KR20170003665A - 매트릭스 메탈로프로테아제7(mmp-7)　회합체의 단량체화 방법 - Google Patents

매트릭스 메탈로프로테아제7(mmp-7)　회합체의 단량체화 방법 Download PDF

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잇빤 자이단호진 가가쿠오요비겟세이료호겐쿠쇼
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Abstract

MMP-7의 회합체를 단량체화하는 방법을 제공한다. MMP-7의 회합체를 저농도의 1가 양이온 염화물(염화나트륨, 염화칼륨 등)을 포함하는 완충액, 또는 1가 양이온 염화물을 함유하지 않는 동일 완충액으로 처리하는 것으로 이루어지는 MMP-7의 단량체화 방법, 해당 단량체화 방법을 도입한 MMP-7의 제조방법, 및 상기 완충액에 용해한 MMP-7 함유 (의약)조성물. 저농도의 MMP-7 함유 (의약)조성물을 조제하는 경우에는 당 알코올이나 당류를 첨가한 상기 완충액을 사용할 수 있다.

Description

매트릭스 메탈로프로테아제7(MMP-7)　회합체의 단량체화 방법{METHOD FOR MONOMERIZING MATRIX METALLOPROTEINASE-7 (MMP-7) AGGREGATE}
본원 발명은 매트릭스 메탈로프로테아제7 (이하, 「MMP-7」이라고 언급하기도 한다.)의 회합체를 단량체화하는 방법에 관한 것이다. 상세하게는, MMP-7의 회합체를 저농도의 1가 양이온 화합물을 함유하는 용액 또는 당해 화합물을 함유하지 않는 동일 용액 중에서 처리하는 것으로 이루어지는, MMP-7 회합체의 단량체화 방법, 해당 단량체화 방법을 도입한 MMP-7의 제조방법, 및 상기 용액에 추가로 당 알코올 또는 당류를 용해한 MMP-7 함유 (의약)조성물에 관한 것이다.
MMP-7은 활성부위에 아연분자를 가지는 아연형 메탈로프로테아제 패밀리에 속하는 매트릭스 메탈로프로테아제 (이하, 「MMP」이라고 언급하기도 한다.)의 하나이다(예를 들면, 비특허문헌 1 참조). MMP는 전구체로서 생산되고, 세포외 분비 시에 시그널 서열이 프로세스되고, 이어서 프로 서열이 프로세스되어서 활성형이 된다. 세포외로 분비된 MMP는 세포외 매트릭스의 대사를 담당하는 것에 대해서, MMP-7은 주로 암 세포에서 분비되고, 침윤, 전이에 관여하는 것이 보고되고 있다(예를 들면, 비특허문헌 2 참조). MMP-7은 다른 많은 MMP가 가지고 있는 힌지, 헤모펙신-유사 도메인을 가지고 있지 않고, MMP 중에서는 최소의 분자단위로 이루어지고, 콜라겐이나 세포외 매트릭스를 구성하고 있는 컴포넌트(피브로넥틴, 비트로넥틴, 라미닌, 아그레칸)를 기질로 한다.
MMP-7은 연골조직의 주성분인 아그레칸을 기질로 하는 것, 추간판 헤르니아의 수술 검체 유래의 마크로파지가 MMP-7을 발현하고 있는 것(예를 들면, 비특허문헌 3 참조) 등으로부터 헤르니아 덩어리의 자연퇴축에 관계하고 있는 것이 추측된다. 그 후에 Haro들은 MMP-7을 헤르니아 도그의 추간판에 투여해서 추간판 내 수핵의 용적 감소를 관찰하고, 추간판 헤르니아의 치료약으로서의 가능성을 나타냈다(예를 들면, 비특허문헌 4 참조). MMP-7의 의약품으로서의 개발이 소망되는 바이기는 하지만, MMP-7은 생체 중에 미량 밖에 존재하지 않고, 생체로부터 MMP-7을 분리 정제하는 것은 매우 곤란해서, 생체 성분을 사용했을 경우, 잠재적인 바이러스 오염 등 안전면에 있어서의 문제가 염려된다. MMP-7은 암 세포로부터도 취득할 수 있지만, 암 세포를 제조주로 하는 것은 바람직하지 않다(예를 들면, 비특허문헌 5 참조).
이러한 문제를 해결하는 방법으로서 유전자 재조합 기술에 의해 MMP-7을 취득하는 시도가 이루어지고 있다. CHO세포에서 MMP-7을 발현시킨 Barnett들의 보고(예를 들면, 비특허문헌 6 참조), 알칼리포스파타아제의 시그널 서열의 염기서열과 대장균의 코돈 사용빈도에 최적화 된 프로매트릭스 메탈로프로테아제7 (이하, 「proMMP-7」이라고 언급하기도 한다.)의 유전자 배열을 연결시킨 핵산 단편을 사용하는 것에　의해, 34℃에서는 가용성의 proMMP-7, 42℃에서는 불용성의 proMMP-7로서 발현시킨 보고(예를 들면, 특허문헌 1 참조) 및 개변형 시그널 펩티드와 proMMP-7의 유전자 배열을 연결시킨 핵산 단편을 사용하는 것에　의해, 봉입체로서 대량으로 발현시킨 보고(예를 들면, 특허문헌 2 참조) 등이 있다.
proMMP-7로부터 활성형 MMP-7로의 변환은 1mM(4-aminophenyl)mercuric acetate(APMA) 또는 0.2μM 트립신 존재 하, 37℃에세 보온하는 방법이나 proMMP-7 함유 용액을 53℃에서 보온하는 방법(예를 들면, 비특허문헌 7 참조)이 보고되고 있고, 그것들은 활성화한 저농도(1㎎/㎖ 이하)의 MMP-7(별명, Matrilysin)은 -20℃에서 6개월간 보존했을 경우 및 실온에서 28일간 보존했을 경우, 그 활성 및 전기영동에 있어서의 변화가 없었던 것을 밝혔다. 이 변화에 관한 명확한 기재는 없지만, 전기영동의 결과로부터 Matrilysin의 분해를 볼 수 없었던 것을 시사한 것으로 생각된다. 그 밖에도, proMMP-7이나 MMP-7의 정제에 관해서는 Kihira, Oneda들 의 방법(예를 들면, 특허문헌 1, 비특허문헌 8 참조)을 비롯해서 여러 보고가 있으며, 실험 레벨에 있어서 일정한 MMP-7의 정제방법은 확립되어 있다. 일반적으로는, 실험 레벨에서의 MMP-7의 정제 방법을 스케일업해서 대량생산이 실시된다. 그렇지만, MMP-7을 대량으로 제조하는 방법은 결코 확립되고 있다고는 말하기 어렵고, MMP-7의 대량제조에 있어서의 문제점이나 해결책에 관한 보고는 거의 볼 수 없다.
또, MMP-7을 함유하는 조성물에 대해서는 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 염산염(트리스 염산염), 염화칼슘 및 염화나트륨을 포함하는 것이 보고되고 있고(예를 들면, 특허문헌 3∼5, 비특허문헌 7, 9 참조), MMP-7과 같은 메탈로프로테아제는 용액 조성물의 경우, 염화칼슘 및 염화나트륨의 공존에 의해 안정화되는 것이 알려져 있다(예를 들면, 특허문헌 6 참조). 특히 의약품은 주로 안전성의 관점에서 통상 체액의 삼투압 부근으로 여겨지고, 염화나트륨은 용액 조성물의 삼투압 조정제로서 일반적인 바, 실제로 이것들의 문헌에 개시되고 있는 조성물은 염화나트륨을 비롯한 1가 양이온 화합물을 체액과 등장이나 그 이상의 농도로 포함하고 있는 것이 거의 대부분이다. 또, 이것들의 문헌에 개시되어 있는 조성물은 당 알코올 또는 당류를 포함하지 않고 있다.
일본특허 제2938352호 WO 2010/047347A 1호 일본 공개특허공보 2000-344672호 일본 공개특허공보 2000-226329호 일본 공개특허공보 2002-173424호 일본 공개특허공보 2005-6509호
Soler et al., Biochem Biophys Res Commun, 1994, vol.201, p.917-923 Ii et al., Exp Biol Med (Maywood), 2006, vol.231, p.20-27 Haro et al., J Spinal Disord, 1999, vol.13, p.245-249 Haro et al., J Orthop Res, 2005, vol.23, p.412-419 Miyazaki et al., Cancer Research, 1990, vol.50, p.7758-7764 Barnett et al., Protein Exp Purif, 1994, vol.5, p.27-36 Crabbe et al., Biochemistry, 1992, vol.31, 8500-8507 Oneda et al., J Biochem, 1999, vol.126, 905-911 Browner et al., Biochemistry, 1995, vol.34, 6602-6610
본원 발명자들은 MMP-7을 함유하는 의약품의 개발 검토의 과정에서, MMP-7은 종래 의약품 제제, 특히 전술한 메탈로프로테아제의 용액 조성물과 같이, 염화나트륨 등에 1가 양이온 화합물이 체액과 등장의 150mM 정도 이상의 경우 회합체를 형성하는 것, 및, 단백이나 그 제제의 제조 시에 통상 사용되는 장치 중의 겔 또는 제제의 보존 시에 통상 사용되는 바이알병 등의 용기에 MMP-7이 흡착하는 것을 알아차리고, MMP-7 제조 시에 있어서의, MMP-7의 제조장치로의 흡착이 억제된 MMP-7 회합체의 단량체화 방법, 해당 단량체화 방법을 도입한 MMP-7의 제조방법, 및 MMP-7의 회합체 형성 및 흡착이 억제된 MMP-7 함유 (의약)조성물을 제공하는 것이 과제가 되었다.
본원 발명자들은 상기의 과제를 해결하기 위해서 예의 연구를 거듭한 결과, 하기 (1)∼ (4)를 발견하고, 본원 발명을 완성하기에 이르렀다.
(1) MMP-7 회합체는 저농도의 1가 양이온 염화물(염화나트륨 및 염화칼륨 등)을 포함하는 트리스 완충액(pH6∼8) 등의 용액으로 처리하는 것에　의해, 해리해서 단량체를 형성한다. 1가 양이온 염화물을 함유하지 않는 동일 용액으로 처리했을 경우에 있어서도 동일하게 단량체를 형성한다.
(2) 상기의 처리에 의한 MMP-7 회합체의 단량체화 방법(이하, 단지 「단량체화 방법」이라고 언급하기도 한다.)을 MMP-7의 제조공정에 도입하는 것에　의해, MMP-7의 제조효율을 올릴 수 있다. 특히, 단량체화 방법을 자기 활성화에 의해 proMMP-7을 MMP-7로 변환한 직후의 한외여과막 처리공정에 도입하는 것에　의해, 더욱 큰 효과가 수득된다.
(3) MMP-7 단량체는 높은 효소활성을 유지한다.
(4) 상기의 트리스 완충액에 만니톨, 수크로오스 등의 당류 또는 당 알코올을 함유시키는 것에　의해, MMP-7의 회합체 형성억제뿐만 아니라, MMP-7의 겔 및 바이알기 벽으로의 흡착이 억제된다. 즉, 수용액으로 했을 경우에 체액과 등장이 되는 150mM 정도 보다 낮은 농도의 1가 양이온 염화물과, 당 알코올 또는 당류를 함유하는 조성물로 하는 것에　의해, MMP-7의 회합체 형성 및 흡착이 억제된 의약제제가 된다.
따라서, 본원 발명은 MMP-7 회합체를 단량체화하는 방법(단량체화 방법), 단량체화 방법을 도입한 MMP-7의 제조방법 및 상기의 완충액을 사용해서 조제되는 MMP-7 함유 (의약)조성물을 포함하는 것으로 아래와 같다.
[1] 130mM 이하의 1가 양이온 화합물을 함유하는 용액 또는 1가 양이온 화합물을 함유하지 않는 용액으로 매트릭스 메탈로프로테아제-7(MMP-7)의 회합체를 처리하는 것을 포함하는 MMP-7 회합체의 단량체화 방법.
[2] 상기 [1]에서, 130mM 이하의 1가 양이온 화합물을 함유하는 용액으로 MMP-7의 회합체를 처리하는 단량체화 방법.
[3] 상기 [1]에서, 1가 양이온 화합물을 함유하지 않는 용액으로 MMP-7의 회합체를 처리하는 단량체화 방법.
[4] 상기 [1] 또는 [2]에서, 상기 1가 양이온 화합물의 농도가 100mM 이하인 단량체화 방법.
[5] 상기 [1], [2] 또는 [4]에서, 상기 1가 양이온 화합물의 농도가 80mM 이하인 단량체화 방법.
[6] 상기 [1], [2] [4] 또는 [5]에서, 상기 1가 양이온 화합물의 농도가 40mM 이하인 단량체화 방법.
[7] 상기 [1], [2] [4], [5] 또는 [6]에서, 상기 1가 양이온 화합물이 염화나트륨, 염화칼륨, 황산나트륨, 황산칼륨, 탄산나트륨, 탄산칼륨, 인산나트륨 및 인산칼륨으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 단량체화 방법.
[8] 상기 [1], [2] [4], [5] 또는 [6]에서, 상기 1가 양이온 화합물이 1가 양이온 염화물에 유래하는 것인 단량체화 방법.
[9] 상기 [8]에서, 상기 1가 양이온 염화물이 염화나트륨 및 염화칼륨으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 단량체화 방법.
[10] 상기 [1] 내지 [9] 중 어느 하나에서, 상기 용액이 추가로, 염화칼슘을 함유하는 단량체화 방법.
[11] 상기 [10]에서, 상기 염화칼슘의 농도가 30mM 이하인 단량체화 방법.
[12] 상기 [1] 내지 [11] 중 어느 하나에서, 상기 용액이 완충액인 단량체화 방법.
[13] 상기 [12]에서, 상기 완충액이 5∼25mM의 트리스 완충액인 단량체화 방법.
[14] 상기 [1] 내지 [13] 중 어느 하나에서, 상기 MMP-7의 농도가 20㎎/㎖ 이하인 단량체화 방법.
[15] 상기 [13] 또는 [14]에서, 상기 용액이 30∼40mM 염화나트륨 및 5∼30mM 염화칼슘을 함유하는 5∼25mM 트리스 완충액(pH6∼8)인 단량체화 방법.
[16] 상기 [1] 내지 [15] 중 어느 하나에서, 상기 용액이 추가로, 당 알코올 및/또는 당류를 함유하는 단량체화 방법.
[17] 상기 [16]에서, 상기 당 알코올 및/또는 당류가 수크로오스, 락토오스, 말토오스, 크실로오스, 트레할로오스, 만니톨, 솔비톨, 크실리톨, 말티톨, 락티톨, 및 올리고당 알코올로 이루어지는 그룹에서 선택되는 단량체화 방법.
[18] 상기 [16] 또는 [17]에서, 상기 당 알코올 및/또는 당류가 2% 이상인 단량체화 방법.
[19] 상기 [18]에서, 상기 당 알코올 및/또는 당류가 2∼7%인 단량체화 방법.
[20] 상기 [17] 내지 [19] 중 어느 하나에서, 상기 당 알코올 및/또는 당류가 만니톨 또는 수크로오스인 단량체화 방법.
[21] 상기 [20]에서, 상기 만니톨이 2∼5%, 상기 수크로오스가 2∼7%인 단량체화 방법.
[22] 상기 [1] 내지 [21] 중 어느 하나에 기재된 단량체화 방법으로 이루어지는 공정을 포함하는 MMP-7의 제조방법.
[23]상기 [22]에서, 상기 공정이 130mM 이상의 1가 양이온 화합물 함유액을 사용한 처리공정 후에 실시되는 제조방법.
[24] 상기 [22] 또는 [23]에서, 하기 (1)∼ (5)의 공정을 포함하는 제조방법:
(1) proMMP-7 봉입체 생산세포를 파쇄하는 공정,
(2) proMMP-7 봉입체를 용해/리폴딩 처리하는 공정,
(3) proMMP-7을 정제하는 공정,
(4) proMMP-7을 자기 활성화해서 MMP-7로 하는 공정, 및
(5) 상기 [1] 내지 [21] 중 어느 하나에 기재된 단량체화 방법으로 이루어지는 공정.
[25] 상기 [24]에서, 상기 (5)의 공정이 한외여과막을 사용한 농축공정인 제조방법.
[26] 130mM 이하의 1가 양이온 화합물을 함유하는 용액 또는 1가 양이온 화합물을 함유하지 않는 용액 중에 매트릭스 메탈로프로테아제-7(MMP-7)을 유효성분으로서 함유하는 MMP-7 함유 (의약)조성물.
[27] 상기 [26]에서, 130mM 이하의 1가 양이온 화합물을 함유하는 용액 중에 MMP-7을 유효성분으로서 함유하는 MMP-7 함유 (의약)조성물.
[28] 상기 [26]에서, 1가 양이온 화합물을 함유하지 않는 용액 중에 MMP-7을 유효성분으로서 함유하는 MMP-7 함유 (의약)조성물.
[29] 상기 [26] 또는 [27]에서, 상기 1가 양이온 화합물이 염화나트륨, 염화칼륨, 황산나트륨, 황산칼륨, 탄산나트륨, 탄산칼륨, 인산나트륨 및 인산칼륨으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 MMP-7 함유 (의약)조성물.
[30] 상기 [26] 또는 [27]에서, 상기 1가 양이온 화합물이 1가 양이온 염화물에 유래하는 것인 MMP-7 함유 (의약)조성물.
[31] 상기 [30]에서, 상기 1가 양이온 염화물이 염화나트륨 및 염화칼륨으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 MMP-7 함유 (의약)조성물.
[32] 상기 [26] 내지 [31] 중 어느 하나에서, 추가로 염화칼슘을 함유하는 MMP-7 함유 (의약)조성물.
[33] 상기 [32]에서, 상기 염화칼슘의 농도가 30mM 이하인 MMP-7 함유 (의약)조성물.
[34] 상기 [26] 내지 [33] 중 어느 하나에서, 상기 용액이 완충액인 MMP-7 함유 (의약)조성물.
[35] 상기 [34]에서, 상기 완충액이 5∼25mM의 트리스 완충액인 MMP-7 함유 (의약)조성물.
[36] 상기 [26] 내지 [35] 중 어느 하나에서, 상기 MMP-7의 농도가 20㎎/㎖ 이하인 MMP-7 함유 (의약)조성물.
[37] 상기 [36]에서, 상기 MMP-7의 농도가 1㎍/㎖∼1㎎/㎖인, [36]에 기재된 MMP-7 함유 (의약)조성물.
[38] 상기 [35], [36] 또는 [37]에서, 상기 용액이 30∼40mM 염화나트륨 및 5∼30mM 염화칼슘을 함유하는 5∼25mM 트리스 완충액(pH6∼8)인 MMP-7 함유 (의약)조성물.
[39] 상기 [26] 내지 [38] 중 어느 하나에서, 상기 용액이 추가로 당 알코올 및/또는 당류를 함유하는 MMP-7 함유 (의약)조성물.
[40] 상기 [39]에서, 상기 당 알코올 및/또는 당류가 수크로오스, 락토오스, 말토오스, 크실로오스, 트레할로오스, 만니톨, 솔비톨, 크실리톨, 말티톨, 락티톨, 및 올리고당 알코올로 이루어지는 그룹에서 선택되는 MMP-7 함유 (의약)조성물.
[41] 상기 [39] 또는 [40]에서, 상기 당 알코올 및/또는 당류가 2% 이상인 MMP-7 함유 (의약)조성물.
[42] 상기 [41]에서, 상기 당 알코올 및/또는 당류가 2∼7%인 MMP-7 함유 (의약)조성물.
[43] 상기 [40] 내지 [42] 중 어느 하나에서, 상기 당 알코올 및/또는 당류가 만니톨 또는 수크로오스인 MMP-7 함유 (의약)조성물.
[44] 상기 [43]에서, 상기 만니톨이 2∼5%, 상기 수크로오스가 2∼7%인 MMP-7 함유 (의약)조성물.
[45] 용제에 용해할 수 있고, 그 용해 시의 조성물이 상기 [26] 내지 [44] 중 어느 하나에 기재된 조성물인 MMP-7 함유 (의약)고체 조성물.
[46] 상기 [26] 내지 [45] 중 어느 하나에 기재된 MMP-7 함유 (의약)조성물을 함유하는 추간판 헤르니아의 치료제.
본원 발명을 따르면, MMP-7의 회합체를 용이하게 단량체화하는 방법이 제공되므로, 당해 방법을 MMP-7의 제조공정에 도입하는 것에　의해, MMP-7의 생산성이나 회수 효율을 올릴 수 있다.
또, 당해 방법에 의해 단량체화된 MMP-7은 MMP-7의 회합체가 존재하는 경우와 비교해서 MMP-7의 효소로서의 비활성도가 높고, 고품질의 MMP-7제제를 얻기 위한 호적한 재료가 될 수 있다.
또, 본원 발명의 양태에 하나인 저농도의 염화나트륨, 및 당 알코올 또는 당류를 포함하는 완충액 중에서 MMP-7을 보존하는 것에　의해, MMP-7은 단량체로서의 형상을 유지할 뿐만 아니라, 높은 효소활성을 유지하고, 또 MMP-7의 보존용기로의 흡착을 억제할 수 있다. 따라서 본원 발명의 단량체화 방법에 사용되는 완충액은 MMP-7 제제의 보존액으로서 유용하다. 그리고 본원 발명의 수용액으로 했을 경우에 저농도의 염화나트륨, 및 당 알코올 또는 당류를 포함하는 MMP-7조성물은 MMP-7의 회합체 형성이 억제되고, 추가로 MMP-7의 용기 등으로의 흡착이 억제 된 의약용도의 용액 조성물 및 그 조제용 조성물로서 유용하다.
도 1은 동적 광산란법에 의해 측정한 MMP-7의 분자량 해석결과에 의거하는 염화나트륨(NaCl) 및 염화칼륨(KCl)에 의한 MMP-7 회합체의 형성 억제효과를 나타낸다.
도 2는 동적 광산란법에 의해 측정한 MMP-7의 분자량 해석결과에 의거하는 MMP-7 회합체의 형성 억제에 있어서의 염화칼슘(CaCl2)의 영향을 나타낸다.
도 3은 사이즈 배제 크로마토그래피에 의해 측정한 MMP-7의 분자량 해석결과에 의거하는 MMP-7의 회합체 형성에 있어서의 MMP-7 농도의 영향을 나타낸다.
도 4는 0.1㎎/㎖, 2㎎/㎖, 20㎎/㎖의 각 MMP-7을, 150mM 염화나트륨(NaCl) 또는 40mM NaCl을 함유하는 트리스 완충액으로 희석했을 때에, 당해 농도의 염화나트륨이 MMP-7의 효소활성에 미치는 영향을 나타낸다.
도 5는 만니톨에 의한 MMP-7의 겔으로의 흡착 억제효과를 나타낸다. A: 5mM 트리스 완충액(pH7)/10mM CaCl2/40mM NaCl, B: 5mM 트리스 완충액(pH7)/10mM CaCl2/40mM NaCl/3.5% 만니톨.
도 6은 만니톨 및 수크로오스에 의한 MMP-7의 바이알기 벽으로의 흡착 억제효과를 나타낸다.
도 7은 만니톨 및 수크로오스의 각 농도에 있어서의 MMP-7의 바이알기 벽으로의 흡착 억제효과를 나타낸다.
도 8은 만니톨 및 수크로오스의 각 농도에 있어서의 MMP-7의 효소활성에 미치는 영향을 나타낸다.
도 9는 MMP-7 회합체의 형성 억제에 있어서의 만니톨의 영향을 나타낸다.
본원 발명은 MMP-7 회합체의 단량체화 방법, 해당 단량체화 방법을 도입한 MMP-7의 제조방법 및 MMP-7 함유 (의약)조성물을 제공하는 것으로, MMP-7 회합체를 저농도의 1가 양이온 화합물, 게다가 당 알코올 또는 당류를 함유하는 용액(이하, 「단량체화용 용액」이라고 언급하기도 한다.)으로 처리하는 것, 동일 용액에 MMP-7을 보존하는 것ㅡ 및 수용액으로 했을 경우에 저농도의 1가 양이온 화합물과 당 알코올 또는 당류를 함유하는 MMP-7조성물로 하는 것에 특징이 있다.
MMP-7 회합체의 검출은 동적 광산란법, 사이즈 배제 크로마토그래피법, 초원심 분석법 등의 방법을 사용해서 MMP-7의 분자량을 측정하고, 아미노산 서열로부터 산출되는 MMP-7 단량체의 분자량(약 19kDa)과 비교하는 것에 의해 실시된다. 본원 발명에 있어서는 동적 광산란법으로 측정한 시료 중의 분자량이 19kDa∼38kDa의 사이의 수치를 나타냈을 경우에 MMP-7은 단량체로서 존재하고 있다고 판정하고, 38kDa 이상의 수치를 나타냈을 경우에 MMP-7은 회합체를 형성하고 있다고 판정했다. 상기의 판정기준은 동적 광산란법에 의한 측정값의 진도(trueness)를 고려한 것으로, 2량체 이상의 값을 나타냈을 경우는 분명한 회합체를 형성하고 있다고 하고, 그것보다도 작은 값의 경우에는 단량체로 했다.
MMP-7의 단량체화는 MMP-7 회합체를 단량체화용 용액으로로 처리하는 것에 의해 수행된다. 본원 발명에 있어서, 「MMP-7 회합체를 단량체화용 용액으로 처리한다」란 MMP-7 회합체를 단량체화용 용액에 폭로시키는 것을 의미하고, 그 용액으로 용해하는 것을 포함한다. 그리고 MMP-7 회합체가 130mM을 넘는 고농도의 1가 양이온 화합물을 함유하는 용액에 용해되어 있을 경우, 단량체화용 용액을 사용해서 한외여과막이나 투석막 등에 의한 버퍼 교환을 실시하는 것을 포함한다. 해당 단량체화용 용액의 pH를 일정하게 유지하기 위한 완충제로서 트리스 완충액, 인산 완충액, 글리신 완충액 및 탄산 완충액 등의 사용이 가능하다. 이것들 중에서 단량체화 처리를 실시할 때의 pH에 맞추어서 적당하게 선택할 수 있다. 해당 완충액의 농도는 5∼25mM, 바람직하게는 5∼20mM의 범위이다. pH는 5∼9, 바람직하게는 6∼8의 범위이다. 더 바람직하게는 메탈로프로테아제의 안정성 향상에 효과를 발휘하는 트리스 완충액이 선택되고, 해당 트리스 완충액의 농도는 5∼10mM, pH는 6∼8의 범위이다(일본 공개특허공보 2011-521906 참조).
본원 발명에 있어서 「1가 양이온 화합물」이란 1가의 양이온과 페어가 되는 음이온으로 이루어지는 화합물을 의미하고, 예를 들면, 염화나트륨, 염화칼륨, 황산나트륨, 황산칼륨, 탄산나트륨, 탄산칼륨, 인산나트륨 및 인산칼륨 등을 들 수 있다. 또, 「1가 양이온 염화물」이란 1가의 양이온과 염화물 이온으로 이루어지는 화합물을 의미하고, 1가 양이온 염화물의 경우 예를 들면, 본원 발명에 사용하는 1가 양이온 화합물은 어느 것의 것을 사용해도 좋지만, 1가 양이온 염화물을 사용하는 것이 바람직하다. 구체적으로는 염화나트륨 및 염화칼륨이며, 가장 바람직한 것은 염화나트륨이다.
MMP-7 회합체를 단량체에 분해하기 위해서 저농도의 1가 양이온 화합물이 사용된다. 단량체에 분해한 MMP-7은 저농도의 1가 양이온 화합물을 함유하는 단량체화용 용액에 있어서 단량체로서 유지된다. 동일한 효과가, 1가 양이온 화합물을 함유하지 않는 단량체화용 용액 및 물 등의 액을 사용했을 경우에도 수득된다. 따라서 1가 양이온 화합물을 함유하지 않는 단량체화용 용액(본원 발명에서는, 해당 단량체화용 용액에 물 등의 액이 포함되는 것으로 한다)을 사용한 MMP-7 회합체의 단량체화 방법도 본원 발명에 포함된다. 이하, 저농도의 1가 양이온 화합물을 함유하는 용액 및 1가 양이온 화합물을 함유하지 않는 동일 용액을, 단순하게 「단량체화용 용액」이라고 언급하기도 한다.
단량체화용 용액에, 다가 양이온 화합물을 첨가하는 것에　의해, 1가 양이온 화합물의 처리농도의 범위를 넓힐 수 있다. 바람직하게는 2가 양이온 화합물이고, 더 바람직하게는 2가 칼슘이온 화합물이고, 가장 바람직하게는 염화칼슘이다. 또, 「다가 양이온 화합물」은 상기한 1가의 양이온 화합물과 마찬가지로 다가의 양이온과 페어가 되는 음이온으로 이루어지는 화합물을 의미한다.
구체적으로는 단량체화용 용액으로서 물을 사용한 경우에는, 40mM 이하의 1가 양이온 화합물이 사용되고, 단량체화용 용액에 염화칼슘을 첨가하는 것에　의해, 40mM 이상의 1가 양이온 화합물을 함유시킨 단량체화용 용액으로의 처리를 가능하게 한다. 더 구체적으로는 5mM∼10mM 염화칼슘을 함유하는 경우에는 80mM 이하의 1가 양이온 화합물, 10mM∼30mM 염화칼슘을 함유하는 경우에는 100mM 이하의 1가 양이온 화합물, 및 30mM 염화칼슘을 함유하는 경우에는 130mM 이하의 1가 양이온 화합물을 함유하는 단량체화용 용액의 사용이 가능하게 된다. 이 결과는 염화칼슘의 첨가에 의해, MMP-7 회합체를 단량체로 분해하는 효과 및 MMP-7 단량체의 회합체 형성을 억제하는 효과가 증강된 것을 나타낸다. 또, 실시예 2의 결과(도 2)로부터, 본 효과는 염화칼슘의 농도에 비례하는 것을 판독할 수 있다. 즉, 고농도의 염화칼슘을 사용하는 것에　의해, MMP-7의 단량체화 및 MMP-7 단량체의 유지의 보다 큰 효과를 기대할 수 있다. 이상에 의해, 1가 양이온 화합물의 농도로서는 수용액으로 했을 경우 130mM 이하, 바람직하게는 100mM 이하, 더욱 바람직하게는 80mM 이하, 가장 바람직하게는 40mM 이하이다. 또, 1가 양이온 화합물은 함유하지 않아도 좋지만, 함유하는 것이 의약 조성물로서의 품질의 관점에서 바람직하다.
본원 발명에 있어서는 30∼40mM 염화나트륨 및 5∼30mM 염화칼슘을 포함하는 5∼25mM 트리스 완충액(pH6∼8)으로 이루어지는 단량체화용 용액, 또는 염화나트륨을 제외한 동일 단량체화용 용액을 사용하는 것이 바람직하다.
본원 발명의 MMP-7 회합체의 단량체화 방법은 효율좋고, 고품질의 MMP-7 단량체를 제조하기 위해서, MMP-7의 제조공정에 편입시킬 수 있다. 유전자 재조합 기술에 의해 수득되는 MMP-7이 일반적인 제조방법은 균체의 배양, 봉입체의 방출, 봉입체의 용해와 리폴딩, proMMP-7의 정제, 자기 활성화에 의한 proMMP-7의 MMP-7에의 변환, MMP-7의 정제ㆍ농축 등의 공정에 의해 수행된다.
더 구체적으로는, 이하의 MMP-7의 제조공정에서 사용된다. 우선, proMMP-7 생산 대장균이 제작된다. 일반적으로는, 통상의 방법에 따라서 발현벡터에 삽입된 proMMP-7 유전자를 대장균에 도입하는 것에 의해 제작할 수 있다. 그렇지만, proMMP-7은 대장균에 대해서 강한 독성을 가지기 때문에 생산 효율이 극단적으로 저하되는 경우가 있다. 이것을 해소하기 위해서 proMMP-7의 N말단측에 시그널 펩티드를 부가하는 등의 방법이 수행되지만, proMMP-7의 경우, 단지 시그널 펩티드를 부가한 것만으로는 proMMP-7의 발현량은 상승하지 않고, 또 발현한 proMMP-7의 일부가 프로테아제에 의해 분해된다는 현상이 인정된다. 이러한 현상은 효율적인 MMP-7의 제조방법 확립에 방해가 된다. 따라서 proMMP-7의 발현량 증대나 프로테아제에 의한 proMMP-7의 분해 억제효과가 증강된 proMMP-7 생산 대장균을 MMP-7제조의 원료로 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 proMMP-7 생산 대장균은 WO2010/047347에 기재된 방법에 따라서 조제할 수 있다(더 구체적으로는, 조제예를 참조).
이렇게 해서 수득된 proMMP-7 생산 대장균은 클로닝을 반복해서 순화한 후에 Working Cell Bank로서 보존되고, MMP-7 제제화를 위한 대량 배양 종균으로 사용할 수 있다. Working Cell Bank의 보존액으로서는 통상, 재조합 대장균의 보존에 사용되는 조건, 예를 들면, 7∼10% 디메틸설폭사이드나 10∼50% 글리세롤을 포함하는 용액 중에서, -80∼-20℃의 냉동고나 액체질소 중, 혹은 앰플 내에 동결건조해서 2∼10℃의 냉장고에서 보존된다.
proMMP-7 생산 대장균의 제조 스케일에서의 배양은 소 스케일에서의 전 배양과 대 스케일에서의 본 배양의 2단계로 수행된다. 전 배양에는 proMMP-7 생산 대장균의 증식에는 재조합 대장균이 일반적인 LB배지(플라스미드 유지를 위해서 암피실린 등 항생물질을 첨가하는 경우가 있다)를 사용할 수도 있지만, 본 배양에 있어서는 부작용의 원인이 되는 물질을 가능한 한 배제한 배지를 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 배지로서 예를 들면, 여러 가지의 미량 금속(마그네슘, 칼슘, 구리, 나트륨 등)을 포함하는 글루코스 배지, LB배지, M9배지 등을 들 수 있다. 배양조건으로서는 대장균의 증식에 적합한 범위를 사용할 수 있지만, 예를 들면, pH(pH6∼8), 온도(30∼45℃), 시간(4∼16시간)의 배양 조건이 가능하다. 이것들의 배양조건은 배양 스케일이나 발현 유도의 처리 등에 의해 적절하게 조절된다. 효율적으로 proMMP-7의 발현을 실시하기 위해서 발현 유도제가 사용되지만, 해당 발현 유도제로서 이소프로필-β-티오갈락토피라노사이드(IPTG), 락토오스 등을 들 수 있다.
본 배양에 의해 대량으로 배양ㆍ증식한 proMMP-7 생산 대장균으로부터 MMP-7을 회수하기 위해서는 이하의 방법이 선택된다. 우선, proMMP-7 생산 대장균을 배양하고, 증식시킨 균체를 적절한 방법으로 파쇄하고, proMMP-7로 이루어지는 봉입체를 균체 외로 방출시킨다. 균체의 파쇄에는 화학물질(예를 들면, 킬레이트제로서 EDTA), 계면활성제(예를 들면, Triton X100), 효소(예를 들면, 리소자임) 등으로 용해시키는 방법 또는 French press나 초음파처리 등의 물리적 처리에 의한 방법이 선택되지만, 어느 쪽의 방법일 수 있다. 이것들의 방법을 몇 가지 조합시키는 것에　의해, 더 효과적으로 균체를 파쇄할 수 있다. 봉입체 함유 파쇄액의 한외여과막 분획이나 원심분리에 의해, 농축과 세정을 반복하는 것에 의해 대부분의 균체 성분이 제거된다. 세정에는 트리스 완충액, 인산 완충액, 글리신 완충액, 탄산 완충액 등 일반적인 완충액이 사용된다. 또, 한외여과막의 포어 직경이나 원심분리의 조건은 다수보고되어 있으므로, 이것들의 조건을 참고로 할 수 있다. 대량으로 처리하는 경우에는 한외여과막 분획에 의해 봉입체를 회수하는 것이 바람직하다.
회수한 봉입체는 일단, 환원제 및 변성제를 함유하는 용액으로 용해된다. 이러한 환원제로서 시스테인, 글루타티온, 디티오트레이톨 및 2-메르캅토에탄올 등을 사용할 수 있다. 이것들은 몇 가지를 조합해서 사용해도 좋다. 환원제의 농도는 용해하는 봉입체의 양에 의존하지만, 10∼200mM의 범위로 사용된다. 변성제로서는 요소, 구아니딘 염산염 등을 사용할 수 있다. 이러한 요소 및 구아니딘 염산염은 각각 4∼8M 및 2∼6M의 농도범위로 사용된다. 또, 완충액으로서는 봉입체의 회수에서 사용하는 것과 동일한 완충액, 예를 들면, 인산 완충액이나 트리스 완충액(pH7.0∼9)이 사용된다. 용해시의 온도는 40℃ 이하라면 특별히 제한할 필요는 없다. 용해시간은 봉입체의 용해 상황을 보면서 설정하면 되며, 통상, 30분∼1시간 교반된다.
다음에, 봉입체의 용해액에, 계면활성제, 금속이온을 포함하는 리폴딩 버퍼를 첨가하는 것에　의해, proMMP-7의 리폴딩, 즉 정상인 입체구조의 구축이 수행된다. 이 때 사용하는 계면활성제로서 브리지35, 금속이온으로서 초산아연, 염화코발트 등이, 각각 0.5∼2% 및 0.05mM∼0.2mM의 농도범위로 사용된다. 리폴딩할 때의 완충액 종류 및 농도는 봉입체를 용해할 때와 동일한 것을 사용할 수 있다. 리폴딩 처리는 1일 이상 스탠딩하는 것에 의해 수행된다.
리폴딩 용액으로부터 proMMP-7을 정제할 때는 일반적으로, 단백질 화학에 있어서 사용되는 정제 방법, 예를 들면, 원심분리, 염석법, 한외여과법, 등전점침전법, 전기영동법, 이온교환 크로마토그래피법, 겔여과 크로마토그래피법, 친화성 크로마토그래피법, 소수 크로마토그래피법, 하이드록시애퍼타이트 크로마토그래피법 등 의 방법을 조합시킨 방법이 사용된다. 본원 발명의 proMMP-7은 이온교환 크로마토그래피, 소수 크로마토그래피 및 한외여과막 처리로 이루어지는 공정을 사용하는 것에 의해 정제할 수 있다. 양 크로마토그래피는 통상의 방법에 따라서 실시할 수 있다. 수득된 단백질이나 폴리펩티드의 양은 BCA Protein Assay Reagent Kit(Pierce Biotechnology, Inc), Protein Assay Kit (BIO-RAD, Inc) 등의 단백 측정 시약을 사용해서 측정된다.
이어서, proMMP-7의 MMP-7으로의 변환이 수행된다. 변환 방법으로서는 proMMP-7 함유용액을 1mM(4-aminophenyl)mercuric acetate(APMA) 또는 0.2μM 트립신 존재 하, 37℃에서 보온하는 방법이나 proMMP-7 함유 용액을 53℃에서 보온하는 방법(Crabbe들, Biochemistry, 1992, vol. 31, 8500-8507)을 들 수 있지만, 어느 쪽의 방법을 사용해도 된다. 이 때, 30∼200mM의 염화 나트륨을 첨가하는 경우가 있다(Crabbe들, Biochemistry, 1992, vol. 31, 8500-8507, WO 2010/047347 A1). 보온시간은 1∼5시간의 범위에서 수행되지만, 시약 및 proMMP-7의 농도나 처리량 등에 의해 적당하게 조절된다. 트립신은 N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone(TPCK) 처리한 것이 사용된다.
MMP-7의 효소활성을 측정하는 방법으로서는 형광기질(Dnp-Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-Ala-D-Arg-NH2; 서열번호 7)의 MMP-7에 의한 절단을 형광측정장치에 의해 측정하는 방법이 있다(Crabbe들, Biochemistry, 1992, vol. 31, 8500-8507). 실제로는, 이러한 원리에 의거하는 MMP-7 활성측정 Kit(ANASPEC사)가 시판되고 있으므로, 이것을 사용하고, 첨부의 프로토콜에 따라서, 활성의 측정이 수행된다. 이렇게 해서 변환된 MMP-7을 proMMP-7로부터 분리 정제할 때는 전술한 단백 정제 방법이 사용된다.
변환된 MMP-7은 고염 농도의 용액 중에서 회합체를 형성하고, MMP-7의 용액 중의 농도가, 1㎎/㎖ 이상이 되면 그 경향이 강하다. MMP-7의 회합체 존재는 MMP-7의 제조ㆍ제제화에 있어서 생산성이나 품질의 저하에 연결된다. 전술한 바와 같이, 염화 칼슘의 공존 하, 130mM 이하의 1가 양이온 화합물을 포함하는 단량체화용 용액 중에서는 MMP-7 회합체는 단량체화하고, MMP-7 단량체로서 유지되지만, 130mM을 넘는 농도의 1가 양이온 화합물을 함유하는 용액 중에서는 MMP-7 회합체를 형성할 가능성이 높은 것이 시사된다. 따라서, 130mM 이상의 1가 양이온 화합물에 의한 처리공정 후에 본원 발명의 단량체화 방법이 편입된다. 더 구체적으로는 자기 활성화에 의한 proMMP-7의 MMP-7로의 변환 직후에 편입하는 것이 바람직하다.
본원 발명의 단량체화 방법에 의한 처리는 20㎎/㎖ 이하의 MMP-7에 대해서 실시하는 것이 바람직하지만, 20㎎/㎖ 이상의 MMP-7을 처리하는 경우에는, 전술한 바와 같이, 염화칼슘의 농도를 조절하는 것에　의해, 동일한 MMP-7의 회합체 형성 억제효과를 기대할 수 있다.
이렇게 해서 수득된 MMP-7의 단량체를 포함하는 용액은 필요에 따라서, 한외여과막 등에 의한 MMP-7의 정제와 농축공정을 거쳐서 제제화의 원료가 된다. 이러한 공정에 있어서도 본원 발명의 단량체화용 용액이 사용된다. 일단, 단량체화한 MMP-7은 단량체화용 용액 중에 보존하는 한, 단량체로서 유지되며, 또, 장기에 걸쳐 효소활성의 저하도 인정되지 않는다. 따라서 본원 발명의 단량체화용 용액은 제제화 전의 MMP-7의 보존, 및 MMP-7을 유효성분으로서 함유하는 (의약)조성물의 제조에 사용하는 것에　의해, 고품질의 MMP-7을 유지할 수 있다.
본원 발명의 MMP-7 회합체의 단량체화 방법 및 해당 단량체화 방법을 도입한 MMP-7의 제조방법에 있어서, 당 알코올이나 당류는 MMP-7의 제조에 범용되는 겔으로의 흡착 억제효과 및 제제화에 사용되는 바이알 등의 용기 벽으로의 흡착 억제효과를 가진다. 이러한 당 알코올 및 당류로서, 수크로오스, 락토오스, 말토오스, 크실로오스, 트레할로오스, 만니톨, 솔비톨, 크실리톨, 말티톨, 락티톨, 올리고당 알코올 등을 들 수 있다. 바람직하게는 만니톨 및 수크로오스, 특히 바람직하게는 만니톨이다.
저농도(예를 들면, 1㎍/㎖∼1㎎/㎖)의 MMP-7을 제제화하는 경우에는, MMP-7의 바이알기 벽으로의 흡착에 의한 로스가 상정되기 때문에, 단량체화용 용액에 상기의 당 알코올이나 당류를 함유시키는 것은 특히 유효하다. MMP-7의 경우, 바이알기 벽으로의 흡착 저지효과를 나타내는 2% 이상, 바람직하게는, 체내삼투압의 조절가능하는 범위인 2∼7%의 당 알코올 또는 당류가 첨가된다. 본원 발명에 있어서는, 바람직하게는, MMP-7의 활성을 유지 할 수 있는 2∼5%의 만니톨 또는 2∼7%의 수크로오스를 첨가한 단량체화용 용액이 사용된다. 더 바람직하게는, 2∼5% 만니톨, 30∼40mM 염화나트륨 및 5∼30mM 염화칼슘을 포함한, 5∼25mM 트리스 완충액(pH6∼8)로부터 이루어지는 단량체화용 용액이 사용된다.
당해 단량체화용 용액에 용해된 MMP-7은 본원 발명의 MMP-7 함유 (의약)조성물로서 그대로 사용할 수 있고, MMP-7의 회합체 형성억제, MMP-7의 활성유지, MMP-7의 용기 등으로의 흡착 억제, 의약 수용액 조성물로서의 품질의 확보 관점에서, MMP-7 함유 (의약)조성물은, 2% 이상의 당 알코올 및/또는 당류, 및 30∼40mM의 1가 양이온 화합물(염화나트륨 또는 염화칼륨)을 포함하는 것이 바람직하다. 더 구체적으로는 MMP-7의 농도가 20㎎/㎖ 이하의 경우, 본원 발명의 MMP-7 함유 (의약)조성물은 2∼5% 만니톨 또는 2∼7%의 수크로오스, 30∼40mM 염화나트륨 및 5∼30mM 염화칼슘을 포함하는 것이 바람직하다. 본원 발명의 MMP-7 함유 (의약)조성물은 액상, 동결건조, 혹은 동결해서 보존하는 것이 가능하다. 이 때에, MMP-7 함유 (의약)조성물의 의약품으로서의 안정성이나 등장성을 유지하기 위해서, 추가적으로 안정화제, 등장제 및 보존제 등의 인간이나 다른 동물에 대해서 투여하는 것이 허용되는 화합물이 첨가될 수 있다. 본원 발명의 MMP-7 함유 (의약)조성물은 용제에 용해할 수 있어서 그 용해 시의 조성물이 상술한 본원 발명의 액체 MMP-7 함유 (의약)조성물이 되는 고체 조성물을 포함한다. 이 고체 조성물은 본원 발명의 액체 MMP-7 함유 (의약)조성물을 동결건조 등에 의해 용제를 제거하는 등에 의해 수득된다. 용제란 의약품 첨가물 사전에 있어서 용제로 여겨지고 있는 것으로, 물, 에탄올 등을 들 수 있다.
이렇게 해서 수득된 본원 발명의 MMP-7 함유 (의약)조성물은 MMP-7의 회합체 형성이나 흡착이 억제된 특이적인 MMP-7의 효소활성을 가지는 것으로, 추간판 헤르니아의 치료약 또는 진단약으로서 사용될 수 있는 것이다.
이하, 실시예에 따라서 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 하기의 실시예에 조금도 한정되는 것은 아니다.
≪ 조제예 ≫
(1) APSP를 가지는 proMMP-7 발현벡터(pETMMP7)의 구축
신장의 cDNA 라이브러리(HumanMTC Panel I, Catalog#: K1420-1, BD사)에서 프라이머 P1(서열번호 1)과 P2(서열번호 2)를 사용해서 proMMP-7 유전자를 PCR에 의해 증폭했다. 증폭된 DNA를 클로닝 벡터(pCRII-TOPO, Invitrogen)에 삽입하고, 수득된 DNA의 염기서열을 결정했다. 염기서열의 결정은 DNA 시퀀서(sequencer)를 사용서 수행했다. 당해 염기서열과 데이터베이스(Accession Numbers: NM002423)에 등록되어 있는 proMMP-7의 염기서열 상동성 검색을 실시하고, proMMP-7 유전자가 삽입된 플라스미드(pCRproMMP-7)를 얻었다.
다음에, pCRproMMP-7을 주형으로 해서, 제한효소 NdeI 인식서열, PhoA-알칼리포스파타아제 시그널 펩티드(APSP) 서열을 코딩하는 염기서열 및 proMMP-7의 N말단 서열을 코딩하는 염기서열로 이루어지는 프라이머 P3(서열번호 3)과 제한효소 BamHI 인식서열 및 proMMP-7의 C말단 서열을 코딩하는 염기서열로 이루어지는 프라이머 P4(서열번호 4)를 사용해서 PCR을 실시했다. 상기와 마찬가지로 증폭된 DNA를 클로닝 벡터에 삽입하고, 수득된 DNA의 염기서열을 결정했다. 염기서열에 돌연변이가 없는 것을 확인한 후, 수득된 플라스미드를 제한효소 NdeI 및 BamHI으로 절단하고, 미리 같은 제한효소로 절단한 발현벡터 pET22b (MERCK LTD., 제품코드; 69744-3)에 삽입하고, proMMP-7 유전자가 삽입된 플라스미드(pETMMP7)를 얻었다.
(2) 개변형 APSP를 가지는 발현벡터 pETMMP7(L13P-A21E)의 구축 및 발현
GeneTailor Site-Directed Mutagenesis System(Invitrogen사)을 사용하고, 첨부의 프로토콜에 따라서, 상기 (1)에서 얻은 pETMMP7의 APSP 서열(Met-Lys-Gln-Ser-Thr-Ile-Ala-Leu-Ala-Leu-Leu-Pro-Leu-Leu- Phe-Thr-Pro-Val-Thr-Lys-Ala; 서열번호 8)의 시그널 펩티다아제 인식부위에 돌연변이를 도입했다(APSP 서열로 나타나는 아미노산 서열에 13번째의 로이신(Leu)을 프롤린(Pro)으로, 21번째의 알라닌(Ala)을 글루탐산(Glu)으로 치환했다). APSP의 개변에는 5'측 프라이머로서 M2(서열번호 5) 및 3'측 프라이머로서 P6(서열번호 6)의 서열을 사용했다. 수득된 개변형 APSP를 가지는 pETMMP7(L13P-A21E)으로 대장균(BL21(DE3))을 형질전환하고, proMMP-7을 발현하는 재조합 대장균(MMP7L13P-A21E균)을 얻었다.
발현 유도는 Overnight Express Autoinduction System 1(MERCK LTD.; 제품코드71300-3)을 사용해서, 첨부의 프로토콜에 따라서 실시했다. 간단하게는, 125㎖의 삼각 플라스크에 50㎍/㎖ Ampicillin(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)을 포함하는 LB배지 50㎖에 각 콜로니를 현탁하고, Kit의 시약을 첨가하고, 37℃에서 16시간 배양했다. 그 균체액의 OD600nm을 측정하고, OD600nm=20, 1㎖에 상당하는 균체를 원심분리에 의해 침전물로 회수했다. 침전물을 200㎕의 BugBuster에 의해 파쇄하고, 원심분리에 의해 침전물를 얻었다. 침전물을 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동(SDS-PAGE)용의 Sample Buffer로 가용화하고, 15% 아크릴아미드겔 SDS-PAGE에 걸고, CBB염색을 실시했다. 그 결과, proMMP-7 발현량의 증가와 분해의 억제효과 증강이 확인되었다.
본 조제예에 있어서는 이하의 서열로 이루어지는 프라이머를 사용했다.
P1: ccataggtcc aagaacaatt gtctctg (서열번호 1)
P2: caatccaatg aatgaatgaa tggatg (서열번호 2)
P3: catatgaaac aaagcactat tgcactggca ctcttaccgt tactgtttac ccctgtgacc aaggccctgc cgctgcctca g (서열번호 3)
P4: ggatccctat ttctttcttg aattac (서열번호 4)
M2: ctgtttaccc ctgtgaccaa ggaactgccg ctgcc (서열번호 5)
P6: cttggtcaca ggggtaaaca gtggcggtaa gag (서열번호 6)
실시예 1
≪1가 양이온 염화물에 의한 MMP-7 회합체의 형성 억제효과≫
(1) MMP-7의 제조
조제예에 기재된 방법에 의해 수득된 proMMP-7 생산 대장균(MMP7L13P-A21E균)을 종균으로 해서 글루코스 배지에서 배양ㆍ증식하고, 이소프로필-β-티오갈락토피라노사이드(IPTG)에 의한 proMMP-7의 발현 유도를 실시했다. 배양액으로부터 균체를 회수하고, French press에 의해 파쇄했다. 해당 파쇄액을 원심분리하고, 침전물에 봉입체를 회수했다. 이어서, 봉입체를 0.1M Tris-HCl(pH7.5) 및 0.1M 디티오트레이톨을 포함하는 6M 염산 구아니딘으로 용해하고, 0.1mM 초산아연, 10mM 염화칼슘, 0.2M 염화나트륨 및 1.0% Brij35을 포함하는 50mM HEPES 완충액(pH7.5)으로 리폴딩한 후, 통상의 방법에 의해, proMMP-7을 이온교환 크로마토그래피 및 소수 크로마토그래피로 정제했다. 수득된 proMMP-7을 47∼48℃로 가열 처리해서 자기 활성화를 실시하고, MMP-7을 얻었다. 수득된 MMP-7은 40mM NaCl, 10mM CaCl2 및 3.5% 만니톨을 포함하는 5mM 트리스 완충액(pH7)을 사용하고, 한외여과막에 의한 희석과 농축을 반복하고, -80℃에서 보존했다.
(2) MMP-7 회합체의 측정
상기 (1)에서 수득된 고농도의 MMP-7 용액을, 5mM 염화칼슘(CaCl2)을 포함하는 물에 염화나트륨(NaCl) 또는 염화칼륨(KCl)을 용해한 용액으로 희석하고, 시료 1 및 시료 2을 조제했다.
시료 1: 1㎎/㎖ MMP-7/5mM CaCl2/ 각 농도 NaCl(10∼160mM)
시료 2: 1㎎/㎖ MMP-7/5mM CaCl2/ 각 농도 KCl(10∼160mM)
MMP-7의 회합체 형성에 있어서의 염화나트륨 및 염화칼륨의 영향을, 상기의 각 시료 100㎕을 사용해서 동적 광산란법(기재; Wyatt Technology DynaPro(Protein Solutions) Titan, 셀; Wyatt Technology 12uL Cell 8.5mm Centre Height, 측정온도; 20℃)에 의해 조사했다. 각 시료 중의 MMP-7의 분자량을 측정ㆍ해석하고, MMP-7의 단량체 분자량(약 19kDa)에 의거해서 분자량 38kDa 이하의 경우를 단량체로 판정했다. 그 결과, 10mM∼80mM NaCl용액 중에서는 MMP-7의 분자량은 20∼29kDa가 되고, 단량체로서 존재하는 것이 밝혀졌다. 염화칼륨을 사용했을 경우도 동일하게 10mM∼80mM KCl 용액 중에 있어서 단량체로 존재한다는 결과가 수득되었다(도 1). 도면 중의 점선은 분자량 38kDa를 나타낸다.
실시예 2
≪MMP-7 회합체의 형성 억제에 있어서의 염화칼슘의 영향≫
실시예 1-(1)에서 수득된 MMP-7 용액을, 물에 염화칼슘 및 염화나트륨을 용해한 용액으로 희석하고, 시료 3을 조제했다.
시료 3: 1㎎/㎖ MMP-7/ 각 농도 CaCl2(0∼30mM)/ 각 농도 NaCl(0∼160mM)
각 농도의 염화칼슘 존재 하에서의 MMP-7 회합체 형성억제에 대한 영향을 실시예 1-(2)의 방법에 따라서 조사했다.
그 결과, 0mM CaCl2일 때 40mM 이하의 NaCl로, 5mM CaCl2일 때 80mM 이하의 NaCl로, 10mM CaCl2일 때 100mM 이하의 NaCl로, 20mM CaCl2일 때 120mM 이하의 NaCl로, 및 30mM CaCl2일 때 130mM 이하의 NaCl로 각각 단량체를 형성하는 것이 나타났다. 또, 단지 물로 희석했을 경우도 MMP-7 단량체의 형성이 인정되었다. 이상에서, 130mM 이상의 NaCl 존재 하에서 MMP-7의 회합체는 형성되지만, 이것에 30mM 이하(∼30mM)의 CaCl2를 공존시키는 것에 의해, MMP-7 회합체의 형성은 억제되는 것이 밝혀졌다. 즉, 당해 농도의 염화칼슘은 더 효과적으로 MMP-7의 단량체를 유지하며, 또 안정화시키는 효과를 갖는다(도 2).
실시예 3
≪MMP-7 회합체 형성에서의 MMP-7 농도의 영향≫
실시예 1-(1)에서 수득된 MMP-7 용액을 10mM CaCl2 및 각 농도의 염화나트륨을 함유하는 용액으로 희석하고, 각 농도의 MMP-7을 함유하는 시료 4를 조제했다.
시료 4: 각 농도 MP-7 (10, 15, 20㎎/㎖)/10mM CaCl2/각 농도 NaCl(50∼250mM)
MMP-7 회합체 형성억제효과 에 대한 MMP-7의 농도 영향을, 사이즈 배제 크로마토그래피법 (HPLC기재; HEWLETT PACKED 1100 series, 담체; TOYOPARL HW50S, 처리온도; 25℃, 유속 0.5㎖/min, 검출파장 280nm)에 의해 조사했다. 칼럼 사이즈는 직경 5mm, 길이 150mm의 것을 사용하고, 칼럼의 평형화는 5mM Tis-HCl(pH7), 10mM CaCl2, 3.5% 만니톨에 40∼500mM NaCl을 포함하는 용액으로 실시했다.
본 조건에서는 분자량 60kDa∼80kDa의 단백질은 허공용적으로 출현한다(크로마토그래피 개시 후, 1.8분). 따라서, 크로마토그래피 개시 후 2분 근방의 피크(또는 리딩피크)를 MMP-7의 회합체로 하고, 해당 피크의 면적을 지표로 해서, MMP-7이 회합체를 형성하는 염화나트륨의 농도를 산출했다.
그 결과, MMP-7의 농도에 의존해서 염화나트륨에 의한 MMP-7 회합체의 형성 억제효과는 약해지지만, 20㎎/㎖ 이하의 MMP-7에 있어서는, 0∼80mM의 NaCl에 의해 MMP-7은 단량체로서 존재하는 것이 밝혀졌다 (도 3). 실시예 2의 결과(도 2 )로부터, 염화칼슘의 농도를 증가하는 것에　의해, MMP-7의 단량체가 유지되는 염화나트륨의 농도도 비례적으로 증가하는 것은 명백하고, 본 실시예에 있어서 30mM CaCl2의 농도를 사용했을 경우, 100mM NaCl 존재하에서도 20㎎/㎖의 MMP-7은 단량체로서 존재하는 것이 추측된다. 추가로 20㎎/㎖ 이상의 MMP-7을 사용했을 경우, 염화칼슘의 농도를 증가시키는 것에　의해, MMP-7을 단량체로서 유지되는 것이 추측된다.
시료 4를 4℃에서 하룻밤 방치한 후에, 상기와 동일한 실험을 실시했지만, 도 3과 동일한 결과가 수득되었다.
실시예 4
≪MMP-7의 회합체 형성에 의한 효소활성으로의 영향≫
실시예 1-(1)에서 수득된 MMP-7 용액을, 40mM NaCl, 10mM CaCl2를 포함하는 5mM 트리스 완충액(pH7)으로 희석하고, 각 농도의 MMP-7을 함유하는 시료 5를 조제했다.
시료 5: 각 농도 MMP-7 (0.1, 2, 20㎎/㎖)/10mM CaCl2/40mM NaCl/5mM 트리스 완충액(pH7)
각 농도의 MMP-7 용액을, 150mM NaCl, 10mM CaCl2를 포함하는 50mM트리스 완충액(pH7) 또는 40mM NaCl, 10mM CaCl2를 포함하는 10mM트리스 완충액(pH7)으로 0.1㎎/㎖가 되도록 희석한 후(1차 희석), 추가로 각 용액을 150mM NaCl, 10mM CaCl2를 포함하는 50mM트리스 완충액(pH7)으로 5ng/㎖에 희석하고(2차 희석), 당해 희석액에 대해서, MMP-7 활성측정 Kit(ANASPEC사)을 사용하고, 첨부의 프로토콜에 따라서, 형광기질(Dnp-Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-Ala-D-Arg-NH2; 서열번호 7)에 대한 절단 활성을 측정했다.
그 결과, 1차 희석에 있어서 150mM NaCl을 포함하는 트리스 완충액(pH7)으로 희석한 2㎎/㎖ 이상의 MMP-7에서는 효소활성이 저하되었다(도 4). 이 효소활성의 저하는 MMP-7 회합체의 형성과 일치한다. 한편, 0.1㎎/㎖ 이하의 농도에서는 효소활성의 저하가 인정되지 않기 때문에, 당해 농도의 MMP-7에 있어서는 적어도 150mM NaCl에 의한 회합체의 형성은 발생하지 않음이 시사된다.
실시예 5
≪한외여과막에 의한 MMP-7의 농축공정에서의 염화나트륨 농도의 영향≫
실시예 1- (1)에서 수득된 MMP-7 용액을, 10mM CaCl2를 포함하는 5mM 트리스 완충액(pH7)으로 희석하고, 각 농도의 염화나트륨을 함유하는 시료 6을 조제했다.
시료 6: 4㎎/㎖ MMP-7/10mM CaCl2/각 농도NaCl (40mM, 80mM, 200mM, 500mM)/5mM 트리스 완충액(pH7)
시료 6의 각 4㎖를 한외여과막(Amicon Ultra-410K)을 사용해서 원심 농축(2500g)하고, 일정시간마다 여과액의 용량과 농축액의 흡광도를 측정했다.
그 결과, 농도가 연한 염화나트륨을 사용한 것이, 단시간에 MMP-7을 농축할 수 있고, 고염 농도에서는 농축에 장시간이 필요했다(표 1). 표 1의 기호 (-)는 농축종료를 나타낸다.
Figure pct00001
실시예 6
≪만니톨에 의한 MMP-7의 흡착 억제효과≫
(1) MMP-7의 겔로의 흡착 억제
실시예 1-(1)에서 수득된 MMP-7 용액을, 10mM CaCl2 및 40mM NaCl를 포함하는 5mM 트리스 완충액(pH7)으로 희석하고, 시료 7을 조제했다.
시료 7: 5.5㎎/㎖ MMP-7/10mM CaCl2/40mM NaCl
시료 7에 1㎖를, 미리 10mM CaCl2 및 40mM NaCl을 포함하는 5mM 트리스 완충액(pH7)으로 평형화한 칼럼(HW40F, 26x6cm, TOSOH CORPORATION.)에 걸고, 같은 트리스 완충액으로 세정 후, 3.5% 만니톨을 함유하는 같은 트리스 완충액으로 용출(유속 5㎖/min) 했다.
그 결과, 겔에 흡착한 MMP-7이 만니톨에 의해 용출되었다(도 5). 이 결과는 만니톨이 MMP-7의 겔로의 흡착 억제효과를 가지는 것을 시사한다.
(2) MMP-7의 용기 벽으로의 흡착 억제
실시예 1-(1)에서 수득된 MMP-7 용액을, 10mM CaCl2, 40mM NaCl 및 만니톨, 수크로오스를 포함하는 5mM 트리스 완충액(pH7)으로 희석하고, 바이알 중에 시료 8∼10의 용액(1㎖)을 조제했다. 각 시료의 삼투압이 같아지도록 이것들의 농도를 조정했다. 만니톨, 수크로오스를 포함하지 않는 같은 트리스 완충액으로 희석한 것(시료 10)을 컨트롤로 했다.
시료 8: 50㎍/㎖ MMP-7/10mM CaCl2/40mM NaCl/5mM 트리스 완충액(pH7)/3.5% 만니톨
시료 9: 50㎍/㎖ MMP-7/10mM CaCl2/40mM NaCl/5mM 트리스 완충액(pH7)/6.6% 수크로오스
시료 10: 50㎍/㎖ MMP-7/10mM CaCl2/40mM NaCl/5mM 트리스 완충액(pH7)
실온에서 3시간 방치 후, 바이알 중의 각 용액을 2단계로 희석했다. 1차 희석으로 10mM CaCl2, 40mM NaCl을 포함하는 5mM 트리스 완충액(pH7), 2차 희석으로 1% Blovk Ace(Blovk Ace 분말: DS Pharma Biomedical사 사)/TBS-T(0.05% Tween20/50mM Tris/150mM NaCl)을 사용했다. 용액 중의 MMP-7을 ELISA에 의해 정량했다. ELISA에는 MMP-7을 토끼에 면역해서 수득된 토끼 항MMP-7항체, 해당 토끼 항MMP-7항체를 비오틴 표지 시약(Biotin (Long Arm) NHS-Water Soluble: 벡터사)으로 표지한 비오틴 표지 토끼 항MMP-7항체, 서양 와사비 퍼옥시다아제(HRP) 표지 스트렙타아비딘(Horseradish Peroxidase Streptavidin, Concentrate; 벡터사), 및 HRP기질용액(Peroxidase Substrate Solution B: KPL사)를 사용했다. ELISA 반응의 컨트롤로서 농도가 분명한 MMP-7의 ELISA용 스탠더드를 사용했다. 해당 MMP-7의 농도는 흡광도를 측정하는 것에 의해 산출했다.
그 결과, 무첨가(시료 10)에 비해서, 만니톨(시료 8), 수크로오스(시료 9)를 첨가했을 경우, MMP-7의 회수율이 높고, 이것들의 흡착 억제효과가 확인되었다(도 6).
이어서, MMP-7의 용기 벽으로의 흡착 저지에 대한 만니톨 및 수크로오스의 유효농도 및 MMP-7의 효소활성으로의 영향을 조사했다. 실시예 1-(1)에서 수득된 MMP-7 용액을, 만니톨 또는 수크로오스를 포함하는 10mM CaCl2, 40mM NaCl 및 5mM 트리스 완충액(pH7)으로 희석하고, 바이알 중에 시료 12∼16의 용액(1㎖)을 조제했다. 만니톨, 수크로오스를 포함하지 않는 같은 트리스 완충액으로 희석한 것(시료11)을, 각 시료의 컨트롤로 했다.
시료 11: 50㎍/㎖ MMP-7/10mM CaCl2/40mM NaCl/5mM 트리스 완충액(pH7)
시료 12: 50㎍/㎖ MMP-7/10mM CaCl2/40mM NaCl/5mM 트리스 완충액(pH7)/1% 만니톨
시료 13: 50㎍/㎖ MMP-7/10mM CaCl2/40mM NaCl/5mM 트리스 완충액(pH7)/2% 만니톨
시료 14: 50㎍/㎖ MMP-7/10mM CaCl2/40mM NaCl/5mM 트리스 완충액(pH7)/2% 수크로오스
시료 15: 50㎍/㎖ MMP-7/10mM CaCl2/40mM NaCl/5mM 트리스 완충액(pH7)/5% 만니톨
시료 16: 50㎍/㎖ MMP-7/10mM CaCl2/40mM NaCl/5mM 트리스 완충액(pH7)/7% 수크로오스
실온에서 3시간 방치 후, 바이알 중의 각 용액을 2단계로 희석했다. 1차 희석액으로 0.01% Briji35, 0.01% BSA, 150mM NaCl, 10mM CaCl2를 포함하는 50mM트리스 완충액(pH7)으로 5ng/㎖에 희석하고, 실시예 4과 동일하게 형광기질에 대한 절단활성(MMP-7의 효소활성)을 측정했다. 본 시험에서는 펩티드 연구소로부터 입수한 형광기질(MOCAc-Pro-Leu-Gly-Leu-A2pr(Dnp)-Ala-Arg-NH2; (7-Methoxycoumarin-4-yl)acetyl-L-prolyl-L-leucylglycyl-L-leucyl-[Nβ-(2,4-dinitrophenyl)-L-2,3-diaminopropionyl]-L-alanyl-L-arginine amide; 서열번호 9)를 사용했다. 또, 2차 희석으로 1% Blovk Ace(Blovk Ace 분말: DS Pharma Biomedical사 사)/TBS-T(0.05% Tween20/50mM Tris/150mM NaCl)을 사용하고, 상기 ELISA에 의해 용액 중의 MMP-7을 정량했다.
그 결과, 무첨가(시료11)에 비해, 2∼5% 만니톨(시료 13, 15), 2∼7% 수크로오스(시료 14, 16)를 첨가했을 경우, MMP-7의 회수율이 높고, 이들 용기 벽으로 흡착 억제효과가 확인되었다(도 7). 또 동일 첨가에 의해 MMP-7의 효소활성 저하는 인정되지 않았다(도 8).
실시예 7
≪MMP-7 회합체의 형성 억제에서의 만니톨의 영향≫
실시예 1-(1)에서 수득된 MMP-7 용액을, 스핀 필터를 사용하고, 각 농도의 NaCl, 5mM CaCl2, 3.5% 만니톨을 포함하는 5mM 트리스 완충액(pH7)로 버퍼 교환한 후, 같은 트리스 완충액으로 희석하고, 시료 17∼22을 조제했다. 만니톨을 포함하지 않는 같은 트리스 완충액으로 동일하게 처리한 것(시료17)을 각 시료의 컨트롤로 했다.
시료 17: 10mM NaCl/1㎎/㎖ MMP-7/5mM CaCl2
시료 18: 10mM NaCl/1㎎/㎖ MMP-7/5mM CaCl2/3.5% 만니톨
시료 19: 40mM NaCl/1㎎/㎖ MMP-7/5mM CaCl2/3.5% 만니톨
시료 20: 80mM NaCl/1㎎/㎖ MMP-7/5mM CaCl2/3.5% 만니톨
시료 21: 120mM NaCl/1㎎/㎖ MMP-7/5mM CaCl2/3.5% 만니톨
시료 22: 180mM NaCl/1㎎/㎖ MMP-7/5mM CaCl2/3.5% 만니톨
각 시료를 실시예 1- (2)에 기재된 동적 광산란법에 의해, MMP-7의 분자량을 측정했다. 그 결과, MMP-7은 40mM 이상의 염화나트륨에 의해 회합체를 형성하는 것이 나타났다(도 9).
(산업상의 이용가능성)
본원 발명의 MMP-7 회합체의 단량체화 방법은 MMP-7의 제조 및 제제화에 이용될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> THE CHEMO-SERO-THERAPEUTIC RESEARCH INSTITUTE <120> Method For Monomerizing Matrix Metalloproteinase 7 (Mmp-7) Aggregate <130> 672389 <150> JP 2014-105452 <151> 2014-05-21 <160> 9 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer used for the cloning of a pro-matrix metalloproteinase-7 gene <400> 1 ccataggtcc aagaacaatt gtctctg 27 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer used for the cloning of a pro-matrix metalloproteinase-7 gene <400> 2 caatccaatg aatgaatgaa tggatg 26 <210> 3 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer used to obtain a DNA fragment consisting of an alkaline phosphatase signal peptide and a pro-matrix metalloproteinase-7 <400> 3 catatgaaac aaagcactat tgcactggca ctcttaccgt tactgtttac ccctgtgacc 60 aaggccctgc cgctgcctca g 81 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer used to obtain a DNA fragment consisting of an alkaline phosphatase signal peptide and a pro-matrix metalloproteinase-7 <400> 4 ggatccctat ttctttcttg aattac 26 <210> 5 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer used to obtain a DNA fragment consisting of a modified alkaline phosphatase signal peptide and a pro-matrix metalloproteinase-7 <400> 5 ctgtttaccc ctgtgaccaa ggaactgccg ctgcc 35 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer used to obtain a DNA fragment consisting of a modified alkaline phosphatase signal peptide and a pro-matrix metalloproteinase-7 <400> 6 cttggtcaca ggggtaaaca gtggcggtaa gag 33 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> A DNP-protein of fluorescent substrate used for measuring the activity of MMP-7 <400> 7 Pro Leu Gly Leu Trp Ala Arg 1 5 <210> 8 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Amino acid sequence of a signal peptide of alkaline phosphatase <400> 8 Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr 1 5 10 15 Pro Val Thr Lys Ala 20 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> A MOCAc-protein of fluorescent substrate used for measuring the activity of MMP-7 <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa=Nbeta-(2,4-dinitrophenyl)-L-2,3-diaminopropionyl <400> 9 Pro Leu Gly Leu Xaa Ala Arg 1 5

Claims (46)

130mM 이하의 1가 양이온 화합물을 함유하는 용액 또는 1가 양이온 화합물을 함유하지 않는 용액으로 매트릭스 메탈로프로테아제-7(MMP-7)의 회합체를 처리하는 것을 포함하는 MMP-7 회합체의 단량체화 방법.
제1 항에 있어서, 130mM 이하의 1가 양이온 화합물을 함유하는 용액으로 MMP-7의 회합체를 처리하는 단량체화 방법.
제1 항에 있어서, 1가 양이온 화합물을 함유하지 않는 용액으로 MMP-7의 회합체를 처리하는 단량체화 방법.
제1 항 또는 제2 항에 있어서, 상기 1가 양이온 화합물의 농도가 100mM 이하인 단량체화 방법.
제1 항, 제2 항 또는 제4 항에 있어서, 상기 1가 양이온 화합물의 농도가 80mM 이하인 단량체화 방법.
제1 항, 제2 항, 제4 항 또는 제5 항에 있어서, 상기 1가 양이온 화합물의 농도가, 40mM 이하인 단량체화 방법.
제1 항, 제2 항, 제4 항, 제5 항 또는 제6 항에 있어서, 상기 1가 양이온 화합물이 염화나트륨, 염화칼륨, 황산나트륨, 황산칼륨, 탄산나트륨, 탄산칼륨, 인산나트륨 및 인산칼륨으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 단량체화 방법.
제1 항, 제2 항, 제4 항, 제5 항 또는 제6 항에 있어서, 상기 1가 양이온 화합물이 1가 양이온 염화물에 유래하는 것인 단량체화 방법.
제8 항에 있어서, 상기 1가 양이온 염화물이 염화나트륨 및 염화칼륨으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 단량체화 방법.
제1 항 내지 제9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액이 추가로 염화칼슘을 함유하는 단량체화 방법.
제10 항에 있어서, 상기 염화칼슘의 농도가 30mM 이하인 단량체화 방법.
제1 항 내지 제11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액이 완충액인 단량체화 방법.
제12 항에 있어서, 상기 완충액이 5∼25mM의 트리스 완충액인 단량체화 방법.
제1 항 내지 제13 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MMP-7의 농도가 20㎎/㎖ 이하인 단량체화 방법.
제13 항 또는 제14 항에 있어서, 상기 용액이 30∼40mM 염화나트륨 및 5∼30mM 염화칼슘을 함유하는 5∼25mM 트리스 완충액(pH6∼8)인 단량체화 방법.
제1 항 내지 제15 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액이 추가로 당 알코올 및/또는 당류를 함유하는 단량체화 방법.
제16 항에 있어서, 상기 당 알코올 및/또는 당류가 수크로오스, 락토오스, 말토오스, 크실로오스, 트레할로오스, 만니톨, 솔비톨, 크실리톨, 말티톨, 락티톨, 및 올리고당 알코올로 이루어지는 그룹에서 선택되는 단량체화 방법.
제16 항 또는 제17 항에 있어서, 상기 당 알코올 및/또는 당류가 2% 이상인 단량체화 방법.
제18 항에 있어서, 상기 당 알코올 및/또는 당류가 2∼7%인 단량체화 방법.
제17 항 내지 제19 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 당 알코올 및/또는 당류가 만니톨 또는 수크로오스인 단량체화 방법.
제20 항에 있어서, 상기 만니톨이 2∼5%, 상기 수크로오스가 2∼7%인 단량체화 방법.
제1 항 내지 제21 항 중 어느 한 항에 기재된 단량체화 방법으로 이루어지는 공정을 포함하는 MMP-7의 제조방법.
제22 항에 있어서, 상기 공정이 130mM 이상의 1가 양이온 화합물 함유액을 사용한 처리공정 후에 이루어지는 제조방법.
제22 항 또는 제23 항에 있어서, 하기 (1)∼ (5)의 공정을 포함하는 제조방법:
(1) proMMP-7 봉입체 생산세포를 파쇄하는 공정,
(2) proMMP-7봉입체를 용해/리폴딩 처리하는 공정,
(3) proMMP-7을 정제하는 공정,
(4) proMMP-7을 자기 활성화해서 MMP-7로 하는 공정, 및
(5) 제1 항 내지 제21 항 중 어느 한 항에 기재된 단량체화 방법으로 이루어지는 공정.
제24 항에 있어서, 상기 (5)의 공정이 한외여과막을 사용한 농축공정인 제조방법.
130mM 이하의 1가 양이온 화합물을 함유하는 용액 또는 1가 양이온 화합물을 함유하지 않는 용액 중에 매트릭스 메탈로프로테아제-7(MMP-7)를 유효성분으로서 함유하는 MMP-7 함유 (의약)조성물.
제26 항에 있어서, 130mM 이하의 1가 양이온 화합물을 함유하는 용액 중에 MMP-7을 유효성분으로서 함유하는 MMP-7 함유 (의약)조성물.
제26 항에 있어서, 1가 양이온 화합물을 함유하지 않는 용액 중에 MMP-7을 유효성분으로서 함유하는 MMP-7 함유 (의약)조성물.
제26 항 또는 제27 항에 있어서, 상기 1가 양이온 화합물이 염화나트륨, 염화칼륨, 황산나트륨, 황산칼륨, 탄산나트륨, 탄산칼륨, 인산나트륨 및 인산칼륨으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 MMP-7 함유 (의약)조성물.
제26 항 또는 제27 항에 있어서, 상기 1가 양이온 화합물이 1가 양이온 염화물에 유래하는 것인 MMP-7 함유 (의약)조성물.
제30 항에 있어서, 상기 1가 양이온 염화물이 염화나트륨 및 염화칼륨으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 MMP-7 함유 (의약)조성물.
제26 항 내지 제31 항 중 어느 한 항에 있어서, 추가로, 염화칼슘을 함유하는 MMP-7 함유 (의약)조성물.
제32 항에 있어서, 상기 염화칼슘의 농도가 30mM 이하인 MMP-7 함유 (의약)조성물.
제26 항 내지 제33 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액이 완충액인 MMP-7 함유 (의약)조성물.
제34 항에 있어서, 상기 완충액이 5∼25mM의 트리스 완충액인 MMP-7 함유 (의약)조성물.
제26 항 내지 제35 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MMP-7의 농도가 20㎎/㎖ 이하인 MMP-7 함유 (의약)조성물.
제36 항에 있어서, 상기 MMP-7의 농도가 1㎍/㎖∼1㎎/㎖인 MMP-7 함유 (의약)조성물.
제35 항, 제36 항 또는 제37 항에 있어서, 상기 용액이 30∼40mM 염화나트륨 및 5∼30mM 염화칼슘을 함유하는 5∼25mM 트리스 완충액(pH6∼8)인 MMP-7 함유 (의약)조성물.
제26 항 내지 제38 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액이 추가로, 당 알코올 및/또는 당류를 함유하는 MMP-7 함유 (의약)조성물.
제39 항에 있어서, 상기 당 알코올 및/또는 당류가 수크로오스, 락토오스, 말토오스, 크실로오스, 트레할로오스, 만니톨, 솔비톨, 크실리톨, 말티톨, 락티톨, 및 올리고당 알코올로 이루어지는 그룹에서 선택되는 MMP-7 함유 (의약)조성물.
제39 항 또는 제40 항에 있어서, 상기 당 알코올 및/또는 당류가 2% 이상인 MMP-7 함유 (의약)조성물.
제41 항에 있어서, 상기 당 알코올 및/또는 당류가 2∼7%인 MMP-7 함유 (의약)조성물.
제40 항 내지 제42 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 당 알코올 및/또는 당류가 만니톨 또는 수크로오스인 MMP-7 함유 (의약)조성물.
제43 항에 있어서, 상기 만니톨이 2∼5%, 상기 수크로오스가 2∼7%인 MMP-7 함유 (의약)조성물.
용제에 용해할 수 있고, 그 용해 시의 조성물이 제26 항 내지 제44 항 중 어느 한 항에 기재된 조성물인 MMP-7 함유 (의약)고체 조성물.
제26 항 내지 제44 항 중 어느 한 항에 기재된 MMP-7 함유 (의약)조성물을 함유하는 추간판 헤르니아의 치료제.
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