JPWO2015178414A1 - マトリックスメタロプロテアーゼ7(mmp−7)会合体の単量体化方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)MMP-7会合体は、低濃度の1価陽イオン塩化物(塩化ナトリウム及び塩化カリウム等)を含むトリス緩衝液(pH6〜8)等の溶液で処理することにより、解離して単量体を形成する。1価陽イオン塩化物を含有しない同溶液で処理した場合においても同様に単量体を形成する。
(2)上記の処理によるMMP-7会合体の単量体化方法(以下、単に「単量体化方法」と称することもある)をMMP-7の製造工程に組み入れることにより、MMP-7の製造効率を上げることができる。特に、単量体化方法を、自己活性化によりproMMP-7をMMP-7に変換した直後の限外ろ過膜処理工程に組み入れることにより、より大きな効果が得られる。
(3)MMP-7単量体は高い酵素活性を維持する。
(4)上記のトリス緩衝液にマンニトール、スクロース等の糖類又は糖アルコールを含有させることにより、MMP-7の会合体形成抑制だけでなく、MMP-7のゲル及びバイアル器壁への吸着が抑制される。すなわち、水溶液とした場合に体液と等張となる150mM程度より低い濃度の1価陽イオン塩化物と、糖アルコール又は糖類とを含有する組成物とすることにより、MMP-7の会合体形成及び吸着が抑制された医薬製剤となる。
[1]130mM以下の1価陽イオン化合物を含有する溶液又は1価陽イオン化合物を含有しない溶液でマトリックスメタロプロテアーゼ−7(MMP-7)の会合体を処理することを含む、MMP-7会合体の単量体化方法。
[2]130mM以下の1価陽イオン化合物を含有する溶液でMMP-7の会合体を処理する、[1]に記載の単量体化方法。
[3]1価陽イオン化合物を含有しない溶液でMMP-7の会合体を処理する、[1]に記載の単量体化方法。
[4]前記1価陽イオン化合物の濃度が、100mM以下である、[1]又は[2]に記載の単量体化方法。
[5]前記1価陽イオン化合物の濃度が、80mM以下である、[1]、[2]又は[4]に記載の単量体化方法。
[6]前記1価陽イオン化合物の濃度が、40mM以下である、[1]、[2]、[4]又は[5]に記載の単量体化方法。
[7]前記1価陽イオン化合物が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、リン酸ナトリウム及びリン酸カリウムからなる群より選択される、[1]、[2]、[4]、[5]又は[6]に記載の単量体化方法。
[8]前記1価陽イオン化合物が、1価陽イオン塩化物に由来するものである、[1]、[2]、[4]、[5]又は[6]に記載の単量体化方法。
[9]前記1価陽イオン塩化物が、塩化ナトリウム及び塩化カリウムからなる群より選択される、[8]に記載の単量体化方法。
[10]前記溶液が、更に塩化カルシウムを含有する、[1]から[9]の何れか一項に記載の単量体化方法。
[11]前記塩化カルシウムの濃度が、30mM以下である、[10]に記載の単量体化方法。
[12]前記溶液が、緩衝液である、[1]から[11]の何れか一項に記載の単量体化方法。
[13]前記緩衝液が、5〜25mMのトリス緩衝液である、[12]に記載の単量体化方法。
[14]前記MMP-7の濃度が、20mg/ml以下である、[1]から[13]の何れか一項に記載の単量体化方法。
[15]前記溶液が、30〜40mM塩化ナトリウム及び5〜30mM塩化カルシウムを含有する5〜25mMトリス緩衝液(pH6〜8)である、[13]又は[14]に記載の単量体化方法。
[16]前記溶液が、更に糖アルコール及び/又は糖類を含有する、[1]から[15]の何れか一項に記載の単量体化方法。
[17]前記糖アルコール及び/又は糖類が、スクロース、ラクトース、マルトース、キシロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、及びオリゴ糖アルコールからなる群より選択される、[16]に記載の単量体化方法。
[18]前記糖アルコール及び/又は糖類が、2%以上である、[16]又は[17]に記載の単量体化方法。
[19]前記糖アルコール及び/又は糖類が、2〜7%である、[18]に記載の単量体化方法。
[20]前記糖アルコール及び/又は糖類が、マンニトール又はスクロースである、[17]から[19]の何れか一項に記載の単量体化方法。
[21]前記マンニトールが2〜5%、前記スクロースが2〜7%である、[20]に記載の単量体化方法。
[22][1]から[21]の何れか一項に記載の単量体化方法からなる工程を含む、MMP-7の製造方法。
[23]前記工程が、130mM以上の1価陽イオン化合物含有液を用いた処理工程後に行われる、[22]に記載の製造方法。
[24]下記(1)〜(5)の工程を包含する、[22]又は[23]に記載の製造方法。
(1)proMMP-7封入体産生細胞を破砕する工程、
(2)proMMP-7封入体を溶解/リフォールディング処理する工程、
(3)proMMP-7を精製する工程、
(4)proMMP-7を自己活性化してMMP-7とする工程、及び
(5)[1]から[21]の何れか一項に記載の単量体化方法からなる工程
[25]前記(5)の工程が、限外ろ過膜を用いた濃縮工程である、[24]に記載の製造方法。
[26]130mM以下の1価陽イオン化合物を含有する溶液又は1価陽イオン化合物を含有しない溶液中にマトリックスメタロプロテアーゼ−7(MMP-7)を有効成分として含有する、MMP-7含有(医薬)組成物。
[27]130mM以下の1価陽イオン化合物を含有する溶液中にMMP-7を有効成分として含有する、[26]に記載のMMP-7含有(医薬)組成物。
[28]1価陽イオン化合物を含有しない溶液中にMMP-7を有効成分として含有する、[26]に記載のMMP-7含有(医薬)組成物。
[29]前記1価陽イオン化合物が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、リン酸ナトリウム及びリン酸カリウムからなる群より選択される、[26]又は[27]に記載のMMP-7含有(医薬)組成物。
[30]前記1価陽イオン化合物が、1価陽イオン塩化物に由来するものである、[26]又は[27]に記載のMMP-7含有(医薬)組成物。
[31]前記1価陽イオン塩化物が、塩化ナトリウム及び塩化カリウムからなる群より選択される、[30]に記載のMMP-7含有(医薬)組成物。
[32]更に、塩化カルシウムを含有する、[26]から[31]の何れか一項に記載のMMP-7含有(医薬)組成物。
[33]前記塩化カルシウムの濃度が、30mM以下である、[32]に記載のMMP-7含有(医薬)組成物。
[34]前記溶液が、緩衝液である、[26]から[33]の何れか一項に記載のMMP-7含有(医薬)組成物。
[35]前記緩衝液が、5〜25mMのトリス緩衝液である、[34]に記載のMMP-7含有(医薬)組成物。
[36]前記MMP-7の濃度が、20mg/ml以下である、[26]から[35]の何れか一項に記載のMMP-7含有(医薬)組成物。
[37]前記MMP-7の濃度が1μg/ml〜1mg/mlである、[36]に記載のMMP-7含有(医薬)組成物。
[38]前記溶液が、30〜40mM塩化ナトリウム及び5〜30mM塩化カルシウムを含有する5〜25mMトリス緩衝液(pH6〜8)である、[35]、[36]又は[37]に記載のMMP-7含有(医薬)組成物。
[39]前記溶液が、更に糖アルコール及び/又は糖類を含有する、[26]から[38]の何れか一項に記載のMMP-7含有(医薬)組成物。
[40]前記糖アルコール及び/又は糖類が、スクロース、ラクトース、マルトース、キシロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、及びオリゴ糖アルコールからなる群より選択される、[39]に記載のMMP-7含有(医薬)組成物。
[41]前記糖アルコール及び/又は糖類が、2%以上である、[39]又は[40]に記載のMMP-7含有(医薬)組成物。
[42]前記糖アルコール及び/又は糖類が、2〜7%である、[41]に記載のMMP-7含有(医薬)組成物。
[43]前記糖アルコール及び/又は糖類が、マンニトール又はスクロースである、[40]から[42]の何れか一項に記載のMMP-7含有(医薬)組成物。
[44]前記マンニトールが2〜5%、前記スクロースが2〜7%である、[43]に記載のMMP-7含有(医薬)組成物。
[45]溶剤に溶解し得て、その溶解時の組成物が[26]から[44]の何れか一項に記載の組成物である、MMP-7含有(医薬)固体組成物。
[46][26]から[45]の何れか一項に記載のMMP-7含有(医薬)組成物を含有する、椎間板ヘルニアの治療剤。
(1)APSPを有するproMMP-7発現ベクター(pETMMP7)の構築
腎臓のcDNAライブラリー(HumanMTC Panel I, Catalog#: K1420-1, BD社)よりプライマーP1(配列番号1)とP2(配列番号2)を用いてproMMP-7遺伝子をPCRにより増幅した。増幅されたDNAをクローニングベクター(pCRII-TOPO, Invitrogen)に挿入し、得られたDNAの塩基配列を決定した。塩基配列の決定は、DNAシークエンサーを用いて行った。当該塩基配列とデーターベース(Accession Numbers: NM002423)に登録されているproMMP-7の塩基配列のホモロジー検索を行い、proMMP-7遺伝子が挿入されたプラスミド(pCRproMMP-7)を得た。
GeneTailor Site-Directed Mutagenesis System(Invitrogen社)を用い、添付のプロトコールに従って、上記(1)で得たpETMMP7のAPSP配列(Met-Lys-Gln-Ser-Thr-Ile-Ala-Leu-Ala-Leu-Leu-Pro-Leu-Leu-Phe-Thr-Pro-Val-Thr-Lys-Ala;配列番号8)のシグナルペプチダーゼ認識部位に変異を導入した(APSP配列で示されるアミノ酸配列の13番目のロイシン(Leu)をプロリン(Pro)に、21番目のアラニン(Ala)をグルタミン酸(Glu)に置換した)。APSPの改変には、5'側プライマーとしてM2(配列番号5)及び3'側プライマーとしてP6(配列番号6)の配列を用いた。得られた改変型APSPを有するpETMMP7(L13P-A21E)で大腸菌(BL21(DE3))を形質転換し、proMMP-7を発現する組み換え大腸菌(MMP7L13P-A21E菌)を得た。
P1: ccataggtcc aagaacaatt gtctctg(配列番号1)
P2: caatccaatg aatgaatgaa tggatg(配列番号2)
P3: catatgaaac aaagcactat tgcactggca ctcttaccgt tactgtttac ccctgtgacc aaggccctgc cgctgcctca g(配列番号3)
P4: ggatccctat ttctttcttg aattac(配列番号4)
M2: ctgtttaccc ctgtgaccaa ggaactgccg ctgcc(配列番号5)
P6: cttggtcaca ggggtaaaca gtggcggtaa gag(配列番号6)
(1)MMP-7の製造
調製例に記載の方法により得たproMMP-7産生大腸菌(MMP7L13P-A21E菌)を種菌としてグルコース培地で培養・増殖し、イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド(IPTG)によるproMMP-7の発現誘導を行った。培養液から菌体を回収し、フレンチプレスにより破砕した。該破砕液を遠心分離し、沈渣に封入体を回収した。次いで、封入体を0.1M Tris-HCl(pH7.5)及び0.1Mジチオスレイトールを含む6M塩酸グアニジンで溶解し、0.1mM酢酸亜鉛、10mM塩化カルシウム、0.2M塩化ナトリウム及び1.0%Brij35を含む50mMHEPES緩衝液(pH7.5)でリフォールディングした後、常法により、proMMP-7をイオン交換クロマトグラフィー及び疎水クロマトグラフィーで精製した。得られたproMMP-7を47〜48℃で加熱処理して自己活性化を行い、MMP-7を得た。得られたMMP-7は、40mM NaCl、10mM CaCl2及び3.5%マンニトールを含む5mMトリス緩衝液(pH7)を用いて、限外ろ過膜による希釈と濃縮を繰り返し、−80℃で保存した。
上記(1)で得られた高濃度のMMP-7溶液を、5mM塩化カルシウム(CaCl2)を含む水に塩化ナトリウム(NaCl)または塩化カリウム(KCl)を溶解した溶液で希釈し、試料1及び試料2を調製した。
試料1:1mg/ml MMP-7/5mM CaCl2/各濃度NaCl(10〜160mM)
試料2:1mg/ml MMP-7/5mM CaCl2/各濃度KCl(10〜160mM)
実施例1-(1)で得られたMMP-7溶液を、水に塩化カルシウム及び塩化ナトリウムを溶解した溶液で希釈し、試料3を調製した。
試料3:1mg/ml MMP-7/各濃度CaCl2(0〜30mM)/各濃度NaCl(0〜160mM)
実施例1-(1)で得られたMMP-7溶液を10mM CaCl2及び各濃度の塩化ナトリウムを含有する溶液で希釈し、各濃度のMMP-7を含有する試料4を調製した。
試料4:各濃度MMP-7(10、15、20mg/ml)/10mM CaCl2/各濃度NaCl(50〜250mM)
実施例1-(1)で得られたMMP-7溶液を、40mM NaCl、10mM CaCl2を含む5mMトリス緩衝液(pH7)で希釈し、各濃度のMMP-7を含有する試料5を調製した。
試料5:各濃度MMP-7(0.1、2、20mg/ml)/10mM CaCl2/40mM NaCl/5mMトリス緩衝液(pH7)
実施例1-(1)で得られたMMP-7溶液を、10mM CaCl2を含む5mMトリス緩衝液(pH7)で希釈し、各濃度の塩化ナトリウムを含有する試料6を調製した。
試料6:4mg/ml MMP-7/10mM CaCl2/各濃度NaCl(40mM、80mM、200mM、500mM)/5mMトリス緩衝液(pH7)
(1)MMP-7のゲルへの吸着抑制
実施例1-(1)で得られたMMP-7溶液を、10mM CaCl2及び40mM NaClを含む5mMトリス緩衝液(pH7)で希釈し、試料7を調製した。
試料7:5.5mg/ml MMP-7/10mM CaCl2/40mM NaCl
実施例1-(1)で得られたMMP-7溶液を、10mM CaCl2、40mM NaCl及びマンニトール、スクロースを含む5mMトリス緩衝液(pH7)で希釈し、バイアル中に試料8〜10の溶液(1ml)を調製した。各試料の浸透圧が同じになるようにこれらの濃度を調整した。マンニトール、スクロースを含まない同トリス緩衝液で希釈したもの(試料10)をコントロールとした。
試料9:50μg/ml MMP-7/10mM CaCl2/40mM NaCl/5mMトリス緩衝液(pH7)/6.6%スクロース
試料10:50μg/ml MMP-7/10mM CaCl2/40mM NaCl/5mMトリス緩衝液(pH7)
試料12:50μg/ml MMP-7/10mM CaCl2/40mM NaCl/5mMトリス緩衝液(pH7)
/1% マンニトール
試料13:50μg/ml MMP-7/10mM CaCl2/40mM NaCl/5mMトリス緩衝液(pH7)
/2% マンニトール
試料14:50μg/ml MMP-7/10mM CaCl2/40mM NaCl/5mMトリス緩衝液(pH7)
/2% スクロース
試料15:50μg/ml MMP-7/10mM CaCl2/40mM NaCl/5mMトリス緩衝液(pH7)
/5% マンニトール
試料16:50μg/ml MMP-7/10mM CaCl2/40mM NaCl/5mMトリス緩衝液(pH7)
/7% スクロース
実施例1-(1)で得られたMMP-7溶液を、スピンフィルターを用いて、各濃度のNaCl、5mM CaCl2、3.5%マンニトールを含む5mMトリス緩衝液(pH7)でバッファー交換した後、同トリス緩衝液で希釈し、試料17〜22を調製した。マンニトールを含まない同トリス緩衝液で同様に処理したもの(試料17)を各試料のコントロールとした。
試料18:10mM NaCl/1mg/ml MMP-7/5mM CaCl2/3.5%マンニトール
試料19:40mM NaCl/1mg/ml MMP-7/5mM CaCl2/3.5%マンニトール
試料20:80mM NaCl/1mg/ml MMP-7/5mM CaCl2/3.5%マンニトール
試料21:120mM NaCl/1mg/ml MMP-7/5mM CaCl2/3.5%マンニトール
試料22:180mM NaCl/1mg/ml MMP-7/5mM CaCl2/3.5%マンニトール
Claims (46)
(1)proMMP-7封入体産生細胞を破砕する工程、
(2)proMMP-7封入体を溶解/リフォールディング処理する工程、
(3)proMMP-7を精製する工程、
(4)proMMP-7を自己活性化してMMP-7とする工程、及び
(5)請求項1から21の何れか一項に記載の単量体化方法からなる工程
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