JP2013518893A - 原核生物フェニルアラニンアンモニアリアーゼ変異体の組成物、及び、その組成物を用いる方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
原核生物フェニルアラニンアンモニアリアーゼ(phenylalanine ammonia-lyase)(PAL)変異体に関連する組成物を、原核生物PALの免疫原性及び/又はタンパク質分解感受性を低減させながら原核生物PALの触媒活性及び/又は安定性を向上させるためのそのような組成物の最適化を含めて本明細書中で提供する。また、治療目的、例えば、フェニルケトン尿症(phenylketonuria)(PKU)を含む高フェニルアラニン血症(hyperphenylalaninemia)(HPA)、及び癌を含む他の障害の治療目的の原核生物PAL変異体のそのような最適な組成物の使用を本明細書中で提供する。
フェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)は、植物[Koukolらの文献, J. Biol. Chem. 236:2692-2698 (1961); Hansonらの文献, The Enzymes 7:75-166 (1972); Poppeらの文献, Curr. Org. Chem. 7:1297-1315 (2003)]、ある真菌類[Raoらの文献, Can. J. Biochem. 4512:1863-1872 (1967); Abellらの文献, Methods Enzymol. 142:242-253 (1987)]、及び、細菌[Bezansonらの文献, Can. J. Microbiol. 16:147-151 (1970); Xiangらの文献, J. Biol. Chem. 277:32505-32509 (2002); Hillらの文献, Chem. Commun. 1358-1359 (2003)]に広く分布している非哺乳動物酵素であり、大腸菌(Escherichia coli)において組換えにより生産される。
原核性物又は細菌PALは、PKUを含むHPA、及び癌を含む他の障害に対する効果的な治療薬として役立つことができる。より強力な触媒活性、高い生化学的安定性、並びに、治療への適用のための、低減された免疫原性、及び/又は、長い生物学的半減期等の向上された特性を具備する、原核生物PALの組成物、及び、生物学的に活性のあるフラグメント、突然変異体、変異体又はその類似体を本明細書中で提供する。また、原核生物PAL、及び生物学的に活性のあるそのフラグメント、突然変異体、変異体又は類似体、並びに、保存剤及び/又は安定化剤を含んだ医薬として許容し得る担体を含む、医薬組成物及び配合物を本明細書中で提供する。また、原核生物PAL、及び生物学的に活性のあるそのフラグメント、突然変異体、変異体又は類似体の製造方法及び精製方法、並びに、PKUを含むHPA及び癌を含む他の疾患の治療を含む治療目的のそのような組成物の使用方法を本明細書中で提供する。
原核生物PAL、及び生物学的に活性のあるフラグメント、突然変異体、変異体又はその類似体の組成物、並びに、フェニルケトン尿症を含む高フェニルアラニン血症及び癌を含む他の障害の治療を含む治療目的のためのそれらの使用を本明細書中で提供する。
特に断りのない限り、本明細書及び特許請求の範囲を含めた本出願で用いる次の用語は、以下に示す定義を有する。本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いられる、単数形「ある(a)」、「ある(an)」及び「該(the)」は、文脈が明らかに他のことを示さなければ、複数の対象を含むことに注意する必要がある。標準的な化学用語の定義は、CareyとSundbergの文献, 上級有機化学(Advanced Organic Chemistry)第3版, A及びB巻(Plenum Press, New York 1992)を含む参考書籍で見出すことができる。本発明の実施には、特に示さなければ、当業者での、合成有機化学、質量分析、クロマトグラフィーの分取及び分析方法、タンパク質化学、生化学、組換えDNA技術、及び薬理学についての従来の方法を用いる。例えば、T.E. Creightonの文献, タンパク質:構造と分子特性(Proteins: Structures and Molecular Properties)(W.H. Freeman and Company, 1993);A.L. Lehningerの文献, 生化学(Biochemistry)(Worth Publishers, Inc., 第4版, 2004);Sambrookらの文献, 分子クローニング:実験マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)(第2版, 1989);酵素学における方法(Methods In Enzymology)(S. ColowickとN. Kaplan編集, Academic Press, Inc.);Remingtonの薬学(Remington's Pharmaceutical Sciences), 第18版(Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990)を参照されたい。
1)アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T);
2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
4)アルギニン(R)、リジン(K);
5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);及び、
6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)
また、アミノ酸は、次のように分類することができる。
(1)疎水性:Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2)中性親水性:Cys, Ser, Thr;
(3)酸性:Asp, Glu;
(4)塩基性:Asn, Gln, His, Lys, Arg;
(5)鎖配向に影響を及ぼす残基:Gly, Pro;及び、
(6)芳香族:Trp, Tyr, Phe
特定の巨大分子の信頼できる三次元構造又は構造モデルの解明は、合理的設計が、特異的構造、及び/又は当該巨大分子の機能の最適化のための生産的な方法になることを可能にする。PAL酵素の最適化の三次元構造又は構造モデルを用いる方法は、先の同時係属中の米国特許出願第11/230,374号(2005年9月19日出願;その全体において本明細書中に引用により組み込まれる)に記載される。原核生物PALの高分解能三次元タンパク質結晶構造が、原核生物PALの生化学特性及び生物物理学特性を改善する、及び、原核生物PALのインビボでの治療有効性を増加させるタンパク質工学を含む技術に関係する方法で使用することができる。野生型原核生物PALと比較して、高いフェニルアラニン変換活性、及び/又は低減された免疫原性を有する原核生物PAL変異体を本明細書中で提供する。また、野生型原核生物PALと比較して、高い生化学的安定性、及び/又は生化学的半減期を有する原核生物PAL変異体を本明細書中で提供する。
本明細書中で提供する野生型PALの生物学的に活性のある部位は、PALの動力学的特性を最適化するように改質することができる。最大半量活性を提供する基質の濃度であるKmは、許容範囲内(120μM〜240μMの範囲)でのPheレベルを維持するPALの治療有効性と密接に関連している。Kmは、基質における酵素の親和性である。親和性を制御することにより、様々な濃度で基質に対する酵素の有効性を制限又は制御することができる。例えば、Kmが1000μM(例えば、ロドスポリディウム トルロイデス由来のPAL)である場合、酵素活性は、240μMの血液Pheレベルで約12.5%、及び60μMの血液Pheレベルで約3%に低減される。Kmが240μMであれば、酵素活性は、240μMの血液Pheレベルで約50%、及び60μMの血液Pheレベルで約12%に低減される。Kmが120μMである場合は、酵素の活性は、240μMの血液Pheレベルにおいて約70%に低減され、60μMの血液Pheレベルにおいて約35%に低減されることになる。最適には、治療目的は、Pheを低減させるばかりでなく、約120μMから約240μMの最適範囲内に維持するのに十分な活性を有する酵素を有することである。高いKm(すなわち1000μM)を有する酵素は、Pheレベルが正常な範囲内まで低下すると急速に活性を失うとともに、高濃度又は大容量の投与物の非実用的な投与を必要とすることになる。一方、非常に低いKmを有する酵素は、Pheレベルを急速に減少させ、それは、高フェニルアラニン血症にとっては致命的であり得るが、癌の管理には有用であり得る。
多くの戦略は、一般にタンパク質免疫原性を低減させるために利用される。一部の実施態様においては、免疫反応を最小限にするために導入される改良は、巨大分子の構造、機能又は安定性を損なわない。用いられる有効な戦略は、ヒト配列含量を増やすこと(キメラ及び/又は他の‘ヒト化’アプローチ)、溶液物性を改良すること、抗体エピトープを除去すること、化学誘導体化(ペグ化など)を導入すること、及び/又は、MHCアグリトープを識別及び除去することを含む。注入による治療においては、インビボでの免疫反応性は、改良される合理的な突然変異生成が生じる及び/又は免疫原性のこれらの部位を突然変異させる前に、単独で、及び部位特異的ペグ化[Hershfieldらの文献, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7185-7189 (1991); Leongらの文献, Cytokine 16(3): 106-119 (2001); Leeらの文献, Pharm. Res. 20(5):818-825 (2003)]、又は、タンパク質免疫原性を許容されるレベルに低減させる他の化学誘導体化方法を組み合わせ、エピトープマッピングをすることで解消することができる。抗原表面タンパク質領域の改良は、免疫原性を低減させる[Chirinoらの文献, Drug Discov. Today 9(2):82-90 (2004)]。ある改良方法は、触媒活性(例えば、吸光度分析が活性測定に用いられる)を保持する、非常に小さなサイズのタンパク質の構築を含む。また、ELISAスクリーニングに結び付くタンパク質工学を用いて、低減された免疫反応性を有する突然変異体の同定をすることができる。他の方法は、ペグ化誘導体化のための追加的な表面リジン部位における点突然変異を導入するもので、この方法は、試験酵素プリンヌクレオシドホスホリラーゼで免疫原性を低減させることが明らかにされている[Hershfieldらの文献(1991), 前述の箇所]。別の経路は、タンパク質エピトープ領域に位置する残基の突然変異を用いて、免疫原部位を除去する[Yeungらの文献, J. Immunol. 172(11):6658-6665 (2004)]。抗体のヒト化(antibody humanization)と類似しているアプローチでは、相同ループ領域、及び/又はヒト抗体からの残基は、相同タンパク質の対応するループ領域に置換される。
巨大分子の化学修飾は、非特異的な方法(誘導体化された種を混合させる)、部位特異的な方法(野生型巨大分子の反応指向性誘導体化、及び/又は、部位特異的突然変異誘発と化学修飾を組み合わせて用いる部位選択性修飾)、又は、発現タンパク質ライゲーション法[Hofmannらの文献, Curr. Opin.Biotechnol. 13(4):297-303 (2002)]で行うことが可能である。一部の実施態様においては、化学修飾は、免疫原性を低減させるために用いられる。ペグ化は、タンパク質の免疫原性を低減させる実証された方法である[Bhadraらの文献, Pharmazie 57(l):5-29 (2002)]が、リン酸化、アミド化、カルボキシル化、アセチル化、メチル化、酸付加塩類、アミド、エステル、及び、N−アシル誘導体の形成を用いた修飾により、グリコシル化及び他の化学誘導体化方法も可能である[Davisの文献, Science 303:480-482 (2004)]。
共同出願された米国特許第7,531,341号の実施例7〜9には、ENU2又はBTBRenu2マウスにおけるPheレベルに対する、ロドスポリディウム トルロイデス由来のリジン突然変異体R91K PAL(RtPAL)、NpPAL、及び、AvPALのペグ化された及びペグ化されていない形態の影響が記載されている。この動物モデルは、動物で重度の高フェニルアラニン血症によって生じる、PAHの遺伝子座のホモ接合突然変異体である。高い血漿Pheレベルは、この動物を血漿Pheを低減させるPALの能力を評価するための適切なモデルにする。NpPAL及びAvPALのペグ化形態の投与により、ペグ化されていないNpPAL及びAvPALと比較して、ENU2マウスのPheがそれぞれ大きく低減される。そのような効果は、10週間にわたる毎週の注射でのNpPALにおいて維持される。これらの結果は、シアノバクテリア種である、ノストック パンクチフォルメ及びアナベナ バリアビリス由来のPALのペグ化が、PKUの影響を受けたマウスのPheレベルを低減させるのに不可欠であることを示すものである。
[D.原核生物PAL変異体の治療用途及び投与]
様々なHPA患者集団を治療する方法であって、HPA及び/又はPKUを管理するために原核生物PAL変異体組成物を単独で、又は他の治療法と組み合わせて使用することを含む方法を本明細書中で提供する。特に、通常は食事介入を用いないほど十分に低いフェニルアラニン濃度を有する患者集団(すなわち軽度HPAの患者)、中度PKU患者、古典的又は重度PKU患者、及びそれらの任意の部分集団を治療するために原核生物PAL変異体組成物を使用できることを意図するものである。軽度HPAの影響を改善するための原核生物PAL変異体組成物による治療の対象となる患者は、血清濃度が200μM未満の妊婦及び幼児を含む。様々な患者集団、及びそれらの異なる治療ニーズを本セクションで更に説明する。
重度PKUは、1200μMを超える血漿Phe濃度で顕在化し、4800μM程度になり得る。この障害を有する患者は、その血漿Phe濃度を臨床的に許容し得るレベル(典型的には、600μM未満又は300μM未満)まで低下させるために、Pheフリー食で治療される必要がある。これらの患者は、最大で1日当たり250〜350mgの食事性Pheのみを許容することが可能である(Spaapenらの文献、Mol. Genet Metab. 78:93〜99(2003))。そのように、これらの患者は、生後7〜10日でPhe制限処方食を開始し、残りの寿命に対してこの食事制限を負うことになる。これらの個人が負う厳格な食事制限の緩和が有益となる。
本明細書中で提供する組成物及び方法で治療することができる患者の第2のグループは、高い血漿Phe濃度、すなわち200μMを超える任意の濃度を有すると判断されたが、(以下に記載するBH4装薬試験によって判断されるように)BH4治療に対して非応答性であると診断された個人である。そのような患者としては、軽度PKU(すなわち、600μMまでの血漿Phe濃度)を有する個人、中度PKU(すなわち、600μMから約1200μMの血漿Phe濃度)を有する個人、並びに古典的な重度PKU(すなわち、1200μMを超える血漿Phe濃度)を有する患者を挙げることができる。
受胎が予定されているPKU女性及び妊娠しているPKU女性における血漿Pheレベルの代謝的制御は、胎児のPAH状態にかかわらず、子宮内の中程度に高いPheレベルであっても、それに暴露される胎児に深刻な結果がもたらされるため重要である。血漿Phe濃度の治療的制御は、十分な制御を達成することができなければ、小頭症、精神薄弱及び先天性心臓疾患を含む障害がもたらされるため、妊娠の最初の三半期において特に重要である。
本明細書全体を通じて記載するように、幼児(0歳から3歳)における血漿Phe濃度の上昇は、小児のIQの有意な低下をもたらすことが測定されてきた。しかし、本明細書の他の箇所に記載したように、400μM程度までの高い血漿Phe濃度を有する患者は、通常は、食事介入を受けない。したがって、0歳から3歳の年齢の幼児は、現在の治療から有意な悪影響を被る。本出願は、360μM±15μMを超える無制限の血漿Phe濃度を有する任意の幼児を、その被験者の血漿Phe濃度の有益な減少をもたらすために、原核生物PAL変異体を含む治療組成物で治療することを意図するものである。
(様々な形態の癌及びその治療方法)
また、様々な形態の癌を治療する方法であって、原核生物PAL変異体を含む医薬組成物の治療有効量を被験者に投与することを含む方法を本明細書中で提供する。広い実施態様においては、癌は、癌に由来する細胞の増殖及び/又は生存がフェニルアラニンの制限又は欠失に感受性のある癌である。ある実施態様においては、癌は、肺癌、脳若しくは中枢神経系の癌、結腸癌、前立腺癌、腎臓癌、肝臓癌又は転移性黒色腫である。他の実施態様においては、癌は、頭及び首の癌、卵巣癌、子宮癌、白血病(例えば、急性骨髄性白血病若しくは急性リンパ芽球性白血病)又は骨髄腫である。更に他の実施態様においては、癌は、小児癌又は抵抗性癌(すなわち、癌治療薬若しくは標的化癌治療薬に対して抵抗性を有することが証明された癌)である。
PKUのモデルであるPahemu2マウスの脳の詳細な神経病理的評価により、活性化された小グリア又はマクロファージ(CD11b+細胞)の数の増加、並びに脳の2つのドーパミン作動性領域、すなわち黒質(substantia nigra)(SN)及び視床下部における誘発性窒素酸化物合成酵素(inducible nitric oxide synthase)(iNOS)の免疫活性の増大が明らかになった(Emburyらの文献、Pediatr. Res. 58:283〜287、2005参照)。SNにおけるこの浸透CD11+細胞及びiNOS上方制御の存在は、パーキンソン病(Parkinson’s Disease)(PD)にも観察される。PD及びHPA/PKUの別の共通の特徴は、脳におけるドーパミンの低下であり、後者は、Pheが、ドーパミンの前駆体であるL-Dopaの前駆体であるチロシン(tyrosine)(Tyr)に変換されない結果として生じる。加えて、PD及びPKUの両方が、ドーパミン作動性ニューロンの損失又は損傷に関連し、PD及び少なくともPahemu2マウスの両方が、臨床的には運動機能の障害を示す。
また、PKU/HPAの治療的介入を本明細書中で提供する。そのような介入は、最初は、単独又は食事制限と組み合わせて使用することができる原核生物PAL変異体の使用に基づく。更に、原核生物PAL変異体及び/又は食事制限と、例えば、脳におけるPhe蓄積を防止するための例えば大きな中性アミノ酸(Kochらの文献、Mol. Genet. Metabol. 79:110〜113(2003)参照)などの、PKUの他の症状を抑えるように設計された他の治療組成物とを更に組み合わせることができる。本セクションでは、本明細書で意図される治療に使用することができる組成物の説明を提供する。
治療有効量の原核生物PAL変異体を、1以上の医薬として許容し得る賦形剤、ビヒクル希釈剤、安定化剤、防腐剤、可溶化剤、乳化剤、補助剤及び/又は担体とともに含む医薬組成物を本明細書中で提供する。そのような医薬組成物は、様々な緩衝液分(例えば、Tris-HCl、ホスフェート)、pH及びイオン強度の希釈剤;洗浄剤及び可溶化剤(例えば、ポリソルベート20、ポリソルベート80)、抗酸化剤(例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム)、防腐剤(例えば、チメロゾール、ベンジルアルコール)及び増量物質(例えば、ラクトース、マンニトール)などの添加剤を含む(例えば、参照により本明細書中に組み込まれているRemington’s Pharmaceutical Sciences、第18版(1990、Mack Publishing Co.(ペンシルバニア州Easton)) 1435:1712頁参照)。治療有効量の活性成分は、体重、年齢及び治療目標などの因子を考慮に入れることによって当業者が容易に決定することができる治療、予防又は診断有効量である。
HPA/PKU患者への原核生物PAL変異体組成物の投与に加えて、一部の実施態様においては、患者の食事性タンパク質を制限又は変更できることも意図される。当業者は、PKUの治療に使用される様々な市販のタンパク質配合物を認識している。そのような配合物としては、MAXIMAID、PHENEX 1、PHENEX 2(Ross Laboratories社(英国Liverpool)及びLOFENALAC、PHENYL-FREE(Mead-Johnson社)等が挙げられる。
本明細書中に記載されているように、所与の患者が、原核生物PAL変異体治療に応答性があるかどうかを判断すること、並びに治療されるPKU患者のクラスを特定するために最初に患者のフェニルアラニン濃度を測定するとともに、療法の有効性を監視するために治療法の進行を通じて患者のフェニルアラニン濃度を測定する必要があり得る。そのような例示的方法を以下に記載する。
BH4装薬試験は、BH4の不足又はPAHの欠乏によりHPAを有する患者間の識別を可能にする。
血液中のPheの存在を確認するための多くの方法がある(例えば、Shawらの論文、「フェニルケトン尿症-臨床生化学における分析方法(Analytical Methods in Phenylketonuria-Clinical Biochemistry)」、In Bickettら編、「フェニルケトン尿症及びアミノ酸代謝のいくつかの他の先天性異常(Phenylketonuria and Some Other Inborn Errors of Amino Acid Metabolism)」、Stuttgart、Georg Thiem Verlag、47〜56(1971)参照)。典型的には、フェニルアラニン及びチロシン濃度は、蛍光アッセイを使用して患者の血清から測定される。このアッセイは、フェニルアラニンがロイシルアラニンの存在下でニンヒドリンとともに加熱されたときの蛍光物質の形成に依存する(McCamanらの文献、J. Lab. Clin. Med. 59:885〜890(1962))。
本明細書中で提供する方法の一部の実施態様においては、様々な形態のHPAを有する患者において治療成果をもたらすために、原核生物PAL変異体と食事性タンパク質制限とが併用される。本明細書中で意図される併用療法において適切な治療成果を達成するために、一般には、所望の治療成果(すなわち、血漿Phe濃度の低下、及び/又は血漿Phe濃度の同時発生的な増加をもたらすことなくより多量のPhe/タンパク質摂取を許容する能力)をもたらすのに有効な組合せ量で原核生物PAL変異体組成物と食事制限を患者に投与することになる。この方法は、原核生物PAL変異体組成物と食事性タンパク質治療組成物を同時に投与することを含み得る。これを、食事性タンパク質必要量のすべてを含むとともに、薬理的タンパク質配合物中に原核生物PAL変異体を含む単一の組成物又は薬理的タンパク質配合物を投与することによって達成することができる。或いは、食事性タンパク質(補給物又は通常のタンパク質食)を原核生物PAL変異体の薬理的配合物(錠剤、注射又は飲料)とほぼ同時に摂取する。原核生物PAL変異体をプロテインバー、又は消化に好適なブラウニー、パンケーキ、ケーキなどの他の食物に配合することもできる。
また、原核生物PAL、又はその生物学的に活性のあるフラグメント、突然変異体、変異体若しくは類似体を製造する方法を本明細書中で提供する。1つの例示的な実施態様においては、N末端標識(例えばオクタヒスチジル標識)を有する又は有しないで、IPTG(イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド)等の誘導プロモーターを用いて、ベクター、例えばpIBX1(Suらの文献, Appl. Environ. Microbiol. 62:2723-2734 (1996))、又はpET28a(Invitrogen社)において、大腸菌BLR(DE3)/pLysS(Novagen社)、又は大腸菌BL21(DE3)/pLysS(Invitrogen社製)細胞において、組換え原核生物PAL、又はその生物学的に活性のあるフラグメント、突然変異体、変異体若しくは類似体が過剰発現される。バイオリアクター/発酵槽のための種培養物を、グリセロールストックから振盪フラスコにて増殖させる。その後、そのような種培養物を、供給バッチモードに制御されたバイオリアクターへ導入する。グルコースを補充し、pHを塩基(NH4OH)で調整し、1200rpm以下で攪拌する。O2供給は、20%より高くなるように溶存酸素を維持する。当該細胞を、37℃の温度で、70〜100のOD600になるまで(約22〜25時間)増殖させ、その後、0.4mM IPTGで誘導する。温度を30℃まで低下させ、0.1 IU/mLより低くなるまで(約40〜48時間、及び一般に200のOD600)増殖させる。細胞培養培地は、一般に、酵母エキスタンパク質、ペプトン-トリプトン、グルコース、グリセロール、カザミノ酸、トレース塩類及びリン酸緩衝塩類と定義され、これらから構成される。組換え原核生物PAL生産物、又はその生物学的に活性のあるフラグメント、突然変異体、変異体若しくは類似体は、細胞内で生産され、分泌されない。細菌は、連続遠心分離(αLaval, Carr, Ceba、又はこれらの等価物)により回収される。この例示的なプロトコルの他の変型が、当業者に明らかになるであろう。
また、原核生物PAL、又はその生物学的に活性のあるフラグメント、突然変異体、変異体若しくは類似体を精製する方法を本明細書中で提供する。例示的な第1の実施態様によれば、形質転換された細胞群を増殖させ、残りの粗組換え酵素は破壊される。異物は、カラムの汚損を防止するために、通常粗バルクから分離される。クロマトグラフィー精製は、1又はいくつかのクロマトグラフィー樹脂を用いて行われる。次いで、精製されたタンパク質は、長期間にわたって安定した活性を提供するよう設計された緩衝液で調製される。他の実施態様においては、原核生物PAL、又はその生物学的に活性のあるフラグメント、突然変異体、変異体若しくは類似体の精製方法は、(a)圧力ホモジナイザー(但し、ガラスビーズ溶解などの他の物理的手段も可)を用いて、組換え原核生物PAL、又はその生物学的に活性のあるフラグメント、突然変異体、変異体若しくは類似体を含む細菌を溶解させること;(b)熱処理を行うこと;(c)第二の連続遠心分離ステップ及び/又は(Cuono Zeta Plus、Maximizer、Pall Filtron、Millipore Millistak、又はOpticao filtersを用いた)深層ろ過を使用してこの溶解物を浄化すること;(d)(Millipore Millistak 40ACを用いた)炭ろ過ステップを施すこと;(e)(1以上の深層フィルター、例えば、Pall EKSP、Pall KS50P及び/又はPall EKMPフィルターを用いた)中間深層ろ過ステップを施した後、(Sartorious Sartopore又はPall EDF0.2μmフィルターを用いた)最終ろ過ステップを施すこと;(f)(Tosoh Biosciences社のToyopearl Butyl 650Mなどの)ブチル疎水性相互作用クロマトグラフィーに通すこと;(g)Qイオン交換カラムに通すこと(Bio Rad社のMacroprep High Qなどの);及び(h)場合により(Sartorious Hydrosart又はPES 30 kDa膜などによる)タンジェンシャルフローろ過を用いた緩衝液交換によって最終生産物を回収することを含む。当業者は、クロマトグラフィーステップ若しくはろ過ステップの1以上を省略若しくは置き換えることができること、又はクロマトグラフィーステップの順序を変更できることを容易に理解する。最後に、要望に応じて適切な滅菌ステップを実施することができる。
(DNA操作)
ノストック パンクチフォルメのゲノムDNAをATCC(29133D)から入手した。また、PAL遺伝子(ZP_00105927)を、プライマー
ノストック パンクチフォルメPAL(NpPAL)、大腸菌BL21(DE3)細胞(Stratagene社製)をpGro7(Takara社製)で形質転換した。また、適切なBL21(DE3)pGro7細胞をInoue法[Sambrook及びRussellの文献, 「分子クローニング:実験マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)」, 第3版 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 2001)]により調製した。これらの細胞を、pET−28−NpPALで形質転換し、50mg/Lカナマイシン及び20mg/Lクロラムフェニコール添加25mL LB培地において、37℃で一晩培養した。20mLのこの培養物を、カナマイシン、クロラムフェニコール、及び500mg/L L−アラビノース添加1L LB培地に播き、37℃で増殖させた。0.6のOD600で、当該培養物を氷で冷却した。5分後、当該培養物を0.3mM IPTGで誘導し、20℃で16時間増殖させた。細胞を遠心分離により回収した。
培養物を卓上型遠心分離機(bench-top centrifuge)において、5,000gで20分間遠心分離し、上清を廃棄した。細胞のペレットを、更なる処理に先駆けて、概して、-70℃で凍結した。解凍において、当該細胞のペレットを、TBS(25mM Tris, 150mM NaCl, pH7.8)中で約80光学濃度ユニット(600nm)に懸濁した。細胞を、APV圧力ホモジナイザーに12〜14,000psiで2回通過させて溶解した。次いで、粗溶解物を55℃で2時間加熱処理した。当該溶解物を10,000gで30分間遠心分離し、上清を保存し、0.2μm真空フィルター(コーニング社製)でろ過した。
ロドスポリディウム トルロイデス由来のPAL(RtPAL)のペグ化の方法を以下に説明する。原核生物PAL[例えば、NpPAL又は、AvPAL]のペグ化に用いられる同様の方法が、実施例6に記載されている。
ペグ化は、文献の方法[Hershfieldらの文献, (1991), 前述の箇所; U.S. Patent No. 6,057,292; Luらの文献, Biochemistry 40(44):13288-13301 (2001); Nektar Therapeutics, 2003 catalog]の改良を用いる。活性化PEGは、線状PEGスクシンイミジルスクシナート(mPEG-SPA、分子量5kDa又は分子量20kDa)及び分岐PEGヒドロスクシンイミド(mPEG2−NHSエステル、分子量10kDa又は分子量40kDa)を含む。両者は、メトキシ基で一端が覆われており、Nektar Therapeutics社から市販されている。また、最適ペグ化タンパク質の試験的測定が一般に求められている[Veroneseらの文献, J. Bioactive Compatible Polymers 12:196-207 (1997)]。最適ペグ化条件は、様々なPAL:PEG比(タンパク質単量体当たりのリジンの数に沿ったタンパク質のモル比を考慮する)、様々なpH、様々な緩衝液、様々な温度、及びインキュベーション時間を用いて決定される。野生型PALは、リジンの数が多く[それぞれ、ロドスポリディウム トルロイデス(Rt)及びアナベナ バリアビリス単量体当たり29及び18]、非変性PALは、マウスでの反復注射に対し免疫反応性を示し、裸の野生型PALは、プロテアーゼへの暴露で急速に不活性化されるので、高いPALタンパク質:PEG誘導体化の比が必要である。ペグ化反応は、-20℃で凍結することで停止され、試料は、SDS−PAGE、MALDI−TOF質量分析、活性評価、タンパク質分解感受性、及び免疫反応性により分析される。
非変性タンパク質試料及びペグ化タンパク質試料において、280nmのPAL吸光係数(RtPAL及びAvPALにおいてそれぞれ、0.5及び0.75mg mL-1cm-1)を用いて、タンパク質濃度を測定した。また、当該濃度は、正確なタンパク質濃度の測定を妨害し得る非タンパク質汚染物質を除去する試料処理を含む、NIタンパク質分析キット(GenoTechnology社製)を用いて算出される。
動力学的モードのCary UV分光光度計(Cary 50)を用いて、PALの活性分析を行う。290nmでの吸光度の増加によってモニターされたtrans−桂皮酸の生成を測定することにより[Hodginsの文献, (1968), 前述の箇所]、L−フェニルアラニン基質でのPALの活性を室温(25℃)で評価した。290nmのtrans−桂皮酸のモル吸光係数は、10,238リットルM-1cm-1である。反応混合物は、100mM Tris−HCl緩衝液(pH8.5)中22.5mMのフェニルアラニンを含んでいた。標準測定においては、最終酵素濃度が0.0035mg/mLであるが、動力学的試験においては、分析での酵素濃度は、分当たりの290nmでの勾配が0.005〜0.02の範囲にあるように、調節される。活性データは比活性(μmol×min-1mg-1)で表される。1ユニットのPALは、室温で分当たり1μモルのtrans−桂皮酸を生成する酵素量と定義される。
生化学的特性評価の後、最も有望なPEG−PAL候補物を、3つの異なる補足的方法(ウェスタンブロット、ELISA及び免疫沈降(IP))を用いて、野生型PAL(ペグ化されていない)を注入したPKUマウスにより産生された抗体に対する免疫反応性のスクリーニングを行った。
ロドスポリディウム トルロイデス由来の野生型PALに関するプロテアーゼマッピング試験では、タンパク質分解感受性の主要部位が示された。そのような部位の除去は、タンパク質分解感受性を低減させ又は除去させ、有用なPKU酵素基質の開発に寄与することができる。しかしながら、タンパク質分解感受性のそのような部位の除去により、酵素活性が低減又は失活し得る。
一般に、NpPAL及びAvPALのペグ化は、タンパク質とSUNBRIGHT ME−200HS 20kDa NHS活性化PEG(NOF)を混合することを含むものである。
タンパク質溶液(0.1mL)を0.9mLの新鮮なMQ水で希釈し、0.5EU/mLの感受性レベルでエンドトキシンに関して携帯型のCharles River社の装置(EndoPTS)で試験した。エンドトキシンが0.5EU/mLより高い場合、エンドトキシンをMustang Eろ過で最初に、次いで、Sterogene Etox樹脂で、又は更にクロマトグラフィー精製により低減させた。低減は制限されるが、pH7.8でDEAE FF(Amersham社製)に通すことで十分に有用であった。
タンパク質を25mg/mLより高く75mg/mL以下に濃縮し、50mM KPO4(pH8.5)に緩衝液交換した。スピンフィルターを用いてこの濃縮物を調製する場合、最初に、当該フィルターを、緩衝液単独で、低減された速度と時間で(3000rpm、3分)回転することでエンドトキシンに関して試験をし、次いで、ステップ1)のタンパク質と同様の方法で、エンドトキシンに関して保持された緩衝液を試験した。50mM KPO4(pH8.5)の緩衝液バッチの履歴/配合は、水(1/4〜1L)、リン酸ニカリウム(48.75mM、8.4913g/l)、及びリン酸一カリウム(1.25mM、0.17011g/L)であった。溶液を0.2μmフィルターでろ過し、室温で保存した。濃縮生産物をMustang Eフィルターアクロディスクでゆっくりろ過した(1〜2mL/分)。滅菌TBS(pH7.5)で希釈及びブランクとされた試料のタンパク質濃度をA280で測定した。吸光係数は、NpPALで0.83、AvPALで0.75であった。
通常-80℃で保存されるPEGを室温になるまで加温した。KPO4緩衝液をPEGに加え、大きな塊がすべて懸濁されるために、最大速度で攪拌すること、及び、試験管を手で激しく振盪することで再懸濁した。代替として、PEGをpH〜5の水中に再懸濁した。最初に湿らせたPEGのあるよく懸濁されたPEG溶液に、タンパク質を1分以内に加え、非常に穏やかな転移によって混合した。アルミニウムホイルで包まれた試験管を選鉱機の軸に載置し、室温で3時間、非常に穏やかに振動させた。当該試験管をTBS(pH7.5)で充填し、ろ過滅菌した。懸濁液をすぐに配合し、或いは、配合されるまで4℃で保存した。
配合緩衝液の配合/バッチの履歴は、水(1/4〜1L)、Tris系(3.2mM)、Tris−HCl(16.8mM)及び塩化ナトリウムからなり;緩衝溶液を0.2μmフィルターでろ過し、室温で保存した。当該緩衝溶液を、100MWCO再生化セルロース膜で、Vivaflow 50(小さなロット)又はVivafiow 200(大きなロット)を用いてタンジェンシャルフローろ過にかけた。当該溶液を、MQ水、0.1N NaOH及び200mLの水で再度フラッシングした。当該溶液を50mL/分の直交流でTBS(pH7.5)により平衡化した。透過液のpHを7.5となるようにした。
細菌で発現され組換えタンパク質に生じる凝集を低減させるために、AvPALポリペプチドにおいてアミノ酸置換を行った。タンパク質凝集は、酵素活性を低減させ、及び/又は、インビボでの免疫原性を増加させ得る。凝集のそのような形成の1つは、鎖間ジスルフィド結合の形成の結果として生じる。このような可能性を最小限にするために、様々なAvPALのシステイン残基を単独で、或いは組み合わせて、セリン残基と置換した。
フォワードプライマーAvarPALfor
AvPALポリペプチド位置503及び565に対応する、AvPAL遺伝子の2つのシステインコドンを部位特異的突然変異誘発(QuickChange XL II、Stratagene社製)によってセリンコドンと置換した。位置503のシステインコドンを、フォワードプライマーAv_C503S
本研究の目的は、インビトロでのフェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)酵素活性に対するAvPALポリペプチドの様々なシステイン残基のセリンによる置換の影響を判断することであった。
本研究の目的は、(1)促進された安定性、(2)凝集体の形成、及び(3)部位特異的ペグ化に対する、AvPALポリペプチドでの様々なシステイン残基のセリンによる置換の影響を判断することであった。
インビトロでの安定性に対する、AvPALのシステイン残基のセリンによる置換の影響を、精製AvPALシステイン突然変異体(ペグ化されている又はペグ化されていない)を37℃で様々な期間保存した後、実施例3に記載したとおりに、これらのタンパク質のインビトロでのPAL比活性を測定することにより判断した。
溶液中のタンパク質凝集体の形成に対する、システイン残基のセリンによる置換の影響を、ペグ化されていない精製野生型AvPAL及びAvPALシステイン突然変異体を、変性及び天然ゲル電気泳動又はSEC−HPLCのいずれかによって分離することにより判断した。
部位特異的ペグ化に対する、AvPALでのシステイン残基のセリンによる置換の影響を、実施例6に記載したとおりに、野生型AvPAL、及び二重システイン突然変異体AvPAL_C503SC565Sをペグ化し、AvPALリジン残基:K2、KlO、K32、Kl15、K145、K195、K301、K335、K413、K419、K493、K494及びK522での相対的ペグ化を比較することにより判断した。
本研究は、細菌で発現されたAvPALタンパク質の凝集メカニズムを調査するために行われた。
本発明で提供する配合物におけるAvPALポリペプチド変異体(例えば、位置503及び565のシステイン残基のセリンによる置換)のペグ化形態の促進された安定性に対する、様々な添加剤(例えば安定化剤)の影響を調査するための試験を実施した。
AvPALポリペプチド変異体(例えば、位置503及び565のシステイン残基のセリンによる置換での)のペグ化形態の活性に対する、様々な固体(例えば、凍結乾燥)の配合物の影響を調査するための試験を実施した。
本明細書中で提供する配合物において、例えば、位置503及び565におけるシステイン残基のセリン置換を有するAvPALポリペプチド変異体(AvPAL_C565C503S)のペグ化形態の加速安定性に対する様々な賦形剤、例えば安定化剤及び防腐剤(すなわち抗菌剤)の影響を調査するための試験を実施した。
これらの試験の目的は、マウスにおけるインビボのPheレベルに対する、AvPALポリペプチドにおける位置503及び565でのシステイン残基のセリン置換の影響を測定することであった。
毒性/薬物動態試験を実施して、カニクイザル及びラットにおける1回投与量のペグ化形態のAvPALポリペプチド変異体(例えば、位置503及び565にシステイン残基のセリン置換を有する)の投与の影響を測定した。
この試験では、それぞれが3匹の雄及び3匹の雌を含む4つのグループのサルを使用した。グループ1には、偽薬(mL/kg)を与え、グループ2、3及び4には、それぞれ4、12及び60mg/kgの溶液中ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの1回の皮下注射を与えた。血漿試料を投与前、及び3から504時間までの投与後の様々な時間に各サルより回収した。60mg/kgの投与量は、サルにとって有毒であることが判明したため、この試験のグループ4の部分を外した。
この試験では、偽薬グループでは3匹の雄及び3匹の雌を含み、並びに試験グループでは6匹の雄及び6匹の雌を含む8つのグループのラットを使用した。グループ1及び5には、偽薬の1回の静脈内及び皮下注射を与えた。グループ2、3及び4には、それぞれ1、5及び25mg/kgのペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの1回の静脈内注射を与えた。グループ6、7及び8には、それぞれ10、25及び250mg/kgのペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの1回の皮下注射を与えた。血液試料を投与前、及び1から360時間までの投与後の様々な時間にラットから回収した。各回収時において、血液を各グループの3匹のラットから回収した。この試験では、ラットにおいて毒性が観察されなかった。
ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの安全性を、ラット及びカニクイザルにおける繰返し投与毒性試験で評価した。
以下の実施例は、フェニルアラニンのレベルの上昇によって特徴付けられる疾患及び障害、例えば、PKUを含むHPA、及び癌を含む他の障害の治療に有用である原核生物PAL、又はその生物学的に活性のあるフラグメント、突然変異体、変異体若しくは類似体を含む組成物を配合するために用いられるパラメーターに関するガイドラインを提供する。本発明の原核生物PALの組成物に用いられるパラメーターは、pHを維持する緩衝剤、等張性調節剤、安定化剤の非存在又は存在、他の賦形剤、ビヒクル、及び希釈剤等の非存在又は存在を含むが、これらに限定されない。
以下の実施例は、フェニルアラニンのレベルの上昇によって特徴付けられる疾患及び障害、例えば、PKUを含むHPA、及び癌を含む他の障害の治療に有用であるペグ化AvPAL変異体、すなわち二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sを含む組成物の例示的な配合物を提供する。原核生物PAL組成物を配合するのに用いることができるパラメーターとしては、pHを維持するための緩衝剤、等張性調整剤、安定化剤の有無、及び他の賦形剤、ビヒクル及び希釈剤等、例えば防腐剤又は抗菌剤の有無が挙げられるが、それらに限定されない。これらの配合物は、本明細書中に記載の他のAvPALシステイン突然変異体などの他のペグ化AvPAL変異体に適用可能であることが理解される。
凝集の制御は、特にタンパク質自体が免疫原性である場合にタンパク質ベースの治療薬の製造及び配合における関心事である。凝集が最小限の(例えば、位置503及び565におけるシステイン残基のセリン置換を有する)ペグ化AvPALポリペプチド変異体の大規模製造を可能にする製造方法が開発された。本明細書中で用いられているように、「最小限の凝集」とは、凝集していない(すなわち、四量体形態の)AvPAL変異体に対する凝集した(すなわち、四量体形態の前のSE-HPLCから溶離する形態)の比が1%未満、例えば、0.5%未満、0.2%未満又は0.1%未満であることを意味する。
以下の実施例は、本明細書中で提供する治療方法における、原核生物PAL、又はその生物学的に活性のある変異体、突然変異体及びフラグメント([原核生物PAL])を含む組成物の臨床的評価に用いられるパラメーターに関するガイダンスを提供する。他の箇所で説明したとおり、原核生物PALをHPA、軽度PKU及び古典的PKUの治療に使用することができる。臨床試験が行われ、安全性、薬動力学、並びに、代替エンドポイント及び明確な臨床的エンドポイント両者の初期反応に関する原核生物PALの経口又は皮下用量の評価を提供する。当該臨床試験は、100人の評価可能な患者の十分な安全性情報を収集するために、最低で24週間にわたって実施されるが、必ずしもこれに限定されない。当該臨床試験の初期用量は、約0.001〜約1.0mg/kg/週で変動する。この用量により、患者における過剰な血漿Pheレベルの低減がもたらされない場合、又は血漿Pheレベルを増加させずに毎日の経口Phe摂取量を増加させる能力として測定される有意な直接的臨床的便益がもたらされない場合は、投与を必要に応じて増やし、24週間の(但し、必ずしもそれに限定されない)追加的な最小限の期間にわたって維持して、安全性を確保するとともに、更なる有効性を評価することができる。
血漿Phe量が上昇した患者は、病歴及び健康診断、神経心理及び認識機能検査、臨床検査(CBC、Panel 20、CH50、UA)の標準セット、尿のプテリン量、ジヒドロプテリジン還元酵素(DHPR)量、並びに、血清アミノ酸の血液(血漿)パネルの絶食という、ベースラインを経験する。患者は、厳密に毎週通院する必要がある。患者は、治療期間の終了1週間後、完全な評価のために病院に戻る。用量増加が必要であれば、患者は、上述に概説された同様のスケジュールに従う。安全性が試験全体にわたってモニターされる。
患者は、遺伝子試験及び血液におけるPheレベルの上昇によって確認されたHPA又は軽度PKUの診断書を有する男性又は女性であり得る。試験には、食事制限に厳密に従わないHPA又はPKU患者が含まれることになる。出産の可能性を有する女性患者は、各投与の直前に陰性の妊娠試験(尿中β-hCG)を有さなければならず、試験全体を通じて医学的に承認された避妊法を使用するよう勧告されなければならない。患者は、妊娠又は授乳している場合;試験に参加する前の30日以内に治験薬を与えられた場合;又は特定の医学的状態、重度の併発病、若しくは試験コンプライアンスを有意に低下させ得るその他の酌量状況を有する場合は、この試験から除外されることになる。
最初の無作為化及び2週間の治療期間の後に、すべての試験参加者は、食事カウンセリングを受け、全体で4から6週間にわたって、標準的な食事療法及び/又はPhe特異的医療食で完成された標準的なPhe制限食餌療法に従うことになる。食事療法を家庭で管理し、食事摂取量を日誌に記録することになる。栄養分及び医療食の摂取量の分析、並びに推奨食事摂取量(RDI)を治療グループ間で比較することになる。
原核生物PAL治療は、深刻な急性又は慢性の薬物反応が研究時に生じない場合には、安全であると判断される。薬剤の非常に長期的な投与は、深刻な異常が臨床検査、臨床研究所、又は他の適切な研究で見られない場合には、安全であると判断される。
ペグ化二重システイン突然変異体AvPAL、AvPAL_C565SC503Sをヒトにおいて臨床評価する。臨床評価の目的は、PKU患者における安全性、許容性、薬物動態(pharmacokinetics)(PK)及び有効性を判断することである。血液Pheレベルは、臨床的エンドポイントとしての役割を果たすことになる。
段階1は、16から50歳の年齢の35PKU患者における非盲検1回投与増量試験である。一次的な目的は、ペグ化二重システイン突然変異体AvPAL、AvPAL_C565SC503Sの安全性及び許容性を評価することであり、二次的な目的は、ペグ化酵素のPK及びPheの低減を評価することである。5人の被験者の7つのコホートに、0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3及び1 mg/kgの上昇投与量のペグ化AvPAL_C565SC503Sを順次投与する。各コホートにおける被験者は、1回投与を受け、全体で6週間にわたって追跡される。参入基準は、スクリーニングでの血液Pheレベル、及び過去3年間の平均血液Pheレベルが600μM以上であることである。
段階2の試験を、中断のない2つのパートに分ける。
○ パート1-16週間-8週間の投与、次いでその後の投与量最適化
○ パート2-40週間の延長
段階1及び2の試験が完了すると、追加的な試験は、例えば、限定することなく、非PKU HPA患者、BH4-応答性PKU患者及び非BH4応答性PHU患者などの特殊な集団における更なる試験を含む、より多くの数の被験者における段階3の6ヵ月二重盲検試験を潜在的に含んでいてもよい。
(配列表)
Claims (75)
- (a)ペグ化アナベナ バリアビリスフェニルアラニンアンモニア-リアーゼ(AvPAL)変異体の位置503及び565のシステイン残基がセリン残基(配列番号11)によって置換されており、該AvPAL変異体がポリエチレングリコールを含み、AvPAL変異体と該ポリエチレングリコールの比が約1:3であるAvPAL変異体と、
(b)(i)Tris-HCl、(ii)NaCl、(iii)L-フェニルアラニン (Phe)及び(iv)グリシン (Gly)を含む医薬として許容し得る担体と
を含む、配合物。 - 前記ペグ化AvPAL変異体の濃度が約5から15mg/mLである、請求項1記載の配合物。
- Tris-HClの濃度が約5から15mMである、請求項1又は2記載の配合物。
- NaClの濃度が約120から150mMである、請求項1から3のいずれか一項記載の配合物。
- Pheの濃度が約0.5から1.5mMである、請求項1から4のいずれか一項記載の配合物。
- Glyの濃度が約1.0から100mM、約1.0から20mM又は20から100mMである、請求項1から5のいずれか一項記載の配合物。
- 前記配合物のpHが約6.5から7.5である、請求項1から6のいずれか一項記載の配合物。
- 前記配合物のpHが約7.0から7.6である、請求項1から7のいずれか一項記載の配合物。
- 防腐剤としてm-クレゾールを更に含む、請求項1から8のいずれか一項記載の配合物。
- m-クレゾールの濃度が約0.3%から0.5%(w/v)である、請求項9記載の配合物。
- (a)ペグ化AvPAL変異体の位置503及び565のシステイン残基がセリン残基(配列番号11)によって置換されており、該AvPAL変異体がポリエチレングリコールを含み、AvPAL変異体と該ポリエチレングリコールの比が約1:3であるペグ化AvPAL変異体と、
(b)(i)Tris-HCl、(ii)NaCl、(iii)Phe及び(iv)Glyを含む医薬として許容し得る担体と
を含む配合物であって、約7.3+/-0.3のpHを有する、前記配合物。 - ペグ化AvPAL変異体の濃度が約10+/-5mg/mLである、請求項11記載の配合物。
- Tris-HClの濃度が約10+/-5mMである、請求項11又は12記載の配合物。
- NaClの濃度が約135+/-15mMである、請求項11から13のいずれか一項記載の配合物。
- Pheの濃度が約1.0+/-0.5mMであり、Glyの濃度が約50.5+/-49.5mM、約10.5+/-9.5mM又は約60+/-40mMである、請求項11から14のいずれか一項記載の配合物。
- 防腐剤としてm-クレゾールを更に含む、請求項11から15のいずれか一項記載の配合物。
- m-クレゾールの濃度が約0.4%+/-0.1%(w/v)である、請求項16記載の配合物。
- (a)ペグ化AvPAL変異体の位置503及び565のシステイン残基がセリン残基(配列番号11)によって置換されており、該AvPAL変異体がポリエチレングリコールを含み、AvPAL変異体と該ポリエチレングリコールの比が約1:3であるペグ化AvPAL変異体と、
(b)(i)約10+/-5mMのTris-HCl;(ii)約135+/-15mMのNaCl;(iii)約1+/-0.5mMのPhe;(iv)約50.5+/-49.5mM、約10.5+/-9.5mM又は約60+/-40mMのGly;及び(v)約0.4%+/-0.1%(w/v)のm-クレゾールを保存剤として含む医薬として許容し得る担体と
を含む配合物であって、約7.3+/-0.3のpHを有する、前記配合物。 - 前記ペグ化AvPAL変異体の保存寿命(T90)が、Pheの存在しない対応するペグ化AvPAL変異体配合物と比較して、4℃から42℃の間の温度で、1.5倍から10倍の間で増加する、請求項1から18のいずれか一項記載の配合物。
- 前記ペグ化AvPAL変異体のT90が、25℃において4倍から5倍の間、37℃において2倍から3倍の間、42℃において2倍から3倍の間、又はその組合せで増加する、請求項19記載の配合物。
- 最小限の凝集でペグ化アナベナ バリアビリスフェニルアラニンアンモニア-リアーゼ(AvPAL)変異体を精製するための方法であって、
(a)該AvPAL変異体を含む細菌細胞を均質化によって溶解して、細胞溶解物を生成すること;
(b)該細胞溶解物を30から120分間にわたって65℃に加熱すること;
(c)加熱された細胞溶解物を遠心分離することであって、該AvPAL変異体を含む上澄みを保持すること;
(d)該上澄みをろ過して、沈殿物を除去すること;
(e)陰イオン交換(AIEX)カラム、続いて疎水性相互作用(HIC)カラムによる連続クロマトグラフィーによって、AvPAL変異体を汚染タンパク質から分離することであって、HICカラムからの溶出液が該AvPAL変異体を含むこと;
(f)該AvPAL変異体を含む該HICカラムからの該溶出液を限外ろ過又は限外ろ過/透析ろ過すること;
(g)ポリエチレングリコールと該AvPAL変異体とを混合することによって該AvPAL変異体をペグ化すること;
(h)限外ろ過/透析ろ過によって遊離ポリエチレングリコールを該ペグ化AvPAL変異体から除去すること;及び
(i)該ペグ化AvPAL変異体を配合することを含み、
該AvPAL変異体の位置503及び565のシステイン残基がセリン残基(配列番号11)によって置換されており、該AvPAL変異体がポリエチレングリコールを含む、前記方法。 - AvPAL変異体と前記ポリエチレングリコールの比が約1:3である、請求項21記載の方法。
- 前記AIEXカラムがToyopearl Giga Cap Q 650Mカラムである、請求項21記載の方法。
- 前記HICカラムがToyopearl Butyl 650Mカラムである、請求項21記載の方法。
- ステップ(e)で得られた前記AvPAL変異体を含む前記HICカラムからの溶出液を凍結及び解凍することであって、グリセロール、スクロース、グルコース、トレハロース、マンニトール及びソルビトールからなる群から選択される1以上のポリオール又は糖を凍結の前に該HICカラム溶出液に添加することを更に含む、請求項21記載の方法。
- 前記ポリオールがグリセロールである、請求項25記載の方法。
- 前記グリセロールの濃度が10%(v/v)である、請求項26記載の方法。
- 前記糖がスクロースである、請求項25記載の方法。
- スクロースの濃度が10%(v/v)である、請求項28記載の方法。
- 前記AvPAL変異体を含む前記HICカラムからの溶出液の凍結を不連続温度ステップで実施する、請求項25記載の方法。
- 前記AvPAL変異体を含む前記HICカラムからの溶出液の解凍を不連続温度ステップで実施する、請求項25記載の方法。
- 前記AvPAL変異体を含む前記HICカラムからの溶出液の凍結及び解凍を不連続温度ステップで実施する、請求項25記載の方法。
- ステップ(f)における透析ろ過緩衝液が、リン酸カリウム(Kpi)、及びtrans-桂皮酸(t-CA)及びグリセロールからなる1以上の薬剤を含む、請求項21記載の方法。
- 前記透析ろ過緩衝液が、50mMのKpi、10mMのt-CA、5%のグリセロール(pH8.5)を含む、請求項33記載の方法。
- ステップ(f)で得られた前記AvPAL変異体を含む前記HICカラムからの限外ろ過、又は限外ろ過/透析ろ過溶出液に非イオン性洗剤を添加する、請求項21記載の方法。
- 前記非イオン性洗剤がポリソルベート80(PS80)である、請求項35記載の方法。
- 前記PS80の濃度が0.02%である、請求項36記載の方法。
- 最小限の凝集でアナベナ バリアビリスフェニルアラニンアンモニア-リアーゼ(AvPAL)変異体を精製するための方法であって、
(a)該AvPAL変異体を発現する細菌細胞を均質化によって溶解して、細胞溶解物を生成すること;
(b)該細胞溶解物を30から120分間にわたって65℃に加熱すること;
(c)加熱された細胞溶解物を遠心分離することであって、該AvPAL変異体を含む上澄みを保持すること;
(d)該上澄みをろ過して、沈殿物を除去すること;及び
(e)陰イオン交換(AIEX)カラム、続いて疎水性相互作用(HIC)カラムによる連続クロマトグラフィーによって、AvPAL変異体を汚染タンパク質から分離することであって、HICカラムからの溶出液が該AvPAL変異体を含むことを含み、
該AvPAL変異体の位置503及び565のシステイン残基がセリン残基(配列番号11)によって置換されている、前記方法。 - 前記AIEXカラムがToyopearl Giga Cap Q 650Mカラムである、請求項38記載の方法。
- 前記HICカラムがToyopearl Butyl 650Mカラムである、請求項38記載の方法。
- フェニルアラニンヒドロキシラーゼ(PAH)の欠乏によって全体的又は部分的に引き起こされる疾患を治療するための方法であって、PAHの欠乏を有する被験者に対して、請求項1から20のいずれか一項に記載の配合物、又は請求項21から37のいずれか一項により精製されたペグ化AvPAL変異体を含む配合物の治療有効量を投与することを含む、前記方法。
- 前記疾患がフェニルアラニンレベルの上昇によって特徴付けられる、請求項41記載の方法。
- 前記被験者が正常なPAH活性の約10%以下を有する、請求項41又は42記載の方法。
- フェニルケトン尿症(PKU)を有する被験者を治療するための方法であって、請求項1から20のいずれか一項に記載の配合物、又は請求項21から37のいずれか一項により精製されたペグ化AvPAL変異体を含む配合物を該被験者に投与することを含み、該AvPAL変異体の投与が、該被験者の血漿におけるフェニルアラニン濃度を、該投与のない該濃度と比較して低下させるのに有効である、前記方法。
- 前記被験者が突然変異体PAHを有する、請求項41から44のいずれか一項記載の方法。
- 前記突然変異体PAHがPAHの触媒領域に突然変異を含む、請求項45記載の方法。
- 前記突然変異が、F39L、L48S、I65T、R68S、A104D、S110C、D129G、E178G、V190A、P211T、R241C、R261Q、A300S、L308F、A313T、K320N、A373T、V388M E390G、A395P、P407S及びY414Cからなる群から選択される1以上の突然変異を含む、請求項46記載の方法。
- 高フェニルアラニン血症(HPA)を有する妊婦を治療するための方法であって、請求項1から20のいずれか一項記載の配合物、又は請求項21から37のいずれか一項により精製されたペグ化AvPAL変異体を含む配合物を、タンパク質制限食と組み合わせて該女性に投与することを含み、該配合物とタンパク質制限食との併用投与が、該女性の血漿フェニルアラニン濃度を、該併用投与のない該濃度と比較して低下させるのに有効である、前記方法。
- 血漿フェニルアラニン濃度の上昇を治療する方法であって、血漿フェニルアラニンが増加した被験者に対して、請求項1から20のいずれか一項記載の配合物、又は請求項21から37のいずれか一項により精製されたペグ化AvPAL変異体を含む配合物を、該被験者の血漿フェニルアラニン濃度の減少をもたらすのに有効な量で投与することを含む、前記方法。
- PKUを有する幼児を治療する方法であって、請求項1から20のいずれか一項記載の配合物、又は請求項21から37のいずれか一項により精製されたペグ化AvPAL変異体を含む配合物を、該幼児の血漿フェニルアラニン濃度の減少をもたらすのに有効な量で該幼児に投与することを含み、該幼児が0から3歳の間であり、該幼児の血漿フェニルアラニン濃度が約360μMから約4800μMの間である、前記方法。
- 被験者の血漿フェニルアラニン濃度を減少させるための方法であって、請求項1から20のいずれか一項記載の配合物、又は請求項21から37のいずれか一項により精製されたペグ化AvPAL変異体を含む配合物を該被験者に投与することを含む、前記方法。
- 前記被験者の血漿フェニルアラニン濃度が、前記配合物の投与の前に約200μMを超えている、請求項51記載の方法。
- 前記有効量が、前記被験者の血漿フェニルアラニン濃度を10%以上減少させる、請求項51又は52記載の方法。
- 前記被験者がPAH活性の欠乏を有する、請求項51から53のいずれか一項記載の方法。
- 前記被験者が突然変異体PAHを有する、請求項51から54のいずれか一項記載の方法。
- 前記突然変異体PAHがPAHの触媒領域に突然変異を含む、請求項55記載の方法。
- 前記突然変異が、F39L、L48S、I65T、R68S、A104D、S110C、D129G、E178G、V190A、P211T、R241C、R261Q、A300S、L308F、A313T、K320N、A373T、V388M E390G、A395P、P407S及びY414Cからなる群から選択される1以上の突然変異を含む、請求項56記載の方法。
- タンパク質制限食を前記被験者に投与することを更に含む、請求項51から57のいずれか一項記載の方法。
- 前記被験者がPKUを有する、請求項51から58のいずれか一項記載の方法。
- 前記PKUが古典的な重度PKUである、請求項59記載の方法。
- 前記被験者が妊婦である、請求項51から60のいずれか一項記載の方法。
- 前記女性にタンパク質制限食を投与することを更に含む、請求項61記載の方法。
- 前記被験者が0から3歳である、請求項51から60のいずれか一項記載の方法。
- 癌を有する被験者を治療するための方法であって、請求項1から20のいずれか一項記載の配合物、又は請求項21から37のいずれか一項により精製されたペグ化AvPAL変異体を含む配合物の治療有効量を該被験者に投与することを含む、前記方法。
- 前記有効量が、前記被験者の血液、血清又は血漿フェニルアラニン濃度を検出レベル未満の濃度から20μMと60μMとの間の濃度の範囲まで減少させる、請求項64記載の方法。
- 前記癌が、肺癌、脳癌、中枢神経系の癌、結腸癌、前立腺癌、腎臓癌、頭及び首の癌、卵巣癌、子宮癌、膀胱癌、乳癌、膵臓癌、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、骨髄腫、小児癌又は抵抗性癌である、請求項64又は65記載の方法。
- 前記癌が転移性黒色腫である、請求項64又は65記載の方法。
- 前記癌に由来する細胞の増殖及び/又は生存が、フェニルアラニンの制限又は欠失に感受性のある、請求項64から67のいずれか一項記載の方法。
- 癌治療薬又は標的化癌治療薬を含む医薬組成物の治療有効量を投与することを更に含む、請求項64から68のいずれか一項記載の方法。
- 前記被験者にタンパク質制限食を投与することを更に含む、請求項64から69のいずれか一項記載の方法。
- 前記有効量が、前記被験者の血液、血清又は血漿フェニルアラニン濃度を検出レベル未満の濃度から約20μM未満の濃度の範囲まで減少させる、請求項64から70のいずれか一項記載の方法。
- 前記有効量が、前記被験者の血液、血清又は血漿フェニルアラニン濃度を検出レベル未満の濃度から約10μM未満の濃度の範囲まで減少させる、請求項64から71のいずれか一項記載の方法。
- 癌を有する被験者の血液、血清又は血漿フェニルアラニン濃度を減少させるための方法であって、請求項1から20のいずれか一項記載の配合物、又は請求項21から37のいずれか一項により精製されたペグ化AvPAL変異体を含む配合物の治療有効量を該被験者に投与することを含む、前記方法。
- 前記有効量が、前記被験者の血液、血清又は血漿フェニルアラニン濃度を検出レベル未満の濃度から20μMと60μMとの間の濃度の範囲まで減少させる、請求項73記載の方法。
- 前記被験者がヒトである、請求項41から74のいずれか一項記載の方法。
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