ES2582459T3 - Composiciones de variantes de fenilalanina amoníaco-liasa de procariotas y métodos de uso de sus composiciones - Google Patents

Composiciones de variantes de fenilalanina amoníaco-liasa de procariotas y métodos de uso de sus composiciones Download PDF

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Abstract

Una formulación que comprende: (a) una variante de fenilalanina amoníaco-liasa (AvPAL) pegilada de Anabaena variabilis, en la que los restos de cisteína en las posiciones 503 y 565 de dicha variante AvPAL han sido sustituidos por restos de serina (SEQ ID NO: 11), comprendiendo dicha variante AvPAL polietilenglicol, en la que la relación de la variante AvPAL y el polietilenglicol es de aproximadamente 1:3, y (b) un vehículo farmacéuticamente aceptable que comprende: (i) Tris-HCl, (ii) NaCl, (iii) L-fenilalanina (Phe), y (iv) glicina (Gly).

Description

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actividad de conversión de fenilalanina in vitro. El método puede ser un ensayo de alto rendimiento. Los genomas completos de las especies bacterianas pueden secuenciarse y se cribaron para la presencia de homólogos de PAL procariotas usando un enfoque bioinformático. En otra realización, se confirma la actividad catalítica de PAL de la proteína producto de tales homólogos, por ejemplo, por pruebas de la capacidad de convertir la fenilalanina en transcinamato in vitro.
En un octavo aspecto, se describen en este documento métodos de uso de composiciones PAL procariotas para el diagnóstico de enfermedades, incluyendo pero no limitado a trastornos causados todo o en parte por una deficiencia en la actividad de PAH. El PAL procariota se puede utilizar para medir los niveles de Phe en muestras de sangre, plasma o suero. También se describen en el presente documento un kit de diagnóstico que comprende PAL procariota para su uso en el control de muestras de sangre, plasma o suero de sujetos para los niveles de Phe.
Descripción de las figuras
FIGURA 1. Figura 1 A: Secuencia de genes de PAL de Nostoc punctiforme (SEQ ID NO: 1); Figura 1B: Secuencia de proteínas de PAL de Nostoc punctiforme (SEQ ID NO: 2).
FIGURA 2. Figura 2A: Secuencia génica de PAL de Anabaena variabilis (SEQ ID NO: 3); Figura 2B: Secuencia de proteínas de PAL de Anabaena variabilis (SEQ ID NO: 4).
FIGURA 3. Árbol de relaciones de aminoácidos aromáticos amoníaco-liasas de procariotas y eucariotas. Las secuencias fueron recuperadas del GenBank (los números de entrada se dan entre paréntesis) y se alinean con ClustalX (1.83) utilizando el método de empalme de vecinos.
FIGURA 4. Alineación de secuencias de proteínas de cianobacterias de PAL de N. punctiforme (SEQ ID NO: 2) y PAL de A. variabilis (SEQ ID NO: 4) con PAL de EncP (SEQ ID No. 5.) y HAL de P. putida (SEQ ID NO: 6). Los restos del sitio activo, que corresponden a la actividad de PAL o HAL, se resaltan.
FIGURA 5. Figura 5 A: La secuencia de proteínas de fenilalanina amoníaco-liasa (PAL) de Anabaena variabilis con una sustitución de cisteína a serina en la posición 64 (AvPAL_C64S, SEQ ID NO: 7); Figura 5B: Secuencia de proteínas de PAL de Anabaena variabilis con una sustitución de cisteína a serina en la posición 318 (AvPAL_C318S, SEQ ID NO: 8); Figura 5C: Secuencia de proteína de PAL de Anabaena variabilis con una sustitución de cisteína a serina en la posición 503 (AvPAL_C503S, SEQ ID NO: 9); Figura 5D: Secuencia de proteínas de PAL de Anabaena variabilis con una cisteína a la sustitución de serina en la posición 565 (AvPAL_C565S, SEQ ID NO: 10); Figura 5E: Secuencia de proteínas de PAL de Anabaena variabilis con sustituciones de cisteína a serina en las posiciones 503 y 565 (AvPAL_C565SC503S, SEQ ID NO: 11). Las sustituciones de cisteína a serina están subrayadas en negrita.
FIGURA 6. Figura 6A: Efecto de las sustituciones de cisteína a serina en la posición 565 o ambas posiciones 565 y 503 de AvPAL no pegilado respecto a la actividad enzimática de PAL in vitro específica tras la incubación durante diversos períodos de tiempo a 37°C. Figura 6B: Efecto de las sustituciones de cisteína a serina en la posición 565 o ambas posiciones 565 y 503 de AvPAL pegilado respecto a la actividad enzimática de PAL in vitro específica tras la incubación durante diversos períodos de tiempo a 37°C.
FIGURA 7. Figura 7A: Efecto de sustituciones de cisteína a serina en AvPAL sobre la formación de agregados de proteínas en solución como se analizó por electroforesis de gel en condiciones desnaturalizantes (panel izquierdo) o condiciones nativas (panel derecho). Figura 7B: Efecto de sustituciones de cisteína a serina en AvPAL sobre la formación de agregados de proteínas en solución como se analizó por SEC-HPLC.
FIGURA 8. Efecto de las sustituciones de cisteína a serina en las posiciones 565 y 503 (Mutante dbl) en AvPAL sobre la pegilación específica de sitio en varias concentraciones de PEG.
FIGURA 9. Efecto del tratamiento de AvPAL con Tween 80 al 0,05% o EDTA 10 mM en la formación de agregados de proteínas en solución como se analizó por SEC-HPLC.
FIGURA 10. Figura 10A: Efecto del tratamiento de AvPAL por ditiotreitol (DTT) sobre la formación de agregados de proteínas en solución como se analizó mediante SEC-HPLC. Figura 10B: Efecto del tratamiento de AvPAL por TDT y N-etilmaleimida (NEM) sobre la formación de agregados de proteínas en solución como se analizó mediante SEC-HPLC.
FIGURA 11. Efecto de Phe y del ácido trans-cinámico (t-CA) como se indica en la actividad enzimática de una AvPAL pegilado con sustituciones de cisteína a serina en las posiciones 565 y 503 (AvPAL_C565SC503S) (RAV-PAL-PEG) almacenados durante diversos tiempos (días) a 4°C (panel superior), a 25°C (panel central) y a 37°C (panel inferior).
FIGURA 12. Efecto de la tirosina (Tyr) a 1 y 5 mM, como se indica en la actividad enzimática de un AvPAL pegilado con sustituciones de cisteína a serina en las posiciones 565 y 503 (AvPAL_C565SC503S) (rAV-PAL-PEG) almacenados durante diversos tiempos (días) a 4°C (panel superior), a 25°C (panel central) y a 37°C (panel inferior). FIGURA 13. Figura 13 A: Efecto de Phe, ácido benzoico y piridoxamina, solo o en combinación como se indica,
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sobre la actividad enzimática de un AvPAL pegilado con sustituciones de cisteína a serina en las posiciones 565 y 503 (AvPAL_C565SC503S) (RAV-PAL-PEG) almacenados durante varios tiempos (semanas) a 4°C (panel superior) y a 37°C (panel inferior). Figura 13B: Las estructuras químicas de ácido benzoico (izquierda), fenilalanina (medio) y ácido trans-cinámico (derecha) se representan.
FIGURA 14. Efecto de los conservantes alcohol de bencilo (Benz'OH, 1,5%) o m-cresol (mCresol, 0,3%) y/o estabilizadores de L-fenilalanina (Phe, 1 mM) y/o glicina (Gly, 1 mM) como se indica en la actividad específica (U/mg) de un AvPAL pegilado con sustituciones de cisteína a serina en las posiciones 565 y 503 (AvPAL_C565SC503S) (RAV-PAL-PEG) almacenados durante diversos tiempos (semanas) a 4°C (panel superior), a 25°C (panel central) y a 40°C (panel inferior).
FIGURA 15. Figura 15 A: Efecto de la glicina (Gly) de 1 a 20 mM, como se indica en la actividad normalizada (%) de un AvPAL pegilado con sustituciones de cisteína a serina en las posiciones 565 y 503 (AvPAL_C565SC503S) almacenados durante diversos tiempos (semanas o meses como se indica) a 25°C (panel superior) y a 40°C (panel inferior). Figura 15B: Efecto de la glicina (Gly) a 20, 50 ó 100 mM, como se indica en la actividad de la enzima (U/ml) de un AvPAL pegilado con sustituciones de cisteína a serina en las posiciones 565 y 503 (AvPAL_C565SC503S) almacenados durante diversos tiempos (semana como se indica) a 40°C.
FIGURA 16. Efecto de sustituciones de cisteína a serina en las posiciones 565 y 503 (AvPAL_C565SC503S) en AvPAL pegilado en niveles in vivo de Phe en ratones ENU2 dosificados con 0,25 UI (panel superior), 1,0 UI (panel central) o 4,0 UI (panel inferior) de la enzima en comparación con ratones ENU2 dosificados con vehículo o 4,0 UI de AvPAL pegilado tipo salvaje.
FIGURA 17. Efecto de sustituciones de cisteína a serina en las posiciones 565 y 503 (AvPAL_C565SC503S) en AvPAL pegilado sobre los pesos corporales de los ratones ENU2 dosificados con 0,25 UI, 1,0 UI o 4,0 UI de enzima en comparación con los ratones ENU2 dosificados con vehículo o 4,0 UI de AvPAL pegilado de tipo salvaje.
Figura 18. Efecto de sustituciones de cisteína a serina en las posiciones 565 y 503 (AvPAL C503S/565S) en AvPAL pegilado en los niveles de Phe in vivo en ratones ENU2 dosificados con 4 UI de enzima en varias proporciones de AvPAL:PEG: 1:1,6 (panel superior), 1:2,4 (panel medio) o 1:3 (panel inferior), en comparación con los ratones ENU2 dosificados con vehículo o 4,0 UI de AvPAL pegilado tipo salvaje respecto a una relación AvPAL:PEG de 1:3.
FIGURA 19. Efecto de sustituciones de cisteína a serina en las posiciones 565 y 503 (AvPAL_C565SC503S) en AvPAL pegilado sobre los pesos corporales de los ratones ENU2 dosificados con 4 UI de enzima en varias proporciones de AvPAL:PEG: 1:1,6, 1:2,4 ó 1:3, en comparación con ratones ENU2 dosificados con vehículo o 4,0 UI de AvPAL pegilada tipo salvaje a una relación de AvPAL:PEG de 1:3.
FIGURA 20. Figura 20A: El efecto de una sola inyección subcutánea de un AvPAL pegilado con sustituciones de cisteína a serina en las posiciones 565 y 503 (AvPAL_C565SC503S) a 4 mg/kg (diamantes) y a 12 mg/kg (cuadrados) en macacos de Java en los niveles AvPAL_C565SC503S en plasma con el tiempo (horas). Figura 20B: Efecto de una inyección subcutánea única de AvPAL_C565SC503S a 4 mg/kg en macacos de Java en los AvPAL_C565SC503S en plasma (diamantes) y niveles de fenilalanina (cuadrados) respecto al tiempo (horas).
FIGURA 21. Figura 21 A: Efecto de una sola inyección intravenosa de un AvPAL pegilado con sustituciones de cisteína a serina en las posiciones 565 y 503 (AvPAL_C565SC503S) a 1 mg/kg (diamantes), en 5 mg/kg (cuadrados) y en 25 mg/kg (triángulos) en ratas en los niveles de AvPAL_C565SC503S en a lo largo del tiempo (horas). Figura 21B: Efecto de una única inyección subcutánea de AvPAL_C565SC503S a 10 mg/kg (diamantes), en 25 mg/kg (cuadrados) y en 250 mg/kg (triángulos) en ratas en los niveles de AvPAL_C565SC503S en plasma a lo largo del tiempo (horas).
FIGURA 22. Diagrama de flujo del proceso de producción para la fabricación a gran escala de un polipéptido de la variante AvPAL pegilado con la agregación mínima. Las flechas que apuntan hacia la izquierda indican los pasos del proceso que son objetivos para la reducción de la agregación.
Descripción detallada
La solicitud generalmente se refiere a composiciones de PAL procariota y fragmentos biológicamente activos, mutantes, variantes o análogos de los mismos y su uso para fines terapéuticos, incluyendo el tratamiento de hiperfenilalaninemia, incluyendo la fenilcetonuria, y otros trastornos, incluyendo el cáncer.
A. Definiciones
A menos que se indique lo contrario, los siguientes términos utilizados en esta solicitud, incluyendo la memoria descriptiva y las reivindicaciones, tienen las definiciones que figuran a continuación. Hay que señalar que, tal como se utiliza en la memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. La definición de los términos de química estándar se puede encontrar en las obras de referencia, incluyendo Carey y Sundberg, Advanced Organic Chemistry, 3ª Edición, Vols. A y B (Plenum Press, New York 1992). La práctica de la presente invención empleará, a
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menos que se indique lo contrario, métodos convencionales de química orgánica sintética, espectroscopia de masas, métodos preparativos y de análisis de la cromatografía, química de proteínas, bioquímica, técnicas de ADN recombinante y farmacología, dentro de la experiencia de la técnica. Véase, por ejemplo, T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W. H. Freeman and Company, 1993); A. L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., 4ª Edición, 2004); Sambrook, et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª Edición, 1989); Methods in Enzymology (S. Colowick y N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Remington Pharmaceutical Sciences, 18ª Edición (Easton, Pensilvania: Mack Publishing Company, 1990).
Las siguientes abreviaturas de aminoácidos se usan en todo el texto:
Alanina: Ala (A) Arginina: Arg (R)
Asparagina: Asn (N) Ácido aspártico: Asp (D)
Cisteína: Cys (C) Glutamina: Gln (Q)
Ácido glutámico: Glu (E) Glicina: Gly (G)
Histidina: His (H) Isoleucina: He (I)
Leucina: Leu (L) Lisina: Lys (K)
Metionina: Met (M) Fenilalanina: Phe (F)
Prolina: Pro (P) Serina: Ser (S)
Treonina: Thr (T) Triptófano: Trp (W)
Tirosina: Tyr (Y) Valina: Val (V)
"Polinucleótido" se refiere a un polímero compuesto de unidades de nucleótidos. Los polinucleótidos incluyen ácidos nucleicos de origen natural, tales como ácido desoxirribonucleico ("ADN") y ácido ribonucleico ("ARN"), así como análogos de ácidos nucleicos. Los análogos de ácidos nucleicos incluyen aquellos que incluyen bases no naturales, nucleótidos que se unen a los enlaces con otros nucleótidos distintos del enlace fosfodiéster natural o que incluyen bases unidas a través de enlaces distintos de los enlaces fosfodiéster. Por lo tanto, los análogos de nucleótidos incluyen, por ejemplo y sin limitación, fosforotioatos, fosforoditioatos, fosforotriésteres, fosforamidatos, boranofosfatos, metilfosfonatos, fosfonatos de quiral-metilo, ribonucleótidos de 2-O-metilo, péptido-ácidos nucleicos (PNA) y similares. Tales polinucleótidos pueden sintetizarse, por ejemplo, usando un sintetizador de ADN automatizado. La expresión "ácido nucleico" se refiere típicamente a polinucleótidos grandes. El término "oligonucleótido" se refiere típicamente a polinucleótidos cortos, generalmente no mayores de aproximadamente 50 nucleótidos. Se entenderá que cuando una secuencia de nucleótidos está representada por una secuencia de ADN (es decir, A, T, G, C), esto también incluye una secuencia de ARN (es decir, A, U, G, C) en el que "U" sustituye a "T."
"ADNc" se refiere a un ADN que es complementario o idéntico a un ARNm, tanto en forma de cadena sencilla o de cadena doble.
La notación convencional se usa en este documento para describir secuencias de polinucleótidos: el extremo izquierdo de una secuencia de polinucleótidos monocatenario es el extremo 5'; la dirección izquierda de una secuencia de polinucleótido de doble cadena se conoce como la dirección 5'. La dirección de adición 5' a 3' de nucleótidos a transcritos de ARN nacientes se denomina como la dirección de transcripción. La cadena de ADN que tiene la misma secuencia que un ARNm se denomina "cadena codificante"; secuencias en la cadena de ADN que tienen la misma secuencia que un ARNm transcrito a partir de ese ADN y que están situadas 5' al extremo 5' del transcrito de ARN son referidas como "secuencias cadena arriba"; secuencias en la cadena de ADN que tienen la misma secuencia que el ARN y que están 3' al extremo 3' del transcrito de ARN de codificación se denominan como "secuencias cadena abajo".
"Complementario" se refiere a la compatibilidad topológica o a hacer coincidir juntas las superficies de interacción de dos polinucleótidos. Por lo tanto, las dos moléculas pueden describirse como complementarias, y además, las características de la superficie de contacto son complementarias entre sí. Un primer polinucleótido es complementario a un segundo polinucleótido si la secuencia de nucleótidos del primer polinucleótido es idéntica a la secuencia de nucleótidos de la pareja de unión de polinucleótidos del segundo polinucleótido. De este modo, el polinucleótido cuya secuencia 5'-TATAC-3' es complementaria a un polinucleótido cuya secuencia es 5'-GTATA-3'.
Una secuencia de nucleótidos es "sustancialmente complementaria" a una secuencia de nucleótidos de referencia si la secuencia complementaria respecto a la secuencia de nucleótidos objeto es sustancialmente idéntica a la secuencia de nucleótidos de referencia.
"Codificación" se refiere a la propiedad inherente de secuencias específicas de nucleótidos en un polinucleótido, tal como un gen, un ADNc, o un ARNm, para servir como plantillas para la síntesis de otros polímeros y
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macromoléculas en procesos biológicos que tienen ya sea una secuencia definida de nucleótidos (es decir, ARNr, ARNt y ARNm) o una secuencia definida de aminoácidos y las propiedades biológicas resultantes de los mismos. Así, un gen codifica una proteína si la transcripción y traducción del ARNm producido por ese gen produce la proteína en una célula u otro sistema biológico. Tanto la cadena codificante, la secuencia de nucleótidos de la cual es idéntica a la secuencia de ARNm y que por lo general se proporciona en los listados de secuencia, y la cadena no codificante, utilizada como molde para la transcripción, de un gen o ADNc puede ser referido como que codifica la proteína u otro producto de ese gen o ADNc. A menos que se especifique lo contrario, una "secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos" incluye todas las secuencias de nucleótidos que son versiones degeneradas una de la otra y que codifican la misma secuencia de aminoácidos. Las secuencias de nucleótidos que codifican proteínas y ARN pueden incluir intrones.
"Polinucleótido recombinante" se refiere a un polinucleótido que tiene secuencias que no están unidas naturalmente juntas. Un polinucleótido recombinante amplificado o montado puede incluirse en un vector adecuado, y el vector puede usarse para transformar una célula huésped adecuada. Una célula huésped que comprende el polinucleótido recombinante se denomina "célula huésped recombinante". El gen se expresa entonces en la célula huésped recombinante para producir, por ejemplo, un "polipéptido recombinante". Un polinucleótido recombinante puede servir como una función no codificante (por ejemplo, promotor, origen de replicación, sitio de unión de ribosomas, etc.) también.
"Secuencia de control de expresión" se refiere a una secuencia de nucleótidos en un polinucleótido que regula la expresión (transcripción y/o traducción) de una secuencia de nucleótidos ligada operativamente a la misma. "Unido operativamente" se refiere a una relación funcional entre dos partes en las que la actividad de una parte (por ejemplo, la capacidad para regular la transcripción) da lugar a una acción en la otra parte (por ejemplo, la transcripción de la secuencia). Las secuencias de control de expresión pueden incluir, por ejemplo y sin limitación, secuencias de promotores (por ejemplo, inducible o constitutiva), potenciadores, terminadores de la transcripción, un codón de inicio (es decir, ATG), señales de empalme para intrones y codones de parada.
"Vector de expresión" se refiere a un vector que comprende un polinucleótido recombinante que comprende secuencias de control de la expresión unidas operativamente a una secuencia de nucleótidos que se expresa. Un vector de expresión comprende suficientes elementos que actúan en cis para la expresión; otros elementos para la expresión pueden ser suministrados por la célula huésped o en el sistema de expresión in vitro. Los vectores de expresión incluyen todos los conocidos en la técnica, tales como cósmidos, plásmidos (por ejemplo, desnudos o contenidos en liposomas) y virus que incorporan el polinucleótido recombinante.
"Amplificación" se refiere a cualquier medio por el que una secuencia de polinucleótidos se copia y de este modo se expandió a un mayor número de moléculas de polinucleótidos, por ejemplo, por transcripción inversa, reacción en cadena de la polimerasa y reacción en cadena de la ligasa.
"Cebador" se refiere a un polinucleótido que es capaz de hibridarse específicamente a una plantilla de polinucleótido designado y proporcionar un punto de iniciación para la síntesis de un polinucleótido complementario. Tal síntesis se produce cuando el cebador de polinucleótido se coloca bajo condiciones en las que se induce la síntesis, es decir, en presencia de nucleótidos, una plantilla polinucleotídica complementaria y un agente para la polimerización tal como ADN polimerasa. Un cebador es típicamente monocatenario, pero puede ser de doble cadena. Los cebadores son típicamente ácidos desoxirribonucleicos, pero una amplia variedad de cebadores sintéticos y de origen natural son útiles para muchas aplicaciones. Un cebador es complementario a la plantilla a la que está diseñado para hibridarse para servir como un sitio para la iniciación de la síntesis, pero no necesita reflejar la secuencia exacta de la plantilla. En tal caso, la hibridación específica del cebador al molde depende de la rigurosidad de las condiciones de hibridación. Los cebadores pueden marcarse con, por ejemplo, restos cromogénicos, radiactivos, fluorescentes y usarse como restos detectables.
"Polipéptido" se refiere a un polímero compuesto de restos de aminoácidos, en relación con las variantes estructurales naturales y análogos sintéticos de origen no natural de los mismos unidos a través de enlaces peptídicos, relacionados con variantes estructurales naturales y análogos sintéticos no naturales de los mismos. Los polipéptidos sintéticos pueden sintetizarse, por ejemplo, usando un sintetizador de polipéptidos automatizado. El término "proteína" típicamente se refiere a polipéptidos grandes. El término "péptido" típicamente se refiere a polipéptidos cortos.
La notación convencional se usa en el presente documento para retratar secuencias de polipéptidos: el extremo izquierdo de una secuencia polipeptídica es el extremo amino terminal; el extremo derecho de una secuencia polipeptídica es el extremo carboxilo terminal.
"Sustitución conservadora" se refiere a la sustitución en un polipéptido de un aminoácido con un aminoácido funcionalmente similar. Los seis grupos siguientes contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservadoras entre sí:
1) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T);
2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E);
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Edad
Ingesta de proteínas recomendada total (g)
6 meses-1 año
14
1-3 años
16
Niños
(4-6 años) 24
7-10 años
28
Hombres
11-14 años 45
15-18 años
59
19-24
58
25-50
63
51+
63
Mujeres
11-14 años 46
15-18 años
44
19-24
46
25-50
50
51+
50
Embarazadas
60
Lactantes
65
Como puede verse a partir de las directrices ejemplares anteriores, en los Estados Unidos, la ingesta de proteínas recomendada para mujeres en edad de procrear (por ejemplo, menos de 51) es de aproximadamente 44 a 50 g/día, mientras que las mujeres embarazadas requieren que se recomiende una ingesta de aproximadamente 60 g/día. En
5 Canadá y el Reino Unido, la ingesta de proteínas recomendada para las mujeres embarazadas es del orden de aproximadamente 70 g/día y 52 g/día. Por lo tanto, la necesidad de garantizar que los niveles de concentración de Phe en plasma de mujeres embarazadas estén estrechamente controlados se complica más por el hecho de que este grupo de pacientes con PKU requiere más proteínas que las mujeres con PKU no embarazadas de edad comparable.
10 En vista de lo anterior, se contempla que las terapias de la variante PAT proporcionadas en este documento serán particularmente útiles en mujeres embarazadas. Se contempla que una mujer, que padece algún tipo de HPA que esté embarazada o que esté contemplando un embarazo, pueda ser embarcada en un curso de terapia con variante PAL procariota para asegurarse de que sus niveles de concentración plasmática de fenilalanina se mantengan tan cerca de 180 μΜ a aproximadamente 360 μΜ, cuando sea posible. Tal curso de terapia permitiría que la mujer
15 aumente su nivel de ingesta de proteína normal.
La discusión de los niveles de concentraciones de fenilalanina en plasma y los grados en que tales concentraciones de fenilalanina deben disminuirse discutidos anteriormente en este documento se incorporan en la presente sección para mujeres embarazadas.
Control de PKU en niños y métodos de tratamiento de los mismos
20 Como se discute a lo largo del presente documento, se ha determinado que una elevación en la concentración de Phe plasmática en niños pequeños (edades de cero a 3 años de edad) se traduce en una disminución significativa en el coeficiente intelectual del niño. Sin embargo, como se ha discutido en otra parte de la memoria descriptiva, los pacientes que tienen elevadas concentraciones en plasma de fenilalanina en cualquier lugar de hasta 400 μΜ normalmente no reciben ninguna intervención dietética. Por lo tanto, los niños en edad de cero a 3 años sufren
25 efectos deletéreos significativos de las presentes terapias. La presente solicitud contempla el tratamiento de cualquier infante que tiene una concentración de Phe en plasma sin restricciones que es mayor que 360 μΜ ± 15 μΜ con una composición terapéutica que comprende una variante PAL procariota a fin de producir una disminución beneficiosa de la concentración de Phe en plasma de ese sujeto.
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Proteína AvPAL pegilada
Muestra Previo D8 D15 D22 D29
S 2 06
<50 <50 50 50 50
AvPAL_C565SC503S (1,0 UI)
S 3 07 <50 <50 <50 <50 <50
S 3 08
<50 <50 <50 <50 <50
S 3 09
<50 <50 <50 <50 50
S 3 10
<50 <50 <50 <50 <50
AvPAL_C565SC503S (4,0 UI)
S 4 11 <50 <50 <50 50 50
S 4 12
<50 <50 50 50 50
S 4 13
50 50 50 450 150
S 4 14
<50 <50 <50 <50 <50
WT AvPAL (4,0 UI)
S 5 15 <50 <50 150 150 450
S 5 16
<50 50 150 150 450
S 5 17
<50 <50 150 4050 12150
S 5 18
<50 50 150 450 150
Proteína AvPAL pegilada
Muestra Previo D36 D43 D50 D57
AvPAL_C565SC503S (0,25 UI)
S 2 03 <50 <50 150 150 <50
S 2 04
<50 >1350 >1350 >1350 4050
S 2 05
<50 N/A* N/A N/A N/A
S 2 06
<50 <50 50 50 <50
AvPAL_C565SC503S (1,0 UI)
S 3 07 <50 50 150 >1350 150
S 3 08
<50 <50 <50 <50 <50
S 3 09
<50 450 >1350 >1350 450
S 3 10
<50 <50 50 50 <50
AvPAL_C565SC503S (4,0 UI)
S 4 11 <50 50 150 50 50
S 4 12
<50 150 150 150 50
S 4 13
50 450 450 450 150
S 4 14
<50 150 150 150 150
WT AvPAL (4,0 UI)
S 5 15 <50 450 1350 1350 150
S 5 16
<50 150 450 450 150
S 5 17
<50 4050 4050 4050 450
S 5 18
<50 50 50 50 <50
* No hay muestras/datos no disponibles
Los títulos de IgG anti-AvPAL reducidos en ratones administrados con 4,0 UI de mutante de cisteína doble de AvPAL pegilado en comparación con 4,0 UI de AvPAL pegilado tipo salvaje se mantuvieron durante todo el estudio.
En el segundo estudio, el mutante de cisteína doble de AvPAL AvPAL_C565SC503S se puso a prueba en diferentes proporciones de pegilación. Los ratones ENU2 machos se dividieron en 5 grupos de dosis: 4 grupos de ensayo (n =
46
4) y un grupo de vehículo (n = 2). A cada ratón se le dio 8 dosis por vía subcutánea semanal de vehículo, baja dosis de mutante de cisteína doble de AvPAL pegilado (4 UI y relación 1:1,6 de AvPAL:PEG), dosis media de mutante de cisteína doble de AvPAL pegilado (4 UI y relación 1:2,4 de AvPAL:PEG), dosis alta de mutante de cisteína doble de AvPAL pegilado (4 UI y relación 1:3 de AvPAL:PEG), o AvPAL pegilado tipo salvaje (4 UI y relación 1:3 de
5 AvPAL:PEG). El plasma se recogió antes de la dosis y a los 4 días después de la dosis (el día 61) y se analizaron para los niveles de Phe. También se recogió suero antes de la dosis a los 4 días después de la dosis (hasta 57 días) para el análisis de los niveles de anticuerpos anti-AvPAL. Los ratones también se pesaron una vez por semana a partir de 2 días antes de la primera dosis (el día 40).
Un ratón tratado con vehículo murió durante el estudio. Como se muestra en la Figura 18, se observó una reducción
10 dependiente de la relación PEG en los niveles de Phe en el plasma 4 días después de cada inyección s.c. del mutante de cisteína doble de AvPAL pegilado. A relaciones de PEG equivalentes, no hubo diferencia en los niveles plasmáticos de Phe entre los ratones tratados con AvPAL pegilado tipo salvaje o el mutante de cisteína doble de AvPAL pegilado. Como se muestra en la figura 19, los pesos corporales de los ratones tratados con AvPAL pegilado tipo salvaje o el mutante de cisteína doble de AvPAL pegilado fueron significativamente mayores que los ratones
15 tratados con vehículo.
Los títulos de anticuerpos anti-AvPAL en estos ratones se analizaron con el ensayo de ELISA indirecto descrito anteriormente.
Como se muestra en la Tabla 7, los títulos de anticuerpos anti-AvPAL fueron más bajos en los ratones tratados con el mutante de cisteína doble de AvPAL pegilado en comparación con los ratones tratados con una dosis equivalente
20 de AvPAL pegilado tipo salvaje que tiene la misma proporción (1:3) de AvPAL frente a PEG. Se observó una respuesta a la dosis inversa entre los títulos de anticuerpos anti-AvPAL y la relación de AvPAL frente a PEG, de acuerdo con la expectativa de que la pegilación de proteínas, tales como AvPAL, se asocia con una menor inmunogenicidad in vivo.
Tabla 7: Títulos de IgG anti-AvPAL
Proteína AvPAL PEGilada
Muestra Previo D15 D28 D43 D64
WT AvPAL (PEG 1:3 NOF)
S 1 01 <50 450 12150 4050 >1350
S 1 06
<50 450 450 450 4050
S 1 10
<50 50 50 150 450
S 1 17
<50 150 450 450 1350
AvPAL_C565SC503S (PEG 1:1,6)
S 2 02 50 450 12150 1350 1350
S 2 07
<50 1350 12150 12150 36450
S 2 11
<50 450 1350 12150 12150
S 2 18
50 150 36450 26,57M >36450
AvPAL_C565SC503S (PEG 1:2,4)
S 3 03 <50 50 150 450 4050
S 3 08
<50 50 50 50 450
S 3 12
<50 50 150 450 4050
S 3 13
<50 50 450 1350 4050
AvPAL_C565SC503S (PEG 1:3)
S 4 04 <50 50 50 450 450
S 4 09
50 50 50 150 450
S 4 14
<50 <50 50 450 1350
S 4 16
<50 <50 150 50 450
Vehículo
S 5 05 <50 <50 <50 <50 N/A*
S 5 15
<50 <50 <50 <50 <50
25 * N/A: sin muestra de suero para este punto de tiempo
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