JPH11513890A

JPH11513890A - Ｃ型肝炎ウイルスｎｓ３プロテアーゼの合成インヒビター

Info

Publication number: JPH11513890A
Application number: JP9540922A
Authority: JP
Inventors: シャン，ルーミン; ダブリュー．ムイ，フィリップ; シー．ウェバー，パトリシア
Original assignee: Schering Corp
Current assignee: Merck Sharp and Dohme Corp
Priority date: 1996-05-10
Filing date: 1997-05-08
Publication date: 1999-11-30
Also published as: AU2933797A; WO1997043310A1; CA2254122A1; EP0907659A1

Abstract

(57)【要約】 HCV NS3プロテアーゼのインヒビター。このインヒビターは、NS3プロテアーゼの基質のサブ配列またはNS4Aコファクターのサブ配列である。本発明の別のインヒビターは、NS4Aコファクターのサブ配列に連結した基質のサブ配列を含む。別の実施態様では、インヒビターは二価インヒビターであり、これはHCV NS4Aコファクターのサブ配列、変異したサブ配列、または変異した完全長配列に連結された、NS3プロテアーゼの基質のサブ配列、変異したサブ配列、または変異した完全長配列からなる。

Description

【発明の詳細な説明】Ｃ型肝炎ウイルスNS3プロテアーゼの合成インヒビター発明の背景Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）は、世界中の非Ａ非Ｂ（NANB）肝炎、慢性肝炎、および肝細胞癌腫（HCC）の主要な病因因子であると考えられている。ウイルス感染は、合衆国における輸血にともなう90％を超える肝炎の原因であり、そして40 才以上の成人における肝炎の優性な形態である。ほとんどすべての感染は、慢性肝炎を生じ、そしてほぼ20％が肝硬変に進展する。ウイルス粒子は、有効なインビトロ複製系の欠如および感染肝臓組織または血液中のHCV粒子の極度に低い量に起因して同定されていない。しかし、ウイルスゲノムの分子クローニングが、感染チンパンジーの血清からメッセンジャーRNA （mRNA）を単離することにより達成され、次いで組換え方法を用いてクローン化された。［Grakoui Aら、J.Virol．67:1385-1395(1993)］現在、HCVは、その構成がフラビウイルスおよびペスチウイルスの構成に類似の約9400ヌクレオチドを含むポジティブ鎖RNAゲノムを含むことが知られている。HCVのゲノムは、フラビウイルスおよびペスチウイルスのゲノムのように、感染細胞中でタンパク質分解を行い、成熟ウイルスタンパク質を形成する約3000アミノ酸の単一の大きなポリタンパク質をコードする。ウイルスポリタンパク質のセルフリー(cell-free)翻訳および細胞培養発現研究は、HCVポリタンパク質が、細胞およびウイルスプロテアーゼによりプロセシングされて推定の構造および非構造（NS）タンパク質を産生することを確立した。特異的タンパク質分解により、ポリタンパク質から、少なくとも９つの成熟ウイルスタンパク質が産生される。切断産物の順序および命名は以下のようである：NH₂-C-E1-E2-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-COOH。３つのアミノ末端の推定構造タンパク質、Ｃ（カプシド）、E1、およびE2（２つのエンベロープ糖タンパク質）は、小胞体（ER）の宿主シグナルペプチダーゼにより切断されると考えられている。宿主酵素はまた、NSのアミノ末端の生成を担っている。非構造タンパク質のタンパク質分解プロセッシングは、ウイルスポリタンパク質内に含まれるウイルスプロテアーゼ：NS2-3およびNS3により行われる。NS2-3プロテアーゼは、N S2とNS3との間の切断を触媒する。それはメタロプロテアーゼであり、そしてNS2 およびNS3のプロテアーゼドメインの両方を必要とする。NS3プロテアーゼは、ポリタンパク質の非構造部分中の基質の切断の残りを触媒する。NS3タンパク質は、631アミノ酸残基を含み、そして２つの酵素ドメイン：アミノ酸残基１〜181内に含まれるプロテアーゼドメインおよびタンパク質の残りの中に含まれるヘリカーゼATPaseドメインからなる。しかし、70kDのNS3タンパク質が感染細胞でさらに切断されてヘリカーゼドメインからプロテアーゼドメインを分離するか否かは知られておらず、細胞培養発現研究では切断は観察されていない。 NS3プロテアーゼは、酵素のセリンプロテアーゼのクラスのメンバーである。それは、触媒三構造としてHis，Asp、およびSerを含む。触媒三構造残基の変異は、基質NS3/4A、NS4A/4B、NS4B/5A、およびNS5A/5Bにおける切断をなくす。NS3 とNS4Aとの間の切断は、分子内酵素反応により媒介され、その一方でNS4A/4B、4 B/5A、5A/5B部位は、トランス(trans)の酵素反応で生じる。哺乳動物細胞中のHCV NSポリタンパク質の種々の形態の一時的発現を用いる実験は、すべてのこれらの切断の有効なプロセッシングにはNS3セリンプロテアーゼが必要であるが、十分ではないことを確立した。フラビウイルスのように、HC V NS3プロテアーゼもまた、これらの切断反応のいくつかを触媒するためにコファクターを必要とする。セリンプロテアーゼNS3に加えて、NS4Aタンパク質は、N S3/4Aおよび4B/5A部位における基質の切断に絶対的に必要であり、そして5A/5B 、そしておそらく4A/4B間の基質の切断の効率を増加する。 HCV NS3プロテアーゼは、HCV複製に必要である非構造HCVタンパク質を切断するので、NS3プロテアーゼは、HCVウイルスに対する治療薬の開発の標的であり得る。従って、HCVプロテアーゼのインヒビターの開発の必要性が存在する。発明の要旨本発明は、Ｃ型肝炎NS3プロテアーゼの二価インヒビターを提供することによってこの必要性を満たし、このインヒビターは第２のペプチドに連結された第１のペプチドからなり、この第１のペプチドはＣ型肝炎NS3プロテアーゼの基質のサブ配列、変異したサブ配列、または変異した完全長配列であり、そして上記第２のペプチドはＣ型肝炎NS4Aポリペプチドのサブ配列、変異したサブ配列、または変異した完全長配列である。本発明は、ペプチドからなるHCVプロテアーゼのインヒビターをさらに提供し、このペプチドはHCV NS3プロテアーゼの基質のサブ配列、変異したサブ配列、または変異した完全長配列である。本発明は、ペプチドからなるHCV NS3プロテアーゼのインヒビターをさらに提供し、このペプチドはHCV NS4Aのポリペプチドのサブ配列、変異したサブ配列、または変異した完全長配列である。本発明は、HCVウイルスに感染した個体を処置する方法をさらに包含し、この方法は上記個体にHCV NS3プロテアーゼのインヒビターを投与する工程を包含し、このインヒビターは第２のペプチドに連結された第１のペプチドからなり、この第１のペプチドはＣ型肝炎NS3プロテアーゼの基質のサブ配列、変異したサブ配列、または変異した完全長配列であり、そして上記第２のペプチドはＣ型肝炎 NS4Aポリペプチドのサブ配列、変異したサブ配列、または変異した完全長配列である。本発明は、HCVウイルスに感染した個体を処置する方法をさらに包含し、この方法は上記個体にHCV NS3プロテアーゼのインヒビターを投与する工程を包含し、このインヒビターはペプチドからなり、このペプチドはHCV NS3プロテアーゼの基質のサブ配列、変異したサブ配列、または変異した完全長配列である。本発明は、HCVウイルスに感染した個体を処置する方法をさらに包含し、この方法は、上記個体にHCV NS3プロテアーゼのインヒビターを投与する工程を包含し、このインヒビターは、Ｃ型肝炎NS4Aポリペプチドのサブ配列、変異したサブ配列、または変異した完全長配列である。本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスに感染した個体を処置するための薬学的組成物をさらに包含し、この薬学的組成物はHCV NS3プロテアーゼのインヒビターおよび薬学的キャリアからなり、このインヒビターは第２のペプチドに連結された第１のペプチドからなり、この第１のペプチドはＣ型肝炎NS3プロテアーゼの基質のサブ配列、変異したサブ配列、または変異した完全長配列であり、そして上記第２のペプチドはＣ型肝炎NS4Aポリペプチドのサブ配列、変異したサブ配列、または変異した完全長配列である。本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスに感染した個体を処置するための薬学的組成物をさらに提供し、この薬学的組成物はHCV NS3プロテアーゼのインヒビターおよび薬学的キャリアからなり、このインヒビターはHCV NS3プロテアーゼの基質のサブ配列、変異したサブ配列、または変異した完全長配列である。本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスに感染した個体を処置するための薬学的組成物をさらに提供し、この薬学的組成物はHCV NS3プロテアーゼのインヒビターおよび薬学的キャリアからなり、このインヒビターはHCV NS4Aポリペプチドのサブ配列、変異したサブ配列、または変異した完全長配列である。図面の簡単な説明図１は、本発明の二価インヒビターの実施態様を概略的に示す。図２は、プラスミドpBJ1015の組換え合成を示す。図３は、プラスミドpTS56-9の組換え合成を示す。図４は、プラスミドpJB1006の組換え合成を示す。図５は、プラスミドpJB1022の組換え合成を示す。図６は、プラスミドpNB(-V)182△4AHTの組換え合成を示す。図７は、プラスミドpT5His/HIV/183の組換え合成を示す。発明の詳細な説明引用したすべての参考文献の教示は、その全体が、本明細書に参考として援用される。本発明は、HCV NS3プロテアーゼのインヒビターである。本発明は、基質またはコファクターNS4Aのいずれかの、NS3プロテアーゼとの相互作用を阻害するHCV NS3プロテアーゼのインヒビター、またはNS3プロテアーゼの、コファクターNS4 AおよびNS3プロテアーゼの基質の両方との相互作用を阻害する二価インヒビターに関する。単一の結合部位のみを標的にするインヒビターと比較して、二価の酵素インヒビターは、より高い結合親和性（能力）、および低減された毒性影響について類似の細胞宿主酵素に対して高められた特異性に関してさらなる利点を提供し得る。HCV NS3 プロテアーゼの二価インヒビターの設計戦略 HCV NS3プロテアーゼの二価インヒビターの設計のための基礎的戦略は、３つの個々の成分からなる分子骨格の考案を含んだ。１．基質結合部位への結合に適切な領域；２．NS4A結合部位への結合に適切な領域３．領域（１）と（２）とを連結する可撓性リンカー領域であって、この２つの末端領域をそれらの各々の結合部位に結合することを可能にする領域。概略的に、これは図１に示され、そこでは、基質サブ配列はブロック10で示され、リンカー12に連結されており、そしてこのリンカー12は、14で示されるポリペプチドNS4Aに連結されている。 NS3プロテアーゼは、HCVポリタンパク質を、NS3/4A、4A/4B、4B/5Aおよび5A/5 B連結部で切断し、次いでこれら部位のサブ配列または変異したサブ配列は、基質インヒビターとして用いられ得る。インヒビターのサブ配列である基質インヒビターは、切断部位の前または後であるサブ配列であるべきであるが、好ましくは、切断部位を含むべきではない。基質の変異したサブ配列または変異した完全長配列は、基質の切断がプロテアーゼの機構に基づく不活性化(mechanism-based inactivation)に至る切断を生じないように切断部位が変異される場合に、用いられ得る。例えば、NS3/4A切断部位は以下の配列を含む：切断部位は、10位のスレオニンと11位のセリンとの間にある。任意のサブ配列インヒビターは、好ましくは、セリン残基の前またはスレオニン残基の後にあるべきである。あるいは、変異したサブ配列または配列は、10〜11位のスレオニン/ セリン切断部位を変化させ、切断部位をなくすことにより産生され得る。 NS4A/4Bは以下の配列を含む。切断部位は、10位のシステイン残基と11位のセリンとの間にある。任意のサブ配列は、好ましくは、セリンの前またはシステインの後にあるべきであるが、好ましくは、システインおよびセリンの両方を含むべきではない。あるいは、変異したサブ配列または配列は、10〜11位におけるシステイン/セリン切断部位を変化させ、切断部位をなくすことにより産生され得る。 NS4B/5Aは以下の配列を含む。切断部位は、10位のシステインと11位のセリンとの間にある。任意のサブ配列は、好ましくは、セリンの前で終わり、またはシステインの前で後で開始すべきであるが、好ましくは、セリンおよびシステインの両方を含むべきではない。あるいは、変異したサブ配列または配列は、10〜11位のシステイン/セリン切断部位を変化させ、切断部位をなくすことにより産生され得る。 NS5A/5Bは以下の配列を含む。切断部位は８位のシステインと９位のセリンとの間にある。任意のサブ配列は、好ましくは、システインで終わり、またはセリンで開始すべきであるが、好ましくは、システインおよびセリンの両方を含むべきではない。あるいは、変異した配列またはサブ配列は、８〜９位のシステイン/セリン切断部位を変化させ、切断部位をなくすことにより産生され得る。リンカー12は、ポリペプチド10および14と結合を形成し得る任意の化学物質であり得る。好ましくは、リンカーは、約７〜14炭素残基を有する炭素鎖に長さが等価であるべきである。適切なリンカーの例は、２つの6-アミノカプロン酸（Ac p）残基、またはAcpおよびLys（ここで、ポリペプチド10または14の一方は、リジンのεアミンとペプチド結合を形成する）である。本発明の二価インヒビターの例は以下の通りである： Glu-Asp-Val-Val-Cys-Cys-Acp-Acp-Cys-Val-Val-Ile-Val- Gly-Arg-Ile-Val-Leu-Ser-Gly-Lys（配列番号１） Glu-Asp-Val-Val-Cys-Cys-Acp-Cys-Val-Val-Ile-Val- Gly-Arg-Ile-Val-Leu-Ser-Gly-Lys-Lys（配列番号２） Glu-Asp-Val-Val-Cys-Cys-Acp-Xaa-Lys-Gly-Ser-Leu-Val- Ile-Arg-Gly-Val-Ile-Val-Val-Cys（配列番号３）ここで、Xaaは、そのεアミノと、10位のグリシンとペプチド結合を形成する続くリジンのカルボキシル基との間のペプチド結合を有するリジン残基である。さらに、１位のグルタミン酸残基はアセチル化されてもよく、またはされなくてもよい。 Glu-Asp-Val-Val-Cys-Cys-Xaa-Lys-Gly-Ser-Leu-Val- Ile-Arg-Gly-Val-Ile-Val-Val-Cys（配列番号４）ここで、Xaaは、そのεアミノと、Glyとペプチド結合を形成する続くリジンのカルボキシル基との間のペプチド結合を有するリジン残基である。さらに、Xaa のカルボキシル基は、別のリジンのαアミノ基とペプチド結合を形成する（示さず）； Glu-Asp-Val-Val-Cys-Cys-Acp-Acp-Lys-Gly-Ser-Leu-Val- Ile-Arg-Gly-Val-Ile-Val-Val-Cys（配列番号５）ここで、９〜21位のアミノ酸は好ましくはＤアミノ酸である； Glu-Asp-Val-Val-Cys-Cys-Acp-Lys-Cys-Val-Val-Ile- Val-Gly-Arg-Ile-Val-Leu-Ser-Gly-Lys（配列番号６）ここで、８位のリジン残基は、Acpのカルボキシルとリジンのαアミノ基との間のペプチド結合を有し、そして８位のリジンのεアミノ基は９位のシステイン残基のカルボキシル基とペプチド結合を形成し、そして９〜21位のアミノ酸残基は好ましくはＤアミノ酸残基である； Glu-Asp-Val-Val-Cys-Cys-Acp-Lys-Gly-Ser-Leu-Val-Ile-Arg- Gly-Val-Ile-Val-Val-Cys-Lys（配列番号７）ここで、８〜20位のアミノ酸残基は好ましくはＤアミノ酸残基である； Glu-Asp-Val-Val-Cys-Cys-Xaa-Cys-Val-Val-Ile-Val-Gly- Arg-Ile-Val-Leu-Ser-Gly-Lys（配列番号８）ここで、Xaaは、そのεアミノと、８位のCys残基のカルボキシル基との間のペプチド結合を形成するLysであり、そしてLys残基のカルボキシル基は別のLys残基のαアミノ基とペプチド結合を形成し（示さず）、好ましくは、８〜20位のアミノ酸残基はＤアミノ酸である。本発明の適切な一価インヒビターの例は、以下の通りである： Lys-Gly-Ser-Leu-Val-Ile-Arg-Gly-Val-Ile-Val-Val-Cys-Lys（配列番号９）ここで、１〜13位のアミノ酸残基は好ましくはＤアミノ酸残基である； Lys-Gly-Ser-Leu-Val-Ile-Arg-Gly-Val-Ile-Val-Lys（配列番号10）ここで、１〜11位のアミノ酸残基は好ましくはＤアミノ酸残基である； Cys-Val-Val-Ile-Val-Gly-Arg-Ile-Val-Leu-Ser-Gly-Lys（配列番号11）ここで、アミノ酸残基は好ましくはＤアミノ酸残基である； Ser-Leu-Val-Ile-Arg-Gly-Val-Ile-Val（配列番号12）ここで、アミノ酸残基は好ましくはＤアミノ酸残基であり、そして１位のセリン残基は好ましくはアセチル化される； Lys-Gly-Ser-Leu-Val-Ile-Arg-Gly-Val-Ile-Val-Val-Cys（配列番号１３）ここで、アミノ酸残基は好ましくはＤアミノ酸残基であり、そして１位のリジン残基は好ましくはアセチル化される； Xaa-Lys-Gly-Ser-Leu-Val-Ile-Arg-Gly-Val-Ile Val-Val-Cys-Lys-Lys （配列番号14）ここで、Xaaはビオチンであり、そして２〜14位のアミノ酸残基は好ましくはＤアミノ酸残基である； Lys-Gly-Ser-Leu-Val-Ile-Arg-Gly-Val-Ile-Val-Val-Cys-Xaa-Lys （配列番号15）ここで、Xaaはリジン残基（そのεアミノ基がビオチンとペプチド結合を形成する）であり、そして１〜13位のアミノ酸残基は好ましくはＤアミノ酸残基である。本発明のインヒビターは、排除固相合成、部分的固相法、フラグメント縮合、または従来の溶液合成のような適切な方法により合成され得る。ポリペプチドは、好ましくは、Merrifield，J．Am．Chem．Soc．85:2149（1963）により記載されるような固相ペプチド合成により調製される。合成は、αアミノ末端において保護されているアミノ酸を用いて実施される。不安定な側鎖を有する三官能アミノ酸もまた適切な基で保護されて、ポリペプチドのアセンブリの間に生じる所望されない化学反応を防止する。αアミノ保護基は選択的に除去されて、続く反応がアミノ末端において起こることを可能にする。αアミノ保護基の除去のための条件は、側鎖保護基を除去しない。 αアミノ保護基は、段階的ポリペプチド合成の技術分野において有用であることが公知であるαアミノ保護基である。アシル型保護基（例えば、ホルミル、トリフルオロアセチル、アセチル）、アリール型保護基（例えば、ビオチニル）、芳香族ウレタン型保護基（例えば、ベンジルオキシカルボニル（Cbz）、置換ベンジルオキシカルボニル、および9-フルオレニルメチルオキシ-カルボニル（Fmo c））、脂肪族ウレタン保護基（例えば、t-ブチルオキシカルボニル（tBoc）、イソプロピルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル）、ならびにアルキル型保護基（例えば、ベンジル、トリフェニルメチル）が含まれる。好ましい保護基はtBocおよびFmocであり、従って、ペプチドはそれぞれtBocおよびFm oc化学により合成されると言われる。選択される側鎖保護基は、カップリングの間にインタクトなままでなければならず、そしてアミノ末端保護基の脱保護の間またはカップリング条件の間に除去されてはならない。側鎖保護基はまた、終了したポリペプチドを変化させない反応条件を使用して、合成の完了に際して除去可能でなければならない。tBoc化学において、三官能アミノ酸についての側鎖保護基は大部分がベンジルに基づく。 Fmoc化学においては、それらは大部分がtert-ブチルまたはトリチルに基づく。 tBoc化学において、好ましい側鎖保護基は、Argについてはトシル、Aspについてはシクロヘキシル、Cysについては4-メチルベンジル（およびアセトアミドメチル）、Glu、Ser、およびThrについてはベンジル、Hisについてはベンジルオキシメチル（およびジニトロフェニル）、Lysについては2-Cl-ベンジルオキシカルボニル、Trpについてはホルミル、そしてTyrについては2-ブロモベンジルである。Fmoc化学において、好ましい側鎖保護基は、Argについては2,2,5,7,8-ペンタメチルクロマン-6-スルホニル（Pmc）または2,2,4,6,7-ペンタメチルジヒドロベンゾフラン-5-スルホニル（Pbf）、Asn、Cys、Gln、およびHisについてはトリチル、Asp、Glu、Ser、Thr、およびTyrについてはtert-ブチル、LysおよびTrpについてはtBocである。通常、固相合成は、αアミノ保護（側鎖保護）アミノ酸を適切な固相支持体にカップリングすることにより、カルボキシル末端から実施される。クロロメチル、クロロトリニル、またはヒドロキシメチル樹脂へ付着されたときにエステル結合が形成され、そして得られたポリペプチドはＣ末端に遊離カルボキシル基を有する。あるいは、アミド樹脂（例えば、ベンズヒドリルアミンまたはp-メチルベンズヒドリルアミン樹脂（tBoc化学について）およびRinkアミドまたはPAL樹脂（Fmoc化学について））が使用される場合はアミド結合が形成され、Ｃ末端にカルボキシアミド基を有するポリペプチドが生じる。これらの樹脂（ポリスチレンベースもしくはポリアミドベース、またはポリエチレングリコールグラフトのいずれかであり、ハンドルまたはリンカーを有するかまたは有さず、付着された第一のアミノ酸を有するかまたは有さない）は市販されており、これらの調製はStew artら(1984)，"Solid Phase Peptide Synthesis"（第２版）、Pierce Chemical CO.,Rockford，IL.；ならびにBayerおよびRapp（1986）Chem.Pept.Prot．3,3；ならびにAthertonら（1989）Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical App roach，IRL Press，Oxfordにより記載されている。側鎖（必要な場合）およびαアミノ基において保護されたＣ末端アミノ酸は、種々の活性化薬剤（ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド（DIPCDI）、およびカルボニルジイミダゾール（CDI）を含む）を用いて、ヒドロキシメチル樹脂に付着される。Ｃ末端アミノ酸は、そのセシウムテトラメチルアンモニウム塩形態において直接的に、またはトリエチルアミン（TEA）またはジイソプロピルエチルアミン（DIEA）の存在下で、クロロメチルまたはクロロトリチル樹脂にカップリングされ得る。アミド樹脂への第一のアミノ酸の付着は、カップリング反応の間のアミド結合形成と同様である。樹脂支持体へのカップリングに続いて、αアミノ保護基は、保護化学（例えば、tBoc、Fmoc）に依存する種々の試薬を用いて除去される。Fmoc除去の程度は、 300〜320nmで、または伝導率セルによってモニターされ得る。αアミノ保護基の除去の後、残りの保護アミノ酸は必要な順番で段階的にカップリングされ、所望の配列を生じる。以下を含む種々の活性化薬剤が結合反応のために使用され得る：DCC、DIPCDI 、2-クロロ-1,3-、ジメチルイミジウムヘキサフルオロホスフェート（CIP）、ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリス-(ジメチルアミノ)-ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（BOP）およびそのピロリジンアナログ（PyBOP）、ブロモ-トリス-ピロリジノ-ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（PyBroP）、N -[(1H-ベンゾトリアゾル-１-イル)-(ジメチルアミノ)メチレン]-N-メチルメタンアミニウムヘキサフルオロホスフェートN-オキシド（HBTU）およびそのテトラフルオロボレートアナログ（TBTU）またはピロリジンアナログ（HBPyU）。カップリング反応に使用される最も一般的な触媒性添加物は、4-ジメチルアミノピリジン（DMAP）、3-ヒドロキシ-3,4-ジヒドロ-4-オキソ-1,2,3-ベンゾトリアジン（H ODhbt）、N-ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）、および1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール（HOAt）を含む。アミノ酸フッ化物または塩化物は、困難なカップリングのために使用され得る。各保護アミノ酸は過剰（＞2.0当量）で使用され、そしてカップリングは通常、N-メチルピロリドン（NMP）中で、またはDMF、CH₂Cl₂、もしくはそれらの混合物中で行われる。カップリング反応の完了の程度は、各段階でモニターされ得る（例えば、Kaiserら，Anal.Biochem．34 :595（1970）によって記載されたニンヒドリン反応による）。不完全なカップリングが見出された場合、カップリング反応は延長および反復され、カオトロピック塩が添加され得る。カップリング反応は、市販の装置（例えば、ABIモデル430 A、431A、および433Aペプチド合成機）を用いて自動的に実施され得る。所望のペプチドの全てのアセンブリの後、ペプチド-樹脂は適切な捕捉剤を含む試薬で切断される。Fmocペプチドは、通常、捕捉剤（例えば、H₂O、エタンジチオール、フェノール、およびチオアニソール）を含むTFAによって切断および脱保護される。tBocペプチドは、通常、樹脂からポリペプチドを切断してほとんどの側鎖保護基を除去する液体HFによって、-５〜０℃にて１〜２時間、切断および脱保護される。捕捉剤（例えば、アニソール、ジメチルスルフィド、および p-チオクレゾール）は、通常液体HFと共に使用され、ポリペプチド中に存在するアミノ酸残基の、切断の間に形成されたカチオンによるアルキル化およびアシル化を阻害する。Trpのホルミル基およびHisのジニトロフェニル基は、HF切断の前に、それぞれDMF中のピペリジンおよびチオフェノールによって除去される必要がある。Cysのアセトアミドメチル基は、酢酸水銀(II)によって、あるいは、同時にシステインをシスチンに酸化するヨウ素、トリフルオロ酢酸タリウム(III) 、またはテトラフルオロホウ酸銀によって除去され得る。tBocペプチド切断および脱保護のために使用される他の強酸は、トリフルオロメタンスルホン酸（TFMS A）およびトリメチルシリルトリフルオロ酢酸（TMSOTf）を含む。詳細には、本発明のポリペプチドを、Merrifield，J.Am.Chem.Soc．85:2149(1 963)に最初に記載された固相ペプチド合成法（但し、Fmoc化学を用いた）により、ABIモデル433A合成機（Applied Biosystems，Foster City，CA）上で、Fmoc-A mide樹脂またはFmoc-L-Lys-(tBoc)-Wang樹脂からアセンブリした。三官能アミノ酸の側鎖を、Glu、AspおよびSerについてはtert.-ブチルによって、Cysについてはトリチルによって、Lysについてはtert.-ブチルオキシカルボニル（tBoc ）によって、Argについては2,2,5,7,8-ペンタメチルクロマン-6-スルホニル（Pm c）または2,2,4,6,7-ペンタメチルジヒドロベンゾフラン-5-スルホニル（Pbf）によって保護した。N-a-Fmoc保護アミノ酸を、樹脂へのカップリングの前にHATU および1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール（HOAt）によって予め活性化した。ジメチルスルホキシド（20％）を条件付きの伸長カップリング（conditiona l extended coupling）およびFmoc脱保護反応の間に添加した。インヒビター配列番号１、２、５、７、および９〜15の合成を、適切なD-およびL-アミノ酸およびアキラルアミノ酸（GlyおよびAhx）の連続的かつ直線的なアセンブリによって達成した。インヒビター配列番号３、４、６、および８の合成は、側鎖アミノ基を1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘックス-1-イリデン)-エチル（Dde）によって保護したLys残基において固着された(anchored)、直交性の鎖アセンブリを必要とした。例えば、インヒビター配列番号３の調製のために、Ac-Glu-Asp-V al-Val-Cys-Cys-Acp-Lys-(アミド樹脂)（配列番号29）を最初にアセンブリした。次いで、Lys残基上のDde脱保護基をジメチルホルムアミド中の２％ヒドラジンによって除去した（Bycroft，B.W.ら、J.Chem.Soc.Chem.commun．1993，778）。最終的に、第２のアームCys-Val-Val-Ile-Val-Gly-Arg-Ile-Val-Leu-Ser-Gly-Ly s（配列番号30）を側鎖アミノ基から連続的にアセンブリした。アセンブリしたペプチドを、適切な捕捉剤（80％TFA:４％フェノール：４％H₂O、４％チオアニソール：４％エタンジチオール：４％トリイソプロピルシラン）を含むトリフルオロ酢酸（TFA）による３時間の側鎖保護基の同時の脱保護によって樹脂から切断した。切断したペプチドを、濾過により樹脂から分離し、そして沈殿させ、そして無水エチルエーテル中で繰り返し洗浄した。沈殿したペプチドを、H₂O中で一晩凍結乾燥した。凍結乾燥した粗ペプチドを、逆相HPLCによって精製した。精製したペプチドを、HPLC、質量分析およびアミノ酸分析によってさらに分析した。 NS3プロテアーゼ、NS4コファクター、およびペプチド基質（4B/5Aまたは5A/5B のいずれか）を利用する高処理能力アッセイを用いることによって、潜在的な化合物がHCV NS3プロテアーゼのインヒビターとして効果的であるかを確認し得る。これらは、プロテアーゼのタンパク質分解活性を阻害する化合物をスクリーニングするために使用され得る。これは、化合物がNS3プロテアーゼのウイルス基質の切断を阻害するか否かを決定するための技術を開発することによって行われる。基質が切断されない場合、ウイルスは複製し得ない。このような高処理能力アッセイの一例は、シンチレーション近傍アッセイ(Scintillation proximity ass ay)（SPA）である。SPA技術は、シンチラント(scintillant)で被覆したビーズの使用を含む。ビーズに結合するのは、可逆的な様式でリガンドまたは酵素と相互作用するアクセプター分子（例えば、抗体、レセプター、または酵素基質）である。代表的なSPAベースのプロテアーゼアッセイについては、基質ペプチドは、一方の末端でビオチン化され、そして他方の末端は、¹²⁵Iまたは³Hのような低エネルギーエミッタで放射標識される。次いで、標識された基質は、酵素とともにインキュベートされる。次いで、ビオチンに結合するアビジン被覆SPAビーズが添加される。基質ペプチドがプロテアーゼによって切断される場合、放射活性エミッタは、シンチラントビーズの近傍にはもはや存在せず、そして発光は起こらない。プロテアーゼのインヒビターは、基質をインタクトなままに残し、そしてそれらが存在するところで生じる発光によって同定され得る。適切なアッセイ技術の別の例はHPLCアッセイである。ここで、NS3プロテアーゼ、基質産物、および潜在的なインヒビターを含有する得られた反応混合物は、 HPLCカラム上で分離されて、基質の切断の程度が決定される。基質が切断されていないか、または切断が阻害された場合には、インタクトな基質のみが存在するか、または減少した量の切断された産物が存在することが示される。この場合、化合物は、NS3プロテアーゼの効果的なインヒビターである。薬学的組成物 HCV NS3プロテアーゼを阻害するための効果的治療のために必要なインヒビターの用量レベルは、多数の異なる因子（投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、および他の投与される薬剤を含む）に依存する。従って、処置用量は、安全性および効力を最適化するように滴定されるべきである。代表的には、インビトロで使用される用量は、これらの試薬のインサイチュ投与のために有用な量の有用な指導を提供し得る。特定疾患の処置のために有効な用量の動物試験は、ヒト用量のさらなる予測的指標を提供する。種々の考察が、例えば、Gilmanら（編） (1990)GoodmanおよびGilman: The Pharmacological Bases of Therapeutics,第８版、Pergamon Press；およびRemington's Pharmaceutical Scienses，第17版( 1990)，Mack Publishing Co.，Easton，Pennに記載されている。例えば、経口、静脈内、腹腔内、または筋肉内投与、経皮性拡散などについての投与方法は、これらおよび以下に議論されている。Langer（1990）Science 249:1527-1533もまた参照のこと。薬学的に受容可能なキャリアは、水、生理的食塩水、緩衝液、および他の化合物（例えば、Merck Index，Merck & Co.，Rahway，New Jerseyに記載される）を含む。適切なキャリアを伴う、１μg／患者のキログラム重〜500mg ／患者のキログラム重が、選択され得る用量の範囲である。徐放処方物、または徐放装置が、連続投与のためにしばしば利用される。本発明のHCV NS3プロテアーゼのインヒビターは、処置されるべき宿主に直接投与され得るか、または化合物のサイズに依存して、それらの投与の前にオボアルブミンまたは血清アルブミンのようなキャリアタンパク質と結合させることが所望され得る。治療的処方物は、従来の任意の用量処方において投与され得る。活性成分は単独で投与され得るが、薬学的処方物として存在することが好ましい。処方物は、代表的には、１つ以上のそれらの受容可能なキャリアと共に、上記で定義した少なくとも１つの活性成分を含む。各々のキャリアは、他の成分に適合性でありかつ患者に害を与えないという意味において、薬学的および生理学的の両方に受容可能であるべきである。処方物は、経口、直腸、経鼻、または非経口（皮下、筋肉内、静脈内、および経皮を含む）投与のために適切な処方物を含む。処方物は、単位用量形態において好都合に提供され得、そして薬学分野において周知の任意の方法によって調製され得る。例えば、Gilmanら（編）（1990） GoodmanおよびGilman: The Pharmacological Bases of Therapeutics,第８版、P ergamon Press，Parrytown，NY；およびRemington's Pharmaceutical Sciences ，第17版(1990)，Mack Publishing Co.，Easton，Penn.；Avisら（編）（1993） Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications、第２版、Dekker，NY ；およびLiebermanら（編）（1990）Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets、第２版、Dekker，NY；およびLiebermanら（編）（1990）Pharmaceutical Dosage Forms : Disperse Systems Dekker，NYを参照のこと。本発明の治療は、他の化学治療剤または化学予防剤と組み合わされ得るか、あるいは共に使用され得る。以下の実施例は、本発明を制限するためではなく、例示するために含まれる。実施例１ HCV NS3プロテアーゼの二価インヒビター配列番号１〜10によって定義される二価インヒビターを、上記のように合成的に産生し、そしてHCV NS3プロテアーゼを阻害するそれらの能力について以下のように試験した。 25mM TRIS、50mM NaCl、５mM EDTA、10％グリセロール、および0.1％NP40を含む水溶液中に、潜在的インヒビターのHCV NS3プロテアーゼを0.05μM〜0.1mMの濃度で、HCV NS4Aコファクターを0.05μM〜0.1μMの濃度で、そして5A/5B基質を 50μMの濃度で添加した。次いで、この溶液を、30℃にて約２時間インキュベートし、その後溶液をHPLCに付して、5A/5Bがインタクトなままであるかどうかを決定し、従ってこの化合物をインヒビターであるとして決定した。しかし、HPLC が、5A/5Bが存在せずに5Aおよび5Bが存在することを示した場合、この化合物はインヒビターではない。潜在的インヒビターを、いくつかの異なる濃度でアッセイし、HCV NS3プロテアーゼの50％阻害を産生する濃度を決定した。結果を以下に示す。インヒビター IC₅₀(μM) 配列番号１ 0.6 50571-120 配列番号２ 3.0 50962-13 配列番号３ 3.0 50828-001 配列番号４ 3〜30 50962-22 配列番号５ 0.2 50571-144 配列番号６ 2.0 50571-150 配列番号７ 0.2 50828-131 配列番号８ 0.2 50962-24 実施例２ HCV NS3 プロテアーゼの一価インヒビター HCV NS3プロテアーゼの一価インヒビターの例は、以下の通りである。インヒビター IC₅₀(μM) 配列番号９ 0.2 50828-129 配列番号10 ５ 50962-004 配列番号11 0.2 50828-70 配列番号12 0.6 50828-116 配列番号13 2.0 50571-147 配列番号14 0.4 50962-047 配列番号15 0.4 50962-050 実施例３ HCV NS3 プロテアーゼの産生Ａ．プラスミド構築物 E.coliにおいてHCVプロテアーゼを発現するための標準的な組換えDNAを技術（ Sambrook、Fritsch、およびManiatis）を使用して、いくつかのプラスミドを設計および構築した（図２〜７）。全てのHCV特異的配列は、親のプラスミドpBRTM /HCV 1-3011（Grakouiら、1993）からもたらされた。プロテアーゼのＮ末端183 アミノ酸バージョンを発現するために、合成オリゴヌクレオチドを使用して、終止コドンをHCVゲノムに挿入した（図３）。Ｎ末端246アミノ酸残基を発現するように設計されたプラスミドを、Ｃ末端の天然のNco1制限部位によって生成した。（ｉ）プラスミドpBJ1015の構築（図２）完全なHCVゲノムを含むプラスミドpBRTM/HCV 1-3011（Grakoui Aら、J.Virol ．67:1385-1395）を、制限酵素ScaIおよびHpaIで消化し、そして7138bp（塩基対）DNAフラグメントを単離し、そしてpSP72（Promega）のSmaI部位にクローン化し、プラスミドpRJ201を生成した。プラスミドpRJ201をMscIで消化し、そして21 06bp MscIフラグメントを単離し、そしてプラスミドpBD7のSmaI部位にクローン化した。得られたプラスミドをKasIおよびNcoIで消化し、そして734bpのDNAフラグメントをクレノーポリメラーゼで平滑末端化した後に単離し、そしてNcoI消化しクレノーポリメラーゼ処理したpTrc HIS B seq発現プラスミド（Invitrogen）中にクローン化した。連結によって、HCV配列の5'末端にNcoI部位が、そして3' 末端にNsiI部位が再び生じた。次いで、プラスミドpTHB HCV NS3をNcoIおよびNs iIで消化し、そしてクレノーポリメラーゼおよびT4 DNAポリメラーゼで処理して平滑末端化738bp DNAフラグメントを生成した。これを単離し、そしてAspI切断しクレノーポリメラーゼ処理した発現プラスミドpQE30（HIV）中にクローン化した。得られたプラスミドpBJ1015は、HCV NS3（246アミノ酸）プロテアーゼを発現する。（ii）アミノ酸183の後ろに終止コドンを有するプラスミドpTS56-9の構築（図３）プラスミドpTHB HCV NS3を、NcoIで消化し、クレノーポリメラーゼで処理し、次いでBstYIで処理した；そしてHCV配列を含むDNAフラグメントを単離し、そしてSmaIおよびBglIIで消化したpSP72中にクローン化した。次いで、得られたプラスミドpTS49-27をBglIIおよびHpaIで消化し、そして以下の二本鎖オリゴヌクレオチドと連結し、pTS56-9を生成した： GA TCA CCG GTC TAG ATCT T GGC CAG ATC TAGA（配列番号18）従って、終止コドンを、NS3タンパク質のプロテアーゼ触媒ドメインをコードするDNAの末端に直接配置した。これによって、NS3タンパク質のヘリカーゼドメインから独立してHCVプロテアーゼを発現することが可能になった。（iii）プラスミドpJB1006の構築。NS3 183のカルボキシ末端における陽性に荷電したアミノ酸のペプチドとの融合（図４）。プラスミドpTS56-9をSphIおよびBglIIで消化し、そしてHCV配列を含むDNAフラグメントを単離し、そしてSphI、BglII切断pSP72中にクローン化した。得られたプラスミドpJB1002を、AgeIおよびHpaIで消化し、そして以下の二本鎖オリゴヌクレオチドに連結し、pJB 1006を構築した： CCG GTC CGG AAG AAA AAG AGA CGC TAG C AG GCC TTC TTT TTC TCT GCG ATC C（配列番号19）これにより、親水性の可溶化モチーフがNS3プロテアーゼ上に融合した。（iv）E.coliにおいてHis-NS3(183)-HTを発現するプラスミドpBJ1022の構築（図５）プラスミドpJB1006をNgoMIおよびNheIで消化し、そして216bp DNAフラグメントを単離し、そしてNgoMI、NheI切断pBJ1015中にクローン化してプラスミドpBJ1 019を構築した。プラスミドpBJ1019をNarIおよびPvuIIで消化し、そしてクレノーポリメラーゼで処理してNarIフラグメントの5'末端をフィルイン(fiII in)した。発現プラスミドpQE31（Invitrogen）をBamHIで消化し、クレノーポリメラーゼで平滑末端化した。717bp NarI-PvuII DNAフラグメントを単離し、そして発現プラスミドpQE31（Invitrogen）の2787bp BamHI/クレノー処理MscI（BalI）フラグメントに連結した。E.coliへの形質転換後に得た組換えプラスミドpBJ1022、は、HIVプロテアーゼ切断部位配列を含まないHis NS3(2-183)-HTを発現する。プラスミドはまた、CAT（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子中に大きな欠失を含む。（ｖ）プラスミドpNB(-V)182-Δ4A HTの構築（図６）プラスミドpMBM48をEagIおよびXhoIで消化し、クレノーポリメラーゼで処理し、そして320bp DNAフラグメントを単離し、そしてBamHI切断、平滑末端化pSP72 中にクローン化してプラスミドpJB1004を構築した。320bpフラグメントは、NS3( 631)のカルボキシ末端からの７アミノ酸、NS4Aの全て、およびNS4Bのアミノ末端の46アミノ酸をコードする。組換えプラスミドpJB1004を、EagIおよびCel2で消化し、クレノーポリメラーゼで平滑末端化した。220bp DNAフラグメントを単離し、そして発現プラスミドpQE30（連結前にBamHIで消化し、そしてクレノーポリメラーゼで平滑末端化した）中にクローン化した。得られたプラスミドpJB1011 を、NgoMIおよびHindIIIで消化し、そして以下の二本鎖オリゴヌクレオチドに連結し、プラスミドpNB 4A HTを構築した： CCG GCA ATT ATA CCT GAC AGG GAG GTT CTC TAC CAG GAA TTC GT TAA TAT GGA CTG TCC CTC CAA GAG ATG GTC CTT AAG GAT GAG ATG GAA GAG TGC CGG AAG AAA AAG AGA CGC A CTA CTC TAC CTT CTC ACG GCC TTC TTT TTC TCT GCG TTC GA（配列番号20）プラスミドpNB 4AHTをMslIおよびXbaIで消化した。1218bp DNAフラグメントを単離し、そしてAgeI切断、クレノーポリメラーゼ処理、XbaI切断したpBJ1019のベクターDNA中にクローン化した。連結によって、NS3における183番目のアミノ酸残基バリンのグリシン残基による置換、および連結部でのNS4Aのアミノ末端の３アミノ酸残基の欠失が生じる。NS3(182aa)-G-NS4A（4-54アミノ酸）を含む組換えプラスミドpNB182Δ4A HTは、連結部にNS3/NS4A切断部位配列を含まず、そしてNS3の自己触媒活性によって切断されない。最後に、プラスミドpNB182Δ4A HT （配列番号８）をStuIおよびNheIで消化し、803bp DNAフラグメントを単離し、そしてStuIおよびNheI切断プラスミドpBJ1022中にクローン化した。得られたプラスミドpNB(-V)182-Δ4A HTは、NS3配列のアミノ末端からのHIV配列の欠失、およびCAT遺伝子におけるHIV配列の欠失を含む（配列番号23）。（vi）プラスミドpT5 His HIV-NS3（図７）の構築プラスミドpTS56-9をBglIIで消化し、そしてクレノーポリメラーゼで処理して 5'末端をフィルインした。次いで、プラスミドをMgoMIで処理し、そしてNS3配列を含む平滑末端化BglII/NgoMIフラグメントを単離し、そしてSglI、クレノー処理、NgmMI切断、およびSalIクレノー処理したpBJ1015に連結した。得られたプラスミドをpT5His HIV 183と命名した。実施例４可溶化モチーフを有するHCV NS3プロテアーゼの精製 His182HT （配列番号４）およびHis(-V)182Δ4AHT（配列番号８）の精製組換えプラスミドpBJ1022およびpNB(-V)182Δ4Aを用いて、E.coli株M15[pREP4 ］(Qiagen)（この株は、lacリプレッサーを過剰発現する）の別々の培養物を、製造者により推奨される方法に従って形質転換した。組換えプラスミドを有する M15[pREP4]細菌を、20g/Lバクトトリプトン、10g/Lバクトイーストエキストラクト、５g/L NaCl（20-10-5ブロス）を含有し、そして100μg/mlアンピシリンおよび25μg/mlカナマイシンを補充したブロス中で一晩増殖させた。培養物を、0.1 のO.D.600まで希釈し、次いで30℃にて0.6〜0.8のO.D.600まで増殖させ、その後 IPTGを１mMの最終濃度まで添加した。誘導の２〜３時間後に、細胞を、ペレット化により収集し、そして細胞ペレットを、100mM Tris、pH7.5を用いて洗浄した。細胞溶解産物を、以下の様に調製した：ペレット化した発酵ブロスの１ml当量に、１mg/mlリゾチームを有する50μl超音波処理緩衝液（50mMリン酸ナトリウム、pH7.8、0.3M NaCl）を添加した；細胞懸濁液を、氷上に30分間置いた。次いで、懸濁液を、0.2％ Tween-20、10mMジチオスレイトール（DTT）の最終濃度にし、そして細胞破損が完了するまで超音波処理した。不溶性物質を、微量遠心機中で12,000×ｇで15分間ペレット化し、可溶性部分を別のチューブに取り出し、次いで可溶性溶解産物を10％グリセロールの最終濃度にした。プラスミドを発現する細胞からの可溶性溶解産物は、予想された分子量の強力に免疫反応性のバンドを生じる。Ni²⁺カラム精製のために調製された可溶性溶解産物は、DTTの代わりに10mM β-メルカプトエタノール（BME）を用いて調製された。溶解産物を−8 0℃にて保存した。Ni²⁺- ニトロシル酢酸（NTA）アガロース（QIAGEN）を用いる精製次いで、タンパク質を、抽出した溶解産物をNTAアガロースカラム上に置くことにより精製した。NTAアガロースカラムクロマトグラフィーを用いた。なぜなら、プロテアーゼのＮ末端に融合されたヒスチジンタグは、ニッケルカラムに容易に結合するからである。これは、可溶性プロテアーゼを迅速に精製するための強力なアフィニティークロマトグラフィー技術を生じる。カラムクロマトグラフィーを、バッチ様式で行なった。Ni²⁺ NTA樹脂（３ml）を、50mlの緩衝液Ａ（10 ％グリセロール、0.2％ Tween-20、10mM BMEを含有する50mM リン酸ナトリウム pH7.8）で２回洗浄した。250mlの発酵液から得られた溶解産物（12.5ml）を、４℃にて１時間、この樹脂とともにインキュベートした。フロースルーを、遠心分離により収集した。樹脂を、1.0×４cmカラムに充填し、そしてベースラインが達成されるまで緩衝液Ａを用いて洗浄した。次いで、結合したタンパク質を、緩衝液Ａ中のイミダゾールの勾配（０〜0.5Ｍ）の20mlで溶出した。溶出した画分を、SDS-PAGE、およびHis-HIV 183に対するウサギポリクローナル抗体を用いるウエスタンブロット分析により評価した。POROS 金属キレートアフィニティーカラムを用いる精製タンパク質を精製するための代替方法では、タンパク質を含有する溶解産物を、 POROS金属キレートアフィニティーカラムにアプライした。灌流クロマトグラフィーを、Ni²⁺で予め荷電したPOROS MC金属キレートカラム（4.6×50mm、1.7ml）上で行なった。サンプルを、10ml/分でアプライし、そしてカラムを緩衝液Ａで洗浄した。カラムを、25mMイミダゾールを含有する緩衝液Ａの10カラム容量を用いて段階的に溶出した。カラムを、緩衝液Ａ中の25〜250mMイミダゾールの勾配の25カラム容量を用いてさらに溶出した。全ての溶出した画分を、SDS-PAGE、およびウサギポリクローナル抗体を用いるウエスタンブロット分析により評価した。実施例５ 5A/5B 基質および4B/5A基質のペプチド合成ペプチド5A/5B基質および4B/5A基質（配列番号16、18、19、20、および21）を、Fmoc化学を用いてABIモデル431Aペプチド合成機で合成した。製造者に推奨されるFastMoc^TM活性化ストラテジー（HBTU/HOBt）を、4Aアクチベーターペプチドの合成に用いた。より強力なアクチベーターであるHATU（付加的なHOAtを有するかまたは有しない）を用いて、予めロードしたWang樹脂に5A/5B基質ペプチドをアセンブリした。ペプチドを樹脂から切り離し、そして標準的なTFA切断プロトコールにより脱保護した。ペプチドを逆相HPLCで精製し、そして質量分析により確認した。実施例６合成5A/5Bペプチド基質を用いるHPLCアッセイ HCV NS3プロテアーゼのタンパク質分解活性を試験するために、DTEDVVCC SMSY TWTGK（配列番号16）および可溶性HCV NS3（配列番号27）を、アッセイ緩衝液中に共に添加した。アッセイ緩衝液は、15％グリセロール、10mM DTT、0.2％ Twee n20および200mM NaClを含有する50mMリン酸ナトリウム（pH7.8）であった。配列番号27のプロテアーゼ活性は、基質を２つの副産物ペプチド（すなわち、5Aおよび5B）に切断した。基質および２つの副産物ペプチドを、300Åの孔径および５ μmの粒径を有する逆相HPLCカラム（Dynamax、4.6×250mm）上で分離した。カラムを、0.1％ TFA（溶媒Ａ）を１分あたり１mlの流速で用いて平衡化した。基質および産物ペプチドの標準物質を、Ａ中で平衡化したカラムにアプライした。溶出を、アセトニトリル勾配（溶媒Ｂ＝Ａ中の100％アセトニトリル）を用いて行なった。２つの勾配を、溶出のために用いた（50分間の５％〜70％Ｂ、それに続く10分間の70％〜100％Ｂ）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ０７Ｋ 14/81 Ｃ１２Ｎ 9/99 19/00 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｎ 9/99 37/64 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者ウェバー，パトリシアシー. アメリカ合衆国ペンシルバニア 19067, ヤードレイ，ティンバーレイクスドライブ 1970

Claims

【特許請求の範囲】１．Ｃ型肝炎NS3プロテアーゼの二価インヒビターであって、第２のペプチドに連結された第１のペプチドからなり、該第１のペプチドがＣ型肝炎NS3プロテアーゼの基質のサブ配列、変異したサブ配列、または変異した完全長配列であり、そして該第２のペプチドがＣ型肝炎NS4Aポリペプチドのサブ配列である、インヒビター。２．配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８からなる群から選択される、請求項１に記載の二価インヒビター。３．ペプチドからなるHCVプロテアーゼのインヒビターであって、該ペプチドがH CV NS3プロテアーゼの基質のサブ配列、変異したサブ配列、または変異した完全長配列である、インヒビター。４．配列番号９、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号 14、および配列番号15からなる群から選択される、請求項３に記載のインヒビター。５．ペプチドからなるHCV NS3プロテアーゼのインヒビターであって、該ペプチドがHCV NS4Aポリペプチドのサブ配列、変異したサブ配列、または変異した完全長配列である、インヒビター。６．Ｃ型肝炎を処置するための医薬の製造のためのHCV NS3プロテアーゼのインヒビターの使用であって、該インヒビターが第２のペプチドに連結された第１のペプチドからなり、該第１のペプチドがＣ型肝炎NS3プロテアーゼの基質のサブ配列、変異したサブ配列、または変異した完全長配列であり、そして該第２のペプチドがＣ型肝炎NS4Aポリペプチドのサブ配列、変異したサブ配列、または変異した完全長配列である、使用。７．前記インヒビターが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８からなる群から選択される、請求項６に記載の使用。８．Ｃ型肝炎を処置するための医薬の製造のためのHCV NS3プロテアーゼのインヒビターの使用であって、該インヒビターがペプチドからなり、該ペプチドがHC V NS3プロテアーゼの基質のサブ配列、変異したサブ配列、または変異した完全長配列である、使用。９．前記インヒビターが、配列番号９、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、および配列番号15からなる群から選択される、請求項８に記載の使用。１０．Ｃ型肝炎を処置するための医薬の製造のためのHCV NS3プロテアーゼのインヒビターの使用であって、該インヒビターがペプチドからなり、該ペプチドが HCV NS4Aポリペプチドのサブ配列、変異したサブ配列、または変異した完全長配列である、使用。１１．Ｃ型肝炎ウイルスに感染した個体を処置するための薬学的組成物であって、HCV NS3プロテアーゼのインヒビターおよび薬学的キャリアからなり、該インヒビターが第２のペプチドに連結された第１のペプチドからなり、該第１のペプチドがＣ型肝炎NS3プロテアーゼの基質のサブ配列、変異したサブ配列、または変異した完全長配列であり、そして該第２のペプチドがＣ型肝炎NS4Aポリペプチドのサブ配列、変異したサブ配列、または変異した完全長配列である、薬学的組成物。１２．前記インヒビターが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８からなる群から選択される、請求項１１に記載の薬学的組成物。１３．Ｃ型肝炎ウイルスに感染した個体を処置するための薬学的組成物であって、HCV NS3プロテアーゼのインヒビターおよび薬学的キャリアからなり、該インヒビターがHCV NS3プロテアーゼの基質のサブ配列、変異したサブ配列、または変異した完全長配列である、薬学的組成物。１４．前記インヒビターが、配列番号９、配列番号10、配列番号11、配列番号12 、配列番号13、配列番号14、および配列番号15からなる群から選択される、請求項１３に記載の薬学的組成物。１５．Ｃ型肝炎ウイルスに感染した個体を処置するための薬学的組成物であって、HCV NS3プロテアーゼのインヒビターおよび薬学的キャリアからなり、該インヒビターがHCV NS4Aポリペプチドのサブ配列、変異したサブ配列、または変異した完全長配列である、薬学的組成物。