ES2350201T3

ES2350201T3 - Sulfamidas heterocíclicas como inhibidores del virus de la hepatitis c.

Info

Publication number: ES2350201T3
Application number: ES03755389T
Authority: ES
Inventors: Jeffrey Allen Campbell; Andrew Charles Good
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 2002-05-20
Filing date: 2003-05-20
Publication date: 2011-01-20
Anticipated expiration: 2023-05-20
Also published as: NO20044808L; EP1506000B1; PL373398A1; JP4312711B2; US20040072761A1; ES2350201T9; WO2003099316A1; EP1506000B9; US6869964B2; EP1506000A4; PL211889B1; DE60334205D1; JP2005526144A; IS7532A; ATE481106T1; AU2003248535A1; EP1506000A1

Abstract

Un compuesto que tiene la fórmula **Fórmula** en la que: (a) R1 es Het no sustituido o sustituido, en la que el término "Het" representa un radical monovalente obtenido mediante la retirada de un hidrógeno de un heterociclo aromático o no aromático, saturado o insaturado, de cinco, seis o siete miembros que contiene de uno a cuatro heteroátomos seleccionados entre nitrógeno, oxígeno y azufre incluyendo heterociclos que están condensados a una o más estructuras de anillo distintas, heterociclos que contienen nitrógeno, en los que el nitrógeno puede estar sustituido con alquilo C1-6, y heterociclos que contienen azufre, en los que el azufre está oxidado a SO o SO2 y dichos sustituyentes Het son iguales o diferentes y se seleccionan de uno a tres entre halo, ciano, trifluorometilo, nitro, alquilo C1-6, alcoxi C1-6, amido, alcanoil C1-6 amino, amino, fenilo o feniltio, estando dicho fenilo o porción fenilo de feniltio no sustituido o sustituido con uno a tres sustituyentes, iguales o diferentes, seleccionados entre halo, ciano, nitro, alquilo C1-6, alcoxi C1-6, amido, fenilo o un heterociclo monocíclico de 5-7 miembros; (b) m es 1 ó 2; (c) n es 1 ó 2; (d) R2 es alquilo C1-6, alquenilo C2-6 o cicloalquilo C3-7, cada uno opcionalmente sustituido de una a tres veces con halógeno; o R2 es H; o R2 junto con el carbono al que está unido forma un anillo de 3, 4 ó 5 miembros; (e) R3 es alquilo C1-8 opcionalmente sustituido con halo, ciano, amino, dialquil C1-6 amino, arilo C6-10, alquil C7-14 arilo, alcoxi C1-6, carboxi, hidroxi, ariloxi, alquil C7-14 ariloxi, alquil C2-6 éster, alquil C8-15 aril éster; alquenilo C3-12, cicloalquilo C3-7, o alquil C4-10 cicloalquilo, en los que el cicloalquilo o alquilcicloalquilo están opcionalmente sustituidos con hidroxi, alquilo C1-6, alquenilo C2-6 o alcoxi C1-6; o R3 junto con el átomo de carbono al que está unido forma un grupo cicloalquilo C3-7 opcionalmente sustituido con alquenilo C2-6; (f) Y es H, fenilo sustituido con nitro, piridilo sustituido con nitro, o alquilo C1-6 opcionalmente sustituido con ciano, OH o cicloalquilo C3-7; con la condición de que si R4 o R5 es H entonces Y es H; (g) B es H, alquilo C1-6, R4-(C=O)-, R4O(C=O)-, R4-N(R5)-C(=O)-, R4-N(R5)-C(=S)-, R4SO2-, o R4-N(R5)-SO2-; (h) R4 es (i) alquilo C1-10 opcionalmente sustituido con fenilo, carboxilo, alcanoílo C1-6, 1-3 halógenos, hidroxi, -OC(O)alquilo C1-6, alcoxi C1-6, amino opcionalmente sustituido con alquilo C1-6, amido, o (alquilo inferior) amido; (ii) cicloalquilo C3-7, cicloalcoxi C3-7, o alquil C4-10 cicloalquilo, cada uno opcionalmente sustituido con hidroxi, carboxilo, (alcoxi C1-6)carbonilo, amino opcionalmente sustituido con alquilo C1-6, amido, o (alquilo inferior) amido; (iii) arilo C6-10 o aril C7-16 alquilo, cada uno opcionalmente sustituido con alquilo C1-6, halógeno, nitro, hidroxi, amido, (alquilo inferior) amido, o amino opcionalmente sustituido con alquilo C1-6; (iv) Het; (v) biciclo(1.1.1)pentano; o (vi) -C(O)Oalquilo C1-6, alquenilo C2-6 o alquinilo C2-6; y (i) R5 es H; alquilo C1-6 opcionalmente sustituido con 1-3 halógenos; o alcoxi C1-6 con la condición de que R4 sea alquilo C1-10; o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo.

Description

La presente invención se refiere, en general, a compuestos antivirales y, más específicamente, se refiere a compuestos que inhiben el funcionamiento de la proteasa NS3 codificada por el virus de la Hepatitis C (VHC), a composiciones que comprenden dichos compuestos y a procedimientos para inhibir el funcionamiento de la proteasa NS3.

El VHC es un patógeno humano fundamental, que se estima que infecta a 170 millones de personas en todo el mundo -aproximadamente cinco veces el número de infectados por el virus de inmunodeficiencia humana tipo 1. Una fracción sustancial de estos individuos infectados por VHC desarrolla una enfermedad hepática progresiva grave, incluyendo cirrosis y carcinoma hepatocelular. (Lauer, G. M.; Walquer, B. D. N. Engl. J. Med (2001), 345, 41-52).

Actualmente, la terapia para VHC más eficaz emplea una combinación de interferón alfa y ribavirina, conduciendo a una eficacia sostenida en un 40% de los pacientes. (Poynard,

T. et al. Lancet (1998), 352, 1426-1432). Recientes resultados clínicos demuestran que el interferón alfa pegilado es superior al interferón alfa sin modificar como monoterapia (Zeuzem,

S. et al. N. Engl. J. Med (2000), 343,1666-1672). Sin embargo, incluso con regímenes terapéuticos experimentales que implican combinaciones de interferón alfa pegilado y ribavirina, una fracción sustancial de pacientes no tienen una reducción sostenida en la carga viral. De esta manera, hay una necesidad clara y conocida desde hace mucho de desarrollar compuestos terapéuticos eficaces para el tratamiento de la infección por VHC.

El VHC es un virus de ARN de cadena positiva. En base a una comparación de la secuencia aminoacídica deducida y la gran similitud en la región 5' no traducida, el VHC se ha clasificado como un género diferente en la familia de Flaviviridae. Todos los miembros de la familia de Flaviviridae tienen viriones envolventes que contienen un genoma de ARN de cadena positiva que codifica todas las proteínas específicas para virus conocidas mediante la traducción de un solo marco de lectura abierta, no interrumpida.

Se encuentra una heterogeneidad considerable dentro del nucleótido y la secuencia aminoacídica codificada por todo el genoma de VHC. Se han caracterizado al menos seis genotipos principales, y se han descrito más de 50 subtipos. Los genotipos de VHC principales se diferencian en su distribución en el mundo, y la importancia clínica de la heterogeneidad genética de VHC permanece esquiva, a pesar de los numerosos estudios del posible efecto de los genotipos sobre la patogénesis y la terapia.

El genoma del ARN de VHC monocatenario es de aproximadamente 9500 nucleótidos de longitud y tiene un solo marco de lectura abierta (FLA) que codifica una sola poliproteína grande, de aproximadamente 3000 aminoácidos. En las células infectadas, esta poliproteína se escinde en múltiples sitios mediante proteasas celulares y virales para producir las proteínas estructurales y no estructurales (NS). En el caso del VHC, la generación de proteínas no estructurales maduras (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, y NS5B) la efectúan dos proteasas virales. La primera, aún poco caracterizada, se escinde en la unión NS2-NS3; la segunda es una serina proteasa contenida dentro de la región N-terminal de NS3 (denominada, en lo sucesivo, proteasa NS3) y media en todas las escisiones posteriores cadena abajo de NS3, tanto en cis, en el sitio de escisión NS3-NS4A, como en trans, para los restantes sitios NS4ANS4B, NS4B-NS5A, NS5A-NS5B. La proteína NS4A parece servir para múltiples funciones, actuando como un cofactor para la proteasa NS3 y ayudando posiblemente en la localización de membrana de NS3 y otros componentes de replicasa viral. La compleja formación de la proteína NS3 con NS4A parece necesaria para los acontecimientos de procesado, potenciando la eficacia proteolítica en todos los sitios. La proteína NS3 presenta también actividades de nucleósido trifosfatasa y ARN helicasa. NS5B es una ARN polimerasa dependiente de ARN que está implicada en la replicación de VHC.

Entre los compuestos que han demostrado eficacia para inhibir la replicación de VHC, como inhibidores selectivos de serina proteasa de VHC, están los compuestos peptídicos desvelados en la Patente de Estados Unidos Nº 6.323.180.

La presente invención proporciona compuestos, incluyendo sales farmacéuticamente aceptables o solvatos de los mismos, que tienen la estructura de la Fórmula I

imagen1

en la que:

(a): R1 es Het no sustituido o sustituido, en la que el término "Het" representa un radical monovalente obtenido mediante la retirada de un hidrógeno de un heterociclo aromático o no aromático, saturado o insaturado, de cinco, seis o siete miembros que contiene de uno a

cuatro heteroátomos seleccionados entre nitrógeno, oxígeno y azufre, incluyendo heterociclos que están condensados a una o más estructuras de anillo distintas, heterociclos que contienen nitrógeno, en los que el nitrógeno puede estar sustituido con alquilo C1-6, y heterociclos que contienen azufre, en los que el azufre está oxidado a SO o SO2 y dichos sustituyentes Het son iguales o diferentes y se seleccionan de uno a tres entre halo, ciano, trifluorometilo, nitro, alquilo C1-6, alcoxi C1-6, amido, alcanoil C1-6 amino, amino, fenilo o feniltio, estando dicho fenilo o porción fenilo de feniltio no sustituido o sustituido con uno a tres sustituyentes, iguales o diferentes, seleccionados entre halo, ciano, nitro, alquilo C1-6, alcoxi C1-6, amido, fenilo o un heterociclo monocíclico de 5-7 miembros;

(b): mes1ó2;

(c): nes1ó2;

(d): R2 es alquilo C1-6, alquenilo C2-6 o cicloalquilo C3-7, cada uno opcionalmente sustituido de una a tres veces con halógeno; o R2 es H; o R2 junto con el carbono al que está unido forma un anillo de 3, 4 ó 5 miembros;

(e): R3 es alquilo C1-8 opcionalmente sustituido con halo, ciano, amino, dialquil C1-6 amino, arilo C6-10, alquil C7-14 arilo, alcoxi C1-6, carboxi, hidroxi, ariloxi, alquil C7-14 ariloxi, alquil C2-6 éster, alquil C8-15 aril éster; alquenilo C3-12, cicloalquilo C3-7, o alquil C4-10 cicloalquilo, en los que el cicloalquilo o alquilcicloalquilo están opcionalmente sustituidos con hidroxi, alquilo C1-6, alquenilo C2-6 o alcoxi C1-6; o R3 junto con el átomo de carbono al que está unido forma un grupo cicloalquilo C3-7 opcionalmente sustituido con alquenilo C2-6;

(f): Y es H, fenilo sustituido con nitro, piridilo sustituido con nitro, o alquilo C1-6 opcionalmente sustituido con ciano, OH o cicloalquilo C3-7; con la condición de que si R4 o R5 es H entonces Y es H;

(g): B es H, alquilo C1-6, R4-(C=O)-, R4O(C=O)-, R4-N(R5)-C(=O)-, R4-N(R5)-C(=S)-, R4SO2-,

o R4-N(R5)-SO2-;

(h) R4 es (i) alquilo C1-10 opcionalmente sustituido con fenilo, carboxilo, alcanoílo C1-6, 1-3 halógenos, hidroxi, -OC(O)alquilo C1-6, alcoxi C1-6, amino opcionalmente sustituido con alquilo C1-6, amido, o (alquilo inferior) amido; (ii) cicloalquilo C3-7, cicloalcoxi C3-7, o alquil C4-10 cicloalquilo, cada uno opcionalmente sustituido con hidroxi, carboxilo, (alcoxi C1-6)carbonilo, amino opcionalmente sustituido con alquilo C1-6, amido, o (alquilo inferior) amido; (iii) arilo C6-10

o aril C7-16 alquilo, cada uno opcionalmente sustituido con alquilo C1-6, halógeno, nitro, hidroxi, amido, (alquilo inferior) amido, o amino opcionalmente sustituido con alquilo C1-6; (iv) Het; (v) biciclo(1.1.1)pentano; o (vi) -C(O)Oalquilo C1-6, alquenilo C2-6 o alquinilo C2-6; y

(i) R5 es H; alquilo C1-6 opcionalmente sustituido con 1-3 halógenos; o alcoxi C1-6 con la condición de que R4 sea alquilo C1-10;

o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable de los mismos.

La presente invención también proporciona composiciones que comprenden los compuestos o sales o solvatos farmacéuticamente aceptables de los mismos y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En particular, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas útiles para inhibir NS3 de VHC, que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la presente invención, o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La presente invención proporciona adicionalmente el uso de los compuestos de la presente invención para la preparación de un medicamento para tratar pacientes infectados con VHC, que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la presente invención, o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo.

Gracias a la presente invención, ahora es posible proporcionar fármacos mejorados que comprenden los compuestos de la invención, que pueden ser eficaces en el tratamiento de pacientes infectados con VHC. En el presente documento se desvelan también compuestos peptídicos que pueden inhibir el funcionamiento de la proteasa NS3, por ejemplo, en combinación con la proteasa NS4A.

Las definiciones y convenciones estereoquímicas usadas en el presente documento generalmente siguen las siguientes referencias: McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms, S.

P. Parker, Ed., McGraw-Hill Book Company, Nueva York (1984) y Stereochemistry of Organic Compounds, Eliel, E. y Wilen, S., John Wiley & Sons, Inc., Nueva York (1994). Muchos compuestos orgánicos existen en formas ópticamente activas, es decir, tienen la capacidad de girar el plano de la luz polarizada. Para describir un compuesto ópticamente activo, se usan los prefijos D y L o R y S para denotar la configuración absoluta de la molécula acerca de su centro o centros quirales. Los prefijos d y I o (+) y (-) se emplean para designar el signo de rotación del plano de la luz polarizada por el compuesto, significando (-) o l que el compuesto es levo-rotatorio y significando (+) o d, que el compuesto es dextro-rotatorio. Para una estructura química dada, estos compuestos, denominados estereoisómeros, son idénticos, excepto que son imágenes especulares entre sí. Un estereoisómero específico de un par de imágenes especulares puede denominarse también enantiómero, y una mezcla de dichos isómeros a menudo se denomina mezcla enantiomérica.

La nomenclatura usada para describir los radicales orgánicos, por ejemplo, hidrocarburos e hidrocarburos sustituidos, generalmente sigue la nomenclatura convencional conocida en la técnica, a menos que se defina específicamente de otra manera. Las combinaciones de grupos, por ejemplo, alquilalcoxiamina, incluyen todas las configuraciones estables posibles, a menos que se indique específicamente otra cosa. Ciertos radicales y combinaciones se definen a continuación para fines de ilustración.

Las expresiones "mezcla racémica" y "racemato" se refieren a una mezcla equimolar de dos especies enantioméricas, carentes de actividad óptica.

El término "quiral" se refiere a moléculas que tienen la propiedad de no superposición sobre la otra imagen especular, mientras que el término "aquiral" se refiere a moléculas que son superponibles sobre la otra imagen especular.

El término "estereoisómeros" se refiere a compuestos que tienen una composición química idéntica, pero que difieren con respecto a la disposición de los átomos o grupos en el espacio.

El término "diastereómero" se refiere a un estereoisómero que no es un enantiómero, por ejemplo, un estereoisómero con dos o más centros de quiralidad y cuyas moléculas no son imágenes especulares entre sí. Los diastereómeros tienen diferentes propiedades físicas, por ejemplo puntos de fusión, puntos de ebullición, propiedades espectrales, y reactividades. Las mezclas de diastereómeros pueden separarse por procedimientos analíticos de alta resolución, tales como electroforesis y cromatografía.

El término "enantiómeros" se refiere a dos estereoisómeros de un compuesto que son imágenes especulares no superponibles entre sí.

La expresión "sal farmacéuticamente aceptable" pretende incluir sales no tóxicas sintetizadas a partir de un compuesto que contiene un resto ácido o básico, por procedimientos químicos convencionales. Generalmente, dichas sales pueden prepararse haciendo reaccionar las formas de ácido o base libre de estos compuestos con una cantidad estequiométrica de la base o ácido apropiado en agua o en un disolvente orgánico, o en una mezcla de los dos; generalmente, se prefiere un medio no acuoso tal como éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol, o acetonitrilo. Las listas de sales adecuadas se encuentran en Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18ª ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1990, pág. 1445. Los compuestos de la presente invención son útiles en forma de la base o ácido libre o en forma de una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos. Todas las formas están dentro del alcance de la invención.

La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" significa la cantidad total de cada componente activo que es suficiente para mostrar un beneficio significativo para el paciente, por ejemplo, una reducción sostenida en la carga viral. Cuando se aplica a un ingrediente activo individual, administrado en solitario, el término se refiere a ese ingrediente solo. Cuando se aplica a una combinación, el término se refiere a cantidades combinadas de los ingredientes activos que dan como resultado el efecto terapéutico, se administre en combinación, en serie o

simultáneamente.

La expresión "compuestos de la invención", y expresiones equivalentes, pretenden abarcar compuestos de Fórmula I, y sales, y solvatos, por ejemplo hidratos, farmacéuticamente aceptables. Análogamente, se entiende que la referencia a intermedios, abarca sus sales, y solvatos, cuando el contexto lo permite. Las referencias al compuesto de la invención también incluyen los compuestos preferidos, por ejemplo, los compuestos de Fórmulas ll-VI.

El término "derivado" significa un compuesto modificado químicamente, en el que la modificación se considera rutinaria por los químicos especialistas, tal como un éster o una amida de un ácido, grupos protectores, tales como el grupo bencilo para un alcohol o tiol, y el grupo terc-butoxicarbonilo para una amina.

El término "solvato" significa una asociación física de un compuesto de la presente invención con una o más moléculas de disolvente, orgánico o inorgánico. Esta asociación física incluye enlaces de hidrógeno. En ciertos casos, el solvato podrá aislarse, por ejemplo cuando una o más moléculas de disolvente se incorporan en la red cristalina del sólido cristalino. "Solvato" abarca solvatos tanto en fase solución como aislables. Los solvatos ejemplares incluyen hidratos, etanolatos, metanolatos, y similares.

El término "profármaco”, como se usa en el presente documento, significa derivados de los compuestos de la invención que tienen grupos química o metabólicamente escindibles y que se convierten, por solvólisis o en condiciones fisiológicas, en los compuestos de la invención, que son farmacéuticamente activos in vivo. Un profármaco de un compuesto puede formarse de manera convencional con un grupo funcional de los compuestos, tal como con un grupo amino, hidroxi o carboxi, cuando esté presente. La forma derivada de profármaco a menudo ofrece ventajas de solubilidad, compatibilidad con tejidos, o liberación retrasada en un organismo mamífero (véase, Bundgard, H., Design of Prodrugs, pág. 7-9, 21-24, Elsevier, Amsterdam 1985). Los profármacos incluyen derivados de ácido bien conocidos para los practicantes de la técnica, tales como, por ejemplo, ésteres preparados por reacción del compuesto ácido precursor con un alcohol adecuado, o amidas preparadas por reacción del compuesto ácido precursor con una amina adecuada.

El término "paciente" incluye tanto seres humanos como otros mamíferos.

La expresión "composición farmacéutica" significa una composición que comprende un compuesto de la invención, junto con al menos un vehículo farmacéutico adicional, es decir, adyuvante, excipiente o portador, tal como diluyentes, agentes conservantes, cargas, agentes de regulación del flujo, agentes disgregantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes, agentes de suspensión, agentes edulcorantes, agentes saborizantes, agentes perfumantes, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos, agentes lubricantes y agentes dispersantes, dependiendo de la naturaleza del modo de administración y formas farmacéuticas. Pueden usarse los ingredientes enumerados en Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18ª ed., Mack Publishing Company, Easton, PA (1999) por ejemplo.

La expresión "farmacéuticamente aceptable" se emplea en el presente documento para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones, y/o formas farmacéuticas que, dentro del alcance del juicio médico, son adecuadas para su uso en contacto con los tejidos de los pacientes sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica, u otro problema o complicación, que corresponde a una proporción riesgo/beneficio razonable.

El término "tratar" se refiere a: (i) prevenir que ocurra una enfermedad, trastorno o afección en un paciente, que puede estar predispuesto a la enfermedad, trastorno y/o afección, pero que aún no se le ha diagnosticado que la tiene; (ii) inhibir la enfermedad, trastorno o afección, es decir, detener su desarrollo; y (iii) aliviar la enfermedad, trastorno o afección, es decir, provocando la regresión de la enfermedad, trastorno y/o afección.

El término "sustituido”, como se usa en el presente documento, incluye sustitución en de uno al número máximo de sitios de unión posibles en el núcleo, por ejemplo, un radical orgánico, al que se une el sustituyente, por ejemplo, mono-, di-, tri-o tetra-sustituido, a menos que específicamente se indique otra cosa.

El término "halo”, como se usa en el presente documento, significa un sustituyente halógeno seleccionado entre bromo, cloro, fluoro o yodo. El término "haloalquilo" significa un grupo alquilo que está sustituido con uno o más sustituyentes halo.

El término "alquilo”, como se usa en el presente documento, significa sustituyentes alquilo de cadena cíclica, lineal o ramificada e incluye, por ejemplo, metilo, etilo, propilo, butilo, terc-butilo, hexilo, 1-metiletilo, 1-metilpropilo, 2-metilpropilo, 1,1-dimetiletilo. De esta manera, alquilo C1-6 se refiere a un grupo alquilo que tiene de uno a seis átomos de carbono. El término "alquilo inferior" significa un grupo alquilo que tiene de uno a seis, preferiblemente de uno a cuatro átomos de carbono. El término "alquil éster" significa un grupo alquilo que adicionalmente contiene un grupo éster. Generalmente, un intervalo del número de carbonos indicado, por ejemplo, alquil C2-6 éster, incluye todos los átomos de carbono en el radical.

El término "alquenilo”, como se usa en el presente documento, significa un radical alquilo que contiene al menos un doble enlace, por ejemplo, etenilo (vinilo) y alquilo.

El término "alcoxi”, como se usa en el presente documento, significa un grupo alquilo con el número indicado de átomos de carbono unidos a un átomo de oxígeno. Alcoxi incluye, por ejemplo, metoxi, etoxi, propoxi, 1-metiletoxi, butoxi y 1,1-dimetil-etoxi. Este último radical se denomina en la técnica terc-butoxi. El término "alcoxicarbonilo" significa un grupo alcoxi que adicionalmente contiene un grupo carbonilo.

El término "haloalcoxi”, como se usa en el presente documento, significa el radical O(haloalquilo), en el que haloalquilo es como se ha definido anteriormente.

El término "alcanoílo”, como se usa en el presente documento, significa radicales ioxoalquilo, lineales o ramificados, que contienen el número indicado de átomos de carbono e incluye, por ejemplo, formilo, acetilo, 1-oxopropilo (propionilo), 2-metil-1-oxopropilo, 1-oxohexilo y similares.

El término "cicloalquilo”, como se usa en el presente documento, significa un sustituyente cicloalquilo que contiene el número indicado de átomos de carbono e incluye, por ejemplo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo y grupos espiro cíclicos tales como espirociclopropilo, espirociclobutilo. El término "cicloalcoxi”, como se usa en el presente documento, significa un grupo cicloalquilo unido a un átomo de oxígeno, tal como, por ejemplo, ciclobutiloxi o ciclopropiloxi. El término "alquilcicloalquilo" significa un grupo cicloalquilo unido a un grupo alquilo. El intervalo de número de carbonos indicado incluye el número total de carbonos en el radical, a menos que se indique específicamente otra cosa. Por lo tanto, un alquil C4-10 cicloalquilo puede contener 1-7 átomos de carbono en el grupo alquilo y 3-9 átomos de carbono en el anillo, por ejemplo, ciclopropilmetilo o ciclohexiletilo.

El término "arilo”, como se usa en el presente documento, significa un resto aromático que contiene el número indicado de átomos de carbono, tal como, aunque sin limitación, fenilo, indanilo o naftilo. Por ejemplo, arilo C6-10 se refiere a un resto aromático que tiene de seis a diez átomos de carbono, que puede estar en forma de una estructura monocíclica o bicíclica. El término "haloarilo”, como se usa en el presente documento, se refiere a un arilo mono-, di-o tri-sustituido con uno o más átomos de halógeno. Las expresiones "alquilarilo", "arilalquilo" y "aralalquilo" significan un grupo arilo sustituido con uno o más grupos alquilo. De esta manera, un grupo alquil C7-14 arilo puede tener 1-8 átomos de carbono en el grupo alquilo para un aromático monocíclico y 1-4 átomos de carbono en el grupo alquilo para un aromático condensado. Los radicales arilo incluyen aquellos sustituidos con sustituyentes típicos conocidos por los especialistas en la técnica, por ejemplo, halo, hidroxi, carboxi, carbonilo, nitro, sulfo, amino, ciano, dialquilamino haloalquilo, CF3, haloalcoxi, tioalquilo, alcanoílo, SH, alquilamino, alquilamida, dialquilamida, carboxiéster, alquilsulfona, alquilsulfonamida y alquil(alcoxi)amina. Los ejemplos de grupos alquilarilo incluyen bencilo, butilfenilo y 1naftilmetilo. Las expresiones "alquilariloxi" y "alquilariléster" significan grupos alquilarilo que contienen un átomo de oxígeno y un éster grupo, respectivamente.

El término "carboxialquilo”, como se usa en el presente documento, significa un grupo carboxilo (COOH) unido a través de un grupo alquilo como se ha definido anteriormente e incluye, por ejemplo, ácido butírico.

El término "amino aralquilo”, como se usa en el presente documento, significa un grupo amino sustituido con un grupo aralquilo, tal como el siguiente amino aralquilo

imagen1

El término "alquilamida”, como se usa en el presente documento, significa una amida mono-sustituida con alquilo, tal como

imagen1

El término "carboxialquilo”, como se usa en el presente documento, significa un grupo carboxilo (COOH) unido a través de un grupo alquilo, como se ha definido anteriormente, e incluye, por ejemplo, ácido butírico.

El término "heterociclo", al que también se hace referencia en el presente documento o "Het", como se usa en el presente documento, significa un radical monovalente obtenido mediante la retirada de un hidrógeno de un heterociclo saturado o insaturado (incluyendo aromático) de cinco, seis o siete miembros, que contiene de uno a cuatro heteroátomos seleccionados entre nitrógeno, oxígeno y azufre. Además, el término heterociclo incluye heterociclos como se ha definido anteriormente, que están condensados a una o más estructuras de anillo distintas. Para heterociclos que contienen nitrógeno, el nitrógeno puede estar sustituido con alquilo C1-6, particularmente metilo. Para heterociclos que contienen azufre, se pretende incluir los heterociclos de azufre oxidado que contienen SO o SO2. Los heterociclos de la presente invención incluyen aquellos sustituidos con sustituyentes típicos, conocidos por los especialistas en la técnica, sobre cualquiera de los átomos de carbono del anillo, por ejemplo, de uno a tres sustituyentes. Los ejemplos de dichos sustituyentes incluyen alquilo C1-6, cicloalquilo C3-7, alcoxi C1-6, cicloalcoxi C3-7, halo-alquilo C1-6, CF3, mono-o dihalo-alcoxi C1-6, ciano, halo, tioalquilo, hidroxi, alcanoílo, NO2, SH, amino, alquil C1-6 amino, di alquil (C1-6) amino, di alquil (C1-6) amida, carboxilo, carboxiéster (C1-6), alquil C1-6 sulfona, alquil C1-6 sulfonamida, alquil C1-6 sulfóxido, di alquil (C1-6) (alcoxi)amina, arilo C6-10, alquil C7-14 arilo, y un heterociclo monocíclico de 5-7 miembros. Los ejemplos de heterociclos adecuados incluyen:

imagen1

tiofeno

imagen1

furano

tiazol

benzotiazol

pirrol

imidazol

pirazol

piridina

pirazina

pirimidina

piridazina

imagen1

indolizina

isoindol

3H-indol

indol

quinolina

isoquinolina

tetrahidrotiofeno

tiadiazol

isoxazol

benzotiofeno

imagen1

piperidina

piperazina

morfolina o

tetrazol.

El término "alquil-heterociclo”, como se usa en el presente documento, significa un radical heterocíclico como se ha definido anteriormente, unido a través de una cadena o grupo alquilo ramificado, en el que el alquilo es como se ha definido anteriormente, que contiene el número indicado átomos de carbono. Los ejemplos de alquil C1-6-Het incluyen:

imagen2

Cuando se usan para nombrar compuestos de la presente invención, las

denominaciones "P1’, P1, P2, P3 y P4", como se usa en este documento, representan las

posiciones relativas de los restos aminoacídicos de un inhibidor de proteasa que se une,

15 respecto a la unión del sustrato de escisión del péptido natural. La escisión ocurre en el sustrato natural entre P1 y P1’, donde las posiciones sin prima designan aminoácidos empezando por el extremo C-terminal del sitio de escisión del péptido natural, que se extiende hacia el extremo N-terminal; mientras que las posiciones con prima empiezan en el extremo N-terminal de la denominación del sitio de escisión y se extienden hacia el extremo C-terminal. Por ejemplo, P1' se refiere a la primera posición desde el extremo a mano derecha del C-terminal del sitio de escisión (es decir, la primera posición N-terminal); mientras que P1 empieza la numeración desde el lado a mano izquierda del sitio de escisión C-terminal, P2: segunda posición desde el C-terminal, etc.) (véase Berger A. & Schechter I., Transactions of the Royal Society London series (1970), B257, 249-264].

De esta manera, en los compuestos de fórmula I, las porciones "P1' a P4" de la molécula se indican a continuación:

imagen1

Como se usa en este documento, el término "ácido 1-aminociclopropil-carboxílico" (Acca) se refiere a un compuesto de fórmula:

imagen1

Como se usa en este documento el término "terc-butilglicina" se refiere a un compuesto de la fórmula:

imagen1

El término "resto", con referencia a un aminoácido o derivado de aminoácido, significa un radical derivado del aminoácido α correspondiente, por eliminación del hidroxilo del grupo carboxi y un hidrógeno del grupo aminoácido α. Por ejemplo, los términos Gln, Ala, Gly, Ile, Arg, Asp, Phe, Ser, Leu, Cys, Asn, Sar y Tyr representan los "restos" L-glutamina, L-alanina, glicina, L-isoleucina, L-arginina, L-ácido aspártico, L-fenilalanina, L-serina, L-leucina, L-cisteína, L-asparagina, sarcosina y L-tirosina, respectivamente.

El término "cadena lateral", con referencia a un aminoácido o resto aminoacídico, significa un grupo unido al átomo de carbono α del aminoácido α. Por ejemplo, la cadena lateral grupo-R para glicina es hidrógeno, para alanina es metilo, para valina es isopropilo. Para los grupos-R específicos o cadenas laterales de los aminoácidos α, se hace referencia al texto de A. L. Lehninger sobre Bioquímica (véase el capítulo 4).

Para los compuestos de la presente invención, se prefiere que m sea 2. Se prefiere también que n sea 1. Adicionalmente se prefiere que R2 sea etilo o etenilo.

De acuerdo con la presente invención, R1 puede ser Het no sustituido o sustituido, dichos sustituyentes Het son iguales o diferentes y se seleccionan de uno a tres entre halo, ciano, trifluorometilo, nitro, alquilo C1-6, alcoxi C1-6, amido, alcanoil C1-6 amino, amino, fenilo o feniltio, estando dicho fenilo o porción fenilo de feniltio no sustituido o sustituido con uno a tres sustituyentes, iguales o diferentes, seleccionados entre halo, ciano, nitro, alquilo C1-6, alcoxi C1-6, amido o fenilo. Preferiblemente, R1 es

imagen1

De acuerdo con la presente invención, R2 puede ser alquilo C1-6, alquenilo C2-6 o cicloalquilo C3-7, cada uno opcionalmente sustituido de una a tres veces con halógeno; o R2 es H; o R2 junto con el carbono al que está unido forma un anillo de 3, 4 ó 5 miembros. Preferiblemente, R2 es alquilo C1-6, alquenilo C2-6 o cicloalquilo C3-7. Más preferiblemente, R2

es etilo o vinilo.

De acuerdo con la presente invención, R3 puede ser alquilo C1-8 opcionalmente sustituido con halo, ciano, amino, dialquil C1-6 amino, arilo C6-10, alquil C7-14 arilo, alcoxi C1-6, carboxi, hidroxi, ariloxi, alquil C7-14 ariloxi, alquil C2-6 éster, alquil C8-15 aril éster, alquenilo C3-12, cicloalquilo C3-7, o alquil C4-10 cicloalquilo, en los que el cicloalquilo o alquilcicloalquilo están opcionalmente sustituidos con hidroxi, alquilo C1-6, alquenilo C2-6 o alcoxi C1-6; o R3 junto con el átomo de carbono al que está unido forma un grupo cicloalquilo C3-7 opcionalmente sustituido con alquenilo C2-6. Preferiblemente, R3 es alquilo C1-8 opcionalmente sustituido con arilo C6, alcoxi C1-6, carboxi, hidroxi, ariloxi, alquil C7-14 ariloxi, alquil C2-6 éster, alquil C8-15 aril éster; alquenilo C3-12, cicloalquilo C3-7, o alquil C4-10 cicloalquilo. Más preferiblemente, R3 es alquilo C1-8 opcionalmente sustituido con alcoxi C1-6; o cicloalquilo C3-7, por ejemplo, alquilo C1-6. Más preferiblemente, R3 es t-butilo.

De acuerdo con la presente invención, Y puede ser H, fenilo sustituido con nitro, piridilo sustituido con nitro, o alquilo C1-6 opcionalmente sustituido con ciano, OH o cicloalquilo C3-7; con la condición de que si R4 o R5 es H entonces Y es H;

De acuerdo con la presente invención, B puede ser H, alquilo C1-6, R4-(C=O)-, R4O(C=O)-, R4-N(R5)-C(=O)-, R4-N(R5)-C(-S)-, R4SO2-, o R4-N(R5)-SO2-. Preferiblemente, B es R4-(C=O)-, R4O(C=O)-, o R4-N(R5)-C(=O)-.

De acuerdo con la presente invención, R4 puede ser (i) alquilo C1-10 opcionalmente sustituido con fenilo, carboxilo, alcanoílo C1-6, 1-3 halógenos, hidroxi, -OC(O)alquilo C1-6, alcoxi C1-6, amino opcionalmente sustituido con alquilo C1-6, amido, o (alquilo inferior) amido; (ii) cicloalquilo C3-7, cicloalcoxi C3-7, o alquil C4-10 cicloalquilo, cada uno opcionalmente sustituido con hidroxi, carboxilo, (alcoxi C1-6)carbonilo, amino opcionalmente sustituido con alquilo C1-6, amido, o (alquilo inferior) amido; (iii) arilo C6-10 o aril C7-16 alquilo, cada uno opcionalmente sustituido con alquilo C1-6, halógeno, nitro, hidroxi, amido, (alquilo inferior) amido, o amino opcionalmente sustituido con alquilo C1-6; (iv) Het; (v) biciclo(1.1.1)pentano; o (vi) C(O)Oalquilo C1-6, alquenilo C2-6 o alquinilo C2-6. Preferiblemente, R4 es (i) alquilo C1-10 opcionalmente sustituido con fenilo, carboxilo, alcanoílo C1-6, 1-3 halógenos, hidroxi, alcoxi C16; (ii) cicloalquilo C3-7, cicloalcoxi C3-7, o alquil C4-10 cicloalquilo; o (iii) arilo C6-10 o aril C7-16 alquilo, cada uno opcionalmente sustituido con alquilo C1-6 o halógeno. Más preferiblemente, R4 es (i) alquilo C1-10 opcionalmente sustituido con 1-3 halógenos o alcoxi C1-6; o (ii) cicloalquilo C3-7 o alquil C4-10 cicloalquilo. Más preferiblemente, R4 es t-butilo.

De acuerdo con la presente invención, R5 puede ser H; alquilo C1-6 opcionalmente sustituido con 1-3 halógenos; o alcoxi C1-6 con la condición de que R4 sea alquilo C1-10. Preferiblemente, R5 es H o alquilo C1-6 opcionalmente sustituido con 1-3 halógenos. Más preferiblemente, R5 es H.

Los sustituyentes de cada agrupación pueden seleccionarse individualmente y combinarse en cualquier combinación que proporcione un compuesto estable, de acuerdo con la presente invención. También, más de un sustituyente de cada grupo puede estar sustituido en el grupo principal, con la condición de que haya suficientes sitios de unión disponibles.

En una realización preferida, los compuestos de la presente invención tienen la

imagen3

en la que R3, R1, B e Y son como se han definido en la Fórmula I, mientras que R12 es alquilo C1-6, alquenilo C2-6 o H. La presente invención comprende adicionalmente sales y solvatos de compuestos de Fórmula

25 II, así como composiciones farmacéuticas que comprenden compuestos de Fórmula II, o sales

o solvatos de los mismos.

En otra realización preferida, los compuestos de la presente invención tienen la estructura de Fórmula III

30

imagen1

en la que R3, R1, B e Y son como se han definido en la Fórmula I. La presente invención comprende adicionalmente sales o solvatos de los compuestos de Fórmula III, así como composiciones farmacéuticas que comprenden compuestos de Fórmula III, o sales o solvatos de los mismos.

En otra realización preferida, los compuestos de la presente invención tienen la estructura de Fórmula IV

imagen1

en la que R3, R1, B e Y son como se han definido en la Fórmula I. La presente invención comprende adicionalmente sales o solvatos de los compuestos de Fórmula IV, así como composiciones farmacéuticas que comprenden compuestos de Fórmula IV, o sales o solvatos de los mismos.

Otra realización preferida son los compuestos de Fórmula V

10

15

20

imagen1

en la que R3, R1, n, B e Y son como se han definido en la Fórmula I, y p es 1-5.

Los compuestos de la presente invención incluyen diastereómeros de la funcionalidad

espiral de los compuestos de Fórmula V, en la que los diastereómeros están en una mezcla o

son un único diastereómero que se ha preparado individualmente o que se ha aislado de una

25 mezcla diastereomérica. La presente invención comprende, adicionalmente, sales y solvatos de compuestos de Fórmula V, así como composiciones farmacéuticas que comprenden compuestos de Fórmula V, o sales o solvatos de los mismos. En otra realización preferida alternativa más, los compuestos de la presente invención

30 tienen la siguiente fórmula estructural en la que:

imagen1

(a): R1 es Het no sustituido o sustituido, dichos sustituyentes Het son iguales o diferentes y se seleccionan entre uno a tres de halo, ciano, trifluorometilo, nitro, alquilo C1-6, alcoxi C1-6, amido, alcanoil C1-6 amino, amino, fenilo o feniltio, estando dicho fenilo o porción fenilo de feniltio no sustituido o sustituido con uno a tres sustituyentes, iguales o diferentes, seleccionados entre halo, ciano, nitro, alquilo C1-6, alcoxi C1-6, amido o fenilo;

(b): nes1ó2;

(c): R32 es H, alquilo C1-6, alcoxi C1-3, cicloalquilo C3-7, alquenilo C2-6, o alquinilo C2-6, todos opcionalmente sustituidos con halógeno;

(d): R33 es alquilo C1-8, alquenilo C3-12, cicloalquilo C3-C7, cicloalquenilo C4-13, o (alquilcicloalquilo) C4-C10, todos opcionalmente sustituidos con hidroxi, alcoxi C1-C6, tioalquilo C1-C6, amino, amido, (alquilo inferior) amido, arilo C6 o C10, o aralquilo C7-C16;

(e): Y2 es H o alquilo C1-C6;

(f): B2 es H, R14-(C=O)-; R14O(C=O)-, R14-N(R15)-C(=O)-; R14-N(R15)-C(=S)-; R14SO2-, o R14 N(R15)-SO2-;

(g): R14 es (i) alquilo C1-10 opcionalmente sustituido con carboxilo, alcanoílo C1-6, hidroxi, alcoxi C1-6, amino opcionalmente mono-o di-sustituido con alquilo C1-6, amido, o (alquilo inferior) amido; (ii) cicloalquilo C3-7, cicloalcoxi C3-7, o alquil C4-10 cicloalquilo, todos opcionalmente sustituidos con hidroxi, carboxilo, (alcoxi C1-6)carbonilo, amino opcionalmente monosustituido o disustituido con alquilo C1-6, amido, o (alquilo inferior) amido; (iii) amino opcionalmente monosustituido o disustituido con alquilo C1-6; amido; o (alquilo inferior)amido;

(iv): arilo C6 o C10 o aralquilo C7-16, todos opcionalmente sustituidos con alquilo C1-6, hidroxi,

amido, (alquilo inferior) amido, o amino opcionalmente monosustituido o disustituido con alquilo C1-6; o (v) Het o (alquilo inferior)-Het, ambos opcionalmente sustituidos con alquilo C1-6, hidroxi, amido, (alquilo inferior) amido, o amino opcionalmente monosustituido o disustituido con alquilo C1-6; y

5 (h) R15 es H o alquilo C1-6. Un grupo más preferido de compuestos de la presente invención son aquellos que tienen la fórmula

10

15

imagen1

20 en la que R1' es

25

30

imagen1

La presente invención comprende adicionalmente sales y solvatos de compuestos de Fórmula VI, así como composiciones farmacéuticas que comprenden compuestos de Fórmula VI, o sales o solvatos de los mismos.

Los compuestos de la presente invención, cuando están en forma básica, pueden formar sales mediante la adición de un ácido farmacéuticamente aceptable. Las sales de adición de ácidos se forman a partir de un compuesto de Fórmula I y un ácido inorgánico farmacéuticamente aceptable incluyendo, aunque sin limitación, ácido clorhídrico, bromhídrico, yodhídrico, sulfúrico, fosfórico, o un ácido orgánico tal como ácido p-toluenosulfónico, metanosulfónico, acético, benzoico, cítrico, malónico, fumárico, maleico, oxálico, succínico, sulfámico o tartárico. De esta manera, los ejemplos de dichas sales farmacéuticamente aceptables incluyen cloruro, bromuro, yoduro, sulfato, fosfato, metanosulfonato, citrato, acetato, malonato, fumarato, sulfamato, y tartrato.

Las sales de un grupo amina pueden comprender también sales de amonio cuaternario en las que el nitrógeno del amino porta un grupo orgánico adecuado tal como un resto alquilo, alquenilo, alquinilo o aralquilo.

Los compuestos de la presente invención, que están sustituido con un grupo ácido, pueden existir en forma de sales, formadas por adición de bases. Dichas sales de adición de bases incluyen aquellas derivadas de bases inorgánicas que incluyen, por ejemplo, sales de metales alcalinos (por ejemplo, sodio y potasio), sales de metales alcalinotérreos (por ejemplo, calcio y magnesio), sales de aluminio y sales de amonio. Además, las sales de adición de bases adecuadas incluyen sales de bases orgánicas fisiológicamente aceptables tales como trimetilamina, trietilamina, morfolina, piridina, piperidina, picolina, diciclohexilamina, N,N’dibenciletilenediamina, 2-hidroxietilamina, bis-(2-hidroxietil)amina, tri-(2-hidroxietil)amina, procaína, dibencilpiperidina, N-bencil-β-fenetilamina, dehidroabietilamina, N,N’bishidroabietilamina, glucamina, N-metilglucamina, colidina, quinina, quinolina, etilendiamina, ornitina, colina, N,N’-bencilfenetilamina, cloroprocaína, dietanolamina, dietilamina, piperazina, tris(hidroximetil)aminometano e hidróxido de tetrametilamonio y aminoácidos básicos tales como lisina, arginina y N-metilglutamina. Estas sales pueden prepararse por procedimientos conocidos por los especialistas en la técnica.

Ciertos compuestos de la presente invención, y sus sales, pueden existir también en forma de solvatos con agua, por ejemplo hidratos, o con disolventes orgánicos tales como metanol, etanol o acetonitrilo para formar, respectivamente, un metanolato, etanolato o acetonitrilato. La presente invención incluye cada uno de estos solvatos y mezclas de los mismos.

Además, los compuestos de la presente invención, o una sal o solvato de los mismos, puede presentar polimorfismo. La presente invención abarca también cualquiera de dichas formas polimórficas.

Los compuestos de la presente invención contienen también dos o más centros quirales. Por ejemplo, los compuestos pueden incluir el elemento P1 de ciclopropilo de fórmula

imagen1

n la que cada uno de C1 y C2 representa un átomo de carbono asimétrico en las posiciones 1 y 2 del anillo de ciclopropilo. Sin obviar otros posibles centros asimétricos en otros segmentos de los compuestos, la presencia de estos dos centros asimétricos significa que los compuestos pueden existir como mezclas racémicas de diastereómeros, tales como los diastereómeros en los que R2 está configurado en posición syn respecto a la amida o en posición syn respecto al carbonilo, como se muestra a continuación.

imagen1

(1R, 2S) (1S, 2R) R2 es syn respecto a carbonilo R2 es syn respecto a carbonilo

imagen1

(1R, 2R) (1S, 2S) R2 es syn respecto a amida R2 es syn respecto a amida

La presente invención incluye tanto enantiómeros como mezclas de enantiómeros, tales como mezclas racémicas.

5 Los enantiómeros pueden resolverse por procedimientos conocidos por los especialistas en la técnica, por ejemplo, por formación de sales diaestereoisoméricas, que pueden separarse por cristalización, cromatografía gas-líquido o de líquidos, reacción selectiva de un enantiómero con un reactivo específico para el enantiómero. Se apreciará que cuando el enantiómero deseado se convierte en otra entidad química por una técnica de separación,

10 entonces se requiere una etapa adicional para formar la forma enantiomérica deseada. Como alternativa, pueden sintetizarse enantiómeros específicos por síntesis asimétrica usando reactivos ópticamente activos, sustratos, catalizadores o disolventes, o convirtiendo un enantiómero en el otro por transformación asimétrica. Los compuestos de la presente invención pueden estar en forma de un profármaco. Los

15 ésteres alifáticos o aromáticos derivados, cuando están presentes, de grupos ácidos colgantes sobre los compuestos de la presente invención son profármacos preferidos. En algunos casos, es deseable preparar profármacos de tipo doble éster tales como (aciloxi) alquil ésteres o (alcoxicarbonil)oxi)alquil ésteres. Ciertos compuestos de la presente invención pueden existir también en diferentes

20 formas conformacionales estables, que pueden ser separables. La simetría torsional debida a una rotación restringida alrededor de un enlace sencillo asimétrico, por ejemplo debida a impedimentos estéricos o a la tensión del anillo, puede permitir la separación de diferentes confórmeros. La presente invención incluye cada isómero conformacional de estos compuestos y mezclas de los mismos.

25 Ciertos compuestos de la presente invención pueden existir en forma zwitteriónica y la presente invención incluye cada forma zwitteriónica de estos compuestos y mezclas de los mismos.

Los materiales de partida útiles para sintetizar los compuestos de la presente invención

los conocen los especialistas en la técnica y pueden fabricarse fácilmente o están disponibles en el mercado.

Los compuestos de la presente invención pueden fabricarse por procedimientos conocidos por los especialistas en la técnica, véanse por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 6.323.180 y la Solicitud de Patente de Estados Unidos 20020111313 A1. Los siguientes procedimientos expuestos a continuación se proporcionan para fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la invención reivindicada. Se reconocerá que puede ser preferido o necesario preparar dicho compuesto en el que un grupo funcional se protege usando después un grupo protector convencional para retirar el grupo protector, proporcionando un compuesto de la presente invención. Los detalles relacionados con el uso de grupos protectores de acuerdo con la presente invención los conocen los especialistas en la técnica.

Los compuestos de la presente invención, por ejemplo, pueden sintetizarse de acuerdo con un procedimiento general como se ilustra en el Esquema I (en el que GPC es un grupo protector de carboxilo y GPA es un grupo protector de amino):

Esquema I

imagen1

Brevemente, los grupos P1, P2, y P3 pueden unirse por técnicas de acoplamiento de péptido bien conocidas. Los grupos P1, P2, y P3 pueden unirse juntos en cualquier orden, siempre y cuando el compuesto final corresponda a los péptidos de la invención. Por ejemplo, P3 puede unirse a P2-P1; o P1 unirse a P3-P2.

Generalmente, los péptidos se alargan desprotegiendo el grupo amino α del resto N

terminal y acoplando el grupo carboxilo desprotegido del siguiente aminoácido adecuadamente N-protegido a través de una unión peptídica usando los procedimientos descritos. Este procedimiento de desprotección y acoplamiento se repite hasta que se obtiene la secuencia deseada. Este acoplamiento puede realizarse con los aminoácidos constituyentes de una manera por etapas, como se representa en el Esquema I.

El acoplamiento entre dos aminoácidos, un aminoácido y un péptido, o dos fragmentos peptídicos, puede realizarse usando procedimientos de acoplamiento convencionales, tales como el procedimiento con azida, el procedimiento con anhídrido del ácido carbónicocarboxílico mixto (cloroformiato de isobutilo), el procedimiento con carbodiimida (diciclohexilcarbodiimida, diisopropilcarbodiimida o carbodiimida soluble en agua), el procedimiento de éster activo (p-nitrofenil éster, éster N-hidroxisuccínico imido), el procedimiento K con reactivo de Woodward, el procedimiento con carbonildiimidazol, procedimientos con reactivos de fósforo o de oxidación-reducción. Algunos de estos procedimientos (especialmente el procedimiento con carbodiimida) pueden potenciarse añadiendo 1-hidroxibenzotriazol o 4-DMAP. Estas reacciones de acoplamiento pueden realizarse en fase solución (fase líquida) o en fase sólida.

Más explícitamente, la etapa de acoplamiento implica el acoplamiento de deshidratación de un carboxilo libre de un reactante con el grupo amino libre del otro reactante en presencia de un agente de acoplamiento para formar un enlace de unión de amida. Las descripciones de dichos agentes de acoplamiento se encuentran en los libros de texto generales sobre la química de los péptidos, por ejemplo, M. Bodanszky, "Peptide Chemistry", 2ª ed. rev., Springer-Verlag, Berlín, Alemania, (1993). Los ejemplos de agentes de acoplamiento adecuados son N,N’-diciclohexilcarbodiimida, 1-hidroxibenzotriazol en presencia de N,N’diciclohexilcarbodiimida o N-etil-N’-[(3-dimetilamino)propil]carbodiimida. Un agente de acoplamiento práctico y útil es el hexafluorofosfato de (benzotriazol-1-iloxi)tris(dimetilamino)fosfonio disponible en el mercado, por sí mismo o en presencia de 1hidroxibenzotriazol o 4-DMAP. Otro agente de acoplamiento práctico y útil es el tetrafluoroborato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-N,N,N’,N’-tetrametiluronio disponible en el mercado. Otro agente de acoplamiento más práctico y útil es el hexafluorofosfato de O-(7azabenzotriazol-1-il)-N,N,N’,N’-tetrametiluronio disponible en el mercado. La reacción de acoplamiento se realiza en un disolvente inerte, por ejemplo diclorometano, acetonitrilo o dimetilformamida. Se añade un exceso de una amina terciaria, por ejemplo diisopropiletilamina, N-metilmorfolina, N-metilpirrolidina o 4-DMAP para mantener la mezcla de reacción a un pH de aproximadamente 8. La temperatura de reacción normalmente varía entre 0ºC y 50ºC y el tiempo de reacción normalmente varía entre 15 min y 24 h.

Los grupos funcionales de los aminoácidos constituyentes generalmente deben protegerse durante las reacciones de acoplamiento para evitar la formación de enlaces indeseados. Los grupos protectores que pueden usarse se enumeran, por ejemplo, en Greene, "Protective Groups in Organic Chemistry", John Wiley & Sons, Nueva York (1981) y "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology", Vol. 3, Academic Press, Nueva York (1981), cuyas divulgaciones se incorporan en el presente documento por referencia.

El grupo amino α de cada aminoácido a acoplar a la cadena peptídica en desarrollo debe estar protegido (GPA). Puede usarse cualquier grupo protector conocido en la técnica. Los ejemplos de dichos grupos incluyen: 1) grupos acilo tales como formilo, trifluoroacetilo, ftalilo, y p-toluenosulfonilo; 2) grupos carbamato aromáticos tales como benciloxicarbonilo (Cbz

o Z) y bensiloxicarbonilos sustituidos, y 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc); 3) grupos carbamato alifático tales como terc-butiloxicarbonilo (Boc), etoxicarbonilo, diisopropilmetoxicarbonilo, y aliloxicarbonilo; 4) grupos alquil carbamato cíclicos tales como ciclopentiloxicarbonilo y adamantiloxicarbonilo; 5) grupos alquilo tales como trifenilmetilo y bencilo; 6) grupos trialquilsililo tales como trimetilsililo; y 7) grupos que contienen tiol tales como feniltiocarbonilo y ditiasuccinoílo. El grupo protector de amino α preferido es Boc o Fmoc. Muchos derivados de aminoácido adecuadamente protegidos para la síntesis de péptidos están disponibles en el mercado. El grupo protector de amino α del resto aminoacídico recién añadido se escinde antes del acoplamiento del siguiente aminoácido. Cuando se usa el grupo Boc, los procedimientos de elección son el uso de ácido trifluoroacético, puro o en diclorometano, o HCl en dioxano o en acetato de etilo. La sal de amonio resultante se neutraliza después, antes del acoplamiento, o in situ con soluciones básicas, tales como tampones acuosos, o aminas terciarias en diclorometano o acetonitrilo o dimetilformamida. Cuando se usa el grupo Fmoc , los reactivos de elección son piperidina o piperidina sustituida en dimetilformamida, aunque puede usarse cualquier amina secundaria. La desprotección se realiza a una temperatura entre 0ºC y temperatura ambiente (ta o TA) normalmente 20-22ºC.

Cualquiera de los aminoácidos que tenga funcionalidades de cadena lateral debe protegerse durante la preparación del péptido, usando cualquiera de los grupos descritos anteriormente. Los especialistas en la técnica apreciarán que la selección y uso de grupos protectores apropiados para estas funcionalidades de cadena lateral dependen del aminoácido y de la presencia de otros grupos protectores en el péptido. La selección de dichos grupos protectores es importante en tanto que el grupo no se retire durante la desprotección y acoplamiento del grupo amino α.

Por ejemplo, cuando se usa Boc como el grupo protector de amino α, los siguientes grupos protectores de cadena lateral son adecuados: pueden usarse restos p-toluenosulfonilo (tosilo) para proteger la cadena lateral amino de aminoácidos tales como Lys y Arg; pueden usarse restos acetamidometilo, bencilo (Bn), o terc-butilsulfonilo para proteger una cadena lateral de cisteína que contiene sulfuro; pueden usarse éteres de bencilo (Bn) para proteger cadenas laterales de serina, treonina o hidroxiprolina que contienen hidroxi; y pueden usarse ésteres de bencilo para proteger cadenas laterales de ácido aspártico y ácido glutámico que contienen carboxi.

Cuando se elige Fmoc para la protección de la amina α, normalmente son aceptables grupos protectores basados en terc-butilo. Por ejemplo, puede usarse Boc para lisina y arginina, terc-butil éter para serina, treonina e hidroxiprolina, y terc-butil éster para ácido aspártico y ácido glutámico. El resto trifenilmetilo (tritilo) puede usarse para proteger la cadena lateral de cisteína que contiene sulfuro.

Una vez completado el alargamiento del péptido se retiran todos los grupos protectores. Cuando se usa una síntesis en fase líquida, los grupos protectores se retiran de cualquier manera dictada por la elección de los grupos protectores. Estos procedimientos los conocen bien los especialistas en la técnica.

Además, puede seguirse la siguiente guía en la preparación de compuestos de la presente invención. Por ejemplo, para formar un compuesto en el que R4-C(O)-, R4-S(O)2, un P3 protegido o todo el péptido o un segmento del péptido se acoplan a un cloruro de acilo o cloruro de sulfonilo apropiado, respectivamente, que está disponible en el mercado o para el cual la síntesis se conocen bien en la técnica. En la preparación de un compuesto en el que R4O-C(O)-, un P3 protegido o todo el péptido o un segmento del péptido se acoplan a un cloroformiato apropiado que está disponible en el mercado o para el cual la síntesis se conoce bien en la técnica. Para derivados de Boc se usa (Boc)2O.

Por ejemplo:

imagen1

Se trata ciclopentanol con fosgeno para formar el cloroformiato correspondiente. El cloroformiato se trata con el NH2-tripéptido deseado en presencia de una base, tal

como trietilamina, dando el ciclopentilcarbamato.

En la preparación de un compuesto en el que R4-N(R5)-C(O)-, o R4-NH-C(S)-, un P3 protegido o todo el péptido o un segmento del péptido se trata con fosgeno, seguido de amina, como se describe en Syn Lett. Feb 1995; (2); 142-144 o se hace reaccionar con el isocianato disponible en el mercado y una base adecuada tal como trietilamina.

En la preparación de un compuesto en el que R4-N(R5)-S(O2), un P3 protegido o todo el péptido o un segmento del péptido se trata con un cloruro de sulfamilo recién preparado o disponible en el mercado, seguido de amina, como se describe en la patente Ger. Offen. (1998), pág. 84, DE 19802350 o WO 98/32748.

El grupo carboxilo α del resto C-terminal normalmente está protegido como un éster (GPC) que puede escindirse dando el ácido carboxílico. Los grupos protectores que pueden usarse incluyen: 1) ésteres de alquilo tales como de metilo, trimetilsililetilo y t-butilo, 2) ésteres de aralquilo tales como de bencilo y bencilo sustituido, o 3) ésteres que pueden escindirse por tratamiento suave con base o medios reductores moderados, tales como tricloroetilo y ésteres de fenacilo.

El ácido α-carboxílico resultante (resultante de la escisión por tratamiento con ácido suave, base suave o medios reductores moderados) se acopla con un R1SO2NH2 [preparado por tratamiento de R1SO2CI en solución de tetrahidrofurano saturado en amoniaco] en presencia de un agente de acoplamiento peptídico, tal como CDI o EDAC, en presencia de una base tal como 4-dimetilaminopiridina (4-DMAP) y/o 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno (DBU) para incorporar el resto P1', montando eficazmente el tripéptido P1’-P1-P2-P3-GPA. Típicamente, en este procedimiento, se usan 1-5 equivalentes de agentes de acoplamiento P1'.

Adicionalmente, si el grupo protector GPA de P3 se retira y se reemplaza con un resto B mediante los procedimientos descritos anteriormente, y el ácido α-carboxílico resultante, procedente de la escisión (resultante de la escisión por tratamiento con ácido suave, base suave o medios reductores moderados), se acopla con un R1SO2NH2 [preparado por tratamiento de R1SO2CI en solución de tetrahidrofurano saturado en amoniaco o por procedimientos alternativos descritos en el presente documento], en presencia de un agente de acoplamiento peptídico, tal como CDI o EDAC, en presencia de una base, tal como 4dimetilaminopiridina (4-DMAP) y/o 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno (DBU) para incorporar el resto P1', se prepara el tripéptido P1’-P1-P2-P3-B. Típicamente, en este procedimiento, se usan 1-5 equivalentes de agentes de acoplamiento P1'.

Los compuestos de la presente invención pueden prepararse por muchos procedimientos, incluyendo aquellos descritos en los ejemplos, a continuación, y como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 6.323.180 y la Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 10/001.850, presentada el 20 de noviembre de 2001.

La presente invención también proporciona composiciones que comprenden un compuesto de la presente invención, o una sal o solvato farmacéuticamente aceptables del mismo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la invención, o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable, con un vehículo farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, un excipiente, diluyente o portador.

El ingrediente activo, es decir, el compuesto, en dichas composiciones, típicamente comprende del 0,1 por ciento en peso al 99,9 por ciento en peso de la composición, y a menudo comprende de aproximadamente el 5 al 95 por ciento en peso.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse por vía oral, parenteral o mediante un depósito implantado. Se prefiere la administración oral o administración por inyección. En algunos casos, el pH de la formulación puede ajustarse con ácidos, bases o tampones farmacéuticamente aceptables, para potenciar la estabilidad del compuesto formulado o su forma de suministro. El término parenteral, como se usa en el presente documento, incluye inyección subcutánea, intracutánea, intravenosa, intramuscular, intra-articular, intrasinovial, intraesternal, intratecal, e intralesional o técnicas de infusión.

Las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de una preparación inyectable estéril, por ejemplo, en forma de una suspensión inyectable estéril, acuosa u oleaginosa. Esta suspensión puede formularse de acuerdo con técnicas conocidas en la técnica, usando agentes dispersantes o humectantes adecuados y agentes de suspensión. Los detalles respecto a la preparación de dichos compuestos los conocen los especialistas en la técnica.

Cuando se administran por vía oral, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse en cualquier forma farmacéutica aceptable por vía oral incluyendo, aunque sin limitación, cápsulas, comprimidos, y suspensiones y soluciones acuosas. En el caso de comprimidos para uso oral, los vehículos que se usan habitualmente incluyen lactosa y almidón de maíz. Los agentes lubricantes, tales como estearato de magnesio, también se usan típicamente. Para la administración oral en forma de cápsula, los diluyentes útiles incluyen lactosa y almidón de maíz secado. Cuando las suspensiones acuosas se administran por vía oral, el ingrediente activo se combina con agentes emulsionantes y de suspensión. Si se desea, pueden añadirse ciertos agentes edulcorantes y/o saborizantes y/o colorantes.

Otros vehículos adecuados para las composiciones indicadas anteriormente pueden

encontrarse en textos farmacéuticos convencionales, por ejemplo en "Remington’s Pharmaceutical Sciences", 19ª ed., Mack Publishing Company, Easton, Penn., 1995. Más detalles relacionados con el diseño y la preparación de formas de suministro adecuadas de las composiciones farmacéuticas de la invención los conocen los especialistas en la técnica.

Los niveles de dosificación de entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 1000 miligramos por kilogramo ("mg/kg") de peso corporal por día, preferiblemente entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 250 mg/kg de peso corporal por día de los compuestos de la invención son típicos en una monoterapia para la prevención y tratamiento de una enfermedad mediada por VHC. Típicamente, las composiciones farmacéuticas de la presente invención se administrarán de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 veces por día o, como alternativa, como una infusión continua. Dicha administración puede usarse como una terapia crónica o aguda. La cantidad de ingrediente activo que se puede combinar con los materiales de soporte para producir una forma farmacéutica individual variará dependiendo del hospedador tratado y del modo de administración particular.

Como apreciará el especialista, pueden requerirse dosis menores o mayores que las citadas anteriormente. La dosificación y los regímenes de tratamiento específicos para cualquier paciente particular dependerán de diversos factores, incluyendo la actividad del compuesto específico empleado, la edad, el peso corporal, el estado de salud general, el sexo, la dieta, el momento de la administración, la velocidad de excreción, la combinación de fármacos, la gravedad y transcurso de la infección, la disposición del paciente a la infección y el juicio del médico que lo trata. Generalmente, el tratamiento se inicia con pequeñas cantidades de dosificación, menores que la dosis óptima del péptido. Posteriormente, la dosificación se aumenta en pequeños incrementos hasta que se alcanza el efecto óptimo según las circunstancias. En general, el compuesto se administra más deseablemente a un nivel de concentración que generalmente, dará resultados antiviralmente eficaces, sin provocar ningún efecto secundario dañino o perjudicial.

Cuando las composiciones de la presente invención comprenden una combinación de un compuesto de la invención y uno o más agentes terapéuticos o profilácticos adicionales, tanto el compuesto como el agente adicional normalmente están presentes a niveles de dosificación de entre aproximadamente el 10 y el 100%, y más preferiblemente entre aproximadamente el 10 y el 80% de la dosificación administrada normalmente en un régimen de monoterapia.

Cuando estos compuestos o sus sales o solvatos farmacéuticamente aceptables se formulan junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, la composición resultante puede administrarse in vivo a mamíferos, tales como el hombre, para tratar o prevenir la infección por el virus VHC. Dicho tratamiento puede conseguirse también usando los compuestos de la

presente invención junto con agentes que incluyen, aunque sin limitación:

agentes inmunomoduladores, tales como interferones; otros agentes antivirales tales como

ribavirina, amantadina; otros inhibidores de proteasa NS3 de VHC; inhibidores de otras

dianas en el ciclo vital del VHC tales como helicasa, polimerasa, metaloproteasa,

o

sitio de entrada de ribosoma interno; o combinaciones de los mismos. Los agentes

adicionales pueden combinarse con los compuestos de la presente invención para crear

una forma farmacéutica individual. Como alternativa, estos agentes adicionales pueden

administrarse por separado a un mamífero como parte de una forma farmacéutica múltiple.

Se describen también en el presente documento procedimientos para inhibir la actividad de la proteasa NS3 de VHC en pacientes, por administración de un compuesto de la presente invención o una sal farmacéuticamente aceptable o solvato del mismo, en el que los sustituyentes son como se han definido anteriormente.

Estos procedimientos son útiles en la reducción de la actividad de la proteasa NS3 de VHC en el paciente. Si la composición farmacéutica comprende sólo un compuesto de la presente invención como el componente activo, dichos procedimientos pueden comprender, adicionalmente, la etapa de administrar a dicho paciente un agente seleccionado entre un agente inmunomodulador, un agente antiviral, un inhibidor de proteasa de VHC, o un inhibidor de otras dianas en el ciclo vital del VHC tales como, por ejemplo, helicasa, polimerasa, o metaloproteasa. Dicho agente adicional puede administrarse al paciente antes de, simultáneamente con o después de la administración de los compuestos de la presente invención.

Estos procedimientos son útiles para inhibir la replicación viral en un paciente. Dichos procedimientos puede ser útiles en el tratamiento o prevención de una enfermedad por VHC.

Los compuestos de la invención pueden usarse también como reactivos de laboratorio. Los compuestos pueden contribuir decisivamente a la hora de proporcionar herramientas de investigación para diseñar ensayos de replicación viral, validación de sistemas de ensayo en animales y estudios de biología estructural para potenciar adicionalmente el conocimiento de los mecanismos de la enfermedad por VHC.

Los compuestos de la presente invención pueden usarse también para tratar o prevenir la contaminación viral de los materiales y, por lo tanto, reducir el riesgo de infección viral del personal médico o del laboratorio, o de pacientes que entren en contacto con dichos materiales, por ejemplo, sangre, tejido, instrumentos y prendas quirúrgicas, instrumentos y prendas de laboratorio, y aparatos y materiales de recogida y o transfusión de sangre.

Ejemplos

Los ejemplos específicos que siguen ilustran las síntesis de los compuestos de la presente invención. Los procedimientos pueden adaptarse a variaciones para producir compuestos abarcados por la presente invención, aunque no se describan específicamente. Además, las variaciones de los procedimientos para producir los mismos compuestos de una manera un tanto diferente, también serán evidentes para un especialista en la técnica.

Los porcentajes en solución expresan una relación de peso a volumen, y las proporciones en solución expresan una relación de volumen a volumen, a menos que se indique otra cosa. Los espectros de resonancia magnética nuclear (RMN) se registraron en un espectrómetro Broker de 300, 400 o 500 MHz; los desplazamientos químicos (δ) se presentan en partes por millón. La cromatografía ultrarrápida se realizó sobre gel de sílice (SiO2) de acuerdo con la técnica de cromatografía ultrarrápida de Still (W.C. Still et al., J. Org. Chem., (1978), 43, 2923).

Todos los datos de Cromatografía de Líquidos (CL) se registraron en un cromatógrafo de líquidos Shimadzu CL-10AS usando un detector de UV-Vis SPD-10AV y los datos de Espectrometría de Masas (EM) se determinaron con un Micromass Platform para CL en modo electronebulización (EN+).

A menos que se indique otra cosa, cada compuesto se analizó por CL-EM, usando una de las siete metodologías posibles, que tienen las siguientes condiciones. Obsérvese que para ciertos compuestos, el término CL-EM está truncado a CL, puesto que el calibrado de EM está limitado a compuestos de PM 900 o menor.

Columnas:: (Procedimiento A) -YMC ODS S7 C18 3,0 x 50 mm

(Procedimiento B) -YMC ODS-A S7 C18 3,0 x 50 mm

(Procedimiento C) -YMC S7 C18 3,0 x 50 mm

(Procedimiento D) -YMC Xterra ODS S7 3,0 x 50 mm

(Procedimiento E) -YMC Xtecra ODS S7 3,0 x 50 mm

(Procedimiento F) -YMC ODS-A S7 C18 3,0 x 50 mm

(Procedimiento G) -YMC C18 S5 4,6 x 50 mm]

Gradiente:: 100% Disolvente A/0% Disolvente B hasta

0% Disolvente A/100% Disolvente B

Tiempo del gradiente:: 2 min. (A, B, D, F, G); 8 min. (C, E)

Tiempo de mantenimiento:: 1 min. (A, B, D, F, G); 2 min. (C, E)

Caudal:: 5 ml/min

Long. de Onda del Detector: 220 nm Disolvente A: MeOH al 10% / H2O al 90% / TFA al 0,1%

Disolvente B: H2O al 10% / MeOH al 90% / TFA al 0,1%.

Los compuestos e intermedios químicos de la presente invención, descritos en los

siguientes ejemplos, se prepararon de acuerdo con los siguientes procedimientos.

Las abreviaturas usadas en la presente solicitud, incluyendo particularmente en los

5 ejemplos ilustrativos que siguen, las conocen bien los especialistas en la técnica. Algunas de

las abreviaturas usadas son las siguientes:

ta temperatura ambiente

Boc terc-butiloxicarbonilo

DMSO dimetilsulfóxido

EtOAc acetato de etilo

t-BuOK t-butóxido potásico

Et2O éter dietílico

TBME terc-butil metil éter

THF tetrahidrofurano

CDI carbonildiimidazol

DBU 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno

TFA ácido trifluoroacético

NMM N-metilmorfolina

HATU O-7-azabenzotriazol-1-ilo

HBTU hexafluorofosfato de O-{1H-benzotriazol-1-il)-N,N,N’,N’-tetrametiluronio

HOBT N-hidroxibenzotriazol

PyBrop hexafluorofosfato de bromo-bis-pirrolidin-fosfonio

DMF dimetilformamida

MeOH metanol

EDTA ácido etilendiaminatetraacético

EMAR espectrometría de masas de alta resolución

DMAP 4-dimetilaminopiridina

DIPEA diisopropiletilamina

Ejemplo 1

(Preparación del Intermedio Clave) Boc-(4R)-(2-fenil-7-metoxiquinolin-4-oxo)-S-prolina, mostrada a continuación, se 10 preparó como se describe en las Etapas 1a-c.

imagen1

Etapa 1a: Preparación de 4-hidroxi-2-fenil-7-metoxiquinolina, mostrada a continuación.

imagen1

A una solución de m-anisidina (300 g, 2,44 mol) y benzoilacetato de etilo (234,2 g, 1,22 mol) en tolueno (2,0 l) se le añadió HCl (4,0 N en dioxano, 12,2 ml, 48,8 mmol). La solución resultante se calentó a reflujo durante 6,5 h usando un aparato de Dean-Stark (se recogieron aproximadamente 56 ml de solución acuosa). La mezcla se enfrió a ta, se repartió múltiples veces con HCl acuoso (10%, 3 x 500 ml), NaOH acuoso (1,0 N, 2 x 200 ml), agua (3 x 200 ml), y la fase orgánica se secó (MgSO4) y se concentró al vacío dando un residuo oleoso (329,5 g). El producto bruto se calentó en un baño de aceite (280ºC) durante 80 min usando un aparato de Dean-Stark (se recogieron aproximadamente 85 ml de líquido). La mezcla de reacción se enfrió a ta, el residuo sólido se trituró con CH2CI2 (400 ml), la suspensión resultante se filtró, y la torta de filtro se lavó con más CH2CI2 (2 x 150 ml). El sólido resultante se secó al vacío (50ºC; 1 torr; 1 día) dando 4-hidroxi-7-metoxi-2-fenilquinolina analíticamente pura en forma de un sólido pardo claro (60,7 g, 20% global). RMN de 1H δ (DMSO): 3,86 (s, 3 H), 6,26 (s, 1 H), 6,94 (dd, J = 9,0, 2,4 Hz, 1 H), 7,21 (d, J = 2,4 Hz, 1 H), 7,55-7,62 (m, 3 H), 7,80-7,84 (m, 2 H), 8,00 (d, J = 9,0 Hz, 1 H), 11,54 (s, 1 H); RMN de 13C (DMSO-d6) δ 55,38, 99,69, 107,07, 113,18, 119,22, 126,52, 127,17, 128,97, 130,34, 134,17, 142,27, 149,53, 161,92, 176,48. CLEM (tiempo de retención: 1,26, procedimiento D), EM m/z 252 (M++1).

Etapa 1b: Preparación de 4-cloro-7-metoxi-2-fenilquinolina, mostrada a continuación.

imagen1

El producto de la Etapa 1a (21,7 g, 86,4 mmol) se suspendió en POCI3 (240 ml). La suspensión se calentó a reflujo durante 2 horas. Después de la retirada del POCI3 al vacío, el residuo se repartió entre EtOAc (1 l), y NaOH acuoso frío (generado a partir de 200 ml de NaOH 1,0 N y 20 ml de NaOH 10,0 N) y se agitó durante 15 min. La fase orgánica se lavó con agua (2 x 200 ml), salmuera (200 ml), se secó (MgSO4), y se concentró al vacío dando 4-cloro2-fenil-7-metoxiquinolina (21,0 g, 90%) en forma de un sólido pardo claro. RMN de 1H (DMSOd6) δ 3,97 (s, 3 H), 7,36 (dd, J = 9,2, 2,6 Hz, 1 H), 7,49-7,59 (m, 4 H), 8,08 (d, J = 9,2 Hz, 1 H), 8,19 (s, 1 H), 8,26-8,30 (m, 2 H); RMN de 13C (DMSO-d6) δ: 55,72, 108,00, 116,51, 119,52, 120,48, 124,74, 127,26, 128,81, 130,00, 137,58, 141,98, 150,20, 156,65, 161,30. CL-EM (tiempo de retención: 1,547, Procedimiento D), EM m/z 270 (M++1). Etapa 1c: Preparación de Boc-(4R)-(2-fenil-7-metoxi-quinolin-4-oxo)-S-prolina, mostrada a continuación.

imagen1

A una suspensión de Boc-4R-hidroxiprolina (16,44 g, 71,1 mmol) en DMSO (250 ml) se le añadió t-BuOK (19,93 g, 177,6 mmol) a 0ºC. La mezcla generada se agitó durante 1,5 horas y después el producto de la Etapa 1b (21,02 g, 77,9 mmol) se añadió en tres porciones durante 1 h. La reacción se agitó durante un día, la mezcla de reacción se vertió en agua fría (1,5 l) y se lavó con Et2O (4 x 200 ml). La solución acuosa se acidificó a pH 4,6, se filtró para obtener un sólido blanco, y se secó al vacío dando el producto, Boc (4R)-(2-fenil-7-metoxiquinolin-4oxo)prolina (32,5 g, 98%). RMN de 1H (DMSO) δ 1,32, 1,35 (dos s (rotámeros) 9 H), 2,30-2,42 (m, 1 H), 2,62-2,73 (m, 1 H), 3,76 (m, 2 H), 3,91 (s, 3 H), 4,33-4,40 (m, 1 H), 5,55 (m, 1 H), 7,15 (dd, J = 9,2, 2,6 Hz, 1 H), 7,37 (d, J = 2,6 Hz, 1 H), 7,42-7,56 (m, 4 H), 7,94-7,99 (m, 1 H), 8,25, 8,28 (2s, 2 H), 12,53 (s a, 1 H); CL-EM (tiempo de retención: 1,40, Procedimiento D), EM m/z 465 (M++1).

Ejemplo 2

(Preparación del Intermedio Clave)

El isómero P1 (1R,2S) de ácido 1-{[1-2-terc-butoxicarbonilamino-3,3-dimetilbutiril)-4-(7metoxi-2-fenilquinolin-4-iloxi)pirrolidin-2-carbonil]amino}-2-vinilciclo-propanocarboxílico, mostrado a continuación, se preparó como se describe en las Etapas 2a-e.

imagen1

Etapa 2a: Preparación de clorhidrato del éster etílico del ácido (1R,2S)/(1S,2R)-1-amino-2vinilciclopropano carboxílico, mostrado a continuación.

imagen1

El compuesto nombrado se preparó por cada uno de los siguientes procedimientos A y

B. Procedimiento A A.1) Preparación de N-bencil imina de éster etílico de glicina, mostrado a continuación.

imagen1

El clorhidrato de éster etílico de glicina (303,8 g, 2,16 mol) se suspendió en tercbutilmetil éter (1,6 l). Se añadieron benzaldehído (231 g, 2,16 mol) y sulfato sódico anhidro (154,6 g, 1,09 mol) y la mezcla se enfrió a 0ºC usando un baño de hielo-agua. Se añadió trietilamina (455 ml, 3,26 mol), gota a gota, durante 30 min y la mezcla se agitó durante 48 h a ta. La reacción se interrumpió después mediante la adición de agua enfriada con hielo (1 l) y la fase orgánica se separó. La fase acuosa se extrajo con terc-butilmetil éter (0,5 l) y las fases orgánicas combinadas se lavaron con una mezcla de NaHCO3 acuoso saturado (1 l) y salmuera (1 l). La solución se secó sobre MgSO4, se concentró al vacío dando 392,4 g del producto N-bencil imina en forma de un aceite amarillo espeso que se usó directamente en la siguiente etapa. RMN de 1H (CDCl3, 300 MHz) δ 1,32 (t, J = 7,1 Hz, 3 H), 4,24 (c, J = 7,1 Hz, 2 H), 4,41 (d, J = 1,1 Hz, 2 H), 7,39-7,47 (m, 3 H), 7,78-7,81 (m, 2 H), 8,31 (s, 1 H). A.2) Preparación de éster etílico del ácido N-Boc-(1R,2S)/(1S,2R)-1-amino-2-vinilciclopropano carboxílico racémico

imagen1

A una suspensión de terc-butóxido de litio (84,06 g, 1,05 mol) en tolueno seco (1,2 l), se le añadió gota a gota una mezcla de la N-bencil imina de éster etílico de glicina (100,4 g, 0,526 mol) y trans-1,4-dibromo-2-buteno (107,0 g, 0,500 mol) en tolueno seco (0,6 l) durante 60 min. Una vez completada la adición, la mezcla de color rojo oscuro se inactivó mediante la adición de agua (1 l) y terc-butilmetil éter (TBME, 1 l). La fase acuosa se separó y se extrajo una segunda vez con TBME (1 l). Las fases orgánicas se combinaron, se añadió HCl 1 N (1 l) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. La fase orgánica se separó y se extrajo con agua (0,8 l). Las fases acuosas se combinaron después, se saturaron con sal (700 g), se añadió TBME (1 l) y la mezcla se enfrió a 0ºC. La mezcla agitada se basificó después a pH 14 mediante la adición gota a gota de NaOH 10 N, la fase orgánica se separó, y la fase acuosa se extrajo con TBME (2 x 500 ml). Los extractos orgánicos combinados se secaron (MgSO4) y se concentraron hasta un volumen de 1 l. A esta solución de amina libre, se le añadió di-tercbutildicarbonato (131,0 g, 0,6 mol) y la mezcla se agitó 4 días a ta. Se añadió más di-tercbutildicarbonato (50 g, 0,23 mol) a la reacción, la mezcla se calentó a reflujo durante 3 h, y después se permitió que se enfriara a temperatura ambiente durante una noche. La mezcla de reacción se secó sobre MgSO4 y se concentró al vacío dando 80 g de material bruto. Este residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida (2,5 kg de SiO2, eluido con MeOH al 1% a 2%/CH2CI2) dando 57 g (53%) de éster etílico del ácido N-Boc-(1R,2S)/(1S,2R)-1-amino-2vinilciclopropano carboxílico racémico en forma de un aceite amarillo que solidificó mientras reposaba en el frigorífico. RMN de 1H (CDCl3, 300 MHz) δ 1,26 (t, J = 7,1 Hz, 3 H), 1,46 (s, 9 H), 1,43-1,49 (m, 1 H), 1,76-1,82 (m a, 1 H), 2,14 (c, J = 8,6 Hz, 1 H), 4,18 (c, J = 7,2 Hz, 2 H), 5,12 (dd, J = 10,3, 1,7 Hz, 1 H), 5,25 (s a, 1 H), 5,29 (dd, J = 17,6, 1,7 Hz, 1 H), 5,77 (ddd, J = 17,6, 10,3, 8,9 Hz, 1 H); EM m/z 254,16 (M+-1). A.3) Preparación de clorhidrato de éster etílico del ácido (1R,2S)/(1S,2R) 1-amino-2vinilciclopropano carboxílico racémico

imagen1

Se disolvió éster etílico del ácido N-Boc-(1R,2S/1S,2R)-1-amino-2-vinilciclopropano carboxílico (9,39 g, 36,8 mmol) en HCl 4 N/dioxano (90 ml, 360 mmol) y se agitó durante 2 h a ta. La mezcla de reacción se concentró dando clorhidrato de éster etílico del ácido (1R,2S/1S,2R)-1-amino-2-vinilciclopropano carboxílico con rendimiento cuantitativo (7 g, 100%). RMN de 1H (Metanol-d4) δ 1,32 (t, J = 7,1, 3 H), 1,72 (dd, J = 10,2, 6,6 Hz, 1 H), 1,81 (dd, J = 8,3, 6,6 Hz, 1 H), 2,38 (c, J = 8,3 Hz, 1 H), 4,26-4,34 (m, 2 H), 5,24 (dd, 10,3, 1,3 Hz, 1 H) 5,40 (d, J = 17,2, 1 H), 5,69-5,81 (m, 1 H). Procedimiento B

imagen1

A una solución de terc-butóxido potásico (11,55 g, 102,9 mmol) en THF (450 ml) a 78ºC se le añadió la N,N-dibencil imina de éster etílico de glicina disponible en el mercado (25,0 g, 93,53 mmol) en THF (112 ml). La mezcla de reacción se calentó a 0ºC, se agitó durante 40 min, y después se volvió a enfriar a -78ºC. A esta solución se le añadió trans-1,4dibromo-2-buteno (20,0 g, 93,50 mmol), la mezcla se agitó durante 1 h a 0ºC y se enfrió de nuevo a -78ºC. Se añadió terc-butóxido potásico (11,55 g, 102,9 mmol), la mezcla se calentó inmediatamente a 0ºC, y se agitó una hora más antes de concentrarla al vacío. El producto bruto se recogió en Et2O (530 ml), se añadió solución ac. 1 N de HCl (106 ml, 106 mmol) y la mezcla bifásica resultante se agitó durante 3,5 h a ta. Las capas se separaron y la fase acuosa se lavó con Et2O (2 x) y se basificó con un solución ac. saturada de NaHCO3. La amina deseada se extrajo con Et2O (3 x) y el extracto orgánico combinado se lavó con salmuera, se secó (MgSO4), y se concentró al vacío para obtener la amina libre. Este material se trató con una solución 4 N de HCl en dioxano (100 ml, 400 mmol) y se concentró dando clorhidrato de éster etílico del ácido (1R,2S)/(1S,2R)-1-amino-2-vinilciclopropano carboxílico en forma de un semisólido pardo (5,3 g, rendimiento del 34%) idéntico al material obtenido a partir del procedimiento A, excepto por la presencia de una pequeña impureza aromática no identificada

(8%).

Etapa 2b: Preparación del isómero P1 (1R,2S) de éster terc-butílico del ácido 2-(1etoxicarbonil-2-vinilciclopropilcarbamil-4-(7-metoxil-2-fenilquinolin-4-iloxi)pirrolidin-1-carboxílico, denominación alternativa éster terc-butílico del ácido 2(S)-(1(R)-etoxicarbonil-2(S)-vinilciclopropilcarbamoil)-4(R)-(7-metoxi-2-fenil-quinolin-4-iloxi)-pirrolidin-1-carboxílico, mostrado a continuación.

imagen1

A una solución de Boc-4(R)-(2-fenil-7-metoxiquinolin-4-oxo)prolina de la Etapa 1c (11,0 g, 23,7 mmol), sal HCl de una mezcla racémica de diastereómeros derivados de P1 (1R,2S) y (1S,2R), de la Etapa 2b, donde el grupo carboxi es syn respecto al resto vinilo (5,40 g, 28,2 mmol), NMM (20,8 ml; 18,9 mmol) en 500 ml de CH2Cl2 al 50%/THF se el añadió el reactivo de acoplamiento PyBrop o hexafluorofosfato de bromotrispirolidino-fosfonio (16,0 g, 34,3 mmol) en tres porciones en 10 min a 0ºC. La solución se agitó a ta durante un día y después se lavó con tampón a pH 4,0 (4 x 50 ml). La fase orgánica se lavó con NaHCO3 acuoso saturado (100 ml), el lavado acuoso se extrajo con acetato de etilo (150 ml), y la fase orgánica se volvió a lavar con tampón a pH 4,0 (50 ml), y NaHCO3 acuoso saturado (50 ml). La solución orgánica se secó (MgSO4), se concentró y se purificó usando una columna Biotage 65M (eluida con EtOAc al 50%/Hexanos) proporcionando aproximadamente 7,5 g de una mezcla 1:1 de isómeros P1 (1R,2S) y (1S,2R) de éster terc-butílico del ácido 2-(1-etoxicarbonil-2-vinilciclopropilcarbamil-4(7-metoxil-2-fenilquinolin-4-iloxi)pirrolidin-1-carboxílico (50% global) o, como alternativa, elución en una columna Biotage 65M usando un gradiente lento de EtOAc al 15% a 60% en hexanos,

5 dando 3,54 g (25%) del isómero P1 (1R,2S) de alto Rf eluido, y 3,54 g (25%) del isómero P1 (1S,2R) de bajo Rf eluido.

Datos para el isómero P1 (1R,2S): RMN de 1H (CDCl3) δ 1,21 (t, J = 7 Hz, 3 H), 1,43 (s, 9 H), 1,47-1,57 (m, 1 H), 1,88 (m, 1 H), 2,05-2,19 (m, 1 H), 2,39 (m, 1 H), 2,88 (m, 1 H), 3,713,98 (m, 2 H), 3,93 (s, 3 H), 4,04-4,24 (m, 2 H), 4,55 (m, 1 H), 5,13 (d, J = 10 Hz, 1 H), 5,22

10 5,40 (m, 1 H), 5,29 (d, J = 17 Hz, 1 H), 5,69-5,81 (m, 1 H), 7,02 (s a, 1 H), 7,09 (dd, J = 9, 2 Hz, 1 H), 7,41-7,52 (m, 4 H), 7,95 (d, J = 9 Hz, 1 H), 8,03, 8,05 (2s, 2 H); RMN de 13C (CDCl3) δ: 14,22; 22,83, 28,25, 33,14, 33,58, 39,92, 51,84, 55,47, 58,32, 61,30, 75,86, 81,27, 98,14, 107,42, 115,00,117,84, 118,27 122,63, 123,03, 127,50, 128,72, 129,26, 133,39, 140,06, 151,23, 159,16, 160,34, 161,35, 169,78, 171,68. CL-EM (tiempo de retención: 1,62,

15 procedimiento D), EM m/z 602 (M++1). Datos para el isómero P1 (1S,2R): RMN de 1H δ 1,25 (t, J = 7 Hz, 3 H),1,44(s,9H), 1,46-1,52 (m, 1 H), 1,84 (m, 1 H), 2,12-2,21 (m, 1 H), 2,39 (m, 1 H), 2,94 (m, 1 H), 3,82 (m, 2 H), 3,97 (s, 3 H), 4,05-4,17 (m, 2 H), 4,58 (m, 1 H), 5,15 (d, J = 10,8 Hz, 1 H), 5,33 (d, J = 17 Hz, 1 H), 5,30-5,43 (m, 1 H), 5,72-5,85 (m, 1 H), 7,05 (s, 1 H), 7,13 (dd, J = 9, 2 Hz, 1 H), 7,46

20 7,60 (m, 4 H), 7,98 (d, J = 9, 1 H), 8,06-8,10 (m, 2 H). CL-EM (tiempo de retención: 1,66, procedimiento D), EM m/z 602 (M++1).

25

30

imagen1

Etapa 2b Alternativa: Preparación de éster terc-butílico del ácido 2(S)-(1(R)etoxicarbonil-2(S)-vinil-ciclopropilcarbamoil)-4(R)-(7-metoxi-2-fenil-quinolin-4-iloxi)-pirrolidin-1carboxílico, mostrado a continuación.

El producto de la Etapa 2a (7,5 g, 39,1 mmol) se combinó con diisopropiletilamina (32,5 ml, 186 mmol) en diclorometano (150 ml). A la mezcla resultante se le añadió HOBT hidrato (6,85 g, 44,7 mmol) y el producto de la Etapa 1c (17,3 g, 37,3 mmol) seguido de la adición de HBTU (16,96 g, 44,7 mmol). Ocurrió una ligera exotermia inmediatamente, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante una noche. Después, la mezcla se concentró al vacío y se redisolvió en acetato de etilo (600 ml). La solución se lavó con agua (2 x 200 ml), después con bicarbonato sódico acuoso al 10% (2 x 200 ml), después con agua (150 ml) y finalmente con salmuera (150 ml). La fase orgánica se secó sobre sulfato de magnesio anhidro y se filtró, y el filtrado se concentró al vacío hasta obtener un sólido vítreo de color beige. La purificación se realizó en múltiple lotes (7 g cada uno) por cromatografía ultrarrápida en un cartucho Biotage Flash 75M (hexanos al 66%/acetato de etilo) proporcionando el isómero P1 (1R.2S) vinil acca de BOC-NH-P2-P1-COOEt como el isómero eluido inicial (9,86 g total, rendimiento del 44,0%), seguido de elución del isómero P1 (1S,2R) vinil acca de BOC-NH-P2-P1-COOEt como el segundo isómero eluido (10,43 g total, rendimiento del 46,5%). Se recuperó un total de 1,97 g de fracciones mixtas, dando una conversión global del 99,3% para los dos diastereómeros.

isómero (1R,2S) -RMN de 1H: (metanol-d4) δ 1,23 (t, J = 7,2 Hz, 3 H), 1,4 (s, 4 H), 1,45 (s, 6 H), 1,73 (dd, J = 7,9, 1,5 Hz, 0,4 H), 1,79 (dd, J = 7,8,2,4 Hz, 0,6 H), 2,21 (c, J = 8,2 Hz, 1 H), 2,44-2,49 (m, 1 H), 2,66-2,72 (m, 0,4 H), 2,73-2,78 (m, 0,6 H), 3,93-3,95 (m, 2 H), 3,96 (s, 3 H), 4,10-4,17 (m, 2 H), 4,44 (c, J = 7,8 Hz, 1 H), 5,13 (d, J = 10,7 Hz, 1 H), 5,31 (d, J = 17,7 Hz, 0,4 H), 5,32 (d, J = 17,4 Hz, 0,6 H), 5,49 (s a, 1 H), 5,66-5,82 (m, 1 H), 7,16 (dd, J = 9,2, 2,5 Hz, 1 H), 7,26 (s, 1 H), 7,42 (d, J = 2,4 Hz, 1 H), 7,48-7,55 (m, 3 H), 8,02-8,05 (m, 3 H); EM m/z 602 (M++1). Etapa 2c: Preparación del diastereómero P1 (1R,2S) de éster etílico del ácido 1-{[4-(7-metoxi2-fenilquinolin-4-iloxi)pirrolidin-2-carbonil]-1-amino}-2-vinilciclopropanocarboxílico, diclorhidrato, mostrado a continuación.

imagen1

El producto de la Etapa 2b (5,88 g, 9,77 mmol) se disolvió en HCl/dioxano (4,0 M; 200 ml) y se agitó durante 2,5 h a ta. La mezcla de reacción se concentró dando el producto del título. RMN de 1H (Metanol-d4) δ 1,24 (t, J = 7 Hz, 3 H), 1,50 (dd, J = 10, 5 Hz, 1 H), 1,78 (dd, J = 8,4, 5,5 Hz, 1 H), 2,24-2,33 (m, 1 H), 2,56-2,66 (m, 1 H), 3,05 (dd, J = 14,6, 7,3 Hz, 1 H), 3,98 (s, 2 H), 4,06 (s, 3 H), 4,15 (c, J = 7 Hz, 2 H), 4,76 (dd, J = 10,6, 7,3 Hz, 1 H), 5,13 (dd, J = 10,2, 1,8 Hz), 5,32 (dd, J = 17, 2 Hz), 5,70-5,83 (m, 1 H), 6,05 (m, 1 H), 7,48 (dd, J = 9, 2 Hz, 1 H), 7,65-7,79 (m, 5 H), 8,12-8,15 (m, 2 H), 8,54 (d, J = 9,5 Hz, 1 H); RMN de 13C (metanol-d4) δ: 14,77, 23,23, 34,86, 37,25, 41,19, 43,90, 52,66, 60,35, 62,32, 62,83, 68,27, 72,58, 73,70, 81,21, 100,70, 102,44, 116,13, 118,67, 122,25, 126,93, 130,27, 130,94, 133,19, 134,14, 134,89, 143,79, 158,39, 166,84, 167,44, 169,57, 171,33. CL-EM (tiempo de retención: 1,55, Procedimiento D), EM m/z 502 (M++1). Etapa 2d: Preparación del isómero P1 (1R,2S) de éster etílico del ácido 1-{[1-2-tercbutoxicarbonilamino-3,3-dimetil-butiril)-4-(7-metoxi-2-fenilquinolin-4-iloxi)p-pirrolidin-2-carbonil]amino}-2-vinil-ciclopropanocarboxílico, mostrado a continuación.

imagen1

A una suspensión del producto de la Etapa 12c (1,95 g; 3,4 mmol), N-BOC-L-tercleucina (0,94 g, 4,08 mmol), NMM (1,87 ml, 17 mmol) en DMF (15 ml) se le añadió HATU (1,55 g, 4,08 mmol) a 0ºC. Después de agitarlo durante 2 días, la mezcla de reacción se diluyó con EtOAc (200 ml), se lavó con tampón a pH 4,0 (2 x 30 ml), NaHCO3 acuoso saturado (30 ml), salmuera (30 ml), se secó (MgSO4), se purificó mediante una columna Biotage 40 M (eluida con EtOAc al 15% a 60% en Hexanos) dando el producto del título en forma de un sólido blanco (2,21 g 90%). RMN de 1H (CDCl3) δ 1,05 (s, 9 H), 1,20 (t, J = 7 Hz, 3 H), 1,38-1,43 (m, 1 H), 1,41 (s, 9 H), 1,80-1,85 (m, 1 H), 2,08-2,16 (m, 1 H), 2,39-2,47 (m, 1 H), 2,90-2,99 (m, 1 H), 3,90-4,01 (m, 1 H), 3,93 (s, 3 H), 4,12 (c, J = 7 Hz, 2 H), 4,36 (d, J = 10 Hz, 1 H), 4,45 (d, J = 12 Hz, 1 H), 4,75-4,85 (m, 1 H), 5,09-5,13 (m, 1 H), 5,21-5,34 (m, 2 H), 5,69-5,81 (m, 1 H), 7,00-7,09 (m, 2 H), 7,42-7,54 (m, 5 H), 8,01-8,05 (m, 3 H); RMN de 13C (CDCl3) δ 14,30, 22,85, 26,40, 28,25, 32,20, 34,09, 35,39, 39,97, 53,86, 55,47, 58,28, 58,96, 61,29, 75,94, 79,86, 97,98, 107,43, 115,06, 117,98, 118,38, 123,03, 127,52, 128,76, 129,24, 133,40, 140,26, 151,44, 155,74, 159,16, 160,09, 161,32, 169,55, 170,64, 172,63. CL-EM (tiempo de retención: 1,85, Procedimiento D), EM m/z 715 (M++1).

Etapa 2e: Preparación del producto del título, isómero P1 (1R,2S) del ácido 1-{[1-2-tercbutoxicarbonilamino-3,3-dimetilbutiril)-4-(7-metoxi-2-fenilquinolin-4-iloxi)pirrolidin-2carbonil]amino}-2-vinilciclo-propanocarboxílico. A una suspensión del producto de la Etapa 12d (2,63 g, 3,68 mmol) en THF(150 ml), CH3OH (80 ml), y H2O (20 ml) se le añadió LiOH (1,32 g, 55,2 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante dos días, se acidificó hasta pH neutro, y se concentró al vacío hasta que sólo quedó la fase acuosa. El residuo acuoso resultante se acidificó a pH 3,0 mediante la adición de HCl acuoso 1,0 N, y se extrajo con EtOAc (4 x 200 ml). El disolvente orgánico combinado se lavó con salmuera (20 ml), se secó (Na2SO4), se filtró, y se concentró al vacío dando el producto del título en forma de un sólido blanco (2,41 g, 96%). RMN de 1H (CDCl3/Metanol-d4) δ 0,98, 1,01 (dos s (rotámeros) 9 H), 1,40, 1,42 (dos s (rotámeros) 9 H), 1,35-1,47 (m, 1 H), 1,89-1,93 (m, 1 H), 2,03-2,14 (m, 1 H), 2,45-2,52 (m, 1 H), 2,64-2,78 (m, 1 H), 3,94 (s, 3 H), 3,96-4,12 (m, 1 H), 4,34 (d, J = 10 Hz, 1 H), 4,52 (d, J = 11 Hz, 1 H), 4,58-4,64 (m, 1 H), 5,10 (d, J = 12 Hz, 1 H), 5,24 (d, J = 16 Hz, 1 H), 5,34 (m, 1 H), 5,68-5,86 (m, 2 H), 7,02-7,05 (m, 1 H), 7,32 (m, 1 H), 7,40-7,54 (m, 4 H), 7,97-8,03 (m, 3 H); RMN de 1H (Metanol-d4) δ 1,03 (s, 9 H), 1,26 (s, 9 H), 1,39-1,47 (m, 1 H), 1,68 (dd, J = 8, 5 Hz, 1 H), 2,15-2,23 (m, 1 H), 2,40-2,51 (m, 1 H), 2,71 (dd, J = 14, 7 Hz, 1 H). 3,95 (s, 3 H), 4,01-4,10 (m, 1 H), 4,22 (d, J = 9 Hz, 1 H), 4,53-4,64 (m, 1 H), 5,08 (dd, J = 10, 2,Hz, 1 H), 5,24 (dd, J = 17, 2 Hz, 1 H), 5,56 (m, 1 H), 5,77-5,89 (m, 1 H), 7,08 (dd, J = 9, 2 Hz, 1 H), 7,27 (s, 1 H), 7,36-7,41 (m, 1 H), 7,48-7,58 (m, 3 H), 8,03-8,12 (m, 3 H); CL-EM (tiempo de retención: 1,64, procedimiento D), EM m/z 687 (M++1).

El procedimiento de hidrólisis descrito en la Etapa 2e, en el presente documento, puede usarse para todos los tripéptidos de N-BOC que contienen vinil Acca como el producto de la Etapa 2d. Ejemplo 3

Compuesto 1, BOCNH-P3(L-t-BuGly)-P2[(4R)-(2-fenil-7-metoxiquinolin-4-oxo)-Sprolina]-P1 (1R,2S Vinil Acca)-CONH(2-sulfoniltiofeno) o la denominación alternativa, Compuesto 1, el isómero P1 (1R,2S) de éster terc-butílico del ácido (1-{4-(7-metoxi-2fenilquinolin-4-iloxi)-2-[1-(tiofeno-2-sulfonilaminocarbonil)-2-vinil-ciclopropilcarbamoil]-pirrolidin1-carbonil}-2,2-dimetilpropil)carbámico, mostrado a continuación, se preparó de la siguiente

imagen4

Preparación del Compuesto 1. Procedimiento A. Una solución de CDI (0,0165 g, 0,10 mmol) y el producto de la Etapa 2e (0,050 g, 0,0728 mmol) en THF (2 ml) se calentó a reflujo durante 30 min y se dejó enfriar hasta ta. Un total de 0,0594 g (0,36 mmol) de 2tiofenosulfonamida (preparada a partir de cloruro de sulfonilo de 2-tiofeno adquirido en Aldrich usando el procedimiento de Steinkopf y Hoepner, Justus Liebigs Ann. Chem., 501, 1933, pág. 174-182), seguido de la adición de una solución de DBU puro (0,025 ml, 0,167 mmol). La reacción se agitó durante 18 h, se diluyó con EtOAc (30 ml) y se lavó con tampón a pH 4,0 (3 x 10 ml), se secó (MgSO4), se concentró y se purificó sobre una placa de CCF preparativa 1000 DM de Analtech (20 X 40 cm, eluida secuencialmente con MeOH al 0% a 6% en CH2CI2) dando el Compuesto 1 (0,0298 g, 49%): RMN de 1H (metanol-d4, 500 MHz) δ 1,02 (s, 9 H), 1,26 (s, 9 H), 1,31-1,32 (m, 1 H), 1,75-1,78 (m, 1 H), 2,03-2,08 (m, 1 H), 2,44-2,53 (m, 1 H), 2,62-2,66 (m, 1 H), 3,91 (s, 3 H), 4,07-4,09 (m, 1 H), 4,23 (s, 1 H), 4,47 (d, J = 12 Hz, 1 H), 4,52-4,56 (m, 1 H), 4,88-4,91 (m, 1 H), 5,11 (d, J = 17 Hz, 1 H), 5,45 (m, 1 H), 5,78-5,90 (m, 1 H), 6,95 (m, 1 H), 7,04 (d, J = 9 Hz, 1 H), 7,19 (s, 1 H), 7,34 (s, 1 H), 7,43-7,65 (m, 4 H), 7,62 (s, 1 H), 8,028,09 (m, 3 H); CL-EM (tiempo de retención: 1,91, Procedimiento D), EM m/z 832 (M++1).

imagen5

Compuesto 2, BOCNH-P3(L-t-BuGly)-P2[(4R)-(2-fenil-7-metoxiquinolin-4-oxo)-Sprolina]-P1 (1R,2S Vinil Acca)-CONH(2-sulfonil-5-clorotiofeno) o la denominación alternativa, Compuesto 2, el isómero P1 (1R,2S) de éster terc-butílico del ácido (1-{4-(7-metoxi-2fenilquinolin-4-iloxi)-2-[1-(5-clorotiofeno-2-sulfonilaminocarbonil)-2-vinil-ciclopropilcarbamoil]pirrolidin-1-carbonil}-2,2-dimetilpropil)carbámico, mostrado anteriormente, se preparó de la siguiente manera.

Preparación del Compuesto 2. Procedimiento B. Una solución de CDI (0,0165 g, 0,10 mmol) y el producto de la Etapa 2e (0,035 g, 0,050 mmol) en THF (2 ml) se calentó a reflujo durante 30 min y se dejó enfriar hasta ta. Un total de 0,0403 g (0,20 mmol) de 5-cloro-2tiofenosulfonamida (preparada a partir de cloruro de 2-tiofeno sulfonilo adquirido en Aldrich y convertido en la sulfonamida primaria de una manera análoga a la del procedimiento de Steinkopf y Hoepner, Justus Liebigs Ann. Chem., 501, 1933, pág. 174-182), seguido de la adición de una solución de DBU puro (0,0194 ml, 0,13 mmol). La reacción se agitó durante 18 h, se diluyó con EtOAc (100 ml) y se lavó con tampón a pH 4,0 (3 x 10 ml), salmuera (10 ml), se secó (MgSO4) y se concentró. El residuo se purificó inicialmente en una columna Isco de 10 g (eluida con Me-OH al 0% a 10%/CH2CI2, seguido de una purificación final sobre una placa de CCF preparativa 1000 DM de Analtech (20 X 40 cM, eluida con MeOH al 2,5% a 5% en CH2CI2) dando el Compuesto 2 (0,0159 g, 37%): RMN de 1H (metanol-d4, 500 MHz) δ 1,03, 1,04 (2s, 9H total), 1,26,1,28 (2s, 9H total), 1,33-1,46 (m, 1 H), 1,76-1,79 (m, 1 H), 2,11 -2,16

5 (m, 1 H), 2,40-2,50 (m, 1 H), 2,69 (dd, J = 14, 7 Hz, 1 H), 3,96 (s, 3 H), 4,04-4,14 (m, 1 H), 4,19-4,24 (m, 1 H), 4,53-4,58 (m, 2 H), 4,97 (d, J = 10 Hz, 1 H), 5,17 (d, J = 17 Hz, 1 H), 5,605,66 (m, 2 H), 7,00 (d, J = 4 Hz, 1 H), 7,13 (dd, J = 9, 2 Hz, 1 H), 7,32 (s, 1 H), 7,40 (d, J = 2 Hz, 1 H), 7,53-7,58 (m, 4 H), 8,04-8,05 (m, 2 H), 8,13-8,17 (m, 1 H); CL-EM (tiempo de retención: 1,76, Procedimiento A), EM m/z 866 (M++1).

imagen6

Ejemplo 5

Compuesto 3, BOCNH-P3(L-t-BuGly)-P2[(4R)-(2-fenil-7-metoxiquinolin-4-oxo)-S

prolina]-P1 (1R,2S Vinil Acca)-CONH(2-sulfonil-5-nitrotiofeno) o la denominación alternativa,

Compuesto 3, el isómero P1 (1R,2S) de éster terc-butílico del ácido (1-{4-(7-metoxi-2

25 fenilquinolin-4-iloxi)-2-[1-(5-nitrotiofeno-2-sulfonilaminocarbonil)-2-vinilciclopropilcarbamoil]pirrolidin-t-carbonil}-2,2-dimetilpropil)carbámico, mostrado anteriormente, se preparó de una manera análoga a la del compuesto 2 pero usando 5-nitrotiofeno-2sulfonamida adquirida en Salor como la sulfonamida primaria: CL-EM (tiempo de retención: 5,19, Procedimiento E), EM m/z 878 (M++1).

30

imagen7

Compuesto 4, BOCNH-P3(L-t-BuGly)-P2[(4R)-(2-fenil-7-metoxiquinolin-4-oxo)-Sprolina]-P1 (1R,2S Vinil Acca)-CONH(2-sulfonil-5-bromotiofeno) o la denominación alternativa, Compuesto 4, el isómero P1 (1R,2S) de éster terc-butílico del ácido (1-{4-(7-metoxi-2fenilquinolin-4-iloxi)-2-[1-(5-bromotiofeno-2-sulfonilaminocarbonil)-2-vinil-ciclopropilcarbamoil] pirrolidin-1-carbonil}-2,2-dimetilpropil)carbámico, mostrado anteriormente, se preparó de una manera análoga a la del compuesto 2 pero usando 5-bromotiofeno-2-sulfonamida adquirida en Oakwood como la sulfonamida primaria: RMN de 1H (metanol-d4, 300 MHz) δ 1,02 (s, 9 H), 1,26 (s, 9 H), 1,43 (m, 1 H), 1,78 (dd, J = 8, 5 Hz, 1 H), 2,05-2,11 (m, 1 H), 2,46-2,55 (m, 1 H), 2,63-2,72 (m, 1 H), 3,91, 3,93 (2s, 3 H), 4,05-4,14 (m, 1 H), 4,23 (s, 1 H), 4,46-4,62 (m, 2 H), 4,90-4,94 (m, 1 H), 5,13 (d, J = 17,2 Hz, 1 H), 5,43-5,48 (m, 1 H), 5,66-5,88 (m, 1 H), 6,96-6,99 (m, 1 H), 7,03-7,06 (m, 1 H), 7,20 (s, 1 H), 7,34-7,37 (m, 2 H), 7,47-7,55 (m, 3 H), 8,01-8,11 (m, 3 H). EMAR calc. para C42H49N5O9S2: 910,2155, encontrado 910,2164. CL (tiempo de retención: 1,75, Procedimiento A).

imagen1

Ejemplo 7

Compuesto 5, BOCNH-P3(L-t-BuGly)-P2[(4R)-(2-fenil-7-metoxiquinolin-4-oxo)-Sprolina]-P1 (1R,2S VinilAcca)-CONH(2-sulfonil-5-[4-clorofenilsulfanil]tiofeno) o la denominación alternativa, Compuesto 5, el isómero P1 (1R,2S) de éster terc-butílico del ácido {1-[2-{1-[5-(4clorofenilsulfanil)-tiofeno-2-sulfonilamino-carbonil]-2-vinil-ciclopropilcarbamoil}-4-(7-metoxi-2fenil-quinolin-4-iloxi)-pirrolidin-1-carbonil]-2,2-dimetilpropil}carbámico, mostrado anteriormente, se preparó de una manera análoga a la del compuesto 2 pero usando 5-bromotiofeno-2sulfonamida adquirida en Maybridge como la sulfonamida primaria: RMN de 1H (metanol-d4, 300 MHz) δ 1,01 (s, 9 H), 1,27 (s, 9 H), 1,43 (m, 1 H), 1,77 (dd, J = 8, 5 Hz, 1 H), 2,00-2,10 (m, 1 H), 2,50-2,63 (m, 2 H), 3,92 (s, 3 H), 4,07-4,10 (m, 1 H), 4,22 (s, 1 H), 4,44-4,58 (m, 2 H), 5,12 (d, J = 17 Hz, 1 H), 5,43 (m, 1 H), 5,76-5,89 (m, 1 H), 7,02-7,23 (m, 7 H), 7,35 (m, 1 H), 7,45-7,53 (m, 4 H), 8,01-8,11 (m, 3 H). EMAR calc. para C48H53CIN5O9S3: 974,2694, encontrado 974,2696. CL (tiempo de retención: 1,95, Procedimiento A).

imagen1

Ejemplo 8

Compuesto 6, BOCNH-P3(L-t-BuGly)-P2[(4R)-(2-fenil-7-metoxiquinolin-4-oxo)-Sprolina]-P1 (1R,2S VinilAcca)-CONH(2-sulfonil-4-cloro-5-bromotiofeno) o la denominación alternativa, Compuesto 6, el isómero P1 (1R,2S) de éster terc-butílico del ácido {1-[2-{1-[5bromo-4-clorotiofeno-2-sulfonilamino-carbonil]-2-vinilciclopropilcarbamoil}-4-(7-metoxi-2-fenilquinolin-4-iloxi)pirrolidin-1-carbonil]-2,2-dimetilpropil}carbámico, mostrado anteriormente, se preparó de una manera análoga a la del compuesto 2 pero usando 5-bromo-4-cloro-tiofeno-2sulfonamida adquirida en Maybridge como la sulfonamida primaria: RMN de 1H (metanol-d4, 300 MHz) δ 1,02 (s, 9 H), 1,27 (s, 9 H), 1,43 (m, 1 H), 1,78 (dd, J = 8, 5 Hz, 1 H), 2,00-2,10 (m, 1 H), 2,49-2,58 (m, 1 H), 2,69 (dd, J = 14, 8 Hz, 1 H), 3,91 (s, 3 H), 4,09 (m, 1 H), 4,22 (s, 1 H), 4,47 (d, J = 12 Hz, 2 H), 4,58 (t, J = 9 Hz, 1 H), 4,94 (dd, J = 10, 2 Hz, 1 H), 5,14 (d, J = M Hz, 1 H), 5,48 (m, 1 H), 5,78-5,91 (m, 1 H), 7,04 (dd, J = 9,2, 2,2 Hz, 1 H), 7,21 (s, 1 H), 7,34-7,40 (m, 2 H), 7,44-7,53 (m, 3 H), 8,01-8,07 (m, 3 H). EMAR calc. para C42H48BrCIN5O9S2: 944,1765, encontrado 944,1763. CL (tiempo de retención: 1,87, Procedimiento A).

imagen8

Compuesto 7, BOCNH-P3(L-t-BuGly)-P2[(4R)-(2-fenil-7-metoxiquinolin-4-oxo)-Sprolina]-P1 (1R,2S VinilAcca)-CONH(2-sulfonil-4-bromo-5-clorotiofeno) o la denominación alternativa, Compuesto 7, el isómero P1 (1R,2S) de éster terc-butílico del ácido {1-[2-{1-[4bromo-5-clorotiofeno-2-sulfonilamino-carbonil]-2-vinilciclopropilcarbamoil}-4-(7-metoxi-2-fenilquinolin-4-iloxi)pirrolidin-1-carbonil]-2,2-dimetilpropil}carbámico, mostrado anteriormente, se preparó de una manera análoga a la del compuesto 2 pero usando 4-bromo-5-cloro-tiofeno-2sulfonamida adquirida en Maybridge como la sulfonamida primaria: RMN de 1H (metanol-d4, 300 MHz) δ 1,02 (s, 9 H), 1,27 (s, 9 H), 1,43 (m, 1 H), 1,78 (dd, J = 7,7, 5,1 Hz, 1 H), 2,03-2,12 (m, 1 H), 2,49-2,59 (m, 1 H), 2,66-2,78 (m, 1 H),3,91 (s, 3 H), 4,09-4,12 (m, 1 H), 4,22 (s, 1 H), 4,48 (d, J = 11,7 Hz, 1 H), 4,56 (t, J = 8,6 Hz, 1 H), 4,94 (dd, J = 10,4, 1,7 Hz, 2 H), 5,14 (d, J = 17,2 Hz, 1 H), 5,48 (m, 1 H), 5,79-5,91 (m, 1 H), 7,04 (dd, J = 9,1, 2,6 Hz, 1 H), 7,21 (s, 1 H), 7,34-7,55 (m, 5 H), 8,01-8,11 (m, 3 H). EMAR calc. para C42H48BrCIN5O9S2: 944,1765, encontrado 944,1763. CL-EM (tiempo de retención: 1,88, Procedimiento A).

Ejemplo 10

imagen1

Compuesto 8, BOCNH-P3(L-t-BuGly)-P2[(4R)-(2-fenil-7-metoxiquinolin-4-oxo)-S

prolina]-P1 (1R,2S VinilAcca)-CONH(2-sulfonil-4,5-diclorotiofeno) o la denominación alternativa, Compuesto 8, el isómero P1 (1R,2S) de éster terc-butílico del ácido {1-[2-{1-[4,5diclorotiofeno-2-sulfonilaminocarbonil]-2-vinilciclopropilcarbamoil}-4-(7-metoxi-2-fenil-quinolin-4iloxi)pirrolidin-1-carbonil]-2,2-dimetilpropil}carbámico, mostrado anteriormente, se preparó de 5 una manera análoga a la del compuesto 2 pero usando 4,5-diclorotiofeno-2-sulfonamida adquirida en Maybridge como la sulfonamida primaria: RMN de 1H (metanol-d4, 300 MHz) δ 1,02 (s, 9 H), 1,27 (s, 9 H), 1,44 (m, 1 H), 1,78 (dd, J = 7,7, 5,1 Hz, 1 H), 2,00-2,12 (m, 1 H), 2,51-2,61 (m, 1 H), 2,67-2,81 (m, 1 H). 3,92 (s, 3 H), 4,09-4,13 (m, 1 H), 4,22 (s, 1 H), 4,48 (d, J = 11,3 Hz, 1 H), 4,57 (t, J = 8,4 Hz, 1 H), 4,94 (dd, J = 10,4, 2 Hz, 2 H), 5,15 (d, d, J = 17,2, 10 1,5 Hz, 1 H), 5,50 (m, 1 H) 5,78-5,91 (m, 1 H), 7,05 (dd, J = 9,2, 2,2 Hz, 1 H), 7,23 (s, 1 H), 7,35-7,41 (m, 2 H), 7,47-7,55 (m, 3 H), 8,01 -8,12 (m, 3 H). EMAR calc. para C42H48Cl2N5O9S2:

imagen9

Compuesto 9, BOCNH-P3(L-t-BuGly)-P2[(4R)-(2-fenil-7-metoxiquinolin-4-oxo)-Sprolina]-P1 (1R,2S VinilAcca)-CONH(5-sulfonil-2,4-dimetiltiazol) o la denominación alternativa,

25 Compuesto 9, el isómero P1 (1R,2S) de éster terc-butílico del ácido {1-[2-{1-[2,4-dimetiltiazol-5sulfonilaminocarbonil]-2-vinilciclopropilcarbamoil}-4-(7-metoxi-2-fenil-quinolin-4-iloxi)pirrolidin-1carbonil]-2,2-dimetilpropil}carbámico, mostrado anteriormente, se preparó de una manera análoga a la del compuesto 2 pero usando 2,4-dimetil-1,3-tiazol-5-sulfonamida adquirida en Maybridge como la sulfonamida primaria: EMAR calc. para C43H53N6O9S2: 861,3315,

30 encontrado 861,3340. CL-EM (tiempo de retención: 1,64, Procedimiento A), EM m/z 861 (M++1).

imagen1

Ejemplo 12

Compuesto 10, BOCNH-P3(L-t-BuGly)-P2[(4R)-(2-fenil-7-metoxiquinolin-4-oxo)-Sprolina]-P1(1R,2SVinilAcca)-CONH(5-metilpiridin-2-sulfonilo) o la denominación alternativa, Compuesto 10, el isómero P1 (1R,2S) de éster terc-butílico del ácido (1 -{4-(7-Metoxi-2-fenilquinolin-4-iloxi)-2-[1-(5-metilpiridin-2-sulfonilaminocarbonil)-2-vinilciclopropilcarbamoil]pirrolidin1-carbonil}-2,2-dimetilpropil)carbámico, mostrado anteriormente, se preparó de una manera análoga a la del compuesto 2 pero usando 5-metil-2-piridinasulfonamida adquirida en Fluka como la sulfonamida primaria: RMN de 1H (metanol-d4, 300 MHz) δ 1,02 (s, 9 H), 1,30 (s, 9 H), 1,41 (m, 1 H), 1,69-1,80 (m, 1 H), 2,04-2,12 (m, 1 H), 2,22 (s, 3 H), 2,33-2,50 (m, 2 H), 3,92 (s, 3 H), 4,05 (m, 1 H), 4,20 (s, 1 H), 4,41-4,57 (m, 2 H), 4,99-5,23 (m, 1 H), 5,43 (m, 1 H), 5,785,91 (m, 1 H), 7,01-7,09 (m, 1 H), 7,18 (s, 1 H), 7,36-7,39 (m, 1 H), 7,45-7,56 (m, 3 H), 7,647,67 (m, 1 H), 7,72-7,79 (m, 1 H), 8,03-8,24 (m, 4 H). CL-EM (tiempo de retención: 1,66, Procedimiento D), EM m/z 841 (M++1).

imagen10

Compuesto 11, BOCNH-P3(L-t-BuGly)-P2[(4R)-(2-fenil-7-metoxiquinolin-4-oxo)-Sprolina]-P1(1R,2SVinilAcca)-CONH(4-sulfonil-2-acetilamino-5-metiltiazol) o la denominación alternativa, Compuesto 11, el isómero P1 (1R,2S) de éster terc-butílico del ácido {1-[2-{1-[2acetilamino-5-metiltiazol-4-sulfonilaminocarbonil]-2-vinilciclopropil-carbamoil}-4-(7-metoxi-2fenilquinolin-4-iloxi)pirrolidin-1-carbonil]-2,2-dimetilpropil}carbámico, mostrado anteriormente, se preparó de una manera análoga a la del compuesto 2 pero usando 2-acetilamino-5metiltiazol-4-sulfonamida (preparada a partir de cloruro de 2-acetilamino-5-metiltiazol-4sulfonilo adquirido en Aldrich y convertido en la sulfonamida primaria de una manera análoga a la del procedimiento de Steinkopf y Hoepner, Justus Liebigs Ann. Chem., 501, 1933, pág. 174182): RMN de 1H (metanol-d4, 300 MHz) δ 1,05 (s, 9 H), 1,29 (s, 9 H), 1,35-1,44 (m, 1 H), 1,731,80 (m, 1 H), 1,92-2,09 (m, 1 H), 2,21 (s, 3 H), 2,49 (s, 3 H), 2,54-2,62 (m, 1 H), 2,71-2,79 (m, 1 H), 3,95 (s, 3 H), 4,11-4,16 (m, 1 H), 4,24 (m, 1 H), 4,50-4,68 (m, 2 H), 4,91-5,01 (m, 1 H), 5,17 (d, J = 17 Hz, 1 H), 5,54 (m, 1 H), 5,67-6,01 (m, 1 H), 7,08 (dd, J = 9, 2 Hz, 1 H), 7,26 (s, 1 H), 7,40 (d, J = 2 Hz, 1 H), 7,47-7,57 (m, 3 H), 8,02, 8,04 (m, 2 H), 8,11 (d, J = 9 Hz, 1 H); EMAR m/z (M+H)+ calc. para C44H54N7S2O10: 904,3374, encontrado 904,3374. CL (tiempo de

imagen11

Compuesto 12, BOCNH-P3(L-t-BuGly)-P2[(4R)-(2-fenil-7-metoxiquinolin-4-oxo)-Sprolina]-P1(1R,2SVinilAcca)-CONH(2-sulfonil-5-Acetilamino-[1,3,4]tiadiazol) o la denominación alternativa, Compuesto 12, el isómero P1 (1R,2S) de éster terc-butílico del ácido {1-[2-[1-(5acetilamino-[1,3,4]tiadiazol-2-sulfonilaminocarbonil)-2-vinilciclopropilcarbamoil]-4-(7-metoxi-2fenilquinolin-4-iloxi)-pirrolidin-1-carbonil]-2,2-dimetilpropil}carbámico, mostrado a continuación, se preparó de una manera análoga a la del compuesto 2 pero usando acetazolamida adquirida en Aldrich como la sulfonamida primaria: RMN de 1H (metanol-d4, 300 MHz) δ 1,03 (s, 9 H), 1,27 (s, 9 H), 1,43 (m, 1 H), 1,64-2,10 (m, 2 H), 2,19 (s, 3 H), 2,44-2,89 (m, 2 H), 3,93 (s, 3 H), 4,12-4,24 (m, 2 H), 4,49 (d, J = 12 Hz, 1 H), 4,55-4,61 (m, 1 H), 5,11 (d, J = 17 Hz, 1 H), 5,55 (m, 1 H), 5,72-5,87 (m, 1 H), 7,05-7,14 (m, 1 H), 7,26 (s, 1 H), 7,37 (m, 1 H), 7,44-7,58 (m, 3 H), 7,97-8,13 (m, 3 H); EMAR m/z (M+H)+ calc. para C42H51N8S2O10: 891,3170, encontrado 891,3152. CL-EM (tiempo de retención: 1,58, Procedimiento A), EM m/z 891 (M++1).

imagen12

Compuesto 13, BOCNH-P3(L-t-BuGly)-P2[(4R)-(2-fenil-7-metoxiquinolin-4-oxo)-Sprolina]-P1(1R,2SVinilAcca)-CONH(1,1-Dioxotetrahidro-1H-1□6-tiofeno-3(R/S)sulfonilaminocarbonilo) o la denominación alternativa, Compuesto 13, el isómero P1 (1R,2S) de éster terc-butílico del ácido {1-[2-[1-(1,1-dioxotetrahidro-1H-1□6-tiofeno-3(R/S)sulfonilaminocarbonil)-2-vinilciclopropilcarbamoil]-4-(7-metoxi-2-fenil-quinolin-4-iloxi) pirrolidin-1carbonil]-2,2-dimetilpropil} carbámico, mostrado anteriormente, se preparó de una manera análoga a la del compuesto 2 pero usando 1,1-dioxotetrahidro-1H-1□6-tiofeno-3(R/S)sulfonamida adquirida en Maybridge como la sulfonamida primaria: RMN de 1H (metanol-d4, 300 MHz) δ 1,04 (s, 9 H), 1,29 (s, 9 H), 1,44 (m, 1 H), 1,72-1,80 (m, 1 H), 2,01-2,10 (m, 1 H), 2,43-2,64 (m, 3 H), 2,69-2,76 (m, 1 H), 3,04-3,52 (m, 4 H), 3,92 (s, 3 H), 3,97-4,11 (m, 2 H), 4,24 (s, 1 H), 4,48-4,60 (m, 2 H), 5,01 (d, J = 12 Hz, 1 H), 5,18 (d, J = 17 Hz, 1 H), 5,50 (m, 1 H), 5,85-6,00 (m, 1 H), 7,03-7,10 (m, 1 H), 7,24 (s, 1 H), 7,36 (m, 1 H), 7,45-7,55 (m, 3 H), 8,03-8,12 (m, 3 H); EMAR m/z(M+H)+ calc. para C42H54N5S2O11: 868,3261, encontrado 868,3256. CL-EM (tiempo de retención: 1,48, Procedimiento A), EM m/z 868 (M++1).

imagen13

Compuesto 14, BOCNH-P3(L-t-BuGly)-P2[(4R)-(2-fenil-7-metoxiquinolin-4-oxo)-S

prolina]-P1(1R,2SVinilAcca)-CONH(-(3,5-Dimetilisoxazol-4-sulfonilo) o la denominación alternativa, Compuesto 14, el isómero P1 (1R,2S) de éster terc-butílico del ácido {1-[2-[l-(3,5dimetilisoxazol-4-sulfonilaminocarbonil)-2-vinil-ciclopropilcarbamoil]-4-(7-metoxi-2-fenil-quinolin4-iloxi)-pirrolidin-1-carbonil]-2,2-dimetil-propil}-carbámico, mostrado anteriormente, se preparó de una manera análoga a la del compuesto 2 pero usando 3,5-dimetilisoxazol-4-sulfonamida adquirida en Maybridge como la sulfonamida primaria: RMN de 1H (metanol-d4, 300 MHz) δ 1,04 (s, 9 H), 1,26 (s, 9 H), 1,43 (m, 1 H), 1,68-1,79 (m, 1 H), 1,95-2,06 (m, 1 H), 2,35 (s, 3 H), 2,58 (s, 3 H), 2,50-2,60 (m, 1 H), 2,66-2,73 (m, 1 H), 3,94 (s, 3 H), 4,08-4,16 (m, 1 H), 4,23 (s, 1 H), 4,50-4,57 (m, 2 H), 4,91-4,95 (m, 1 H), 5,11-5,19 (m, 1 H), 5,48 (m, 1 H), 5,48-5,77 (m, 1 H), 7,05-7,14 (m, 1 H), 7,26 (m, 1 H), 7,39 (m, 1 H), 7,46-7,57 (m, 3 H), 8,05-8,13 (m, 3 H); EMAR m/z (M+H)+ calc. para C43H53N6SO10: 845,3544, encontrado 845,3541. CL-EM (tiempo de retención: 1,66, Procedimiento A), EM m/z 845(M++1).

imagen14

Compuesto 15, BOCNH-P3(L-t-BuGly)-P2[(4R)-(2-fenil-7-metoxiquinolin-4-oxo)-Sprolina]-P1(1R,2SVinilAcca)-CONH(6-Etoxibenzotiazol-2-sulfonilo) o la denominación alternativa, Compuesto 15, el isómero P1 (1R,2S) de éster terc-butílico del ácido {1-[2-[1-(6etoxibenzotiazol-2-sulfonilaminocarbonil)-2-vinil-ciclopropilcarbamoil]-4-(7-metoxi-2fenilquinolin-4-iloxi)-pirrolidin-1-carbonil]-2,2-dimetilpropil}-carbámico, mostrado anteriormente, se preparó de una manera análoga a la del compuesto 2 pero usando 6-etoxi-2benzotiazolsulfonamida adquirida en Aldrich como la sulfonamida primaria: RMN de 1H (metanol-d4, 300 MHz) δ 1,01 (s, 9 H), 1,28 (s, 9 H), 1,25-1,37 (m, 4 H), 1,76 (dd, J = 7,5, 4,9 Hz, 1 H), 2,00-2,22 (m, 2 H), 2,35 (m, 1 H), 3,83-4,06 (m, 3 H), 3,93 (s, 3 H), 4,19 (s, 1 H), 4,34-4,55 (m, 2 H), 5,10 (d, J = 17,2 Hz, 1 H), 5,43 (m, 1 H), 5,79-5,99 (m, 1 H), 6,79-6,88 (m, 1 H), 7,02-7,14 (m, 2 H), 7,21 (s, 1 H), 7,37 (m, 1 H), 7,43-7,56 (m, 4 H), 7,98-8,08, (m, 3 H). EMAR calc. para C47H55N6O10S2 927,3421 encontrado 927,3427. CL (tiempo de retención: 1,80, Procedimiento A).

imagen1

Ejemplo 18

Compuesto 16, BOCNH-P3(L-t-BuGly)-P2[(4R)-(2-fenil-7-metoxiquinolin-4-oxo)-Sprolina]-P1(1R,2SVinilAcca)-CONH(5-Cloro-4-nitrotiofeno-2-sulfonilo) o la denominación alternativa, Compuesto 16, el isómero P1 (1R,2S) de éster terc-butílico del ácido {1-[2-[1-(5cloro-4-nitro-tiofeno-2-sulfonilaminocarbonil)-2-vinilciclopropilcarbamoil]-4-(7-metoxi-2-fenilquinolin-4-iloxi)-pirrolidin-1-carbonil]-2,2-dimetil-propil} carbámico, mostrado anteriormente, se preparó de una manera análoga a la del compuesto 2 pero usando 5-cloro-4-nitrotiofeno-2sulfonamida adquirida en Buttpark como la sulfonamida primaria: EMAR calc. para C42H48ClN6O11S2: 911,2511, encontrado 911,2494. CL (tiempo de retención: 1,75, Procedimiento A).

imagen15

Compuesto 17, BOCNH-P3(L-t-BuGly)-P2[(4R)-(2-fenil-7-metoxiquinolin-4-oxo)-Sprolina]-P1(1R,2SVinilAcca)-CONH(5-(2-metil-5-trifluorometil-2H-pirazol-3-il)tiofeno-2-sulfonilo)

o la denominación alternativa, Compuesto 17, el isómero P1 (1R,2S) de éster terc-butílico del ácido [1-(4-(7-metoxi-2-fenil-quinolin-4-iloxi)-2-{1-[5-(2-metil-5-trifluorometil-2H-pirazol-3il)tiofeno-2-sulfonilaminocarbonil]-2-vinil-ciclopropilcarbamoil}-pirrolidin-1-carbonil)-2,2-dimetilpropil} carbámico, mostrado anteriormente, se preparó de una manera análoga a la del compuesto 2 pero usando 5-(2-metil-5-trifluorometil-2H-pirazol-3-il)tiofeno-2-sulfonamida adquirida en Buttpark como la sulfonamida primaria: RMN de 1H (metanol-d4, 300 MHz) δ 1,02 (s, 9 H), 1,26 (s, 9 H), 1,42 (m, 1 H), 1,78 (dd, J = 7,7, 5,1 Hz, 1 H), 2,10 (c, J = 8,8 Hz, 2 H), 2,55-2,70 (m, 2 H), 3,84-4,00 (m, 6 H), 4,12 (m, 1 H), 4,22 (m, 1 H), 4,45-4,59 (m, 2 H), 4,91 (d, J = 12 Hz, 1 H), 5,14 (d, J = 16,8 Hz, 1 H), 5,48 (s, 1 H), 5,82-5,94 (m, 1 H), 6,70 (m, 1 H), 7,02-7,07 (m, 1 H), 7,17-7,21 (m, 2 H), 7,34 (m, 1 H), 7,44-7,53 (m, 3 H), 7,61 (d, J = 4,0 Hz, 1 H), 8,00-8,11 (m, 3 H). EMAR calc. para C47F3H53N7O9S2 980,3298 encontrado 980,3308. CL (tiempo de retención: 1,78, Procedimiento A).

Ejemplo 20

Preparación de Intermedios P1 adicionales para su incorporación en los compuestos de Fórmula I.

Los intermedios P1 descritos en esta sección pueden usarse para preparar compuestos de Fórmula I mediante los procedimientos descritos en el presente documento.

1. Resolución de éster etílico del ácido N-Boc-(1R,2S)/(1S,2R)-1-amino-2vinilciclopropano carboxílico

imagen1

Resolución A

A una solución acuosa de tampón fosfato sódico (0,1 M, 4,25 litros ("l"), pH 8) en un reactor encamisado de 12 litros, mantenida a 39ºC, y agitada a 300 rpm se le añadieron 511 gramos de Acalase 2.4L (aproximadamente 425 ml) (Novozimas North America Inc.). Cuando la temperatura de la mezcla alcanzó los 39ºC, el pH se ajustó a 8,0 mediante la adición de NaOH al 50% en agua. Una solución del éster etílico del ácido N-Boc-(1R,2S)/(1S,2R)-1amino-2-vinilciclopropano carboxílico racémico (85 g) en 850 ml de DMSO se añadió después

durante un periodo de 40 min. La temperatura de reacción se mantuvo después a 40ºC durante 24,5 h, tiempo durante el cual el pH de la mezcla se ajustó a 8,0 en los puntos temporales 1,5 h y 19,5 h usando NaOH al 50% en agua. Después de 24,5 h, el exceso enantiomérico del éster se determinó que era del 97,2%, y la reacción se enfrió a temperatura ambiente (26ºC) y 5 se agitó durante una noche (16 h) después de lo cual el exceso enantiomérico del éster se determinó que era del 100%. El pH de la mezcla de reacción se ajustó después a 8,5 con NaOH al 50% y la mezcla resultante se extrajo con MTBE (2 x 2 l). El extracto de MTBE combinado se lavó después con NaHCO3 al 5% (3 x 100 ml), agua (3 x 100 ml), y se evaporó al vacío dando el éster etílico del ácido N-Boc-(1R,2S)/-1-amino-2-vinil-ciclopropano carboxílico

10 enantioméricamente puro en forma de un sólido amarillo (42,55 g; pureza: 97% a 210 nm, que no contenía ácido; exceso enantiomérico del 100% ("ee").

La fase acuosa del procedimiento de extracción se acidificó después a pH 2 con H2SO4 al 50% y se extrajo con MTBE (2 x 2 l). El extracto de MTBE se lavó con agua (3 x 100 ml) y se evaporó dando el ácido en forma de un sólido amarillo (42,74 g; pureza: 99% a 210 nm, que no

15 contenía éster).

imagen1

éster 1R, 2S ácido 1S, 2R

éster: ácido

Espec. Masas Alta Resolución: (+) ESI, C13H22NO4, [M+H]+ , calc. 256,1549, encontrado 256,1542 (-) ESI, C11H16NO4, [M-H] , calc. 226,1079, encontrado 226,1089

RMN: desplazamiento químico observado Disolvente: CDCl3 (protones δ 7,24 ppm, C-13 δ 77,0 ppm) Bruker DRX-500C: protón 500,032 MHz, carbono 125,746 MHz

Posición: Protón (patrón) ppm C-13 ppm Protón (patrón) ppm C-13 ppm

1: -- 40,9 -- 40,7

2: 2,10 (c, J = 9,0 Hz) 34,1 2,17 (c, J = 9,0 Hz) 35,0

3a: 1,76 (a) 23,2 1,79 (a) 23,4

3b: 1,46 (a) 1,51 (a)

Posición: Protón (patrón) ppm C-13 ppm Protón (patrón) ppm C-13 ppm

4: -- 170,8 -- 175,8

5: 5,74 (ddd, J = 9,0, 10,0, 17,0 Hz) 133,7 5,75 (m) 133,4

6a: 5,25 (d, J = 17,0 Hz) 117,6 5,28 (d, J = 17,0 Hz) 118,1

6b: 5,08 (dd, J = 10,0, 1,5 Hz) 5,12 (d, J = 10,5 Hz)

7: -- 155,8 -- 156,2

8: -- 80,0 -- 80,6

9: 1,43 (s) 28,3 1,43 (s) 28,3

10: 4,16 (m) 61,3 -- --

11: 1,23 (t, J = 7,5 Hz) 14,2 --

Resolución B

A 0,5 ml de tampón Heps•Na 100 mM (pH 8,5) en un pocillo de una placa de 24 pocillos (capacidad: 10 ml/pocillo), se le añadieron 0,1 ml de Savinase 16.0L (proteasa de Bacillus 5 clausii) (Novozimas North America Inc.) y una solución del éster etílico del ácido N-Boc(1R,2S)/(1S,2R)-1-amino-2-vinilciclopropano carboxílico racémico (10 mg) en 0,1 ml de DMSO. La placa se cerró herméticamente y se incubó a 250 rpm a 40ºC. Después de 18 h, se determinó que el exceso enantiomérico del éster era del 44,3% de la siguiente manera: 0,1 ml de la mezcla de reacción se retiró y se mezcló bien con 1 ml de etanol; después de la

10 centrifugación, 10 microlitros ("µl") del sobrenadante se analizaron con la HPLC quiral. A la mezcla de reacción restante, se le añadieron 0,1 ml de DMSO, y la placa se incubó durante 3 días más a 250 rpm a 40ºC, después de lo cual se añadieron cuatro ml de etanol al pocillo. Después de la centrifugación, se analizaron 10 µl del sobrenadante con la HPLC quiral y se determinó que el exceso enantiomérico del éster era del 100%.

15 Resolución C A 0,5 ml de tampón Heps•Na 100 mM (pH 8,5) en un pocillo de una placa de 24 pocillos (capacidad: 10 ml/pocillo), se le añadieron 0,1 ml de Esperase 8.0L, (proteasa de Bacillus halodurans) (Novozimas North America Inc.) y una solución del éster etílico del ácido N-Boc(1R,2S)/(1S,2R)-1-amino-2-vinilciclopropano carboxílico racémico (10 mg) en 0,1 ml de DMSO.

The placa se cerró herméticamente y se incubó a 250 rpm a 40ºC. Después de 18 horas, se determinó que el exceso enantiomérico del éster era del 39,6% de la siguiente manera: 0,1 ml de la mezcla de reacción se retiraron y se mezclaron bien con 1 ml de etanol; después de la centrifugación, se analizaron 10 µl del sobrenadante con la HPLC quiral. A la mezcla de

5 reacción restante, se le añadieron 0,1 ml de DMSO, y la placa se incubó durante 3 días más a 250 rpm a 40ºC, después de lo cual se añadieron cuatro ml de etanol al pocillo. Después de la centrifugación, se analizaron 10 µl del sobrenadante con la HPLC quiral y se determinó que el exceso enantiomérico del éster era del 100%.

El análisis de las muestras se realizó de la siguiente manera:

10 1) Preparación de la muestra: aproximadamente 0,5 ml de la mezcla de reacción se mezcló bien con 10 volúmenes de EtOH. Después de la centrifugación, se inyectaron 10 µl del sobrenadante en la columna de HPLC. 2) Determinación de la conversión: Columna: YMC ODS A, 4,6 x 50 mm, S-5 µm

15 Disolvente: A, HCl 1 mM en agua; B, MeCN Gradiente: B al 30% durante 1 min; B al 30% a 45% durante 0,5 min; B al 45% durante 1,5 min; B al 45% a 30% durante 0,5 min. Caudal: 2 ml/min Detección UV: 210 nm

20 Tiempo de retención: ácido, 1,2 min; éster, 2,8 min. 3) Determinación del exceso enantiomérico para el éster: Columna: CHIRACEL OD-RH, 4,6 x 150 mm, S-5 µm Fase móvil: MeCN/HClO4 50 mM en agua (67/33) Caudal: 0,75 ml/min.

25 Detección UV: 210 nm. Tiempo de retención: isómero (1S, 2R) como ácido: 5,2 min; Racemato: 18,5 min y 20,0 min; isómero (1R, 2S) como éster: 18,5 min.

30 2. Preparación de éster etílico del ácido N-Boc-(1R,2S)-1-amino-2ciclopropilciclopropano carboxílico

imagen1

Una solución de ácido N-Boc-(1R,2S)-1-amino-2-vinilciclopropano carboxílico (255 mg, 1,0 mmol) en éter (10 ml) se trató con acetato de paladio (5 mg, 0,022 mmol). La solución de color naranja/rojo se puso en una atmósfera de N2. Un exceso de diazometano en éter se añadió gota a gota durante el transcurso de 1 h. La solución resultante se agitó a ta durante 18

h. El exceso de diazometano se retiró usando una corriente de nitrógeno. La solución resultante se concentró por evaporación rotatoria dando el producto bruto. La cromatografía ultrarrápida (EtOAc al 10%/hexano) proporcionó 210 mg (78%) de éster etílico del ácido N-Boc(1R,2S)-1-amino-2-ciclopropilciclopropano carboxílico en forma de un aceite incoloro. CL-EM (tiempo de retención: 2,13, similar al procedimiento A excepto: tiempo del gradiente 3 min, columna Xterra EM C18 S7 3,0 x 50 mm), EM m/e 270 (M++1).

3.: El ácido 1-terc-butoxicarbonilamino-ciclopropano-carboxílico está disponible en

el mercado

4.: Preparación de clorhidrato del éster metílico del ácido 1aminociclobutanocarboxílico

imagen1

Se disolvió ácido 1-aminociclobutanocarboxílico (100 mg, 0,869 mmol) (Tocris) en 10 ml de MeOH, se burbujeó HCl gas durante 2 h. La mezcla de reacción se agitó durante 18 h, y después se concentró al vacío dando 144 mg de un aceite amarillo. La trituración con 10 ml de éter proporcionó 100 mg del producto del título en forma de un sólido blanco. RMN de 1H (CDCl3) δ 2,10-2,25 (m, 1 H), 2,28-2,42 (m, 1 H), 2,64-2,82 (m, 4 H), 3,87 (s, 3 H), 9,21 (s a, 3 H).

5. Preparación del éster terc-butílico del ácido (1R,2R)/(1S,2S) 1-Amino-2etilciclopropanocarboxílico racémico, mostrado a continuación.

imagen1

Etapa 1: Preparación de éster di-terc-butílico del ácido 2-etilciclopropano-1,1-dicarboxílico, mostrado a continuación.

imagen1

A una suspensión de cloruro de benciltrietilamonio (21,0 g, 92,2 mmol) en una solución acuosa de NaOH al 50% (92,4 g en 185 ml H2O) se le añadió 1,2-dibromobutano (30,0 g, 138,9 mmol) y di-terc-butilmalonato (20,0 g, 92,5 mmol). La mezcla de reacción se agitó vigorosamente 18 h a ta, añadiéndose después una mezcla de hielo y agua. El producto bruto se extrajo con CH2CI2 (3 x) y se lavó secuencialmente con agua (3 x), salmuera y los extractos orgánicos se combinaron. La fase orgánica se secó (MgSO4), se filtró y se concentró al vacío. El residuo resultante se cromatografió ultrarrápidamente (100 g SiO2, Et2O al 3% en hexano) dando el producto del título (18,3 g, 67,8 mmol, rendimiento del 73%) que se usó directamente en la siguiente reacción. Etapa 2: Preparación de éster terc-butílico del ácido 2-etilciclopropano-1,1-dicarboxílico

racémico, mostrado a continuación.

imagen1

El producto de la Etapa 1 (18,3 g, 67,8 mmol) se añadió a una suspensión de tercbutóxido potásico (33,55 g, 299,0 mmol) en éter seco (500 ml) a 0ºC, seguido de H2O (1,35 ml, 75,0 mmol) y se agitó vigorosamente durante una noche a ta. La mezcla de reacción se vertió en una mezcla de hielo y agua y se lavó con éter (3 x). La fase acuosa se acidificó con una solución ac. al 0% de ácido cítrico a 0ºC y se extrajo con EtOAc (3 x). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con agua (2 x), salmuera, se secaron (MgSO4) y se concentraron al vacío dando el producto del título en forma de un aceite amarillo pálido (10 g, 46,8 mmol, rendimiento del 69%). Etapa 3: Preparación de éster terc-butílico del ácido (1R,2R)/(1S,2S) 2-etil-1-(2trimetilsilaniletoxicarbonilamino)ciclopropano-carboxílico, mostrado a continuación.

imagen16

A una suspensión del producto de la Etapa 2 (10 g, 46,8 mmol) y 3 g de tamices

moleculares 4A activados recientemente en benceno seco (160 ml), se le añadió Et3N (7,50 ml,

53,8 mmol) y DPPA (11 ml, 10,21 mmol). La mezcla de reacción se calentó a reflujo durante

20 3,5 h, añadiéndose después 2-trimetilsilil-etanol (13,5 ml, 94,2 mmol), y la mezcla de reacción se calentó a reflujo durante una noche. La mezcla de reacción se filtró, se diluyó con Et2O, se lavó con una solución acuosa al 10% de ácido cítrico, agua, NaHCO3 acuoso saturado, agua (2 x), salmuera (2 x), se secó (MgSO4) y se concentró al vacío. El residuo se suspendió con 10 g de resina aceptora de poliisocianato, de Aldrich, en 120 ml de CH2CI2, se agitó a ta durante

25 una noche y se filtró dando el producto del título (8 g, 24,3 mmol; 52%) en forma de un aceite amarillo pálido: RMN de 1H (CDCl3) δ 0,03 (s, 9 H), 0,97 (m, 5 H), 1,20 (m a, 1 H), 1,45 (s, 9 H), 1,40-1,70 (m, 4 H), 4,16 (m, 2 H), 5,30 (s a, 1 H). Etapa 4: Preparación de éster terc-butílico del ácido (1R,2R)/(1S,2S) 1-amino-2

30

35

imagen17

Al producto de la Etapa 3 (3 g, 9 mmol) se le añadió una solución 1,0 M de TBAF en THF (9,3 ml, 9,3 mmol) y la mezcla se calentó a reflujo durante 1,5 h, se enfrió a ta y después se diluyó con 500 ml de EtOAc. La solución se lavó sucesivamente con agua (2 x 100 ml), salmuera (2 x 100 ml), se secó (MgSO4), se concentró al vacío proporcionando el intermedio del título.

6. Preparación de sal clorhidrato del éster metílico del ácido 1-aminoespiro[2,3]hexano-1-carboxílico

imagen1

Etapa 1 Preparación de éster dimetílico del ácido [2,3]hexano-1,1-dicarboxílico, mostrado a

continuación.

imagen1

A una mezcla de metileno-ciclobutano (1,5 g, 22 mmol) y Rh2(OAc)4 (125 mg, 0,27 mmol) en CH2CI2 anhidro (15 ml) se le añadieron 3,2 g (20 mmol) de dimetil diazomalonato (preparado de acuerdo con J. Lee et al. Synth. Comm., 1995, 25, 1511-1515) a 0ºC durante un periodo de 6 h. La mezcla de reacción se calentó después a ta y se agitó durante 2 h más. La mezcla se concentró y se purificó por cromatografía ultrarrápida (eluyendo con hexano/Et2O

10:1 a hexano/Et2O 5:1) dando 3,2 g (72%) de éster dimetílico del ácido [2,3]hexano-1,1dicarboxílico en forma de un aceite amarillo. RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) δ 3,78 (s, 6 H), 2,36 (m, 2 H), 2,09 (m, 3 H), 1,90 (m, 1 H), 1,67 (s, 2 H). CL-EM: EM m/z 199 (M++1). Etapa 2: Preparación de éster metílico del ácido espiro[2,3]hexano-1,1-dicarboxílico, mostrado

a continuación.

imagen1

A la mezcla de éster dimetílico del ácido espiro [2,3]hexano-1,1-dicarboxílico (200 mg, 1,0 mmol) en 2 ml de MeOH y 0,5 ml de agua se le añadió KOH (78 mg, 1,4 mmol). Esta solución se agitó a ta durante 2 días. Después se acidificó con HCl diluido y se extrajo dos veces con éter. Las fases orgánicas combinadas se secaron (MgSO4) y se concentraron para

producir 135 mg (73%) de 2 en forma de un sólido blanco. RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) δ 3,78 (s, 3 H), 2,36-1,90 (m, 8 H). CL-EM: EM m/z 185 (M++1) Etapa 3: Preparación del producto del título, sal clorhidrato del éster metílico del ácido 1-aminoespiro[2,3]hexano-1-carboxílico.

A una mezcla de éster metílico del ácido espiro[2,3]hexano-1,1-dicarboxílico (660 mg, 3,58 mmol) en 3 ml de t-BuOH anhidro se le añadieron 1,08 g (3,92 mmol) de DPPA y 440 mg (4,35 mmol) de Et3N. La mezcla se calentó a reflujo durante 21 h y después se repartió entre H2O y éter. La fase etérea se secó sobre sulfato de magnesio, se filtró y se concentró al vacío para producir un aceite. A este aceite se le añadieron 3 ml de una solución 4 M de HCl/dioxano. Esta solución ácida se agitó a ta durante 2 h y después se concentró al vacío. El residuo se trituró con éter dando 400 mg (58%) del producto deseado en forma de un sólido blanco. RMN de 1H (300 MHz, d6-DMSO) δ 8,96 (s a, 3 H), 3,71 (s, 3 H), 2,41 (m, 1 H), 2,12 (m, 4 H), 1,93 (m, 1 H), 1,56 (c, 2 H, J = 8 Hz). CL-EM de amina libre: EM m/z 156 (M++1).

7. Preparación de sal clorhidrato del éster metílico del ácido 1-amino

manera.

imagen18

Etapa 1: éster dimetílico del ácido espiro[2,4]heptano-1,1-dicarboxílico, mostrado a continuación, se preparó de la siguiente manera.

imagen1

Usando el mismo procedimiento descrito en la preparación de sal clorhidrato del éster metílico del ácido 1-amino-espiro[2,3]hexano-1-carboxílico, se hicieron reaccionar 1,14 g (13,9 mmol) de metilenciclopentano y 2,0 g (12,6 mmol) de dimetil diazomalonato para producir 1,8 g (67%) del éster dimetílico. RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) δ 3,73 (s, 6 H), 1,80 (m, 2 H), 1,70 (m, 4 H), 1,60 (m, 4 H). CL-EM: EM m/z 213 (M++1). Etapa 2: Preparación de éster metílico del ácido espiro[2,4]heptano-1,1-dicarboxílico, mostrado a continuación, se preparó de la siguiente manera.

imagen1

Usando el mismo procedimiento descrito en la preparación de sal clorhidrato del éster metílico del ácido 1-aminoespiro[2,3]hexano-1-carboxílico, 1,7 g (8,0 mmol) del producto de la Etapa 1 y 493 mg (8,8 mmol) de KOH dieron 1,5 g (94%) de éster metílico del ácido espiro[2,4]heptano-1,1-dicarboxílico. RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) δ 3,80 (s, 3 H), 2,06 (d, 1 H, J = 5 Hz), 1,99 (d, 1 H, J = 5 Hz), 1,80-1,66 (m, 8 H). CL-EM: EM m/z 199 (M++1). Etapa 3: Preparación de sal clorhidrato del éster metílico del ácido 1-amino-espiro[2,4]heptano1-carboxílico, mostrado a continuación, se preparó de la siguiente manera.

imagen1

Usando el mismo procedimiento descrito anteriormente en la preparación de sal clorhidrato del éster metílico del ácido 1-amino-espiro[2,3]hexano-1-carboxílico, 500 mg (2,5 mmol) del producto de la Etapa 2, 705 mg (2,5 mmol) de DPPA y 255 mg (2,5 mmol) de Et3N dieron 180 mg (35%) de esta sal clorhidrato. RMN de 1H (300 MHz, d6-DMSO) δ 8,90 (s a, 3 H), 3,74 (s, 3 H), 1,84 (m, 1 H), 1,69 (m, 4 H), 1,58 (m, 4 H), 1,46 (d, 1 H, J = 6 Hz). CL-EM de amina libre: EM m/z 170 (M++1).

8. Preparación de sal clorhidrato del éster metílico del ácido 1-aminoespiro[2,2]pentano-1-carboxílico, mostrado a continuación, se preparó de la siguiente

manera.

imagen1

Etapa 1: éster dimetílico del ácido espiro[2,2]pentano-1,1-dicarboxílico, mostrado a continuación, se preparó de la siguiente manera.

imagen1

A una mezcla de metilenciclopropano (1,0 g, 18,5 mmol) (preparado de acuerdo con P. Binger, Patente de Estados Unidos con Nº de Serie 5.723.714) y Rh2(OAc)4 (82 mg, 0,185 mmol) en CH2CI2 anhidro (10 ml), se le añadió dimetil diazomalonato (2,9 g, 18,3 mmol) a 0ºC. En la parte superior del matraz se instaló un dedo frío, cuya temperatura se mantuvo a -10ºC. La mezcla de reacción se calentó a ta y se agitó durante 2 h más. La mezcla se concentró al vacío y se purificó por cromatografía ultrarrápida (eluyendo con hexano/Et2O 10:1 a hexano/Et2O 5:1) dando 0,85 g (25%) del éster dimetílico en forma de un aceite amarillo. RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) δ 3,73 (s, 6 H), 1,92 (s, 2 H), 1,04 (d, 4 H, J = 3 Hz). Etapa 2: éster metílico del ácido espiro[2,2]pentano-1,1-dicarboxílico, mostrado a continuación, se preparó de la siguiente manera.

imagen1

Usando el mismo procedimiento descrito anteriormente en la preparación de sal clorhidrato del éster metílico del ácido 1-amino-espiro[2,3]hexano-1-carboxílico, 800 mg (4,3 mmol) del producto de la etapa 1 y 240 mg (4,3 mmol) de KOH dieron 600 mg (82%) de éster metílico del ácido espiro[2,2]pentano-1,1 -dicarboxílico. RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) δ 3,82 (s, 6 H), 2,35 (d, 1 H, J = 3 Hz), 2,26 (d, 1 H, J = 3 Hz), 1,20 (m, 1 H), 1,15 (m, 1 H), 1,11 (m, 1 H), 1,05 (m, 1 H). EMBR: EM m/z 169 (M+-1) (Procedimiento D). Etapa 3: sal clorhidrato del éster metílico del ácido 1-amino-espiro[2,2]pentano-1-carboxílico, mostrada a continuación, se preparó de la siguiente manera.

imagen1

Usando el mismo procedimiento descrito anteriormente para la preparación de sal clorhidrato del éster metílico del ácido 1-amino-espiro[2,3]hexano-1-carboxílico, 400 mg (2,3 mmol) del producto de la etapa 2, 700 mg (2,5 mmol) de DPPA y 278 mg (2,7 mmol) de Et3N dieron 82 mg (20%) de la sal clorhidrato. RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) δ 9,19 (s a, 3 H), 3,81 (s, 3 H), 2,16, (d, J = 5,5 Hz, 1 H), 2,01 (d, J = 5,5 Hz, 1 H), 1,49 (m, 1 H), 1,24, (m, 1 H), 1,12 (m, 2 H). EMBR de amina libre: EM m/z 142 (M++1).

9. Preparación de éster etílico del ácido 5-amino-espiro[2,3]hexano-5-carboxílico, mostrado a continuación, se preparó de la siguiente manera.

imagen1

Espiro[2,3]hexan-4-ona (500 mg, 5 mmol), que se preparó a partir de biciclopropilideno

(A. Meijere et al. Org. Syn. 2000, 78, 142-151) de acuerdo con A. Meijere et al. J. Org. Chem. 1988; 53, 152-161, se combinó con carbamato de amonio (1,17 g, 15 mmol) y cianuro potásico (812 mg, 12,5 mmol) en 50 ml de EtOH y 50 ml de agua. La mezcla se calentó a 55ºC durante 2 días. Después se añadió NaOH (7 g, 175 mmol) y la solución se calentó a reflujo durante una noche. La mezcla se enfrió después a 0ºC, se acidificó a pH 1 con HCl concentrado, y se concentró al vacío. Se añadió EtOH a la mezcla de aminoácido bruto y después se concentró a sequedad (5x) para retirar el agua residual. El residuo se disolvió en 100 ml de EtOH enfriado a 0ºC. Después se trató con 1 ml de SOCI2 y se calentó a reflujo durante 3 días. Los sólidos se retiraron por filtración, y el filtrado se concentró al vacío dando el producto bruto. El producto bruto se repartió entre NaOH 3 N, NaCl y EtOAc. La fase orgánica se secó sobre carbonato potásico y se concentró. El residuo se purificó usando cromatografía en columna sobre gel de sílice C18 (eluyendo con MeOH/H2O) para producir 180 mg (21%) de 15 en forma de un aceite. RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) δ 8,20 (s a, 2 H), 4,27 (s, 2 H), 2,80 (s, 1 H), 2,54 (s, 1 H), 2,34 (m, 2 H), 1,31 (s, 3 H), 1,02 (s, 1 H), 0,66 (m, 3 H). RMN de 13C (300 MHz, CDCl3) δ 170,2(s), 63,0(s), 62,8’(s), 26,1 (s), 26,0 (s), 24,9 (s), 13,9 (s), 11,4 (s), 10,9 (s). CL-EM: EM m/z 170 (M++1).

Ejemplo 21

Estudios Biológicos Ensayo del péptido FRET con el complejo de proteasa NS3/4A de VHC recombinante

El fin de este ensayo in vitro era medir la inhibición de complejos de proteasa NS3 de VHC, derivados de las cepas BMS, H77C o J416S, como se describe a continuación, mediante los compuestos de la presente invención. Este ensayo proporciona una indicación de cómo de eficaces serían los compuestos de la presente invención para inhibir la actividad proteolítica de VHC.

Se obtuvo el suero de un paciente infectado con VHC de Dr. T. Wright, Hospital de San Francisco. Una plantilla de ADNc de longitud completa, modificada genéticamente, del genoma de VHC (cepa BMS) se construyó a partir de fragmentos de ADN obtenidos mediante transcripción inversa-PCR (TI-PCR) del ARN del suero y usando cebadores seleccionados en base a la homología entre otras cepas del genotipo la. A partir de la determinación de la secuencia completa del genoma, se asignó un genotipo Ia al VHC aislado, de acuerdo con la clasificación de Simmonds et al. (Véase P Simmonds, KA Rose, S Graham, SW Chan, F McOmish, BC Dow, EA Follett, PL Yap y H Marsden, J. Clin. Microbiol., 31 (6), 1493-1503 (1993)). Se demostró que la secuencia aminoacídica de la región no estructural, NS2-5B, era >97% idéntica al genotipo la de VHC (H77C) y 87% idéntica al genotipo 1b (J4L6S). Los clones infecciosos, H77C (genotipo 1a) y J4L6S (genotipo 1b) se obtuvieron de R. Purcell (NIH) y las secuencias se han publicado en Genbank (AAB67036, véase Yanagi. M., Purcell, R.H., Emerson, S.U. y Bukh. J. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94(16), 8738-8743 (1997); AF054247, véase Yanagi, M., St Claire, M., Shapiro, M., Emerson, S.U., Purcell, R.H. y Bukh. J, Virology 244(1), 161-172, (1998)).

Se usaron las cepas BMS, H77C y J4L6S para la producción de complejos de proteasa NS3/4A recombinantes. El ADN que codifica el complejo de proteasa NS3/4A de VHC recombinante (aminoácidos 1027 a 1711) para estas cepas se manipularon como se describe en P. Gallinari et al. (véase Gallinari P, Paolini C, Brennan D, Nardi C, Steinkuhler C, De Francesco R. Biochemistry. 38(17): 5620-32, (1999)). Brevemente, se añadió una cola de solubilización de tres lisinas en el extremo 3’ de la región de codificación de NS4A. La cisteína en la posición P1 del sitio de escisión NS4A-NS4B (aminoácido 1711) se cambió por una glicina para evitar la escisión proteolítica del marcador de lisina. Adicionalmente, se introdujo una mutación de cisteína a serina, mediante PCR, en la posición del aminoácido 1454 para evitar la escisión autolítica en el dominio de helicasa NS3. El fragmento de ADN variante se clonó en el vector de expresión bacteriano pET21 b (Novagen) y el complejo NS3/4A se expresó en la cepa BL21 de Escherichia coli (DE3) (Invitrogen) siguiendo el protocolo descrito por P. Gallinari et al. (véase Gallinari P, Brennan D, Nardi C, Brunetti M, Tomei L, Steinkuhler C, De Francesco R., J Virol. 72(8): 6758-69 (1998)) con modificaciones. Brevemente, la expresión de NS3/4A se indujo con isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido 0,5 mM (IPTG) durante 22 h a 20ºC. Una fermentación típica (10 l) produjo aproximadamente 80 g de pasta celular húmeda. Las células se resuspendieron en tampón de lisis (10 ml/g.) constituido por ácido N(2-hidroxietil)piperazin-N’-(2-etano sulfónico) (HEPES) 25 mM, pH 7,5, glicerol al 20%, cloruro sódico (NaCl) 500 mM, Triton-X100 al 0,5%, 1 ug/ml de lisozima, cloruro de magnesio (MgCI2) 5 mM, 1 ug/ml de Dnasel, β-mercaptoetanol 5 mM (βME), inhibidor de proteasa -ácido etilendiamina tetraacético (EDTA) libre (Roche), se homogeneizó y se incubó durante 20 min a 4ºC. El homogeneizado se sonicó y se aclaró por ultra-centrifugación a 235.000 g durante 1 h a 4ºC. Se añadió imidazol al sobrenadante a una concentración final de 15 mM y el pH se ajustó a 8,0. El extracto de proteína bruta se cargó en una columna de níquel -ácido nitrilotriacético (Ni-NTA) pre-equilibrada con tampón B (HEPES 25 mM, pH 8,0, glicerol al 20%, NaCl 500 mM, Triton-X100 al 0,5%, imidazol 15 mM, βME 5 mM). La muestra se cargó a un caudal de 1 ml/min. La columna se lavó con 15 volúmenes de columna de tampón C (igual que el tampón B excepto con Triton-X100 al 0,2%). La proteína se eluyó con 5 volúmenes de columna de tampón D (igual que el tampón C excepto con imidazol 200 mM).

Las fracciones que contenían el complejo de proteasa NS3/4A se combinaron y se cargaron en una columna de desalación Superdex-S200 pre-equilibrada con tampón D (HEPES 25 mM, pH 7,5, glicerol al 20%, NaCl 300 mM, Triton-X100 al 0,2%, βME 10 mM). La muestra se cargó a un caudal de 1 ml/min. Las fracciones que contenían el complejo de proteasa NS3/4A se combinaron y se concentraron a aproximadamente 0,5 mg/ml. La pureza de los complejos de proteasa NS3/4A, derivadas de las cepas BMS, H77C y J4L6S, se juzgó que era mayor del 90% por SDS-PAGE y análisis de espectrometría de masas.

La enzima se almacenó a -80ºC, se descongeló sobre hielo y se diluyó antes de usarla en el tampón de ensayo. El sustrato usado para el ensayo de proteasa NS3/4A era RET S 1 (Sustrato Depsipeptídico de Transferencia de Energía de Resonancia; AnaSpec, Inc. Nº cat 22991) (péptido FRET), descrito por Taliani et al. en Anal. Biochem. 240(2): 60-67 (1996). La secuencia de este péptido está ligeramente basada en el sitio de escisión natural NS4NNS4B, excepto que hay una unión éster en lugar de un enlace de amida en el sitio de escisión. El sustrato peptídico se incubó con uno de los tres complejos NS3/4A recombinantes, en ausencia o presencia de un compuesto de la presente invención, y la formación del producto de reacción fluorescente se siguió en tiempo real usando un Cytofluor Serie 4000.

Los reactivos fueron los siguientes: HEPES y glicerol (ultrapuros) se obtuvieron de GIBCO-BRL. El dimetilsulfóxido (DMSO) se obtuvo de Sigma. El β-mercaptoetanol se obtuvo de Bio Rad. Tampón de ensayo: HEPES 50 mM, pH 7,5; NaCl 0,15 M; Triton al 0,1%; glicerol al 15%; βME 10 mM. Sustrato: concentración final 2 µM (a partir de una solución madre 2 mM en DMSO almacenada a -20ºC). VHC NS3/4A de tipo la (lb), concentración final 2-3 nM (a partir de una solución madre 5 µM en HEPES 25 mM, pH 7,5, glicerol al 20%, NaCl 300 mM, Triton-X100 al 0,2%, βME 10 mM). Para compuestos con potencies que se aproximan al límite del ensayo, el ensayo se hizo más sensible añadiendo 50 µg/ml de BSA al tampón de ensayo y reduciendo la concentración final de proteasa a 300 pM.

El ensayo se realizó en una placa negra de poliestireno de 96 pocillos de Falcon. Cada pocillo contenía 25 µl de complejo de proteasa NS3/4A en tampón de ensayo, 50 µl de un compuesto de la presente invención en DMSO al 10%/tampón de ensayo y 25 µl de sustrato en tampón de ensayo. Se prepare también un control (sin compuesto) con el número: AJ238799), se generó un ADNc de VHC que codificaba el sitio de entrada a ribosoma interno 5' (IRES), el gen de resistencia a neomicina, el VEMC (virus de encefalo-miocarditis)-IRES y las proteínas no estructurales del VHC, NS3-NS5B, y la región 3' no traducida (RNT). Las transcripciones in vitro del ADNc se transfectaron en la línea celular de hepatoma humano, Huh7. La selección de las células que expresan constitutivamente el replicón de VHC se consiguió en presencia del marcador seleccionable, neomicina (G418). Las líneas celulares resultantes se caracterizaron para la producción de ARN de cadena positiva y negativa y tiempo suplementario de producción de proteínas.

Las células Huh7, que expresan constitutivamente el replicón de VHC, se cultivaron en Medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) que contenía suero de ternera fetal al 10% (FCS) y 1 mg/ml de G418 (Gibco-BRL). Las células se sembraron al noche anterior (1,5 x 104 células/pocillo) en placas estériles de cultivo tisular de 96 pocillos. El compuesto y los controles sin compuesto se prepararon en DMEM que contenía FCS al 4%, penicilina / estreptomicina 1:100, L-glutamina 1:100 y DMSO al 5% en la placa de dilución (concentración final de DMSO en el ensayo 0,5%). Las mezclas de compuesto / DMSO se añadieron a las células y se incubaron durante 4 días a 37ºC. Después de 4 días, las placas se enjuagaron minuciosamente con solución salina tamponada con fosfato (PBS) (3 veces 150 µl). Las células se lisaron con 25 µl de un reactivo de ensayo de lisis que contenía el péptido FRET (RET S1, como se ha descrito para el ensayo de enzima in vitro). El reactivo de ensayo de lisis se preparó a partir de reactivo de lisis de cultivo celular de células de luciferasa 5X (Promega Nº E153A) diluido a 1X con agua destilada, se añadió NaCl a una concentración final de 150 mM, el péptido FRET se diluyó a una concentración final de 10 µM a partir de una solución madre 2 mM en DMSO al 100%. La placa se puso después en el instrumento Cytofluor 4000, que se había ajustado a 340 nm excitación / 490 emisión, en modo automático durante 21 ciclos y la placa leía en modo cinético. Las determinaciones de CE50 se realizaron como se ha descrito para las determinaciones de CI50.

Como un ensayo secundario, las determinaciones de CE50 a partir del ensayo del replicón FRET se confirmaron en un ensayo cuantitativo de ARN. Las células se lisaron usando el kit Rneasy (Qiagen). El ARN total purificado se normalizó usando RiboGreen (Jones LJ, Yue ST, Cheung CY, Singer VL, Anal. Chem., 265(2):368-74 (1998)) y la misma placa de ensayo. El complejo enzimático se mezcló con compuesto o con solución de control durante 1 min antes de iniciar la reacción enzimática mediante la adición de sustrato. La placa de ensayo se leyó inmediatamente usando el Cytofluor Serie 4000 (Perspective Biosystems). El instrumento se ajustó para que leyera una emisión de 340 nm y excitación de 490 nm a 25ºC. Las reacciones se siguieron generalmente durante aproximadamente 15 minutos.

El porcentaje de inhibición se calculó con la siguiente ecuación:

100 -[( imagen19 Finh / imagen19 Fcon) x 100]

en la que δF es el cambio en la fluorescencia a lo largo del intervalo lineal de la curva. Se aplicó un ajuste no lineal de la curva a los datos de inhibición-concentración, y la concentración 50% eficaz (CI50) se calculó usando el programa Excel Xl-fit usando la ecuación, y = A+((B-A)/(1+((C/x)^D))).

Se encontró que todos los compuestos ensayados tenían CI50 de 0,48 µM o menores. Además, los compuestos de la presente invención, que se ensayaron contra más de un tipo de complejo de NS3/4A, se encontró que tenían propiedades inhibidoras similares, aunque los compuestos demostraron uniformemente una mayor potencia contra las cepas 1b, en comparación con las cepas 1a. Ensayos de Especificidad

Los ensayos de especificidad se emplearon para demostrar la selectividad de los compuestos de la presente invención para inhibir proteasa NS3/4A de VHC, en comparación con otras serina o cisteína proteasas.

Las especificidades de los compuestos de la presente invención se determinaron frente a una diversidad de serina proteasas: elastasa de esputo humana (HS), elastasa pancreática porcina (PPE) y quimiotripsina pancreática humana y una cisteína proteasa: catepsina B de hígado humana. En todos los casos se usó un protocolo con un formato de placa de 96 pocillos usando p-nitroanilina (pNA) colorimétrica, que es un sustrato específico para cada enzima, como se ha descrito anteriormente (solicitud CT 2633) con algunas modificaciones a los ensayos de serina proteasa.

Cada ensayo incluía una pre-incubación de 2 h de enzima-inhibidor a TA, seguido de la adición de sustrato e hidrólisis para una conversión de ~30% según se mide en un lector de microplacas Spectramax Pro. Las concentraciones del compuesto variaron de 100 a 0,4 µM, dependiendo de su potencia.

Las condiciones finales y el protocolo para los ensayos de serina proteasa fueron:

clorhidrato de tris(hidroximetil)aminometano (Tris-HCl) 50 mM, pH 8,

sulfato sódico (Na2SO4) 0,5 M, NaCl 50 mM, EDTA 0,1 mM, DMSO al 3%,

Tween-20 al 0,01% con: succ-AAA-pNA 133 µMyHS 20 nMo PPE 8 nM;

succ-AAPF-pNA 100 µM y quimiotripsina 250 pM.

El porcentaje de inhibición se calculó usando la fórmula:

[1-((UVinh-UVblanco)/(UVctl-UVblanco))] x 100

Se aplicó un ajuste de curva no lineal a los datos de inhibición-concentración, y la concentración 50% eficaz (CI50) se calculó usando el programa Excel Xl-fit. Ensayo basado en Células del Replicón de VHC

Se estableció un sistema celular completo de replicón de VHC como se describe en Lohmann V, Korner F, Koch J, Herian U, Theilmann L, Bartenschlager R., Science 285(5424): 110-3 (1999). Este sistema permitió a los inventores evaluar los efectos de sus compuestos proteasa de VHC sobre la replicación del ARN de VHC. Brevemente, usando la secuencia IB de la cepa de VHC descrita en la publicación de Lohmann (Assession relative quantitation of VHC RNA expresión assessed using the Taqman procedure (Kolykhalov AA, Mihalik K, Feinstone SM, Rice CM, Journal of Virology 74, 2046-2051 (2000)) y el kit en una etapa Platinum Quantitative TA-PCR Thermoscript (lnvitrogen, Nº cat 11731-015). Brevemente, se añadió ARN hasta un volumen de 5 µl (< 1 ng) a 20 µI de mezcla Ready que contenía lo siguiente: mezcla de reacción Thermoscript 1,25X (que contenía sulfato de magnesio y 2desoxinucleósido 5’-trifosfatos (dNTPs)), dNTPs 3 mM, cebador hacia delante 200 nM (secuencia: 5’-gggagagccatagtggtctgc-3’), cebador inverso 600 nM (5’-cccaaatctccaggcattga3’), sonda 100 nM (5’-6-FAM-cggaattgccaggacgaccgg-BHQ-1-3’) (FAM: fluoresceínaaminohexil amidita; BHQ: inactivador Black Hole), colorante de referencia VM Rox (Invitrogen Nº cat 12223-012) y mezcla de polimerasa Thermoscript Plus Platinum Taq. Todos los cebadores se diseñaron con el programa ABI Prism 7700 y se obtuvieron de Biosearch Technologies, Novato, CA. Las muestras que contenían concentraciones conocidas de transcripción de ARN de VHC se tomaron como patrones. Usando el siguiente protocolo cíclico (50ºC, 30 min; 95ºC, 5 min; 40 ciclos de 95ºC, 15 s, 60ºC, 1 min), se cuantificó la expresión de ARN de VHC, como se describe en el manual de Perkin Elmer, usando el detector de secuencias ABI Prism 7700.

El ensayo de informador de luciferasa se usó también para confirmar la potencia del compuesto en el replicón. La utilización de un ensayo de informador de luciferasa de replicón fue descrito por primera vez por Krieger et al (Krieger N, Lohmann V, y Bartenschlager R, J. Virol. 75(10): 4614-4624 (2001)). La construcción de replicón descrita para nuestro ensayo de FRET se modificó reemplazando el gen de resistencia de neomicina por el gen de resistencia de blasticidina, condensado al extremo N-terminal de la forma humanizada de luciferasa renilla (sitios de restricción Ascl/Pmel usados para la subclonación). Se introdujo también la mutación adaptativa en la posición 1179 (serina a iso-leucina) (Blight KJ, Kolykhalov, AA, Rice, CM, Science 290(5498): 1972-1974). El ensayo de informador de luciferasa se realizó sembrando células huh7 la noche anterior a una densidad de 2 x 106 células por matraz T75. Las células se lavaron el siguiente día con 7,5 ml de Opti-MEM. Siguiendo el protocolo de Invitrogen, se

5

10

15

20

25

30

77

agitaron 40 µI de DMRIE-C vorticialmente con 5 ml de Opti-MEM antes de añadir 5 µg de ARN de replicón informador de VHC. La mezcla se añadió a las células huh7 lavadas y se dejó durante 4 horas a 37ºC. Mientras tanto, se prepararon diluciones en serie del compuesto y controles sin compuesto en DMEM que contenía FCS al 10% y DMSO al 5% en la placa de dilución (concentración final de DMSO en el ensayo 0,5%). Las mezclas de compuesto / DMSO se añadieron a cada pocillo de una placa de 24 pocillos. Después de 4 horas, la mezcla de transfección se aspiró, y las células se lavaron con 5 ml de Opti-MEM antes de la tripsinización. Las células tripsinizadas se resuspendieron en DMEM al 10% y se sembraron a 2 x 104 células/pocillo en las placas de 24 pocillos que contenían el compuesto o los controles sin compuesto. Las placas se incubaron durante 4 días. Después de 4 días, el medio se retiró y las células se lavaron con PBS. Se añadieron inmediatamente 100 µl de tampón de lisis de luciferasa renilla 1 x (Promega) a cada pocillo y las placas se congelaron a -80ºC para su análisis posterior, o se ensayaron después de 15 min de lisis. El lisado (40 µl) de cada pocillo se transfirió a una placa negra de 96 pocillos (fondo transparente) seguido de 200 µl de sustrato de ensayo de luciferasa renilla 1x. Las placas se leyeron inmediatamente en un Packard TopCount NXT, usando un programa de luminiscencia.

El porcentaje de inhibición se calculó usando la siguiente fórmula:

señal de luciferasa media en pocillos experimentales (compuesto +)

% control =

señal de luciferasa media en pocillos de control DMSO (compuesto -)

Los valores se representaron gráficamente y se analizaron usando XLFit para obtener el valor de CE50. Ejemplos Biológicos

Los compuestos representativos de la invención se evaluaron en el ensayo de células de replicón de VHC y/o en varios de los ensayos de especificidad esbozados. Por ejemplo, se encontró que el Compuesto 1 tenía una CI50 de 8 nM contra la cepa BMS de NS3/4A en el ensayo enzimático. Se obtuvieron valores de potencia similares con las cepas publicadas H77C (CI50 de 2,2 nM) y J4L6S (CI50 de 1,6 nM). El valor de CE50 en el ensayo de replicón fue de 55 nM.

En los ensayos de especificidad, se encontró que el mismo compuesto tenía la siguiente actividad: HS = 35 µM; PPE > 50 µM; quimiotripsina > 50 µM; catepsina B > 50 µM (cuestiones de solubilidad a 100 µM). Estos resultados indican que esta familia de compuestos son altamente específicos para la proteasa NS3 y muchos de estos miembros inhiben la replicación del replicón de VHC.

Los compuestos de la presente invención se ensayaron y se encontró que tenían

actividades en los siguientes intervalos: Intervalos de Actividad para CI50 (Cepa BMS de NS3/4A): A es 1-10 micromolar (µM); B es 0,1-1 µM; C es < 0,1 µM

5 Intervalos de Actividad para CE50: A es 1-10 micromolar (µM); B es 0,1-1 µM; C es < 0,1 µM

Obsérvese que usando el número de compuesto de la patente mostrado en la tabla (a continuación) pueden encontrarse las estructuras de los compuestos en el presente documento.

10 De acuerdo con la presente invención, los compuestos preferidos tienen una actividad biológica (CE50) de 10 µM o menor, más preferiblemente 1 µM o menor y aún más preferiblemente de 0,1 µM o menor.

Tabla 1 del Ejemplo 21: Tabla de Actividad

Compuesto Nº: CI50 a, b, c CE50 a, b, c

1: C C

2: C B

3: B B

4: C B

5: B A

6: C B

7: C A

8: C B

9: C B

10: C B

11: C A

12: B A

13: C B

14: C B

15: B A

16: C B

17: C B

Ejemplo 22

15 Los siguientes compuestos son ejemplos adicionales de compuestos que pueden

prepararse de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención.

5

10

15

20

25

30

imagen1

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto que tiene la fórmula

imagen1

en la que:

(a)

R1 es Het no sustituido o sustituido, en la que el término "Het" representa un radical monovalente obtenido mediante la retirada de un hidrógeno de un heterociclo aromático o no aromático, saturado o insaturado, de cinco, seis o siete miembros que contiene de uno a cuatro heteroátomos seleccionados entre nitrógeno, oxígeno y azufre incluyendo heterociclos que están condensados a una o más estructuras de anillo distintas, heterociclos que contienen nitrógeno, en los que el nitrógeno puede estar sustituido con alquilo C1-6, y heterociclos que contienen azufre, en los que el azufre está oxidado a SO o SO2 y dichos sustituyentes Het son iguales o diferentes y se seleccionan de uno a tres entre halo, ciano, trifluorometilo, nitro, alquilo C1-6, alcoxi C1-6, amido, alcanoil C1-6 amino, amino, fenilo o feniltio, estando dicho fenilo o porción fenilo de feniltio no sustituido o sustituido con uno a tres sustituyentes, iguales o diferentes, seleccionados entre halo, ciano, nitro, alquilo C1-6, alcoxi C1-6, amido, fenilo o un heterociclo monocíclico de 5-7 miembros;

(b)

mes1ó2;

(c)

nes1ó2;

(d)

R2 es alquilo C1-6, alquenilo C2-6 o cicloalquilo C3-7, cada uno opcionalmente sustituido de una a tres veces con halógeno; o R2 es H; o R2 junto con el carbono al que está unido forma un anillo de 3, 4 ó 5 miembros;

(e)

R3 es alquilo C1-8 opcionalmente sustituido con halo, ciano, amino, dialquil C1-6 amino, arilo C6-10, alquil C7-14 arilo, alcoxi C1-6, carboxi, hidroxi, ariloxi, alquil C7-14 ariloxi, alquil C2-6

éster, alquil C8-15 aril éster; alquenilo C3-12, cicloalquilo C3-7, o alquil C4-10 cicloalquilo, en los que el cicloalquilo o alquilcicloalquilo están opcionalmente sustituidos con hidroxi, alquilo C1-6, alquenilo C2-6 o alcoxi C1-6; o R3 junto con el átomo de carbono al que está unido forma un grupo cicloalquilo C3-7 opcionalmente sustituido con alquenilo C2-6;

5 (f) Y es H, fenilo sustituido con nitro, piridilo sustituido con nitro, o alquilo C1-6 opcionalmente sustituido con ciano, OH o cicloalquilo C3-7; con la condición de que si R4 o R5 es H entonces Y es H;

(g) B es H, alquilo C1-6, R4-(C=O)-, R4O(C=O)-, R4-N(R5)-C(=O)-, R4-N(R5)-C(=S)-, R4SO2-,

o R4-N(R5)-SO2-;

10 (h) R4 es (i) alquilo C1-10 opcionalmente sustituido con fenilo, carboxilo, alcanoílo C1-6, 1-3 halógenos, hidroxi, -OC(O)alquilo C1-6, alcoxi C1-6, amino opcionalmente sustituido con alquilo C1-6, amido, o (alquilo inferior) amido; (ii) cicloalquilo C3-7, cicloalcoxi C3-7, o alquil C4-10 cicloalquilo, cada uno opcionalmente sustituido con hidroxi, carboxilo, (alcoxi C1-6)carbonilo, amino opcionalmente sustituido con alquilo C1-6, amido, o (alquilo inferior) amido; (iii) arilo C6-10

15 o aril C7-16 alquilo, cada uno opcionalmente sustituido con alquilo C1-6, halógeno, nitro, hidroxi, amido, (alquilo inferior) amido, o amino opcionalmente sustituido con alquilo C1-6; (iv) Het; (v) biciclo(1.1.1)pentano; o (vi) -C(O)Oalquilo C1-6, alquenilo C2-6 o alquinilo C2-6; y

(i) R5 es H; alquilo C1-6 opcionalmente sustituido con 1-3 halógenos; o alcoxi C1-6 con la

condición de que R4 sea alquilo C1-10; 20 o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo.
2.

Un compuesto de la reivindicación 1 en el que m es 2.
3.

Un compuesto de la reivindicación 1 en el que n es 1.
4.

Un compuesto de la reivindicación 1, en el que R1 es
5.

El compuesto de la reivindicación 1, en el que R2 es alquilo C1-6, alquenilo C2-6 o cicloalquilo C3-7.
6.

Un compuesto de la reivindicación 5, en el que R2 es etilo o vinilo.
7.

El compuesto de la reivindicación 1, en el que R3 es alquilo C1-8 opcionalmente sustituido con arilo C6, alcoxi C1-6, carboxi, hidroxi, ariloxi, alquil C7-14 ariloxi, alquil C2-6 éster, alquil C8-15 aril éster; alquenilo C3-12, cicloalquilo C3-7, o alquil C4-10 cicloalquilo.
8.

El compuesto de la reivindicación 7, en el que R3 es alquilo C1-8 opcionalmente

sustituido con alcoxi C1-6; o cicloalquilo C3-7.
9.

Un compuesto de la reivindicación 1, en el que R3 es alquilo C1-6.
10.

El compuesto de la reivindicación 9, en el que R3 es t-butilo.
11.

Un compuesto de la reivindicación 1, en el que m es 2, n es 1 y R2 es etilo o vinilo.
12.

El compuesto de la reivindicación 1, en el que Y es H.
13.

El compuesto de la reivindicación 1 en el que B es H, alquilo C1-6, R4-(C=O)-, R4O(C=O)-, R4-N(R5)-C(=O)-, R4-N(R5)-C(=S)-, R4SO2-, o R4-N(R5)-SO2-.
14.

El compuesto de la reivindicación 13, en el que B es R4-(C=O)-, R4O(C=O)-, o R4-N(R5)C(=O)-.
15.

El compuesto de la reivindicación 14, en el que B es R4O(C=O)-y R4 es alquilo C1-6.
16.

El compuesto de la reivindicación 1, en el que R4 es (i) alquilo C1-10 opcionalmente sustituido con fenilo, carboxilo, alcanoílo C1-6, 1-3 halógenos, hidroxi, alcoxi C1-6; (ii) cicloalquilo C3-7, cicloalcoxi C3-7, o alquil C4-10 cicloalquilo; o (iii) arilo C6-10 o aril C7-16 alquilo, cada uno opcionalmente sustituido con alquilo C1-6 o halógeno.
17.

El compuesto de la reivindicación 13, en el que P4 es (i) alquilo C1-10 opcionalmente sustituido con 1-3 halógenos o alcoxi C1-6; o (ii) cicloalquilo C3-7 o alquil C4-10 cicloalquilo.
18.

El compuesto de la reivindicación 17, en el que R4 es t-butilo.
19.

El compuesto de la reivindicación 1, en el que R5 es H o alquilo C1-6 opcionalmente sustituido con 1-3 halógenos.
20.

El compuesto de la reivindicación 19, en el que R5 es H.
21.

Un compuesto de la fórmula

25

30

imagen1

imagen1

en la que R1 es

imagen1

imagen1

imagen1

o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo.
22.

Uso del compuesto de la reivindicación 1, o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, para la preparación de un medicamento para tratar una infección por VHC en un paciente.
23.

Una composición que comprende el compuesto de la reivindicación 1, o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
24.

La composición de la reivindicación 23, que comprende adicionalmente un agente inmunomodulador adicional.
25.

La composición de la reivindicación 24, en la que el agente inmunomodulador adicional está seleccionado entre el grupo constituido los interferones α, β y δ.
26.

La composición de la reivindicación 23, que comprende adicionalmente un agente antiviral.
27.

La composición de la reivindicación 26, en la que el agente antiviral está seleccionado entre el grupo constituido por ribavirina y amantadina.
28.

La composición de la reivindicación 23, que comprende adicionalmente un inhibidor de VHC proteasa distinto del compuesto de la reivindicación 1.
29. La composición de la reivindicación 28, que comprende adicionalmente un inhibidor de 5 una diana en el ciclo vital del VHC distinto de la proteasa NS3 de VHC.
30. La composición de la reivindicación 29, en la que la diana está seleccionada entre el grupo constituido por helicasa, polimerasa, metaloproteasa y mezclas de las mismas.

10 31. Uso de la composición de la reivindicación 23, para la preparación de un medicamento para tratar una infección vírica de hepatitis C en un paciente.