PL211889B1

PL211889B1 - Pochodna heterocyklosulfonamidowa, kompozycja ją zawierająca oraz ich zastosowanie

Info

Publication number: PL211889B1
Application number: PL373398A
Authority: PL
Inventors: Jeffrey Allen Campbell; Andrew Charles Good
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 2002-05-20
Filing date: 2003-05-20
Publication date: 2012-07-31
Also published as: US6869964B2; EP1506000A1; JP4312711B2; IS7532A; WO2003099316A1; EP1506000A4; JP2005526144A; DE60334205D1; PL373398A1; ATE481106T1; ES2350201T3; NO20044808L; EP1506000B1; AU2003248535A1; EP1506000B9; US20040072761A1; ES2350201T9

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest pochodna heterocyklosulfonamidowa, kompozycja ją zawierająca oraz ich zastosowanie. Pochodna ta hamuje działanie proteazy NS3 kodowanej przez wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV).

HCV jest głównym patogenem ludzkim i jak się ocenia, jest odpowiedzialny za zakażenie na całym świecie 170 milionów osób - w przybliżeniu, liczba zakażonych wirusem HCV jest pięciokrotnie większa od liczby zakażonych wirusem nabytego ludzkiego niedoboru odporności typu 1. U znacznej części tych osobników zakażonych wirusem HCV rozwija się poważna, postępująca choroba wątroby, wliczając w to marskość wątroby i rak wątrobowo-komórkowy (Lauer G. M., Walker B. D., Ν. Engl. J. Med. (2001), 345, strony 41-52).

Obecnie, w najskuteczniejszym leczeniu HCV wykorzystuje się połączenie interferonu α i ribawiryny, co prowadzi do przedłużenia skuteczności leczenia u 40% pacjentów (Poynard, T. i inni, Lancet (1998), 352, strony 1426-1432). Ostatnie wyniki badań klinicznych wykazują, że interferon α poli(oksy)etylenowany jest w monoterapii lepszy od interferonu α niemodyfikowanego (Zeuzem S. i inni, N. Engl, J. Med. (2000), 343, strony 1666-1672). Jednakże, nawet w przypadku stosowania doświadczalnych trybów leczenia, w których wykorzystuje się połączenia interferonu α poli(oksy)etlenowanego i ribawiryny, u znacznej części pacjentów nie stwierdzono przedłużonego zmniejszenia obciążenia wirusowego. Tak więc, istnieje widoczna i od dawna oczekiwana potrzeba opracowania skutecznych środków terapeutycznych do leczenia zakażenia wirusem HCV.

Wirus HCV jest wirusem zawierającym nić (+) RNA. W oparciu o porównanie dedukowanej sekwencji aminokwasowej i silnego podobieństwa w obszarze 5' który nie ulega translacji, wirus HCV został sklasyfikowany jako oddzielny rodzaj w rodzinie Flaviviridae. Wszyscy członkowie rodziny Flaviviridae posiadają wiriony z okrywą, które zawierają genom (+) RNA kodujący wszystkie znane, specyficzne dla wirusa białka, na drodze translacji pojedynczej, nieuszkodzonej, otwartej ramki odczytu.

Stwierdzono wewnątrz nukleotydu znaczną różnorodność i kodowaną sekwencję aminokwasową poprzez genom HCV. Scharakteryzowano co najmniej sześć głównych genotypów i opisano ponad 50 podtypów. W skali światowej rozkład głównych genotypów wirusa HCV jest różny i znaczenie kliniczne różnorodności genetycznej wirusa HCV, pomimo wielu badań możliwego wpływu genotypów na patogenezę i leczenie, pozostaje trudne do określenia.

Długość jednoniciowego genomu RNA wirusa HCV wynosi w przybliżeniu 9500 nukleotydów i posiada pojedynczą, otwartą ramkę odczytu (ORF) kodująca pojedynczą, dużą poliproteinę składającą się z około 3000 aminokwasów. W komórkach zakażonych, ta poliproteina jest rozszczepiana w wielu miejscach przez proteazy komórkowe i proteazy wirusowe, w celu wytworzenia białek strukturalnych i białek niestrukturalnych (NS). W przypadku wirusa HCV, wytworzenie dojrzałych białek niestrukturalnych (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A i NS5B) jest wynikiem działania dwóch proteaz wirusowych. Pierwsza z nich, jak dotąd słabo poznana, rozszczepia połączenie NS2-NS3, natomiast druga jest proteazą serynową znajdującą się w regionie N-końcowym białka NS3 (określana jako proteaza NS3) i pośredniczy we wszystkich kolejnych rozszczepieniach w kierunku 5'^3' nici NS3, zarówno w układzie cis przy miejscu rozszczepienia NS3-NS4A jak i w układzie trans dla pozostałych miejsc NS4A-NS4B, NS4B-NS5A, NS5A-NS5B. Okazuje się, że białko NS4A pełni wielorakie funkcje, działając jako kofaktor dla proteazy NS3 i prawdopodobnie uczestniczy w umiejscowieniu błonowym białka NS3 oraz innych składników replikacji wirusowej. Wydaje się, że utworzenie kompleksu białka NS3 z NS4A jest niezbędne dla zdarzeń które zwiększają wydolność proteolityczną we wszystkich miejscach. Białko NS3 charakteryzuje się także aktywnościami trifosfatazy nukleozydowej i helikazy RNA. NS5B jest polimerazą RNA zależną od RNA, która bierze udział w replikacji wirusa HCV.

Wśród związków które wykazują skuteczność w hamowaniu wirusa HCV, jako selektywne inhibitory proteazy serynowej wirusa HCV, znajdują się związki peptydowe ujawnione w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 6,323,180.

PL 211 889 B1

Przedmiotem wynalazku jest związek o wzorze:

w którym R1 oznacza:

PL 211 889 B1

albo jego sól dopuszczona do stosowania w farmacji lub jego solwat.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie związku według wynalazku albo jego soli dopuszczonej do stosowania w farmacji lub jego solwatu do wytwarzania leku do leczenia infekcji wirusem HCV.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto kompozycja zawierająca substancję aktywną i nośnik dopuszczony do stosowania w farmacji, charakteryzująca się tym, że substancją aktywną jest związek według wynalazku albo jego sól dopuszczona do stosowania w farmacji lub jego solwat.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie kompozycji według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia pacjenta zakażonego wirusem zapalenia wątroby typu C.

Kompozycje według wynalazku są użyteczne w hamowaniu HCV NS3.

Sposoby leczenia pacjentów zakażonych wirusem HCV obejmują podawanie pacjentowi leczniczo skutecznej ilości związku według obecnego wynalazku albo jego soli dopuszczonej do stosowania w farmacji, jego solwatu lub proleku. Sposoby hamowania proteazy HCV NS3 polegają na podawaniu pacjentowi skutecznej ilości związku według obecnego wynalazku.

Obecny wynalazek umożliwia dostarczenie ulepszonych leków zawierających związki według wynalazku, które mogą być skuteczne w leczeniu pacjentów zakażonych wirusem HCV. Dokładniej, przedmiotem obecnego wynalazku są związki peptydowe, które mogą hamować czynność proteazy NS3, na przykład w połączeniu z proteazą NS4A.

W niniejszym opisie, definicje i konwencje stereochemiczne stosuje się w oparciu o wytyczne zamieszczone McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms, edycja S. P. Parker, McGraw-Hill Book Company, New York (1984) i w Stereochemistry of Organic Compounds, E. Eliel i S. Wilen, John Wiley & Sons, Inc., New York (1994). Wiele związków organicznych istnieje w postaciach optycznie czynnych, to znaczy mają one zdolność skręcania płaszczyzny światła spolaryzowanego liniowo. W opisie związku optycznie czynnego, prefiksy D i L lub R i S stosuje się do oznaczenia konfiguracji absolutnej cząsteczki wokół jej centrum chiralnego (centrów chiralnych). Prefiksy d i l lub ( + ) i (-) stosuje się do oznaczenia kierunku obrotu światła spolaryzowanego liniowo przez związek, przy czym ( - ) lub 1 oznacza że związek jest lewoskrętny oraz ( + ) lub d oznacza że związek jest prawoskrętny. W przypadku określonej budowy chemicznej, związki te nazywane stereoizomerami są identyczne, z tym że stanowią odbicie lustrzane względem siebie. Określony stereoizomer z pary stanowiącej odbicie lustrzane względem siebie, określa się także nazwą enancjomer, przy czym mieszanina takich izomerów nazywana jest często mieszaniną enancjomeryczną.

Jeżeli nie zdefiniowano inaczej, nazewnictwo użyte do opisania grup organicznych, na przykład węglowodorów i węglowodorów podstawionych, opiera się ogólnie na znanej w tej dziedzinie standardowej nomenklaturze. Jeżeli nie stwierdzono inaczej, to połączenia grup, na przykład „alkiloalkoksyamina, obejmują wszystkie stabilne konfiguracje. Dla ilustracji, poniżej zdefiniowano pewne grupy i połączenia grup.

PL 211 889 B1

Określenia „mieszanina racemiczna i „racemat odnoszą się do równomolowej mieszaniny dwóch cząsteczek enancjomerycznych, nie wykazującej aktywności optycznej.

Określenie „chiralny odnosi się do cząsteczek które charakteryzują się tym że ich odbicia lustrzane nie dają się na siebie nałożyć, natomiast określenie „achiralny odnosi się do cząsteczek które charakteryzują się tym, że ich odbicia lustrzane dają się na siebie nałożyć.

Określenie „stereoizomery odnosi się do związków o identycznym składzie chemicznym lecz o odmiennym rozmieszczeniu atomów lub grup w przestrzeni.

Określenie „diastereoizomer odnosi się do stereoizomeru który nie jest enancjomerem, na przykład do stereoizomerów posiadających dwa centra chiralne lub ich większą ilość i których cząsteczki nie są odbiciami lustrzanymi względem siebie. Diastereoizomery posiadają różne właściwości fizyczne, na przykład temperatury topnienia, temperatury wrzenia, właściwości spektralne i reaktywności. Mieszaniny diastereoizomerów można rozdzielać z zastosowaniem procedur analitycznych o wysokiej rozdzielczości, takich jak elektroforeza i chromatografia.

Określenie „enancjomery odnosi się do dwóch stereoizomerów związku, których odbicia lustrzane nie dają się na siebie nałożyć.

Określenie „sól dopuszczona do stosowania w farmacji obejmuje sole nietoksyczne syntetyzowane ze związków, które posiadają fragment zasadowy lub kwasowy, z zastosowaniem tradycyjnych metod chemicznych. Zwykle, takie sole można wytworzyć w reakcji postaci wolnego kwasu lub wolnej zasady tych związków ze stechiometryczną ilością zasady lub kwasu, w środowisku wodnym lub w środowisku rozpuszczalnika organicznego albo w mieszaninie tych dwóch mediów, przy czym zwykle preferowane są media niewodne, takie jak eter, octan etylu, etanol, izopropanol lub acetonitryl. Wykazy odpowiednich soli zamieszczone są w Remington's Pharmaceutical Sciences, wydanie 18-te, Mack Publishing Company, Easton, PA, 1990, strona 1445. Związki według obecnego wynalazku są użyteczne w postaci wolnej zasady lub wolnego kwasu albo w postaci ich soli dopuszczonej do stosowania w farmacji. Wszystkie te postacie mieszczą się w zakresie wynalazku.

Określenie „ilość skuteczna leczniczo oznacza ilość całkowitą każdego składnika aktywnego, która jest odpowiednia dla wywołania znaczącej korzyści u pacjenta, na przykład wydłużonego zmniejszenia obciążenia wirusem. W przypadku stosowania pojedynczego składnika aktywnego, podawanego indywidualnie, określenie to odnosi się do tego pojedynczego składnika. Gdy określenie stosuje się do połączenia, to odnosi się ono do połączonej ilości składników aktywnych powodujących skutek leczniczy, bez względu na to czy są podawane w połączeniu, czy kolejno, czy też równocześnie.

Określenie „związki według wynalazku i wyrażenia równoważne, obejmują związki o wyżej przedstawionym wzorze oraz ich sole dopuszczone do stosowania w farmacji i solwaty, na przykład hydraty. Podobnie, odniesienie się do produktów pośrednich obejmuje ich sole i solwaty, tam gdzie kontekst na to pozwala.

Określenie „pochodna oznacza związek zmodyfikowany chemicznie, przy czym jako modyfikację specjalista chemik uważa zwykle tworzenie estru lub amidu kwasu, w przypadku alkoholu lub tiolu zabezpieczenie taką grupą jak grupa benzylowa oraz w przypadku aminy zabezpieczenie grupą tert-butoksykarbonylową.

Określenie „solwat oznacza asocjację fizyczną związku według tego wynalazku z jedną cząsteczką rozpuszczalnika lub z ich większą ilością, czy to rozpuszczalnika organicznego czy też nieorganicznego. Ta asocjacja fizyczna obejmuje wiązanie wodorowe. W pewnych przypadkach, solwat będzie miał zdolność do wyodrębnienia się, na przykład gdy jedna cząstka rozpuszczalnika lub ich większa ilość jest wprowadzona do siatki krystalicznej substancji krystalicznej. Określenie „solwat obejmuje zarówno solwaty w fazie ciekłej jak i solwaty wyodrębnione. Do przykładów solwatów zalicza się hydraty, etanolaty, metanolaty i tym podobne

Użyte w niniejszym opisie określenie „prolek oznacza pochodne związków według wynalazku, które posiadają grupy zdolne do chemicznego lub metabolicznego odszczepienia i stają się, w wyniku solwolizy lub w warunkach fizjologicznych, związkami według wynalazku, które są aktywne farmaceutycznie in vivo. Prolek związku można wytworzyć tradycyjnymi metodami z grupami funkcyjnymi związków, takimi jak grupa aminowa, grupa hydroksy lub grupa karboksy, gdy są one obecne. Postać proleku pozwala często na uzyskanie korzyści w zakresie rozpuszczalności, zgodności tkankowej lub opóźnionego uwalniania w organizmie ssaka (patrz Bundgard H., Design of Prodrugs, strony 7-9, 21-24, Elsevier, Amsterdam 1985). Do proleków zalicza się pochodne kwasowe dobrze znane lekarzowi specjaliście w tej dziedzinie, takie jak na przykład estry wytwarzane w reakcji macierzystego związku

PL 211 889 B1 kwasowego z odpowiednim alkoholem albo amidy wytwarzane w reakcji macierzystego związku kwasowego z odpowiednią aminą.

Określenie „pacjent obejmuje zarówno ludzi jak i inne ssaki.

Określenie „kompozycja farmaceutyczna oznacza kompozycję zawierającą związek według wynalazku w połączeniu z co najmniej jednym, dodatkowym nośnikiem farmaceutycznym, to jest ze środkiem wspomagającym, z substancją pomocniczą lub z podłożem, takim jak rozcieńczalniki, środki konserwujące, substancje wypełniające, środki poślizgowe, substancje rozsadzające, substancje zwilżające, emulgatory, środki dyspergujące, substancje słodzące, substancje smakowe, substancje zapachowe, środki przeciwbakteryjne, środki przeciwgrzybicze, środki smarujące i środki ułatwiające dozowanie, w zależności od rodzaju postaci dawkowania i sposobu ich podawania. Na przykład, można stosować składniki wymienione w Remington's Pharmaceutical Sciences, wydanie 18-te, Mack Publishing Company, Easton, PA (1999).

Wyrażenie „dopuszczony do stosowania w farmacji stosuje się w niniejszym opisie w celu odniesienia do tych związków, materiałów, kompozycji i/lub postaci dawkowania, które zgodnie z ustaloną oceną medyczną nadają się do stosowania w kontakcie z tkankami pacjentów, bez nadmiernej toksyczności, nadmiernego podrażnienia, nadmiernej odpowiedzi alergicznej lub bez innych problemów albo komplikacji, proporcjonalnie do rozsądnego stosunku ryzyko/korzyść.

Określenie „leczenie odnosi się do: (i) zapobiegania chorobie, zaburzeniu lub stanowi które mogą wystąpić u pacjenta predysponowanego na tę chorobę, zaburzenie i/lub stan lecz u którego jeszcze nie rozpoznano tej choroby, zaburzenia i/lub tego stanu; (ii) hamowania choroby, zaburzenia lub stanu, to znaczy zatrzymania ich rozwoju; oraz (iii) łagodzenia choroby, zaburzenia lub stanu, to znaczy powodowania cofnięcia się choroby, zaburzenia i/lub stanu.

Jeżeli nie określono inaczej, to użyte w niniejszym opisie określenie „podstawiony obejmuje podstawienie od jednej do maksymalnej liczby możliwych miejsc wiązania na rdzeniu, na przykład w grupie organicznej, z którą związany jest podstawnik, na przykład podstawienie mono-, di-, tri- lub tetra-.

Jak to użyto w niniejszym opisie, określenie atom fluorowca oznacza podstawnik fluorowcowy wybrany spośród atomów bromu, chloru, fluoru lub jodu. Określenie „fluorowcoalkil oznacza grupę alkilową podstawioną jednym podstawnikiem fluorowcowym albo ich większą ilością.

Jak to użyto w niniejszym opisie, określenie „alkil oznacza acykliczne podstawniki alkilowe o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym i na przykład obejmuje metyl, etyl, propyl, butyl, tert-butyl, heksyl, 1-metyloetyl, 1-metylopropyl, 2-metylopropyl, 1,1-dimethylethyl. Tak więc, określenie C1-6-alkil odnosi się do grupy alkilowej posiadającej od jednego do sześciu atomów węgla. Określenie „niższy alkil oznacza grupę alkilową posiadającą od jednego do sześciu, korzystnie od jednego do czterech atomów węgla. Określenie „alkiloester oznacza grupę alkilową zawierającą dodatkowo grupę estrową. Zwykle, przy ustalonej liczbie atomów węgla, na przykład w grupie C2-6-alkiloestrowej, określenie obejmuje wszystkie atomy węgla w grupie.

Jak to użyto w niniejszym opisie, określenie „alkenyl oznacza grupę alkilową zawierającą co najmniej jedno podwójne wiązanie, na przykład etenyl (winyl) i alkil.

Użyte w niniejszym opisie określenie „grupa alkoksy oznacza grupę alkilową ze wskazaną liczbą atomów węgla przyłączonych do atomu tlenu. Określenie grupa alkoksy obejmuje na przykład grupę metoksy, grupę etoksy, grupę propoksy, grupę 1-metyloetoksy, grupę butoksy i grupę 1,1-dimetyloetoksy. Ta ostatnia grupa jest określana w tej dziedzinie jako grupa tert-butoksy. Określenie „alkoksykarbonyl oznacza grupę alkoksy zawierającą dodatkowo grupę karbonylową.

Jak to użyto w niniejszym opisie, określenie „grupa fluorowcoalkoksy oznacza -O-(fluorowcoalkil), gdzie fluorowcoalkil został uprzednio zdefiniowany.

Jak to użyto w niniejszym opisie, określenie „alkanoil oznacza grupy 1-oksoalkilowe o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym, zawierające wskazaną liczbę atomów węgla i obejmuje takie grupy jak na przykład formyl, acetyl, 1-oksopropylo(propionyl), 2-metylo-1-oksopropyl, 1-oksoheksyl i tym podobne.

Użyte w niniejszym opisie określenie „cykloalkil oznacza podstawnik cykloalkilowy zawierający wskazaną liczbę atomów węgla i obejmuje na przykład cyklopropyl, cyklobutyl, cyklopentyl, cykloheksyl, cykloheptyl oraz cykliczne grupy spiranowe, takie jak spirocyklopropyl lub spirocyklobutyl. Jak to użyto w niniejszym opisie, określenie „grupa cykloalkoksy oznacza grupę cykloalkilową przyłączoną do atomu tlenu, taką jak na przykład cyklobutyloksy or cyklopropyloksy. Określenie „alkilocykloalkil oznacza cykloalkil przyłączony do grupy alkilowej. Jeżeli nie określono inaczej, to ustalony zakres liczby atomów węgla obejmuje całkowitą liczbę atomów węgla w grupie. Taki C4-10-alkilocykloalkil mo8

PL 211 889 B1 że zawierać od 1 do 7 atomów węgla w grupie alkilowej i od 3 do 9 atomów węgla w pierścieniu, i może to być na przykład cyklopropylometyl lub cykloheksyloetyl.

Użyte w niniejszym opisie określenie „aryl oznacza aromatyczny fragment cząsteczki zawierający wskazaną liczbę atomów węgla, taki jak fenyl, indanyl lub naftyl lecz nie ograniczając się do nich. Na przykład określenie C6-10-aryl oznacza aromatyczny fragment cząsteczki posiadający od 6 do 10 atomów węgla, który może mieć budowę monocykliczną lub bicykliczną. Użyte w niniejszym opisie określenie „fluorowcoaryl odnosi się do arylu mono-, di- lub tripodstawionego jednym atomem fluorowca lub ich większą ilością. Określenia „alkiloaryl, „aryloalkil i „aryloalkiloalkil oznaczają grupę arylową podstawioną jedną grupą alkilową lub ich większą ilością. Tak więc grupa C7-14-alkiloarylowa może posiadać od 1 do 8 atomów węgla w grupie alkilowej, w przypadku monocyklicznej grupy aromatycznej i od 1 do 4 atomów węgla w grupie alkilowej, w przypadku skondensowanej grupy aromatycznej. Do grup arylowych zalicza się grupy podstawione typowymi podstawnikami znanymi przez specjalistów, takimi jak na przykład atom fluorowca, grupa hydroksy, grupa karboksy, karbonyl, grupa nitrowa, grupa sulfonowa, grupa aminowa, grupa cyjanowa, grupa dialkiloaminowa, fluorowcoalkil, CF3, grupa fluorowcoal-koksy, tioalkil, alkanoil, SH, grupa alkiloaminowa, grupa alkiloamidowa, grupa dialkiloamidowa, karboksyester, grupa alkilosulfonowa, grupa alkilosulfonamidowa i grupa alkiIo (alkoksy)aminowa. Do przykładów grup alkiloarylowych zalicza się benzyl, butylofenyl i 1-naftylofenyl. Określenia „grupa alkiloaryloksy i „grupa alkiloaryloester oznacza grupy alkiloarylowe zawierające odpowiednio atom tlenu i grupę estrową.

Jak to użyto w niniejszym opisie, określenie „karboksyalkil oznacza grupę karboksy (COOH) dołączoną do grupy alkilowej, którą zdefiniowano powyżej i obejmuje na przykład kwas masłowy.

Jak to użyto w niniejszym opisie, określenie „alkanoil oznacza grupy 1-oksoalkilowe o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym, zawierające wskazaną liczbę atomów węgla i obejmuje takie grupy jak na przykład formyl, acetyl, 1-oksopropylo-(propionyl), 2-metylo-1-oksopropyl, 1-oksoheksyl i tym podobne.

Użyte w niniejszym opisie określenie „aminoaryloalkil oznacza grupę aminową podstawioną grupą aryloalkilową, taką jak poniższa grupa aminoaryloalkilowa.

Jak to użyto w niniejszym opisie, określenie „alkiloamid oznacza amid monopodstawiony grupą alkilową, taki jak grupa o poniższym wzorze.

Użyte w niniejszym opisie określenie „grupa heterocykliczna oznaczana również skrótem „Het, oznacza grupę jednowartościową uzyskaną przez usunięcie atomu wodoru pięcio-, sześcio- lub siedmioczłonowej, nasyconej lub nienasyconej grupy heterocyklicznej (wliczając w to grupy aromatyczne), zawierającej od jednego do czterech heteroatomów wybranych spośród atomów azotu, tlenu lub siarki. Ponadto, określenie grupa heterocykliczna obejmuje zdefiniowane powyżej grupy heterocykliczne, które są skondensowane z jedną lub z większą ilością innych struktur pierścieniowych. W przypadku grup heterocyklicznych zawierających atom azotu, to atom azotu może być podstawiony C1-6-alkilem, szczególnie metylem. W przypadku grup heterocyklicznych zawierających atom siarki, definicja obejmuje również grupy heterocykliczne zawierające utlenioną postać siarki, to jest SO i SO2. Grupy heterocykliczne obejmują takie grupy które są podstawione typowymi podstawnikami, które są znane specjalistom w tej dziedzinie, na dowolnym spośród pierścieniowych atomów węgla, przy czym ilość podstawników wynosi na przykład od jednego do trzech. Do przykładów takich podstawników zalicza się C1-6-alkil, C3-7-cykloalkil, grupę C1-6-alkoksy, grupę C3-7-cykloalkoksy, fluorowco-C1-6-alkil, CF3, grupę mono- lub di-fluorowco-C1-6-alkoksy, grupę cyjanową, atom fluorowca, tioalkil, grupę hydroksy, alkanoil, NO2, SH, grupę aminową, grupę C1-6-alkiloaminową, grupę di-(C1-6)-alkiloaminową, grupę di-(C1-6)-alkiloamidową, grupę karboksy, (C1-6)-karboksyester, C1-6-alkilosulfon, grupę C1-6-alkilosulfonamidową,

PL 211 889 B1

C1-6-alkilosulfotlenek, grupę di-(C1-6)-alkilo(alkoksy)aminową, C6-10-aryl, C7-14-alkiloaryl oraz od pięciodo siedmioczłonową monocykliczną grupę heterocykliczną. Do przykładów odpowiednich grup heterocyklicznych zalicza się:

PL 211 889 B1

lecz nie ograniczając się do nich.

Jak to użyto w niniejszym opisie, określenie „grupa alkiloheterocykliczna oznacza zdefiniowaną powyżej grupę heterocykliczną przyłączona poprzez grupę alkilową o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym, przy czym grupa alkilowa jest grupą zdefiniowaną powyżej, zawierającą wskazaną liczbę atomów węgla. Do przykładów grup C1-6-alkiloheterocyklicznych zalicza się:

Użyte w niniejszym opisie oznaczenia „P1', P1, P2, P3 i P4, zastosowane w nazwach związków, odwzorowują względne pozycje wiązania reszt aminokwasowych inhibitora proteazy w stosunku do pozycji wiązania rozszczepionego substratu naturalnego peptydu. Rozszczepienie następuje w naturalnym substracie pomiędzy pozycjami P1 i P1', gdzie pozycje bez wskaźnika prim wskazują aminokwasy rozpoczynające się od C-końcowego miejsca rozszczepienia naturalnego peptydu i rozciągające się do miejsca N-końcowego, podczas gdy pozycje ze wskaźnikiem prim rozciągają się od N-końcowego miejsca rozszczepienia w kierunku miejsca C-końcowego. Na przykład, oznaczenie P1' odnosi się do pierwszej pozycji z dala od prawego, C-końcowego miejsca rozszczepienia (to znaczy do pierwszej pozycji N-końcowej); podczas gdy P1 jest początkiem numerowania od lewej strony C-końcowego miejsca rozszczepienia, P2 oznacza drugą pozycję miejsca C-końcowego i tak dalej. Patrz: Berger A. & Schechter I., Transactions of the Royal Society London series (1970), B257, strony 249-264].

Tak więc, w pochodnych heterocyklosulfonamidowych o wzorze I, części „od P1' do P4 cząsteczki są takie jak to przedstawiono poniżej:

PL 211 889 B1

Jak to użyto w niniejszym opisie, określenie „kwas 1-aminocyklopropylokarboksylowy (Acca), odnosi się do związku o wzorze:

Jak to użyto w niniejszym opisie, określenie „tert-butyloglicyna odnosi się do związku o wzorze:

Określenie „reszta, w odniesieniu do aminokwasu lub pochodnej aminokwasu, oznacza grupę pochodzącą od odpowiedniego α-aminokwasu, powstałą w wyniku eliminacji grupy OH z grupy karboksylowej i jednego atomu wodoru z grupy α-aminokwasowej. Na przykład, określenia Gln, Ala, Gly, Ile, Arg, Asp, Phe, Ser, Leu, Cys, Asn, Sar i Tyr oznaczają „reszty odpowiednio L-glutaminy, L-alaniny, glicyny, L-izoleucyny, L-argininy, kwasu L-asparaginowego, L-fenyloalaniny, L-seryny, L-leucyny, L-cysteiny, L-asparaginy, sarkozyny i L-tyrozyny.

Określenie „łańcuch boczny, użyte w odniesieniu do aminokwasu lub reszty aminokwasowej, oznacza grupę przyłączoną do alfa atomu węgla α-aminokwasu. Na przykład, w przypadku glicyny grupą R stanowiącą łańcuch boczny jest atom wodoru, w przypadku alaniny jest to metyl oraz w przypadku waliny jest to izopropyl. Odnośnie specjalnych grup R lub łańcuchów bocznych aminokwasów, patrz: A.L. Lehninger's text on Biochemistry (rozdział 4).

Korzystne jest gdy m oznacza 2. Korzystne jest także gdy n oznacza 1. Dodatkowo korzystne jest gdy R2 oznacza etyl lub etenyl.

R1 może oznaczać niepodstawioną lub podstawioną grupę Het, przy czym podstawniki Het są takie same lub różne i są wybrane spośród takich grup jak atom fluorowca, grupa cyjanowa, trifluorometyl, grupa nitrowa, C1-6-alkil, grupa C1-6-alkoksy, grupa amidowa, grupa C1-6-alkanoiloaminowa, grupa aminowa, fenyl lub grupa fenylotio, przy czym fenyl lub fragment fenylowy grupy fenylotio są niepodstawione lub podstawione takimi samymi lub różnymi podstawnikami, w ilości od jednego do trzech, wybranymi spośród takich grup jak atom fluorowca, grupa cyjanowa, grupa nitrowa, C1-6-alkil, grupa C1-6-alkoksy, grupa amidowa lub fenyl. Korzystnie, R1 oznacza:

PL 211 889 B1

R2 może oznaczać C1-6-alkil, C2-6-alkenyl lub C3-7-cykloalkil, przy czym każda z tych grup może być ewentualnie podstawiona atomem fluorowca, w ilości od 1 do 3; albo R2 oznacza H; albo R2 razem z atomem węgla do którego jest przyłączony tworzy trzy-, cztero- lub pięcioczłonowy pierścień. Korzystnie, R2 oznacza C1-6-alkil, C2-6-alkenyl lub C3-7-cykloalkil. Korzystniej R2 oznacza etyl lub winyl.

R3 może oznaczać C1-8-alkil, ewentualnie podstawiony taką grupą jak atom fluorowca, grupa cyjanowa, grupa aminowa, grupa C1-6-dialkilo-aminowa, C6-10-aryl, C7-14-alkiloaryl, grupa C1-6-alkoksy, grupa karboksy, grupa hydroksy, grupa aryloksy, grupa C7-14-alkilo-aryloksy, C2-6-alkiloester, C8-I5-alkiloaryloester; C3-12-alkenyl, C3-7-cykloalkil lub C4-10-alkilocykloalkil, przy czym cykloalkil lub alkilocykloalkil są ewentualnie podstawione grupą hydroksy, C1-6-alkilem, C2-6-alkenylem lub grupą C1-6-alkoksy; albo podstawnik R3 razem z atomem węgla do którego jest przyłączony tworzy C3-7-cykloalkil ewentualnie podstawiony C2-6-alkenylem. Korzystnie R3 oznacza C1-8-alkil, ewentualnie podstawiony taką grupą jak C6-10-aryl, grupa C1-6-alkoksy, grupa karboksy, grupa hydroksy, grupa aryloksy, grupa C7-14-alkiloaryloksy, C2-6-alkiloester, C8-15-alkilo-aryloester; C3-12-alkenyl, C3-7-cykloalkil lub C4-10-alkilo-cykloalkil. Korzystniej, R3 oznacza C1-8-alkil ewentualnie podstawiony grupą C1-6-alkoksy lub C3-7-cykloalkilem, na przykład C1-6-alkil. Najkorzystniej, R3 oznacza tert-butyl.

Y może oznaczać H, fenyl podstawiony grupą nitrową, pirydyl podstawiony grupą nitrową lub C1-6-alkil ewentualnie podstawiony grupą cyjanową, grupą OH lub C3-7-cykloalkilem; z tym zastrzeżeniem, że jeżeli R4 lub R5 oznacza H to Y oznacza H.

PL 211 889 B1

B może oznaczać H, C1-6-alkil, R4-(C=O)-, R4O(C=O)-, R4-NR5)-C(=O)-, R4-N(R5)-C(=S)-, R4SO2- lub R4-N(R5)-SO2-. Korzystnie, B oznacza R4-(C=O)-, R4O(C=O)- lub R4-N(R5)-C (=O).

R4 może oznaczać: (i) C1-10-alkil ewentualnie podstawiony taką grupą jak fenyl, grupa karboksy, C1-6-alkanoil, atom fluorowca w ilości od 1 do 3, grupa hydroksy, -OC(O)-C1-6-alkil, grupa C1-6-alkoksy, grupa aminowa ewentualnie podstawiona C1-6-alkilem, grupą amidową lub grupą (niższy alkil)amidową;

(ii) C3-7-cykloalkil, grupę C3-7-cykloalkoksy lub C4-10-alkilocykloalkil, przy czym każdy z podstawników jest ewentualnie podstawiony taką grupą jak grupa hydroksy, grupa karboksy, (C1-6-alkoksy) karbonyl, grupa aminowa ewentualnie podstawiona C1-6-alkilem, grupą amidową lub grupą (niższy alkil)amidową;

(iii) C6-10-aryl lub C7-16-aryloalkil, przy czym każdy z tych podstawników jest ewentualnie podstawiony taką grupą jak C1-6-alkil, atom fluorowca, grupa nitrowa, grupa hydroksy, grupa amidowa, grupa (niższy alkil)-amidowa lub grupa aminowa ewentualnie podstawiona C1-6-alkilem;

(iv) grupę Het;

(v) bicyklo(1.1.1)pentan; lub (vi) -C(O)OC-C1-6-alkil, C2-6-alkenyl lub C2-6-alkinyl.

Korzystnie, R4 oznacza: (i) C1-10-alkil ewentualnie podstawiony taką grupą jak fenyl, grupa karboksy, C1-6-alkanoil, atom fluorowca w ilości od 1 do 3, grupa hydroksy, grupa C1-6-alkoksy; (ii) C3-7-cykloalkil, grupę C3-7-cykloalkoksy lub C4-10-alkilocykloalkil; lub (iii) C6-10-aryl lub C7-16-aryloalkil, przy czym każdy z tych podstawników jest ewentualnie podstawiony taką grupą jak C1-6-alkil lub atom fluorowca. Korzystniej, R4 oznacza: (i) C1-10-alkil ewentualnie podstawiony atomem fluorowca w ilości od 1 do 3 lub grupą C1-6-alkoksy; lub (ii) C3-7-cykloalkil lub C4-10-alkilocykloalkil. Najkorzystniej, R4 oznacza tert-butyl.

R5 może oznaczać Η; C1-6-alkil ewentualnie podstawiony atomami fluorowca w ilości od 1 do 3; lub grupę C1-6-alkoksy, z tym zastrzeżeniem, że R4 oznacza C1-10-alkil. Korzystnie, R5 oznacza H lub C1-6-alkil ewentualnie podstawiony atomami fluorowca w ilości od 1 do 3. Korzystniej, R5 oznacza H.

Podstawniki z każdej grupy mogą być wybrane indywidualnie i połączone w dowolnych kombinacjach, które umożliwiają uzyskanie stabilnego związku zgodnie z obecnym wynalazkiem. Również, na rdzeniu każdej grupy może być podstawionych więcej podstawników niż jeden, z tym zastrzeżeniem, że są dostępne odpowiednie miejsca wiążące.

W korzystnej odmianie, pochodne heterocyklosulfonamidowe posiadają budowę opisaną wzorem II:

Wzór XI w którym R3, R1, B i Y posiadają znaczenie zdefiniowane dla wzoru I oraz R12 oznacza C1-6-alkil, C2-6-alkenyl lub H.

Zgodnie z inną, korzystną odmianą, pochodne heterocyklosulfonamidowe posiadają budowę opisaną wzorem III:

PL 211 889 B1

w którym R3, R1, B i Y posiadają znaczenie zdefiniowane dla wzoru I.

Zgodnie z inną, korzystną odmianą, pochodne heterocyklosulfonamidowe posiadają budowę opisaną wzorem IV

w którym R3, R1, B i Y posiadają znaczenie zdefiniowane dla wzoru I.

Zgodnie z inną, korzystną odmianą pochodne heterocyklosulfonamidowe posiadają budowę opisaną wzorem V:

PL 211 889 B1

w którym R3, R1, n, B i Y posiadają znaczenie zdefiniowane dla wzoru I oraz ρ oznacza liczbę od 1 do 5.

Diastereoizomery związków o wzorze V charakteryzują się zdolnością rotacji oraz występują albo w mieszaninie albo są pojedynczymi diastereoizomerami wytworzonymi indywidualnie lub wydzielonymi z mieszaniny diastereoizomerycznej.

W jeszcze innej, odmiennej, korzystnej odmianie, pochodne heterocyklosulfonamidowe są opisane poniższym wzorem strukturalnym:

w którym:

R1 oznacza niepodstawioną lub podstawioną grupę Het, przy czym podstawniki Het są takie same lub różne i są wybrane spośród grup, w ilości od jednej do trzech, takich jak atom fluorowca, grupa cyjanowa, trifluorometyl, grupa nitrowa, C1-6-alkil, grupa C1-6-alkoksy, grupa amidowa, grupa C1-6-alkanoiloaminowa, grupa aminowa, fenyl lub grupa fenylotio, przy czym fenyl lub fragment fenylowy grupy fenylotio są niepodstawione lub podstawione takimi samymi lub różnymi podstawnikami, w ilości od jednej do trzech, wybranymi spośród takich grup jak atom fluorowca, grupa cyjanowa, grupa nitrowa, C1-6-alkil, grupa C1-6-alkoksy, grupa amidowa lub fenyl; n oznacza 1 lub 2;

PL 211 889 B1 (c) R32 oznacza Η, C1-6-alkil, grupę C1-3-alkoksy, C3-7-cykloalkil, C2-6-alkenyl lub C2-6-alkinyl, przy czym wszystkie te grupy są ewentualnie podstawione atomem fluorowca;

(d) R33 oznacza C1-8-alkil, C3-12-alkenyl, C3-7-cykloalkil, C4-13-Cykloalkenyl lub C4-10-alkilocykloalkil, przy czym wszystkie te podstawniki są ewentualnie podstawione taką grupą jak grupa hydroksy, grupa C1-6-alkoksy, C1-6-tioalkil, grupa aminowa, grupa amidowa, grupa (niższy alkil)-amidowa, grupa C6- lub C10-arylowa albo C7-16-aryloalkil;

(e) Y2 oznacza H lub C1-6-alkil;

(f) B2 oznacza H, R14-(C=O)-, R14-O(C=O)-, R14-N(R15) -C(=O)-, R14-N(R15)-C(=S)-, R14SO2lub R₁₄-N (R₁₅)-SO₂-;

(g) R14 oznacza:

(i) C1-10-alkil ewentualnie podstawiony taką grupą jak grupa karboksy, C1-6-alkanoil, grupa hydroksy, grupa C1-6-alkoksy, grupa aminowa ewentualnie mono- lub dipodstawioną C1-6-alkilem, grupa amidowa lub grupa (niższy alkil)-amidowa;

(ii) C3-7-cykloalkil, grupę C3-7-cykloalkoksy lub C4-10-alkilocykloalkil, przy czym każdy z podstawników jest ewentualnie podstawiony taką grupą jak grupa hydroksy, grupa karboksy, (C1-6-alkoksy)karbonyl, grupa aminowa ewentualnie mono- lub dipodstawioną C1-6-alkilem, grupą amidową lub grupą (niższy alkil)-amidową;

(iii) grupę aminową ewentualnie mono- lub dipodstawioną C1-6-alkilem; grupę amidową; lub grupę (niższy alkil) -amidową;

(iv) C6- lub C10-aryl albo C7-16-aryloalkil, przy czym wszystkie te grupy ewentualnie podstawione taką grupą jak C1-6-alkil, grupa hydroksy, grupa amidowa, grupa (niższy alkil)amidowa albo grupa aminowa ewentualnie mono- lub dipodstawioną C1-6-alkilem; albo (v) grupę Het lub grupę (niższy alki)-Het, przy czym obie te grupy ewentualnie podstawione taką grupą jak C1-6-alkil, grupa hydroksy, grupa amidowa, grupa (niższy alkil)amidowa lub grupa aminowa ewentualnie mono- lub dipodstawioną C1-6-alkilem; oraz

h) R15 oznacza H lub C1-6-alkil.

Korzystniejszą grupą związków według obecnego wynalazku ą związki opisane poniższym wzorem:

którym R1' oznacza:

PL 211 889 B1

Związki według obecnego wynalazku, gdy są w postaci zasadowej, mogą tworzyć sole w wyniku dodania kwasu dopuszczonego do stosowania w farmacji. Sole addycyjne z kwasem wytwarza się ze związku o wzorze I i kwasu dopuszczonego do stosowania w farmacji, wliczając w to kwas chlorowodorowy, kwas bromowodorowy, kwas jodowodorowy, kwas siarkowy, kwas fosforowy albo taki kwas organiczny jak kwas p-toluenosulfonowy, kwas metanosulfonowy, kwas octowy, kwas benzoesowy, kwas cytrynowy, kwas malonowy, kwas fumarowy, kwas maleinowy, kwas szczawiowy, kwas bursztynowy, kwas amidosulfonowy lub kwas winowy lecz nie ograniczając się do nich. Tak więc, do przykładów takich soli dopuszczonych do stosowania w farmacji zalicza się chlorek, bromek, jodek, siarczan, fosforan, metanosulfonian, cytrynian, octan, malonian, fumaran, amidosulfonian i winian.

Sole grupy aminowej mogą także obejmować czwartorzędowe sole amoniowe, w których aminowy atom azotu jest nośnikiem odpowiedniej grupy organicznej, takiej jak alkil, alkenyl, alkinyl lub aryloalkil.

Związki według obecnego wynalazku, które są podstawione grupą kwasową, mogą istnieć w postaci soli utworzonych przez dodanie zasady. Do takich soli addycyjnych z zasadą zalicza się te które pochodzą od zasad nieorganicznych, do których zalicza się na przykład sole metali alkalicznych (na przykład sodu i potasu), sole metali ziem alkalicznych (na przykład wapnia i magnezu) sole glinu i sole amoniowe. Ponadto, do odpowiednich soli zalicza się sole dopuszczalnych fizjologicznie zasad organicznych, takich jak trimetyloamina, trietyloamina, morfolina, pirydyna, piperydyna, pikolina, dicykloheksyloamina, N,N,-dibenzyloetylenodiamina, 2-hydroksyetyloamina, bis-(2-hydroksyetylo)amina, tri-(2-hydroksyetylo)amina, prokaina, dibenzylopiperydyna, A-benzylo-e-fenetyloamina, dehydroabietyloamina, N,N'-bishydroabietyloamina, glukamina, N-metyloglukamina, kolidyna, chinina, chinolina, etylenodiamina, ornityna, cholina, A,A'-benzylofenetyloamina, chloroprokaina, dietanoloamina, dietyloamina, piperazyna, tris(hydroksymetylo)aminometan i wodorotlenek tetrametyloamoniowy oraz zasadowe aminokwasy, takie jak lizyna, arginina i A-metyloglutamina. Sole te można wytwarzać stosując metody znane specjalistom.

Pewne związki według obecnego wynalazku oraz ich sole mogą istnieć w postaci solwatów z wodą, na przykład hydratów albo w postaci solwatów z rozpuszczalnikami organicznymi, takimi jak metanol, etanol lub acetonitryl, w celu utworzenia odpowiednio metanolatu, etanolatu lub acetonitrylatu. Przedmiotem obecnego wynalazku są takie solwaty oraz ich mieszaniny.

PL 211 889 B1

Ponadto, związki według obecnego wynalazku albo ich sole lub solwaty mogą wykazywać polimorfizm. Obecny wynalazek obejmuje także takie postacie polimorficzne.

Związki według obecnego wynalazku mogą zawierać także dwa centra chiralne lub ich większą ilość. Na przykład, związki mogą zawierać element cyklopropylowy P1 o wzorze:

w którym każdy z symboli C1 i C2 oznacza asymetryczny atom węgla w pozycjach 1 i 2 pierścienia cyklopropylowego. Nie biorąc pod uwagę innych centrów asymetrycznych w innych segmentach związków, obecność tych dwóch centrów asymetrycznych oznacza, że związki mogą istnieć jako mieszaniny racemiczne diastereoizomerów, takich jak diastereoizomery w których R2 jest w konfiguracji albo syn w stosunku do amidu albo syn w stosunku do karbonylu, jak to pokazano poniżej.

Obecny wynalazek obejmuje zarówno enancjomery i mieszaniny enancjomerów jak i mieszaniny racemiczne.

Enancjomery można rozdzielać stosując metody znane przez specjalistów w tej dziedzinie, na przykład przez utworzenie soli diastereoizomerycznych, które można rozdzielać na drodze krystalizacji, z zastosowaniem chromatografii gaz-ciecz lub chromatografii cieczowej, poddanie selektywnej reakcji jednego enancjomeru z reagentem specyficznym enancjomerycznie. Jest oczywiste, że gdy żądany enancjomer przekształca się w inną postać chemiczną przez zastosowanie techniki rozdziału, to wymagany jest dodatkowy etap w celu utworzenia żądanej postaci enancjomerycznej. Odmiennie, określone enancjomery można syntetyzować na drodze syntezy asymetrycznej z zastosowaniem

PL 211 889 B1 optycznie czynnych reagentów, substratów, katalizatorów lub rozpuszczalników albo przez przekształcenie jednego enancjomeru w inny na drodze transformacji asymetrycznej.

Związki według obecnego wynalazku mogą występować w postaci proleku. Korzystnymi prolekami są proste, alifatyczne lub aromatyczne estry pochodzące od grup kwasowych występujących w związkach według tego wynalazku. W pewnych przypadkach, pożądane jest wytworzenie proleku w postaci diestru, takiego jak estry (acyloksy)alkilowe lub estry (alkoksykarbonyloksy)alkilowe.

Pewne związki według obecnego wynalazku mogą także istnieć w różnych stabilnych postaciach konformacyjnych, które można rozdzielać. Asymetria skrętna spowodowana zahamowaną rotacją wokół asymetrycznego wiązania pojedynczego, spowodowana na przykład zawadą przestrzenną lub odkształceniem pierścienia, może umożliwić rozdzielenie różnych konformerów. Obecny wynalazek obejmuje każdy izomer konformacyjny tych związków oraz ich mieszaniny.

Pewne związki według obecnego wynalazku istnieją w postaci amfoterycznej. Obecny wynalazek obejmuje każdą postać amfoteryczną tych związków oraz ich mieszanin.

Substraty nadające się do syntezy związków według obecnego wynalazku są znane specjalistom z tej dziedziny i można je łatwo wytworzyć lub są dostępne w handlu.

Związki według obecnego wynalazku można wytworzyć z zastosowaniem metod znanych specjalistom z tej dziedziny, patrz na przykład opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 6,323,180 oraz zgłoszenie patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 20020111313 A1. Poniższy opis metod został zamieszczony w celach ilustracji i nie można go traktować jako ograniczenie zakresu wynalazku określonego w zastrzeżeniach. Jest oczywiste, że może być korzystne lub niezbędne wytworzenie takiego związku w którym grupa funkcyjna jest zabezpieczona z użyciem tradycyjnej grupy zabezpieczającej i następnie grupa zabezpieczająca jest usunięta w celu otrzymania związku według obecnego wynalazku. Szczegóły dotyczące zastosowania grup zabezpieczających zgodnie z obecnym wynalazkiem są znane specjalistom z tej dziedziny.

Związki według obecnego wynalazku można na przykład syntetyzować zgodnie z ogólnym procesem przedstawionym nas schemacie I (w którym CPG oznacza grupę zabezpieczającą grupę karboksylową oraz APG oznacza grupę zabezpieczającą grupę aminową).

Schemat I

PI ............................*> Pl-CPG + APG-P2 —APG-P2-P1-CPG

APG-P3-P2-P1-CPG *--- P2-P1-CPG + APG-P3

B-P3-P2-P1 ---*- B-P3-P2-P1-P1'

Krótko, grupy P1, P2 i P3 można wiązać z zastosowaniem dobrze znanych technik sprzęgania peptydowego. Grupy P1, P2 i P3 można wiązać razem w dowolnej kolejności tak długo aż związek końcowy odpowiada peptydom według wynalazku. Na przykład, P3 można wiązać do P2-P1 lub P1 można wiązać do P3-P2.

Zwykle, peptydy są wydłużane przez odbezpieczenie grupy aminowej reszty N-końcowej i sprzęganie niezabezpieczonej grupy karboksylowej następnego, odpowiedniego aminokwasu zabezpieczonego przy azocie poprzez wiązanie peptydowe, z zastosowaniem metod uprzednio opisaPL 211 889 B1 nych. Tę procedurę odbezpieczania i sprzęgania powtarza się aż do uzyskania żądanej sekwencji. To sprzęganie można przeprowadzić etapami z komponentami aminokwasowymi, jak to przedstawiono na schemacie I.

Sprzęganie pomiędzy dwoma aminokwasami, pomiędzy aminokwasem i peptydem lub pomiędzy dwoma fragmentami peptydowymi można przeprowadzić z zastosowaniem standardowych procedur sprzęgania, takich jak metoda z zastosowaniem azydku, metoda z zastosowaniem mieszanego bezwodnika węglowo-karboksylowego (chloromrówczan izobutylu), metoda z zastosowaniem karbodiimidu (dicykloheksylokarbodiimid, diizopropylokarbodiimid lub karbodiimid rozpuszczalny w wodzie), metoda z zastosowaniem aktywnego estru (ester o-nitrofenylowy, imidoester N-hydroksybursztynowy), metoda K z reagentem Woodwarda, metoda z zastosowaniem karbonylodiimidazolu, metody z zastosowaniem reagentów fosforowych lub metody utlenianie-redukcja. Niektóre z tych metod (szczególnie metoda z zastosowaniem karbodiimidu) można udoskonalić przez dodanie 1-hydroksybenzotriazolu lub 4-DMAP. Te reakcje sprzęgania można przeprowadzić albo w roztworze (faza ciekła) albo w fazie stałej.

Dokładniej, etap sprzęgania wymaga sprzęgania z zastosowaniem odwadniania, wolnej grupy karboksylowej jednego reagenta z wolną grupą aminową drugiego reagenta, w obecności środka sprzęgającego, w celu utworzenia połączenia w postaci wiązania amidowego. Opis takich środków sprzęgających znajduje się w ogólnych podręcznikach dotyczących chemii peptydów, takich jak na przykład M. Bodanszky, Peptide Chemistry, wydanie drugie poprawione, Springer-Verlag, Berlin, Niemcy, (1993). Do przykładów odpowiednich środków sprzęgających zalicza się N,N'-dicykloheksylokarbodiimid, 1-hydroksybenzotriazol w obecności N,N'-dicykloheksylokarbodiimidu lub N-etylo-N'-[(3-dimetyloamino)propylo]karbodiimid. Praktycznym i użytecznym środkiem sprzęgającym jest dostępny w handlu jest heksafluorofosforan (benzotriazol-1-iloksy)tris-(dimetyloamino)fosfonowy albo stosowany sam albo w obecności 1-hydroksybenzotriazolu lub 4-DMAP. Innym praktycznym i użytecznym środkiem sprzęgającym jest dostępny w handlu tetrafluoroboran 2-(1H-benzotriazol-1-ilo)-N,N,N',N'-tetrametylouroniowy. Jeszcze innym praktycznym i użytecznym środkiem sprzęgającym jest dostępny w handlu heksafluorofosforan O-(7-azabenzotriazol-1-ilo)-N,N,N',N'-tetra-metylouroniowy. Reakcję sprzęgania przeprowadza się w środowisku rozpuszczalnika obojętnego, takiego jak na przykład dichlorometan, acetonitryl lub dimetyloformamid. W celu utrzymania w mieszaninie reakcyjnej wartości pH wynoszącej około 8, do mieszaniny reakcyjnej dodaje się nadmiar aminy trzeciorzędowej, takiej jak na przykład diizopropyloetyloamina, N-metylomorfolina, N-metylopirolidyna lub 4-DMAP. Temperatura reakcji mieści się zwykle w zakresie od 0°C do 50°C i czas reakcji wynosi od 15 minut do 24 godzin.

Podczas reakcji sprzęgania, grupy funkcyjne składników aminokwasowych muszą być zwykle zabezpieczone, w celu uniknięcia tworzenia się niepożądanych wiązań. Grupy zabezpieczające które można stosować są wymienione w książce Greene'a, Protective Groups in Organic Chemistry, John Wiley & Sons, New York (1981) oraz w The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, tom 3, Academic Press, New York (1981), które to publikacje zamieszcza się w niniejszym jako referencje.

Grupa α-aminowa każdego aminokwasu poddawanego reakcji sprzęgania do rozrastającego się peptydu musi być zabezpieczona (APG). Można zastosować dowolną grupę zabezpieczającą znaną w tej dziedzinie. Do przykładów takich grup zalicza się: 1) grupy arylowe, takie jak formyl, trifluoroacetyl, ftalil i p-toluenosulfonyl; 2) aromatyczne grupy karbaminianowe, takie jak benzyloksykarbonyl (Cbz lub Z) i podstawione benzyloksykarbonyle oraz 9-fluorenylometyloksykarbonyl (Fmoc); 3) alifatyczne grupy karbaminianowe, takie jak tert-butyloksykarbonyl (Boc), etoksykarbonyl, diizopropylometoksykarbonyl i alliloksykarbonyl; 4) cykloalkilowe grupy karbaminianowe, takie jak cyklopentyloksykarbonyl i adamantyloksykarbonyl; 5) grupy alkilowe, takie jak trifenylometyl i benzyl; 6) trialkilosilil taki jak trimetylosilil; oraz 7) grupy zawierające tiol, takie jak fenylotiokarbonyl i ditiasukcynoil. Korzystną grupą zabezpieczającą grupę α-aminową jest albo Boc albo Fmoc. W handlu dostępnych jest wiele odpowiednio zabezpieczonych pochodnych aminokwasów przeznaczonych do syntezy peptydu. Grupę zabezpieczającą grupę α-aminową nowo dodanej reszty aminokwasu odszczepia się przed sprzęganiem następnego aminokwasu. Gdy stosuje się grupę Boc, metodami z wyboru są: metoda z kwasem trifluorooctowym, czystym lub w dichlorometanie albo metoda z HCl w dioksanie lub o octanie etylu. Następnie, otrzymaną sól amonową zobojętnia się albo przed sprzęganiem albo in situ, z użyciem takich roztworów zasadowych jak bufory uwodnione lub roztwory amin trzeciorzędowych w dichlorometanie albo w acetonitrylu lub w dimetyloformamidzie. Gdy stosuje się grupę Moc; reagentami z wyboru są piperydyna lub piperydyna podstawiona w dimetyloformamidzie lecz można

PL 211 889 B1 użyć dowolną aminę drugorzędową. Odbezpieczenie przeprowadza się w zakresie temperatur od 0°C do temperatury pokojowej (rt lub RT), zwykle od 20°C do 22°C.

Podczas wytwarzania peptydu, każdy aminokwas posiadający grupy funkcyjne w łańcuchu bocznym musi być zabezpieczony z zastosowaniem dowolnej z wyżej opisanych grup. Dla specjalistów w tej dziedzinie jest oczywiste, że dobór i zastosowanie odpowiednich grup zabezpieczających dla tych grup funkcyjnych w łańcuchu bocznym zależy od rodzaju aminokwasu i od obecności innych grup funkcyjnych w peptydzie. Dobór takich grup zabezpieczających jest ważny, ponieważ grupa nie może zostać usunięta podczas etapu odbezpieczania i podczas sprzęgania grupy α-aminowej.

Na przykład, gdy stosuje się grupę Boc jako grupę zabezpieczającą grupę α-aminową, odpowiednie są niżej wymienione grupy zabezpieczające łańcuch boczny: p-toluenosulfonylowe (tosylowe) fragmenty cząsteczek można użyć do zabezpieczenia aminowego łańcucha bocznego takich aminokwasów jak Lys i Arg; acetamidometylowe, benzylowe (Bn) lub tert-butylosulfonylowe fragmenty cząsteczek można użyć do zabezpieczenia łańcucha bocznego cysteiny zawierającego grupę siarczkową; etery benzylowe (Bn) można użyć do zabezpieczenia łańcuchów bocznych seryny, treoniny lub hydroksyproliny zawierających grupę hydroksy; oraz estry benzylowe można użyć do zabezpieczenia łańcuchów bocznych kwasu asparaginowego i kwasu glutaminowego zawierających grupę karboksylową.

Gdy do zabezpieczenia grupy α-aminowej wybrana jest grupa Fmoc, zwykle możliwymi do przyjęcia jako grupami zabezpieczającymi łańcuch boczny są grupy na bazie tert-butylu. Na przykład, Boc można użyć do lizyny i argininy, eter tert-butylowy można użyć do seryny, treoniny i hydroksyproliny oraz ester tert-butylowy można użyć do kwasu asparaginowego i do kwasu glutaminowego. Fragment trifenylometylowy (tritylowy) cząsteczki można użyć do zabezpieczenia łańcucha bocznego cysteiny zawierającego grupę siarczkową.

Po zakończeniu wydłużania peptydu, usuwa się wszystkie grupy zabezpieczające. Gdy stosuje się syntezę w fazie ciekłej, grupy zabezpieczające usuwa się w sposób zależny od rodzaju wybranych grup zabezpieczających. Procedury te są dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie.

Ponadto, przy wytwarzaniu związków według obecnego wynalazku należy wziąć pod uwagę poniższe wskazówki. Na przykład, w celu uformowania związku w którym R4-C(O)-, R4-S(O)2, zabezpieczony P3 albo cały peptyd lub odcinek peptydu jest odpowiednio sprzężony z odpowiednim chlorkiem kwasowym lub chlorkiem sulfonylu, należy mieć na uwadze że jest on dostępny w handlu albo jego synteza jest dobrze znana. W przypadku wytwarzania, związek w którym występuje R4O-C(O)-, zabezpieczony P3 albo cały peptyd lub odcinek peptydu jest sprzężony z odpowiednim chloromrówczanem, który jest dostępny w handlu albo jego synteza jest dobrze znana. W przypadku pochodnych Boc stosuje się (Boc)2O.

Na przykład:

W celu otrzymania odpowiedniego chloromrówczanu, cyklopentanol poddaje się reakcji z fosgenem.

Chloromrówczan poddaje się reakcji z żądanym NH2-tripeptydem, w obecności takiej zasady jak trietyloamina, otrzymując cyklopentylokarbaminian.

W procesie wytwarzania, związek w którym występuje R4-N(R5)-C(O)- lub R4-NH-C(S)-, zabezpieczony P3 albo cały peptyd lub odcinek peptydu poddaje się reakcji z fosgenem i następnie z aminą, jak to opisano w SynLett., luty 1995, 2, strony 142-144 albo poddaje się reakcji z dostępnym w handlu izocyjanianem i z odpowiednią zasadą, taką jak trietyloamina.

PL 211 889 B1

W procesie wytwarzania, związek w którym występuje R4-N(R5)-S(O2)-, zabezpieczony P3 albo cały peptyd lub odcinek peptydu poddaje się reakcji albo ze świeżo wytworzonym lub z dostępnym w handlu chlorkiem sulfamylu i następnie reakcji z aminą, jak to opisano w opisie patentowym Ger. Offen. (1998), strony 84, numer DE 19802350 lub w publikacji międzynarodowej numer WO 98/32748.

Grupa α-karboksylowa reszty C-końcowej jest zwykle zabezpieczona jako ester (CPG), który można odszczepić otrzymując kwas karboksylowy. Do grup zabezpieczających które można użyć zalicza się : 1) estry alkilowe, takie jak metyl, trimetylosililoetyl i tert-butyl; 2) estry aryloalkilowe, takie jak benzyl i benzyl podstawiony; lub 3) estry które można odszczepić w reakcji z łagodną zasadą lub z łagodnym środkiem redukującym, takie jak estry trichloroetylu i fenacylu.

Otrzymany kwas α-karboksylowy (w wyniku rozszczepienia przez łagodny kwas, łagodną zasadę lub łagodny środek redukujący) sprzęga się z R1SO2NH2 (wytworzonym w reakcji R1SO2Cl, w roztworze z tetrahydrofuranem nasyconym amoniakiem), w obecności środka sprzęgającego peptyd, takiego jak CDI lub EDAC i w obecności takiej zasady jak 4-dimetyloaminopirydyna (4-DMAP) i/lub 1,8-diazabicyklo[5.4.0]undec-7-en (DBU), w celu wprowadzenia fragmentu peptydowego P1', tworząc skutecznie tripeptyd P1'-P1-P2-P3-APG. W tym procesie stosuje się zwykle 1-5 równoważników środka sprzęgającego peptyd P1'.

Ponadto, jeżeli od P3 odszczepia się grupę zabezpieczającą APG i zastępuje grupą B w sposób opisany powyżej i otrzymany w wyniku odszczepienia kwas α-karboksylowy (od-szczepienia przeprowadzonego z zastosowaniem łagodnego kwasu, łagodnej zasady lub łagodnego środka redukującego) sprzęga się z R1SO2NH2 [wytworzonym w reakcji R1SO2Cl, w roztworze z tetrahydrofuranem nasyconym amoniakiem lub z zastosowaniem metod alternatywnych przedstawionych w niniejszym opisie], w obecności środka sprzęgającego peptyd, takiego jak CDI lub EDAC i w obecności takiej zasady jak 4-dimetyloaminopirydyna (4-DMAP) i/lub 1,8-diazabicyklo[5.4.0]undec-7-en (DBU), w celu wprowadzenia fragmentu peptydowego P1', to otrzymuje się tripeptyd P1'-P1-P2-P3-B. W tym procesie stosuje się zwykle 1-5 równoważników środka sprzęgającego P1'.

Związki według obecnego wynalazku można wytworzyć z zastosowaniem wielu metod, wliczając te metody, które opisano w przykładach zamieszczonych poniżej oraz te opisane w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 6,323,180 oraz w zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 10/001,850 złożonym dnia 20 listopada 2001 r. Informacje i wskazówki podane w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 6,323,180 oraz w zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 10/001,850, zamieszcza się w niniejszym opisie w całości jako referencje.

Przedmiotem obecnego wynalazku są także kompozycje zawierające związek według obecnego wynalazku albo jego sól dopuszczoną do stosowania w farmacji lub jego solwat oraz nośnik dopuszczony do stosowania w farmacji. Kompozycje farmaceutyczne według obecnego wynalazku zawierają leczniczo skuteczną ilość związku według wynalazku albo jego soli dopuszczonej do stosowania w farmacji lub jego solwatu oraz nośnik dopuszczony do stosowania w farmacji, przy czym nośnikiem dopuszczonym do stosowania w farmacji jest na przykład substancja pomocnicza lub rozcieńczalnik podłoża.

Składnik aktywny, to jest związek, znajduje się zwykle w takich kompozycjach w ilości od 0,1% wagowego do 99,9% wagowego kompozycji i często ilość składnika aktywnego mieści się w granicach od 5% wagowych do 95% wagowych.

Kompozycje farmaceutyczne według tego wynalazku można podawać doustnie, pozajelitowo lub z wszczepionego zbiornika. Preferowane jest podawanie doustne lub podawanie przez wstrzyknięcie. W pewnych przypadkach, pH postaci użytkowej można wyregulować przy użyciu dopuszczonych do stosowania w farmacji kwasów, zasad lub buforów, w celu zwiększenia stabilności związku zawartego w postaci użytkowej albo stabilności jego postaci dawkowania. Użyte w niniejszym opisie określenie podawanie pozajelitowe obejmuje wstrzyknięcie podskórne, śródskórne, dożylne, domięśniowe, sródstawowe, wewnątrz-maziówkowe, do pnia mózgu, domostkowe, dokanałowe i wstrzyknięcie do miejsca występowania zmiany chorobowej lub techniki infuzyjne.

Kompozycje farmaceutyczne mogą występować w postaci sterylnych preparatów do wstrzyknięć, na przykład jako sterylna, dająca się wstrzykiwać, wodna lub oleista zawiesina. Tę zawiesinę można wytworzyć stosując znane w tej dziedzinie techniki, z użyciem odpowiednich środków rozpraszających lub zwilżających i środków dyspergujących. Szczegóły dotyczące wytwarzania takich związków są znane specjalistom w tej dziedzinie.

PL 211 889 B1

Gdy są podawane doustnie, kompozycje farmaceutyczne według tego wynalazku można podawać w dowolnej, doustnej, dopuszczonej do stosowania postaci dawkowania, wliczając w to kapsułki, tabletki oraz wodne zawiesiny i roztwory lecz nie ograniczając się do nich. W przypadku tabletek do podawania doustnego, do powszechnie stosowanych nośników zalicza się laktozę i skrobię kukurydzianą. Zwykle dodawane są także środki smarujące, takie jak stearynian magnezu. W przypadku podawania doustnego kapsułek, do użytecznych rozcieńczalników zalicza się laktozę i wysuszoną skrobię kukurydzianą. Gdy podaje się doustnie wodne zawiesiny, składnik aktywny jest połączony z emulgatorem i środkiem dyspergującym. W razie potrzeby, można dodać niektóre środki słodzące i/lub substancje smakowe i/lub barwniki.

Informacje o innych, odpowiednich nośnikach dla kompozycji omówionych powyżej znajdują się w standardowych podręcznikach z zakresu farmacji, na przykład w Remington's Pharmaceutical Sciences, wydanie 19-te, Mack Publishing Company, Easton, Penn., 1995. Dodatkowe szczegóły dotyczące opracowania i wytwarzania odpowiednich postaci dawkowania kompozycji farmaceutycznych według wynalazku są znane specjalistom w tej dziedzinie.

Poziomy dawkowania związków według wynalazku, mieszczące się w zakresie od około 0,01 do około 1000 miligramów na kilogram („mg/kg) masy ciała na dzień, korzystnie w zakresie od około 0,5 do około 250 mg/kg masy ciała na dzień, są typowe w monoterapii mającej na celu zapobieganie i leczenie choroby spowodowanej przez wirusa HCV. Zwykle, kompozycje farmaceutyczne według tego wynalazku podaje się od około 1 do około 5 razy na dzień albo odmiennie, jako ciągły wlew. Takie podawanie można stosować jako leczenie przewlekłe lub ostre. Ilość składnika aktywnego którą można łączyć z substancjami użytymi do sporządzenia nośnika w celu wytworzenia jednostkowej postaci dawkowania, będzie zmieniać się w zależności od leczonego osobnika i od określonego sposobu podawania.

W zależności od oceny specjalistów, mogą być niezbędne niższe lub wyższe dawki od podanych powyżej. W przypadku poszczególnych pacjentów, określone dawkowanie i tryb ich leczenia będzie zależał od różnych czynników, wliczając w to aktywność określonego związku który został zastosowany, wieku, masy ciała, ogólnego stanu zdrowia, płci, diety czasu podawania, szybkości wydalania, połączenia leku, ostrości i przebiegu zakażenia, skłonności pacjenta do zakażenia i oceny przez lekarza prowadzącego leczenie. Zwykle, leczenie zapoczątkowuje się stosując małe dawki, znacznie mniejsze od optymalnej dawki peptydu. Następnie, dawkowanie zwiększa się z zastosowaniem małych przyrostów aż osiągnie się warunki pozwalające na uzyskanie optymalnego skutku. Na ogół, najbardziej wskazane jest podawanie związku przy poziomie stężenia, który pozwala uzyskać skuteczne wyniki działania przeciwwirusowego, bez powodowania jakichkolwiek szkodliwych lub zgubnych skutków ubocznych.

Gdy kompozycje według tego wynalazku zawierają połączenie związku według wynalazku oraz jeden albo większą ilość dodatkowych środków leczniczych lub profilaktycznych, poziomy dawki zarówno związku jak i środka dodatkowego wynoszą zwykle od około 10% do około 100%, korzystniej od około 10% do około 80% normalnej dawki podawanej w trybie monoterapii.

Gdy z tych związków albo z ich dopuszczonych do stosowania w farmacji soli, solwatów lub proleków wytwarza się postać użytkową razem z nośnikiem dopuszczonym do stosowania w farmacji, to otrzymaną kompozycję można podawać in vivo ssakom, takim jak człowiek, w celu hamowania proteazy HCV NS3 albo w celu leczenia zakażenia wirusem HCV lub zapobiegania temu zakażeniu. Takie leczenie można także przeprowadzić z zastosowaniem związków według tego wynalazku w połączeniu ze środkami do których zalicza się: immunomodulatory, takie jak interferony; inne środki przeciwwirusowe, takie jak rybawiryna, amantadyna; inne inhibitory proteazy HCV NS3; inhibitory innych obiektów w cyklu życiowym wirusa HCV, takich jak helikaza, polimeraza, metaloproteaza lub wewnętrzne miejsce dostępu rybosomu; albo ich połączeń lecz nie ograniczając się do nich. Dodatkowe środki mogą być łączone ze związkami według tego wynalazku w celu utworzenia jednostkowej postaci dawkowania. Odmiennie, te dodatkowe środki mogą być oddzielnie podawane ssakowi jako część wielokrotnej postaci dawkowania.

Sposoby hamowania aktywności proteazy HVC NS3 u pacjentów polegają na podawaniu związku według obecnego wynalazku albo jego soli dopuszczonej do stosowania w farmacji lub jego solwatu, w którym podstawniki zdefiniowano powyżej.

W korzystnej odmianie, metody te nadają się do obniżenia aktywności proteazy HCV NS3 u pacjenta. Jeżeli kompozycja farmaceutyczna zawiera tylko związek według tego wynalazku jako składnik aktywny, takie metody mogą dodatkowo obejmować etap podawania temu pacjentowi środka wybraPL 211 889 B1 nego spośród takich środków jak immunomodulator, środek przeciwwirusowy, inhibitor proteazy wirusa HCV lub inhibitor innych obiektów w cyklu życiowym wirusa HCV, takich jak helikaza, polimeraza lub metaloproteaza. Taki dodatkowy środek można podawać pacjentowi przed podaniem związków według tego wynalazku, równocześnie z podawaniem tych związków albo po ich podaniu.

Metody te nadają się do hamowania replikacji wirusowej u pacjenta. Takie metody mogą być użyteczne w leczeniu choroby HCV lub w zapobieganiu tej chorobie.

Związki według wynalazku można także użyć jako reagenty laboratoryjne. Związki mogą być pomocne jako narzędzia badawcze do projektowania testów replikacji wirusowej, oceny systemów testów na zwierzętach i badań w zakresie biologii molekularnej, w celu powiększenia wiedzy dotyczącej mechanizmów choroby powodowanej przez HCV.

Związki według tego wynalazku można także użyć do usuwania skażeń wirusowych materiałów lub do zapobiegania tym skażeniom i tym samym do zmniejszenia ryzyka zakażenia wirusem personelu laboratoryjnego lub medycznego albo pacjentów, którzy kontaktowali się z tymi materiałami, na przykład z krwią, tkanką, z instrumentami i strojami chirurgicznymi i z pobieraniem krwi od dawców lub z aparaturą i materiałami do transfuzji.

Zamieszczone poniżej charakterystyczne przykłady ilustrują syntezy związków według obecnego wynalazku, których nie można traktować jako ograniczających wynalazek w jego przedmiocie i zakresie. Metody można dostosować do odmian, w celu wytworzenia związków według tego wynalazku lecz nie w pełni ujawnionych. Dodatkowe odmiany metod prowadzących do wytworzenia takich samych związków w nieco odmienny sposób, będą oczywiste dla specjalisty w tej dziedzinie.

Jeżeli nie określono inaczej, to procenty odnoszące się do roztworu wyrażają wzajemny stosunek masy do objętości i proporcje odnoszące się roztworu wyrażają wzajemny stosunek objętości do objętości. Widma magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) rejestrowano przy użyciu spektrometru Brukera, 300 MHz, 400 MHz lub 500 MHz; przesunięcia chemiczne (δ) podano w częściach na milion. Chromatografię szybkosprawną wykonywano na żelu krzemionkowym (SiO2), zgodnie z metodą chromatografii szybkosprawne j Stilla (W.C. Still i inni, J. Org. Chem., (1978), 43, strona 2923).

Wszystkie dane dotyczące chromatografii cieczowej rejestrowano przy użyciu chromatografu cieczowego Shimadzu LC-10AS, z użyciem detektora SPD-10AV UV-Vis i dane dotyczące spektrometrii mas (MS) wyznaczano z użyciem urządzenia Micromass Platform for LC z interfejsem elektrosprejowym (ES+).

Jeżeli nie odnotowano inaczej, związek analizowano metodą LC-MS, z zastosowaniem jednej z siedmiu metod, wykonywanych w następujących warunkach. Należy odnotować, że dla pewnych związków, określenie LC-MS jest ograniczone do LC, ponieważ kalibrowanie MS jest ograniczone do związków o masie cząsteczkowej 900 i mniejszej.

Kolumny:

(metoda A) - YMC ODS S7 C18 3,0 x 50 mm, (metoda B) - YMC ODS-A S7 C18 3,0 x 50 mm, (metoda C) - YMC S7 C18 3,0 x 50 mm, (metoda D) - YMC Xterra ODS S7 3,0 x 50 mm, (metoda E) - YMC Xterra ODS S7 3,0 x 50 mm, (metoda F) - YMC ODS-A S7 C18 3,0 x 50 mm, (metoda G) - YMC C18 S5 4,6 x 50 mm;

gradient: od 100% rozpuszczalnika A/0% rozpuszczalnika B do 0% rozpuszczalnika A/100% rozpuszczalnika B;

czas gradientu: 2 min (A, B, D, F, G); 8 min (C, E);

czas retencji substancji niezatrzymywanej: 1 min. (A, B, D, F, G); 2 min. (C, E); objętościowe natężenie przepływu: 5 ml/min; długość fali detektora: 220 nm;

rozpuszczalnik A: 10% CH3OH/90% H2O/0,1% TFA; rozpuszczalnik Β: 10% H2O/90% CH3OH/0,1% TFA.

Związki i chemiczne produkty pośrednie według obecnego wynalazku, opisane w poniższych przykładach, wytworzono z wykorzystaniem poniższych metod.

Skróty zastosowane w obecnym zgłoszeniu, szczególnie poniższych, ilustrujących przykładach, są dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie. Poniżej zamieszczono wykaz niektórych skrótów stosowanych w niniejszym opisie:

PL 211 889 B1 rt temperatura pokojowa

Boc tert-butyloksykarbonyl

DMSO dimetylosulfotlenek

EtOAc octan etylu t-BuOK tert-butoksylan potasu

Et2O eter dietylowy

TBME eter tert-butylowo-metylowy

THF tetrahydrofuran

CDI karbonylodiimidazol

DBU 1,8-diazabicyklo[5.4.0]undec-7-en

TFA kwas trifluorooctowy

NMM N-metylomorfolina

HATU O-7-azabenzotriazol-1-il

HBTU heksafluorofosforan O-{1 H-benzotriazol-1 -ilo)-W,W,W',W-tetrametylouroniowy

HOBT N-hydroksybenzotriazol

PyBrop heksafluorofosforan bromo-bis-pirolidynofosfoniowy DMF dimetyloformamid

MeOH metanol

EDTA kwas etylenodiaminotetraoctowy

HRMS spektrometria mas wysokiej rozdzielczości DMAP 4-dimetyloaminopirydyna

DIPEA diizopropyloetyloamina.

P r z y k ł a d 1 (Wytwarzanie kluczowego produktu pośredniego)

Boc-(4R)-(2-fenylo-7-metoksychinolino-4-okso)-S-prolinę, której wzór strukturalny zamieszczono poniżej, wytworzono w sposób opisany w etapach 1a-1c.

Etap 1a: Wytwarzanie 4-hydroksy-2-fenylo-7-metoksychinoliny, której wzór strukturalny przedstawiono poniżej

Do roztworu m-anizydyny (300 g, 2,44 mole) i benzoilooctanu etylu (234,2 g, 1,22 mole) w toluenie (2,0 l) dodano HCl (roztwór 4,0 N w dioksanie, 12,2 ml, 48,8 mmoli). Otrzymany roztwór utrzymywano przez 6 godzin 30 minut w stanie wrzenia pod chłodnicą zwrotną, z zastosowaniem aparatu Dean-Starka (odebrano około 56 ml roztworu wodnego). Mieszaninę reakcyjną schłodzono do temperatury pokojowej, następnie podzielono kilkakrotnie z wodnym roztworem HCl (roztwór 10%, 3 x 500 ml), z wodnym roztworem NaOH (roztwór 1,0 N, 2 x 200 ml) i wodą (3 x 200 ml), po czym warstwę organiczną osuszono (MgSO4) i zatężono pod próżnią, otrzymując oleistą pozostałość (329, 5 g). Surowy produkt ogrzewano przez 80 minut na łaźni olejowej (280°C), z zastosowaniem aparatu Dean-Starka (odebrano około 85 ml cieczy). Mieszaninę reakcyjną schłodzono do temperatury pokojowej, po czym pozostałość w postaci substancji stałej roztarto z CH2Cl2 (400 ml). Następnie otrzymaną zawiesinę przefiltrowano i placek filtracyjny przemyto dodatkowa ilością CH2Cl2 (2 x 150 ml). Wytworzoną substancję stałą wysuszono pod próżnią (50°C, 1 tor, 1 dzień), otrzymując analitycznie czystą 4-hydroksy-7-metoksy-2-fenylochinolinę w postaci substancji stałej koloru jasno-brązowego (60,7 g, wydajność całkowita - 20%).

PL 211 889 B1 ¹H NMR (DMSO) δ: 3,86 (s, 3H), 6,26 (s, 1H), 6,94 (dd, J = 9,0, 2,4 Hz, 1H), 7,21 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 7,55 - 7,62 (m, 3H), 7,80 - 7,84 (m, 2H), 8,00 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 11,54 (s, 1H).

¹³C NMR (DMSO-d6) δ: 55, 38, 99, 69, 107,07, 113,18, 119,22, 126,52, 127,17, 128,97, 130,34, 134,17, 142,27, 149,53, 161,92, 176,48.

LC-MS: czas retencji: 1,26, metoda D.

MS: m/z = 252 (M⁺+1).

Etap 1b: Wytwarzanie 4-chloro-2-fenylo-7-metoksychinoliny, której wzór strukturalny przedstawiono poniżej

Sporządzono zawiesinę produktu z etapu 1a (21,7g, 86,4 mmoli) w POCl3 (240 ml). Zawiesinę ogrzewano przez 2 godziny, utrzymując w stanie wrzenia pod chłodnicą zwrotną. Po usunięciu POCl3 pod próżnią, pozostałość rozdzielono pomiędzy octan etylu (1 litr) i zimny roztwór NaOH (wytworzony z 200 ml 1,0 N roztworu NaOH i 20 ml 10 N roztworu NaOH) i mieszano przez 15 minut. Warstwę organiczną przemyto wodą (2 x 200 ml), solanką (200 ml), następnie osuszono (MgSO4) i zatężono pod próżnią, otrzymując 4-chloro-2-fenylo-7-metoksychinolinę (21,0 g, 90%) w postaci substancji stałej koloru jasnobrązowego.

¹H NMR (DMSO-d6) δ: 3,97 (s, 3H), 7,36 (dd, J = 9,2, 2,6 Hz, 1H), 7,49 - 7,59 (m, 4H), 8,08 (d, J= 9,2 Hz, 1H), 8,19 (s, 1H), 8,26 - 8,30 (m, 2H).

¹³C NMR (DMSO-d6) δ: 55, 72, 108, 00, 116, 51, 119,52, 120,48, 124,74, 127,26, 128,81, 130,00, 137,58, 141,98, 150,20, 156,65, 161,30.

LC-MS: czas retencji: 1,547, metoda D.

MS: m/z = 270 (M⁺+1).

Etap 1c: Wytwarzanie Boc-(4R)-(2-fenylo-7-metoksychinolino-4-okso)-S-proliny, której wzór strukturalny przedstawiono poniżej

Do zawiesiny Boc-4R-hydroksyproliny (16,44 g, 71,1 mmoli) w DMSO (250 ml) dodano w temperaturze 0°C t-BuOK (19,93 g, 177,6 mmoli). Wytworzoną mieszaninę mieszano przez 1,5 godziny i następnie dodawano przez 1,5 godziny, w trzech porcjach, produkt z etapu 1b (21,02 g, 77,9 mmoli). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez jeden dzień, po czym wlano do zimnej wody (1,5 1) i przemyto eterem dietylowym (4 x 200 ml). Roztwór wodny zakwaszono do pH = 4,6, następnie przefiltrowano otrzymując osad koloru białego. Osad wysuszono pod próżnią, otrzymując produkt - Boc-(4R)-(2-fenylo-7-metoksychinolino-4-okso)prolinę (32,5 g, 98%).

¹H NMR (DMSO) δ: 1,32, 1,35 (dwa s (rotamery), 9H), 2,30 - 2,42 (m, 1H), 2,62 - 2,73 (m, 1H), 3,76 (m, 2H), 3,91 (s, 3H), 4,33 - 4,40 (m, 1H), 5,55 (m, 1H), 7,15 (dd, J = 9,2, 2,6 Hz, 1H), 7,37 (d J = 2,6 Hz, 1H), 7,42 - 7,56 (m, 4H), 7,94 - 7,99 (m, 1H), 8,25, 8, 28 (2s, 2H), 12,53 (szerokie s, 1H).

PL 211 889 B1

LC-MS: czas retencji: 1,40, metoda D.

MS: m/z = 4 65 (M⁺+1).

P r z y k ł a d 2 (Wytwarzanie kluczowego produktu pośredniego)

Izomer (1R, 2S) P1 kwasu 1-{[1-2-tert-butoksykarbonylo-amino-3,3-dimetylobutyrylo)-4-(7-metoksy-2-fenylochinolin-4-yloksy)pirolidyno-2-karbonylo]amino}-2-winylocyklopropano-karboksylowego, którego wzór strukturalny zamieszczono poniżej, wytworzono w sposób opisany w etapach 2a-2e.

Etap 2a: Wytwarzanie chlorowodorku estru etylowego kwasu (1R,2S)/(1S,2R)-1-amino-2-winylocyklopropanokarboksylowego, którego wzór strukturalny przedstawiono poniżej

Wymieniony związek wytworzono stosując każdą z poniższych metod A I B.

Metoda A

A.1) Wytwarzanie N-benzyloiminy estru etylowego glicyny, której wzór strukturalny przedstawiono poniżej

Sporządzono zawiesinę chlorowodorku estru etylowego glicyny (303,8 g, 2,16 mola) w eterze tert-butylowo-metylowym (1,6 l). Następnie dodano benzaldehyd (231 g, 2,16 mola) i bezwodny siarczan sodu (154,6 g, 1,09 mola), po czym mieszaninę reakcyjną schłodzono na łaźni wodno-lodowej do temperatury 0°C Z kolei przez 30 minut wkraplano trietyloaminę (455 ml, 3,26 mola) i następnie mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 48 godzin. Następnie, reakcję zgaszono przez dodanie wody schłodzonej lodem (1 litr), po czym warstwę organiczną oddzielono. Warstwę wodną ekstrahowano eterem tert-butylowo-metylowym (0,5 l) i następnie połączone warstwy organiczne przemyto mieszaniną nasyconego, wodnego roztworu NaHCO3 (1 litr) i solanki (1 litr). Roztwór osuszono nad MgSO4 i zatężono pod próżnią, otrzymując 392 g N-benzyloiminy w postaci gęstego oleju koloru żółtego, który bezpośrednio użyto w następnym etapie.

¹H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ: 1,32 (t, J = 7,1 Hz, 3H), 4,24 (q, J = 7,1 Hz, 2H), 4,41 (d, J = 1,1 Hz, 2H), 7,39 - 7,47 (m, 3H), 7,78 - 7,81 (m, 2H), 8,31 (s, 1H).

A.2) Wytwarzanie racemicznego estru etylowego kwasu N-Boc-(1R, 2S)/(1S, 2R)-1-amino-2-winylocyklopropanokarboksylowego

Do zawiesiny tert-butoksylanu litu (84,06 g, 1,05 mola) w osuszonym toluenie (1,2 l) wkraplano przez 60 minut mieszaninę N-benzyloiminy estru etylowego glicyny (100,4 g, 0,526 mola) i trans-1,4PL 211 889 B1

-bromo-2-buten (107,0 g, 0,500 mola) w osuszonym toluenie (0,6 l). Po zakończeniu dodawania, mieszaninę reakcyjną koloru ciemnoczerwonego zgaszono przez dodanie wody (1 litr) i eteru tert-butylowo-metylowego (TBME, 1 litr). Fazę wodną oddzielono i ekstrahowano drugi raz przy użyciu TBME (1 litr). Fazy organiczne połączono i dodano 1 N roztwór HCl (1 litr), po czym mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Fazę organiczną oddzielono i ekstrahowano wodą (0,8 l). Następnie, fazy wodne połączono, nasycono solą (700 g) i dodano TBME (1 litr), po czym mieszaninę schłodzono do temperatury 0°C. Mieszaninę reakcyjną zalkalizowano w trakcie mieszania do pH = 14 przez wkroplenie 10 N roztworu NaOH, po czym warstwę organiczną oddzielono i następnie fazę wodną ekstrahowano przy użyciu TBME (2 x 500 ml). Połączone ekstrakty organiczne osuszono (MgSO4) i zatężono do objętości 1 litra. Do tego roztworu wolnej aminy dodano diwęglan di-tert-butylu (131,0 g, 0,6 mola) i mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 4 dni. Następnie, do mieszaniny reakcyjnej dodano dodatkową ilość diwęglanu di-tert-butylu (50 g, 0,23 mola). Mieszaninę reakcyjną ogrzewano przez 3 godziny, utrzymując w stanie wrzenia pod chłodnicą zwrotną, po czym pozostawiono na noc do samoczynnego schłodzenia do temperatury pokojowej. Mieszaninę reakcyjną osuszono nad MgSO4 i zatężono pod próżnią, otrzymując 80 g surowej substancji. Tę pozostałość oczyszczono metodą chromatografii szybkosprawnej (2,5 kg SiO2, elucja przy użyciu od 1% do 2% CH3OH/CH2Cl2), otrzymując 57 g (53%) racemicznego estru etylowego kwasu N-Boc-(1R, 2S)/(1S, 2R)-1-amino-2-winylocyklopropanokarboksylowego w postaci oleju koloru żółtego, który podczas przechowywania w chłodziarce uległ zestaleniu.

¹H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ: 1,26 (t, J = 7,1 Hz, 3H), 1,46 (s, 9H), 1,43 - 1,49 (m, 1H), 1,76 - 1,82 (szerokie m, 1H), 2,14 (q, J = 8,6 Hz, 1H), 4,18 (q, J= 7,2 Hz, 2H), 5,12 (dd, J= 10,3, 1,7 Hz, 1H), 5,25 (szerokie s, 1H), 5,29 (dd, J = 17,6, 1,7 Hz, 1H), 5,77 (ddd, J = 17,6, 10,3, 8,9 Hz, 1H).

MS: m/z = 254,16 (M⁺+1).

A.3) Wytwarzanie racemicznego chlorowodorku estru etylowego kwasu (1R, 2S)/(1S, 2R)-1-amino-2-winylocyklopropanokarboksylowego

Ester etylowy kwasu N-Boc-(1R, 2S)/(1S, 2R)-1-amino-2-winylocyklopropanokarboksylowego (9,39 g, 36,8 mmoli) rozpuszczono w mieszaninie 4 N HCl/dioksan (90ml, 360 mmoli) i mieszano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Mieszaninę reakcyjną zatężono, otrzymując chlorowodorek estru etylowego kwasu (1R, 2S)/(1S, 2R)-1-amino-2-winylocyklopropanokarboksylowego z wydajnością ilościową (7 g, 100%).

¹H NMR (metanol-d4) δ: 1,32 (t, J = 7,1, 3H), 1,72 (dd, J = 10,2, 6,6 Hz, 1H), 1,81 (dd, J = 8,3, 6,6 Hz, 1H), 2,38 (q, J = 8,3 Hz, 1H), 4,26 - 4,34 (m, 2H), 5,24 (dd, 10,3, 1,3 Hz, 1H) 5,40 (d, J = 17,2, 1H), 5,69 - 5,81 (m, 1H).

Metoda B

Do roztworu tert-butoksylanu potasu (11,55 g, 102,9 mmola) w THF (450 ml), utrzymywanego w temperaturze -78°C, dodano dostępną w handlu N,N,-dibenzyloiminę estru etylowego glicyny (25,0 g, 93,53 mmole) w THF (112 ml). Mieszaninę reakcyjną ocieplono do temperatury 0°C i mieszano przez 40 minut, po czym ponownie schłodzono do temperatury -78°C. Do tego roztworu dodano trans-1,4-dibromo-2-buten (20,0 g, 93,50 mmole) i następnie mieszaninę reakcyjną mieszano przez 1 godzinę w temperaturze 0°C, po czym schłodzono do temperatury -78°C. Dodano tert-butoksylan potasu (11,55 g, 102,9 mmole), po czym mieszaninę ocieplono natychmiast do temperatury 0°C i mieszano ponad 1 godzinę przed zatężeniem pod próżnią. Surowy produkt wprowadzono do eteru dietylowego (530 ml), następnie dodano 1 N wodny roztwór HCl (106 ml, 106 mmoli) i otrzymaną dwufazową mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 3,5 godziny. Warstwy rozdzielono, po czym warstwę wodną przemyto eterem dimetylowym (2 x) i zalkalizowano nasyconym, wodnym roztworem NaHCO3. Żądaną aminę ekstrahowano eterem dietylowym (3 x) i następnie połączone ekstrakty organiczne przemyto solanką, osuszono (MgSO4) i zatężono pod próżnią, otrzymując wolną aminę. Tę

PL 211 889 B1 substancję zadano 4 N roztworem HCl w dioksanie (100 ml, 400 mmoli) i zatężono, otrzymując chlorowodorek estru etylowego kwasu (1R, 2S)/(1S, 2R)-1-amino-2-winylocyklopropanokarboksylowego w postaci półstałej substancji koloru brązowego (5,3 g, wydajność - 34%), która była taka sama jak substancja otrzymana zgodnie z metodą A, z tą różnicą, że zawierała małą ilość niezidentyfikowanych organicznych zanieczyszczeń aromatycznych (8%).

Etap 2b: Wytwarzanie izomeru (1R,2S)-P1 estru tert-butylowego kwasu 2-(1-etoksykarbonylo-2-winylocyklopropylokarbamylo-4-(7-metoksy-2-fenylo-chinolin-4-yloksy)pirolidyno-1-karboksylowego lub o odmiennej nazwie to jest estru tert-butylowego kwasu 2(S)-(1(R)etoksykarbonylo-2(S)-winylo-cyklopropylokarbamoilo)-4(R)-(7-metoksy-2-fenylo-chinolin-4-yloksy) pirolidyno-1-karboksylowego, którego schemat przedstawiono poniżej

Do roztworu zawierającego Boc-4(R)-(2-fenylo-7-metoksychinolino-4-okso)proliny z etapu 1c (11,0 g, 23,7 mmole), chlorowodorek mieszaniny racemicznej diastereoizomerów pochodnych (1R, 2S) i (1S, 2R) P1 z etapu 2b, gdzie grupa karboksy znajduje się w pozycji syn w stosunku do grupy winylowej (5,40 g, 28,2 mmoli), NMM (20,8 ml, 18,9 mmoli) w 500 ml mieszaniny 50% CH2Cl2/THF dodawano w temperaturze 0°C przez 10 minut, w trzech porcjach, reagent sprzęgający PyBrop lub heksafluorofosforan bromo-tris-pirolidynofosfoniowy (16,0 g, 34,3 mmole). Roztwór mieszano w temperaturze pokojowej przez jeden dzień i następnie przemyto buforem o pH = 4,0 (4 x 50 ml). Warstwę organiczną przemyto nasyconym, wodnym roztworem NaHCO3, po czym przemywki wodne ekstrahowano octanem etylu (150 ml) i następnie warstwę organiczną wymyto buforem o pH = 4,0 (50 ml) i nasyconym, wodnym roztworem NaHCO3 (50 ml). Roztwór organiczny osuszono (MgSO4), zatężono i oczyszczono z zastosowaniem kolumny Biotage 65M (elucja mieszaniną 50% octanu etylu/heksany), otrzymując 7,5 g mieszaniny izomerów (1R, 2S) i (1S, 2R) P1 estru tert-butylowego kwasu 2-(1-etoksykarbonylo-2-winylo-cyklopropylokarbamyIo-4-(7-metoksy]-2-fenylochinolin-4-yloksy)pirolidyno-1-karboksylowego (wydajność całkowita - 50%) lub odmiennie, w wyniku elucji na kolumnie Biotage 65M z zastosowaniem powolnego gradientu mieszanina od 15% do 60% octanu etylu w heksanach otrzymano

PL 211 889 B1

3,54 g (25%) izomeru (1R, 2S) P1 o wysokiej wartości Rf i 3,54 g (25%) izomeru (1S, 2R) P1 o niskiej wartości Rf.

Dane dla izomeru P1(1R, 2S)-:

¹H NMR (CDCl3) δ: 1,21 (t, J = 7 Hz, 3H), 1,43 (s, 9H), 1,47 - 1,57 (m, 1H), 1,88 (m, 1H), 2,05 - 2,19 (m, 1H), 2,39 (m, 1H), 2,88 (m, 1H), 3,71 - 3,98 (m, 2H), 3,93 (s, 3H), 4,04 - 4,24 (m, 2H), 4,55 (m, 1H), 5,13 (d, J = 10 Hz, 1H), 5,22 - 5,40 (m, 1H), 5,29 (d, J = 17 Hz, 1H), 5,69 - 5,81 (m, 1H), 7,02 (szerokie s, 1H), 7,09 (dd, J = 9,2 Hz, 1H), 7,41 - 7,52 (m, 4H), 7,95 (d, J = 9 Hz, 1H), 8,03, 8,05 (2s, 2H).

¹³C NMR (CDCl3) δ: 14, 22, 22, 83, 28, 25, 33, 14, 33, 58, 39,92, 51,84, 55,47, 58,32, 61,30, 75,86, 81,27, 98,14, 107,42, 115,00, 117,84, 118,27, 122,63, 123,03, 127,50, 128,72, 129,26, 133,39, 140,06, 151,23, 159,16, 160,34, 161,35, 169,78, 171,68.

LC-MS: (czas retencji: 1,62, metoda D).

MS: m/z = 602 (M⁺+1).

Dane dla izomeru P1(1S, 2R)-:

¹H NMR δ: 1,25 (t, J=1 Hz, 3H), 1,44 (s, 9H), 1,46-1,52 (m, 1H), 1,84 (m, 1H), 2,12 - 2,21 (m, 1H), 2,39 (m, 1H), 2,94 (m, 1H), 3,82 (m, 2H), 3,97 (s, 3H), 4,05 - 4,17 (m, 2H), 4,58 (m, 1H), 5,15 (d, J = 10,8 Hz, 1H), 5,33 (d, J = 17 Hz, 1H), 5,30 - 5,43 (m, 1H), 5,72 - 5,85 (m, 1H), 7,05 (s, 1H), 7,13 (dd, J = 9, 2 Hz, 1H), 7,46 - 7,60 (m, 4H), 7,98 (d, 7=9, 1H), 8,06 - 8,10 (m, 2H).

LC-MS: (czas retencji: 1,66, metoda D).

MS: m/z = 602 (M⁺+1).

Odmienny etap 2b:

Wytwarzanie estru tert-butylowego kwasu 2(S)-(1(R)-etoksykarbonylo-2(S)-winylocyklopropylokarbamoilo)-4(R)-(7-metoksy-2-fenylochinolin-4-yloksy)pirolidyno-1-karboksylowego, którego schemat przedstawiono poniżej

PL 211 889 B1

Produkt z etapu 2a (7,5 g, 39,1 mmoli) połączono z di-izopropyloetyloaminą (32,5 ml, 186 mmoli) w dichlorometanie (150 ml). Do wytworzonej mieszaniny dodano wodzian HOBT (6,85 g, 44,7 mmole) i produkt z etapu 1c (17,3 g, 37,3 mmoli), po czym dodano HBTU (16,96 g, 44,7 mmole). Bezpośrednio po dodaniu nastąpiła słaba reakcja egzotermiczna. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez okres nocy w temperaturze pokojowej, po czym zatężono pod próżnią i ponownie rozpuszczono w octanie etylu (600 ml). Roztwór przemyto wodą (2 x 200 ml), następnie 10% wodnym roztworem wodorowęglanu sodu (2 x 200 ml), następnie wodą (150 ml) i w końcu solanką (150 ml). Masę organiczna osuszono nad bezwodnym MgSO4 i przefiltrowano, po czym filtrat zatężono pod próżnią, otrzymując szklista substancję stałą koloru beżowego. Oczyszczanie przeprowadzono w wielu porcjach (każda po 7 g) metodą chromatografii szybkosprawnej z zastosowaniem wkładu Biotage Flash 75M (mieszanina 66% heksanów/octan etylu), otrzymując izomer P1(1R,2S)-winyloAcca estru BOC-NH-P2-P1-COOC2H5 jako izomer eluowany w pierwszej kolejności (całkowita wydajność 9,86 g, 44,0%) i następnie jako drugi eluowano izomer P1(1S, 2R)-winyloAcca estru BOC-NH-P2-P1-COOC2H5 (całkowita wydajność 10,43 g, 46,5%). Odzyskano ogółem 1,97 g frakcji mieszanych, uzyskując 99,3% całkowitej przemiany do dwóch diastereoizomerów.

Izomer (1R, 2S) :

¹H NMR (metanol-d4) δ: 1,23 (t, J = 1,2 Hz, 3H), 1,4 (s, 4H), 1,45 (s, 6H), 1,73 (dd, J = 7,9, 1,5 Hz, 0,4H), 1,79 (dd, J = 7,8, 2,4 Hz, 0,6H), 2,21 (q, J = 8,2 Hz, 1H), 2,44 - 2,49 (m, 1H), 2,66 - 2,72 (m, 0,4H), 2,73 - 2,78 (m, 0,6Η), 3,93 - 3,95 (m, 2H), 3,96 (s, 3H), 4,10 - 4,17 (m, 2H), 4,44 (q, J= 7,8 Hz, 1H), 5,13 (d, J= 10,7 Hz, 1H), 5,31 (d, J= 17,7 Hz, 0,4H), 5,32 (d, J= 17,4 Hz, 0,6H), 5,49 (bs, 1H), 5,66 - 5,82 (m, 1H), 7,16 (dd, J = 9,2, 2,5 Hz, 1H), 7,26 (s, 1H), 7,42 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 7,48 - 7,55 (m, 3H), 8,02 - 8,05 (m, 3H).

MS: m/z = 602 (M⁺+1)

Etap 2c: Wytwarzanie diastereoizomeru P1(1R, 2S) dichlorowodorku estru etylowego kwasu 1-{[4-(7-metoksy-2-fenylochinolin-4-yloksy)pirolidyno-2-karbonylo]-1-amino}-2-winylocyklopiopanokarboksylowego, którego wzór strukturalny przedstawiono poniżej

Produkt z etapu 2b (5,88 g, 9,77 mmoli) rozpuszczono w roztworze HCl w dioksanie (roztwór 4,0 M, 200 ml) i mieszano w temperaturze pokojowej przez 2,5 godziny. Mieszaninę reakcyjną zatężono, otrzymując związek wymieniony w tytule.

¹H NMR (metanol-d4) δ: 1,24 (t, J = 7 Hz, 3H), 1,50 (dd, J= 10,5 Hz, 1H), 1,78 (dd, J= 8,4, 5,5 Hz, 1H), 2,24 - 2,33 (m, 1H), 2,56 - 2,66 (m, 1H), 3,05 (dd, J = 14,6, 7,3 Hz, 1H), 3,98 (s, 2H), 4,06 (s, 3H), 4,15 (q, J= 7 Hz, 2H), 4,76 (dd, J= 10,6, 7,3 Hz, 1H), 5,13 (dd, J= 10,2, 1,8 Hz), 5,32 (dd, J = 17,2 Hz), 5,70 - 5,83 (m, 1H), 6,05 (m, 1H), 7,48 (dd, 7 = 9,2 Hz, 1H), 7,65 - 7,79 (m, 5H), 8,12 - 8,15 (m, 2H), 8,54 (d, J= 9,5 Hz, 1H).

¹³C NMR (metanol-d4) δ: 14,77, 23,23, 34, 86, 37,25, 41,19, 43,90, 52,66, 60,35, 62,32, 62,83, 68,27, 72,58, 73,70, 81,21, 100,70, 102,44, 116,13, 118,67, 122,25, 126,93, 130,27, 130,94, 133,19, 134,14, 134,89, 143,79, 158,39, 166,84, 167,44, 169,57, 171,33.

LC-MS: (czas retencji: 1,55, metoda D).

MS: m/z = 502 (M⁺+1).

Etap 2d: Wytwarzanie izomeru P1(1R, 2S) estru etylowego kwasu 1-{[1-2-tert-butoksykarbonyloamino-3,3-dimetylobutyrylo)-4-(7-metoksy-2-fenylochinolin-4-yloksy)-pirolidyno-2-karbonylo]amino}-2-winylocyklopropanokarboksylowego, którego wzór strukturalny przedstawiono poniżej

PL 211 889 B1

Do zawiesiny produktu z etapu 12c (1,95g, 3,4 mmola), N-BOC-L-tert-leucyny (0,94 g, 4,08 mmola), NMM (1,87 ml, 17 mmoli) w DMF (15 ml) dodano w temperaturze pokojowej HATU (1,55g, 4,08 mmole). Po dwudniowym mieszaniu, mieszaninę reakcyjną rozcieńczono octanem etylu (200 ml), przemyto buforem o pH = 4,0 (3 x 30 ml), nasyconym, wodnym roztworem NaHCO3 (30 ml), solanką (30 ml), po czym osuszono (MgSO4), oczyszczono z zastosowaniem kolumny Biotage 40 M (elucja przy użyciu mieszaniny zawierającej od 15% do 60% octanu etylu w heksanach), otrzymując związek wymieniony w tytule w postaci substancji stałej koloru białego (2,21 g, 90%).

¹H NMR (CDCl3) δ: 1,05 (s, 9H), 1,20 (t, J = 7 Hz, 3H), 1,38 - 1,43 (m, 1H), 1,41 (s, 9H), 1,80 - 1,85 (m, 1H), 2,08 - 2,16 (m, 1H), 2,39 - 2,47 (m, 1H), 2,90 - 2,99 (m, 1H), 3,90 - 4,01 (m, 1H), 3,93 (s, 3H), 4,12 (q, J = 7 Hz, 2H) 4,36 (d, J = 10 Hz, 1H), 4,45 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,75 - 4,85 (m, 1H), 5,09 - 5,13 (m, 1H), 5,21 - 5,34 (m, 2H), 5,69 - 5,81 (m, 1H), 7,00 - 7,09 (m, 2H), 7,42 - 7,54 (m, 5H), 8,01 - 8,05 (m, 3H).

¹³C NMR (CDCl3) δ: 14,30, 22,85, 26,40, 28,25, 32,20, 34,09, 35,39, 39,97, 53,86, 55,47, 58,28,

58,96, 61,29, 75,94, 79,86, 97,98, 107,43, 115,06, 117,98, 118,38, 123,03, 127,52, 128,76, 129,24, 133,40, 140,26, 151,44, 155,74, 159,16, 160,09, 161,32, 169,55, 170,64, 172,63.

LC-MS: (czas retencji: 1,85, metoda D).

MS: m/z = 715 (M⁺+1).

Etap 2e: Wytwarzanie związku wymienionego w tytule, to jest izomeru P1(1R, 2S) kwasu 1-{[1-2-tert-butoksykarbonyloamino-3,3-dimetylobutyrylo)-4-(7-metoksy-2-fenylochinolin-4-yloksy)pirolidyno-2-karbonylo]amino}-2-winylocyklopropanokarboksylowego

Do zawiesiny produktu z etapu 12d (2,63 g, 3,68 mmola) w THF (150 ml), CH3OH (80 ml i H2O (20 ml) dodano LiOH (1,32 g, 55,2 mmoli). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 2 dni, następnie zakwaszono do pH obojętnego i zatężono pod próżnią aż uzyskano pozostałość tylko w postaci warstwy wodnej. Otrzymana wodna pozostałość zakwaszono do pH = 3,0 przez dodanie 1,0 N wodnego roztworu HCl i następnie ekstrahowano octanem etylu (4 x 200 ml). Połączone rozpuszczalniki organiczne przemyto solanką (20 ml), następnie osuszono (Na2SO4), przefiltrowano i zatężono pod próżnią, otrzymując związek wymieniony w tytule w postaci substancji stałej koloru białego (2,41 g, 96%).

¹H NMR (CDCl3/metanol-d4) δ: 0,98, 1,01 (dwa s (rotamery), 9H), 1,40, 1,42 (dwa s (rotamery), 9H), 1,35 - 1,47 (m, 1H), 1,89 - 1,93 (m, 1H), 2,03 - 2,14 (m, 1H), 2,45 - 2, 52 (m, 1H), 2,64 - 2,78 (m, 1H), 3,94 (s, 3H), 3,96 - 4,12 (m, 1H), 4,34 (d, J = 10 Hz, 1H), 4,52 (d, J = 11 Hz, 1H), 4,58 - 4,64 (m, 1H), 5,10 (d, J = 12 Hz, 1H), 5,24 (d, J = 16 Hz, 1H), 5,34 (m, 1H), 5,68 - 5,86 (m, 2H), 7,02 - 7, 05 (m, 1H), 7,32 (m, 1H), 7,40 - 7,54 (m, 4H), 7,97 - 8,03 (m, 3H).

¹H NMR (metanol-d4) δ: 1,03 (s, 9H), 1,26 (s, 9H), 1, 39 - 1,47 (m, 1H), 1,68 (dd, J= 8, 5 Hz, 1H), 2,15 - 2,23 (m, 1H), 2,40 - 2,51 (m, 1H), 2,71 (dd, J = 14, 7 Hz, 1H), 3,95 (s, 3H), 4,01 - 4,10 (m, 1H), 4,22 (d, J = 9 Hz, 1H), 4, 53 - 4, 64 (m, 1H), 5,08 (dd, J = 10, 2 Hz, 1H), 5,24 (dd, J = 17, 2 Hz, 1H), 5,56 (m, 1H), 5, 77 - 5, 89 (m, 1H), 7,08 (dd, J = 9, 2 Hz, 1H), 7,27 (s, 1H), 7,36 - 7,41 (m, 1H), 7,48 - 7,58 (m, 3H), 8,03 - 8,12 (m, 3H).

LC-MS: (czas retencji: 1,64, metoda D).

MS: m/z =687 (M⁺+1).

Ujawnioną w etapie 2e opisu przykładu 2 procedurę hydrolizy, można zastosować do wszystkich N-BOC-tripeptydów które zawierają fragment winyloAcca jak produkt z etapu 2d.

PL 211 889 B1

P r z y k ł a d 3

Związek 1, to jest BOCNH-P3(L-t-BuGly)-P2[(4R)-(2-fenylo-7-metoksychinolino-4-okso)-S-prolino]-P1(1R, 2S-winyloAcca)-CONH-(2-sulfonylotiofen) lub związek 1 o odmiennej nazwie to jest izomer P1(1R, 2S) estru tert-butylowego kwasu (1-{4-(7-metoksy-2-fenylochinolin-4-yloksy)-2-[1-(tiofeno2-sulfonyloaminokarbonylo)-2-winylocyklopropylo-karbamoilo]pirolidyno-1-karbonylo}-2,2-dimetylopropylo)-karbamowego, którego wzór strukturalny przedstawiono poniżej, wytworzono w następujący sposób.

Wytwarzanie związku 1, metoda A:

Roztwór CDI (0,0165g, 0,10 mmola) i produkt z etapu 2e (0,050 g, 0,0728 mmola) w THF (2 ml) ogrzewano przez 30 minut, utrzymując w stanie wrzenia pod chłodnicą zwrotną i następnie pozostawiono do schłodzenia do temperatury pokojowej. Dodano w jednej porcji 0,0594 g (0,36 mmola)

2-tiofenosulfonamidu (wytworzonego z uzyskanego z firmy Aldrich chlorku kwasu 2-tiofenosulfonowego z wykorzystaniem metody Steinkopfa i Hoepnera, Justus Liebigs Ann. Chem., 501, 1933, strony 174-182), po czym dodano roztwór czystego DBU (0,025 ml, 0,167 mmola). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 18 godzin, następnie rozcieńczono octanem etylu (30 ml) i przemyto buforem o pH =4,0 (3 x 10 ml), po czym osuszono (MgSO₄), zatężono i oczyszczono na jednej płytce 1000 DM do preparatywnej TLC z firmy Analtech (20 x 40 cm, z zastosowaniem elucji sekwencyjnej z użyciem mieszaniny od 0% do 6% metanolu w CH2Cl2), otrzymując związek 1 (0,0298 g, 49%).

¹H NMR (metanol-d4, 500 MHz) δ: 1,02 (s, 9H), 1,26 (s, 9H), 1,31 - 1,32 (m, 1H), 1,75 - 1,78 (m, 1H), 2, 03 - 2, 08 (m, 1H), 2, 44 - 2, 53 (m, 1H), 2,62 - 2,66 (m, 1H), 3,91 (s, 3H), 4,07 - 4,09 (m, 1H), 4,23 (s, 1H), 4,47 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,52 - 4,56 (m, 1H), 4,88 - 4,91 (m, 1H), 5,11 (d, J = 17 Hz, 1H), 5,45 (m, 1H), 5,78 - 5,90 (m, 1H), 6,95 (m, 1H), 7,04 (d, J = 9 Hz, 1H), 7,19 (s, 1H), 7,34 (s, 1H), 7,43 - 7,65 (m, 4H), 7,62 (s, 1H), 8,02 - 8,09 (m, 3H).

LC-MS: (czas retencji: 1,91, metoda D).

MS: m/z = 832 (M⁺+1).

PL 211 889 B1

P r z y k ł a d 4

Związek 2, to jest BOCNH-P3(L-t-BuGly)-P2[(4R)-(2-fenylo-7-metoksychinolino-4-okso)-S-prolino]-P1(1R, 2S-winyloAcca)-CONH-(2-sulfonylo-5-chlorotiofen) lub związek 2 o odmiennej nazwie to jest izomer P1(1R, 2S) estru tert-butylowego kwasu (1-{4-(7-metoksy-2-fenylochinolin-4-yloksy)-2-[1-(5-chlorotiofeno-2-sulfonyloaminokarbonylo)-2-winylocyklopropylokarbamoilo]pirolidyno-1-karbonylo}-2,2-dimetylopropylo)karbamowego, którego wzór strukturalny przedstawiono powyżej, wytworzono w następujący sposób.

Wytwarzanie związku 2, metoda B:

Roztwór CDI (0,0165 g, 0,10 mmola) i produktu z etapu 2e (0,035 g, 0,050 mmola) w THF (2 ml) ogrzewano przez 30 minut, utrzymując w stanie wrzenia pod chłodnicą zwrotną i następnie pozostawiono do schłodzenia do temperatury pokojowej. Dodano w jednej porcji 0,0403 g (0,20 mmola)

5-chloro-2-tiofenosulfonamidu (wytworzonego z uzyskanego z firmy Aldrich chlorku kwasu 2-tiofenosulfonowego i przekształconego w sulfamid pierwszorzędowy w sposób analogiczny do metody Steinkopfa i Hoepnera, Justus Liebigs Ann. Chem., 501, 1933, strony 174-182), po czym dodano roztwór czystego DBU (0,0194 ml, 0,13 mmola). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 18 godzin, następnie rozcieńczono octanem etylu (100 ml) i przemyto buforem o pH = 4,0 (3 x 10 ml) oraz solanką (10 ml), po czym osuszono (MgSO4) i zatężono. Pozostałość oczyszczono najpierw na kolumnie 10 g Isco (elucja mieszaniną od 0% do 10% metanol/CH2Cl2), następnie przeprowadzono oczyszczanie końcowe na jednej płytce 1000 DM do preparatywnej TLC z firmy Analtech (20 x 40 cm, z zastosowaniem elucji z użyciem mieszaniny od 2,5% do 5% metanolu w CH2Cl2), otrzymując związek 2 (0,0159 g, 37%).

¹H NMR (metanol-d4, 500 MHz) δ: 1,03, 1,04 (2s, ogółem 9H), 1,26, 1,28 (2s, ogółem 9H), 1,33 - 1,46 (m, 1H), 1,76 - 1,79 (m, 1H), 2,11 - 2,16 (m, 1H), 2,40 - 2,50 (m, 1H), 2,69 (dd, J = 14,7 Hz, 1H), 3,96 (s, 3H), 4,04 - 4,14 (m, 1H), 4,19 - 4,24 (m, 1H), 4,53 - 4,58 (m, 2H), 4,97 (d, J = 10 Hz, 1H), 5,17 (d, J = 17 Hz, 1H), 5,60 - 5,66 (m, 2H), 7,00 (d, J = 4 Hz, 1H), 7,13 (dd, J = 9, 2 Hz, 1H), 7,32 (s, 1H), 7,40 (d, J = 2 Hz, 1H), 7,53 - 7,58 (m, 4H), 8,04 - 8,05 (m, 2H), 8,13 - 8,17 (m, 1H).

LC-MS: (czas retencji: 1,76, metoda A).

MS: m/z = 866 (M⁺+1).

P r z y k ł a d 5

Związek 3, to jest BOCNH-P3(L-t-BuGly)-P2[(4R)-(2-fenylo-7-metoksychinolino-4-okso)-S-prolino]-P1{1R, 2S-winyloAcca)-CONH-(2-sulfonylo-5-nitrotiofen) lub związek 3 o odmiennej nazwie to jest izomer P1(1R, 2S) estru tert-butylowego kwasu (1-{4-(7-metoksy-2-fenylochinolin-4-yloksy)-2-[1-(5-nitrotiofeno-2-sulfonyloaminokarbonylo)-2-winylocyklopropylokarbamoilo]pirolidyno-1-karbonylo}-2,2-dimetylopropylo)karbamowego, którego wzór strukturalny przedstawiono powyżej, wytworzono w sposób analogiczny do opisanego przy wytwarzaniu związku 2, z tą różnicą, że jako sulfonamid pierwszorzędowy zastosowano 5-nitrotiofeno-2-sulfonamid zakupiony w firmie Salor.

LC-MS: (czas retencji: 5,19, metoda E).

MS: m/z = 878 (M⁺+1).

PL 211 889 B1

Związek 4, to jest BOCNH-P3(L-t-BuGly)-P2[(4R)-(2-fenylo-7-metoksychinolino-4-okso)-S-prolino]-P1{1R, 2S-winyloAcca)-CONH-(2-sulfonylo-5-bromotiofen) lub związek 4 o odmiennej nazwie to jest izomer P1(1R, 2S) estru tert-butylowego kwasu (1-{4-(7-metoksy-2-fenylochinolin-4-yloksy)-2-[1-(5-bromotiofeno-2-sulfonyloaminokarbonyIo)-2-winylocyklopropylokarbamoiIo]pirolidyno-1-karbonylo}-2,2-dimetylopropylo)karbamowego, którego wzór strukturalny przedstawiono powyżej, wytworzono w sposób analogiczny do opisanego przy wytwarzaniu związku 2, z tą różnicą, że jako sulfonamid pierwszorzędowy zastosowano 5-bromotiofeno-2-sulfonamid zakupiony w firmie Oakwood.

¹H NMR (metanol-d4, 300 MHz) δ: 1,02 (s, 9H), 1,26 (s, 9H), 1,43 (m, 1H), 1,78 (dd, J = 8, 5 Hz, 1H), 2,05 - 2,11 (m, 1H), 2,46 - 2,55 (m, 1H), 2,63 - 2,72 (m, 1H), 3,91, 3,93 (2s, 3H), 4,05 - 4,14 (m, 1H), 4,23 (s, 1H), 4,46 - 4,62 (m, 2H), 4,90 - 4,94 (m, 1H), 5,13 (d, J = 17,2 Hz, 1H), 5,43 - 5,48 (m, 1H), 5,66 - 5,88 (m, 1H), 6,96 - 6,99 (m, 1H), 7,03 - 7,06 (m, 1H), 7,20 (s, 1H), 7,34 - 7,37 (m, 2H), 7,47 - 7,55 (m, 3H), 8,01 - 8,11 (m, 3H). HRMS:

- obliczono dla C42H49N5O9S2: 910,2155;

- znaleziono: 910,2164.

LC: (czas retencji: 1,75, metoda A).

P r z y k ł a d 7

Związek 5, to jest BOCNH-P3(L-t-BuGly)-P2[(4R)-(2-fenylo-7-metoksychinolino-4-okso)-S-prolino]-P1(1R, 2S-winyloAcca)-CONH-(2-sulfonylo-5-[4-chlorofenylosulfanylo]tiofen) lub związek 5 o odmiennej nazwie to jest izomer P1(1R, 2S) estru tert-butylowego kwasu {1-[2-{1-[5-(4-chlorofenylo sulfanylo)tiofeno-2-sulfonyloaminokarbonylo]-2-winylocyklopropylokarbamoiIo}-{4-(7-metoksy-2-fenylochinolin-4-yloksy)pirolidyno-1-karbonylo]-2,2-dimetylopropylo}karbamowego, którego wzór strukturalny przedstawiono powyżej, wytworzono w sposób analogiczny do opisanego przy wytwarzaniu związku 2, z tą różnicą, że jako sulfonamid pierwszorzędowy zastosowano 5-bromotiofeno-2-sulfonamid zakupiony w firmie Maybridge.

PL 211 889 B1 ¹H NMR (metanol-d4, 300 MHz) δ: 1,01 (s, 9H), 1,27 (s, 9H), 1,43 (m, 1H), 1,77 (dd, J = 8, 5 Hz,

1H), 2.00 - 2,10 (m, 1H), 2, 50 - 2, 63 (m, 2H), 3,92 (s, 3H), 4,07 - 4,10 (m, 1H), 4,22 (s, 1H), 4,44 - 4,58 (m, 2H), 5,12 (d, J = 17 Hz, 1H), 5,43 (m, 1H), 5, 76 - 5, 89 (m, 1H), 7, 02 - 7,23 (m, 7H), 7,35 (m, 1H), 7, 45 - 7,53 (m, 4H), 8.01 - 8,11 (m, 3H). HRMS:

- obliczono dla C48H53ClN5O9S3: 974, 2694;

- znaleziono: 974,2696.

LC: (czas retencji: 1,95, metoda A).

P r z y k ł a d 8

Związek 6, to jest BOCNH-P3(L-t-BuGly)-P2[(4R)-(2-fenyIo-7-metoksychinolino-4-okso)-S-prolino]-P1(1R, 2S-winyloAcca)-CONH-(2-sulfonylo-4-chloro-5-bromotiofen) lub związek 6 o odmiennej nazwie to jest izomer P1(1R, 2S) estru tert-butylowego kwasu {1-[2-{1-[5-bromo-4-chlorotiofeno-2-sulfonyloaminokarbonylo]-2-winylocyklopropylokarbamoilo}-4-(7-metoksy-2-fenylochinolin-4-yloksy)pirolidyno-1-karbonylo]-2,2-dimetylopropylo}karbamowego, którego wzór strukturalny przedstawiono powyżej, wytworzono w sposób analogiczny do opisanego przy wytwarzaniu związku 2, z tą różnicą, że jako sulfonamid pierwszorzędowy zastosowano 5-bromo-4-chlorotiofeno-2-sulfonamid zakupiony w firmie

Maybridge.

¹H NMR (metanol-d4, 300 MHz) δ: 1,02 (s, 9H), 1,27 (s, 9H), 1,43 (m, 1H), 1,78 (dd, J = 8,5 Hz, 1H), 2,00 - 2,10 (m, 1H), 2,49 - 2,58 (m, 1H), 2,69 (dd, J = 14, 8 Hz, 1H), 3,91 (s, 3H), 4,09 (m, 1H), 4,22 (s, 1H), 4,47 (d, J = 12 Hz, 2H), 4,58 (t, J = 9 Hz, 1H), 4,94 (dd, J = 10,2 Hz, 1H), 5,14 (d, J = 17 Hz, 1H), 5,48 (m, 1H), 5,78 - 5,91 (m, 1H), 7,04 (dd, J = 9,2, 2,2 Hz, 1H), 7,21 (s, 1H), 7,34 - 7,40 (m, 2H), 7,44 - 7,53 (m, 3H), 8,01-8,07 (m, 3H).

HRMS:

- obliczono dla C42H48BrClN5O9S2: 944, 1765;

- znaleziono: 944,1763.

LC: (czas retencji: 1,87, metoda A).

PL 211 889 B1

P r z y k ł a d 9

Związek 7, to jest BOCNH-P3(L-t-BuGly)-P2[(4R)-(2-fenylo-7-metoksychinolino-4-okso)-S-prolino]-P1(1R, 2S-winyloAcca)-CONH-(2-sulfonylo-4-bromo-5-chlorotiofen) lub związek 7 o odmiennej nazwie to jest izomer P1(1R, 2S) estru tert-butylowego kwasu {1-[2-{1-[4-bromo-5-chlorotiofeno-2-sulfonyloaminokarbonylo]-2-winylocyklopropylokarbamoilo}-4-(7-metoksy-2-fenylochinolin-4-yloksy)pirolidyno-1-karbonylo]-2,2-dimetylopropylo}karbamowego, którego wzór strukturalny przedstawiono powyżej, wytworzono w sposób analogiczny do opisanego przy wytwarzaniu związku 2, z tą różnicą, że jako sulfonamid pierwszorzędowy zastosowano 4-bromo-5-chlorotiofeno-2-sulfonamid zakupiony w firmie Maybridge.

¹H NMR (metanol-d4, 300 MHz) δ: 1,02 (s, 9H), 1,27 (s, 9H), 1,43 (m, 1H), 1,78 (dd, J = 7,7, 5,1 Hz, 1H), 2,03 - 2,12 (m, 1H), 2,49 - 2,59 (m, 1H), 2,66 - 2,78 (m, 1H), 3,91 (s, 3H), 4,09 - 4,12 (m, 1H), 4,22 (s, 1H), 4,48 (d, J = 11,7 Hz, 1H), 4,56 (t, J = 8,6 Hz, 1H), 4,94 (dd, J = 10,4, 1,7 Hz, 2H), 5,14 (d, J = 17,2 Hz, 1H), 5,48 (m, 1H), 5,79 - 5,91 (m, 1H), 7,04 (dd, J = 9,1, 2,6 Hz, 1H), 7,21 (s, 1H), 7,34 - 7,55 (m, 5H), 8,01 - 8,11 (m, 3H).

HRMS:

- obliczono dla C42H48BrClN5O9S2: 944, 1765;

- znaleziono: 944,1763.

LC-MS: (czas retencji: 1,88, metoda A).

P r z y k ł a d 10

Związek 8, to jest BOCNH-P3(L-t-BuGly)-P2[(4R)-(2-fenyIo-7-metoksychinolino-4-okso)-S-prolino]-P1(1R, 2S-winyloAcca)-CONH-(2-sulfonylo-4,5-dichlorotiofen) lub związek 8 o odmiennej nazwie to jest izomer P1(1R, 2S) estru tert-butylowego kwasu {1-[2-{1-[4,5-chlorotiofeno-2-sulfonylo aminokarbonylo]-2-winylocyklopropylokarbamoilo}-4-(7-metoksy-2-fenylochinolin-4-yloksy)pirolidyno-1-karbonylo]-2,2-dimetylopropylo}karbamowego, którego wzór strukturalny przedstawiono powyżej, wytworzono w sposób analogiczny do opisanego przy wytwarzaniu związku 2, z tą różnicą, że jako sulfonamid pierwszorzędowy zastosowano 4,5-chlorotiofeno-2-sulfonamid zakupiony w firmie Maybridge.

¹H NMR (metanol-d4, 300 MHz) δ: 1,02 (s, 9H), 1,27 (s, 9H), 1,44 (m, 1H), 1,78 (dd, J = 7,7, 5,1 Hz, 1H), 2.00 - 2,12 (m, 1H), 2,51 - 2,61 (m, 1H), 2,67 - 2,81 (m, 1H), 3,92 (s, 3H), 4,09 - 4,13 (m, 1H), 4,22 (s, 1H), 4,48 (d, J = 11,3 Hz, 1H), 4,57 (t, J = 8,4 Hz, 1H), 4,94 (dd, J = 10,4, 2 Hz, 2H), 5,15 (d,d, J= 17,2, 1,5 Hz, 1H), 5,50 (m, 1H), 5,78 - 5,91 (m, 1H), 7,05 (dd, J= 9,2, 2,2 Hz, 1H), 7,23 (s, 1H), 7,35 - 7,41 (m, 2H), 7,47 - 7,55 (m, 3H), 8.01 - 8,12 (m, 3H).

HRMS :

- obliczono dla C42H48Cl2N5O9S2: 900,2271;

- znaleziono: 900,2285.

LC: (czas retencji: 1,86, metoda A).

PL 211 889 B1

\

P r z y k ł a d 11

Związek 9, to jest BOCNH-P3(L-t-BuGly)-P2[(4R)-(2-fenylo-7-metoksychinolino-4-okso)-S-prolino]-P1(1R, 2S-winyloAcca)-CONH-(5-sulfonylo-2,4-dimetylotiazol) lub związek 9 o odmiennej nazwie to jest izomer P1(1R, 2S) estru tert-butylowego kwasu {1-[2-{1-[2,4-dimetylotiazolo-5-sulfonyloaminokarbonylo]-2-winylocyklopropylokarbamoilo}-4-(7-metoksy-2-fenylochinolin-4-yloksy)pirolidyno-1-karbonylo]-2,2-dimetylopropylo}karbamowego, którego wzór strukturalny przedstawiono powyżej, wytworzono w sposób analogiczny do opisanego przy wytwarzaniu związku 2, z tą różnicą, że jako sulfonamid pierwszorzędowy zastosowano 2,4-dimetylo-1,3-tiazolo-5-sulfonamid zakupiony w firmie May-bridge.

HRMS:

- obliczono dla C43H53N6O9S2: 861,3315;

- znaleziono: 861,3340.

LC-MS: (czas retencji: 1,64, metoda A).

MS: m/z = 861 [M⁺+1].

ο \

P r z y k ł a d 12

Związek 10, to jest BOCNH-P3(L-t-BuGly)-P2[(4R)-(2-fenyIo-7-metoksychinolino-4-okso)-S-prolino]-P1(1R, 2S-winyloAcca)-CONH-(5-metylopirydyno-2-sulfonylo) lub związek 10 o odmiennej nazwie to jest izomer P1(1R, 2S) estru tert-butylowego kwasu (1-{4-(7-metoksy-2-fenylochinolin-4-yloksy)-2-[1-(5-metylopirydyno-2-sulfonyloaminokarbonylo]-2-winylo-cyklopropylokarbamoilo]pirolidyno-1-karbonylo}-2,2-dimetylopropylo)karbamowego, którego wzór strukturalny przedstawiono powyżej, wytworzono w sposób analogiczny do opisanego przy wytwarzaniu związku 2, z tą różnicą, że jako sulfonamid pierwszorzędowy zastosowano 5-metylo-2-pirydynosulfonamid zakupiony w firmie Fluka.

¹H NMR (metanol-d4, 300 MHz) δ: 1,02 (s, 9H), 1,30 (s, 9H), 1,41 (m, 1H), 1,69 - 1,80 (m, 1H), 2,04 - 2,12 (m, 1H), 2,22 (s, 3H), 2,33 - 2,50 (m, 2H), 3,92 (s, 3H), 4,05 (m, 1H), 4,20 (s, 1H), 4,41 - 4,57 (m, 2H), 4,99 - 5,23 (m, 1H), 5,43 (m, 1H), 5,78 - 5,91 (m, 1H), 7,01 - 7,09 (m, 1H), 7,18 (s, 1H), 7,36 - 7,39 (m, 1H), 7,45 - 7,56 (m, 3H), 7,64 - 7,67 (m, 1H), 7,72 - 7,79 (m, 1H), 8,03-8,24 (m, 4H).

PL 211 889 B1

LC-MS: (czas retencji: 1,66, metoda D). MS: m/z =841 (M⁺+1).

P r z y k ł a d 13

Związek 11, to jest BOCNH-P3(L-t-BuGly)-P2[(4R)-(2-fenylo-7-metoksychinolino-4-okso)-S-prolino]-P1{1R, 2S-winyloAcca)-CONH-(4-sulfonylo-2-acetyloamino-5-metylo-tiazol) lub związek 11 o odmiennej nazwie to jest izomer P1(1R, 2S) estru tert-butylowego kwasu {1-[2-{1-[2-acetyloamino-5-metylotiazolo-4-sulfonyloaminokarbonylo]-2-winylocyklopropylokarbamoilo]-4-(7-metoksy-2-fenylochinolin-4-yloksy)pirolidyno-1-karbonylo]-2,2-dimetylopropyIo}-karbamowego, którego wzór strukturalny przedstawiono powyżej, wytworzono w sposób analogiczny do opisanego przy wytwarzaniu związku 2, z tą różnicą, że zastosowano 2-acetyloamino-5-metylotiazolo-4-sulfonamid (wytworzony z chlorku 2-acetyloamino-5-metylotiazolo-4-sulfonylu, zakupionego w firmie Aldrich i przekształconego w sulfonamid pierwszorzędowy z wykorzystaniem metody Steinkopfa i Hoepnera, Justus Liebigs Ann. Chem., 501, 1933, strony 174-182).

¹H NMR (metanol-d4, 300 MHz) δ: 1,05 (s, 9H), 1,29 (s, 9H), 1,35 - 1,44 (m, 1H), 1,73 - 1,80 (m, 1H), 1,92 - 2,09 (m, 1H), 2,21 (s, 3H), 2,49 (s, 3H), 2,54 - 2,62 (m, 1H), 2,71 - 2,79 (m, 1H), 3,95 (s, 3H), 4,11 - 4,16 (m, 1H), 4,24 (m, 1H), 4,50 - 4,68 (m, 2H), 4,91 - 5,01 (m, 1H), 5,17 (d, J = 17 Hz, 1H), 5,54 (m, 1H), 5,67 - 6,01 (m, 1H), 7,08 (dd, J = 9, 2 Hz, 1H), 7,26 (s, 1H), 7,40 (d, J = 2 Hz, 1H), 7,47 - 7,57 (m, 3H), 8,02, 8,04 (m, 2H), 8,11 (d, J = 9 Hz, 1H).

HRMS m/z (M+H)⁺:- obliczono dla C44H54N7S2O11: 904,3374;

- znaleziono: 904,3374.

LC: (czas retencji: 1,59, metoda A).

P r z y k ł a d 14

Związek 12, to jest BOCNH-P3(L-t-BuGly)-P2[(4R)-(2-fenylo-7-metoksychinolino-4-okso)-S-prolino]-P1(1R, 2S-winyloAcca)-CONH-(2-sulfonylo-5-acetyloamino[1,3,4]-tiadiazol) lub związek 12 o odPL 211 889 B1 miennej nazwie to jest izomer P1(1R, 2S) estru tert-butylowego kwasu {1-[2-[1-(5-acetyloamino[1,3,4]tiadiazolo-2-sulfonyloaminokarbonylo)-2-winylocyklopropylokarbamoilo]-4-(7-metoksy-2-fenylochinolin-4-yloksy)pirolidyno-1-karbonylo]-2,2-dimetylopropyIo}-karbamowego, którego wzór strukturalny przedstawiono powyżej, wytworzono w sposób analogiczny do opisanego przy wytwarzaniu związku 2, z tą różnicą, że jako sulfonamid pierwszorzędowy zastosowano acetazoloamid zakupiony w firmie Aldrich.

¹H NMR (metanol-d4, 300 MHz) δ: 1,03 (s, 9H), 1,27 (s, 9H), 1,43 (m, 1H), 1,64 - 2,10 (m, 2H), 2,19 (s, 3H), 2,44 - 2,89 (m, 2H), 3,93 (s, 3H), 4,12 - 4,24 (m, 2H), 4,49 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,55 - 4,61 (m, 1H), 5,11 (d, J = 17 Hz, 1H), 5,55 (m, 1H), 5,72 - 5,87 (m, 1H), 7,05 - 7,14 (m, 1H), 7,26 (s, 1H), 7,37 (m, 1H), 7,44 - 7,58 (m, 3H), 7,97 - 8,13 (m, 3H).

HRMS m/z (M⁺ + 1):

- obliczono dla C42H51N8S2O10: 891,3170;

- znaleziono: 891,3152.

LC-MS: (czas retencji: 1,50, metoda A).

MS: m/z = 891 (M⁺+1).

s=o

P r z y k ł a d 15

Związek 13, to jest BOCNH-P3 (L-t-BuGly)-P2 [(4R)-(2-fenyIo-7-metoksychinolino-4-okso)-S-prolino]-P1(1R, 2S-winyloAcca)-CONH-(1,1-diokso-tetrahydro-1H-1,6-tiofeno-3(R/S)-sulfonyloaminokarbonyl) lub związek 13 o odmiennej nazwie to jest izomer P1(1R, 2S) estru tert-butylowego kwasu {1-[2-[1-(1,1-diokso-tetrahydro-1,6-tiofeno-3(R/S)-sulfonyloaminokarbonylo)-2-winylocyklopropylokarbamoilo]-4-(7-metoksy-2-fenylochinolin-4-yloksy)pirolidyno-1-karbonylo]-2,2-dimetylopropylo}karbamowego, którego wzór strukturalny przedstawiono powyżej, wytworzono w sposób analogiczny do opisanego przy wytwarzaniu związku 2, z tą różnicą, że jako sulfonamid pierwszorzędowy zastosowano 1,1-dioxotetrahydro-1H-1,6-tiofeno-3 (R/S)-sulfonamid zakupiony w firmie Maybridge.

¹H NMR (metanol-d4, 300 MHz) δ: 1,04 (s, 9H), 1,29 (s, 9H), 1,44 (m, 1H), 1,72 - 1,80 (m, 1H), 2,01-2,10 (m, 1H), 2,43 - 2,64 (m, 3H), 2,69 - 2,76 (m, 1H), 3,04 - 3,52 (m, 4H), 3,92 (s, 3H), 3,97 - 4,11 (m, 2H), 4,24 (s, 1H), 4,48 - 4,60 (m, 2H), 5,01 (d, J = 12 Hz, 1H), 5,18 (d, J = 17 Hz, 1H), 5,50 (m, 1H), 5,85 - 6,00 (m, 1H), 7,03 - 7,10 (m, 1H), 7,24 (s, 1H), 7,36 (m, 1H), 7,45 - 7,55 (m, 3H), 8,03 - 8,12 (m, 3H).

HRMS m/z (M+H)⁺:

- obliczono dla C42H54N5S2O11: 868, 3261;

- znaleziono: 868,3256.

LC-MS: (czas retencji: 1,48, metoda A).

MS: m/z = 8 68 (M⁺+1).

PL 211 889 B1

P r z y k ł a d 16

Związek 14, to jest BOCNH-P3(L-t-BuGly)-P2[(4R)-(2-fenylo-7-metoksychinolino-4-okso)-S-prolino]-P1(1R, 2S-winyloAcca)-CONH-(3,5-dimetyloizoksazolo-4-sulfonyl) lub związek 14 o odmiennej nazwie to jest izomer P1(1R, 2S) estru tert-butylowego kwasu {1-[2-[1-(3,5-dimetyloizoksazolo-4-sulfonyloaminokarbonylo)-2-winylocyklopropylokarbamoilo]-4-(7-metoksy-2-fenylochinolin-4-yloksy)pirolidyno-1-karbonylo]-2,2-dimetylopropylo}karbamowego, którego wzór strukturalny przedstawiono powyżej, wytworzono w sposób analogiczny do opisanego przy wytwarzaniu związku 2, z tą różnicą, że jako sulfonamid pierwszorzędowy zastosowano 3,5-dimetyloizoksazolo-4-sulfonamid zakupiony w firmie Maybridge.

¹H NMR (metanol-d4, 300 MHz) δ: 1,04 (s, 9H), 1,26 (s, 9H), 1,43 (m, 1H), 1,68 - 1,79 (m, 1H), 1,95 - 2,06 (m, 1H), 2,35 (s, 3H), 2,58 (s, 3H), 2,50 - 2,60 (m, 1H), 2,66 - 2,73 (m, 1H), 3,94 (s, 3H), 4,08 - 4,16 (m, 1H), 4,23 (s, 1H), 4,50 - 4,57 (m, 2H), 4,91 - 4,95 (m, 1H), 5,11 - 5,19 (m, 1H), 5,48 (m, 1H), 5,48 - 5,77 (m, 1H), 7,05 - 7,14 (m, 1H), 7,26 (m, 1H), 7,39 (m, 1H), 7,46 - 7,57 (m, 3H), 8,05 - 8,13 (m, 3H).

HRMS m/z (M+H)⁺:

- obliczono dla C43H53N6SO10: 845,3544;

- znaleziono: 845,3541.

LC-MS: (czas retencji: 1,66, metoda A).

MS: m/z = 845 (M⁺+1).

P r z y k ł a d 17

Związek 15, to jest BOCNH-P3(L-t-BuGly)-P2[(4R)-(2-fenylo-7-metoksychinolino-4-okso)-S-prolino]-P1(1R, 2S-winyloAcca)-CONH-(6-etoksybenzotiazolo-2-sulfonyl) lub związek 15 o odmiennej nazwie to jest izomer P1(1R, 2S) estru tert-butylowego kwasu {1-[2-[1-(6-etoksybenzotiazolo-2-sulfonyloaminokarbonylo)-2-winylocyklopropylokarbamoilo]-4-(7-metoksy-2-fenylochinolin-4-yloksy)pirolidyno-1-karbonylo]-2,2-dimetylopropylo}karbamowego, którego wzór strukturalny przedstawiono powyPL 211 889 B1 żej, wytworzono w sposób analogiczny do opisanego przy wytwarzaniu związku 2, z tą różnicą, że jako sulfonamid pierwszorzędowy zastosowano 6-etoksy-2-benzotiazolosulfonamid zakupiony w firmie Aldrich.

¹H NMR (metanol-d4, 300 MHz) δ: 1,01(s, 9H), 1,28 (s, 9H), 1,25 - 1,37 (m, 4H), 1,76 (dd, J= 7,5, 4,9 Hz, 1H), 2,00 - 2,22 (m, 2H), 2,35 (m, 1H), 3,83 - 4,06 (m, 3H), 3,93 (s, 3H), 4,19 (s, 1H), 4,34 - 4,55 (m, 2H), 5,10 (d, J = 17,2 Hz, 1H), 5,43 (m, 1H), 5, 79 - 5,99 (m, 1H), 6,79 - 6,88 (m, 1H), 7,02 - 7,14 (m, 2H), 7,21 (s, 1H), 7,37 (m, 1H), 7,43 - 7,56 (m, 4H), 7,98 - 8,08 (m, 3H).

HRMS:

- obliczono dla C47H55N6O10S2: 927,3421;

- znaleziono: 927,3427.

LC: (czas retencji: 1,80, metoda A).

P r z y k ł a d 18

Związek 16, to jest BOCNH-P3(L-t-BuGly)-P2[(4R)-(2-fenylo-7-metoksychinolino-4-okso)-S-prolino]-P1(1R, 2S-winyloAcca)-CONH-(5-chloro-4-nitrotiofeno-2-sulfonyl) lub związek 16 o odmiennej nazwie to jest izomer (1R, 2S) P1 estru tert-butylowego kwasu {1-[2-[1-(5-chloro-4-nitrotiofeno-2-sulfonyloaminokarbonylo)-2-winylocyklopropyIokarbamoilo]-4-(7-metoksy-2-fenylochinolin-4-yloksy)-pirolidyno-1-karbonylo]-2,2-dimetylopropyIo}karbamowego, którego wzór strukturalny przedstawiono powyżej, wytworzono w sposób analogiczny do opisanego przy wytwarzaniu związku 2, z tą różnica, że jako sulfonamid pierwszorzędowy zastosowano 5-chloro-4-nitrotiofeno-2-sulfonamid zakupiony w firmie Buttpark.

HRMS:

- obliczono dla C42H48ClN6O11S2: 911,2511;

- znaleziono: 911,2494.

LC: (czas retencji: 1,75, metoda A).

PL 211 889 B1

P r z y k ł a d 19

Związek 17, to jest BOCNH-P3(L-t-BuGly)-P2[(4R)-(2-fenylo-7-metoksychinolino-4-okso)-S-prolino]-P1(1R, 2S-winyloAcca)-CONH-(5-(2-metylo-5-trifluorometylo-2H-pirazol-3-ilo)tiofeno-2-sulfonyl) lub związek 17 o odmiennej nazwie to jest izomer (1R, 2S) P1 estru tert-butylowego kwasu [1-(4-(7-metoksy-2-fenylochinolin-4-yloksy)-2-{1-[5-(2-metylo-5-trifluorometylo-2H-pirazol-3-ilo)tiofeno-2-sulfonyloamino-karbonylo]-2-winyl-cyklopropylokarbamoil}pirolidyno-1-karbonylo)-2,2-dimetylopropylo]karbamowego, którego wzór strukturalny przedstawiono powyżej, wytworzono w sposób analogiczny do opisanego przy wytwarzaniu związku 2, z tą różnica, że jako sulfonamid pierwszorzędowy zastosowano 5-(2-metylo-5-trifluorometylo-2H-pirazol-3-ilo)tiofeno-2-sulfonamid zakupiony w firmie Buttpark.

¹H NMR (metanol-d4, 300 MHz) δ: 1,02 (s, 9H), 1,26 (s, 9H), 1,42 (m, 1H), 1,78 (dd, J = 1,1, 5,1 Hz, 1H), 2,10 (q, J = 8,8 Hz, 2H), 2, 55 - 2,70 (m, 2H), 3,84 - 4,00 (m, 6H), 4,12 (m, 1H), 4,22 (m, 1H), 4,45 - 4,59 (m, 2H), 4,91 (d, J = 12 Hz, 1H), 5,14 (d, J = 16,8 Hz, 1H), 5,48 (s, 1H), 5,82 - 5,94 (m, 1H), 6,70 (m, 1H), 7,02 - 7,07 (m, 1H), 7,17 - 7,21 (m, 2H), 7,34 (m, 1H), 7,44 - 7,53 (m, 3H) 7,61 (d, J= 4,0 Hz, 1H), 8,00 - 8,11 (m, 3H).

HRMS:

- obliczono dla C47F3H53N7O9S2: 980,3298;

- znaleziono: 980,3308.

LC: (czas retencji: 1,78, metoda A).

P r z y k ł a d 20

Wytwarzanie dodatkowych produktów pośrednich P1, w celu ich wprowadzenia do związków o wzorze I.

Opisane w tej części produkty pośrednie P1, można zastosować do wytwarzania związków o wzorze I z zastosowaniem metod przedstawionych w niniejszym opisie.

1. Rozdzielanie estru etylowego kwasu N-Boc-(1R, 2S)/(1S, 2R)-1-amino-2-winylocyklopropanokarboksylowego.

Rozdzielanie A

Do buforu w postaci wodnego roztworu fosforanu sodu (0,1 M, 4,25 litra („L), pH = 8), umieszczonego w 12 litrowym reaktorze z płaszczem, utrzymywanego w temperaturze 39°C i mieszanego z szybkością 300 obrotów na minutę, dodano Acalase 2.4L (425 ml) (Novozymes North America Inc.). Gdy temperatura mieszaniny osiągnęła 39°C, wyregulowano pH do wartości 8,0 przez dodanie 50% roztworu NaOH w wodzie. Następnie dodawano przez 40 minut roztwór racemicznego estru etylowego kwasu W-Boc-(1R, 2S)/(1S, 2R)-1-amino-2-winylocyklo-propanokarboksylowego (85g) w 850 ml DMSO. Temperaturę mieszaniny reakcyjnej utrzymywano przez 24,5 godziny na poziomie 40°C i po 1,5 godziny oraz po 19,5 godzinach utrzymywania temperatury 40°C pH mieszaniny regulowano do wartości 8,0 przy użyciu 50% wodnego roztworu NaOH. Po 24,5 godzinach oznaczono nadmiar enancjomeryczny estru, który wynosił 97,2%, po czym mieszaninę reakcyjną schłodzono do temperatury pokojowej (26°C) i mieszano przez okres nocy (16 godzin) i po tym czasie oznaczony nadmiar enancjomeryczny estru wynosił 100%. Następnie, pH mieszaniny reakcyjnej wyregulowano do wartości 8,5 przy użyciu 50% roztworu NaOH, po czym otrzymaną mieszaninę ekstrahowano przy użyciu MTBE (2x2 litry). Połączone ekstrakty MTBE przemyto 5% roztworem NaHCO3 (3 x 100 ml) i wodą (3 x 100 ml),

PL 211 889 B1 następnie odparowano pod próżnią, otrzymując enancjomerycznie czysty ester etylowy kwasu N-Boc-(1R, 2S)/(1S, 2R)-1-amino-2-winylocyklopropanokarboksylowego w postaci substancji stałej koloru jasnożółtego (42,55 g, czystość - 97% @ 210 nm, który nie zawierał kwasu; 100% nadmiaru enancjomerycznego („ee)).

Następnie, warstwę wodną z etapu ekstrakcji zakwaszono do pH = 2 przy użyciu 50% roztworu kwasu siarkowego i ekstrahowano przy użyciu MTBE (2x2 litry). Ekstrakt MTBE przemyto wodą (3 x 100 ml) i odparowano, otrzymując kwas w postaci substancji stałej koloru jasnożółtego (42,74 g, czystość -99% @ 210 nm, który nie zawierał estru).

ο ο

ester-(IR,2S) kwas-(lS,2R)

	Ester	Kwas
Spektrometria mas o wysokiej rozdzielczości	- (+)ESI, C13H22NO4, [M+H]+:	(-)ESI, C11H16NO4, [M+H]^-:
	obliczono 256,1549;	obliczono 226,1079;
	znaleziono 256,1542;	znaleziono 226,1089;

NMR - obserwowane przesunięcie chemiczne:

rozpuszczalnik CDCl3 (proton - δ 7,24 ppm; ¹³C - δ 77,0 ppm;) aparat Broker DRX-500C: proton - 500,032 MHz;

węgiel - 125,746 MHz;

Pozycja	Proton (wzorzec) [ppm]	¹³C Proton (wzrzec) [ppm] [ppm]	¹³C [ppm]
1	-	40,9 -	40,7
2	2,10 (q, J = 9,0 Hz)	34,1 2,17(q, J = 9,0 Hz)	35,0
3a	1,76 (szerokie)	23,2	23,4
3b	1,46 (szerokie)
4	-	170,8 -	175,8
5	5,74 (ddd, J = 9,0, 10,0, 17,0 Hz	-133,7 5,75 (m)	133,4
6a	5,25 (d, J = 17,0 Hz)	117,6 5,25 (, J= 17,0 Hz)	118,1
6b	5,08 (dd, J=10,0, 1,5 Hz	5,12 (d, J = 10,5 Hz)
7	-	155,8 -	156,2
8	-	80,0 -	80,6
9	1,43 (s)	28,3 1,43 (s)	28,3
10	4,16 (m)	61,3 -	-
11	1,23 (t, J= 7,5 Hz)	14,2 -	-

Rozdzielanie B

Do 0,5 ml buforu 100 mM Heps-Na (pH 8,5) umieszczonego w studzience płytki 24-studzienkowej (pojemność: 10 ml/studzienkę) dodano 0,1 ml Savinase 16.0L (proteaza pochodząca od Bacillus clausii) (Novozymes North America Inc.) i roztwór racemicznego estru etylowego kwasu

PL 211 889 B1

W-Boc-(1R, 2S)/(1S, 2R)-1-amino-2-winylocyklopropanokarboksylowego (10 mg) w 0,1 ml DMSO. Płytkę szczelnie zamknięto i następnie inkubowano w temperaturze 40°C, przy 250 obrotach na minutę. Po 18 godzinach, nadmiar enancjomeryczny estru wynosił 44,3%, co oznaczono w następujący sposób: pobrano 0,1 ml mieszaniny reakcyjnej i zmieszano dokładnie z 1 ml etanolu; po wirowaniu, 10 mikrolitrów („μΓ) nadsączu analizowano z zastosowaniem chiralnej HPLC Do pozostałej mieszaniny reakcyjnej dodano 0,1 ml DMSO, po czym płytkę inkubowano przez dodatkowe 3 dni w temperaturze 40°C i przy 250 obrotach na minutę i następnie do studzienki dodano 4 ml etanolu. Po wirowaniu, 10 μl nadsączu analizowano metodą chiralnej HPLC i stwierdzono, że nadmiar enancjomeryczny estru wynosił 100%.

Rozdzielanie C

Do 0,5 ml buforu 100 mM Heps-Na (pH 8,5) umieszczonego w studzience płytki 24-studzienkowej (pojemność: 10 ml/studzienkę) dodano 0,1 ml Esperase 8. OL (proteaza pochodząca od Bacillus halodurans) (Novozymes North America Inc.) i roztwór racemicznego estru etylowego kwasu N-Boc-(1R, 2S)/(1S, 2R)-1-amino-2-winylocyklopropanokarboksylowego (10 mg) w 0,1 ml DMSO. Płytkę szczelnie zamknięto i następnie inkubowano w temperaturze 40°C, przy 250 obrotach na minutę. Po 18 godzinach, nadmiar enancjomeryczny estru wynosił 39,6%, co oznaczono w następujący sposób: pobrano 0,1 ml mieszaniny reakcyjnej i zmieszano dokładnie z 1 ml etanolu; po wirowaniu, 10 μl nadsączu analizowano z zastosowaniem chiralnej HPLC Do pozostałej mieszaniny reakcyjnej dodano 0,1 ml DMSO, po czym płytkę inkubowano przez dodatkowe 3 dni w temperaturze 40°C i przy 250 obrotach na minutę i następnie do studzienki dodano 4 ml etanolu. Po wirowaniu, 10 μl nadsączu analizowano metodą chiralnej HPLC i stwierdzono, że nadmiar enancjomeryczny estru wynosił 100%.

Analizy próbek przeprowadzono w następujący sposób:

1) Przygotowanie próbki:

Około 0,5 ml mieszaniny reakcyjnej wymieszano dokładnie z 10 objętościami etanolu. Po wirowaniu, 10 μl nadsączu wstrzyknięto do kolumny HPLC.

2) Oznaczanie stopnia przemiany:

kolumna: YMC CDS A, 4,6 χ 50 mm, S-5 μm;

rozpuszczalnik: A - roztwór 1 mM HCl w wodzie, B - CH3CN; gradient: 30% B przez 1 min, od 30% do 45% B przez

0,5 min, 45% B przez 1,5 min, od 45% do 30%

B przez 0,5 min;

objętościowe natężenie przepływu: 2 ml/min;

detekcja UV: 210 nm;

czas retencji: kwas - 1,2 min, ester - 2,8 min.

3) Oznaczanie nadmiaru enancjomerycznego dla estru:

kolumna: CHIRACEL OD-RH, 4,6 x 150 mm, S-5 μm;

faza ruchoma: CH3CN/50 mM HClO4 w wodzie (67/33); objętościowe natężenie przepływu: 0,75 ml/min;

detekcja UV: 210 nm;

czas retencji: izomer (1S, 2R) w postaci kwasu - 5,2 min, racemat - 18,5 min i 20,0 min, izomer (1R,2S) w postaci estru - 18,5 min.

2. Wytwarzanie estru etylowego kwasu N-Boc-(1R, 2S)-1-amino-2-cyklopropylocyklopropanokarboksylowego.

Roztwór kwasu N-Boc-(1R, 2S)-1-amino-2-winylocyklopropanokarboksylowego (255 mg, 1,0 mmol) w eterze (10 ml) poddano reakcji z octanem palladu (5 mg, 0,022 mmola). Roztwór koloru pomarańczowo-czerwonego umieszczono w atmosferze azotu. Następnie przez 1 godzinę wkraplano nadmiar diazometanu w postaci roztworu w eterze. Otrzymany roztwór mieszano w temperaturze poPL 211 889 B1 kojowej przez 18 godzin. Nadmiar diazometanu usunięto w strumieniu azotu. Otrzymany roztwór odparowano w wyparce obrotowej, otrzymując surowy produkt. Po obróbce metodą chromatografii szybkosprawnej (mieszanina 10% octanu etylu/heksan) otrzymano 210 mg (78%) estru etylowego kwasu A-Boc-(1R, 2S)-1-amino-2-cyklopropylocyklopropanokarboksylowego w postaci bezbarwnego oleju.

LC-MS: czas retencji: 2,13 (z zastosowaniem metody podobnej do metody A, z tą różnicą że: elucja gradientowa przez 3 minuty oraz kolumna Xterra MS C18 S7 3,0 x 50 mm).

MS: m/e = 270 [M⁺+1].

3. Kwas 1-tert-butoksykarbonyloaminocyklopropanokarboksylowy jest dostępny w handlu.

4. Wytwarzanie chlorowodorku estru metylowego kwasu 1-aminocyklobutanokarboksylowego.

Kwas 1-aminocyklobutanokarboksylowy (100 mg, 0,869 mmola) (Tocris) rozpuszczono w 10 ml metanolu i przez roztwór przepuszczano przez 2 godziny gazowy HCl. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 18 godzin i następnie zatężono pod próżnią, otrzymując 144 mg oleju koloru żółtego. Po roztarciu z 10 ml eteru otrzymano 100 mg produktu wymienionego w tytule w postaci substancji stałej koloru białego.

¹H NMR (CDCl3) δ: 2,10 - 2,25 (m, 1H), 2,28 - 2,42 (m, 1H), 2,64 - 2,82 (m, 4H), 3,87 (s, 3H), 9,21 (szerokie s, 3H).

5. Wytwarzanie racemicznego estru tert-butylowego kwasu (1R, 2R)/(1S, 2S)-1-amino-2-etylocyklopropanokarboksylowego, którego wzór strukturalny przedstawiono poniżej.

H₂N co₂- t-butyl grupa etylowa w położeniu syn w stosunku do grupy karboksy

Etap 1: Wytwarzanie estru di-tert-butylowego kwasu 2-etylocyklopropano-1,1-dikarboksylowego, którego wzór strukturalny przedstawiono poniżej

t-butyl-O₂C CO₂~t-butyl

Do zawiesiny chlorku benzylotrietyloamoniowego (21,0 g, 92,2 mmoli) w 50% wodnym roztworze NaOH (92,4 g w 185 ml H2O) dodano 1,2-dibromobutan (30,0 g, 138,9 mmoli) i malonian di-tertbutylu (20,0 g, 92,5 mmoli). Mieszaninę reakcyjną mieszano energicznie w temperaturze pokojowej przez 18 godzin, po czym dodano mieszaninę wody i lodu. Surowy produkt ekstrahowano przy użyciu CH2Cl2 (3x) i kolejno przemyto wodą (3x) i solanką, po czym ekstrakty organiczne połączono. Warstwę organiczną osuszono (MgSO4), przefiltrowano i zatężono pod próżnią. Otrzymaną pozostałość poddano obróbce metodą chromatografii szybkosprawnej (100 g SiO2, 3% eteru dietylowego w heksanie), otrzymując produkt wymieniony w tytule (18,3 g, 67,8 mmoli, wydajność - 73%), który użyto bezpośrednio w następnej reakcji.

PL 211 889 B1

Etap 2: Wytwarzanie racemicznego estru tert-butylowego kwasu 2-etylocyklopropano-1,1-dikarboksylowego, którego wzór strukturalny przedstawiono poniżej

Produkt z etapu 1 (18,3 g, 67,8 mmoli) dodano w temperaturze 0°C do zawiesiny tertbutoksylanu potasu (33,55 g, 299,0 mmoli) w osuszonym eterze (500 ml) i następnie dodano wodę (1,35 ml, 75,0 mmoli), po czym mieszano energicznie w temperaturze pokojowej przez okres nocy. Mieszaninę reakcyjną wlano do mieszaniny wody i lodu oraz przemyto eterem (3x). Warstwę wodną zakwaszono w temperaturze 0°C 10% wodnym roztworem kwasu cytrynowego i następnie ekstrahowano octanem etylu (3x). Połączone warstwy organiczne przemyto wodą (2x) i solanką, następnie osuszono (MgSO4) i zatężono pod próżnią, otrzymując produkt wymieniony w tytule w postaci oleju koloru jasnożółtego (10 g, 46,8 mmoli, wydajność - 69%).

Etap 3: Wytwarzanie estru tert-butylowego kwasu (1R, 2R)/(1S, 2S)-2-etylo-1-(2-trimetylosilanyloetoksykarbonyloamino)cyklopropanokarboksylowego, którego wzór strukturalny przedstawiono poniżej

Do zawiesiny produktu z etapu 2 (10 g, 46,8 mmoli) i 3 g świeżo aktywowanych sit molekularnych 4A w osuszonym benzenie (160 ml) dodano trietyloaminę (7,50 mL, 53,8 mmoli) i DPPA (11 ml, 10,21 mmoli). Mieszaninę reakcyjną ogrzewano utrzymując w stanie wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 3,5 godziny, po czym dodano 2-trimetylosililoetanol (13,5 mL, 94,2 mmoli) i następnie mieszaninę reakcyjną ogrzewano przez okres nocy utrzymując w stanie wrzenia pod chłodnicą zwrotną. Mieszaninę reakcyjną przefiltrowano, rozcieńczono eterem dimetylowym, przemyto 10% wodnym roztworem kwasu cytrynowego, wodą, nasyconym roztworem NaHCO3, wodą (2x) i solanką (2x), następnie osuszono (MgSO4) i zatężono pod próżnią. Z pozostałości wytworzono zawiesinę z 10 g zmiatacza rodnikowego w postaci żywicy poliizocyjanianowej z firmy Aldrich w 120 ml CH2Cl2, po czym mieszano w temperaturze pokojowej przez okres nocy i następnie przefiltrowano, otrzymując produkt wymieniony w tytule (8 g, 24,3 mmoli, 52%) w postaci oleju koloru jasnożółtego.

¹H NMR (CDCl3) δ: 0,03 (s, 9H), 0,97 (m, 5H), 1,20 (bm, 1H), 1,45 (s, 9H), 1, 40 - 1, 70 (m, 4H), 4,16 (m, 2H), 5,30 (bs, 1H).

Etap 4: Wytwarzanie racemicznego estru tert-butylowego kwasu (1R, 2R)/(1S, 2S)-1-amino-2-etylocyklopropanokarboksylowego, którego wzór strukturalny przedstawiono poniżej

H₂N CO₂~ t-butyl grupa etylowa w położeniu syn w stosunku do grupy karboksy

Do produktu z etapu 3 (3 g, 9 mmoli) dodano 1,0 M roztwór TBAF w THF (9,3 ml, 9,3 mmoli) i następnie mieszaninę reakcyjną ogrzewano przez 1,5 godziny do stanu wrzenia pod chłodnicą zwrotną, po czym schłodzono do temperatury pokojowej i następnie rozcieńczono 500 ml octanu etylu. Roztwór przemyto kolejno wodą (2 x 100 ml), solanką (2 x 100 ml), po czym osuszono (MgSO4) i zatężono pod próżnią, otrzymując produkt pośredni wymieniony w tytule.

PL 211 889 B1

6. Wytwarzanie chlorowodorku estru metylowego kwasu 1-aminospiro[2.3]heksano-1-karboksylowego.

Etap 1: Wytwarzanie estru dimetylowego kwasu [2.3]heksano-1,1-dikarboksylowego, którego wzór strukturalny przedstawiono poniżej

Do mieszaniny metylenocyklobutanu (1,5 g, 22 mmoli) i Rh2(CH3COO)4 (125 mg, 0,27 mmola) w bezwodnym CH2Cl2 (15 ml) dodawano, przez 6 godzin i w temperaturze O0C, 3,2 g (20 mmoli) diazomalonianu dimetylu (wytworzonego zgodnie z doniesieniem J. Lee i innych w Synth. Comm., 1995,

25, strony 1511-1515). Następnie, mieszaninę reakcyjną ogrzano do temperatury pokojowej i mieszano przez dodatkowe 2 godziny. Mieszaninę zatężono i oczyszczono metodą chromatografii szybkosprawnej (elucja mieszaniną heksan/eter dietylowy w stosunku od 10:1 do 5:1), otrzymując 3,2 g (72%) estru dimetylowego kwasu [2.3]heksano-1,1-dikarboksylowego w postaci oleju koloru żółtego.

¹H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 3,78 (s, 6H), 2,36 (m, 2H), 2,09 (m, 3H), 1,90 (m, 1H), 1,67 (s, 2H).

LC-MS: MS m/z = 199 (M⁺+1).

Etap 2: Wytwarzanie estru metylowego kwasu spiro[2.3]heksano-1,1-dikarboksylowego, którego wzór strukturalny przedstawiono poniżej

Do mieszaniny estru dimetylowego kwasu spiro [2.3]-heksano-1,1-dikarboksylowego (200 mg, 1,0 mmol) w 2 ml metanolu i 0,5 ml wody dodano KOH (78 mg, 1,4 mmola). Roztwór ten mieszano przez 2 dni w temperaturze pokojowej. Następnie, roztwór zakwaszono rozcieńczonym HCl i ekstrahowano dwa razy eterem. Połączone fazy organiczne osuszono (MgSO4) i zatężono, otrzymując 135 mg (73%) produktu z etapu 2, w postaci substancji stałej koloru białego.

¹H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 3,78 (s, 3H), 2,36 - 1,90 (m, 8H).

LC-MS: MS m/z = 185 [M⁺+1].

Etap 3: Wytwarzanie produktu wymienionego w tytule, to jest chlorowodorku estru metylowego kwasu 1-aminospiro-[2.3]heksano-1-karboksylowego

Do mieszaniny estru metylowego kwasu spiro[2.3]heksano-1,1-dikarboksylowego (660 mg, 3,58 mmola) w 3 ml bezwodnego tert-butanolu dodano 1,08 g (3,92 mmola) DPPA i 440 mg (4,35 mmola) trietyloaminy. Mieszaninę ogrzewano przez 21 godzin, utrzymując w stanie wrzenia pod chłodnicą zwrotną i następnie rozdzielono pomiędzy wodę i eter. Fazę eterowa osuszono nad siarczanem magnezu, następnie przefiltrowano i zatężono pod próżnią, otrzymując olej. Do tego oleju dodano 3 ml 4 M roztworu HCl w dioksanie. Ten kwaśny roztwór mieszano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej i następnie zatężono pod próżnią. Pozostałość roztarto z eterem, otrzymując 400 mg (58%) żądanego produktu w postaci substancji stałej koloru białego.

¹H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ: 8,96 (szerokie s, 3H), 3,71 (s, 3H), 2,41 (m, 1H), 2,12 (m, 4H),

1,93 (m, 1H), 1,56 (q, 2H, J = 8 Hz).

LC-MS wolnej aminy: MS m/z = 156 [M⁺+1].

PL 211 889 B1

7. Poniżej opisano wytwarzanie chlorowodorku estru metylowego kwasu 1-aminospiro[2.4]heptano-1-karboksylowego, którego wzór strukturalny przedstawiono poniżej.

Etap 1: Ester dimetylowy kwasu spiro[2.4]heptano-1,1-dikarboksylowego, którego wzór strukturalny przedstawiono poniżej, wytworzono w następujący sposób

Stosując taką samą procedurę jaką opisano przy wytwarzaniu chlorowodorku estru metylowego kwasu 1-aminospiro[2.3]-heksano-1-karboksylowego, poddano reakcji 1,14 g (13,9 mmoli) metylenocyklopentanu i 2,0 g (12,6 mmoli) diazomalonianu dimetylu, otrzymując 1,8 g (67%) estru dimetylowego.

¹H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 3,73 (s, 6H), 1,80 (m, 2H), 1,70 (m, 4H), 1,60 (m, 4H).

LC-MS: MS m/z = 213 [M⁺+1].

Etap 2: Ester metylowy kwasu spiro[2.4]heptano-1,1-dikarboksylowego, którego wzór strukturalny przedstawiono poniżej, wytworzono w następujący sposób

Stosując taką samą procedurę jaką opisano przy wytwarzaniu chlorowodorku estru metylowego kwasu 1-aminospiro[2.3]-heksano-1-karboksylowego, poddano reakcji 1,7 g (8,0 mmoli) produktu z etapu 1 i 4 93 mg (8,8 mmoli) KOH otrzymano 1,5 g (94%) estru metylowego kwasu spiro[2.4]heptano-1,1-dikarboksylowego.

¹H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 3,80 (s, 3H), 2,06 (d, 1H, J = 5 Hz), 1,99 (d, 1H, J = 5 Hz), 1,80 - 1,66 (m, 8H).

LC-MS: MS m/z = 199 [M⁺+1].

Etap 3: Chlorowodorek estru metylowego kwasu 1-aminospiro [2.4]heptano-1-karboksylowego, którego wzór strukturalny przedstawiono poniżej, wytworzono w następujący sposób

Stosując taką samą procedurę jaką opisano przy wytwarzaniu chlorowodorku estru metylowego kwasu 1-aminospiro[2.3]-heksano-1-karboksylowego, poddano reakcji 500 mg (2,5 mmola) produktu z etapu 2, 705 mg (2,5 mmola) DPPA i 255 mg (2,5 mmola) trietyloaminy, otrzymując 180 mg (35%) tego chlorowodorku.

¹H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ: 8,90 (szerokie s, 3H), 3,74 (s, 3H), 1,84 (m, 1H), 1,69 (m, 4H),

1,58 (m, 4H), 1,46 (d, 1H, J = 6 Hz).

LC-MS wolnej aminy: MS m/z = 170 [M⁺+1].

PL 211 889 B1

8. Poniżej opisano wytwarzanie chlorowodorku estru metylowego kwasu 1-aminospiro[2.2]pentano-1-karboksyIowego, którego wzór strukturalny przedstawiono poniżej.

Etap 1: Ester dimetylowy kwasu spiro[2.2]pentano-1,1-dikarboksylowego, którego wzór strukturalny przedstawiono poniżej, wytworzono w następujący sposób

Do mieszaniny metylenocyklopropanu (1,0 g, 18,5 mmoli) (wytworzonego zgodnie z ujawnieniem P. Bingera w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer seryjny 5, 723,714) i Rh₂(CH₃COO)₄ (82 mg, 0,185 mmola) w bezwodnym CH₂Cl₂ (10 ml) dodano w temperaturze 0°C diazomalonian dimetyIu (2,9 g, 18,3 mmoli). Na szczycie kolby reakcyjnej umieszczono chłodnicę palcową której temperaturę utrzymywano na poziomie -10°. Mieszaninę reakcyjną zatężono pod próżnią i oczyszczono metodą chromatografii szybkosprawnej (elucja mieszaniną heksan/eter dietylowy w stosunku od 10:1 do 5:1, otrzymując 0,85 g (25%) estru dimetylowego w postaci oleju koloru żółtego.

¹H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 3,73 (s, 6Η), 1,92 (s, 2Η), 1,04 (d, 4Η, J = 3 Hz).

Etap 2: Ester metylowy kwasu spiro[2.2]pentano-1,1-dikarboksylowego, którego wzór strukturalny przedstawiono poniżej, wytworzono w następujący sposób

Stosując taką samą procedurę jaką opisano przy wytwarzaniu chlorowodorku estru metylowego kwasu 1-aminospiro[2.3]-heksano-1-karboksylowego, poddano reakcji 800 mg (4,3 mmola) produktu z etapu 1 i 240 mg (4,3 mmola) KOH, otrzymując 600 mg (82%) estru metylowego kwasu spiro[2.2]pentano-1,1-karboksylowego.

¹H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 3,82 (s, 6H), 2,35 (d, 1H, J = 3 Hz), 2,26 (d, 1H, J = 3 Hz), 1,20 (m, 1H), 1,15 (m, 1H), 1,11 (m, 1H), 1,05 (m, 1H).

LRMS: MS m/z = 169 [M⁺+1] (metoda D).

Etap 3: Chlorowodorek estru metylowego kwasu 1-aminospiro[2.2]pentano-1-karboksylowego, którego wzór strukturalny przedstawiono poniżej, wytworzono w następujący sposób

Stosując taką samą procedurę jaką opisano przy wytwarzaniu chlorowodorku estru metylowego kwasu 1-aminospiro[2.3]-heksano-1-karboksylowego, poddano reakcji 400 mg (2,3 mmola) produktu z etapu 2, 700 mg (2,5 mmola) DPPA i 278 mg (2,7 mmola) trietyloaminy, otrzymując 82 mg (20%) chlorowodorku.

¹H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 9,19 (szerokie s, 3H), 3,81 (s, 3H), 2,16, (d, J = 5,5 Hz, 1H), 2,01 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 1,49 (m, 1H), 1,24, (m, 1H), 1,12 (m, 2H).

LC-MS wolnej aminy: MS m/z = 142 [M⁺+1].

PL 211 889 B1

8. Poniżej opisano wytwarzanie estru etylowego kwasu 5-aminospiro[2.3]heksano-5-karboksylowego, którego wzór strukturalny przedstawiono poniżej.

ΝΗ ct oc₂h₅

Spiro[2.3]heksan-4-οη (500 mg, 5 mmoli), który wytworzono z bicyklopropylidenu (A. Meijere i inni, Org. Syn., 2000, 78, strony 142-151), zgodnie z A. Meijere i inni, J. Org. Chem., 1988, 53, strony 152-161, połączono z karbaminianem amonu (1,17 g, 15 mmoli) i cyjankiem potasu (812 mg, 12,5 mmoli) w 50 ml etanolu i 50 ml wody. Mieszaninę reakcyjną ogrzewano przez 2 dni w temperaturze 55°C. Następnie dodano NaOH (7 g, 175 mmoli), po czym roztwór ogrzewano przez okres nocy, utrzymując w stanie wrzenia pod chłodnicą zwrotną. Następnie mieszaninę reakcyjną schłodzono do temperatury O0C, po czym zakwaszono przy użyciu stężonego HCl do pH = 1 i zatężono pod próżnią. Do surowej mieszaniny aminokwasu dodano etanol i następnie zatężono do sucha (5x), aż do usunięcia resztek wody. Pozostałość rozpuszczono w 100 ml etanolu i schłodzono do temperatury 0°C Schłodzoną mieszaninę poddano reakcji z 1 ml SOCl2 i ogrzewano przez 3 dni, utrzymując w stanie wrzenia pod chłodnicą zwrotną. Składniki stałe usunięto na drodze filtracji, po czym filtrat zatężono pod próżnią otrzymując surowy produkt. Surowy produkt rozdzielono pomiędzy 3N roztwór NaOH, NaCl i octan etylu. Fazę organiczną osuszono na węglanem potasu i zatężono. Pozostałość oczyszczono na kolumnie chromatograficznej z żelem krzemionkowym C18 (elucja mieszanina metanol/woda), otrzymując 180 mg (21%) produktu 15 w postaci oleju.

¹H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 8,20 (szerokie s, 2H), 4,27 (s, 2H), 2,80 (s, 1H), 2,54 (s, 1H), 2,34 (m, 2H), 1,31 (s, 3H), 1,02 (s, 1H), 0,66 (m, 3H).

¹³C NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 170,2 (s), 63,0 (s), 62,8 (s), 26,1 (s), 26,0 (s), 24,9 (s), 13,9 (s), 11,4 (s), 10,9 (s).

LC-MS: MS m/z = 170 [M⁺+1].

P r z y k ł a d 21

Badania biologiczne

Oznaczenie kompleksu zrekombinowanej proteazy HCV NS3/4A z użyciem peptydu FRET

Celem tego testu in vitro było zmierzenie hamowania przez związki według niniejszego wynalazku kompleksów proteazy HCV NS3, pochodzących ze szczepów BMS, H77C lub J416S, jak to opisano poniżej,. Test ten dostarcza informacji dotyczących skuteczności związków według niniejszego wynalazku w hamowaniu aktywności proteolitycznej HCV.

Surowicę od pacjenta zakażonego HCV otrzymywano od Dr T. Wrighta, San Francisco Hospital. Zaprojektowaną pełnej długości matrycę cDNA genomu HCV (szczep BMS) skonstruowano z otrzymywanych fragmentów DNA, stosując PCR z reakcją odwrotnej transkrypcji (RT-PCR) z RNA z surowicy i stosując startery wybrane na podstawie homologii pomiędzy innymi szczepami o genotypie la. Na podstawie oznaczenia całej genomowej sekwencji, izolatowi HCV przypisano genotyp 1a zgodnie z klasyfikacją Simmondsa i współpracowników (patrz P. Simmonds, K.A. Rose, S. Graham, S.W. Chan, F. McOmish, B.C. Dow, E. A. Follett, P.L. Yap i H. Marsden, J. Clin. Microbiol., 31(6), strony 1493-1503 (1993)). Wykazano, że sekwencja aminokwasowa niestrukturalnego regionu, NS2-5B, będzie >97% identyczna z genotypem la HCV (H77C) i w 87% identyczna z genotypem Ib (J4L6S). Infekcyjne klony, H77C (genotyp 1a) i J4L6S (genotyp 1b) otrzymano od R. Purcella (NIH) i sekwencje opublikowano w Genbank (AAB67036, patrz Yariagi M., Purcell R.H., Emerson S.U. i Bukh, J. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 94(16), strony 8738-8743 (1997); AF054247, patrz Yanagi M., St Claire M., Shapiro M., Emerson S.U., Purcell R.H. i Bukh, J. Virology, 244 (1), strony 161-172. (1998)).

Szczepy BMS, H77C i J4L6S zastosowano do produkcji zrekombinowanych kompleksów proteazy NS3/4A. DNA kodujący zrekombinowany kompleks proteazy HCV NS3/4A dla tych szczepów (aminokwasy 1027 do 1711), poddano obróbce jak to opisał P. Gallinari i współpracownicy (patrz Gallinari P., Paolini C, Brennan D., Nardi C, Steinkuhler C, De Francesco R., Biochemistry, 38(17), strony 5620-32, (1999)). Pokrótce, koniec trójlizynowy zwiększający rozpuszczalność dodano na końcu 3' regionu kodującego NS4A. Resztę cysteiny w pozycji P1 tworzącą miejsce cięcia NS4A-NS4B (aminokwas 1711) zmieniono na resztę glicyny, aby uniknąć proteolitycznego cięcia etykietki lizynowej. Ponadto, metodą PCR wprowadzono mutację cysteiny na serynę w pozycji reszty aminokwasowej 1454, aby zapobiec autolitycznemu cięciu w domenie helikazy NS3. Fragment odmiany DNA klonoPL 211 889 B1 wano stosując bakteryjny wektor ekspresyjny pET21b (Novagen) i kompleks NS3/4A ulegał ekspresji w komórkach Escherichia coli, szczepu BL21 (DE3) (Invitrogen), zgodnie z protokołem opisanym przez P. Gallinari i współpracowników (patrz Gallinari P., Brennan D., Nardi C, Brunetti M., Tomei L., Steinkuhler C, De Francesco R., J Virol., 72(8), strony 6758-69 (1998)), z modyfikacjami. Pokrótce, ekspresję NS3/4A indukowano za pomocą 0,5 mM izopropylo-3-D-1-tiogalaktopiranozydem (IPTG) przez 22 godziny w temp. 20°C. Typowa wydajność fermentacji (10 1) wynosiła około 80 g wilgotnej pasty komórkowej. Komórki ponownie zawieszono w buforze do lizy (10 ml/g) składającym się z 25 mM kwasu N-(2-hydroksyetylo)piperazyno-N'-(2-etanosulfonowego) (HEPES), pH 7,5, 20% glicerolu, 500mM chlorku sodu (NaCl), 0,5% Triton-X100, 1 μg/ml lizozymu, 5 mM chlorku magnezu (MgCl₂), 1 pg/ml Dnasel, 5 mM β-merkaptoetanolu (βΜΕ), inhibitora proteazy - wolnego kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (Roche), następnie homogenizowano i inkubowano przez 20 minut w temp. 4°C. Na homogenat działano ultradźwiękami i klarowano stosując ultrawirowanie przez godzinę w temp. 4°C, przy 235000 g. Do supernatantu dodano imidazol aż do uzyskania końcowego stężenia 15mM i odczyn doprowadzono do pH = 8,0. Nieczyszczony, surowy ekstrakt białkowy wprowadzono na kolumnę nikiel - kwas nitrylotrioctowy (Ni-NTA) wstępnie zrównoważoną buforem B (25mM HEPES, pH 8,0, 20% glicerol, 500 mM NaCl, 0,5% Triton-X100, 15 mM imidazol, 5 mM (βΜΕ). Próbkę wprowadzono przy szybkości przepływu Iml/min. Kolumnę przemyto 15 objętościami kolumny buforu C (taki sam jak bufor B z wyjątkiem 0,2% Triton-X100). Białko wymywano buforem D przy użyciu 5 objętości kolumny (taki sam jak bufor C lecz zawierający 200 mM imidazolu).

Frakcje zawierające kompleks proteazy NS3/4A połączono i wprowadzono na kolumnę odsalającą Superdex-S200 wstępnie zrównoważoną buforem D (25 mM HEPES, pH 7,5, 20% glicerol, 300 mM NaCl, 0,2% Triton-X100, 10 mM βΜΕ). Próbkę wprowadzono przy szybkości przepływu 1 ml/min. Frakcje zawierające kompleks proteaza-NS3/4A połączono i zatężono do około 0,5 mg/ml. Na podstawie analiz metodą SDS-PAGE i metodą spektrometrii mas stwierdzono, że czystość kompleksów protezy NS3/4A pochodzących ze szczepów BMS, H77C i J4L6S, jest większa od 90%.

Enzym przechowywany w temp. -80°C, roztopiono w lodzie i przed użyciem rozcieńczono w buforze do testu. Substratem stosowanym do oznaczania proteazy NS3/4A, był RET Sl (Resonance Energy Transfer Depsipeptyde Substrate = substrat depsipeptydowy do rezonansowego przeniesienia energii firmy AnaSpec, Inc., numer katalogowy 22991) (peptyd FRET), opisany przez Taliani i współpracowników w Anal. Biochem., 240(2), strony 60-67 (1996). Budowa sekwencji tego peptydu bazuje w przybliżeniu na naturalnym miejscu cięcia NS4A/NS4B, z tym wyjątkiem, że w miejscu cięcia występuje wiązanie estrowe zamiast wiązania amidowego. Peptydowy substrat inkubowano z jednym z trzech zrekombinowanych kompleksów NS3/4A, przy braku związku według niniejszego wynalazku lub w obecności takiego związku, przy czym tworzenie się produktu reakcji fluorescencyjnej śledziono w czasie rzeczywistym stosując urządzenie Cytofluor Series 4000.

Zastosowano następujące odczynniki otrzymane z GIBCO-BRL: HEPES i glicerol (ultraczysty). Sulfotlenek dimetylu (DMSO) otrzymano z firmy Sigma. β-Merkaptoetanol otrzymano z firmy Bio Rad. Skład buforu do testów był następujący: 50 mM HEPES, pH 7,5; 0,15 M NaCl; 0,1% Triton; 15% glicerol; 10 mM βΜΕ. Stężenie końcowe substratu: 2 μΜ (z 2 mM roztworu podstawowego w DMSO, przechowywanego w temp. -20°C). Stężenie końcowe NS3/4A typ 1a (1b) HCV: 2-3 nM (z 5μΜ roztworu podstawowego w buforze składającym się z 25 mM HEPES, pH 7,5; 20% glicerolu; 300 mM NaCl; 0,2% Triton-X100; 10mM βΜΕ). W przypadku związków o sile działania zbliżonej do granicy testu, test przeprowadzono tak, aby był bardziej czuły dodając do buforu do testów 50 μg/ml BSA i obniżając końcowe stężenie proteazy do 300 pM.

Test wykonywano w 96-studzienkowej polistyrenowej czarnej szalce z firmy Falcon. Każda studzienka zawierała 25 μl kompleksu NS3/4A-proteaza w buforze do testu, 50 μl związku według niniejszego wynalazku w mieszaninie 10% DMSO/bufor do testów i 25 μl substratu w buforze do testu. Test kontrolny (bez związku) sporządzono również na takiej samem szalce do oznaczeń. Kompleks enzymatyczny mieszano ze związkiem lub roztworem kontrolnym przez 1 min przed rozpoczęciem reakcji enzymatycznej w wyniku dodania substratu. Szalki testowe odczytano natychmiast stosując urządzenie Cytofluor Series 4000 (z firmy Perspective Biosystems). Urządzenie ustawiono na odczyt fali emisyjnej o długości 340 nm i fali wzbudzenia 490 nm, w temperaturze 25°C. Reakcje prowadzono zwykle przez około 15 minut.

PL 211 889 B1

Procent hamowania obliczono stosując poniższe równanie:

100-[^Finh^F_Con) X100] gdzie δF oznacza zmianę fluorescencji w zakresie linowym krzywej. Do danych hamowaniestężenie zastosowano nieliniowe dopasowywanie krzywej i stężenie skuteczne w 50% (IC50) obliczono z zastosowaniem oprogramowania Excel Xl-fit, stosując równanie:

y=A+( (B-A)/(1+ ( (C/x^D)) )

Stwierdzono, że wszystkie badane związki mają wartości IC50 wynoszące 0,48 μΜ lub mniej. Ponadto stwierdzono, że związki według niniejszego wynalazku które badano przeciwko więcej niż jednemu typowi kompleksu NS3/4A, mają podobne właściwości hamujące, lecz związki jednakowo wykazywały większą siłę działania przeciwko szczepom Ib w porównaniu do szczepów 1a.

Testy specyficzności

Oznaczenie specyficzności wykonano w celu wykazania selektywności związków według niniejszego wynalazku w hamowaniu proteazy NS3/4A HCV, w porównaniu z hamowaniem innych proteaz serynowych lub cysteinowych.

Specyficzności związków według niniejszego wynalazku wyznaczono względem wielu różnych proteaz serynowych: ludzkiej elastazy z plwociny (HS), elastazy z trzustki świni (PPE) i ludzkiej trzustkowej chymotrypsyny i jednej proteazy cysternowej: ludzka wątrobowa katepsyna B. We wszystkich przypadkach zastosowano protokół z 96-studzienkowymi szalkami, stosując substrat kolorymetryczny p-nitroanilinę (pNA), specyficzny dla każdego enzymu, stosowany w sposób opisany wcześniej (zgłoszenie CT 2633), z pewnymi modyfikacjami odnoszącymi się do testów proteazy serynowej.

Każdy test obejmował dwugodzinną wstępną inkubację enzymu z inhibitorem w temperaturze pokojowej, a następnie dodanie substratu i hydrolizę do uzyskania 30% przekształcenia, jak to zmierzono w czytniku mikroszalek Spectramax Pro. Stężenia związków były różne, od 100 μΜ do 0,4 μΜ, w zależności od ich mocy.

Końcowe warunki i protokół oznaczania proteazy serynowej były następujące:

Chlorowodorek tris(hydroksymetylo)aminometanu (Tris-HCl) 50 mM, pH 8, 0,5 M siarczan sodu (Na2SO4), 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 3% DMSO, 0,01% Tween-20 z: 133 μΜ succ-AAA-pNA i 20 nM HS lub 8 nM PPE; 100 μΜ succ-AAPF-pNA i 250 pM chymotrypsyna.

Procent hamowania obliczono stosując wzór:

[1-((UVinh-UVblank) / (UVctl-UVblank))] x 100

Do analizy danych hamowanie-stężenie zastosowano nieliniowe dopasowywanie krzywej, przy czym stężenie skuteczne w 50% (IC50) obliczono z zastosowaniem oprogramowania Excel Xl-fit.

Test replikonu HCV na komórkach

Układ cała komórka z replikonem HCV utworzono w sposób opisany przez Lohmanna V., Kornera F., Kocha J., Heriana U., Theilmanna L. i Bartenschlagera R. w Science, 285 (5424), strony 110-3 (1999). Układ ten umożliwił nam określenie działania naszych związków hamujących proteazę HCV na replikację RNA HCV. Pokrótce, stosując sekwencję szczepu 1B HCV opisaną w opracowaniu Lohmanna (numer zgłoszenia: AJ238799), utworzono cDNA HCV kodujący wewnętrzne miejsce 5' dostępu rybosomy (internal ribosome entry site - IRES), gen oporności na neomycynę, EMCV (wirus zapalenia mózgu i mięśnia sercowego)-IRES i niestrukturalne białka HCV, NS3-NS5B, i nie ulegający translacji region 3' (NTR). Transkryptami cDNA in vitro transfekowano ludzką linię komórkową wątrobiaka, Huh7. Wybór komórek konstytutywnie prowadzących ekspresję replikonu HCV osiągnięto dzięki obecności markera selekcyjnego, neomycyny (G418). Otrzymane linie komórkowe charakteryzują się produkcją w czasie nici sensowej ( + ) i antysensowej (-) RNA oraz produkcją białka.

Komórki Huh7, konstytutywnie prowadzące ekspresję replikonu HCV, hodowano w pożywce Dulbecco zmodyfikowanej przez Eagle'a (DMEM) zawierającej 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS) i 1 mg/ml G418 (Gibco-BRL). Komórki wysiano na jedną noc przed badaniem (1,5 x 10⁴ komórek/studzienkę) w 96-studzienkowych sterylnych szalkach do hodowli tkankowej. Przygotowano próby kontrolne ze związkiem i próby bez związku, w DMEM zawierającym 4% PCS, 1:100 Penicylinę/streptomycynę, 1:100 L-glutaminę i 5% DMSO w szalce do rozcieńczeń (końcowe stężenie w teście - 0,5% DMSO). Mieszaniny związek/DMSO dodano do komórek i inkubowano przez 4 dni w temp. 37°C. Po 4 dniach, szalki przemyto dokładnie roztworem soli zbuforowanej fosforanem (PBS) (3 razy 150 μ^. Komórki lizowano 25 μl odczynnika do lizy zawierającego peptyd FRET (RET S1, jak

PL 211 889 B1 to opisano przy oznaczaniu enzymu in vitro). Odczynnik do testu lizy wykonano z 5X komórkowego odczynnika lucyferazowego do lizy komórek w hodowlach (Promega numer katalogowy E153A) rozcieńczonego do 1X wodą destylowaną, dodano NaCl do stężenia końcowego 150 mM, peptyd FRET rozcieńczono do stężenia końcowego 10 μΜ z roztworu podstawowego o stężeniu 2 mM w 100% DMSO. Następnie, szalkę umieszczono w urządzeniu Cytofluor 4000, który ustawiono na długość fali wzbudzenia 340nm/emisji 490 i automatyczny tryb dla 21 cykli, przy czym odczyt szalek następował w trybie kinetycznym. Wyznaczanie wartości EC50 przeprowadzono w sposób opisany przy oznaczaniu wartości IC50.

Wyznaczenie wartości EC50 w teście replikonu z FRET potwierdzono w drugim teście, którym był ilościowy test RNA. Komórki lizowano stosując zestaw Rneasy (Qiagen). Oczyszczony całkowity RNA normalizowano stosując RiboGreen (Jones L.J., Yue S.T., Cheung C Y., Singer V.L., Anal. Chem., 265 (2), strony 368-74 (1998)) i oznaczono względną ilościową ekspresję RNA HCV stosując procedurę Taqman (Kolykhalov Α.Ά., MihaIik K., Feinstone S.M., Rice C.M., Journal of Virology, 74, strony 2046-2051 (2000)) i zestaw Platinum Quantitative RT-PCR Thermoscript One-Step (firmy Invitrogen numer katalogowy 11731-015). Krótko, RNA rozcieńczone do objętości 5 μl (< 1 ng) dodano do 20 μl gotowej mieszaniny (Ready-Mix) składającej się z: 1,25X mieszaniny do reakcji Thermoscript (zawierającej siarczan magnezu i 5'-trifosforany 2-dezoksynukleozydu (dNTPs)), 3 mM dNTPs, 200 nM startera zgodnego z kierunkiem transkrypcji (sekwencja: 5'-gggagagccatagtggtctgc-3'), 600 nM startera przeciwnego do kierunku transkrypcji (5'-cccaaatctccaggcattga-3'), 100 nM sondy (5'-6-FAM-cggaattgccaggacgaccgg-BHQ-1-3')(FAM = Fluoresceinoaminoheksyloamidyt; BHQ = ciemny wygaszasz;), 1 μΜ barwnika wzorcowego Rox ( firma Invitrogen numer katalogowy 12223-012) i mieszaniny polimerazy Thermoscript Plus Platinum Taq. Wszystkie startery zaprojektowano stosując oprogramowanie ABI Prism 7700 i otrzymywano z Biosearch Technologies, Novato, CA. Jako standardy stosowano próbki zawierające znane stężenia transkryptu RNA HCV. Stosując poniższy protokół pracy cyklicznej (50°C - 30 min; 95°C - 5 min; 40 cykli w temperaturze 95°C - 15 sekund, w temperaturze 60°C - 1 min), ekspresję RNA HCV określono ilościowo zgodnie z instrukcją Perkin-Elmera stosując detektor do wykrywania sekwencji ABI Prism 7700.

Test reporterowy z lucyferazą stosowano do potwierdzenia mocy związku w replikonie. Wykorzystanie testu replikonu z układem reporterowym lucyferazy po raz pierwszy opisali Krieger i współpracownicy (Krieger N., Lohmann V., i Bartenschlager R., J. Virol., 75(10), strony 4614-4624 (2001)). Konstrukt replikonu opisany dla testu FRET zmodyfikowano przez zastąpienie genu oporności na neomycynę przez fuzyjny gen oporności na blastycydynę z N-końcem humanizowanej postaci lucyferazy z Renilla (do wklonowania stosowano miejsca restrykcyjne Asc 1/Pme 1). Wprowadzono również mutację adaptacyjną w pozycji 1179 (seryna na izoleucynę) (Blight K.J., KolykhalovA.A., Rice C.M., Scence, 290(5498), strony 1972-1974). Test reporterowy z lucyferazą rozpoczęto przez wysianie komórek Huh7 dzień przed testem, przy gęstości 2 x 10⁶ komórek na kolbę T75. Komórki przemyto następnego dnia 7,5 ml Opti-MEM medium. Zgodnie z protokołem Invitrogen, 40 μl DM-RIE-C mieszano na mieszadle Vortex stosując 5 ml Opti-MEM przed dodaniem 5 μg reporterowego RNA HCV. Mieszaninę dodano do przemytych komórek Huh7 i pozostawiono na 4 godziny w temperaturze 37°C. W międzyczasie przygotowano w DMEM, zawierającym 10% PCS i 5% DMSO, serię rozcieńczeń związku i rozcieńczenia kontrolne bez związku, w szalce do rozcieńczeń (końcowe stężenie w teście 0,5% DMSO). Mieszaninę związek/DMSO dodano do każdej studzienki w szalce 24-studzienkowej. Po 4 godzinach, mieszaninę do transfekcji odessano i komórki przemyto 5 ml Opti-MEM przed trypsynizacją. Komórki trypsynizowane zawieszono ponownie w 10% DMEM i wysiano przy 2 x 10⁴ komórek/studzienkę w 24-studzienkowych szalkach zawierających związek lub kontrolnych, bez związków. Szalki inkubowano przez 4 dni. Po 4 dniach, pożywki usunięto i komórki przemyto przy użyciu PBS. Do każdej studzienki dodano natychmiast 100 μl 1x buforu do lizy z lucyferazą RenilIa (Promega) i szalki zamrażano w temp. -80°C do dalszych analiz, lub testowano po 15 minutach lizy. Lizat (40 μθ z każdej studzienki przenoszono do 96-studzienkowej czarnej szalki (przezroczyste dno) a następnie dodano 200 μl 1x substratu do oznaczenia lucyferazy Renilla. Szalki odczytywano natychmiast przy użyciu licznika Packard TopCount NXT, z zastosowaniem programu do luminescencji

Procent hamowania obliczono stosując poniższy wzór:

θ średni sygnał lucyferazy w studzienkach doświadczalnych (+związek) średni sygnał lucyferazy w studzienkach kontrolnych z DMSO (— związek)

Wartości przedstawiono na wykresie i w celu otrzymania wartości EC50 analizowano stosując Xlfit.

PL 211 889 B1

Przykłady biologiczne

Badano reprezentatywne związki według wynalazku, stosując oznaczenie w komórkach z replikonem HCV i/lub w kilku z opisanych testów na specyficzność. Na przykład, oznaczając enzym stwierdzono, że wartość IC50 związku 1 wynosiła 8 nM względem szczepu NS3/4A BMS. Podobne wartości mocy otrzymano z publikowanymi szczepami H77C (wartość IC50 wynosiła 2,2 nM) i J4L6S (wartość IC50 wynosiła 1,6 nM). Wartość EC50 w teście replikonu była równa 55 nM.

W tych testach specyficzności wykryto, że te same związki charakteryzują się niżej przedstawioną aktywnością: HS = 35 μΜ; PPE > 50 μΜ; Chymotrypsin > 50 μΜ; Katepsyna B > 50 μΜ (graniczna rozpuszczalność przy 100 μΜ). Przedstawione wyniki wskazują, że ta rodzina związków jest wysoce specyficzna względem proteazy NS3 i wiele z jej członków hamuje replikację replikonu HCV.

Zbadano związki według obecnego wynalazku i stwierdzono, że ich aktywności mieszczą się w niżej podanych zakresach:

Zakresy aktywności IC50 (szczep NS3/4A BMS):

zakres A = 1-10 mikromoli (μΜ);

zakres B = 0,1-1 μΜ; zakres C = < 0,1 μΜ.

Zakresy aktywności EC50: zakres A = 1-10 mikromoli (μΜ); zakres B= 0,1-1 μΜ; zakres C = < 0,1 μΜ.

Należy odnotować, że na podstawie podanego w poniższej tabeli numeru związku według wynalazku, można określić na podstawie niniejszego opisu budowę związków.

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, biologiczna aktywność korzystnych związków (określona wskaźnikiem EC50) wynosi 10 μΜ lub poniżej, korzystniej 1 μΜ lub poniżej i najkorzystniej 0,1 μΜ lub poniżej.

T a b e l a 1 z przykładu 21

Tabela aktywności
Numer związku	IC50 a, b, c	EC50 a, b, c
1	C	C
2	C	B
3	B	B
4	C	B
5	B	A
6	C	B
7	C	A
8	C	B
9	C	B
10	C	B
11	C	A
12	B	A
13	C	B
14	C	B
15	B	A
16	C	B
17	C	B

PL 211 889 B1

P r z y k ł a d 22

Poniższe związki są dodatkowymi przykładami związków, które można wytworzyć wykorzystując sposoby postępowania według obecnego wynalazku.

PL 211 889 B1

Jakkolwiek wynalazek został opisany z odniesieniem do określonych odmian, specjaliści mają świadomość istnienia innych odmian, które nie zostały szczegółowo opisane w niniejszym patencie lecz które mieszczą się w zakresie poniższych zastrzeżeń.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Pochodna heterocyklosulfonamidowa o wzorze:

PL 211 889 B1

PL 211 889 B1 /A

CH

Cl lub

NO,

CF albo jego sól dopuszczona do stosowania w farmacji lub jego solwat.
2. Zastosowanie związku określonego w zastrz. 1 albo jego soli dopuszczonej do stosowania w farmacji lub jego solwatu do wytwarzania leku do leczenia infekcji wirusem HCV.
3. Kompozycja zawierająca substancję aktywną i nośnik dopuszczony do stosowania w farmacji, znamienna tym, że substancją aktywną jest związek określony w zastrz. 1 albo jego sól dopuszczona do stosowania w farmacji lub jego solwat.
4. Zastosowanie kompozycji określonej w zastrz. 3 do wytwarzania leku do leczenia pacjenta zakażonego wirusem zapalenia wątroby typu C.