KR20110065440A

KR20110065440A - 바이러스 감염의 치료를 위한 화합물 및 제약 조성물

Info

Publication number: KR20110065440A
Application number: KR1020117002744A
Authority: KR
Inventors: 에리카 크레톤-스콧; 쿠숨 굽타; 브렌다 헤르난데즈-산티아고; 마리타 라르손
Original assignee: 아이데닉스 파마슈티칼스, 인코포레이티드
Priority date: 2008-07-02
Filing date: 2009-07-01
Publication date: 2011-06-15
Also published as: RU2011103559A; WO2010014134A1; TW201004632A; AU2009277172B2; JP2011526893A; EP2476690A1; BRPI0913677A2; CA2729168A1; EP2307434B1; EP2307434A1; WO2010014134A8; HK1156038A1; RU2519947C2; IL210319A0; CN102177172A; ZA201100176B; AU2009277172A1; ES2458358T3; US20100003217A1; RU2014112319A

Abstract

본원에서 제공되는 것은 HCV 감염을 포함한 간 장애의 치료를 위한 화합물, 조성물 및 방법이다. 구체적으로는, 단독으로, 또는 다른 항-바이러스 제제와 조합되어 투여될 수 있는 뉴클레오시드 유도체의 화합물 및 조성물이 개시된다.

Description

바이러스 감염의 치료를 위한 화합물 및 제약 조성물{COMPOUNDS AND PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF VIRAL INFECTIONS}

[관련 출원에 대한 상호 참조]

본 출원은 2008년 7월 2일에 출원된 U.S. 가출원 제61/133,844호, 및 2009년 1월 27일에 출원된 61/147,722호의 우선권 혜택을 주장하는 바로써, 이들 각각의 개시내용은 그 전체가 본원에 참조로써 개재된다.

[기술분야]

본원에서 제공되는 것은 그를 필요로 하는 숙주에서 C형 간염 바이러스 감염 및 B형 간염 바이러스 감염을 포함한 바이러스 감염의 치료에 사용하기 위한 화합물, 방법 및 제약 조성물이다.

플라비비리다에 바이러스

플라비비리다에(Flaviviridae) 바이러스 과는 하기 3종 이상의 별개 속을 포함한다: 소 및 돼지에서 질병을 야기하는 페스티바이러스(pestivirus); 뎅기열 및 황열과 같은 질병의 주요 원인인 플라비바이러스(flavivirus); 및 유일한 구성원이 HCV인 헤파시바이러스(hepacivirus). 상기 플라비바이러스 속에는 혈청학적 연관성을 기준으로 하여 군들로 분리되는 68종을 초과하는 구성원들이 포함된다 (문헌 [Calisher et al ., J. Gen . Virol , 1993, 70, 37-43]). 임상적 증상은 다양하며, 열, 뇌염 및 출혈열이 포함된다 (문헌 [Fields Virology , Editors: Fields, B.N., Knipe, D.M., and Howley, P.M., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, PA, 1996, Chapter 31, 931-959]). 인간 질병과 연관되어 있는 세계적인 관심의 플라비바이러스에는 뎅기 출혈열 바이러스 (DHF), 황열 바이러스, 쇼크 증후군 및 일본 뇌염 바이러스가 포함된다 (문헌 [Halstead, S.B., Rev . Infect . Dis ., 1984, 6, 251-264]; [Halstead, S.B., Science , 239:476-481, 1988]; [Monath, T.P., New Eng . J. Med , 1988, 319, 641-643]).

페스티바이러스 속에는 소 바이러스성 설사 바이러스 (BVDV), 표준 돼지열 바이러스 (CSFV, 돼지 콜레라 바이러스로도 지칭됨) 및 양의 보더병 바이러스 (BDV)가 포함된다 (문헌 [Moennig, V. et al . Adv . Vir . Res . 1992, 41, 53-98]). 가축 (소, 돼지 및 양)의 페스티바이러스 감염은 세계적으로 상당한 경제적 손실을 야기한다. BVDV는 소에서 점막 질병을 야기하며, 가축 산업에서 상당한 경제적 중요성을 가진다 (문헌 [Meyers, G. and Thiel, H.-J., Advances in Virus Research , 1996, 47, 53-118]; [Moennig V., et al ., Adv . Vir . Res . 1992, 41, 53-98]). 인간 페스티바이러스는 동물 페스티바이러스만큼 광범위하게 특성화되어 있지 않다. 그러나, 혈청학적 조사는 인간에서의 상당한 페스티바이러스 노출을 암시하고 있다.

페스티바이러스와 헤파시바이러스는 밀접하게 관련되어 있는 플라비비리다에 과 내의 바이러스 군들이다. 이 과의 다른 밀접하게 관련되어 있는 바이러스에는 GB 바이러스 A, GB 바이러스 A-유사 인자, GB 바이러스-B 및 GB 바이러스-C (G형 간염 바이러스 HGV로도 지칭됨)가 포함된다. 헤파시바이러스 군 (C형 간염 바이러스; HCV)은 밀접하게 관련되어 있으나 유전형적으로 구별가능한, 인간을 감염하는 수많은 바이러스들로 구성된다. 대략 6종의 HCV 유전형 및 50종을 초과하는 아형이 존재한다. 세포 배양물에서 효율적으로 생장함에 있어서의 헤파시바이러스의 저조한 능력과 함께, 페스티바이러스와 헤파시바이러스 사이의 유사성으로 인하여, 종종 소 바이러스성 설사 바이러스 (BVDV)가 HCV 바이러스를 연구하기 위한 대체물로서 사용된다.

페스티바이러스와 헤파시바이러스의 유전적 구성은 매우 유사하다. 이들 양성 가닥 RNA 바이러스들은 바이러스 복제에 필요한 모든 바이러스성 단백질을 코딩하고 있는 하나의 커다란 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 가지고 있다. 이러한 단백질들은 해독과 동시에, 그리고 해독 후에 세포-코딩 및 바이러스-코딩 프로테이나제 모두에 의해 가공되어 성숙한 바이러스 단백질을 산출하는 폴리단백질로서 발현된다. 바이러스 게놈 RNA의 복제를 담당하는 바이러스성 단백질들은 카르복시-말단 쪽으로 위치되어 있다. ORF의 3분의 2는 비구조성 (NS) 단백질로 지칭된다. ORF의 비구조성 단백질 부분의 유전적 구성 및 폴리단백질 가공은 페스티바이러스와 헤파시바이러스에 있어서 매우 유사하다. 페스티바이러스와 헤파시바이러스 모두에 있어서, 성숙한 비구조성 (NS) 단백질은 비구조성 단백질 코딩 영역의 아미노 말단으로부터 ORF의 카르복시-말단까지 순서대로 p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, 및 NS5B로 구성된다.

페스티바이러스와 헤파시바이러스의 NS 단백질들은 특정 단백질 기능의 특징을 나타내는 서열 도메인을 공유한다. 예를 들어, 양 군 바이러스들의 NS3 단백질은 세린 프로테이나제 및 헬리카제의 특징을 나타내는 아미노산 서열 기조를 가지고 있다 (문헌 [Gorbalenya et al . (1988) Nature 333:22]; [Bazan and Fletterick (1989) Virology 171:637-639]; [Gorbalenya et al. (1989) Nucleic Acid Res . 17.3889-3897]). 유사하게, 페스티바이러스와 헤파시바이러스의 NS5B 단백질은 RNA-유도 RNA 폴리머라제의 특징을 나타내는 기조를 가진다 (문헌 [Koonin, E.V. and Dolja, V.V. (1993) Crit . Rev . Biochem . Molec . Biol . 28:375-430]).

바이러스 생활사에서의 페스티바이러스와 헤파시바이러스 NS 단백질들의 실제 역할 및 기능은 전적으로 유사하다. 양 경우에서, NS3 세린 프로테이나제는 ORF에서의 그의 위치 하류의 폴리단백질 전구체의 모든 단백질분해 가공을 담당한다 (문헌 [Wiskerchen and Collett (1991) Virology 184:341-350]; [Bartenschlager et al . (1993) J Virol . 67:3835-3844]; [Eckart et al. (1993) Biochem. Biophys . Res . Comm . 192:399-406]; [Grakoui et al . (1993) J. Virol . 67:2832-2843]; [Grakoui et al . (1993) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90:10583-10587]; [Hijikata et al. (1993) J. Virol . 67:4665-4675]; [Tome et al . (1993) J Virol . 67:4017-4026]). NS4A 단백질은 양 경우에서 NS3 세린 프로테아제와 공동인자로서 작용한다 (문헌 [Bartenschlager et al . (1994) J. Virol . 68:5045-5055]; [Failla et al . (1994) J. Virol. 68:3753-3760]; [Lin et al . (1994) 68:8147-8157]; [Xu et al . (1997) J Virol . 71:5312-5322]). 양 바이러스의 NS3 단백질은 또한 헬리카제로서 기능한다 (문헌 [Kim et al . (1995) Biochem . Biophys . Res . Comm . 215:160-166]; [Jin and Peterson (1995) Arch . Biochem . Biophys., 323:47-53]; [Warrener and Collett (1995) J. Virol . 69:1720-1726]). 마지막으로, 페스티바이러스와 헤파시바이러스의 NS5B 단백질은 예상되었던 RNA-유도 RNA 폴리머라제 활성을 가진다 (문헌 [Behrens et al. (1996) EMBO J. 15:12-22]; [Lchmann et al. (1997) J. Virol . 71 :8416-8428]; [Yuan et al . (l997) Biochem . Biophys . Res . Comm. 232:231-235]; 하게돈(Hagedorn)의 PCT WO 97/12033호; US 특허 제5,981,247호; 6,248,589호 및 6,461,845호, 문헌 [Zhong et al. (1998) J. Virol . 72.9365-9369]).

C형 간염 바이러스

C형 간염 바이러스 (HCV)는 세계적으로 만성 간 질병의 제1 원인이다 (문헌 [Boyer, N. et al . J. Hepatol . 32:98-112, 2000]). HCV는 느리게 진전되는 바이러스 감염을 야기하며, 경화증 및 간세포 암종의 주요 원인이다 (문헌 [Di Besceglie, A.M. and Bacon, B.R., Scientific American , Oct.: 80-85, (1999)]; [Boyer, N. et al . J. Hepatol . 32:98-112, 2000]). 세계적으로 대략 1억 7000만 명의 사람들이 HCV에 감염되어 있다 (문헌 [Boyer, N. et al . J. Hepatol . 32:98-112, 2000]). 만성 C형 간염 감염에 의해 야기되는 경화증은 미국에서 매년 8,000-12,000 건의 사망의 원인이 되며, HCV 감염은 간 이식으로 가는 제1의 징후이다.

HCV는 수혈후 간염의 80 ％ 이상 및 산발성 급성 간염의 상당 비율을 야기하는 것으로 알려져 있다. 예비적인 증거는 또한 "특발성" 만성 감염, "잠재성" 경화증, 및 아마도 B형 간염 바이러스 (HBV)와 같은 다른 간염 바이러스와 관련되지 않는 간세포 암종의 많은 경우에서 HCV를 연루시킨다. 건강한 사람들의 소정 비율은 지리학 및 기타 역학적 인자에 따라 만성 HCV 보균자인 것으로 보인다. 정보가 아직 예비적인 것이기는 하나, 그 수는 실질적으로 HBV의 것을 초과할 수 있으며; 얼마나 많은 이러한 사람들이 준임상적 만성 간 질병을 가지고 있는지는 분명치 않다 (문헌 [The Merck Manual, 18th ed., (2006)]).

HCV는 대략 9.4 kb의 양성-센스(positive-sense) 단일-가닥 RNA 게놈을 함유하는 외피화(enveloped) 바이러스이다. 상기 바이러스 게놈은 5' 비해독 영역 (UTR), 대략 3011개 아미노산의 폴리단백질 전구체를 코딩하고 있는 긴 오픈 리딩 프레임, 및 짧은 3' UTR로 구성된다. 상기 5' UTR은 HCV 게놈의 가장 고도로 보존된 부분으로서, 폴리단백질 해독의 개시 및 조절에 중요하다. HCV 게놈의 해독은 내부 리보좀 진입(internal ribosome entry)으로 알려져 있는 캡-비의존성 기작에 의해 개시된다. 이와 같은 기작은 내부 리보좀 진입 부위 (IRES)로 알려져 있는 RNA 서열에 대한 리보좀의 결합을 수반한다. 최근에는, RNA 가매듭(pseudoknot) 구조가 HCV IRES의 필수적인 구조 요소인 것으로 확인된 바 있다. 바이러스 구조 단백질에는 뉴클레오 캡시드 코어 단백질 (C), 및 2종의 외피 글리코단백질 E1 및 E2가 포함된다. HCV는 또한 NS2-NS3 영역에 의해 코딩되어 있는 아연-의존성 메탈로프로테이나제 및 NS3 영역에 코딩되어 있는 세린 프로테이나제의, 프로테이나제 2종을 코딩하고 있다. 이들 프로테이나제들은 전구체 폴리단백질 특정 영역의 성숙한 펩티드로의 절단에 필요하다. 비구조성 단백질 5의 카르복실측 절반인 NS5B는 RNA-의존성 RNA 폴리머라제를 함유한다. 나머지 비구조성 단백질인 NS4A 및 NS4B의 기능, 및 NS5A (비구조성 단백질 5의 아미노-말단측 절반)의 기능에 대해서는 알려져 있지 않다.

현재 항바이러스 연구의 상당부분 초점은 인간에서의 만성 HCV 감염 치료의 개선된 방법의 개발을 향해 있다 (문헌 [Di Besceglie, A.M. and Bacon, B.R., Scientific American , Oct.: 80-85, (1999)]).

HCV 감염이 세계적으로 유행 수준에 도달해 있으며, 감염된 환자에 대하여 비참한 효과를 가진다는 사실에 비추어 볼 때, 숙주에 대하여 낮은 독성을 가지는 새로운 효과적인 C형 간염 치료용 제약 제제를 제공할 강한 필요성이 존재한다.

또한, 다른 플라비비리다에 감염의 위협이 증가함을 고려할 때, 플라비비리다에 감염을 치료하는 새로운 효과적인 제약 제제를 제공할 강한 필요성이 존재한다.

[발명의 개요]

소정 구현예에서, 본원에서 제공되는 화합물은 하기 화학식 I의 것, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체 형태, 또는 호변이성질체 형태이다:

<화학식 I>

(여기서 R¹은 히드록실, 아미노 또는 벤질아미노이며; R²는 수소,

,

,

또는

이고, 단, R¹이 히드록실인 경우, R²는 수소,

및

이 아닌 다른 것이며, R¹인 벤질아미노인 경우, R²는

이 아닌 다른 것임).

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 하기의 화학식을 가지는 화합물 1a, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 수화물이다:

<화학식 1a>

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 하기의 화학식을 가지는 화합물 1b, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 수화물이다:

<화학식 1b>

소정 구현예에서, 본원에서 제공되는 화합물은 하기 화학식 VI의 것, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체 형태, 또는 호변이성질체 형태이다:

<화학식 VI>

(여기서, R^a 및 R^b는 하기와 같이 선택됨:

i) R^a는 수소 또는 알킬이고, R^b는 알킬, 시클로알킬, 카르복시알킬, 알콕시카르보닐알킬 또는 디알킬아미노알킬이거나; 또는

ii) R^a 및 R^b가 그들이 치환되어 있는 질소 원자와 함께 1개 또는 2개의 알킬 기로 임의 치환되는 3-7 원의 헤테로시클릭 또는 헤테로아릴 고리를 형성함).

소정 구현예에서, 화합물 1은 모약물인 2'-C-메틸 구아노신의 전구약물이다. 다른 말로 하면, 간에서의 화합물 1의 대사로부터 모약물이 수득될 수 있으며, 그에 따라 모약물이 숙주의 간에 축적될 수 있다.

소정 구현예에서, 본원에서 제공되는 화합물은 플라비비리다에 감염, 및 기타 관련 이상 예컨대 항-플라비비리다에 항체 양성 및 플라비비리다에-양성 이상, HCV에 의해 야기되는 만성 간 염증, 경화증, 섬유증, 급성 간염, 전격성 간염, 만성 지속성 간염, 및 피로의 예방 및 치료에 유용하다. 이러한 화합물 또는 제제는 항-플라비비리다에 항체 또는 플라비비리다에-항원 양성이거나 플라비비리다에에 노출된 적이 있는 개체에서 임상적 질환의 진전을 예방 또는 지연하기 위하여 예방적으로 사용될 수도 있다. 일 구현예에서, 상기 플라비비리다에는 C형 간염이다. 소정 구현예에서, 상기 화합물은 RNA-의존성 RNA 폴리머라제를 통하여 복제되는 소정의 바이러스를 치료하는 데에 사용된다.

일 구현예에서는, 임의로 제약상 허용되는 담체 중에서 단독으로, 또는 또 다른 항-플라비비리다에 제제와 함께 또는 교대로, 본원에서 제공되는 화합물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 인간을 포함한 숙주에서의 플라비비리다에 감염의 치료 방법이 제공된다.

일 양태에서, 본원에서 기술되는 화합물은 HCV 감염의 치료 또는 예방에 유용한 것과 같은 제2의 치료제와 함께 제공 또는 투여된다. 대표적인 치료제들에 대해서는 하기의 부문에 상세하게 기술되어 있다.

일 구현예에서는, 임의로 제약상 허용되는 담체 중에서 단독으로, 또는 또 다른 항-플라비비리다에 제제와 함께 또는 교대로, 약 1 mg/일 내지 약 150 mg/일 양의 S-(2-{[(2R,3R,4R,5R)-5-(2-아미노-6-옥소-1,6-디히드로-퓨린-9-일)-3,4-디히드록시-4-메틸-테트라히드로-퓨란-2-일메톡시]-벤질아미노-포스포릴옥시}-에틸)에스테르를 투여하는 것을 포함하는, 인간을 포함한 숙주에서의 플라비비리다에 감염의 치료 방법이 제공된다.

또 다른 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 임의로 제약상 허용되는 담체 중에서 치료적 유효량의 리바비린과 함께 또는 교대로, 약 1 mg/일 내지 약 150 mg/일 양의 S-(2-{[(2R,3R,4R,5R)-5-(2-아미노-6-옥소-1,6-디히드로-퓨린-9-일)-3,4-디히드록시-4-메틸-테트라히드로-퓨란-2-일메톡시]-벤질아미노-포스포릴옥시}-에틸)에스테르를 투여하는 것을 포함하는, 인간을 포함한 숙주에서의 플라비비리다에 감염의 치료 방법이다. 일 구현예에서, 투여되는 리바비린의 양은 약 800 mg 내지 약 1400 mg이다.

또 다른 양태에서 제공되는 것은 본원에서 기술되는 화합물의 치료 또는 예방적 유효량, 및 HCV 감염의 치료 또는 예방에 유용한 것과 같은 제2 치료제의 치료 또는 예방적 유효량을 포함하는, HCV 감염과 같은 장애를 치료 또는 예방하는 데에 사용하기에 적합한 제약 조성물, 단일 단위 투약 형태, 및 키트이다.

소정 구현예에서는, 본원에서 제공되는 화합물의 치료적 유효량을 그를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 간 장애의 치료 방법이 제공된다.

일부 구현예들에서, 본원에서 제공되는 것은 하기이다:

(a) 본원에서 기술되는 바와 같은 화합물, 및 그의 제약상 허용되는 염 및 조성물;

(b) 특히 플라비비리다에 감염을 가지고 있거나 C형 간염에 의해 감염될 위험성이 있는 것으로 진단된 개체에서의 플라비비리다에 감염을 포함한 간 장애의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한, 본원에서 기술되는 바와 같은 화합물, 및 그의 제약상 허용되는 염 및 조성물;

(c) 본원에서 기술되는 바와 같은 화합물의 제조 방법;

(d) 제약상 허용되는 담체 또는 희석제와 함께 본원에서 기술되는 바와 같은 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 제제;

(e) 임의로 제약상 허용되는 담체 또는 희석제 중에, 1종 이상의 다른 효과적인 항-HCV 제제와 함께 본원에서 기술되는 바와 같은 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 제제;

(f) 본원에서 기술되는 바와 같은 화합물, 그의 제약상 허용되는 염 또는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 플라비비리다에에 의해 감염된 숙주의 치료 및/또는 예방 방법; 및

(g) 1종 이상의 효과적인 항-HCV 제제와 함께 및/또는 교대로 본원에서 기술되는 바와 같은 화합물, 그의 제약상 허용되는 염 또는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 플라비비리다에에 의해 감염된 숙주의 치료 및/또는 예방 방법.

치료될 수 있는 플라비비리다에에 대해서는 예를 들면 문헌 [Fields Virology, Editors: Fields, B.N., Knipe, D.M., and Howley, P.M., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, PA, Chapter 31, 1996]에 일반적으로 논의되어 있다. 특정 구현예에서, 플라비비리다에는 HCV이다. 다른 구현예에서, 플라비비리다에는 플라비바이러스 또는 페스티바이러스이다. 구체적인 플라비바이러스에는 비제한적으로 하기가 포함된다: 아브세타로브(Absettarov), 알푸이(Alfuy), 아포이(Apoi), 아로아(Aroa), 바가자(Bagaza), 반지(Banzi), 보우보위(Bouboui), 부쑤쿠아라(Bussuquara), 카시파코레(Cacipacore), 카레이 아일랜드(Carey Island), 다카르 바트(Dakar bat), 뎅기 1(Dengue 1), 뎅기 2, 뎅기 3, 뎅기 4, 엣지 힐(Edge Hill), 엔테베 바트(Entebbe bat), 가제트 굴리(Gadgets Gully), 한잘로바(Hanzalova), 하이프르(Hypr), 일휴스(Ilheus), 이스라엘 터키 수막뇌염(Israel turkey meningoencephalitis), 일본 뇌염(Japanese encephalitis), 주그라(Jugra), 주티아파(Jutiapa), 카담(Kadam), 카르시(Karshi), 케도우고우(Kedougou), 코코베라(Kokobera), 코우탕고(Koutango), 쿰린지(Kumlinge), 쿤진(Kunjin), 캬사누르 삼림병(Kyasanur Forest disease), 랑가트(Langat), 도약병(Louping ill), 메아반(Meaban), 모독(Modoc), 몬타나 마이오티스 백색질뇌염(Montana myotis leukoencephalitis), 머레이 밸리 뇌염(Murray valley encephalitis), 나란잘(Naranjal), 네기시(Negishi), 엔타야(Ntaya), 옴스크 출혈열(Omsk hemorrhagic fever), 프놈-펜 바트(Phnom-Penh bat), 포와싼(Powassan), 리오 브라보(Rio Bravo), 로시오(Rocio), 로얄 팜(Royal Farm), 러시아 봄-여름 뇌염(Russian spring-summer encephalitis), 사보야(Saboya), 세인트 루이스 뇌염(St. Louis encephalitis), 살 비에자(Sal Vieja), 산 페를리타(San Perlita), 사우마레즈 리프(Saumarez Reef), 세피크(Sepik), 소쿨루크(Sokuluk), 스폰드웨니(Spondweni), 스트래트포드(Stratford), 템부수(Tembusu), 튤레니이(Tyuleniy), 우간다 S(Uganda S), 우수투(Usutu), 웨셀스브론(Wesselsbron), 웨스트 나일(West Nile), 야운데(Yaounde), 황열(Yellow fever), 및 지카(Zika).

치료될 수 있는 페스티바이러스에 대해서는 문헌 [Fields Virology , Editors: Fields, B.N., Knipe, D.M., and Howley, P.M., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, PA, Chapter 33, 1996]에 일반적으로 논의되어 있다. 구체적인 페스티바이러스에는 비제한적으로 하기가 포함된다: 소 바이러스성 설사 바이러스 ("BVDV"), 표준 돼지열 바이러스 ("CSFV", 돼지 콜레라 바이러스로도 지칭됨), 및 보더병 바이러스 ("BDV").

도 1은 역상 HPLC에 의한 화합물 1 부분입체이성질체 2종의 해상을 예시하는 HPLC 궤적을 제공하며 - 궤적 중 2개의 피크인 피크 1 (부분입체이성질체 1) 및 피크 2 (부분입체이성질체 2)는 화합물 1의 순수한 부분입체이성질체에 해당한다.
도 2는 실시예 14의 방법 1에 의해 수득된 화합물 1 및 대사물 표준의 대표적인 HPLC 크로마토그램을 제공한다.
도 3은 실시예 15의 방법 2에 의해 수득된 화합물 1 및 대사물 표준의 대표적인 HPLC 크로마토그램을 제공한다.
도 4는 실시예 16의 방법 2에 의해 수득된 화합물 1 및 대사물 표준의 대표적인 HPLC 크로마토그램을 제공한다.
도 5는 99.9 ％ 신뢰 구간에서의 5종의 개별 실험 데이터 세트에 대한 맥시너지TM II 분석 (블리스 독립)의 결과를 도시한다.
도 6은 콤비툴 소프트웨어에 의해 로외 부가 모델을 사용하여 수득된, 5종의 독립적인 실험으로부터의 모든 약물 조합에 있어서의 계산된 부가 효과와 관찰된 항-HCV 효과 사이의 차이를 도시한다.

본원에서 제공되는 것은 대상에서 HCV 감염과 같은 간 장애를 치료하는 데에 유용한 화합물, 조성물 및 방법이다. 추가적으로 제공되는 것은 그와 같은 방법에 유용한 투약 형태이다.

정의

본원에서 제공되는 화합물을 지칭할 때, 하기의 용어들은 다르게 표시되지 않는 한 하기의 의미를 가진다.

"제약상 허용되는 염"에는 해당 생물학적 특성을 유지하며, 독성이거나 제약 용도에 대하여 기타 바람직하지 않은 것이 아닌, 본원에서 제공되는 화합물의 소정 염이 포함된다. 그와 같은 염은 업계에 잘 알려져 있는 다양한 유기 및 무기 상대-이온으로부터 유도될 수 있다. 그와 같은 염에는 하기가 포함된다: (1) 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산, 술팜산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 트리클로로아세트산, 프로피온산, 헥산산, 시클로펜틸프로피온산, 글리콜산, 글루타르산, 피루브산, 락트산, 말론산, 숙신산, 소르브산, 아스코르브산, 말산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 3-(4-히드록시벤조일)벤조산, 피크르산, 신남산, 만델산, 프탈산, 라우르산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, 1,2-에탄-디술폰산, 2-히드록시에탄술폰산, 벤젠술폰산, 4-클로로벤젠술폰산, 2-나프탈렌술폰산, 4-톨루엔술폰산, 캄포산, 캄포술폰산, 4-메틸비시클로[2.2.2]-옥트-2-엔-1-카르복실산, 글루코헵톤산, 3-페닐프로피온산, 트리메틸아세트산, tert-부틸아세트산, 라우릴 황산, 글루콘산, 벤조산, 글루탐산, 히드록시나프토산, 살리실산, 스테아르산, 시클로헥실술팜산, 퀸산, 뮤콘산 등의 산들과 같은 유기 또는 무기 산들을 사용하여 형성되는 산 부가염; 또는 (2) 모 화합물에 존재하는 산성 양성자가 (a) 금속 이온, 예컨대 알칼리 금속 이온, 알칼리토 이온 또는 알루미늄 이온, 또는 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속 수산화물, 예컨대 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 알루미튬, 리튬, 아연, 및 바륨 수산화물, 암모니아에 의해 치환되는 경우, 또는 (b) 유기 염기, 예컨대 지방족, 지환족, 또는 방향족 유기 아민, 예컨대 암모니아, 메틸아민, 디메틸아민, 디에틸아민, 피콜린, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 에틸렌디아민, 라이신, 아르기닌, 오르니틴, 콜린, N,N'-디벤질에틸렌-디아민, 클로로프로카인, 디에탄올아민, 프로카인, N-벤질페네틸아민, N-메틸글루카민 피페라진, 트리스(히드록시메틸)-아미노메탄, 수산화 테트라메틸암모늄 등과 배위결합하는 경우 중 어느 것에 의해 형성되는 염.

단지 예로써, 염에는 추가적으로 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 암모늄, 테트라알킬암모늄 등, 그리고 화합물이 염기성 관능기를 함유하는 경우, 비-독성 유기 또는 무기 산, 예컨대 수소할로겐화물의 염, 예를 들면 히드로클로리드 및 히드로브로미드, 술페이트, 포스페이트, 술파메이트, 니트레이트, 아세테이트, 트리플루오로아세테이트, 트리클로로아세테이트, 프로피온네이트, 헥사노에이트, 시클로펜틸프로피오네이트, 글리콜레이트, 글루타레이트, 피루베이트, 락테이트, 말로네이트, 숙시네이트, 소르베이트, 아스코르베이트, 말레이트, 말레에이트, 푸마레이트, 타르타레이트, 시트레이트, 벤조에이트, 3-(4-히드록시벤조일)벤조에이트, 피크레이트, 신나메이트, 만델레이트, 프탈레이트, 라우레이트, 메탄술포네이트 (메실레이트), 에탄술포네이트, 1,2-에탄디술포네이트, 2-히드록시에탄술포네이트, 벤젠술포네이트 (베실레이트), 4-클로로벤젠술포네이트, 2-나프탈렌술포네이트, 4-톨루엔술포네이트, 캄포레이트, 캄포술포네이트, 4-메틸비시클로[2.2.2]-옥트-2-엔-1-카르복실레이트, 글루코헵토네이트, 3-페닐프로피오네이트, 트리메틸아세테이트, tert-부틸아세테이트, 라우릴 술페이트, 글루코네이트, 벤조에이트, 글루타메이트, 히드록시나프토에이트, 살리실레이트, 스테아레이트, 시클로헥실술파메이트, 퀴네이트, 뮤코네이트 등이 포함된다.

본원에서 제공되는 화합물과 관련한 "순수한" 또는 "정제된"이라는 용어에는 75 중량％, 80 중량％, 85 중량％, 90 중량％, 95 중량％, 96 중량％, 97 중량％, 98 중량％, 99 중량％, 99.5 중량％, 99.8 중량％, 99.9 중량％ 이상 내지 100 중량％의 화합물을 포함하며, 나머지는 다른 화학 종 또는 부분입체이성질체를 포함하는 조성물이 포함된다. 본원에서 사용될 때, 키랄 화합물에 적용될 경우의 "순수한"이라는 용어는 그의 반대되는 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체가 실질적으로 없는 (즉, 거울상이성질적 또는 부분입체이성질적으로 과잉 상태인) 키랄 화합물의 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체를 지칭한다. 예를 들어, 화합물의 순수한 "R" 형태에는 화합물의 "S" 형태가 실질적으로 없으며, 그에 따라 "S" 형태에 대하여 거울상이성질적 또는 부분입체이성질적으로 과잉 상태이다. "거울상이성질적 또는 부분입체이성질적으로 순수한" 또는 "순수한 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체"라는 용어는 그 화합물이 과잉의 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체, 예를 들면 75 중량％ 초과, 80 중량％ 초과, 85 중량％ 초과, 90 중량％ 초과, 91 중량％ 초과, 92 중량％ 초과, 93 중량％ 초과, 94 중량％ 초과, 95 중량％ 초과, 96 중량％ 초과, 97 중량％ 초과, 98 중량％ 초과, 98.5 중량％ 초과, 99 중량％ 초과, 99.2 중량％ 초과, 99.5 중량％ 초과, 99.6 중량％ 초과, 99.7 중량％ 초과, 99.8 중량％ 초과, 또는 99.9 중량％ 초과의 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체를 포함하고 있다는 것을 나타낸다. 소정 구현예에서, 상기 중량은 화합물, 즉 화합물의 모든 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체의 총 중량을 기준으로 한다. 소정 구현예에서는, 한가지 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체가 30-80 ％, 또는 30-70 ％, 30-60 ％, 30 ％, 35 ％, 40 ％, 45 ％, 50 ％, 55 ％ 또는 60 ％, 또는 그 사이의 임의의 백분율만큼 과잉 상태일 수 있다.

유사하게, 화합물과 관련한 "단리된"이라는 용어에는 75 중량％, 80 중량％, 85 중량％, 90 중량％, 95 중량％, 98 중량％, 99 중량％ 이상 내지 100 중량％의 화합물을 포함하며, 나머지는 다른 화학 종 또는 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체를 포함하는 조성물이 포함된다.

"용매화물"에는 비-공유 분자간 힘에 의해 결합된 화학양론 또는 비-화학양론적 양의 용매를 추가적으로 포함하는, 본원에서 제공되는 화합물 또는 그의 염이 포함된다. 용매가 물인 경우, 용매화물은 수화물이다.

본원에서 사용될 때의 "숙주"라는 용어에는 세포 주 및 동물, 바람직하게는 인간을 포함하여, 바이러스가 복제될 수 있는 임의의 단세포 또는 다세포 생물체가 포함된다. 다르게는, 숙주는 본원에서 제공되는 화합물에 의해 복제 또는 기능이 변경될 수 있는 플라비비리다에 바이러스 게놈의 일부를 보유하고 있을 수 있다. 숙주라는 용어에는 구체적으로 감염된 세포, 플라비비리다에 게놈 전체 또는 그의 일부에 의해 핵산전달감염된 세포, 및 동물, 특히 영장류 (침팬지 포함) 및 인간이 포함된다. 대부분의 동물 적용분야에서, 숙주는 인간 환자이다. 그러나 본원에서, 소정 조치에서는 분명하게 수의 적용분야가 예상된다 (예컨대 침팬지).

본원에서 사용될 때, "대상" 및 "환자"라는 용어는 본원에서 호환가능하게 사용된다. "대상" 및 "대상들"이라는 용어는 비-영장류 (예컨대 소, 돼지, 말, 고양이, 개, 래트, 및 마우스) 및 영장류 (예컨대 시노몰구스(cynomolgous) 원숭이와 같은 원숭이, 침팬지 및 인간), 예를 들면 인간을 포함한 포유동물과 같은 동물을 지칭한다. 일 구현예에서, 대상은 현행 C형 간염 감염 치료에 대하여 치료저항성이거나 비-반응성이다. 또 다른 구현예에서, 대상은 농장 동물 (예컨대 말, 소, 돼지 등) 또는 애완동물 (예컨대 개 또는 고양이)이다. 일 구현예에서, 대상은 인간이다.

본원에서 사용될 때, "치료제" 및 "치료제들"이라는 용어는 장애 또는 그의 1종 이상 증상의 치료 또는 예방에 사용될 수 있는 소정 제제(들)을 지칭한다. 소정 구현예에서, "치료제"라는 용어에는 본원에서 제공되는 화합물이 포함된다. 일 구현예에서, 치료제는 장애 또는 그의 1종 이상 증상의 치료 또는 예방에 유용한 것으로 알려져 있거나, 또는 거기에 사용된 바가 있거나 현재 사용되고 있는 제제이다.

"치료적 유효량"에는 질병을 치료하기 위하여 대상에게 투여되었을 때 해당 질병 치료를 수행하기에 충분한 화합물 또는 조성물의 양이 포함된다. "치료적 유효량"은 특히 화합물, 질병 및 그의 중증도, 그리고 치료될 대상의 연령, 체중 등에 따라 달라질 수 있다.

일 구현예에서, 임의의 질병 또는 장애를 "치료하는 것" 또는 그의 "치료"는 대상에 존재하는 질병 또는 장애를 개선하는 것을 지칭한다. 또 다른 구현예에서, "치료하는 것" 또는 "치료"에는 대상에 의해 식별되지 않을 수 있는 1종 이상의 물리적 파라미터를 개선하는 것이 포함된다. 또 다른 구현예에서, "치료하는 것" 또는 "치료"에는 물리적인 것 (예컨대 식별할 수 있는 증상의 안정화) 또는 생리적인 것 (예컨대 물리적인 파라미터의 안정화) 중 어느 것으로, 또는 양자 모두에 있어서 질병 또는 장애를 조정하는 것이 포함된다. 또 다른 구현예에서, "치료하는 것" 또는 "치료"에는 질병 또는 장애의 발병을 지연하는 것이 포함된다.

본원에서 사용될 때, "예방제" 및 "예방제들"이라는 용어가 사용되는 경우에는, 장애 또는 그의 1종 이상 증상의 예방에 사용될 수 있는 소정 제제(들)을 지칭한다. 소정 구현예에서, "예방제"라는 용어에는 본원에서 제공되는 화합물이 포함된다. 소정의 다른 구현예에서는, "예방제"라는 용어가 본원에서 제공되는 화합물을 지칭하지 않는다. 예를 들면, 예방제는 장애의 발병, 전개, 진전 및/또는 중증도를 예방 또는 방해하는 데에 유용한 것으로 알려져 있거나, 또는 거기에 사용된 바가 있거나 현재 사용되고 있는 제제이다.

본원에서 사용될 때, "예방적 유효량"이라는 구에는 장애와 관련된 1종 이상 증상의 전개, 재발 또는 발병의 예방 또는 감소를 초래하는 데에, 또는 또 다른 요법 (예컨대 또 다른 예방제)의 예방 효과(들)을 강화 또는 향상시키는 데에 충분한 요법 (예컨대 예방제)의 양이 포함된다.

본원에서 사용될 때, "동위원소 조성"은 주어진 원자에 대하여 존재하는 각 동위원소의 양을 지칭하며, "자연 동위원소 조성"은 주어진 원자에 대한 자연 발생 동위원소 조성 또는 분포량을 지칭한다. 그의 자연 동위원소 조성을 함유하는 원자는 본원에서 "비-보강" 원자로도 지칭될 수 있다. 다르게 설계되지 않는 한, 본원에서 언급되는 화합물의 원자는 그 원자의 소정의 안정한 동위원소를 나타내는 것을 의미한다. 예를 들어, 다르게 표시되지 않는 한, "H" 또는 "수소"로서 구체적으로 위치가 설계될 때, 상기 위치는 그의 자연 동위원소 조성에서의 수소를 가지는 것으로 이해된다.

본원에서 사용될 때, "동위원소가 보강된(enriched)"은 그 원자의 자연 동위원소 조성이 아닌 다른 동위원소 조성을 가지는 원자를 지칭한다. "동위원소가 보강된"은 그 원자의 자연 동위원소 조성이 아닌 다른 동위원소 조성을 가지는 하나 이상의 원자를 함유하는 화합물을 지칭할 수도 있다.

본원에서 사용될 때, "동위원소 풍부도(enrichment)"는 해당 원자의 자연 동위원소 분포량을 대신하는, 분자 중 주어진 원자에서의 특정 동위원소 양의 도입 백분율을 지칭한다. 예를 들면, 주어진 위치에서의 1 ％의 중수소 풍부도는 주어진 샘플 중 분자의 1 ％가 특정 위치에서 중수소를 함유한다는 것을 의미한다. 중수소의 자연 발생 분포가 약 0.0156 ％이므로, 비-보강 개시 물질을 사용하여 합성된 화합물 중 소정 위치에서의 중수소 풍부도는 약 0.0156 ％이다. 본원에서 제공되는 화합물의 동위원소 풍부도는 질량 분광측정법 및 핵 자기 공명 분광법을 포함하여, 업계 일반의 숙련자에게 알려져 있는 통상적인 분석 방법들을 사용하여 측정될 수 있다.

화합물

본원에서 제공되는 화합물은 2'-C-메틸 구아노신의 유도체이다. 상기 화합물은 플라비비리다에 및 C형 간염 감염의 치료 및/또는 예방에 유용하다.

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 화합물은 본원에서 화합물 1로 지칭되는 (3-히드록시-2,2-디메틸-티오프로피온산 S-(2-{[(2R,3R,4R,5R)-5-(2-아미노-6-옥소-1,6-디히드로-퓨린-9-일)-3,4-디히드록시-4-메틸-테트라히드로-퓨란-2-일메톡시]-벤질아미노-포스포릴옥시}-에틸)에스테르)의 부분입체이성질체 또는 대사물이다. 화합물 1은 하기 화학식 1의 구조를 가진다:

<화학식 1>

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 하기의 화학식을 가지는 화합물 1a, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 입체이성질체, 용매화물 또는 수화물이다:

<화학식 1a>

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 순수한 화합물 1a이다. 또 다른 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 부분입체이성질적으로 순수한 화합물 1a이다.

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 하기의 화학식을 가지는 화합물 1b, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 입체이성질체, 용매화물 또는 수화물이다:

<화학식 1b>

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 순수한 화합물 1b이다. 또 다른 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 부분입체이성질적으로 순수한 화합물 1b이다.

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 하기 화학식 I의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체 형태, 또는 호변이성질체 형태이다:

<화학식 I>

,

,

또는

이고, 단, R¹이 히드록실인 경우, R²는 수소,

및

이 아닌 다른 것이며, R¹이 벤질아미노인 경우라면, R²는

이 아닌 다른 것임).

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 화학식 I을 가지는 순수한 화합물이다.

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 하기 화학식 Ia의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체 형태, 또는 호변이성질체 형태이다:

<화학식 Ia>

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 하기 화학식 Ib의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체 형태, 또는 호변이성질체 형태이다:

<화학식 Ib>

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 화학식 Ia 또는 Ib를 가지는 순수한 화합물이다. 일 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 화학식 Ia 또는 Ib를 가지는 부분입체이성질적으로 순수한 화합물이다.

일 구현예에서, R¹은 히드록실, 아미노 또는 벤질아미노이다. 또 다른 구현예에서, R¹은 아미노 또는 벤질아미노이다. 또 다른 구현예에서, R¹은 히드록시이다.

일 구현예에서, R²는 수소,

,

또는

이다.

또 다른 구현예에서, R²는

,

또는

이다.

일 구현예에서, R²는 수소이다.

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 화합물은 하기 화학식 II의 것, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체 형태, 또는 호변이성질체 형태이다:

<화학식 II>

(여기서, R²는 수소,

,

,

또는

임).

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 화학식 II를 가지는 순수한 화합물이다.

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 화합물은 하기 화학식 IIa의 것, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체 형태, 또는 호변이성질체 형태이다:

<화학식 IIa>

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 화합물은 하기 화학식 IIb의 것, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체 형태, 또는 호변이성질체 형태이다:

<화학식 IIb>

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 화학식 IIa 또는 IIb를 가지는 순수한 화합물이다. 일 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 화학식 IIa 또는 IIb를 가지는 부분입체이성질적으로 순수한 화합물이다.

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 화합물은 하기 화학식 III의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체 형태, 또는 호변이성질체 형태이다:

<화학식 III>

(여기서, R²는 수소,

,

또는

임).

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 화학식 III을 가지는 순수한 화합물이다.

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 화합물은 하기 화학식 IIIa의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체 형태, 또는 호변이성질체 형태이다:

<화학식 IIIa>

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 화합물은 하기 화학식 IIIb의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체 형태, 또는 호변이성질체 형태이다:

<화학식 IIIb>

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 화학식 IIIa 또는 IIIb를 가지는 순수한 화합물이다. 일 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 화학식 IIIa 또는 IIIb를 가지는 부분입체이성질적으로 순수한 화합물이다.

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 화합물은 하기 화학식 IV의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체 형태, 또는 호변이성질체 형태이다:

<화학식 IV>

(여기서, R²는 수소,

또는

임).

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 화학식 IV를 가지는 순수한 화합물이다.

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 화합물은 하기 화학식 V의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체 형태, 또는 호변이성질체 형태이다:

<화학식 V>

(여기서 R¹은 히드록실 또는 아미노임).

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 화학식 V를 가지는 순수한 화합물이다.

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 화합물은 하기 화학식 Va의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체 형태, 또는 호변이성질체 형태이다:

<화학식 Va>

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 화합물은 하기 화학식 Vb의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체 형태, 또는 호변이성질체 형태이다:

<화학식 Vb>

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 화학식 Va 또는 Vb를 가지는 순수한 화합물이다. 일 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 화학식 Va 또는 Vb를 가지는 부분입체이성질적으로 순수한 화합물이다.

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 하기의 화학식 2를 가지는 화합물 2, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체 형태, 또는 호변이성질체 형태이다:

<화학식 2>

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 순수한 화합물 2이다.

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 하기의 화학식 2a를 가지는 화합물 2a, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체 형태, 또는 호변이성질체 형태이다:

<화학식 2a>

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 하기의 화학식 2b를 가지는 화합물 2b, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체 형태, 또는 호변이성질체 형태이다:

<화학식 2b>

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 순수한 화합물 2a 또는 2b이다. 또 다른 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 부분입체이성질적으로 순수한 화합물 2a 또는 2b이다.

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 하기의 화학식 3을 가지는 화합물 3, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체 형태, 또는 호변이성질체 형태이다:

<화학식 3>

또 다른 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 순수한 화합물 3이다.

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 하기의 화학식 3a를 가지는 화합물 3a, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체 형태, 또는 호변이성질체 형태이다:

<화학식 3a>

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 하기의 화학식 3b를 가지는 화합물 3b, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체 형태, 또는 호변이성질체 형태이다:

<화학식 3b>

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 순수한 화합물 3a 또는 3b이다. 또 다른 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 부분입체이성질적으로 순수한 화합물 3a 또는 3b이다.

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 하기의 화학식 4를 가지는 화합물 4, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체 형태, 또는 호변이성질체 형태이다:

<화학식 4>

또 다른 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 순수한 화합물 4이다.

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 하기의 화학식 5를 가지는 화합물 5, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 또는 호변이성질체 형태이다:

<화학식 5>

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 순수한 화합물 5이다.

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 하기의 화학식 6을 가지는 화합물 6, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체 형태, 또는 호변이성질체 형태이다:

<화학식 6>

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 순수한 화합물 6이다.

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 하기의 화학식 7을 가지는 화합물 7, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체 형태, 또는 호변이성질체 형태이다:

<화학식 7>

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 순수한 화합물 7이다.

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 하기의 화학식 8을 가지는 화합물 8, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 또는 호변이성질체 형태이다:

<화학식 8>

또 다른 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 순수한 화합물 8이다.

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 하기의 화학식 9를 가지는 화합물 9, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체 형태, 또는 호변이성질체 형태이다:

<화학식 9>

또 다른 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 순수한 화합물 9이다.

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 하기의 화학식 9a를 가지는 화합물 9a, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체 형태, 또는 호변이성질체 형태이다:

<화학식 9a>

또 다른 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 순수한 화합물 9a이다. 또 다른 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 부분입체이성질적으로 순수한 화합물 9a이다.

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 하기의 화학식 9b를 가지는 화합물 9b, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체 형태, 또는 호변이성질체 형태이다:

<화학식 9b>

또 다른 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 순수한 화합물 9b이다. 또 다른 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 부분입체이성질적으로 순수한 화합물 9b이다.

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 하기의 화학식 10의 화합물 10, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체 형태, 또는 호변이성질체 형태이다:

<화학식 10>

또 다른 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 순수한 화합물 10이다.

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 하기의 화학식 10a를 가지는 화합물 10a, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체 형태, 또는 호변이성질체 형태이다:

<화학식 10a>

또 다른 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 순수한 화합물 10a이다. 또 다른 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 부분입체이성질적으로 순수한 화합물 10a이다.

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 하기의 화학식 10b를 가지는 화합물 10b, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체 형태, 또는 호변이성질체 형태이다:

<화학식 10b>

또 다른 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 순수한 화합물 10b이다. 또 다른 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 부분입체이성질적으로 순수한 화합물 10b이다.

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 하기의 화학식 11을 가지는 화합물 11, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체 형태, 또는 호변이성질체 형태이다:

<화학식 11>

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 순수한 화합물 11이다.

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 하기의 화학식 11a를 가지는 화합물 11a, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체 형태, 또는 호변이성질체 형태이다:

<화학식 11a>

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 하기의 화학식 11b를 가지는 화합물 11b, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체 형태, 또는 호변이성질체 형태이다:

<화학식 11b>

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 순수한 화합물 11a 또는 11b이다. 또 다른 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 부분입체이성질적으로 순수한 화합물 11a 또는 11b이다.

소정 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 동위원소가 보강된 화학식 I의 화합물, 동위원소가 보강된 화학식 Ia의 화합물, 동위원소가 보강된 화학식 Ib의 화합물, 동위원소가 보강된 화학식 II의 화합물, 동위원소가 보강된 화학식 IIa의 화합물, 동위원소가 보강된 화학식 IIb의 화합물, 동위원소가 보강된 화학식 III의 화합물, 동위원소가 보강된 화학식 IIIa의 화합물, 동위원소가 보강된 화학식 IIIb의 화합물, 동위원소가 보강된 화학식 IV의 화합물, 동위원소가 보강된 화학식 V의 화합물, 동위원소가 보강된 화학식 Va의 화합물, 및 동위원소가 보강된 화학식 Vb의 화합물로 구성되는 군에서 선택되는 동위원소 보강 화합물이다.

소정 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 동위원소가 보강된 화학식 VI의 화합물, 동위원소가 보강된 화학식 VIa의 화합물, 및 동위원소가 보강된 화학식 VIb의 화합물로 구성되는 군에서 선택되는 동위원소 보강 화합물이다.

소정 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 동위원소 보강 화합물 1, 동위원소 보강 화합물 1a, 동위원소 보강 화합물 1b, 동위원소 보강 화합물 2, 동위원소 보강 화합물 2a, 동위원소 보강 화합물 2b, 동위원소 보강 화합물 3, 동위원소 보강 화합물 3a, 동위원소 보강 화합물 3b, 동위원소 보강 화합물 4, 동위원소 보강 화합물 5, 동위원소 보강 화합물 6, 동위원소 보강 화합물 7, 동위원소 보강 화합물 8, 동위원소 보강 화합물 8a, 동위원소 보강 화합물 8b, 동위원소 보강 화합물 9, 동위원소 보강 화합물 9a, 동위원소 보강 화합물 9b, 동위원소 보강 화합물 10, 동위원소 보강 화합물 10a, 동위원소 보강 화합물 10b, 동위원소 보강 화합물 11, 동위원소 보강 화합물 11a, 및 동위원소 보강 화합물 11b로 구성되는 군에서 선택되는 동위원소 보강 화합물이다.

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 화합물, 그의 용매화물, 수화물, 입체이성질체 형태, 또는 호변이성질체 형태이며, 여기서 상기 화합물은 하기의 화학식을 가지는 화합물의 대사물이고:

여기서 상기 화합물은 하기로 구성되는 군에서 선택된다:

(a) C-18 (2) 4.6×250 mm의 5 ㎛ 입자 크기 컬럼을 약 2.1분에 용리 완료하는 화합물;

(b) C-18 (2) 4.6×250 mm의 5 ㎛ 입자 크기 컬럼을 약 6.2분에 용리 완료하는 화합물;

(c) C-18 (2) 4.6×250 mm의 5 ㎛ 입자 크기 컬럼을 약 8.0분에 용리 완료하는 화합물;

(d) C-18 (2) 4.6×250 mm의 5 ㎛ 입자 크기 컬럼을 약 9.4분에 용리 완료하는 화합물;

(e) C-18 (2) 4.6×250 mm의 5 ㎛ 입자 크기 컬럼을 약 10.9분에 용리 완료하는 화합물;

(f) C-18 (2) 4.6×250 mm의 5 ㎛ 입자 크기 컬럼을 약 12.4분에 용리 완료하는 화합물;

(g) C-18 (2) 4.6×250 mm의 5 ㎛ 입자 크기 컬럼을 약 13.1분에 용리 완료하는 화합물;

(h) C-18 (2) 4.6×250 mm의 5 ㎛ 입자 크기 컬럼을 약 17.1분에 용리 완료하는 화합물;

(i) C-18 (2) 4.6×250 mm의 5 ㎛ 입자 크기 컬럼을 약 25.2분에 용리 완료하는 화합물; 및

(j) C-18 (2) 4.6×250 mm의 5 ㎛ 입자 크기 컬럼을 약 26.5분에 용리 완료하는 화합물 (여기서, 기술되어 있는 체류 시간들은 실시예 16에 기술되어 있는 바와 같은 HPLC법 1에서 수득됨).

여기서 상기 화합물은 실시예 16에 기술되어 있는 HPLC법 2에서 C-18 4.6×250 mm의 5 ㎛ 입자 크기 컬럼을 약 16.4분에 용리 완료한다.

여기서 상기 화합물은 하기로 구성되는 군에서 선택된다:

(a) C-18 4.6×250 mm의 5 ㎛ 입자 크기 컬럼을 약 38.4분에 용리 완료하는 화합물;

(b) C-18 4.6×250 mm의 5 ㎛ 입자 크기 컬럼을 약 39.8분에 용리 완료하는 화합물;

(c) C-18 4.6×250 mm의 5 ㎛ 입자 크기 컬럼을 약 36.8분에 용리 완료하는 화합물;

(d) C-18 4.6×250 mm의 5 ㎛ 입자 크기 컬럼을 약 26.8분에 용리 완료하는 화합물;

(e) C-18 4.6×250 mm의 5 ㎛ 입자 크기 컬럼을 약 33.8분에 용리 완료하는 화합물;

(f) C-18 4.6×250 mm의 5 ㎛ 입자 크기 컬럼을 약 30.9분에 용리 완료하는 화합물;

(g) C-18 4.6×250 mm의 5 ㎛ 입자 크기 컬럼을 약 4.6분에 용리 완료하는 화합물; 및

(h) C-18 4.6×250 mm의 5 ㎛ 입자 크기 컬럼을 약 28.1분에 용리 완료하는 화합물 (여기서, 기술되어 있는 체류 시간들은 실시예 15에 기술되어 있는 바와 같은 HPLC법 1에서 수득됨).

<화학식 VI>

(여기서, R^a 및 R^b는 하기와 같이 선택됨:

i) R^a는 수소이고, R^b는 알킬, 카르복시알킬, 알콕시카르보닐알킬 또는 디알킬아미노알킬이거나; 또는

ii) R^a 및 R^b가 그들이 치환되어 있는 질소 원자와 함께 1개 또는 2개의 알킬 기로 임의 치환되는 3-7 원의 헤테로시클릭을 형성함).

소정 구현예에서, 본원에서 제공되는 화합물은 하기 화학식 VIa의 것, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체 형태, 또는 호변이성질체 형태이다:

<화학식 VIa>

(여기서 변수들은 본원의 다른 곳에 기술되어 있는 바와 같음).

소정 구현예에서, 본원에서 제공되는 화합물은 하기 화학식 VIb의 것, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체 형태, 또는 호변이성질체 형태이다:

<화학식 VIb>

일 구현예에서, R^a는 수소이며; R^b는 이소프로필, t-부틸, 시클로헥실, 에톡시카르보닐메틸, t-부틸옥시카르보닐메틸, 카르복시메틸 또는 디메틸아미노에틸이다. 일 구현예에서, R^a 및 R^b는 그들이 치환되어 있는 질소 원자와 함께 4-메틸피페라진 또는 모르폴린 고리를 형성한다.

소정 구현예에서, 본원에서 제공되는 화합물은 하기, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체 형태, 또는 호변이성질체 형태에서 선택된다:

,

,

,

,

,

,

및

.

소정 구현예에서, 본원에서 제공되는 화합물은 동위원소가 보강된 본 단락에 따른 화합물이다.

소정 구현예에서, 본원에서 제공되는 화합물은 하기, 본 단락에 따른 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체 형태, 또는 호변이성질체 형태에서 선택된다:

,

,

,

및

.

,

,

,

및

.

소정 구현예에서, 본원에서 제공되는 화합물은 부분입체이성질적으로 순수한 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 에스테르이다. 소정 구현예에서, 본원에서 제공되는 화합물은 부분입체이성질적으로 순수한 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염이다. 소정 구현예에서, 상기 부분입체이성질적으로 순수한 화합물은 약 80 중량％ 이상의 지명된 부분입체이성질체 및 약 20 중량％ 이하의 다른 입체이성질체(들), 약 90 중량％ 이상의 지명된 부분입체이성질체 및 약 10 중량％ 이하의 다른 입체이성질체(들), 약 95 중량％ 이상의 지명된 부분입체이성질체 및 약 5 중량％ 이하의 다른 입체이성질체(들), 약 96.6 중량％ 이상의 지명된 부분입체이성질체 및 약 3.4 중량％ 이하의 다른 입체이성질체(들), 약 97 중량％ 이상의 지명된 부분입체이성질체 및 약 3 중량％ 이하의 다른 입체이성질체(들), 약 99 중량％ 이상의 지명된 부분입체이성질체 및 약 1 중량％ 이하의 다른 입체이성질체(들), 또는 약 99.9 중량％ 이상의 지명된 부분입체이성질체 및 약 0.1 중량％ 이하의 다른 입체이성질체(들)을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 중량은 화합물의 총 중량을 기준으로 한다.

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 화합물은 실질적으로 순수한 형태로 존재한다.

소정 구현예에서, 제공되는 것은 수용자에 대한 투여시에 직간접적으로 본원에서 제공되는 화합물을 제공하거나 또는 원하는 활성 자체를 나타내는, 염, 또는 에스테르로서 주어질 수 있는 화합물이다.

또한 본원에서 제공되는 것은 본원에서 제공되는 화합물의 동위원소가 보강된 유사체이다. 약동학 ("PK"), 약역학 ("PD"), 및 독성 프로필을 개선하기 위한 약제의 동위원소 보강 (예컨대 중수소화)에 대해서는 일부 종류의 약물을 사용하여 이전에 입증된 바 있다. 예를 들면 문헌 [Lijinsky et . al ., Food Cosmet. Toxicol., 20: 393 (1982)]; [Lijinsky et . al ., J. Nat. Cancer Inst., 69: 1127 (1982)]; [Mangold et. al ., Mutation Res. 308: 33 (1994)]; [Gordon et . al ., Drug Metab. Dispos., 15: 589 (1987)]; [Zello et . al ., Metabolism, 43: 487 (1994)]; [Gately et . al., J. Nucl. Med., 27: 388 (1986)]; [Wade D, Chem. Biol. Interact. 117: 191 (1999)]을 참조하라.

약물의 동위원소 보강은 예를 들면 (1) 원치 않는 대사물을 감소시키거나 제거하기 위하여, (2) 모약물의 반감기를 증가시키기 위하여, (3) 원하는 효과를 달성하는 데에 요구되는 투여 수를 감소시키기 위하여, (4) 원하는 효과를 달성하는 데에 필요한 투여량을 감소시키기 위하여, (5) 형성될 경우, 활성 대사물의 형성을 증가시키기 위하여, 및/또는 (6) 특정 조직에서 유해 대사물의 생성을 감소시키기 위하여, 및/또는 조합치료를 위한 것인지 아닌지에 관계없이 조합 치료를 위한 더 효과적인 약물 및/또는 더 안전한 약물을 생성시키기 위하여, 사용될 수 있다.

원자를 그의 동위원소들 중 1종으로 대체하는 것은 종종 화학 반응 반응 속도의 변화를 초래하게 된다. 이와 같은 현상은 반응속도론적 동위원소 효과(Kinetic Isotope Effect) ("KIE")로 알려져 있다. 예를 들어, 화학 반응의 속도-결정 단계 (즉 가장 높은 전이 상태 에너지를 가지는 단계) 동안에 C-H 결합이 파괴되는 경우, 그 수소에 대한 중수소의 치환은 반응 속도의 감소를 초래하게 되고, 과정이 느려지게 된다. 이와 같은 현상은 중수소 반응속도론적 동위원소 효과 ("DKIE")로 알려져 있다 (예를 들면 문헌 [Foster et al ., Adv. Drug Res., vol. 14, pp. 1-36 (1985)]; [Kushner et al ., Can. J. Physiol. Pharmacol., vol. 77, pp. 79-88 (1999)] 참조).

DKIE의 크기 는 C-H 결합이 파괴되는 주어진 반응과 수소에 대하여 중수소가 치환되어 있는 동일 반응의 속도들 간의 비로 표현될 수 있다. 상기 DKIE는 약 1 (동위원소 효과 없음) 내지 매우 큰 수, 예컨대 50 이상 (수소에 대하여 중수소가 치환될 경우, 반응이 50배 이상 더 느려질 수 있음을 의미함)의 범위일 수 있다. 고도의 DKIE 값은 불확실성 원리의 결과인 턴넬링(tunneling)으로 알려져 있는 현상에 부분적으로 기인할 수 있다. 턴넬링은 수소 원자의 작은 질량에 기인하여, 양성자가 관련되는 전이 상태가 때로는 요구되는 활성화 에너지의 부재하에 형성될 수 있음으로써 발생한다. 중수소는 수소에 비해 더 큰 질량을 가지고 있으므로, 통계적으로 이와 같은 현상을 겪을 가능성을 훨씬 더 적게 가진다.

삼중수소 ("T")는 연구, 융합 반응, 중성자 발생기 및 방사성약제에 사용되는, 수소의 방사성 동위원소이다. 삼중수소는 핵에 2개의 중성자를 가지며, 3에 가까운 원자 중량을 가지는 수소 원자이다. 그것은 환경 중에서 자연적으로는 매우 낮은 농도로 발생되며, 대부분 보통 T₂O로서 발견된다. 삼중수소는 느리게 (반감기 = 12.3년) 붕괴되면서, 인간 피부의 외부 층을 침투할 수 없는 저에너지의 베타 입자를 방출한다. 내부 노출이 이 동위원소와 관련된 주요 위험이기는 하나, 중대한 건강상의 위험을 야기하기 위해서는 그것이 다량으로 섭취되어야 한다. 중수소와 비교할 때에는, 더 적은 양의 삼중수소가 소비된 후에도, 그것이 유해한 농도에 도달할 수 있다. 수소에 대한 삼중수소 ("T")의 치환은 중수소에 비해 더욱 더 강한 결합을 초래함으로써, 숫자상 더 큰 동위원소 효과를 제공한다. 유사하게, 비제한적으로 탄소의 ¹³C 또는 ¹⁴C, 황의 ³³S, ³⁴S, 또는 ³⁶S, 질소의 ¹⁵N, 및 산소의 ¹⁷O 또는 ¹⁸O를 포함하여, 다른 원소들에 대한 동위원소의 치환도 유사한 반응속도론적 동위원소 효과를 제공하게 된다.

예를 들면 DKIE는, 아마도 염화 트리플루오로아세틸과 같은 반응성 종의 생성을 제한하는 것에 의해, 할로탄의 간독성을 감소시키는 데에 사용되었었다. 그러나, 이와 같은 방법이 모든 약물 종류에 적용가능하지는 않을 수 있다. 예를 들면, 중수소 도입은 대사 스위칭(metabolic switching)으로 이어질 수 있다. 대사 스위칭의 개념은 화학 반응 (예컨대 산화) 전에 단계 I(Phase I) 효소에 의해 격리될 때 이종(xenogen)들이 다양한 구조로 일시 결합 및 재결합될 수 있다는 것을 주장한다. 이와 같은 가설은 많은 단계 I 효소 결합 포켓의 상대적으로 커다란 크기 및 많은 대사 반응들의 무작위 특성에 의해 뒷받침되고 있다. 대사 스위칭은 잠재적으로 상이한 비율의 알려져 있는 대사물은 물론, 완전히 새로운 대사물로 이어질 수 있다. 이와 같은 새로운 대사물 프로필은 다소간의 독성을 부여할 수 있다.

동물 신체는 그의 순환계로부터 치료제와 같은 외래 물질을 제거할 목적으로 다양한 효소들을 발현한다. 그와 같은 효소의 예에는 해당 외래 물질과 반응하여 더 극성인 대사물 또는 신장 배설을 위한 대사물로 전환시키는 시토크롬 P450 효소 ("CYP"), 에스테라제, 프로테아제, 리덕타제, 데히드로제나제, 및 모노아민 옥시다제가 포함된다. 제약 화합물의 일부 가장 보편적인 대사 반응은 탄소-수소 (C-H) 결합의 탄소-산소 (C-O) 또는 탄소-탄소 (C-C) 파이-결합 중 어느 것으로의 산화를 수반한다. 생성되는 대사물은 생리학적 조건하에서 안정하거나 불안정할 수 있으며, 모화합물과 비교하여 실질적으로 상이한 약동학, 약역학, 그리고 급성 및 장기 독성 프로필을 가질 수 있다. 많은 약물에 있어서, 상기 산화는 신속하다. 따라서, 해당 약물은 종종 다수 또는 고도의 하루 투여량의 투여를 필요로 한다.

따라서, 본원에서 제공되는 화합물 소정 위치에서의 동위원소 보강은 자연적인 동위원소 조성을 가지는 유사 화합물과 비교하여 본원에서 제공되는 화합물의 약동학, 약역학, 및/또는 독성학적 프로필에 영향을 주게 될 검출가능한 KIE를 생성하게 된다.

화합물의 제조

본원에서 제공되는 화합물은 업계 숙련자에게 알려져 있는 소정의 방법에 의해 제조, 단리 또는 수득될 수 있다. 대표적인 제조 방법에 대해서는 하기의 실시예에 상세하게 기술되어 있다. 화합물 1은 2007년 12월 27일에 출원된 US 출원 제12/005,937호에 기술되어 있는 방법에 의해 제조될 수 있다.

본원에서 제공되는 화합물이 수개의 키랄 중심을 가지고 있으며, 광학적으로 활성인 부분입체이성질체 형태로 존재 및 분리될 수 있다는 것은 인식되어 있다. 일부 화합물들은 다형을 나타낼 수 있다. 본원에서 기술되는 유용한 특성을 가지는 본원에서 제공되는 화합물의 어떠한 라세미, 광학-활성, 부분입체이성질체, 다형, 또는 입체이성질체 형태, 또는 이들의 혼합물도 청구되는 주제의 영역에 속한다는 것이 이해되어야 한다. 광학적으로 활성인 형태를 제조하는 방법 (예를 들면 재결정화 기술에 의한 라세미 형태의 해상에 의해, 광학-활성 개시 물질로부터의 합성에 의해, 키랄 합성에 의해, 또는 키랄 고정 상을 사용한 크로마토크래피 분리에 의해)에 대해서는 업계에 잘 알려져 있다.

부분입체이성질적으로 순수한 물질을 수득하는 방법의 예들이 업계에 알려져 있는데, 적어도 하기 및 이들의 임의 조합이 포함된다:

i) 분별 결정화 - 부분입체이성질체들을, 그들의 용해도 차이를 이용한 분별 결정화에 의해 분리하는 기술;

ii) 분별 증류 - 부분입체이성질체들을, 그들의 비점 차이를 이용한 분별 증류에 의해 분리하는 기술;

iii) 크로마토크래피 분리 - 부분입체이성질체들을, 그들의 고정 상과의 다양한 상호작용을 이용하여 액체 이동 상 중에서 분리하는 기술;

iv) 화학적 비대칭 합성 - 원하는 부분입체이성질체를, 생성물에 비대칭 (즉, 키랄성)을 생성시키는 조건 (이것은 키랄 촉매 또는 키랄 보조제를 사용하여 달성될 수 있음)하에서 비키랄 전구체로부터 합성하는 합성 기술.

본원에서 제공되는 화합물은 본원에 기술되어 있는 기술들 중 하나에 의해, 또는 필요에 따라 상기 기술들의 조합에 의해 제조될 수 있다.

분석 방법

화합물은 업계 숙련자에게 알려져 있는 소정의 분석법에 따라 HCV 활성에 대하여 분석될 수 있다. 또한, 화합물은 업계 숙련자에게 알려져 있는 소정의 분석법에 따라 대상의 간 세포에서의 축적에 대하여 분석될 수 있다. 소정 구현예에서, 화합물은 대상에게 투여될 수 있으며, 대상의 간 세포가 화합물 또는 그의 유도체, 예컨대 그의 뉴클레오시드, 뉴클레오시드 포스페이트 또는 뉴클레오시드 트리포스페이트 유도체에 대하여 분석될 수 있다.

일 구현예에서는, 본원에서 제공되는 화합물이 생체내 또는 시험관내에서 간 세포와 같은 세포에 투여되며, 해당 화합물의 전달 및 세포에서의 트리포스포릴화를 표시하기 위하여 세포내로 전달된 뉴클레오시드 트리포스페이트 농도가 측정된다. 세포내 뉴클레오시드 트리포스페이트의 농도는 업계에 알려져 있는 분석 기술을 사용하여 측정될 수 있다.

사용 방법

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 화합물은 간으로의 전달이 강화될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 화합물은 간으로의 뉴클레오시드 활성 5'-모노포스페이트의 전달을 가능케 하며, 이는 활성 트리포스포릴화 화합물의 형성을 강화할 수 있다.

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 본원에서 제공되는 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 입체이성질체, 용매화물 또는 수화물 유효량의 투여를 포함하는, 플라비비리다에에 의해 감염된 숙주의 치료 및/또는 예방 방법이다. 일 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 대상에서의 HCV 감염의 치료 방법이다. 소정 구현예에서, 상기 방법은 HCV감염의 치료 또는 예방을 위한 유효량의 화합물을 감염의 치료 또는 예방에 효과적인 제2의 제제와 함께 그를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. 상기 화합물은 본원에서 기술되는 바와 같은 임의의 화합물일 수 있으며, 상기 제2의 제제는 업계 또는 본원에서 기술되는 임의의 제2 제제일 수 있다. 소정 구현예에서, 상기 화합물은 상기 부문에서 기술된 바와 같은 제약 조성물 또는 투약 형태의 형태이다.

치료될 수 있는 플라비비리다에에 대해서는 문헌 [Fields Virology , Editors: Fields, B.N., Knipe, D.M., and Howley, P.M., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, PA, Chapter 31, 1996]에 일반적으로 논의되어 있다. 특정 구현예에서, 상기 플라비비리다에는 HCV이다. 다른 구현예에서, 상기 플라비비리다에는 플라비바이러스 또는 페스티바이러스이다. 구체적인 플라비바이러스에는 비제한적으로 하기가 포함된다: 아브세타로브, 알푸이, 아포이, 아로아, 바가자, 반지, 보우보위, 부쑤쿠아라, 카시파코레, 카레이 아일랜드, 다카르 바트, 뎅기 1, 뎅기 2, 뎅기 3, 뎅기 4, 엣지 힐, 엔테베 바트, 가제트 굴리, 한잘로바, 하이프르, 일휴스, 이스라엘 터키 수막뇌염, 일본 뇌염, 주그라, 주티아파, 카담, 카르시, 케도우고우, 코코베라, 코우탕고, 쿰린지, 쿤진, 캬사누르 삼림병, 랑가트, 도약병, 메아반, 모독, 몬타나 마이오티스 백색질뇌염, 머레이 밸리 뇌염, 나란잘, 네기시, 엔타야, 옴스크 출혈열, 프놈-펜 바트, 포와싼, 리오 브라보, 로시오, 로얄 팜, 러시아 봄-여름 뇌염, 사보야, 세인트 루이스 뇌염, 살 비에자, 산 페를리타, 사우마레즈 리프, 세피크, 소쿨루크, 스폰드웨니, 스트래트포드, 템부수, 튤레니이, 우간다 S, 우수투, 웨셀스브론, 웨스트 나일, 야운데, 황열, 및 지카.

소정 구현예에서, 상기 대상은 HCV에 의해 감염되었거나, 또는 그에 의해 감염될 위험성이 있는 모든 대상일 수 있다. 감염 또는 감염 위험성은 업계 숙련 개업의에 의해 적합하다고 간주되는 임의의 기술에 따라 측정될 수 있다. 일 구현예에서, 대상은 HCV 및/또는 HBV에 의해 감염된 인간이다.

소정 구현예에서, 상기 대상은 HCV 및/또는 HBV 감염에 대한 치료 또는 예방을 받은 적이 전혀 없다. 다른 구현예에서, 상기 대상은 이전에 HCV 및/또는 HBV 감염에 대한 치료 또는 예방을 받은 적이 있다. 예를 들자면 소정 구현예에서, 상기 대상은 HCV 및/또는 HBV 치료에 대하여 응답한 적이 없다. 예를 들어, 현행 인터페론 치료하에서는, 50 ％이상까지의 HCV 대상이 치료에 대하여 응답하지 않는다. 소정 구현예에서, 대상은 치료를 받은 적이 있으나 바이러스 감염 또는 그의 1종 이상의 증상으로 계속 고통받고 있는 대상일 수 있다. 소정 구현예에서는, 대상은 치료를 받은 적이 있으나 지속적인 바이러스학적 응답을 달성하는 데에 실패한 대상일 수 있다. 소정 구현예에서, 대상은 HCV 감염에 대하여 치료를 받은 적이 있으나 예컨대 치료 12주 후에 HCV RNA 농도의 2log₁₀ 감소를 나타내는 데에 실패한 대상이다. 치료 12주 후에 혈청 HCV RNA에서의 2log₁₀을 초과하는 감소를 나타내지 않은 대상은 97-100 ％의 비응답 가능성을 가지는 것으로 여겨진다.

소정 구현예에서, 상기 대상은 치료와 관련된 1종 이상의 유해 사례로 인하여 HCV 치료를 중단한 대상이다. 소정 구현예에서, 대상은 현행 치료가 지시되지 않는 대상이다. 예를 들자면, HCV에 대한 어떤 치료는 신경정신병적 사례와 관련된다. 인터페론 (IFN)-알파 더하기 리바비린은 고율의 우울증과 관련된다. 우울 증상은 수많은 의학적 장애에서의 좋지 않은 결과와 연관되어 있다. 자살, 자살 및 살인 관념, 우울증, 약물 중독/남용의 재발, 및 공격적인 행동을 포함하여 생명을 위협하거나 치명적인 신경정신병적 사례들이 이전에 정신병적 장애가 있거나 없었던 대상에서 HCV 치료 동안에 발생한 바 있다. 인터페론-유도 우울증은 특히 정신병적 장애를 가지는 대상에 대한 만성 C형 간염 치료에 있어서의 제한요소이다. 정신병적 부작용은 인터페론 치료에 있어서 보편적인 것으로써, HCV 감염에 대한 현행 치료 중단의 약 10 ％ 내지 20 ％의 원인이 된다.

따라서, 제공되는 것은 우울증과 같은 신경정신병적 사례의 위험성이 현행 HCV 요법을 사용한 치료에 금기를 나타내는 대상에서의 HCV 감염의 치료 또는 예방 방법이다. 일 구현예에서, 제공되는 것은 우울증과 같은 신경정신병적 사례 또는 그의 위험성이 현행 HCV 요법을 사용한 치료의 중단을 지시하는 대상에서의 HCV 감염의 치료 또는 예방 방법이다. 추가적으로 제공되는 것은 우울증과 같은 신경정신병적 사례 또는 그의 위험성이 현행 HCV 치료의 투여량 감소를 지시하는 대상에서의 HCV 감염의 치료 또는 예방 방법이다.

현행 치료는 또한 인터페론 또는 리바비린, 또는 이들 모두, 또는 인테페론이나 리바비린의 투여를 위한 제약 생성물의 임의의 다른 성분에 대하여 과민성인 대상에서 금기시된다. 현행 치료는 헤모글로빈혈증 (예컨대 중증성 지중해빈혈, 겸상 적혈구성 빈혈)에 걸린 대상, 및 기타 현행 치료의 혈액학적 부작용의 위험성이 있는 대상에서 지시되지 않는다. 통상적인 혈액학적 부작용에는 골수 억제, 중성구감소 및 혈소판감소가 포함된다. 또한, 리바비린은 적혈구에 대하여 독성으로써, 용혈과 관련된다. 따라서 일 구현예에서, 제공되는 것은 인터페론 또는 리바비린, 또는 이들 모두에 대하여 과민성인 대상, 헤모글로빈혈증에 걸린 대상, 예컨대 중증성 지중해빈혈 대상 및 겸상 적혈구성 빈혈 대상, 그리고 기타 현행 치료의 혈액학적 부작용의 위험성이 있는 대상에서의 HCV 감염의 치료 또는 예방 방법이다.

소정 구현예에서, 상기 대상은 HCV 치료를 받은 적이 있으며, 본원에서 제공되는 방법의 투여 전에 그 치료를 중단한 대상이다. 다른 구현예에서, 대상은 치료를 받은 적이 있으며, 본원에서 제공되는 방법의 투여와 함께 그 치료를 계속 받는다. 상기 방법은 업계 숙련자의 판단에 따라 HCV용의 다른 치료와 공동-투여될 수 있다. 소정 구현예에서, 본원에서 제공되는 방법 또는 조성물은 감소된 투여량의 다른 HCV용 치료와 공동-투여될 수 있다.

소정 구현예에서, 제공되는 것은 인터페론을 사용한 치료에 대하여 치료저항성인 대상의 치료 방법이다. 예를 들자면 일부 구현예에서, 상기 대상은 인터페론, 인터페론 α, 페길레이팅된(pegylated) 인터페론 α, 인터페론 더하기 리바비린, 인터페론 α 더하기 리바비린, 및 페길레이팅된 인터페론 α 더하기 리바비린으로 구성되는 군에서 선택되는 1종 이상의 제제를 사용한 치료에 대하여 응답하는 데에 실패한 대상일 수 있다. 일부 구현예에서, 대상은 인터페론, 인터페론 α, 페길레이팅된 인터페론 α, 인터페론 더하기 리바비린, 인터페론 α 더하기 리바비린, 및 페길레이팅된 인터페론 α 더하기 리바비린으로 구성되는 군에서 선택되는 1종 이상의 제제를 사용한 치료에 대하여 저조하게 응답한 대상일 수 있다. 타리바비린과 같은 리바비린의 전구-약물 형태 역시 사용될 수 있다.

소정 구현예에서, 상기 대상은 HCV의 HIV와의 공동-감염에 걸려 있거나, 또는 그 위험성이 있는 대상이다. 예를 들자면, 미국에서 HIV 대상의 30 ％는 HCV와 공동-감염되어 있으며, 증거는 HIV에 의해 감염된 사람들이 훨씬 더 신속한 그의 C형 간염 감염 과정을 겪는다는 것을 나타내고 있다 (문헌 [Maier and Wu, 2002, World J Gastroenterol 8:577-57]). 본원에서 제공되는 방법은 그와 같은 대상에서 HCV 감염을 치료 또는 예방하는 데에 사용될 수 있다. 이러한 대상에서의 HCV의 제거는 말기-단계 간 질병으로 인한 사망률을 낮추게 될 것으로 여겨진다. 실제로, 진행성 간 질병의 위험성은 중증의 AIDS-기원 면역결핍을 가지는 대상에서 없는 대상에서에 비해 더 높다. 예를 들면 문헌 [Lesens et al ., 1999, J Infect Dis 179:1254-1258]을 참조하라. 일 구현예에서, 본원에서 제공되는 화합물은 HIV 대상에서 HIV를 억제하는 것으로 나타났다. 따라서 소정 구현예에서, 제공되는 것은 그를 필요로 하는 대상에서의 HIV 감염 및 HCV 감염의 치료 또는 예방 방법이다.

소정 구현예에서, 화합물 또는 조성물은 간 이식에 후속하여 대상에게 투여된다. C형 간염은 미국에서 간 이식의 제1 원인이며, 간 이식을 받는 많은 대상들이 이식 후 HCV 양성으로 남게 된다. 일 구현예에서, 제공되는 것은 본원에서 제공되는 화합물 또는 조성물을 사용한 그와 같은 재발성 HCV 대상의 치료 방법이다. 소정 구현예에서, 제공되는 것은 재발성 HCV 감염을 예방하기 위한 간 이식 전, 동안 또는 후의 대상의 치료 방법이다.

소정 구현예에서, 본원에서 제공되는 화학식 I의 화합물은 인간을 포함한 대상에서의 화합물 1의 대사를 평가하기 위한 마커 또는 표준으로서 유용하다.

제2 치료제

소정 구현예에서, 본원에서 제공되는 화합물 및 조성물은 그를 필요로 하는 대상에게 본원에서 제공되는 화합물의 유효량을 투여하는 것, 및 HCV 감염과 같은 장애를 치료하는 데에 효과적인 제2 제제의 유효량을 추가적으로 투여하는 것을 포함하는 간 장애의 치료 방법에 사용될 수 있다. 상기 제2 제제는 FDA에 의해 현재 승인되어 있는 것들을 포함하여, 장애의 치료에 효과적인 것으로 업계 숙련자들에게 알려져 있는 임의의 제제일 수 있다.

소정 구현예에서, 본원에서 제공되는 화합물은 1종의 제2 제제와 함께 투여된다. 다른 구현예에서, 본원에서 제공되는 화합물은 2종의 제2 제제와 함께 투여된다. 또 다른 구현예에서, 본원에서 제공되는 화합물은 2종 이상의 제2 제제와 함께 투여된다.

본원에서 사용될 때, "함께"라는 용어에는 1종을 초과하는 요법 (예컨대, 1종 이상의 예방제 및/또는 치료제)의 사용이 포함된다. "함께"라는 용어의 사용이 그를 필요로 하는 대상에게 요법 (예컨대 예방제 및/또는 치료제)이 투여되는 순서를 제한하는 것은 아니다. 예를 들자면, 제1 요법 (예컨대 본원에서 제공되는 화합물과 같은 예방제 또는 치료제)은 제2 요법 (예컨대 예방제 또는 치료제)의 투여 전에 (예컨대 5분, 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 8주, 또는 12주 전), 그와 동시에, 또는 그 후에 (예컨대 5분, 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 8주, 또는 12주 후) 장애를 가지는 대상에게 투여될 수 있다.

본원에서 사용될 때, "상승적인(synergistic)"이라는 용어에는 장애를 예방, 관리 또는 치료하기 위하여 사용되어 왔거나 현재 사용되고 있으며, 개별 요법들을 더한 효과보다 더욱 효과적인, 본원에서 제공되는 화합물과 또 다른 요법 (예컨대 예방제 또는 치료제)의 조합이 포함된다. 요법 조합 (예컨대 예방제 또는 치료제들의 조합)의 상승 효과는 그를 필요로 하는 대상에 대한 1종 이상 요법들의 더 적은 투약량의 사용 및/또는 상기 요법들의 덜 빈번한 투여를 가능케 할 수 있다. 요법 (예컨대 예방제 또는 치료제)의 더 적은 투약량을 이용하거나, 및/또는 상기 요법을 덜 빈번하게 투여하는 능력은 장애의 예방 또는 치료에서의 상기 요법의 효능을 감소시키지 않으면서도 대상에 대한 상기 요법의 투여와 관련된 임의의 독성을 감소시킬 수 있다. 또한, 상승 효과는 장애의 예방 또는 치료에서의 제제의 효능 향상을 초래할 수 있다. 마지막으로, 요법 조합 (예컨대 예방제 또는 치료제들의 조합)의 상승 효과는 요법들 중 어느 것 단독 사용과 관련된 부정적이거나 원치 않는 부작용을 방지하거나 감소시킬 수 있다.

본원에서 제공되는 활성 화합물은 또 다른 치료제, 특히 항-HCV 또는 B형 간염 제제와 함께 투여될 수 있다. 상기 활성 화합물은 업계 숙련 개업의에 의해 선택되는 투여량으로 투여될 수 있다. 예를 들자면, 주어지는 투약량은 약물의 흡수율, 불활성화율 및 배설율은 물론, 업계 숙련자에게 알려져 있는 기타 요인에 따라 달라질 수 있다. 투약량은 또한 완화될 이상의 중증도에 따라 달라질 수 있다는 것을 알아야 한다. 임의의 특정 대상에 있어서는, 시간이 지나면서 개별 요구도, 및 조성물을 투여하거나 그의 투여를 감독하는 개업의의 판단에 따라 구체적인 투약량 및 일정이 조정될 수 있다는 것 또한 이해되어야 한다. 소정 구현예에서는, 10-15 μM, 바람직하게는 1-5 μM 미만의 EC₅₀을 나타내는 항-HCV (또는 항-페스티바이러스 또는 항-플라비바이러스) 화합물이 유용하다.

항바이러스 제제를 사용한 장기간의 치료 후에는 플라비바이러스, 페스티바이러스 또는 HCV의 약물-내성 변종들이 출현할 수 있다는 것이 알려져 있다. 약물 내성은 가장 통상적으로는 바이러스 복제에 사용되는 효소를 코딩하고 있는 유전자의 돌연변이에 의해 발생한다. 바이러스 감염에 대한 약물의 효능은 주 약물에 의해 야기되는 것과 상이한 돌연변이를 유도하는 제2, 또는 어쩌면 제3의 항바이러스 화합물과 함께 화합물을 투여하는 것에 의해, 연장, 증대, 또는 회복될 수 있다. 다르게는, 그와 같은 조합 요법에 의해 약물의 약동학, 생체분포 또는 기타 파라미터가 변경될 수 있다. 소정 구현예에서, 동시 투여 요법은 그것이 바이러스에 대한 다중의 동시 스트레스를 유도할 수 있음으로 인하여 사용될 수 있다.

배경기술 부문에서 기술한 바이러스 치료 중 어느 것도 본 명세서에서 기술되는 화합물과 함께 사용될 수 있다.

HCV의 치료를 위한 대표적인 제2 제제

소정 구현예에서, 1종 이상의 본원에서 제공되는 화합물은 항-C형 간염 바이러스 프로테아제 억제제와 함께 투여될 수 있다. 유용한 프로테아제 억제제에는 TMC435350 (스웨덴 후팅게 소재 메디비르/티보텍(Medivir/Tibotec) 사); ITMN-191 (R-7227; 캘리포니아 브리스번 소재 인터뮨 파르마.(InterMune Pharma.), Inc. 사), ACH-806 (GS-9132; 코네티컷 뉴 헤이븐 소재 아칠리온 파르마.(Achillion Pharma.), Inc. 사), ACH-1095 (아칠리온 파르마., Inc. 사), BI 12202 (독일 잉겔하임 소재 뵈링거 잉겔함임(Boehringer Ingelheim) 사), 실루프레비르(ciluprevir) (BILN-2061; 뵈링거 잉겔하임 사), MK-7009 (뉴저지 화이트하우스 스테이션 소재 머크 파르마.(Merck Pharma.), Inc. 사), 보세프비르(boceprevir) (SCH 503034; 뉴저지 케닐워스 소재 셰링-플러프(Schering-Plough) 사), SCH 446211 (SCH6; 셰링-플러프 사), SCH 351633 (셰링-플러프 사), 및 텔라프레비르(telaprevir) (VX-950; 매사추세츠 캠브리지 소재 베르텍스 파르마.(Vertex Pharma.), Inc. 사)가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

소정 구현예에서, 유용한 항-C형 간염 바이러스 프로테아제 억제제에는 알파케토아미드 및 히드라지노우레아를 포함한 기질-기반 NS3 프로테아제 억제제 (WO 98/22496호; 문헌 [Attwood et al ., Antiviral Chemistry and Chemotherapy 1999, 10, 259-273]; 독일 특허 공개 DE 19914474호; 및 WO 98/17679호), 및 보론산 또는 포스포네이트와 같은 친전자체에서 종결하는 억제제 (WO 99/07734호); RD3-4082 및 RD3-4078 (전자는 아미드 상에서 14개 탄소의 사슬로 치환되며, 후자는 파라-페녹시페닐 기를 프로세싱함)을 포함한 비-기질-기반의 NS3 프로테아제 억제제 예컨대 2,4,6-트리히드록시-3-니트로-벤즈아미드 유도체 (문헌 [Sudo K. et al ., Biochemical and Biophysical Research Communications , 1997, 238, 643-647]; [Sudo K. et al ., Antiviral Chemistry and Chemotherapy , 1998, 9, 186]); 및 페난트렌퀴논인 Sch 68631 (문헌 [Chu M. et al ., Tetrahedron Letters 37:7229-7232, 1996])이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

소정 구현예에서, 유용한 항-C형 간염 바이러스 프로테아제 억제제에는 에글린 c(eglin c) (문헌 [Qasim M.A. et al ., Biochemistry 36:1598-1607, 1997]); HCV 엔도펩티다제 2를 억제하기 위한 시스테인 프로테아제 억제제 (U.S. 특허 제6,004,933호); C형 간염 바이러스 NS3 프로테아제의 합성 억제제 (U.S. 특허 제5,990,276호); 억제제 트리펩티드 (U.S. 특허 제6,534,523호, 6,410,531호, 및 6,420,380호, 그리고 WO 02/060926호); 디아릴 펩티드 (WO 02/48172호 및 U.S. 특허 제6,911,428호); 및 이미다졸레이딘온 (WO 02/08198호, WO 02/48157호, 및 U.S. 특허 제6,727,366호 및 6,838,475호)이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

소정 구현예에서, 유용한 항-C형 간염 바이러스 세린 프로테아제 억제제에는 U.S. 특허 제6,872,805호; WO 2006000085호; U.S. 특허 제7,208,600호; U.S. 특허 공개 제2006/0046956호; WO 2007/001406호 (키론(Chiron) 사); U.S. 특허 공개 제2005/0153877호; WO 2006/119061호 (머크 사); WO 00/09543호; U.S. 특허 제6,323,180호; WO 03/064456호; U.S. 특허 제6,642,204호; WO 03/064416호; U.S. 특허 제7,091,184호; WO 03/053349호; U.S. 특허 제6,867,185호; WO 03/099316호; U.S. 특허 제6,869,964호; WO 03/099274호; U.S. 특허 제6,995,174호; WO 2004/032827호; U.S. 특허 제7,041,698호; WO 2004/043339호, U.S. 특허 제5,538,865호; WO 02/008251호; U.S. 특허 제7,169,760호; U.S. 특허 공개 제2005/176648호; WO 02/08187호; WO 02/008256호; WO 98/17679호; U.S. 특허 제6,265,380호; WO 02/48116호; U.S. 특허 제6,653,295호; 및 US 6,878,722호에 제공되어 있는 HCV 세린 프로테아제 억제제들이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

소정 구현예에서, 본원에서 제공되는 1종 이상의 화합물은 NS3/4A 융합 단백질 및 NS5A/5B 기질을 사용한 역-상 HPLC 분석에서 적절한 억제를 나타내는 티아졸리딘 유도체 (문헌 [Sudo K. et al ., Antiviral Research , 1996, 32, 9-18])와 함께 투여될 수 있다. 유용한 티아졸리딘 유도체에는 RD-1-6250 (긴 알킬 사슬로 치환된 융합 신나모일 잔기를 프로세싱함), RD4 6205, 및 RD4 6193이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

소정 구현예에서, 본원에서 제공되는 1종 이상의 화합물은 티아졸리딘 및/또는 벤즈아닐리드 (문헌 [Kakiuchi N. et al ., J. EBS Letters 421, 217-220]; [Takeshita N. et al ., Analytical Biochemistry , 1997, 247, 242-246])와 함께 투여될 수 있다.

소정 구현예에서, 본원에서 제공되는 1종 이상의 화합물은 스트렙토마이세스 종의 발효 배양 브로스에서 분리된, SDS-PAGE 및 방사선자동사진법 분석에서 프로테아제에 대하여 프로세싱 활성을 가지는 페난트렌퀴논과 함께 투여될 수 있다. 유용한 페난트렌퀴논에는 SCH 68631 (문헌 [Chu M. et al ., Tetrahedron Letters , 1996, 37, 7229-7232]) 및 SCH 351633 (문헌 [Chu M. et al ., Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 9, 1949-1952])이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

소정 구현예에서, 본원에서 제공되는 1종 이상의 화합물은 헬리카제 억제제 (U.S. 특허 제5,633,358호; WO 97/36554호)와 함께 투여될 수 있다.

소정 구현예에서, 본원에서 제공되는 1종 이상의 화합물은 뉴클레오티드 폴리머라제 억제제와 함께 투여될 수 있다. 유용한 뉴클레오티드 폴리머라제 억제제에는 글리오톡신 (gliotoxin) (문헌 [Ferrari R. et al ., Journal of Virology , 1999, 73, 1649-1654]), 및 세룰레닌(cerulenin) (문헌 [Lohmann V. et al ., Virology, 1998, 249, 108-118])이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

소정 구현예에서, 본원에서 제공되는 1종 이상의 화합물은 간섭 RNA (RNAi) 기반의 항바이러스제와 함께 투여될 수 있다. 유용한 RNAi 기반의 항바이러스제에는 숏(short) 간섭 RNA (siRNA) 기반의 항바이러스제, 예컨대 시르나(Sirna)-034 및 기타 WO/03/070750호, WO 2005/012525호, 및 US 특허 공개 US 2004/0209831호에 기술되어 있는 것들, 그리고 마이크로RNA 기반의 항바이러스제, 예컨대 miR-122 (문헌 [Pan Q-W. et al ., World J. Gastroenterol , 2007, 13, 4431-4436)가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

소정 구현예에서, 본원에서 제공되는 1종 이상의 화합물은 바이러스의 5' 비-코딩 영역 (NCR)의 서열 범위에 대하여 상보적인 안티센스 포스포로티오에이트 올리고데옥시뉴클레오티드 (S-ODN) (문헌 [Alt M. et al ., Hepatology , 1995, 22, 707-717]), 또는 NCR의 3' 말단을 포함하는 뉴클레오티드 326-348, 및 HCV RNA의 코어 코딩 영역에 위치하는 뉴클레오티드 371-388 (문헌 [Alt M. et al ., Archives of Virology , 1997, 142, 589-599]; [Galderisi U. et al ., Journal of Cellular Physiology , 1999, 181, 251-257])과 함께 투여될 수 있다.

소정 구현예에서, 본원에서 제공되는 1종 이상의 화합물은 IRES-의존성 해독의 억제제 (일본 특허 공개 JP-08268890호; 일본 특허 공개 JP-10101591호)와 함께 투여될 수 있다.

소정 구현예에서, 본원에서 제공되는 1종 이상의 화합물은 리보자임과 함께 투여될 수 있다. 유용한 리보자임에는 뉴클레아제-내성 리보자임 (문헌 [Maccjak, D.J. et al ., Hepatology 1999, 30, abstract 995]), 헤파자임(HEPTAZYME)^® (콜로라도 보울더 소재 리보자임 파르마.(Ribozyme Pharma.) Inc. 사), 및 U.S. 특허 제6,043,077호, 5,869,253호, 및 5,610,054호에 개시되어 있는 리보자임이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

소정 구현예에서, 본원에서 제공되는 화합물은 국제 공개 제WO 01/90121호, WO 01/92282호, WO 2004/003000호, 2004/002422호, 및 WO 2004/002999호에서 이데닉스 파마슈티칼즈(Idenix Pharmaceuticals) 사에 의해 기술되어 있는 화합물들 중 어느 것과 함께 투여될 수 있다.

소정 구현예에서, 본원에서 제공되는 1종 이상의 화합물은 1종 이상의 뉴클레오시드 유사체와 함께 투여될 수 있다. 유용한 뉴클레오시드 유사체에는 PCT/CAOO/01316호 (WO 01/32153호) 및 PCT/CA01/00197호 (WO 01/60315호); WO 02/057425호; WO 02/057287호; U.S. 특허 제7,202,224호, 7,125,855호, 7,105,499호, 및 6,777,395호; PCT/EPO1/09633호 (WO 02/18404호); U.S. 특허 공개 제2006/0040890호, 2005/0038240호, 및 2004/0121980호; U.S. 특허 제6,846,810호, 6,784,166호, 및 6,660,721호; PCT 공개 제WO 01/79246호, WO 02/32920호, 및 WO 02/48165호; US 2005/0009737호; U.S. 특허 공개 제2005/0009737호; 및 U.S. 특허 제7,094,770호 및 6,927,291호에 기술되어 있는 뉴클레오시드 유사체들이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

소정 구현예에서, 본원에서 제공되는 1종 이상의 화합물은 1종 이상의 제2 제제와 함께 투여될 수 있다. 유용한 제2 제제에는 2'-플루오로뉴클레오시드 (WO 99/43691호), 1-아미노-알킬시클로헥산 (U.S. 특허 제6,034,134호), 알킬 지질 (U.S. 특허 제5,922,757호), 비타민 E 및 기타 항산화제 (U.S. 특허 제5,922,757호), 스쿠알렌, 아만타딘, 담즙산 (U.S. 특허 제5,846,964호), N-(포스포노아세틸)-L-아스파르트산, (U.S. 특허 제5,830,905호), 벤젠디카르복스아미드 (U.S. 특허 제5,633,388호), 폴리아데닐산 유도체 (U.S. 특허 제5,496,546호), 2',3'-디데옥시이노신 (U.S. 특허 제5,026,687호), 벤즈이미다졸 (U.S. 특허 제5,891,874호), 식물 추출물 (U.S. 특허 제5,837,257호, 5,725,859호, 및 6,056,961호), 및 피페리덴 (U.S. 특허 제5,830,905호)이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

소정 구현예에서, 본원에서 제공되는 1종 이상의 화합물은 항-C형 간염 바이러스 인터페론과 함께 투여될 수 있다. 유용한 인터페론에는 인트론(INTRON) A^® (인터페론 알파-2b; 셰링-플러프, Inc. 사) 및 페가시스(PEGASYS)^® (페그인터페론 알파-2a; 뉴저지 너틀리 소재 호프만-라로셰(Hoffmann-LaRoche), Inc. 사); 로페론(ROFERON) A^® (재조합 인터페론 알파-2a; 호프만 라로셰 Inc. 사), 인페르겐^® (공통 인터페론; 인터페론 알파콘-1; 펜실베이니아 크랜베리 타운십 소재 스리 리버즈 파르마.(Three Rivers Pharma.) 사), PEG-인트론^® (페길레이팅된 인터페론 알파-2b; 셰링 플러프, Inc. 사), 및 페가시스^® (페길레이팅된 인터페론 알파-2a; 호프만-라로셰, Inc. 사)가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

소정 구현예에서, 유용한 항-C형 간염 바이러스 인터페론에는 인페르겐^®, IL-29 (PEG-인터페론 람다; 워싱턴 시애틀 소재 자이모제네틱스(ZymoGenetics), Inc. 사), 악티뮨(ACTIMMUNE)^® (인터페론 감마-1b; 인터뮨(Intermune), Inc. 사), R7025 (맥시 알파(Maxy-alpha); 캘리포니아 레드우드 시티 소재 맥시젠(Maxygen) 사), 벨레로폰(BELEROFON) (프랑스 에브리 소재 노틸러스 바이오테크.(Nautilus Biotech.) 사), 오랄 인터페론 알파(Oral Interferon alpha) (텍사스 아마릴로 소재 아마릴로 바이오사이언시즈(Amarillo Biosciences), Inc. 사), 록테론(LOCTERON)^® (BLX-883; 매사추세츠 캠브리지 소재 옥토플러스(OctoPlus), Inc. 사), 오메가 인터페론 (캘리포니아 헤이워드 소재 인타르시아 세라퓨틱스(Intarcia Therapeutics), Inc. 사), 멀티페론(MULTIFERON)^® (플로리다 플랜테이션 소재 비라겐(Viragen), Inc.사), 옴니페론(OMNIFERON)™ (비라겐, Inc. 사), 메두사 인터페론(medusa interferon) (프랑스 베니슈스 세덱스 소재 플라멜 테크놀로지스(Flamel Technologies), Inc.사), 웰페론(WELLFERON)^® (펜실베이니아 필라델피아 소재 글락소스미스클라인(GlaxoSmithKline) 사), 알부페론(ALBUFERON)^® (메릴랜드 로크빌 소재 휴먼 게놈 사이언시즈(Human Genome Sciences), Inc.사), 레베트론(REBETRON)^® (셰링-플러프, Inc. 사), 및 레비프(REBIF)^® (인퍼페론 β-1a; 매사추세츠 로크랜드 소재 세로노(Serono), Inc. 사)가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

소정 구현예에서, 본원에서 제공되는 1종 이상의 화합물은 항-C형 간염 바이러스 폴리머라제 억제제와 함께 투여될 수 있다. 유용한 폴리머라제 억제제에는 레베톨(REBETOL)^® (리바비린; 셰링-플러프, Inc. 사), 레보비린(levovirin) (캘리포니아 코스타 메사 소재 ICN 파르마. 사), 비라미딘(VIRAMIDINE)^® (캘리포니아 알리소 비에조 소재 밸리언트 파르마. 인터내셔날(Valeant Pharma. International) 사), MK-0608 (7-데아자-2'-C-메틸아데노신; 머크 파르마. Inc. 사), 7-데아자-MK-0608 (7-데아자-7-플루오로-2'-C-메틸아데노신; 머크 파르마. Inc. 사), NM 283 (발로피시타빈(valopicitabine); 매사추세츠 캠브리지 소재 이데닉스 파르마., Inc. 사), PSI-6130 (2'-데옥시-2'-플루오로-2'-C-메틸시티딘; 호프만-라로셰, Inc. 사), 2'-O-메틸시티딘 (문헌 [Carroll, S.S. et al ., J. Biol . Chem., 2003, 278, 11979-11984]), 2'-C-메틸아데노신 (문헌 [Tomassini, J.E. et al., Antimicrob . Agents Chemother ., 2005, 49, 2050-2058]; [Migliaccio, G. et al ., J. Biol . Chem ., 2003, 278, 49164-49170]), 2'-C-메틸구아노신 (문헌 [Migliaccio, G. et al ., J. Biol . Chem ., 2003, 278, 49164-49170]; [Eldrup, A.B. et al ., J. Med . Chem ., 2004, 47, 2283-2295]), R1479 (4'-아지도시티딘; 호프만-라로셰, Inc. 사), ANA598 (캘리포니아 샌디에고 소재 아나디스 파르마.(Anadys Pharma.) Inc. 사), R1626 (호프만-라로셰, Inc. 사), RO-0622 (4'-아지도-2'-데옥시뉴클레오시드 유사체, 캘리포니아 팔로 알토 소재 로체 팔로 알토(Roche Palo Alto), LLC 사), GL-59728 (캘리포니아 레드우드 시티 소재 진랩스 테크놀로지스(Genelabs Technologies), Inc. 사), GL-60667 (진랩스 테크놀로지스, Inc. 사), 및 R7128 (뉴저지 프린스톤 소재 파르마셋(Pharmasset), Inc. 사)이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

소정 구현예에서, 본원에서 제공되는 1종 이상의 화합물은 항-C형 간염 바이러스 비-뉴클레오시드 폴리머라제 억제제와 함께 투여될 수 있다. 유용한 비-뉴클레오시드 폴리머라제 억제제에는 BILB 1941 (뵈링거 잉겔하임 사), HCV-796 (펜실베이니아 엑스톤 소재 비로파르마, Inc. 사), DKA 화합물 30 (문헌 [Summa, V. et al ., J. Med . Chem ., 2004, 47, 14-17]; [Summa, V. et al ., J. Med . Chem ., 2004, 47, 5336-5339]), 벤즈이미다졸 5-카르복스아미드 유도체 (문헌 [Beaulieu, P.L. et al ., Bioorg . Med . Chem . Lett ., 2004, 14, 967-971]), 인돌-N-아세트아미드 유도체 (문헌 [Di Marco, S. et al ., J. Biol . Chem ., 2005, 280, 29765-29770]; [Harper, S. et al ., J. Med. Chem ., 2005, 48, 1314-1317]), 벤조티아디아진 유도체 (문헌 [Dhanak, D. et al ., J. Biol . Chem ., 2002, 277, 38322-38327]; [Tomei, L. et al ., J. Virol , 2004, 78, 938-946]), 페닐알라닌 유도체 (문헌 [Wang, M. et al ., J. Biol . Chem ., 2003, 278, 9489-9495]), 티오펜 2-카르복실산 유도체 (문헌 [Chan, L. et al ., Bioorg . Med . Chem . Lett ., 2004, 14, 793-796]; [Biswal, B.K. et al ., J. Biol . Chem ., 2005, 280, 18202-18210]), 디히드로피론 유도체 (문헌 [De Clercq, E., Nat . Rev . Drug Dis ., 2007, 6, 1001-1018]), 테트라히드로피라노인돌릴 아세트산 유도체 HCV-371 (문헌 [Howe, A.Y. et al ., Antimicrob . Agents Chemother ., 2004, 48, 4813-4821]), 및 5-히드록시-3(2H)-피리다진온 시리즈 (문헌 [Zhou, Y. et al ., Antiviral Res ., 2007, 74, A38, abstract 27]; [Zhou, Y. et al ., Antiviral Res ., 2007, 74, A51-A52, abstract 59])이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

소정 구현예에서, 본원에서 제공되는 1종 이상의 화합물은 리바비린 및 항-C형 간염 바이러스 인터페론과 함께 투여될 수 있다. 유용한 인터페론에는 인트론 A^® (인터페론 알파-2b) 및 페가시스^® (페그인터페론 알파-2a); 로페론 A^® (재조합 인터페론 알파-2a), 인페르겐^® (공통 인터페론; 인터페론 알파콘-1), PEG-인트론^® (페길레이팅된 인터페론 알파-2b) 및 페가시스^® (페길레이팅된 인터페론 알파-2a)가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

소정 구현예에서, 본원에서 제공되는 1종 이상의 화합물은 항-C형 간염 바이러스 시클로필린 B 억제제와 함께 투여될 수 있다. 유용한 시클로필린 B 억제제에는 NIM-811 (뉴저지 이스트 하노버 소재 노파르티스(Novartis) 사), 시클로스포린 A (CsA; 노파르티스 사), SCY-635 (노스 캐롤라이나 리서치 트라이앵글 파크 소재 씨넥시스(Scynexis), Inc. 사), 및 DEBIO-025 (스위스 로잔 소재 데비오팜 그룹(Debiopharm Group) 사)가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

소정 구현예에서, 본원에서 제공되는 1종 이상의 화합물은 항-C형 간염 바이러스 α-글루코시다제 억제제와 함께 투여될 수 있다. 유용한 α-글루코시다제 억제제에는 셀고스비르(celgosivir) (캐나다 밴쿠버 소재 미게닉스(Migenix), Inc.사)가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

소정 구현예에서, 본원에서 제공되는 1종 이상의 화합물은 항-C형 간염 바이러스 백신과 함께 투여될 수 있다. 유용한 백신에는 TG4040, PeviPROTM, CGI-5005, HCV/MF59, GV1001, IC41, 및 INNO0101 (E1)이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

소정 구현예에서, 본원에서 제공되는 1종 이상의 화합물은 항-C형 간염 바이러스 단일클론 또는 다클론 항체와 함께 투여될 수 있다. 유용한 단일클론 항체에는 AB68 및 XTL-6865 (구 HepX-C; 이스라엘 레오보트 소재 XTL 바이오파르마.(Biopharma.) 사)가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 유용한 다클론 항체에는 시카비르(cicavir)가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

소정 구현예에서, 본원에서 제공되는 1종 이상의 화합물은 항-C형 간염 바이러스 면역조정제와 함께 투여될 수 있다. 유용한 면역조정제에는 자닥신(ZADAXIN)^® (티말파신(thymalfasin); 캘리포니아 포스터 시티 소재 싸이클론 파르마. 인터내셔날(SciClone Pharma. International) 사), 세플렌(CEPLENE)™ (캘리포니아 샌디에고 소재 맥심 파르마.(Maxim Pharma.) Inc. 사), 셀세프트(CELLCEPT)^® (호프만-라로셰, Inc. 사), 시바시르(CIVACIR)^® (메릴랜드 로크빌 소재 나비 바이오파르마.(Nabi Biopharma.) 사), CPG 10101 (뉴욕 뉴욕 소재 화이저(Pfizer), Inc. 사), ANA773 (아나디스 파르마. Inc. 사), ANA971 (아나디스 파르마. Inc. 사), ANA975 (아나디스 파르마. Inc. 사), NOV-205 (매사추세츠 뉴튼 소재 노벨로스 세라퓨틱스(Novelos Therapeutics), Inc. 사), 및 오글루파니드(Oglufanide) (캘리포니아 우드사이드 소재 임플리싯 바이오사이언스(Implicit Bioscience), Inc. 사)가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

소정 구현예에서, 본원에서 제공되는 1종 이상의 화합물은 기타 제2 제제와 함께 투여될 수 있다. 유용한 제2 제제에는 넥사바르(Nexavar), 독소루비신(doxorubicin), PI-88, 아만타딘, JBK-122, VGX-410C, MX-3253 (세글로시비르(Ceglosivir)), 수버스(Suvus) (BIVN-401 또는 비로스타트(virostat)), PF-03491390 (구 IDN-6556), G126270, UT-231B, EMZ702, ACH-0137171, MitoQ, ANA975, AVI-4065, 바비툭시나브(Bavituxinab) (타르바신(Tarvacin)), 알리니아(Alinia) (니트라족사니드(nitrazoxanide)), 메리메포디브(merimepodib) (VX-497; 베르텍스 파르마., Inc. 사), 수메트렐(summetrel) (펜실베이니아 채드 포드 소재 엔도 파르마. 홀딩스(Endo Pharma. Holdings), Inc. 사), ISIS 14803 (캘리포니아 칼스배드 소재 이시스 파르마.(Isis Pharma.), Inc. 사), 및 PYN 17이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

제약 조성물 및 투여 방법

본원에서 제공되는 화합물은 업계에서 가용한 방법 및 본원에서 개시되는 방법들을 사용하여 제약 조성물로 제제화될 수 있다. 그와 같은 화합물은 간으로의 약물의 전달을 강화하기 위하여 일부 구현예에서 사용될 수 있다.

소정 구현예에서는, 제2의 제제가 본원에서 제공되는 화합물과 함께 제제화 또는 포장될 수 있다. 물론, 상기 제2 제제는 업계 숙련자의 판단에 따라 그와 같은 공동-제제화가 모든 제제의 활성 또는 투여 방법을 틀림없이 방해하지 않는 경우에만 본원에서 제공되는 화합물과 함께 제제화될 것이다. 소정 구현예에서, 본원에서 제공되는 화합물 및 제2 제제는 별도로 제제화된다. 그들은 업계 숙련 개업의의 편의에 따라 함께 포장되거나 별도로 포장될 수 있다.

임상 실시시, 본원에서 제공되는 활성 제제는 모든 통상적인 경로, 특히 경구, 비경구, 직장 또는 흡입 (예컨대 에어로졸의 형태로)에 의해 투여될 수 있다. 소정 구현예에서, 본원에서 제공되는 화합물은 경구로 투여된다.

경구 투여용 고체 조성물로는, 정제, 환약, 경질 젤라틴 캡슐, 분말 또는 과립이 사용될 수 있다. 이러한 조성물에서, 활성 생성물은 1종 이상의 불활성 희석제 또는 보조제, 예컨대 슈크로스, 락토스 또는 전분과 혼합된다.

이러한 조성물은 희석제가 아닌 다른 물질, 예를 들면 윤활제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트, 또는 제어 방출을 위한 코팅을 포함할 수 있다.

경구 투여용 액체 조성물로는, 불활성 희석제, 예컨대 물 또는 액체 파라핀을 함유하는 제약상 허용되는 현탁액, 에멀션, 시럽 및 엘릭시르인 용액이 사용될 수 있다. 이러한 조성물은 희석제가 아닌 다른 물질, 예를 들면 침윤, 감미 또는 향미 생성물을 포함할 수도 있다.

비경구 투여를 위한 조성물은 에멀션 또는 살균 용액일 수 있다. 용매 또는 운반체로는, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 특히 올리브 오일, 또는 주사가능 유기 에스테르, 예를 들면 에틸 올레에이트가 사용될 수 있다. 이러한 조성물은 보조제, 특히 침윤제, 등장화제, 에멀션화제, 분산제 및 안정화제를 함유할 수도 있다. 살균은 예를 들면 세균학적 필터를 사용하여, 방사선에 의해, 또는 가열에 의해 몇 가지 방식으로 수행될 수 있다. 그것은 사용시에 살균수 또는 임의의 다른 주사가능 살균 매체에 용해될 수 있는 살균 고체 조성물의 형태로 제조될 수도 있다.

직장 투여용 조성물은 활성 주성분 이외에 부형제 예컨대 코코아 버터, 반-합성 글리세리드 또는 폴리에틸렌 글리콜을 함유하는 좌약 또는 직장 캡슐이다.

조성물은 또한 에어러졸일 수 있다. 액체 에어로졸의 형태로 사용하기 위해서는, 조성물이 사용시에 무발열원성 살균수, 염수 또는 임의의 다른 제약상 허용되는 운반체에 용해되는 안정한 살균 용액 또는 고체 조성물일 수 있다. 직접 흡입되기 위한 건조 에어로졸의 형태로 사용하기 위해서는, 활성 주성분이 미세하게 분할된 후, 수용성의 고체 희석제 또는 운반체, 예를 들면 덱스트란, 만니톨 또는 락토스와 조합된다.

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 조성물은 제약 조성물 또는 단일 단위 투약 형태이다. 본원에서 제공되는 제약 조성물 및 단일 단위투약 형태는 예방제 또는 치료제 (예컨대 본원에서 제공되는 화합물, 또는 다른 예방제 또는 치료제) 1종 이상의 예방 또는 치료적 유효량, 및 통상적인 1종 이상의 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 포함한다. 특정 구현예 및 본 문맥에서, "제약상 허용되는"이라는 용어는 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되었거나, 또는 미국 약전 또는 기타 일반적으로 동물, 더 구체적으로는 인간에 사용하는 것으로 알려져 있는 약전에 열거되어 있음을 의미한다. "담체"라는 용어에는 희석제, 보조제 (예컨대 프로인드 보조제(Freund's adjuvant) (완전 및 불완전)), 부형제, 또는 그에 의해 치료제가 투여되는 운반체가 포함된다. 이와 같은 제약 담체는 살균 액체, 예컨대 물, 그리고 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것을 포함한 오일, 예컨대 땅콩 오일, 대두 오일, 무기 오일, 참깨 오일 등일 수 있다. 물은 제약 조성물이 정맥내로 투여되는 경우에 담체로서 사용될 수 있다. 염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액 역시 특히 주사 용액용의 액체 담체로서 사용될 수 있다. 적합한 제약 담체의 예가 E.W. 마틴(Martin)에 의해 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences"]에 기술되어 있다.

통상적인 제약 조성물 및 투약 형태는 1종 이상의 부형제를 포함한다. 적합한 부형제에 대해서는 제약 업계 숙련자에게 잘 알려져 있으며, 적합한 부형제의 비제한적인 예에는 전분, 글루코스, 락토스, 슈크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카 겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화 나트륨, 건조 탈지 우유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등이 포함된다. 특정 부형제가 제약 조성물 또는 투약 형태에의 도입에 적합한지 여부는 비제한적으로 투약 형태가 대상에게 투여될 방식, 및 투약 형태 내의 구체적인 활성 성분을 포함하여, 업계에 잘 알려져 있는 다양한 요인들에 따라 달라진다. 원하는 경우, 상기 조성물 또는 단일 단위 투약 형태는 소량의 침윤제 또는 에멀션화제, 또는 pH 버퍼링제를 함유할 수도 있다.

본원에서 제공되는 락토스가 없는 조성물은 업계에 잘 알려져 있으며 예를 들면 미국 약전 (USP) SP (XXI)/NF (XVI)에 열거되어 있는 부형제들을 포함할 수 있다. 일반적으로, 무락토스 조성물은 제약상 상용성이며 제약상 허용되는 양으로, 활성 성분, 바인더/충전재, 및 윤활제를 포함한다. 대표적인 무락토스 투약 형태는 활성 성분, 미세결정질 셀룰로스, 예비 젤라틴화 전분, 및 마그네슘 스테아레이트를 포함한다.

추가적으로 본원에 포함되는 것은 활성 성분을 포함하는 무수의 제약 조성물 및 투약 형태로서, 물이 일부 화합물의 분해를 촉진할 수 있기 때문이다. 예를 들어, 물의 첨가 (예컨대 5 ％)는 제약 업계에서 시간 경과에 따른 보관 수명 또는 제제의 안정성과 같은 특성들을 측정하기 위하여 장기 저장을 시뮬레이팅하는 수단으로서 광범위하게 허용되고 있다. 예를 들면 문헌 [Jens T. Carstensen, Drug Stability: Principles & Practice, 2d. Ed., Marcel Dekker, NY, NY, 1995, pp. 379 80]을 참조하라. 실제로, 물 및 열은 일부 화합물의 분해를 가속화한다. 따라서, 제제에 대한 물의 효과는 매우 중요할 수 있는데, 제제의 제조, 취급, 포장, 저장, 선적, 및 사용시에 통상적으로 수분 및/또는 습기를 만나게 되기 때문이다.

본원에서 제공되는 무수의 제약 조성물 및 투약 형태는 무수 또는 저수분 함유 성분, 및 저수분 또는 저습 조건을 사용하여 제조될 수 있다. 락토스, 및 1차 또는 2차 아민을 포함하는 1종 이상의 활성 성분을 포함하는 제약 조성물 및 투약 형태는 제조, 포장, 및/또는 저장시에 수분 및/또는 습기와의 실질적인 접촉이 예상되는 경우에 무수일 수 있다.

무수의 제약 조성물은 그의 무수 특성이 유지되도록 제조 및 저장되어야 한다. 따라서, 무수 조성물은 그것이 적합한 제제용 키트에 포함될 수 있도록, 물에 대한 노출을 방지하는 것으로 알려져 있는 재료를 사용하여 포장될 수 있다. 적합한 포장의 예에는 기밀 밀봉 호일, 플라스틱, 단위 투여 용기 (예컨대 바이알), 발포 팩, 및 스트립 팩이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

추가적으로 제공되는 것은 활성 성분이 분해될 속도를 감소시키는 1종 이상의 화합물을 포함하는 제약 조성물 및 투약 형태이다. 본원에서 "안정화제"로 지칭되는 그와 같은 화합물에는 항산화제 예컨대 아스코르브산, pH 버퍼, 또는 염 버퍼가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 제약 조성물 및 단일 단위 투약 형태는 용액, 현탁액, 에멀션, 정제, 환약, 캡슐, 분말, 지속-방출 제제 등의 형태를 취할 수 있다. 경구용 제제는 표준 담체 예컨대 제약 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 마그네슘 카르보네이트 등을 포함할 수 있다. 소정 구현예에서, 그와 같은 조성물 및 투약 형태는 대상에의 적정 투여를 위한 형태를 제공하기 위한 적합한 양의 담체와 함께, 정제된 형태로 예방제 또는 치료제의 예방 또는 치료적 유효량을 함유하게 된다. 상기 제제는 투여 양식에 적합해야 한다. 소정 구현예에서, 제약 조성물 또는 단일 단위 투약 형태는 살균되어 있으며, 대상, 예를 들면 동물 대상, 예컨대 포유동물 대상, 예를 들면 인간 대상에 대한 투여에 적합한 형태이다.

제약 조성물은 그의 의도하는 투여 경로와 부합하도록 제제화된다. 투여 경로의 예에는 비경구, 예컨대 정맥내, 피내, 피하, 근육내, 피하, 경구, 협측, 설하, 흡입, 비내, 경피, 국소, 점막관통, 종양내, 윤활막내 및 직장 투여가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 특정 구현예에서, 조성물은 일상적인 절차에 따라 인간에 대한 정맥내, 피하, 근육내, 경구, 비내 또는 국소 투여용으로 적합화된 제약 조성물로서 제제화된다. 일 구현예에서, 제약 조성물은 일상적인 절차에 따라 인간에 대한 피하 투여용으로 제제화된다. 통상적으로, 정맥내 투여용 조성물은 살균된 등장 수성 버퍼 중의 용액이다. 필요할 경우, 조성물은 가용화제, 및 주사 부위에서의 통증을 완화하기 위한 국소 마취제 예컨대 리그노캄(lignocamne)을 포함할 수도 있다.

투약 형태의 예에는 하기가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다: 정제; 캐플릿; 캡슐, 예컨대 연질 탄성 젤라틴 캡슐; 사셰; 트로키; 로젠지; 분산액; 좌약; 연고; 습포제 (찜질약); 페이스트; 분말; 드레싱; 크림; 고약; 용액; 패치; 에어로졸 (예컨대 비강 스프레이 또는 흡입기); 젤; 현탁액 (예컨대 수성 또는 비수성 액체 현탁액, 수중유 에멀션, 또는 유중수 액체 에멀션), 용액, 및 엘릭시르를 포함하여, 대상에 대한 경구 또는 점막 투여용으로 적합한 액체 투약 형태; 대상에 대한 비경구 투여용으로 적합한 액체 투약 형태; 및 재구성되어 대상에 대한 비경구 투여용으로 적합한 액체 투약 형태를 제공할 수 있는 살균 고체 (예컨대 결정질 또는 비정질 고체).

본원에서 제공되는 투약 형태의 조성, 형상, 및 유형은 통상적으로 그의 용도에 따라 달라질 것이다. 예를 들면, 바이러스 감염 초기 치료에 사용되는 투약 형태는 동일한 감염의 유지 치료에 사용되는 투약 형태에 비해 그것이 포함하는 1종 이상 활성 성분의 더 많은 양을 함유할 수 있다. 유사하게, 비경구 투약 형태는 동일한 질병 또는 장애를 치료하는 데에 사용되는 경구 투약 형태에 비해 그것이 포함하는 1종 이상 활성 성분의 더 적은 양을 함유할 수 있다. 본원에 포함되는 특정 투약 형태가 서로 달라지게 되는 이러한 방식 및 기타 방식들은 업계 숙련자가 용이하게 알 수 있을 것이다. 예를 들면 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th ed., Mack Publishing, Easton PA (2000)]을 참조하라.

일반적으로, 조성물의 성분들은 예를 들면 활성 제제의 양이 표시되어 있는 앰풀 또는 사셰와 같은 기밀 밀봉 용기 내의 건조한 동결건조 분말 또는 무수 농축물로서 개별적으로, 또는 단위 투약 형태에 함께 혼합되어 공급된다. 조성물이 주입에 의해 투여되어야 하는 경우, 그것은 살균된 제약 등급의 물 또는 염수가 들어 있는 주입 병을 사용하여 분배될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우에는, 성분들이 투여 전에 혼합될 수 있도록 주사용 살균수 또는 염수의 앰풀이 제공될 수 있다.

통상적인 투약 형태는 아침용 단일 하루-1회 투여량으로서, 또는 음식을 섭취하면서 하루에 걸쳐 분할되는 투여량으로서 주어질 때, 일 당 약 0.1 mg 내지 약 1000 mg 범위 내에 있는 본원 제공 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 수화물을 포함한다. 특정 투약 형태는 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1.0, 2.0, 2.5, 5.0, 10.0, 15.0, 20.0, 25.0, 50.0, 100, 200, 250, 500 또는 1000 mg의 활성 화합물을 포함할 수 있다.

경구 투약 형태

경구 투여에 적합한 제약 조성물은 비제한적으로 정제 (예컨대 씹을 수 있는 정제), 캐플릿, 캡슐, 및 액체 (예컨대 가향 시럽)와 같은 별도의 투약 형태로 주어질 수 있다. 그와 같은 투약 형태는 사전결정된 양의 활성 성분을 함유하며, 업계 숙련자에게 잘 알려져 있는 제약 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로는, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th ed., Mack Publishing, Easton PA (2000)]을 참조하라.

소정 구현예에서, 경구 투약 형태는 고체로써, 상기 부문에 상세하게 기술되어 있는 바와 같이 무수의 성분들을 사용하여 무수 조건하에서 제조된다. 그러나, 본원에서 제공되는 조성물의 영역은 무수의 고체 경구 투약 형태를 벗어나 연장된다. 그에 따라, 본원에서는 추가적인 형태들이 기술된다.

통상적인 경구 투약 형태는 친화성인 혼합물 중의 활성 성분(들)을 통상적인 제약 배합 기술에 따라 1종 이상의 부형제와 조합함으로써 제조된다. 부형제는 투여에 요구되는 제조 형태에 따라 매우 다양한 형태를 취할 수 있다. 예를 들어, 경구용 액체 또는 에어로졸 투약 형태에 사용하기에 적합한 부형제에는 물, 글리콜, 오일, 알콜, 향미제, 보존제, 및 착색제가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 고체 경구 투약 형태 (예컨대 분말, 정제, 캡슐 및 캐플릿)에 사용하기에 적합한 부형제의 예에는 전분, 당, 미세 결정질 셀룰로스, 희석제, 과립화제, 윤활제, 바인더, 및 분해제가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

그의 투여의 용이성으로 인하여, 정제 및 캡슐은 가장 유리한 경구용 투약 단위 형태를 대표하는데, 이 경우에는 고체 부형제가 사용된다. 원하는 경우, 정제는 표준의 수성 또는 비수성 기술에 의해 코팅될 수 있다. 그와 같은 투약 형태는 임의의 제약 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 제약 조성물 및 투약 형태는 활성 성분을 액체 담체, 미분할된 고체 담체, 또는 이들 모두와 균일하게 친화성으로 혼합한 다음, 필요에 따라 원하는 외관으로 생성물을 성형함으로써 제조된다.

예를 들면, 정제는 압축 또는 성형에 의해 제조될 수 있다. 압축 정제는 임의로 부형제와 혼합되어 있는 분말 또는 과립과 같은 자유 유동 형태의 활성 성분을 적합한 기계에서 압축함으로써 제조될 수 있다. 성형 정제는 가습된 분말화 화합물의 불활성 액체 희석제와의 혼합물을 적합한 기계에서 성형함으로써 제조될 수 있다.

경구 투약 형태에 사용될 수 있는 부형제의 예에는 바인더, 충전재, 분해제, 및 윤활제가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 제약 조성물 및 투약 형태에 사용하기에 적합한 바인더에는 옥수수 전분, 감자 전분, 또는 기타 전분, 젤라틴, 천연 및 합성 고무 예컨대 아카시아, 나트륨 알기네이트, 알긴산, 기타 알기네이트, 분말화 트라가칸트, 구아 고무, 셀룰로스 및 그의 유도체 (예컨대 에틸 셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트, 카르복시메틸 셀룰로스 칼슘, 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스), 폴리비닐 피롤리돈, 메틸 셀룰로스, 예비 젤라틴화 전분, 히드록시프로필 메틸 셀룰로스 (예컨대 2208, 2906, 2910번), 미세결정질 셀룰로스, 및 이들의 혼합물이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원에서 개시되는 제약 조성물 및 투약 형태에 사용하기에 적합한 충전재의 예에는 활석, 칼슘 카르보네이트 (예컨대 과립 또는 분말), 미세결정질 셀룰로스, 분말화 셀룰로스, 덱스트레이트, 카올린, 만니톨, 규산, 소르비톨, 전분, 예비 젤라틴화 전분, 및 이들의 혼합물이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 제약 조성물 중의 바인더 또는 충전재는 통상 제약 조성물 또는 투약 형태의 약 50 내지 약 99 중량％로 존재한다.

적합한 형태의 미세결정질 셀룰로스에는 AVICEL PH 101, AVICEL PH 103, AVICEL RC 581, AVICEL PH 105 (펜실베이니아 마커스 후크 소재 FMC 코포레이션, 아메리칸 비스코스 디비젼, 아비셀 세일즈(FMC Corporation, American Viscose Division, Avicel Sales) 사에서 구입가능)로 판매되고 있는 재료들, 및 이들의 혼합물이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 특별한 바인더는 AVICEL RC 581로 판매되고 있는 미세결정질 셀룰로스와 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스의 혼합물이다. 적합한 무수 또는 저수분 부형제 또는 첨가제에는 AVICEL PH 103™ 및 전분 1500 LM이 포함된다.

분해제는 수성 환경에 노출되었을 때 분해되는 정제를 제공하기 위하여 조성물에 사용된다. 너무 많은 분해제를 함유하는 정제는 저장시에 분해될 수 있는 반면, 너무 적게 함유하는 것은 원하는 속도로, 또는 원하는 조건하에서 분해될 수 없다. 따라서, 활성 성분의 방출을 유해하게 변경할 만큼 너무 많지도 않고 너무 적지도 않은 충분량의 분해제가 고체 경구 투약 형태를 형성하는 데에 사용되어야 한다. 사용되는 분해제의 양은 제제의 유형에 따라 달라지는데, 업계 일반의 숙련자라면 용이하게 알 수 있다. 통상적인 제약 조성물은 약 0.5 내지 약 15 중량％의 분해제, 구체적으로는 약 1 내지 약 5 중량％의 분해제를 포함한다.

제약 조성물 및 투약 형태에 사용될 수 있는 분해제에는 아가 아가, 알긴산, 칼슘 카르보네이트, 미세결정질 셀룰로스, 크로스카르멜로스 나트륨, 크로스포비돈, 폴라크릴린 칼륨, 나트륨 전분 글리콜레이트, 감자 또는 타피오카 전분, 예비 젤라틴화 전분, 기타 전분, 점토, 기타 알긴, 기타 셀룰로스, 고무, 및 이들의 혼합물이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

제약 조성물 및 투약 형태에 사용될 수 있는 윤활제에는 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 무기 오일, 경질 무기 오일, 글리세린, 소르비톨, 만니톨, 폴리에틸렌 글리콜, 기타 글리콜, 스테아르산, 나트륨 라우릴 술페이트, 활석, 수소화 식물성 오일 (예컨대 땅콩 오일, 면실 오일, 해바라기 오일, 참깨 오일, 올리브 오일, 옥수수 오일, 및 대두 오일), 아연 스테아레이트, 에틸 올레에이트, 에틸 라우레에이트, 아가, 및 이들의 혼합물이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 추가적인 윤활제에는 예를 들면 실로이드(syloid) 실리카 겔 (에어로실(AEROSIL) 200, 매릴랜드 볼티모어 소재 W.R. 그레이스(Grace) Co. 사 제조), 합성 실리카의 응고 에어로졸 (텍사스 플라노 소재 데구사(Degussa) Co. 사에서 시판), CAB O SIL (매사추세츠 보스턴 소재 캐보트(Cabot) Co. 사에 의해 판매되는 발열원성 이산화 규소 생성물), 및 이들의 혼합물이 포함된다. 조금이라도 사용될 경우, 윤활제는 통상적으로 그것이 도입되는 제약 조성물 또는 투약 형태의 약 1 중량％ 미만의 양으로 사용된다.

대표적인 구현예에서, 화합물 1은 폴리에틸렌 글리콜 및 나트륨 라우릴 술페이트에 용해/분산되어, 히프로멜로스 경질 캡슐에 충전된다. 일 구현예에서, 상기 캡슐은 약 1-150 mg의 화합물 1을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 캡슐은 약 5-50 mg의 화합물 1을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 캡슐은 약 5 mg의 화합물 1을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 캡슐은 약 25 mg의 화합물 1을 포함한다.

지연 방출 투약 형태

본원에서 제공되는 화합물과 같은 활성 성분은 업계 일반의 숙련자에게 잘 알려져 있는 제어 방출 수단 또는 전달 장치에 의해 투여될 수 있다. 그 예에는 하기의 U.S. 특허 번호에 기술되어 있는 것들이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다: 3,845,770호; 3,916,899호; 3,536,809호; 3,598,123호; 및 4,008,719호; 5,674,533호; 5,059,595호; 5,591,767호; 5,120,548호; 5,073,543호; 5,639,476호; 5,354,556호; 5,639,480호; 5,733,566호; 5,739,108호; 5,891,474호; 5,922,356호; 5,972,891호; 5,980,945호; 5,993,855호; 6,045,830호; 6,087,324호; 6,113,943호; 6,197,350호; 6,248,363호; 6,264,970호; 6,267,981호; 6,376,461호; 6,419,961호; 6,589,548호; 6,613,358호; 6,699,500호 (이들 각각은 본원에 참조로써 개재됨). 그와 같은 투약 형태는 예를 들면 다양한 비율로 원하는 방출 프로필을 제공하는 히드로프로필메틸 셀룰로스, 기타 중합체 매트릭스, 젤, 투과가능 막, 삼투 시스템, 다층 코팅, 미세입자, 리포좀, 미세구체, 또는 이들의 조합을 사용하여, 1종 이상 활성 성분의 저속 방출 또는 제어 방출을 제공하는 데에 사용될 수 있다. 본원에서 기술되는 것들을 포함하여 업계 일반의 숙련자에게 알려져 있는 적합한 제어 방출 제제가 본원에서 제공되는 활성 성분과 함께 사용하기 위하여 용이하게 선택될 수 있다. 그에 따라 본원에 포함되는 것들은 비제한적으로 제어 방출용으로 적합화되어 있는 정제, 캡슐, 젤캡, 및 캐플릿과 같이 경구 투여에 적합한 단일 단위 투약 형태이다.

모든 제어 방출 제약 생성물은 그의 비제어 대응물에 의해 달성되는 것에 비해 약물 치료를 향상시킨다는 공통적인 목표를 가지고 있다. 이상적으로는, 의학적 치료에서의 적정하게 설계된 제어 방출 조제물의 사용은 최소량의 시간 이내에 이상을 치유 또는 제어하는 데에 최소의 약물 물질이 사용된다는 것을 특징으로 한다. 제어 방출 제제의 장점에는 약물 활성의 연장, 투약 빈도의 감소, 및 대상 순응도의 증가가 포함된다. 또한, 제어 방출 제제는 약물의 혈중 농도와 같은 작용 또는 기타 특성들의 개시 시간에 영향을 주는 데에 사용될 수 있으며, 그에 따라 부작용 (예컨대 악영향)의 발생에 영향을 줄 수 있다.

대부분의 제어 방출 제제는 처음에는 원하는 치료 효과를 신속하게 산출하는 약물 (활성 성분)의 양을 방출하고, 점차적으로 계속하여 다른 약물 양을 방출하여, 연장된 시간 기간 동안 해당 수준의 치료 또는 예방 효과를 유지하도록 설계된다. 신체에서 이러한 일정한 약물 농도를 유지하기 위해서는, 신체로부터 대사 및 배설되는 약물의 양을 대체하게 되는 속도로 약물이 투약 형태로부터 방출되어야 한다. 활성 성분의 제어 방출은 비제한적으로 pH, 온도, 효소, 물, 또는 기타 생리학적 조건 또는 화합물을 포함한 다양한 조건들에 의해 자극될 수 있다.

소정 구현예에서, 약물은 정맥내 주입, 이식가능 삼투 펌프, 경피 패치, 리포좀, 또는 기타 투여 양식을 사용하여 투여될 수 있다. 일 구현예에서는, 펌프가 사용될 수 있다 (문헌 [Sefton, CRC Crit . Ref . Biomed . Eng . 14:201 (1987)]; [Buchwald et al ., Surgery 88:507 (1980)]; [Saudek et al ., N. Engl . J. Med . 321:574 (1989)] 참조). 또 다른 구현예에서는, 중합체 재료가 사용될 수 있다. 또 다른 구현예에서는, 제어 방출 시스템이 숙련 개업의에 의해 결정되는 대상의 적절한 부위에 위치되는데, 다시 말하자면 그에 따라 전신적인 투여량의 일부만을 필요로 할 수 있다 (예를 들면 문헌 [Goodson, Medical Applications of Controlled Release , vol. 2, pp. 115-138 (1984)] 참조). 기타 제어 방출 시스템에 대해서는 랑거(Langer)에 의한 고찰 (문헌 [Science 249:1527-1533 (1990)])에 논의되어 있다. 활성 성분은 체액에 불용성인 외부 중합체 막, 예를 들면 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 에틸렌/프로필렌 공중합체, 에틸렌/에틸 아크릴레이트 공중합체, 에틸렌/비닐아세테이트 공중합체, 실리콘 고무, 폴리디메틸 실록산, 네오프렌 고무, 염소화 폴리에틸렌, 염화폴리비닐, 비닐 아세테이트와의 염화비닐 공중합체, 염화 비닐리덴, 에틸렌 및 프로필렌, 이오노머 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 부틸 고무 에피클로로히드린 고무, 에틸렌/비닐 알콜 공중합체, 에틸렌/비닐 아세테이트/비닐 알콜 삼원중합체, 및 에틸렌/비닐옥시에탄올 공중합체에 의해 둘러싸인 고체 내부 매트릭스, 예를 들면 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리부틸메타크릴레이트, 가소화 또는 비가소화 염화폴리비닐, 가소화 나일론, 가소화 폴리에틸렌테레프탈레이트, 천연 고무, 폴리이소프렌, 폴리이소부틸렌, 폴리부타디엔, 폴리에틸렌, 에틸렌-비닐아세테이트 공중합체, 실리콘 고무, 폴리디메틸실록산, 실리콘 카르보네이트 공중합체, 친수성 중합체 예컨대 아크릴산 및 메타크릴산의 에스테르의 히드로겔, 콜라겐, 가교-결합된 폴리비닐알콜 및 가교-결합된 부분 가수분해 폴리비닐 아세테이트 중에 분산될 수 있다. 활성 성분은 이후 방출 속도 제어 단계에서 외부 중합체 막을 통하여 확산된다. 그와 같은 비경구 조성물 중 활성 성분의 백분율은 구체적인 그의 특성은 물론, 대상의 요구도에 따라 크게 달라진다.

비경구 투약 형태

일 구현예에서, 제공되는 것은 비경구 투약 형태이다. 비경구 투약 형태는 비제한적으로 피하, 정맥내 (일시 주사 포함), 근육내, 및 동맥내를 포함한 다양한 경로에 의해 대상에게 투여될 수 있다. 그의 투여가 통상적으로 오염물질에 대한 대상의 선천적인 방어를 우회하기 때문에, 비경구 투약 형태는 통상적으로 살균된 것이거나, 또는 대상에 대한 투여 전에 살균될 수 있다. 비경구 투약 형태의 예에는 즉석 주사용 용액, 제약상 허용되는 주사용 운반체 중에 즉석에서 용해 또는 현탁되는 건조 생성물, 즉석 주사용 현탁액, 및 에멀션이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

비경구 투약 형태를 제공하는 데에 사용될 수 있는 적합한 운반체에 대해서는 업계 숙련자에게 잘 알려져 있다. 그 예에는 하기가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다: USP 주사용수; 비제한적으로 염화 나트륨 주사액, 링거 주사액, 덱스트로스 주사액, 덱스트로스 및 염화 나트륨 주사액, 및 락테이트화 링거 주사액과 같은 수성 운반체; 비제한적으로 에틸 알콜, 폴리에틸렌 글리콜, 및 폴리프로필렌 글리콜과 같은 수혼화성 운반체; 및 비제한적으로 옥수수 오일, 면실 오일, 땅콩 오일, 참깨 오일, 에틸 올레에이트, 이소프로필 미리스테이트, 및 벤질 벤조에이트와 같은 비수성 운반체.

본원에서 개시되는 활성 성분 1종 이상의 용해도를 증가시키는 화합물이 비경구 투약 형태에 도입될 수도 있다.

경피, 국소 & 점막 투약 형태

역시 제공되는 것은 경피, 국소, 및 점막 투약 형태이다. 경피, 국소, 및 점막 투약 형태에는 안 용액, 스프레이, 에어로졸, 크림, 로션, 연고, 젤, 용액, 에멀션, 현탁액, 또는 업계 숙련자에게 알려져 있는 기타 형태가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들면 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16^th, 18th and 20^th eds., Mack Publishing, Easton PA (1980, 1990 & 2000)]; 및 [Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 4th ed., Lea & Febiger, Philadelphia (1985)]을 참조하라. 구강 내의 점막 조직을 치료하는 데에 적합한 투약 형태는 구강세척제 또는 구강 젤로서 제제화될 수 있다. 또한, 경피 투약 형태에는 "저장소 유형" 또는 "매트릭스 유형" 패치가 포함되는데, 이들은 피부에 적용되어 특정 시간 기간 동안 착용됨으로써, 원하는 양의 활성 성분의 침투를 가능케 할 수 있다.

본원에 포함되는 경피, 국소, 및 점막 투약 형태를 제공하는 데에 사용될 수 있는 적합한 부형제 (예컨대 담체 및 희석제) 및 기타 재료에 대해서는 제약 업계 숙련자에게 잘 알려져 있는데, 주어지는 제약 조성물 또는 투약 형태가 적용될 예정인 구체적인 조직에 따라 달라진다. 그와 같은 사실을 고려할 때, 통상적인 부형제에는 비독성이며 제약상 허용되는 것으로서 로션, 팅크제, 크림, 에멀션, 젤 또는 연고를 형성하는 물, 아세톤, 에탄올, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 부탄 1,3 디올, 이소프로필 미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, 무기 오일, 및 이들의 혼합물이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 원하는 경우, 보습제 또는 습윤제가 제약 조성물 및 투약 형태에 첨가될 수도 있다. 그와 같은 추가적인 성분의 예에 대해서는 업계에 잘 알려져 있다. 예를 들면, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16^th, 18th and 20^th eds., Mack Publishing, Easton PA (1980, 1990 & 2000)]을 참조하라.

치료될 구체적인 조직에 따라, 제공되는 활성 성분을 사용한 치료 전에, 그와 함께, 또는 그 이후에 추가 성분들이 사용될 수 있다. 예를 들면, 침투 강화제가 활성 성분을 조직으로 전달하는 것을 돕기 위하여 사용될 수 있다. 적합한 침투 강화제에는 하기가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다: 아세톤; 다양한 알콜 예컨대 에탄올, 올레일, 및 테트라히드로퓨릴; 알킬 술폭시드 예컨대 디메틸 술폭시드; 디메틸 아세트아미드; 디메틸 포름아미드; 폴리에틸렌 글리콜; 피롤리돈 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 콜리돈(Kollidon) 등급물 (포비돈, 폴리비돈); 요소; 및 다양한 수용성 또는 수불용성 당 에스테르 예컨대 트윈 80 (폴리소르베이트 80) 및 스판(Span) 60 (소르비탄 모노스테아레이트).

1종 이상 활성 성분의 전달을 향상시키기 위하여, 제약 조성물 또는 투약 형태, 또는 제약 조성물 또는 투약 형태가 적용되는 조직의 pH가 조정될 수도 있다. 유사하게, 전달을 향상시키기 위하여 용매 담체의 극성, 그의 이온 강도, 또는 장성이 조정될 수 있다. 전달이 향상되도록 1종 이상 활성 성분의 친수성 또는 친지질성을 유리하게 변경하기 위하여, 스테아레이트와 같은 화합물이 제약 조성물 또는 투약 형태에 첨가될 수도 있다. 이와 관련하여, 스테아레이트는 제제용 지질 운반체로서, 에멀션화제 또는 계면활성제로서, 그리고 전달 강화제 또는 침투 강화제로서 기능할 수 있다.

생성되는 조성물의 특성을 추가적으로 조정하기 위하여, 활성 성분의 상이한 염, 수화물 또는 용매화물들이 사용될 수 있다.

투약량 및 단위 투약 형태

인간 치료에서는, 의사가 예방 또는 치유적 치료에 따라, 그리고 치료되는 대상 고유의 연령, 체중, 감염 단계 및 기타 요인들에 따라 가장 적절하다고 생각되는 약량을 결정하게 된다. 소정 구현예에서, 투여량은 성인에 대하여 일 당 약 1 내지 약 1000 mg, 또는 성인에 대하여 일 당 약 5 내지 약 250 mg 또는 일 당 약 10 내지 50 mg이다. 소정 구현예에서, 투여량은 성인에 대하여 일 당 약 5 내지 약 400 mg 또는 일 당 25 내지 200 mg이다. 소정 구현예에서는, 일 당 약 50 내지 약 500 mg의 투여율 역시 고려된다.

다른 양태에서, 제공되는 것은 그를 필요로 하는 대상에게 본원에서 제공되는 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염의 유효량을 투여하는 것에 의한, 대상에서의 HCV 감염의 치료 또는 예방 방법이다. 장애 또는 그의 1종 이상 증상의 예방 또는 치료에 효과적일 화합물 또는 조성물의 양은 질병 또는 이상의 특성 및 중증도, 그리고 활성 성분이 투여되는 경로에 따라 달라지게 된다. 빈도 및 투약량 역시 투여되는 구체적인 요법 (예컨대 치료제 또는 예방제), 장애, 질병 또는 이상의 중증도, 투여 경로는 물론, 대상의 연령, 신체, 체중, 응답, 및 과거 의료 이력에 따른 각 대상 고유의 요인들에 따라 달라지게 된다. 효과적인 투여량은 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유도되는 투여량-응답 곡선으로부터 외삽될 수 있다.

소정 구현예에서, 대표적인 조성물 투여량에는 대상 또는 샘플 체중 킬로그램 당 활성 화합물의 양 밀리그램 또는 마이크로그램이 포함된다 (예를 들면 킬로그램 당 약 10 마이크로그램 내지 킬로그램 당 약 50 밀리그램, 킬로그램 당 약 100 마이크로그램 내지 킬로그램 당 약 25 밀리그램, 또는 킬로그램 당 약 100 마이크로그램 내지 킬로그램 당 약 10 밀리그램). 소정 구현예에서, 본원에서 제공되는 조성물과 관련하여 대상에게 투여되는 투약량은 활성 화합물의 중량을 기준으로 0.140 mg/kg대상체중 내지 3 mg/kg대상체중이다. 소정 구현예에서, 대상에게 투여되는 투약량은 0.20 mg/kg대상체중 내지 2.00 mg/kg대상체중 사이, 또는 0.30 mg/kg대상체중 내지 1.50 mg/kg대상체중 사이이다.

소정 구현예에서, 본원에서 기술되는 이상에 대한 본원에서 제공되는 조성물의 권장 하루 투여량 범위는 단일 하루-1회 투여량으로서, 또는 하루에 걸친 분할 투여량으로서 주어질 때 일 당 약 0.1 mg 내지 약 1000 mg의 범위 내에 위치한다. 일 구현예에서, 하루 투여량은 동일하게 분할된 투여량으로 하루에 2회 투여된다. 하루 투여량 범위는 소정 구현예에서 일 당 약 10 mg 내지 약 200 mg, 다른 구현예에서는 일 당 약 10 mg 내지 약 150 mg 사이, 또 다른 구현예에서는 일 당 약 25 내지 약 100 mg 사이이어야 한다. 업계 일반의 숙련자라면 알고 있을 바와 같이, 일 부 경우에는 본원에서 개시되는 범위를 벗어나는 활성 성분 투약량을 사용하는 것이 필요할 수도 있다. 또한, 대상 응답과 관련하여 어떻게 그리고 언제 치료를 중단, 조정, 또는 종결할지에 대해서는 임상의 또는 치료 의사가 인지하게 된다는 것을 알아야 한다.

업계 일반의 숙련자라면 쉽게 알고 있을 바와 같이, 상이한 질병 및 이상에 대해서는 상이한 치료적 유효량이 적용가능할 수 있다. 유사하게, 해당 장애를 예방, 관리, 치료 또는 개선하기에 충분하나 본원에서 제공되는 조성물과 관련한 악영향을 야기하기에는 불충분하거나 그를 감소시키기에 충분한 양 역시 상기한 투약량 및 투여 빈도 일정에 의해 포괄된다. 또한, 본원에서 제공되는 조성물의 다수 투약량이 대상에게 투여되는 경우, 모든 투약량이 동일할 필요는 없다. 예를 들어, 대상에게 투여되는 투약량은 조성물의 예방 또는 치료 효과를 향상시키기 위하여 증가될 수 있거나, 또는 특정 대상이 겪는 1종 이상의 부작용을 감소시키기 위하여 감소될 수 있다.

소정 구현예에서, 본원에서 제공되는 조성물의 투약량은 대상에서 장애, 또는 그의 1종 이상 증상을 예방, 치료, 관리, 또는 개선하기 위하여 투여되는 활성 화합물의 중량을 기준으로 대상 체중의 0.1 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 10 mg/kg, 또는 15 mg/kg 이상이다. 또 다른 구현예에서, 대상에서 장애, 또는 그의 1종 이상 증상을 예방, 치료, 관리, 또는 개선하기 위하여 투여되는 조성물 또는 본원 제공 조성물의 투약량은 0.1 mg 내지 200 mg, 0.1 mg 내지 100 mg, 0.1 mg 내지 50 mg, 0.1 mg 내지 25 mg, 0.1 mg 내지 20 mg, 0.1 mg 내지 15 mg, 0.1 mg 내지 10 mg, 0.1 mg 내지 7.5 mg, 0.1 mg 내지 5 mg, 0.1 내지 2.5 mg, 0.25 mg 내지 20 mg, 0.25 내지 15 mg, 0.25 내지 12 mg, 0.25 내지 10 mg, 0.25 mg 내지 7.5 mg, 0.25 mg 내지 5 mg, 0.5 mg 내지 2.5 mg, 1 mg 내지 20 mg, 1 mg 내지 15 mg, 1 mg 내지 12 mg, 1 mg 내지 10 mg, 1 mg 내지 7.5 mg, 1 mg 내지 5 mg, 또는 1 mg 내지 2.5 mg의 단위 투여량이다.

소정 구현예에서, 치료 또는 예방은 본원에서 제공되는 화합물 또는 조성물의 1종 이상의 부하 투여량(loading dose)에 의해 개시되어, 1종 이상의 유지 투여량으로 이어질 수 있다. 그와 같은 구현예에서, 상기 부하 투여량은 예를 들면 1일 내지 5주 동안 일 당 약 60 내지 약 400 mg, 또는 일 당 약 100 내지 약 200 mg일 수 있다. 상기 부하 투여량은 1종 이상의 유지 투여량으로 이어질 수 있다. 소정 구현예에서, 각 유지 투여량은 독립적으로 일 당 약 10 mg 내지 약 200 mg, 일 당 약 25 mg 내지 약 150 mg 사이, 또는 일 당 약 25 내지 약 80 mg 사이이다. 유지 투여량은 매일 투여될 수 있으며, 단일 투여량으로서, 또는 분할 투여량으로서 투여될 수 있다.

소정 구현예에서, 본원에서 제공되는 화합물 또는 조성물의 투여량은 대상의 혈액 또는 혈청에서의 활성 성분의 항정-상태 농도를 달성하기 위하여 투여될 수 있다. 상기 항정-상태 농도는 숙련자에게 가용한 기술에 따른 측정에 의해 측정될 수 있거나, 또는 키, 체중 및 연령과 같은 대상의 신체적 특성을 기준으로 할 수 있다. 소정 구현예에서는, 약 300 내지 약 4000 ng/mL, 약 400 내지 약 1600 ng/mL, 또는 약 600 내지 약 1200 ng/mL의 대상 혈액 또는 혈청 중 항정-상태 농도를 달성하도록, 본원 제공 화합물 또는 조성물의 충분량이 투여된다. 일부 구현예에서, 부하 투여량은 1 내지 5일 동안 약 1200 내지 약 8000 ng/mL, 또는 약 2000 내지 약 4000 ng/mL의 항정-상태 혈액 또는 혈청 농도를 달성하도록 투여될 수 있다. 소정 구현예에서, 유지 투여량은 약 300 내지 약 4000 ng/mL, 약 400 내지 약 1600 ng/mL, 또는 약 600 내지 약 1200 ng/mL의 대상 혈액 또는 혈청 중 항정-상태 농도를 달성하도록 투여될 수 있다.

소정 구현예에서는, 동일 조성물의 투여가 반복될 수 있으며, 투여는 1일, 2일, 3일, 5일, 10일, 15일, 30일, 45일, 2개월, 75일, 3개월, 또는 6개월 이상 이격될 수 있다. 다른 구현예에서는, 동일한 예방제 또는 치료제의 투여가 반복될 수 있으며, 투여는 1일, 2일, 3일, 5일, 10일, 15일, 30일, 45일, 2개월, 75일, 3개월, 또는 6개월 이상 이격될 수 있다.

소정 양태에서, 본원에서 제공되는 것은 투여에 적합한 형태로 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 단위 투약물이다. 그와 같은 형태에 대해서는 상기에 상세하게 기술되어 있다. 소정 구현예에서, 상기 단위 투약물은 1 내지 1000 mg, 5 내지 250 mg 또는 10 내지 50 mg의 활성 성분을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 단위 투약물은 약 1, 5, 10, 25, 50, 100, 125, 250, 500 또는 1000 mg의 활성 성분을 포함한다. 그와 같은 단위 투약물은 업계 숙련자에게 익숙한 기술에 따라 제조될 수 있다.

제2 제제의 투약이 본원에서 제공되는 조합 치료에 사용될 수 있다. 소정 구현예에서, 본원에서 제공되는 조합 치료에서는, HCV 감염을 예방 또는 치료하기 위하여 사용되었었거나 현재 사용되고 있는 것에 비해 더 적은 투약량이 사용된다. 제2 제제의 권장 투약량은 숙련자의 지식으로부터 수득될 수 있다. 임상적 용도로 승인되어 있는 제2 제제들에 있어서의 권장 투약량에 대해서는 예를 들면 그 전체가 본원에 참조로써 개재되는 문헌 [Hardman et al ., eds., 1996, Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis Of Basis Of Therapeutics 9^th Ed, Mc-Graw-Hill, New York]; [Physician's Desk Reference (PDR) 57^th Ed., 2003, Medical Economics Co., Inc., Montvale, NJ]에 기술되어 있다.

다양한 구현예에서, 요법들 (예컨대 본원에서 제공되는 화합물 및 제2 제제)은 5분 미만 간격으로, 30분 미만 간격으로, 1시간 간격으로, 약 1시간 간격으로, 약 1 내지 약 2시간 간격으로, 약 2시간 내지 약 3시간 간격으로, 약 3시간 내지 약 4시간 간격으로, 약 4시간 내지 약 5시간 간격으로, 약 5시간 내지 약 6시간 간격으로, 약 6시간 내지 약 7시간 간격으로, 약 7시간 내지 약 8시간 간격으로, 약 8시간 내지 약 9시간 간격으로, 약 9시간 내지 약 10시간 간격으로, 약 10시간 내지 약 11시간 간격으로, 약 11시간 내지 약 12시간 간격으로, 약 12시간 내지 18시간 간격으로, 18시간 내지 24시간 간격으로, 24시간 내지 36시간 간격으로, 36시간 내지 48시간 간격으로, 48시간 내지 52시간 간격으로, 52시간 내지 60시간 간격으로, 60시간 내지 72시간 간격으로, 72시간 내지 84시간 간격으로, 84시간 내지 96시간 간격으로, 또는 96시간 내지 120시간 간격으로 투여된다. 다양한 구현예에서, 상기 요법은 24시간 이하 간격, 또는 48시간 이하 간격으로 투여된다. 소정 구현예에서는, 2종 이상의 요법이 동일한 환자 회진 이내에 투여된다. 다른 구현예에서는, 본원에서 제공되는 화합물과 제2 제제가 동시에 투여된다.

다른 구현예에서, 본원에서 제공되는 화합물과 제2 제제는 약 2 내지 4일 간격으로, 약 4 내지 6일 간격으로, 약 1주 간격으로, 약 1 내지 2주 간격으로, 또는 2주를 초과하는 간격으로 투여된다.

소정 구현예에서는, 동일한 제제의 투여가 반복될 수 있으며, 투여는 1일, 2일, 3일, 5일, 10일, 15일, 30일, 45일, 2개월, 75일, 3개월, 또는 6개월 이상 이격될 수 있다. 다른 구현예에서는, 동일한 제제의 투여가 반복될 수 있으며, 투여는 1일, 2일, 3일, 5일, 10일, 15일, 30일, 45일, 2개월, 75일, 3개월, 또는 6개월 이상 이격될 수 있다.

소정 구현예에서, 본원에서 제공되는 화합물 및 제2 제제는 본원에서 제공되는 화합물이 다른 제제와 함께 작용하여 그것이 다르게 투여되었을 경우에 비해 이익의 증가를 제공할 수 있도록 하는 순서로 그리고 시간 간격 이내에 환자, 예를 들면 인간과 같은 포유동물에게 투여된다. 예를 들면, 제2 활성 제제는 동시에, 또는 임의의 순서로 연속하여 상이한 시점에 투여될 수 있으나; 동시에 투여되는 것이 아닌 경우에는, 원하는 치료 또는 예방 효과를 제공할 수 있도록 시간상 충분히 가깝게 투여되어야 한다. 일 구현예에서, 본원에서 제공되는 화합물과 제2 제제는 중첩되는 시간에 그 효과를 나타낸다. 각 제2 활성 제제는 별도로, 임의의 적절한 형태로, 그리고 임의의 적합한 경로에 의해 투여될 수 있다. 다른 구현예에서, 본원에서 제공되는 화합물은 제2 활성 제제의 투여 전에, 그와 동시에 또는 후에 투여된다.

소정 구현예에서, 본원에서 제공되는 화합물 및 제2 제제는 주기적으로 환자에게 투여된다. 주기적 요법은 일정 시간 기간 동안 제1 제제 (예컨대 제1 예방제 또는 치료제)를 투여한 후, 이어서 일정 시간 기간 동안 제2 제제 및/또는 제3 제제 (예컨대 제2 및/또는 제3의 예방제 또는 치료제)가 투여되고, 이와 같은 순차적인 투여가 반복되는 것을 수반한다. 주기적 요법은 1종 이상 요법에 대한 내성의 발생을 감소시키거나, 요법 중 1종의 부작용을 방지 또는 감소시키거나, 및/또는 치료의 효능을 향상시킬 수 있다.

소정 구현예에서, 본원에서 제공되는 화합물 및 제2 활성 제제는 약 3주 미만의 주기로, 약 2주마다 1회씩, 약 10일마다 1회씩, 또는 약 1주마다 1회씩 투여된다. 1주기는 주기마다 약 90분, 주기마다 약 1시간, 주기마다 약 45분 동안의 주입에 의한 본원 제공 화합물 및 제2 제제의 투여를 포함할 수 있다. 각 주기는 1주 이상의 휴지, 2주 이상의 휴지, 3주 이상의 휴지를 포함할 수 있다. 투여되는 주기의 수는 약 1 내지 약 12 주기, 더 통상적으로는 약 2 내지 약 10 주기, 더 통상적으로는 약 2 내지 약 8 주기이다.

또 다른 구현예에서는, 치료 과정이 동시에 환자에게 투여되는데, 다시 말하자면 본원에서 제공되는 화합물이 제2 활성 제제와 함께 작용할 수 있도록 하는 시간 간격 이내에 제2 제제의 개별 투여량이 별도로 투여된다. 예를 들면, 1종의 성분이 2주마다 1회씩 또는 3주마다 1회씩 투여될 수 있는 다른 성분과 함께 주 당 1회씩 투여될 수 있다. 다른 말로 하면, 치료제들이 동시에 또는 동일 일자 동안에 투여되지 않는다 할지라도, 투여 처방계획은 동시에 수행된다.

제2 제제는 본원에서 제공되는 화합물과 부가적으로 또는 상승적으로 작용할 수 있다. 일 구현예에서, 본원에서 제공되는 화합물은 하나의 제약 조성물 내에서 1종 이상의 제2 제제와 동시에 투여된다. 또 다른 구현예에서, 본원에서 제공되는 화합물은 별도의 제약 조성물 내에서 1종 이상의 제2 제제와 동시에 투여된다. 또 다른 구현예에서, 본원에서 제공되는 화합물은 제2 제제의 투여 전에 또는 그에 이어서 투여된다. 역시 고려되는 것은 본원에서 제공되는 화합물과 제2 제제의 동일하거나 서로 다른 투여 경로, 예컨대 경구 및 비경구에 의한 투여이다. 소정 구현예에서, 본원에서 제공되는 화합물이 비제한적으로 독성을 포함한 부정적인 부작용을 잠재적으로 생성시키는 제2 제제와 동시에 투여되는 경우, 상기 제2 활성 제제는 유리하게는 부정적인 부작용이 유도되는 역치 미만에 속하는 투여량으로 투여될 수 있다.

대표적인 투약량 및 치료 방법

일 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 임의로 제약상 허용되는 담체 중에서 단독으로, 또는 또 다른 항-플라비비리다에 제제와 함께 또는 교대로, 약 1 mg/일 내지 약 150 mg/일 양의 화합물 1을 투여하는 것을 포함하는, 인간을 포함한 숙주에서의 플라비비리다에 감염의 치료 방법이다. 소정 구현예에서, 투여되는 화합물 1의 양은 약 5 mg/일 내지 약 100 mg/일이다. 소정 구현예에서, 투여되는 화합물 1의 양은 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100 mg/일이다. 소정 구현예에서, 투여되는 화합물 1의 양은 약 5, 10, 25, 50, 75, 또는 100 mg/일이다.

소정 구현예에서, 본원에서 제공되는 것은 임의로 제약상 허용되는 담체 중에서 치료적 유효량의 리바비린과 함께 또는 교대로, 약 1 mg/일 내지 약 150 mg/일 양의 화합물 1을 투여하는 것을 포함하는, 인간을 포함한 숙주에서의 플라비비리다에 감염의 치료 방법이다. 일 구현예에서, 투여되는 리바비린의 양은 약 800 mg 내지 약 1400 mg이다. 일 구현예에서, 상기 방법은 약 5 mg/일 내지 약 100 mg/일 양의 화합물 1, 및 약 800 mg 내지 약 1400 mg 양의 리바비린을 투여하는 것을 포함한다. 소정 구현예에서, 투여되는 화합물 1의 양은 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100 mg/일이며, 리바비린의 양은 약 800 mg, 1000 mg, 1200 mg 또는 1400 mg이다. 소정 구현예에서, 투여되는 화합물 1의 양은 약 5, 10, 25, 50, 75, 또는 100 mg/일이며, 리바비린의 양은 약 800 mg, 1000 mg, 1200 mg 또는 1400 mg이다.

키트

역시 제공되는 것은 HCV 감염과 같은 간 장애의 치료 방법에 사용하기 위한 키트이다. 상기 키트는 본원에서 제공되는 화합물 또는 조성물, 제2 제제 또는 조성물, 및 장애를 치료하기 위한 용법과 관련하여 건강 관리 제공자에게 정보를 제공하는 지침을 포함할 수 있다. 지침은 인쇄된 형태, 또는 플로피 디스크, CD 또는 DVD와 같은 전자 매체의 형태로, 또는 해당 지침이 수득될 수 있는 웹사이트 주소의 형태로 제공될 수 있다. 본원에서 제공되는 화합물 또는 조성물, 또는 제2 제제 또는 조성물의 단위 투여량은 대상에게 투여되었을 때 1일 이상 동안 대상에서 치료적 또는 예방적으로 효과적인 화합물 또는 조성물의 혈장 농도가 유지될 수 있도록 하는 투약량을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 화합물 또는 조성물은 살균된 수성의 제약 조성물 또는 건조 분말 (예컨대 동결건조) 조성물로서 포함될 수 있다.

일부 구현예에서는, 적합한 포장이 제공된다. 본원에서 사용될 때, "포장"에는 시스템에서 통상적으로 사용되며 대상에게 투여하기에 적합한 본원 제공 화합물 및/또는 제2 제제를 고정된 한계 내에서 유지할 수 있는 고체 매트릭스 또는 재료가 포함된다. 그와 같은 재료에는 유리 및 플라스틱 (예컨대 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 및 폴리카르보네이트) 병, 바이알, 종이, 플라스틱, 및 플라스틱-호일 라미네이팅된 외피 등이 포함된다. e-광선 살균 기술이 사용되는 경우, 상기 포장은 충분히 작은 밀도를 가짐으로써 내용물의 살균을 가능케 해야 한다.

하기의 실시예는 대표적인 본원 제공 화합물의 합성을 예시한다. 이들 실시예는 청구되는 주제의 영역을 제한하고자 하는 것이 아니며, 그렇게 간주되어서도 아니 된다. 청구된 주제의 영역이 본원에서 구체적으로 기술된 바와 다르게 실행될 수도 있다는 것은 분명할 것이다. 주제의 수많은 변형 및 변이가 본원 교시의 관점에서 가능하며, 그에 따라 청구된 주제의 영역 내에 있다.

[실시예]

실시예 1

2'-C-메틸 구아노신의 히드록시tBuSate-포스포르아미데이트 유도체 제조

(화합물 3)

단계 1: {9-[(2R)2-C-메틸-β-D-리보-퓨라노실]-구아닌}-5'-일-O-(트리페닐메틸옥시-tert-부틸-S-아실-2-티오에틸) H-포스포네이트

-15 ℃에서, 피리딘 (75 ml) 중 9-(2-C-메틸-β-D-리보퓨라노실)구아닌 (4.87 mmol) 및 S-(2-포스파이트-에틸) 2,2-디메틸-3-트리페닐메틸옥시-티오프로피오네이트 트리에틸아민 염 (6.34 mmol)의 교반 용액에 질소하에서 염화 피발로일 (9.74 mmol)을 적가하였다. 반응 혼합물을 -15 ℃에서 2시간 동안 교반하였다. 디클로로메탄 및 NH₄Cl 용액을 첨가하였다. NH₄Cl 용액을 사용하여 유기 상을 세척 분리한 후, Na₂SO₄ 상에서 건조하고, 여과한 후, 감압하에서 농축하였다. 실리카 겔 크로마토그래피 (DCM/MeOH)에 의해 조 물질을 정제함으로써, 표제 화합물을 산출하였다. 분자식 C₃₇H₄₂N₅O₉PS.

단계 2: {9-[(2R)2-C-메틸-β-D-리보-퓨라노실]-구아닌}-5'-일-O-(트리페닐메틸옥시-tert-부틸-S-아실-2-티오에틸) 포스포르아미데이트

사염화 탄소 (8 ml) 중 화합물 1-1 (0.76 mmol)의 냉각된 용액 (-45 ℃)에 디옥산 (3.80 mmol, 8 ml) 중 NH₃의 0.5 M 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 -15 ℃ 내지 -10 ℃ 사이에서 3시간 동안 교반하였다. 진공에서 휘발성물질을 증발시켰다. 수득된 잔류물을 디클로로메탄을 사용하여 공동-증발시키고, 정제 없이 다음 단계에 사용하였다. 베이지색의 고체. 분자식 C₃₇H₄₃N₆O₉PS. 스캔 ES⁺ 779 (M+H)⁺.

단계 3: 2'-C-메틸 구아노신의 히드록시tBuSate-포스포르아미데이트 유도체

화합물 1-2 (0.78 mmol)를 수성 AcOH 80 ％ (31 ml) 중에서 실온으로 8시간 동안 교반하였다. EtOAc를 첨가하고 (20 ml), 감압하에서 수성 층을 농축하였다. C₁₈ 크로마토그래피 (물/아세토니트릴)에 의해 조 물질을 정제하여 표제 화합물을 산출하였다. 백색의 분말. 분자식 C₁₈H₂₉N₆O₉PS.

실시예 2

{9-[(2R)2-C-메틸-β-D-리보-퓨라노실]-구아닌}-5'-일 포스포르아미데이트의 제조

(화합물 4)

{9-[(2R)2-C-메틸-β-D-리보-퓨라노실]-구아닌}-5'-일-O-(히드록시-tert-부틸-S-아실-2-티오에틸) 포스포르아미데이트 (화합물 3) (0.20 mol)을 0 ℃에서 NH₃로 포화된 메탄올의 용액 (4 ml)에 용해시켰다. 반응 혼합물을 0 ℃에서 30분 동안 및 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 용매를 증발시키고, 구배 0-3 ％의 메탄올을 사용하여 용리되는 역상 (C18) 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 조 물질을 정제함으로써, 백색의 고체로서 표제 화합물 (화합물 4)을 산출하였다. 분자식 C₁₁H₁₇N₆O₇P.

실시예 3

[(2R)-2-메틸-β-D-리보퓨라노실]구아닌 5'-모노포스페이트의 제조

(화합물 5)

트리에틸포스페이트 (825 μL) 중 9-(2-C-메틸-β-D-리보퓨라노실)구아닌 (0.33 mmol)의 교반 용액에 0 ℃에서 염화 포스포릴 (75 μL, 1.07 mmol)을 첨가하였다. 이와 같은 반응 혼합물을 5 ℃에서 밤새 교반하였다. TEAB 1 M (pH = 7.5, 15 mL)을 사용하여 조심스럽게 반응을 중단하고, 0 ℃에서 20분 동안 교반한 다음, 물 및 에틸 아세테이트를 사용하여 희석하였다. 감압하에서 수성 상을 농축하였다. 조 물질을 TEAB에 의해 용리되는 DEAE-세파덱스 크로마토그래피에 적용하였다. 원하는 분획을 합쳐, 감압하에서 농축하고, 물/메탄올의 혼합물을 사용하여 공동-증발시킨 후, 최종적으로 물을 사용하여 공동-증발시켰다. 생성되는 잔류물을 준-정제용 HPLC 상에서 정제하였다. 예상 생성물을 함유하는 분획들을 감압하에서 농축하고, 물/메탄올 혼합물을 사용하여 공동-증발시킨 후, 물로부터 동결건조하였다. 다우엑스(Dowex) Na⁺ 수지 컬럼 상에서 물을 사용하여 트리에틸암모늄 염 모노포스페이트를 용리시키고, 동결건조 후 나트륨 염을 산출하였다. 백색의 고체. 분자식 C₁₁H₁₅N₅O₈PNa.

실시예 4

{9-[(2R)2-C-메틸-β-D-에리트로-퓨라노실]-구아닌}-5'-일-O-(카르복시-tert-부틸-S-아실-2-티오에틸) 벤질아민 포스포르아미데이트의 제조

(화합물 11)

단계 1: 2,2-디메틸말론산-디-tert-부틸 에스테르

문헌 [Synthesis, 1983, 135]에 기술되어 있는 절차에 따라 디메틸말론산으로부터 화합물 3-5를 합성하였다. 황색의 오일. 분자식 C₁₃H₂₄O₄.

단계 2: 2,2-디메틸말론산-tert-부틸 에스테르

문헌 [J. Org . Chem , 2004, 69, 6185]에 기술되어 있는 절차에 따라 화합물 5로부터 화합물 3-6을 합성하였다. 백색의 고체. 분자식 C₉H₁₆O₄.

단계 3: 2-(2-히드록시-에틸술파닐카르보닐)-2-메틸-프로피온산-tert-부틸 에스테르

톨루엔 (6 ml)과 DMF (455 ㎕)의 혼합물 중 화합물 3-6 (1.30 mmol)의 교반 용액에 1,1'-카르보닐디이미다졸 (1.69 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하고, 톨루엔/DMF (93/7, v/v)로 희석한 후, -16 ℃로 냉각하고, 2-메르캅토에탄올 (1.69 mmol)로 처리하였다. 혼합물을 -15 ℃ 내지 -5 ℃ 사이에서 3시간 동안 교반하였다. 감압하에서 용매를 제거하였다. 잔류물을 DCM에 용해시키고, 물로 세척하였다. 유기물질을 분리하고, Na₂SO₄ 상에서 건조한 후, 감압하에서 농축함으로써 표제 화합물을 산출하였다. 황색의 오일. 분자식 C₁₁H₂₀O₄S.

단계 4: S-(2-포스파이트-에틸)-2,2-디메틸-술파닐카르보닐 프로피온산 tert-부틸 에스테르 트리에틸아민

피리딘 (6 ml)에 용해시킨 화합물 3-7 (1.3 mmol)을 아인산 (13 mmol)에 첨가하였다. 반응 혼합물을 0 ℃로 냉각하고, 염화 피발로일 (7.15 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온으로 가온시키고, 3시간 동안 교반하였다. 1 M 수성 TEAB (3 ml)를 사용하여 조심스럽게 반응을 중단하고, EtOAc (50 ml)로 희석한 후, 0.5 M TEAB (15 ml)를 사용하여 세척하였다. 유기물질을 분리하고, Na₂SO₄ 상에서 건조한 후, 감압하에서 농축하고, 톨루엔을 사용하여 공동-증발시킨 후, 실리카 겔 크로마토그래피 (DCM + 1 ％ TEA/DCM, MeOH 10 ％, TEA 1 ％)에 의해 정제함으로써 표제 화합물을 산출하였다. 황색의 오일. 분자식 C₁₁H₂₀NO₆PS.

단계 5: {9-[(2R)2-C-메틸-β-D-에리트로-퓨라노실]-구아닌}-5'-일-O-(tert-부틸카르복시-tert-부틸-S-아실-2-티오에틸) H-포스포네이트

화합물 1-1에 대하여 기술된 바와 같은 절차에 따라 9-(2-C-메틸-β-D-리보퓨라노실)구아닌 및 S-(2-포스파이트-에틸)-2,2-디메틸-술파닐카르보닐 프로피온산 tert-부틸 에스테르 트리에틸아민 염으로부터 화합물 3-9를 합성하였다. 옅은 황색의 오일. 분자식 C₂₂H₃₄N₅O₁₀PS. 스캔 ES⁺ 592 (M+H)⁺.

단계 6: {9-[(2R)2-C-메틸-β-D-에리트로-퓨라노실]-구아닌}-5'-일-O-(tert-부틸카르복시-tert-부틸-S-아실-2-티오에틸) 벤질아민 포스포르아미데이트

사염화 탄소 (8.4 ml) 중 화합물 3-9 (0.84 mmol)의 교반 용액에 벤질아민 (8.4 mmol)을 적가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 EtOAc (100 ml)로 희석하고, 1 N HCl (50 ml)을 사용하여 세척하였다. 유기물질을 분리하고, Na₂SO₄ 상에서 건조한 후, 감압하에서 농축하였다. 조 물질을 실리카 겔 크로마토그래피 (메탄올/디클로로메탄)에 의해 정제함으로써 표제 화합물을 산출하였다. 백색의 고체. 분자식 C₂₉H₄₁N₆O₁₀PS. 스캔 ES⁺ 697 (M+H)⁺.

단계 7: {9-[(2R)2-C-메틸-β-D-에리트로-퓨라노실]-구아닌}-5'-일-O-(카르복시-tert-부틸-S-아실-2-티오에틸) 벤질아민 포스포르아미데이트

DCM (1 ml) 중 화합물 3-10 (0.07 mmol)의 교반 용액에 TFA (2.24 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반한 다음, TFA를 첨가하고 (1.12 mmol), 혼합물을 추가 1시간 동안 교반시켰다. 용매를 증발시켰다. 정제용 HPLC에 의해 조 물질을 정제함으로써 표제 화합물을 산출하였다. 백색의 고체. 분자식 C₂₅H₃₃N₆O₁₀PS.

실시예 5

[(2R)-2-메틸-β-D-리보퓨라노실]구아닌-N-벤질아미닐-5'-모노포스페이트 (염)

(화합물 2, 나트륨 염)

NH₃/MeOH (7 N) (10 ml) 중에서 실온으로 5시간 동안 화합물 1 (0.24 mmol)을 교반하였다. 혼합물을 증발시키고, 실리카 겔 크로마토그래피 (물/아세토니트릴)에 의해 수득된 잔류물을 정제한 후, 다우엑스 Na⁺ 수지 컬럼 상에서 물을 사용하여 용리함으로써, 동결건조 후 나트륨 염을 산출하였다.

백색의 고체. 분자식 C₁₈H₂₃N₆O₇P.

실시예 6

[(2R)-2-메틸-β-D-리보퓨라노실]구아닌 5'-디포스페이트

화합물 5-4 (0.276 mmol)를 Bu₃N (1.1 mmol)과 함께 물 (0.7 ml)에 용해시켰다. 혼합물을 감압하에서 농축하고, 피리딘을 사용하여 3회, 톨루엔을 사용하여 2회 공동-증발시켰다. DMF (2.25 ml)를 첨가하고, 이어서 1,1-카르보디이미다졸 (1.68 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 16시간 동안 교반한 후, TEAB (7 ml)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하고, 물 (중성 pH)로 가수분해한 후, 감압하에서 농축하였다. 조 물질을 세파덱스-DEAE-A25 5 (플루카(Fluka) 사) 컬럼을 통하여 TEAB로 용리하고, 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 수득된 백색의 분말을 다우엑스 Na⁺ 수지 컬럼 상에서 물을 사용하여 용리함으로써, 동결건조 후 나트륨 염을 산출하였다. 백색의 고체. 분자식 C₁₁H₁₅N₅Na₂O₁₁P₂.

실시예 7

[(2R)-2-메틸-β-D-리보퓨라노실]구아닌 5'-트리포스페이트 (나트륨 염)

0 ℃에서, 트리에틸포스페이트 (1 ml) 중 9-(2-C-메틸-β-D-리보퓨라노실)구아닌 (0.40 mmol)의 용액에 염화 포스포릴 (1.08 mmol)을 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 5 ℃에서 밤새 교반하였다. 트리부틸암모늄 피로포스페이트 (PPi/Bu₃N 1/1.5, 1 g, 2.19 mmol)를 무수 DMF (2 mL)에 용해시켰다. 이 용액 2.4 mL를 반응 혼합물에 첨가하였다. 다음에, 혼합물을 0 ℃에서 1분 동안 교반하였다. TEAB 1 M (pH = 7.5, 5 mL)을 사용하여 조심스럽게 반응을 중단하고, 0 ℃에서 20분 동안 교반한 다음, 물 및 에틸 아세테이트로 희석하였다. 수성 상을 감압하에서 농축하였다. 조 물질을 DEAE-세파덱스 크로마토그래피 (TEAB 용리)에 적용하였다. 원하는 분획을 합쳐, 감압하에서 농축하고, 물/메탄올의 혼합물을 사용하여 공동-증발시킨 후, 최종적으로 물을 사용하여 공동-증발시켰다. 생성되는 잔류물을 준-정제용 HPLC 상에서 정제하였다. 다우엑스 Na⁺ 수지 컬럼 상에서 물을 사용하여 상기 트리에틸암모늄 염 트리포스페이트를 3회 용리함으로써, 동결건조 후 나트륨 염을 산출하였다. 백색의 분말. 분자식 C₂₉H₆₃N₈Na₃O₁₄P₃.

실시예 8

O-(히드록실-tert-부틸-S-아실-2-티오에틸)-2'-C-메틸구아노신-5'-일 포스페이트

(나트륨 염)

화합물 1 (0.11 mmol)을 수성 1 N HCl에 용해시키고, 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압하에서 농축하였다. 수득된 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피 C18 (물/아세토니트릴을 사용하여 용리)에 의해 정제하고, 다우엑스 Na⁺ 수지 컬럼 상에서 물을 사용하여 용리함으로써, 동결건조 후 나트륨 염을 산출하였다. 백색의 분말.

실시예 9

P 부분입체이성질체 비 > 1.00:1.00을 가지는 조 화합물 1의 정제

역-상 크로마토그래피 (조제 베이커본드(Bakerbond) 40 ㎛ C-18 RP-실리카 - 100 ％ 아세토니트릴 내지 100 ％ H₂O 구배를 사용하여 세척)에 의해 조 화합물 1을 정제하였다. 상기 조물질을 테트라히드로퓨란, H₂O 및 포화 나트륨 비카르보네이트 수용액에 용해시켰다.

약한 진공하에서 하기의 단계적인 구배를 사용하여 용리하였음:

1.5 ％ MeCN/H₂O

5 ％ MeCN/H₂O

10 ％ MeCN/H₂O

15 ％ MeCN/H₂O

18 ％ MeCN/H₂O

20 ％ MeCN/H₂O

25 ％ MeCN/H₂O.

수회의 25 ％ MeCN 분획 후에, 순수한 화합물 1을 수득하였다. 화학적으로 순수한 분획 (> 1.00:1.00의 부분입체이성질체 혼합물)을 2-6 ℃에서 15시간 동안 저장하고, 그 시간 후 침전된 고체 (주로 부분입체이성질체 2)를 여과한 후, 32-38 ℃에서 진공하에 건조함으로써, 순수 부분입체이성질체 2 (부분입체이성질적 순도: 98 ％)를 산출하였다.

하기하는 방법 A를 사용하여 HPLC에 의해 고체의 화학적 순도를 조사하였다. 부분입체이성질적 순도는 키랄 HPLC 및 ³¹P NMR에 의해 조사하였다.

실시예 10

화합물 1 부분입체이성질체 1의 단리:

콤비플래시(CombiFlash) 정제 시스템 상에서 역상 컬럼 크로마토그래피 (C18 실리카 겔)을 사용하여 화합물 1 부분입체이성질체 1을 분리하였다. 부분입체이성질체의 혼합물 (1 g, 83/17 부분입체이성질체 2/1, 화학적 순도 = 97.3 ％)을 THF/물 (3:1, 4 ml)에 용해시켰다. 상기 용액을 예비-평형화 C18 컬럼 (재활용가능 RediSep RfC₁₈, 130 g)에 적재하고, 구배 메탄올/물 (40/60 내지 50/50, 유량 = 50 ml/분)을 사용하여 용리하였다. 먼저 용리되는 이성질체가 부분입체이성질체 1이었다. 상기 분획을 HPLC에 의해 화학적 순도 및 부분입체이성질체 1의 부분입체이성질적 순도에 대하여 조사하였다. 순수한 분획을 합쳐 진공에서 증발시킴으로써 부분입체이성질체 1을 산출하였다. 순량 = 290 mg; 화학적 및 부분입체이성질적 순도 모두 > 99 ％ (AUC, 각각 HPLC법 A 및 HPLC법 B).

HPLC법 A: 화학적 순도

컬럼: 조르박스 에클립스(Zorbax Eclipse) XDB-C8; 4.6×75 mm 3.5-마이크로미터

이동상 A: 아세토니트릴

이동상 B: 0.01 M 암모늄 아세테이트 버퍼, PH=4.4

컬럼 온도: 28 ℃

유량: 1.4 ml/분

검출: UV 254 nm, UV 272 nm

방법 B: 화합물 1 부분입체이성질체를 해상하기 위한 HPLC법

컬럼: 아길렌트 이클립스(Agilent Eclipse) XDB C₁₈; 4.6×l50 mm 5-마이크로미터

이동상 A: 메탄올

이동상 B: 물

유량: 1.0 ml/분

검출: UV 272 nm

체류 시간:

화합물 1, 부분입체이성질체 2: 16.5±0.5 분

화합물 1, 부분입체이성질체 1 : 14.4±0.5 분

도 1은 화합물 1의 2종 부분입체이성질체의 해상을 예시하는 HPLC 궤적 - 궤적 중 2개의 피크, 피크 1 및 피크 2는 화합물 1의 부분입체이성질체 1 및 2에 해당함 -을 제공한다.

실시예 11

A. 화합물 1의 제조

화합물 1은 1:1 비의 인 부분입체이성질체 혼합물로서 합성된다. 2'-C-메틸 구아노신으로부터 화합물 1로의 전체 단리 수율은 통상적으로 30-35 ％이다.

2'-C-메틸 구아노신을 아르곤하에 아세토니트릴에 현탁시키고, 무수 나트륨 술페이트 (2.5 당량)을 첨가하였다. 5분 동안 교반한 후, 벤젠보론산을 조금씩 첨가하고, 혼합물을 1시간 동안 환류하였다. ¹H-NMR (NMR 샘플 제조: 약 0.1 ml의 반응 분취량을 아르곤 흐름하에 송풍 건조하여 아세토니트릴을 제거하고, 잔류물을 d6-DMSO에 용해시킴)에 의한 반응 혼합물의 분석은 > 96:4의 생성물:개시 물질 비를 나타내었다.

2시간 환류 후, 혼합물을 아르곤하에서 25 ℃로 냉각하고, 추가적으로 무수 나트륨 술페이트 (1.0 당량)을 첨가하였다. 생성되는 혼합물을 직접 다음 단계에 사용하였다.

포스포네이트 10-3을 아세토니트릴 (526 mL)에 용해시키고, 아르곤하에서 2'-C-메틸 구아노신-보로네이트 10-2의 조 혼합물에 첨가하였다. 다음에, 이 혼합물을 아르곤하에서 5 ℃로 냉각하였다. 별도로, 피리딘을 아르곤하에서 염화 피발로일로 처리하고, 내부 온도를 8 ℃ 미만으로 유지하면서 생성되는 혼합물을 보로네이트-포스포네이트 반응 플라스크에 적가 (1.5시간 동안)하였다. 8 ℃에서 30분 동안 교반한 후의 HPLC (테스트20; 254 nm)에 의한 분석은 ~1.5:1의 P-H 생성물 대 2'-C-메틸 구아노신의 비를 나타내었다. 이후 50분 동안 상기 반응 혼합물을 점차적으로 14 ℃로 가온시켰는데, 그 시점에서의 HPLC (테스트20; 254 nm)에 의한 분석은 ~6.5:1의 P-H 생성물 대 2'-C-메틸 구아노신의 비를 나타내었다. 추가적인 PivCl은 첨가되지 않았다.

반응 내부 온도를 감소시킨 다음, 8 ℃ 미만으로 유지한 후, 벤질아민을 적가 (1시간)함으로써 진한 현탁액을 생성시켰다. 다음에, 내부 온도를 15 ℃ 미만으로 확실하게 유지하면서 15분에 걸쳐 사염화 탄소를 첨가하였다. 반응은 약간 발열성이었다. 15분 후의 HPLC (테스트20; 272 nm)에 의한 분석은 P-H 중간물의 완전한 소비 (Rt 5.26분) 및 생성물의 형성 (Rt 5.73분)을 나타내었다. 반응 혼합물을 아르곤하에서 4 ℃로 밤새 저장하였다.

TBME (3 L)를 첨가하고, 생성되는 혼합물을 시트르산 수용액 (22 ％ w/v, 9.3 L)에 부었다. 추가적인 TBME (4.4 L)를 사용하여 반응 용기를 세정하였다. 상기 2상 혼합물을 실온에서 45분 동안 교반함으로써 보로네이트의 파괴를 수행하였다. 수성 상에서 잔류 고체가 관찰되었으므로, 추가 1 L의 시트르산 용액을 첨가하여 적합한 상 분리를 수행하였다.

2개의 상을 분리하였는데, 수성 상은 HPLC 분석에 의해 pH 4이며 생성물이 없는 것으로 관찰되었다. 수성 나트륨 비카르보네이트 (5 ％ w/v; 4.7 L)를 사용하여 유기 층을 pH 8까지 염기성화하고, 포화 염수 (2 L)의 첨가 후 층을 분리하였다. HPLC 분석에 의해 수성 비카르보네이트 층에는 생성물이 없는 것으로 관찰되었다.

추가적인 TBME (7.4 L)를 유기 층에 첨가하여 생성물의 추가적인 침전을 유도하고, 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다.

진공하에서의 여과 및 이후의 HPLC 분석은 TBME 여과액 중의 소량의 생성물을 표시하였다. 물 (8 L, 여과액 중에 생성물 없음), TBME ( 4 L, 여과액 중에 무시할만한 생성물) 및 에탄올 (2 L, 여과액에서 생성물 관찰)을 사용하여 케이크를 세척하였다.

진공 오븐 (< 35 ℃)에서 드라이어라이트(Drierite) 흡수제를 사용하여 고체를 건조함으로써, 465 g의 옅은 황색 포스포르아미데이트 10-4를 산출하였다.

272 nm에서의 HPLC AUC 테스트20: 92 ％ - 포스포네이트 10-3의 배치로부터 유래하는 2종의 주요 불순물인 Rt 4.5분 (2.5 ％) 및 Rt 5.1분 (3.5 ％).

수율: 67 ％. ³¹P NMR 비 9.93 ppm:9.78 ppm = 1.1:1.0.

포스포르아미에디트 10-4를 아르곤하에서 무수 에탄올 (4.0 L)에 용해시켰다. 별도로, 아르곤하에서 염화 아세틸을 무수 에탄올 (600 mL)에 조심스럽게 - 고도로 발열성임 - 첨가하였다. 그렇게 생성된 에탄올 중 HCl의 용액을 포스포르아미데이트 용액에 첨가하였는데, 그에 의해 내부 온도는 18 ℃에서 20 ℃로 상승하였다. 추가 100 mL의 무수 에탄올을 사용하여 나머지 HCl 용액을 반응 혼합물에 세정 투입하였다.

상기 반응 혼합물을 30분 동안 60 ℃로 가열하였는데, 그 후의 HPLC 분석 (254 또는 272 nm에서의 테스트20)은 개시 물질의 주요 생성물 (Rt 3.32분)로의 완전한 전환 (Rt 5.7분)을 나타내었다.

총 45분의 반응 시간 후, 혼합물을 25-30 ℃로 냉각하고, 고체 나트륨 비카르보네이트 (2.3 Kg)을 첨가한 후, 1시간 동안 교반하면서 내부 온도를 25-30 ℃로 유지하였다. pH 컬러패스트(Colorfast) 표지 스트립을 사용하여 pH를 모니터링하였는데, pH는 5-6인 것으로 확인되었다.

상기 혼합물을 셀라이트를 통하여 여과하고, 에탄올 (4 L) 및 테트라히드로퓨란 (1.5 L)으로 세척하였다. 여과액을 35 ℃에서 진공하에 농축하여 고체 (356 g)를 산출하였다.

35 ℃에서 15분 동안의 TBME (1.5 L)를 사용한 연화(trituration)에 의해 트리틸 부산물을 제거함으로써 고체를 산출하고, 그것을 여과한 후, TBME (750 ml)로 세척하고 건조하여 조 10-5 (268 g; 78 ％ 272 nm에서의 HPLC 테스트20 AUC)를 생성시켰다. 여과액에서는 HPLC 분석에 의해 생성물이 관찰되지 않았다.

역-상 크로마토그래피 (3 Kg의 조제 베이커본드 40 ㎛ C-18 RP-실리카 - 100 ％ 아세토니트릴 내지 100 ％ H₂O 구배를 사용하여 세척)에 의해 268 g의 조 화합물 1을 정제하였다. 상기 조물질을 테트라히드로퓨란 (225 mL), H₂O (75 mL) 및 포화 나트륨 비카르보네이트 수용액 (75 mL)에 용해시켰다. 135 g 수득, 272 nm에서의 HPLC 테스트20 AUC에서 > 98 ％ 순도 (59 ％ 수율).

통상적인 분석 데이터는 하기에 나타내었다:

화합물 1: C₂₅H₃₅N₆O₉PS 626.62 g몰^-1

HPLC AUC (방법 테스트20): 272 nm에서 99 ％, Rt 3.32분

B. 화합물 1 부분입체이성질체 2의 제조

절차 1

화합물 1 (부분입체이성질체의 혼합물)의 합성 - 염화 아세틸/에탄올 매개 탈-트리틸화 반응:

무수 에탄올 (3.3 L) 중 화합물 10-4 (229.0 g, 264 mmol, 89 ％ 순도, 부분입체이성질체 비 2:1 TrO-A:TrO-B)의 현탁액에 첨가 깔때기를 통하여 5분의 기간에 걸쳐 염화아세틸 (37.5 ml, 527 mmol)을 첨가하였다. 생성되는 혼합물을 가열 맨틀 상에서 60 ℃로 가열하고, 60 ℃에서 1시간 동안 유지하였다. HPLC가 반응이 완료되었음을 나타내었다 (방법 A, AUC, 272 nm, 0.5 ％ 미만의 화합물 10-4만이 검출되었음).

후처리: 반응 혼합물을 얼음 배스에서 28 ℃로 냉각하고; 무수 나트륨 술페이트 (65 g)를 첨가하였다. 다음에, 냉각 배스를 제거하였다. 나트륨 비카르보네이트 분말 (1.2 kg)을 1시간의 기간에 걸쳐 조금씩 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였는데; 혼합물의 pH는 ~7이었다. 다음에, 불용성 고체를 진공 여과에 의해 제거하였다. 여과 케이크를 에탄올 (700 ml) 및 THF (700 ml)로 세척하였다. 여과액을 회전증발기(rotavap)에서 약 200 ml의 부피로 농축하였다. 잔류물에 tert-부틸 메틸 에테르 (TBME) (1 L)를 충전하였다. 점강성의 고체가 용액으로부터 침강하여 플라스크의 측면에 부착되었다. 다음에, 혼합물을 밤새 냉장실 (4 ℃)에 방치시켰다.

상기 혼합물로부터 TBME를 따라내었다. 추가 TBME (200 ml)를 첨가하여 5분 동안 회전시킴으로써 잔류 고체를 세척하였다. TBME를 따라내고 조물질을 산출하였다.

화합물 1 부분입체이성질체 2의 단리/정제:

상기 조 물질을 THF (520 ml) 및 물 (30 ml)에 현탁시켰다. 소량 (약 5 ml)의 포화 나트륨 비카르보네이트 용액을 첨가하여 pH를 7.5 (개시 pH = 6, pH 페이퍼)로 조정하였다. 혼합물을 원형저 플라스크에서 15분 동안 주변으로 회전시켰다. 추가 THF (280 ml)를 혼합물에 첨가하였다. 5분 동안의 교반 후, 진공 여과에 의해 고체를 수집하였다. 여과 케이크를 THF (120 ml) 및 물 (140 ml)로 세척하고, 진공 오븐에서 40 ℃로 건조하였다. 화합물 1 부분입체이성질체 2를 백색의 고체로서 수득하였다. 순량 = 55.0 g, 화학적 순도 = 97 ％ (AUC, HPLC법 A, 실시예 10 참조); 부분입체이성질적 순도 = 97.7 ％ (AUC, HPLC).

절차 2

무수 에탄올 (2.46 L) 중 화합물 10-4 (231.0 g, 266 mmol, 90 ％ 순도, 부분입체이성질체 비 2.3:1 TrO-A: TrO-B)의 현탁액에 첨가 깔때기를 통하여 5분의 기간에 걸쳐 염화아세틸 (37.8 ml, 530 mmol)을 첨가하였다. 생성되는 혼합물을 가열 맨틀 상에서 60 ℃로 가열하고, 60 ℃에서 1시간 동안 유지하였다. HPLC 결과가 반응이 완료되었음을 나타내었다 (방법 A, AUC, 272 nm, 1.5 ％ 미만의 화합물 10-4만이 검출되었음).

후처리: 반응 혼합물을 얼음 배스에서 30 ℃로 냉각하고; 무수 나트륨 술페이트 (70 g)를 첨가하였다. 다음에, 냉각 배스를 제거하였다. 나트륨 비카르보네이트 분말 (2.0 kg)을 1시간의 기간에 걸쳐 조금씩 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였는데; 혼합물의 pH는 6~7이었다. 다음에, 불용성 고체를 진공 여과에 의해 제거하였다. 여과 케이크를 에탄올 (600 ml) 및 THF (600 ml)로 세척하였다. 여과액을 회전증발기(rotavap)에서 약 200 ml의 부피로 농축하였다. 잔류물에 TBME (1 L)를 충전하고, 혼합물을 워터 배스에서 35 ℃로 30분 동안 회전시켰다. 점강성의 고체가 용액으로부터 침강하여 플라스크의 측면에 부착되었다. 다음에, 혼합물을 밤새 냉장실 (4 ℃)에 방치시켰다.

상기 혼합물로부터 TBME를 따라내었다. 추가 TBME (400 ml)를 첨가하여 5분 동안 회전시킴으로써 잔류 고체를 세척하였다. TBME를 따라내고 조물질을 산출하였다.

화합물 1 부분입체이성질체 2의 단리/정제:

상기 조 물질을 THF (400 ml) 및 물 (40 ml)에 현탁시켰다. 소량 (약 7 ml)의 포화 나트륨 비카르보네이트 용액을 첨가하여 pH를 7.5 (개시 pH = 6, pH 페이퍼)로 조정하였다. 혼합물을 원형저 플라스크에서 30분 동안 교반하였다. 진공 여과에 의해 고체를 수집하였다. 추가 THF (200 ml)를 혼합물에 첨가하여, 물질의 전달을 촉진하였다. 여과 케이크를 THF (40 ml) 및 물 (100 ml)로 세척하고, 진공 오븐에서 40 ℃로 건조하였다. 화합물 1 부분입체이성질체 2를 백색의 고체로서 수득하였다. 순량 = 50.0 g, 화학적 순도 = 97 ％ (AUC, HPLC법 A, 실시예 10 참조); 부분입체이성질적 순도 = 94 ％. 상기 물질을 하기와 같이 추가적으로 정제하였다: 아세토니트릴/물 (50 ml/450 ml)을 사용하여 연화함으로써, 부분입체이성질체 순도를 향상시키고; THF/물 (3:1, 360 ml)에 용해시킨 후, 셀라이트 패드를 통하여 여과함으로써 극성 불순물을 제거하고 (RT = 0.7분, HPLC법 A); 아세토니트릴/물 (50 ml/450 ml)을 사용하여 2차 연화함으로써, 1H-NMR에 의해 관찰된 미지의 불순물 (δ = 11.7 ppm)을 제거하였음. 화학적 순도 및 부분입체이성질적 순도 모두 > 99 ％로, 최종 순수 부분입체이성질체 2를 수득하였다. 순량 = 38.5 g.

실시예 12

{9-[(2R)2-C-메틸-β-D-리보-퓨라노실]-구아닌}-5'-일-O-(트리페닐메틸옥시-tert-부틸-S-아실-2-티오에틸) H-포스포네이트, 화합물 11-1

-15 ℃에서, 피리딘 (75 ml) 중 9-(2-C-메틸-β-D-리보퓨라노실)구아닌 (4.87 mmol) 및 S-(2-포스파이트-에틸) 2,2-디메틸-3-트리페닐메틸옥시-티오프로피오네이트 트리에틸아민 염 (6.34 mmol)의 용액에 질소하에서 염화 피발로일 (9.74 mmol)을 적가하였다. 반응 혼합물을 -15 ℃에서 2시간 동안 교반하였다. 디클로로메탄 및 NH₄Cl 용액을 첨가하였다. 유기 상을 분리하여, NH₄Cl 용액으로 세척하고, Na₂SO₄ 상에서 건조한 후, 여과하여, 감압하에서 농축하였다. 조 물질을 실리카 겔 크로마토그래피 (DCM/MeOH)에 의해 정제함으로써 표제 화합물 11-1을 산출하였다. 분자식: C₃₇H₄₂N₅O₉PS.

화합물 11-2a

{9-[(2R)2-C-메틸-β-D-리보-퓨라노실]-구아닌}-5'-일-O-(트리페닐메틸옥시-tert-부틸-S-아실-2-티오에틸) 이소프로필 포스포르아미데이트

사염화 탄소 (10 ml) 중 화합물 11-1 (0.98 mmol)의 용액에 이소프로필아민 (4.9 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 휘발성물질을 진공체서 증발시켰다. 수득된 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피 (DCM/MeOH)에 의해 정제함으로써 표제 화합물을 산출하였다. 베이지색의 고체. 분자식: C₄₀H₄₉N₆O₉PS. 스캔 ES⁺ 821 (M+H)⁺.

화합물 11-3a

{9-[(2R)2-C-메틸-β-D-리보-퓨라노실]-구아닌}-5'-일-O-(히드록시-tert-부틸-S-아실-2-티오에틸)-N-이소프로필 포스포르아미데이트

디클로로메탄 (2 ml) 중 화합물 11-2a (0.5 mmol)의 용액을 트리플루오로 아세트산 (160 ㎕)과 함께 실온에서 15분 동안 교반하였다. 다음에, 혼합물을 실리카 겔 크로마토그래피 (DCM/MeOH)에 의해 정제함으로써 표제 화합물을 산출하였다. 백색의 분말. 분자식: C₂₁H₃₅N₆O₉PS.

화합물 11-2b

{9-[(2R)2-C-메틸-β-D-리보-퓨라노실]-구아닌}-5'-일-O-(트리페닐메틸옥시-tert-부틸-S-아실-2-티오에틸) 모르폴리닐 포스포르아미데이트

화합물 11-2a에 대하여 기술되어 있는 바와 같은 절차에 따라, 화합물 11-1 및 모르폴린으로부터 화합물 11-2b를 합성하였다. 베이지색의 고체. 분자식 C₄₁H₄₉N₆O₁₀PS. 스캔 ES⁺ 849 (M+H)⁺.

화합물 11-3b

3-히드록시-2,2-디메틸-티오프로피온산-S-{[9-[(2R)2-C-메틸-β-D-리보-퓨라노실]-구아닌-5'-일]-[(모르폴린-1-일)-포스피노일옥시]-에틸} 에스테르

화합물 11-3a에 대하여 기술되어 있는 바와 같은 절차에 따라, 화합물 11-2b로부터 화합물 11-3b를 합성하였다. 백색의 분말. 분자식: C₂₂H₃₅N₆O₁₀PS.

화합물 11-2c

{9-[(2R)2-C-메틸-β-D-리보-퓨라노실]-구아닌}-5'-일-O-(트리페닐메틸옥시-tert-부틸-S-아실-2-티오에틸) tert-부틸 포스포르아미데이트

화합물 11-2a에 대하여 기술되어 있는 바와 같은 절차에 따라, 화합물 11-1 및 tert-부틸아민으로부터 화합물 11-2c를 합성하였다. 베이지색의 고체. 분자식: C₄₁H₅₁N₆O₉PS. 스캔 ES⁺ 835 (M+H)⁺.

화합물 11-3c

{9-[(2R)2-C-메틸-β-D-리보-퓨라노실]-구아닌}-5'-일-O-(히드록시-tert-부틸-S-아실-2-티오에틸)-N- tert-부틸 포스포르아미데이트

화합물 11-3c에 대하여 기술되어 있는 바와 같은 절차에 따라, 화합물 11-2c로부터 화합물 11-3c를 합성하였다. 백색의 분말. 분자식: C₂₂H₃₇N₆O₉PS.

화합물 11-2d

{9-[(2R)2-C-메틸-β-D-리보-퓨라노실]-구아닌}-5'-일-O-(트리페닐메틸옥시-tert-부틸-S-아실-2-티오에틸) N-메틸피페라질 포스포르아미데이트

화합물 11-2a에 대하여 기술되어 있는 바와 같은 절차에 따라, 화합물 11-1 및 N-메틸피페라진으로부터 화합물 11-2d를 합성하였다. 베이지색의 고체. 분자식: C₄₂H₅₂N₇O₉PS. 스캔 ES⁺ 862 (M+H)⁺.

화합물 11-3d

3-히드록시-2,2-디메틸-티오프로피온산-S-{[9-[(2R)2-C-메틸-β-D-리보-퓨라노실]-구아닌-5'-일]-[(4-메틸-피페라진-1-일)-포스피노일옥시]-에틸} 에스테르

화합물 11-3a에 대하여 기술되어 있는 바와 같은 절차에 따라, 화합물 11-2d로부터 화합물 11-3d를 합성하였다. 백색의 분말. 분자식: C₂₃H₃₈N₇O₉PS.

화합물 11-2e

{9-[(2R)2-C-메틸-β-D-리보-퓨라노실]-구아닌}-5'-일-O-(트리페닐메틸옥시-tert-부틸-S-아실-2-티오에틸) 아세트산-에틸-에스테르 포스포르아미데이트

화합물 11-2a에 대하여 기술되어 있는 바와 같은 절차에 따라, 화합물 11-1 및 글리신 에틸-에스테르로부터 화합물 11-2e를 합성하였다. 베이지색의 고체. 분자식: C₄₁H₄₉N₆O₁₁PS. 스캔 ES⁺ 864 (M+H)⁺.

화합물 11-3e

{9-[(2R)2-C-메틸-β-D-리보-퓨라노실]-구아닌}-5'-일-O-(히드록시-tert-부틸-S-아실-2-티오에틸)-N-아세트산-에틸-에스테르 포스포르아미데이트

화합물 11-3a에 대하여 기술되어 있는 바와 같은 절차에 따라, 화합물 11-2e로부터 화합물 11-3e를 합성하였다. 백색의 분말. 분자식: C₂₂H₃₅N₆O₁₁PS.

화합물 11-2f

{9-[(2R)2-C-메틸-β-D-리보-퓨라노실]-구아닌}-5'-일-O-(트리페닐메틸옥시-tert-부틸-S-아실-2-티오에틸)-아세트산-tert-부틸 에스테르 포스포르아미데이트

화합물 11-2a에 대하여 기술되어 있는 바와 같은 절차에 따라, 화합물 11-1 및 글리신 tert-부틸-에스테르로부터 화합물 11-2f를 합성하였다. 베이지색의 고체. 분자식: C₄₃H₅₃N₆O₁₁PS. 스캔 ES⁺ 893 (M+H)⁺.

화합물 11-3f

{9-[(2R)2-C-메틸-β-D-리보-퓨라노실]-구아닌}-5'-일-O-(히드록시-tert-부틸-S-아실-2-티오에틸)-N-아세트산-tert-부틸-에스테르 포스포르아미데이트

화합물 11-3a에 대하여 기술되어 있는 바와 같은 절차에 따라, 화합물 11-2f로부터 화합물 11-3f를 합성하였다. 백색의 분말. 분자식: C₂₄H₃₉N₆O₁₁PS.

화합물 11-2g

{9-[(2R)2-C-메틸-β-D-리보-퓨라노실]-구아닌}-5'-일-O-(트리페닐메틸옥시-tert-부틸-S-아실-2-티오에틸)-디메틸아미노-에틸 포스포르아미데이트

화합물 11-2a에 대하여 기술되어 있는 바와 같은 절차에 따라, 화합물 11-1 및 디메틸-아미노-에틸아민으로부터 화합물 11-2g를 합성하였다. 분자식: C₄₁H₅₇N₇O₉PS. 스캔 ES⁺ 850 (M+H)⁺.

화합물 11-3g

{9-[(2R)2-C-메틸-β-D-리보-퓨라노실]-구아닌}-5'-일-O-(히드록시-tert-부틸-S-아실-2-티오에틸)-N-디메틸-아미노-에틸 포스포르아미데이트

화합물 11-3a에 대하여 기술되어 있는 바와 같은 절차에 따라, 화합물 11-2g로부터 화합물 11-3g를 합성하였다. 백색의 분말. 분자식: C₂₂H₃₈N₇O₉PS.

화합물 11-3h

{9-[(2R)2-C-메틸-β-D-리보-퓨라노실]-구아닌}-5'-일-O-(히드록시-tert-부틸-S-아실-2-티오에틸)-N-아세트산 포스포르아미데이트

디클로로메탄 (2 ml) 중 화합물 11-3f (0.16 mmol)의 용액에 TFA (35 당량)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 50 ℃에서 30분 동안, 및 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 다음에, 혼합물을 증발시키고, 실리카 겔 크로마토그래피 (DCM/MeOH)에 의해 정제함으로써 표제 화합물을 산출하였다. 백색의 분말. 분자식: C₂₀H₃₁N₆O₁₁PS.

실시예 13

화합물 1, 부분입체이성질체 1 및 부분입체이성질체 2의 생물학적 활성

하기하는 바와 같은 효소-연관 면역흡착 분석 (ELISA) 및 루시퍼라제 분석에 의해 NS4A 단백질의 발현을 모니터링함으로써, 화합물 1, 부분입체이성질체 1 및 부분입체이성질체 2의 생물학적 활성을 측정하였다.

루시퍼라제 레플리콘 분석

HCV 루시퍼라제 레플리콘(replicon) 분석은 HCV 유전형 1b 레플리콘 및 루시퍼라제-네오마이신 포스포트랜스퍼라제 융합 유전자를 보유하는 인간 간암 세포주 (Huh-7)에서의 처리 3일 후에 세포 배양에서 HCV 복제를 억제하는 시험 화합물의 능력을 측정한다. HCV 복제의 억제는 루시퍼라제 단백질 발현의 정량에 의해 측정하였다. 상기 HCV 루시퍼라제 레플리콘은 ZS11 HCV 레플리콘 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자의 아미노 말단에 루시퍼라제 유전자를 융합시킴으로써 구성하였다. 상기 ZS11 HCV 레플리콘 (문헌 [Zhu Q, Guo J-T, and Seeger C, 2003])은 SP1 레플리콘으로부터 유래하나, 3종의 세포 배양-적합화 돌연변이를 함유하고 있다: E1202G (NS3), S2204I (NS5A), 및 D2254E (NS5A). 이들 돌연변이는 효율적인 시험관내 복제를 가능케 한다. 상기 루시퍼라제 리포터 유전자는 pGL4.13[luc2/SV40] 벡터 (프로메가(Promega) Corp. 사)로부터 증폭하였다. 루시퍼라제-네오마이신 융합으로부터 생성되는 레플리콘 (ZS11-LUC)을 Huh-7 세포에 안정하게 핵산전달감염시킴으로써 Zluc 세포주를 생성시켰다.

루시퍼라제 레플리콘 분석은 하기와 같이 요약된다: 고체 백색 96-웰 조직 배양 플레이트 (BD 팔콘(Falcon) 사)에 Zluc 세포를 접종하였다. 배지 중에서 2×-농축된 모액으로서 새로 항바이러스 화합물 용액을 제조하였다. 배지 중에서 이 모액으로부터 8회의 추가적인 3-배 약물 희석액을 제조하여, 총 9종의 희석액을 제조하였다. Zluc 세포를 접종한지 적어도 4시간 후, 조직 배양 플레이트에서 1부피의 세포/배지에 1부피의 각 2×-농축 약물 희석액을 첨가함으로써, 약물 처리를 개시하였다. 다음에, 37 ℃/5 ％ CO₂에서 3일 동안 세포를 배양하였다.

다음에, 배지/화합물을 플레이트로부터 제거하고, ONE-glo-루시퍼라제 분석 시약 (프로메가 사)을 각 웰에 첨가하였다. 분석 플레이트를 실온에서 3분 동안 진탕한 후, 빅터(Victor)³V 멀티라벨 계수기 상에서 700 nm 컷-오프 필터 (퍼킨 엘머 사)를 사용하여 1초의 해독 시간으로 각 웰에 있어서의 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 마이크로소프트 엑셀 및 XLfit 4.1 소프트웨어에 의해 측정되는 생성 최적-피트 방정식으로부터의 투여량 응답 곡선에서 EC₅₀ 값을 계산하였다.

HCV 레플리콘 분석 (NS4A ELISA)

HCV 레플리콘 분석은 HCV 유전형 1b 레플리콘을 보유하는 인간 간암 세포주 (Huh-7) (GS4.1 세포)에서의 처리 3일 후에 세포 배양에서 HCV 복제를 억제하는 시험 화합물의 능력을 측정한다. HCV 복제의 억제는 효소-연관 면역흡착 분석 (ELISA)를 사용한 바이러스 NS4A 단백질의 정량에 의해 측정하였다. 상기 GS4.1 세포주 (문헌 [Zhu, Guo and Seeger 2003])는 Huh-7 인간 간 세포주로부터 유래하는 것으로써, EMCV IRES 프로모터의 조절하에 HCV 주 con1, 유전형 1b로부터의 비구조 단백질 NS3 내지 NS5B를 함유하는 2시스트론 SP1 ΔS HCV 레플리콘을 안정적으로 보유한다. 또한, 상기 레플리콘은 HCV 프로모터의 조절하에 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자를 함유한다 (출처: 펜실베이니아 필라델피아 소재 폭스 체이스 캔서 센터(Fox Chase Cancer Center)의 Dr. 크리스토프 시거(Christoph Seeger)).

NS4A ELISA 분석은 하기와 같이 요약된다. 96-웰 조직 배양 플레이트에 GS4.1 세포를 접종하였다. 배지 중에서 2×-농축된 모액으로서 새로 항바이러스 화합물 용액을 제조하였다. 배지 중에서 이 모액으로부터 8회의 추가적인 3-배 약물 희석액을 제조하여, 총 9종의 희석액을 제조하였다. GS4.1 세포를 접종한지 적어도 4시간 후, 조직 배양 플레이트에서 1부피의 세포/배지에 1부피의 각 2×-농축 약물 희석액을 첨가함으로써, 약물 처리를 개시하였다. 다음에, 37 ℃/5 ％ CO₂에서 3일 동안 세포를 배양하였다.

다음에, 배지/화합물을 플레이트로부터 제거하고, 아세톤:메탄올을 사용하여 세포를 고정한 후, 세척 용액으로 3회 세척한 다음, 평형 염 용액 중에서 10 ％ 소 태아 혈청을 사용하여 1시간 동안 블로킹하였다. 세포를 3회 세척한 후, 항-C형 간염 NS4A 단일클론 항체 (비로겐(Virogen) Corp. 사)를 사용하여 37 ℃에서 2시간 동안 배양하였다. 세포를 3회 세척한 후, 양고추냉이 퍼옥시다제 접합 염소 항-마우스 항체 (자이메드(Zymed) 사)를 사용하여 37 ℃에서 1시간 동안 배양하였다. 이후, 세포를 3회 세척한 후, 어둠 속에서 오르소-페닐렌디아민 (자이메드 사) 및 과산화수소 (EMD 바이오사이언스(Biosciences) 사)를 함유하는 용액에 30분 동안 노출시켰다. 묽은 황산 (말린크로트 케미칼즈(Mallinckrodt Chemicals) 사)을 사용하여 반응을 중지시키고, 빅터³V 1420 멀티라벨 계수기 (퍼킨 엘머 사)에서 흡광도를 측정하였다. 마이크로소프트 엑셀 및 XLfit 4.1 소프트웨어에 의해 측정되는 생성 최적-피트 방정식으로부터의 투여량 응답 곡선에서 EC₅₀ 값을 계산하였다.

세포독성 분석

세포독성 분석은 GS4.1 세포 또는 Zluc 세포 중 어느 것에서의 3일 동안의 시험 화합물을 사용한 처리 후의 세포의 생존력을 측정한다. 분석의 해독정보는 황색 MTS 테트라졸륨 화합물의 자주색 포르마잔 생성물로의 생체환원이다. 이와 같은 전환은 NADPH 또는 NADH에 의해 매개되며, 배양물 중 생존 세포의 수에 직접적으로 비례한다. 세포독성 분석은 하기와 같이 요약된다. 96-웰 조직 배양 플레이트에 GS4.1 또는 Zluc 세포를 접종하였다. 배지 중에서 2×-농축된 모액으로서 새로 항바이러스 화합물 용액을 제조하였다. 배지 중에서 이 모액으로부터 8회의 추가적인 3-배 약물 희석액을 제조하여, 총 9종의 희석액을 제조하였다. 세포를 접종한지 적어도 4시간 후, 조직 배양 플레이트에서 1부피의 세포/배지에 1부피의 각 2×-농축 약물 희석액을 첨가함으로써, 약물 처리를 개시하였다. 다음에, 37 ℃/ 5 ％ CO₂에서 3일 동안 세포를 배양하였다. 처리 3일 후, 각 웰에 MTS 용액을 첨가함으로써, 셀타티터(CellTiter) 96^® 수성 1용액 세포 증식 분석(Aqueous One Solution cell proliferation assay) (프로메가 사)을 수행하였다. 다음에, 플레이트를 37 ℃/ 5 ％ CO₂에서 3.5시간 동안 배양하였다. 다음에, 빅터³V 1420 멀티라벨 계수기 (퍼킨 엘머 사)에서 해독하고, 마이크로소프트 엑셀 및 XLfit 4.1 소프트웨어를 사용하여 CC₅₀ 농도를 측정하였다.

실시예 14

래트, 원숭이 및 인간 간 마이크로좀 분획에서의 화합물 1의 시험관내 대사 특성

본 연구에서 사용된 시험 화합물은 하기였다: 화합물 1, 순도 > 95 ％, 화합물 4, 순도 > 95 ％; 화합물 3, 순도 90 ％ 및 화합물 2, 순도 80 ％.

저장 조건 - 시험 화합물은 광으로부터 보호되는 4 내지 8 ℃에 저장하였으며, DMSO 모용액은 -20 ℃에 저장하였다.

하기의 간 세포하 분획을 연구에 사용하였다.

<표 1>

<표 2>

하기의 반응물들을 연구에 사용하였다:

NADPH 재생성 시스템 용액 A: NADP+ + 글루코스-6-포스페이트 및 용액 B: 매사추세츠 워번 소재 BD 젠테스트(Gentest) 사의 글루코스-6-포스페이트 데히드로제나제; 매사추세츠 워번 소재 BD 젠테스트 사의 케토코나졸; 디메틸 술폭시드 (DMSO), 미주리 세인트 루이스 소재 시그마-알드리치 사의 돼지 간 에스테라제 및 알칼라인 포스파타제; 펜실베이니아 피츠버그 소재 피셔 사이언티픽 사의 일염기성 칼륨 포스페이트 (K₂HPO₄); 미시간 머스케곤 소재 버딕 앤드 잭슨(Burdick and Jackson) 사의 메탄올 및 아세토니트릴; 하기와 같이 제조된 0.2 M 칼륨 포스페이트 버퍼, pH 7.4: 버퍼 100 ml를 위하여, 19 mL의 용액 A (13.6 g KH₂PO₄/0.5 L)를 81 mL의 용액 B (17.4 g K₂HPO₄/0.5 L)와 혼합. pH 조정제는 필요치 않음.

모 화합물 1이 소비되는 것을 사용하여 그의 시험관내 대사를 평가하였다. 변화하지 않는 화합물 1의 상대적인 농도는 HPLC-UV법 1에 의해 측정하였다. 잔류 화합물 1은 시간 0 또는 대조와의 백분율 차이로 기록하였다. HPLC-UV 시스템은 하기와 같았다:

방법 1

HPLC: 아길렌트 1100

컬럼: 페노메넥스 루나(Phenomenex Luna) C18(2), 250×4.6 mm

예비컬럼: 페노메넥스 시큐리티가드(SecurityGuard) C18 카트리지 4×2 mm

이동 상 (MP): (MPA) 10 mM K₂HPO₄ pH 5; (MPB) ACN

구배 용리: 5 내지 60 ％ MPB 전개 0 내지 15 분

전개시간: 15 분

후시간: 6 분

유량: 1 mL/분

주입 부피: 20 μL

UV: 252 nm

하기의 HPLC-UV법을 사용하여 관찰된 대사물의 체류 시간을 화학적으로 합성된 표준에 의해 수득되는 체류 시간과 비교함으로써, 추정 대사물의 예비 확인을 수행하였다:

방법 2

컬럼: 페노메넥스 루나 C18(2), 250×4.6 mm

예비컬럼: 페노메넥스 시큐리티가드 C18 카트리지 4×2 mm

이동상 (MP): (MPA) 10 mM K₂HPO₄ pH 5; (MPB) MeOH

구배 용리: 시간 (분) ％MPB

0 5

15 30

20 30

30 45

전개시간: 60 분

후시간: 6 분

유량: 1 mL/분

주입 부피: 20 μL

UV: 252 nm

방법 2에 의해 수득되는 화합물 1 (부분입체이성질체 1 및 2) 및 대사물 표준의 대표적인 HPLC 크로마토그램을 도 2에 제공하였다.

간 마이크로좀 및 세포질액에서의 화합물 1 안정성

배양 시점 당 0.1 mL의 최종 부피에서 간 마이크로좀 또는 세포질액을 사용한 배양을 수행하였다. 배양 버퍼 (0.1 M 칼륨 포스페이트, pH 7.4, 5 mM MgCl₂, 및 0.1 mM EDTA)에 현탁된 혼합(pooled) 마이크로좀 단백질 (1.0 mg/mL)을 사용하여, DMSO 중 모 용액으로부터의 화합물 1 10 μM (최종 DMSO 농도는 0.1 ％이었음)을 37 ℃에서 0-60분 동안 배양하였다. NADPH (3 mM의 최종 농도)의 첨가에 의해 마이크로좀 반응을 개시하였다. (a) 단백질이 없거나, (b) NADPH가 없는 배양을 대조로서 사용하였다. 중지 용액 (아세토니트릴) 0.2 mL의 첨가에 의해 반응을 종결하였다. 샘플을 30초 동안 보르텍싱-혼합한 다음, 10,000×g로 10분 동안 원심분리하였다. 라브콩코 센트리바프(Labconco CentriVap) 농축기를 사용하여 상청액을 건조하고, 건조한 잔류물을 물에 재구성한 후, HPLC 유리 바이알로 옮겨 HPLC-UV법 1 (상기하였음)에 의해 분석하였다.

결과: 간 마이크로좀에서의 화합물 1 대사의 범위는 시간 경과에 따른 그의 고갈을 평가함으로써 측정하였으며, 백분율 (％) 잔류 화합물 1로 기록하였다 (표 3). 유의성 있는 NADPH-의존성 대사가 관측되었다: 원숭이에서 30분 이내에 100 ％, 그리고 래트 및 인간에서 60분 이내에 각각 64 및 66 ％. 실질적인 NADPH-비의존성 대사 역시 원숭이에서 관측되었는데, 60분 후에 대략 60 ％의 변화하지 않은 화합물 1이 남아 있었다.

<표 3>

CYP3A4 억제

배양 시점 당 0.1 mL의 최종 부피에서 배양을 수행하였다. 배양 버퍼 (0.1 M 칼륨 포스페이트, pH 7.4)에 현탁된 혼합(pooled) 래트 (1 mg/mL), 원숭이 (0.5 mg/mL) 또는 인간 (1.0 mg/mL) 간 마이크로좀을 케토코나졸 또는 리토나비르 (0.1 및 1 μM)의 존재하에 10 μM의 화합물 1과 함께 배양하였다. 최종 용매 (DMSO 또는 메탄올) 농도는 0.2 ％로 유지하였다. NADPH 재생 시스템 (1.3 mM NADP⁺, 3.3 mM 글루코스-6-포스페이트, 0.4 U/ml 글루코스-6-포스페이트 데히드로제나제, 및 3.3 mM MgCl₂, 최종 농도)의 첨가에 의해 반응을 개시하였다. 억제제가 없는 배양을 대조로서 사용하였다. 중지 용액 (아세토니트릴) 0.2 mL의 첨가에 의해 30분 (원숭이) 또는 60분 (래트 및 인간)에 반응을 종결하였다. 샘플을 30초 동안 보르텍싱-혼합한 다음, 10,000×g로 10분 동안 원심분리하였다. 라브콩코 센트리바프 농축기를 사용하여 상청액을 건조하고, 건조한 잔류물을 물에 재구성한 후, HPLC 유리 바이알로 옮겨 HPLC-UV법 1 (상기하였음)에 의해 분석하였다.

배양 버퍼 (0.1 M 칼륨 포스페이트, pH 7.4, 5 mM MgCl₂, 및 0.1 mM EDTA)에 현탁시켜 케토코나졸 또는 리토나비르 (0.1 및 1 μM)의 존재하에 50 μM 테스토스테론 (CYP3A4 마커 기질)으로 배양한 혼합 인간 (0.25 mg/mL) 간 마이크로좀을 사용하여 추가적인 대조 배양을 수행하였다. 최종 용매 (DMSO 또는 메탄올) 농도는 0.2 ％로 유지하였다. NADPH (3 mM의 최종 농도)의 첨가에 의해 반응을 개시하였다. 억제제가 없는 배양을 대조로서 사용하였다. 15분 후에 중지 용액 (아세토니트릴) 0.2 mL의 첨가에 의해 반응을 종결하였다. 샘플을 30초 동안 보르텍싱-혼합한 다음, 10,000×g로 10분 동안 원심분리하였다. 상청액을 HPLC 유리 바이알로 옮기고, HPLC-UV에 의해 분석하였다.

결과: 2종의 CYP3A4 억제제인 케토코나졸 및 리토나비르를 사용하여 화합물 1의 NADPH-의존성 대사에서의 CYP3A4의 잠재적인 역할을 평가하고, 결과를 표 4에 요약하였다.

<표 4>

화합물 1은 원숭이 간 마이크로좀에서 신속하에 대사되므로, 단백질 농도를 0.5 mg/mL로, 배양 시간을 30분으로 감소시킴으로써, 배양 조건을 조정하였다. 래트 및 인간에 대한 배양 조건은 변화하지 않았는데; 단백질은 1 mg/mL이었으며, 배양 시간은 60분이었다. 3종의 종 모두에서 1 μM의 케토코나졸 또는 리토나비르로 완전한 화합물 1의 억제가 관측됨으로써, 간 마이크로좀에서의 화합물 1의 CYP3A가 NADPH-의존성 대사와 관련되어 있음을 암시하였다. 인간 간 마이크로좀에서의 테스토스테론의 6-β-히드록실화는 1 μM의 케토코나졸 또는 리토나비르에 의해 90 ％ 억제됨으로써, 억제제에 있어서의 적합한 반응 조건이 확인되었다.

화합물 1 대사와 관련된 CYP 동종효소의 확인

수퍼좀 - 각 CYP450 수퍼좀에 제공되어 있는 프로토콜에 따라, 최종 부피 0.1 mL의 반응 버퍼 (50-100 mM 칼륨 포스페이트, pH 7.4 또는 100 mM 트리스-HCL, pH 7.4) 중에서 배양을 수행하였다. 각 반응은 4 pmole의 CYP450 수퍼좀, 1.3 mM의 NADP⁺, 3.3 mM의 글루코스-6-포스페이트, 0.4 U/mL의 글루코스-6-포스페이트 데히드로제나제, 3.3 mM의 MgCl₂ 및 lOμM의 화합물 1을 함유하였다. 37 ℃에서의 60분 동안의 배양 후, 100 μL의 중지 용액 (아세토니트릴:메탄올; 1:1)을 첨가하고, 샘플을 10,000×g에서 10분 동안 원심분리하였다. 다음에, 상청액을 건조하고, 10 mM의 칼륨 포스페이트, pH 5에 재구성한 후, HPLC 유리 바이알로 추가 이동시켜, HPLC-UV (상기하였음)에 의해 분석하였다.

결과: 인간 재조합 CYP 효소를 사용하여, CYP3A4가 화합물 1 대사를 촉매촉진하는 유일한 CYP임이 확인됨으로써 (표 5), CYP3A4 연관성을 더욱 확고히 하였다.

<표 5>

대사물 프로필화

배양 시점 당 0.1 mL의 최종 부피에서 간 마이크로좀, 간 세포질액 또는 돼지 간 에스테라제를 사용한 배양을 수행하였다. DMSO 중 모 용액으로부터의 화합물 1 50 μM (최종 DMSO 농도는 0.1 ％이었음)을 사용하여 37 ℃에서 2시간 동안 배양 버퍼 (0.1 M 칼륨 포스페이트, pH 7.4)에 현탁된 혼합 마이크로좀 단백질 (1.0 mg/mL)을 배양하고; NADPH 재생 시스템 (1.3 mM NADP⁺, 3.3 mM 글루코스-6-포스페이트, 0.4 U/ml 글루코스-6-포스페이트 데히드로제나제, 및 3.3 mM MgCl₂, 최종 농도)의 첨가에 의해 마이크로좀 반응을 개시하였다. NADPH가 없거나 단백질이없는 배양을 대조로서 사용하였다. 중지 용액 (아세토니트릴) 0.1 mL의 첨가에 의해 반응을 종결하였다. 샘플을 30초 동안 보르텍싱-혼합한 다음, 10,000×g에서 10분 동안 원심분리하였다. 라브콩코 센트리바프 농축기를 사용하여 상청액을 건조하고, 건조한 잔류물을 물에 재구성한 후, HPLC 유리 바이알로 옮겨 HPLC-UV법 2 (상기하였음)에 의해 분석하였다.

DMSO 중 모 용액으로부터의 화합물 1 10 μM (최종 DMSO 농도는 0.1 ％이었음)을 사용하여 37 ℃에서 2시간 동안 배양 버퍼 (0.1 M 칼륨 포스페이트, pH 7.4)에 현탁된 혼합 간 세포질액 (1.0 mg단백질/mL)을 배양하고; 시험 항목의 첨가에 의해 반응을 개시하였다. 단백질이 없는 배양을 대조로서 사용하였다. 중지 용액 (아세토니트릴) 0.1 mL의 첨가에 의해 반응을 종결하였다. 샘플을 30초 동안 보르텍싱-혼합한 다음, 10,000×g에서 10분 동안 원심분리하였다. 라브콩코 센트리바프 농축기를 사용하여 상청액을 건조하고, 건조한 잔류물을 물에 재구성한 후, HPLC 유리 바이알로 옮겨 HPLC-UV법 2 (상기하였음)에 의해 분석하였다.

DMSO 중 모 용액으로부터의 화합물 1 10 μM (최종 DMSO 농도는 0.1 ％이었음)을 사용하여 37 ℃에서 60분 동안 배양 버퍼 (0.1 M 칼륨 포스페이트, pH 7.4)에 현탁된 돼지 간 에스테라제 (14 U)를 배양하고; 시험 항목의 첨가에 의해 반응을 개시하였다. 단백질이 없는 배양을 대조로서 사용하였다. 중지 용액 (아세토니트릴) 0.1 mL의 첨가에 의해 반응을 종결하였다. 샘플을 30초 동안 보르텍싱-혼합한 다음, 10,000×g에서 10분 동안 원심분리하였다. 라브콩코 센트리바프 농축기를 사용하여 상청액을 건조하고, 건조한 잔류물을 물에 재구성한 후, HPLC 유리 바이알로 옮겨 HPLC-UV법 2 (상기하였음)에 의해 분석하였다.

화합물 1에 대하여 상기한 바와 같이 화학적으로 합성된 표준 화합물 2, 화합물 4 및 화합물 3을 배양함으로써, 제안된 대사물의 대사 안정성을 시험하였다. 가능한 경우, 화합물 5의 형성은 알칼라인 포스파타제 (10 U)를 사용하여 37 ℃에서 60분 동안 샘플을 배양하는 것에 의해 입증하였다.

결과: 대사물의 LC 용리를 추정 대사물의 가용한 합성 표준의 그것과 비교함으로써, 예비확인을 수행하였다 (도 2). 대사물 할당 및 예비 확인은 표 6에 요약하였다. 대사물 U1, U2 및 U3는 체류 시간을 기준으로 특성화하였다.

<표 6>

7종의 잠재적인 대사물을 관찰하였는데, 그중 4종이 합성 표준을 사용한 공동-용리를 기준으로 화합물 5, 2'-C-메틸 구아노신, 화합물 3의 부분입체이성질체 1 및 2로 예비 확인되었다. 3종의 미지 대사물은 화합물 U1, U2 및 U3이었다. 화합물 3의 부분입체이성질체 1 및 2, 그리고 화합물 U1, U2 및 U3는 NADPH를 사용하여 수행된 배양에서 관찰됨으로써, 그 형성에서의 CYP450의 연관성을 암시하였다. 화합물 3의 부분입체이성질체 1 및 2는 3종 전체의 종에서 관찰되었다. 화합물 U2는 래트에서만 관찰되었으며, 화합물 U1 및 U3는 원숭이에서만 관찰되었다. 화합물 5의 형성은 NADPH가 없는 원숭이 및 인간 마이크로좀에서 관찰되었다. 그의 2'-C-메틸 구아노신의 5'-모노포스페이트로서의 확인은 포스페이트 기를 절단하여 뉴클레오시드 2'-C-메틸 구아노신을 방출하는 포스파타제를 사용하여 샘플을 처리하는 것에 의해 확인되었다. NADPH를 사용하여 배양된 샘플에서의 화합물 5의 형성은 매트릭스 간섭으로 인하여 확인될 수 없었다. 그러나, 화합물 5가 2'-C-메틸 구아노신으로 분해되고, 그것이 3종 전체의 종에 대한 NADPH 샘플에서 검출됨으로써, 화합물 5가 실제로는 형성되었음을 암시할 수 있다는 것을 알아야 한다.

간 세포질액에서는 화합물 1의 대사가 관찰되지 않았다. 돼지 간 에스테라제를 사용한 60-분 배양에서는, 25 ％의 화합물 1이 마이크로좀 배양에서는 관찰되지 않았었던 대사물인 화합물 2로 전환되었다 (표 7).

마이크로좀 (표 8)에서, 세포질액 (표 9)에서, 그리고 돼지 간 에스테라제 (표 7)의 사용에서 화합물 2는 화합물 5로의 신속한 대사를 받는다. 미미하거나 (래트에서 10 ％) 내지는 중간 정도인 (인간 및 원숭이에서 20-30 ％) 화합물 3 (부분입체이성질체 1 및 부분입체이성질체 2)의 NADPH-의존성 대사 (표 10)가 나타났다. 미미한 NADPH-비의존성 대사 역시 나타났으나, 원숭이 마이크로좀에서 만이었다 (표 8).

<표 7>

<표 8>

<표 9>

<표 10>

화합물 1을 사용한 배양 후에 화합물 4는 어떠한 샘플에서도 관찰되지 않았다. 화합물 2에서 관찰되었던 것처럼 그것이 화합물 5로 전환될 수 있는지를 보기 위하여, 이와 같은 화합물의 대사 안정성을 평가하였다. NADPH 존재하에서의 마이크로좀에서는 잔류 화합물 4를 기준으로 미미한 대사 (10-20 ％) 만이 관찰되었다. 매트릭스 간섭으로 인하여 이들 샘플에서 화합물 5의 형성은 확인될 수 없었다. NADPH-의존성 대사는 관찰되지 않았다. 간 세포질액 (표 9) 또는 돼지 간 에스테라제 (표 7) 중 어느 것을 사용하여서는, 화합물 4의 대사가 관찰되지 않았다. 이러한 관찰들은 화합물 1을 사용하여 배양된 샘플에서의 화합물 4의 결핍이 화합물 2의 경우에서와 같은 추가 대사로 인한 것이 아니라는 것을 암시하며, 그에 따라 화합물 4가 화합물 1의 시험관내 대사물이 아니라는 것을 암시한다.

미미하거나 (래트에서 10 ％) 내지는 중간 정도인 (인간 및 원숭이에서 20-30 ％) 화합물 3의 NADPH-의존성 대사 (표 10)가 나타났다. 미미한 NADPH-비의존성 대사 역시 나타났으나, 원숭이 마이크로좀에서 만이었다 (표 10). 이와 같은 샘플의 알칼라인 포스파타제를 사용한 처리는 2'-C-메틸 구아노신의 형성을 초래함으로써, 화합물 3을 사용한 배양 후, 원숭이 마이크로좀에서는 화합물 5가 형성됨을 암시하였다. 간 세포질액 (표 9) 또는 돼지 간 에스테라제 (표 8)을 사용하여서는, 화합물 3의 대사가 관찰되지 않았다.

결론

화합물 1은 원숭이 간 마이크로좀에서 상당한 대사를 나타내었으며; 인간 및 래트에서의 대사 역시 실질적이었다. 화합물 1의 대사는 CYP450 및 비-CYP450 경로 모두에 의해 매개되는 것으로 보여진다. 인간 재조합 CYP 효소를 사용하여 3A4를 화합물 1의 NADPH-의존성 대사에 연관된 유일한 CYP로 확인하였다. 8종의 잠재적인 시험관내 대사물을 관찰하였는데, 5종이 2'-C-메틸 구아노신, 화합물 2, 5 및 화합물 3의 부분입체이성질체 2종 (화합물 3a 및 3b)로 확인되었다. 대사물 U1, U2 및 U3에 대해서는 알려지지 않았으며, 의존성인 종으로 보이는데; U2는 래트 마이크로좀에서만 관찰된 반면, U1 및 U2는 원숭이 마이크로좀에서만 관찰되었다. 화합물 3의 형성은 3종 전체의 종에서 발생하였다. 일부 화합물 5의 형성이 화합물 3a 및 3b로의 대사와도 관련되어 있기는 하지만, 화합물 5의 형성은 화합물 2의 형성을 통하여 CYP450 및 비-CYP450 경로 모두에 의해 매개되는 것으로 보인다. NADPH를 사용한 배양에서는 매트릭스에 의한 간섭으로 인하여 화합물 5가 관찰될 수 없었지만, 모노포스페이트는 2'-C-메틸 구아노신으로 분해될 수 있기 때문에, 이러한 샘플들에서의 2'-C-메틸 구아노신의 존재는 화합물 5가 실제로는 형성된다는 것을 암시한다. 비-CYP450 매개 화합물 5 형성은 래트 및 인간에서보다 원숭이에서 더욱 중요한 것으로 보이는데, 원숭이 마이크로좀에서 관찰되는 화합물 5 및 2'-C-메틸 구아노신의 더 높은 농도의 원인이 된다.

실시예 15

1차 간세포 및 Huh-7 세포에서의 화합물 1 및 2'-C-메틸 구아노신의 시험관내 대사 경향

본 연구에서는, 하기의 세포주들을 사용하였다.

반응물: 하기의 반응물들을 연구에 사용하였다:

미시간 머스케곤 소재 버딕 앤드 잭슨 사의 아세토니트릴, 메탄올 및 HPLC 등급의 물; 미주리 세인트 루이스 소재 시그마-알드리치 사의 알칼라인 포스파타제, 디메틸 술폭시드 (DMSO), 덱사메타손, 인슐린 및 테트라부틸 암모늄 디히드로젠포스페이트 (TBAP); 버지니아 헤른돈 소재 셀그로, 메디아테크(Cellgro, Mediatech) 사의 피루베이트, L-글루타민, HEPES, 비 필수 아미노산, 페니실린-스트렙토마이신, 포스페이트 버퍼링된 염수 (PBS) 및 트립신-EDTA를 포함하는 DMEM; 에코 라이트(Eco Lite) 액체 씬틸레이션(scintilation); 기브코, 인비트로겐 코포레이션(Gibco, Invitrogen Corporation) 사의 소 태아 혈청 (FBS), 인슐린-프랜스페린-셀레늄-A 및 윌리암스(William's) E 배양 배지; 펜실베이니아 피츠버그 소재 피셔 사이언티픽 사의 칼륨 포스페이트, 일염기성 (K₂HPO₄); 및 퍼킨 엘머 라이프 사이언스 사의 얼티마 플로우(Ultima Flow)-AP 액체 씬틸레이션.

세포 배양물의 제조

1차 간세포: 동물 및 인간 간으로부터 새로 단리한 세포를 얼음 상 현탁액으로 수득하였다. 70-75×g (래트) 또는 95-90×g (원숭이 및 인간)에서의 원심분리에 의해 펠렛화하고, 플레이팅 배지 (5 ％ FBS, 0.5 ％ 페니실린-스트렙토마이신, 1 ％ L-글루타민, 4 μg/mL 인슐린 및 1 μM 덱사메타손으로 보충된 윌리엄스 E) mL 당 800,000 세포로 재현탁하였다. 다음에, 다수-웰 콜라겐 I-코팅 플레이트 (래트 테일 콜라겐 유형 I; 12- 또는 6-웰)에 1 mL (12-DNPF; 800,000 세포/웰) 또는 2 mL (6-웰; 1,600,000 세포/웰)의 세포 현탁액을 첨가함으로써 접종하였다. 상기 플레이트를 약하게 진탕하여 세포를 균일하게 분포시키고, 37 ℃에서 대략 4 내지 6시간 동안 배양기에 위치시킴으로써 세포가 부착하도록 하였다. 일단 세포가 부착하고 나면, 플레이팅 배지를 제거하고, 간세포 배양 배지 (페니실린-스트렙토마이신, 1 ％ L-글루타민, 1 ％ 인슐린-트랜스페린-셀레늄 및 0.1 μM 덱사메타손으로 보충된 윌리엄스 E)로 대체하였다. 세포를 37 ℃에서 밤새 배양기에 방치함으로써 배양 및 배지에 순화시켰다.

Huh-7 세포: 트립신-EDTA를 사용하여 Huh-7 세포의 융합성 단일층을 분산시키고, 세정한 후, 1,000 rpm에서의 원심분리 (베크만(Beckman) 사, 모델 알레그라(Allegra) 6R)에 의해 펠렛화하였다. 배지 (1 ％ 피루베이트, 10 ％ FBS, 0.5 ％ 페니실린-스트렙토마이신, 1 ％ L-글루타민, 1 ％ 비필수 아미노산 및 22 mM HEPES로 보충된 DMEM) mL 당 0.2, 0.3 및 0.4 × 10⁶ 세포로 세포를 재현탁하였다. 다음에, 다수-웰 콜라겐 I-코팅 플레이트 (래트 테일 콜라겐 유형 I; 6-웰)에 2.0 mL의 세포 현탁액을 첨가하여 접종함으로써, 0.4, 0.6 및 0.8 × 10⁶ 세포/웰의 최종 세포 밀도를 달성한 후, 37 ℃에서 밤새 배양기에 위치시킴으로써 세포가 배양 및 배지에 부착 및 순화하도록 하였다. 각 시점에서의 세포 수 측정을 위하여, 동일한 세포 밀도를 가지는 2반복의 플레이트를 준비하였다.

[¹⁴C]-화합물 1 및 [¹⁴C]-2'-C-메틸 구아노신을 사용한 배양

간세포 배양 배지/웰 (1,600,000 세포/mL) 2.0 mL의 최종 부피로 방사성표지된 화합물 1 및 2'-C-메틸 구아노신 (모두 구아닌 잔기의 C-8 위치에 표지됨)을 사용한 간세포 배양을 수행하였다. 밤샘 세포 배양으로부터의 배양 배지를 제거하여, DMSO (최종 DMSO 농도는 0.1 ％이었음) 또는 50 ％ 에탄올 (최종 에탄올 농도는 0.2 ％이었음) 중 모 용액으로부터의 1 또는 10 μM의 [¹⁴C]-화합물 1 (122 DPM/pmol) 또는 [¹⁴C]-2'-C-메틸 구아노신 (127 DPM/pmol)을 함유하며 37 ℃로 예비-가온된 새로운 배지로 대체하였다. 1, 4, 8 및 24시간 후, 0.5-1.0 mL의 배양 배지를 제거하여 분석 (하기함)시까지 -20 ℃로 저장하였다. 나머지 배지는 버리고, 빙-냉 PBS를 사용하여 세포 단일층을 조심스럽게 2회 세척하였다. 최종 세척 후, 모든 PBS를 조심스럽게 제거하고, 1.0 mL의 추출 용액 (빙-냉 70 ％ 메탄올)을 첨가하였다. 세포를 파괴하여 추출 용액 중에 현탁시키고, 2 mL 폴리프로필렌 마이크로퓨지 튜브로 옮긴 후, -20 ℃에서 밤새 세포내 내용물을 추출하였다.

Huh7 배양 배지/웰 2.0 mL의 최종 부피로 Huh-7 배양을 수행하였다 (0.4, 0.6 및 0.8 ×10⁶ 세포/mL). 밤샘 세포 배양으로부터의 배양 배지를 제거하여, 1차 간세포에 대하여 상기한 바와 같은 [¹⁴C]-화합물 1 또는 [¹⁴C]-2'-C-메틸 구아노신을 함유하며 37 ℃로 예비-가온된 새로운 배지로 대체하였다. 24, 48 및 72시간 후, 0.5-1.0 mL의 배양 배지를 제거하여 분석 (하기함)시까지 -20 ℃로 저장하였다. 나머지 배지는 버리고, 상기한 바와 같이 세포 단일층을 처리 및 추출하였다.

1차 간세포에서의 2'-C-메틸 구아노신-5'-트리포스페이트의 시험관내 세포내 반감기 (t_1/2) 측정

10 μM의 [¹⁴C]-화합물 1 (122 DPM/pmol) 또는 [¹⁴C]-2'-C-메틸 구아노신 (127 DPM/pmol)을 사용하여 1차 간세포를 24시간 동안 배양하고, 그 시점에서 배양 배지를 제거하여 가온된 (37 ℃) PBS로 조심스럽게 2회 세포 단일층을 세척한 후, 무-약물 배지를 사용하여 다시 배양 중에 위치시켰다. 24시간 이하의 선택된 시간에 배지를 제거하고, 빙-냉 PBS를 사용하여 세포 단일층을 조심스럽계 2회 세척하였다. 최종 세척 후, 모든 PBS를 조심스럽게 제거하고, 세포 단일층을 전기한 바와 같이 처리 및 추출하였다.

[¹⁴C]-화합물 1 또는 [¹⁴C]-2'-C-메틸 구아노신을 사용한 배양 후 1차 간세포 및 Huh7 세포에서의 화합물 5, 6 및 7의 형성에 대한 리바비린 및 리토나비르의 효과

하기를 제외하고는 본질적으로 상기한 바와 같이 1차 간세포 (1,600,000 세포/웰) 및 Huh 세포 (400,000 세포/웰) 배양을 수행하였다. 10 μM의 [¹⁴C]-화합물 1 (122 DPM/pmol) 및 [¹⁴C]-2'-C-메틸 구아노신 (127 DPM/pmol)을 사용하여 리토나비르 (1 μM) 또는 리바비린 (5 μM)의 존재 또는 부재하에 24시간 (간세포) 또는 72시간 (Huh7, 리바비린만) 동안 세포를 배양하였다. 배양 배지 (0.5-1.0 mL)를 제거하여, 분석 (하기하였음)을 위해 -20 ℃에서 저장하였다. 나머지 배지는 버리고, 세포 단일층을 세척한 후, 전기한 바와 같이 세척 및 처리하였다.

2'-C-메틸 구아노신 뉴클레오티드 (화합물 5, 6 및 7)의 안정성

HPLC-등급의 물 중에 화합물 5 (2'-C-메틸 구아노신 모노포스페이트) (10 ％) 및 화합물 6 (2'-C-메틸 구아노신 디포스페이트) (30 ％)도 포함하는 화합물 7 (2'-C-메틸 구아노신 트리포스페이트)의 100 μM 표준 용액을 제조하고, 이 표준 용액 100 μL를 (a) 900 μL의 추출 용액 (70 ％ 메탄올) 및 (b) 900 μL의 70 ％ 메탄올 중 바탕 간세포 세포 추출물에 혼화함으로써, 2'-C-메틸 구아노신 뉴클레오티드의 안정성을 평가하였다. 혼화된 샘플을 3일 이하 동안 -20 ℃에 위치시킨 후, 그것을 실험 샘플에 대하여 기술된 바와 같이 처리하였다.

추정 대사물의 예비 확인

하기하는 크로마토그래피 조건을 사용하여 배양 배지 및 세포 추출물에서 관찰된 대사물의 체류 시간을 화학적을 합성된 표준을 사용하여 수득된 체류 시간과 비교함으로써, 추정 대사물의 예비 확인을 수행하였다. 알칼라인 포스파타제을 사용하여 세포 추출물 샘플을 배양하고 (10 단위, 37 ℃에서 60분), 생성 뉴클레오티드의 HPLC 체류 시간을 실제 2'-C-메틸 구아노신의 그것과 비교함으로써, 2'-C-메틸 구아노신 뉴클레오티드 (모노-, 디- 및 트리포스페이트)의 추가 확인을 수행하였다.

샘플 제조 및 분석

세포 추출물

에펜도르프 마이크로센트리퓨지 (에펜도르프(Eppendorf) 사, 모델 5414D)를 사용하여 10분 동안 16,000 RCF로 원심분리하여 세포 잔사를 제거함으로써, 세포 추출물을 제조하였다. 상청액 5-10 μL의 분취량을 5 mL의 에코라이트™ (캘리포니아 어빈 소재 MP 사) 액체 씬틸레이션 칵테일에 첨가하고, 베크만 코울터 LS6500 다목적 액체 씬틸레이션 계수기 (캘리포니아 풀러튼 소재 베크만 인스트루먼츠(Beckman Instruments) 사)를 사용한 액체 씬틸레이션 계수 (LSC)에 의해 방사능을 측정하였다. 다음에, 나머지 샘플을 라브콩코 냉장 센트리바프 농축기 (미주리 캔사스 시티 소재 라브콩코 사)를 사용하여 건조하였다. 건조 추출물을 HPLC-등급의 물 120 μL에 재구성한 후, 에펜도르프 마이크로센트리퓨지를 사용하여 10분 동안 16,000 RCF로 원심분리하였다. HPLC 분석 (하기하였음) 전에, LSC에 의해 분취량 5 μL를 사용하여 농축된 추출물의 방사능을 측정하였다. 다음에, 건조 전 및 후 추출물에서의 총 방사능을 비교함으로써, 추출 회수율을 측정하였다. 다음에, 유동 씬틸레이션 분석기 라디오매틱(Radiomatic)™ 515TR을 사용하여 HPLC에 의해 온라인 방사능 검출로 나머지 추출물을 분석하였다. 플로-원(Flo-One)™ 소프트웨어 (퍼킨 엘머 라이프 사이언스 사)를 사용하여 피크를 적분함으로써, 분리 성분들의 방사능을 정량하였다. 저조한 회수율 (< 85 ％)을 가지는 샘플은 가능한 경우에 재분석하였다.

뉴클레오티드 안정성 샘플을 제조하고, 샘플이 방사성이 아니었으므로 LSC가 필요하지 않았다는 것 이외에는 실험 샘플에 대하여 상기한 바와 같이 처리하였다. HPLC-등급의 물 100 μL에 건조 추출물을 재구성하고, 에펜도르프 마이크로센트리퓨지를 사용하여 10분 동안 16,000 RCF로 원심분리한 후, LC-UV (방법 2: 하기하였음)에 의해 분석하였다. 이들 샘플에서의 화합물 5, 화합물 6 및 화합물 7에 대한 UV 피크 면적을 표준 용액에 대하여 수득되는 피크 면적과 비교하였다.

배양 배지

배양 배지 샘플을 실온에서 해동하여, 보르텍싱한 후, 에펜도르프 마이크로센트리퓨지를 사용하여 16,000 RCF로 원심분리하였다. 10 μL의 분취량을 5 mL의 에코라이트™ (캘리포니아 어빈 소재 MP 사) 액체 씬틸레이션 칵테일에 첨가하고, 베크만 코울터 LS6500 다목적 액체 씬틸레이션 계수기 (캘리포니아 풀러튼 소재 베크만 인스트루먼츠 사)를 사용한 LSC에 의해 방사능을 측정하였다. 다음에, 유동 씬틸레이션 분석기 라디오매틱™ 515TR을 사용하여 HPLC에 의해 (하기하였음) 온라인 방사능 검출로 샘플 (50-100 μL)을 분석하였다. 플로-원™ 소프트웨어 (퍼킨 엘머 라이프 사이언스 사)를 사용하여 피크를 적분함으로써, 분리 성분들의 방사능을 정량하였다. 저조한 회수율 (< 85 ％)을 가지는 샘플은 가능한 경우에 재분석하였다.

분석 방법

모든 샘플은 하기의 HPLC법을 사용하여 분석하였다:

기기 편성:

켐스테이션(ChemStation) LC3D 버젼 A.10.02 (1757)가 구비된 아길렌트 1100 (아길렌트 테크놀로지스, Inc 사)

온도조절장치가 구비된 오토샘플러

다이오드 배열 검출기

온도조절 컬럼 구획

4차 펌프

진공 탈기장치

크로마토그래피 조건:

방법 1 - 화합물 1 배양 배지 및 세포 추출물의 분석:

ㆍ 컬럼: 페노메넥스® 콜럼부스 5 μ C18, 4.6×250 mm

ㆍ (캘리포니아 토란스 소재 페노메텍스 USA 사)

ㆍ 가드 컬럼: 시큐리티 가드 카트리지, 폴라(Polar) RP 4×2 mm

ㆍ (캘리포니아 토란스 소재 페노메텍스 USA 사)

ㆍ 컬럼 온도: 주변온도

ㆍ UV 검출: 252 nm

ㆍ 방사능 검출: 500 μL의 액체 셀, 씬틸레이션 유동 칵테일

ㆍ (얼티마 플로우-AP, 코네티컷 소재 퍼킨 엘머 라이프 사이언스 사), 3 mL/분으로.

화합물 1 (부분입체이성질체 1 및 2) 및 방법 1에의해 수득되는 대사물 표준의 대표적인 HPLC 크로마토그램을 도 3에 제공하였다.

방법 2 - 2'-C-메틸 구아노신 세포 추출물의 분석:

ㆍ 컬럼: 페노메넥스® 콜럼부스 5 μ C18, 4.6×250 mm

ㆍ (캘리포니아 토란스 소재 페노메텍스 USA 사)

ㆍ 가드 컬럼: 시큐리티 가드 카트리지, 4×2 mm

ㆍ (캘리포니아 토란스 소재 페노메텍스 USA 사)

ㆍ 컬럼 온도: 주변온도

UV 검출: 252 nm

ㆍ 방사능 검출: 500 μL의 액체 셀, 씬틸레이션 유동 칵테일 (얼티마 플로우-AP, 코네티컷 소재 퍼킨 엘머 라이프 사이언스 사), 3 mL/분으로.

방법 3 - 2'-C-메틸 구아노신 배양 배지 샘플의 분석:

ㆍ 컬럼: 페노메넥스® 콜럼부스 5 μ C18, 4.6×250 mm

ㆍ (캘리포니아 토란스 소재 페노메텍스 USA 사)

ㆍ 가드 컬럼: 시큐리티 가드 카트리지, 4×2 mm

ㆍ (캘리포니아 토란스 소재 페노메텍스 USA 사)

ㆍ 컬럼 온도: 주변온도

UV 검출: 252 nm

방법 4 - 화합물 1 배양 배지 샘플의 분석:

본 방법은 간세포 대사물 프로필을 실시예 14의 마이크로좀 배양을 사용하여 관찰된 대사물 프로필과 비교하는 데에 사용되었다.

ㆍ 컬럼: 페노메넥스® 콜럼부스 5 μ C18, 4.6×250 mm

ㆍ (캘리포니아 토란스 소재 페노메텍스 USA 사)

ㆍ 가드 컬럼: 시큐리티 가드 카트리지, 4×2 mm

ㆍ (캘리포니아 토란스 소재 페노메텍스 USA 사)

ㆍ 컬럼 온도: 주변온도

UV 검출: 252 nm

계산

마이크로소프트® 오피스 엑셀 2003을 사용하여 화합물 1 및 화합물 7 (2'-C-메틸 구아노신 트리포스페이트)에 대한 농도-시간 데이터를 분석함으로써, 농도-시간 곡선 (AUC) 값 아래의 면적을 수득하였다. AUC₀ _-24는 선형 사다리꼴 규칙 및 24시간까지의 샘플링 시간을 사용하여 계산된 농도-시간 곡선 아래의 면적이었다. 선형 회귀 분석 (마이크로소프트 엑셀)을 사용하여 함수 t₁ _/2 = 0.693/k (여기서 k는 pmol/1,000,000세포로 나타낸 화합물 7 세포내 농도의 자연 log 대 배양 시간을 플로팅함으로써 수득되는 선형 회귀의 기울기임)로부터 화합물 7에 대한 시험관내 세포내 t₁ _/2 값을 평가하였다.

결과

[¹⁴C]-표지된 화합물 1을 사용하여 1차 간세포 및 인간 간암 세포주 Huh7에서 화합물 1의 대사 경향 및 세포내 활성화를 평가하였다. [¹⁴C]-표지된 2'-C-메틸 구아노신을 사용하여 모 뉴클레오시드 2'-C-메틸 구아노신의 활성화도 병행 평가함으로써, 화합물 1을 통한 화합물 5의 전달이 활성 트리포스페이트인 화합물 7의 더 높은 농도로 이어지는지 여부를 평가하였다.

HPLC를 사용하여 [¹⁴C]-화합물 1 및 [¹⁴C]-2'-C-메틸 구아노신의 방사능을 평가하였다. 간세포 배지에서 모 물질의 1:1000 희석물을 제조하고, HPLC에 의해 분석하였다. 양 화합물 모두가 순도 > 98 ％이었다.

대사 프로필: 배양 배지

10 마이크로몰의 [¹⁴C]-화합물 1 또는 [¹⁴C]-2'-C-메틸 구아노신을 사용한 1차 간세포 배양

4시간에 화합물 1 배지 농도의 대략 50 ％가 감소되며, 24시간 후에는 검출가능한 화합물 1이 없는, [¹⁴C]-화합물 1의 광범위한 대사가 래트 간세포에서 관찰되었다 (표 11). 원숭이 간세포에서의 대사는 중간이었는데; 8시간까지 약 40 ％, 24시간 후에는 77 ％의 중간정도로 농도가 감소되었다 (표 11). 래트 및 원숭이 간세포와는 달리, 인간 간세포에서의 화합물 1 대사 (표 11)는 24시간까지 겨우 38 ％의 화합물 1 배지 농도가 감소됨으로써 낮은 것으로 나타났다.

<표 11>

래트 간세포의 배양 배지에서 래트 간세포의 배양 배지에서는 총 10종의 대사물이 관찰되었으며 (표 12); 원숭이 간세포에서는 9종 (표 13), 인간 간세포에서는 7종 (표 14)이 관찰되었다.

<표 12>

<표 13>

<표 14>

가능한 경우, 참조 표준과의 체류 시간 비교에 의해 대사물 확인을 수행하였다. 실시예 14에 기록되어 있는 것들과 관련된 바와 같은 간세포 대사물 확인 및 평가를 추가적으로 입증 및 확인하기 위하여, HPLC법 1 내지 4를 사용하여 간세포 및 마이크로좀 샘플 모두를 분석하였다. 표 15는 1차 간세포 및 Huh7 세포에서 관찰된 화합물 1 대사물들에 대한 대사물 평가를 요약하고 있다.

<표 15>

24시간 후 배양 배지에서 측정된 총 방사능의 26 ％ (인간), 42 ％ (원숭이) 및 67 ％ (래트)를 나타냄으로써, 모든 종에서 2'-C-메틸 구아노신이 우세한 대사물이었다.

<표 16>

화합물 5 및 화합물 2는 24시간 후에 총 방사능의 8 ％를 나타냄으로써 원숭이에서 가장 높았던 반면, 인간 및 래트에서는 24시간 후에 각각 3 내지 5 ％를 나타내었다. 배양 배지 중 화합물 5의 존재는 알칼라인 포스파타제 처리에 의해 확인하였다. 또 다른 미확인 대사물(들)을 HPLC법 1의 크로마토그래피 조건하에서 화합물 2와 공동 용리하거나, HPLC법 4의 크로마토그래피 조건하에서 화합물 3과 공동 용리한다. 상기의 미지 대사물들인 U1 및 U3는 래트에서 24시간 후에 총 방사능의 7 내지 8 ％, 원숭이에서는 10 및 5 ％, 인간 간세포에서는 대략 2 ％를 차지한다. 또 다른 미지의 대사물인 U5는 래트 간세포에서만 관찰되었으며, 24시간 후에 총 방사능의 약 7 ％를 차지하였다. 간 마이크로좀에서의 중요한 NADPH-의존성 대사물로 확인된 화합물 3 (화합물 3a와 3b의 혼합물)은 원숭이 및 래트 간세포에서는 총 방사능의 3 ％ 이하를 나타내고 인간 간세포에서는 검출불가능함으로써 (표 12-13), 간세포에서는 미미한 대사물인 것으로 보였다.

[¹⁴C]-2'-C-메틸 구아노신을 사용한 배양 후 1차 간세포의 배양 배지에서는 대사물이 관찰되지 않았다.

1 마이크로몰의 [¹⁴C]-화합물 1 또는 [¹⁴C]-2'-C-메틸 구아노신을 사용한 배양

인간 및 래트 간세포에서 1 μM의 [¹⁴C]-화합물 1의 대사를 평가하였는데, 10 μM에서 관찰된 바와 같이 8시간에서 화합물 1 배지 농도의 대략 79 ％ 감소, 및 24시간 후 검출가능한 화합물 1이 없음으로써, 래트에서의 대사가 광범위하였다 (표 11). 인간 간세포에서의 대사 (표 11)는 더 낮아서, 24시간까지 51 ％의 화합물 1이 배지에 남아있었다. 래트 간세포의 배양 배지에서는 총 8종의 대사물이 관찰되었는데 (표 17); 인간간세포 배지에서는 2'-C-메틸 구아노신, 화합물 5 및 화합물 2 만이 검출가능하였다 (표 17).

<표 17>

인간 및 래트 간세포에서 24시간의 주요 대사물은 2'-C-메틸 구아노신으로서, 각각 39 및 58 ％를 차지하였다 (표 16). 24시간에 인간 간세포에서, 화합물 5는 8 ％이었으며, 화합물 2는 1.7 ％이었다. 래트 간세포에서 24시간에, 화합물 5는 검출되지 않았으며, 화합물 2는 총 방사능의 7 ％이었다. 래트 간세포에서 24시간에는, 화합물 3 (3a 및 3b, 1.7 ％) 역시 검출되었다 (표 17).

1 μM의 [¹⁴C]-2'-C-메틸 구아노신을 사용한 배양 후에는 1차 간세포의 배양 배지에서 대사물이 관찰되지 않았다.

Huh7 세포

1차 간세포와 달리, 인간 간암 세포주 Huh7에서의 화합물 1 대사는 저조하였다. 24시간 후, 화합물 1은 배양 배지에서 측정된 방사능의 86 ％를 차지하였으며, 72시간까지 67 ％를 차지하였다. Huh7 세포의 배양 배지에서는 총 6종의 대사물 (표 18)이 관찰되었다.

<표 18>

소량 대사물 (< 1 ％)인 U6는 Huh7에 고유한 것으로 보였다. 화합물 2는 72시간까지 총 대사물의 26 ％를 차지함으로써, Huh7 세포의 주요 대사물인 것으로 보였다. 2'-C-메틸 구아노신 및 화합물 5는 72시간에 총 방사능의 각각 2 및 0.9 ％를 차지하였다. U4는 72시간에 방사능의 3.4 ％를 차지하였다.

[¹⁴C]-2'-C-메틸 구아노신을 사용한 배양 후에는 Huh7 세포의 배양 배지에서 대사물이 관찰되지 않았다.

대사 프로필: 세포 추출물

화합물 5 (10 ％) 및 화합물 6 (30 ％)도 함유하는 화합물 7의 참조 표준을 사용하여, 샘플 제조 및 추출 과정에 있어서의 2'-C-메틸 구아노신의 안정성을 평가하였다. 2'-C-메틸 구아노신의 분해는 관찰되지 않았다.

1차 간세포

10 마이크로몰의 [¹⁴C]-화합물 1 및 [¹⁴C]-2'-C-메틸 구아노신

상기한 실험 절차에 기술되어 있는 바와 같이 LSC에 의해 세포내 방사능의 추출 회수율을 측정하였다. 일반적으로, 추출 회수율은 66 ％ 내지 79 ％의 범위였다. 세포 펠렛에 남아 있는 방사능은 관찰되지 않았다. 1차 간세포에서의 [¹⁴C]-화합물 1의 대사 프로필을 표 19 내지 표 22, 및 표 26 내지 표 29에 요약하였으며, 인간, 원숭이 래트 간세포에서의 [¹⁴C]-2'-C-메틸 구아노신의 대사 프로필을 표 23A 내지 표 25 및 표 27에 요약하였다.

<표 19>

<표 20>

<표 21>

<표 22>

<표 23A>

<표 23B>

<표 24>

<표 25>

<표 26>

<표 27>

<표 28>

<표 29>

알칼라인 포스파타제 분해를 사용하여 2'-C-메틸 구아노신 뉴클레오티드의 확인을 수행하였다. [¹⁴C]-화합물 1 및 [¹⁴C]-2'-C-메틸 구아노신을 사용한 배양 후의 2'-C-메틸 구아노신 뉴클레오티드 농도를 표 28 내지 표 34에 요약하였다.

<표 30>

<표 31>

<표 32>

<표 33>

<표 34>

인간 간세포에서의 [¹⁴C]-화합물 1을 사용한 배양 24시간 후, 주요 대사물은 화합물 7 (65 ％)이었으며, 다음은 화합물 6 (15.3 ％), 그리고 9-10 ％의 총 방사능을 가지는 2'-C-메틸 구아노신 및 화합물 5이었다. 24시간에는, 화합물 1 (1.5 ％) 역시 검출되었다. 최대 화합물 7 농도 296 pmol/1,000,000세포 (공여체 2종의 평균)는 24시간에 관찰되었다. 24시간 이후의 샘플링은 수행되지 않았기 때문에, 화합물 7의 농도가 계속해서 상승하게 되는지의 여부는 분명하지 않다. 인간 간세포 (n=2)에서의 평균 화합물 7 AUC₀ _-24시간은 7,398 pmol*시간/1,000,000세포이었다.

화합물 7은 또한 4-24시간에서의 원숭이 (> 70 ％) 및 래트 (> 70-55 ％) 간세포에서의 주요 세포내 대사물이었다. 양 종에서 24시간 후에 화합물 1은 검출되지 않았다. 원숭이 간세포에서, 화합물 6은 17 ％인 반면, 2'-C-메틸 구아노신 및 화합물 5는 24시간에 총 세포내 방사능의 2-5 ％이었다. 2'-C-메틸 구아노신, 화합물 5 및 6은 24시간에 래트 간세포에서 총 방사능의 8-16 ％를 차지하였다. 화합물 7은 래트 간세포에서 8시간에 최대 농도 1,705 pmol/1,000,000세포에 달한 반면, 원숭이에서는 1종의 공여체에서 8시간에, 그리고 다른 공여체에서 24시간에 피크 농도 895 및 552 pmol/1,000,000세포에 달하였다. 화합물 7에 있어서, AUC₀ _-24시간 값은 원숭이 및 래트 간세포에서 각각 11,813 및 29,846 pmol*시간/1,000,000세포이었다.

[¹⁴C]-2'-C-메틸 구아노신 대사도 1차 간세포에서 평가하였다. 1차 간세포에서의 [¹⁴C]-2'-C-메틸 구아노신의 대사 프로필은 표 21 내지 표 25, 및 표 28 내지 표 34에 요약하였다. 인간, 원숭이 및 래트 간세포에서의 모노-, 디- 및 트리포스페이트의 백분율은 각각 7-12 ％, 17-20 ％ 및 69-76 ％이었다. [¹⁴C]-2'-C-메틸 구아노신을 사용한 배양 후의 화합물 7의 농도는 [¹⁴C]-화합물 1을 사용한 배양 후에 비해 2.3 내지 19.7배 더 낮았다. 24시간에, 인간, 원숭이 및 래트 간세포에서 각각 215, 32 및 249 pmol/1,000,000세포의 최대 화합물 7 농도가 관찰되었다.

1 마이크로몰에서의 [¹⁴C]-화합물 1 및 [¹⁴C]-2'-C-메틸 구아노신

래트 및 인간 간세포에서 1 μM의 [¹⁴C]-화합물 1로 유사한 대사 경향 및 프로필을 관찰하였는데 (표 21, 표 29, 표 30 및 표 34); 원숭이 간세포에서의 1 μM의 [¹⁴C]-화합물 1은 평가되지 않았다. 화합물 7이 인간 및 래트 간세포에서 각각 최대 농도 60.4 및 103 pmol/1,000,000세포로 24시간에 총 방사능의 70-78 ％를 차지함으로써, 양 종에서 주요 대사물이었다. 화합물 7에 대한 AUC₀ _-24시간은 래트 (n=1) 및 인간 (n=1) 간세포에서 각각 3,881 및 1,027 pmol*시간/1,000,000세포이었다. 이러한 값은 인간 및 래트 간세포에서의 10 μM [¹⁴C]-화합물 1에서 관찰된 값에 비해 대략 8.8-7.2배 더 낮은 것이다. 1 μM의 [¹⁴C]-2'-C-메틸 구아노신은 10 μM에서 관찰된 것과 유사한 프로필을 나타내었다. 1 μM [¹⁴C]-2'-C-메틸 구아노신을 사용한 배양 후 화합물 7에 대한 AUC₀ _-24시간은 인간 (n=1) 및 래트 (n=1) 간세포에서 각각 302 및 458 pmol*시간/1,000,000세포로써, 10 μM 2'-C-메틸 구아노신을 사용하여 관찰된 AUC보다 11.7-배 더 낮았다. 이러한 관찰은 화합물 7의 형성이 이와 같은 농도 범위에서 화합물 1 및 2'-C-메틸 구아노신 모두에 대하여 투여량 의존성이라는 것을 암시한다.

인간 및 래트 간세포에서의 [¹⁴C]-화합물 7 반감기

표 35 및 표 36에 인간 및 래트 간세포에서의 화합물 7 감쇠를 요약하였다. 시간 0에서의 화합물 7 농도는 인간 및 래트 간세포에서 각각 692 및 932 pmol/1,000,000세포이었다. [¹⁴C]-화합물 1 없이 24시간 후, 화합물 7 농도는 인간 및 래트 간세포에서 각각 273 (61 ％ 감소) 및 83 (91 ％ 감소) pmol/1,000,000세포로 감소하였다. 인간 간세포에서의 화합물 7의 시험관내 반감기는 17.4시간인 반면, 래트 간세포에서는 6.61시간이었다.

<표 35>

<표 36>

인간 간세포에서 [¹⁴C]-2'-C-메틸 구아노신 후의 시험관내 화합물 7 반감기도 측정하였다. 24시간 동안의 [¹⁴C]-2'-C-메틸 구아노신을 사용한 배양 후 시간 0에서의 화합물 7 농도는 266 pmol/1,000,000세포이었다. [¹⁴C]-2'-C-메틸 구아노신 없이 24시간 후, 화합물 7 농도는 58 pmol/1,000,000세포 (78 ％ 감소)로 감소하였다. 인간 간세포에서의 2'-C-메틸 구아노신 후 시험관내 화합물 7 반감기는 10.8시간으로써, 화합물 1 후 관찰된 것의 거의 절반이었다.

Huh7 세포

Huh7에서의 [¹⁴C]-화합물 1의 대사 프로필을 표 26, 표 37 및 표 38에 요약하였다. [¹⁴C]-화합물 1 및 [¹⁴C]-2'-C-메틸 구아노신을 사용한 배양 후의 2'-C-메틸 구아노신 뉴클레오티드 농도를 표 37 및 표 38에 요약하였다.

<표 37>

<표 38>

[¹⁴C]-화합물 1 배양 후 72시간까지 Huh7 세포에서는 화합물 7이 주요 대사물 (총 방사능의 83-93 ％)이었다. Huh7 세포에서의 화합물 7의 농도는 인간 간세포에서보다 88 ％ 더 낮았다. 16 pmol/1,000,000세포의 최대 화합물 7 농도는 48시간에서 발생하였으며, AUC₀ _-72시간은 873 pmol*시간/1,000,000세포 (n=2)이었다. [¹⁴C]-화합물 1을 사용한 72시간 배양 후, 변화되지 않은 화합물 1은 총 방사능의 15 ％를 나타내었다. Huh7 (n=1) 세포에서 24 및 48시간에 1종의 미지 대사물 (U9)이 관찰되었는데, 1차 간세포에서는 관찰되지 않았기 때문에, Huh7에 고유한 것으로 보인다.

[¹⁴C]-2'-C-메틸 구아노신을 사용한 배양 후에는 화합물 7 농도가 상당히 낮았다 (표 18 내지 표 38). 3 pmol/1,000,000세포의 최대 농도는 24시간에서 발생하였으며, AUC₀ _-72시간은 120 pmol*시간/1,000,000세포 (n=1)로써, [¹⁴C]-화합물 1을 사용한 것에 비해 7.3-배 더 낮았다. 화합물 7이 관찰된 유일한 세포내 대사물이었다.

1차 간세포에서의 2'-C-메틸 구아노신 뉴클레오티드 농도에 대한 리바비린 및 리토나비르의 효과

리바비린은 HCV의 치료에 현재 사용되고 있는 뉴클레오티드 유사체로써, 인간 (n=1) 및 래트 (n=2)에서의 2'-C-메틸 구아노신 뉴클레오티드 농도에 대한 24시간 후의 그의 효과를 평가하였다. 표 39 및 표 40에, 리바비린 5 μM의 존재하에 10 μM [¹⁴C]-화합물 1 또는 10 μM [¹⁴C]-2'-C-메틸 구아노신 후 달성되는 2'-C-메틸 구아노신 뉴클레오티드 농도를 요약하였다.

<표 39>

<표 40>

화합물 1의 경우, 인간 또는 래트 간세포에서의 리바비린 존재하 2'-C-메틸 구아노신 뉴클레오티드 농도에서 대조 농도와의 큰 차이는 관찰되지 않았다. 2'-C-메틸 구아노신의 경우, 래트 간세포에서 트리포스페이트 농도의 약간의 감소 (17 ％)가 나타난 반면, 인간 간세포 (n=1)에서는 38 ％의 감소가 관찰되었다. 그러나, 이와 같은 효과가 실제로 리바비린에 의한 2'-C-메틸 구아노신 포스포릴화의 억제와 관련된 것인지, 또는 1종의 공여체 만이 평가된 것으로 인한 분석 변이성 때문인지를 결정하기 위해서는 추가적인 평가가 필요할 것이다.

상기한 마이크로좀에서의 연구는 CYP3A가 화합물 1 대사에 역할을 할 수 있다는 것을 암시한다. 상기 연구에서, CYP3A 억제제인 리토나비르는 간 마이크로좀에서 NADPH-의존성 화합물 1 대사를 차단하였다. 10 μM의 [¹⁴C]-화합물 1을 사용한 배양 후 인간 및 래트 간세포에서의 대사 및 이후의 2'-C-메틸 구아노신 뉴클레오티드 형성에 대한 1 μM 리토나비르의 효과를 24시간 후에 평가하고, 표 39 및 표 40에 요약하였다. 인간 간세포에서, 리토나비르는 비처리 대조에 비해 화합물 7 농도를 30 ％ 감소시켰다. 그러나, 이와 같은 효과가 실제로 CYP450 촉매촉진 대사의 억제와 관련된 것인지, 또는 분석 변이성으로 인한 것인지를 결정하기 위해서는 추가적인 평가가 필요할 것이다. 래트 간세포 (n=2)에서는 2'-C-메틸 구아노신 뉴클레오티드 농도의 감소가 관찰되지 않았다.

결론

본 연구에서 입증된 바와 같이, [¹⁴C]-화합물 1은 2'-C-메틸 구아노신 뉴클레오티드의 형성 (화합물 5, 6 및 7)을 포함하여, 1차 간세포에서 광범위한 시험관내 대사를 받는다 (래트>원숭이>인간).

배양 배지에서, 2'-C-메틸 구아노신은 3종 전체의 종에서 관찰되는 주요 대사물이었다. 실시예 14의 간 마이크로좀에서의 연구는 5종의 주요 NADPH (CYP)-의존성 대사물, 즉 화합물 3 (3a 및 3b), U1, U2 및 U3를 확인하였다. 본 연구에서, U1 및 U3는 3종 전체의 종에서 검출되었다. 반면, U2는 어떠한 종에서도 검출되지 않았으며, 화합물 3 (3a 및 3b)은 래트 및 원숭이 간세포에서만 검출가능한 소량 대사물인 것으로 보였다. 화합물 5가 배양 배지에서 관찰되었는데, 세포 침투 전에 소정의 화합물 1 대사/분해가 이루어짐으로써, 2'-C-메틸 구아노신 배지 농도에 기여할 수 있다는 것을 암시한다.

1차 간세포의 추출물에서는, 3종 전체의 종에서 4-24시간에 60-81 ％의 총 세포내 방사능을 차지함으로써, 화합물 7이 주요 대사물이었다. 24시간에는, 래트 간세포에서의 소량 (1 ％)의 대사물 U1, 및 인간 간세포에서의 소량 (1-2 ％)의 변화되지 않은 화합물 1 이외에는, 2'-C-메틸 구아노신 및 그의 뉴클레오티드가 모든 세포내 방사능을 차지하였다.

2'-C-메틸 구아노신 뉴클레오티드는 [¹⁴C]-2'-C-메틸 구아노신을 사용한 배양에 비해 [¹⁴C]-화합물 1을 사용한 간세포의 배양 후에 실질적으로 더 높았다. 이는 특히 2'-C-메틸 구아노신을 사용한 배양 후 2'-C-메틸 구아노신 포스포릴화가 제한되는 경우에 그러하였다. 3종 전체의 종에서, 활성 트리포스페이트인 화합물 7의 농도는 2'-C-메틸 구아노신에서에 비해 화합물 1에서 2.3- 내지 19.7-배 더 높았다. 트리포스페이트 형성은 투여량 의존성인 것으로 보였으며, 인간 및 래트 간세포에서 각각 17.4 및 6.61시간의 생체 반감기를 나타내었다. 또한, 화합물 5가 화합물 1을 사용한 배양 후 1차 간세포에서 검출가능하였으며, 특히 2'-C-메틸 구아노신을 사용한 배양 후에 모노포스페이트가 검출불가능하거나 검출 한계에 있었던 원숭이 및 래트 간세포에서 2'-C-메틸 구아노신을 사용하여 관찰된 것에 비해 농도가 상당히 더 높았다.

1차 간세포와 달리, 화합물 7의 형성을 포함한 화합물 1 대사는 Huh7 세포에서 상당히 더 낮아서, 이후의 트리포스페이트로의 포스포릴화와 함께 화합물 5 방출로 이어지는 효소 경로(들)이 인간 간암 유래의 세포주에서보다 1차 간세포에서 더 활성일 수 있다는 것을 암시하였다. 그럼에도 불구하고, [¹⁴C]-화합물 1을 사용한 배양 후 Huh7 세포에서의 화합물 7 농도는 [¹⁴C]-2'-C-메틸 구아노신을 사용한 배양 후에 비해 실질적으로 더 높았다.

실시예 16

방사성표지된 화합물 1을 사용한 래트 대사 연구

방사성표지된 화합물 1을 사용하여 예비 래트 대사 연구를 수행하였다. 구아닌 잔기의 C-8 위치에서 [¹⁴C]를 사용하여 화합물을 표지하였다. 연구 목적은 1) 총 방사능의 혈장 약동학, 2) 간에서의 총 방사능 및 2'-C-메틸 구아노신-5'-TP의 시간-추이, 3) 배설의 주요 경로, 및 4) 배설물, 간 및 혈장에서의 대사 프로필을 확인하는 것이었다.

연구 설계

동위원소 희석 [¹⁴C]-화합물 1을 50 mg/kg으로 정맥내로, 또는 100 mg/kg으로 경구 섭식에 의해 수컷 스프래그-도울리(Sprague-Dawley) 래트에게 투여하였다. 연구 설계 및 샘플 수집에 대해서는 하기의 표에 요약하였다:

화합물 1 [구아닐-8-¹⁴C]은 캘리포니아 브레아 소재 모라벡 바이오케미칼즈(Moravek Biochemicals), Inc 사로부터 입수하였으며, 하기의 명세를 가졌다:

내용 화합물 1 [구아닐-8-¹⁴C]-

방사성화학물질 순도 98.4 ％ (이성질체로서)

비활성 54.8 mCi/mmol

배치/로트 번호 448-108-0548

분자량 628.4 g/mol

공급자 캘리포니아 브레아 소재

모라벡 바이오케미칼즈, Inc 사

전기한 하기의 절차 또는 그의 일상적인 변형에 따라 화합물 1을 제조하였으며, 하기의 명세를 가졌다:

내용 화합물 1

HPLC 순도 254 nm에서의 피크 면적에 의해 98.9

배치/로트 번호 JW-210-112-01

분자량 626.619 g/mol

공급자 이데닉스 파마슈티칼즈 사

본원에서 기술되는 절차 또는 그의 일상적인 변형에 따라 참조 화합물인 2'-C-메틸 구아노신, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5 (2'-C-메틸 구아노신-5'-MP), 화합물 7 (2'-C-메틸 구아노신-5'-TP), 화합물 6 (2'-C-메틸 구아노신-5'-DP, 화합물 7에 존재)을 제조하였다.

연구에 사용된 모든 화학물질들은 시약 등급 이상의 것이었다. 용매는 HPLC 등급이었으며, 버딕 앤드 존슨 사에서 구입하였다.

분석 절차

액체 씬틸레이션 계수 (LSC)

액체 씬틸레이션 계수 (LSC)에 의해 모든 샘플에서의 방사능을 정량하였다. LSC에는 베크만 코울터 LS6500 다목적 액체 씬틸레이션 계수기 (캘리포니아 풀러튼 소재 베크만 인스트루먼츠 사)를 사용하였다. 부피 기준으로 샘플을 분취하여 2반복으로 분석하였다. 각 액체 샘플에는 에코라이트™ (캘리포니아 어빈 소재 MP 사) 액체 씬틸레이션 칵테일을 사용하였다.

고-성능 액체 크로마토그래피

HPLC 분석을 위하여, 하기에 나타낸 바와 같은 액체 섬광물(scintillant) 셀을 사용하는 방사능 모니터를 사용하여 용리물 중 방사능을 검출하였다. 별도 성분의 방사능 백분율은 ProFSA 소프트웨어를 사용하여 피크를 적분함으로써 정량하였다. 하기에 열거된 시스템 및 조건을 사용하여 HPLC 분석을 수행하였다.

시스템 1: 아길렌트 1100 시리즈

ㆍ 웰 플레이트 오토샘플러

ㆍ 1100 샘플러용 온도조절장치

ㆍ 다이오드 배열 검출기

ㆍ 온도조절 컬럼 구획

ㆍ 4차 펌프

ㆍ 진공 탈기장치

ㆍ LC3D 버젼 A.10.02 (1757)용 켐스테이션

(델라웨어 소재 아길렌트 테크놀로지스, Inc 사)

ㆍ 유동 씬틸레이션 분석기 라디오매틱™ 625TR

ㆍ ProFSA 소프트웨어

(매사추세츠 소재 퍼킨 엘머 라이프 사이언스 사)

상기 시스템은 투여 제제의 분석, 및 소변, 대변 및 혈장에서의 대사 프로필에 사용되었다.

시스템 2: 아길렌트 1100 시리즈

ㆍ 웰 플레이트 오토샘플러

ㆍ 1100 샘플러용 온도조절장치

ㆍ 다이오드 배열 검출기

ㆍ 온도조절 컬럼 구획

ㆍ 4차 펌프

ㆍ 진공 탈기장치

ㆍ LC3D 버젼 B.01.01 (164)용 켐스테이션

(델라웨어 소재 아길렌트 테크놀로지스, Inc 사)

ㆍ 유동 씬틸레이션 분석기 라디오매틱™ 515TR

ㆍ 플로-원™ 소프트웨어

(매사추세츠 소재 퍼킨 엘머 라이프 사이언스 사)

상기 시스템은 간 추출물의 분석에 사용되었다.

크로마토그래피 조건

방법 1

ㆍ 컬럼: 페노메넥스® 루나 5 μ C18 (2), 4.6×250 mm

(캘리포니아 토란스 소재 페노메텍스 USA 사)

ㆍ 가드 컬럼: 시큐리티 가드 카트리지, 4×2 mm

(캘리포니아 토란스 소재 페노메텍스 USA 사)

ㆍ 컬럼 온도: 35 ℃

ㆍ UV 검출: 252 nm

ㆍ 방사능 검출: 500 μL 액체 셀, 섬광물 유동 칵테일 (얼티마 플로우-AP, 코네티컷 소재 퍼킨 엘머 라이프 사이언스 사), 4.5 mL/분으로

상기 방법은 투여전 및 투여후 제제 분취량을 분석하는 데에, 그리고 소변, 대변 추출물, 및 혈장 샘플을 HPLC 프로필화하는 데에 사용되었다.

방법 2

ㆍ 컬럼: 페노메넥스® 콜럼부스 5 μ C-18, 4.6×250 mm

(캘리포니아 토란스 소재 페노메텍스 USA 사)

ㆍ 가드 컬럼: 시큐리티 가드 카트리지, 4×2 mm

(캘리포니아 토란스 소재 페노메텍스 USA 사)

ㆍ 컬럼 온도: 주변온도

ㆍ UV 검출: 252 nm

ㆍ 방사능 검출: 500 μL 액체 셀, 섬광물 유동 칵테일 (얼티마 플로우-AP, 코네티컷 소재 퍼킨 엘머 라이프 사이언스 사), 3 mL/분으로

상기 방법은 간 추출물을 분석하는 데에 사용되었다.

도 4는 방법 2에 의해 수득된 참조 표준과 화합물 1 (부분입체이성질체 1 및 2) 혼합물의 대표적인 HPLC 크로마노그램을 제공한다.

샘플 제조 및 분석

간 및 혈장 샘플은 -80 ℃의 냉동장치에 저장하였으며, 다른 모든 샘플은 -20 ℃의 냉동장치에 저장하였다.

방사성화학물질 순도용 투여 제제

5 ％ DMSO를 함유하는 PEG 200 중에서 2종의 투여 제제 (IV 투여 군 1A-C용 50 mg/mL, 및 PO 투여 군 2A-C용 100 mg/mL)를 제조하였다. 투여량 투여 전 및 후에 투여 제제의 하위샘플을 제거하였다. 메탄올 (490 μL) 및 물 중의 20 mM 암모늄 포르메이트 (1500 μL)를 첨가함으로써, 각 하위샘플의 분취량 (10 μL)을 희석하였다. 방사성화학물질 순도의 측정을 위하여 HPLC법 1에 의해 희석된 투여 제제를 분석하였다.

소변

선택된 시점으로부터 4종 전체의 동물에 대하여 고정된 총 부피의 백분율을 혼합함으로써, 군 1C 및 2C용으로 혼합 소변 샘플을 제조하였다. 군 1C용으로는, 1-, 2-, 6- 및 24-시간 수집 간격의 샘플들을 혼합하였다. 군 2C용으로는, 24시간 수집 간격에 대해서만 4종 전체 동물로부터의 샘플 풀(pool)을 제조하였다. 1-, 2-, 및 6-시간 수집 간격에 대해서는, 군 2A 및 2B의 단일 동물의 소변 샘플을 분석에 사용하였다. 모든 샘플을 실온으로 하고, 간단하게 보르텍싱하였다. 필요에 따라 선택된 HPLC법 용의 적절한 수성 이동상을 사용하여 샘플을 희석하였다 (2- 내지 20-배). 24시간 수집 간격으로부터의 혼합 및 희석된 샘플을 2040×g로 10분 동안 원심분리하였다. 다른 모든 샘플은 원심분리 없이 분석하였다. HPLC 프로필화에는 HPLC법 1을 사용하였다. 마이크로좀 및 간세포 배양에 의해 생성된 대사 프로필 (실시예 14 및 15) 및 간 추출물의 대사 프로필과의 비교를 위하여, 선택된 샘플을 HPLC법 2에 의해 분석하였다.

대변

각 군에 대한 각 개별 동물 샘플 균질물의 총 중량 중 고정된 백분율을 조합함으로써, 군 1C 및 2C로부터 24시간 시간 간격용으로 혼합 샘플을 제조하였다. 15-mL 폴리프로필렌 원심분리 튜브에서 분취량을 혼합하였다. 혼합 샘플 (각각 대략 3 g)에, 4.5 mL의 MeOH-물 (70:30)을 첨가하였다. 상기 샘플을 1분 동안 보르텍싱하고, 10분 동안 초음파처리한 다음, 5700×g로 10분 동안 원심분리하였다. 상청액을 튜브로 옮기고, 상청액의 총 부피를 측정하였다. 2회 추가적으로 추출 절차를 반복하였다. 추출 회수율용 2반복 분취량 (각각 20 μL)의 LSC에 의해 각 추출물의 방사능을 측정하였다. LSC 및 HPLC에 의한 분석을 위하여, 각 추출물의 일부 (총 부피의 10 ％)를 혼합하였다. 합쳐진 추출물을 수성 이동상으로 희석 (1:4)하고, HPLC법 1을 사용하여 분석함으로써, 대사 프로필을 수득하였다. 시험관내의 것을 생체내 대사 데이터와 비교하기 위하여, 상기와 동일한 대변 샘플을 HPLC법 2에 의해 분석하였다.

HPLC 분석용 혈장 추출물

군 1A, 군 1C, 및 군 2A-C용으로 혼합 시간별 래트 혈장 샘플을 제조하였다. 4종 동물 각각으로부터의 혈장 1 mL를 조합함으로써, 풀을 제조하였다. 혼합 샘플의 하위샘플 (각각 2 mL)을 추출을 위하여 15-mL의 원추형 원심분리 튜브로 옮겼다. 각 하위샘플에, 6 mL의 메탄올을 첨가하고, 각 혼합물을 강하게 보르텍싱한 다음, 5700 ×g로 15분 동안 원심분리하였다. 상청액 (추출물 1)을 15-mL 튜브로 옮겼다. 메탄올 (2 mL)을 사용하여 펠렛을 추가적으로 추출하였다. 각 샘플을 강하게 보르텍싱함으로써 확실하게 혼합하였다. 상기 샘플을 상기한 바와 같이 원심분리하였다. 상청액 (추출물 2)를 제거하였다. 각 추출물의 총 부피를 기록하였다. 각 혼합 혈장 샘플 추출물 1 및 2의 비례량 샘플을 합치고, 스피드백(SpeedVac)에서 주변 온도로 농축한 후, 각 샘플에 대하여 메탄올 (50 μL), 및 총 부피 500 μL까지의 HPLC법 1 수성 이동상을 첨가함으로써 재구성하였다. 군 1B의 혼합 시간별 혈장을 제조한 후, 혼합 샘플 부피 (3.8 mL) 및 추출 부피 (제1 및 제2 추출에 대하여 각각 11.4 mL 및 4 mL) 이외에는 유사하게 추출하였다. 모든 추출물 및 재구성 추출물을 LSC에 의해 분석하였다. 충분한 방사능을 함유하는 재구성 추출물을 HPLC에 의해 분석하였다.

HPLC 분석용 간 추출물

드라이 아이스 상에서 20 mM EDTA 및 20 mM EGTA를 함유하는 70 ％ 메탄올-30 ％ 물 중에 균질물 (간의 약 1× (w/v) 중량)을 제조하고, 냉동 상태로 저장하였다. 각 군에 대한 각 개별 동물 샘플 균질물의 총 중량 중 고정된 백분율을 조합함으로써, 전체 군에 대하여 혼합 간 샘플을 제조하였다. 각 혼합 간 균질물 (3.77-5.02 g)을 50-mL 폴리프로필렌 원심분리 튜브에 넣고, 16.0 mL의 메탄올:물 (70:30)을 첨가하였다. 상기 샘플을 1분 동안 보르텍싱한 다음, 11200×g로 20분 동안 원심분리하였다. 상청액을 튜브로 옮기고, 총 부피를 측정하였다. 3회 추가적으로 추출 절차를 반복하였다. 추출 회수율용 2반복 분취량 (각각 100 μL)의 LSC에 의해 각 상청액의 방사능을 측정하였다. 비례량 혼합을 위하여 각 샘플로부터의 4종 전체 추출물의 하위샘플을 취하였다. 군 1에 대해서는, 농축 전에 하위샘플을 혼합하였으며, 군 2에 대해서는, 더 큰 부피가 사용되는 관계로 각 하위샘플을 별도로 농축한 다음 혼합하였다. 각 추출물을 대략 100 μL로 완전하게 건조 또는 감축하였다. 메탄올 (20 μL) 및 충분한 부피의 HPLC법 2 수성 이동상을 사용하여 각 재구성 샘플의 총 부피가 500 μL가 되도록 재구성을 수행하였다. 재구성 샘플의 2반복 분취량을 LSC에 의해 분석하였다. 각 샘플을 HPLC법 2에 의해 분석하였다.

투여된 투여량의 ㎍ 당량/g 및 백분율의 계산

각 수집 기간에서의 모 약물 및 각 대사물의 투여된 투여량의 백분율 (％ AD) = (대사물에 기인하는 샘플 중 총 방사능의 ％) * (해당 수집 기간 동안 회수된, 투여된 투여량의 ％로 표현된 총 방사능).

상기 계산에서, 추출 회수율에 대한 보정은 이루어지지 않았다.

각 수집 기간에서의 모 약물 또는 대사물의 마이크로그램 당량/g = (각 대사물의 ％ 방사능) * (해당 수집 기간 동안의 총 ㎍ 당량)

PK 파라미터의 계산

마이크로소프트^® 오피스 엑셀 2003을 사용하여 총 방사능용의 혈장 농도-시간 데이터를 분석함으로써, 농도-시간 곡선 아래의 면적 (AUC)를 수득하였다. 선형 사다리꼴 규칙 및 공칭 샘플링 시간을 사용하여 AUC0-24 (투여 후 0 내지 24시간의 농도-시간 곡선 아래 면적)을 계산하였다. IV 투여 군의 경우, 시간 0에서의 농도는 처음 2개의 시점에 대한 농도 데이터로부터 외삽하였다. 최대 (피크) 혈장 농도 (C_max) 및 피크 농도까지의 시간 (t_max)은 관측값이었다. 기술 통계는 엑셀에서 작성하였다.

유효 숫자 및 수의 반올림

유효 숫자에 대하여 일반적인 규칙을 적용하지는 않았다. 연구에 사용된 일반 분석 방법론으로 인하여, 더 많은 유효 숫자로 주어진 값이 그 값이 더 정밀함을 암시하는 것은 아니다. 스프레드시트 또는 계산기에의 진입을 위하여, 전체적으로 반올림된 정수가 사용된 LSC를 제외하고는, 기기-수득 값을 수득된 그대로 입력하였다. 표의 데이터는 반올림된 수로 나타내었다.

투여량 분석 및 투여량 투여

투여 제제의 분석

하기의 절차에 의해 2종의 투여 제제 (IV 투여 군 1A-C용의 50 mg/kg 및 PO 투여 군 2A-C용의 100 mg/kg)을 제조하였다. 양 제제는 5 ％ DMSO를 함유하는 PEG 200 중에서 제조하였다. 필요한 양의 방사성 물질을 칭량한 후, 약주걱을 사용하여 미세한 분말로 마쇄하였다. PEG 200 및 칭량된 시험 항목 최종 부피의 30 ％를 자석 교반하에 교반하면서 제제화 바이알에 첨가하여 균일한 제제를 수득하였다. 최종 부피는 PEG 200을 사용하여 맞추었다. 상기 제제를 실온에서 15분 동안 또는 그 이상 초음파처리하여 균질 현탁액을 수득하였다. 제제가 균질해질 때까지 초음파처리/교반의 주기를 계속하였다. 균질성 (CV)의 측정을 위하여 3반복 분취량을 제거하였다. 제제의 방사능 농도를 측정하고, 비활성을 계산하였다.

490 μL의 메탄올 및 1.5 mL의 수성 이동상을 사용하여 각 제제 10 μL를 희석한 후, 투여 분취량을 HPLC 방법 1에 의해 분석하였다.

투여 전 및 후의 투여 제제 중 시험 항목의 방사성화학물질 순도를 하기 표에 나타내었다:

<표 41>

상기 데이터는 투여 제제가 투여량 투여 시간 동안 안정하다는 것을 나타낸다.

투여량 투여

군 1 및 2에 대한 목표 투여 농도는 각각 50 mg/kg (IV) 및 100 mg/kg (PO)이었다. 평균 투여 데이터를 하기 표에 요약하였다:

<표 42>

약동학

총 방사능의 약동학

혈장 샘플의 방사성분석을 수행하였다. ㎍ 당량/mL로 표현된 총 방사능에 대한 혈장 농도 데이터를 하기에 요약하였다:

IV 투여 군의 경우, 총 방사능의 농도는 1시간까지 빠르게 감소된 다음, 2시간에 다시 증가된다. 4시간에서의 감소 후, 6시간에 농도의 2차 증가가 관찰되었다. 유사하게, PO 투여 군에 대해서도 2시간 및 6시간에 농도의 상승이 관찰되었다. 이와 같은 양상은 방사능의 장간 순환 및 재흡수를 암시한다.

각 투여 군에 대한 평균 농도 데이터로부터 AUC 값을 계산하였다. 시간 0에서의 농도 (C₀)는 0.08- 및 0.25-시간 시점에서의 농도로부터 외삽에 의해 계산하였다. AUC0-24 값은 IV 및 PO 투여 군에 대하여 각각 36.0 및 15.4 시간ㆍ㎍ 당량/mL이었다. 총 방사능의 투여량 표준화 흡수율은 대략 22 ％이었다.

화합물 1 및 2'-C-메틸 구아노신의 혈장 농도는 LC-MS에 의해 측정된다.

간에서의 총 방사능

투여 후 2, 6 및 24시간에 IV 및 PO 투여 군 모두의 동물들로부터 간 샘플을 수집하였다. 상기 샘플을 절단 후 순간 냉동시키고, 균질화 동안 드라이 아이스 상에서 유지하였다. 균질화는 드라이 아이스 상의 20 mM EDTA 및 20 mM EGTA를 함유하는 70 ％ 메탄올-30 ％ 물 (간의 약 1× (w/v) 중량) 중에서 수행하였다. 3반복 칭량된 분취량 (약 500 mg)을 팩카드 (Packard) 샘플 산화장치에서 연소시킨 후, LSC 분석을 수행하여 방사능을 측정하였다 (9100 μL Spec-Chec®). 간에서의 총 방사능 농도에 대한 평균 데이터를 하기에 요약하였다.

<표 43>

IV 투여 군에 대한 데이터는 약물의 간 추출이 매우 조기에 (투여 2시간 이내) 이루어지며, 매우 효율적이라는 것을 암시한다.

투여된 투여량의 배설

각 동물의 소변 및 대변을 방사성표지 함량에 대하여 분석하였다. 소변 및 대변 배설의 합계로서의 데이터를 하기에 요약하였다:

<표 44>

모든 투여 군에 대한 소변 배설의 데이터를 하기의 표에 요약하였다:

<표 45>

경구 투여 군에서의 방사능의 저조한 소변 배설은 저조한 흡수를 나타내는데, 이와 같은 관찰은 약동학적 데이터와 일치한다.

대변 배설의 데이터를 하기에 요약하였다:

<표 46>

군 1C에 대한 데이터는, IV 투여량의 39 ％가 대변에서 회수됨으로써, 광범위한 담즙 분비를 암시한다. 경구 투여 군에 있어서, 대변 배설은 제1 제거 경로였다. 총 투여 방사능의 대략 91 ％가 대변을 통하여 제거되었다. 담즙 분비가 중요한 제거 경로를 나타내기 때문에, 소변 및 대변에서 회수되는 경구 투여 투여량의 양은 흡수의 범위를 평가하는 데에 사용될 수 없었다.

대사물의 정량 및 분포

상기한 바와 같은 방사성화학물질 검출을 사용한 HPLC 분석을 위하여, 소변, 대변, 혈장 및 간 추출물을 제조하였다. 대변, 간 및 혈장 추출물에 대한 용매 추출 회수율을 표 47에 나타내었다. HPLC법 1 및 HPLC법 2에 의해 분석된 참조 표준의 체류 시간을 표 48에 제공하였다.

<표 47>

<표 48>

소변 대사물

군 1C에 대하여 전 시점 혼합 소변 샘플의 HPLC 분석을 수행하였다. HPLC 피크 면적 분포의 백분율 및 투여된 투여량의 백분율로 표현된 데이터를 표 49에 요약하였다. 체류 시간을 기준으로 대사물 R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 및 R8을 특성화하였다.

<표 49>

모든 소변 샘플 역시 HPLC법 2에 의해 분석하였다. 이와 같은 방법을 상기한 시험관내 대사 실험 및 간 추출물의 분석에 사용하였다. 이와 같은 방법은 또한 참조 표준과의 체류 시간 비교에 의한 대사물의 확인을 위한 추가적인 증거를 제공하였다.

PO 투여 군의 경우에는, 24-시간 수집 시간으로부터의 혼합 소변 샘플을 분석하였다. 1-, 2-, 및 6-시간 수집 시간의 경우, 대부분의 샘플이 방사성분석에 사용되었다. 나머지 샘플은 비례량 혼합에 불충분하였다. 따라서, 1A 또는 1B 군의 단일 동물 샘플을 HPLC 프로필화에 사용하였다. HPLC 분포의 백분율 및 투여된 투여량의 백분율로서의 데이터를 표 50에 요약하였다. 체류 시간을 기준으로 대사물 R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 및 R8을 특성화하였다.

<표 50>

표 50은 단일 동물 샘플 및 혼합 샘플로부터의 데이터를 포함하고 있다. 소변 대사물의 전체적인 분포를 평가하기 위하여, 단일 동물로부터의 프로필이 전체적인 평균 대사 프로필을 반영하는 것으로 가정하였다. 그에 따라, 단일 동물로부터의 HPLC 분포 데이터를 사용하여 1-, 2-, 및 6-시간 수집 간격 동안 다양한 대사물로서 배설된 투여 투여량의 백분율을 계산하였다. 평가 데이터를 표 51에 요약하였다. 체류 시간을 기준으로 대사물 R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 및 R8을 특성화하였다.

<표 51>

2종의 소변 샘플 (동물 번호 19의 6-시간 샘플 및 24-시간 수집으로부터의 혼합 소변)을 HPLC법 2에 의해 분석하였다.

방법 1을 사용한 HPLC 분석으로부터의 데이터를 대사물의 분포를 계산하는 데에 사용하였다. IV 투여 군의 소변에서는, 화합물 1이 주요 성분이었다. 그것은 투여 투여량의 26.1 ％, 및 총 소변 배설의 55.6 ％를 차지하였다. 2'-C-메틸 구아노신이 주요 대사물이었다 (18.0 ％ AD, 총 소변 배설의 38.4 ％). 1종의 극성 대사물 (R1으로 지칭)이 1.0 ％ AD 및 총 소변 배설의 2.3％를 나타내었다. 다른 모든 대사물들은 0.2 ％ AD 미만으로 존재하였다.

PO 투여 군의 경우, 2'-C-메틸 구아노신이 2.6 ％ AD의 평가 농도로 존재하며 총 소변 배설의 90.4 ％를 차지하는 주요 소변 성분이었다 (표 51). 극성의 대사물인 R1은 0.1 ％ AD로 검출되었으며, 총 소변 배설의 4.5 ％를 차지하였다. 화합물 1은 0.02 ％ AD 만을 차지하였다. 그것은 1-시간 시점에서만 가장 풍부한 성분이었으며, 1시간 이내에 소변을 통하여 제거되는 총 방사능의 74.8 ％를 차지하였다. 6시간까지, 그것은 총 소변 배설의 6.6 ％ 만을 차지하였다.

화합물 2 및 화합물 3은 매우 낮은 농도로 존재하였으며, HPLC법 1 및 2를 사용하여 적절한 참조 표준에 의해 유사한 체류 시간을 기준으로 확인되었다.

대변 대사물

상기한 바와 같은 HPLC 분석을 위하여, 혼합 대변 샘플을 추출 및 제조하였다. 24시간 수집물의 대변 샘플만을 분석하였다. 낮은 총 방사능 및 샘플 크기로 인하여, 6시간 수집물은 분석되지 않았다.

방사성화학물질 검출을 사용하는 HPLC에 의해 상기 샘플들을 분석하였다. 이러한 분석들로부터 투여된 투여량의 ％로서의 대사물의 분포를 유도하였다. IV 및 PO 투여 군 모두의 혼합 대변 추출물의 HPLC 분석 데이터를 표 52에 제공하였다. 양 혼합 대변 추출물 역시 HPLC법 2에 의해 분석하였다. 체류 시간을 기준으로 대사물 R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 및 R8을 특성화하였다.

<표 52>

방법 1을 사용한 HPLC 분석으로부터의 데이터를 대사물의 분포를 계산하는 데에 사용하였다. 양 투여 군에 있어서, 화합물 1이 가장 풍부한 대변 중 성분이었다. 그것은 IV 및 PO 투여 군에 대하여 각각 19.7 ％ 및 65.6 ％ AD (총 대변 배설의 50.6 ％ 및 71.9 ％)를 차지하였다 (표 52). 2'-C-메틸 구아노신이 IV 투여 군에 있어서의 주요 대사물로써, 16.0 ％ AD (총 대변 배설의 41.0 ％)를 차지하였다. PO 투여 군의 경우에는, 2'-C-메틸 구아노신이 유일한 대사물이었다 (25.6 ％ AD, 총 대변 배설의 28.1 ％). IV 투여 군의 경우, R11 및 R10으로 지칭되는 2종의 소량 대사물이 각각 1.9 및 1.3 ％ AD (총 대변 배설의 5.0％ 및 3.4 ％)로 검출되었다. 대사물 R11 및 R12는 각각 실시예 14 및 15에서 마이크로좀 및 간세포 배양에 의해 생성되는 대사물 U3 및 U1과 크로마토그래피상 동일하였다.

화합물 1 및 그의 주요 대사물인 2'-C-메틸 구아노신의 총 배설

화합물 1 및 그의 주요 대사물 2'-C-메틸 구아노신의 총 배설을 각 성분의 총 소변 및 총 대변 배설의 합계로서 계산하였다. 군 C의 경우, 평가 데이터를 소변 회수율을 계산하는 데에 사용하였다. 화합물 1의 전체 배설은 IV 및 PO 투여 군에 대하여 각각 투여된 투여량의 45.9 ％ 및 65.6 ％이었다. 2'-C-메틸 구아노신의 배설은 각 투여량의 34.0 ％ 및 28.2 ％를 차지하였다.

<표 53>

혈장 대사물

상기한 바와 같은 HPLC 분석을 위하여 시간별 혈장 샘플을 혼합, 추출 및 제조하였다. 군 1의 경우, 시간별 혈장 샘플 (2, 6, 및 24시간)을 혼합 및 제조하고, 상기한 바와 같이 HPLC에 의해 분석하였다. 군 2의 경우, 6-시간 샘플만이 분석에 충분한 방사능을 가졌다. 모든 혈장 샘플에서 관찰된 유일한 검출가능 대사물은 2'-C-메틸 구아노신이었다. 2-시간 혈장은 2'-C-메틸 구아노신일 수 있는 2.1분에서 용리되는 극성의 피크를 나타내었다. 2'-C-메틸 구아노신이 매트릭스 성분과 상호작용하며 그것이 용매 전면 (대략 2분)에서 대사물의 부분 용리를 야기하는 것이 관측되었다. 수성 이동상을 사용한 희석 후 샘플을 재분석하였을 때, 이와 같은 성분은 사라졌다.

간 대사 프로필

개별 동물로부터의 샘플의 중량에 따른 비례량 혼합에 의해 양 투여 군에 대하여 각 시점에서 간 균질물을 혼합하였다. 상기한 바와 같은 HPLC 분석을 위하여 혼합 샘플을 추출 및 제조하였다. 대사물의 풍부도를 투여된 투여량의 ％ 및 ㎍ 당량/g으로서 측정하였다. 데이터를 각각 표 54, 표 55, 표 56 및 표 57에 나타내었다. 체류 시간을 기준으로 대사물 R1, R8 및 R9를 특성화하였다.

<표 54>

<표 55>

<표 56>

<표 57>

IV 투여 군의 2종의 간 추출물 (군 1A로부터의 2-시간 샘플 및 군 1B로부터의 6-시간 샘플)에서만 HPLC 방사성화학물질 검출법에 의해 낮은 농도로 2'-C-메틸 구아노신-5'-TP이 관찰되었다. 그것은 군 1A 간에서 0.05 ％ AD, 그리고 군 1B 간에서 0.04 ％를 차지하였다 (표 54). 화합물 7의 농도는 군 1A에서 0.60 화합물 1 ㎍ 당량 /간g, 그리고 군 1B에서 0.48 화합물 1 ㎍ 당량 /간g이었다 (표 56).

IV 투여 군의 간 추출물에서의 주요 대사물은 2, 6, 및 24시간에 투여량의 9.7 ％, 6.4 ％, 및 1.1 ％를 차지하는 화합물 5이었다. 이러한 값은 샘플에서의 총 방사능의 60-63 ％를 나타내었다 (표 54). 경구 투여 군으로부터의 어떠한 간에서도 화합물 5는 HPLC법에 의해 검출되지 않았다. IV 군 샘플에서 화합물 6은 투여량의 3.4 ％, 2.0 ％, 및 0.29 ％로 존재하였다. 이러한 농도는 간에서의 총 방사능의 대략 16-22 ％를 나타낸다 (표 54). 경구 투여 군 샘플의 경우, 화합물 6은 2, 6, 및 24시간에 각각 투여된 투여량의 0.04 ％, 0.06 ％, 및 0.08 ％로 관찰됨으로써, 간에서의 총 방사능의 15-46 ％를 나타내었다 (표 55).

2'-C-메틸 구아노신은 IV 투여 군의 경우 간에서의 총 방사능의 대략 14-24 ％, 그리고 PO 투여 군의 경우 간에서의 총 방사능의 대략 54-85 ％를 차지하였다. IV 투여 군의 간 샘플에서는, 3종의 소량 미확인 대사물이 검출되었다.

추출물의 예비 조사는 경구 투여 군 샘플에서의 3종 전체 포스포릴화 화합물의 존재를 밝혔다. 투여된 [¹⁴C]-화합물 1의 낮은 농도 및 낮은 비활성으로 인하여, 모노포스페이트 및 트리포스페이트는 이들 샘플에서 방사성HPLC 분석에 의해 검출되지 않았다.

24시간 기간의 노출 후 소변, 대변 및 간에 있어서의 비교용 대사물 프로필을 표 58에 나타내었다. 체류 시간을 기준으로 대사물 R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 및 R9를 특성화하였다.

<표 58>

결론

[¹⁴C]-화합물 1의 단일 투여량을 제공받은 래트에서, 방사능의 전체적인 소변 및 대변 회수율은 24시간 이내에 IV 투여의 86 ％ 및 PO 투여의 94 ％를 차지하였다. 경구 투여된 군에서의 제1 제거 경로는 대변 배설 (투여량의 91 ％)이었다. IV 군의 경우, 소변 (투여량의 47 ％) 및 대변 (투여량의 39 ％)에서 거의 동일한 양의 방사능이 회수되었다.

IV 투여 후에는, 변화되지 않은 화합물 1이 주요 방사성 성분 (투여량의 26 ％)이었으며, 2'-C-메틸 구아노신이 소변에서 관찰되는 주요 대사물 (투여량의 18 ％)이었다. 제2의 더욱 극성인 대사물이 IV 투여의 1.1 ％를 차지하였다. 다른 모든 대사물들은 투여된 투여량의 0.2 ％ 미만으로 존재하였다. 대변으로 배설되는 방사능의 91 ％ 이상이 변화되지 않은 화합물 1 및 2'-C-메틸 구아노신으로 회수되었다. 이들 2종 화합물들의 대변 회수율은 IV 투여의 20 및 16 ％, 그리고 PO 투여의 66 및 26 ％를 차지하였다.

경구 투여 후에는, 2'-C-메틸 구아노신이 소변에서의 주요 투여-관련 성분 (투여량의 2.6 ％)이었다. 극성의 대사물인 R1은 0.1 ％를 차지하였으며, 화합물 1은 경구 투여량의 겨우 0.02 ％를 차지하였다. 추정 대사물인 화합물 2 및 화합물 3은 매우 낮은 농도로 검출되었다.

양 투여 군에 있어서, 화합물 1이 가장 풍부한 성분이었다 (IV 투여의 20 ％ 및 경구 투여의 66 ％). 2'-C-메틸 구아노신은 IV 군의 대변에서 관찰되는 주요 대사물이었으며 (투여량의 16.0 ％), PO 투여 군의 대변에서 검출되는 유일한 대사물이었다 (투여량의 26 ％). IV 투여 군에서는, R11 및 R10으로 지칭되는 2종의 소량 대사물이 투여된 투여량의 각각 1.9 ％ 및 1.3 ％로 검출되었다.

래트에서, 투여량 표준화 AUC₀ _-24 값은 방사성 투여량의 경구 생체이용률이 22 ％이었음을 암시한다. 이와 같은 데이터는 화합물 1, 그의 주요 대사물인 2'-C-메틸 구아노신 및 다양한 다른 소량 대사물들의 합쳐진 생체이용률을 반영한다. 그러나, IV 투여 중 상당량 (39 ％)이 대변으로 배설되면서 광범위한 담즙 분비를 나타내기 때문에, 경구 투여량의 흡수 범위는 22 ％를 초과할 것으로 예상된다.

[¹⁴C]-화합물 1의 IV 투여 후, 간에서의 총 방사능의 농도는 2시간에 투여된 투여량의 16 ％, 6시간에 10 ％를 나타내었다. 간에서의 총 방사능은 24시간까지 투여량의 1.8 ％로 감소되었다. 이러한 방사능 농도는 206, 137 및 23의 화합물 1 ㎍ 당량/간g에 해당한다.

경구 투여 후에는 간 농도가 상당히 더 낮아서, 2, 6 및 24시간에서 각각 투여량의 0.2 ％, 0.4 ％ 및 0.2 ％를 차지하였다. 그럼에도 불구하고, 이러한 농도는 5, 10 및 4의 화합물 1 ㎍ 당량/간g에 해당한다.

IV 투여 군 간 추출물에서의 주요 대사물은 2'-C-메틸 구아노신의 모노포스페이트로써, 이것은 2, 6, 및 24시간에 각각 투여된 투여량의 9.7 ％, 6.4 ％, 및 1.1 ％를 차지하였다. 이러한 값들은 간에서의 총 방사능의 60-63 ％를 나타낸다. 디포스페이트의 농도는 간에서의 방사능의 16-22 ％를 차지하며, 3개의 각 시점에서 IV 투여의 3.4, 2.0, 및 0.3 ％를 나타낸다. IV 투여 군의 2시간 및 6시간 샘플링 시점에서의 2종의 혼합 간 추출물에서, 방사성표지된 2'-C-메틸 구아노신-5'-TP가 HPLC 분석에 의해 낮은 농도로 검출되었으며, 투여된 투여량의 0.04-0.05 ％를 나타내었다. 2'-C-메틸 구아노신은 IV 투여 군의 간에서의 총 방사능의 대략 14-24 ％를 차지하였다.

[¹⁴C]-화합물 1의 경구 투여 후에는, 모든 간 샘플에서 화합물 5 또는 7 중 어느 것도 HPLC법에 의해 검출되지 않았다. 디포스페이트는 2-, 6-, 및 24-시간 시점에서 각각 방사성 투여량의 0.04, 0.06 및 0.08 ％를 나타내었다. 이러한 농도는 해당 샘플링 시간에서의 간에서의 총 방사능의 15-46 ％에 해당하는 것으로써, 각각 1.1, 1.6 및 1.9 화합물 1 ㎍ 당량/간g과 같다. PO 군의 간에서 2'-C-메틸 구아노신은 방사능의 54-85 ％를 차지하였다.

이와 같은 연구는 비교적 다량의 화합물 1이 IV 투여에 의해 전달되었을 때, 화합물 5가 래트 간에서 발견되는 주요 투여-관련 성분이라는 것을 나타낸다. 경구 투여 후에는, 상당히 낮은 농도의 투여-관련 물질이 간에서 발견되며, 화합물 6이 주요 분자 형태이다.

실시예 17

HCV 레플리콘에 대한 화합물 1과 리바비린 (RBV)의 시험관내 조합 연구

GS4.1 세포 (문헌 [Zhu et al ., 2003, J. Virol ., 77:9204-9210])에서의 HCV 레플리콘에 대한 리바비린 (RBV)과 조합된 화합물 1의 항바이러스 활성을 하기와 같이 측정하였다.

GS4.1 세포주는 HCV 유전형 1b 레플리콘 (문헌 [Lohmann 1999, Science 285 (5424): 110-3])을 포함한다. 화합물 1과 RBV를 분석 배지 중에 4× 모액으로 희석하였다. 5-포인트 적정을 위하여, 분석 배지 중에서 상기 개시 4× 모액으로부터 4회의 추가적인 1.25-배 연속 희석을 수행하였다. 5×5 바둑판 설계의 96-웰 플레이트에, 화합물 1 약물 희석액은 수평으로 첨가하고, RBV 희석액은 수직으로 첨가하였다. 각 플레이트에서 이와 같은 설정을 2반복으로 전개하였다. 최종 약물 농도는 단일-약물 적정 실험에서 경험적으로 결정된 화합물 1 및 RBV EC₅₀ 값의 1.5× 내지 0.6×의 범위이었으며; 화합물 1의 EC₅₀은 0.4±0.09 μM이었고, RBV의 EC₅₀은 21.8±3.6 μM이었다. 약물 처리 3일 후, 효소-연관 면역흡착 분석 (ELISA)를 사용한 바이러스 NS4A 단백질의 정량에 의해 HCV 레플리콘의 억제를 측정하였다. HCV 레플리콘 ELISA의 전개 및 평가에 대해서는 연구 보고서 [IDIX-08-106]에 상세하게 기술되어 있다.

이러한 분석에서는 시험 화합물의 세포독성이 약물-약물 상호작용 분석을 왜곡할 수 있기 때문에, 하기하는 절차 (문헌 [Mosmann 1983 J. Immunol . Meth , 65, 55-63])를 사용하여 세포독성 분석을 병행 수행하였다. 분석의 해독정보는 황색 MTS 테트라졸륨 화합물의 자주색 포르마잔 생성물로의 생체환원에 의해 측정하였다. 이와 같은 전환은 대사적으로 활성인 세포 중의 NADPH 또는 NADH에 의해 매개되며, 그에 따라 배양물 중 생존 세포의 수에 직접적으로 비례한다. 플레이트를 상기한 바와 같이 설정하였다.

시험관내 조합 데이터 분석은 맥시너지(MacSynergy)TM II 프로그램 (블리스(Bliss) 독립 모델) 및 콤비툴(CombiTool) 소프트웨어 (로외(Loewe) 부가 모델)을 사용하여 수행하였다. 또한, 칼큐신(CalcuSyn) 프로그램을 사용하여 계산된 EC₅₀에서의 CI를 계산하였다.

대조

1. 무약물 대조: 분석 배지 중 HCV 레플리콘 (GS4.1) 세포.

2. 단일 약물 대조: 화합물 1 단독으로 처리된 HCV 레플리콘 (GS4.1) 세포.

3. 단일 약물 대조: RBV 단독으로 처리된 HCV 레플리콘 (GS4.1) 세포.

4. 양성 NS4A ELISA 대조: 분석 배지 중 HCV 레플리콘 (GS4.1) 세포.

5. 음성 NS4A ELISA 대조: 분석 배지 중 Huh-7 세포.

6. 양성 세포독성 대조: 분석 배지.

7. 음성 세포독성 대조: 분석 배지 중 HCV 레플리콘 (GS4.1) 세포.

세포주

각 세포주를 시험하여, ATCC 마이코플라스마 테스팅 서비스(Mycoplasma Testing Services)에서 DNA 염색 및 직접 배양 PCR 절차에 의해 마이코플라스마에 대하여 음성인 것을 찾았다.

Huh-7 세포주는 인간 간암 세포로부터 유래한 것이다 (문헌 [Nakabayashi, 1982, Cancer Res . 42:3858-3863]). Huh-7 세포를 75 cm² 코닝 플라스크 내의 Huh-7 생장 배지 중에서 5 ％ CO₂를 사용하여 37 ℃로 유지하고, 트립신-EDTA를 사용하여 대략 80 ％ 융합(confluence)으로 붕괴시켰다.

GS4.1 세포주는 Huh-7 인간 간 세포주로부터 유래한 것으로써, 2시스트론 HCV 레플리콘을 안정적으로 보유한다. 세포를 75 cm² 코닝 플라스크 내의 GS4.1 생장 배지 중에서 5 ％ CO₂를 사용하여 3 ℃로 유지하고, 트립신-EDTA를 사용하여 대략 80 ％ 융합(confluence)으로 붕괴시켰다.

시약

본 연구에서 사용된 시약은 하기의 공급처로부터 구입하였다:

트립신-EDTA, 공급처: 셀그로(Cellgro) 사; 메탄올, 공급처: 버딕 & 잭슨 사; 아세톤, 공급처: J.T. 베이터 사; 항-C형 간염 NS4A 마우스 단일클론 항체 (mAb), 공급처: 비로겐(Virogen) 사; 세척 용액 농축액 (20×), 공급처: KPL 사; HRP-염소 항-마우스 IgG (H+L) 접합 항체, 공급처: 자이메드 사; 오르소-페닐렌디아민 (OPD 정제), 공급처: 자이메드 사; 과산화 수소 30％ 용액 (H₂O₂), 공급처: EMD 사; 황산 (H₂SO₄), 공급처: 말린크로트 케미칼즈(Mallinckrodt Chemicals) 사; 셀타이터(CellTiter) 96® 아퀘오우스 원(AQueous One) 용액 세포 증식 분석 (MTS-기반), 공급처: 프로메가 사; 시트르산, 트리나트륨 염, 2수화물, 공급처: 시그마-알드리치 사; 나트륨 포스페이트, 2염기성 (Na₂HPO₄), 공급처: 피셔 케미칼즈; 트리즈마(Trizma)® 히드로클로리드 용액 (트리스-HCl), 공급처: 시그마-알드리치 사; 염화 나트륨 (NaCl) 용액 5.0 M, 공급처: 어플라이드 바이오시스템 사; 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA) 용액 0.5 M 공급처: 시그마-알드리치 사; 디메틸 술폭시드 (DMSO), 공급처: 시그마-알드리치 사; 제네티신(Geneticin)® (G418), 100×, 공급처: 셀그로 사; 이글 배지의 둘베코 변형 (DMEM), 공급처: 셀그로 사; 소 태아 혈청 (FBS), 열 불활성화, 공급처: 셀그로 사; 페니실린/스트렙토마이신 용액 (mL 당 10,000 IU/mL 당 10,000 ㎍), 공급처: 셀그로 사; 글루타맥스(GlutaMAX), 디펩티드 L-글루타민 (200 mM), 공급처: 기브코 사; 및 MEM 비필수 아미노산, 공급처: 셀그로 사.

배지 및 버퍼

1. Huh-7 세포용 완전 생장 배지: 10 ％ 소 태아 혈청, 100 IU/mL 페니실린, 100 ㎍/mL 스트렙토마이신, 2 mM 글루타맥스, 및 1 ％ MEM 비필수 아미노산이 보충된 1× DMEM (글루코스, L-글루타민 및 나트륨 피루베이트 함유).

2. GS4.1 세포용 완전 생장 배지: 10 ％ 소 태아 혈청, 100 IU/mL 페니실린, 100 ㎍/mL 스트렙토마이신, 2 mM 글루타맥스, 1 ％ MEM 비필수 아미노산, 및 0.5 mg/mL 제네티신 (G418)이 보충된 1× DMEM (글루코스, L-글루타민 및 나트륨 피루베이트 함유).

3. 분석 배지: 1 ％ DMSO를 포함하는 Huh-7 완전 생장 배지.

4. ELISA 세척 용액: dH₂O 중에 1×로 희석된 KPL 세척 용액.

5. 10 ％ FBS-TNE: 50 mM 트리스-HCl (pH 7.5; 시그마 사), 100 mM NaCl, 10 ％ FBS를 포함하는 1 mM EDTA.

6. 시트레이트/포스페이트 버퍼: 16 mM 시트르산, 27 mM Na₂HPO₄.

7. OPD 용액: 플레이트 당 1 OPD 정제 + 12 mL 시트레이트/포스페이트 버퍼 + 5 mL 30 ％ H₂O₂.

약물 처리

96-웰 플레이트에, 50 μL의 완전 생장 배지 중에 열 당 7.5×10³ 세포의 밀도로 GS4.1 (열 A-G) 및 Huh-7 (열 H) 세포를 각각 접종하였다.

화합물 1 및 RBV를 분석 배지 중에 4× 모액으로 희석하였다. 분석 배지 중에서 상기 4× 모액으로부터 각 화합물의 4회의 추가적인 1.25-배 연속 희석액을 제조하였다.

세포를 37 ℃/5 ％ CO₂로 4시간 이상 동안 배양한 다음, 5×5 바둑판 설계 중에 25 μL의 연속 화합물 1 약물 희석액을 수평으로, 25 μL의 연속 RBV 희석액을 수직으로 첨가함으로써 약물 처리를 개시하였다. 각 96-웰 플레이트에서 이와 같은 설정을 2반복으로 전개하였다. 양 약물의 최종 농도는 단일-약물 적정 실험에서 경험적으로 결정된 그의 각 EC₅₀ 값의 1.5× 내지 0.6×의 범위이었다.

세포를 억제제와 함께 37 ℃/5 ％ CO₂로 3일 동안 배양하였다.

HCV 레플리콘 ELISA

약물 처리 3일 후, 천천히 부어 플레이트로부터 배지를 제거하고, 100 μL/웰의 1:1 아세톤:메탄올을 사용하여 플레이트에 세포를 고정시켰다.

실온에서 1분 배양 후, 플레이트를 100 μL/웰의 ELISA 세척 용액으로 3회 세척한 다음, 150 μL/웰의 10 ％ FBS-TNE를 사용하여 블로킹하였다.

실온에서 1시간 배양 후, 플레이트를 100 μL/웰의 ELISA 세척 용액으로 3회 세척한 다음, 100 μL/웰의 마우스 항-C형 간염 NS4A mAb (10 ％ FBS-TNE 중에 1:4000으로 희석된 1 mg/mL 모액)를 첨가하였다.

37 ℃에서의 2시간 배양 후, 플레이트를 100 μL/웰의 ELISA 세척 용액으로 3회 세척한 다음, 100 μL/웰의 HRP-염소 항-마우스 항체 (10 ％ FBS-TNE 중에 1:3,500으로 희석)를 첨가하였다.

37 ℃에서의 1시간 배양 기간 후, 각 플레이트를 100 μL/웰의 ELISA 세척 용액으로 3회 세척하였다. 다음에, 100 μL/웰의 OPD 용액을 사용하여 색상 발현을 개시하였다.

어둠 속 실온에서의 30분의 배양 기간 후, 100 μL의 2N H₂SO₄를 각 웰에 첨가함으로써, 반응을 중지하였다.

빅터 (Victor)³ V 1420 다표지 계수기 (퍼킨 엘머 사)에서 490 nm로 흡광도를 측정하였다. 2반복 웰의 평균을 사용하여 각 약물 및 약물 조합에 대하여 HCV 레플리콘 복제의 ％억제를 계산하였다. XLfit4.1 소프트웨어에 의해 결정된 최종 최고-정합 방정식으로부터 화합물 1 단독 및 RBV 단독에 대하여 50 ％ 효과 농도 (EC₅₀) 값을 계산하였다. 블리스 독립 모델 (맥시너지™ II) 및 로외 부가 모델 (콤비툴 사)을 사용하여 시험관내 조합 데이터 분석을 수행하였다. 또한, 칼큐신프로그램을 사용하여 계산된 EC₅₀에서 평균 CI를 계산하였다.

MTS 분석을 사용한 GS4.1 세포 상에서의 화합물 1 및 RBV의 세포독성 측정

세포를 플레이팅하고, 상기한 약물 매트릭스를 사용하여 억제제로 처리하였다.

약물 처리 3일 후, 20 μL의 MTS를 각 웰에 첨가한 다음, 37 ℃/5 ％ CO₂로 플레이트를 배양하였다.

3시간의 배양 후, 빅터³ V 1420 다표지 계수기 (퍼킨 엘머 사)에서 490 nm로 흡광도를 측정하였다. XLfit 4.1 소프트웨어에 의해 결정된 최종 최고-정합 방정식으로부터 각 약물 및 약물조합에 대한 50 ％ 세포독성 농도 (CC50) 값을 측정하였다.

본 연구에서 사용된 실험 조건하에서는, 화합물 1 및 RBV 단독, 또는 이들의 조합으로 처리된 세포에서 시험관내 세포독성의 증거는 관찰되지 않았다.

약물 조합 데이터의 분석

맥시너지™ II 프로그램, 버젼 1.0 (프리차드(Prichard), 아셀틴(Aseltine), 쉬프만(Shipman); 미국 미시간 소재 미시간 대학교)을 사용하여 블리스 독립 모델에 따라 항바이러스 효능 데이터를 평가하였다. 맥시너지™ II는 개별적으로 적정된 각 약물에 대한 투여량-응답 곡선을 기준으로 이론적이고 부가적인 투여량-응답 면을 계산한다. 다음에, 계산된 부가 상호작용 면이 실험적으로 유도된 상호작용 면으로부터 차감됨으로써, 비-부가적 상호작용의 면적을 밝혀낸다. 0 ％ 억제에서의 평면 위 피크는 부가 상호작용에 비해 더 큰 영역, 또는 상승작용을 나타낸다. 역으로, 0 ％ 억제에서의 평면 아래 피크는 부가 상호작용 미만의 영역, 또는 길항작용을 나타낸다. 데이터 세트는 실험적 투여량-응답 면 주변의 신뢰 구간을 사용하여 통계적으로 평가된다. 피크 크기가 계산됨으로써, 신뢰 구간 외부에 있는 상승작용 또는 길항작용의 정도가 정량되며; 상승작용 및 길항작용 크기 및 log 크기 (약물 희석 보정)가 기록된다. 본 연구에서는, 99.9 ％의 신뢰 구간에서 데이터 세트를 평가하였으며; <25 μM^2％의 크기 (log 크기 < 2)를 부가적인 것으로 간주하였고, >25이나 <50 μM^2％ (log 크기 > 2 내지 <5)인 것을 약한 상승작용 또는 길항작용으로 파악하였으며, >50이나 <100 μM^2％ (log 크기 > 5 내지 <9)인 값을 중간 상승작용 또는 길항작용으로 간주하였고, >100 μM^2％의 값 (log 크기 >9)을 강한 상승작용 또는 길항작용으로 간주하였다 (문헌 [Prichard, et al ., 2004, Antimicrobial Agents and Chemotherapy; 37(3): 540-545]).

콤비툴 프로그램 버젼 2.001 (드레시어(Dressier), 뮬러(Muller), 및 슈넬(Suhnel); 델라웨어 제나 소재 인스티튜트 오브 몰큘라 바이오테크놀로지(Institute of Molecular Biotechnology) 사)을 사용하여 예상 효과 (로외 부가 모델에 따름)과 관찰된 효과 (실험 데이터) 사이의 차이를 계산하였다. 예상 효과로부터의 차이가 도시되면, 화합물 상호작용의 시각적 표시가 수득된다. 0에서의 선은 부가 0 상호작용 평면을 나타낸다. 0 상호작용 평면 아래 또는 위에 속하는 점들은 각각 상승작용 또는 길항작용의 영역을 표시한다. 예상 효과로부터의 0.25를 초과하는 편차는 유의성이 있는 것으로 간주하였다 (문헌 [Dressier et al ., 1999, Computers and Biomedical Research; 32: 145- 160]).

칼큐신 프로그램 버젼 2.1 (영국 캠브리지 소재 바이오소프트(BIOSOFT) 사)을 사용하여 문헌 [Chou and Talalay (1984) Adv . Enz . Regul . 22: 27-55]에 의해 제안된 조합 지수 방정식(Combination Index equation)을 기준으로 약물-약물 상호작용의 특성을 측정하였다. 약물 조합에 대하여 계산된 EC₅₀에서의 조합 지수를 기록하는데; CI 값을 기준으로 한 약물 상호작용의 정도에 대한 기술은 윈도즈 소프트웨어 매뉴얼용 칼큐신에 권장되어 있는 바와 같다 (표 59).

<표 59>

맥시너지™ II 분석 (블리스 독립)

99.9 ％ 신뢰 구간에서 맥시너지™ II 소프트웨어를 사용하여 5종의 개별적인 실험 데이터 세트를 분석하였다.

이와 같은 분석의 결과를 도 5에 나타내었다. 상승적인 상호작용은 도 5에 해당 농도에서의 소형 피크로 표시되어 있는, 그의 EC₅₀에서 (1× 내지 1.5× EC₅₀), 또는 그것을 넘어서는 곳에서의 가장 낮은 RBV 농도 (0.6× EC₅₀) 및 화합물 1 농도의 영역에 국한되었다. 도 5의 다른 모든 데이터 점들은 부가저 0-상호작용 평면에 근접하여 군집되어 있음으로써, 해당 농도에서는 2종의 약물이 시험관내에서 HCV 레플리콘을 부가적인 양식으로 억제한다는 것을 암시한다.

56.7 μM^2％의 계산된 상호작용 크기는 중간 상승작용을 암시한다. 약물 희석에 대하여 보정할 경우, 0.53 μM^2％의 log 상호작용 크기가 도출되는데, 역시 화합물 1과 RBV의 부가적인 상호작용을 암시한다.

전체적으로, 일 구현예에서, 화합물 1과 RBV의 조합 효과는 ≥0.4 μM의 화합물 1이 저농도 (0.6×EC₅₀)의 RBV와 조합되는 경우에 약하게 상승적이다. 다른 구현예에서, 화합물 1과 RBV의 조합은 부가적이다.

콤비툴 분석 (로외 부가성)

계산된 부가 효과와 실험 데이터 사이의 차이를 정량하고, 각 약물조합에 대하여 플로팅하였다. 도 6은 로외 부가 모델을 사용한 콤비툴 소프트웨어에 의해 수득된, 5종의 독립된 실험으로부터의 모든 약물 조합에 있어서의 계산된 부가 효과와 관찰된 항-HCV 효과 사이의 차이를 도시한다. 도 6에서, LA-EXP = 콤비툴 소프트웨어의 로외 부가모델에 의해 측정된 바와 같은 5종의 실험으로부터의 관찰된 효과와 예상 효과 사이의 차이이다. 0에서의 선은 부가0 상호작용 평면을 나타낸다. 0 상호작용 평면 아래 또는 위에 속하는 점들은 각각 상승작용 또는 길항작용의 영역을 나타낸다. 예상 효과로부터의 0.25를 초과하는 편차는 유의성이 있는 것으로 간주하였다.

맥시너지™ II 분석과 유사하게, 콤비툴은, 콤비툴 그래프의 -0.25 평면 부근에 데이터 점들이 군집되어 있는 것으로 볼 때, 고농도의 화합물 1 및 저농도의 RBV를 포함하는 약물 조합이 약하게 상승적이라는 것을 보여준다. 다른 모든 약물조합 데이터 점들은 -0.25 평면의 위에 속함으로써, 해당 약물 농도에서는 2종의 약물이 부가적인 방식으로 HCV 레플리콘을 억제한다는 것을 암시한다. 일 구현예에서, 콤비툴 프로그램을 사용하여 조사된 로외 부가 모델에 있어서, 화합물 1과 RBV의 상호작용은 고농의 화합물 1이 저농도의 RBV와 조합되는 경우에, 약하게 상승적인 것으로 보이고; 모든 기타 조합은 부가적인 상호작용을 초래하는 것으로 보인다.

칼큐신 분석 (조합 지수)

칼큐신 프로그램은 계산된 EC₅₀에서의 평균 CI가 0.37±0.12로써, 이와 같은 효과 수준에서의 상승작용의 해석과 일치한다는 것을 확인하였다.

화합물 1 및 RBV 단독 또는 조합으로 처리된 세포에서 시험관내 세포독성의 증거는 관찰되지 않았으므로, 조합된 활성 관계가 세포 세포독성보다는 HCV 레플리콘의 억제에 기인한다는 것으로 암시한다.

소정 구현예에서, 리바비린과 화합물 1의 조합은 단독으로 시험된 어느 하나의 제제에 비해 향상된 항바이러스 효능을 가진다. 소정 구현예에서, 상기 조합은 특성상 상승적이다. 이는 2'-C-메틸 뉴클레오시드와 리바비린 사이의 길항작용이 존재한다는 문헌상의 기록과 반대되는 것으로써, 문헌 [Coelmont et al ., Antimicrobial Agents and Chemotherapy , 2006, 50, 3444-3446]을 참조하라.

어떠한 이론에도 얽매이고자 하는 것은 아니나, 리바비린에 노출된 세포는 실질량의 리바비린 트리포스페이트를 생성시키고, 이것은 뉴클레오티드 합성 피드백 기작을 통하여 세포 GTP - HCV RNA 합성을 위한 자연상의 기질 - 농도의 고갈을 야기하는 것으로 여겨진다. 그 결과는 2'-C-메틸 구아노신-5'-트리포스페이트가 함께 경쟁할 자연 GTP 기질을 덜 가지게 되며, 그에 따라 더 효과적인 억제제가 되는 것이다.

리바비린의 피드백 효과가 구아노신을 구아노신 모노포스페이트로 전환하는 제1 포스포릴화 단계에 대하여 예상된다는 것 역시 알아야 한다. 화합물 1이 2'-C-메틸 구아노신-5'-모노포스페이트의 방출에 의해 상기 단계를 우회하기 때문에, 리바비린은 화합물 1의 2'-C-메틸 구아노신-5'-트리포스페이트로의 전환에 대하여 부정적인 영향을 가지지 않을 것으로 예상된다.

실시예 18

리바비린 및 화합물 1에 대한 S282T 치환 HCV의 시험관내 감수성

본 실험에서는, 표준 생화학 분석 및 유전형 1b 레플리콘 시험 시스템의 2종 시험 시스템에서의 S282T 치환 C형 간염 바이러스 (HCV)의 리바비린 (RBV) 및 화합물 1에 대한 시험관내 감수성을 평가하였다. 먼저 약물의 존재 또는 부재하에 방사성표지된 구아노신 5'-모노포스페이트 (GMP)의 올리고머성 리보핵산 (RNA) 주형으로의 NS5B-매개 도입을 측정하는 표준 시험관내 효소 분석을 사용하여 리바비린 5'-트리포스페이트및 화합물 7의 항바이러스 효능을 측정하였다. 리바비린 트리포스페이트 (RBV-TP), 또는 화합물 1의 세포 내에서의 활성 대사물인 화합물 7의 존재하에 야생-형 및 부위-지정 S282T 돌연변이 효소를 분석하였다.

대조

1. 생화학적 HCV 분석용 무-약물 (양성) 대조: 약물이 없는 반응 버퍼 중 폴리머라제.

2. 생화학적 HCV 분석용 바탕 (음성) 대조: 양성 대조 더하기 100 mM EDTA와 동일.

3. HCV 레플리콘 분석용 무-약물 (양성) 대조: 분석 배지 중 HCV 레플리콘 (GS4.1) 세포.

4. 양성 NS5A ELISA 대조: 분석 배지 중 비처리 HCV 레플리콘 (GS4.1) 세포.

5. 음성 NS5A ELISA 대조: 분석 배지 중 Huh-7 세포.

6. 양성 세포독성 대조: 분석 배지.

7. 음성 세포 독성 대조: 분석 배지 중 비처리 HCV 레플리콘 (GS4.1) 세포.

HCV 폴리머라제

하기와 같이 본 연구에 사용된 폴리머라제 효소를 발현 및 정제하였다. 야생-형 구성물은 재조합 폴리머라제 효소를 생성시키는 데에 사용되는 표준 세균 발현 시스템에 유전형 1b (주 Con-1)의 65 kDa HCV NS5B 단백질을 코딩하고 있다. 시중의 돌연변이유발 키트를 사용하여 제조자에 의해 권장되는 바와 같이 야생-형 구성물의 부위-지정 돌연변이유발에 의해 NS5B 유전자의 잔기 282에 단일 세린-대-스레오닌 치환을 보유하는 돌연변이 HCV 폴리머라제 플라스미드를 생성시켰다. 본 연구에 활용되는 발현 구성물은 하기이다:

1. 발현 벡터 pET21a (Ampr)의 NheI/XhoI 제한 부위로 클로닝된 HCV 유전형 Ib 야생-형 폴리머라제 (카르복시말단 아미노산 21개의 결실 포함). 클론 번호 9-15.

2. HCV 1b S282T 폴리머라제는 동일한 발현 벡터 중 NS5B 유전자의 B 도메인 내 잔기 282에 단일 세린-대-스레오닌 치환을 함유함.

HCV 레플리콘 세포 주

각 세포 주를 시험하여, ATCC 마이코플라스마 테스팅 서비스에서 DNA 염색 및 직접 배양 PCR 절차에 의해 검출하였을 때 마이코플라스마에 대하여 음성인 것을 찾았다.

1. Huh-7 세포 주는 인간 간암 세포로부터 유래한 것이다 (문헌 [Nakabayashi H., Growth of human hepatoma cell lines with differentiated functions in chemically defined medium, Cancer Res .; 1982, 42:3858-3863]). Huh-7 세포를 75 cm² 코닝 플라스크 내의 Huh-7 생장 배지 중에서 5 ％ CO₂를 사용하여 37 ℃로 유지하고, 트립신-EDTA를 사용하여 대략 80 ％ 융합으로 붕괴시켰다.

공급처: Dr. 크리스토프 시거(Christoph Seeger), 폭스 체이스 캔서(Fox Chase Cancer) 사; 펜실베이니아 필라델피아 소재.

2. GS4.1 세포 주 (문헌 [Zhu et al ., Replication of hepatitis C virus subgenomes in nonhepatic epithelial and mouse hepatoma cells, J. Virol .; 2003, 77:9204-9210])는 Huh-7 인간 간 세포 주로부터 유래한 것으로써, 2시스트론 HCV 레플리콘을 안정적으로 보유한다. 세포를 75 cm² 코닝 플라스크 내의 GS4.1 생장 배지 중에서 5 ％ CO₂를 사용하여 37 ℃로 유지하고, 트립신-EDTA를 사용하여 대략 80 ％ 융합으로 붕괴시켰다.

공급처: Dr. 크리스토프 시거, 폭스 체이스 캔서 사; 펜실베이니아 필라델피아 소재.

3. 184R-A 세포 주는 야생-형 레플리콘 세포를 1 내지 5 μM의 화합물 1 존재하에 >100일 동안 배양함으로써 유도하였다. 군집 서열분석은 S282T 변이체가 103일까지 야생형보다 빨리 생장하였음을 표시하였다.

4. 184R-D2 세포 주 역시 0.9 μM로 시작하여 3.6 μM로 종료되는 점증 농도의 화합물 1 존재하에 야생-형 레플리콘 세포를 배양함으로써 유도하였다. S282T 돌연변이는 선택 69일 후에 레플리콘에서 출현하였으며, 선택 80일 후에는 야생-형 S282 변이체보다 빨리 생장하였다. 2종의 추가적인 돌연변이인 S189P 및 Y586C를 184R-D 레플리콘 세포 주에서 관찰하였다. 이들 돌연변이는 어떠한 다른 화합물 1-내성 레플리콘에서도 선택되지 않았으며, HCV 뉴클레오시(티)드 유사체에 대한 내성과 관련된 적이 없다.

생화학 분석용 시약

무-RNase 수, 공급처: 어플라이드 바이오시스템즈(어플라이드 바이오시스템즈 사) 사 (카탈로그 #: AM9932); 염화 마그네슘, 공급처: 시그마-알드리치 사 (카탈로그 #: M1028); 염화 망간, 공급처: 시그마-알드리치 사 (카탈로그 #: Ml787); Dithiothreitol (DTT), 공급처: 시그마-알드리치 사 (카탈로그 #: 43815); α-[³³P]GTP, 공급처: 퍼킨 엘머 라이프 사이언시즈 사 (카탈로그 #: NEG 606H); 유연성 96-웰 뚜껑, 공급처: BD 팔콘 사 (카탈로그 #: 353913); 유연성 96-웰 U-저부 플레이트, 공급처: BD 팔콘 사 (카탈로그 #: 353911); 마이크로씬트(Microscint)-0 씬틸레이션 액, 공급처: 퍼킨 엘머 라이프 사이언시즈 사 (카탈로그 #: 6013611); 울트라퓨어(UltraPure) 소 태아 혈청 (BSA) 50 mg/mL, 공급처: 어플라이드 바이오시스템즈 사 (카탈로그 #: AM2616); 유니필터(Unifilter)-96 GF/B 플레이트, 공급처: 퍼킨 엘머 라이프 사이언시즈 사 (카탈로그 #: 6005177); 에탄올 (EtOH) 200 프루프, 공급처: 시그마-알드리치 사 (카탈로그 #: E7023-4L); 나트륨 피로포스페이트 10수화물, 공급처: EMD 케미칼즈 (카탈로그 #: SX0740-1); 트리톤 X-100, 공급처: 시그마-알드리치 사 (카탈로그 #: T8787); SUPERase-In RNase 억제제, 공급처: 어플라이드 바이오시스템즈 사 (카탈로그 #: AM2696);글루탐산 모노나트륨 염 1수화물, 공급처: 시그마-알드리치 사 (카탈로그 #: G2834); 트리클로로아세트산 (TCA), 공급처: EMD 케미칼즈 (카탈로그 #: TX1045-1), 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA) 0.5 M, pH 8.0, 공급처: 어플라이드 바이오시스템즈 사 (카탈로그 #: AM9260G); 아데노신 트리포스페이트 (ATP), 공급처: GE 헬스케어 라이프 사이언시즈(Healthcare Life Sciences) 사 (카탈로그 #: 27-2056-01); 시티딘 트리포스페이트 (CTP), 공급처: GE 헬스케어 라이프 사이언시즈 사 (카탈로그 #: 27-2066-01); 구아노신 트리포스페이트 (GTP), 공급처: GE 헬스케어 라이프 사이언시즈 사 (카탈로그 #: 27-2076-01); 우리딘 트리포스페이트 (UTP), 공급처: GE 헬스케어 라이프 사이언시즈 사 (카탈로그 #: 27-2086-01); 및 합성 RNA 올리고뉴클레오티드, 공급처: 다르마콘(Dharmacon) 사 (카탈로그 #: 통상적인 합성).

레플리콘 분석 및 ELISA용 시약

75 cm² 플라스크, 공급처: 코닝 코스타 사 (카탈로그 #: 430641); 96-웰 플레이트, 공급처: 코닝 코스타 사 (카탈로그 #: 3595); 트립신-EDTA, 공급처: 셀그로 사 (카탈로그 #: 25- 053-CI); 메탄올, 공급처: 버딕 & 잭슨 사 (카탈로그 #: AH230-4); 아세톤, 공급처: J.T. 베이커 사 (카탈로그 #: 9006-03); 항-C형 간염 NS5A 마우스 단일클론 항체 (mAb), 공급처: 비로겐 사 (카탈로그 #: 256-A); 세척 용액 농축액 (20×), 공급처: KPL 사 (카탈로그 #: 50-63-00); HRP-염소 항-마우스 IgG (H+L) 접합 항체, 공급처: 자이메드 사 (카탈로그 #: 81-6520); 오르소-페닐렌디아민 (OPD 정제), 공급처: 자이메드 사 (카탈로그 #: 00- 2003); 과산화 수소 30 ％ 용액 (H₂O₂), 공급처: EMD 사 (카탈로그 #: HXO635-1); 황산, 공급처: 말린크로트 케미칼즈 사 (카탈로그 #: 2876-05); 셀타이터(CellTiter) 96® 아쿠에우스 원 용액 셀 증식 분석 (MTS-기반), 공급처: 프로메가 사 (카탈로그 #: G3582); 시트르산, 트리나트륨 염, 탈수화물, 공급처: 시그마-알드리치 사 (카탈로그 #: C-8532); 나트륨 포스페이트, 2염기성, 공급처: 피셔 케미칼 사 (카탈로그 #: S373-3); 트리즈마® 히드로클로리드 용액 (트리스-HCl), 공급처: 시그마-알드리치 사 (카탈로그 #. T2663-1L); 염화 나트륨, 용액 5.0 M, 공급처: 어플라이드 바이오시스템 사 (카탈로그 #: AM9759); 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA) 용액 0.5 M, 공급처: 시그마-알드리치 사 (카탈로그 #: E7889-100 mL); 디메틸 술폭시드, 공급처: 시그마-알드리치 사 (카탈로그 #: D2650); 제네티신® (G418), 100×, 공급처: 셀그로 사 (카탈로그 #: 30-324-CI); 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM), 공급처: 셀그로 사 (카탈로그 #: 10-013-CV); 소 태아 혈청 (FBS), 열 불활성화, 공급처: 셀그로 사 (카탈로그 #: 35-016-CV); 페니실린/스트렙토마이신 용액 (mL 당 10,000 IU/mL 당 10,000 ㎍), 공급처: 셀그로 사 (카탈로그 #: 30-001-CI); 글루타맥스, 디펩티드 L-글루타민 (200 mM), 공급처: 기브코 사 (카탈로그 #: 35050-061); 및 MEM 비필수 아미노산, 공급처: 셀그로 사 (카탈로그 #: 25-025-CI).

배지 및 버퍼

본 실험에서는, 하기의 배지 및 버퍼를 사용하였다.

2. 야생-형 및 184R 레플리콘 세포용 완전 생장/선택 배지: 10 ％ 소 태아 혈청, 100 IU/mL 페니실린, 100 ㎍/mL 스트렙토마이신, 2 mM 글루타맥스, 1 ％ MEM 비필수 아미노산, 및 0.5 mg/mL 제네티신 (G418)이 보충된 1× DMEM (글루코스, L-글루타민 및 나트륨 피루베이트 함유),

3. 분석 배지: 1 ％ DMSO를 포함하는 Huh-7 완전 생장 배지.

4. ELISA 세척 용액: dH₂O 중에 1×로 희석된 KPL 세척 용액.

I: 시험관내 HCV 폴리머라제 분석

본 실험에서는, RBV-TP 및 화합물 7에 의한 HCV 야생-형 및 S282T 돌연변이 폴리머라제의 시험관내 폴리머라제 활성의 평가 억제를 수행하였다.

야생-형 및 S282T 돌연변이 HCV 1b 폴리머라제의 생성

단일 단계 니켈 친화성 크로마토그래피 절차를 이용하여, E. coli BL21 (DE3) 세포로부터 카르복시말단에 헥사-히스티딘 표지된 야생-형 및 S282T HCV 폴리머라제 효소를 발현시키고, 85-90 ％ 순도로 정제하였다.

화합물 용액의 제조

무-뉴클레아제 수 중 10 mM 용액으로서 화합물 7 및 리바비린-TP 모액을 제조하고, 소량 분취량으로 -20 ℃에서 저장하였다.

5 μM ATP 수용액 중에서 RBV-TP 및 화합물 7의 8회 연속 희석액을 새로 제조함으로써, 1000-0.46 μM (RBV-TP) 및 100-0.05 μM (화합물 7)의 최종 약물 시험 농도를 산출하였다.

IC₅₀ 측정을 위한 생화학적 HCV 폴리머라제 분석

본 분석은 트리클로로아세트산 (TCA) 침전성 물질로의 α-[³³P]GMP의 도입에 대한 약물의 억제 효과를 측정하기 위하여 수행하였다. 96-웰 필터 플레이트로의 여과에 의해 방사성표지된 생성물을 수집하고, 액체 씬틸레이션 계수에 의해 정량하였다. 상보성 RNA 가닥의 합성을 위한 주형으로는 합성 RNA 올리고뉴클레오티드를 사용하였다.

ㆍ 시험 항목을 포함하는 96-웰 유연성 플레이트를 하기와 같이 제조하였다: 5 μM ATP 중 10 μL의 연속-희석 RBV-TP 또는 화합물 7을 인접하는 컬럼의 3반복 웰로 옮겼다. 효소 첨가 전에 플레이트를 얼음 상에서 유지하였다.

ㆍ 바탕 방사능을 측정하기 위하여, 분석 플레이트 컬럼 1에 10 μL의 500 mM EDTA를 첨가하였다.

ㆍ 무-약물 대조용으로, 분석 플레이트 컬럼 2 및 3에 10 μL의 5 μM ATP를 첨가하였다.

ㆍ 얼음 상에서 대량으로 반응 칵테일을 제조한 후; 각 분석 웰에 40 μL의 반응 칵테일을 첨가함으로써 반응을 개시하였다. 그에 따라, 최종 반응 부피는 50 μL이었다. 반응액 중 모든 시약의 최종 농도를 하기 표 60에 제공하였다.

<표 60>

ㆍ 30 ℃에서 2시간 동안 반응액을 배양하였다.

ㆍ 침전 용액 (22.5 ％ TCA, 25 mM 나트륨 피로포스페이트, 빙냉) 50 μL의 첨가에 의해 반응을 종결한 후, 20분 이상 동안 얼음 상에서 배양하였다.

ㆍ 팩카드 유니필터 수확기(Packard Unifilter Harvester) (퍼킨 엘머 라이프 사이언스 사)에서 0.1 M 나트륨 피로포스페이트로 사전-세정된 GF/B 필터 플레이트 (퍼킨 엘머 라이프 사이언스 사)를 사용하여 플레이트를 수확하였다. 탈염수를 사용하여 플레이트를 강하게 세척한 후, 건조를 돕기 위하여 에탄올로 세척하였다.

ㆍ 플레이트를 공기 건조시키고, 이어서 마이크로씬트-O (웰 당 35 μL; 퍼킨 엘머 라이프 사이언스 사)를 첨가하였다. 팩카드 탑카운트 액체 씬틸레이션 계수기 (퍼킨 엘머 라이프 사이언스 사)에서 플레이트를 계수하였다.

ㆍ 단일-부위 투여량 응답 곡선으로부터 XLfit 4.1 소프트웨어를 사용하여 결정된 최고-정합 방정식에 의해 IC₅₀을 계산하였다.

리바비린-TP 및 화합물 7에 의한 야생-형 HCV NS5B (유전형 1b)의 시험관내 억제를 하기 표 61에 제공하였다 (μM로 나타낸 IC₅₀ 값)

<표 61>

표 61에 나타낸 바와 같이, RBV-TP는 야생-형 유전형 1b NS5B의 한계 억제를 나타내었으며, 시험관내에서 화합물 7에 비해 >3,000배 활성이 더 적었다. 2.61±0.72 μM의 평균 IC₅₀ 값에서 알 수 있는 바와 같이, S282T 돌연변이 효소는 화합물 7에 의한 억제에 대하여 9.73±1.79-배 감수성이 더 작았다. 반면, RBV-TP는 45.9±16.2 μM의 19.2-배 더 작은 IC₅₀에서 알 수 있는 바와 같이, S282T 돌연변이 폴리머라제에 대하여 강화된 시험관내 활성을 나타내었다.

이러한 데이터는 S282T 돌연변이 효소에 대한 시험관내에서의 RBV-TP와 화합물 7의 상이한 교차-저항성 프로필을 암시하며, 리바비린은, 화합물 1과 함께 사용될 경우에, S282T 저항성 돌연변이의 출현을 상쇄할 수 있다는 것을 암시한다.

소정 구현예에서는, 인터페론이 화합물 1과 함께 사용될 경우, S282T 저항성 돌연변이의 출현을 상쇄할 수 있다.

표 62는 야생-형으로부터 돌연변이 S282T까지의 배수 변화를 제공한다.

<표 62>

S282T 돌연변이 효소는 2.61±0.72 μM의 평균 IC₅₀ 값에서 알 수 있는 바와 같이, 화합물 7에 의한 억제에 대하여 9.73±1.79-배 감수성이 더 작았다 (표 61, 표 62). 반면, RBV-TP는 45.9±16.2 μM의 19.2-배 더 작은 IC₅₀에서 알 수 있는 바와 같이, S282T 돌연변이 폴리머라제에 대하여 강화된 시험관내 활성을 나타내었다 (표 61).

II. A. 안정한 HCV 레플리콘 세포 주를 보유하는 야생-형 또는 S282T에 대한 리바비린의 항바이러스 활성

본 연구에서는, 유전형 1b의 야생-형 또는 화합물 1-저항성 S282T 레플리콘을 보유하는 안정한 세포 주에서의 리바비린 및 화합물 1의 시험관내 항-HCV 활성을 측정한다.

RBV 및 화합물 1을 사용한 HCV 레플리콘 분석

약물 처리

하기의 프로토콜을 사용하였다:

1. 96-웰 플레이트의 컬럼 2-12에 완전 생장 배지 50 μL 중 세포 당 7.5×10³ 세포의 밀도로 야생형 (GS4.1) 또는 S282T (184R-A 및 184R-D2) 레플리콘 세포 중 어느 것을 접종하였다. Huh-7 세포를 유사한 밀도로 각 플레이트의 컬럼 1에 접종하였다.

2. 화합물 1 및 RBV를 2× 모액으로 분석 배지 중에 희석하였다. 분석 배지 중에서, 상기 2× 모액으로부터 각 화합물의 8회의 추가적인 3-배 연속 희석액을 제조하였다. 최종 약물 농도는 100 내지 0.015 μM의 범위였다.

3. 37 ℃/5 ％ CO₂로 4시간 이상 동안 세포를 배양한 다음, 50 μL의 연속 RBV 및 화합물 1 약물 희석액을 첨가함으로써 약물 처리를 개시하였다. 이 단계를 96-웰 플레이트에서 2반복으로 전개하였다.

4. 세포를 37 ℃/5 ％ CO₂로 3일 동안 억제제와 함께 배양하였다.

HCV 레플리콘 ELISA

HCV 레플리콘 분석에는 하기의 프로토콜을 사용하였다:

1. 약물 처리 3일 후, 천천히 부어 플레이트로부터 배지를 제거하고, 100 μL/웰의 1:1 아세톤:메탄올을 사용하여 플레이트에 세포를 고정시켰다.

2. 실온에서 1분 배양 후, 플레이트를 100 μL/웰의 ELISA 세척 용액으로 3회 세척한 다음, 150 μL/웰의 10 ％ FBS-TNE를 사용하여 블로킹하였다.

3. 실온에서 1시간 배양 후, 플레이트를 100 μL/웰의 ELISA 세척 용액으로 3회 세척한 다음, 100 μL/웰의 마우스 항-C형 간염 NS5A mAb (10 ％ FBS-TNE 중에 1:1,500으로 희석된 1 mg/mL 모액)를 첨가하였다.

4. 37 ℃에서의 2시간 배양 후, 플레이트를 100 μL/웰의 ELISA 세척 용액으로 3회 세척한 다음, 100 μL/웰의 HRP-염소 항-마우스 항체 (10 ％ FBS-TNE 중에 1:4,000으로 희석)를 첨가하였다.

4. 37 ℃에서의 1시간 배양 기간 후, 각 플레이트를 100 μL/웰의 ELISA 세척 용액으로 3회 세척하였다. 다음에, 100 μL/웰의 OPD 용액을 사용하여 색상 전개를 개시하였다.

5. 어둠 속 실온에서의 30분의 배양 기간 후, 100 μL의 2N H₂SO₄를 각 웰에 첨가함으로써, 반응을 중지하였다.

6. 빅터³ V 1420 다표지 계수기 (퍼킨 엘머 사)에서 490 nm로 흡광도를 측정하였다. 2반복 웰의 평균을 사용하여 각 약물에 대하여 HCV 레플리콘 복제의 ％억제를 계산하였다. XLfit 4.1 소프트웨어에 의해 결정된 최종 최고-정합 방정식으로부터 화합물 1 및 RBV에 대하여 50 ％ 효과 농도 (EC₅₀) 값을 계산하였다.

3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-술포페닐)-2H-테트라졸륨, 내부 염 (MTS) 분석을 사용한 GS4.1 세포 상에서의 RBV 및 화합물 1의 세포독성 측정

세포를 플레이팅하고, 상기한 바와 같이 억제제로 처리하였다.

약물 처리 3일 후, 20 μL의 MTS를 각 웰에 첨가한 다음, 37 ℃/5 ％ CO₂로 3시간 동안 플레이트를 배양하였다.

빅터³ V 1420 다표지 계수기 (퍼킨 엘머 사)에서 490 nm로 흡광도를 측정하였다. XLfit 4.1 소프트웨어에 의해 결정된 최종 최고-정합 방정식으로부터 각 약물 및 약물조합에 대한 50 ％ 세포독성 농도 (CC₅₀) 값을 측정하였다.

본 연구에서 사용된 실험 조건하에서는, 100 μM까지의 화합물 1 또는 RBV로 처리된 야생-형 또는 S282T 레플리콘 세포에서 시험관내 세포독성의 증거가 관찰되지 않은 바, 표 63을 참조하라. 화합물 1은 야생-형 HCV 레플리콘 보유 GS4.1 세포 및 S282T 돌연변이 레플리콘 세포에서 예상했던 항바이러스 활성을 나타내었다. 3종의 독립적인 실험 데이터 세트로부터 측정된 평균 EC₅₀ 값을 표 63에 제공하였다. 표 64는 야생-형으로부터 돌연변이 S282T까지의 배수 변화를 제공한다.

<표 63>

<표 64>

수 이동은 화합물 1 저항성 세포 주에서 수득된 EC₅₀을 야생-형 세포에서 수득된 EC₅₀으로 나눔으로써 측정됨.

리바비린은 야생-형 GS4.1 레플리콘 세포에서 평균 EC₅₀ 38±2.8 μM로써 측정가능한 항-HCV 활성을 가지며, 그에 따라 화합물 1에 비해 대략 126-배 덜 활성이다. 그러나, 2종의 화합물 1-저항성 레플리콘 세포 주인 184R-A 및 184R-D2에서 시험하였을 때, 리바비린은 12.3±1.9 μM (184R-A) 및 17±3.5 μM (184R-D2) (표 63)의 더 낮은 평균 EC₅₀으로 표시되는 바와 같이, 활성에서 2- 내지 3-배의 증가를 나타내었다.

HCV 레플리콘으로부터의 이와 같은 데이터는 RBV가 실제로는 그것이 화합물의 세포독성과 겹치기 때문에 RBV 활성을 측정하기가 매우 어려운 야생-형 레플리콘에 대해서보다 S282T 돌연변이 HCV 레플리콘에 대해서 더 활성이라는 사실을 확인하여 주는 것으로 보인다.

S282T 돌연변이 폴리머라제에 대한 RBV의 향상된 활성은 RBV가 돌연변이 HCV 주에 대한 직접적인 항바이러스 제제라는 것과 일치하는 것으로 보이지만, RBV의 다른 작용 기작이 배제된 것은 아니다. 요약하면, 리바비린 및 그의 활성 대사물인 RBV-TP는 S282T 변이체에 대하여 강화된 항바이러스 시험관내 활성을 나타내며, 화합물 1 (2'-C-메틸 뉴클레오티드) 시그내쳐 HCV 저항성 돌연변이 S282T를 보유하는 HCV 레플리콘과 관련한 화합물 1 및 화합물 7에 대한 교차-저항성 및/또는 길항작용의 증거를 나타내지 않는 것으로 보인다.

본 명세서에서 인용한 모든 공개 및 특허, 출원들은 각 개별 공개 또는 특허 출원이 구체적이고도 개별적으로 참조로써 개재되는 것으로 표시된 것과 같이 본원에 참조로써 개재된다. 청구된 주제가 다양한 구현예 양식으로 기술되어 있기는 하지만, 숙련 기술자라면, 그의 기술사상으로부터 벗어나지 않고도 다양한 변형, 치환, 생략, 및 변경들이 이루어질 수 있다는 것을 알 것이다. 따라서, 주제의 영역은 그의 등가물을 포함한 하기 청구범위의 영역에 의해서만 제한되는 것으로 하고자 한다.

Claims

하기의 화학식을 갖는, 부분입체이성질적으로 순수한 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 수화물.
하기의 화학식을 갖는 부분입체이성질적으로 순수한 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 수화물.
하기의 화학식을 갖는 정제된 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체 형태 또는 호변이성질체 형태.

(여기서 R¹은 히드록실, 아미노 또는 벤질아미노이고; R²는 수소,
,
,
또는
이고, 단 R¹이 히드록실인 경우, R²는 수소,
및
이 아닌 다른 것이고, R¹이 벤질아미노인 경우, R²는
이 아닌 다른 것임).
제3항에 있어서, 하기의 화학식 II를 갖는 정제된 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체 형태 또는 호변이성질체 형태.
<화학식 II>

(여기서, R²는 수소,
,
,
또는
임).
제3항에 있어서, 하기의 화학식 III을 갖는 정제된 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체 형태 또는 호변이성질체 형태.
<화학식 III>

(여기서, R²는 수소,
,
또는
임).
제3항에 있어서, 하기의 화학식 IV를 갖는 정제된 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체 형태 또는 호변이성질체 형태.
<화학식 IV>

(여기서, R²는
또는
임).
제3항에 있어서, 하기의 화학식 V를 갖는 정제된 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체 형태 또는 호변이성질체 형태.
<화학식 V>

(여기서 R¹은 히드록실 또는 아미노임).
제3항에 있어서, 하기에서 선택되는 정제된 화합물.

,
,

,
,

,
, 및

.
제3항에 있어서, 하기에서 선택되는 정제된 화합물.

,
,

,

,

,
,

,
,

,

,
, 및

.
하기의 화학식을 갖는 화합물의 정제된 대사물이며,

하기로 이루어진 군에서 선택되는 것인 대사물.
(a) C-18 (2) 4.6×250 mm의 5 ㎛ 입자 크기 컬럼을 약 2.1분에 용리 완료하는 화합물;
(b) C-18 (2) 4.6×250 mm의 5 ㎛ 입자 크기 컬럼을 약 6.2분에 용리 완료하는 화합물;
(c) C-18 (2) 4.6×250 mm의 5 ㎛ 입자 크기 컬럼을 약 8.0분에 용리 완료하는 화합물;
(d) C-18 (2) 4.6×250 mm의 5 ㎛ 입자 크기 컬럼을 약 9.4분에 용리 완료하는 화합물;
(e) C-18 (2) 4.6×250 mm의 5 ㎛ 입자 크기 컬럼을 약 10.9분에 용리 완료하는 화합물;
(f) C-18 (2) 4.6×250 mm의 5 ㎛ 입자 크기 컬럼을 약 12.4분에 용리 완료하는 화합물;
(g) C-18 (2) 4.6×250 mm의 5 ㎛ 입자 크기 컬럼을 약 13.1분에 용리 완료하는 화합물;
(h) C-18 (2) 4.6×250 mm의 5 ㎛ 입자 크기 컬럼을 약 17.1분에 용리 완료하는 화합물;
(i) C-18 (2) 4.6×250 mm의 5 ㎛ 입자 크기 컬럼을 약 25.2분에 용리 완료하는 화합물; 및
(j) C-18 (2) 4.6×250 mm의 5 ㎛ 입자 크기 컬럼을 약 26.5분에 용리 완료하는 화합물
(여기서, 기술되어 있는 체류 시간들은 하기 표와 같은 HPLC 구배 조건에서 수득됨:
하기의 화학식을 갖는 화합물의 정제된 대사물이며,

하기 표와 같은 HPLC 구배 조건에서, C-18 4.6×250 mm의 5 ㎛ 입자 크기 컬럼을 약 16.4분에 용리 완료하는 대사물.
하기의 화학식을 갖는 화합물의 정제된 대사물이며,

하기로 이루어진 군에서 선택되는 것인 대사물.
(a) C-18 4.6×250 mm의 5 ㎛ 입자 크기 컬럼을 약 38.4분에 용리 완료하는 화합물;
(b) C-18 4.6×250 mm의 5 ㎛ 입자 크기 컬럼을 약 39.8분에 용리 완료하는 화합물;
(c) C-18 4.6×250 mm의 5 ㎛ 입자 크기 컬럼을 약 36.8분에 용리 완료하는 화합물;
(d) C-18 4.6×250 mm의 5 ㎛ 입자 크기 컬럼을 약 26.8분에 용리 완료하는 화합물;
(e) C-18 4.6×250 mm의 5 ㎛ 입자 크기 컬럼을 약 33.8분에 용리 완료하는 화합물;
(f) C-18 4.6×250 mm의 5 ㎛ 입자 크기 컬럼을 약 30.9분에 용리 완료하는 화합물;
(g) C-18 4.6×250 mm의 5 ㎛ 입자 크기 컬럼을 약 4.6분에 용리 완료하는 화합물; 및
(h) C-18 4.6×250 mm의 5 ㎛ 입자 크기 컬럼을 약 28.1분에 용리 완료하는 화합물
(여기서, 기술되어 있는 체류 시간들은 하기 표와 같은 HPLC 구배 조건에서 수득됨:
하기의 화학식 I을 갖는 동위원소 보강 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 입체이성질체 형태 또는 호변이성질체 형태.
<화학식 I>

(여기서 R¹은 히드록실, 아미노 또는 벤질아미노이고; R²는 수소,
,
,
또는
이고, 단 R¹이 히드록실인 경우, R²는 수소,
및
이 아닌 다른 것이고, R¹이 벤질아미노인 경우, R²는
이 아닌 다른 것임).
제13항에 있어서, 동위원소 보강 화합물 2, 동위원소 보강 화합물 2a, 동위원소 보강 화합물 2b, 동위원소 보강 화합물 3, 동위원소 보강 화합물 3a, 동위원소 보강 화합물 3b, 동위원소 보강 화합물 4, 동위원소 보강 화합물 5, 동위원소 보강 화합물 6, 동위원소 보강 화합물 7, 동위원소 보강 화합물 8, 동위원소 보강 화합물 8a, 동위원소 보강 화합물 8b, 동위원소 보강 화합물 9, 동위원소 보강 화합물 9a, 동위원소 보강 화합물 9b, 동위원소 보강 화합물 10, 동위원소 보강 화합물 10a, 동위원소 보강 화합물 10b, 동위원소 보강 화합물 11, 동위원소 보강 화합물 11a, 및 동위원소 보강 화합물 11b인 동위원소 보강 화합물.
동위원소 보강 화합물 1, 동위원소 보강 화합물 1a, 및 동위원소 보강 화합물 1b로 이루어진 군에서 선택되는 동위원소 보강 화합물.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 유효 치료량을 투여하는 것을 포함하는, 플라비비리다에 바이러스에 감염된 숙주의 치료 방법.
제16항에 있어서, 바이러스가 C형 간염인 방법.
제17항에 있어서, 숙주가 인간인 방법.
제16항에 있어서, 상기 투여가 실질량의 상기 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 입체이성질체를 상기 숙주의 간으로 유도하는 방법.
제16항에 있어서, 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 입체이성질체가 인터페론, 리바비린, 인터류킨, NS3 프로테아제 억제제, 시스테인 프로테아제 억제제, 페난트렌퀴논, 티아졸리딘 유도체, 티아졸리딘, 벤즈아닐리드, 헬리카제 억제제, 폴리머라제 억제제, 뉴클레오티드 유사체, 글리오톡신, 세룰레닌, 안티센스 포스포로티오에이트 올리고데옥시뉴클레오티드, IRES-의존성 번역의 억제제 및 리보자임으로 이루어진 군에서 선택되는 제2 항-바이러스 제제와 함께 또는 교대로 투여되는 방법.
제20항에 있어서, 제2 제제가 페길레이팅된 인터페론 알파 2a, 인터페론 알파콘-1, 천연 인터페론, 알부페론, 인터페론 베타-1a, 오메가 인터페론, 인터페론 알파, 인터페론 감마, 인터페론 타우, 인터페론 델타 및 인터페론 γ-1b로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
제20항에 있어서, 제2 제제가 리바비린인 방법.
제16항에 있어서, 숙주가 인간인 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 화합물, 및 제약상 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 제약 조성물.
제18항에 있어서, 경구 제제인 조성물.
(a) 하기의 화학식을 갖는 전구체 화합물 1을 간세포 또는 간 마이크로좀 조성물과 접촉시켜 혼합물을 산출하는 것:

; 및
(b) 혼합물로부터 화합물을 단리하는 것
을 포함하는, 제3항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 정제 화합물의 제조 방법.
제24항에 있어서, 단리하는 것이 역상 배지-함유 컬럼으로부터 화합물을 용리하는 것을 포함하는 방법.
하기의 화학식 VI을 갖는 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물, 수화물 또는 입체이성질체.
<화학식 VI>

(여기서, R^a 및 R^b는 하기와 같이 선택됨:
i) R^a는 수소이고; R^b는 알킬, 카르복시알킬, 시클로알킬, 알콕시카르보닐알킬 또는 디알킬아미노알킬이거나; 또는
ii) R^a 및 R^b는 그들이 치환되어 있는 질소 원자와 함께 1개 또는 2개의 알킬 기로 임의 치환되는 3-7 원의 헤테로시클릭 고리를 형성함).
제28항에 있어서, R^a 및 R^b가 하기와 같이 선택되는 것인 화합물:
i) R^a는 수소이고; R^b는 이소프로필, t-부틸, 시클로헥실, 에톡시카르보닐메틸, t-부틸옥시카르보닐메틸, 카르복시메틸 또는 디메틸아미노에틸이거나; 또는
ii) R^a 및 R^b는 그들이 치환되어 있는 질소 원자와 함께 4-메틸피페라진 또는 모르폴린 고리를 형성함.
제28항에 있어서, 하기에서 선택되는 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물, 수화물 또는 입체이성질체.

,
,

,
,

,
,

및
.
제28항에 있어서, 하기인 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물, 수화물 또는 입체이성질체.

,

,

,

및
.
제28항에 있어서, 하기인 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물, 수화물 또는 입체이성질체.

,

,

,

및
.
제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 유효 치료량을 투여하는 것을 포함하는, 플라비비리다에 바이러스에 감염된 숙주의 치료 방법.
약 1 mg/일 내지 약 150 mg/일의 양으로 화합물 1을 투여하는 것을 포함하는, 플라비비리다에 바이러스에 감염된 숙주의 치료 방법.
제34항에 있어서, 양이 약 5 mg/일 내지 약 100 mg/일인 방법.
제34항에 있어서, 양이 약 5, 10, 25, 50, 75 또는 100 mg/일인 방법.
제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 인터페론, 리바비린, 인터류킨, NS3 프로테아제 억제제, 시스테인 프로테아제 억제제, 페난트렌퀴논, 티아졸리딘 유도체, 티아졸리딘, 벤즈아닐리드, 헬리카제 억제제, 폴리머라제 억제제, 뉴클레오티드 유사체, 글리오톡신, 세룰레닌, 안티센스 포스포로티오에이트 올리고데옥시뉴클레오티드, IRES-의존성 번역의 억제제 및 리보자임으로 이루어진 군에서 선택되는 제2 항-바이러스 제제를 투여하는 것을 더 포함하는 방법.
제37항에 있어서, 제2 제제가 페길레이팅된 인터페론 알파 2a, 인터페론 알파콘-1, 천연 인터페론, 알부페론, 인터페론 베타-1a, 오메가 인터페론, 인터페론 알파, 인터페론 감마, 인터페론 타우, 인터페론 델타 및 인터페론 γ-1b로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
제38항에 있어서, 제2 제제가 리바비린인 방법.
제39항에 있어서, 화합물 1이 약 1 mg/일 내지 약 150 mg/일의 양으로 투여되고, 투여되는 리바비린의 양이 약 800 mg 내지 약 1400 mg인 방법.
제40항에 있어서, 투여되는 리바비린의 양이 약 800 gm, 1000 mg, 1200 mg 또는 1400 mg인 방법.
제33항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스가 C형 간염인 방법.
제33항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주가 인간인 방법.
제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 화합물, 및 제약상 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 제약 조성물.
제34항에 있어서, 경구용 제제인 조성물.
약 1 mg 내지 약 150 mg의 양으로 화합물 1을 포함하는 제약 조성물.
제46항에 있어서, 양이 약 5 mg 또는 25 mg인 제약 조성물.
제47항에 있어서, 경구용 캡슐인 조성물.
i) 2'-C-메틸 구아노신을 나트륨 술페이트 및 벤젠보론산과 반응시켜 하기 화학식 10-2의 화합물을 수득하는 것:
<화학식 10-2>

ii) 화학식 10-2의 화합물을 하기 화학식 10-3의 포스포네이트와 반응시킨 후에, 벤질아민과 반응시켜 하기 화합물 10-4를 수득하는 것:
<화학식 10-3>

<화학식 10-4>

; 및
iii) 화합물 10-4를 탈보호하여 하기의 화합물 1을 수득하는 것:
<화합물 1>

을 포함하는, 화합물 1의 제조 방법.