PL215228B1

PL215228B1 - Zwiazki tripeptydowe, ich zastosowanie i kompozycja farmaceutyczna je zawierajaca oraz jej zastosowanie

Info

Publication number: PL215228B1
Application number: PL373547A
Authority: PL
Inventors: Amy Ripka; Jeffrey Allen Campbell; Andrew Charles Good; Paul Michael Scola; Ny Sin; Brian Venables
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 2002-05-20
Filing date: 2003-05-20
Publication date: 2013-11-29
Also published as: IS7533A; AU2003299519A8; EP1506172B1; ATE503764T1; EP1506172A2; DE60336550D1; WO2004032827A3; US20040048802A1; AU2003299519A1; WO2004032827A2; PL373547A1; JP2006507264A; US7041698B2; ES2361011T3; EP1506172A4; JP4312718B2; NO20044897L

Description

Przedmiotem wynalazku są związki tripeptydowe, ich zastosowanie i kompozycja farmaceutyczna je zawierająca i jej zastosowanie. Nowe związki wykazują działanie przeciwwirusowe, hamują działanie proteazy NS3 kodowanej przez wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV). Tak więc, znajdują zastosowanie do hamowania czynności proteazy NS3.

HCV jest głównym patogenem ludzkim i jak się ocenia, jest odpowiedzialny za zakażenie na całym świecie 170 milionów osób - w przybliżeniu, liczba zakażonych wirusem HCV jest pięciokrotnie większa od liczby zakażonych wirusem nabytego ludzkiego niedoboru odporności typu 1. U znacznej części tych osobników zakażonych wirusem HCV rozwija się poważna, postępująca choroba wątroby, wliczając w to marskość wątroby i rak wątrobowo-komórkowy (Lauer G. M., Walker B. D., N. Engl. J. Med. (2001), 345, strony 41-52).

Obecnie, w najskuteczniejszym leczeniu HCV wykorzystuje się połączenie interferonu α i rybawiryny, co prowadz1 do przedłużenia skuteczności leczenia u 40% pacjentów (Poynard, T. i inni, Lancet (1998), 352, strony 1426-1432). Ostatnie wyniki badań klinicznych wykazują, że interferon α poli(oksy)etylenowany jest w monoterapii lepszy od interferonu a niemodyfikowanego (Zeuzem S. i inni, N. Engl, J. Med. (2000), 343, strony 1666-1672). Jednakże, nawet w przypadku stosowania doświadczalnych trybów leczenia, w których wykorzystuje się połączenia interferonu α poli(oksy)etlenowanego i rybawiryny, u znacznej części pacjentów nie stwierdzono przedłużonego zmniejszenia obciążenia wirusowego. Tak więc, istnieje widoczna i od dawna oczekiwana potrzeba opracowania skutecznych środków terapeutycznych do leczenia zakażenia wirusem HCV.

Wirus HCV jest wirusem zawierającym nić (+) RNA. W oparciu o porównanie dedukowanej sekwencji aminokwasowej i silnego podobieństwa w obszarze 5' który nie ulega translacji, wirus HCV został sklasyfikowany jako oddzielny rodzaj w rodzinie Flaviviridae. Wszyscy członkowie rodziny Flaviviridae posiadają wiriony z okrywą, które zawierają genom (+) RNA kodujący wszystkie znane, specyficzne dla wirusa białka, na drodze translacji pojedynczej, nieuszkodzonej, otwartej ramki odczytu.

Stwierdzono wewnątrz nukleotydu znaczną różnorodność i kodowaną sekwencję aminokwasową poprzez genom HCV. Scharakteryzowano co najmniej sześć głównych genotypów i opisano ponad 50 podtypów. W skali światowej rozkład głównych genotypów wirusa HCV jest różny i znaczenie kliniczne różnorodności genetycznej wirusa HCV, pomimo wielu badań możliwego wpływu genotypów na patogenezę i leczenie, pozostaje trudne do określenia.

Długość jednoniciowego genomu RNA wirusa HCV wynosi w przybliżeniu 9500 nukleotydów i posiada pojedynczą, otwartą ramkę odczytu (ORF) kodującą pojedynczą, dużą poliproteinę składającą się z około 3000 aminokwasów. W komórkach zakażonych, ta poliproteina jest rozszczepiana w wielu miejscach przez proteazy komórkowe i proteazy wirusowe, w celu wytworzenia białek strukturalnych i białek niestrukturalnych (NS). W przypadku wirusa HCV, wytworzenie dojrzałych białek niestrukturalnych (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A i NS5B) jest wynikiem działania dwóch proteaz wirusowych. Pierwsza z nich, jak dotąd słabo poznana, rozszczepia połączenie NS2-NS3, natomiast druga jest proteazą serynową znajdującą się w regionie N-końcowym białka NS3 (określana jako proteaza NS3) i pośredniczy we wszystkich kolejnych rozszczepieniach w kierunku 5' >3' nici NS3, zarówno w układzie cis przy miejscu rozszczepienia NS3-NS4A jak i w układzie trans dla pozostałych miejsc NS4A-NS4B, NS4B-NS5A, NS5A-NS5B. Okazuje się, że białko NS4A pełni wielorakie funkcje, działając jako kofaktor dla proteazy NS3 i prawdopodobnie uczestniczy w umiejscowieniu błonowym białka NS3 oraz innych składników replikacji wirusowej. Wydaje się, że utworzenie kompleksu białka NS3 z NS4A jest niezbędne dla zdarzeń które zwiększają wydolność proteolityczną we wszystkich miejscach. Białko NS3 charakteryzuje się także aktywnościami trifosfatazy nukleozydowej i helikazy RNA. NS5B jest polimerazą RNA zależną od RNA, która bierze udział w replikacji wirusa HCV.

Wśród związków które wykazują skuteczność w hamowaniu wirusa HCV, jako selektywne inhibitory proteazy serynowej wirusa HCV, znajdują się związki peptydowe ujawnione w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 6,323,180.

Przedmiotem wynalazku są związki tripeptydowe posiadające budowę opisaną wzorem I, wliczając w to ich farmaceutycznie dopuszczalne sole:

PL 215 228 B1

w którym:

(a) R1 oznacza H, C1-6alkil, allil lub fenyl;

R2 oznacza:

(i) C1-6alkil; C1-6alkil podstawiony przez grupę (C1-6alkilo)-karboksy, naftyl, tiofenyl, fenyl, przy czym fenyl może być podstawiony przez atom fluorowca, C1-4alkil, C1-4alkoksyl; cykloheksyl; fenylocyklopropyI; allil; lub R2 oznacza pięcio- Iub sześcioczłonową grupę heterocykliczną zawierającą jeden lub dwa heteroatomy wybrane spośród atomu azotu, tlenu lub siarki i która to grupa może być podstawiona jeden do trzech razy atomem fluorowca, C1-4alkilem, grupą C1-4alkilokarboksy lub fenylem, przy czym w przypadku tiofenu może on być ewentualnie skondensowany z grupą tetrametylenową (-CH2)4-); lub (ii) fenyl; fenyl podstawiony jeden do trzech razy podstawnikami wybranymi z grupy obejmującej: atom fluorowca, C1-4-alkil, C1-4alkoksyl, grupę nitrową, grupę cyjanową, grupę C1-6alkilokarboksy, acetyl, metylosulfanyl, trifluorometyl, grupę fenoksy, grupę karboksy, benzoil, oksym benzoilu, fenyl; lub fenyl może być podstawiony pięcio- do dziewięcioczłonową grupą heterocykliczną zawierającą jeden do trzech heteroatomów wybranych spośród atomu azotu, tlenu lub siarki, przy czym sama grupa heterocykliczna może być podstawiona od dwóch do trzech razy przez etoksykarbonyl, metyl, grupę metoksy lub trifluorometyl;

(b) R1 i R2 mogą razem tworzyć od pięcio- do sześcioczłonowej grupy heterocyklicznej lub razem tworzyć grupę pięcio- do sześcioczłonową grupę heterocykliczną skondensowaną z jedną lub dwiema grupami benzenowymi;

(c) A oznacza -OH, grupę cyklopropylo-N(H)SO2-;

(d) R4 oznacza winyl;

(e) n oznacza 1;

(f) R3 oznacza t-butyl;

(g) Y oznacza H; i (h) B oznacza grupę (C1-6-alkilo)karboksy lub cyklopropylo-metylokarbonyl.

Korzystny jest związek według wynalazku, w którym R1 oznacza H, C1-6alkil, allil lub fenyl.

Korzystny jest związek według wynalazku, w którym R2 oznacza fenyl ewentualnie podstawiony C1-3alkilem, atomem chloru lub atomem fluoru w liczbie od jednego do trzech; albo R2 oznacza fenyl ewentualnie podstawiony fenylem, grupą metoksy, grupą fenoksy, grupą C2-4alkilokarboksy, C2-6alkanoilem, grupą nitrową, metylosulfanylem lub grupą karboksy.

Korzystny jest związek według wynalazku, w którym R2 oznacza C1-6-alkil, cykloheksyl, przy czym te grupy mogą być ewentualnie podstawione fenylem.

Korzystny jest związek według wynalazku, w którym R2 oznacza sześcioczłonową grupę heterocykliczną ewentualnie podstawioną atomem chloru w liczbie od jednego do trzech lub atomem fluoru w liczbie jeden do trzech lub podstawioną grupą (C1-6-alkilo)karboksy.

Korzystny jest związek według wynalazku, w którym R2 oznacza allil.

Korzystny jest związek według wynalazku, w którym podstawniki R1 i R2 tworzą pięcio- lub sześcioczłonowy pierścień heterocykliczny zawierający ewentualnie atom tlenu.

Korzystny jest związek według wynalazku, w którym podstawniki R1 i R2 tworzą skondensowaną strukturę pierścieniową, zawierającą pięcio- i sześcioczłonowy pierścień.

PL 215 228 B1

Korzystny jest związek według wynalazku, w którym R4 oznacza allil.

Korzystny jest związek według wynalazku, w którym R3 oznacza t-butyl.

Korzystny jest związek według wynalazku, którym jest związek o wzorze

Korzystny jest związek według wynalazku, którym jest związek o wzorze:

Korzystny jest związek według zastrz. 1, którym jest związek o wzorze:

PL 215 228 B1

(VII)

Korzystny jest związek według wynalazku, którym jest związek o wzorze:

PL 215 228 B1

Korzystny jest związek według wynalazku, którym jest związek o wzorze:

PL 215 228 B1

Korzystny jest związek według wynalazku, którym jest związek o wzorze:

Dalszym aspektem wynalazku jest zastosowanie wyżej określonych związków tripeptydowych o wzorze (I) do leczenia zakażenia wirusem HCV u pacjenta lub do hamowania protezy HCV NS3.

Innym aspektem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca farmaceutycznie dopuszczalny nośnik i substancję czynną, znamienna tym, że zawiera jako substancję czynną wyżej określony związek o wzorze (I).

Dalszym aspektem wynalazku jest zastosowanie wyżej określonej kompozycji farmaceutycznej do wytwarzania leku do leczenia u pacjenta zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu C.

Tak więc, przedmiotem wynalazku są także kompozycje zawierające związki albo ich sole dopuszczone do stosowania w farmacji oraz nośnik dopuszczony do stosowania w farmacji. Szczególnie, przedmiotem obecnego wynalazku są kompozycje użyteczne w hamowaniu HCV NS3, zawierające leczniczo skuteczną ilość związku według wynalazku albo jego soli dopuszczonej do stosowania w farmacji oraz nośnik dopuszczony do stosowania w farmacji.

Związki według wynalazku znajdują zastosowanie do leczenia pacjentów zakażonych wirusem HCV, które obejmuje podawanie pacjentowi leczniczo skutecznej ilości związku według wynalazku albo jego soli dopuszczonej do stosowania w farmacji. Stwierdzono, że związki według wynalazku hamują proteazy HCV NS3.

Tak więc, wynalazek umożliwia dostarczenie ulepszonych leków zawierających związki według wynalazku, które mogą być skuteczne w leczeniu pacjentów zakażonych wirusem HCV. Dokładniej, przedmiotem obecnego wynalazku są związki tripeptydowe, które mogą hamować czynność proteazy NS3, na przykład w połączeniu z proteazą NS4A.

W niniejszym opisie, definicje i konwencje stereochemiczne stosuje się w oparciu o wytyczne zamieszczone w McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms, edycja S. P. Parker, McGraw-Hill Book

PL 215 228 B1

Company, New York (1984) i w Stereochemistry of Organic Compounds, E. Eliel i S. Wilen, John Wiley & Sons, Inc., New York (1994). Wiele związków organicznych istnieje w postaciach optycznie czynnych, to znaczy mają one zdolność skręcania płaszczyzny światła spolaryzowanego liniowo. W opisie związku optycznie czynnego, prefiksy D i L lub R i S stosuje się do oznaczenia konfiguracji absolutnej cząsteczki wokół jej centrum chiralnego (centrów chiralnych). Prefiksy d i l lub (+) i (-) stosuje się do oznaczenia kierunku obrotu światła spolaryzowanego liniowo przez związek, przy czym (-) lub l oznacza, że związek jest lewoskrętny oraz (+) lub d oznacza że związek jest prawoskrętny. W przypadku określonej budowy chemicznej, związki te nazywane stereoizomerami są identyczne, z tym że stanowią odbicie lustrzane względem siebie. Określony stereoizomer z pary stanowiącej odbicie lustrzane względem siebie, określa się także nazwą enancjomer, przy czym mieszanina takich izomerów nazywana jest często mieszaniną enancjomeryczną.

Jeżeli nie zdefiniowano inaczej, nazewnictwo użyte do opisania grup organicznych, na przykład węglowodorów i węglowodorów podstawionych, opiera się ogólnie na znanej w tej dziedzinie standardowej nomenklaturze. Jeżeli nie stwierdzono inaczej, to połączenia grup, na przykład „alkiloalkoksyamina, obejmują wszystkie stabilne konfiguracje. Dla ilustracji, poniżej zdefiniowano pewne grupy i połączenia grup.

Określenia „mieszanina racemiczna i „racemat odnoszą się do równomolowej mieszaniny dwóch cząsteczek enancjomerycznych, nie wykazującej aktywności optycznej.

Określenie „chiralny odnosi się do cząsteczek które charakteryzują się tym, że ich odbicia lustrzane nie dają się na siebie nałożyć, natomiast określenie „achiralny odnosi się do cząsteczek które charakteryzują się tym, że ich odbicia lustrzane dają się na siebie nałożyć.

Określenie „stereoizomery odnosi się do związków o identycznym składzie chemicznym lecz o odmiennym rozmieszczeniu atomów lub grup w przestrzeni.

Określenie „diastereoizomer odnosi się do stereoizomeru który nie jest enancjomerem, na przykład do stereoizomeru posiadającego dwa centra chiralne lub ich większą ilość i których cząsteczki nie są odbiciami lustrzanymi względem siebie. Diastereoizomery posiadają różne właściwości fizyczne, na przykład temperatury topnienia, temperatury wrzenia, właściwości spektralne i reaktywności. Mieszaniny diastereoizomerów można rozdzielać z zastosowaniem procedur analitycznych o wysokiej rozdzielczości, takich jak elektroforeza i chromatografia.

Określenie „enancjomery odnosi się do dwóch stereoizomerów związku, których odbicia lustrzane nie dają się na siebie nałożyć.

Określenie „sól dopuszczona do stosowania w farmacji obejmuje sole nietoksyczne syntetyzowane ze związków, które posiadają fragment zasadowy lub kwasowy, z zastosowaniem tradycyjnych metod chemicznych. Zwykle, takie sole można wytworzyć w reakcji postaci wolnego kwasu lub wolnej zasady tych związków ze stiechometryczną ilością zasady lub kwasu, w środowisku wodnym lub w środowisku rozpuszczalnika organicznego albo w mieszaninie tych dwóch mediów, przy czym zwykle preferowane są media niewodne, takie jak eter, octan etylu, etanol, izopropanol lub acetonitryl. Wykazy odpowiednich soli zamieszczone są w Remington's Pharmaceutical Sciences, wydanie 18-te, Mack Publishing Company, Easton, PA, 1990, strona 1445. Związki według obecnego wynalazku są użyteczne w postaci wolnej zasady lub wolnego kwasu albo w postaci ich soli dopuszczonej do stosowania w farmacji. Wszystkie te postacie mieszczą się w zakresie wynalazku.

Określenie „ilość skuteczna leczniczo oznacza ilość całkowitą każdego składnika aktywnego, która jest odpowiednia dla wywołania znaczącej korzyści u pacjenta, na przykład wydłużonego zmniejszenia obciążenia wirusem. W przypadku stosowania pojedynczego składnika aktywnego, podawanego indywidualnie, określenie to odnosi się do tego pojedynczego składnika. Gdy określenie stosuje się do połączenia, to odnosi się ono do połączonej ilości składników aktywnych powodujących skutek leczniczy, bez względu na to czy są podawane w połączeniu, czy kolejno, czy też równocześnie.

Określenie „związki według wynalazku i wyrażenia równoważne, obejmują związki o wzorze (I) oraz ich sole dopuszczone do stosowania w farmacji. Podobnie, odniesienie się do produktów pośrednich obejmuje ich sole, tam gdzie kontekst na to pozwala. Odniesienia do związku według wynalazku obejmują także związki korzystne, na przykład związki o wzorze III-XIII.

Określenie „pochodna oznacza związek zmodyfikowany chemicznie, przy czym jako modyfikację specjalista chemik uważa zwykle tworzenie estru lub amidu kwasu, w przypadku alkoholu lub tiolu zabezpieczenie taką grupą jak grupa benzylowa oraz w przypadku aminy zabezpieczenie grupą tertbutoksy-karbonylową.

PL 215 228 B1

Określenie „solwat oznacza asocjację fizyczną związku według tego wynalazku z jedną cząsteczką rozpuszczalnika lub z ich większą ilością, czy to rozpuszczalnika organicznego czy też nieorganicznego. Ta asocjacja fizyczna obejmuje wiązanie wodorowe. W pewnych przypadkach, solwat będzie miał zdolność do wyodrębnienia się, na przykład gdy jedna cząstka rozpuszczalnika lub ich większa ilość jest wprowadzona do siatki krystalicznej substancji krystalicznej. Określenie „solwat obejmuje zarówno solwaty w fazie ciekłej jak i solwaty wyodrębnione. Do przykładów solwatów zalicza się hydraty, etanolaty, metanolaty i tym podobne.

Użyte w niniejszym opisie określenie „prolek oznacza pochodne związków według wynalazku, które posiadają grupy zdolne do chemicznego lub metabolicznego odszczepienia i stają się, w wyniku solwolizy lub w warunkach fizjologicznych, związkami według wynalazku, które są aktywne farmaceutycznie in vivo. Prolek związku można wytworzyć tradycyjnymi metodami z grupami funkcyjnymi związków, takimi jak grupa aminowa, grupa hydroksy lub grupa karboksy, gdy są one obecne. Postać proleku pozwala często na uzyskanie korzyści w zakresie rozpuszczalności, zgodności tkankowej lub opóźnionego uwalniania w organizmie ssaka (patrz Bundgard H., Design of Prodrugs, strony 7-9, 2124, Elsevier, Amsterdam 1985). Do proleków zaliczą się pochodne kwasowe dobrze znane lekarzowi specjaliście w tej dziedzinie, takie jak na przykład estry wytwarzane w reakcji macierzystego związku kwasowego z odpowiednim alkoholem albo amidy wytwarzane w reakcji macierzystego związku kwasowego z odpowiednią aminą.

Określenie „pacjent obejmuje zarówno ludzi jak i inne ssaki.

Określenie „kompozycja farmaceutyczna oznacza kompozycję zawierającą związek według wynalazku w połączeniu z co najmniej jednym, dodatkowym nośnikiem farmaceutycznym, to jest ze środkiem wspomagającym, z substancją pomocniczą lub z podłożem, takim jak rozcieńczalniki, środki konserwujące, substancje wypełniające, środki poślizgowe, substancje rozsadzające, substancje zwilżające, emulgatory, środki dyspergujące, substancje słodzące, substancje smakowe, substancje zapachowe, środki przeciwbakteryjne, środki przeciwgrzybicze, środki smarujące i środki ułatwiające dozowanie, w zależności od rodzaju postaci dawkowania i sposobu ich podawania. Na przykład, można stosować składniki wymienione w Remington's Pharmaceutical Sciences, wydanie 18-te, Mack Publishing Company, Easton, PA (1999).

Wyrażenie „dopuszczony do stosowania w farmacji stosuje się w niniejszym opisie w celu odniesienia do tych związków, materiałów, kompozycji i/lub postaci dawkowania, które zgodnie z ustaloną oceną medyczną nadają się do stosowania w kontakcie z tkankami pacjentów, bez nadmiernej toksyczności, nadmiernego podrażnienia, nadmiernej odpowiedzi alergicznej lub bez innych problemów albo komplikacji, proporcjonalnie do rozsądnego stosunku ryzyko/korzyść.

Określenie „leczenie odnosi się do: (i) zapobiegania chorobie, zaburzeniu lub stanowi które mogą wystąpić u pacjenta predysponowanego na tę chorobę, zaburzenie i/lub stan lecz u którego jeszcze nie rozpoznano tej choroby, zaburzenia i/lub tego stanu; (ii) hamowania choroby, zaburzenia lub stanu, to znaczy zatrzymania ich rozwoju; oraz (iii) łagodzenia choroby, zaburzenia lub stanu, to znaczy powodowania cofnięcia się choroby, zaburzenia i/lub stanu.

Jeżeli nie określono inaczej, to użyte w niniejszym opisie określenie „podstawiony obejmuje podstawienie od jednej do maksymalnej liczby możliwych miejsc wiązania na rdzeniu, na przykładw grupie organicznej, z którą związany jest podstawnik, na przykład podstawienie mono-, di-, tri- lub tetra-.

Jak to użyto w niniejszym opisie, określenie atom fluorowca oznacza podstawnik fluorowcowy wybrany spośród atomów bromu, chloru, fluoru lub jodu. Określenie „fluorowcoalkil oznacza grupę alkilową podstawioną jednym podstawnikiem fluorowcowym albo ich większą ilością.

Jak to użyto w niniejszym opisie, określenie „alkil oznacza acykliczne podstawniki alkilowe o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym i na przykład obejmuje metyl, etyl, propyl, butyl, tert-butyl, heksyl, 1-metyloetyl, 1-metylopropyl, 2-metylopropyl, 1,1-dimetyloetyl. Tak więc, określenie C1-6-alkil odnosi się do grupy alkilowej posiadającej od jednego do sześciu atomów węgla. Określenie „niższy alkil oznacza grupę alkilową posiadającą od jednego do sześciu, korzystnie od jednego do czterech atomów węgla. Określenie „alkiloester oznacza grupę alkilową zawierającą dodatkowo grupę estrową. Zwykle, przy ustalonej liczbie atomów węgla, na przykład w grupie C2-6-alkiloestrowej, określenie obejmuje wszystkie atomy węgla w grupie.

Użyte w niniejszym opisie określenie „grupa alkoksy oznacza grupę alkilową ze wskazaną liczbą atomów węgla przyłączonych do atomu tlenu. Określenie grupa alkoksy obejmuje na przykład grupę metoksy, grupę etoksy, grupę propoksy, grupę 1-metyloetoksy, grupę butoksy i grupę 1,1-dime10

PL 215 228 B1 tyloetoksy. Ta ostatnia grupa jest określana w tej dziedzinie jako grupa tert-butoksy. Określenie „alkoksykarbonyl oznacza grupę alkoksy zawierającą dodatkowo grupę karbonylową.

Jak to użyto w niniejszym opisie, określenie „grupa fluorowcoalkoksy oznacza -O-(fluorowcoalkil), gdzie fluorowcoalkil został uprzednio zdefiniowany.

Jak to użyto w niniejszym opisie, określenie „alkanoil oznacza grupy 1-oksoalkilowe o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym, zawierające wskazaną liczbę atomów węgla i obejmuje takie grupy jak na przykład formyl, acetyl, 1-oksopropylo(propionyl), 2-metylo-1-oksopropyl, 1-oksoheksyl i tym podobne.

Użyte w niniejszym opisie określenie „cykloalkil oznacza podstawnik cykloalkilowy zawierający wskazaną liczbę atomów węgla i obejmuje na przykład cyklopropyl, cyklobutyl, cyklopentyl, cykloheksyl, cykloheptyl oraz cykliczne grupy spiranowe, takie jak spirocyklopropyl lub spirocyklobutyl. Jak to użyto w niniejszym opisie, określenie „grupa cykloalkoksy oznacza grupę cykloalkilową przyłączoną do atomu tlenu, taką jak na przykład cyklobutyloksy lub cyklopropyloksy. Określenie „alkilocykloalkil oznacza cykloalkil przyłączony do grupy alkilowej. Jeżeli nie określono inaczej, to ustalony zakres liczby atomów węgla obejmuje całkowitą liczbę atomów węgla w grupie. Taki C4-10-alkilocykloalkil może zawierać od 1 do 7 atomów węgla w grupie alkilowej i od 3 do 9 atomów węgla w pierścieniu, i może to być na przykład cyklopropylometyl lub cykloheksyloetyl.

Użyte w niniejszym opisie określenie „aryl oznacza aromatyczny fragment cząsteczki zawierający wskazaną liczbę atomów węgla, taki jak fenyl, indanyl lub naftyl lecz nie ograniczając się do nich. Na przykład określenie C6-10-aryl oznacza aromatyczny fragment cząsteczki posiadający od 6 do 10 atomów węgla, który może mieć budowę monocykliczną lub bicykliczną. Użyte w niniejszym opisie określenie „fluorowcoaryl odnosi się do arylu mono-, di- lub tripodstawionego jednym atomem fluorowca lub ich większą ilością. Określenia „alkiloaryl, „aryloalkil i „aryloalkiloalkil oznaczają grupę arylową podstawioną jedną grupą alkilową lub ich większą ilością. Tak więc grupa C7-14-alkiloarylowa może posiadać od 1 do 8 atomów węgla w grupie alkilowej, w przypadku monocyklicznej grupy aromatycznej i od 1 do 4 atomów węgla w grupie alkilowej, w przypadku skondensowanej grupy aromatycznej. Do grup arylowych zalicza się grupy podstawione typowymi podstawnikami znanymi przez specjalistów, takimi jak na przykład atom fluorowca, grupa hydroksy, grupa karboksy, karbonyl, grupa nitrowa, grupa sulfonowa, grupa aminowa, grupa cyjanowa, grupa dialkiloaminowa, fluorowcoalkil, CF3, grupa fluorowcoalkoksy, tioalkil, alkanoil, SH, grupa alkiloaminowa, grupa alkiloamidowa, grupa dialkiloamidowa, karboksyester, grupa alkilosulfonowa, grupa alkilosulfonamidowa i grupa alkilo(alkoksy)aminowa. Do przykładów grup alkiloarylowych zalicza się benzyl, butylofenyl i 1-naftylofenyl. Określenia „grupa alkiloaryloksy i „alkiloaryloester oznacza grupy alkiloarylowe zawierające odpowiednio atom tlenu i grupę estrową.

Jak to użyto w niniejszym opisie, określenie „karboksyalkil oznacza grupę karboksy (COOH) dołączoną do grupy alkilowej, którą zdefiniowano powyżej i obejmuje na przykład kwas masłowy.

Użyte w niniejszym opisie określenie „aminoaryloalkil oznacza grupę aminową podstawioną grupą aryloalkilową, taką jak poniższa grupa aminoaryloalkilowa.

Jak to użyto w niniejszym opisie, określenie „alkiloamid oznacza amid monopodstawiony grupą alkilową, taki jak grupa o poniższym wzorze.

PL 215 228 B1

Użyte w niniejszym opisie określenie „alkilokarboksyalkil odnosi się do grupy o poniższym wzorze.

Użyte w niniejszym opisie określenie „grupa heterocykliczna oznaczana również skrótem „Het, oznacza grupę jednowartościową uzyskaną przez usunięcie atomu wodoru z pięcio-, sześcio- lub siedmioczłonowej, nasyconej lub nienasyconej grupy heterocyklicznej (wliczając w to grupy aromatyczne), zawierającej od jednego do czterech heteroatomów wybranych spośród atomów azotu, tlenu lub siarki. Grupy heterocykliczne według obecnego wynalazku, obejmują takie grupy które są podstawione typowymi podstawnikami, które są znane specjalistom w tej dziedzinie, na dowolnym spośród pierścieniowych atomów węgla, przy czym ilość podstawników wynosi na przykład od jednego do trzech. Do przykładów takich podstawników zalicza się C1-6-alkil, C3-7-cykloalkil, grupę C1-6-alkoksy, grupę C3-7-cykloalkoksy, fluorowco-C1-6-alkil, CF3, grupę mono- lub difluorowco-C1-6-alkoksy, grupę cyjanową, atom fluorowca, tioalkil, grupę hydroksy, alkanoil, NO2, SH, grupę aminową, grupę C1-6-alkiloaminową, grupę di-(C1-6)-alkiloaminową, grupę di-(C1-6)-alkiloamidową, grupę karboksy, (C1-6)-karboksyester, C1-6-alkilosulfon, grupę C1-6-alkilosulfonamidową, C1-6-alkilo-sulfotlenek, grupę di-(C1-6)-alkilo(alkoksy)aminową, C6-10-aryl, C7-14-alkiloaryl oraz od pięcio- do siedmioczłonową monocykliczną grupę heterocykliczną. Ponadto, określenie grupa heterocykliczna obejmuje zdefiniowane powyżej grupy heterocykliczne, które są skondensowane z jedną lub z większą ilością innych struktur pierścieniowych. Do przykładów odpowiednich grup heterocyklicznych zalicza się pirolidynę, tetrahydrofuran, tiazolidynę, pirol, tiofen, diazepinę, 1H-imidazol, oksazol, pirazynę, izoksazol, tiazol, tetrazol, piperydynę, 1,4-dioksan, 4-morfolinę, pirydynę, pirymidynę tiazolo[4,5-b]pirydynę, chinolinę lub indol albo grupy heterocykliczne o poniższych wzorach:

Użyte w niniejszym opisie określenie „grupa alkiloheterocykliczna oznacza taką grupę heterocykliczną jaką zdefiniowano powyżej, połączoną z grupą alkilową o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym, przy czym grupa alkilowa jest taką grupą jaką zdefiniowano powyżej, zawierającą wskazaną liczbę atomów węgla. Do przykładów grup C1-6-alkilo-Het zalicza się:

Użyte w niniejszym opisie oznaczenia ,,P1', P1, P2, P3 i P4, zastosowane w nazwach związków według obecnego wynalazku, odwzorowują względne pozycje wiązania reszt aminokwasowych inhibitora proteazy w stosunku do pozycji wiązania rozszczepionego substratu naturalnego peptydu. Rozszczepienie następuje w naturalnym substracie pomiędzy pozycjami P1 i P1', gdzie pozycje bez wskaźnika prim wskazują aminokwasy rozpoczynające się od C-końcowego miejsca rozszczepienia naturalnego peptydu i rozciągające się do miejsca N-końcowego, podczas gdy pozycje ze wskaźnikiem prim rozciągają się od N-końcowego miejsca rozszczepienia w kierunku miejsca C-końcowego. Na przykład, oznaczenie P1' odnosi się do pierwszej pozycji z dala od prawego, C-końcowego miejsca rozszczepienia (to znaczy do pierwszej pozycji N-końcowej); podczas gdy P1 jest początkiem numerowania od lewej strony C-końcowego miejsca rozszczepienia, P2 oznacza drugą pozycję miejsca C-końcowego i tak dalej. Patrz: Berger A. & Schechter I., Transactions of the Royal Society London series (1970), B257, strony 249-264.

Tak więc, w związkach o wzorze I, części „od P1' do P4 cząsteczki są takie jak to przedstawiono poniżej:

PL 215 228 B1

Jak to użyto w niniejszym opisie, określenie „kwas 1-aminocyklopropylokarboksylowy (Acca) odnosi się do związku o wzorze:

Jak to użyto w niniejszym opisie, określenie „tert-butyloglicyna odnosi się do związku o wzorze:

Określenie „reszta, w odniesieniu do aminokwasu lub pochodnej aminokwasu, oznacza grupę pochodzącą od odpowiedniego α-aminokwasu, powstałą w wyniku eliminacji grupy OH z grupy karboksylowej i jednego atomu wodoru z grupy α-aminokwasowej. Na przykład, określenia Gln, Ala, Hyp, Ile, Arg, Asp, Phe, Ser, Leu, Cys, Asn, Sar i Tyr oznaczają „reszty odpowiednio L-glutaminy, L-alaniny, glicyny, L-izoleucyny, L-argininy, kwasu L-asparaginowego, L-fenylo-alaniny, L-seryny, L-leucyny, L-cysteiny, L-asparaginy, sarkozyny i L-tyrozyny.

Określenie „łańcuch boczny, użyte w odniesieniu do aminokwasu lub reszty aminokwasowej, oznacza grupę przyłączoną do alfa atomu węgla α-aminokwasu. Na przykład, w przypadku glicyny grupą R stanowiącą łańcuch boczny jest atom wodoru, w przypadku alaniny jest to metyl oraz w przypadku waliny jest to izopropyl. Odnośnie specjalnych grup R lub łańcuchów bocznych aminokwasów, patrz: A.L. Lehninger's text on Biochemistry (rozdział 4).

Związki według wynalazku, gdy występują w postaci zasadowej, mogą tworzyć sole w wyniku dodania kwasu dopuszczonego do stosowania w farmacji. Sole addycyjne z kwasem wytwarza się ze związku o wzorze (I) i kwasu dopuszczonego do stosowania w farmacji, wliczając w to kwas chlorowodorowy, kwas bromowodorowy, kwas jodowodorowy, kwas siarkowy, kwas fosforowy albo taki kwas organiczny jak kwas p-toluenosulfonowy, kwas metanosulfonowy, kwas octowy, kwas benzoesowy, kwas cytrynowy, kwas malonowy, kwas fumarowy, kwas maleinowy, kwas szczawiowy, kwas bursztynowy, kwas amidosulfonowy lub kwas winowy lecz nie ograniczając się do nich. Tak więc, do

PL 215 228 B1 przykładów takich soli dopuszczonych do stosowania w farmacji zalicza się chlorek, bromek, jodek, siarczan, fosforan, metanosulfonian, cytrynian, octan, malonian, fumaran, amidosulfonian i winian.

Sole grupy aminowej mogą także obejmować czwartorzędowe sole amoniowe, w których aminowy atom azotu jest nośnikiem odpowiedniej grupy organicznej, takiej jak alkil, alkenyl, alkinyl lub aryloalkil.

Związki według wynalazku, które są podstawione grupą kwasową, mogą istnieć w postaci soli utworzonych przez dodanie zasady. Do takich soli addycyjnych z zasadą zalicza się te sole, które pochodzą od zasad nieorganicznych, do których zalicza się na przykład sole metali alkalicznych (na przykład sodu i potasu), sole metali ziem alkalicznych (na przykład wapnia i magnezu) sole glinu i sole amoniowe. Ponadto, do odpowiednich soli zalicza się sole dopuszczalnych fizjologicznie zasad organicznych, takich jak trimetyloamina, trietyloamina, morfolina, pirydyna, piperydyna, pikolina, dicykloheksyloamina, N,N,-dibenzyloetylenodiamina, 2-hydroksy-etyloamina, bis-(2-hydroksyetylo)-amina, tri-(2-hydroksyetylo)-amina, prokaina, dibenzylopiperydyna, N-benzylo-e-fenetyloamina, dehydroabietyloamina, N,N'-bis-hydroabietyloamina, glukamina, N-metyloglukamina, kolidyna, chinina, chinolina, etylenodiamina, ornityna, cholina, N,N'-benzylofenetyloamina, chloroprokaina, dietanoloamina, dietyloamina, piperazyna, tris(hydroksymetylo)aminometan i wodorotlenek tetrametyloamoniowy oraz zasadowe aminokwasy, takie jak lizyna, arginina i N-metyloglutamina. Sole te można wytwarzać stosując metody znane specjalistom.

Pewne związki według wynalazku oraz ich sole mogą istnieć w postaci solwatów z wodą, na przykład hydratów albo w postaci solwatów z rozpuszczalnikami organicznymi, takimi jak metanol, etanol lub acetonitryl, w celu utworzenia odpowiednio metanolatu, etanolatu lub acetonitrylatu.

Ponadto, związki według wynalazku albo ich sole lub solwaty mogą wykazywać polimorfizm.

Związki według wynalazku mogą zawierać także dwa centra chiralne lub ich większą ilość. Na przykład, związki mogą zawierać element cyklopropylowy P1 o wzorze:

w którym każdy z symboli C1 i C2 oznacza asymetryczny atom węgla w pozycjach 1 i 2 pierścienia cyklopropylowego. Nie biorąc pod uwagę innych centrów asymetrycznych w innych segmentach związków, obecność tych dwóch centrów asymetrycznych oznacza, że związki mogą istnieć jako mieszaniny racemiczne diastereoizomerów, takich jak diastereoizomery w których R2 jest w konfiguracji albo syn w stosunku do amidu albo syn w stosunku do karbonylu, jak to pokazano poniżej.

R2 jest w konfiguracji syn w stosunku do karbonylu R2 jest w konfiguracji syn w stosunku do karbonylu

PL 215 228 B1

R2 jest w konfiguracji syn w stosunku do amidu R2 jest w konfiguracji syn w stosunku do amidu

Tak więc, związki według wynalazku mogą występować w postaci enancjomerów i mieszanin enancjomerów jak i mieszaniny racemicznej.

Enancjomery można rozdzielać stosując metody znane przez specjalistów z tej dziedziny, na przykład przez utworzenie soli diastereoizomerycznych, które można rozdzielać na drodze krystalizacji, z zastosowaniem chromatografii gaz-ciecz lub chromatografii cieczowej, poddanie selektywnej reakcji jednego enancjomeru z reagentem specyficznym enancjomerycznie. Jest oczywiste, że gdy żądany enancjomer przekształca się w inną postać chemiczną przez zastosowanie techniki rozdziału, to wymagany jest dodatkowy etap w celu utworzenia żądanej postaci enancjomerycznej. Odmiennie, określone enancjomery można syntetyzować na drodze syntezy asymetrycznej z zastosowaniem optycznie czynnych reagentów, substratów, katalizatorów lub rozpuszczalników albo przez przekształcenie jednego enancjomeru w inny na drodze transformacji asymetrycznej.

Związki według wynalazku mogą występować w postaci proleku. Korzystnymi prolekami są proste, alifatyczne lub aromatyczne estry pochodzące od grup kwasowych występujących w związkach według tego wynalazku. W pewnych przypadkach, pożądane jest wytworzenie proleku w postaci diestru, takiego jak estry (acyloksy)alkilowe lub estry (alkoksykarbonyloksy)alkilowe.

Pewne związki według wynalazku mogą także istnieć w różnych stabilnych postaciach konformacyjnych, które można rozdzielać. Asymetria skrętna spowodowana zahamowaną rotacją wokół asymetrycznego wiązania pojedynczego, spowodowana na przykład zawadą przestrzenną lub odkształceniem pierścienia, może umożliwić rozdzielenie różnych konformerów.

Pewne związki według wynalazku istnieją w postaci amfoterycznej.

Substraty nadające się do syntezy związków według wynalazku są znane specjalistom z tej dziedziny i można je łatwo wytworzyć lub są dostępne w handlu.

Związki według wynalazku można wytworzyć z zastosowaniem metod znanych specjalistom z tej dziedziny, patrz na przykład opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 6,323,180 oraz zgłoszenie patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 20020111313 A1. Poniższy opis metod został zamieszczony w celach ilustracji. Jest oczywiste, że może być korzystne lub niezbędne wytworzenie takiego związku w którym grupa funkcyjna jest zabezpieczona z użyciem tradycyjnej grupy zabezpieczającej i następnie grupa zabezpieczająca jest usunięta w celu otrzymania związku według obecnego wynalazku. Szczegóły dotyczące zastosowania grup zabezpieczających zgodnie z obecnym wynalazkiem są znane specjalistom z tej dziedziny.

Związki według wynalazku można na przykład syntetyzować zgodnie z ogólnym procesem przedstawionym na schemacie I (w którym CPG oznacza grupę zabezpieczającą grupę karboksylową oraz APG oznacza grupę zabezpieczającą grupę aminową).

PL 215 228 B1

Schemat I

Pl -*- Pl-CPG + APG-P2 —APG-P2-Pl-CPG b

APG-P3-P2-Pl-CPG *- P2-P1-CPG + APG-P3 d

B-P3-P2-P1 -► B-P3-P2-P1-P1'

Krótko, grupy P1, P2 i P3 można wiązać z zastosowaniem dobrze znanych technik sprzęgania peptydowego. Grupy P1, P2 i P3 można wiązać razem w dowolnej kolejności tak długo aż związek końcowy odpowiada peptydom według wynalazku. Na przykład, P3 można wiązać do P2-P1 lub P1 można wiązać do P3-P2.

Zwykle, peptydy są wydłużane przez odbezpieczenie grupy aminowej reszty N-końcowej i sprzęganie niezabezpieczonej grupy karboksylowej następnego, odpowiedniego aminokwasu zabezpieczonego przy azocie poprzez wiązanie peptydowe, z zastosowaniem metod uprzednio opisanych. Tę procedurę odbezpieczania i sprzęgania powtarza się aż do uzyskania żądanej sekwencji. To sprzęganie można przeprowadzić etapami z komponentami aminokwasowymi, jak to przedstawiono na schemacie I.

Sprzęganie pomiędzy dwoma aminokwasami, pomiędzy aminokwasem i peptydem lub pomiędzy dwoma fragmentami peptydowymi można przeprowadzić z zastosowaniem standardowych procedur sprzęgania, takich jak metoda z zastosowaniem azydku, metoda z zastosowaniem mieszanego bezwodnika węglowo-karboksylowego (chloromrówczan izobutylu), metoda z zastosowaniem karbodiimidu (dicykloheksylokarbodiimid, diizopropylokarbodiimid lub karbodiimid rozpuszczalny w wodzie), metoda z zastosowaniem aktywnego estru (ester o-nitrofenylowy, imidoester N-hydroksybursztynowy), metoda K z reagentem Woodwarda, metoda z zastosowaniem karbonylodiimidazolu, metody z zastosowaniem reagentów fosforowych lub metody utlenianie-redukcja. Niektóre z tych metod (szczególnie metoda z zastosowaniem karbodiimidu) można udoskonalić przez dodanie 1-hydroksybenzotriazolu lub 4-DMAP. Te reakcje sprzęgania można przeprowadzić albo w roztworze (faza ciekła) albo w fazie stałej.

Dokładniej, etap sprzęgania wymaga sprzęgania z zastosowaniem odwadniania, wolnej grupy karboksylowej jednego reagenta z wolną grupą aminową drugiego reagenta, w obecności środka sprzęgającego, w celu utworzenia połączenia w postaci wiązania amidowego. Opis takich środków sprzęgających znajduje się w ogólnych podręcznikach dotyczących chemii peptydów, takich jak na przykład M. Bodanszky, Peptide Chemistry, wydanie drugie poprawione, Springer-Verlag, Berlin, Niemcy, (1993). Do przykładów odpowiednich środków sprzęgających zaIicza się N,N'-dicykloheksylokarbodiimid, 1-hydroksy-benzotriazol w obecności N,N'-dicykloheksylokarbodiimidu Iub N-etylo-N'-[(3-dimetyloamino)propylo]karbodiimid. Praktycznym i użytecznym środkiem sprzęgającym jest dostępny w handlu heksafluorofosforan (benzotriazol-1-iloksy)tris-(dimetyloamino)fosfonowy albo stosowany sam albo w obecności 1-hydroksybenzotriazolu lub 4-DMAP. Innym praktycznym i użytecznym środkiem sprzęgającym jest dostępny w handlu tetrafluoroboran 2-(1H-benzotriazol-1-ilo)-N,N,N',N'-tetrametylouroniowy. Jeszcze innym praktycznym i użytecznym środkiem sprzęgającym jest dostępny w handlu heksafluorofosforan O-(7-azabenzotriazol-1-ilo)-N,N,N',N'-tetra-metylouroniowy. Reakcję sprzęgania przeprowadza się w środowisku

PL 215 228 B1 rozpuszczalnika obojętnego, takiego jak na przykład dichlorometan, acetonitryl lub dimetyloformamid. W celu utrzymania w mieszaninie reakcyjnej wartości pH wynoszącej około 8, do mieszaniny reakcyjnej dodaje się nadmiar aminy trzeciorzędowej, takiej jak na przykład diizopropyloetyloamina, N-metylomorfolina, N-metylopirolidyna lub 4-DMAP. Temperatura reakcji mieści się zwykle w zakresie od 0°C do 50°C i czas reakcji wynosi od 15 minut do 24 godzin.

Podczas reakcji sprzęgania, grupy funkcyjne składników aminokwasowych muszą być zwykle zabezpieczone, w celu uniknięcia tworzenia się niepożądanych wiązań. Grupy zabezpieczające które można stosować są wymienione w książce Greene'a, Protective Groups in Organic Chemistry, John

Wiley & Sons, New York (1981) oraz w The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, tom 3, Academic Press, New York (1981), które to publikacje zamieszcza się w niniejszym jako referencje.

Grupa α-aminowa każdego aminokwasu poddawanego reakcji sprzęgania do rozrastającego się peptydu musi być zabezpieczona (APG). Można zastosować dowolną grupę zabezpieczającą znaną w tej dziedzinie. Do przykładów takich grup zalicza się: 1) grupy acylowe, takie jak formyl, trifluoroacetyl, ftalil i p-toluenosulfonyl; 2) aromatyczne grupy karbaminianowe, takie jak benzyloksykarbonyl (Cbz lub Z) i podstawione benzyloksykarbonyle oraz 9-fluorenylo-metyloksykarbonyl (Fmoc); 3) alifatyczne grupy karbaminianowe, takie jak tert-butyloksykarbonyl (Boc), etoksykarbonyl, diizopropylometoksykarbonyl i alliloksy-karbonyl; 4) cykloalkilowe grupy karbaminianowe, takie jak cyklopentyloksykarbonyl i adamantyloksykarbonyl; 5) grupy alkilowe, takie jak trifenylometyl i benzyl; 6) trialkilosilil taki jak trimetylosilil; oraz 7) grupy zawierające tiol, takie jak fenylotiokarbonyl i ditiasukcynoil. Korzystną grupą zabezpieczającą grupę α-aminową jest albo Boc albo Fmoc. W handlu dostępnych jest wiele odpowiednio zabezpieczonych pochodnych aminokwasów przeznaczonych do syntezy peptydu. Grupę zabezpieczającą grupę α-aminową nowo dodanej reszty aminokwasu odszczepia się przed sprzęganiem następnego aminokwasu. Gdy stosuje się grupę Boc, metodami z wyboru są: metoda z kwasem trifluorooctowym, czystym lub w dichlorometanie albo metoda z HCl w dioksanie lub w octanie etylu. Następnie, otrzymaną sól amonową zobojętnia się albo przed sprzęganiem albo in situ, z użyciem takich roztworów zasadowych jak bufory uwodnione lub roztwory amin trzeciorzędowych w dichlorometanie albo w acetonitrylu lub w dimetyloformamidzie. Gdy stosuje się grupę Moc, reagentami z wyboru są piperydyna lub piperydyna podstawiona w dimetyloformamidzie lecz można użyć dowolną aminę drugorzędową. Odbezpieczenie przeprowadza się w zakresie temperatur od 0°C do temperatury pokojowej (rt lub RT), zwykle od 20°C do 22°C.

Podczas wytwarzania peptydu, każdy aminokwas posiadający grupy funkcyjne w łańcuchu bocznym musi być zabezpieczony z zastosowaniem dowolnej z wyżej opisanych grup. Dla specjalistów w tej dziedzinie jest oczywiste, że dobór i zastosowanie odpowiednich grup zabezpieczających dla tych grup funkcyjnych w łańcuchu bocznym zależy od rodzaju aminokwasu i od obecności innych grup funkcyjnych w peptydzie. Dobór takich grup zabezpieczających jest ważny, ponieważ grupa nie może zostać usunięta podczas etapu odbezpieczania i podczas sprzęgania grupy α-aminowej.

Na przykład, gdy stosuje się grupę Boc jako grupę zabezpieczającą grupę α-aminową, odpowiednie są niżej wymienione grupy zabezpieczające łańcuch boczny: p-toluenosulfonylowe (tosylowe) fragmenty cząsteczek można użyć do zabezpieczenia aminowego łańcucha bocznego takich aminokwasów jak Lys i Arg; acetamidometylowe, benzylowe (Bn) lub tert-butylosulfonylowe fragmenty cząsteczek można użyć do zabezpieczenia łańcucha bocznego cysteiny zawierającego grupę siarczkową; etery benzylowe (Bn) można użyć do zabezpieczenia łańcuchów bocznych seryny, treoniny lub hydroksyproliny zawierających grupę hydroksy; oraz estry benzylowe można użyć do zabezpieczenia łańcuchów bocznych kwasu asparaginowego i kwasu glutaminowego zawierających grupę karboksylową.

Gdy do zabezpieczenia grupy α-aminowej wybrana jest grupa Fmoc, zwykle możliwymi do przyjęcia grupami zabezpieczającymi łańcuch boczny są grupy na bazie tert-butylu. Na przykład, Boc można użyć do lizyny i argininy, eter tert-butylowy można użyć do seryny, treoniny i hydroksyproliny oraz ester tert-butylowy można użyć do kwasu asparaginowego i do kwasu glutaminowego. Fragment trifenylometylowy (tritylowy) cząsteczki można użyć do zabezpieczenia łańcucha bocznego cysteiny zawierającego grupę siarczkową.

Po zakończeniu wydłużania peptydu, usuwa się wszystkie grupy zabezpieczające. Gdy stosuje się syntezę w fazie ciekłej, grupy zabezpieczające usuwa się w sposób zależny od rodzaju wybranych grup zabezpieczających. Procedury te są dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie.

Ponadto, przy wytwarzaniu związków według obecnego wynalazku należy wziąć pod uwagę poniższe wskazówki. Na przykład, w celu uformowania związku w którym R4-C(O)-, R4-S(O)2, zabezpieczony P3 albo cały peptyd lub odcinek peptydu jest odpowiednio sprzężony z odpowiednim chlorPL 215 228 B1 kiem kwasowym lub chlorkiem sulfonylu, należy mieć na uwadze że jest on dostępny w handlu albo jego synteza jest dobrze znana. W przypadku wytwarzania, związek w którym występuje R4O-C(O)-, zabezpieczony P3 albo cały peptyd lub odcinek peptydu jest sprzężony z odpowiednim chloromrówczanem, który jest dostępny w handlu albo jego synteza jest dobrze znana. W przypadku pochodnych Boc stosuje się (Boc)2O.

Na przykład:

W celu otrzymania odpowiedniego chloromrówczanu, cyklopentanol poddaje się reakcji z fosgenem.

Chloromrówczan poddaje się reakcji z żądanym NH2-tripeptydem, w obecności takiej zasady jak trietyloamina, otrzymując cyklopentylokarbaminian.

W procesie wytwarzania, związek w którym występuje R4-N(R5)-C(O)- lub R4-NH-C(S)-, zabezpieczony P3 albo cały peptyd lub odcinek peptydu, poddaje się reakcji z fosgenem i następnie z aminą, jak to opisano w SynLett., luty 1995, 2, strony 142-144 albo poddaje się reakcji z dostępnym w handlu izocyjanianem i z odpowiednią zasadą, taką jak trietyloamina.

W procesie wytwarzania, związek w którym występuje R4-N(R5)-S(O2)-, zabezpieczony P3 albo cały peptyd lub odcinek peptydu poddaje się reakcji albo ze świeżo wytworzonym lub z dostępnym w handlu chlorkiem sulfamylu i następnie reakcji z aminą, jak to opisano w opisie patentowym Ger. Offen. (1998), strony 84, numer DE 19802350 lub w publikacji międzynarodowej numer WO 98/32748.

Grupa α-karboksylowa reszty C-końcowej jest zwykle zabezpieczona jako ester (CPG), który można odszczepić otrzymując kwas karboksylowy. Do grup zabezpieczających które można użyć zalicza się : 1) estry alkilowe, takie jak metyl, trimetylosililoetyl i tert-butyl; 2) estry aryloalkilowe, takie jak benzyl i benzyl podstawiony; lub 3) estry które można odszczepić w reakcji z łagodną zasadą lub z łagodnym środkiem redukującym, takie jak estry trichloroetylu i fenacylu.

Otrzymany kwas α-karboksylowy (w wyniku rozszczepienia przez łagodny kwas, łagodną zasadę lub łagodny środek redukujący) sprzęga się z R1SO2NH2 (wytworzonym w reakcji R1SO2Cl, w roztworze z tetrahydrofuranem nasyconym amoniakiem), w obecności środka sprzęgającego peptyd, takiego jak CDI lub EDAC i w obecności takiej zasady jak 4-dimetyloaminopirydyna (4-DMAP) i/lub 1,8-diazabicyklo[5.4.0]undec-7-en (DBU), w celu wprowadzenia fragmentu peptydowego P1', tworząc skutecznie tripeptyd P1'-P1-P2-P3-APG. W tym procesie stosuje się zwykle 1-5 równoważników środka sprzęgającego peptyd P1'.

Ponadto, jeżeli od P3 odszczepia się grupę zabezpieczającą APG i zastępuje się grupą B w sposób opisany powyżej i następnie otrzymany w wyniku odszczepienia kwas α-karboksylowy (odszczepienia przeprowadzonego z zastosowaniem łagodnego kwasu, łagodnej zasady lub łagodnego środka redukującego) sprzęga się z R1SO2NH2 [wytworzonym w reakcji R1SO2Cl, w roztworze z tetrahydrofuranem nasyconym amoniakiem lub z zastosowaniem metod alternatywnych przedstawionych w niniejszym opisie], w obecności środka sprzęgającego peptyd, takiego jak CDI lub EDAC i w obecności takiej zasady jak 4-dimetyloaminopirydyna (4-DMAP) i/lub 1,8-diazabicyklo-[5.4.0]undec-7-en (DBU), w celu wprowadzenia fragmentu peptydowego P1', to otrzymuje się tripeptyd P1'-P1-P2-P3-B. W tym procesie stosuje się zwykle 1-5 równoważników środka sprzęgającego P1'.

Związki według wynalazku można wytworzyć z zastosowaniem wielu metod, wliczając te metody, które opisano w przykładach zamieszczonych poniżej oraz te przedstawione w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 6,323,180 oraz w zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 10/001,850 złożonym dnia 20 listopada 2001 r. Informacje i wskazówki podane w opisie patento18

PL 215 228 B1 wym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 6,323,180 oraz w zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 10/001,850, zamieszcza się w niniejszym opisie w całości jako referencje.

Przedmiotem wynalazku są także kompozycje zawierające związek według wynalazku albo jego sól dopuszczoną do stosowania w farmacji oraz nośnik dopuszczony do stosowania w farmacji. Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku zawierają leczniczo skuteczną ilość związku według wynalazku albo jego soli dopuszczonej do stosowania w farmacji oraz nośnik dopuszczony do stosowania w farmacji, przy czym nośnikiem dopuszczonym do stosowania w farmacji jest na przykład substancja pomocnicza lub rozcieńczalnik podłoża.

Składnik aktywny, to jest związek, znajduje się zwykle w takich kompozycjach w ilości od 0,1% wagowego do 99,9% wagowego kompozycji i często ilość składnika aktywnego mieści się w granicach od 5% wagowych do 95% wagowych.

Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku można podawać doustnie, pozajelitowo lub z wszczepionego zbiornika. Preferowane jest podawanie doustne lub podawanie przez wstrzyknięcie. W pewnych przypadkach, pH postaci użytkowej można wyregulować przy użyciu dopuszczonych do stosowania w farmacji kwasów, zasad lub buforów, w celu zwiększenia stabilności związku zawartego w postaci użytkowej albo stabilności jego postaci dawkowania. Użyte w niniejszym opisie określenie podawanie pozajelitowe obejmuje wstrzknięcie podskórne, śródskórne, dożylne, domięśniowe, sródstawowe, wewnątrzmaziówkowe, do pnia mózgu, domostkowe, dokanałowe i wstrzyknięcie do miejsca występowania zmiany chorobowej lub techniki infuzyjne.

Kompozycje farmaceutyczne mogą występować w postaci sterylnych preparatów do wstrzyknięć, na przykład jako sterylna, dająca się wstrzykiwać, wodna lub oleista zawiesina. Tę zawiesinę można wytworzyć stosując znane w tej dziedzinie techniki, z użyciem odpowiednich środków rozpraszających lub zwilżających i środków dyspergujących. Szczegóły dotyczące wytwarzania takich związków są znane specjalistom w tej dziedzinie.

Gdy są podawane doustnie, kompozycje farmaceutyczne według tego wynalazku można podawać w dowolnej, doustnej, dopuszczonej do stosowania postaci dawkowania, wliczając w to kapsułki, tabletki oraz wodne zawiesiny i roztwory lecz nie ograniczając się do nich. W przypadku tabletek do podawania doustnego, do powszechnie stosowanych nośników zalicza się laktozę i skrobię kukurydzianą. Zwykle dodawane są także środki smarujące, takie jak stearynian magnezu. W przypadku podawania doustnego kapsułek, do użytecznych rozcieńczalników zalicza się laktozę i wysuszoną skrobię kukurydzianą. Gdy podaje się doustnie wodne zawiesiny, składnik aktywny jest połączony z emulgatorem i środkiem dyspergującym. W razie potrzeby, można dodać niektóre środki słodzące i/lub substancje smakowe i/lub barwniki.

Informacje o innych, odpowiednich nośnikach dla kompozycji omówionych powyżej znajdują się w standardowych podręcznikach z zakresu farmacji, na przykład w Remington's Pharmaceutical Sciences, wydanie 19-te, Mack Publishing Company, Easton, Penn., 1995. Dodatkowe szczegóły dotyczące opracowania i wytwarzania odpowiednich postaci dawkowania kompozycji farmaceutycznych według wynalazku są znane specjalistom w tej dziedzinie.

Poziomy dawkowania związków według wynalazku, mieszczące się w zakresie od około 0,01 do około 1000 miligramów na kilogram („mg/kg) masy ciała na dzień, korzystnie w zakresie od około 0,5 do około 250 mg/kg masy ciała na dzień, są typowe w monoterapii mającej na celu zapobieganie i leczenie choroby spowodowanej przez wirusa HCV. Zwykle, kompozycje farmaceutyczne według tego wynalazku podaje się od około 1 do około 5 razy na dzień albo odmiennie, jako ciągły wlew. Takie podawanie można stosować jako leczenie przewlekłe lub ostre. Ilość składnika aktywnego którą można łączyć z substancjami użytymi do sporządzenia nośnika w celu wytworzenia jednostkowej postaci dawkowania, będzie zmieniać się w zależności od leczonego osobnika i od określonego sposobu podawania.

W zależności od oceny specjalistów, mogą być niezbędne niższe lub wyższe dawki od podanych powyżej. W przypadku poszczególnych pacjentów, określone dawkowanie i tryb ich leczenia będzie zależał od różnych czynników, wliczając w to aktywność określonego związku który został zastosowany, wieku, masy ciała, ogólnego stanu zdrowia, płci, diety czasu podawania, szybkości wydalania, połączenia leku, ostrości i przebiegu zakażenia, skłonności pacjenta do zakażenia i oceny przez lekarza prowadzącego leczenie. Zwykle, leczenie zapoczątkowuje się stosując małe dawki, znacznie mniejsze od optymalnej dawki peptydu. Następnie, dawkowanie zwiększa się z zastosowaniem małych przyrostów aż osiągnie się warunki pozwalające na uzyskanie optymalnego skutku. Na ogół, najbardziej wskazane jest podawanie związku przy poziomie stężenia, który pozwala uzyskać skuteczne

PL 215 228 B1 wyniki działania przeciwwirusowego, bez powodowania jakichkolwiek szkodliwych lub zgubnych skutków ubocznych.

W terapii można stosować kompozycje farmaceutyczne zawierające połączenie związku według wynalazku oraz jeden albo większą liczbę dodatkowych środków leczniczych lub profilaktycznych. Poziomy dawki zarówno związku jak i środka dodatkowego wynoszą zwykle od około 10% do około 100%, korzystniej od około 10% do około 80% normalnej dawki podawanej w trybie monoterapii.

Gdy z tych związków albo z ich dopuszczonych do stosowania w farmacji soli wytwarza się postać użytkową razem z nośnikiem dopuszczonym do stosowania w farmacji, to otrzymaną kompozycję można podawać in vivo ssakom, takim jak człowiek, w celu hamowania proteazy HCV NS3 albo w celu leczenia zakażenia wirusem HCV lub zapobiegania temu zakażeniu. Takie leczenie można także przeprowadzić z zastosowaniem związków według tego wynalazku w połączeniu ze środkami do których zalicza się: immunomodulatory, takie jak interferony; inne środki przeciwwirusowe, takie jak rybawiryna, amantadyna; inne inhibitory proteazy HCV NS3; inhibitory innych obiektów docelowych w cyklu życiowym wirusa HCV, takich jak helikaza, polimeraza, metaloproteaza lub wewnętrzne miejsce dostępu rybosomu; albo ich połączeń lecz nie ograniczając się do nich. Dodatkowe środki mogą być łączone ze związkami według tego wynalazku w celu utworzenia jednostkowej postaci dawkowania. Odmiennie, te dodatkowe środki mogą być oddzielnie podawane ssakowi jako część wielokrotnej postaci dawkowania.

Związki według wynalazku wykazują zdolność hamowania aktywności proteazy HVC NS3 u pacjentów.

Tak więc, związki według wynalazku nadają się do obniżenia aktywności proteazy HCV NS3 u pacjenta. Jeżeli kompozycja farmaceutyczna zawiera tylko związek według tego wynalazku jako składnik aktywny, takie metody mogą dodatkowo obejmować etap podawania temu pacjentowi środka wybranego spośród takich środków jak immunomodulator, środek przeciwwirusowy, inhibitor proteazy wirusa HCV lub inhibitor innych obiektów w cyklu życiowym wirusa HCV, takich jak helikaza, polimeraza lub metaloproteaza. Taki dodatkowy środek można podawać pacjentowi przed podaniem związków według tego wynalazku, równocześnie z podawaniem tych związków albo po ich podaniu.

Metody te nadają się do hamowania replikacji wirusowej u pacjenta. Takie metody mogą być użyteczne w leczeniu choroby HCV lub w zapobieganiu tej chorobie.

Związki według wynalazku można także użyć jako reagenty laboratoryjne. Związki mogą być pomocne jako narzędzia badawcze do projektowania testów replikacji wirusowej, oceny systemów testów na zwierzętach i badań w zakresie biologii molekularnej, w celu powiększenia wiedzy dotyczącej mechanizmów choroby powodowanej przez HCV.

Związki według tego wynalazku można także użyć do usuwania skażeń wirusowych materiałów lub do zapobiegania tym skażeniom i tym samym do zmniejszenia ryzyka zakażenia wirusem personelu laboratoryjnego lub medycznego albo pacjentów, którzy kontaktowali się z tymi materiałami, na przykład z krwią, tkanką, z instrumentami i strojami chirurgicznymi i z pobieraniem krwi od dawców lub z aparaturą i materiałami do transfuzji.

P r z y k ł a d y

Zamieszczone poniżej charakterystyczne przykłady ilustrują syntezy związków według wynalazku. Dodatkowe odmiany metod prowadzących do wytworzenia takich samych związków w nieco odmienny sposób, będą oczywiste dla specjalisty w tej dziedzinie.

Jeżeli nie określono inaczej, to procenty odnoszące się do roztworu wyrażają wzajemny stosunek masy do objętości, a proporcje odnoszące się do roztworu wyrażają wzajemny stosunek objętości do objętości. Widma magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) rejestrowano przy użyciu spektrometru Brukera, 300 MHz lub 500 MHz; przesunięcia chemiczne (δ) podano w częściach na milion. Chromatografię szybkosprawną wykonywano na żelu krzemionkowym (SiO2), zgodnie z metodą chromatografii szybkosprawnej Stilla (W.C. Still i inni, J. Org. Chem., (1978), 43, strona 2923).

Wszystkie dane dotyczące chromatografii cieczowej rejestrowano przy użyciu chromatografu cieczowego Shimadzu LC-10AS, z użyciem detektora SPD-10AV UV-Vis i dane dotyczące spektrometrii mas (MS) wyznaczano z użyciem urządzenia Micromass Platform for LC z interfejsem elektrosprejowym (ES+).

Jeżeli nie odnotowano inaczej, związek analizowano metodą LC-MS, z zastosowaniem jednej z siedmiu metod, wykonywanych w następujących warunkach. Należy odnotować, że dla pewnych związków, określenie LC-MS jest ograniczone do LC, ponieważ kalibrowanie MS jest ograniczone do związków o masie cząsteczkowej 900 i mniejszej.

PL 215 228 B1

Jeżeli nie odnotowano inaczej, związek analizowano metodą LC-MS, z zastosowaniem jednej z poniższych metod i w podanych warunkach (odnotowanych dla każdego związku, przy czym określenie LC-MS A odpowiada metodzie A i tak dalej):

kolumny: (metoda A) - YMC ODS-A C18 S7 (3,0 x 50 mm), (metoda B) - YMC ODS-A (5,0 x 30 mm), (metoda C) - Xterra C18 S7 (3,0 x 50 mm), (metoda D) - YMC C18 S5 (4,6 x 50 mm), (metoda E) - YMC C18 S5 (4,6 x 33 mm), (metoda F) - Xterra C18 S7 (3,0 x 50 mm), (metoda G) - Xterra MS C18 (3,0 x 50 mm), (metoda H) - Xterra ODS S7 (3,0 x 50 mm);

gradient: od 100% rozpuszczalnika A/0% rozpuszczalnika B do 0% rozpuszczalnika A/100% rozpuszczalnika B;

czas gradientu: 1,5 min (H), 2 min (D), 3 min (A, B, C, G), 4 min (F), 15 min (E); czas retencji substancji niezatrzymywanej: 1 min; objętościowe natężenie przepływu: 4 ml/min (A-C, E-G), 5 ml/min (D, H); długość fali detektora: 220 nm;

rozpuszczalniki (A-D, F-H): rozpuszczalnik A: 10% CH3OH /90% H2O /0,1% TFA, rozpuszczalnik B: 90% CH3OH/10% H2O /0,1% TFA;

rozpuszczalniki (E):

rozpuszczalnik A: 10% CH3OH /90% H2O /0,2% H3PO4, rozpuszczalnik B: 90% CH3OH/10% H2O /0,2% H3PO4

W trakcie wytwarzania poniższych związków odkryto, że podczas ich syntezy występuje częściowa epimeryzacja. W konsekwencji, mogą występować małe ilości diastereoizomerów, najprawdopodobniej epimerycznych przy centrum chiralnym proIiny P2.

Związki i chemiczne produkty pośrednie według obecnego wynalazku, opisane w poniższych przykładach, wytworzono z wykorzystaniem poniższych metod.

W przykładach 1-3 opisano produkty pośrednie użyte do wytwarzania tripeptydów opisanych w przykładzie 4 i szczególnie w związkach 1-68.

P r z y k ł a d 1

Wytwarzanie produktu pośredniego P1, to jest racemicznego estru etylowego kwasu N-Boc-(1R/2S)/(1S/2R)-1-amino-2-winylocyklopropanokarboksylowego

Etap 1a: Wytwarzanie N-benzyloiminy estru etylowego glicyny, której wzór strukturalny przedstawiono poniżej

PL 215 228 B1

Sporządzono zawiesinę chlorowodorku estru etylowego glicyny (303,8 g, 2,16 mola) w eterze tert-butylowo-metylowym (1,6 I). Następnie dodano benzaldehyd (231 g, 2,16 mola) i bezwodny siarczan sodu (154,6 g, 1,09 mola), po czym mieszaninę reakcyjną schłodzono na łaźni wodno-lodowej do temperatury 0°C. Z kolei przez 30 minut wkraplano trietyloaminę (455 ml, 3,26 mola) i następnie mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 48 godzin. Następnie, reakcję zgaszono przez dodanie wody schłodzonej lodem (1 litr), po czym warstwę organiczną oddzielono. Warstwę wodną ekstrahowano eterem tert-butylowo-metylowym (0,5 I) i następnie połączone warstwy organiczne przemyto mieszaniną nasyconego, wodnego roztworu NaHCO3 (1 litr) i solanki (1 litr). Roztwór osuszono nad MgSO4 i zatężono pod próżnią, otrzymując 392 g N-benzyloiminy w postaci gęstego oleju koloru żółtego, który bezpośrednio użyto w następnym etapie.

¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz) δ: 1,32 (t, J = 7,1 Hz, 3Η), 4,24 (q, J = 7,1 Hz, 2H), 4,41 (d, J = 1,1 Hz, 2H), 7,39 - 7,47 (m, 3Η), 7,78 - 7,81 (m, 2Η), 8,31 (s, 1H).

Etap 1b: Wytwarzanie racemicznego estru etylowego kwasu N-Boc-(1R2S)/(1S,2ff)-1-amino-2-winylocyklopropanokarboksylowego

Do zawiesiny tert-butoksylanu litu (100 g, 1,25 mola) w osuszonym toluenie (1,0 I) wkraplano mieszaninę N-benzyloiminy estru etylowego glicyny (119,3 g, 0,625 mola) i trans-1,4-bromo-2-buten (126,3 g, 0,594 mola) w osuszonym toluenie (0,8 I). Po zakończeniu dodawania, mieszaninę reakcyjną koloru ciemnoczerwonego zgaszono przez dodanie wody (1 litr) i eteru tert-butylowometylowego (TBME, 1 litr). Fazę wodną oddzielono i ekstrahowano drugi raz przy użyciu TBME (1 litr). Fazy organiczne połączono i dodano 1N roztwór HCl (1,3 litra), po czym mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.

Fazę organiczną oddzielono i ekstrahowano wodą (1,0 I). Następnie, fazy wodne połączono, nasycono solą (1000 g) i dodano TBME (1 litr), po czym mieszaninę schłodzono do temperatury 0°C. Mieszaninę reakcyjną zalkalizowano w trakcie mieszania do pH = 14 przez wkroplenie 10 N roztworu NaOH, po czym warstwę organiczną oddzielono i następnie fazę wodną ekstrahowano przy użyciu TBME (2 x 500 ml). Połączone ekstrakty organiczne osuszono (MgSO4) i zatężono do objętości 1 litra. Do tego roztworu wolnej aminy dodano diwęglan di-tert-butylu (124,7 g, 0,714 mola) i mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 4 dni. Następnie, do mieszaniny reakcyjnej dodano dodatkową ilość diwęglanu di-tert-butylu (65,5 g, 0,375 mola).

Mieszaninę reakcyjną ogrzewano przez 3 godziny, utrzymując w stanie wrzenia pod chłodnicą zwrotną, po czym pozostawiono na noc do samoczynnego schłodzenia do temperatury pokojowej. Mieszaninę reakcyjną osuszono nad MgSO4 i zatężono pod próżnią, otrzymując 200 g surowej substancji. Tę pozostałość oczyszczono metodą chromatografii szybkosprawnej (2,5 kg SiO2, elucja przy użyciu od 1% do 2% CH₃OH/CH₂Cl₂), otrzymując 72,5 g (48%) racemicznego estru etylowego kwasu N-Boc-(1R,2S)/(1S,2R)-1-amino-2-winylocyklopropanokarboksylowego w postaci oleju koIoru żółtego, który podczas przechowywania w chłodziarce uległ zestaleniu.

¹H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ: 1,26 (t, J = 7,1 Hz, 3H), 1,46 (s, 9H), 1,43 - 1,49 (m, 1H), 1,76 1,82 (szerokie m, 1H), 2,14 (q, J = 8,6 Hz, 1H), 4,18 (q, J = 7,2 Hz, 2H), 5,12 (dd, J = 10,3, 1,7 Hz, 1H), 5,25 (szerokie s, 1H), 5,29 (dd, J = 17,6, 1,7 Hz, 1H), 5,77 (ddd, J = 17,6, 10,3, 8,9 Hz, 1H).

PL 215 228 B1

P r z y k ł a d 2

Wytwarzanie BocNH-P3(t-butyl-Gly)-P2(Hyp)-P1(1R,2S-winyloAcca)-CONHSO2-cyklopropan

Etapy 2a i 2b: Wytwarzanie BocNH-P2(Hyp)-P1(1R2S)/(1S,2ff)-winyloAcca)OC₂H₅, którego wzór

Racemiczny ester etylowy kwasu N-Boc-(1R/2S)/(1S/2R)-1-amino-2-winylocyklopropanokarboksylowego (18,75 g) rozpuszczono w 4N roztworze HCl w dioksanie (87 ml, 345 mmoli).

Roztwór mieszano przez 1,5 godziny i następnie zatężono pod próżnią, otrzymując chlorowodorek estru etylowego kwasu N-Boc-(1R/2S)/(1S/2R)-1-amino-2-winylocyklopropanokarboksylowego (14 g) w postaci mieszaniny piana/olej koloru pomarańczowego, którą użyto w następnym etapie bez dodatkowego oczyszczania. Chlorowodorek estru etylowego kwasu N-Boc-(1R/2S)/(1S/2R)-1-amino-2-winyloPL 215 228 B1 cyklopropanokarboksylowego (14,07 g) rozpuszczono w 1,30 litra osuszonego acetonitrylu, w kolbie pojemności 5 litrów wyposażonej w mieszadło mechaniczne, w atmosferze azotu. Roztwór schłodzono na łaźni wodno-lodowej do temperatury 5°C. Następnie dodano Boc-Hyp-OH (34,0 g, 147 mmoli), po czym mieszaninę reakcyjną pozostawiono na 15 minut do wymieszania. Do mieszaniny reakcyjnej dodano diizopropyloetyloaminę (61,4 ml, 353 mmoli), acetonitryl (100 ml) i w końcu dodano HATU (41,9 g, 110 mmoli). Po 27 godzinach, mieszaninę reakcyjną zatężano pod próżnią aż do uzyskania gęstego oleju koloru pomarańczowego, który bezpośrednio rozcieńczono w 1,2 litra octanu etylu i otrzymaną mieszaninę podzielono na trzy porcje po 400 ml. Każdą porcję o objętości 400 ml przemyto przy użyciu 500 ml wody, 500 ml 1N roztworu wodorowęglanu sodu, 500 ml 1N roztworu kwasu chlorowodorowego, 500 ml 1N roztworu wodorowęglanu sodu i 500 ml solanki. Frakcje organiczne połączono, osuszono nad siarczanem sodu i zatężono pod próżnią. Surowy produkt rozpuszczono w minimalnej ilości chlorku metylenu i grawitacyjnie przefiltrowano przez warstwę krzemionki (1 kg), eluując mieszaniną octan etylu:heksany w stosunku 2:1. Otrzymano 17,9 g związku wymienionego w tytule w postaci piany koloru kremowego.

¹H NMR (d4-CH3OH, 500 MHz, 55°C) δ: 5,74 (m, 1H), 5,28 (dd, 1H, J = 17, 1,6 Hz), 5,10 (d, 1H, J = 10,4 Hz), 4,39 (m, 1H), 4,26 (t, 1H, J = 7,7 Hz), 4,13 (m, 2H), 3,57 (ddd, 1H, 4,55, 4,45, 3,5 Hz), 3,44 (m, 1H), 2,21 (m, 1H), 2,18 (dt, 1H, 9,1, 8,5 Hz), 2,10 (m, 1H), 1,77 (bm, 2H), 1,42 i 1,44 (9H, s, z diastereoizomerów), 1,22 (t, 3H, J = 7,1 Hz).

LC-MS H: czas retencji - 1,09.

MS: m/z = 369 (M+H).

Etap 2c: Wytwarzanie BocNH-P2 (Hyp (O-suberylo))-P1(1R,2S-winyloAcca)-OC₂HR i rozdzielanie wytworzonych diastereoizomerów w sposób opisany poniżej

W 500 ml chlorku metylenu rozpuszczono BocNH-P2(Hyp)-P1(1R,2S)/(1S,2R)-winyloAcca)OC2H5 (54,715 g). Do tego roztworu dodano w kolejności chlorek suberylu (37,39 g, 163 mmoli) i trietyloaminę (41,4 ml, 297 mmoli), po czym mieszaninę reakcyjną mieszano w atmosferze azotu przez 39 godzin. Następnie mieszaninę reakcyjną przemyto wodą (2 x 600 ml) i solanką (2 x 600). Warstwę organiczną przefiltrowano przez warstwę krzemionki uformowaną z zawiesiny z chlorkiem metylenu. Frakcje produktu zatężono, otrzymując pianę koloru żółtego, którą oczyszczono na kolumnie Biotage Flash 150 wypełnionej krzemionką przez wprowadzenie na kolumnę w postaci roztworu w 400 ml eteru dietylowego i elucję mieszaniną heksany:octan etylu w stosunku 3:1. Frakcje zawierające produkt zatężono pod próżnią, otrzymując 21,61 g związku wymienionego w tytule (26%), w postaci diastereoizomeru o wyższej wartości Rf.

1H NMR (d4-CH3OH, 500 MHz, 55°C) δ: 7,33 (m, 2H), 7,15 (m, 6H), 5,73 (m, 1H), 5,45 (m, 1H), 5,28 (m, 1H), 5,08 (m, 1H), 4,21 (m, 2H), 4,07 (m, 3H), 3,48 (m, 4H), 2,94 (bm, 2H), 2,35 (bm, 1H), 2,14 (m, 1Η), 1,99 (m, 1H), 1,71 (m, 1H), 1,38 i 1,40 (s, 9H, konformery), 1,31 (m, 1H), 1,19 i 1,22 (t, 3H, konformery).

LC-MS D: czas retencji - 1,94.

MS: m/z = 561 (M+H).

PL 215 228 B1

Etap 2d: Wytwarzanie BocNH-P2(Hyp(O-suberylo))-P1(1R2S-winyloAcca)-OH, którego wzór strukturalny przedstawiono poniżej

W atmosferze azotu, rozpuszczono BocNH-P2(Hyp-(O-suberylo))-P1(1R,2S-winyloAcca)-OC2H5 (24,02 g) w 50 ml metanolu i 100 ml tetrahydrofuranu. Następnie, do mieszaniny dodano powoli 1N roztwór NaOH (51 mL, 51,0 mmoli). Roztwór mieszano przez 21 godzin, po czym dodano w porcjach 51 ml 1N roztworu kwasu chlorowodorowego. Mieszaninę reakcyjną zatężono pod próżnią i pozostawiono na noc pod działaniem próżni z pompy próżniowej. Po 16 godzinach, surowy produkt rozpuszczono w 100 ml octanu etylu i przefiltrowano przez dwulitrowy lejek z przegrodą ze szkła spiekanego z warstwą żelu krzemionkowego grubości 42 mm. Produkt eluowano octanem etylu, otrzymując 22,4 g (98%) związku wymienionego w tytule w postaci substancji stałej koloru białego.

¹H NMR (DMSO-d₆, 500Mz) δ: 12,55 (bs, 1H), 7,36 (m, 2H), 7,18 (m, 6H), 5,74 (m, 1H), 5,59 (bm, 1H), 5,22 (d, 1H, 16,8 Hz), 5,05 (d, 1H, J = 11 Hz), 4,07 (m, 2H), 3,36 - 3,43 (m, 4H), 3,00 (bm, 2H), 2,30 (m, 1H), 1,89 (m, 1H), 1,55 (m, 1H), 1,31 i 1,34 (s, 9H rotamery), 1,20 (m, 1H).

LC-MS E: czas retencji - 3,09.

MS: m/z = 533 (M+H).

Etap 2e: Wytwarzanie BocNH-P2(Hyp(O-suberylo))-P1(1R2S-winyloAcca)-CONHSO₂-cyklopropanu

Wytwarzanie cyklopropylosulfonamidowego fragmentu związku z przeznaczeniem do użycia w etapie 2e:

Przez roztwór zawierający 20 ml THF, schłodzono do temperatury 0°C, przepuszczano za pomocą bełkotki gazowy amoniak aż do osiągnięcia stanu nasycenia. Do tego roztworu dodano 2 g (5,69 mmoli) chlorku cyklopropylosulfonylu (dostarczonego przez firmę Array Biopharma). Roztwór ogrzewano przez 2 godziny do temperatury pokojowej, po czym surowy roztwór przefiltrowano przez warstwę żelu krzemionkowego, eluując produkt octanem etylu. Frakcje zatężono pod próżnią, otrzymując 1,70 g (99%) cyklopropylosulfonamidu w postaci substancji stałej koloru białego.

¹H NMR (d4-CHaOH, 500MHz) δ: 0,94 - 1,07 (m, 4H), 2,52 - 2,60 (m, 1H).

PL 215 228 B1

Wytwarzanie BocNH-P2(Hyp(O-sube/y7o))P1 (1 R2S-winyloAcca)-CONHSO?-cyklopropanu, którego wzór strukturalny przedstawiono poniżej:

W kolbie okrągłodennej pojemności 250 ml, w której utrzymywano atmosferę azotu, rozpuszczono BocNH-P2(Hyp-(O-suberylo))-P1(1R,2S-winyloAcca)-OH (9,7 g) w 50 ml tetrahydrofuranu. Następnie do roztworu dodano karbonylodiimidazol (3,54 g, 21,9 mmola). Mieszaninę reakcyjną ogrzewano przez 1 godzinę do temperatury 80°C i następnie odstawiono ogrzewanie i jednocześnie kontynuowano mieszanie przez dodatkową godzinę i 45 minut. Do roztworu dodano cyklopropylosulfonamid (4,33 g, 45,5 mmoli), po czym dodano DBU (5,45 ml, 36,4 mmoli) i mieszano przez 16 godzin. Mieszaninę reakcyjną zatężono w warunkach wysokiej próżni, po czym pozostałość rozcieńczon o octanem etylu (600 ml). Warstwę organiczną przemyto 1N roztworem HCl 2 x 300 ml. Warstwy HCl ekstrahowano zwrotnie przy użyciu 100 ml octanu etylu i ekstrakt organiczny połączono z pozostałą warstwą organiczną. Następnie, połączone warstwy organiczne przemyto 2 x 300 ml wody i 2 x 300 ml solanki. Roztwór osuszono nad siarczanem sodu i zatężono pod próżnią. Otrzymany olej rozpuszczono w chlorku metylenu i przefiltrowano grawitacyjnie przez warstwę krzemionki (67 mm x 33 mm), eluując mieszaniną octan etylu:heksany w stosunku 1:1. Otrzymano 8,66 g (75%) krystalicznej substancji stałej koloru kremowego.

¹H NMR (d4-CH3OH, 500MHz) δ: 7,34 (m, 2H), 7,18 (m, 6H), 5,75 (m, 1H), 5,47 (bm, 1H), 5,30 (d, 1H, J = 17 Hz), 5,12 (d, 1H, J = 10,4 Hz), 4,21 (m, 2H), 3,49 (m, 3H), 3,39 (dd, 11,6, 3,7Hz), 2,93 (m, 2H), 2,18-2,23 (m, 2H), 1,82 - 1,91 (m, 2H), 1,42 (s, 9H), 1,36 - 1,42 (m, 4H), 1,02 - 1,15 (m, 2H).

LC-MS A: czas retencji - 2,83.

MS: m/z = 658 (M+Na).

Etap 2f i etap 2g: Wytwarzanie BocNH-P3(t-butyloGly)-P2(Hyp)-P1(1R2S-winyloAcca)-CONHSO2cyklopropanu

BocNH-P2(Hyp(O-sube/y7o))-P1(1R,2S-winyloAcca)-CONHSO2-cyklopropan (8,66 g, 13,6 mmoli) poddano reakcji z 4N roztworem HCl w dioksanie (34 ml) i mieszano przez 1,5 godziny. Następnie, mieszaninę reakcyjną rozcieńczono eterem dimetylowym (100 ml) i wytrącony osad wydzielono na lejku Buchnera, otrzymując 4,94 g piany koloru jasnożółtego, którą użyto w następnym etapie bez dodatkowego oczyszczania. Chlorowodorek P2(Hyp)-P1(1R,2S-winyloAcca)-CONHSO2-cyklopropa-nu (4,94 g, 13,0 mmoli) rozpuszczono następnie w dimetyloformamidzie (40 ml), utrzymując w atmosferze azotu. Roztwór schłodzono na łaźni wodno-lodowej do temperatury 2°C, po czym dodano N-Boc-L-te/t-leucynę (3,10 g, 13,7 mmoli), świeżo destylowaną dietyloizopropyloaminę (9,0 ml, 52,0 mmole i HATU (5,44 g, 14,3 mmoli). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 18,5 godziny i po tym czasie zatężono pod próżnią do objętości około 15 ml i rozcieńczono octanem etylu (350 ml). Następnie, warstwę organiczną przemyto wodą

PL 215 228 B1 (200 ml), 1N roztworem kwasu chlorowodorowego (2 x 350 ml) i solanką (2 x 350 ml), po czym osuszono nad siarczanem sodu. Roztwór zatężono do objętości około 20 ml i następnie przefiltrowano grawitacyjnie przez warstwę krzemionki, eluując mieszaniną octan etylu:heksany u stosunku 1:1. Otrzymano 4,78 g (66%) związku wymienionego w tytule, w postaci substancji stałej koloru białego.

¹H NMR (d4-CH3OH, 500MHz) δ: 6,65 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 5,77 (m, 1H), 5,31 (d, J = 17,1 Hz, 1H), 5,13 (d, J = 10,4 Hz, 1H), 4,49 (s, 1H), 4,37 (m, 1H), 4,30 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 3,81 (m, 2H), 2,93 (m, 1H), 2,23 (q, J = 8,9 Hz, 1H), 2,12 (dd, J = 13,1 Hz, 7,0 Hz, 1H), 1,97 (m, 1H), 1,87 (dd, J = 8,2 Hz, 5,5 Hz, 1H), 1,44 (s, 9H), 1,40 (m, 1H), 1,23 (t, J = 7,0 Hz, 2H), 1,07 (m, 2H), 1,01 (s, 9H).

LC-MS A: czas retencji - 2,20.

MS: m/z = 557 (M+H).

P r z y k ł a d 3

Wytwarzanie izocyjanianów i chlorków karbamoilu z przeznaczeniem do użycia w przykładzie 4

Izocyjaniany i chlorki karbamoilu stosowane w przykładzie 4 są dostępne w handlu, za wyjątkiem wymienionych w tabeli 1, które zsyntetyzowano z wykorzystaniem niżej omówionych metod.

Procedury stosowane do wytwarzania izocyjanianów i chlorków karbamoilu (patrz tabela 1):

Metoda A: Roztwór indoliny (2 ml, 17,8 mmoli) rozpuszczonej THF (25 ml) dodano do wstępnie schłodzonego do temperatury -78°C roztworu fosgenu (20%) w toluenie (38 ml) i trietyloaminy (2,5 ml) w toluenie (30 ml). Po mieszaniu przez 3 godziny w temperaturze -78°C roztwór ogrzano w strumieniu azotu i zatężono pod próżnią. Produkt rekrystalizowano z mieszaniny octan etylu/heksany.

Metoda B: Sporządzono zawiesinę lub roztwór aminy (1,0 g) w toluenie (0,5 M). Następnie dodano roztwór fosgenu (20%) w toluenie (4,0 równoważniki), po czym mieszaninę ogrzewano przez dwie godziny. Mieszaninę reakcyjną schłodzono i produkt odfiltrowano lub wytrącono z heksanów albo z octanu etylu i następnie przefiltrowano i wysuszono pod próżnią.

Metoda C: Sporządzono zawiesinę estru metylowego kwasu 3-amino-5,6-dichloro-2-pirazynokarboksylowego (3 g, 13,5 mmoli) w toluenie (7 ml) i ogrzano do temperatury 110°C. Następnie za pomocą strzykawki roztwór chlorku oksalilu (4,7 ml) w toluenie (14 ml). Po 2-4 godzinach mieszaninę reakcyjną schłodzono do temperatury pokojowej i zatężono pod próżnią aż do otrzymania oleju koloru ciemnobrązowego. Produkt destylowano (122°C, 0,1 mm), otrzymując substancję stałą koloru żółtego.

Tabela 1

Izocyjanian/chlorek karbamoilu	Metoda		Czas	Metoda wytracania osadu	Wydajność
CO	A	patrz szczegóły metody	rekrystali zerwany	5%
OQ^hc° co₂c₂h_s	B	80°C	4h	octan etylu	46%
^ CO₂x-C,H₇ co	E3	80°C	2h	heksany	89%
OCN z 1	B	100°C	2h	filtrowany	<10%
C i COg C H 2	C	patrz szczegóły metody	nie stosowano	46%

PL 215 228 B1

P r z y k ł a d 4

Ogólna procedura wytwarzania P2-karbaminianów tripeptydu (związki od 1 do 68), jak to przedstawiono poniżej

Reprezentatywna procedura wytwarzania P2-karbaminianów tripeptydu (BocNH-P3(t-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-NR'R'j)-P1(1R,2S-winvloAcca)-CONHSO₂-cvklopropan), związki od 1 do 68, z użyciem izocyjanianów lub chlorków karbamoilu:

(BocNH-P3(t-butyIoGly)-P2(Hyp)-P1(1R,2S-winyloAcca)-CONHSO₂-cyklopropan) (80 mg, 0,144 mmola) rozpuszczono w 500 μl tetrahydrofuranu, po czym roztwór schłodzono na łaźni wodno-lodowej do temperatury 2°C. Do tej schłodzonej mieszaniny dodano 60% wodorek sodu w oleju mineralnym (18 mg, 0,431 mmola) i następnie dodano izocyjanian lub chlorek karbamoilu (1,1 rownoważnik). Po mieszaniu przez 2 godziny, łaźnię chłodzącą usunięto i następnie mieszaninę reakcyjną pozostawiono na 2 godziny do wymieszania przed zgaszeniem nasyconym roztworem chlorku amonu. Następnie, mieszaninę reakcyjną rozcieńczono przy użyciu 30 ml octanu etylu, po czym przemyto 30 ml 1N roztworu HCl i 30 ml solanki. Warstwę organiczną osuszono nad siarczanem sodu i zatężono pod próżnią. Otrzymany produkt w postaci mieszaniny oleju i substancji stałej rozcieńczono 3 ml chlorku metylenu i przefiltrowano przez warstwę żelu krzemionkowego o wymiarach 50 mm x 36 mm i eluowano mieszaniną heksany:octan etylu w stosunku 1:1. W wyniku dodatkowej elucji octanem etylu otrzymano P2-karbaminianu tripeptydu:

BocNH-P3(t-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(N-metylo-N-fenylo)))-P1(1ff,2S-winyloAcca)-CONHSO₂-cyklopropan ¹H NMR (d4-CHsOH, 500 MHz) δ: 7,34 (m, 2H), 7,21 (t, J = 7,3 Hz, 3H), 6,63 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 5,78 (m, 1H), 5,31 (s, 1H), 5,23 (d, J = 17,1 Hz, 1H), 5,06 (d, J = 9,8 Hz, 1H), 4,25 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 4,21 (m, 2H), 3,90 (m, 1H), 3,26 (s, 3H), 2,85 (m, 1H), 2,12 (m, 3H), 1,82 (m, 1H), 1,43 (m, 1H), 1,40 (s, 9H), 1,15 (m, 2H), 1,02 (s, 9H), 0,96 (m, 2H).

LC-MS A: czas retencji - 2,40.

MS: m/z = 691 (M+H).

PL 215 228 B1

Reagent stosowany do wytwarzania związku 2

Związek 2

BocNH-P3((-butyIoGly)-P2(Hyp (O-CO-(NH-(2-metylobenzylo))))-P1 (1 R2S-winyloAcca)-CONHSO₂cyklopropan (94%): ¹H NMR (d₄-CH₃OH, 500 MHz) δ: 7,21 (s, 1H), 7,13 (s, 3H), 6,63 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 5,77 (m, 1H), 5,32 (s, 1H), 5,30 (d, J = 18,3 Hz, 1H), 5,11 (d, J = 10,4Hz, 1H), 4,35 (m, 1H), 4,25 (m, 3H), 4,07 (m, 1H), 3,93 (m, 1H), 2,91 (m, 1H), 2,34 (m, 1H), 2,30 (s, 3H), 2,23 (m, 1H), 2,13 (m, 1H), 1,85 (m, 1H), 1,43 (s, 9H), 1,35 (s, 1H), 1,23 (m, 2H), 1,06 (m, 2H), 1,01 (s, 9H).

LC-MS A: czas retencji - 2,65.

MS: m/z = 704 (M+H).

BocNH-P3(^butyloGly)-Ρ2(Hyp(O-CO-(NH-2-trans-fenylocyklopropylo)))-P1(1R2S-WinyloAcca)CONHSO₂-cyklopropan (93%): ¹H NMR (d₄-CH₃OH, 500 MHz) δ: 7,23 (m, 2H), 7,12 (m, 3H), 5,77 (m, 1H), 5,30 (d, J =

15.9 Hz, 2H), 5,12 (d, J = 10,1 Hz, 1H), 4,35 (m, 1H), 4,26 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 4,10 (m, 2H), 3,93 (m, 1H), 2,92 (s, 1H), 2,68 (m, 1H), 2,33 (m, 1H), 2,21 (m, 1H), 2,13 (m, 1H), 2,03 (m, 1H), 1,86 (dd, J =

7.9 Hz, 5,5 Hz, 1H), 1,45, 1,42 (s, 10H, od dwóch izomerów), 1,23 (m, 2H), 1,05 (m, 2Η), 1,01 (s, 9Η), 0,88 (m, 2Η).

LC-MS A: czas retencji - 2,69.

MS: m/z = 716 (M+H).

PL 215 228 B1

BocNH-P3(t-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(4-morfolino)))-P1(1ff,2S-winyloAcca)-CONHSO₂-cyklopropan (58%): LC-MS A: czas retencji - 2,31.

BocNH-P3(t-butyIoGly)-P2(Hyp(O-CO-(M,M-diaHilo)))-P1(1R2S-winyloAcca)-CONHSO₂-cyklopropan (98%) ¹H NMR (d₄-CH₃OH, 500 MHz) δ: 6,63 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 5,76 (m, 3H), 5,30 (m, 2H),

5,11 (m, 5H), 4,33 (dd, J = 10,7 Hz, 7,0 Hz, 1H), 4,24 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 4,12 (d, J = 11,9 Hz, 1H), 3,87 (m, 3H), 3,79 (m, 2H), 2,92 (m, 1H), 2,33 (dd, J = 14,0 Hz, 7,0 Hz, 1H), 2,22 (q, J = 8,8 Hz, 1H), 2,13 (m, 1H), 1,86 (dd, J = 8,2 Hz, 5,5 Hz, 1H), 1,42 (s, 10H), 1,23 (m, 2H), 1,06 (m, 2H), 1,01 (s, 9H).

LC-MS A: czas retencji - 2,62.

PL 215 228 B1

BocNH-P3(FbutyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-cykloheksylo)))-P1(1ff,2S-winyloAcca)-CONHSO_r cyklopropan (31%): ¹H NMR (d4-CH3OH, 500 MHz) δ: 7,00 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 6,64 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 5,76 (m, 1H), 5,31 (d, J = 18,6 Hz, 1H), 5,27 (s, 1H), 5,12 (d, J = 11,9 Hz, 1H), 4,33 (m, 1H), 4,25 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 4,03 (m, 1H), 3,92 (m, 1H), 3,34 (s, 1H), 2,93 (m, 1H), 2,30 (m, 1H), 2,23 (q, J = 8,6 Hz, 1H), 2,11 (m, 1H), 1,86 (m, 3H), 1,72 (m, 2H), 1,44 (s, 10H), 1,31 (m, 2H), 1,24 (m, 2H), 1,17 (m, 4H), 1,06 (m, 2H), 1,01 (s, 9H).

LC-MS A: czas retencji - 2,67.

MS: m/z = 682 (M+H).

Związek 7

do wytwarzania związku 7

Związek 7

BocNH-P3ff-butvloGlv)-P2(Hvp(O-CO-(NH-fenetvlo)))-P1(1ft,2S-winvloAcca)-CONHSO₂cyklopropan (19%): ¹H NMR (d₄-CH₃OH, 500 MHz) δ: 7,27 (t, J = 7,6 Hz, 2H), 7,19 (d, J =7,6 Hz, 3H), 5,77 (m, 1H), 5,30 (d, J = 17,4 Hz, 1H), 5,26 (s, 1H), 5,13 (d, J = 10,4 Hz, 1H), 4,32 (m, 1H), 4,26 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 4,04 (m, 1H), 3,92 (m, 1H), 3,30 (m, 2H), 2,93 (m, 1H), 2,76 (m, 2H), 2,26 (m, 2H), 2,10 (m, 1H), 1,87 (dd, J = 8,2 Hz, 5,5 Hz, 1H), 1,43 (s, 9 H), 1,33 (s, 1H), 1,24 (m, 2H), 1,07 (m, 2H), 1,01 (s, 9H).

LC-MS A: czas retencji - 2,65.

MS: m/z = 704 (M+H).

PL 215 228 B1

BocNH-P3(t-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-bifen-2-ylo)))-P1(1ff,2S-winyloAcca)-CONHSO₂cyklopropan (83%): ¹H NMR (d4-CH3OH, 500 MHz) δ: 7,67 (m, 1H), 7,44 (m, 2H), 7,35 (m, 4H), 7,25 (m, 2H), 6,62 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 5,77 (m, 1H), 5,31 (d, J = 17,4 Hz, 1H), 5,26 (s, 1H), 5,12 (d, J = 10,4 Hz, 1H), 4,25 (m, 2H), 4,05 (t, J = 6,7 Hz, 1H), 3,91 (m, 1H), 2,92 (m, 1H), 2,21 (m, 2H), 2,09 (m, 1H), 1,86 (dd, J = 7,9 Hz, 5,5 Hz, 1H), 1,42 (m, 1H), 1,39 (s, 9H), 1,23 (t, J = 7,0 Hz, 2H), 1,06 (m, 2H), 1,00 (s, 9H).

LC-MS A: czas retencji - 3,00.

MS: m/z = 752 (M+H).

Reagent stosowany do wytwarzania związku 9

Związek 9

BocNH-P3(f-butyloGlv)-P2(Hvp(O-CO-(NH-5-chloro-2-metoksvfenvlo))))-P1(1R2S-winvloAcca)

-CONHSO?-cyklopropan (60%): ¹H NMR (d₄-CH₃OH, 500 MHz) δ: 7,98 (s, 1H), 6,99 (d, J = 8,5 HZ, 1H), 6,92 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 6,63 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 5,77 (m, 1H), 5,40 (s, 1H), 5,30 (d, J = 17,1 HZ, 1H), 5,12 (d, J = 11,6 Hz, 1H), 4,40 (dd, J = 9,8 Hz, 7,3 Hz, 1H), 4,24 (t, J = 9,2 Hz, 2H), 3,96 (d, J = 11,9 Hz, 1H), 3,84 (s, 3H), 2,93 (m, 1H), 2,42 (dd, J = 13,7 Hz, 6,7 Hz, 1H), 2,23 (m, 2H), 1,87 (dd, J = 7,9 Hz, 5,5 Hz, 1H), 1,43 (m, 1H), 1,36 (s, 9H), 1,23 (t, J = 7,0 Hz, 2H), 1,06 (m, 2H), 1,01 (s, 9H).

LC-MS A: czas retencji - 2,76.

MS: m/z = 740 (M+H).

PL 215 228 B1

BocNH-P3(t-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-benzo[1,31dioksol-5-ilo)))-P1 (1 ft,2S-winvloAcca)CONHSO?-cyklopropan (70%): ¹H NMR (d4-CH3OH, 500 MHz) δ: 7,08 (s, 1H), 6,76 (m, 1H), 6,70 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 6,63 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 5,89 (s, 2H), 5,77 (m, 1H), 5,37 (s, 1H), 5,29 (d, J = 17,1 Hz, 1H), 5,11 (d, J = 10,4 Hz, 1H), 4,39 (t, J = 8,0 Hz, 1H), 4,27 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 4,16 (d, J = 12,2 Hz, 1H), 3,95 (dd, J = 11,3 Hz, 3,4 Hz, 1H), 2,93 (m, 1H), 2,40 (dd, J = 14,0 Hz, 7,0 Hz, 1H), 2,21 (m, 2H), 1,86 (dd, J = 7,9 Hz, 5,5 Hz, 1H), 1,43 (m, 1H), 1,39 (s, 9H), 1,23 (t, J = 7,0 Hz, 2H), 1,05 (m, 2H), 1,02 (s, 9H).

LC-MS A: czas retencji - 2,56.

MS: m/z = 720 (M+H).

Reagent stosowany do wytwarzania związku 11

Związek 11

BocNH-P3(t-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(4-metoksybenzylo))))-P1(1ff,2S-winyIoAcca)CONHSO?-cyklopropan (89%): ¹H NMR (d4-CH3OH, 500 MHz) δ: 7,18 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 6,85 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 5,76 (m, 1H), 5,31 (s, 1H), 5,29 (d, J = 17,1 Hz, 1H), 5,12 (d, J = 10,4 Hz, 1H), 4,34 (m, 1H), 4,25 (t, J = 9,5 Hz, 1H), 4,19 (m, 2H), 4,05 (m, 1H), 3,92 (m, 1H), 3,75 (s, 3H), 2,92 (m, 1H), 2,32 (dd, J = 13,7 Hz, 6,7 Hz, 1H), 2,22 (q, J = 8,5 Hz, 1H), 2,13 (m, 1H), 1,86 (dd, J = 7,9 Hz, 5,5 Hz, 1H), 1,43 (s, 9H), 1,36 (m, 1H), 1,22 (m, 2H), 1,05 (m, 2H), 1,01 (s, 9H).

LC-MS A: czas retencji - 2,55.

MS: m/z = 720 (M+H).

BocNH-P3(t-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-2-[(2S,3S)-3-metylowalerianian-metylu1)))P1 (1 ff,2S-winyloAcca)-CONHSO?-cyklopropan (68%): ¹H NMR (d4-CH3OH, 500 MHz) δ: 6,63 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 5,77 (m, 1H), 5,30 (m, 2H),

5,12 (d, J = 10,4 Hz, 1H), 4,35 (m, 1H), 4,27 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 4,12 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 4,02 (m, 1H),

PL 215 228 B1

3,96 (m, 1H), 3,70 (s, 3H), 2,92 (m, 1H), 2,33 (dd, J = 13,7 Hz, 7,0 Hz, 1H), 2,24 (m, 1H), 2,13 (m, 1H), 1,86 (dd, J = 8,2 Hz, 5,5 Hz, 1H), 1,80 (m, 1H), 1,45 (s, 11H), 1,24 (m, 3H), 1,06 (m, 2Η), 1,01 (s, 9H), 0,90 (m, 6H).

LC-MS A: czas retencji - 2,63.

MS: m/z = 728 (M+H).

BocNH-P3(f-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(M.M-(pirolidyno))))-P1(1ff,2S-winyloAcca)-CONHSO₂cyklopropan (57%): ¹H NMR (d4-CH3OH, 500 MHz) δ: 6,60 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 5,76 (m, 1H), 5,30 (m, 2H),

5,12 (d, J = 10,4 Hz, 1H), 4,37 (dd, J = 10,1 Hz, 7,3 Hz, 1H), 4,22 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 4,16 (d, J = 11,6 Hz, 1H), 3,90 (dd, J = 11,9 Hz, 3,4 Hz, 1H), 3,34 (s, 4H), 2,93 (m, 1H), 2,34 (dd, J = 14,0 Hz, 7,0 Hz, 1H), 2,22 (q, J = 8,9 Hz, 1H), 2,13 (m, 1H), 1,86 (m, 5H), 1,43 (s, 10H), 1,23 (t, J = 7,0 Hz, 2H), 1,05 (m, 2H), 1,02 (s, 9H).

LC-MS A: czas retencji - 2,40.

BocNH-P3(f-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(M.M-(piperydyno))))-P1(1R2S-winyloAcca)-CONHSO₂cyklopropan (77%): ¹H NMR (d₄-CH₃OH, 500 MHz) δ: 6,61 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 5,76 (m, 1H), 5,30 (d, J = 17,1 Hz, 1H), 5,28 (s, 1H), 5,12 (d, J = 10,1 Hz, 1H), 4,35 (dd, J = 10,3 Hz, 7,3 Hz, 1H), 4,22 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 4,14 (d, J = 11,6 Hz, 1H), 3,91 (dd, J = 11,6 Hz, 3,4 Hz, 1H), 3,40 (s, 4H), 2,93 (m, 1H), 2,34 (dd, J = 14,0 Hz, 7,0 Hz, 1H), 2,21 (q, J = 8,8 Hz, 1H), 2,13 (m, 1H), 1,86 (dd, J = 8,2 Hz, 5,5 Hz, 1H), 1,60 (m, 2H), 1,51 (m, 4 Η), 1,43 (s, 10 H), 1,23 (t, J = 7,0 Hz, 2H), 1,06 (m, 2H), 1,01 (s, 9H).

LC-MS A: czas retencji - 2,55.

MS: m/z = 668 (M+H).

PL 215 228 B1

BocNH-P3(hbutyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(2-metylo-5-nitrofenylo))))-P1(1ff,2S-winyloAcca)CONHSO?-cyklopropan (75%): ¹H NMR (d₄-CH₃OH, 500 MHz) δ: 8,53 (s, 1H), 7,89 (d, J = 10,1 Hz, 1H), 7,40 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 6,63 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 5,77 (m, 1H), 5,44 (s, 1H), 5,29 (d, J = 17,4 Hz, 1H), 5,11 (d, J = 10,7 Hz, 1H), 4,44 (m, 1H), 4,29 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 4,25 (d, J = 11,3 Hz, 1H), 4,00 (dd, J = 11,6 Hz, 3,4 Hz, 1H), 2,92 (m, 1H), 2,47 (m, 1H), 2,34 (s, 3 Η), 2,22 (m, 2H), 1,87 (dd, J = 7,9 Hz, 5,5 Hz, 1H), 1,43 (m, 1H), 1,38 (s, 9H), 1,23 (t, J = 7,0 Hz, 2H), 1,07 (m, 2H), 1,03 (s, 9H).

LC-MS A: czas retencji - 2,61.

MS: m/z = 735 (M+H).

BocNH-P3(?-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(2,3,4-trifluorofenylo))))-P1(1R2S-winyloAcca)CONHSO?-cyklopropan (49%): ¹H NMR (d4-CH₃OH, 500 MHz) δ: 7,63 (s, 1H), 7,07 (q, J = 9,8 Hz, 1H), 6,65 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 5,76 (m, 1H), 5,42 (s, 1H), 5,30 (d, J = 17,1 Hz, 1H), 5,12 (d, J = 11,6 Hz, 1H), 4,40 (s, 1H),

4,26 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 4,21 (d, J = 11,9 Hz, 1H), 3,96 (dd, J = 11,9 Hz, 3,9 Hz, 1H), 2,93 (m, 1H), 2,42 (dd, J = 14,0 Hz, 6,7 Hz, 1H), 2,22 (m, 2H), 1,87 (dd, J = 8,2 Hz, 5,5 Hz, 1H), 1,43 (m, 1H), 1,39 (s, 9H), 1,23 (m, 2H), 1,06 (m, 2H), 1,02 (s, 9H).

LC-MS A: czas retencji - 2,69.

MS: m/z = 730 (M+H).

PL 215 228 B1

BocNH-P3(f-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(2-ferf-butylofenylo))))-P1(1ff,2S-winyloAcca)CONHSO?-cyklopropan (52%): ¹H NMR (d^CHsOH, 500 MHz) δ: 7,42 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,20 (m, 3H), 6,65 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 5,77 (m, 1H), 5,37 (s, 1H), 5,30 (d, J = 17,1Hz, 1H), 5,12 (d, J = 10,4 Hz, 1H), 4,44 (s, 1H), 4,30 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 4,16 (m, 1H), 3,97 (m, 1H), 2,92 (m, 1H), 2,39 (m, 1H), 2,22 (m, 2H), 1,86 (m, 1H), 1,50 (m, 1Η), 1,45 (s, 9H), 1,37 (s, 9H), 1,23 (m, 2H), 1,06 (m, 2H), 1,02 (s, 9H).

LC-MS A: czas retencji - 2,75.

MS: m/z = 732 (M+H).

Reagent stosowany do wytwarzania związku 18

Związek 18

BocNH-P3(f-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(2,6-dichloropirydyn-4-ylo))))-P1(1ff,2S-winyloAcca)CONHSO?-cyklopropan (20%): ¹H NMR (d₄-CH₃OH, 500 MHz) δ: 7,47 (s, 2H), 5,83 (m, 1H), 5,40 (s, 1H), 5,25 (d, J = 17,1 Hz, 1H), 5,08 (d, J = 9,8 Hz, 1H), 4,43 (m, 1H), 4,30 (d, J = 11,6 Hz, 1H), 4,21 (m, 1H), 3,96 (dd, J = 12,2 Hz, 3,1 Hz, 1H), 2,81 (m, 1H), 2,44 (m, 1H), 2,39 (m, 1H), 2,17 (m, 2H), 1,85 (m, 1H), 1,37 (m, 1H), 1,33 (s, 9H), 1,16 (m, 2H), 1,01 (s, 9H), 0,98 (m, 2H).

LC-MS A: czas retencji - 2,73.

MS: m/z = 768 (M+H).

PL 215 228 B1

Reagent stosowany do wytwarzania związku 19

Związek 19

BocNH-P3((-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(2-benzoesanetylu))))-P1(1ff,2S-winyloAcca)CONHSO2-cyklopropan (50%): ¹HNMR(d₄-CH₃OH, 500 MHz) δ: 8,36 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 8,01 (d, J =7,0 Hz, 1H), 7,54 (t, J = 1r3 Hz, 1H), 7,07 (t, J =7,3Hz, 1H), 5,85 (m, 1H), 5,39 (s, 1H),5,24 (d, J = 17,1 Hz, 1H), 5,06 (d, J = 10,1Hz, 1H), 4,47 (t, J = 8,5 Hz, 1H), 4,34 (m, 4H), 4,23 (s, 1H), 3,98 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 2,83 (m, 1H), 2,47 (m, 1H), 2,29 (m, 1H), 2,16 (m, 1H), 1,85 (dd, J = 7,9 Hz, 5,5 Hz, 14), 1,38 (t, J = 7,0 Hz, 3H), 1,32 (m, 1H), 1,28 (s, 9H), 1,15 (s, 2H), 1,03 (s, 9H), 0,99 (m, 2H).

LC-MS A: czas retencji - 3,48.

MS: m/z = 747 (M+H).

BocNH-P3((-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(5-chloro-2-metylofenylo))))-P1(1ff,2S-winyloAcca)CONHSO2-cyklopropan (40%): ¹H NMR (d4-CH3OH, 500 MHz) δ: 7,60 (s, 1H), 7,14 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 7,03 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 5,87 (m, 1H), 5,37 (s, 1H), 5,24 (d, J = 17,1 Hz, 1H), 5,05 (d, J = 9,8 Hz, 1H), 4,45 (m, 1H),

4,26 (s, 1H), 4,22 (d, J = 11,9 Hz, 1H), 3,98 (m, 1H), 2,81 (m, 1H), 2,44 (m, 1H), 2,30 (m, 1H), 2,20 (s, 3H), 2,16 (m, 1H), 1,84 (dd, J = 7,6 Hz, 5,2 Hz, 1H), 1,39 (s, 10H), 1,13 (s, 2H), 1,03 (s, 9H), 0,96 (s, 2H).

LC-MS A: czas retencji - 2,76.

MS: m/z = 724 (M+H).

PL 215 228 B1

BocNH-P3(t-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(2-fluoro-5-metylofenylo))))-P1(1ff,2S-winyloAcca)CONHSO₂-cyklopropan (53%): ¹H NMR (d₄-CH₃OH, 500 MHz) δ: 7,69 (s, 1H), 6,96 (t, J = 8,2 Hz, 1H), 6,86 (s, 1H), 5,85 (m, 1H), 5,38 (s, 1H), 5,23 (d, J = 17,4 Hz, 1H), 5,06 (d, J = 10,1 Hz, 1H), 4,45 (m, 1H), 4,25 (s, 1H), 4,22 (d, J = 11,9 Hz, 1H), 3,98 (m, 1H), 2,81 (m, 1H), 2,44 (m, 1H), 2,28 (s, 4H), 2,14 (m, 1H), 1,85 (m, 1H), 1,37 (s, 10H), 1,14 (s, 2H), 1,03 (s, 9H), 0,96 (s, 2H).

LC-MS A: czas retencji - 2,69. MS: m/z = 708 (M+H).

BocNH-P3(FbutyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(2-etylo-6-izopropylofenylo))))-P1(1R2S-winyloAcca)CONHSO₂-cyklopropan

BMS-557166 (78%): ¹H NMR (d6-DMSO, 500 MHz) δ: 10,40 (s, 1H), 7,22 (t, J = 7,6 Hz, 1H), 7,15 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,08 (d, J = 7,3 Hz, 1H), 6,38 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 5,63 (m, 1H), 5,34 (s, 1H),

5,27 (d, J = 17,1 Hz, 1H), 5,12 (d, J = 10,7 Hz, 1H), 4,34 (m, 1H), 4,14 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 3,96 (m, 1H), 3,85 (d, J = 11,9 Hz, 1H), 3,09 (m, 1H), 2,93 (m, 1H), 2,50 (m, 2H), 2,22 (m, 2H), 2,13 (m, 1H), 1,72 (m, 1H), 1,41 (s, 10H), 1,21 (m, 9H), 1,03 (m, 2H), 0,96 (s, 9H), 0,90 (s, 2H).

LC-MS A: czas retencji - 2,81.

MS: m/z = 746 (M+H).

PL 215 228 B1

BocNH-P3ff-butvloGlv)-P2(Hvp(O-CO-(NH-(3,5-dichlorofenvlo))))-P1(1ft,2S-winvloAcca)CONHSO₂-cyklopropan (64%): ¹H NMR (d₄-CH₃OH, 500 MHz) δ: 7,44 (s, 2H), 7,04 (s, 1H), 6,62 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 5,76 (m, 1H), 5,40 (s, 1H), 5,29 (d, J = 17,1 Hz, 1H), 5,12 (d, J = 10,4 Hz, 1H), 4,40 (dd, J = 10,1 Hz, 7,3 Hz, 1H), 4,25 (m, 2H), 3,96 (dd, J = 11,9 Hz, 3,6 Hz, 1H), 2,92 (m, 1H), 2,42 (dd, J = 14,0 Hz, 7,0 Hz, 1H), 2,23 (m, 2H), 1,87 (dd, J = 8,2 Hz, 5,5 Hz, 1H), 1,42 (m, 1H), 1,35 (s, 9H), 1,23 (t, J = 7,0 Hz, 2H), 1,05 (m, 2H), 1,01 (s, 9H).

LC-MS A: czas retencji - 2,96.

MS: m/z = 691 (M+H).

BocNH-P3(FbutyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(3-fluorobenzylo))))-P1(1ff,2S-winyloAcca)CONHSO₂-cyklopropan (57%): ¹H NMR (d₄-CH₃OH, 500 MHz) δ: 7,32 (m, 1H), 7,08 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,01 (d, J = 10,1 Hz, 1H), 6,96 (t, J = 8,2 Hz, 1H), 6,63 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 5,77 (m, 1H), 5,33 (s, 1H), 5,30 (d, J = 18,6 Hz, 1H), 5,12 (d, J = 10,4 Hz, 1H), 4,35 (m, 1H), 4,25 (m, 3H), 4,05 (m, 1H), 3,95 (m, 1H), 2,92 (m, 1H), 2,33 (dd, J = 13,4 Hz, 7,0 Hz, 1H), 2,22 (m, 1H), 2,13 (m, 1H), 1,86 (dd, J = 7,9 Hz, 5,5 Hz, 1H), 1,43 (s, 9Η), 1,38 (m, 1H), 1,23 (m, 2H), 1,06 (m, 2H), 1,01 (s, 9H).

LC-MS A: czas retencji - 2,80.

MS: m/z = 708 (M+H).

PL 215 228 B1

do wytwarzania związku 25 £***4 O C*k

VI *ϋί5Λ. w*» %*·

BocNH-P3(f-butvloGlv)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(3-etvlofenvlo))))-P1(1ff,2S-winvloAcca)-CONHSO₂cyklopropan (77%): ¹H NMR (d₄-CH₃OH, 500 MHz) δ: 7,27 (s, 1H), 7,21 (s, 1H), 7,15 (t, J = 7,6 Hz, 1H), 6,86 (d, J = 7,0 Hz, 1H), 6,64 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 5,77 (m, 1H), 5,39 (s, 1H), 5,29 (d, J = 17,1 Hz, 1H), 5,12 (d, J = 10,4 Hz, 1H), 4,40 (dd, J = 9,7 Hz, 7,3 Hz, 1H), 4,28 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 4,18 (d, J = 11,6 Hz, 1H), 3,97 (Μ, 1H), 2,93 (Μ, 1H), 2,59 (q, J = 7,6 Hz, 2H), 2,41 (dd, J = 14,0 Hz, 7,0 Hz, 1H), 2,22 (m, 2H), 1,87 (dd, J = 8,2 Hz, 5,5 Hz, 1H), 1,42 (m, 1H), 1,38 (s, 9H), 1,23 (m, 2H), 1,20 (t, J = 7,3 Hz, 3H), 1,06 (m, 2H), 1,02 (s, 9H).

LC-MS A: czas retencji - 2,78.

MS: m/z = 704 (M+H).

BocNH-P3(f-butvloGlv)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(2-chlorobenzvlo))))-P1(1ff,2S-winvloAcca)CONHSO₂-cyklopropan (62%): ¹H NMR (d₆-aceton, 500 MHz) δ: 8,39 (s, 1H), 7,41 (m, 2H), 7,32 (m, 2H), 6,96 (s, 1H), 5,80 (m, 2H), 5,36 (s, 1H), 5,23 (d, J = 17,1 Hz, 1H), 5,06 (d, J = 10,7 Hz, 1H), 4,42 (m, 2H), 4,29 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 3,99 (s, 1H), 2,92 (m, 1H), 2,33 (m, 1H), 2,23 (m, 2H), 1,79 (dd, J = 7,6 Hz, 5,5 Hz, 1H), 1,46 (m, 1H), 1,42 (s, 9H), 1,16 (m, 2H), 1,04 (s, 11H).

LC-MS A: czas retencji - 2,58.

MS: m/z = 724 (M+H).

PL 215 228 B1

BocNH-P3(hbutyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(3-metoksyfenylo))))-P1(1ff,2S-winyloAcca)CONHSO₂-cyklopropan (47%): ¹H NMR (d₆-aceton, 500 MHz) δ: 10,11 (s, 1H), 8,72 (s, 1H), 8,40 (s, 1H), 7,26 (s, 1H), 7,19 (t, J = 8,2 Hz, 1H), 7,10 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 6,61 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 5,77 (m, 2H), 5,47 (s, 1H), 5,24 (d, J = 17,4 Hz, 1H), 5,08 (d, J = 10,4 Hz, 1H), 4,37 (m, 1H), 4,30 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 4,06 (m, 2H), 3,77 (s, 3H), 2,94 (m, 1H), 2,40 (m, 1H), 2,26 (m, 2H), 1,80 (dd, J = 7,9 Hz, 5,5 Hz, 1H), 1,50 (m, 1H), 1,37 (s, 9H), 1,20 (t, J = 7,0 Hz, 2H), 1,07 (m, 2H), 1,05 (s, 9H).

LC-MS A: czas retencji - 2,51.

MS: m/z = 706 (M+H).

Związek 28

BocNH-P3(FbutyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(3-benzoesan-etylu))))-P1(1R2S-winyloAcca)CONHSO₂-cyklopropan (43%): ¹H NMR (d₆-aceton, 500 MHz) δ: 10,10 (s, 1H), 9,01 (s, 1H), 8,40 (s, 1H), 8,26 (s, 1H), 7,79 (d, J = 7,0 Hz, 1H), 7,69 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,44 (t, J = 7,9 Hz, 1H), 5,77 (m, 2H), 5,49 (s, 1H), 5,23 (d, J = 17,4 Hz, 1H), 5,08 (d, J = 10,1 Hz, 1H), 4,41 (t, J = 7,6 Hz, 1H), 4,35 (q, J = 7,0 Hz, 2H),

4,29 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 4,16 (d, J = 11,6 Hz, 1H), 4,03 (m, 1H), 2,94 (m, 1H), 2,42 (dd, J = 13,7 Hz, 6,7 Hz, 1H), 2,26 (m, 2H), 1,80 (dd, J = 7,9 Hz, 5,5 Hz, 1H), 1,50 (dd, J = 9,5 Hz, 5,5 Hz, 1H), 1,35 (m, 12H), 1,20 (t, J = 7,0 Hz, 2 Η), 1,07 (m, 2H), 1,04 (s, 9H).

LC-MS A: czas retencji - 2,63.

MS: m/z = 748 (M+H).

PL 215 228 B1

BocNH-P3((-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(2-metylosulfanylofenylo))))-P1(1ff,2S-winyloAcca)CONHSO2-cyklopropan (63%): ¹H NMR (d₆-aceton, 500 MHz) δ: 10,13 (s, 1H), 8,40 (s, 1H), 7,99 (s, 1H), 7,90 (s, 1H), 7,46 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,27 (t, J = 7,6 Hz, 1H), 7,12 (t, J = 7,6 Hz, 1H), 5,79 (m, 2H), 5,46 (s, 1H), 5,25 (d, J = 17,1 Hz, 1H), 5,08 (d, J = 10,4 Hz, 1H), 4,43 (m, 1H), 4,28 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 4,20 (d, J = 11,3 Hz, 1H), 4,03 (m, 1H), 2,95 (m, 1H), 2,44 (m, 1H), 2,40 (s, 3H), 2,27 (m, 2H), 1,80 (dd, J = 7,9 Hz, 5,2 Hz, 1H), 1,50 (dd, J = 9,5 Hz, 5,2 Hz, 1H), 1,36 (s, 9H), 1,20 (t, J = 7,3 Hz, 2H), 1,05 (s, 11H).

LC-MS A: czas retencji - 2,57.

MS: m/z = 722 (M+H).

BocNH-P3(t-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(2-benzoesanmetylu))))-P1(1R2S-winyloAcca)CONHSO2-cyklopropan (18%): ¹H NMR (d4-CH3OH, 500 MHz) δ: 8,37 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 8,01 (d, J = 6,7 Hz, 1H), 7,55 (t, J = 8,6 Hz, 1H), 7,08 (t, J = 7,3 Hz, 1H), 5,81 (m, 1H), 5,39 (s, 1H), 5,25 (d, J = 17,1 Hz, 1H), 5,07 (d, J = 10,4 Hz, 1H), 4,46 (m, 1H), 4,32 (d, J = 12,2 Hz, 1H), 4,23 (s, 1H), 3,98 (d, J = 12,2 Hz, 1H), 3,89 (s, 3H), 2,87 (m, 1H), 2,46 (m, 1H), 2,29 (m, 1H), 2,15 (s, 1H), 1,85 (dd, J = 7,9 Hz, 5,5 Hz, 1H), 1,38 (m, 1H), 1,28 (s, 9 Η), 1,15 (s, 2H), 1,03 (s, 11H).

LC-MS A: czas retencji - 2,75.

MS: m/z = 734 (M+H).

PL 215 228 B1

BocNH-P3(t-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(2,3-dichlorofenylo))))-P1(1ff,2S-winyloAcca)CONHSO₂-cyklopropan (30%): ¹H NMR (d₄-CH₃OH, 500 MHz) δ: 7,81 (s, 1H), 7,27 (m, 2H), 6,62 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 5,78 (m, 1H), 5,41 (s, 1H), 5,27 (d, J = 17,4 Hz, 1H), 5,09 (d, J = 10,6 Hz, 1H), 4,42 (m, 1H), 4,25 (m, 2H), 3,97 (m, 1H), 2,91 (m, 1H), 2,43 (dd, J = 13,4 Hz, 6,7 Hz, 1H), 2,20 (m, 2H), 1,85 (dd, J = 7,9 Hz, 5,2 Hz, 1H), 1,40 (m, 1H), 1,37 (s, 9H), 1,19 (m, 2H), 1,01 (s, 11H).

LC-MS A: czas retencji - 2,78.

MS: m/z = 744 (M+H).

BocNH-P3(t-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(N-(9-karbazolilo))))-P1(1ff,2S-winyloAcca)-CONHSO₂ ^L cyklopropan (27%): ¹H NMR (d₄-CH₃OH, 500 MHz) δ: 8,18 (s, 2H), 8,03 (d, J = 7,6 Hz, 2H), 7,48 (t, J = 8,5 Hz, 2H), 7,37 (t, J = 7,3 Hz, 2H), 5,80 (s, 1H), 5,75 (m, 1H), 5,29 (d, J = 17,4, 1H), 5,12 (d, J = 10,4 Hz, 1H), 4,63 (m, 2H), 4,30 (m, 1H), 4,07 (m, 1H), 2,94 (m, 1H), 2,68 (m, 1H), 2,35 (m, 1H), 2,24 (m, 1H), 1,89 (dd, J = 7,9 Hz, 5,5 Hz, 1H), 1,44 (m, 1H), 1,23 (m, 2H), 1,08 (m, 2H), 1,05 (s, 9H), 1,02 (s, 9H).

LC-MS A: czas retencji - 2,96.

MS: m/z = 750 (M+H).

PL 215 228 B1

BocNH-P3(t-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(2-bromofenylo))))-P1(1ff,2S-winyloAcca)-CONHSO₂cyklopropan (35%): ¹H NMR (d₄-CH₃OH, 500 MHz) δ: 7,75 (m, 1H), 7,57 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,32 (t, J = 8,5 Hz, 1H), 7,05 (t, J = 7,9 Hz, 1H), 6,65 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 5,77 (m, 1H), 5,41 (s, 1H), 5,30 (d, J = 17,1 Hz, 1H), 5,12 (d, J = 10,4 Hz, 1H), 4,40 (m, 1H), 4,27 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 4,23 (d, J = 11,9 Hz, 1H), 3,97 (dd, J = 11,9 Hz, 3,4 Hz, 1H), 2,93 (m, 1H), 2,41 (m, 1H), 2,22 (m, 2H), 1,87 (dd, J = 8,2 Hz, 5,5 Hz, 1H), 1,43 (m, 1H), 1,39 (s, 9H), 1,23 (t, J = 7,3 Hz, 2H), 1,06 (m, 2H), 1,02 (s, 9H).

LC-MS A: czas retencji - 2,65.

MS: m/z = 754 (M+H).

BocNH-P3(t-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(3-trifluorometylofenylo))))-P1(1R2S-winyloAcca)CONHSO₂-cyklopropan (29%): ¹H NMR (d₄-CH₃OH, 500 MHz) δ: 7,84 (s, 1H), 7,60 (d, J = 7,0 Hz, 1H), 7,44 (m, 1H),

7,29 (d, J = 7,3 Hz, 1H), 6,63 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 5,78 (m, 1H), 5,41 (s, 1H), 5,28 (d, J = 17,4 Hz, 1H), 5,11 (d, J = 10,4 Hz, 1H), 4,42 (m, 1H), 4,25 (m, 2H), 3,96 (dd, J = 11,9 Hz, 3,4 Hz, 1H), 2,91 (m, 1H), 2,43 (dd, J = 13,7 Hz, 7,0 Hz, 1H), 2,21 (m, 2H), 1,86 (dd, J = 8,2 Hz, 5,2 Hz, 1H), 1,42 (m, 1H), 1,34 (s, 9H), 1,22 (m, 2H), 1,02 (s, 9H), 1,02 (m, 2H).

LC-MS A: czas retencji - 2,79.

MS: m/z = 743 (M+H).

PL 215 228 B1

BocNH-P3(t-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-3-(5,6-dichloropirazyno-2-karboksylanmetylu))))P1(1 R,2S-winyloAcca)-CONHSO₂-cyklopropan (48%): ¹H NMR (d4-CH3OH, 500 MHz) δ: 6,64 (d, J =9,2 Hz, 1H), 5,76 (m, 1H), 5,45 (s, 1H), 5,30 (d, J = 17,4 Hz, 1H), 5,12 (d, J = 10,4 Hz, 1H), 4,42 (dd, J = 10,3 Hz, 7,0 Hz, 1H), 4,23 (m, 2H), 3,99 (dd, J = 11,6 Hz, 3,6 Hz, 1H), 3,95 (s, 3H), 2,93 (m, 1H), 2,44 (dd, J = 14,0 Hz, 7,0 Hz, 1H), 2,24 (m, 2H), 1,87 (dd, J = 8,2 Hz, 5,5 Hz, 1H), 1,41 (m, 1H), 1,37 (s, 9H), 1,23 (m, 2H), 1,06 (m, 2H), 1,02 (s, 9H).

LC-MS A: czas retencji - 2,67.

BocNH-P3(FbutyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(N-(1 -indolinylo))))-P1(1 ,2S-winyloAcca)-CONHSO₂cyklopropan (78%): ¹H NMR (d4-CH3OH, 500 MHz) δ: 7,76 (s, 1H), 7,51 (m, 2H), 6,94 (m, 1H), 6,59 (m, 1H), 5,75 (m, 1H), 5,41 (s, 1H), 5,29 (d, J = 17,1 Hz, 1H), 5,12 (d, J = 11,3 Hz, 1H), 4,44 (s, 1H), 4,28 (s, 1H), 4,21 (s, 1H), 3,96 (m, 3H), 3,07 (s, 2H), 2,93 (m, 1H), 2,46 (s, 1H), 2,21 (m, 2H), 1,87 (dd, J = 8,2 Hz, 5,5 Hz, 1H), 1,42 (m, 1H), 1,31 (s, 9H), 1,22 (m, 2H), 1,06 (m, 2H), 1,03 (s, 9H).

LC-MS A: czas retencji - 2,68.

MS: m/z = 702 (M+H).

PL 215 228 B1

BocNH-P3(f-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(3-metylosulfanylofenylo))))-P1(1R2S-winyloAcca)CONHSO2-cyklopropan (17%): ¹H NMR (d4-CH3OH, 500 MHz) δ: 7,41 (s, 1H), 7,15 (m, 2Η), 6,91 (d, J = 7,0 Hz, 1H), 5,77 (m, 1H), 5,38 (s, 1H), 5,28 (d, J = 16,8 Hz, 1H), 5,10 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 4,41 (m, 1H), 4,26 (m, 1H), 4,20 (d, J = 11,9 Hz, 1H), 3,96 (dd, J = 11,6 Hz, 3,6 Hz, 1H), 2,69 (m, 1H), 2,44 (s, 3H), 2,40 (m, 1H), 2,20 (s, 2H), 1,86 (m, 1H), 1,41 (m, 1H), 1,37 (s, 9H), 1,20 (s, 2H), 1,02 (s, 11H).

LC-MS A: czas retencji - 2,69.

MS: m/z = 622 (M+H-Boc).

BocNH-P3((-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(2-chloro-5-metylofenylo))))P1(1ff,2S-winyloAcca)CONHSO2-cyklopropan (27%): ¹H NMR (d₄-CH₃OH, 500 MHz) δ: 7,64 (s, 1H), 7,25 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 6,92 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 6,59 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 5,80 (m, 1H), 5,39 (s, 1H), 5,26 (d, J = 17,4 Hz, 1H), 5,07 (d, J = 10,1Hz, 1H), 4,42 (m, 1H), 4,26 (m, 2H), 3,98 (d, J = 11,6 Hz, 1H), 2,89 (m, 1H), 2,43 (m, 1H), 2,31 (s, 3H), 2,24 (m, 1H), 2,15 (m, 1H), 1,85 (dd, J = 7,9 Hz, 5,2 Hz, 1H), 1,39 (m, 1H), 1,37 (s, 9H), 1,17 (m, 2H), 1,03 (s, 11H).

LC-MS A: czas retencji - 2,72.

MS: m/z = 725 (M+H).

BocNH-P3(f-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(M.M-difenylo)))-P1(1R2S-winyloAcca)-CONHSO₂cyklopropan (51%): ¹H NMR (d₄-CH₃OH, 500 MHz) δ: 7,33 (m, 4H), 7,22 (m, 6H), 6,74 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 5,72 (m, 1H), 5,39 (s, 1H), 5,27 (d, J = 17,4 Hz, 1H), 5,10 (d, J = 10,4 Hz, 1H), 4,29 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 4,25 (d, J = 11,9 Hz, 1H), 4,05 (dd, J = 10,3 Hz, 7,3 Hz, 1H), 3,89 (dd, J = 12,2 Hz, 3,0 Hz, 1H),

PL 215 228 B1

2,92 (m, 1H), 2,19 (m, 2H), 2,08 (m, 1H), 1,83 (dd, J = 8,2 Hz, 5,5 Hz, 1H), 1,43 (s, 9H), 1,36 (dd, J = 9,5 Hz, 5,5 Hz, 1H), 1,23 (t, J = 7,0 Hz, 2H), 1,05 (m, 2H), 1,03 (s, 9H).

LC-MS A: czas retencji - 2,75.

MS: m/z = 752 (M+H).

Związek 40

BocNH-P3(FbutyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(3-benzoesanmetylu))))-P1(1R2S-winyloAcca)CONHSO?-cyklopropan (9%): ¹H NMR (d^CHsOH, 500 MHz) δ: 8,11 (s, 1H), 7,66 (m, 2H), 7,37 (t, J = 7,9 Hz, 1H), 6,60 (s, 1H), 5,77 (s, 1H), 5,41 (s, 1H), 5,29 (d, J = 16,8 Hz, 1H), 5,11 (d, J = 9,8 Hz, 1H), 4,42 (m, 1H), 4,26 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 4,22 (d, J = 12,5 Hz, 1H), 3,96 (dd, J = 11,6 Hz, 3,4 Hz, 1H), 3,89 (s, 3H), 2,90 (s, 1H), 2,42 (m, 1H), 2,21 (s, 2H), 1,86 (dd, J = 7,9 Hz, 5,5 Hz, 1H), 1,41 (m, 1H), 1,35 (s, 9H), 1,22 (m, 2H), 1,02 (s, 11H).

LC-MS A: czas retencji - 2,59.

MS: m/z = 734 (M+H).

BocNH-P3(FbutyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(4-metoksy-2-nitrofenylo))))-P1(1R2S-winyloAcca)CONHSO?-cyklopropan (23%): ¹H NMR (d^CHsOH, 500 MHz) δ: 8,05 (s, 1H), 7,60 (d, J = 3,1 Hz, 1H), 7,28 (dd, J = 9,2 Hz, 3,1Hz, 1H), 6,60 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 5,76 (m, 1H), 5,40 (s, 1H), 5,28 (d, J = 17,1 Hz, 1H), 5,10 (d, J = 10,4 Hz, 1H), 4,42 (dd, J = 10,1 Hz, 7,3 Hz, 1H), 4,25 (m, 2H), 3,97 (dd, J = 11,9 Hz, 3,0 Hz, 1H), 3,85 (s, 3H), 2,92 (m, 1H), 2,42 (dd, J = 13,3 Hz, 7,0 Hz, 1H), 2,21 (m, 2H), 1,85 (dd, J = 7,9 Hz, 5,5 Hz, 1H), 1,40 (m, 1H), 1,34 (s, 9H), 1,22 (m, 2Η), 1,02 (s, 11H).

LC-MS A: czas retencji - 2,63.

MS: m/z = 773 (M+H).

PL 215 228 B1

BocNH-P3(hbutyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(2,3-dimetylofenylo))))-P1(1ff,2S-winyloAcca)CONHSO₂-cyklopropan (18%): ¹H NMR (d₄-CH₃OH, 500 MHz) δ: 7,17 (m, 1H), 7,00 (m, 2H), 5,77 (m, 1H), 5,38 (s, 1H),

5,29 (d, J = 16,8 Hz, 1H), 5,11 (d, J = 9,8 Hz, 1H), 4,41 (s, 1H), 4,29 (m, 1H), 4,16 (d, J = 11,6 Hz, 1H), 3,97 (d, J = 10,4 Hz, 1H), 2,91 (s, 1H), 2,41 (m, 1H), 2,27 (s, 3H), 2,21 (m, 2H), 2,13 (s, 3H), 1,86 (m, 1H), 1,43 (s, 10H), 1,22 (s, 2Η), 1,03 (s, 11H).

LC-MS A: czas retencji - 2,64.

MS: m/z = 704 (M+H).

Związek 43

BocNH-P3(hbutyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(N,N-dimetylo)))-P1(1ff,2S-winyloAcca)-CONHSO₂cyklopropan (16%): ¹H NMR (d4-CH₃OH, 500 MHz) δ: 6,60 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 5,76 (m 1H), 5,29 (d, J = 17,1Hz, 1H), 5,26 (s, 1H), 5,12 (d, J = 10,4 Hz, 1H), 4,38 (dd, J = 10,0 Hz, 7,3 Hz, 1H), 4,22 (m, 1H), 4,16 (d, J = 11,6 Hz, 1H), 3,90 (dd, J = 11,6 Hz, 3,1 Hz, 1H), 2,92 (m, 1H), 2,89 (s, 6H), 2,35 (dd, J = 14,0 Hz, 7,3 Hz, 1H), 2,21 (m, 1H), 2,16 (m, 1H), 1,85 (dd, J = 8,2 Hz, 5,5 Hz, 1H), 1,42 (s, 10H), 1,22 (m, 2H), 1,05 (m, 2 Η), 1,02 (s, 9H).

LC-MS A: czas retencji - 2,28.

PL 215 228 B1

BocNH-P3(t-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(M.M-dietylo)))-P1(1R2S-winyloAcca)-CONHSO₂cyklopropan (27%): ¹H NMR (d4-CH3OH, 500 MHz) δ, 6,59 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 5,77 (m, 1H), 5,29 (s, 1H), 5,27 (d, J = 16,5 Hz, 1H), 5,10 (d, J = 10,7 Hz, 1H), 4,37 (dd, J = 10,3 Hz, 7,3 Hz, 1H), 4,23 (m, 1H), 4,13 (d, J = 12,5 Hz, 1H), 3,90 (dd, J = 11,3 Hz, 3,4 Hz, 1H), 3,26 (m, 4Η), 2,91 (m, 1H), 2,36 (dd, J = 13,7 Hz, 7,0 Hz, 1H), 2,18 (m, 2H), 1,85 (dd, J = 7,9 Hz, 5,5 Hz, 1H), 1,44 (m, 1H), 1,42 (s, 9H), 1,20 (m, 2H), 1,10 (t, J = 8,2 Hz, 6H), 1,02 (s, 11H).

LC-MS A: czas retencji - 2,38.

MS: m/z = 678 (M+Na).

BocNH-P3(t-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(MM-diizopropylo)))-P1(1ff,2S-winyloAcca)-CONHSO₂cyklopropan (43%): ¹H NMR (d4-CH3OH, 500 MHz) δ: 6,59 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 5,76 (m, 1H), 5,33 (s, 1H),

5,30 (d, J = 18,3 Hz, 1H), 5,13 (d, J = 10,4 Hz, 1H), 4,41 (dd, J = 10,7 Hz, 7,0 Hz, 1H), 4,27 (m, 1H), 4,14 (s, 1H), 3,67 (s, 1H), 4,10 (d, J = 11,9 Hz, 1H), 3,90 (dd, J = 11,4 Hz, 3,4 Hz, 1H), 2,93 (m, 1H),

2,37 (dd, J = 14,0 Hz, 7,0 Hz, 1H), 2,24 (q, J = 8,6 Hz, 1H), 2.16 (m, 1H), 1,87 (dd, J = 8,2 Hz, 5,5 Hz, 1H), 1,44 (m, 1H), 1,42 (s, 9H), 1,23 (m, 2H), 1,19 (m, 12H), 1,08 (m, 2H), 1,01 (s, 9H).

LC-MS A: czas retencji - 2,65.

MS: m/z = 684 (M+H).

BocNH-P3(t-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(Ν,Ν-dibutylo)))-P1(1ff,2S-winyloAcca)-CONHSO₂cyklopropan (39%): ¹H NMR (d4-CH3OH, 500 MHz) δ: 5,83 (m, 1H), 5,26 (s, 1H), 5,24 (d, J = 17,1 Hz, 1H), 5,06 (d, J = 10,4 Hz, 1H), 4,41 (dd, J = 9,8 Hz, 7,6 Hz, 1H), 4,25 (m, 1H), 4,09 (d, J = 12,2 Hz, 1H), 3,91 (dd, J = 11,9 Hz, 3,3 Hz, 1H), 3,20 (m, 4Η), 2,80 (m, 1H), 2,38 (dd, J = 13,7 Hz, 7,3 Hz, 1H), 2,24

PL 215 228 B1 (m, 1H), 2,15 (q, J = 8,9 Hz, 1H), 1,84 (dd, J = 7,9 Hz, 5,2 Hz, 1H), 1,53 (m, 2H), 1,46 (m, 1H), 1,43 (s, 9H), 1,35 (m, 2H), 1,30 (m, 4H), 1,14 (s, 2H), 1,02 (s, 9H), 0,97 (m, 2H), 0,92 (m, 6H).

LC-MS A: czas retencji - 2,78.

MS: m/z = 713 (M+H).

BocNH-P3(f-butvloGlv)-P2(Hvp(O-CO-(NH-(3-acetvlofenvlo))))-P1(1ff,2S-winvloAcca)-CONHSO2cyklopropan (54%): ¹H NMR (d4-CH3OH, 500 MHz) δ: 8,05 (m, 1H), 7,66 (m, 2H), 7,40 (t, J = 7,9 Hz, 1H), 5,84 (s, 1H), 5,39 (s, 1H), 5,25 (d, J = 15,3 Hz, 1H), 5,07 (d, J = 7,0 Hz, 1H) , 4,45 (t, J = 7,9 Hz, 1H), 4,26 (m, 1H), 4,22 (d, J = 12,5 Hz, 1H) , 3,97 (dd, J = 11,9 Hz, 3,3 Hz, 1H), 2,81 (szerokie s, 1H) , 2,57 (s, 3H), 2,44 (dd, J = 13,7 Hz, 7,0 Hz, 1H), 2,25 (s, 1H), 2,16 (s, 1H), 1,85 (dd, J = 7,9 Hz, 5,5 Hz, 1H),

1,38 (m, 1H), 1,34 (s, 9H), 1,16 (m, 2H), 1,01 (s, 11H).

LC-MS A: czas retencji - 2,48.

MS: m/z = 718 (M+H).

BocNH-P3(f-butvloGlv)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(2-benzoesan izopropylu))))-P1 (1 R2S-winvloAcca)CONHSO2-cyklopropan (34%): ¹H NMR (d4-CH3OH, 500 MHz) δ: 8,38 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 8,00 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 7,55 (t, J = 8,2 Hz, 1H), 7,06 (t, J = 7,6 Hz, 1H), 6,62 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 5,76 (m, 1H), 5,40 (s, 1H), 5,30 (d,

PL 215 228 B1

J = 17,1 Hz, 1H), 5,20 (m, 1H), 5,12 (d, J = 10,1 Hz, 1H), 4,44 (m, 1H), 4,32 (d, J = 11,9 Hz, 1H), 4,23 (m, 1H), 3,96 (m, 1H), 2,94 (m, 1H), 2,45 (dd, J = 13,7 Hz, 6,7 Hz, 1H), 2,23 (m, 2H), 1,88 (dd, J = 8,2 Hz, 5,5 Hz, 1H), 1,43 (dd, J = 9,7 Hz, 5,5 Hz, 1H), 1,37 (m, 6H), 1,29 (s, 9H), 1,23 (t, J = 70 Hz, 2H), 1,06 (m, 2H), 1,02 (s, 9H).

LC-MS A: czas retencji - 2,56. MS: m/z = 763 (M+H).

BocNH-P3(FbutyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-2-(4,5,6,7-tetrahydrobenzo[ó]tiofeno-3-karboksylan etylu))))-P1 (1 ff,2S-winyloAcca)-CONHSO?-cyklopropan (10%): ¹H NMR (d^CHsOH, 500 MHz) δ: 5,75 (m, 1H), 5,42 (s, 1H), 5,31 (dd, J = 17,1Hz, 5,5

Hz, 1H), 5,13 (d, J = 10,4 Hz, 1H), 4,42 (m, 1H), 4,32 (m, 1H), 4,28 (m, 2H), 4,20 (m, 1H), 3,93 (m, 1H), 2,93 (m, 1H), 2,74 (s, 2H), 2,62 (s, 2H), 2,47 (m, 1H), 2,25 (m, 2H), 1,79 (m, 5H), 1,38 (m, 1H), 1,34 (m, 3H), 1,31 (s, 9H), 1,23 (m, 2H), 1,06 (m, 2H), 1,02, 1,01 (s, ogółem 9H).

LC-MS A: czas retencji - 3,08. MS: m/z = 809 (M+H).

BocNH-P3(t-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(3,5-dimetyΙοfenyIo))))-P1(1ff,2S-winyloAcca)CONHSO?-cyklopropan (43%): ¹H NMR (d^CHsOH, 500 MHz) δ: 7,03 (m, 2H), 6,67 (s, 1H), 6,64 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 5,77 (m, 1H), 5,38 (s, 1H), 5,30 (d, J = 17,1 Hz, 1H), 5,11 (d, J = 10,4 Hz, 1H), 4,41 (m, 1H), 4,27 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 4,18 (d, J = 11,9 Hz, 1H), 3,97 (dd, J = 11,9 Hz, 3,7 Hz, 1H) , 2,91 (m, 1H), 2,41 (dd, J = 13,7 Hz, 7,0 Hz, 1H), 2,24 (s, 6H), 2,21 (m, 2H), 1,87 (dd, J = 8,2 Hz, 5,5 Hz, 1H), 1,42 (m, 1H),

1,38 (s, 9H), 1,22 (m, 2H), 1,05 (m, 2H), 1,01 (s, 9H).

LC-MS A: czas retencji - 2,73.

MS: m/z = 704 (M+H).

PL 215 228 B1

BocNH-P3(t-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(2-fluorofenylo))))-P1(1ff,2S-winyloAcca)-CONHSO₂cyklopropan (37%): ¹H NMR (d4-CH₃OH, 500 MHz) δ: 7,86 (s, 1H), 7,10 (m, 3H), 6,63 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 5,77 (m, 1H), 5,42 (s, 1H), 5,30 (d, J = 17,1 Hz, 1H), 5,12 (d, J = 10,4 Hz, 1H), 4,40 (m, 1H), 4,27 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 4,21 (d, J = 11,9 Hz, 1H), 3,96 (dd, J = 11,9 Hz, 3,6 Hz, 1H), 2,92 (m, 1H), 2,42 (dd, J = 13,7 Hz, 6,7 Hz, 1H), 2,22 (m, 2H), 1,87 (dd, J = 7,9 Hz, 5,5 Hz, 1H), 1,42 (dd, J = 9,5 Hz, 5,5 Hz, 1H), 1,38 (s, 9H), 1,23 (t, J = 7,3 Hz, 2H), 1,06 (m, 2H), 1,02 (s, 9H).

LC-MS A: czas retencji - 2,52.

MS: m/z = 694 (M+H).

BocNH-P3(hbutyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(2,6-difluorofenylo))))-P1(1ff,2S-winyloAcca)CONHSO₂cyklopropan (34%): ¹H NMR (d4-CH₃OH, 500 MHz) δ: 7,28 (m, 1H), 7,01 (t, J = 7,9 Hz, 2H), 6,65 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 5,77 (m, 1H), 5,41 (s, 1H), 5,30 (d, J = 17,4 Hz, 1H), 5,12 (d, J = 10,4 Hz, 1H), 4,36 (s, 1H),

4,29 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 4,10 (m, 1H), 3,96 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 2,92 (m, 1H), 2,37 (s, 1H), 2,21 (m, 2H), 1,86 (dd, J = 7,9 Hz, 5,5 Hz, 1H), 1,44 (s, 10H), 1,23 (t, J = 7,0 Hz, 2H), 1,06 (m, 2H), 1,02 (s, 9H).

LC-MS A: czas retencji - 2,38.

MS: m/z = 712 (M+H).

PL 215 228 B1

BocNH-P3(f-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(2-chlorofenylo))))-P1(1ff,2S-winyloAcca)-CONHSO₂cyklopropan (37%): ¹H NMR (d4-CH₃OH, 500 MHz) δ: 7,81 (s, 1H), 7,39 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 7,28 (t, J = 7,9 Hz, 1H), 7,10 (t, J = 7,6 Hz, 1H), 6,64 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 5,77 (m, 1H), 5,42 (s, 1H), 5,30 (d, J = 17,1Hz, 1H), 5,12 (d, J = 10,4Hz, 1H), 4,41 (m, 1H), 4,27 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 4,23 (d, J = 12,5 Hz, 1H), 3,98 (dd, J = 11,6 Hz, 3,1Hz, 1H), 2,92 (m, 1H), 2,42 (dd, J = 13,4 Hz, 6,7 Hz, 1H), 2,22 (m, 2H), 1,87 (dd, J = 8,2 Hz, 5,5 Hz, 1H), 1,42 (dd, J = 9,8 Hz, 5,5 Hz, 1H), 1,38 (s, 9H), 1,23 (t, J = 7,0 Hz, 2H), 1,06 (m, 2H), 1,02 (s, 9H).

LC-MS A: czas retencji - 2,59. MS: m/z = 711 (M+H).

BocNH-P3(f-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(2,6-dichlorofenylo))))-P1(1ff,2S-winyloAcca)CONHSO₂-cyklopropan (37%): ¹H NMR (d₄-CH₃OH, 500 MHz) δ: 7,43 (d, J = 7,9 Hz, 2H), 7,27 (t, J = 7,9 Hz, 1H), 6,62 (s, 1H), 5,77 (m, 1H), 5,39 (s, 1H), 5,30 (d, J = 17,1Hz, 1H), 5,12 (d, J = 10,1Hz, 1H), 4,44 (s, 1H),

4,29 (s, 1H), 4,10 (m, 1H), 4,10 (m, 1H), 3,99 (m, 1H), 2,92 (s, 1H), 2,42 (s, 1H), 2,22 (szerokie s, 2H), 1,86 (s, 1H), 1,48 (s, 1H), 1,45 (s, 9H), 1,23 (t, J = 7,3 Hz, 2H), 1,06 (s, 2H), 1,01 (s, 9H).

LC-MS A: czas retencji - 2,49.

BocNH-P3(f-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(2-metoksyfenylo))))-P1(1ff,2S-winyloAcca)CONHSO₂-cyklopropan (32%): ¹H NMR (d₄-CH₃OH, 500 MHz) δ: 7,85 (s, 1H), 7,03 (t, J = 7,9 Hz, 1H), 6,96 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 6,90 (t, J = 7,2 Hz, 1H), 6,63 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 5,77 (m, 1H), 5,39 (s, 1H), 5,30 (d, J = 17,1Hz, 1H), 5,12 (d, J = 11,3 Hz, 1H), 4,40 (t, J = 9,6 Hz, 1H), 4,26 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 4,21 (d, J = 12,2, 1H), 3,97 (dd, J = 11,6 Hz, 3,3 Hz, 1H), 3,84 (s, 3H), 2,92 (m, 1H), 2,41 (m, 1H), 2,23 (m, 2H), 1,87 (dd, J = 8,2 Hz, 5,5 Hz, 1H), 1,42 (dd, J = 9,5 Hz, 5,5 Hz, 1H), 1,37 (s, 9H), 1,23 (t, J = 7,0 Hz, 2H), 1,05 (m, 2H), 1,01 (s, 9H).

LC-MS A: czas retencji - 2,56.

MS: m/z = 706 (M+H).

PL 215 228 B1

BocNH-P3(i-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(2-etoksvfenylo))))-P1(1P,2S-winyloAcca)-CONHSO2cyklopropan (32%): ¹H NMR ^-C^OH, 500 MHz) δ: 7,87 (s, 1H), 7,00 (t, J = 7,6 Hz, 1H), 6,94 (d, J = 1,9

Hz, 1H), 6,88 (t, J = 7,6 Hz, 1H), 6,62 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 5,79 (m, 1H), 5,39 (s, 1H), 5,27 (d, J = 17,4

Hz, 1H), 5,09 (d, J = 10,4 Hz, 1H), 4,42 (t, J = 8,8 Hz, 1H), 4,25 (t, J = 9,8 Hz, 2H), 4,08 (m, 2Η), 3,98 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 2,91 (m, 1H), 2,43 (dd, J = 13,4Hz, 6,7 Hz, 1H), 2,19 (m, 2H), 1,85 (dd, J = 7,9 Hz,

5,5 Hz, 1H), 1,41 (t, J = 6.7 Hz. 4H), 1,35 (s, 9H), 1,19 (m, 2H), 1,02 (s, 11H).

LC-MS A: czas retencji - 2,67.

BocNH-P3(^butvloGlv)-P2(Hvp(O-CO-(NH-(o-tolilo))))-P1(1R,2S-winvloAcca)-CONHSO2cyklopropan (40%): ¹H NMR (d4-CH3OH, 500 MHz) δ: 7,37 (m, 1H), 7,17 (t, J = 7,6 Hz, 1H), 7,14 (t, J = 7,9 Hz, 1H), 7,06 (t, J = 7,6 Hz, 1H), 5,78 (m, 1H), 5,39 (s, 1H), 5,30 (d, J = 17,1 Hz, 1H), 5,12 (d, 10,4 Hz, 1H), 4,41 (s, 1H), 4,29 (m, 1H), 4,17 (d, J = 11,6 Hz, 1H), 3,98 (dd, J = 11,0, 2,8 Hz, 1H), 2,92 (m, 1H),

2,40 (m, 1H), 2,23 (s, 5H), 1,86 (dd, J = 7,9 Hz, 5,5 Hz, 1H), 1,43 (s, 10H), 1,23 (t, J = 7,0 Hz, 2H), 1,05 (m, 2H), 1,02 (s, 9H).

LC-MS A: czas retencji - 2,54.

MS: m/z = 690 (M+H).

PL 215 228 B1

BocNH-P3(FbutyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(2,6-dimetylofenylo))))-P1(1ff,2S-winyloAcca)CONHSO?-cyklopropan (42%): ¹H NMR (d^CHsOH, 500 MHz) δ: 7,05 (s, 3H), 5,78 (m, 1H), 5,39 (m, 1H), 5,31 (d, J = 17,1Hz, 1H), 5,13 (d, J = 10,1Hz, 1H), 4,44 (dd, J = 9,8 Hz, 7,3 Hz, 1H), 4,30 (m, 1H), 4,10 (m, 1H), 4,01 (m, 1H), 2,93 (m, 1H), 2,40 (dd, J = 13,7 Hz, 6,7 Hz, 1H), 2,23 (s, 6H), 2,18 (m, 2H), 1,87 (dd, J = 7,9 Hz, 5,5 Hz, 1H), 1,48 (m, 1H), 1,45 (s, 9H), 1,23 (t, J = 7,3 Hz, 2H), 1,06 (m, 2H), 1,03 (s, 9H).

LC-MS A: czas retencji - 2,55.

MS: m/z = 704 (M+H).

BocNH-P3(FbutyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(2-etylofenylo))))-P1(1R2S-winyloAcca)-CONHSO₂cyklopropan (43%): ¹H NMR (d^CHsOH, 500 MHz) δ: 7,39 (szerokie s, 1H), 7,21 (s, J = 7,0 Hz, 1H), 7,14 (m, 2H), 5,76 (m, 1H), 5,39 (s, 1H), 5,29 (d, J = 17,1Hz, 1H), 5,11 (d, J = 10,1Hz, 1H), 4,41 (m, 1H),

4,29 (m, 1H), 4,16 (d, J = 11,6 Hz, 1H), 3,98 (d, J = 11,6, 1H), 2,92 (m, 1H), 2,62 (q, J = 7,3 Hz, 2H),

2,40 (szerokie s, 1H), 2,20 (m, 2H), 1,86 (dd, J = 7,9 Hz, 5,5 Hz, 1H), 1,42 (s, 10H), 1,23 (m, 2H), 1,17 (t, J = 7,6 Hz, 3H), 1,03 (s, 11H).

LC-MS A: czas retencji - 2,61.

MS: m/z = 704 (M+H).

BocNH-P3(FbutyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(2-nitrofenylo))))-P1(1R2S-winyloAcca)-CONHSO₂cyklopropan (48%): ¹H NMR (d^CHsOH, 500 MHz) δ: 8,31 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 8,14 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 7,68 (t, J = 8,2 Hz, 1H), 7,24 (t, J = 7,3 Hz, 1H), 6,61 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 5,76 (m, 1H), 5,43 (s, 1H), 5,29 (d, J = 17,1 Hz, 1H), 5,11 (d, J = 10,4, 1H), 4,44 (dd, J = 10,4 Hz, 7,0 Hz, 1H), 4,31 (d, J = 11,9 Hz, 1H), 4,23 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 3,96 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 2,93 (m, 1H), 2,46 (dd, J = 13,7 Hz, 6,7 Hz, 1H), 2,22 (m, 2H), 1,87 (dd, J = 8,2 Hz, 5,5 Hz, 1H), 1,40 (m, 1H), 1,31 (s, 9H), 1,22 (m, 2H), 1,02 (s, 11H).

LC-MS A: czas retencji - 2,56.

MS: m/z = 721 (M+H).

PL 215 228 B1

BocNH-P3(hbutyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(2-etylo-6-metylo))))-P1(1ff,2S-winyloAcca)-CONHSO₂cyklopropan (43%): ¹H NMR (d₄-CH₃OH, 500 MHz) δ: 7,08 (m, 3H), 6,64 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 5,78 (m, 1H),

5,40 (s, 1H), 5,31 (d, J = 17,IHz, 1H), 5,12 (d, J = 10,4 Hz, 1H), 4,44 (m, 1H), 4,31 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 4,09 (m, 1H), 4,00 (m, 1H), 2,93 (m, 1H), 2,60 (q, J = 7,6 Hz, 2H), 2,39 (m, 1H), 2,23 (s, 5H), 1,87 (dd, J = 7,9 Hz, 5,5 Hz, 1H), 1,50 (s, 1H), 1,46 (s, 9H), 1,23 (t, J = 7,3 Hz, 2H), 1,17 (t, J = 7,3 Hz, 3H), 1,03 (s, 11H).

LC-MS A: czas retencji - 2,63.

MS: m/z = 718 (M+H).

BocNH-P3(t-butyloGly)-P2(Hyp_(O-CO-(NH-(2,6-dietylofenylo))))-P1 (1 R2S-winyloAcca)CONHSO₂-cyklopropan (51%): ¹H NMR (d₄-CH₃OH, 500 MHz) δ: 7,18 (m, 1H), 7,10 (d, J = 7,3 Hz, 2H), 6,64 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 5,78 (m, 1H), 5,41 (s, 1H), 5,32 (d, J = 17,1 Hz, 1H), 5,13 (d, J = 10,4 Hz, 1H), 4,44 (dd, J = 10,1 Hz, 7,0 Hz, 1H), 4,32 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 4,08 (m, 1H), 4,01 (m, 1H), 2,93 (m, 1H), 2,60 (q, J = 7,6, 4H), 2,40 (m, 1H), 2,24 (m, 2H), 1,87 (dd, J = 8,2 Hz, 5,5 Hz, 1H), 1,51 (s, 1H), 1,46 (s, 9H), 1,23 (m, 2H), 1,18 (t, J = 7,6 Hz, 6H), 1,06 (m, 2H), 1,03 (s, 9H).

LC-MS A: czas retencji - 2,69.

MS: m/z = 732 (M+H).

PL 215 228 B1

BocNH-P3(FbutyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(2-chloro-6-metylo))))-P1(1ff,2S-winyloAcca)CONHSO₂-cyklopropan (38%): ¹H NMR (d^CHsOH, 500 MHz) δ: 7,28 (m, 1H), 7,18 (m, 2H), 6,66 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 5,77 (m, 1H), 5,40 (s, 1H), 5,32 (d, J = 16,8 Hz, 1H), 5,12, (d, J = 10,1 Hz, 1H), 4,44 (m, 1H), 4,30 (m, 1H), 4,04 (m, 1H), 4,01 (m, 1H), 2,93 (m, 1H), 2,41 (m, 1H), 2,29 (s, 3H), 2,25 (m, 2H), 1,87 (m, 1H), 1,49 (m, 1H), 1,45 (s, 9H), 1,23 (t, J = 7,2, 2H), 1,06 (m, 2H), 1,02 (S, 9H).

LC-MS A: czas retencji - 2,51.

MS: m/z = 724 (M+H).

BocNH-P3(t-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(2-benzoesan butylu))))-P1 (1 ff,2S-winyloAcca)CONHSO₂-cyklopropan (35%): ¹H NMR (d^CHsOH, 500 MHz) δ: 8,39 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 8,01 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,56 (t, J = 7,6 Hz, 1H), 7,09 (t, J = 7,6 Hz, 1H), 6,66 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 5,76 (m, 1H), 5,40 (s, 1H), 5,31 (d, J = 17,1 Hz, 1H), 5,12 (d, J = 10,4 Hz, 1H), 4,43 (dd, J = 10,1 Hz, 7,0 Hz, 1H), 4,31 (m, 3H), 4,24 (d, J = 9,8 Hz, 1H), 3,96 (d, J = 11,6 Hz, 1H), 2,94 (m, 1H), 2,44 (dd, J = 13,4 Hz, 6,7 Hz, 1H), 2,24 (m, 2H), 1,87 (dd, J = 8,2 Hz, 5,5 Hz, 1H), 1,76 (m, 2H), 1,48 (q, J = 7,6 Hz, 2H), 1,43 (m, 1Η), 1,29 (s, 9H), 1,24 (m, 2H), 1,07 (m, 2H), 1,02 (s, 9H), 1,00 (m, 3H).

LC-MS A: czas retencji - 2,99.

MS: m/z = 776 (M+H).

BocNH-P3(FbutyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(2-jodofenylo))))-P1(1ff,2S-winyloAcca)-CONHSO₂cyklopropan (36%); ¹H NMR (d^CHsOH, 500 MHz) δ: 7,84 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 7,57 (szerokie s, 1H), 7,36 (t, J = 7,6 Hz, 1H), 6,93 (t, J = 7,6 Hz, 1H), 6,63 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 5,79 (m, 1H), 5,38 (s, 1H), 5,27 (d,

PL 215 228 B1

J = 17,1Hz, 1H), 5,08 (d, J = 10,1, 1H), 4,41 (s, 1H), 4,28 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 4,22 (d, J = 11,6 Hz, 1H), 3,99 (dd, J = 11,9 Hz, 3,1Hz, 1H), 2,90 (m, 1H), 2,41 (m, 1H), 2,20 (m, 2H), 1,85 (J = 7,6 Hz, 5,5 Hz, 1H), 1,40 (s, 10H), 1,18 (szerokie s, 2H), 1,01 (s, 11H).

LC-MS A: czas retencji - 2,60. MS: m/z = 802 (M+H).

BocNH-P3(f-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(2-propylofenylo))))-P1(1R2S-winyloAcca)-CONHSO₂cyklopropan (40%); ¹H NMR (d₄-CH₃OH, 500 MHz) δ: 7,38 (m, 1H), 7,19-7,10 (m, 3H), 6,67 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 5,77 (m, 1H), 5,39 (s, 1H), 5,31 (d, J = 17,1Hz, 1H), 5,12 (d, J = 10,4 Hz, 1H), 4,40 (szerokie s, 1H), 4,29 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 4,17 (d, J = 11,9 Hz, 1H), 3,98 (m, 1H), 2,91 (m, 1H), 2,58 (m, 2H), 2,38 (szerokie s, 1H), 2,22 (m, 2H), 1,86 (m, 1H), 1,58 (q, J = 7,3 Hz, 2H), 1,42 (s, 10H), 1,23 (m, 2H), 1,06 (m, 2H), 1,03 (s, 9H), 0,93 (t, J = 7,3 Hz, 3H).

LC-MS A: czas retencji - 2,71. MS: m/z = 718 (M+H).

BocNH-P3(^butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(2-fenoksvfenylo))))-P1(1ff,2S-winyloAcca)-CONHSO2

-cyklopropan (39%): ¹H NMR (d4-CH3OH, 500 MHz) δ: 7,95 (szerokie s, 1H), 7,34 (t, J = 8,2 Hz, 2Η), 7,10 (m, 2H), 7,02 (t, J = 7,9 Hz, 1H), 6,96 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 6,83 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 6,62 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 5,78 (m, 1H), 5,35 (s, 1H), 5,25 (d, J = 17,1Hz, 1H), 5,07 (d, J = 10,4 Hz, 1H), 4,38 (t, J = 9,5 Hz, 1H), 4,24 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 4,17 (d, J = 11,9 Hz, 1H), 3,95 (m, 1H), 2,89 (m, 1H), 2,37 (m, 1H), 2,15 (m, 2H), 1,84 (m, 1H), 1,35 (s, 10H), 1,16 (s, 2H), 1,01 (s, 11H).

LC-MS A: czas retencji - 2,80.

MS: m/z = 769 (M+H).

PL 215 228 B1

BocNH-P3(t-butvloGlv)-P2(Hvp(O-CO-(NH-(1,3,5-trimetvlopirazol-4-ilo))))-P1(1R2S-winvloAcca)CONHSO2-cyklopropan ¹H NMR (d4-CH3OH, 500 MHz) δ: 5,83 (m, 1H), 5,36 (s, 1H), 5,27 (d, J = 17,4 Hz, 1H), 5,08 (d, J = 9,8 Hz, 1H), 4,44 (m, 1H), 4,27 (m, 1H), 4,10 (m, 1H), 3,97 (m, 1H), 3,67 (s, 3Η), 2,84 (m, 1H), 2,39 (m, 1H), 2,25 (m, 1H), 2,18 (m, 1H), 2,13 (s, 3Η), 2,07 (s, 3Η), 1,85 (m, 1H), 1,44 (s, 10Η), 1,17 (m, 2Η), 1,03 (m, 11H).

LC-MS A: czas retencji - 2,21.

MS: m/z = 708 (M+H).

Wytwarzanie związku 69 - to jest BocNH-P3(t-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(kwas 2-benzoesowy))))-P1(1R,2S-winyloAcca)-CONHSO2-cyklopropanu na drodze hydrolizy związku 19 to jest BocNH-P3(t-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(2-benzoesan etylu))))-P1(1R,2S-winyloAcca)CONHSO₂-cyklopropanu

Związek 19 - to jest BocNH-P3(t-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(2-benzoesan etylu))))-P1(1R,2S-winyloAcca)-CONHSO₂-cyklopropan (82 mg, 0,11 mmola) rozpuszczono w 600 μΐ THF i 200 μl wody. Dodano LiOH (5,4 mg), po czym mieszaninę reakcyjną mieszano przez 24 godziny, utrzymując w atmosferze azotu. Następnie dodano dodatkową ilość LiOH (3,0 mg). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 5 dni, po czym dodano dodatkową ilość LioH (5,4 mg). Po następnych 24 godzinach, mieszaninę reakcyjną rozcieńczono octanem etylu (25 ml) i przemyto kolejno 1N roztworem HCl (25 ml) i solanką (25 ml). Warstwę organiczną osuszono nad Na2SO4 i zatężono pod próżnią, otrzymując 51 mg BocNH-P3(t-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(kwas 2-benzoesowy))))-P1(1R,2S-winyloAcca)CONHSO2-cyklopropanu w postaci substancji stałej koloru białego.

¹H NMR (d4-CH3OH, 500 MHz) δ: 8,38 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 8,04 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,54 (t, J = 7,3 Hz, 1H), 7,07 (t, J = 7,3 Hz, 1H), 5,76 (m, 1H), 5,41 (s, 1H), 5,30 (d, J = 17,IHz, 1H), 5,12 (d, J = 10,4 Hz, 1H), 4,42 (dd, J = 10,4 Hz, 7,0 Hz, 1H), 4,31 (d, J = 12,2 Hz, 1H), 4,22 (d, J = 10,1Hz, 1H), 3,96 (d, J = 11,0 Hz, 1H), 2,94 (m, 1H), 2,43 (m, 1H), 2,23 (m, 2H), 1,87 (dd, J = 8,2 Hz, 5,5 Hz, 1H), 1,43 (m, 1H), 1,26 (s, 11H), 1,06 (m, 2H), 1,01 (s, 9H).

LC-MS A: czas retencji - 2,61.

MS: m/z = 72 (M+H).

P r z y k ł a d 5

Wytwarzanie reagentów na bazie karbaminianu p-nitrofenylu

Na zamieszczonym poniżej schemacie przedstawiono sposób zastosowany do wytwarzania szeregu karbaminianów p-nitrofenylu, których wzory strukturalne zamieszczono w tabeli 2. Karbaminiany te użyto do syntezy P2-karbaminianów tripeptydu opisanych w przykładzie 6 i szczególnie do wytworzenia związków 70-74.

PL 215 228 B1

Przedstawioną poniżej procedurę ogólną zastosowano do wytworzenia reagentów na bazie karbaminianu p-nitrofenylu, których wzory strukturalne zamieszczono w tabeli 2.

Stanowiącą substrat aminę heterocykliczną (1,34 mmola) rozpuszczono w 10 ml CHCl3. Do tego roztworu dodano roztwór chloromrówczanu p-nitrofenylu (270 mg, 1,34 mmola) rozpuszczonego w 10 ml CHCl3 i następnie dodano pirydynę (108 ml).

Po dwugodzinnym mieszaniu, mieszaninę reakcyjną przefiltrowano i następnie zatężono pod próżnią. Pożądany heterocykliczny karbaminian p-nitrofenylu użyto w następnym etapie bez dodatkowego oczyszczania.

Tabela 2

Reagent na bazie	łfydajność
p-nitrofenylu
K—O	>ΑΪ H	85%
	reagent 70
^s\iA~	OT u H	98%
	reagent 71
/-N \ V		82%
H reagent 72
	>-.xr ’N a	77%
0	reagent 73
fl	kjO'	97%
	s
o	-o reagent 74

PL 215 228 B1

P r z y k ł a d 6

Wytwarzanie P2-karbaminianów tripeptydu, to jest związków 70-74 Zamieszczone w powyższej tabeli 2 karbaminiany p-nitrofenylu (reagenty 70-74), użyto do wytworzenia karbaminianów tripeptydów (związki 70-74) z przykładu 6, postępując zgodnie z ogólną procedurą opisaną poniżej.

Ogólna procedura wytwarzania karbaminianów tripeptydu, związków 70-74, z zastosowaniem reagentów 70-74 zamieszczonych w tabeli 2

Do wstępnie schłodzonego roztworu (2°C) BocNH-P3(t-butyloGly)-P2(Hyp)-P1(1R,2S-winyloAcca)-CONHSO2-cyklopropanu (80 mg, 0,144 mmola) rozpuszczonego w 2,0 ml tetrahydrofuranu dodano wodorek sodu (60%, 17 mg, 0,432 mmola). Do roztworu heterocyklicznego karbaminianu p-nitrofenylu (0,158 mmola, reagent 70-74 z tabeli 2), w 500 μl THF i 200 μΐ DMF (procedura A) lub w 500 ml DMF (procedura B), umieszczonego w oddzielnej kolbie, dodano 60% wodorek sodu (6,5, mg, 0,165 mmola). Ten roztwór mieszano przez 5 minut i następnie wprowadzono za pomocą strzykawki bezpośrednio do wstępnie schłodzonej mieszaniny tripeptydu. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 4 godziny i następnie reakcję zgaszono przy użyciu nasyconego roztworu chlorku amonu (1,0 ml). Następnie, mieszaninę reakcyjną rozcieńczono 50 ml octanu etylu i przemyto 50 ml 1N roztworu HCl, 50 ml 1N roztworu NaHCO3, 50 ml wody i 50 ml solanki. Produkt oczyszczono metodą preparatywnej TLC, eluując mieszaniną octan etylu:heksany w stosunku 2:1. Otrzymano następujące karbaminiany tripeptydu:

PL 215 228 B1

BocNH-P3(t-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(3,4-dimetyloizoksazol-5-ilo))))-P1(1R2SwinyloAcca)-CONHSO2-cyklopropan (69%, procedura A, z zastosowaniem reagenta 70): ¹H NMR (d₄-CH₃OH, 500 MHz) δ: 6,59 (m, 1H, NH), 5,83 (m, 1H), 5,40 (m, 1H), 5,26 (d, 1H, J = 16,8 Hz), 5,09 (m, 1H), 4,40 (m, 1H), 4,26 (m, 1H), 4,18 (d, 1H, J = 11,9 Hz), 3,97 (dd, 1H, J = 12,2, 3,7 Hz), 2,85 (bs, 1H), 2,42 (m, 1H), 2,20 - 2, 30 (m, 2H), 2,18 (s, 3H), 1,87 (s, 3H), 1,86 (m, 2H), 1,42 (s, 9H), 1,39 (m, 2H), 1,15-1,21 (m, 2H), 1,03 (s, 9H).

LC-MS C: czas retencji - 2,27.

MS: m/z = 695 (M+H).

BocNH-P3(f-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-4-(tiofeno-3-karboksylan-metylu))))-P1(1R2SwinyloAcca)-CONHSO2-cykIopropan (21%, procedura B, z zastosowaniem reagenta 71): ¹H NMR (d₄-CH₃OH, 300 MHz) δ: 8,21 (d, 1H, J = 3,7 Hz), 7,62 (bs, 1H), 6,65 (d, 1H, NH, J = 8,8 Hz), 5,81 (m, 1H), 5,40 (bs, 1H), 5,27 (d, 1H, J = 17,2 Hz), 5,09 (d, 1H, J = 10,9 Hz), 4,45 (m, 1H), 4,30 (m, 1H), 4,22 (m, 1H), 3,95 (m, 1H), 3,86 (s, 3H), 2,87 (m, 1H), 2,46 (m, 1H), 2,21 (m, 2H), 1,87 (m, 1H), 1,30 (s, 9H), 1,26 - 1,36 (m, 2H), 1,15 1,22 (m, 2H), 1,02 (s, 9H).

LC-MS C: czas retencji - 2,62.

MS: m/z = 740 (M+H).

BocNH-P3((-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-2-(nikotynian etylu))))-P1 (1 R,2S-winyloAcca)-CONHSO2-cyklopropan (13%, procedura A, z zastosowaniem reagenta 72): ¹H NMR (d₄-CH₃OH, 500 MHz) δ: 8,48 (m, 1H), 8,38 (m, 1H), 7,18 (m, 1H), 5,83 (m, 1H), 5,44 (m, 1H), 5,27 (d, 1H, J = 17,1 Hz), 5,08 (m, 1H), 4,45 (m, 1H), 4,38 (q, 2H, J = 7,0 Hz), 4,30 (m, 1H), 4,23 (m, 1H), 3,98 (m, 1H), 2,85 (m, 1H), 2,47 (m, 1H), 2,15 - 2,28 (m, 2H), 2,01 (m, 1H), 1,85 (m, 1H), 1,44 (m, 2H), 1,39 (t, 3H, J = 7,0 Hz), 1,32 (s, 9H), 1,18 (m, 2H), 1,03 (s, 9H).

LC-MS C: czas retencji - 2,38.

MS: m/z = 749 (M+H).

PL 215 228 B1

Związek 73

BocNH-P3(FbutyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(5-metylo-2-fenylo-4H-pirazol-3-ilo))))-P1(1ff,2SwinyloAcca)-CONHSO?-cyklopropan (4,2%, procedura A, z zastosowaniem reagenta 73): ¹H NMR (d₄-CH₃OH, 300 MHz) δ: 7,48 (m, 5H), 6,67 (d, 1H, J = 10,3 Hz), 6,21 (bs, 1H), 5,76 (m, 1H), 5,31 (d, 1H, J =17,2 Hz), 5,30 (m, 1H), 5,13 (dd, 1H, J = 10,3, 1,5 Hz), 4,19 - 4,31 (m, 2H), 4,05 (m, 1H), 3,89 - 3,94 (m, 1H), 2,93 (m, 1H), 2,26 (s, 3H), 2,18 - 2,28 (m, 2H), 1,86 (m, 1H), 1,42 (s, 9H), 1,37 - 1,44 (m, 2H), 1,23 - 1,29 (m, 2H), 1,04 - 1,10 (m, 2H), 1,00 (s, 9H).

LC-MS C: czas retencji - 2,40.

MS: m/z = 756 (M+H).

BocNH-P3(hbutyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(2-benzofenono))))-P1(1ff,2S-winyloAcca)-CONHSO₂ cyklopropan (37%, z zastosowaniem reagenta 74): ¹H NMR (d₄-CH₃OH, 300 MHz) δ: 8,13 (d, 1H, J = 8,05 Hz, 7,48-7,69 (m, 7H), 7,15 (t, 1H, J = 7,3 Hz), 6.66 (d, 1H, J = 9,2 Hz), 5,80 (m, 1H), 5,34 (m, 1H), 5,26 (d, 1H, J =17,2 Hz), 5,08 (d, 1H, J = 10,6 Hz), 4,40 (m, 1H), 4,21 (m, 2H), 3,94 (dd, 1H, J = 11,7, 3,3 Hz), 2,86 (bs, 1H), 2,37 (m, 1H), 2,19 (m, 2H), 1,86 (m, 1H), 1,37-1,44 (m, 2H), 1,30 (s, 9H), 1,18 (m, 2H), 1,01 (s, 9H), 0,94 -1.02 (m, 1H).

LC-MS C: czas retencji - 2,76.

MS: m/z = 780 (M+H).

P r z y k ł a d 7

Wytwarzanie BocNH-P3(t-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-O-sukcynimidylo))-P1(1R,2S-winyloAcca)CONHSO2-cyklopropan do użycia jako półprodukt w syntezie P2-karbaminianów tripeptydu opisanej w przykładzie 8

PL 215 228 B1

Węglan P2-sukcynimidylu - półprodukt do syntezy karbaminianów tripeptydu opisanej w przykładzie 8

BocNH-P3(f-butyloGly)-P2(Hyp)-P1 (1 R,2S-winyloAcca)-CONHSO₂-cyklopropan (400 mg, 0,710 mmola, 1,0 równoważnika) rozpuszczono w tetrahydrofuranie (10 ml). Następnie, do utworzonej zawiesiny dodano 90% węglan N,N'-disukcynimidylu 404 mg, 1,42 mmola, 2,0 równoważniki). Do dokładnie wymieszanej zawiesiny dodano 60% NaH (88 mg, 2,20 mmole, 3,1 równoważnika), po czym mieszaninę reakcyjną utrzymywano przez 4 godziny w stanie wrzenia pod chłodnicą zwrotną. Następnie, mieszaninę reakcyjną rozcieńczono octanem etylu (125 ml) i przemyto 1N roztworem HCl (125 ml) oraz solanką (125 ml). Warstwę organiczną osuszono nad siarczanem sodu, przefiltrowano i usunięto rozpuszczalnik pod próżnią, otrzymując produkt wymieniony w tytule w postaci piany koloru kremowego, który użyto bez oczyszczania. Wydajność surowego produktu - 100%.

LC-MS C: czas retencji - 2,01.

MS: m/z = 691 (M+H)⁺.

P r z y k ł a d 8

Wytwarzanie P2-karbaminianów tripeptydu to jest związków BocNH-P3(t-butyloGly)P2(Hyp(O-CO-(NHR)-P1(1R,2S-winyloAcca)-CONHSO2-cyklopropanu (związki 75-86), z użyciem węglanów P2-sukcynimidylu opisanych w przykładzie 7

Produkt z przykładu 7, to jest BocNH-P3(t-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-O-sukcynimidylo))P1(1R-2S-winyloAcca)-CONHSO2-cyklopropan (czystość oznaczona ilościowo - 90%, 145 mg, 0,188 mmola, 1,0 równoważnika), rozpuszczono w dichlorometanie (2,0 ml) i następnie dodano aminę, taka jak na przykład 2-aminopirydyna (35,4 mg, 0,376 mmola, 2,0 równoważniki). Rurkę ciśnieniową szczelnie zamknięto i ogrzewano przez 3 dni w temperaturze 50°C. Należy odnotować, że opisaną powyżej 2-aminopirydynę użyto do wytworzenia związku 75 z przykładu 8. W przypadku wytwarzania związków 76-86 z przykładu 8, zamiast 2-aminopirydyny zastosowano inną, wymaganą aminę. Surową substancję oczyszczono z zastosowaniem jednej z dwóch metod przedstawionych poniżej.

Metoda A:

Surową substancję wprowadzono bezpośrednio na płytkę preparatywnej TLC (Analtech SiO2, 1000μns) i eluowano w mieszaninie heksany:octan etylu, w stosunku 1:2. Zadsorbowaną na SiO₂substancję zeskrobano z płytki i mieszano przez 1 godzinę z 20% metanolu w octanie etylu. Krzemionkę odfiltrowano i otrzymaną ciecz zatężono pod próżnią, otrzymując produkt.

Metoda B:

Surową mieszaninę reakcyjną zatężono pod próżnią, po czym pozostałość rozpuszczono w metanolu (2,0 ml) i następnie przepuszczono przez filtr strzykawkowy z PTFE 0,2 nm. Następnie, roztwór ten wstrzyknięto bezpośrednio do preparatywnego urządzenia HPLC o następujących parametrach:

- kolumna: XTerra Prep MS C18 (19,0 x 100,0 mm);

- gradient: od 50% rozpuszczalnika A/50% rozpuszczalnika B do 0% rozpuszczalnika A/100% rozpuszczalnika B;

- czas gradientu: 15 minut;

- czas retencji substancji niezatrzymywanej: 1 min

- objętościowe natężenie przepływu: 25 ml/min;

- długość fali detektora: 220 nm;

rozpuszczalniki:

rozpuszczalnik A: 10% metanolu /90% wody /10 nM octanu amonu, rozpuszczalnik B: 90% metanolu/10% wody/10 nM octanu amonu.

Po zakończeniu elucji, frakcje zatężono w celu usunięcia metanolu i następnie wlano do równych objętości wody i octanu 5 etylu. Warstwę organiczną osuszono nad siarczanem sodu i zatężono pod próżnią, otrzymując produkty oczyszczone.

PL 215 228 B1

BocNH-P3(FbutyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(pirydyn-2-ylo))))-P1(1ff,2S-winyloAcca)-CONHSO₂cyklopropan (oczyszczony metodą A, 8%) ¹H NMR (d4-CHsOH, 300 MHz) δ: 8,20 (d, 1H, J = 4,0 Hz), 7,88 (d aproks., 1H), 7,74 (t, 1H, J = 6, 9 Hz), 7,04 (t, 1H, J = 6,0 Hz), 6,64 (d, 1H, NH, J = 8,8 Hz), 5,78 (m, 1H), 5,43 (m, 1H), 5,27 (d, 1H, J = 17,2 Hz), 5,09 (d, 1H, J = 10,2 Hz), 4,42 (t, 1H), 4,25 (m, 2H), 3,99 (dd, 1H ), 2,90 (m, 1H), 2,44 (m, 1H), 2,20 (m, 2H), 1,86 (m, 1H), 1,30 - 1,43 (m, 3H), 1,30 (s, 9H), 1,19 (m, 2H), 1,02 (s, 9H), 1,61 1,82 (m, 1H).

LC-MS F: czas retencji - 2,66.

MS: m/z = 677 (M+H).

Związek 76

BocNH-P3(FbutyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-2-(1-(4-acetylofenylo))piperydyno-4-karboksylanetylu)))-P1 (1 ff,2S-winyloAcca)-CONHSO₂-cyklopropan (oczyszczony metodą B, 32%) ¹H NMR (d₄-CH₃OH, 500 MHz) δ: 8,47 (s, 1H), 7,73 (d, 1H, J = 8,2 Hz), 7,20 (d, 1H, J = 8,6 Hz),

6,62 (d, 1H, NH, J = 9,2 Hz), 5,77 (m, 1H), 5,44 (m, 1H), 5,31 (d, 1H, J = 17,1 Hz), 5,13 (dd, 1H, J = 10,4, 1,5 Hz), 4,45 (m, 1H), 4,26 (m, 2H), 4,18 (q, 2H, J = 7,0 Hz), 4,01 - 4,14 (m, 2H), 3,12 (m, 2H), 2,94 (m, 1H), 2,80 (t, 1H, J = 11,4 Hz), 2,72 (t, 1H, J = 11,9 Hz), 2,56 (s, 3H), 2,43 - 2,53 (m, 2H), 2,18 2,28 (m, 2H), 2,01 - 2,04 (m, 3H), 1,79 - 1, 91 (m, 3H), 1,44 (m, 2H), 1,32 (s, 9H), 1,21 - 1,29 (m, 2H), 1,07 (m, 1H), 1,03 (s, 9H).

LC-MS C: czas retencji - 2,71.

MS: m/z = : 873 (M+H)

PL 215 228 B1

BocNH-P3(f-butvloGlv)-P2(Hvp(O-CO-(NH-cvkloheksvlo)))-P1(1ff,2S-winvloAcca)-CONHSO2cyklopropan (izomer A, oczyszczony metodą B, 23%) ¹H NMR (d4-CH3OH, 500 MHz) δ: 7,43 (m, 3H), 7,33 (m, 3Η), 7,21 (t, J = 8,9 Hz), 5,78 (m, 1H),

5,25 - 5,30 (m, 2Η), 5,09 (dd, 1H, J = 10,5,1,7 Hz), 4,56 (m, 1H), 4,32 (m, 1H), 4,24 (m, 1H), 4,12 (m, 1H), 3,94 (m, 1H), 2,89 (m, 1H), 2,29 (m, 1H), 2,16 (m, 2H), 1,95 (d, 1H, J = 12,8 Hz), 1,84 (m, 1H),

I, 37 (s, 9H), 1,19 (m, 2H), 1,00 (s, 9H), 0,96 - 1,04 (m, 2H).

LC-MS C: czas retencji - 2,70.

MS: m/z = 795 (M+H).

BocNH-P3(f-butvloGlv)-P2(Hyp(O-CO-(NH-2-(oksvm benzofenonu)))-P1 (1 ,2S-winvloAcca)CONHSO2-cvklopropan (izomer B, oczyszczony metodą B, 19%) ¹H NMR (d4-CH3OH, 500 MHz) δ: 8,13 (s, 1H, OH), 7,43 (m, 3H), 7,29 (m, 3H), 6,94 (m, 2H),

6,67 (d, 1H, NH, J = 9,2 Hz), 5,78 (m, 1H), 5,41 (m, 1H), 5,28 (d, 1H, J = 17,1 Hz), 5,10 (d, 1H, J =

II, 6 Hz), 4,57 (m, 1H), 4,38 (m, 1H), 4,26 (m, 1H), 4,17 (d aproks., 1H), 3,99 - 4,05 (m, 1H), 2,92 (m, 1H), 2,37 (dd, 1H, J = 14,0, 7,0 Hz), 2,20 (m, 2H), 1,95 (d, 1H, J = 16,8 Hz), 1,87 (m, 1H), 1,40 - 1,44 (m, 2H), 1,36 (s, 9H), 1,20 - 1,25 (m, 2H), 1,03 (s, 9H).

LC-MS C: czas retencji - 2,83.

MS: m/z = 795 (M+H).

BocNH-P3(f-butvloGlv)-P2(Hyp(O-CO-(NH-1-(4-chloro-2-(5-metvlo-2H-pirazol-3-vlo)fenvlo))))P1 (1 ff,2S-winvloAcca)-CONHSO2-cvklopropan (oczyszczony metodą B, 11%) ¹H NMR (d4-CH3OH, 500 MHz) δ: 8,23 (m, 1H), 7,62 (s, 1H), 7,23 (dd, 1H, J = 8,5, 2,4 Hz), 6,62 (d, 1H, NH, J = 7,6 Hz, 6,46 (s, 1H), 5,78 (m, 1H), 5,42 (m, 1H), 5,27 (d, 1H), 5,10 (d, 1H), 4,56 (m,

PL 215 228 B1

1H), 4,42 (m, 1H), 4,24 (m, 2H), 4,04 (dd, 1H, J = 12,0, 3,2 Hz), 2,92 (m, 1H), 2,40 (m, 1H), 2,35 (s, 3H), 2,15-2,27 (m, 2H), 1,86 (dd, 1H, J = 7,9, 5,5 Hz), 1,42 (m, 2H), 1,26 (s, 9H), 1,21 (m, 2H), 1,02 (s, 9H).

LC-MS G: czas retencji - 3,06.

MS: m/z = 790 (M+H).

BocNH-P3(FbutyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(2-acetofenono))))-P1(1R,2S-winyloAcca)-CONHSO₂

-cyklopropan (oczyszczony metodą B, 14%) ¹H NMR (d₄-CH₃OH, 500 MHz) δ: 8,40 (d, 1H, J = 8,6 Hz), 8,02 (d, 1H, J = 7,9), 7,56 (t, 1H, J = 8,6), 7,17 (t, 1H, J = 7,5 Hz), 6,62 (d, 1H, NH, J = 9,5 Hz), 5,78 (m, 1H), 5,39 (s, 1H), 5,28 (d, 1H, J = 17,1 Hz), 5,10 (d, 1H, J = 10,4, 1,8 Hz), 4,45 (m, 1H), 4,31 (d, 1H, J = 4,9 Hz), 4,24 (d, 1H, J = 4,3 Hz), 4,05 (m, 1H), 3,97 (m, 1H), 2,91 (m, 1H), 2,63 (s, 3H), 2,45 (dd, 1H, J = 13,7, 7,0 Hz), 2,17 - 2,28 (m, 2H), 1,87 (m, 1H), 1,38 - 1,45 (m, 2H), 1,28 (s, 9H), 1,17 - 1,25 (m, 2H), 1,02 (s, 9H).

LC-MS C: czas retencji - 2,62.

MS: m/z = 718 (M+H).

Związek 80

BocNH-P3(FbutyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-1-(2-piperydyno-5-acetylofenylo))))-P1 (1 R,2SwinyloAcca)-CONHSO2-cyklopropan (oczyszczony metodą B, 18%) ¹H NMR (d₄-CH₃OH, 500 MHz) δ: 8,51 (bs, 1H), 7,70 (d, 1H, J = 8,2 Hz), 7,18 (d, 1H, J = 8,6

Hz), 5,85 (m, 1H), 5,42 (s, 1H), 5,23 (d, 1H, J = 17,1 Hz), 5,05 (d, 1H, J = 10,4 Hz), 4,48 (m, 1H), 4,45 (m, 2H), 4,01 - 4,12 (m, 2H), 2,80 - 2,92 (m, 4H), 2,55 (s, 3H), 2,50 (m, 1H), 2,35 (m, 1H), 2,14 (m, 1H), 1,85 (m, 1H), 1,74 (m, 5H), 1,62 (m, 2H), 1,32 (s, 9H), 1,13 (m, 2H), 1,02 (s, 9H), 0,95 (m, 2H).

LC-MS C: czas retencji - 2,75.

MS: m/z = 801 (M+H).

PL 215 228 B1

BocNH-P3(hbutyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-2-[(5-metylofuran-2-ylo)fenylo))))-P1(1ff,2SwinyloAcca)-CONHSO?-cyklopropan (oczyszczony metodą B, 5%) ¹H NMR (d₄-CH₃OH, 500 MHz) δ: 7,63 (d, 2H, J = 7,9 Hz), 7,24 (t, 1H, J = 7,6), 7,19 (t, 1H, J =

7,2 Hz), 8,58 (d, 1H, J = 3,0 Hz), 6,14 (d, 1H, J = 3,0 Hz), 5,83 (m, 1H), 5,37 (m, 1H), 5,25 (m, 1H), 5,07 (m, 1H), 4,41 (m, 1H), 4,26 (m, 1H), 4,19 (m, 1H), 3,98 (m, 1H), 2,87 (m, 1H), 2,36 (s, 3H), 2,15 (m, 1H), 1,84 (m, 1H), 1,37 (s, 9H), 1,29 (m, 2H), 1,16 (m, 2H), 1,03 (s, 9H), 0,90 - 0,97 (m, 3H).

LC-MS C: czas retencji - 2,81.

MS: m/z = 756 (M+H).

BocNH-P3(FbutyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-2-(morfolin-4-ylo-fenylo))))-P1(1ff,2S-winyloAcca)CONHSO?-cyklopropan (oczyszczony metodą B, 22%) ¹H NMR (d4-CH₃OH, 300 MHz) δ: 7,89 (bs, 1H), 7,20 (d, 1H, J = 7,7 Hz), 7,03 - 7,13 (m, 1H),

6,71 (d, 1H, J = 9,9 Hz), 5,76 (m, 1H), 5,41 (m, 1H), 5,31 (d, 1H, J = 17,2 Hz), 5,13 (d, 1H, J = 10,3 Hz), 4,41 (m, 1H), 4,25 (m, 2H), 3,99 (m, 1H), 3,83 (m, 4H), 2,95 (m, 1H), 2,83 (m, 4H), 2,41 (m, 1H), 2,15 - 2,29 (m, 2H), 1,89 (m, 1H), 1,44 (m, 1H), 1,36 (s, 9H), 1,24 (m, 2H), 1,07 (m, 2H), 1,03 (m, 9H).

LC-MS A: czas retencji - 2,71.

MS: m/z = 761 (M+H).

PL 215 228 B1

BocNH-P3((-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(5-metylo-2-pirol-1-ilofenylo))))-P1 (1 R,2SwinyloAcca)-CONHSO2-cyklopropan (oczyszczony metodą B, 18%) ¹H NMR (d4-CH3OH, 300 MHz) δ: 7,59 (bs, 1H), 7,16 (d, 1H, J = 8,05 Hz), 7,06 (dd, 1H, J =

8,05, 1,1 Hz), 6,80 (m, 2H), 6,67 (d, 1H, J = 9,5 Hz), 6,26 (m, 2H), 5,77 (m, 1H), 5,28 - 5,34 (m, 2H), 5,12 (m, 1H), 4,23 - 4,32 (m, 2H), 4,10 (m, 1H), 3,92 (m, 1H), 2,93 (m, 1H), 2,37 (s, 3H), 2,23 (m, 2H), 2,10 (m, 1H), 1,87 (m, 1H), 1,40 (s, 9H), 1,21 - 1,31 (m, 3H), 1,04 - 1,10 (m, 2H), 1,01 (s, 9H).

LC-MS C: czas retencji - 2,84.

MS: m/z = 755 (M+H).

BocNH-P3(f-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(2-pirolidyn-1-ylo-5-trifluorometylofenylo))))P1 (1 R,2S-winyloAcca)-CONHSO2-cyklopropan (oczyszczony metodą A, 23%) ¹H NMR (d4-CH3OH, 500 MHz) δ: 7,59 (bs, 1H), 7,30 (m, 1H), 6,93 (m, 1H), 5,86 (m, 1H), 5,39 (m, 1H), 5,23 (m, 1H), 5,04 (m, 1H), 4,45 (m, 1H), 4,11 - 4,29 (m, 2H), 4,01 (m, 1H), 2,66 - 2,87 (m, 1H), 2,29-2,58 (m, 2H), 2,12 (m, 1H), 1,95 (m, 5H), 1,83 (m, 1H), 1,38 - 1,44 (m, 2H), 1,39 (s, 9H), 1,12 (m, 2H), 1,02 (s, 9H), 0,86 - 1,07 (m, 4H).

LC-MS C: czas retencji - 2,86.

MS: m/z = 813 (M+H).

BocNH-P3(f-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(2-pirolidyn-1-ylo-5-trifluorometylofenylo))))P1 (1 R,2S-winyloAcca)-CONHSO2-cyklopropan (oczyszczony metodą A, 25%) ¹H NMR (d₄-CH₃OH, 500 MHz) δ: 7,52 (d, 1H, J = 8,2 Hz), 7,46 (d, 1H, J = 8,2 Hz), 6,92 (s, 2H),

6.34 (s, 2H), 5,84 (m, 1H), 5,30 (m, 1H), 5,19 (m, 1H), 5,00 (m, 1H), 4,37 (m, 1H), 4,20 (m, 2H), 4,04 4,11 (m, 1H), 3,98 (m, 1H), 3,89 (m, 1H), 2,82 (m, 1H), 2, 30 - 2,36 (m, 2H),1,80 (m, 1H), 1,44 (m, 2H),

1.35 (s, 9H), 1,28 (m, 2H), 1,01 (s, 9H), 0,81 - 0,93 (m, 1H).

LC-MS C: czas retencji - 2,87.

MS: m/z = 809 (M+H).

PL 215 228 B1

BocNH-P3(FbutyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(2-pirol-1-ilofenylo))))-P1 (1 ff ,2S-winyloAcca)CONHSO₂-cyklopropan (oczyszczony metodą A, 41%) ¹H NMR (d₄-CH₃OH, 300 MHz) δ: 7,76 (bs, 1H), 7,21 - 7,37 (m, 4H), 6,84 (s, 2H), 6,56 (d, 1H,

J = 8,4 Hz), 6,28 (m, 2H), 5,86 (m, 1H), 5,25 (m, 1H), 5,18 (bs, 1H), 5,03 (d, 1H, J = 10,6 Hz), 4,35 (m, 1H), 4,22 (, 1H), 4,08 (m, 1H), 3,86 - 3,96 (m, 1H), 2,79 (m, 1H), 2,25 - 2,36 (m, 2H), 2,08 (m, 1H), 1,82 (m, 1H), 1,39 (s, 9H), 1,28 - 1,35 (m, 1H), 1,10 (m, 1H), 1,01 (s, 9H), 0,91 (m, 1H).

LC-MS F: czas retencji - 3,36.

MS: m/z = 741 (M+H).

/

O

Związek 87

BocNH-P3(FbutyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(2-(5,6-dimetoksybenzotriazol-2-ilo)fenylo))))P1 (1 ff,2S-winyloAcca)-CONHSO₂-cyklopropan (oczyszczony metodą A, 29%) ¹H NMR (CH₃OH) δ: 8,30 (d, J = 7,0 Hz, 1H), 8,07 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,42 (m, 1H), 7,22 (m, 3H), 6,58 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 5,76 (m, 1H), 5,40 (s, 1H), 5,28 (dd, J = 1,5 Hz, 17,2 Hz, 1H), 5,10 (dd, J = 1,8 Hz, 10,3 Hz, 1H), 4,44 (dd, J = 7,0 Hz, 9,9 Hz, 1H), 4,25 (m, 2H), 3,97 (m, 7H), 2,92 (m, 1H), 2,43 (m, 1H), 2,20 (m, 2H), 1,87 (dd, J = 5,5 Hz, 8,1 Hz, 1H), 1,43 (m, 1H), 1,19 (m, 11H), 1,01 (m, 11H).

LC-MS A: czas retencji - 2,71.

MS: m/z = 853 (M+H).

PL 215 228 B1

BocNH-P3(f-butvloGlv)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(2-(4H-[1,2,4]triazol-3-ilo)fenvlo))))-P1 (1 R,2SwinvloAcca)-CONHSO2-cvklopropan (oczyszczony metodą B, 31%) ¹H NMR (CH3OH) δ: 8,56 (szerokie s, 1H), 8,34 (brs, 1H), 8,15 (szerokie s, 1H), 7,39 (szerokie s, 1H), 7,13 (s, 1H), 6,65 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 5,76 (m, 1H), 5,43 (s, 1H), 5,31 (dd, J = 1,2 Hz, 17,1 Hz 1H), 5,13 (dd, J = 1,5 Hz, 10,4 Hz, 1H), 4,44 (dd, J = 13 Hz, 10,1 Hz, 1H), 4,30 (d, J = 11,3 Hz, 1H), 4,25 (m, 1H), 3,99 (m, 1H), 2,94 (m, 1H), 2,43 (q, J = 6,4 Hz, 1H) 2,22 (m, 2H), 1,88 (dd, J = 5,5 Hz, 8,2 Hz, 1H), 1,43 (m, 1H), 1,24 (m, 11H), 1,08 (m, 2H), 1,02 (s, 9H).

LC-MS C: czas retencji - 2,45.

MS: m/z = 743 (M+H).

Związek 89

BocNH-P3(f-butvloGlv)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(2-pirazol-1-ilo-fenvlo))))-P1 (1 ff,2S-winvloAcca)CONHSO2-cvklopropan (oczyszczony metodą B, 53%) ¹H NMR (CH3OH) δ: 8,08 (szerokie s, 1H), 8,03 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 7,76 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 7,45 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 7,37 (t, J = 8,6 Hz, 1H), 7,21 (t, J = 7,9 Hz, 1H), 6,60 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 6,54 (t, J = 2,1 Hz, 1H), 5,76 (m, 1H), 5,35 (s, 1H), 5,30 (dd, J = 1,5 Hz, 17,1 Hz, 1H), 5,12 (d, J = 10,1 Hz, 1H), 4,36 (m, 1H), 4,24 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 4,19 (d, J = 11,9 Hz, 1H), 3,95 (dd, J = 2,8 Hz, 11,6 Hz, 1H), 2,93 (m, 1H), 2,36 (m, 1H), 2,22 (q, J = 8,9 Hz, 1H), 2,16 (m, 1H), 1,87 (m, 1H), 1,44 (m, 1H), 1,34 (s, 9H), 1,23 (m, 2H), 1,06 (m, 2H), 1,01 (s, 9H).

LC-MS C: czas retencji - 2,44.

MS: m/z = 742 (M+H).

PL 215 228 B1

BocNH-P3(FbutyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(2-piperydyn-1-ylofenylo))))-P1 (1 R,2S-winyloAcca)CONHSO2-cyklopropan (oczyszczony metodą B, 49%) ¹H NMR (CH3OH) δ: 7,91 (szerokie s, 1H), 7,16 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,07 (t, J = 7,6 Hz, 1H), 7,01 (t, J = 7,6 Hz, 1H), 6,61 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 5,76 (m, 1H), 5,41 (s, 1H), 5,30 (dd, J = 1,5 Hz, 17,1 Hz, 1H), 5,12 (dd, J = 1,5 Hz, 10,4 Hz, 1H), 4,42 (m, 1H), 4,25 (m, 2H), 3,99 (dd, J = 3,4 Hz, 11,9 Hz, 1H), 2,93 (m, 1H), 2,76 (m, 4H), 2,44 (m, 1H), 2,23 (m, 2H), 1,87 (dd, J = 5,5 Hz, 8,2 Hz, 1H), 1,72 (m, 4H), 1,59 (m, 2H), 1,43 (m, 1H), 1,34 (s, 9H), 1,24 (m, 2H), 1,07 (m, 2H), 1,03 (s, 9H).

LC-MS A: czas retencji - 2,37.

MS: m/z = 759 (M+H).

BocNH-P3(FbutyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(5-karboksyetylo-2-piperydyn-1-ylofenylo))))P1 (1 R,2S-winyloAcca)-CONHSO2-cyklopropan (oczyszczony metodą B, 43%) ¹H NMR (CH3OH) δ: 8,53 (s, 1H), 7,71 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 7,18 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 6,58 (d, J =

8,9 Hz, 1H), 5,77 (m, 1H), 5,43 (s, 1H), 5,30 (d, J = 17,4 Hz, 1H), 5,12 (dd, J = 1,8 Hz, 10,4 Hz, 1H), 4,43 (m, 1H), 4,34 (dd, J = 7,0 Hz, 14,3 Hz, 2H), 4,25 (m, 2H), 4,00 (m, 1H), 2,93 (m, 1H), 2,84 (m, 4H), 2,45 (dd, J = 7,0 Hz, 13,7 Hz, 1H), 2,23 (m, 2H), 1,87 (dd, J = 5,5 Hz, 8,2 Hz, 1H), 1,73 (m, 4H), 1,62 (m, 2H), 1,44 (m, 1H), 1,37 (m, 3H), 1,33 (s, 9H), 1,24 (m, 2H), 1,07 (m, 2H), 1,03 (s, 9H).

LC-MS C: czas retencji - 2,81.

MS: m/z = 831 (M+H).

Związek 92

BocNH-P3(f-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(5-trifluorometylo-2-(4-trifluorometylopiperydyn-1ylo)fenylo))))-P1 (1 R,2S-winyloAcca)-CONHSO2-cyklopropan (oczyszczony metodą B, 8%) ¹H NMR (CH3OH) δ: 8,28 (s, 1H), 7,32 (s, 2H), 6,57 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 5,79 (m, 1H), 5,42 (s,

1H), 5,27 (dd, J = 1,2 Hz, 17,4 Hz, 1H), 5,07 (d, J = 10,1 Hz, 1H), 4,45 (dd, J = 7,6 Hz, 9,8 Hz, 1H), 4,30 (d, J = 12,2 Hz, 1H), 4,25 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 4,03 (m, 1H), 3,13 (t, J = 15,0 Hz, 2H), 2,90 (m, 1H), 2,80 (m, 1H), 2,70 (t, J = 11,3 Hz, 1H), 2,47 (dd, J = 7,3 Hz, 14,0 Hz, 1H), 2,31 (m, 2H), 2,16 (dd,

PL 215 228 B1

J = 8,9 Hz, 17,7 Hz, 1H), 2,00 (s, 1H), 1,98 (s, 1H), 1,85 (dd, J = 5,2 Hz, 7,2 Hz, 1H), 1,79 (m, 2H), 1,39 (m, 1H), 1,31 (s, 9H), 1,18 (m, 2H), 1,03 (s, 9H), 1,00 (m, 2H).

LC-MS A: czas retencji - 2,89.

MS: m/z = 895 (M+H).

BocNH-P3(f-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(2-[1,2,3]triazol-2-ilofenylo))))-P1(1ff,2S-winyloAcca)CONHSO₂-cyklopropan (oczyszczony metodą B, 42%) ¹H NMR (CH₃OH) δ: 8,24 (szerokie s, 1H), 7,99 (s, 2H), 7,94 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 7,40 (t, J = 7,6

Hz, 1H), 7,23 (t, J = 7,6 xHz, 1H), 6,61 (d, J = 8,9, 1H), 5,76 (m, 1H), 5,39 (s, 1H), 5,31 (d, J = 17,1 Hz, 1H), 5,13 (d, J = 10,4 Hz, 1H), 4,41 (m, 1H), 4,25 (m, 2H), 3,96 (dd, J = 2,8 Hz, 11,6 Hz, 1H), 2,94 (m, 1H), 2,39 (m, 1H), 2,24 (q, J = 8,9 Hz, 1H), 2,15 (m, 1H), 1,87 (m, 1H), 1,44 (m, 1H), 1,29 (s, 9H), 1,24 (m, 2H), 1,07 (m, 2H), 1,02 (s, 9H).

LC-MS C: czas retencji - 2,52.

MS: m/z = 765 (M+H).

Związek §4

BocNH-P3(f-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(5-metylo-2-tiazol-2-ilofenylo))))-P1(1ff,2SwinyloAcca)-CONHSO₂-cyklopropan (oczyszczony metodą B, 76%) ¹H NMR (CH₃OH) δ: 8,22 (s, 1H), 7,83 (s, 1H), 7,70 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,55 (s, 1H), 6,94 (d, J =

7,6 Hz 1H), 6,58 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 5,77 (m, 1H), 5,40 (s, 1H), 5,29 (d, J = 17,4 Hz, 1H), 5,11 (d, J = 10,4 Hz, 1H), 4,46 (m, 1H), 4,32 (d, J = 11,3 Hz, 1H), 4,25 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 4,00 (d, J = 10,7 Hz, 1H), 2,93 (m, 1H), 2,44 (m, 1H), 2,37 (s, 3H), 2,23 (m, 2H), 1,87 (dd, J = 5,5 Hz, 7,6 Hz, 1H), 1,44 (m, 1H), 1,23 (s, 11H), 1,02 (s, 11H).

LC-MS A: czas retencji - 2,75.

MS: m/z = 773 (M+H).

PL 215 228 B1

BocNH-P3(f-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(5-metoksy-2-pirazol-1-ilofenylo))))-P1(1R,2SwinyloAcca)-CONHSO?-cyklopropan (oczyszczony metodą B, 22%) ¹H NMR (CH3OH) δ: 7,92 (s, 1H), 7,72 (s, 2H), 7,33 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 6,76 (d, J = 7,9 Hz, 1H),

6,62 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 6,51 (s, 1H), 5,76 (m, 1H), 5,35 (s, 1H), 5,31 (d, J = 17,4 Hz, 1H), 5,12 (d, J = 10,4

Hz, 1H), 4,35 (m, 1H), 4,23 (m, 2H), 3,96 (m, 1H), 3,84 (s, 3H), 2,93 (m, 1H), 2,36 (m, 1H), 2,24 (m, 1H),

2,15 (m, 1H), 1,86 (m, 1H), 1,44 (m, 1H), 1,35 (s, 9H), LC-MS C: czas retencji - 2,43.

MS: m/z = 772 (M+H).

1,24 (m, 2H), 1,07 (d, J = 7,3 Hz, 2H), 1,01 (s, 9H).

BocNH-P3(f-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(5-metylo-2-pirazol-1-ilofenylo)))-P1(1R,2SwinyloAcca)-CONHSO?-cyklopropan (oczyszczony metodą B, 13%) ¹H NMR (CH3OH) δ: 7,97 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 7,91 (szerokie s, 1H), 7,74 (d, J = 1,5 Hz, 1H),

7,31 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 7,03 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 6,60 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 6,51 (t, J = 2,1 Hz, 1H), 5,77 (m, 1H), 5,33 (s, 1H), 5,29 (dd, J = 1,5Hz, 17,1 Hz, 1H), 5,11 (dd, J = 1,5 Hz, 10,4 Hz, 1H), 4,36 (dd, J = 7,6 Hz, 9,8 Hz, 1H), 4,24 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 4,20 (d, J = 12,2 Hz, 1H), 3,95 (dd, = 3,1 Hz, 11,6 Hz, 1H), 2,92 (m, 1H), 2,38 (s, 3H), 2,35 (m, 1H), 2,20 (m, 2H), 1,86 (dd, J = 5,5 Hz, 7,9 Hz, 1H), 1,44 (m, 1H), 1,34 (s, 9H), 1,22 (m, 2H), 1,06 (m, 2H), 1,02 (s, 9H).

LC-MS A: czas retencji - 2,49.

MS: m/z = 756 (M+H).

Związek 97

PL 215 228 B1

BocNH-P3(t-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(5-metylo-2-[1,2,31triazol-2-ilofenylo))))-P1 (1 R,2SwinyloAcca)-CONHSO₂-cyklopropan (oczyszczony metodą B, 50%) ¹H NMR (CH3OH) δ: 8,05 (szerokie s, 1H), 7,96 (s, 2H), 7,80 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 7,05 (d, J = 8,2

Hz, 1H), 6,60 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 5,76 (m, 1H), 5,37 (s, 1H), 5,30 (dd, J = 1,5 Hz, 17,1 Hz, 1H), 5,12 (dd, J = 1,5 Hz, 10,1 Hz, 1H), 4,40 (m, 1H), 4,25 (m, 2H), 3,96 (dd, J = 3,1 Hz, 11,9 Hz, 1H), 2,93 (m, 1H), 2,40 (m, 4H), 2,20 (m, 2H), 1,87 (dd, J = 5,5 Hz, 8,2 Hz, 1H), 1,43 (m, 1H), 1,29 (s, 9H), 1,24 (m, 2H), 1,07 (m, 2H), 1,02 (s, 9H).

LC-MS A: czas retencji - 2,59.

MS: m/z = 657 (M-Boc+H).

BocNH-P3(t-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(5-cyjano-2-pirazol-1-ilofenylo))))-P1 (1 R,2SwinyloAcca)-CONHSO₂ cyklopropan (oczyszczony metodą B, 34%) ¹H NMR (CH3OH) δ: 8,63 (s, 1H), 8,24 (s, 1H), 7,84 (s, 1H), 7,70 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 7,54 (d, J =

7,6 Hz, 1H), 6,62 (m, 2H), 5,76 (m, 1H), 5,39 (s, 1H), 5,31 (d, 17,1 Hz, 20 1H), 5,12 (d, J = 10,4 Hz, 1H), 4,40 (m, 1H), 4,31 (d, J = 11,6 Hz, 1H), 4,23 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 3,96 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 2,93 (m, 1H), 2,41 (m, 1H), 2,22 (m, 2H), 1,87 (dd, J = 5,5 Hz, 7,9 Hz, 1H), 1,43 (m, 1H), 1,29 (s, 9H), 1,23 (m, 2H), 1,06 (m, 2H), 1,02 (s, 9H).

LC-MS C: czas retencji - 2,39.

MS: m/z = 789 (M+Na).

Związek 99

BocNH-P3(t-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(5-fluoro-2-pirazol-1-ilofenylo))))-P1 (1 R,2SwinyloAcca)-CONHSO₂-cyklopropan (oczyszczony metodą B, 12%) ¹H NMR (CH3OH) δ: 8,02 (s, 2Η), 7,76 (s, 1Η), 7,46 (m, 1H), 6,94 (m, 1H), 6,61 (d, J = 7,6 Hz,

1H), 6,54 (s, 1H), 5,76 (m, 1H), 5,38 (s, 1H), 5,30 (d, J = 17,4 Hz, 1H), 5,12 (d, J = 10,4 Hz, 1H), 4,37 (m, 1H), 4,24 (m, 2H), 3,97 (m, 1H), 2,92 (m, 1H), 2,38 (m, 1H), 2,20 (m, 2H), 1,86 (m, 1H), 1,44 (m, 1H), 1,32 (s, 9H), 1,23 (m, 2H), 1,06 (m, 2H), 1,01 (s, 9H).

PL 215 228 B1

LC-MS A: czas retencji - 2,50.

MS: m/z = 760 (M+H).

BocNH-P3(f-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(5-trifluorometylo-2-pirazol-1-ilofetylo))))-P1(1ff,2SwinyloAcca)-CONHSO?-cyklopropan BMS-593177 (29%)

¹H NMR (CH3OH) δ: 8,62 (s, 1H), 8,21 (s, 1H), 7,83 (s, 1H), 7,69 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 7,48 (d, J =

7,6 Hz 1H), 6,60 (s, 1H), 5,77 (m, 1H), 5,38 (s, 1H), 5,29 (d, J = 17,1 Hz, 1H), 5,11 (d, J = 10,4, 1H), 4,40 (m, 1H), 4,31 (d, J = 12,2, 1H), 4,23 (d, J = 9,2, 1H), 3,97 (d, J = 10,4, 1H), 2,93 (m, 1H), 2,41 (m, 1H), 2,21 (m, 2H), 1,87 (m, 1H), 1,44 (s, 1H), 1,39 (s, 9H), 1,16 (t, J = 7,0 Hz, 2H), 102 (m, 11H).

MS: m/z = 810 (M+H).

Wytwarzanie związku 101

Związek 101

PL 215 228 B1

Półprodukt 1 ze schematu 1 (1,51 g, 2,71 mmole) rozpuszczono w mieszaninie TFA (50 ml) i DCM (50 ml) i następnie roztwór mieszano w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Mieszaninę reakcyjną zatężono pod próżnią i pozostawiono na okres nocy pod działaniem wysokiej próżni. Żądany produkt otrzymano z wydajnością ilościową i został użyty bezpośrednio w następnym etapie bez oczyszczania.

MS: m/z = 457 (M+H).

Etap 2

Produkt z etapu 1 (1,54 g, 2,71 mmoli) połączono z DIEA (1,75 g, 13,6 mmoli), kwasem cyklopropylooctowym (0,363 g, 3,52 mmoli) i DCM (25 ml). Mieszaninę poddano reakcji z HATU (1,34 g, 3,52 mmoli) i HOAT (0, 479 g, 3,52 mmoli), po czym otrzymany roztwór mieszano w temperaturze pokojowej przez 8 godzin. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono przy użyciu DCM (50 ml) i przemyto wodą (2 x 25 ml). Przemywki wodne ekstrahowano wstecznie przy użyciu DCM (2 x 50 ml), po czym połączone fazy organiczne przemyto solanką i osuszono nad siarczanem magnezu, następnie przefiltrowano i zatężono pod próżnią, otrzymując lepki olej. Po oczyszczeniu metodą chromatografii szybkosprawnej (DCM:CH3OH, 30:1), otrzymano żądany produkt w postaci substancji stałej koloru białego.

MS: m/z = 539 (M+H).

PL 215 228 B1

Etap 3

Produkt z etapu 2 (50 mg, 0,093 mmola) rozpuszczono w THF (1 ml) i poddano reakcji z NaH (60% zawiesina w oleju, 12 mg, 0,28 mmola). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 5 minut, po czym dodano DSC (80 mg, 0,28 mmola) i następnie otrzymaną mieszaninę ogrzewano przez 18 godzin w temperaturze 70°C. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono octanem etylu i przemyto nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu. Przemywki wodne ekstrahowano ponad cztery razy octanem etylu. Ekstrakty organiczne połączono, osuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu, po czym przefiltrowano i zatężano pod próżnią aż do otrzymania substancji stałej o konsystencji wosku. Tę surową substancję ponownie rozpuszczono w THF (1 ml) i następnie mieszaninę poddano reakcji z 1,2,3,4-tetrahydroizochinoliną (37 mg, 0,28 mmola) i PS-DIEA (73 mg, 0,28 mmola). Otrzymaną mieszaninę mieszano przez 72 godziny i następnie poddano reakcji z 4M roztworem HCl w 1,4-dioksanie (1 ml) oraz CH3OH (2 ml) i przefiltrowano, otrzymując substancje stałą. Filtrat zatężono pod próżnią i oczyszczono metodą preparatywnej HPLC w odwróconym układzie faz, otrzymując związek 101 w postaci substancji stałej koloru żółtego (24 mg, wydajność - 37%).

¹H NMR (CD3OD) δ: 0,15 (s, 2H), 0,47 (s, 2H), 0,92 - 0,98 (m, 1H), 1,05 (s, 9H), 1,08 - 1,09 (m, 1H), 1,22 - 1,26 (m, 2H), 1,43 (dd, J = 9,46, 5,49 Hz, 1H), 1,87 (dd, J = 8, 24, 5,49 Hz, 1H), 2,05 - 2,26 (m, 5H), 2,39 (dd, J = 13,28, 7,17 Hz, 1H), 2,83 (s, 2H), 2,91 - 2,95 (m, 1H), 3,62 - 3,66 (m, 2H), 3,95 (dd, J = 11,90, 3,66 Hz, 1H), 4,21 (d, J = 11,60 Hz, 1H), 4,38 - 4,42 (m, 1H), 4,55 - 4,61 (m, 3H), 5,13 (dd, J = 10,38, 1,22 Hz, 1H), 5,30 (dd, J = 16,79, 0,92 Hz, 1H), 5,36 (s, 1H), 5,76 (ddd, J = 17,32, 9,99, 9,31 Hz, 1H), 7,15 (s, 4H).

MS: m/z = 698 (M+H).

P r z y k ł a d 9

Wytwarzanie BocNH-P3(t-butyloGly)-P2(Hyp)-P1(1R,2S/(1R,2S)-winyloAcca)-CO2H, półproduktu do wytwarzania P2-karbaminianów, P1-kwasów karboksylowych tripeptydu według przykładu 10

Etapy 9a i 9b

Wytwarzanie estru BocNH-P3(t-butvloGlv)-P2(Hyp)-P1 (1ff,2S/f1ff.2S)-winvloAcca)-CO2C2H₅, którego wzór strukturalny przedstawiono poniżej

PL 215 228 B1

BocNH-P2(Hyp)-P1(1ff,2S/(1ff,2S)-winyloAcca)-winyloAcca)-OC2H5 (5,218 g) rozpuszczono w 4N roztworze HCl w dioksanie. Otrzymany roztwór mieszano przez 90 minut i następnie zatężono pod próżnią, otrzymując pianę koloru żółtego, którą użyto w następnym etapie bez dodatkowego oczyszczania. Następnie, chlorowodorek BocNH-P2(Hyp)-P1(1ff,2S/(1ff,2S)-winyloAcca)-OC2H5 i N-Boc-L-tertleucynę (3,60 g, 15,6 mmoli) oraz 1,5 ml diizopropyloetyloaminę rozpuszczono, w atmosferze azotu, w bezwodnym acetonitrylu (500 ml). Wytworzony roztwór schłodzono na łaźni wodno-lodowej do temperatury 0°C. Do roztworu dodano dodatkową ilość diizopropyloetyloaminy (7,13 mL, 41 mmoli) i następnie dodano HATU (7,0 g, 18.4 mmol). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 31 godzin i następnie zatężono pod próżnią. Pozostałość rozcieńczono octanem etylu (500 ml) i przemyto kolejno 1N roztworem kwasu chlorowodorowego (500 ml), 1N roztworem wodorowęglanu sodu (500 ml) i solanką (500 ml). Warstwę organiczną osuszono nad siarczanem sodu i przefiltrowano przez krzemionkę. Roztwór zatężono i następnie oczyszczono metodą chromatografii szybkosprawnej na żelu krzemionkowym z zastosowaniem elucji mieszaniną octan etylu:heksany, w stosunku 2:1, otrzymując 3,22 g (32%) związku wymienionego w tytule w postaci substancji stałej koloru białego.

¹H NMR (d4-CH3OH, 500 MHz) δ: 5,73 (m, 1H), 5,28 (m, 1H), 5,08 (aproks. t, J = 10 Hz, 1H), 4,47 (m, 2H), 4,26 (m, 1H), 4,07 - 4,17 (m, 2H), 3,80 (m, 2H), 2,33 (m, 1H), 2,16 - 2,23 (m, 2H), 2,09 (m, 1H), 1,67 - 1,79 (m, 1H), 1,43 (s, 9H), 1,22 (t, J = 6,85 Hz, 3H), 1,02 i 1,00 (diastereotopowe, 2s, 9H).

LC-MS D: czas retencji - 1,65.

MS: m/z = 482 (M+H).

Etap 9c

Wytwarzanie kwasu BocNH-P3(t-butyloGly)-P2(Hyp)-P1(1ff,2S/(1ff.2S)-winyloAcca)-CO2H, któ-

BocNH-P3(t-butyloGly)-P2(Hyp)-P1(1ff,2S/(1ff,2S)-winyloAcca)-CO2C2H5 (2,705 g, 5,62 mmoli) rozpuszczono w metanolu (18 ml) i tetrahydrofuranie (50 ml). Roztwór schłodzono na łaźni wodnolodowej do temperatury 2°C. Do schłodzonego roztworu dodano 1N roztwór NaOH (16,9 ml). Po mieszaniu przez 3 godziny roztwór zatężono do objętości około 20 ml, po czym dodano 0,5N roztwór wodorowęglanu sodu (60 ml) i octan etylu (60 ml). Warstwy rozdzielono i następnie warstwę wodną o odczynie zasadowym zakwaszono do pH = 1 przy użyciu 1N roztworu kwasu chlorowodorowego. Następnie, zakwaszoną fazę wodną ekstrahowano octanem etylu (3 x 100 ml) i te frakcje organiczne osuszono nad siarczanem sodu i zatężono pod próżnią, otrzymując 2,11 g (83%) %) związku wymienionego w tytule w postaci sproszkowanej substancji stałej koloru białego, który użyto w następnym etapie bez dodatkowego oczyszczania.

P r z y k ł a d 10

Ogólna procedura wytwarzania P2-karbaminianu Pl-kwasów tripeptydów (związki 102109), jak to pokazano poniżej w ogólnej postaci, z półproduktu wytworzonego w sposób poda-

PL 215 228 B1

Reprezentatywna procedura wytwarzania P2-karbaminianu P1-kwasów tripeptydu (BocNHP3(t-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-NR¹R²)-P1(1 R,2S/(1 R,2S)-winyloAcca)-CO2H) z zastosowaniem izocyjanianów

BocNH-P3(t-butyloGly)-P2(Hyp)-P1(1R,2S/(1R.2S)-winyloAcca)-CO2H (150 mg, 0,33 mmola) rozpuszczono w tatrahydrofuranie (1,6 ml). Otrzymany roztwór schłodzono do -39°C na łaźni CH3CN/CO2. Do mieszaniny reakcyjnej dodano 60% NaH (40 mg. 0,99 mmola) i następnie dodawano powoli przez 30 minut żądany izocyjanian (0,38 mmola). Następnie, boki kolby przemyto tetrahydrofuranem (500 ml), po czym mieszaninę reakcyjną pozostawiono na okres nocy do ocieplenia w zimnej łaźni. Po mieszaniu przez 22 godziny, reakcje zgaszono przy użyciu 0,5N roztworu wodorowęglanu sodu (10 ml). Dodano octan etylu (20 ml) i 0,5N roztwór wodorowęglanu sodu (20 ml), po czym rozdzielono warstwy. Warstwę wodną o odczynie zasadowym zakwaszono przy użyciu 1N roztworu kwasu chlorowodorowego aż do uzyskania pH = 1 i następnie ekstrahowano octanem etylu (2 x 30 ml). Te warstwy octanu etylu osuszono nad siarczanem sodu, następnie przefiltrowano i zatężono pod próżnią, otrzymując poniższe P2-karbaminianu kwasów tripeptydu:

BocNH-P3(f-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(2,6-difluorofenylo))))-P1 (1 R,2S/(1 R.2S)-winyloAcca)CO₂H, (57%):

¹H NMR (d₄-CH₃OH, 500 MHz) δ: 7,27 (m, 1H), 7,00 (m, 2H), 6,00 (m, 1H), 5,37 (d, J = 13,4 Hz, 1H), 5,21 (dd, J = 17,4 5 and 17,1 Hz, 1H), 4,99 (dd, J = 10,7 i 10,1 Hz, 1H), 4,50 - 4,57 (m, 1H), 4,32 (m, 1H), 4,09 (m, 1H), 3,94 (m, 1H), 2,43 (m, 1H), 2,18 - 2,29 (m, 1H), 1,96-2,11 (m, 1H), 1,56 - 1,69 (m, 1H), 1,44 i 1,43 (diastereotropowy, 2s, 9H), 1,28 (m, 1H), 0,99 i 0,98 (diastereotropowy, 2s, 9H).

LC-MS D: czas retencji - 1,63.

MS: m/z = 609 (M+H).

PL 215 228 B1

BocNH-P3(hbutyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(2-metylobenzylo))))-P1 (1 R,2S/(1 R,2S)-winyloAcca)CO?H, (48%):

¹H NMR (d4-CH₃OH, 500 MHz) δ: 7,20 (m, 1H), 7,12 (m, 3H), 5,97 (m, 1H), 5,28 (m, 1H), 5,21 (dd, J = 17,7 i 17,1 Hz, 1H), 4,97 (dd, J = 11,3 i 11,0 Hz, 1H), 4,47 (m, 1H), 4,21 - 4,31 (m, 3H), 4,01 (m, 1H), 3,89 (m, 1H), 2,25 - 2,40 (m, 1H), 2,29 (s, 3H), 2,07 - 2,16 (m, 1H), 1,97 (m, 1H), 1,51 - 1,69 (m, 1H), 1,43 i 1,42 (diastereotropowy, 2s, 9H), 1,28 (m, 1H), 0,99 i 0,98 (diastereotropowy 2s, 9H).

LC-MS D: czas retencji - 1,77.

MS: m/z = 601 (M+H).

BocNH-P3(f-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-2-[(2S,3S)-3-metylowalerianian-metylu])))P1 (1 R,2S/(1 R,2S)-winyloAcca)-CO₂H, (59%):

LC-MS D: czas retencji - 1,76.

MS: m/z = 625 (M+H).

BocNH-P3(f-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-1-(R)-1-naftyloetylo)))-P1(1R,2S/(1R,2S)-winyloAcca)CO₂H, (9%):

LC-MS D: czas retencji - 1,87.

MS: m/z = 651 (M+H).

PL 215 228 B1

BocNH-P3(FbutyloGly)-P2 (Hyp(O-CO-(NH-fenylo)))-P1 (1 R,2S/(1 R,2S)-winyloAcca)-CO₂H, (42%):

LC-MS D: czas retencji - 1,72.

MS: m/z = 573 (M+H).

BocNH-P3(t-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(5-metylo-2-fluorofenylo))))-P1 (1 R,2S/(1 R,2S)winyloAcca) -CO2H, (25%):

LC-MS D: czas retencji - 1,78.

MS: m/z = 605 (M+H).

O

Związek 108

PL 215 228 B1

BocNH-P3(f-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(2-tiofen-2-ylo-etylo))))-P1(1R,2S/(1R,2S)-winyloAcca)CO2H, (50%):

LC-MS D: czas retencji - 1,73.

MS: m/z = 607 (M+H).

BocNH-P3(t-butyloGly)-P2(Hyp(O-CO-(NH-(3-trifluorometylofenylo))))-P1 (1 R,2S/(1 R,2S)winyloAcca)-CO?H, (18%):

LC-MS D: czas retencji - 1,87.

MS: m/z = 641 (M+H).

P r z y k ł a d 11

Związki 110 i 111 wytworzono w wyniku przemian chemicznych opisanych w niniejszym przykładzie, stosując jako substrat związek 19.

Związek 19 (88 mg, 0,12 mmola) rozpuszczono w 4N roztworze HCl w dioksanie (0,29 ml, 1,20 mmola). Po mieszaniu przez 1 godzinę w temperaturze 25°C dodano eter dietylowy (10 ml), po czym rozpuszczalnik usunięto pod próżnią, otrzymując odblokowany chlorowodorek, który użyto w następnym etapie bez dodatkowego oczyszczania.

Chlorowodorek analogu związku 19 z usuniętą grupą Boc (0,12 mmola) rozpuszczono w chlorku metylenu (6 ml). Do roztworu dodano 4,8-diazabicyklo[5.4.0]non-5-en (356 mg, 0,24 mmola) i natychmiast po tym dodano chloromrówczan metylu (11 mg, 0,12 mmola). Mieszaninę reakcyjną koloru żółtego mieszano w temperaturze 25°C przez 18 godzin. Następnie, mieszaninę reakcyjną rozcieńczono octanem etylu (50 ml) i 1N roztworem HCl (50 ml). Część organiczną oddzielono i przemyto 1N roztworem HCl (1 x 50 ml) oraz solanką (1 x 50 ml). Część organiczną osuszono nad siarczanem sodu i zatężono pod próżnią. Produkt oczyszczono metodą preparatywnej TLC, eluując mieszaniną octan etylu:heksany, w stosunku 1:1. Otrzymano związek 110 (67%).

PL 215 228 B1

Zwiążek 111 wytworzono ze związku 19, z zastosowaniem procedury opisanej powyżej dla wytwarzania związku 110, z tą różnicą, że zamiast chloromrówczanu metylu zastosowano chloromrówczan etylu.

P r z y k ł a d 12

Część 1 przykładu 12: Wytwarzanie członów P1

Poniżej opisano sposób wytwarzania następujących, dodatkowych członów P1 i P1' związków.

1. Rozdzielanie estru etylowego kwasu N-Boc-(1 R,2S)/(1 S,2R)-1-amino-2-winylocyklopropanokarboksylowego

Rozdzielanie A

Do buforu w postaci wodnego roztworu fosforanu sodu (0,1 M, 4,25 litra („L), pH = 8), umieszczonego w 12 litrowym reaktorze z płaszczem, utrzymywanego w temperaturze 39°C i mieszanego z szybkością 300 obrotów na minutę, dodano 2,4 L (425 ml) Acalase (Novozymes North America Inc.). Gdy temperatura mieszaniny osiągnęła 39°C, wyregulowano pH do wartości 8,0 przez dodanie 50% roztworu NaOH w wodzie. Następnie dodawano przez 40 minut roztwór racemicznego estru etylowego kwasu N-Boc-(1R,2S)/(1S,2R)-1-amino-2-winylocyklopropanokarboksylowego (85 g) w 850 ml DMSO. Temperaturę mieszaniny reakcyjnej utrzymywan o przez 24,5 godziny na poziomie 40°C i po 1,5 godzinie utrzymywania temperatury 40°C oraz po 19,5 godzinach utrzymywania tej temperatury pH mieszaniny regulowano do wartości 8,0 przy użyciu 50% wodnego roztworu NaOH. Po 24,5 godzinach oznaczono nadmiar enancjomeryczny estru, który wynosił 97,2%, po czym mieszaninę reakcyjną schłodzono do temperatury pokojowej (26°C) i mieszano przez okres nocy (16 godzin) i po tym czasie oznaczony nadmiar enancjomeryczny estru wynosił 100%. Następnie, pH mieszaniny reakcyjnej wyregulowano do wartości 8,5 przy użyciu 50% roztworu NaOH, po czym otrzymaną mieszaninę ekstrahowano przy użyciu MTBE (2x2 litry). Połączone ekstrakty MTBE przemyto 5% roztworem NaHCO3 (3 x 100 ml) i wodą (3 x 100 ml), następnie odparowano pod próżnią, otrzymując enancjomerycznie czysty ester etylowy kwasu N-Boc-(1R,2S)/(1S,2R)-1-amino-2-winylocyklopropanokarboksylowego

PL 215 228 B1 w postaci substancji stałej koloru jasnożółtego (42,55 g, czystość - 97% ^@ 210 nm, który nie zawierał kwasu; 100% nadmiaru enancjomerycznego („ee)).

Następnie, warstwę wodną z etapu ekstrakcji zakwaszono do pH = 2 przy użyciu 50% roztworu kwasu siarkowego i ekstrahowano przy użyciu MTBE (2x2 litry). Ekstrakt MTBE przemyto wodą (3 X 100 ml) i odparowano, otrzymując kwas w postaci substancji stałej koloru jasnożółtego (42,74 g, czystość - 99% ^@ 210 nm, który nie zawierał estru).

	Ester	Kwas
Spektrometria mas o wysokiej rozdzielczości	(+) ESI, C13H22NO4, [M+H]+: obliczono 256,1549; znaleziono 256,1542;	(-) ESI, C11H16NO4, [M+H]': obliczono 226,1079; znaleziono 226,1089;
NMR - obserwowane przesunięcie chemiczne: rozpuszczalnik CDCI3 (proton - δ 7,24 ppm; ¹³C - δ 77,0 ppm;) aparat Broker DRX-500C: proton - 500,032 MHz; węgiel - 125,746 MHz;
Pozycja	Proton (wzorzec) [ppm]	¹³C [ppm]	Proton (wzorzec) [ppm]	¹³C [ppm]
1	-	40,9	-	40,7
2	2,10 (q, J = 9,0 Hz)	34,1	2,17 (q, J = 9,0 Hz)	35,0
3a	1,76 (szerokie)	23,2	1,79 (szerokie)	23,4
3b	1,46 (szerokie)	1,51 (szerokie)
4	-	170,8	-	175,8
5	5,74 (ddd, J = 9,0, 10,0, 17,0 Hz)	133,7	5,75 (m)	133,4
6a	5,25 (d, J = 17,0 Hz)	117,6	5,25 (d, J = 17,0 Hz)	118,1
6b	5,08 (dd, J = 10,0, 1,5 Hz)	5,12 (d, J = 10,5 Hz)
7	-	155,8	-	156,2
8	-	80,0	-	80,6
9	1,43 (s)	28,3	1,43 (s)	28,3
10	4,16 (m)	61,3	-	-
11	1,23 (t, J = 7,5 Hz)	14,2	-	-

Rozdzielanie B

Do 0,5 ml buforu 100 mM Heps*Na (pH 8,5) umieszczonego w studzience płytki 24-studzienkowej (pojemność: 10 ml/studzienkę) dodano 0,1 ml Savinase 16.0L (proteaza pochodząca od Bacillus clausii) (Novozymes North America Inc.) i następnie dodano roztwór racemicznego estru etylowego kwasu N-Boc-(1R,2S)/(1S,2R)-1-amino-2-winylocyklopropanokarboksyIowego (10 mg) w 0,1 ml DMSO. Płytkę szczelnie zamknięto, po czym inkubowano w temperaturze 40°C, przy 250 obrotach na minutę. Po 18 godzinach, nadmiar enancjomeryczny estru wynosił 44,3%, co oznaczono w następujący sposób: pobrano 0,1 ml mieszaniny reakcyjnej i zmieszano dokładnie z 1 ml etanolu; po wirowaniu,

PL 215 228 B1 mikrolitrów („μΓ) nadsączu analizowano z zastosowaniem chiralnej HPLC. Do pozostałej mieszaniny reakcyjnej dodano 0,1 ml DMSO, po czym płytkę inkubowano przez dodatkowe 3 dni w temperaturze 40°C, przy 250 obrotach na minutę i następnie do studzienki dodano 4 ml etanolu. Po wirowaniu, 10 μl nadsączu analizowano metodą chiralnej HPLC i stwierdzono, że nadmiar enancjomeryczny estru wynosił 100%.

Rozdzielanie C

Do 0,5 ml buforu 100 mM Heps*Na (pH 8,5) umieszczonego w studzience płytki 24-studzienkowej (pojemność: 10 ml/studzienkę) dodano 0,1 ml Esperase 8.0L (proteaza pochodząca od Baci77us ha7odu/ans) (Novozymes North America Inc.) i roztwór racemicznego estru etylowego kwasu N-Boc-(1R2S)/(1S,2R)-1-amino-2-winylocyklopropanokarboksylowego (10 mg) w 0,1 ml DMSO. Płytkę szczelnie zamknięto i następnie inkubowano w temperaturze 40°C, przy 250 obrotach na minutę. Po 18 godzinach, nadmiar enancjomeryczny estru wynosił 39,6%, co oznaczono w następujący sposób: pobrano 0,1 ml mieszaniny reakcyjnej i zmieszano dokładnie z 1 ml etanolu; po wirowaniu, 10 μl nadsączu analizowano z zastosowaniem chiralnej HPLC. Do pozostałej mieszaniny reakcyjnej dodano 0,1 ml DMSO, po czym płytkę inkubowano przez dodatkowe 3 dni w temperaturze 40°C i przy 250 obrotach na minutę i następnie do studzienki dodano 4 ml etanolu. Po wirowaniu, 10 μl nadsączu analizowano metodą chiralnej HPLC i stwierdzono, że nadmiar enancjomeryc zny estru wynosił 100%.

Analizy próbek przeprowadzono w następujący sposób:

1) Przygotowanie próbki:

Około 0,5 ml mieszaniny reakcyjnej wymieszano dokładnie z 10 objętościami etanolu. Po wirowaniu, 10 μl nadsączu wstrzyknięto do kolumny HPLC.

2) Oznaczanie stopnia przemiany:

kolumna: YMC ODS A, 4,6 x 50 mm, S-5 μm;

rozpuszczalnik: A - roztwór 1 mM HCl w wodzie, B - CH3CN;

gradient: 30% B przez 1 min, od 30% do 45% B przez 0,5 min, 45% B przez 1,5 min, od

45% do 30% B przez 0,5 min;

objętościowe natężenie przepływu: 2 ml/min;

detekcja UV: 210 nm;

czas retencji: kwas - 1,2 min, ester - 2,8 min.

3) Oznaczanie nadmiaru enancjomerycznego dla estru:

kolumna: CHIRACEL OD-RH, 4,6 x 150 mm, S-5 μm;

faza ruchoma: CH3CN/50 mM HClO4 w wodzie (67/33);

objętościowe natężenie przepływu: 0,75 ml/min;

detekcja UV: 210 nm;

czas retencji: izomer (1S,2R) w postaci kwasu - 5,2 min, racemat - 18,5 min i 20,0 min, izomer (1R,2S) w postaci estru - 18,5 min.

2. Wytwarzanie estru etylowego kwasu N-Boc-(1R,2S)-1-amino-2-cyklopropylocyklopropanokarboksylowego

Roztwór kwasu N-Boc-(1R,2S)-1-amino-2-winylocyklopropanokarboksylowego (255 mg, 1,0 mmol) w eterze (10 ml) poddano reakcji z octanem palladu (5 mg, 0,022 mmola). Roztwór koloru pomarańczowo-czerwonego umieszczono w atmosferze azotu. Następnie przez 1 godzinę wkraplano nadmiar diazometanu w postaci roztworu w eterze. Otrzymany roztwór mieszano w temperaturze po86

PL 215 228 B1 kojowej przez 18 godzin. Nadmiar diazometanu usunięto w strumieniu azotu. Otrzymany roztwór odparowano w wyparce obrotowej, otrzymując surowy produkt. Po obróbce metodą chromatografii szybkosprawnej (mieszanina 10% octanu etylu/heksan) otrzymano 210 mg (78%) estru etylowego kwasu N-Boc-(1ff,2S)-1-amino-2-cyklopropylocyklopropanokarboksylowego w postaci bezbarwnego oleju.

LC-MS: czas retencji: 2,13 (z zastosowaniem metody podobnej do metody A, z tą różnicą że: elucja gradientowa przez 3 minuty oraz kolumna Xterra MS C18 S7 3,0 x 50 mm).

MS: m/e = 270 [M⁺+1].

3. Kwas 1-tert-butoksykarbonyloaminocyklopropanokarboksylowy jest dostępny w handlu.

4. Wytwarzanie chlorowodorku estru metylowego kwasu 1-aminocyklobutanokarboksylowego.

Kwas 1-aminocyklobutanokarboksylowy (100 mg, 0,869 mmola) (Tocris) rozpuszczono w 10 ml metanolu i przez roztwór przepuszczano przez 2 godziny gazowy HCl. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 18 godzin i następnie zatężono pod próżnią, otrzymując 144 mg oleju koloru żółtego. Po roztarciu z 10 ml eteru otrzymano 100 mg produktu wymienionego w tytule w postaci substancji stałej koloru białego.

¹H NMR (CDCl3) δ: 2,10 - 2,25 (m, 1H), 2,28 - 2,42 (m, 1H), 2,64 - 2,82 (m, 4H), 3,87 (s, 3H), 9,21 (szerokie s, 3H).

5. Wytwarzanie racemicznego estru tert-butylowego kwasu (1R,2R)/(1S,2S)-1-amino-2-etylocyklopropanokarboksylowego, którego wzór strukturalny przedstawiono poniżej.

H₂N co₂- t-butyl grupa etylowa w położeniu syn w stosunku do grupy karboksy

Etap 1: Wytwarzanie estru di-fe/Y-butylowego kwasu 2-etvlocvklopropano-1,1-dikarboksvlowego, którego wzór strukturalny przedstawiono poniżej

t-butyl-O₂C CO₂- t-butyl

Do zawiesiny chlorku benzylotrietyloamoniowego (21,0 g, 92,2 mmoli) w 50% wodnym roztworze NaOH (92,4 g w 185 ml H2O) dodano 1,2-dibromobutan (30,0 g, 138,9 mmoli) i malonian di-te/tbutylu (20,0 g, 92,5 mmoli). Mieszaninę reakcyjną mieszano energicznie w temperaturze pokojowej przez 18 godzin, po czym dodano mieszaninę wody i lodu. Surowy produkt ekstrahowano przy użyciu

PL 215 228 B1

CH2Cl2 (3x) i kolejno przemyto wodą (3x) oraz solanką, po czym ekstrakty organiczne połączono. Warstwę organiczną osuszono (MgSO4), przefiltrowano i zatężono pod próżnią. Otrzymaną pozostałość poddano obróbce metodą chromatografii szybkosprawnej (100 g SiO2, 3% eteru dietylowego w heksanie), otrzymując produkt wymieniony w tytule (18,3 g, 67,8 mmoli, wydajność - 73%), który użyto bezpośrednio w następnej reakcji.

Etap 2: Wytwarzanie racemicznego estru fe/Y-butylowego kwasu 2-etylocyklopropano-1,1-dikarboksylowego, którego wzór strukturalny przedstawiono poniżej

Produkt z etapu 1 (18,3 g, 67,8 mmoli) dodano w temperaturze 0°C do zawiesiny tertbutoksylanu potasu (33,55 g, 299,0 mmoli) w osuszonym eterze (500 ml) i następnie dodano wodę (1,35 ml, 75,0 mmoli), po czym mieszano energicznie w temperaturze pokojowej przez okres nocy. Mieszaninę reakcyjną wlano do mieszaniny wody i lodu oraz przemyto eterem (3x). Warstwę wodną zakwaszono w temperaturze 0°C 10% wodnym roztworem kwasu cytrynowego i następnie ekstrahowano octanem etylu (3x). Połączone warstwy organiczne przemyto wodą (2x) i solanką, następnie osuszono (MgSO4) i zatężono pod próżnią, otrzymując produkt wymieniony w tytule w postaci oleju koloru jasnożółtego (10 g, 46,8 mmoli, wydajność - 69%).

Etap 3: Wytwarzanie estru fe/Y-butylowego kwasu (1ff,2ff)/(1S,2S)-2-etylo-1-(2-trimetylosilanyloetoksykarbonyloamino)cyklopropanokarboksylowego, którego wzór strukturalny przedstawiono poniżej

Do zawiesiny produktu z etapu 2 (10 g, 46,8 mmoli) i 3 g świeżo aktywowanych sit molekularnych 4A w osuszonym benzenie (160 ml) dodano trietyloaminę (7,50 mL, 53,8 mmoli) i DPPA (11 ml, 10,21 mmoli). Mieszaninę reakcyjną ogrzewano utrzymując w stanie wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 3,5 godziny, po czym dodano 2-trimetylosililoetanol (13,5 mL, 94,2 mmoli) i następnie mieszaninę reakcyjną ogrzewano przez okres nocy utrzymując w stanie wrzenia pod chłodnicą zwrotną. Mieszaninę reakcyjną przefiltrowano, rozcieńczono eterem dimetylowym, przemyto 10% wodnym roztworem kwasu cytrynowego, wodą, nasyconym roztworem NaHCO3, wodą (2x) i solanką (2x), następnie osuszono (MgSO4) i zatężono pod próżnią. Z pozostałości wytworzono zawiesinę z 10 g zmiatacza rodnikowego w postaci żywicy poliizocyjanianowej z firmy Aldrich w 120 ml CH2Cl2, po czym mieszano w temperaturze pokojowej przez okres nocy i następnie przefiltrowano, otrzymując produkt wymieniony w tytule (8 g, 24,3 mmoli, 52%) w postaci oleju koloru jasnożółtego.

¹H NMR (CDCl3) δ: 0,03 (s, 9H), 0,97 (m, 5H), 1,20 (bm, 1H), 1,45 (s, 9H), 1,40 - 1,70 (m, 4H), 4,16 (m, 2H), 5,30 (bs, 1H).

Etap 4: Wytwarzanie racemicznego estru fe/Y-butylowego kwasu (1R,2R)/(1S,2STBAF)-1-amino-2-etylocyklopropanokarboksylowego, którego wzór strukturalny przedstawiono poniżej

H₂N CCL-fc-butyl grupa etylowa w położeniu syn w stosunku do grupy karboksy

Do produktu z etapu 3 (3 g, 9 mmoli) dodano 1,0 M roztwór TBAF w THF (9,3 ml, 9,3 mmoli) i następnie mieszaninę reakcyjną ogrzewano przez 1,5 godziny do stanu wrzenia pod chłodnicą

PL 215 228 B1 zwrotną, po czym schłodzono do temperatury pokojowej i następnie rozcieńczono 500 ml octanu etylu. Roztwór przemyto kolejno wodą (2 x 100 ml), solanką (2 x 100 ml), po czym osuszono (MgSO4) i zatężono pod próżnią, otrzymując produkt pośredni wymieniony w tytule.

6. Wytwarzanie chlorowodorku estru metylowego kwasu 1-aminospiro[2.3]heksano-1-karboksylowego.

Etap 1: Wytwarzanie estru dimetylowego kwasu [2.3]heksano-1,1-dikarboksylowego, którego wzór strukturalny przedstawiono poniżej

O

Do mieszaniny metylenocyklobutanu (1,5 g, 22 mmoli) i Rh2(CH3COO)4 (125 mg, 0,27 mmola) w bezwodnym CH2Cl2 (15 ml) dodawano, przez 6 godzin i w temperaturze 0°C, 3,2 g (20 mmoli) diazomalonianu dimetylu (wytworzonego zgodnie z doniesieniem J. Lee i innych w Synth. Comm., 1995, 25, strony 1511-1515). Następnie, mieszaninę reakcyjną ogrzano do temperatury pokojowej i mieszano przez dodatkowe 2 godziny. Mieszaninę zatężono i oczyszczono metodą chromatografii szybkosprawnej (elucja mieszaniną heksan/eter dietylowy w stosunku od 10:1 do 5:1), otrzymując 3,2 g (72%) estru dimetylowego kwasu [2.3]heksano-1,1-dikarboksylowego w postaci oleju koloru żółtego.

¹HNMR (300 MHz, CDCl3) δ: 3,78 (s, 6H), 2,36 (m, 2H), 2,09 (m, 3H), 1,90 (m, 1H), 1,67 (s, 2H).

LC-MS: MS m/z = 199 (M⁺+1).

Etap 2: Wytwarzanie estru metylowego kwasu spiro[2.3]heksano-1,1-dikarboksylowego, którego wzór strukturalny przedstawiono poniżej

Do mieszaniny estru dimetylowego kwasu spiro[2.3]-heksano-1,1-dikarboksylowego (200 mg, 1,0 mmol) w 2 ml metanolu i 0,5 ml wody dodano KOH (78 mg, 1,4 mmola). Roztwór ten mieszano przez 2 dni w temperaturze pokojowej. Następnie, roztwór zakwaszono rozcieńczonym HCl i ekstrahowano dwa razy eterem. Połączone fazy organiczne osuszono (MgSO4) i zatężono, otrzymując 135 mg (73%) produktu z etapu 2, w postaci substancji stałej koloru białego.

¹H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 3,78 (s, 3H), 2,36 - 1,90 (m, 8H).

LC-MS: MS m/z = 185 [M⁺+1].

Etap 3: Wytwarzanie produktu wymienionego w tytule, to jest chlorowodorku estru metylowego kwasu 1 -aminospiro-[2.3]heksano-1-karboksylowego

Do mieszaniny estru metylowego kwasu spiro[2.3]heksano-1,1-dikarboksylowego (660 mg, 3,58 mmola) w 3 ml bezwodnego tert-butanolu dodano 1,08 g (3,92 mmola) DPPA i 440 mg (4,35 mmola) trietyloaminy. Mieszaninę ogrzewano przez 21 godzin, utrzymując w stanie wrzenia pod chłodnicą zwrotną i następnie rozdzielono pomiędzy wodę i eter. Fazę eterową osuszono nad siarczanem magnezu, następnie przefiltrowano i zatężono pod próżnią, otrzymując olej. Do tego oleju dodano 3 ml 4 M roztworu HCl w dioksanie. Ten kwaśny roztwór mieszano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej i następnie zatężono pod próżnią. Pozostałość roztarto z eterem, otrzymując 400 mg (58%) żądanego produktu w postaci substancji stałej koloru białego.

¹H NMR (300 MHz, d6-DMS0) δ: 8,96 (szerokie s, 3H), 3,71 (s, 3H), 2,41 (m, 1H), 2,12 (m, 4H),

1,93 (m, 1H), 1,56 (q, 2H, J = 8 Hz).

PL 215 228 B1

LC-MS wolnej aminy: MS m/z = 156 [M⁺+1].

7. Poniżej opisano wytwarzanie chlorowodorku estru metylowego kwasu 1-aminospiro[2.4]-heptano-1-karboksylowego, którego wzór strukturalny przedstawiono poniżej.

Etap 1: Ester dimetylowy kwasu spiro[2.4]heptano-1,1-dikarboksylowego, którego wzór strukturalny przedstawiono poniżej, wytworzono w następujący sposób

Stosując taką samą procedurę jaką opisano przy wytwarzaniu chlorowodorku estru metylowego kwasu 1-aminospiro[2.3]-heksano-1-karboksylowego, poddano reakcji 1,14 g (13,9 mmoli) metylenocyklopentanu i 2,0 g (12,6 mmoli) diazomalonianu dimetylu, otrzymując 1,8 g (67%) estru dimetylowego.

¹H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 3,73 (s, 6H), 1,80 (m, 2H), 1,70 (m, 4H), 1,60 (m, 4H).

LC-MS: MS m/z = 213 [M⁺+1].

Etap 2: Ester metylowy kwasu spiro[2.4]heptano-1,1-dikarboksylowego, którego wzór strukturalny przedstawiono poniżej, wytworzono w następujący sposób

Stosując taką samą procedurę jaką opisano przy wytwarzaniu chlorowodorku estru metylowego kwasu 1-aminospiro[2.3]-heksano-1-karboksylowego, poddano reakcji 1,7 g (8,0 mmoli) produktu z etapu 1 i 493 mg (8,8 mmoli) KOH otrzymano 1,5 g (94%) estru metylowego kwasu spiro[2.4]heptano-1,1-dikarboksylowego.

¹H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 3,80 (s, 3H), 2,06 (d, 1H, J = 5 Hz), 1,99 (d, 1H, J = 5 Hz), 1,80-1,66 (m, 8H).

LC-MS: MS m/z = 199 [M⁺+1].

Etap 3: Chlorowodorek estru metylowego kwasu 1-aminospiro[2.4]heptano-1-karboksylowego, którego wzór strukturalny przedstawiono poniżej, wytworzono w następujący sposób

Stosując taką samą procedurę jaką opisano przy wytwarzaniu chlorowodorku estru metylowego kwasu 1-aminospiro[2.3]-heksano-1-karboksylowego, poddano reakcji 500 mg (2,5 mmola) produktu z etapu 2, 705 mg (2,5 mmola) DPPA i 255 mg (2,5 mmola) trietyloaminy, otrzymując 180 mg (35%) tego chlorowodorku.

¹H NMR (300 MHz, DMS0-d6 ) δ: 8,90 (szerokie s, 3H), 3,74 (s, 3H), 1,84 (m, 1H), 1,69 (m, 4H), 1,58 (m, 4H), 1,46 (d, 1H, J = 6 Hz).

PL 215 228 B1

LC-MS wolnej aminy: MS m/z = 170 [M⁺+1]

8. Poniżej opisano wytwarzanie chlorowodorku estru metylowego kwasu 1-aminospiro[2.2]pentano-1-karboksylowego, którego wzór strukturalny przedstawiono poniżej.

Etap 1: Ester dimetylowy kwasu spiro[2.2]pentano-1,1-dikarboksylowego, którego wzór strukturalny przedstawiono poniżej, wytworzono w następujący sposób

Do mieszaniny metylenocyklopropanu (1,0 g, 18,5 mmoli) (wytworzonego zgodnie z ujawnieniem P. Bingera w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer seryjny 5,723,714) i Rh2(CH3COO)4 (82 mg, 0,185 mmola) w bezwodnym CH2Cl2 (10 ml) dodano w temperaturze 0°C diazomalonian dimetyIu (2,9 g, 18,3 mmoli). Na szczycie kolby reakcyjnej umieszczono chłodnicę palcową której temperaturę utrzymywano na poziomie -10°C. Mieszaninę reakcyjną ogrzano do temperatury pokojowej i mieszano przez dodatkowe 2 godziny. Mieszaninę reakcyjną zatężono pod próżnią i oczyszczono metodą chromatografii szybkosprawnej (elucja mieszaniną heksan/eter dietylowy w stosunku od 10:1 do 5:1, otrzymując 0,85 g (25%) estru dimetylowego w postaci oleju koloru żółtego.

¹H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 3,73 (s, 6H), 1,92 (s, 2H), 1,04 (d, 4H, J = 3 Hz).

Etap 2: Ester metylowy kwasu spiro[2.2]pentano-1,1-dikarboksylowego, którego wzór strukturalny przedstawiono poniżej, wytworzono w następujący sposób

Stosując taką samą procedurę jaką opisano przy wytwarzaniu chlorowodorku estru metylowego kwasu 1-aminospiro[2.3]-heksano-1-karboksylowego, poddano reakcji 800 mg (4,3 mmola) produktu z etapu 1 i 240 mg (4,3 mmola) KOH, otrzymując 600 mg (82%) estru metylowego kwasu spiro[2.2]pentano-1,1-karboksylowego.

¹H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 3,82 (s, 6H), 2,35 (d, 1H, J = 3 Hz), 2,26 (d, 1H, J = 3 Hz), 1,20 (m, 1H), 1,15 (m, 1H), 1,11 (m, 1H), 1,05 (m, 1H).

LRMS: MS m/z = 169 [M⁺+1] (metoda D).

Etap 3: Chlorowodorek estru metylowego kwasu 1-aminospiro[2.2]pentano-1-karboksylowego, którego wzór strukturalny przedstawiono poniżej, wytworzono w następujący sposób

Stosując taką samą procedurę jaką opisano przy wytwarzaniu chlorowodorku estru metylowego kwasu 1-aminospiro[2.3]-heksano-1-karboksylowego, poddano reakcji 400 mg (2,3 mmola) produktu z etapu 2, 700 mg (2,5 mmola) DPPA i 278 mg (2,7 mmola) trietyloaminy, otrzymując 82 mg (20%) chlorowodorku.

¹H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 9,19 (szerokie s, 3H), 3,81 (s, 3H), 2,16, (d, J = 5,5 Hz, 1H), 2,01 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 1,49 (m, 1H), 1,24, (m, 1H), 1,12 (m, 2H).

PL 215 228 B1

LC-MS wolnej aminy: MS m/z = 142 [M⁺+1].

9. Poniżej opisano wytwarzanie estru etylowego kwasu 5-aminospiro[2.3]heksano-5-karboksylowego, którego wzór strukturalny przedstawiono poniżej.

croc₂H₅

Spiro[2.3]heksan-4-on (500 mg, 5 mmoli), który wytworzono z bicyklopropylidenu (A. Meijere i inni, Org. Syn., 2000, 78, strony 142-151) połączono z karbaminianem amonu (1,17 g, 15 mmoli) i cyjankiem potasu (812 mg, 12,5 mmoli) w 50 ml etanolu i 50 ml wody, zgodnie z metodą A. Meijere i innych, J. Org. Chem., 1988, 53, strony 152-161. Mieszaninę reakcyjną ogrzewano przez 2 dni w temperaturze 55°C. Następnie dodano NaOH (7 g, 175 mmoli), po czym roztwór ogrzewano przez okres nocy, utrzymując w stanie wrzenia pod chłodnicą zwrotną. Następnie mieszaninę reakcyjną schłodzono do temperatury 0°C, po czym zakwaszono do pH = 1 przy użyciu stężonego HCl i zatężono pod próżnią. Do surowej mieszaniny aminokwasu dodano etanol i następnie zatężono do sucha (5x), aż do usunięcia resztek wody. Pozostałość rozpuszczono w 100 ml etanolu i schłodzono do temperatury 0°C. Schłodzoną mieszaninę poddano reakcji z 1 ml SOCl2 i ogrzewano przez 3 dni, utrzymując w stanie wrzenia pod chłodnicą zwrotną. Składniki stałe usunięto na drodze filtracji, po czym filtrat zatężono pod próżnią otrzymując surowy produkt. Surowy produkt rozdzielono pomiędzy 3N roztwór NaOH, NaCl i octan etylu. Fazę organiczną osuszono węglanem potasu i zatężono. Pozostałość oczyszczono na kolumnie chromatograficznej z żelem krzemionkowym C18 (elucja mieszaniną metanol/woda), otrzymując 180 mg (21%) produktu 15 w postaci oleju.

¹H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 8,20 (szerokie s, 2H), 4,27 (s, 2H), 2,80 (s, 1H), 2,54 (s, 1H), 2,34 (m, 2H), 1,31 (s, 3H), 1,02 (s, 1H), 0,66 (m, 3H).

¹³C NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 170,2 (s), 63,0 (s), 62,8 (s), 26,1 (s), 26,0 (s), 24,9 (s), 13,9 (s), 11,4 (s), 10,9 (s).

LC-MS: MS m/z = 170 [M⁺+1],

10. Poniżej opisano wytwarzanie chlorowodorku estru metylowego kwasu 1-aminospiro[2.2]-pentano-1-karboksylowego, którego wzór strukturalny przedstawiono poniżej.

Etap 1: Wytwarzanie esteru dimetylowego kwasu spiro[2.2]pentano-1,1-dikarboksylowego, którego wzór strukturalny przedstawiono poniżej

Do mieszaniny metylenocyklopropanu (3,89 g, 72 mmole) (wytworzonego zgodnie z ujawnieniem P. Bingera w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer seryjny 5,723,714) i Rh2(CH3COO)4 (3,18 g, 7,2 mmoli) w bezwodnym CH2Cl2 (10 ml), schłodzonej do temperatury 0°C, dodano diazomalonian dimetylu (11,38 g, 72 mmole). Na szczycie kolby reakcyjnej umieszczono chłodnicę palcową której temperaturę utrzymywano na poziomie -78°C. Mieszaninę reakcyjną koloru zielonego ogrzano do temperatury pokojowej i w tym czasie obserwowano wydzielanie się pęcherzy gazowego N2. Reakcja egzotermiczna spowodowała łagodne wrzenie mieszaniny trwające 15 minut. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez dodatkowe 4 godziny, następnie zatężono pod próżnią

PL 215 228 B1 i oczyszczono metodą chromatografii szybkosprawnej (elucja mieszaniną heksan/eter dietylowy w stosunku od 10:1 do 5:1, otrzymując 10,5 g (79%) estru dimetylowego w postaci oleju koloru żółtego.

Etap 2: Ester metylowy kwasu spiro[2.21pentano-1,1-dikarboksylowego, którego wzór strukturalny przedstawiono poniżej, wytworzono w następujący sposób

Do mieszaniny 800 mg estru dimetylowego kwasu spiro[2.31-heksano-1-dikarboksylowego, poddano reakcji (4,3 mmola) w 8 ml metanolu i 2 ml wody dodano 240 mg KOH (4,3 mmola). Roztwór mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 dni i następnie zakwaszono do pH = 3 rozcieńczonym roztworem HCl, po czym ekstrahowano dwa razy przy użyciu eteru. Połączone fazy organiczne osuszono (MgSO4) i zatężono, otrzymując 600 mg (82%) estru metylowego kwasu spiro[2.31-heksano-1-dikarboksylowego w postaci substancji stałej koloru białego.

LRMS: MS m/z = 169 [M⁺-11.

Etap 3: Chlorowodorek estru metylowego kwasu 1-aminospiro[2.21pentano-1-karboksylowego, którego wzór strukturalny przedstawiono poniżej, wytworzono w następujący sposób

Do mieszaniny estru metylowego kwasu spiro[2.21heksano-1-dikarboksylowego (400 mg, 2,30 mmola) w 3 ml bezwodnego tert-butanolu dodano 700 mg (2,50 mmola) DPPA i 278 mg (2,70 mmola) trietyloaminy. Mieszaninę ogrzewano przez 21 godzin utrzymując w stanie wrzenia pod chłodnicą zwrotną i następnie rozdzielono pomiędzy wodę i eter. Fazę eterową osuszono nad siarczanem magnezu, następnie przefiltrowano i zatężono pod próżnią otrzymując olej. Do tego oleju dodano 3 ml 4M roztworu HCl w dioksanie. Ten kwaśny roztwór mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny i następnie zatężono pod próżnią. Pozostałość roztarto z eterem, otrzymując 82 mg (20%) chlorowodorku estru metylowego kwasu 1-aminospiro-[2.21pentano-1-karboksylowego w postaci substancji stałej koloru białego.

¹H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 9,19 (szerokie s, 3H), 3,81 (s, 3H), 2,16 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 2,01 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 1,49 (m, 1H), 1,24 (m, 1H), 1,12 (m, 2H).

LC-MS wolnej aminy: MS m/z = 142 [M⁺+11.

Część 2 przykładu 12

Poniżej opisano sposób wytwarzania następujących półproduktów P1'.

1. Wytwarzanie cyklopropylosulfonamidu (alternatywna droga postępowania)

Etap 1: Wytwarzanie N-fe/Y-butylo-(3-chloro)propylosulfonamidu

PL 215 228 B1

W THF (2,5 I) rozpuszczono te/t-butyloaminę (315,3 ml, 3,0 mole). Roztwór schłodzono do temperatury -20°C i następnie dodano powoli chlorek 3-chloropropanosulfonylu (182,4 ml, 1,5 mola). Mieszaninę reakcyjną pozostawiono do ocieplenia do temperatury pokojowej i mieszano przez 24 godziny. Mieszaninę reakcyjną przefiltrowano, po czym filtrat zatężono pod próżnią. Pozostałość rozpuszczono w CH2Cl2 (2,0 I). Otrzymany roztwór przemyto 1N roztworem HCl (1,0 I), wodą (1,0 I) i solanką (1,0 I), po czym osuszono nad siarczanem sodu. Roztwór przefiltrowano i zatężono pod próżnią, otrzymując substancję stałą koloru jasnożółtego, którą krystalizowano z heksanu. Otrzymano w wyniku produkt w postaci substancji stałej koloru białego (316,0 g, 99%).

¹H-NMR (CDCl3) δ: 1,38 (s, 9H), 2,30 - 2,27 (m, 2H), 3,22 (t, J = 7,35 Hz, 2H), 3,68 (t, J = 6,2 Hz, 2H), 4,35 (b, 1H).

Etap 2: Wytwarzanie fe/Y-butyloamidu kwasu cyklopropanosulfonowego

Roztwór N-te/t-butylo-(3-chloro)propylosulfonamidu (2,14 g, 10,0 mmoli) w THF (100 ml) dodano w temperaturze -78°C n-butylolit (roztwór 2,5M w heksanie, 8,0 ml, 20,0 mmoli). Mieszaninę reakcyjną pozostawiono na 1 godzinę do ocieplenia do temperatury pokojowej. Składniki lotne usunięto pod próżnią. Pozostałość rozdzielono pomiędzy octan etylu i wodę (200 ml, 200 ml). Oddzieloną fazę organiczną przemyto solanką, następnie osuszono nad siarczanem sodu, po czym przefiltrowano i zatężono pod próżnią. Pozostałość rekrystalizowano z heksanu, otrzymując żądany produkt w postaci substancji stałej koloru białego (1,0 g, 56%).

¹H-NMR (CDCl3) δ: 0,98 - 1, 00 (m, 2H), 1,18 - 1,19 (m, 2H), 1,39 (s, 9H), 2,48 - 2,51 (m, 1H), 4,19 (b, 1H).

Etap 3: Wytwarzanie cyklopropylosulfonamidu

Roztwór Yfe/Y-butyloamidu kwasu cyklopropanosulfonowego (110,0 g, 0,62 mola) w TFA (500 ml) mieszano w temperaturze pokojowej przez 16 godzin. Składniki lotne usunięto pod próżnią. Pozostałość rekrystalizowano z mieszaniny octan etylu/heksan (60 ml/240 ml), otrzymując żądany produkt w postaci substancji stałej koloru białego (68,5 g, 91%).

¹H NMR (DMSOd6) δ: 0,84 - 0,88 (m, 2H), 0,95 - 0,98 (m, 2H), 2,41 - 2,58 (m, 1H), 6,56 (b, 2H).

2. Wytwarzanie cyklobutylosulfonamidu

Roztwór bromku cyklobutylu (5,0 g, 37,0 mmoli) w 30 ml bezwodnego eteru dietylowego (Et2O), schłodzonego do temperatury -78°C, dodano 44 ml (74,8 mmoli) 1,7M roztworu Yfe/Y-butylolitu w pentanach, po czym roztwór ogrzewano powoli przez 1,5 godziny do temperatury -35°C. Tę mieszaninę przeniesiono powoli poprzez kaniulę do roztworu świeżo destylowanego chlorku sulfurylu (5,0 g, 37,0 mmoli) w 100 ml heksanów, schłodzonego do temperatury -40°C, następnie ogrzewano przez 1 godzinę do temperatury 0°C i ostrożnie zatężono pod próżnią. Mieszaninę tę rozpuszczono ponownie w Et2O, następnie przemyto jeden raz małą ilością wody lodowej, po czym osuszono nad siarczanem magnezu i ostrożnie zatężono. Tę mieszaninę rozpuszczono ponownie w 20 ml THF, następnie wkroplono do 500 ml nasyconego roztworu NH3 w THF i pozostawiono do wymieszania na okres nocy.

PL 215 228 B1

Mieszaninę zatężono pod próżnią aż do uzyskania surowej substancji stałej koloru żółtego i rekrystalizowano z minimalnej ilości CH2Cl2 w heksanach z 1-2 kroplami metanolu, otrzymując 1,90 g (38%) cyklobutylosulfonamidu w postaci substancji stałej koloru białego.

¹H-NMR (CDCl3) δ: 1,95 - 2,06 (m, 2H), 2,30 - 2,54 (m, 4H), 3,86 (p, J = 8 Hz, 1H), 4,75 (szerokie s, 2H).

¹³C NMR (CDCl3) δ: 16,43, 23,93, 56,29.

HRMS: m/z (M-H)^-:

obliczono dla C4H8NSO2 - 134, 0276; znaleziono - 134.0282.

3. Wytwarzanie cyklopentylosulfonamidu

Roztwór 2M chlorku cyklopentylomagnezu (18,5 ml (37,0 mmoli) w eterze wkroplono do schłodzonego do temperatury -78°C roztworu świeżo destylowanego chlorku sulfurylu (3,0 ml, 37,0 mmol) (otrzymanego z firmy Aldrich) w 100 ml heksanów. Mieszaninę reakcyjną ogrzewano przez 1 godzinę do temperatury 0°C i następnie ostrożnie zatężono pod próżnią. Tę mieszaninę rozpuszczono ponownie w Et2O (200 ml), następnie przemyto jeden raz małą ilością wody lodowej (200 ml), po czym osuszono nad siarczanem magnezu i ostrożnie zatężono. Tę mieszaninę rozpuszczono ponownie w 35 ml THF, następnie wkroplono do 500 ml nasyconego roztworu NH3 w THF i pozostawiono do wymieszania na okres nocy. Mieszaninę reakcyjną zatężono pod próżnią aż do uzyskania surowej substancji stałej koloru żółtego, po czym pozostałość przefiltrowano przez 50 g żelu krzemionkowego, z zastosowaniem jako eluentu mieszaniny 70% octan etylu/heksany i następnie roztwór zatężono. Pozostałość rekrystalizowano z minimalnej ilości CH2Cl2 w heksanach z 1-2 kroplami metanolu, otrzymując 2,49 g (41%) cyklopentylosulfonamidu w postaci substancji stałej koloru białego.

¹H NMR (CDCl3) δ: 1,58 - 1,72 (m,2H), 1,74 - 1,88 (m, 2H), 1,94 - 2,14 (m, 4H), 3,48 - 3,59 (m, 1H), 4,80 (bs, 2H).

¹³C NMR (CDCl3) δ: 25,90, 28,33, 63,54.

MS: m/e = 148 (M-H)^-.

4. Wytwarzanie cykloheksylosulfonamidu

Roztwór 2M chlorku cykloheksylomagnezu (18,5 ml (37,0 mmoli) (TCI Americas) w eterze wkroplono do schłodzonego do temperatury -78°C roztworu świeżo destylowanego chlorku sulfurylu (3,0 ml, 37,0 mmol) w 100 ml heksanów. Mieszaninę reakcyjną ogrzewano przez 1 godzinę do temperatury 0°C i następnie ostrożnie zatężono pod próżnią. Tę mieszaninę rozpuszczono ponownie w Et2O (200 ml), następnie przemyto jeden raz małą ilością wody lodowej (200 ml), po czym osuszono nad siarczanem magnezu i ostrożnie zatężono. Tę mieszaninę rozpuszczono ponownie w 35 ml THF, następnie wkroplono do 500 ml nasyconego roztworu NH3 w THF i pozostawiono do wymieszania na okres nocy. Mieszaninę reakcyjną zatężono pod próżnią aż do uzyskania surowej substancji stałej koloru żółtego, po czym pozostałość przefiltrowano przez 50 g żelu krzemionkowego, z zastosowaniem jako eluentu mieszaniny 70% octan etylu/heksany i następnie roztwór zatężono. Pozostałość rekrystalizowano z minimalnej ilości CH2Cl2 w heksanach z 1-2 kroplami metanolu, otrzymując 1,66 g (30%) cykloheksylo-sulfonamidu w postaci substancji stałej koloru białego.

¹H-NMR (CDCl3) δ: 1,11-1,37 (m, 3H), 1,43 - 1,56 (m, 2H), 1,67 - 1,76 (m, 1H), 1,86 - 1,96 (m, 2H), 2,18 - 2,28 (m, 2H), 2,91 (tt, J = 12, 3,5 Hz, 1H), 4,70 (bs, 2H).

^13cHNMR (CDCl3) δ: 25,04, 25,04, 26,56, 62,74.

MS: m/e = 162 (M-1)^-.

PL 215 228 B1

5. Wytwarzanie neopentylosulfonamidu

Postępując zgodnie z procedurą stosowaną przy wytwarzaniu cykloheksylosulfonamidu, 0,75M roztwór chlorku neopentyIomagnezu (Alfa) w eterze (49 ml, 37 mmoli) przekształcono w 1,52 g (27%) neopentylosulfonamidu w postaci substancji stałej koloru białego.

¹H-NMR (CDCl3) δ: 1,17 (s, 9H), 3,12 (s, 2H), 4,74 (szerokie s, 2H).

¹³CNMR (CDCl3) δ: 29,46, 31,51, 67,38.

MS: m/e = 150 (M-1)^-.

6. Wytwarzanie cyklobutylometylosulfonamidu

Roztwór zawierający 12,3 g (83 mmole) bromku cyklobutylometylu (Aldrich) i 13,7 g (91 mmoli) jodku sodu w 150 ml acetonu ogrzewano przez okres nocy, utrzymując w stanie wrzenia pod chłodnicą zwrotną i następnie schłodzono do temperatury pokojowej. Nieorganiczne substancje stałe odfiltrowano oraz oddestylowano aceton i jodek cyklopropylometylu (8,41 g, 46%), odpowiednio w temperaturze otoczenia i w temperaturze 80°C i pod ciśnieniem 150 torów.

Roztwór jodku cyklobutylometylu 4,0 g (21,98 mmoli) w 30 ml bezwodnego eteru dietylowego (Et2O), schłodzony do temperatury -78°C, wprowadzono za pomocą kaniuli do roztworu zawierającego 17 ml (21,98 mmoli) 1,3M roztworu sfec-butylolitu w cykloheksanach i następnie roztwór mieszano przez 5 minut. Do tej mieszaniny wprowadzono poprzez kaniulę roztwór zawierajacy 3,0 g (21,98 mmoli) schłodzonego do temperatury -78°C, świeżo destylowanego chlorku sulfurylu w 100 ml heksanów, po czym mieszaninę ogrzewano przez 1 godzinę do temperatury pokojowej i następnie ostrożnie zatężono pod próżnią. Tę mieszaninę ponownie rozpuszczono w Et2O, następnie przemyto jeden raz małą ilością wody lodowej, po czym osuszono (MgSO4) i ostrożnie zatężono. Tę mieszaninę rozpuszczono ponownie w 30 ml THF i wkroplono do 500 ml nasyconego roztworu NH3 w THF i pozostawiono do wymieszania przez okres nocy. Mieszaninę reakcyjną zatężono pod próżnią aż do otrzymania surowej substancji stałej koloru żółtego, którą rekrystalizowano z minimalnej ilości CH2Cl2 w heksanach z 1-2 kroplami metanolu. Otrzymano 1,39 g (42%) cyklobutylometylosulfonamidu w postaci substancji stałej koloru białego.

¹H-NMR (CDCl3) δ: 1,81 - 2,03 (m, 4H), 2,14 - 2,28 (m, 2H), 2,81 - 2,92 (m, 1H), 3,22 (d, J = 7 Hz, 2H), 4,74 (szerokie s, 2H).

¹³C NMR (CDCl3) δ: 19,10, 28,21, 30,64, 60,93.

MS: m/e = 148 (M-1)^-.

Czas retencji (metoda B) - 1,72, 818 (M⁺+H).

7. Wytwarzanie cyklopropylometylosulfonamidu ο

S-NH,

II ² ο

Stosując procedurę wykorzystywaną przy otrzymywaniu cyklobutylometylosulfonamidu, wytworzono cyklopropylometylosulfonamid z zastosowaniem jako substratu bromku cyklopropylometylu (Aldrich) (patrz także JACS 1981, strony 442-445).

PL 215 228 B1 ¹H-NMR (CDCl3) δ: 0,39-0,44 (m, 2H), 0,67-0,76 (m, 2H), 1,13-1,27 (m, 1H), 3,03 (d, J =7,3 Hz, 2H), 4,74 (szerokie s, 2H).

¹³C NMR (CDCl3) δ: 4,33, 5,61, 59,93.

MS: m/e = 134 (M-1).

8. Wytwarzanie 2-tiofenosulfonamidu

2-tiofenosulfonamid wytworzono z chlorku 2-tiofenosulfonylu dostarczonego przez firmę Aldrich, z zastosowaniem metody Steinkopfa i Hoepnera, Justus Liebigs Ann. Chem., 501, 1933, strony 174-182.

9. 4-bromobenzenosulfonamidu

O ii

Br—C p— S-NH₂

O

4-Bromofenylosulfonamid wytworzono w reakcji dostępnego w handlu chlorku bromosulfonylu z nasyconym roztworem amoniaku w THF.

10. Wytwarzanie cyklopropanosulfonamidów podstawionych w pozycji 1.

la) fc-butyloamina l-pot Ib-Io) n-butylolit (2 równ.);

n-butylolit (1 równ.; elektrofil Id) TFA

---,-,—,—...-------------->.

o o

t\_J —s~nh₂

Etap 1: Wytwarzanie M-te/t-butylo-(3-chloro)propylosuIfonamidu (opisany powyżej)

Etap 2: Wytwarzanie M-te/t-butylo-(1-metylo)cyklopropylosulfonamidu

Roztwór N-tert-butylo-(3-chloro)propylosulfonamidu (4,3 g, 20 mmoli) rozpuszczono w osuszonym THF (100 ml) i schłodzono do temperatury -78°C. Do tego roztworu dodano powoli n-butylolit (17,6 ml, 44 mmoli, 2,5 M roztwór w heksanie). Następnie usunięto łaźnię z suchym lodem, po czym mieszaninę reakcyjną pozostawiono do ocieplenia na 1,5 godziny do temperatury pokojowej. Następnie, mieszaninę tę schłodzono do temperatury -78°C, po czym dodano roztwór n-butylolitu (20 mmoli, 8 ml, 2,5M roztwór w heksanie). Mieszaninę reakcyjną ogrzano do temperatury pokojowej, ponownie schłodzono przez okres 2 godzin do temperatury -78°C i dodano czysty roztwór jodku metylu (5,68 g, 40 mmoli). Mieszaninę reakcyjną pozostawiono na okres nocy do ocieplenia do temperatury pokojoPL 215 228 B1 wej, następnie reakcję zgaszono w temperaturze pokojowej nasyconym roztworem NH4Cl (100 ml). Następnie, mieszaninę reakcyjną ekstrahowano octanem etylu (100 ml). Fazę organiczną przemyto solanką (100 ml), osuszono (MgSO4) i zatężono pod próżnią, otrzymując olej koloru żółtego, który poddano krystalizacji z heksanu. Otrzymano produkt w postaci oleju koloru jasnożółtego (3,1 g, 81%).

¹H-NMR (CDCl3) δ: 0,79 (m, 2H), 1,36 (s, 9H), 1,52 (m, 2H), 1,62 (s, 3H), 4,10 (bs, 1H).

Etap 3: Wytwarzanie 1-metylocyklopropylosulfonamidu z przykładu 3

O

7Λ

Roztwór N-tert-butylo-(1-metylo)cyklopropylosulfonamidu (1,91 g, 10 mmoli) rozpuszczono w TFA (30 ml) i następnie mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 16 godzin. Rozpuszczalnik usunięto pod próżnią, otrzymując olej koloru żółtego, który krystalizowano z mieszaniny octan etylu/heksan (1:4, 40 ml), otrzymując 1-metylocyklopropylosulfonamid z przykładu 3, w postaci substancji stałej koloru białego (1,25 g, 96%).

¹H-NMR (CDCl3) δ: 0,84 (m, 2H), 1,41 (m, 2H), 1,58 (s, 3H), 4,65 (bs, 2H).

Analiza elementarna:

obliczono dla C4H9NO2S - C, 35,54; H, 6,71; N, 10,36; znaleziono - C, 35,67; H, 6,80; N, 10,40.

Wytwarzanie N-ferf-butylo-(1-allilo)cyklopropylosulfonamidu

Etap 1:

Związek ten, to jest W-ferf-butylo-(1-allilo)-cyklopropylosulfonamid wytworzono z wydajnością 97%, postępując zgodnie z procedurą opisaną przy wytwarzaniu N-tert-butylo-(1-metylo)cyklopropylosulfonamidu, z tą różnicą, że reagentem elektrofilowym był bromek allilu (1,25 równoważnika). Związek użyto w następnym etapie bez dodatkowego oczyszczania.

¹H-NMR (CDCl3) δ: 0,83 (m, 2H), 1,34 (s, 9H), 1,37 (m, 2H), 2,64 (d, J = 7,3 Hz, 2H), 4,25 (bs, 1H), 5,07 - 5,10 (m, 2H), 6,70 - 6,85 (m, 1H).

Etap 2: Wytwarzanie 1-allilocyklopropylosulfonamidu z przykładu 4

Związek ten, to jest 1-allilocyklopropylosulfonamid wytworzono z wydajnością 40% z N-tertbutylo-(1-allilo)-cyklopropylosulfonamidu, postępując zgodnie z procedurą opisaną przy wytwarzaniu 1-metylocyklopropylosulfonamidu. Związek oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym, z zastosowaniem jako eluentu 2% metanolu w CH2Cl2.

¹H-NMR (CDCl3) δ: 0,88 (m, 2Η), 1,37 (m, 2H), 2,66 (d, J = 7,0 Hz, 2H), 4,80 (s, 2H), 5,16 (m, 2H), 5,82 (m, 1H).

¹³C NMR (CDCl3) δ: 11,2, 35,6, 40,7, 119,0, 133,6.

Wytwarzanie N-ferf-butylo-[1-(1-hydroksy)cykloheksylo]-cyklopropylosulfonamidu

Etap 1:

PL 215 228 B1

Związek ten wytworzono z wydajnością 84%, postępując zgodnie z procedurą opisaną przy wytwarzaniu N-te/t-butylo-(1-metylo)cyklopropylosulfonamidu, z tą różnicą, że użyto 1,30 równoważnika cykloheksanonu i że zastosowano rekrystalizację z minimalnej ilości 20% roztworu octanu etylu w heksanie.

¹H-NMR (CDCl3) δ: 1,05 (m, 4H), 1,26 (m, 2H), 1,37 (s, 9H), 1,57 - 1,59 (m, 6H), 1,97 (m, 2H), 2,87 (bs, 1H), 4,55 (bs, 1H).

Etap 2: Wytwarzanie 1-(1-cykloheksenylo)cyklopropylosulfonamidu

Związek ten, to jest 1-(1-cykloheksenylo)-cyklopropylosulfonamid, wytworzono z wydajnością 85% z N-te/t-butylo-[1-(1-hydroksy)cykloheksylo]cyklopropylosulfonamidu z zastosowaniem procedury opisanej przy wytwarzaniu 1-metylocyklopropylosulfonamidu i następnie przeprowadzono rekrystalizację z minimalnej ilości octanu etylu i heksanu.

¹H-NMR (DMSO-d6) δ: 0,82 (m, 2H), 1,28 (m, 2H), 1,51 (m, 2H), 1,55 (m, 2H), 2,01 (s, 2H), 2,16 (s, 2H), 5,89 (s, 1H), 6,46 (s, 2H).

¹³C NMR (DMSO-d6) δ: 11,6, 21,5, 22,3, 25,0, 27,2, 46,9, 131,6, 132,2.

LR-MS (ESI): 200 (M⁺-1).

Wytwarzanie N-fe/Y-butylo-(1-benzoilo]-cyklopropylosulfonamidu '5 6

Etap 1:

Związek ten wytworzono z wydajnością 66% postępując zgodnie z procedurą opisaną przy wytwarzaniu N-te/t-butylo-(1-metylo)cyklopropylosulfonamidu, z tą różnicą, że reagentem elektrofi lowym był benzoesan metylu (1,2 równoważnika). Związek oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym, stosując jako eluent od 30% do 100% CH2Cl2 w heksanie.

¹H-NMR (CDCl3) δ: 1,31 (s, 9H), 1,52 (m, 2H), 1,81 (m, 2H), 4,16 (bs, 1H), 7,46 (m, 2H), 7,57 (m, 1H), 8,05 (d, J = 8,5 Hz, 2H).

Etap 2 : Wytwarzanie 1-benzoilocyklopropylosulfonamidu

Ten związek, to jest 1-benzoilocyklopropylosulfonamid, wytworzono z wydajnością 87% z N tertbutylo-(1-benzoilo)cyklopropylosulfonamidu z zastosowaniem procedury opisanej przy wytwarzaniu 1-metylocyklopropylosulfonamidu i następnie przeprowadzono rekrystalizację z minimalnej ilości octanu etylu w heksanie.

¹H NMR (DMSO-d6) δ: 1,39 (m, 2H), 1,61 (m, 2H), 7,22 (s, 2H), 7,53 (t, J =7,6 Hz, 2H), 7,65 (t, J = 7,6 Hz, 1H), 8,06 (d, J = 8,2 Hz, 2H).

¹³C NMR (DMSO-d6) δ: 12,3, 48,4, 128,1, 130,0, 133,4, 135,3, 192,0.

Wytwarzanie N-terf-butylo-(1-benzylo)cyklopropylosulfonamidu

Etap 1:

PL 215 228 B1

Związek ten wytworzono z wydajnością 60%, stosując procedurę opisaną przy wytwarzaniu N-tert-butylo-(1-metylo)-cyklopropylosulfonamidu, z tą różnicą, że użyto 1,05 równoważnika bromku benzylu i następnie przeprowadzono rozcieranie z mieszaniną 10% octanu etylu w heksanie.

¹H-NMR (CDCl3) δ: 0,92 (m, 2H), 1,36 (m, 2H), 1,43 (s, 9H), 3,25 (s, 2H), 4,62 (bs, 1H), 7,29 7,36 (m, 5H).

Etap 2: Wytwarzanie 1-benzylocyklopropylosulfonamidu

Związek ten, to jest 1-benzylocyklopropylosulfonamid z przykładu 7, wytworzono z 66% wydajnością z N-tert-butylo-(1-benzylo)cyklopropylosulfonamidu z zastosowaniem procedury opisanej przy wytwarzaniu 1-metylocyklopropylosulfonamidu i następnie przeprowadzono rekrystalizację z minimalnej ilości mieszaniny zawierającej 10% octanu etylu w heksanie.

¹H-NMR (CDCl3) δ: 0,90 (m, 2H), 1,42 (m, 2H), 3,25 (s, 2H), 4,05 (s, 2H), 7,29 (m, 3H), 7,34 (m, 2H).

¹³C NMR (CDCl3) δ: 11,1, 36,8, 41,9, 127,4, 128,8, 129,9, 136,5.

Wytwarzanie M-fert-butylo-(1-fenyloaminokarboksy)-cyklopropylosulfonamidu

Etap 1:

Związek ten wytworzono z wydajnością 42% z zastosowaniem procedury opisanej przy wytwarzaniu N-tert-butylo-(1-metylo)-cyklopropylosulfonamidu, z tą różnicą, że użyto 1 równoważnik izocyjanianu fenylu i następnie przeprowadzono rekrystalizację z minimalnej ilości mieszaniny zawierającej octan etylu w heksanie.

¹H-NMR (CDCl3) δ: 1,38 (s, 9H), 1,67 - 1,71 (m, 4H), 4,30 (bs, 1H), 7,10 (t, J = 7,5 Hz, 1H), 7,34 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 7,53 (t, J = 7,5 Hz, 2H).

Etap 2: Wytwarzanie 1-(fenyloaminokarboksy)cyklopropylosulfonamidu

Etap 2:

1-(Fenyloaminokarboksy)cyklopropylosulfonamid wytworzono z 75% wydajnością z N-tertbutylo-(1-fenyloaminokarboksy)- cyklopropylosulfonamidu z zastosowaniem procedury opisanej przy wytwarzaniu 1-metylocyklopropylosulfonamidu i następnie przeprowadzono rekrystalizację z minimalnej ilości mieszaniny zawierającej octan etylu w heksanie.

¹H-MMR (CDCl3) δ: 1,70 (m, 2H), 1,75 (m, 2H), 4,85 (s, 2H), 7,16 (t, J = 7,6 Hz, 1H), 7,35 (t, J = 7,6 Hz, 2H), 7,53 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 9,25 (s, 1H).

P r z y k ł a d 13

Badania biologiczne

Oznaczenie kompleksu zrekombinowanej proteazy NS3/4A HCV z użyciem testu peptydowego FRET

Celem tego testu in vitro był pomiar hamowania aktywności kompleksów proteazy NS3 HCV, pochodzących ze szczepów BMS, H77C lub J416S, jak opisano poniżej, przez związki według wynalazku. Test ten dostarcza informacji dotyczących skuteczności związków według niniejszego wynalazku w hamowaniu aktywności proteolitycznej HCV.

100

PL 215 228 B1

Surowicę od pacjenta zakażonego HCV otrzymano od Dr. T. Wrighta, San Francisco Hospital. Zaprojektowaną pełnej długości matrycę cDNA (komplementarny kwas dezoksyrybonukleinowy) genomu HCV (szczep BMS) skonstruowano na podstawie fragmentów DNA otrzymanych w PCR sprzężonej z odwrotną transkrypcją (RT-PCR) z surowicy RNA (kwas rybonukleinowy) i stosując startery wybrane na podstawie homologii pomiędzy innymi szczepami ο genotypie 1a. Na podstawie oznaczenia całej genomowej sekwencji izolatowi HCV przypisano genotyp 1a zgodnie z klasyfikacją Simmondsa i współpracowników (patrz P. Simmonds, K.A. Rose, S. Graham, S.W. Chan, F. McOmish,

B. C. Dow, E.A. Follett, P. L. Yap i H. Marsden, J. Clin. Microbiol., 31(6), strony 1493-1503 (1993)). Wykazano, że sekwencja aminokwasowa niestrukturalnego regionu, NS2-5B, będzie identyczna w >97% z genotypem 1a HCV (H77C) i w 87% identyczna z genotypem 1b (J4L6S). Klony infekcyjne, H77C (genotyp 1a) i klony infekcyjne J4L6S, H77C (genotyp 1a) i J4L6S (genotyp 1b) otrzymano od R. Purcella (NIH) i sekwencje opublikowano w Genbank (AAB67036, patrz Yanagi M., Purcell R.H., Emerson S.U. i Bukh, J. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 94(16), strony 8738-8743 (1997); AF054247, patrz Yanagi M., St Claire M., Shapiro M., Emerson S.U., Purcell R.H. i Bukh, J. Virology 244 (1), strony 161-172. (1998)).

Do uzyskania zrekombinowanych kompleksów proteazy NS3/4A wykorzystano szczepy BMS, H77C i J4L6S. DNA kodujący zrekombinowany kompleks proteazy NS3/4A HCV (aminokwasy od 1027 do 1711) dla tych szczepów poddano obróbce jak to opisali P. Gallinari i współpracownicy (patrz Gallinari P., Paolini

C. , Brennan D., Nardi C., Steinkuhler C., De Francesco R., Biochemistry, 38 (17), strony 5620-32, (1999)). Pokrótce, etykietę złożoną z trzech lizyn zapewniającą rozpuszczalność dodano na końcu 3' regionu kodującego NS4A. Resztę cysteiny w pozycji P1 tworzącą miejsce cięcia NS4A-NS4B (aminokwas 1711) zmieniono na resztę glicyny, aby uniknąć proteolitycznego cięcia końca lizynowego. Ponadto, metodą PCR wprowadzono mutację cysteiny na serynę w pozycji 1454 reszty aminokwasowej, aby zapobiec autolitycznemu cięciu w domenie helikazy NS3. Fragment wariantu DNA klonowano stosując bakteryjny wektor ekspresyjny pET21b (Novagen) i prowadzono ekspresję kompleksu NS3/4A w komórkach Escherichia coli, szczepu BL21 (DE3) (Invitrogen) zgodnie z protokołem opisanym przez P. Gallinariego i współpracowników (patrz Gallinari P., Brennan D., Nardi C., Brunetti M., Tomei L., Steinkuhler C., De Francesco ff.. J. Virol., 72 (8), strony 6758-69 (1998)) z modyfikacjami. Pokrótce, ekspresję NS3/4A indukowano 0,5 mM izopropylo β-D-1-tiogalaktopiranozydem (IPTG) przez 22 godziny w temperaturze 20°C. Typowa wydajność fermentacji (10 I) wynosiła około 80 g wilgotnej pasty komórkowej. Komórki ponownie zawieszono w buforze do Iizy (10 ml/g) składającym się z 25 mM kwasu N-(2-hydroksyetylo)piperazyno-N'-(2etanosulfonowego) (HEPES), pH = 7,5, 20% glicerolu, 500 mM chlorku sodu (NaCl), 0,5% Triton-X100, 1 μg/ml lizozymu, 5 mM chlorku magnezu (MgCl₂), 1 μg/ml Dnazy I, β-merkaptoetanolu (βΜΕ), inhibitora proteazy - wolnego kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (Roche), homogenizowano i inkubowano przez 20 min w temperaturze 4°C. Homogenat poddano działaniu ultradźwięków i klarowano stosując jednogodzinne ultrawirowanie przy 235000 g, w temperaturze 4°C. Do supernatantu dodano imidazol aż do uzyskania końcowego stężenia 15 mM i doprowadzono odczyn do pH = 8,0. Nieoczyszczony surowy ekstrakt białkowy wprowadzono na kolumnę Nikiel - kwas nitrylotrioctowy (Ni-NTA) wstępnie zrównoważoną buforem B (25 mM HEPES, pH = 8,0, 20% glicerol, 500 mM NaCl, 0,5% Triton-X100, 15 mM imidazol, 5 mM βΜΕ). Próbkę wprowadzono przy objętościowym natężeniu przepływu przepływu 1 ml/min. Kolumnę przemyto 15 objętościami kolumny buforu C (taki sam jak bufor B za wyjątkiem 0,2% Triton -X100). Białko wymywano buforem D stosując 5 objętości kolumny (taki sam jak bufor C za wyjątkiem 200 mM imidazolu).

Frakcje zawierające kompleks proteazy NS3/4A zebrano i wprowadzono na kolumnę odsalającą Superdex-S200 wstępnie zrównoważoną buforem D (25 mM HEPES, pH = 7,5, 20% glicerol, 300 mM NaCl, 0,2% Triton-X100, 10 mM (βΜΕ). Próbkę wprowadzono przy objętościowym natężeniu przepływu wynoszącym 1 ml/min. Frakcje zawierające kompleks proteazy NS3/4A zebrano i zatężono do około 0,5 mg/ml. Stosując SDS-PAGE i analizę metodą spektrometrii mas stwierdzono, że czystość kompleksów proteazy NS3/4A pochodzących ze szczepów BMS, H77C i J4L6S, jest większa od 90%.

Enzym przechowywany w temperaturze -80°C roztapiano w lodzie i przed użyciem rozcieńczano w buforze do badań. Substratem stosowanym do oznaczania proteazy NS3/4A, był RET Si (Resonance Energy Transfer Depsipeptide Substrate = substrat depsipeptydowy do rezonansowego przeniesienia energii z firmy AnaSpec Inc. Numer katalogowy 22991) (peptyd do FRET), opisany przez Talianiego i współpracowników w Anal. Blochfem., 240 (2), strony 60-67 (1996). Budowa sekwencji tego peptydu bazuje w przybliżeniu na naturalnym miejscu cięcia NS4A/NS4B z tym wyjątkiem, że w miejscu cięcia występuje wiązanie estrowe zamiast wiązania amidowego. Substrat peptydowy inkubowano z jednym z trzech zrekombinowanych kompleksów NS3/4A, przy braku lub w obecności

PL 215 228 B1

101 związku według niniejszego wynalazku, przy czym tworzenie się produktu reakcji fluorescencyjnej śledzono w czasie rzeczywistym stosując Cytofluor Series 4000.

Zastosowano następujące odczynniki otrzymane z GIBCO-BRL: HEPES i glicerol (ultraczysty). Sulfotlenek dimetylu (DMSO) otrzymano z firmy Sigma. β-Merkaptoetanol otrzymano z firmy Bio Rad. Skład buforu do testów był następujący: 50 mM HEPES, pH 7,5; 0,15 M NaCl; 0,1% Triton; 15% glicerol; 10 mM βΜΕ. Stężenie końcowe substratu: 2 μΜ (z 2 mM roztworu podstawowego w DMSO, przechowywanego w temp. -20°C). Stężenie końcowe NS3/4A typ 1a (1b) HCV: 2-3 nM (z 5 μΜ roztworu podstawowego w buforze składającym się z 25 mM HEPES, pH 7,5; 20% glicerolu; 300 mM NaCl; 0,2% Triton-X100; 10mM βΜΕ). W przypadku związków o sile działania zbliżonej do granicy testu, test przeprowadzono tak, aby był bardziej czuły dodając do buforu do testów 50 μg/ml BSA i obniżając końcowe stężenie proteazy do 300 pM.

Test wykonywano w 96-studzienkowej polistyrenowej czarnej szalce Falcon. Każda szalka zawierała 25 μl kompleksu proteazy NS3/4A w buforze do testu, 50 μl związku według niniejszego wynalazku w mieszaninie 10% DMSO/bufor do testów i 25 μl substratu w buforze do testu. Test kontrolny (bez związku) również przygotowano w takiej samej szalce do oznaczeń. Kompleks enzymatyczny mieszano ze związkiem lub roztworem kontrolnym przez 1 min przed rozpoczęciem reakcji enzymatycznej w wyniku dodania substratu. Szalki testowe odczytywano natychmiast stosując Cytofluor Series 4000 (Perspective Biosystems). Urządzenie ustawiono na odczyt fali emisyjnej o długości 340 nm i wzbudzenia o długości 490 nm w temp. 25°C. Reakcje prowadzono zwykle przez około 15 minut.

Procent hamowania obliczono stosując poniższe równanie:

100-[ ^Finh^Fcon) x 100] gdzie δF oznacza zmianę fluorescencji w zakresie linowym krzywej. Do danych hamowaniestężenie zastosowano nieliniowe dopasowywanie krzywej i stężenie prowadzące do 50% skuteczności (IC50) obliczono przez zastosowanie oprogramowania Excel X1-fit, stosując równanie:

y=A+((B-A)/(1+((C/x) “D))).

Stwierdzono, że wszystkie badane związki mają wartości IC50 wynoszące 2,3 μΜ lub mniej. Ponadto stwierdzono, że związki według niniejszego wynalazku, które badano przeciwko więcej niż jednemu typowi kompleksu NS3/4A, mają podobne właściwości hamujące lecz wszystkie związki wykazywały większą moc przeciwko szczepom 1b w porównaniu do szczepów 1a.

Testy specyficzności

Oznaczenie specyficzności wykonano, aby wykazać selektywność związków według niniejszego wynalazku w hamowaniu proteazy NS3/4A HCV, w porównaniu do innych proteaz serynowych lub cysteinowych.

Specyficzności związków według niniejszego wynalazku wyznaczono względem wielu różnych proteaz serynowych: Iudzkiej elastazy z plwociny (HS), elastazy z trzustki świni (PPE) i ludzkiej trzustkowej chymotrypsyny i jednej proteazy cysteinowej: ludzkiej wątrobowej katepsyny B. We wszystkich przypadkach zastosowano protokół z 96-studzienkowymi szalkami, stosując substrat kolorymetryczny p-nitroanilinę (pNA) specyficzny dla każdego enzymu, jak to opisano wcześniej (międzynarodowa publikacja patentowa numer WO 00/09543), z pewnymi modyfikacjami w oznaczeniach proteazy serynowej. Wszystkie enzymy zakupiono w firmie Sigma, podczas gdy substraty pochodziły z firmy Bachem.

Każdy test obejmował 2 godzinną wstępną inkubację enzymu z inhibitorem w temperaturze pokojowej, a następnie dodanie substratu i hydrolizę aż do uzyskania 30% przekształcenia, jak to zmierzono w czytniku mikroszalek Spectramax Pro. Stężenia związków były różne, od 100 do 0,4 μΜ w zależności od ich mocy.

Końcowe warunki i protokół każdego testu były następujące:

mM chlorowodorek Tris(hydroksymetylo)aminometanu (Tris-HCl) pH = 8, 0,5 M siarczan sodu (Na2SO4), 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 3% DMSO, 0,01% Tween-20 z:

133 μΜ sukc-AAA-pNA i 20nM HS lub 8 nM PPE; 100 μΜ sukc-AAPF-pNA i 250pM chymotrypsyna.

100 mM NaHPO4 (wodorofosforan sodu) pH = 6, 0,1 mM EDTA, 3% DMSO, 1 mM TCEP (chlorowodorek Tris(2-karboksyetylo)fosfiny), 0,01% Tween-20, 30pM Z-FR-pNA i 5nM katepsyna B (roztwór wyjściowy enzymu przed użyciem aktywowany w buforze zawierającym 20 mM TCEP).

102

PL 215 228 B1

Procent hamowania obliczono stosując wzór:

[1-((UVinh-UVblank)/(UVctl-UVblank))] x 100

Do analizy danych hamowanie-stężenie zastosowano nieliniowe dopasowywanie krzywej i stężenie przy skuteczności 50% (IC50) obliczono przez zastosowanie oprogramowania Excel X1-fit.

Oznaczanie replikonu HCV z zastosowaniem komórek

Układ: cała komórka z replikonem HCV uzyskano jak opisano w pracy Lohmanna V., Kornera F., Kocha J., Heriana U., Theilmanna L., Bartenschlagera R., Science, 285 (5424), strony 110-3 (1999). Układ ten umożliwił nam określenie działania naszych związków hamujących proteazę HCV na replikację RNA HCV. Pokrótce, stosując sekwencję szczepu 1B HCV opisaną w pracy Lohmanna (Numer dostępu: AJ238799), utworzono cDNA HCV kodujący wewnętrzne miejsce 5' dostępu rybosomu (internal ribosome entry site - IRES), gen oporności na neomycynę, EMCV (wirus zapalenia mózgu i mięśnia sercowego-)IRES i niestrukturalne białka HCV, NS3-NS5B oraz nie ulegający translacji region 3' (NTR). Transkryptami cDNA in viY/o transfekowano ludzką linię komórkową wątrobiaka Huh7. Selekcję komórek konstytutywnie prowadzących ekspresję replikonu HCV przeprowadzono na podstawie obecności markera selekcyjnego, neomycyny (G418). Otrzymane linie komórkowe charakteryzowano pod kątem produkcji w czasie nici sensowej (+) i antysensowej (-) RNA i produkcji białka.

Komórki Huh7, konstytutywnie prowadzące ekspresję replikonu HCV, hodowano w pożywce Dulbecco zmodyfikowanej według Eagle (DMEM) zawierającej 10% płodową surowicę cielęcą (FCS) i 1 mg/ml G418 (Gibco-BRL). Komórki wysiano na jedną noc przed badaniem (1,5 x 10⁴ komórek/studzienkę) w 96-studzienkowych sterylnych szalkach do hodowli tkankowej. Przygotowano próby kontrolne ze związkiem i bez związku w DMEM zawierającej 4% PCS, 1:100 penicylinę/streptomycynę, 1:100 L-glutaminę i 5% DMSO w szalce do rozcieńczeń (końcowe stężenie 0,5% DMSO w teście). Mieszaniny związek/DMSO dodano do komórek i inkubowano przez 4 dni w temp. 37°C. Po 45 dniach, szalki przemyto obficie roztworem soli zbuforowanej fosforanem (PBS) (3 razy 150 μ^. Komórki lizowano stosując 25 μl odczynnika do lizy zawierającego peptyd do FRET (RET S1, jak opisano w oznaczaniu enzymu in vitro). Odczynnik do oznaczenia Iizy wykonano z 5X komórkowego lucyferazowego odczynnika do Iizy komórek w hodowlach (Promega numer katalogowy E153A) rozcieńczonego do IX wodą destylowaną, do którego dodano NaCl do stężenia końcowego 150 mM. Peptyd do FRET rozcieńczono do stężenia końcowego 10 μΜ z roztworu wyjściowego 2 mM w 100% DMSO. Następnie, szalkę umieszczono w urządzeniu Cytofluor 4000, które ustawiono na długość fali wzbudzenia 340 nm / emisji 490 nm, automatyczny tryb dla 21 cykli i odczyt szalek w trybie kinetycznym. Wyznaczanie wartości EC50 przeprowadzono w sposób opisany przy oznaczaniu wartości IC50.

Wyznaczenie wartości EC50 w teście replikonu z FRET potwierdzono w drugim teście, którym był ilościowy test RNA. Komórki poddano lizie stosując zestaw Rneasy (Qiagen). Oczyszczony całkowity RNA normalizowano stosując RiboGreen (Jones L.J., Yue S.T., Cheung C.Y., Singer V.L., Anal. Chem., 265 (2), strony 368-74 (1998)) i oznaczono względną ilościową ekspresję RNA HCV, stosując procedurę Taqmana (Kolykhalov A.A., Mihalik K., Feinstone S.M., Rice C.M., Journal of Virology, 74, strony 2046-2051 (2000)) oraz zestaw Platinum Quantitative RT-PCR Thermoscript One-Step (Invitrogen numer katalogowy 11731-015). Pokrótce, RNA roztworzony w objętości < 1 ng) dodano do 20 μl gotowej mieszaniny (Ready-Mix) zawierającej następujące składniki: 1,25X mieszaninę do reakcji Thermoscript (zawierającą siarczan magnezu i 5'-trifosforany 2-dezoksynucleozydu (dNTPs)), 3 mM dNTP, 200 nM startera zgodnego z kierunkiem transkrypcji (sekwencja: 5'-gggagagccatagtggtctgc-3'), 600 nM startera przeciwnego do kierunku transkrypcji (5'-cccaaatctccaggcattga-3'), 100 nM sondy (5'-6-FAM-cggaattgccaggacgaccgg-BHQ-1-3')(FAM: Fluoresceinoaminoheksyloamidyt; BHQ: ciemny wygaszacz), 1 μΜ barwnik wzorcowy Rox (Invitrogen nr katalogowy 12223-012) i mieszaninę polimerazy Thermoscript Plus Platinum Taq. Wszystkie startery zaprojektowano stosując oprogramowanie ABI Prism 7700 i otrzymywano z Biosearch Technologies, Novato, CA. Próbki zawierające znane stężenia transkrytpu RNA HCV stosowano jako standardy. Stosując poniższy protokół pracy cyklicznej (50°C - 30 min; 95°C - 5 min; 40 cykli w temperaturze 95°C - 15 sekund, w temperaturze 60°C - 1 min), ekspresję RNA HCV określono ilościowo zgodnie z instrukcją Perkin-Elmera, przy użyciu detektora do wykrywania sekwencji ABI Prism 7700.

Test reporterowy z lucyferazą stosowano do potwierdzenia mocy związku w replikonie. Wykorzystanie oznaczenia replikonu z zastosowaniem układu reporterowego lucyferazy po raz pierwszy opisali Krieger i współpracownicy (Krieger N., Lohmann V. i Bartenschlager R., J. Virol., 75 (10), stroPL 215 228 B1

103 ny 4614-4624 (2001)). Konstrukcję replikonu opisaną dla testu FRET zmodyfikowano przez zastąpienie genu oporności na neomycynę przez fuzyjny gen oporności na blastycydynę z N-końcem humanizowanej postaci lucyferazy z Renilla (do wklonowania stosowano miejsca restrykcyjne Asc 1/Pme 1). Wprowadzono również mutację adaptacyjną w pozycji 1179 (seryna na izoleucynę) (Blight K. J., Kolykhalov A.A., Rice C.M., Scence, 290 ( 5498), strony 1972-1974). Test reporterowy z lucyferazą rozpoczęto przez wysianie komórek Huh7 dzień przed testem, przy gęstości 2 x 10⁶ komórek na kolbę T75. Komórki przemyto następnego dnia 7,5 ml Opti-MEM. Zgodnie z protokołem Invitrogen, 40 μΐ DMRIEC mieszano na mieszadle Vortex stosując 5 ml Opti-MEM przed dodaniem 5 μg reporterowego replikonu RNA HCV. Mieszaninę dodano do przemytych komórek Huh7 i pozostawiono na 4 godziny w temp. 37°C. W międzyczasie przygotowano w DMEM zawierającym 10% PCS i 5% DMSO serię rozcieńczeń związku i próby kontrolne bez związku, w szalce do rozcieńczeń (końcowe stężenie 0,5% DMSO w teście). Mieszaninę związek/DMSO dodano do każdej studzienki w 24-studzienkowej szalce. Po 4 godzinach, mieszaninę do transfekcji odessano i komórki przemyto 5 ml Opti-MEM przed trypsynizacją. Komórki trypsynizowane zawieszono ponownie w 10% DMEM i wysiano przy 2 x 10⁴ komórek/studzienkę w 24-studzienkowych szalkach zawierających związek lub kontrolnych, bez związków. Szalki inkubowano przez 4 dni. Po 4 dniach, pożywkę usunięto i komórki przemyto PBS. Natychmiast do każdej studzienki dodano 100 μΐ 1x Buforu do lizy z lucyferazą Renilla (Promega) i szalki zamrażano w temp. -80°C do dalszych analiz, lub testowano po 15 minutach lizy. Lizat (40 μθ z każdej studzienki przenoszono do 96-studzienkowej czarnej szalki (przezroczyste dno) a następnie dodano 200 μl 1x substratu do oznaczenia lucyferazy Renilla. Natychmiast szalki odczytywano stosując licznik Packard TopCount NXT i program do luminescencji.

Procent hamowania obliczono stosując poniższy wzór:

% kontroli = średni sygnał lucyferazy w studzienkach doświadczalnych (+ związek) średni sygnał lucyferazy w studzienkach kontrolnych z DMSO (- związek)

Wartości przedstawiono na wykresie i w celu otrzymania wartości EC50 analizowano stosując X1-fit.

Przykłady biologiczne

Reprezentatywne związki według wynalazku badano stosując oznaczenie w komórkach z replikonem HCV i/lub w kilku z opisanych testów na specyficzność. Na przykład w wyniku oznaczenia aktywności enzymu stwierdzono, że związek 8 wykazuje wartość IC50 równą 51 nM przeciwko NS3/4A szczepu BMS. Podobne wartości mocy otrzymano dla publikowanych szczepów H77C (IC50 wynosi 11 nM) i J4L6S (IC50 wynosi 9,5 nM). Wartość EC50 w teście replikonu wynosiła 284 nM.

W testach specyficzności wykryto, że te same związki charakteryzują się niżej przedstawioną aktywnością: HS = 35 μΜ; PPE > 50 μΜ; Chymotrypsin > 50 μΜ; Katepsyna B > 50 μΜ (graniczna rozpuszczalność przy 100 μΜ). Przedstawione wyniki wskazują, że ta rodzina związków jest wysoce specyficzna względem proteazy NS3 i wiele z jej członków hamuje replikację replikonu HCV.

Zbadano związki według obecnego wynalazku i stwierdzono, że ich aktywności mieszczą się w niżej podanych zakresach: Zakresy aktywności IC50):

zakres A >10 mikromolarny (μΜ); zakres B = 1-10 μΜ; zakres C = 0,1-1 μΜ; zakres D < 0,1 μΜ.

Zakresy aktywności EC50: zakres A > 10 mikromolarny (μΜ); zakres B = 1-10 μΜ; zakres C = 0,1-1 μΜ; zakres D < 0,1 μΜ.

Należy odnotować, że na podstawie podanego w poniższej tabeli numeru związku według wynalazku można, w oparciu o niniejszy opis, określić budowę związków.

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, biologiczna aktywność korzystnych związków (określona wskaźnikiem EC50) wynosi 10 μΜ lub poniżej, korzystniej 1 μΜ lub poniżej i najkorzystniej 0,1 μΜ lub poniżej.

104

PL 215 228 B1

Tabela aktywności
Numer związku	Zakres IC50	Zakres EC50
1	C	B
2	C	B
3	D	B
4	C	A
5	C	B
6	D	B
7	C	B
8	D	C
9	D	C
10	C	A
11	C	B
12	B	A
13	C	A
14	C	B
15	D	B
16	C	B
17	C	B
18	C	A
19	D	D
20	D	B
21	D	C
22	B
23	D	C
24	C	A
25	D	B
26	D	B
27	D	B
28	C	B
29	D	C
30	D	D
31	D	C
32	D	D
33	C	C
34	C	B
35	D	A
36	D	C

PL 215 228 B1

105 cd. tabeli

37	D	B
38	D	C
39	D	C
40	D	B
41	D	B
42	D	B
43	D	A
44	D	B
45	D	C
46	C	B
47	C	A
48	D	C
49	C	B
50	D	B
51	C	B
52	C	A
53	D	B
54	C	B
55	D	C
56	D	C
57	C	B
58	B
59	C	B
60	D	C
61	B
62	B
63	C	B
64	D	C
65	D	C
66	D	B
67	D	C
68	B
69	C	A
70	C	A
71	D	C
72	D	B
73	D	A
74	D	C

106

PL 215 228 B1 cd tabeli

75	C	A
76	D	C
77a	C	B
77b	C	A
78	C	A
79	D	C
80	D	D
81	D	D
82	D	C
83	D	D
84	D	C
85	D	C
86	D	C
87	D	D
88	D	A
89	D	C
90	D	D
91	D	C
92	D	D
93	D	C
94	D	D
95	D	C
96	D	D
97	D	D
98	D	D
99	D	D
100	D	D
101	D	B
102	A
103	A
104	B
105	A
106	A
107	A
108	A
109	A
110	D	C
111	D	C

PL 215 228 B1

Claims

1. Związki tripeptydowe o wzorze (I)

Y

A

O i ich farmaceutycznie dopuszczalne sole, w którym to wzorze (a) R1 oznacza H, C1-6alkil, allil lub fenyl;

R2 oznacza:

(i) C1-6alkil; C1-6alkil podstawiony przez grupę (C1-6-alkilo) - karboksy, naftyl, tiofenyl, fenyl, przy czym fenyl może być podstawiony przez atom fluorowca, C1-4alkil, C1-4alkoksyl; cykloheksyl; fenylocyklopropyl; allil; lub R2 oznacza pięcio- Iub sześcioczłonową grupę heterocykliczną zawierającą jeden lub dwa heteroatomy wybrane spośród atomu azotu, tlenu lub siarki i która to grupa może być podstawiona jeden do trzech razy atomem fluorowca, C1-4alkilem, grupą C1-4alkilokarboksy lub fenylem, przy czym w przypadku tiofenu może on być ewentualnie skondensowany z grupą tetrametylenową (-CH2)4-); lub (ii) fenyl; fenyl podstawiony jeden do trzech razy podstawnikami wybranymi z grupy obejmującej: atom fluorowca, C1-4-alkil, C1-4alkoksyl, grupę nitrową, grupę cyjanową, grupę C1-6alkilokarboksy, acetyl, metylosuifanyl, trifluorometyl, grupę fenoksy, grupę karboksy, benzoil, oksym benzoilu, fenyl; lub fenyl może być podstawiony pięcio- do dziewięcioczłonową grupą heterocykliczną zawierającą jeden do trzech heteroatomów wybranych spośród atomu azotu, tlenu lub siarki, przy czym sama grupa heterocykliczna może być podstawiona od dwóch do trzech razy przez etoksykarbonyl, metyl, grupę metoksy lub trifluorometyl;

(c) A oznacza -OH, grupę cyklopropylo-N(H)SO2-;

(d) R4 oznacza winyl;

(e) n oznacza 1;

(f) R3 oznacza t-butyl;

(g) Y oznacza H; i (h) B oznacza grupę (C1-6-alkilo)karboksy lub cyklopropylometylokarbonyl.

2. Związek według zastrz. 1, w którym R1 oznacza H, C1-6alkil, allil lub fenyl.

3. Związek według zastrz. 1, w którym R2 oznacza fenyl ewentualnie podstawiony C1-3alkilem, atomem chloru lub atomem fluoru w liczbie od jednego do trzech; albo R2 oznacza fenyl ewentualnie podstawiony fenylem, grupą metoksy, grupą fenoksy, grupą C2-4alkilokarboksy, C2-6alkanoilem, grupą nitrową, metylosulfanylem lub grupą karboksy.

4. Związek według zastrz. 1, w którym R2 oznacza C1-6alkil, cykloheksyl, przy czym te grupy mogą być ewentualnie podstawione fenylem.

5. Związek według zastrz. 1, w którym R2 oznacza sześcioczłonową grupę heterocykliczną ewentualnie podstawioną atomem chloru w liczbie od jednego do trzech lub atomem fluoru w liczbie jeden do trzech lub podstawioną grupą (C1-6-alkilo)karboksy.

6. Związek według zastrz. 1, w którym R2 oznacza allil.

7. Związek według zastrz. 1, w którym podstawniki R1 i R2 tworzą pięcio- lub sześcioczłonowy pierścień heterocykliczny zawierający ewentualnie atom tlenu.

108

PL 215 228 B1

8. Związek według zastrz. 1, w którym podstawniki R1 i R2 tworzą skondensowaną strukturę pierścieniową, zawierającą pięcio- i sześcioczłonowy pierścień.

9. Związek według zastrz. 1, w którym R4 oznacza allil.

10. Związek według zastrz. 1, w którym R3 oznacza t-butyl.

11. Związek według zastrz. 1, którym jest związek o wzorze

12. Związek według zastrz. 1, którym jest związek o wzorze:

13. Związek według zastrz. 1, którym jest związek o wzorze:

14. Związek według zastrz. 1, którym jest związek o wzorze:

PL 215 228 B1

109

15. Związek według zastrz. 1, którym jest związek o wzorze:

16. Związek według zastrz. 1, którym jest związek o wzorze:

Związek według zastrz. 1, którym jest związek o wzorze

18. Związek według zastrz. 1, którym jest związek o wzorze

110

PL 215 228 B1

19. Związek według zastrz. 1, którym jest związek o wzorze:

20. Związek według zastrz. 1, którym jest związek o wzorze:

21. Związek według zastrz. 1, którym jest związek o wzorze:

22. Zastosowanie związków tripeptydowych o wzorze (I) jak określono w zastrz. 1 do leczenia zakażenia wirusem HCV u pacjenta lub do hamowania protezy HCV NS3.

23. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca farmaceutycznie dopuszczalny nośnik i substancję czynną, znamienna tym, że zawiera jako substancję czynną związek jak określono w zastrz. 1.

24. Zastosowanie kompozycji farmaceutycznej jak określono w zastrz. 23 do wytwarzania leku do leczenia u pacjenta zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu C.