JP2011526893A - ウイルス感染の治療のための化合物、及び医薬組成物 - Google Patents
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Abstract
【選択図】 なし
Description
本出願は、2008年7月2日に出願された米国仮出願第61/133,844号、及び2009年1月27日に出願された第61/147,722号の優先権の利益を主張し、それぞれの開示は、これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる
その必要のある宿主において、C型肝炎ウイルス感染、及びB型肝炎ウイルス感染を含むウイルス感染の治療に使用するための化合物、方法、並びに医薬組成物が、本明細書に提供される。
(フラビウイルス科(flaviviridae)ウイルス)
ウイルスのフラビウイルス科ファミリーには、少なくとも3つの異なる属:ウシ、及びブタにおいて疾患を生じさせるペスチウイルス;デング熱、及び黄色熱などの疾患の原因であるフラビウイルス;並びにその唯一のメンバーがHCVであるヘパシウイルス;を含む。フラビウイルス属は、血清学的な関連性に基づいてグループ分けされた68を超えるメンバーを含む(Calisherらの文献、J. Gen. Virol、1993、70、37-43)。臨床症状は、一様ではなく、熱、脳炎、及び出血熱を含む(フィールズウイルス学(Fields Virology)、編集者:Fields, B. N.、Knipe、D. M.、及びHowley, P. M.、Lippincott-Raven Publishers、Philadelphia、PA、1996、Chapter 31、931-959)。ヒト疾患に関連した世界的懸念のフラビウイルスには、デング出血熱ウイルス(DHF)、黄熱ウイルス、ショック症候群、及び日本脳炎ウイルスを含む(Halstead, S. B.の文献、Rev. Infect. Dis., 1984, 6, 251-264;Halstead, S. B.の文献、Science、239:476-481、1988;Monath, T. P.の文献、New Eng. J. Med.、1988、319、641-643)。
C型肝炎ウイルス(HCV)は、世界的な慢性肝疾患の主因である。(Boyer, N.らの文献、J. Hepatol. 32:98-1 12, 2000)。HCVは、ゆっくりと増殖してウイルス感染を生じさせ、かつ肝硬変、及び肝臓癌の主な原因である(Di Besceglie, A. M.、及びBacon, B. R.の文献、Scientific American、10月:80-85, (1999);Boyer, N.らの文献 J. Hepatol. 32:98-112, 2000)。ほぼ170,000,000人の人々が、世界中でHCVに感染している。(Boyer, N.らの文献 J. Hepatol. 32:98-112,2000)。慢性C型肝炎感染によって生じる肝硬変は、米国において1年あたり8000〜12,000人の死亡の原因となっており、HCV感染は、肝移植のための主要な指標である。
特定の実施態様において、本明細書に提供される化合物は、式I
i)Raは、水素、又はアルキルであり、及びRbは、アルキル、シクロアルキル、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、又はジアルキルアミノアルキルであるか;又は、
ii)Ra、及びRbは、これらが置換される窒素原子と共に、1つ、又は2つのアルキル基で任意に置換された3〜7員の複素環、又はヘテロアリール環を形成する)。
(a)本明細書に記述したとおりの化合物、並びにその医薬として許容し得る塩、及び組成物;
(b)特にフラビウイルス科感染を有するか、又はC型肝炎により感染されることとなるリスクがあると診断された個体における、フラビウイルス科感染を含む肝臓障害の治療、及び/又は予防に使用するための本明細書に記述したとおりの化合物、並びにその医薬として許容し得る塩、及び組成物;
(c)本明細書に記述したとおりの化合物の製造方法;
(d)本明細書に記述したとおりの化合物又はその医薬として許容し得る塩を、医薬として許容し得る担体若しくは希釈剤と共に含む医薬製剤;
(e)本明細書に記述したとおりの化合物、又はその医薬として許容し得る塩を、一つ以上のその他の有効な抗HCV剤と共に、任意に医薬として許容し得る担体、又は希釈剤中に含む医薬品製剤;
(f)本明細書に記述したとおりの化合物、その医薬として許容し得る塩、又は組成物の有効量を投与することを含むフラビウイルス科に感染した宿主の治療、及び/又は予防のための方法;並びに、
(g)本明細書に記述したとおりの化合物、その医薬として許容し得る塩、又は組成物の有効量を、一つ以上の有効な抗HCV剤と組み合わせて、及び/又は交互に、投与することを含むフラビウイルス科に感染した宿主の治療、及び/又は予防のための方法。
対象におけるHCV感染などの肝臓障害を治療するために有用な化合物、組成物、及び方法が、本明細書に提供される。このような方法のために有用な剤形を更に提供してある。
本明細書に提供される化合物について言及するときに、以下の用語は、特に明記しない限り以下の意味を有する。
本明細書に提供される化合物は、2'-C-メチルグアノシンの誘導体である。化合物は、フラビウイルス科、及びC型肝炎感染の治療、及び/又は予防に有用である。
(a)約2.1分にてC-18(2)4.6×250mm 5μm粒径カラムから溶出する化合物、
(b)約6.2分にてC-18(2)4.6×250mm 5μm粒径カラムから溶出する化合物、
(c)約8.0分にてC-18(2)4.6×250mm 5μm粒径カラムから溶出する化合物、
(d)約9.4分にてC-18(2)4.6×250mm 5μm粒径カラムから溶出する化合物、
(e)約10.9分にてC-18(2)4.6×250mm 5μm粒径カラムから溶出する化合物、
(f)約12.4分にてC-18(2)4.6×250mm 5μm粒径カラムから溶出する化合物、
(g)約13.1分にてC-18(2)4.6×250mm 5μm粒径カラムから溶出する化合物、
(h)約17.1分にてC-18(2)4.6×250mm 5μm粒径カラムから溶出する化合物、
(i)約25.2分にてC-18(2)4.6×250mm 5μm粒径カラムから溶出する化合物、及び、
(j)約26.5分にてC-18(2)4.6×250mm 5μm粒径カラムから溶出する化合物、
からなる群から選択され、記述した保持時間は、実施例16に記載されているとおりのHPLC方法1で得られる化合物、その溶媒和物、水和物、立体異性形態、又は互変異性形態が本明細書に提供される。
(a)約38.4分にてC-18 4.6×250mm 5μm粒径カラムから溶出する化合物、
(b)約39.8分にてC-18 4.6×250mm 5μm粒径カラムから溶出する化合物、
(c)約36.8分にてC-18 4.6×250mm 5μm粒径カラムから溶出する化合物、
(d)約26.8分にてC-18 4.6×250mm 5μm粒径カラムから溶出する化合物、
(e)約33.8分にてC-18 4.6×250mm 5μm粒径カラムから溶出する化合物、
(f)約30.9分にてC-18 4.6×250mm 5μm粒径カラムから溶出する化合物、
(g)約4.6分にてC-18 4.6×250mm 5μm粒径カラムから溶出する化合物、及び、
(h)約28.1分にてC-18 4.6×250mm 5μm粒径カラムから溶出する化合物からなる群から選択され、かつ記述した保持時間は、実施例15に記載されているとおりのHPLC方法1で得られる化合物、その溶媒和物、水和物、立体異性形態、又は互変異性形態が本明細書に提供される。
i)Raは、水素であり;及びRbは、アルキル、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、又はジアルキルアミノアルキルであるか;又は、
ii)Ra、及びRbは、これらが置換される窒素原子と共に、1つ、又は2つのアルキル基で任意に置換された3〜7員の複素環を形成する。
本明細書に提供される化合物は、当業者に明らかな任意の方法によって調製すること、単離すること、又は得ることができる。例示的な調製法を下記の実施例に詳述してある。化合物1は、2007年12月27日に出願の米国出願第12/005937号に記述された方法によって調製することができる。
i)(分別結晶)-ジアステレオマーがそれらの溶解度の相違による分別結晶によって分離されることによる技術;
ii)(分留)-ジアステレオマーがこれらの沸点の相違による分留によって分離されることによる技術;
iii)(クロマトグラフ分離)-ジアステレオマーが定常状態でこれらの相互作用が異なることにより液体の移動相において分離されることによる技術;
iv)(化学的不斉合成)-キラル触媒、又はキラル助剤を使用して達成され得る、生成物の不斉性(すなわち、キラリティー)を生じる条件下で、所望のエナンチオマーをアキラル前駆体から合成することによる合成技術;
化合物は、当業者に公知の任意のアッセイ法に従って、HCV活性についてアッセイすることができる。更に、化合物は、当業者に公知の任意のアッセイに従って、対象の肝細胞における蓄積についてアッセイすることができる。特定の実施態様において、化合物は、対象に投与することができ、かつ対象の肝細胞を、化合物、又はその誘導体、例えばヌクレオシド、ヌクレオシドホスフェート、又はそのヌクレオシドトリホスフェート誘導体についてアッセイすることができる。
一つの実施態様において、本明細書に提供される化合物は、肝臓への送達を都合よく増強させることができる。一部の実施態様において、化合物は、ヌクレオシドの活性な5'-モノホスフェートの肝臓への送達を可能にし、これにより活性なトリホスフェート化された化合物の形成を増強することができる。
特定の実施態様において、本明細書に提供される化合物、及び組成物は、肝臓障害の治療の方法に有用であり、その必要のある対象におけるHCV感染などの障害の治療のために有効な第2の薬剤のさらなる投与を含む。第2の薬剤は、FDAによって現在承認されているものを含む、本障害の治療のために有効であることが当業者に公知の任意の薬剤であることができる。
特定の実施態様において、本明細書に提供した一つ以上の化合物は、抗C型肝炎ウイルスプロテアーゼ阻害剤と組み合わせて投与することができる。有用なプロテアーゼ阻害剤は、TMC435350(Medivir/Tibotec、Huddinge、Sweden);ITMN-191(R-7227;InterMune Pharma., Inc., Brisbane、CA)、ACh-806(GS-9132;Achillion Pharma., Inc., New Haven、CT)、ACH-1095(Achillion Pharma., Inc.)、BI 12202(Boehringer Ingelheim、Ingelheim Germany)、シルプレビル(BILN-2061;Boehringer Ingelheim)、MK-7009(Merck Pharma., Inc., Whitehouse Station、NJ)、ボセプレビル(SCH 503034;Schering-Plough、Kenilworth、NJ)、SCH 446211(SCH6;Schering-Plough)、SCH 351633(Schering-Plough)、及びテラプレビル(VX-950;Vertex Pharma., Inc., Cambridge、MA)を含むが、限定されない。
本明細書に提供される化合物は、当該技術分野において利用可能な方法、及び本明細書に開示したものを使用して、医薬組成物に製剤化することができる。このような化合物は、一部の実施態様において肝臓への薬物の送達を増強するために使用することができる。
経口投与のために適した医薬組成物は、錠剤(例えば、咀嚼錠)、カプレット、カプセル、及び液体(例えば、風味をつけたシロップ)などの、しかし、限定されない、別々の剤形として存在することができる。このような剤形には、活性成分の予め定められた量を含み、当業者に周知の調剤方法によって調製してもよい。一般に、「レミントンの医薬品科学(Remington's Pharmaceutical Science)」、第20版、Mack Publishing、Easton PA(2000)を参照されたい。
本明細書に提供される化合物などの活性成分は、徐放性手段によって、又は当業者に周知である送達装置によって投与することができる。例には、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる米国特許番号:3,845,770;3,916,899;3,536,809;3,598,123;かつ4,008,719;5,674,533;5,059,595;5,591,767;5,120,548;5,073,543;5,639,476;5,354,556;5,639,480;5,733,566;5,739,108;5,891,474;5,922,356;5,972,891;5,980,945;5,993,855;6,045,830;6,087,324;6,113,943;6,197,350;6,248,363;6,264,970;6,267,981;6,376,461;6,419,961;6,589,548;6,613,358;6,699,500に記述したものを含むが、限定されない。このような剤形を使用して、様々な比率で所望の放出プロフィールを提供するように、例えばハイドロプロピルメチルセルロース、その他のポリマーマトリクス、ゲル、浸透膜、浸透圧系、多層膜コーティング、微小粒子、リポソーム、微粒子、又はこれらの組み合わせを使用する、1つ以上の活性成分の緩徐放出、又は徐放を提供することができる。本明細書に記述したものを含む当業者に公知の適切な徐放製剤には、本明細書に提供した活性成分と共に使用するために容易に選択することができる。従って、錠剤、カプセル、ジェルキャップ、及び徐放のために適応されるカプレットなどの経口投与のために適した単一の単位剤形が、本明細書に包含される。
一つの実施態様において、非経口的剤形が提供される。非経口的剤型は、皮下、静脈内(ボーラス投与を含む)、筋肉内、及び動脈内を含むが、限定されない種々の経路によって対象に投与することができる。これらの投与は、典型的には混入物に対する対象の天然の防御を迂回するので、非経口的剤形は、典型的には無菌であるか、又は対象への投与前に滅菌することができる。非経口的剤形の例には、注射の準備済みの溶液、注射用の医薬として許容し得る媒体に溶解し、又は懸濁する準備済みの乾燥製品、注射の準備済みの懸濁液、及び乳剤を含むが、限定されない。
また、経皮、局所的、及び粘膜剤形が提供される。経皮、局所的、及び粘膜剤形は、当業者に公知の眼科用液剤、スプレー、エアロゾル、クリーム、ローション、軟膏、ゲル、溶液、乳剤、懸濁液、又はその他の形態を含むが、限定されない。例えば、「レミントンの医薬品科学(Remington's Pharmaceutical Science)」、第16版、第18版、及び第20版、Mack Publishing、Easton PA(1980、1990 & 2000);及び医薬品剤形の紹介(Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms)、第4版、Lea、及びFebiger、Philadelphia(1985)を参照されたい。口腔内の粘膜組織を治療するために適した剤形は、含嗽薬として、又は経口ゲルとして製剤化することができる。さらなる経皮剤形には、「貯蔵所型」、又は「マトリックス型」パッチを含み、これは、活性成分の所望の量の透過を可能にする特定の期間の間皮膚に適用して、着用することができる。
ヒト治療において、医師は、彼が予防的処置、又は治療的処置に従って、及び年齢、重量、感染段階、及び治療される対象に特異的なその他の要因に従って、最適であると考える薬量を決定するであろう。特定の実施態様において、用量は、成人について1日あたり約1〜約1000mg、又は成人について1日あたり約5〜約250mg、若しくは1日あたり約10〜50mgである。特定の実施態様において、用量は、成人について1日あたり約5〜約400mg、又は1日あたり25〜200mgである。特定の実施態様において、1日あたり約50〜約500mgの用量率が想定される。
一つの実施態様において、任意に医薬として許容し得る担体中の、単独で、又は別の抗フラビウイルス科剤と組み合わせて、若しくは交互に投与される、約1mg/日〜約150mg/日の量の化合物1を投与することを含む、ヒトを含む宿主におけるフラビウイルス科感染の治療のための方法が本明細書に提供される。特定の実施態様において、投与される化合物1の量は、約5mg/日〜約100mg/日である。特定の実施態様において、投与される化合物1の量は、約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、又は100mg/日である。特定の実施態様において、投与される化合物1の量は、約5、10、25、50、75、又は100mg/日である。
また、HCV、及び/又はHBV感染などの肝臓障害の治療の方法に使用するためのキットが提供される。キットには、本明細書に提供される化合物又は組成物、第2の薬剤又は組成物、及び障害を治療するための使用法に関する情報を医療提供者に提供する説明書を含むことができる。説明書は、印刷形態で、又はフロッピーディスク、CD、若しくはDVDなどの電子媒体の形態で、又はこのような説明書が得られるようなウェブサイトアドレスの形態で提供してもよい。本明細書に提供される化合物若しくは組成物、又は第2の薬剤、若しくは組成物の単位投与量には、対象に投与されたときに、該化合物若しくは組成物の治療的は予防的に有効な血漿レベルを少なくとも1日間対象において維持することができる投薬量を含むことができる。一部の実施態様において、化合物、又は組成物は、無菌の水性医薬組成物、又は乾燥粉末(例えば、凍結乾燥された)組成物として含めることができる。
(2'-C-メチルグアノシンのヒドロキシtBuSate-ホスホロアミダート誘導体(化合物3)の調製)
({9-[(2R)2-C-メチル-β-D-リボ-フラノシル]-グアニン}-5'-イルホスホロアミダート(化合物4)の調製)
([(2R)2-C-メチル-β-D-リボフラノシル]-グアニン}-5'-モノホスフェート(化合物5)の調製)
({9-[(2R)2-C-メチル-β-D-エリスロ-フラノシル]-グアニン}-5'-イル-O-(カルボキシ-tert-ブチル-S-アシル-2-チオエチル)ベンジルアミンホスホロアミダート(化合物11)の調製)
([(2R)-2-メチル-β-D-リボリボフラノシル]グアニン-N-ベンジルアミニル-5'-モノホスフェート(塩)(化合物2、ナトリウム塩))
([(2R)-2-メチル-β-D-リボリボフラノシル]グアニン5'-ジホスフェート)
([(2R)-2-メチル-β-D-リボリボフラノシル]グアニン5'-トリホスフェート(ナトリウム塩))
(O-(ヒドロキシル-tert-ブチル-S-アシル-2-チオエチル)-2'-C-メチルグアノシン-5'-イルホスフェート(ナトリウム塩))
(ジアステレオマー比>1.00:1.00での粗製化合物1の精製)
粗製化合物1は、逆相クロマトグラフィーによって精製した(調製したBakerbond 40μm C-18 RP-シリカ−100%のアセトニトリルから100%のH2Oへの勾配で洗浄)。粗製物をテトラヒドロフラン、H2O、及び飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に溶解した。
段階的な勾配で穏やかな真空下で溶出*:
固体の化学的純度を後述した方法Aを使用してHPLCによって調べた。ジアステレオマー純度をキラルHPLC、及び31P NMRによって調べた。
(化合物1、ジアステレオマー1の単離:)
化合物1、ジアステレオマー1は、CombiFlash精製系での逆相カラムクロマトグラフィ(C18シリカゲル)を使用して分離した。ジアステレオマー(1g、83/17ジアステレオマー2/1、化学的純度=97.3%)の混合物をTHF/水(3:1、4ml)に溶解した。溶液を予め平衡化したC18カラム(再使用可能なRediSep RfC18、13Og)に添加して、勾配メタノール/水(40/60〜50/50、流速= 50ml/分)で溶出させた。最初に溶出された異性体がジアステレオマー1であった。画分を化学物質、及びジアステレオマー1のジアステレオ異性の純度についてHPLCによって調べた。透明な画分を合わせて、真空中で蒸発させ、ジアステレオマー1を得た。正味=290mg;化学物質、及びジアステレオマー純度>99%(AUC、それぞれHPLC方法A、及びHPLC方法B)。
(HPLC方法A:化学的純度)
カラム:Zorbax Eclipse XDB-C8;4.6x75mm 3.5 Micron
移動相A:アセトニトリル
移動相B:0.01 M酢酸アンモニウム緩衝液、PH=4.4
カラム温度:28℃
流速:1.4ml/分
検出:UV254nm、UV272nm
カラム:Agilent Eclipse XDB C1;4.6xl50mm 5 Micron
移動相A:メタノール
移動相B:水
流速:1.Oml/分
検出:UV272nm
化合物1、ジアステレオマー2:16.5±0.5分
化合物1、ジアステレオマー1:14.4±0.5分
(A.化合物1の調製)
Test20 AUC @272nm(59%、収率)。
典型的な分析データは、下記に示してある:
化合物1:C25H35N6O9PS 626.62gmol-1
HPLC AUC(方法Test20):99%@272nm 、Rt 3.32分
化合物1(ジアステレオマーの混合物)の合成-塩化アセチル/エタノールを媒介した脱トリチル化反応)
上記の粗製物質をTHF(520ml)、及び水(30ml)に懸濁した。少量(約5ml)の飽和炭酸水素ナトリウム溶液を添加し、pHを7.5に調製した(開始pH=6、pH紙)。混合物を丸底フラスコにおいて周りを15分間回旋させた。更に多くのTHF(280ml)を混合物に添加した。5分間撹拌した後に、固体を減圧濾過によって収集した。フィルターケーキをTHF(120ml)、及び水(140ml)で洗浄して、4O℃にて真空オーブンにおいて乾燥させた。化合物1、ジアステレオマー2が白色固体として得られた。正味= 55.Og、化学的純度=97%(AUC、HPLC方法A、実施例10を参照されたい);ジアステレオマー純度=97.7% (AUC、HPLC)。
(化合物1(ジアステレオマーの混合物)の合成−塩化アセチル/エタノールを媒介した脱トリチル反応:)
上記の粗製物質をTHF(400ml)、及び水(40ml)に懸濁した。少量(約7ml)の飽和炭酸水素ナトリウム溶液を添加して、pHを7.5に調製した(開始pH=6、pH紙)。混合物を丸底フラスコにおいて30分間撹拌した。固体を減圧濾過によって収集した。更に多くのTHF(200ml)を混合物に添加し、材料の移行を促進させた。フィルターケーキをTHF(40ml)、及び水(100ml)で洗浄して、4O℃にて真空オーブンにおいて乾燥させた。化合物1、ジアステレオマー2が白色固体として得られた。正味= 50.Og、化学的純度= 97%(AUC、HPLC方法A、実施例10を参照したい);ジアステレオマー純度=94%。材料を以下の通りに更に精製した:ジアステレオマー純度を改善するために、アセトニトリル/水(50ml/450ml)で完全に粉砕した;THF/水(3:1、360ml)に溶解し、極性不純物を除去するために、セライトパッドを介して濾過した(RT=0.7分、HPLC方法A);1H-NMR(δ=11.7ppm)によって観察される未知不純物を除去するためにアセトニトリル/水(50ml/450ml)で第2のトリチュレーション。最終的な透明なジアステレオマー2が、化学物質、及びジアステレオマー純度>99%で得られた。正味=38.5g。
({9-[(2R)2-C-メチル-β-D-リボ-フラノシル]-グアニン}-5'-イル-O-(トリフェニルメチルオキシ-tert-ブチル-S-アシル-2-チオエチル)H-ホスホナート、化合物11-1)
({9-[(2R)2-C-メチル-β-D-リボ-フラノシル]-グアニン}-5'-イル-O-(トリフェニルメチルオキシ-tert-ブチル-S-アシル-2-チオエチル)イソプロピルホスホロアミダート)
({9-[(2R)2-C-メチル-β-D-リボ-フラノシル]-グアニン}-5'-イル-O-(ヒドロキシ-tert-ブチル-S-アシル-2-チオエチル)-N-イソプロピルホスホロアミダート)
({9-[(2R)2-C-メチル-β-D-リボ-フラノシル]-グアニン}-5'-イル-O-(トリフェニルメチルオキシ-tert-ブチル-S-アシル-2-チオエチル)モルホリニルホスホロアミダート)
(3-ヒドロキシ-2,2-ジメチル-チオプロピオン酸-S-{9-[(2R)2-C-メチル-β-D-リボ-フラノシル]-グアニン-5'-イル]-[(モルホリン-1-イル)ホスフィノイルオキシ]-エチル}エステル)
({9-[(2R)2-C-メチル-β-D-リボ-フラノシル]-グアニン}-5'-イル-O-(トリフェニルメチルオキシ-tert-ブチル-S-アシル-2-チオエチル)tert-ブチルホスホロアミダート)
({9-[(2R)2-C-メチル-β-D-リボ-フラノシル]-グアニン}-5'-イル-O-(ヒドロキシ-tert-ブチル-S-アシル-2-チオエチル)-N-tert-ブチルホスホロアミダート)
({9-[(2R)2-C-メチル-β-D-リボ-フラノシル]-グアニン}-5'-イル-O-(トリフェニルメチルオキシ-tert-ブチル-S-アシル-2-チオエチル)N-メチルピペラジルホスホロアミダート)
(3-ヒドロキシ-2,2-ジメチル-チオプロピオン酸-S-{[9-[(2R)2-C-メチル-β-D-リボ-フラノシル]-グアニン}-5'-イル]-[(4-メチル-ピペラジン-l-イル)-ホスフィノイルオキシ]-エチル}エステル)
({9-[(2R)2-C-メチル-β-D-リボ-フラノシル]-グアニン}-5'-イル-O-(トリフェニルメチルオキシ-tert-ブチル-S-アシル-2-チオエチル)-酢酸-エチル-エステルホスホロアミダート)
({9-[(2R)2-C-メチル-β-D-リボ-フラノシル]-グアニン}-5'-イル-O-(ヒドロキシ-tert-ブチル-S-アシル-2-チオエチル)-N-酢酸-エチル-エステルホスホロアミダート)
({9-[(2R)2-C-メチル-β-D-リボ-フラノシル]-グアニン}-5'-イル-O-(トリフェニルメチルオキシ-tert-ブチル-S-アシル-2-チオエチル)-酢酸-tert-ブチルエステルホスホロアミダート)
({9-[(2R)2-C-メチル-β-D-リボ-フラノシル]-グアニン}-5'-イル-O-(ヒドロキシ-tert-ブチル-S-アシル-2-チオエチル)-N-酢酸-tert-ブチル-エステルホスホロアミダート)
({9-[(2R)2-C-メチル-β-D-リボ-フラノシル]-グアニン}-5'-イル-O-(トリフェニルメチルオキシ-tert-ブチル-S-アシル-2-チオエチル)-ジメチルアミノ-エチルホスホロアミダート)
({9-[(2R)2-C-メチル-β-D-リボ-フラノシル]-グアニン}-5'-イル-O-(ヒドロキシ-tert-ブチル-S-アシル-2-チオエチル)-N-ジメチル-アミノ-エチルホスホロアミダート)
({9-[(2R)2-C-メチル-β-D-リボ-フラノシル]-グアニン}-5'-イル-O-(ヒドロキシ-tert-ブチル-S-アシル-2-チオエチル)-N-酢酸ホスホロアミダート)
(化合物1、ジアステレオマー1、及びジアステレオマー2の生物活性)
化合物1、ジアステレオマー1、及びジアステレオマー2の生物活性は、後述するように酵素結合抗体免疫吸着アッセイ(ELISA)によって、及びルシフェラーゼアッセイによってNS4Aタンパク質の発現をモニターすることによって測定した:
HCVルシフェラーゼレプリコンアッセイは、試験化合物が、HCV遺伝子型1bレプリコン、及びルシフェラーゼ-ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ融合遺伝子を有するヒト肝癌株化細胞(Huh-7)において3日の処理後の細胞培養におけるHCV複製を阻害する能力を測定する。HCV複製の阻害は、ルシフェラーゼタンパク質発現の定量化によって測定した。HCVルシフェラーゼレプリコンは、ZS11 HCVレプリコンのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子のアミノ末端にルシフェラーゼ遺伝子を融合することによって構築した。ZS11 HCVレプリコン(Zhu Q、Guo JT、及びSeeger Cの文献、2003)は、SPlレプリコンに由来するが、3つの細胞培養に適応した突然変異:E1202G(NS3)、S2204I(NS5A)、及びD2254E(NS5A)を含む。これらの突然変異は、効率的なインビトロでの複製を可能にする。ルシフェラーゼレポーター遺伝子は、pGL4.13[luc2/SV40]ベクター(Promega Corp.)から増幅した。ルシフェラーゼ-ネオマイシン融合により生じるレプリコン(ZS11-luc)をHuh-7細胞に安定にトランスフェクトして、Zluc株化細胞を得た。
HCVレプリコンアッセイは、試験化合物が、HCV遺伝子型1bレプリコン(GS4.1細胞)を有するヒト肝癌株化細胞(Huh-7)における3日の処理後の細胞培養におけるHCV複製を阻害する能力を測定する。HCV複製の阻害は、酵素結合抗体免疫吸着アッセイ(ELISA)を使用して、ウイルスのNS4Aタンパク質の定量化によって測定した。GS4.1株化細胞(Zhu、Guo、及びSeegerの文献 2003)は、Huh-7ヒト肝臓株化細胞に由来し、EMCV IRESプロモーターの制御下にHCV株con1、遺伝子型1からのNS3からNS5Bまでの非構造タンパク質を含むバイシストロン性SP1ΔS HCVレプリコンを安定に有する。加えて、レプリコンは、HCVプロモーターの制御下にネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含む(提供先:Dr. Christoph Seeger、Fox Chase Cancer Center、Philadelphia、PA)。
細胞障害性アッセイは、GS4.1細胞、又はZluc細胞のいずれかにおいて3日間試験化合物で処理した後の細胞の生存度を測定する。アッセイ読出しは、黄色のMTSテトラゾリウム化合物の、紫のホルマザン生成物への生体内還元である。この変換は、NADPH、又はNADHによって媒介され、培養における生存細胞の数に正比例する。細胞障害性アッセイは、以下の通りに要約される。96ウェル組織培養プレートには、GS4.1、又はZluc細胞を播種した。抗ウイルス薬化合物溶液を2×濃縮した貯蔵液として培地中に新たに作製した。8つのさらなる3倍薬物希釈を、合計9希釈について培地中にこれらの貯蔵液から調製した。細胞を播種して少なくとも4時間にて、組織培養プレートにおける細胞/培地の1容積に、それぞれの2×濃縮薬物希釈の1容積を添加することによって薬物処理を開始した。次いで、細胞を37℃/5%のCO2にて3日間インキュベートした。処理の3日後に、CellTiter 96(登録商標)Aqueous One Solution細胞増殖アッセイ(Promega)を、それぞれのウェルにMTS溶液を添加することによって行った。次いで、プレートを37℃/5%のCO2にて3.5時間インキュベートした。次いで、プレートをVictor3V 1420マルチ標識カウンター(Perkin Elmer)において読み込んで、CC50濃度をMicrosoft Excel、及びXLfit 4.1ソフトウェアを使用して決定した。
(ラット、サル、及びヒト肝臓ミクロソーム分画における化合物1のインビトロでの体内薬物動態)
この研究に使用した試験化合物は、以下のとおりだった:化合物1、純度95%>、化合物4、純度>95%の;化合物3、90%純度、及び化合物2(純度80%)。
貯蔵条件-試験化合物は、光から保護して4〜8℃にて貯蔵し、DMSO貯蔵液は、-2O℃にて貯蔵した。
NADPH再生系溶液A:NADP++グルコース6-リン酸、及び溶液B:BD Gentest、Woburn MAからのグルコース‐6‐リン酸デヒドロゲナーゼ;BD Gentest、Woburn MAからのケトコナゾール;Sigma-Aldrich、St Louis、Moからのジメチルスルホキシド(DMSO)、ブタ肝臓エステラーゼ、及びアルカリホスファターゼ;Fisher Scientific, Pittsburg, PAからのリン酸カリウム、一塩基(K2HPO4);Burdick and Jackson Muskegon、MIからのメタノール、及びアセトニトリル;0.2 Mリン酸カリウム緩衝液pH 7.4は、以下の通りに調製される:100mLの緩衝液のためには、19mL溶液A(13.6gのKH2PO4/0.5L)を81mlの溶液B(17.4gのK2HPO4/0.5L)と混合した。pH調整は、必要ではない。
肝ミクロソーム、又はサイトゾルとのインキュベーションは、インキュベーション時点につき0.1mLの最終容積で行った。DMSO中の保存液からの10μM化合物1(最終的なDMSO濃度は、0.1%であった)を、インキュベーション緩衝液(0.1Mのリン酸カリウム、pH 7.4、5mM MgCl2、及び0.1mM EDTA)に懸濁した、プールしたミクロソームタンパク質(1.0mg/ml)と共に、0〜60分37℃とインキュベートした。ミクロソーム反応をNADPH(3mM終濃度)の添加によって開始した。(a)タンパク質なし、又は(b)NADPHなしでのインキュベーションを対照として用いた。反応を0.2mLの停止液(アセトニトリル)の添加によって終結させた。試料を30秒間ボルテックス混合して、次いで10,000×gにて10分間遠心した。上清をLabconco CentriVap濃縮器を使用して乾燥させて、乾燥残渣を水に再構成させ、HPLCガラスバイアルに移して、HPLC-UV方法1(上記)によって解析した。
インキュベーションは、インキュベーション時点につき0.1mLの最終容積で行った。インキュベーション緩衝液(0.1Mのリン酸カリウム、pH 7.4)に懸濁した、プールしたラット(1mg/ml)、サル(0.5mg/ml)、又はヒト(1.0mg/ml)肝ミクロソームをケトコナゾール、又はリトナビル(0.1、及び1μM)の存在下において10μM化合物1とインキュベートした。最終的な溶媒(DMSO、又はメタノール)濃度は、0.2%にて維持した。NADPH再生系(1.3mM NADP+、3.3mMグルコース6リン酸、0.4U/mlのグルコース‐6‐リン酸デヒドロゲナーゼ、及び3.3mM MgCl2、終濃度)の添加によって反応を開始した。阻害剤なしのインキュベーションを対照として用いた。0.2mLの停止液(アセトニトリル)の添加により、30分(サル)、又は60分(ラット、及びヒト)にて反応を終結した。試料を30秒間ボルテックス混合して、次いで10,000×gにて10分間遠心した。上清をLabconco CentriVap濃縮器を使用して乾燥させて、乾燥残渣を水に再構成させ、HPLCガラスバイアルに移して、HPLC-UV方法1(上記)によって解析した。
(スーパーソーム)-インキュベーションは、それぞれのCYP450 スーパーソームに提供されたプロトコルに従って、0.1mL反応緩衝液(50〜100mMリン酸カリウム、pH 7.4、又は100mM Tris-HCl(pH 7.4))の最終的容積で行った。それぞれの反応には、4pmoleのCYP450 スーパーソーム、1.3mM NADP+、3.3mMグルコース-6-リン酸、0.4U/mLグルコース-6-ホスフェートデヒドロゲナーゼ、3.3mM MgCl、及び10μM化合物1を含んだ。37℃にて60分間のインキュベーションに続いて、100μLの停止液(アセトニトリル:メタノール;l:l)を添加して、試料を10,000×gにて10分間遠心した。次いで、上清を乾燥させて、10mMリン酸カリウム(pH 5)に再構成し、更にHPLCガラスバイアルに移して、HPLC-UVによって解析した(上記)。
肝ミクロソーム、肝臓サイトゾル、又はブタ肝臓エステラーゼとのインキュベーションは、インキュベーション時点につき0.1mLの最終容積で行った。インキュベーション緩衝液(0.1Mのリン酸カリウム、pH 7.4)に懸濁した、プールしたミクロソームタンパク質(1.0mg/ml)をDMSO(最終的なDMSO濃度は、0.1%であった)中の保存液からの50μM化合物1と共に37℃にて2時間インキュベートした;ミクロソーム反応をNADPH再生系(1.3mM NADP+、3.3mMグルコース-6-リン酸、0.4U/mlのグルコース‐6‐リン酸デヒドロゲナーゼ、及び3.3mM MgCl2(終濃度))の添加によって開始した。NADPHなし、又はタンパク質なしでのインキュベーションを対照として用いた。0.1mLの停止液(アセトニトリル)の添加によって反応を終結した。試料を30秒間ボルテックス混合して、次いで10,000×gにて10分間遠心した。上清をLabconco CentriVap濃縮器を使用して乾燥させて、乾燥残渣を水に再構成させ、HPLCガラスバイアルに移して、HPLC-UV方法2(上記)によって解析した。
化合物1は、サル肝ミクロソームにおける有意な代謝を示した;ヒト、及びラットにおける代謝もかなりであった。化合物1代謝は、CYP450、及び非CYP450経路によって媒介されるようである。ヒト組換えCYP酵素を使用して、3A4は、化合物1のNADPH依存的代謝に関与する唯一のCYPとして同定された。8つの潜在的なインビトロでの代謝産物が観察され、5つは、2'-C-メチルグアノシン、化合物2、5、及び化合物3の2つのジアステレオマー(化合物3a、及び3b)として同定された。代謝産物U1、U2、及びU3は、未知であり、種依存的であるようであり;U2は、ラットミクロソームのみにおいて観察されたが、U1、及びU2は、サルミクロソームのみにおいて観察された。化合物3の形成は、3つ全ての種において生じた。化合物5の形成は、化合物2の形成を介してCYP450、及び非CYP450経路によって媒介されるようであるが、いくつかの化合物5の形成は、化合物3a、及び3bへの代謝にも関連していた。化合物5は、マトリックスによる干渉のため、NADPHとのインキュベーションでは観察することができなかったが、モノホスフェートは、2'-C-メチルグアノシンに分解され得るので、これらの試料における2'-C-メチルグアノシンの存在は、化合物5が実際は形成されたことを示唆する。CYP450を媒介しない化合物5形成は、ラット、及びヒトにおけるよりもサルにおいて有意なようであり、おそらく、サルミクロソームにおいて観察される高レベルの化合物5、及び2'-C-メチルグアノシンの原因である。
Burdick and Jackson; Muskegon, MIからのアセトニトリル、メタノール、及びHPLC等級水;Sigma-Aldrich、St Louis、Moからのアルカリホスファターゼ、ジメチルスルホキシド(DMSO)、デキサメサゾン、インスリン、及びテトラブチルリン酸二水素アンモニウム(TBAP);Cellgro、Mediatech、Herndon、VAからの、ピルベートを含むDMEM、L-グルタミン、HEPES、非必須アミノ酸、ペニシリン-ストレプトマイシン、リン酸緩衝食塩水(PBS)、及びトリプシン-EDTA;Eco Lite液体シンチレーション;Gibco, Invitrogen Corporationからのウシ胎児血清(FBS)、インスリン-トランスフェリン-セレン-A、及びWilliam E培養液;Fisher Scientific、Pittsburg、PAからのリン酸カリウム、一塩基(K2HPO4);並びにPerkin Elmer Life SciencesからのUltima Flow-AP液体シンチレーション。
(初代肝細胞):動物、及びヒト肝臓から新たに単離した細胞は、氷上の懸濁液中に得た。細胞を70〜75×g(ラット)、又は95〜90×g(サル、及びヒト)での遠心分離によってペレットにして、プラッティング培地(5%のFBS、0.5%のペニシリン-ストレプトマイシン、1%のL-グルタミン、4μg/mLインスリン、及び1μMデキサメサゾンを補ったWilliam E)の1mlにつき800,000細胞にて再懸濁した。次いで、マルチウェルコラーゲンIコートしたプレート(ラット尾部コラーゲンI型;12、又は6ウェル)に、1mL(12ウェル;800,000細胞/ウェル)、又は2mL(6ウェル;1,600,000万細胞/ウェル)の細胞懸濁液の添加によって、播種した。プレートを穏やかに振盪して、均一に細胞を分配し、37℃にておよそ4〜6時間インキュベーターに置いて、細胞を付着させた。一旦細胞が付着されたら、プラッティング培地を除去して、肝細胞培養液(ペニシリン-ストレプトマイシン、1%のL-グルタミン、1%のインスリン-トランスフェリン-セレン、及び0.1μMデキサメサゾンを補ったWilliam E)で置換した。細胞を一晩37℃にてインキュベーターにおいて、培養、及び培地に順応させた。
両方ともグアニン部分のC-8位置において標識した放射標識した化合物1、及び2'-C-メチルグアノシンとの肝細胞インキュベーションを、2.0mL肝細胞培養液/ウェル(1,600,000細胞/ml)の最終容積にて行った。細胞の一晩インキュベーションからの培養液を除去して、DMSO(最終的なDMSO濃度は、0.1%であった)、若しくは50%のエタノール(最終的なエタノール濃度は、0.2%であった)中の保存液からの1、若しくは10μM [14C]-化合物1(122dpm/pmol)、又は[14C]-2'-C-メチルグアノシン(127dpm/pmol)を含む、37℃に予熱した新鮮な培地で置換した。1、4、8、及び24時間後、0.5〜1.0mLのインキュベーション培地を除去して、解析(後述する)まで-20℃にて貯蔵した。残りの培地を廃棄して、細胞単層を氷冷PBSで2回慎重に洗浄した。最後の洗浄液に続いて、全てのPBSを慎重に除去して、1.0mLの抽出溶液(氷冷70%のメタノール)を添加した。細胞を掻爬して、抽出溶液に懸濁して、2mLのポリプロピレンミクロチューブに移して、細胞内容物を-20℃にて一晩抽出した。
初代肝細胞を10μM [14C]-化合物1(122DPM/pmol)、又は[14C]-2'-C-メチルグアノシン(127DPM/pmol)と24時間インキュベートして、その時点でインキュベーション培地を除去して、細胞単層を暖かい(37℃)PBSで2回慎重に洗浄して、薬物を含まない培地との培養に戻して置いた。24時間まで選択時間にて、培地を除去して、細胞単層を氷冷PBSで2回慎重に洗浄した。最後の洗浄液に続いて、全てのPBSを慎重に除去して、細胞単層を処理して、前述したように抽出した。
初代肝細胞(1,600,000細胞/ウェル)、及びHuh7細胞(400,000細胞/ウェル)インキュベーションは、以下の例外を除いて本質的に上記の通りに行った。細胞を24時間(肝細胞)、若しくは72時間(Huh7、リバビリンのみ)、リトナビル(1μM)、又はリバビリン(5μM)の有無において10μMにて[14C]-化合物1(122DPM/pmol)、及び[14C]-2'-C-メチルグアノシン(127DPM/pmol)とインキュベートした。インキュベーション培地(0.5〜1.0mL)を除去して、解析(後述する)まで-2O℃保存した。残りの培地を廃棄して、前述したように細胞単層を洗浄して、処理した。
2'-C-メチルグアノシンヌクレオチドの安定性は、HPLC-等級水中に化合物5(2'-C-メチルグアノシン一リン酸)(10%)、及び化合物6(2'-C-メチルグアノシン二リン酸)(30%)をまた含んだ化合物7(2'-C-メチルグアノシントリホスフェート)の100μM標準液を調製して、100μLのこの標準液を(a)900μLの抽出溶液(70%のメタノール)、及び(b)70%のメタノール中の900μLのブランク肝細胞細胞抽出物にスパイクすることによって評価した。スパイクした試料を3日間まで-2O℃に置いて、この時間の後、これらを実験試料について記述したとおりに処理した。
推定上の代謝産物の予備的な同定は、下記に記述したクロマトグラフィー条件を使用して、インキュベーション培地、及び細胞抽出物における観察した代謝産物の保持時間を、化学的に合成した標準で得られた保持時間と比較することによって行った。更に、2'-C-メチルグアノシンヌクレオチド(モノ、ジ、及びトリホスフェート)の同定は、以下によって実施した:細胞抽出物試料をアルカリホスファターゼとインキュベートすること(37℃にて60分間10単位)、及び標準の2'-C-メチルグアノシンのもので生じるヌクレオシドのHPLC保持時間を比較すること。
(細胞抽出物)
細胞抽出物を、細胞細片を除去するために10分間Eppendorfマイクロ遠心機(Eppendorf、モデル5415D)を使用して、16,000RCFにて遠心分離することにによって調製した。5〜10μLの一定分量の上清を5mLのEcoLite(商標)(MP、Irvine, CA)液体シンチレーションカクテルに添加し、Beckman Coulter LS6500多目的液体シンチレーション計数器(Beckman Instruments, Fullerton, CA)を使用して、液体シンチレーション計数(LSC)によって放射能を測定した。次いで、残りの試料をLabconco冷蔵centrivap濃縮器(Labconco、Kansas C1ty Mo)を使用して乾燥させた。乾燥抽出物を120μL HPLC-等級水に再構成してEppendorfマイクロ遠心機を使用して16,000RCFにて10分間遠心した。HPLC解析(後述する)の前に、濃縮した抽出物の放射能を、5μLの一定分量を使用してLSCによって測定した。次いで、抽出回収を、乾燥の前後に抽出物における総放射能を比較することによって決定した。次いで、残りの抽出物をFlow Scintillation Analyzer Radiomatic(商標)515TRを使用してオンライン放射能検出でHPLCによって解析した。分離した成分における放射能は、Flo-One(商標)ソフトウェア(Perkin Elmer Life Sciences)を使用して、ピークを積分することによって定量化した。可能な場合、不十分な回収(<85%)である試料を再び解析した。
インキュベーション培地試料を室温で解凍して、ボルテックスして、Eppendorfマイクロ遠心機を使用して16,000RCFにて遠心した。10μLの一定分量の上清を5mLのEcoLite(商標)(MP、Irvine, CA)液体シンチレーションカクテルに添加し、Beckman Coulter LS6500多目的液体シンチレーション計数器(Beckman Instruments, Fullerton, Ca)を使用して、液体シンチレーション計数(LSC)によって放射能を測定した。試料(50〜100μL)をFlow Scintillation Analyzer Radiomatic(商標)515TRを使用してオンライン放射能検出でHPLCによって解析した。分離した成分における放射能は、Flo-One(商標)ソフトウェア(Perkin Elmer Life Sciences)を使用して、ピークを積分することによって定量化した。可能な場合、不十分な回収(<85%)である試料を再び解析した。
(分析法)
全ての試料は、以下のHPLC方法を使用して解析した:
(計測手段):
ChemStation LC3D Version A. 10.02 (1757)を備えたAgilent 1100 (Agilent Technologies, Inc)
サーモスタットを備えたオートサンプラ
ダイオードアレイ検出器
サーモスタットによるカラムコンパートメント
4基ポンプ
真空デガッサー
(クロマトグラフィー条件:)
(方法1-化合物1インキュベーション培地、及び細胞抽出物の解析:)
・カラム:Phenomenex (登録商標)Columbus 5 μ C18、4.6×250mm
・(Phenomenex USA、Torrance、CA)
・ガードカラム:セキュリティガードカートリッジ、4×2mm
・(Phenomenex USA、Torrance、CA)
・カラム温度:周囲
・UV検出:252nm
・放射能検出:500μL液体細胞、Scintillant Flow Cocktail(Ultima Flow-AP、
・Perkin Elmer Life Sciences, CT)3ml/分にて
(方法2-2'-C-メチルグアノシン細胞抽出物の解析:)
・カラム:Phenomenex (登録商標)Columbus 5μC18、4.6×250mm
・(Phenomenex USA、Torrance、CA)
・ガードカラム:セキュリティガードカートリッジ、4×2mm
・(Phenomenex USA、Torrance、CA)
・カラム温度:周囲
・UV検出:252nm
・放射能検出:500μL液体セル、Scintillant Flow Cocktail(Ultima Flow-AP、Perkin Elmer Life Sciences, CT)3ml/分にて。
・カラム:Phenomenex (登録商標)Columbus 5μC18、4.6×250mm
・(Phenomenex USA、Torrance、CA)
・ガードカラム:セキュリティガードカートリッジ、4×2mm
・(Phenomenex USA、Torrance、CA)
・カラム温度:周囲
・UV検出:252nm
・放射能検出:500μL液体セル、Scintillant Flow Cocktail(Ultima Flow-AP、Perkin Elmer Life Sciences, CT)3ml/分にて。
この方法は、ミクロソームインキュベーションで観察される代謝産物プロフィール(実施例14)肝細胞代謝産物プロフィールの比較のために使用した。
・カラム:Phenomenex (登録商標)Columbus 5μC18、4.6×250mm
・(Phenomenex USA、Torrance、CA)
・ガードカラム:セキュリティガードカートリッジ、4×2mm
・(Phenomenex USA、Torrance、CA)
・カラム温度:周囲
UV検出:252nm
・放射能検出:500μL液体セル、Scintillant Flow Cocktail(Ultima Flow-AP、Perkin Elmer Life Sciences, CT)3ml/分にて。
化合物1、及び化合物7(2'-C-メチルグアノシンチオホスフェート)は、Microsoft(登録商標)Office Excel 2003を使用して解析し、濃度-時間曲線(AUC)下の面積を得た。AUC0-24は、リニア台形則、及び24時間までのサンプリング時間を使用して算出される濃度-時間曲線下で領域であった。線形回帰分析(Microsoft Excel)を使用して、関数t1/2=0.693/k(式中、kは、pmol/100万細胞における化合物7の細胞内濃度の自然体数対インキュベーション時間をプロットすることによって得られた直線回帰の勾配である)から、化合物7についてインビトロ細胞内t1/2値を見積もった。
化合物1の体内薬物動態、及び細胞内活性化は、初代肝細胞において、及びヒト肝癌株化細胞Huh7において、[14C]標識した化合物1を使用して評価した。また、親ヌクレオシド(2'-C-メチルグアノシン)の活性化を、[14C]-標識した2'-C-メチルグアノシンを使用して平行して評価して、化合物1を経た化合物5の送達が高レベルの活性なトリホスフェート、化合物7を引き起こすかどうかを評価した。
(初代肝細胞)
(10マイクロモル濃度[14C]-化合物1、又は[14C]-2'-C-メチルグアノシンとのインキュベーション)
[14C]-化合物1の広範な代謝がラット肝細胞において観察され、4時間にて化合物1培地レベルのほぼ50%の減少であり、24時間後に検出可能な化合物1はなかった。(表11)サル肝細胞における代謝は、中程度であった;培地レベルは、8時間まで約40%、及び24時間後に77%に減少された(表11)。ラット、及びサル肝細胞とは対照的に、ヒト肝細胞中の化合物1代謝(表11)は、24時間まで観察される化合物1培地レベルの38%の減少のみで、低いようである。
1μMでの[14C]-化合物1の代謝をヒト、及びラット肝細胞において評価し、10μMにおいて観察されるように、ラットにおける代謝は、広範であり、8時間にて化合物1培地がおよそ79%の減少し、及び24時間後に検出可能な化合物はない(表11)。ヒト肝細胞における代謝(表11)は、低く、51%の化合物1が24時間まで培地に残っている。合計8つの代謝産物をがラット肝細胞のインキュベーション培地において観察された(表17);2'-C-メチルグアノシン、化合物5、及び化合物2のみがヒト肝細胞培地において検出可能であった(表17)。
初代肝細胞とは対照的に、ヒト肝癌株化細胞(Huh7)における化合物1代謝は、低かった。24時間後に、化合物1は、インキュベーション培地において測定された放射能の86%の原因であり、72まで、それは67%の原因であった。合計6個の代謝産物(表18)がHuh7細胞のインキュベーション培地において観察された。
試料調製、及び抽出工程を通じた2'-C-メチルグアノシンヌクレオチドの安定性を化合物7の参照標準を使用して評価し、これには、化合物5(10%)、及び化合物6(30%)も含めた。2'-C-メチルグアノシンヌクレオチドの破壊は、観察されなかった。
(10マイクロモル濃度における[14C]-化合物1、及び[14C]-2'-C-メチルグアノシン)
細胞内放射能の抽出回収は、上記の実験手順下に記述したとおりに総放射能のLSCによって決定した。一般に、抽出回収は、66%から79%の範囲であった。細胞ペレットに残っている放射能は、決定されなかった。初代肝細胞における[14C]-化合物1の代謝プロフィールを表19〜表22、及び表26〜表29に要約してあり、ヒト、サル、及びラット肝細胞における[14C]-2'-C-メチルグアノシンの代謝プロフィールを表23A〜表25、及び表27に要約してある。
同様の代謝傾向、及びプロフィールがラット、及びヒト肝細胞において1μM [14C]-化合物1にて観察される(表21、表29、表30、及び表34);1μM[14C]−化合物1は、サル肝細胞において評価しなかった。化合物7は、両方の種の主要な代謝産物であり、それぞれヒト、及びラット肝細胞において60.4、及び103pmol/100万細胞の最大のレベルで24時間にて70〜78%の総放射能の原因であった。化合物7についてのAUC0-24hは、それぞれ、ラット(n=1)、及びヒト(n=1)肝細胞について3,881、及び1,027pmol*h/100万細胞であった。これらの値は、それぞれヒト、及びラット肝細胞における10μM [14C]-化合物1について観察される値よりもおよそ8.8、及び7.2倍低い。1μMでの[14C]-2'-C-メチルグアノシンは、10μMで観察されたのと類似のプロファイルを示した。1μM [14C]-2'-C-メチルグアノシンとのインキュベーション後の化合物7についてのAUC0-24hは、それぞれヒト(n=1)、及びラット(n=1)肝細胞について302、及び458pmol*h/100万細胞であり、10μM 2'-C-メチルグアノシンで観察されるAUCよりも11.7倍低かった。これらの観察は、化合物7の形成がこの濃度範囲において化合物1、及び2'-C-メチルグアノシンの両方に対して依存的用量であることを示唆する。
表35、及び表36は、ヒト、及びラット肝細胞における化合物7減衰を要約する。時刻ゼロにおける7化合物レベルは、それぞれヒト、及びラット肝細胞において692、及び932pmol/100万細胞であった。[14C]-化合物1なしの24時間後、化合物7レベルは、それぞれヒト、及びラット肝細胞において273(61%の減少)、及び83(91%の減少)pmol/100万細胞まで減少した。ヒト肝細胞における化合物7についてのインビトロでの半減期は17.4時間であったが、ラット肝細胞において、6.61時間であった。
Huh7細胞における[14C]-化合物1の代謝プロフィールを表26、表37、及び表38に要約してある。[14C]-化合物1、及び[14C]-2'-C-メチルグアノシンとのインキュベーション後の2'-C-メチルグアノシンヌクレオチドレベルを表37、及び表38に要約してある。
リバビリンは、現在使用されているHCVの治療のためのヌクレオシド類似体であり、ヒト(n=1)、及びラット(n=2)肝細胞における2'-C-メチルグアノシンヌクレオチドレベルに対するその効果を24時間後に評価した。表39、及び表40は、5μMリバビリンの存在下における10μM [14C]-化合物1、又は10μM [14C]-2'-C-メチルグアノシン後に達成された2'-C-メチルグアノシンヌクレオチドレベルを要約してある。
この研究において証明されたとおり、[14C]-化合物1は、初代肝細胞(ラット>サル>ヒト)において、2'-C-メチルグアノシンヌクレオチド(化合物5、6、及び7)の形成を含む広範なインビトロでの代謝を受ける。
(放射標識した化合物1でのラット代謝研究)
予備的なラット代謝研究を放射標識した化合物1で行った。化合物をグアニン部分のC-8位置において[14C]で標識した。研究の目的は、1)総放射能の血漿薬物動態、2)肝臓における総放射能の時間経過、及び2'-C-メチルグアノシン-5'-TPの量、3)排出の主要な経路、並びに4)排泄物、肝臓、及び血漿における代謝プロフィールを決定することであった。
同位体希釈した[14C]-化合物1は、雄スプラーグドーリーラットに50mg/kgにて静脈内に、又は100mg/kgにて経口栄養によって投与した。研究デザイン、及び試料収集は、以下の表に要約してある:
(液体シンチレーション計数(LSC))
全ての試料における放射能は、液体シンチレーション計数(LSC)によって定量した。Beckman Coulter LS6500多目的液体シンチレーション計数器(Beckman Instruments, Fullerton, CA)をLSCのために使用した。試料は、容量により分注して、複製して解析した。EcoLite(商標)(MP、Irvine, CA)液体シンチレーションカクテルをそれぞれの液体試料に添加した。
HPLC解析については、溶出液中の放射能は、下記の示されるように、液体シンチラントセルを使用した放射能モニターを使用して検出した。別々の成分における放射能の割合は、ProFSAソフトウェアを使用してピークを組み込むことによって定量化した。HPLC解析は、下記に収載したシステム、及び条件を使用して行った。
(システム1):Agilent 1100シリーズ
・ウエルプレートオートサンプラー
・1100のサンプラーのためのサーモスタット
・ダイオードアレイ検出器
・サーモスタットによるカラムコンパートメント
・4基ポンプ
・真空デガッサー
・LC3DバージョンA.10.02(1757)のためのChemstation
(Agilent Technologies, Inc., DE)
・Flow Scintillation Analyzer Radiomatic(商標)625TR
・ProFSAソフトウェア
(Perkin Elmer Life Sciences, MA)
(システム2):Agilent 1100シリーズ
・ウエルプレートオートサンプラー
・1100のサンプラーのためのサーモスタット
・ダイオードアレイ検出器
・サーモスタットによるカラムコンパートメント
・4基ポンプ
・真空デガッサー
・LC3DバージョンA.10.02(1757)のためのChemstation
(Agilent Technologies, Inc., DE)
・Flow Scintillation Analyzer Radiomatic(商標)515TR
・ProFSAソフトウェア
(Perkin Elmer Life Sciences, MA)
(クロマトグラフィー条件)
(方法1)
・カラム:Phenomenex (登録商標)Luna 5μC18(2)、4.6×250mm
(Phenomenex USA, Torrance, CA)
・ガードカラム:セキュリティガードカートリッジ、4×2mm
・(Phenomenex USA、Torrance、Ca)
・カラム温度:35℃
・UV検出:252nm
・放射能検出:500μL液体セル、Scintillant Flow Cocktail(Ultima Flow-AP、Perkin Elmer Life Sciences, CT)@ 4.5ml/分。
(方法2)
・カラム:Phenomenex (登録商標)Luna 5μC18(2)、4.6×250mm
(Phenomenex USA, Torrance, CA)
・ガードカラム:セキュリティガードカートリッジ、4×2mm
・(Phenomenex USA、Torrance、Ca)
・カラム温度:周囲
・UV検出:252nm
・放射能検出:500μL液体セル、Scintillant Flow Cocktail(Ultima Flow-AP、Perkin Elmer Life Sciences, CT)@ 3ml/分。
肝臓、及び血漿試料は、-8O℃フリーザに貯蔵して、他の全ての試料は-2O℃フリーザに貯蔵した。
2つの用量製剤(IV用量群1A-Cのために50mg/ml、及びPO用量群2A-Cのために100mg/ml)を5%のDMSOを含むPEG 200中に調製した。用量製剤の副試料は、用量投与の前後に除去した。それぞれの副試料の一定分量(10μL)をメタノール(490μL)、及び水(1500μL)中の20mMギ酸アンモニウムを添加することによって希釈した。希釈した用量製剤は、HPLC方法1によって放射化学的純度の決定のために解析した。
プールした尿試料を、選択した時点から4匹全ての動物について固定したパーセントの総容積を混合することによって、1C、及び2C群について調製した。1C群については、1、2、6、及び24時間の収集間隔の試料をプールした。2C群については、4匹全ての動物からの試料のプールを24時間の収集間隔のみについて調製した。2A、又は2B群の単一の動物の尿試料は、1、2、及び6時間の収集間隔についての解析のために使用した。全ての試料を室温に持ってきて、短時間ボルテックスした。試料を、選択したHPLC方法のために適した水系移動相で必要に応じて希釈した(2〜20倍)。24時間の収集間隔からのプールして希釈した試料を、10分間2040×gにて遠心分離した。他の全ての試料は、遠心分離なしで解析した。HPLC方法1をHPLCプロファイリングのために使用した。選択した試料を、ミクロソーム、及び肝細胞インキュベーションによって生成した代謝産物プロフィール(実施例14、及び15)、並びに肝臓抽出物の代謝産物プロフィールとの比較のために、HPLC方法2によって解析した。
プールした試料を、それぞれの群について、それぞれの個々の動物試料ホモジネートの総重量の固定した割合を合わせることによって1C、及び2C群から24時間の時間的間隔について調製した。一定分量を15-mLのポリプロピレン遠心管にプールした。プールした試料(それぞれおよそ3g)に、4.5mLのMeOH-水(70:30)を添加した。試料を1分間ボルテックスし、10分間超音波処理した。次いで、10分間5700×gにて遠心した。上清をチューブへ移して、上清の総容積を測定した。抽出手順を更に2回繰り返した。それぞれの抽出物における放射能を、抽出回収について2回の一定分量(各々20μL)のLSCによって決定した。それぞれの抽出物の一部(10%の総容積)をLSC、及びHPLCによる解析のためにプールした。合わせた抽出物を水系移動相で希釈し(1:4)、代謝プロフィールを得るためにHPLC方法1を使用して解析した。インビボの代謝データとインビトロでのものを比較するために、これらの同じ糞便試料をHPLC方法2によって解析した。
プールした末端ラット血漿試料を1A群、1C群、及び2A-C群について調製した。プールは、4匹の動物のそれぞれからの1mlの血漿を合わせることによって調製した。プールした試料の副試料(それぞれ2ml)を抽出のために15-mLの円錐遠心管へ移した。それぞれの副試料に、6mLのメタノールを添加して、それぞれの混合物を勢いよくボルテックスして、次いで5700×gにて15分間遠心分離した。上清(抽出物1)を15-mLのチューブへ移した。ペレットをメタノール(2mL)で更に抽出した。それぞれの試料を徹底的にボルテックスして、確実に混合した。試料を上記の通りに遠心分離した。上清(抽出物2)を除去した。それぞれの抽出物の総容積を記録した。それぞれのプールした血漿試料の抽出物1、及び2の比例した副試料を合わせて、外界温度にてSpeedVacにおいて濃縮して、メタノール(50μL)、及びHPLC方法1の水系移動相をそれぞれの試料について500μLの総容積に添加することによって再構成した。1B群のプールした末端血漿を調製して、プールした試料体積(3.8mL)、及び抽出容積(それぞれ、第1、及び第2の抽出について11.4mL、及び4mL)を除いて、同様に抽出した。全ての抽出物、及び再構成した抽出物をLSCによって解析した。十分な放射能を含む再構成した抽出物をHPLCによって解析した。
ホモジネートは、2OmM EDTA、及び2OmM EGTA(肝臓の約1×(w/v)重量)を含む70%のメタノール-30%の水中のドライアイス上で調製して、凍結貯蔵した。プールした肝臓試料をそれぞれの群について個々の動物試料ホモジネートの総重量の固定した割合を合わせることにより、全ての群について調製した。それぞれのプールした肝臓ホモジネート(3.77〜5.02g)は、50-mLのポリプロピレン遠心管に置いて、16.0mLのメタノール:水(70:30)を添加した。試料を1分間ボルテックスして、次いで11200×gにて20分間遠心した。上清をチューブへ移して、総容積を測定した。抽出手順を更に3回繰り返した。それぞれの上清の放射能を、抽出回収について2回の一定分量(それぞれ100μL)のLSCによって決定した。それぞれの試料からの4つ全ての抽出物の副試料を、比例した貯蔵のために採取した。1群については、副試料を濃縮前にプールして、2群については、大容積が含まれるため、それぞれの副試料を別々に濃縮して、次いでプールした。それぞれの抽出物を完全に乾燥させ、又はおよそ100μLに減少させた。再構成は、メタノール(20μL)と、それぞれの再構成した試料の総容積が500μLであるように、HPLC方法2の水系移動相の十分な容積とで達成した。再構成した試料の2つの一定分量をLSCによって解析した。それぞれの試料をHPLC方法2によって解析した。
親薬物、及びそれぞれの回収期間におけるそれぞれの代謝産物について投与された用量のパーセント(% AD)=(代謝産物に起因する試料中の総放射能の%)*(対応する回収期間の間に回収された、投与した用量の%として表される総放射能)。
抽出回収のための補正は、これらの算出のために行わなかった。
総放射能のための血漿濃度-時間データをMicrosoft(登録商標)Office Excel 2003を使用して解析し、濃度-時間曲線(AUC)下の面積を得た。AUC0-24(投薬の0から24時間後の濃度-時間曲線下の面積)は、リニア台形則、及び名目サンプリング時間を使用して算出した。IV用量群については、時刻ゼロにおける濃度は、最初の2回の時点についての濃度データから推定した。最大(ピークの)血漿濃度(Cmax)、及び濃度をピークまで上げる時間(tmax)は、実測値であった。記述統計は、Excelにおいて作成した。
有効数字について、通則を適用しなかった。研究に使用される一般的な解析方法論のため、有効数字で存在される値は、これらの値がより正確であることを意味しない。表計算プログラム、又は計算機への入力については、機器で得られた値を、全部の丸めた整数が使用されるLSCを除いて、得られたとおりに入力した。表のデータは、丸めた数として示してある。
(用量製剤の解析)
2つの用量製剤(IV用量群1A-Cのために50mg/kg、及びPO用量群2A-Cのために100mg/kg)を以下の手順によって調製した。両方の製剤は、5%のDMSOを含むPEG 200中に調製した。必要とされる放射性物質の量をスパチュラで重みをかけて細粉に粉砕した。30%の最終容積のPEG 200、及び重みをかけた試験物を製剤バイアルに添加すると共に、一様な製剤を得るために撹拌をマグネチック下で撹拌した。最終容積には、PEG 200で作製した。製剤を少なくとも15分間室温で超音波処理して、均質な懸濁液を得た。製剤が均一になるまで、超音波処理/撹拌のサイクルを続けた。3つの一定分量を均質性の決定のために除去した(CV)。製剤の放射能濃度を決定して、比活性を算出した。
肝臓試料は、IV、及びPO用量群の動物から投薬後2、6、及び24時間にて収集した。試料を切除後、フラッシュ凍結させて、ホモジナイゼーションの間ドライアイスに保持した。ホモジナイゼーションは、2OmM EDTA、及び2OmM EGTA(約1×(w/v)肝臓の重量)を含む70%のメタノール-30%の水中のドライアイス上で行った。3回の重さを量った一定分量(約500mg)をPackard試料酸化剤中で燃焼して、放射能9100μL Spec-Chec)(登録商標)を決定するためにLSC解析を行った)。肝臓における総放射能のレベルについての平均データを下記に要約してある。
尿、大便、血漿、及び肝臓抽出物を、上記の通りに放射化学の検出でのHPLC解析のために調製した。大便、肝臓、及び血漿抽出物のための溶媒抽出回収は、表47に示してある。HPLC方法1、及び方法2によって解析した参照標準の保持時間を表48に示してある。
全ての時点のプールした尿試料のHPLC解析を1C群について行った。データを、HPLCピーク面積分布の割合として、及び投与した用量の割合として表して、表49に要約してある。代謝産物R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、及びR8を保持時間に基づいて特徴づけた。
プールした糞便試料を上記の通りに抽出して、HPLC解析のために調製した。24時間収集のみの糞便試料を解析した。低い総放射能、及び試料サイズのため、6時間収集は解析しなかった。
化合物1、及びその主要な代謝産物2'-C-メチルグアノシンの総排泄は、それぞれの成分の総尿中、及び総糞便中排泄の合計として算出した。C群については、推定したデータを算出尿の回収に使用した。データは、表53に示してある。化合物1の全体の排泄は、それぞれIV、及びPO用量群について、投与した用量の45.9%、及び65.6%であった。2'-C-メチルグアノシンの排泄は、それぞれの用量の34.0%、及び28.2%の原因であった。
末端血漿試料を上記の通りにプールして、抽出して、HPLC解析のために調製した。1群については、末端血漿試料(2、6、及び24時間)を上記の通りにプールして、HPLCによって解析した。2群については、6時間試料のみが、解析のための十分な放射能を有した。全ての血漿試料において観察される唯一の検出可能な代謝産物は、2'-C-メチルグアノシンであった。2時間血漿では、2.1分にて溶出する極性ピークを示し、これは、2'-C-メチルグアノシンであり得た。2'-C-メチルグアノシンは、基質成分と相互作用し、これが溶媒前端(およそ2分)における代謝産物の一部溶出を生じさせたことが観察された。試料を水系移動相で希釈した後に再び解析したときは、この成分が消滅した。
肝臓ホモジネートは、個々の動物からの試料の重量に応じて、比例混合によって両用量群についてそれぞれの時点についてプールした。プールした試料を上記の通りに抽出して、HPLC解析のために調製した。代謝産物の存在量は、投与した用量の%として、及びμg当量/gとして決定した。データは、それぞれ、表54、表55、表56、及び表57に示してある。代謝産物R1、R8、及びR9は、保持時間に基づいて特徴づけた。
[14C]化合物1の単一用量を与えられたラットでは、放射能の全体の尿、及び糞便の回収は、IV用量の86%、及びPO用量の94%の原因であった。経口的に投薬された群についての主な排泄経路は、糞便中排泄であった(用量の91%)。IV群については、ほぼ同等の放射能の量が、尿(用量の47%)、及び大便(用量の39%)において回収された。
(HCVレプリコンでの化合物1、及びリバビリン(RBV)のインビトロ併用研究)
GS4.1細胞におけるHCVレプリコン上でのリバビリン(RBV)と組み合わせた化合物1の抗ウイルス活性(Zhuらの文献、2003、J Virol、77:9204-9210)は、下記に記述したとおりに測定した。
Bliss independence model))、及びCombiToolソフトウェア(Loewe additivity model)を使用して行った。加えて、CalcuSynプログラムを、算出したEC50にてCIを算出するために使用した。
(対照)
1. 薬物対照なし:HCVレプリコン(GS4.1)アッセイ培地における細胞。
2. 単一の薬物統制:化合物1単独で処理したHCVレプリコン(GS4.1)細胞。
3. 単一の薬物統制:RBV単独で処理したHCVレプリコン(GS4.1)細胞。
4. ポジティブNS4A ELISA対照:アッセイ培地におけるHCVレプリコン(GS4.1)細胞。
5. ネガティブNS4A ELISA対照:アッセイ培地におけるHuh-7細胞。
6. ポジティブ細胞障害性対照:アッセイ培地。
7. ネガティブ細胞障害性対照:アッセイ培地におけるHCVレプリコン(GS4.1)細胞。
それぞれの株化細胞を試験して、ATCCマイコプラズマ試験サービスにおけるDNA染色、及び直接培養PCR手順によって検出すると、マイコプラズマについてネガティブであることが分かった。
この研究に使用した試薬は、以下の提供先から購入した:トリプシン-EDTA、提供先:Cellgro;メタノール、提供先:Burdick & Jackson;アセトン、提供先:J.T. Baker;抗C型肝炎NS4Aマウスモノクローナル抗体(mAb)、提供先:Virogen;洗浄溶液濃縮物(20X)、提供先:KPL;HRP-ヤギ抗マウスIgG(H+L)抱合体抗体、提供先:Zymed;オルトフェニレンジアミン(OPD錠剤)、提供先:Zymed;過酸化水素30%溶液(H2O2)、提供先:EMD;硫酸(H2SO4)、提供先:Mallinckrodt Chemicals;CellTiter96(登録商標)AQueous One Solution細胞増殖アッセイ(MTに基づく)、提供先:Promega;クエン酸、トリス分裂子塩、二水和物、提供先:Sigma-Aldrich;リン酸ナトリウム、二塩基(Na2HPO4)、提供先:Fisher Chemical;Trizma(登録商標)塩酸溶液(Tris-HCl)、提供先:Sigma-Aldrich;塩化ナトリウム(NaCl)溶液5.0 M、提供先:Applied Biosystem;エチレンジアミン四酢酸(EDTA)溶液0.5 M、提供先:Sigma-Aldrich;ジメチルスルホキシド(DMSO)、提供先:Sigma-Aldrich;ジェネティシン(登録商標)(G418)、100×、提供先:Cellgro;ダルベッコ修正イーグル培地(DMEM)、提供先:Cellgro;ウシ胎児血清(FBS)、熱不活性化した、提供先:Cellgro;ペニシリン/ストレプトマイシン溶液(1mLにつき10,000IU/ mLにつき10,000μg)提供先:Cellgro;GlutaMAX、ジペプチドL-グルタミン(200mM)、提供先:Gibco;及びMEM非必須アミノ酸、提供先:Cellgro。
1. Huh-7細胞のための完全増殖培地:10%のウシ胎児血清、100IU/mLのペニシリン、100μg/mLのストレプトマイシン、2mM GlutaMAX、及び1%のMEM非必須アミノ酸を補った1×DMEM(グルコース、L-グルタミン、及びナトリウムピルベートを含む)。
96ウェルプレートには、GS4.1(列A〜G)、及びHuh-7(列H)細胞を、50μL完全増殖培地中に、それぞれウェルにつき7.5×103細胞の密度にて播種した。
薬物処理の3日後、培地を穏やかにタップすることによってプレートから除去して、細胞を1:1のアセトン:メタノールの100μL/ウェルでプレートに固定した。
細胞をプレートにまき、上で記述した薬物マトリックスを使用して阻害剤で処理した。
MacSynergy(商標)IIプログラム、バージョン1.0(Prichard、Aseltine、Shipman;University of Michigan, Michigan, USA)を、Bliss独立モデルに従って抗ウイルス薬能力データを評価するために使用した。MacSynergy(商標)IIは、個々に滴定したそれぞれの薬物についての用量-反応曲線に基づいて理論的な、相加的な、用量反応表面を算出する。次いで、算出した相加的相互作用表面を、実験に由来する相互作用表面から減算して、非相加的相互作用の領域を明らかにする。0%の阻害における面より上のピークは、相加的相互作用、又は相乗作用を超える領域を示す。逆に、0%の阻害における面の下のピークは、相加的相互作用より少ないものの領域、又はアンタゴニズムを示す。データセットを、実験的な用量反応表面周辺の信頼区間で統計学的に評価する。ピークボリュームは、信頼区間の外にある相乗作用、又はアンタゴニズムの程度を定量化して算出する;相乗作用、及びアンタゴニズムボリューム、及び対数ボリューム(薬物希釈に対して修正する)を報告してある。この研究において、データセットは、99.9%の信頼度にて評価した;<25μM2%のボリューム(対数ボリューム<2)は相加的と考え、>25しかし<50μM2%のもの(対数ボリューム>2、及び<5)を弱い相乗作用、又はアンタゴニズムと認め、値>50しかし<100μM2%(対数ボリューム>5、及び<9)を中度の相乗作用、又はアンタゴニズムと考え、かつ値>100μM2%(対数ボリューム>9)を強力な相乗作用、又はアンタゴニズムと考えた(Prichardらの文献、2004、Antimicrobial Agents and Chemotherapy;37(3):540〜545)。
5つの個々の実験データセットを、99.9%の信頼区間にてMacSynergy(商標)IIソフトウェアを使用して解析した。
算出した相加作用と実験データ間との間の相違をそれぞれの薬物組み合わせについて定量化して、プロットした。図6は、Loewe相加性モデルを使用してCombiToolソフトウェアで得た5つの独立した実験から、全ての薬物組み合わせについて算出した相加性と観察された抗HCV効果との間の相違を示す。図6において、La-EXP=5つの実験から観察された効果とCombiToolソフトウェアによるLoewe相加性モデルによって定まる予測される効果との間の相違。ゼロにおける行は、相加的ゼロ相互作用面を表す。相加的ゼロ相互作用面を表す。ゼロ相互作用面とり下、又はより上に入る位置は、それぞれ相乗作用、又はアンタゴニズムの領域を表す。予測される効果からの0.25よりも大きい偏差を有意であると考えた。
CalcuSynプログラムにより、算出したEC50における平均CIは、0.37±0.12であったことを決定した、この効果レベルにおける相乗作用の解釈に一致した。
(S282T置換されたHCVのリバビリン、及び化合物1に対するインビトロ感受性)
この実験では、2つの試験系:標準的な生化学的アッセイ、及び遺伝子型1bレプリコン試験系において、リバビリン(RBV)、及び化合物1に対するS282T置換されたC型肝炎ウイルス(HCV)のインビトロでの感受性を評価した。リバビリン5'-トリホスフェート、及び化合物7の抗ウイルス能を、薬物の有無におけるオリゴマーリボ核酸(RNA)鋳型への放射標識したグアノシン5'-モノホスフェート(GMP)のNS5Bを媒介した組み込みを測定する標準的なインビトロ酵素アッセイを使用して最初に決定した。野生型、及び部位特異的S282T変異酵素を、リバビリントリホスフェート(RBV-TP)、又は細胞における化合物1の活性代謝物である化合物7の存在下においてアッセイした。
(対照)
1. 生化学的HCVアッセイのための薬物なし(ポジティブ)対照:薬物なしの反応緩衝液中のポリメラーゼ。
2. 生化学的HCVアッセイのためのバックグランド(ネガティブ)対照:ポジティブ対照更に100mM EDTAと同じ。
3. HCVレプリコンアッセイのための薬物なし(ポジティブ)対照:アッセイ培地におけるHCVレプリコン(GS4.1)細胞。
4. ポジティブNS5A ELISA対照:アッセイ培地における未処置HCVレプリコン(GS4.1)細胞。
5. ネガティブNS5A ELISA対照:アッセイ培地におけるHuh-7細胞。
6. ポジティブ細胞障害性対照:アッセイ培地。
7. ネガティブ細胞障害性対照:アッセイ培地における未処置HCVレプリコン(GS4.1)細胞。
この研究に使用したポリメラーゼ酵素は、以下の通りに発現して、精製した。野生型構築物は、組換えポリメラーゼ酵素を産生するために使用される標準的な細菌発現系において遺伝子型1b(株con-1)の65kDaのHCV NS5Bタンパク質をコードする。NS5B遺伝子の残基282にて単一のセリンからスレオニンへの置換を有する突然変異体HCVポリメラーゼプラスミドは、製造業者によって推奨されるように、市販の突然変異誘発キットを使用して、野生型構築物の部位特異的変異誘発によって産生した。この研究に利用した発現構築物は、以下の通りだった:
1. 発現ベクターpET21a(Ampr)のNhel/Xhol制限部位にクローン化したHCV遺伝子型1b野生型ポリメラーゼ(21カルボキシ末端のアミノ酸の欠失をもつ)。クローン番号9〜15。
2. HCV Ib S282Tポリメラーゼは、同じ発現ベクターのNS5B遺伝子のBドメイン内に残基282に単一のセリンからスレオニンへの置換を含む。
それぞれの株化細胞を試験して、ATCCマイコプラズマ試験サービスにおけるDNA染色、及び直接培養PCR手順によって検出すると、マイコプラズマについてネガティブであることが分かった。
1. Huh-7株化細胞は、ヒト肝細胞癌細胞に由来した(Nakabayashi、1982、Cancer Res. 42:3858-3863)。Huh-7細胞は、5%のCO2で37℃にてHuh-7増殖培地中で75cm2 Corningフラスコにおいて維持して、およそ80%のコンフルエンスにてトリプシン-EDTAで分けた。
提供先:Dr. Christoph Seeger、Fox Chase Cancer;Philadelphia、PA
2. GS4.1株化細胞(Zhuらの文献、Replication of hepatitis C virus subgenomes in nonhepatic epithelial and mouse hepatoma cells, J. Virol; 2003, 77:9204-9210)は、Huh-7ヒト肝臓株化細胞に由来して、双シストロン性HVレプリコンを安定に有する。細胞を5%のCO2で3℃にてGS4.1増殖培地中で75cm2 Corningフラスコにおいて維持して、およそ80%のコンフルエンスにてトリプシン-EDTAで分けた。
提供先:Dr. Christoph Seeger、Fox Chase Cancer;Philadelphia、PA
3. 184R-A株化細胞は、1〜5μMの化合物1の存在下において>100日間野生型レプリコン細胞を培養することによって由来した。集団シーケンシングは、S282T変異体が103日までに野生型よりも大きくなったことを示した。
4. また、184R-D2株化細胞は、0.9μMで開始して、3.6μMで終わって化合物1の濃度を増大して存在させて、野生型レプリコン細胞を培養することによって由来した。S282T突然変異は、選択の69日後にレプリコンにおいて出現し、選択の80日後に、野生型S282変異体よりも大きくなった。2つのさらなる突然変異、S189P、及びY586Cは、184R-Dレプリコン株化細胞において観察される。これらの突然変異は、他のいかなる化合物1耐性レプリコンにおいても選択されず、HCV ヌクレオシ(チ)ド類似体に対する耐性には関係しなかった。
RNaseを含まない水、提供先:Applied Biosystems(Catalog#:AM9932);塩化マグネシウム、提供先:Sigma-Aldrich(Catalog#:M1028);塩化マンガン、提供先:Sigma-Aldrich(Catalog#:M1787);ジチオスレイトール(DTT)、提供先:Sigma-Aldrich(Catalog#:43815);α-[33P]GTP、提供先:Perkin Elmer Life Sciences(Catalog#:NEG 606H);フレキシブル96ウェル蓋、提供先:BD Falcon (Catalog*:353913);フレキシブル96ウェルU底プレート、提供先:BD Falcon (Catalog#:353911);Microscint-Oシンチレーション液体、提供先:Perkin Elmer Life Sciences(Catalog#:6013611);超高純度ウシ血清アルブミン(BSA)、50mg/mL、提供先:Applied Biosystems(Catalog#:AM2616);Unifilter-96 GF/Bプレート、提供先:Perkin Elmer Life Sciences(Catalog#:6005177);エタノール(EtOH)、200プルーフ、提供先:Sigma-Aldrich(Catalog#:E7023〜4L);ピロリン酸ナトリウム十水化物、提供先:EMD Chemicals(Catalog#:SX0740-1);Triton X-100、提供先:Sigma-Aldrich(Catalog#:T8787);SUPERase-In RNase阻害剤、提供先:Applied Biosystems(Catalog#:AM2696);グルタミン酸一ナトリウム塩一水和物、提供先:Sigma-Aldrich(Catalog#:G2834);トリクロロ酢酸(TCA)、提供先:EMD Chemicals(Catalog#:TX1045-1)、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)0.5M、pH 8.0、提供先:Applied Biosystems(Catalog#:AM9260G);アデノシントリホスフェート、提供先:GE Healthcare Life Sciences(Catalog#:27-2056-01);シチジントリホスフェート(CTP)、提供先:GE Healthcare Life Sciences(Catalog#:27-2066-01);グアノシントリホスフェート(GTP)、提供先:GE Healthcare Life Sciences(Catalog#:27-2076-01);ウリジントリホスフェート(UTP)提供先:GE Healthcare Life Sciences(Catalog#:27-2086-01);及び合成RNAオリゴヌクレオチド、提供先:Dharmacon(Catalog#:カスタム合成)。
75cm2フラスコ、提供先:Corning Costar(Catalog#:430641);96ウェルプレート、提供先:Corning Costar(Catalog#:3595);トリプシン-EDTA、提供先:Cellgro(Catalog#:25-053-CI);メタノール、提供先:Burdick、及びJackson(Catalog#:AH230-4);アセトン、提供先:J.T. Baker(Catalog#:9006-03);抗C型肝炎NS5Aマウスモノクローナル抗体(mAb)提供先:Virogen(Catalog#:256-A);洗浄溶液濃縮物(20×)、提供先:KPL(Catalog#:50-63-00);HRP-ヤギ抗マウスIgG(H+L)抱合体抗体、提供先:Zymed(Catalog#:81-6520);オルトフェニレンジアミン(OPD錠剤)提供先:Zymed(Catalog#:00-2003);過酸化水素30%溶液(H2O2)、提供先:EMD(Catalog#:HXO635-1);硫酸、提供先:Mallinckrodt化学物質(Catalog#:2876-05);CellTiter 96(登録商標)AQueous One Solution 細胞増殖アッセイ(MTに基づく)、提供先:Promega(Catalog#:G3582);クエン酸、三ナトリウム塩、脱水物、提供先:Sigma-Aldrich(Catalog#:C-8532);リン酸ナトリウム、二塩基、提供先:Fisher Chemical(Catalog#:S373-3);Trizma(登録商標)ハイドロクロライド溶液(Tris-HCl)提供先:Sigma-Aldrich(Catalog#.T2663-1L);塩化ナトリウム、5.0M溶液、提供先:Applied Biosystem(Catalog#:AM9759);エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、溶液0.5M、提供先:Sigma-Aldrich(Catalog#:E7889-100 mL);ジメチルスルホキシド、提供先:Sigma-Aldrich(Catalog#:D2650);ジェネティシン(登録商標)(G418)、100×、提供先:Cellgro(Catalog#:30-324C1);ダルベッコ修飾イーグル培地(DMEM)(提供先):Cellgro(Catalog#:10-013-CV);ウシ胎児血清(FBS)、熱不活性化した、提供先:Cellgro(Catalog#:35-016-CV);ペニシリン/ストレプトマイシン溶液(1mLにつき10,000IU/ mLにつき10,000μg)、提供先:Cellgro;GlutaMAX、ジペプチドL-グルタミン(200mM)、提供先:Gibco;及びMEM非必須アミノ酸、提供先:Cellgro(Catalog#:25-025-CI)。
この実験では、以下の培地、及び緩衝液を使用した。
1. Huh-7細胞のための完全増殖培地:10%のウシ胎児血清、100IU/mLのペニシリン、100μg/mLのストレプトマイシン、2mM GlutaMAX、及び1%のMEM非必須アミノ酸を補った1×DMEM(グルコース、L-グルタミン、及びナトリウムピルベートを含む)。
2. 野生型、及び184Rレプリコン細胞のための完全増殖/選択培地:10%のウシ胎児血清、100IU/mLのペニシリン、100μg/mLのストレプトマイシン、2mM GlutaMAX、1%のMEM非必須アミノ酸、及び0.5mg/mlのジェネティシン(G418)を補った1×DMEM(グルコース、L-グルタミン、及びナトリウムピルベートを含む)
3. アッセイ培地:1%のDMSOを含むHuh-7完全増殖培地
4. ELISA洗浄液溶液:dH2O中に1×に希釈したKPL洗浄溶液
5. 10%のFBS-TNE:10%のFBSを含む、50mM Tris-HCl(pH 7.5;Sigma)、100mM NaCl、1mM EDTA
6. シトラート/ホスフェート緩衝液:16mMクエン酸、27mM Na2HPO4
7. OPD溶液:プレートにつき1 OPD錠剤+ 12mLのシトラート/ホスフェート緩衝液+5mLの30% H2O2。
この実験では、RBV-TP、及び化合物7によるHCV野生型、及びS282T突然変異体ポリメラーゼのインビトロでのポリメラーゼ活性の評価阻害を行った。
カルボキシ末端にヘキサヒスチジンタグをもつ野生型、及びS282T HCVポリメラーゼ酵素を発現して、一段階ニッケルアフィニティークロマトグラフィ手順を利用する大腸菌(E. coli)BL21(DE3)細胞から85〜90%の純度に精製した。
化合物7、及びリバビリン-TP株の調製は、ヌクレアーゼを含まない水中に10mM溶液として調製して、小さな一定分量を-2O℃にて貯蔵した。
このアッセイは、α-[33P]GMPのトリクロロ酢酸(TCA)沈殿可能材料への組み込みに対する薬物の阻害作用を測定するために行った。放射標識した生成物を96ウェルフィルタプレート上で濾過によって収集して、液体シンチレーション計数によって定量化した。合成RNAオリゴヌクレオチドを、相補RNA鎖の合成のための鋳型として使用した。
・試験物質を含む96ウェルフレキシブルプレートは、以下の通りに調製した:5μM ATP中の10μLの段階希釈したRBV-TP、又は化合物7を、隣接するカラムの3つのウェルに移した。プレートを酵素添加前に氷上に保持した。
・10μLの500mM EDTAをアッセイプレートのカラム1に添加し、バックグランド放射能を決定した。
・10μLの5μM ATPを、薬物なし対照のためのアッセイプレートのカラム2、及び3に添加した。
・反応カクテルを大量に氷上に調製して;反応を始めるために、40μLの反応カクテルをアッセイのそれぞれのウェルに添加した。従って、最終反応容積は、50μLであった。反応における全ての試薬の終濃度は、表60に提供してある:
・反応は、50μL沈澱溶液(22.5%のTCA、25mMピロリン酸ナトリウム、氷冷却)の添加、続いて少なくとも20分間の氷上でのインキュベーションによって終結した。
・プレートは、0.1Mのピロリン酸ナトリウムでプレリンスしたGF/Bフィルタプレート(Perkin Elmer Life Sciences)を使用してPackard Unifilter Harvester(Perkin Elmer Life Sciences)で収集した。プレートは、脱イオン水、続いてエタノール洗浄液によって広範に洗浄し、乾燥を補助した。
・プレートを空気乾燥させて、続いてMicroScint-O(ウェルにつき35μL;Perkin Elmer Life Sciences)を添加した。プレートをPackard TopCount液体シンチレーション計数器(Perkin Elmer Life Sciences)で計数した。
・IC50値は、XLfit 4.1ソフトウェアで決定される最良適合方程式によって、単一の部位用量反応曲線から算出した。
この研究では、遺伝子型1bの野生型、又は化合物1耐性のS282Tレプリコンを有する安定な株化細胞におけるリバビリン、及び化合物1のインビトロでの抗HCV活性を決定した。
(薬物処理)
以下のプロトコルを使用した:
1. 96ウェルプレートのカラム2〜12には、野生型(GS4.1)、又はS282T(184R-A、及び184R-D2)レプリコン細胞のいずれかを50μLの完全増殖培地中に、ウェルにつき7.5×103細胞の密度にて播種した。Huh-7細胞を同様の密度にてそれぞれのプレートのカラム1に播種した。
2. 化合物1、及びRBVを2×株にアッセイ培地に希釈した。それぞれの化合物の8つのさらなる3倍段階希釈を、アッセイ培地中に2×株から調製した。最終的な薬剤濃度は、100〜0.015μMまでの範囲であった。
3. 細胞を少なくとも4時間37℃/5% CO2にてインキュベートして、次いで薬物処理を、50μLの段階RBV、及び化合物1薬物希釈を添加することによって開始した。この準備は、それぞれの96ウェルプレートにおいて複製して実行した。
4. 細胞を37℃/5% CO2にて阻害剤と共に3日間インキュベートした。
以下のプロトコルをHCVレプリコンアッセイのために使用した:
1. 薬物処理の3日後、培地を穏やかにタップすることによってプレートから除去して、細胞を1:1のアセトン:メタノールの100μL/ウェルでプレートに固定した。
2. 室温にて1分のインキュベーション後、プレートを100μL/ウェルのELISA洗浄溶液で3回洗浄して、次いで150μL/ウェルの10%のFBS-TNEでブロックした。
3. 室温にて1時間のインキュベーション後、プレートを100μL/ウェルのELISA洗浄溶液で3回洗浄して、次いで100μL/ウェルのマウス抗C型肝炎NS5A mAb(10%のFBS-TNE中に1:1,500に希釈した1mg/mlの貯蔵液)を添加した。
4. 37℃にて2時間のインキュベーションに続いて、プレートを100μL/ウェルのELISA洗浄溶液で3回洗浄して、次いで100μL/ウェルのHRP-ヤギ抗マウス抗体(10%のFBS-TNE中に1:4,000に希釈した)を添加した。
4. 37℃にて1時間のインキュベーション期間の後、それぞれのプレートを100μL/ウェルのELISA洗浄溶液で3回洗浄した。次いで、発色を100μL/ウェルのOPD溶液で開始した。
5. 室温で暗所において30分のインキュベーション期間の後、反応をそれぞれのウェルに100μLの2N H2SO4を添加することによって止めた。
6. 吸光度は、Victor3V1420のマルチ標識カウンター(Perkin Elmer)で490nmにて測定した。HCVレプリコン複製のパーセント阻害は、2つのウェルの平均を使用して、それぞれの薬物、及び薬物の組み合わせについて算出した。50%有効濃度(EC50)値を、XLfit4.1のソフトウェアによって決定される生じる最良適合方程式から化合物1及びRBVについて算出した。
細胞を上記の通りにプレートにまき、阻害剤で処理した。
Claims (49)
- 式:
(a)約2.1分にてC-18(2)4.6×250mm 5μm粒径カラムから溶出する化合物、
(b)約6.2分にてC-18(2)4.6×250mm 5μm粒径カラムから溶出する化合物、
(c)約8.0分にてC-18(2)4.6×250mm 5μm粒径カラムから溶出する化合物、
(d)約9.4分にてC-18(2)4.6×250mm 5μm粒径カラムから溶出する化合物、
(e)約10.9分にてC-18(2)4.6×250mm 5μm粒径カラムから溶出する化合物、
(f)約12.4分にてC-18(2)4.6×250mm 5μm粒径カラムから溶出する化合物、
(g)約13.1分にてC-18(2)4.6×250mm 5μm粒径カラムから溶出する化合物、
(h)約17.1分にてC-18(2)4.6×250mm 5μm粒径カラムから溶出する化合物、
(i)約25.2分にてC-18(2)4.6×250mm 5μm粒径カラムから溶出する化合物、及び、
(j)約26.5分にてC-18(2)4.6×250mm 5μm粒径カラムから溶出する化合物からなる群から選択され、記述した保持時間は、以下の通りのHPLC勾配条件で得られる:
- 式:
(a)約38.4分にてC-18 4.6×250mm 5μm粒径カラムから溶出する化合物、
(b)約39.8分にてC-18 4.6×250mm 5μm粒径カラムから溶出する化合物、
(c)約36.8分にてC-18 4.6×250mm 5μm粒径カラムから溶出する化合物、
(d)約26.8分にてC-18 4.6×250mm 5μm粒径カラムから溶出する化合物、
(e)約33.8分にてC-18 4.6×250mm 5μm粒径カラムから溶出する化合物、
(f)約30.9分にてC-18 4.6×250mm 5μm粒径カラムから溶出する化合物、
(g)約4.6分にてC-18 4.6×250mm 5μm粒径カラムから溶出する化合物、及び、
(h)約28.1分にてC-18 4.6×250mm 5μm粒径カラムから溶出する化合物、
からなる群から選択され、記述した保持時間は、以下の通りのHPLC勾配条件で得られる:
- 前記化合物が同位体的に濃縮された化合物2、同位体的に濃縮された化合物2a、同位体的に濃縮された化合物2b、同位体的に濃縮された化合物3、同位体的に濃縮された化合物3a、同位体的に濃縮された化合物3b、同位体的に濃縮された化合物4、同位体的に濃縮された化合物5、同位体的に濃縮された化合物6、同位体的に濃縮された化合物7、同位体的に濃縮された化合物8、同位体的に濃縮された化合物8a、同位体的に濃縮された化合物8b、同位体的に濃縮された化合物9、同位体的に濃縮された化合物9a、同位体的に濃縮された化合物9b、同位体的に濃縮された化合物10、同位体的に濃縮された化合物10a、同位体的に濃縮された化合物10b、同位体的に濃縮された化合物11、同位体的に濃縮された化合物11a、及び同位体的に濃縮された化合物11bである、請求項13記載の同位体的に濃縮された化合物。
- 同位体的に濃縮された化合物1、同位体的に濃縮された化合物1a、及び同位体的に濃縮された化合物1bからなる群から選択される、同位体的に濃縮された化合物。
- 請求項1〜15のいずれか記載の化合物の有効な治療量を投与することを含む、フラビウイルス科ウイルスに感染した宿主の治療のための方法。
- 前記ウイルスがC型肝炎である、請求項16記載の方法。
- 前記宿主がヒトである、請求項17記載の方法。
- 前記投与が、前記化合物、又はその医薬として許容し得る塩、若しくは立体異性体の実質的な量を前記宿主の肝臓に向けられる、請求項16記載の方法。
- 前記化合物、又はその医薬として許容し得る塩、若しくは立体異性体がインターフェロン、リバビリン、インターロイキン、NS3プロテアーゼ阻害剤、システインプロテアーゼ阻害剤、フェナントレンキノン、チアゾリジン誘導体、チアゾリジン、ベンズアニリド、ヘリカーゼ阻害剤、ポリメラーゼ阻害剤、ヌクレオチド類似体、グリオトキシン、セルレニン、アンチセンスホスホロチオアートオリゴデオキシヌクレオチド、IRES依存的翻訳阻害剤、及びリボザイムからなる群から選択される第2の抗ウイルス薬と組み合わせ、又は交互に投与される、請求項16記載の方法。
- 前記第2の薬剤がペグ化されたインターフェロンα2a、インターフェロンアルファコン-1、天然のインターフェロン、アルブフェロン、インターフェロンβ-1a、オメガインターフェロン、インターフェロンα、インターフェロンγ、インターフェロンτ、インターフェロンδ、及びインターフェロンγ-1bからなる群から選択される、請求項20記載の方法。
- 前記第2の薬剤がリバビリンである、請求項20記載の方法。
- 前記宿主がヒトである、請求項16記載の方法。
- 請求項1〜15のいずれか記載の化合物、及び医薬として許容し得る賦形剤、担体、又は希釈剤を含む、医薬組成物。
- 前記組成物が経口製剤である、請求項18記載の組成物。
- 単離には、逆相媒体を含むカラムから化合物を溶出させることを含む、請求項24記載の方法。
- Ra、及びRbは、以下の通りに選択される、請求項28記載の化合物:
i)Raは、水素であり;及びRbは、イソプロピル、t-ブチル、シクロヘキシル、エトキシカルボニルメチル、t-ブチルオキシカルボニルメチル、カルボキシメチル、又はジメチルアミノエチルであるか;又は
ii)Ra、及びRbは、これらが置換される窒素原子と共に、4-メチルピペラジン、又はモルホリン環を形成する。 - 請求項28〜32のいずれか1項記載の化合物の有効な治療量を投与することを含む、フラビウイルス科ウイルスに感染した宿主の治療のための方法。
- 約1mg/日〜約150mg/日の量の化合物1を投与することを含む、フラビウイルス科ウイルスに感染した宿主の治療のための方法。
- 前記量が約5mg/日〜約100mg/日である、請求項34記載の方法。
- 前記量が約5、10、25、50、75、又は100mg/日である、請求項34記載の方法。
- インターフェロン、リバビリン、インターロイキン、NS3プロテアーゼ阻害剤、システインプロテアーゼ阻害剤、フェナントレンキノン、チアゾリジン誘導体、チアゾリジン、ベンズアニリド、ヘリカーゼ阻害剤、ポリメラーゼ阻害剤、ヌクレオチド類似体、グリオトキシン、セルレニン、アンチセンスホスホロチオアートオリゴデオキシヌクレオチド、IRES依存的翻訳阻害剤、及びリボザイムからなる群から選択される第2の抗ウイルス薬を投与することを更に含む、請求項33〜36のいずれか1項記載の方法。
- 前記第2の薬剤がペグ化されたインターフェロンα2a、インターフェロンアルファコン-1、天然のインターフェロン、アルブフェロン、インターフェロンβ-1a、オメガインターフェロン、インターフェロンα、インターフェロンγ、インターフェロンτ、インターフェロンδ、及びインターフェロンγ-1bからなる群から選択される、請求項37記載の方法。
- 前記第2の薬剤がリバビリンである、請求項38記載の方法。
- 前記化合物1が約1mg/日から約150mg/日の量で投与され、かつ前記投与されるリバビリンの量が約800mg〜約1400mgである、請求項39記載の方法。
- 前記投与されるリバビリンの量が約800mg、1000mg、1200mg、又は1400mgである、請求項40記載の方法。
- 前記ウイルスがC型肝炎である、請求項33〜41のいずれか1項記載の方法。
- 前記宿主がヒトである、請求項33-42のいずれか1項記載の方法。
- 請求項28〜32のいずれか1項記載の化合物、及び医薬として許容し得る賦形剤、担体、又は希釈剤を含む、医薬組成物。
- 前記組成物が経口製剤である、請求項34記載の組成物。
- 約1mg〜約150mgの量の化合物1を含む、医薬組成物。
- 前記量が約5mg、又は25mgである、請求項46記載の医薬組成物。
- 前記組成物が経口カプセルである、請求項47記載の組成物。
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