MX2013013570A - Profarmacos de monofosfato de purina para el tratamiento de infecciones virales. - Google Patents

Profarmacos de monofosfato de purina para el tratamiento de infecciones virales.

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Abstract

La presente invención se dirige a compuestos, composiciones y métodos para tratar o prevenir infecciones virales usando profármacos de monofosfato de análogo de nucleósido. Más específicamente, HCV, Norovirus, Saporovirus, virus de Dengue, virus de Chikungunya y fiebre amarilla en pacientes humanos u otros huéspedes animales. Los compuestos son ciertos profármacos de monofosfato de nucleósido de 2,6-diamino 2-C-metil purina y análogos de profármaco modificado, y sales, profármacos y otros derivados de los mismos farmacéuticamente aceptables. En particular, los compuestos muestran actividad antiviral contra HCV, Norovirus, Saporovirus, virus de Dengue, virus de Chikungunya y fiebre amarilla. Esta invención muestra cómo modificar la trayectoria metabólica de 2,6-diamino 2'-C-metil purina y entregar trifosfato(s) de nucleótido a polimerasas en concentraciones terapéuticamente relevantes hasta ahora inalcanzables.

Description

PROFÁRMACOS DE MONOFOSFATO DE PURINA PARA EL TRATAMIENTO DE INFECCIONES VIRALES Campo de la invención La presente invención se dirige a los compuestos, métodos y composiciones para tratar o prevenir infecciones virales usando los análogos de nucleótidos. Más específicamente, la invención describe los profármacos de monofosfato de nucleósido de 2,6-diamino 2'-C-Me purina y análogos de profármacos modificados, sales farmacéuticamente aceptables, u otros derivados de estos, y su uso en el tratamiento de infección o infecciones virales, y en particular para 1 ) Flaviviridae familia de virus que incluyen hepatitis C (HCV), virus del Nilo Occidental, virus del Dengue, virus de Chikugunya y fiebre amarilla; e 2) infección por Caliciviridae incluyendo Norovirus y Sapovirus. Esta invención enseña cómo modificar la ruta metabólica de 2,6-diamino 2'-C-metil purinas y entregar trifosfatos de nucleótidos a las polimerasas en concentraciones terapéuticamente relevantes hasta ahora inalcanzables.
Antecedentes de la invención Los análogos de nucleósidos, como clase, tienen una historia regulatoria bien establecida, con más de 10 aprobados actualmente por la Administración de Fármacos y Alimentos de Estados Unidos (US FDA) para el tratamiento del virus de ¡nmunodeficiencia humana (HIV), hepatitis B (HBV) o virus de hepatitis C (HCV). El desafío en el desarrollo de las terapias antivirales es inhibir la replicación viral sin dañar la célula huésped. Generalmente, para exhibir actividad antiviral, los análogos de nucleosidos deben ser convertidos metabólicamente por las quinasas de la célula huésped en sus formas trifosfatos correspondientes (NTP). En la forma trifosfato, los inhibidores de nucleosidos de la polimerasa imitan nucleótidos naturales, ya que compiten con uno de los cinco nucleosidos 5'-trifosfatos (NTP) de origen natural, es decir, CTP, UTP, TTP, ATP o GTP durante la elongación del DNA o RNA. Así, los análogos de nucleosidos inhiben la replicación viral al actuar como terminadores de cadena o terminadores de cadena retardada.
El virus de hepatitis C (HCV) ha infectado más de 1 80 millones de personas en el mundo. Se estima que de tres a cuatro millones personas son recién infectadas cada año, de los cuales el 70% desarrollarán hepatitis crónica. El HCV es responsable del 50-76% de todos los casos de cáncer de hígado, y dos tercios de todos los trasplantes de hígado en el mundo desarrollado. La terapia estándar [interferón alfa pegilado más ribavirina (un análogo de nucleósido)] sólo es eficaz en el 50-60% de los pacientes y se asocia con efectos secundarios significativos. Por lo tanto, hay una necesidad urgente de nuevos fármacos contra HCV.
El genoma del virus de la hepatitis C comprende un RNA de cadena positiva incluido en una nucleocápside y envoltura de lípidos y consta de 9.6 kb de ribonucleótidos, que codifica un polipéptido grande de aproximadamente 3000 aminoácidos (Dymock y otros Antiviral Chemistry & Chemotherapy 2000, 1 1 , 79). A continuación de la maduración, este polipéptido se corta en al menos 10 proteínas. Una de estas proteínas, NS5B, posee actividad de la polimerasa y está implicada en la síntesis de RNA de doble cadena a partir del genoma de RNA viral de cadena sencilla que sirve como molde. El descubrimiento de nuevas estrategias antivirales para inhibir selectivamente la replicación de HCV se ha obstaculizado mucho tiempo por la falta de modelos de cultivo celular convenientes para la propagación del HCV. Este obstáculo se superó primero con el establecimiento del sistema de replicón del HCV en 1999 (Bartenschlager, R. , Nat. Rev. Drug Discov. 2002, 1 , 91 1 -916 y Bartenschlager, R. , J. Hepatol. 2005, 43, 21 0-216) y, en 2005, con el desarrollo de modelos celulares robustos de HCV (Wakita, T. , y otros, Nat. Med. 2005, 1 1 , 791 -6; Zhong, J . y otros, Proc. Nati. Acad. , Scie. Estados Unidos 2005, 1 02, 9294-9; Lindenbach, B. D. , y otros, Science 2005, 309, 623-6).
La replicación del HCV se puede prevenir mediante la manipulación de la actividad polimerasa de NS5B a través de la inhibición competitiva de la proteína NS5B. Alternativamente, un análogo de nucleósido terminado de cadena se puede incorporar también en la cadena de RNA que se extiende. Recientemente, muchas solicitudes de patente (que incluyen WO 99/43691 , WO 01 /321 53, WO 01 16031 5, WO 01 179246, WO 01 /90121 , WO 01 /92282, WO 02/48165, WO 02/18404, WO 02/094289, WO 02/057287, WO 02/100415 (A2), US 06/040890, WO 02/057425, WP 1674104 (A1 ), EP 1706405 (A1 ), US 06/199783, WO 02/32920, US 04/67841 66, WO 05/000864, WO 05/021 568) han descrito análogos nucleósidos como agentes anti-HCV.
El virus de Chikungunya (CHI V) es un virus transmitido por insectos que se transmite a los humanos por los mosquitos Aedes Aegyopti que portan el virus [Lahariya C, Pradhan SK. Emergence of virus of Chikungunya in I ndian subcontinent after 32 years: a review. J Vect Borne Dis. 2006;43(4): 1 51 -60]. El virus de Chikungunya (CHIKV) es un miembro del género Alphavirus, en la familia Togaviridae. CHI KV se aisló por primera vez de la sangre de un paciente febril en Tanzania en 1953, y desde entonces se ha identificado reiteradamente en Africa occidental, central y del sur y muchas zonas de Asia, y se ha citado desde ese momento como la causa de numerosas epidemias humanas en esas zonas. Ha habido brotes recientes de CHI KV asociados con la enfermedad severa. CHIKV causa una enfermedad con síntomas similares a la fiebre del dengue. CHI KV se manifiesta con una fase febril aguda de la enfermedad que dura sólo dos a cinco días, seguido de una fase prolongada que puede incluir la enfermedad artrálgica (dolor de la articulación) que afecta a las articulaciones de las extremidades, mialgia (dolor muscular), dolor de cabeza, fatiga (debilidad), náusea, vómito y erupción cutánea. El dolor de las articulaciones asociado con la infección de CHIKV persiste durante semanas o meses, o en algunos casos años. El período de incubación (tiempo entre la infección y la enfermedad) puede ser de 2-12 días, pero generalmente es de 3-7 días. La fiebre aguda de Chikungunya dura de unos pocos días a un par de semanas, pero algunos pacientes prolongaron la fatiga durante varias semanas. Además, algunos pacientes han informado de dolor, incapacidad por dolor en las articulaciones, o artritis que puede durar semanas o meses. Ninguna muerte, casos neuroinvasores, o casos hemorrágicos relacionados con la infección CHIKV se han documentado inequívocamente en la literatura científica. No existen actualmente tratamientos específicos para la infección por el virus de Chikungunya, ni ninguna vacuna aprobada para la prevención de la infección.
Norovirus es uno de los cuatro géneros virales encontrados en la familia de RNA de cadena positiva sin envoltura Calciviridae. Las otras tres especies en Calciviridae son Lagovirus, Vesivirus, y Sapovirus. Sapovirus es el único miembro del género distinto de Norovirus, que utiliza a los humanos como huéspedes. El genoma del Norovirus es de aproximadamente 7.56 kb con tres marcos de lectura abiertos (ORFs). El primer ORF codifica para proteínas no estructurales, incluyendo una helicasa, una proteasa, y una RNA polimerasa dirigida por RNA (RDRP), las cuales se requieren para la replicación del virus. Los dos ORF restantes codifican para las proteínas de la cápside (Jiang, X. (1 993) Virology 1 95(1 ): 51 -61 ). Las numerosas cepas de norovirus se han clasificado en 5 genogrupos de los cuales I , IV y V infectan a los humanos (Zheng, D. P. , y otros (2006) Virology 346(2):312-323) y se estima por el CDC que causa aproximadamente 23 millones de casos de gastroenteritis, que corresponden al 40% de las enfermedades transmitidas por los alimentos cada año en los Estados Unidos (Mead P.S. (1999) Emerg. Infect. Dis. 5(5):607-625).
Los síntomas más comunes son vómitos, diarrea y calambres intestinales. El vómito es el síntoma más común en los niños, mientras que la diarrea es más común en los adultos infectados. La deshidratación es una preocupación significativa. La pérdida de vida debido a este virus es de aproximadamente 300 pacientes por año en los Estados Unidos, y estas muertes son por lo general en los pacientes con un sistema inmunológico débil (Centers for disease control and prevention. "Norwalk-like viruses: public health consequences and outbreak management" MMWR 2001 ;50 (num. RR-9):3). El periodo de incubación entre la exposición y la infección completa es típicamente de 24 a 48 horas, con aproximadamente 30% de los individuos infectados que no muestran síntomas. Los síntomas generalmente persisten por 24 a 60 h (Adler, J . L. y Zickl, R. , J. (1969) Infecí. Dis. 1 19:668-673). La dispersión viral puede durar hasta 2 semanas después de la infección, sin embargo, no está claro si este virus es infeccioso.
Norovirus se transmite principalmente por vía fecal-oral a través de alimentos o agua contaminados, contacto de persona a persona, aerosoles de muestras de heces o vómito. Los títulos virales en muestras de heces pueden alcanzar 1 06 a 1 07 partículas por mi, y las partículas son estables a temperaturas de 0°C (32°F) a 60°C (140°F) (Duizer, E. y otros, (2004) Appl. Environ. Microbiol. 70(8); 4538-4543). El virus es altamente infeccioso, y varias fuentes sugieren que la infección puede requerir la inoculación de tan pocas como 10 a 100 partículas virales (Centers for Disease Control and Prevention) "Norwalk-like viruses: public health consequences and outbreak management'' MMR 2001 ; 50(num. RR-9):3-6). Esto conduce a las epidemias en las escuelas, hogares de ancianos, cruceros, hospitales u otros lugares donde las personas se reúnen.
Norovirus se denomina además virus tipo Norwaik, un nombre derivado de un brote en una escuela en Norwaik, Ohio en 1968. La partícula viral responsable de la enfermedad de Norwaik se identificó en 1972 por microscopía inmunoelectrónica seguido el paso de los filtrados de frotis rectales a través de tres conjuntos de voluntarios humanos (Kapikian, A.Z. y otros (1972) J. Virol. 10: 1075-1081 ). En años siguientes, el virus se denominó virus estructurado redondo pequeño debido a su imagen de microscopía electrónica, calicivirus, ya que es un miembro de la familia Caliciviridae, y/o más comúnmente virus tipo Norwaik probablemente después que la cepa se aisló originalmente. Los nombres comunes para el virus incluyen virus de vómitos de invierno, gripa estomacal, intoxicación alimentaria, y gastroenteritis viral. Mientras que el resultado de la infección generalmente no es peligroso para la vida, el costo de la pérdida del uso de las instalaciones y pérdida de la productividad es grande, y, en consecuencia, una terapia para el tratamiento de la infección por norovirus en los seres humanos, puede ser muy deseable.
Actualmente no existe ningún tratamiento farmacéutico aprobado para la infección por Norovirus (http://www.cdc.gov/ncidod/dvrd/revb/gastro/norovirus-qa.htm), y probablemente esto se debe al menos en parte a la falta de disponibilidad de un sistema de cultivo celular. Recientemente, un sistema de replicón se ha desarrollado para la cepa original de Norwaik G-l (Chang , K.O. , y otros (2006) Virology 353:463-473) . Tanto los replicones de norovirus como los replicones de hepatitis C requieren de helicasa, proteasa, y polimerasa viral para ser funcionales con el fin de que se produzca la replicación del replicón. Más recientemente, un ensayo de infectividad in vitro en cultivo de células se ha informado utilizando inóculos del genogrupo I y I I de Norovirus (Straub, T. M. y otros (2007) Emerg. Infect. Dis. 13(3):396-403). Este ensayo se realiza en un biorreactor de pared-rotativa utilizando pequeñas células epiteliales intestinales en perlas microportadores, y al menos inicialmente parece difícil tamizar un número significativo de compuestos con este sistema. Eventualmente, el ensayo de infectividad puede ser útil para tamizar inhibidores de entrada. Otros grupos, tal como Ligocyte Pharmaceuticals, Inc. (httpJ/www. ligocyte.com/) se han enfocado en tratar de desarrollar una vacuna contra Norovirus, sin embargo, estos esfuerzos aún no han tenido éxito y puede resultar difícil, como frecuentemente ha sido el caso en los sistemas virales donde la baja fidelidad de la replicasa es un beneficio evolutivo.
El Virus del Nilo Occidental (WNV) es de la familia Flaviviridae y predominantemente una enfermedad transmitida por mosquitos. Se descubrió por primera vez en el Distrito del Nilo Occidental de Uganda en 1 937. De acuerdo con los informes de los Centers for disease control and prevention, el WNV se ha encontrado en Africa, Medio Oriente, Europa, Oceanía, Asia occidental y central, y América del Norte. Su primera aparición en América del Norte se inició en la zona metropolitana de la ciudad de Nueva York en 1999. Es una epidemia de estación en Norte América, que normalmente entra en erupción en el verano y continúa hasta el otoño, representando un peligro para la salud del medio ambiente. Su ciclo natural es ave-mosquito-ave y mamífero. Los mosquitos, en particular las especies Culex pipiens, se infectan cuando se alimentan de pájaros infectados. Los mosquitos infectados propagan después el WNV a otras aves y mamíferos, que incluyen los humanos cuando le muerden. En los humanos y caballos, la encefalitis fatal es la manifestación más grave de la infección por WNV. El virus puede causar además mortalidad en algunas aves infectadas. No existe tratamiento específico para la infección por WNV. En los casos con síntomas más leves, las personas experimentan síntomas tales como fiebre y dolores que ellos pasan, aunque incluso las personas sanas se han convertido en enfermos durante varias semanas. En los casos más graves, las personas por lo general necesitan ir al hospital donde puedan recibir tratamiento de apoyo.
La infección por dengue es también de la familia Flaviviridae y es la infección más importante transmitida por artrópodos en Singapur (Epidemiol News Bull 2006, 32, 62-6). A nivel mundial, existe un estimado de 50 a 1 00 millones de casos de fiebre del dengue (DF) y varios cientos de miles de casos de fiebre hemorragica del dengue (DHF) por año con un promedio de fatalidad del 5%. Muchos pacientes se recuperan de la infección por dengue con mínima o ninguna enfermedad residual. Las infecciones por dengue por lo general son asintomáticas, pero pueden presentarse con fiebre de dengue clásico, fiebre de dengue hemorrágico o síndrome de shock del dengue. Incluso para pacientes ambulatorios, la necesidad de mantener una hidratación adecuada es muy importante. Las infecciones por dengue se pueden manejar eficazmente con terapia de reemplazo de fluido por vía intravenosa, y si se diagnostica tempranamente, las tasas de mortalidad se pueden mantener por debajo del 1 %. Para manejar el dolor y la fiebre, los pacientes sospechosos de tener una infección por dengue se les debe dar preparaciones de acetaminofeno. La aspirina y los medicamentos antiinflamatorios no esferoides pueden agravar la tendencia a la hemorragia asociada con alguna infección por dengue. Sin embargo, algunas manifestaciones de infección por dengue descritas previamente incluyen fallo hepático (Dig Dis Sci 2005, 50, 1 146-7), encefalopatía (J Trop Med Public Health 1987, 1 8, 398-406), y síndrome de Guillain-Barré (Intern Med 2006, 45, 563-4).
Se descubrió que, después de la incubación en cultivo celular, o administración in vivo, los nucleosidos 2,6-diamino 2'-C-Me purina se convierten en los nucleosidos correspondientes 6-hidroxi-2,6-diamino 2'-C-Me purina. Hemos encontrado además que esto era válido para una variedad de otros nucleosidos de purina 6-sustituidos. Estos compuestos actúan como profármacos para análogos de G o I , como es el caso del profármaco abacavir y su conversión in vivo en el análogo de G correspondiente Carbovir ((-)-carbocíclico 2',3'-didehidro-2',3'-dideoxiguanosina). Esta conversión limita seriamente la variedad de nucleosidos trifosfatos de purina 6-sust¡tuidos que pueden formarse in vivo como agentes antivirales potenciales.
A la luz del hecho de que HCV; Norovirus, Sapovirus, virus del dengue, virus de Chikungunya y fiebre amarilla han alcanzado niveles alarmantes en todo el mundo, y tienen efectos significativos y trágicos en algunos casos en el paciente afectado, continúa siendo una fuerte necesidad proporcionar nuevos agentes farmacéuticos eficaces para tratar estas enfermedades, con agentes que tengan baja toxicidad para el huésped.
Puede ser ventajoso proporcionar nuevos agentes antivirales o quimioterapia, composiciones que incluyen estos agentes, y métodos de tratamiento que usan estos agentes, particularmente para tratar virus mutantes resistentes al fármaco. La presente invención proporciona agentes, composiciones y métodos de este tipo.
Breve descripción de la invención La presente invención proporciona compuestos, métodos y composiciones para tratar o prevenir la infección por HCV, Norovirus, Sapovirus, virus del dengue, virus de Chikungunya o fiebre amarilla en un huésped. Los métodos implican administrar una cantidad terapéuticamente o profilácticamente eficaz de al menos un compuesto como se describe en la presente descripción para tratar o prevenir una infección por, o una cantidad suficiente para reducir la actividad biológica de la infección por HCV, Norovirus, Sapovirus, virus del dengue, virus de Chikungunya o fiebre amarilla. Las composiciones farmacéuticas incluyen uno o más de los compuestos descritos en la presente descripción, en combinación con un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable, para tratar un huésped con cáncer o infectado con HCV, Norovirus, Sapovirus, virus del dengue, virus de Chikungunya o fiebre amarilla. Las formulaciones pueden incluir además al menos un agente terapéutico adicional. Además, la presente invención incluye los procesos para preparar tales compuestos.
Al igual que con los replicones de hepatitis C, los replicones de norovirus requieren una helicasa, proteasa, y polimerasa viral para ser funcionales con el fin de que se produzca la replicación del replicón. Los replicones se pueden usar en ensayos de alto rendimiento, que evalúan si un compuesto a clasificar por actividad inhibe la capacidad de función de la helicasa, proteasa, y/o polimerasa de norovirus, como se evidencia por una inhibición de la replicación del replicón.
Los compuestos son formas monofosfato de varios nucleósidos de 2,6-diamino 2'-C-metil purina, o análogos de formas monofosfatos, que se tornan trifosforilados también cuando se administran in vivo. Hemos descubierto, muy sorprendentemente, que la preparación del profármaco monofosfato de estos nucleósidos protege parcialmente (o potencialmente en su totalidad) el grupo 6-amino de la conversión al análogo G. Mediante la preparación de los profármacos de monofosfato, hemos desarrollado un método para entregar trifosfatos de nucleótidos a la polimerasa, que antes de esta invención no era posible, o al menos no era posible en concentraciones terapéuticamente relevantes. Esta invención, en algunas modalidades, entrega dos trifosfatos a la polimerasa, uno de los cuales se reconoce como un análogo de G y el otro es reconocido como un análogo de A. Esta invención toma en cuenta una nueva y novedosa serie de trifosfatos de nucleótidos (junto con mezclas con el análogo de G correspondiente) que se preparan in vivo y se registran como agentes antivirales.
Los compuestos descritos en la presente descripción incluyen análogos de monofosfato de nucleósidos de p-D-2,6-diamino 2-C-metil purina. En una modalidad, el compuesto activo es de la Fórmula (A); en otra modalidad , el com puesto activo es de la Fórmula (B) : (A) (B) o una sal farmacéuticamente aceptable o profármaco del mismo, en donde: cuando hay quiralidad en el centro de fósforo este puede ser completamente o parcialmente Rp o S o cualquier mezcla de éstos R es OH o F; Y es O o S; R24 es seleccionado de OR 5, al oleil-o — ) (en donde R 5, R1 7 y R1 8 son como los defin idos más abajo) ; R2 y R3, cuando son administrados in vivo, son capaces de proporcionar el monofosfato o trimonofosfato de nucleósido, es decir ya sea parcialmente o completamente resistente a la deaminación de 6-NH2 en un sistema biológico. y representativos son independientemente seleccionados de: (a) OR15, donde R15 es seleccionado de H, Li, Na, K, fenilo y piridinilo; el fenilo y piridinilo son sustituidos con uno a tres sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de (CH2)O.BC02R16 y (CH2)o-6CON(R16)2; R16 es independientemente H, C1-20 alquilo, la cadena de carbono derivada de un alcohol graso (tal como alcohol oleílico, octacosanol, triacontanol, alcohol linoleílico, y etc) o Ci-2o alquilo sustituido con un alquilo inferior, alcoxi, di(alquilo inferior)-amino, fluoro, C3-10 cicloalquilo, cicloalquil alquilo, cicloheteroalquilo, arilo, tal como fenilo, heteroarilo, tal como, piridinilo, arilo sustituido, o heteroarilo sustituido; en donde los sustituyentes son C1-5 alquilo, o C1-5 alquilo sustituido con un alquilo inferior, alcoxi, di(alquilo inferior)-amino, fluoro, C3-10 cicloalquilo, cicloalquilo; (c) el éster de un L-aminoácido donde R17 está restringido a los L-aminoácidos naturales, y R1 8 es H , C 1 -20 alquilo, la cadena de carbono derivada de un alcohol graso (tal como alcohol oleílico, octacosanol, triacontanol, alcohol linoleílico, y etc) o C 1 -20 alquilo sustituido con un alquilo inferior, alcoxi, di(alquilo inferior)-amino, fluoro, C3-10 cicloalquilo, cicloalquil alquilo, cicloheteroalquilo, arilo, tal como fenilo, heteroarilo, tal como, piridinilo, arilo sustituido, o heteroarilo sustituido; en donde los sustituyentes son C i -5 alquilo, o C 1 -5 alquilo sustituido con un alquilo inferior, alcoxi, di(alquilo inferior)-amino, fluoro, C3-i o cicloalquilo, o cicloalquilo; (d) R2 y R3 pueden unirse para formar un anillo donde R19 es H , C 1 -20 alquilo, C 1.20 alquenilo, la cadena de carbono derivada de un alcohol graso (tal como alcohol oleílico, octacosanol, triacontanol, alcohol linoleílico, etc) o C 1 -20 alquilo sustituido con un alquilo inferior, alcoxi, di(alquilo inferior)-amino, fluoro, C3-10 cicloalquilo, cicloalquil alquilo, cicloheteroalquilo, arilo, tal como fenilo, heteroarilo, tal como, piridinilo, arilo sustituido, o heteroarilo sustituido; en donde los sustituyentes son C i -s alquilo, o C 1.5 alquilo sustituido con un alquilo inferior, alcoxi, di(alquilo inferior)-amino, fluoro, C 3- 1 0 cicloalquilo, o cicloalquilo; (e) R2 y R3 pueden unirse para formar un anillo seleccionado de y donde R20 es O o NH y R2 es seleccionado de H, C 1 -20 alquilo, C 1 -20 alquenilo, la cadena de carbono derivada de un ácido graso (tales como ácido oleico, ácido linoleico, y similares), y C 1.20 alquilo sustituido con un alquilo inferior, alcoxi, di(alquilo inferior)-amino, fluoro, C3-10 cicloalquilo, cicloalquil alquilo, cicloheteroalquilo, a rilo , tales como fenilo, heteroarilo, tales como piridinilo, arilo sustituido, o heteroarilo sustituido; en donde los sustituyentes son C 1 -5 alquilo, o C 1.5 alquilo sustituido con un alquilo inferior, alcoxi, di(alquilo inferior)-amino, fluoro, C3-1 0 cicloalquilo, o cicloalquilo.
Los compuestos se pueden preparar, por ejemplo, preparando los análogos 5'-OH, convirtiendo después éstos a los análogos mono- fosfato.
Además, los compuestos descritos en la presente descripción son inhibidores de HCV, Norovirus, Sapovirus, virus del dengue, virus Chikungunya y/o fiebre amarilla. Por lo tanto, estos compuestos se pueden usar además para tratar a pacientes que están co-infectados con HCV, Norovirus, Sapovirus, virus del dengue, virus Chikungunya y/o fiebre amarilla.
Breve descripción de las figuras Figura 1 : Figura ORTEP de 24 Figura 2: Figura ORTEP de 25 (Sp) Figura 3: Figura ORTEP DE 25 (sP) Figura 4: Incorporación de trifosfato de ((2R,3S,4R, 5R)-5-(2,6-diamino-9H-purin-9-il)-3,4-dih¡droxitetrahidrofuran-2-il)metil tetrahidrógeno por HCV NS5B.
Figura 5: I ncorporación de trifosfato de ((2R,3S,4R,5R)-5-(2-amino-6-hidroxi-9H-purin-9-il)-3, 5-dihidroxitetrah¡drofuran-2-il)metil tetrahidrógeno por HCV NS5B.
Figura 6: Análisis por LC/MS de los nucleotidos formados después de 4 h de incubación en las células Huh7 de 50 µ? 12.
Figura 7: Análisis por LC/MS de los nucleotidos formados después de 4 h de incubación en las células Huh7 de 50 µ? 8a.
Figura 8: supresión metabólica con 8a genera entrega intracelular tanto de un 2,6-diamino como de un trifosfato G.
Figura 9: Análisis por LC/MS de los nucleotidos formados después de 4 h de incubación en las células Huh7 de 50 µ? 8b-arriba.
Figura 10: Supresión metabólica con 8b-arriba genera entrega intracelular tanto de un 2,6-diamono como de un G trifosfato.
Figura 1 1 : Metabolismo intracelular de DAPD en células PBM a una concentración de 50 µ?, durante un periodo de 4 h, a 37°C.
Figura 12: Incubación de fosforamidato RS-864, que contiene un grupo 6-amino y un profármaco 5'-MP en las células PBM a una concentración de 50 µ?, durante un periodo de 4 h, a 37°C.
Descripción detallada de la invención Los profármacos de monofosfatos de nucleósidos de 2,6-diamino-2'-C-Me purina descritos en la presente descripción muestran actividad inhibidora contra HCV, Norovirus, Saporovirus, virus del dengue, virus de Chikungunya y fiebre amarilla. Por lo tanto, los compuestos se pueden usar para tratar o prevenir una infección viral en un huésped, o reducir la actividad biológica del virus. El huésped puede ser un mamífero, y, en particular, un humano, infectado con HCV, Norovirus, Saporovirus, virus del dengue, virus de Chikungunya y/o fiebre amarilla. Los métodos implican administrar una cantidad eficaz de uno o más de los profármacos de monofosfato de nucleótidos de 2,6-diamino 2'-C-Me purina descritos en la presente descripción.
Las formulaciones farmacéuticas que incluyen uno o más compuestos descritos en la presente descripción, en conjunto con un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable, se describen también. En una modalidad, las formulaciones incluyen al menos un compuesto descrito en la presente descripción y al menos un agente terapéutico adicional.
La presente invención se entenderá mejor con referencia a las siguientes definiciones: I . Definiciones El término "independientemente" se usa en la presente descripción para indicar que la variable, que es independientemente aplicada, varía independientemente de aplicación en aplicación. Asi, en un compuesto tal como R"XYR", en donde R" es "independientemente carbono o nitrógeno", tanto R" puede ser carbono, como R" puede ser nitrógeno, o un R" puede ser carbono y el otro R" nitrógeno.
Cuando se usa en la presente descripción, el término "enantioméricamente puro" se refiere a una composición de nucleótidos que comprende al menos aproximadamente 95%, y, de preferencia, aproximadamente 97%, 98%, 99% o 1 00% de un único enantiómero de ese nucleotido.
Cuando se usa en la presente descripción, el término "sustancialmente libre de" o "sustancialmente en ausencia de" se refiere a una composición de nucleotido que incluye al menos 85 a 90% en peso, de preferencia 95% a 98% en peso, y aún con mayor preferencia, 99% a 100% en peso, del enantiómero designado de ese nucleotido. En una modalidad preferida, los compuestos descritos en la presente descripción se encuentran sustancialmente libres de enantiómeros.
Igualmente, el término "aislado" se refiere a una composición de nucleotido que incluye al menos 85 a 90% en peso, de preferencia 95% a 98% en peso, y aún con mayor preferencia, 99%a 100% en peso, del nucleotido, el resto comprende otras especies químicas o enantiómeros.
En algunos casos, el átomo de fósforo puede ser quiral en la presente descripción denominado "P*" o "P" que significa eso y que tiene una designación de "R" o "S" que corresponde con los significados aceptados por las reglas de Cahn-I ngold-Prelog para dicha asignación . Los profármacos de la Fórm ula A y B pueden existir como una mezcla de diastereómeros debido a la quiralidad en el centro de fósforo. Cuando hay quiralidad en el centro de fósforo éste puede ser completamente o parcialmente Rp o Sp o cualquier mezcla de éstos.
El término "alquilo" , como se usa en la presente descripción , a menos que se especifique de cualquier otra forma , se refiere a un hidrocarburo primario, secundario, o terciario, saturado , lineal, ramificado o cíclico, que incluye grupos alquilo sustituidos y no sustituidos. El grupo alqui lo puede estar opcionalmente sustituido con cualquier porción que de cualquier otra forma no interfiere con la reacción o que proporciona una mejora en el proceso, que incluye pero sin limitarse a pero limitado a halo, haloalquilo, hidroxilo, carboxilo, acilo, arilo, aciloxi , amino, amido, derivados carboxilos, alquilam ino, dialquilam ino, arilamino, alcoxi, ariloxi , nitro, ciano, ácido sulfónico, tiol, imina , su lfonilo, sulfanilo, sulfinilo, sulfamonilo, éster, ácido carboxílico, amida , fosfonilo, fosfinilo, fosforilo, fosfamina , tioéster, tioéter, haluro ácido, anhídrido, oxima, hidrozina, carbamato, ácido fosfónico, fosfonato, no protegidos, o protegidos según sea necesario, como conocen los expertos en la material , por ejemplo, como se enseña en Greene, y otros, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, Segunda edición, 19991 , incorporado por este medio como referencia. Se incluyen específicamente C F3 y C H2CF3.
En el texto , siempre que se use el término C (intervalo alqui lo) , el término incluye independientemente cada miembro de esa clase como si se estableciera específicamente y por separado. El término "alquilo" incluye las porciones C1.22 alquilo, y el término "alquilo inferior" incluye las porciones Ci -6 alquilo. Se entiende que las personas de habilidad ordinaria en la material que el radical alquilo relevante se nombra al reemplazar el sufijo "-ano", con el sufijo "-¡lo".
El término "alquenilo" se refiere a un radical hidrocarburo, insaturado, lineal o ramificado, en tanque que contiene uno o más enlaces dobles. El grupo alquenilo descrito en la presente descripción puede estar opcionalmente sustituido con cualquier porción que no afecte adversamente el proceso de reacción, que incluye pero sin limitarse a los descritos para los sustituyentes en porciones alquilo. Los ejemplos no limitantes de grupos alquenilo incluyen etileno, metiletileno, isopropilideno, 1 ,2-etano-diilo, 1 , -etano-diilo, 1 ,3-propano-diilo, 1 ,2-propano-diilo, 1 ,3-butano-diilo, y 1 ,4-butano-diilo.
El término "alquinilo" se refiere a un radical hidrocarburo, acíclico, insaturado, lineal o ramificado, en tanto que contiene uno o más enlaces triples. El grupo alquinilo puede estar opcionalmente sustituido con cualquier porción que no afecte adversamente el proceso de reacción, que incluye pero sin limitarse a los descritos anteriormente para las porciones alquilo. Los ejemplos no limitantes de grupos alquinilo incluyen etinilo, proinilo, hidroxipropinilo, butin-1 -ilo, butin-2-ilo, pentin-1 -ilo, pentin-2-ilo, 4-metoxipentin-2-ilo, 3-metilbutin-1 -ilo, hexin-1 -ilo, hexin-2-ilo, y los radicales de hexin-3-ilo, 3,3-dimetilbutin-1 -ilo.
El término "alquilamino" o "arilamino" se refiere a un grupo amino que tiene uno o dos sustituyentes alquilo o arilo, respectivamente.
El término "protegido" como se usa en la presente descripción, y a menos que se define de cualquier otra forma, se refiere a un grupo que se agrega a un átomo de oxígeno, nitrógeno, o fósforo para evitar que reaccione más o para otros fines. Una amplia variedad de grupos protectores de oxígeno y nitrógeno se conocen por los expertos en la materia de la síntesis orgánica, y se describen, por ejemplo, en Greene y otros, Protective Groups in Organic Syntehsis, supra.
El término "arilo", solo en combinación, se refiere a un sistema aromático carbocíclico que contiene uno, dos o tres anillos en donde tales anillos pueden unirse juntos de una manera colgante o pueden fusionarse. Los ejemplos no limitantes de arilo incluyen fenilo, bifenilo, o naftilo, u otros grupos aromáticos que quedan después de la eliminación de un hidrógeno de un anillo aromático. El término arilo incluye porciones sustituidas e insustituidas. El grupo arilo puede estar opcionalmente sustituido con cualquier porción que no afecte adversamente el proceso de reacción, que incluye pero sin limitarse a los descritos anteriormente para las porciones alquilo. Los ejemplos no limitantes de arilo sustituido incluyen heteroarilamino, N-aril-N-alquilamino, N-heteroarilamino-N-alquilamino, heteroaralcoxi, arilamino, aralquilamino, ariltio, monoarilamidosulfonilo, arilsulfonamido, diarilamidosulfonilo, monoaril amidosulfonilo, arilsulf inilo, arilsulfonilo, heteroariltio, heteroarilsulfinilo, heteroarilsulfonilo, aroilo, heteroaroilo, aralcanoilo, heteroalcanoilo, hidroxiaralquilo, hidroxiheteroaralquilo, haloalcoxialquilo, arilo, aralquilo, ariloxi, aralcoxi, ariloxialquilo, heterociclilo saturado, heterociclilo parcialmente saturado, heteroarilo, heteroariloxi, heteroariloxialquilo, arilalquilo, heteroarilalquilo, arilalquenilo, y heteroarilalquenilo, carboaralcoxi.
Los términos "alcarilo" o "alquilarilo" se refieren a un grupo alquilo con un sustituyente arilo. Los términos "aralquilo" o "arilalquilo" se refieren a un grupo arilo con un sustituyente alquilo.
El término "halo", como se usa en la presente descripción, incluye cloro, bromo, yodo y fluoro.
El término "acilo" se refiere a un éster de ácido carboxíclico en el cual la porción no carbonilo del grupo éster se selecciona de alquilo lineal, ramificado, o cíclico o alquilo inferior, alcoxialquilo que incluye pero sin limitarse a metoximetilo, aralquilo que incluye pero sin limitarse a bencilo, ariloxialquilo tal como fenoximetilo, arilo que incluye pero sin limitarse a fenilo opcionalmente sustituido con halógeno (F, Cl, Br, I); alquilo (que incluye pero sin limitarse a Ci, C2, C3 y C4) o alcoxi (que incluye pero sin limitarse a C1, C2, C3, y C ), ésteres de sulfonato tal como alquilo o aralquil sulfonilo que incluyen pero sin limitarse a metanosulfonilo, el éster de mono, di o trifosfato, tritilo o monometoxitrilo, bencilo sustituido, trialquilsililo (por ejemplo, dimetil-t-butilsililo) o difenilmetilsililo. Los grupos arilo en los ésteres comprenden óptimamente un grupo fenilo. El término "acilo inferior" se refiere a un grupo acilo en el cual la porción no carbonilo es alquilo inferior.
Los términos "alcoxi" y "alcoxialquilo" abarcan radicales lineales o ramificados que contienen oxi que tienen porciones alquilo, tal como radical metoxi. El término "alcoxialquilo" abarca además los radicales alquilo que tienen uno o más radicales alcoxi unidos al radical alquilo, o sea, para formar radicales monoalcoxialquilo y dialcoxialquilo. Los radicales "alcoxi" pueden sustituirse, además, con uno más átomos de halógeno, tal como flúor, cloro o bromo, para proporcionar radicales "haloalcoxi". Los ejemplos de tales radicales incluyen fluorometoxi, clorometoxi, trifluorometoxi, difluorometoxi, trifluoroetoxi, fluoroetoxi, tetrafluoroetoxi, pentafluoroetoxi, y fluoropropoxi.
El término "alquilamino" denota "monoalquilamino" y "dialquilamino" que contiene uno o dos radicales alquilo, respectivamente, unidos a un radical amino. Los términos arilamino denotan "monoarilamino" y "diarilamino" que contienen uno o dos radicales arilo, respectivamente, unidos a un radical amino. El término "aralquilamino", abarca radicales aralquilo unidos a un radical amino. El término aralquilamino denota "monoaralquilamino" y "diaralquilamino" que contienen uno o dos radicales aralquilo, respectivamente, unidos a un radical amino. El término aralquilamino denota además "monoaralquil monoalquilamino" que contienen uno o dos radicales aralquilo un radical alquilo unidos a un radical amino.
El término "heteroátomo", como se usa en la presente descripción, se refiere a oxígeno, azufre, nitrógeno y fósforo.
Los términos "heteroarilo" o "heteroaromático", como se usa en la presente descripción, se refiere a un aromático que incluye al menos un oxígeno, azufre, nitrógeno o fósforo en el anillo aromático.
El término "heterocíclico", "heterociclilo" y cicloheteroalquilo se refiere a un grupo cíclico no aromático en donde hay al menos un heteroatomo, tal como oxígeno, azufre, nitrógeno o fósforo en el anillo.
Los ejemplos no limitantes de grupos heterocíclicos y heteroarilo incluyen furilo, furanilo, piridilo, pirimidilo, tienilo, isotiazolilo, imidazolilo, tetrazolilo, pirazinilo, buenzofuranilo, benzotiofenilo, quinolilo, isoquinolilo, benzotienilo, isobenzofurilo, pirazolilo, indolilo, isoindolilo, bencimidazolilo, purinilo, carbazolilo, oxazolilo, tiazolilo, isotiazolilo, 1 ,2,4-tiadiazolilo, isooxazolilo, pirrolilo, quinazolinilo, cinolinilo, ftalazinilo, xantinilo, hipoxantinilo, tiofeno, furano, pirrol, isopirrol, pirazol, imidazol, 1 ,2,3-triazol, 1 ,2,4-triazol, oxazol, isoxazol, tiazol, isotiazol, pirimidina o piridazina, y pteridinilo, aziridinas, tiazol, isotiazol, 1 ,2,3-oxadiazol, tiazina, piridina, pirazina, piperazina, pirrolidina, oxaziranos, fenazina, fenotiazina, morfolinilo, pirazolilo, piridazinilo, pirazinilo, quinoxalinilo, xantinilo, hipoxantinilo, pteridinilo, 5-azacítidinilo, 5-azauracililo, triazolopiridinilo, imidazolopiridinilo, pirrolopirimidinilo, pirazolopirimidinilo, adenina, N6-alquilpurinas, N6-bencilpurina, N6-halopurina, N6-vinipurina, N6-purina acetilénica, N6-acil purina, N6-hidroxialquil purina, N6-tioalquil purina, timina, citosina, 6-azapirimidina, 2-mercaptopirimidina, uracilo, N5-alquipirimidinas, N5-bencilpirimidinas, N5-pirmidina acetilénica, N5-acil pirimidina, N5-hidroxialquil purina, y N6-tioalquil purina, e isoxazolilo. El grupo heteroaromático puede estar opcionalmente sustituido como se describió anteriormente para el arilo. El grupo heterocíclico o heteroaromático puede estar opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados de halógeno, haloalquilo, alquilo, alcoxi, hidroxi, derivados carboxilo, amido, amino, alquilamino y dialquilamino. El heteroaromático puede ser parcialmente o totalmente hidrogenado como se desee. Como un ejemplo no limitante, puede usarse dihidropiridina en lugar de piridina. Los grupos de oxígeno y nitrógeno funcionales en el grupo heterocíclico o heteroarilo pueden estar protegidos según sea necesario o deseado. Los grupos protectores adecuados son bien conocidos por los expertos en la material, e incluyen trimetilsililo, dimetilhexilsililo, t-butildimetilsililo, y t-butildifenilsililo, tritilo o tritilo sustituido, grupos alquilo, grupos acilo tales como acetilo y propionilo, metanosulfonilo, y p-toluenosulfonilo. El grupo heterocíclico o heteroaromático puede estar sustituido con cualquier porción que no afecte adversamente la reacción, que incluye pero sin limitarse a los descritos anteriormente para el arilo.
El término "huésped", como se usa en la presente descripción, se refiere a un organismo unicelular o multicelular en el que el virus puede replicarse, que incluyen pero sin limitarse a líneas celulares y animales, y, de preferencia, humanos. Alternativamente, el huésped puede portar una parte del genoma viral, cuya replicación o función se puede alterar por los compuestos de la presente invención. El término huésped se refiere específicamente a las células infectadas, las células transfectadas con todo o parte del genoma viral y los animales, en particular, primates (incluyendo, pero sin limitarse a chimpancés) y humanos. En la mayoría de las aplicaciones de animales de la presente invención, el huésped es un paciente humano. Las aplicaciones veterinarias, en ciertas indicaciones, sin embargo, se contemplan claramente por la presente invención (tal como para el uso en el tratamiento de chimpancés).
El término "péptido" se refiere a varios compuestos naturales o sintéticos que contienen de dos a cien aminoácidos enlazados por el grupo carboxilo de un aminoácido al grupo amino de otro.
El término "profármaco o sal farmacéuticamente aceptable" se usa a lo largo de la especificación para describir cualquier forma farmacéuticamente aceptable (tal como un éster, éster fosfato, sal de un éster o un grupo relacionado) de un compuesto nucleótido que, después de la administración a un paciente, proporciona el compuesto monofosfato de nucleótido. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen aquéllas derivadas de bases y ácidos inorgánicos y orgánicos farmacéuticamente aceptables. Las sales adecuadas incluyen las derivadas de metales alcalinos tales como potasio y sodio, metales alcalinotérreos tales como calcio y magnesio, entre otros numerosos ácidos bien conocidos en la técnica farmacéutica. Los profármacos farmacéuticamente aceptables se refieren a un compuesto que se metaboliza, por ejemplo, hidroliza u oxida, en el huésped para formar el compuesto de la presente invención. Los ejemplos típicos de profármacos incluyen los compuestos que tienen grupos protectores biológicamente lábiles en porciones funcionales del compuesto activo. Los profármacos incluyen compuestos que se pueden oxidar, reducir, aminar, desaminar, hidroxilar, dehidroxilar, hidrolizar, dehidrolizar, alquilar, dealquilar, acilar, deacilar, fosforilar, o defosforilar para producir el compuesto activo. Las formas de profármaco de los compuestos de esta invención pueden poseer actividad antiviral, se pueden metabolizar para formar un compuesto que presenta dicha actividad, o ambos.
Los profármacos incluyen además ésteres de aminoácidos de los nucleósidos descritos (ver, por ejemplo, especificación de patente europea num. 99493, cuyo texto se incorpora como referencia, que describe ésteres de aminoácidos del Aciclovir, específicamenté los ésteres de glicina y alanina que muestran una solubilidad en agua mejorada en comparación con el propio Aciclovir, y la patente estadounidense num. 4,957,924 (Beauchamp), que describe el éster de valina del aciclovir, caracterizado por la ramificación de la cadena lateral adyacente al átomo de carbono-a, que mostró biodisponibilidad mejorada después de la administración oral en comparación con los ésteres de alanina y glicina). Un proceso para preparar tales ésteres de aminoácidos se da a conocer en la patente estadounidense un. 4,957,924 (Beauchamp), cuyo texto se incorpora como referencia. Como una alternativa al uso de valina en sí, se puede usar un equivalente funcional del aminoácido (por ejemplo, un haluro de ácido tal como el cloruro de ácido, o un anhídrido de ácido)._ En tal caso, para evitar reacciones colaterales indeseables, puede ser ventajoso usar un derivado de amino-protegido.
I I . Compuesto activo En una modalidad, los compuestos tienen la fórmula proporcionada más abajo: Fórmula 1 donde R1 es OH, o F, y R4 y R5 son, independientemente, Ci-6 alquilo, o una cadena de carbono derivada de un alcohol graso. Las cadenas de carbono derivadas de los alcoholes grasos típicamente tienen entre 8 y 34 átomos de carbono, y pueden incluir 0, 1 o más dobles enlaces. Los alcoholes grasos frecuentemente se obtienen, pero no siempre, por reducción del ácido graso correspondiente. El término "radical de ácido graso" se usa en la presente descripción para referirse a estas cadenas de carbono que todavía contienen el grupo carbonilo del ácido como el punto de unión. Por ejemplo, el alcohol oleílico es cis-9-octadecen-1 -ol, una cadena de 18 carbonos con un único doble enlace. La cadena de carbono derivada dej alcohol oleílico (denominada además en la presente descripción como "cadena de carbono de oleilo") es cis-9- octadeceno. Los valores representativos para R\ R4 y R5 se proporcionan más abajo: En otra modalidad, los compuestos tienen la siguiente fórmula: Fórmula 2 en donde R1 es como se define en la reivindicación 1 , R6 es un metal alcalino o H, y R7 es una cadena de carbono derivada de un alcohol graso. Los valores representativos para R1 , R6 y R7 se proporcionan más abajo: En otra modalidad, los compuestos tienen la siguiente fórmula: Fórmula 3 en donde R1 es como se define en la reivindicación 1 , R8 es -C(0)-Ce-34 alquilo o alquenilo, o un radica l de ácido graso. Los valores representativos para R\ R6, y R7 se proporcionan más abajo: En una cuarta modalidad, los compuestos tienen las fórmulas: Fórmula 4 Fórmula 5 en donde R1 es como se definió en la Fórmula 1 , R9 es O o NH, y R10 es C 1-6 alquilo o una cadena de carbono derivada de un alcohol graso. Los valores representativos para R1 , R9, y R10 se proporcionan más abajo: En una quinta modalidad, los compuestos tienen una de las siguientes fórm ulas: Fórmula 6 Fórmula 7 en donde R1 es como se definió en la Fórmula 1 , R1 1 es Ci-e alquilo o una cadena de carbono derivada de un alcohol graso. Los valores representativos para R1 y R1 1 se proporcionan más abajo: En una sexta modalidad, los compuestos tienen una siguientes fórmulas: Fórmula 8 Fórmula 9 en donde R1 es como se definió en la Fórmula 1 , y R12 y R13 son O o NH. Los valores representativos para R1 , R12 y R13 se proporcionan más abajo: en donde R es como se definió en la Fórmula 1 , R4 es C 1 -6 alquilo o cadena de carbono derivada de un alcohol graso, y R12 es O o NH. valores representativos para R1 , R4 y R12 se proporcionan más abajo En una octava modalidad, los compuestos tienen la siguiente fórmula: Fórmula 1 1 en donde . ;linoleil -O-f ; "leü -0~ y R1 , R1 1 , R7 y R13 son como se definieron anteriormente.
Los procesos para preparar un diastereómero único o enriquecido en el centro de fosforo basado en el grupo saliente de un 4-(sulfonil sustituido)fenol se describen también. En donde el _ representa un grupo o grupos que se pueden convertir en un monofosfato en un sistema biológico que contiene un centro quiral fijo y G1 es un grupo tal como metilo, trifluorometilo, fenilo y etc. La mezcla Rp/Sp se puede separar a través de cromatografía o cristalización. Alternativamente, la mezcla Rp/Sp se puede separar mediante la reacción con un 4-(tiosustituido)fenol en el que solo uno o predominantemente un diastereómero reacciona con dicho 4-(tiosustituido)fenol permitiendo la separación a través de cromatografía o cristalización. Después de la separación, la oxidación del tioéter a la sulfona permite el uso como un reactivo que forma profármaco de monofosfato.
Los procesos para preparar un diastereómero único o enriquecido en el centro de fósforo de un nucleosido basado en el grupo saliente de 4-(metilsulfonil)fenol se describe también. Los procesos implican: a) Reacción del fosforodicloridato de fenilo, F1 , con 4-(metilsulfonil)fenol seguido por etil alanina para dar G 1 como una mezcla aproximada de 1 : 1 Rp/Sp; b) Oxidación de la sulfona H 1 ; c) reacción del H 1 Rp/Sp con un 4-(metiltio)fenol en el que solo un diastereómero reacciona permitiendo la separación a través de la cromatografía c) seguido a la separación el metiltio J 1 se oxida al diastereómero de sulfona único o enriquecido 11 ; d) reacción del diastereómero de sulfona único o enriquecido 11 con el 5'-OH de un nucleósido permite la formación del diastereómero de nucleósido único o enriquecido J 1 ; e) reacción del diastereómero de sulfona único o enriquecido 11 con 4-(met¡ltio)fenol invierte el centro de fósforo formando L1 que contiene la estequiometría del fósforo opuesta con relación a 11 ; f) oxidación de L1 con la sulfona y reacción con el 5'-OH de un nucleósido permite la formación de un diastereómero de profármaco de un diastereómero de nucleósido único o enriquecido con la estequiometría del fósforo opuesta con relación a J 1 . configuración opuesta al fosforo ! versus Jl K] Diastereómero enriquecido fosforamidaio nucleósido En las modalidades anteriores, en a lgunos casos, el átomo de fósforo puede ser q uirai en la presente descripción denominado "P*" o "P" que sig nifica eso y que tiene una desig nación de " R" o "S" que corresponde con los significados aceptados por las reglas de Cahn-I ngold-Prelog para dicha asignación. Estas modalidades pueden existir como una mezcla de diastereomeros debido al a quiraiidad en el centro de fósforo. Cuando hay quiraiidad en el centro de fósforo de estas modalidades puede ser completamente o parcialmente Rp o Sp o cualquier mezcla de éstos.
II I . Estereoisomerismo y polimorfismo Los compuestos descritos en la presente descripción pueden tener centros asimétricos y presentarse como racematos, mezclas racémicas, diastereómeros o enantiómeros individuales, todos con formas isoméricas que se incluyen en la presente invención. Los compuestos de la presente invención que tienen un centro quiral pueden existir en y aislarse en formas racémicas y ópticamente activas. Algunos compuestos pueden presentar polimorfismo. La presente invención abarca formas racémicas, ópticamente-activas, polimórficas, o estereoisoméricas, o mezclas de éstas, de un compuesto de la invención, que posee las propiedades útiles descritas en la presente descripción. Las formas ópticamente activas se pueden preparar mediante, por ejemplo, la resolución de la forma racémica por técnicas de recristalización, por síntesis a partir de materiales de partida ópticamente activos, por síntesis quiral, o por separación cromatográfica usando una fase estacionaria quiral o por resolución enzimática. Uno puede ya sea purificar el nucleósido respectivo, derivar después el nucleósido para formar los compuestos descritos en la presente descripción, o purificar sus propios nucleótidos.
Las formas ópticamente activas de los compuestos se pueden preparar usando cualquier método conocido en la materia, incluyendo, pero sin limitarse a, por resolución de la forma racémica mediante técnicas de recrístalización, por síntesis a partir de materiales de partida ópticamente activos, por síntesis quiral, o por separación cromatográfica usando una fase estacionaria quiral.
Los ejemplos de métodos para obtener materiales ópticamente activos incluyen al menos lo siguiente. i) separación física de los cristales: una técnica mediante la cual los cristales macroscópicos de los enantiómeros individuales se separan manualmente. Esta técnica se puede usar si existen cristales de los enantiómeros separados, es decir, el material es un conglomerado, y los cristales son visualmente diferentes; ií) cristalización simultánea: una técnica mediante la cual -los enantiómeros individuales se cristalizan separadamente a partir de una solución de racemato, sólo posible si ésta última es un conglomerado en estado sólido; iii) resoluciones enzimáticas: una técnica mediante la cual la separación parcial o completa de un racemato en virtud de diferentes velocidades de reacción para los enantiómeros con una enzima; iv) síntesis enzimática asimétrica: una técnica de síntesis mediante la cual al menos una etapa de la síntesis usa una reacción enzimática para obtener un precursor sintético enantioméricamente puro o enriquecido del enantiómero deseado; v) síntesis química asimétrica: una técnica de síntesis mediante la cual el enantiómero deseado se sintetiza a partir de un precursor aquiral bajo condiciones que producen asimetría (es decir, quiralidad) en el producto, que puede lograrse usando catalizadores quirales o auxiliares quirales; vi) separaciones del diastereómero: una técnica mediante la cual un compuesto racémíco se hace reaccionar con un reactivo enantioméricamente puro (el auxiliar quiral) que convierte a los enantiómeros individuales en diastereómeros. Los diastereómeros resultantes se separan después por cromatografía o cristalización en virtud de sus diferencias estructurales ahora marcadas y el auxiliar quiral se elimina posteriormente para obtener el enantiómero deseado; vii) transformaciones asimétricas de primer y segundo orden: una técnica mediante la cual los diastereómeros a partir del racemato se equilibran para hacer rendir una preponderancia en solución del diastereomero a partir del enantiómero deseado o donde la cristalización preferencial del diastereomero a partir del enantiómero deseado perturba el equilibro tal que en principio, eventualmente, todo el material se convierte en el diastereomero cristalino a partir del enantiómero deseado. El enantiómero deseado se libera entonces a partir del diastereomero; viii) resoluciones cinéticas: esta técnica se refiere al logro de la resolución parcial o completa de un racemato (o de una resolución adicional de un compuesto parcialmente resuelto) en virtud de las velocidades de reacción desiguales de los enantiómeros con un reactivo o catalizador quiral, no racémico bajo condiciones cinéticas; ix) síntesis enantioespecífica a partir de precursores no racémicos: una técnica sintética mediante la cual el enantiómero deseado se obtiene a partir de materiales de partida no quirales y donde la integridad estereoquímica no está o sólo está m ínimamente comprometida en el transcurso de la síntesis; x) cromatografía líquida quiral: una técnica mediante la cual los enantiómeros de un racemato se separan en una fase móvil líquida en virtud de sus diferentes interacciones con una fase estacionaria (incluyendo pero sin limitarse a por medio del HPLC quiral). La fase estacionaria se puede preparar de material quiral o la fase móvil puede contener un material quiral adicional para provocar las diferentes interacciones; xi) cromatografía quiral de gases: una técnica mediante la cual el racemato se volatiliza y los enantiómeros se separan en virtud de sus diferentes interacciones en la fase móvil gaseosa con una columna que contiene una fase adsorbente quiral no-racémica fija; xii) extracción con disolventes quirales: una técnica en la cual los enantiómeros se separan en virtud de la disolución preferencial de un enantiómero en un disolvente quiral en particular; xiii) transporte a través de membranas quirales: una técnica mediante la cual un racemato se pone en contacto con una barrera de membrana fina. La barrera típicamente separa dos fluidos miscibles, uno que contiene el racemato, y una fuerza directriz tales como concentración o presión diferencial provoca el transporte preferencial a través de la barrera de la membrana. La separación se produce como resultado de la naturaleza quiral no-racémica de la membrana que permite que sólo un enantiómero del racemato pase a través.
La cromatografía quiral, que incluye pero sin limitarse a, cromatografía del lecho móvil simulado, se usa en una modalidad. Una amplia variedad de fase estacionarias quirales está disponible en el comercio.
IV. Formulaciones de sales o profármacos de nucleótidos En los casos donde los compuestos son suficientemente básicos o ácidos para formar sales ácidas o básicas no tóxicas estables, puede ser apropiada la administración del compuesto como una sal farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables son las sales orgánicas de adición de ácido que forman con ácidos, que forman un anión fisiológico aceptable, por ejemplo, tosilato, metanosulfonato, acetato, citrato, malonato, tartrato, succinato, benzoato, ascorbato, a-cetoglutarato y a-glicerofosfato. Las sales inorgánicas adecuadas se pueden formar además, incluyendo, pero sin limitarse a, sales de sulfato, nitrato, bicarbonato y carbonato.
Las sales farmacéuticamente aceptables se pueden obtener usando procedimientos estándares bien conocidos en la material, por ejemplo haciendo reaccionar un compuesto suficientemente básico tal como una amina con un ácido adecuado, proporcionando un anión fisiológicamente aceptable. Sales de metal alcalino (por ejemplo, sodio, potasio o litio) o metal alcalinotérreo (por ejemplo, calcio) de ácidos carboxílicos se pueden preparar también.
Los profármacos de nucleótidos descritos en la presente descripción se pueden administrar para aumentar adicionalmente la actividad, biodisponibilidad, estabilidad o alterar de cualquier otra forma las propiedades del monofosfato de nucleótido.
Un número de ligandos de profármaco de nucleótido se conoce. En general, la alquilación, acilación u otra modificación lipofílica del monofosfato u otro análogo del nucleósido aumentará la estabilidad del nucleótido.
Los ejemplos de grupos sustituyentes que pueden reemplazar uno o más hidrógenos en la porción de monofosfato son alquilo, arilo, esteroides, carbohidratos, incluyendo pero sin limitarse a azúcares, 1 ,2-diacilglicerol y alcoholes. Varios se describen en R. Jones & N. Bischofberger, Antiviral Research, 1995, 27, 1 -17 y S.J. Hecker & M. D. Erion, J. Med. Chem. , 2008, 51 , 2328-2345. Cualquiera de estos puede usarse en combinación con los nucleótidos descritos para lograr el efecto deseado.
El nucleótido activo también se puede proporcionar como un lípido 5'-fosfoéter como se describe en las siguientes referencias, que se incorporan como referencia: Kucera, L.S. , N. lyer, E. Leake, A. Raben, Modest E.K. , D.L.W. , y C. Piantadosi, "Novel membrane-interactive ether Ikipid analogs that inhibit infectious HIV-1 production and induce detective virus formation", AI DS Res. Hum. Retroviruses, 1 990, 6, 491 -501 ; Piantadosi, C , J. Marasco C.J. , S. L. Morris-Natschke, K. L. Meyer, F. Gumus, J.R. Surtes, K.S. Ishaq, L.S. Kucera, N. lyer, C.A. Wallen, S. Piantadosi, y E.J. Modest, "Synthesis and evaluation of novel ether lipid nucleoside conjugates for anti-HIV activity", J. Med. Chem. , 1991 , 34, 1408-14; Hosteller, K.Y. , D. D. Richman, D.A. Carson, L. M. Stuhmiller, G. M. T. van Wijk, y H. van den Bosch, "Greatly enhanced inhibition of human immunodeficiency virus type 1 replication in CEM and HT4-6C cells by 3'-deoxithymidine diphosphate dimyristoilglycerol, a lipid prodrug of 3,-deoxithymidine," Antimicrob. Agents Chemother. , 1992, 36, 2025-29; Hostetler, K.Y., L.M. Stuhmiller, H. B. Lenting, H. van den Bosch, y D. D. Richman, "Synthesis and antiretroviral activity of fosfolipid analogs of azidothymidine and other antiviral nucleosides" , J. Biol. Chem. , 1990, 265, 61 127.
Los ejemplos no limitantes de patentes estadounidenses que describen sustituyentes lipofílicos adecuados que describen sustituyentes lipofílicos adecuados que se pueden incorporar covalentemente en el nucleósido, preferentemente en la posición R2 y/o R3 de los nucleótidos descritos en la presente descripción, o preparaciones lipofílicas, que se incluyen en las patentes estadounidenses num. 5, 149,794 (Yatvin y otros); 5, 194,654 (Hostetler y otros), 5,223,263 (Hostetler y otros); 5,256,641 (Yatvin y otros); 5,41 1 ,947 (Hostetler y otros); 5,463,092 (Hostetler y otros); 5,6543,389 (Yatvin y otros); 5,543,390 (Yatvin y otros); 5,543,391 (Yatvin y otros); y 5,554,728 (Basava y otros), las cuales se incorporan como referencia. Las solicitudes de patentes extranjeras que describen los sustituyentes lipofílicos que se pueden unir a los nucleósidos de la presente invención, o preparaciones lipofílicas, incluyen WO 89/02733, WO 90/00555, WO 91 /16920, WO 91 /18914, WO 93/00910, WO 94/26273, WO 96/1 5132, WP 0 350 287, EP 93917054.4 y WO 91 /1 9721 .
V. Métodos de tratamiento Los huéspedes, incluyendo pero sin limitarse a los humanos, infectados con HCV, Norovirus, Saporovirus, virus del dengue, virus de Chikungunya, y/o fiebre amarilla, así como otros virus en la familia taxonómica de Calciviridae o Flaviviridae, o un fragmento de gene de éstos, se pueden tratar administrándole al paciente u na cantidad eficaz del compuesto activo o un profármaco farmacéuticamente aceptable o sal de éstos en presencia de un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. Los materiales activos se pueden administrar por cualquier vía apropiada, por ejemplo, vía oral, parenteral, intravenosa, intradérmica, subcutánea, o tópica, en forma líquida o sólida.
En el uso terapéutico para tratar la infección por virus, se pueden administrar los compuestos y/o composiciones a pacientes diagnosticados con dicha infección por el virus a niveles de dosificación adecuados para lograr un beneficio terapéutico. Por "beneficio terapéutico", y equivalentes gramaticales, se entiende que la administración del compuesto conduce a un efecto beneficioso en el paciente en el tiempo. Por ejemplo, en beneficio terapéutico se puede lograr cuando el título del virus o carga viral en un paciente, se reduce o deja de aumentar.
El beneficio terapéuticos se puede lograr además si la administración de un compuesto retrasa o detiene por completo el inicio de los síntomas adversos que acompañan típicamente dichas infecciones virales, i ndependientemente del títu lo del virus o carga viral en el paciente. Los compuestos y/o composiciones descritas en la presente descripción se pueden administrar además profilácticamente en pacientes que están en riesgo de desarrollar la infección por virus, o que han estado expuestos al virus, para prevenir el desarrollo de dicha infección por virus. Por ejemplo, los compuestos y/o composiciones de éstos se pueden administrar a pacientes con probabilidad de haber estado expuestos a dicho virus.
VI . Terapia combinada o alternativa En una modalidad, los compuestos de la invención se pueden emplear juntos con al menos otro agente antiviral, seleccionado a partir de los inhibidores de entrada, inhibidores de transcriptasa inversa, inhibidores de proteasa, y agentes terapéuticos de base inmunitaria.
Por ejemplo, cuando se usa para tratar o prevenir la infección por HCV, el compuesto activo o su profármaco o sal farmacéuticamente aceptable se puede administrar en conjunto o alternando con otro agente anti-HCV, incluyendo, pero sin limitarse a, aquéllos de las fórmulas anteriores. En general, en la terapia combinada, dosificaciones efectivas de dos o más agentes se administran juntas, mientras que durante la terapia alternativa, una dosificación eficaz de cada agente se administra de forma secuencial. La dosificación dependerá de la absorción, inactivación y tasas de excreción del fármaco, así como de otros factores conocidos por los expertos en la materia. Se debe señalar que los valores de dosificación variarán además con la gravedad de la afección a aliviar. Se debe entender además que para cualquier sujeto en particular, los regímenes y esquemas de dosificación específicos deben ajustarse con el tiempo de acuerdo a la necesidad individual y el criterio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones.
Los ejemplos no limitantes de agentes antivirales que se pueden usar en conjunto con los compuestos descritos en la presente descripción incluyen aquéllos en la Tabla 1 más abajo.
Tabla 1 : Compuestos anti-hepatitis C en desarrollo clínico actual III. Terapia combinada para tratar infecciones novovirales Además de los compuestos antivirales descritos en la presente descripción, otros compuestos se pueden presentar también. Por ejemplo, el interferon tipo I (I FN) se conoce que inhibe la replicación de Norovirus. Ciertas vitaminas, particularmente la vitamina C, se cree que sea eficaz en el tratamiento de ciertas infecciones virales. Un estudio demostró que la suplementacion con vitamina A redujo la frecuencia de las infecciones por norovirus Gi l , aumentó la longitud de dispersión tanto de Norovirus Gl como Gi l , y disminuyó la frecuencia de la diarrea asociada a NoV (1 : J Infecí Dis. 2007 Oct 1 ; 196 (7):978-85. Epub 22 de agosto de 2007). La lisina es conocida como un agente antiviral. Se conoce también que las partículas similares a virus (VLP) derivadas de genogrupo I I (Gi l) de Norovirus se unieron a la superficie celular del proteoglicano de heparan sulfato y otros glicosaminoglicanos cargados negativamente. Para tratar los síntomas de la infección, uno puede administrar además un anti-emético, un agente anti-diarreico, y/o un analgésico.
VI I I. Composiciones farmacéuticas Los huéspedes, incluyendo pero sin limitarse a los humanos, infectados con una familia de virus Flaviviridae o virus Caliciviridae o un fragmento de gene de éstos, se pueden tratar administrándole al paciente una cantidad eficaz del compuesto activo o un profármaco farmacéuticamente aceptable o sal de éstos en presencia de un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. Los materiales activos se pueden administrar por cualquier vía apropiada, por ejemplo, vía oral, parenteral, intravenosa, intradérmica, subcutánea, o tópica, en forma líquida o sólida.
Una dosis preferida del compuesto estará en el intervalo de entre aproximadamente 0.1 y aproximadamente 100 mg/kg, más generalmente, entre aproximadamente 1 y 50 mg/kg y, preferentemente, entre aproximadamente 1 y aproximadamente 20 mg/kg, de peso corporal del receptor por día. El intervalo de dosificación efectiva de las sales y profármacos farmacéuticamente aceptables se puede calcular basado en el peso del nucleósido parenteral a entregarse. Si la sal o profármaco exhibe su actividad , la dosificación efectiva se puede estimar como anteriormente usando el peso de la sal o profármaco, o por otros medios conocidos por los expertos en la materia.
El compuesto se administra convenientemente en la unidad de cualquier forma de dosificación adecuada, incluyendo pero sin limitarse a, pero limitado a, una que contiene de 7 a 3000 mg, preferentemente de 70 a 1400 mg de ingrediente activo por forma de dosificación unitaria. Una dosificación oral de 50-1000 mg es generalmente conveniente.
Idealmente, el ingrediente activo debe administrarse para alcanzar concentraciones plasmáticas máximas del compuesto activo de aproximadamente 0.2 a 70 µ?, preferentemente aproximadamente 1 .0 a 15 µ?. Esto se puede lograr, por ejemplo, por la inyección intravenosa de una solución de 0.1 a 5% del ingrediente activo, opcionalmente en solución salina, o administrado como un bolo de ingrediente activo.
La concentración de compuesto activo en la composición del fármaco dependerá de las tasas de absorción, inactivación y excreción del fármaco así como de otros factores conocidos por los expertos en la materia. Se debe señalar que los valores de dosificación variarán también con la gravedad de la afección a aliviar. Se debe entender además que para cualquier sujeto en particular, los regímenes de dosificación específicos deben ajustarse con el tiempo de acuerdo con la necesidad individual y el juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones, y que ios intervalos de concentración que se exponen en la presente descripción son solamente ilustrativos y no pretenden limitar el alcance o práctica de la composición reivindicada. El ingrediente activo se puede administrar una vez, o puede dividirse en un número de dosis más pequeñas que se administran en intervalos variables de tiempo.
Un modo preferido de administración del compuesto activo es el oral. Las composiciones orales incluirán generalmente un diluyente inerte o un portador comestible. Se pueden encerrar en cápsulas de gelatina o comprimirse en tabletas. Para el propósito de la administración terapéutica oral, el compuesto activo puede incorporarse con excipientes y usarse en forma de tabletas, trociscos o cápsulas. Los agentes de unión farmacéuticamente compatibles, y/o materiales adyuvantes pueden incluirse como parte de la composición.
Las tabletas, pildoras, cápsulas, trociscos y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de una naturaleza similar: un aglutinante tales como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tales como almidón o lactosa, un agente desintegrante tales como ácido algínico, Primogel o almidón de maíz; un lubricante tales como estearato de magnesio o Sterotes; un agente de deslizamiento tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tales como sacarosa o sacarina; o un agente saborizante tales como yerbabuena, salicilato de metilo, o sabor de naranja. Cuando la forma de dosificación unitaria es una cápsula, ésta puede contener, además del material del tipo anterior, un portador líquido tal como un aceite graso. Además, las formas de dosificación unitaria pueden contener varios de otros materiales que modifican la forma física de la unidad de dosificación, por ejemplo, revestimientos de azúcar, goma laca u otros agentes entéricos.
El compuesto se puede administrar como componente de un elíxir, suspensión, jarabe, oblea, goma de mascar o similares. Un jarabe puede contener, además del o los compuestos activos, sacarosa como agente edulcorante y ciertos conservadores, tintes y colorantes y sabores.
El compuesto o un profármaco farmacéuticamente aceptable o sales de éstos se pueden mezclar también con otros materiales activos que no afectan la acción deseada, o con materiales que complementan la acción deseada, tales como antibióticos, antifúngicos, anti-inflamatorios u otros antivirales, incluyendo pero sin limitarse a otros compuestos nucleósidos. Las soluciones o suspensiones que se usan para aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metil parabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito sódico; agentes quelantes, tal como ácido etilendiaminotetraacético; amortiguadores tales como acetatos, citratos o fosfatos, y agentes para el ajuste de la tonicidad, tal como cloruro de sodio o dextrosa. La preparación parental se puede encerrar en ampolletas, jeringas desechables o viales de dosis múltiples fabricados de vidrio o plástico.
Si se administran intravenosamente, los portadores preferidos son la solución salina fisiológica o solución salina regulada con fosfato (PBS).
En una modalidad preferida, los compuestos activos se preparan con portadores que protegerán el compuesto contra la eliminación rápida del cuerpo, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo pero sin limitarse a, sistemas de suministro microencapsulados e implantes. Se pueden usar polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como etileno y acetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, y ácido poliláctico. Por ejemplo, los compuestos con recubrimiento entérico se pueden usar para proteger a la escisión por el ácido del estómago. Los métodos para la preparación de tales formulaciones serán evidentes para los expertos en la materia. Los materiales adecuados se pueden obtener además comercialmente.
Las suspensiones liposomales (incluyendo pero sin limitarse a liposomas dirigidos a las células infectadas con anticuerpos monoclonales para antígenos virales) se prefieren también portadores de acuerdo con los métodos conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, como se describe en la patente estadounidense num. 4,522,81 1 (incorporada como referencia). Por ejemplo, las formulaciones de liposomas se pueden preparar disolviendo lípido(s) apropiado(s) (tales como estearoil fosfatidiletanolamina, estearoil fosfatidilcolina, aracadoil fosfatidilcolina, y colesterol) en un disolvente inorgánico que se evapora después, dejando una película delgada de lípido seco sobre la superficie del recipiente. Una solución acuosa del compuesto activo o sus derivados monofosfato, difosfato, y/o trifosfato se introduce después en el recipiente. El recipiente se agita manualmente después para liberar el material lipídico de los lados del recipiente y dispersar los agregados lipidíeos, formando de ese modo la suspensión liposomal.
Los términos utilizados para describir la invención se utilizan comúnmente y son conocidos por los expertos en la técnica. Cuando se usan en la presente descripción, las siguientes abreviaturas tienen lo significados indicados: ac acuoso CDI carbonildiimidazol DMF N, N-dimetilformamida DMSO dimetilsulfóxido EDC clorhidrato de 1 -etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida EtOAc acetato de etilo h hora/horas HOBt N-hidroxibenzotriazol M molar min minuto ta o TA temperatura ambiente TBAT tetrabutilamonio trifenildifluorosilicato TBTU tetrafluoroborato de 0-(benzotr¡azol-1 -il)-N, N, N', N'- tetrametiluronio THF tetrahidrofurano IX. Esquemas generales para preparar los compuestos activos Se proporcionan además los métodos para la preparación fácil de los profármacos de monofosfato de nucleósido de 2,6-diamino 2'-C-Me purina. Los profármacos de monofosfato de nucleósido de 2,6-diamino 2'-C-Me purina descritos en la presente descripción se pueden preparar como se describe en detalle más abajo, o por otros métodos conocidos por los expertos en la materia. Se entenderá por el experto en la técnica que estos esquemas no son en modo algunos limitativos y que se pueden hacer variaciones de detalles sin apartarse del espíritu y alcance de la presente invención.
Generalmente, los profármacos de monofosfato de nucleósido de fórmulas A y B se preparan preparando primero el nucleósido correspondiente, y luego cubriendo el grupo 5'-hidroxi (y el grupo 3'-hidroxi) como un profármaco monofosfato como es descrito en la presente descripción que se puede convertir fácilmente in vivo al monofosfato de nucleósido y en última instancia a una forma trifosfato activa.
Los diversos esquemas de reacción se resumen a continuación. Esquema 1 es un ejemplo no limitante de la síntesis de compuestos activos de la presente invención, y en particular, una aproximación sintética a los nucleósidos 1 .
Esquema 2 es un ejemplo no limitante de la síntesis de compuestos activos de la presente invención, y en particular, una aproximación sintética alternativa a los nucleósidos 1 .
Esquema 3 es un ejemplo no limitante de la síntesis de compuestos activos de la presente invención, y en particular, una aproximación sintética a los profármacos de monofosfato I .
Esquema 4 es un ejemplo no limitante de la síntesis de compuestos activos de la presente invención, y en particular, una aproximación sintética a los profármacos de monofosfato II .
Esquema 5 es un ejemplo no limitante de la síntesis de compuestos activos de la presente invención, y en particular, una aproximación sintética a los profármacos de monofosfato I I I.
Esquema 6 es un ejemplo no limitante de la síntesis de compuestos activos de la presente invención, y en particular, una aproximación sintética a los profármacos de monofosfato IV-VI .
Esquema 7 es un ejemplo no limitante de la síntesis de compuestos activos de la presente invención, y en particular, una aproximación sintética a los profármacos de monofosfato VI I .
Esquema 8 es un ejemplo no limitante de la síntesis de compuestos activos de la presente invención, y en particular, una aproximación sintética a los profármacos de monofosfato VIII-IX.
Esquema 9 es un ejemplo no limitante de una ruta a 1 '-ct-mesilato, 16.
Esquema 1 0 es un ejemplo no limitante de una ruta alternativa a 1 '-a-mestilato, 16.
La preparación de los compuestos de fórmula A y B se realiza primero preparando los nucleosidos 1 que pueden realizarse en cambio por el experto en la material, usando los métodos definidos en: a) Rajagopalan, P. ; Boudinot, F. D; Chu, C. K. ; Tennant, B.C. ; Baldwin, B. H. ; Antiviral Nucleosides: Chiral Synthesis and Chemotherapy: Chu, C. K. ; Eds. Elsevier: 2003. b) Recent Advances in Nucleosides: Chemistry and Chemotherapy: Chu, C. K. ; Ed. Elsevier: 2002. c) Frontiers in Nucleosides & Nucleic Acids, 2004, Eds. R. F. Schinazi & D.C. Liotta, IHL Press, Tucker, GA Estados Unidos, pp: 319-37. d) Handbook of Nucleoside Synthesis: Vorbruggen H. & Ruh-Pohlenz C. John Wiley & sons 2001 ), y por los Esquemas generales 1 -2. Específicamente, los nucleosidos 1 se pueden preparar acoplando azúcar 2 con una base purina libre o sililada y protegida en presencia de ácido de Lewis tal como TMSOTf. La desprotección de los hidroxilos 3'- y 5'- genera el nucleósido 1 . 2 R y base pueden contener 1 protección adecuada; Pr= protección; LG= OCOalquilo, OCOarilo, OCOalquilarilo Esquema 1 . Una aproximación sintética a los nucleósidos 1 . (La base es 2 ,6-diaminopurina o convertible a 2,6-diam inopurina (tal como 2-N H2, 6-CI purina) ; R1 es como se definió en la sección del com puesto activo).
Alternativamente, los nucleósidos 1 se pueden preparar a partir de compuestos 1 '-halo, 1 '-sulfonato o 1 '-hidroxi 3. Para el caso de 1 '-halo o 1 '-sulfonato u na base purina libre o proteg ida en presencia de una base tal como trietilamina o hidruro sódico seguido por la desprotección puede generar los nucleósidos 1 . Para el caso de 1 '-halo una base purina libre o protegida en presencia de un agente de acoplamiento Mitsunobu tal como diisopropil azodicarboxilato seguido por la desprotección puede generar los nucleósidos 1 . 3 1 R y Base puede contener protección adecuada; Pr= protección; X= halógeno, sulfonato o OH Esquema 2 Una aproximación sintética a los nucleósidos 1 . (La base es 2,6-diaminopurina o convertible a 2,6-diaminopurina (tal como 2-NH2, 6-Cl purina); R1 es como se definió en la sección del compuesto activo).
Los profármacos de monofosfato I se pueden preparar como se definió en el Esquema 3 iniciando a partir del fenol 4. La exposición de 4 al oxicloruro de fósforo o tricloruro de fosforotioilo proporciona 5, que se permite reaccionar subsiguientemente con un éster amino 6 para generar fosforamidato 7. El nucleósido 1 se puede convertir después en análogo de monofosfato 8 mediante la reacción del grupo 5'-hidroxilo el propanoato de clorofosforilamino, 7. La eliminación de los grupos de protección a partir de la base y/o azúcar de 8, si se presenta, proporciona profármacos de monofosfato I . contener protección adecuada Esquema 3 Una aproximación sintética a los profármacos de monofosfato I . (La base es 2,6-diaminopurina o una base que puede convertirse en 2,6-diaminopurina; R1 , Y, R16, R17 y R1 8 son como se definieron en la sección de compuesto activo).
Los profármacos de monofosfato I I se pueden preparar mediante la reacción de fenol 4 con oxicloruro de fósforo o tricloruro de fosforotioilo para proporcionar fosforocloridato de difenilo, 9 (Esquema 4). El nucleósido 1 puede convertirse después en un intermediario del análogo de monofosfato mediante la reacción del grupo 5'-hidroxilo con el fosforocloridato de difenilo, 9. La eliminación de los grupos de protección, si es necesario, proporciona los profármacos de monofosfato II .
Esquema 4 Una aproximación sintética a los profármacos de monofosfato II . (La base es 2,6-diaminopurina o una base que puede convertirse en 2,6-diaminpurina; R1 , Y, R16 y R17 son como se definieron en la sección de compuesto activo).
Los profármacos de monofosfato I II se pueden preparar mediante la reacción del nucleósido 1 con oxicloruro de fósforo o tricloruro de fosforotioilo. El intermediario resultante se puede hacer reaccionar después con un éster L-am¡no seguido por agua (Esquema 5). La eliminación de los grupos de protección, si es necesario, proporciona los profármacos de monofosfato I I I . adecuada Esquema 5 Una aproximación sintética a los profármacos de monofosfato I I I. (La base es 2,6-diaminopurina o una base que puede convertirse en 2,6-diaminopurina; R1 , Y, R17 y R18 son como se definieron en la sección de compuesto activo).
Los profármacos de monofosfato IV se pueden preparar mediante la reacción del nucleósido 1 con oxicloruro de fósforo o tricloruro de fosforotioilo. El intermediario resultante se puede hacer reaccionar después con un éster de un ácido L-amino seguido por 1 1 (Esquema 6). La eliminación de los grupos de protección, si es necesario, proporciona los profármacos de monofosfato IV. Utilizando un protocolo similar con sustitución de 10 por R15OH u 1 1 , los profármacos de monofosfato V y VI se pueden preparar también.
Esquema 6 Una aproximación sintética a los profármacos de monofosfato IV-VI . (La base es 2,6-diaminpurina o una base que puede convertirse en 2,6-diaminopurina; R\ Y, R17, R18 y R20 son como se definieron en la sección de compuesto activo).
Los profármacos de fosfato cíclico, fosforamidato, o fosforodiamidato IV se pueden preparar mediante la reacción del nucleósido 1 con oxicloruro de fósforo o tricloruro de fosforotioiio. El intermediario resultante se puede hacer reaccionar con el dinucleófilo 12 (Esquema 7). La eliminación de los grupos de protección, si es necesario, proporciona profármacos de monofosfato VI I . 12 R y base pueden contener protección adecuada Esquema 7 Una aproximación sintética a los profármacos de monofosfato VII. (La base es 2,6-diaminopurina o una base que puede convertirse en 2,6-diaminopurina; R\ Y y R20 son como se definieron en la sección de compuesto activo).
Los profármacos 3',5'-fosfato cíclico VI I I se pueden preparar mediante la reacción de oxicloruro de fósforo o tricloruro de fosforotioilo con un reactivo que contiene OH o NH tal como fenol 4. El intermediario resultante 1 5 se puede purificar o usar directamente con el nucleósido 1 (Esquema 8). La eliminación de los grupos de protección, si es necesario, proporciona los profármacos de monofosfato VI I I . Los profármacos de 3',5'-fosfato cíclico VI I I-IX se pueden preparar además a través de métodos conocidos que involucran a los intermediarios de fósforo (II I) que reaccionan con 1 seguido por la oxidación del fósforo (V) (Esquema 8).
PYCI3 + 4 ~ R1 y base pueden contener protección adecuada ; A. ; Linoleil-O-H ; oleil-O-H 0/ -O-J (IX) Esquema 8 Una aproximación sintética a los profármacos de monofosfato VI I I-IX. (La base es 2,6-diaminopurina o una base que puede convertirse en 2,6-diaminopurina; R1 , Y, R14, R17, R1 8 y R20 son como se definieron en la sección de compuesto activo).
Para el caso del compuesto 3 cuando X = sulfonato (Esquema 2) tal como 16 (Esquema 9) que pueden prepararse a partir de 15 bajo condiciones de acoplamiento con un ácido sulfónico. Por ejemplo, pueden proporcionarse condiciones de acoplamiento tal como acoplamiento Mitsunobu con azo carboxilatos y reactivos de fósforo (I II) 16. El compuesto 15 en presencia de un ácido sulfónico o sal de sulfonato se puede acoplar a 15 con el azodicarboxilato de diisopropilo y trifenilfosfina en un disolvente tales como dioxano o tolueno.
Sal de ácido sulfóníco o sulfonato Esquema 9 Ruta a 1 '-a-mes¡lato, 16 Además, el sulfonato 16 se puede preparar a partir de 15 invirtiendo primero el grupo hidroxi de 15 en (Esquema 9) condiciones de acoplamiento tal como acoplamiento Mitsunobu con un ácido carboxílico o sal de carboxilato, un carboxilato azo y un reactivo de fósforo (I II) se puede proporcionar 17. El compuesto 1 7 en presencia de ácido acético o sal de acetato se puede acoplar a 15 con el azodicarboxilato de diisopropilo y trifenilfosfina en un disolvente tal como dioxano o tolueno. La eliminación selectiva del acetato de 17 se puede realizar con una base tal como carbonato de potasio en un disolvente alcohólico tal como metanol para poder proporcionar alcohol 1 '-invertido 1 8. La conversión de 16 a 18 se puede realizar con un cloruro o anhídrido de sulfonilo en presencia de una base tal como trietilamina o diisopropil etilamina en un disolvente tal como diclorometano o dicloroetano.
AcOH 15 ß/a 1:9 pero separable 16 16 17 Esquema 1 0 Ruta alternativa a 1 '-a-mesilato, 1 6.
En algunos casos el átomo de fósforo puede ser quiral en la presente descripción denominado "P*" o "P" que significa eso y que tiene una designación de "R" o "S" que corresponde con los significados aceptados por las reglas de Cahn-I ngold-Prelog para dicha asignación. Los profármacos de fórmulas A y B pueden existir como una mezcla de diastereómeros debido a la qu iralidad en el centro de fósforo. Cuando hay quiralidad en el centro de fósforo puede ser completamente o parcialmente Rp o Sp o cualquier mezcla de éstos.
En otra modal idad , la invención se refiere a un proceso para preparar una análogo de fósforo de un alcohol en donde el enlace fósforo-oxígeno se forma mediante la reacción con un reactivo de fórmulas generales G o H con un alcohol 1 o , 2° o 3o o alcóxido 1 o, 2o o 3o.
(G) (H) en donde: la quiralidad en el centro de fósforo de fórm ulas G o H puede ser completamente o parcia lmente Rp o Sp o cualquier mezcla de éstos, Y, R2 y R3 son como se definieron a nteriormente, y R22 es, independientemente, H , C 1 -20 alquilo, CF3, arilo, tal como fenilo, heteroarilo tal como piridinilo, arilo sustituido o heteroarilo sustituido, o Ci -2o alq uilo sustituido con un alquilo inferior, alcoxi , di(alquilo inferior)-amino, cloro, fluoro, arilo, tal como fenilo, heteroarilo, tai como, piridinilo, arilo sustituido, o heteroarilo sustituido.
En esta modal idad , los alcoholes no se lim itan a los nucleósidos purina descritos en la presente descripción , pero puede ser cualquier alcohol, incluyendo, pero no lim itado a , cualquier porción 5'-OH en un nucleósido con algo de azúcar incluyendo dicha porción 5'-OH . Los compuestos formados mediante este proceso pueden ser cualquier éster de fosfato deseado.
En u n aspecto de esta modalidad , donde R2 y/o R3 de fórmulas G o H contienen un centro quiral, el proceso implica además la etapa de separación de los diastereómeros de fósforo mediante la cristalización de la mezcla diastereomérica G o H , donde R2 y/o R3 de fórmulas G o H contienen un centro quiral, el proceso im plica además la etapa de separación de los diastereómeros de fósforo mediante la reacción de compuestos de fórmula I mezcla diastereomérica de fórmulas G o H , (I) donde R22 es como se definió anteriormente, R23 se selecciona de H, Li, Na, K, NH4, y la sal bis con Ca o Mg. donde R2 y/o R3 de fórmulas G o H contienen un centro quiral, el proceso implica además la etapa de inversión del estereocentro de fósforo mediante la reacción de los compuestos de fórmula I con un diastereómero sencillo o enriquecido de fórmulas G o H.
(I) donde R22 es como se definió anteriormente, y R23 se seleccionada de H, Li, Na, K, NH4, y la sal bis con Ca o Mg.
La presente invención se ilustra además en los siguientes Ejemplos 1 - 8, que muestra los métodos preparativos para sintetizar los nucleósidos y profármacos de 2,6-diamino 2'-C-Me purina, y los Ejemplos 9 - 31 muestran los métodos de la evaluación biológica de los nucleósidos, nucleótidos y análogos de nucleótidos de 2,6-diamino 2'-C-Me purina. Se entenderá por el experto en la técnica que estos ejemplos no son en modo alguno limitantes y que se pueden hacer variaciones en detalles sin apartarse del espíritu y alcance de la presente invención.
Ejemplos específicos Los compuestos específicos que son representativos de esta invención se prepararon como para los siguientes ejemplos y secuencias de reacción; los ejemplos y los diagramas que describen las secuencias de reacción se ofrecen a modo de ilustración, para ayudar la comprensión de la invención y no se debe considerar que limitan de ningún modo la invención mostrada en las reivindicaciones que siguen después. Los presentes compuestos pueden usarse además como intermediarios en los ejemplos subsiguientes para producir compuestos adicionales de la presente invención. Ningún intento necesariamente ha sido hecho para optimizar los rendimientos obtenidos en cualquiera de las reacciones. Un experto en la técnica puede saber cómo aumentar tales rendimientos a través de variaciones rutinarias de los tiempos de reacción, temperaturas, disolventes y/o reactivos.
Los solventes anhidros se compraron a Aldrich Chemical Company, Inc. (Milwaukee). Los reactivos se compraron a proveedores comerciales. A menos que se indique de otra manera, los materiales usados en los ejemplos se obtuvieron de proveedores comerciales fácilmente disponibles, o se sintetizaron mediante los métodos estándares conocidos para el experto en síntesis química. Los puntos de fusión (mp) se determinado en un aparato de punto de fusión digital electrotérmico y están sin corregir. Espectros de NMR 1 H y 13C se tomaron en un espectrómetro Varían Unity Plus 400 a temperatura ambiente y se reportó en ppm campo abajo a partir de tetrametilsilano interno. Los experimentos de intercambio de deuterio, experimentos de desacoplamiento o 2D-COSY se realizaron para confirmar las asignaciones de protones. Multiplicidades de señal se representan por s (singulete), d (doblete), dd (doblete de doblete), t (triplete), q (cuádruplo), br (ancho), bs (singulete amplio), m (multiplete). Todos los valores J son en Hz. Los espectros de masa se determinaron en un espectrómetro Micromasa Platform LC usando técnicas de electronebulización. Los análisis elementales se realizaron por Atlantic Microlab Inc. (Norcross, GA). TLC analítica se realizó sobre placas de gel de sílice Whatman LK6F, y TLC preparativa sobre placas de gel de sílice Whatman PK5F. La cromatografía de columna se llevó a cabo sobre Gel de Sílice o a través de cromatografía líquida de alta eficacia de fase inversa.
Ejemplo 1 : Síntesis de los profármacos de monofosfato 2,6-diamino purina 2'-C-Me 8a y 8b. 7 etapas 8 8a R= i- 8b R= Etii 3-feniiprcpanoato (2R,3R,4R,5R)-5-((benzoiloxi)metil)-2-(2,6-diamino-9H-purin-9-il)-3-metiltetrahidrofuran-3,4-diil dibenzoato 3 A una suspensión agitada de (3R,4S,5R)-5-((benzoiloxi)metil)-3-metiltetrahidrofuran-2,3,4-triil tribenzoato 1 (2.9 g, 5 mmol) y 2,6-diaminopurina 2 (830 mg, 5.5 mmol) en acetonitrilo anhidro a -78°C se añadió DBU (2.3 mi, 15.0 mmol), seguido por una adición lenta de TMOSTF (3.8 mi, 20.0 mmol). La mezcla de reacción se agitó a -78°C por 20 min, y después se elevó hasta 0CC. Después de agitar 30 min a 0°C, la mezcla de reacción se calentó gradualmente hasta 65°C, y se agitó toda la noche. La mezcla de reacción se diluyó con CH2CI2 (200 mi) y se lavó con NaHC03 saturado. Las capas se separaron y la capa acuosa resultante se extrajo con CH2CI2 (2 x 20 mi). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2S04. Después de eliminar el solvente, el residuo se purificó por cromatografía de columna en gel de sílice (0% a 10% MeOH en EtOAc). 2.8 g del compuesto 3 se obtuvo (92% de rendimiento). LC/MS calculada para C32H28 6O7 608.2, observado: 609.2 (M + 1). (2R,3R,4R, 5R)-5-((benzoiloxi)metil)-2-(2,6-bis(bis(ter-butroxicarbonil)amino)-9H-purin-9-il)-3-metiltetrahidrofuran-3,4-diil dibenzoato 4 Una solución de 3 (1.4 g, 2.3 mmol), Boc anhídrido (3.0 g, 13.8 mmol) y DMAP (56 mg, 0.46 mmol) en THF (12 mi) se agitó a ta por 30 h. Después que la reacción se completó, el solvente se eliminó a presión reducida y el residuo se purificó por cromatografía rápida de columna (0% a 40% EtOAc en hexano). Se obtuvieron 2.1 g de un sólido blanco 4 (90% de rendimiento).
Di-ter-butil (9-((2R, 3R, 4R, 5R)-3, 4-dihidroxi-5-(h¡droximetil)-3-metiltetrahidrofuran-2-il)-9H-purina-2,6-diil)bis(ter-butoxicarbonilcarbamato) 5 A una solución de 4 (1.7 g, 1.68 mmol) en metanol anhidro (50 mi) se añadió una solución de metóxido sódico (4.37 M, 0.3 mi, 1.3 mmol) a ta por 30 min (Monitoreado por TLC y LC-MS). Después que la reacción se completó, se añadió resina Dowex (H+ forma) en forma de porciones para ajustar el pH a 7.0. La resina se filtró y se lavó con metanol, el filtrado se concentró y el residuo se purificó por cromatografía rápida de columna (0% a 10% MeOH en CH2CI2) para proporcionar 1.08 g de un sólido blanco 5 (92% de rendimiento). 1H-NMR (CD3OD): 0.92 (s, 3H, CH3), 1.40 (s, 18H, 6 x CH3), 1.41 (s, 18H, 6 x CH3), 3.89 (dd, 1H, J=2.8 Hz, J = 12.4 Hz), 4.03-4.11 (m, 2H), 4.22 (d, 1H, J = 8.8 Hz, H3'), 6.19 (s, 1H, Hi'), 9.09 (s, 1H, H8); 13C-NMR (CD3OD): 20.2, 27.9, 28.1, 60.9, 73.1, 80.2, 84.6, 84.9, 85.4, 93.3, 128.8, 147.0, 151.2, 151.9, 152.0, 155.0; LC/MS calculada para C3iH48N60i2 696.3, observado: 697.4 (M+1). (2S)-etil 2-((((2S, 3R, 4R, 5R)-5-(2, 6-diamino-9H-purin-9-il)-3, 4-dihidroxi-4-metiltetrahidrofuran-2-il)metoxi)(fenoxi)fosforilamino)propanoato 8a A una solución de 5 (780 mg, 1.12 mmol) y N-metilimidazol (0.45 mi, 5.8 mmol) en THF (5 mi) a 0°C se añadió por goteo (2S)-etil 2- (cloro(fenoxi)fosforilamino)propanoato1 (5.8 mi, 5.8 mmol). La mezcla resultante se agitó toda la noche a ta. Después de la eliminación del solvente a presión reducida, el residuo se purificó por cromatografía rápida de columna (0% a 10% MeOH en CH2CI2) para proporcionar 576 mg de 7a como un sólido blanco (54% de rendimiento). Una solución enfriada previamente (<10°C) de TFA (80%, 23 mi) se añadió a 7a enfriado previamente (~5°C) (550 mg, 0.58 mmol) en un baño de hielo. La solución se agitó desde la temperatura del baño de hielo hasta ta, después se agitó a ata por 4 h (monitoreado por TLC y LC/MS). Después que la reacción se completó, el solvente se eliminó a presión reducida y el residuo se evaporó conjuntamente con el metanol (4 x 15 mi). El residuos e disolvió en metanol (20 I) y se neutralizó con NaHCC saturado. Después de la eliminación del solvente, el resido se purificó por cromatografía rápida de columna (0°C a 15% MeOH en CH2CI2) para proporcionar 225 mg de un sólido blanco 8a (71%) (38.3% de rendimiento para dos etapas). H-NMR (CD3OD) (1:1 mezcla de diastereómeros P): 0.94 (s, 3H, CH3); 0.97 (s, 3H¡ CH3), 1.13-1.19 (m, 6H, 2 x CH3), 1.16-1.31 (m, 6H, 2 x CH3), 3.90-4.58 (m, 14H), 5.93 (s, 1H, Hi'), 5.96 (s, 1H, ? ), 7.14-7.34 (m, 10H, Ar-H), 7.86 (s, 2H, He); 31PNMR (CD3OD): 4.77, 4.89; LC/MS calculada para C22H3o 708P 551.1, observado: 552.3 (M+1).
Etil 3-(2-(((((2S,4S,4R,5R)-5-(2,6-diamino-9H-purin-9-il)-3,4-dih¡droxi-4-metiltetrahidrofuran-2-il)metoxi)(((S)- 1 -ñetoxi- 1 -oxopropan-2-il)amino)fosforil)oxi)fenil)propanoato 8b Un procedimiento similar se empleó para la síntesis del profármaco 8b. 8b (110 mg) se obtuvo a partir de 210 mg de 5, 56% para dos etapas). Mayor (que eluye primero "arriba" ) 8b-arriba: Rotación óptica [a]24D -7.08 (c 0.24, MeOH); 1H-NMR (CD3OD) 0.97 (s, 3H, CH3), 1.15-1.20 (m, 6H, 2 x CH3), 1.34 (d, 3H, J=7.2 Hz, CH3), 2.62 (t, 2H, J=8.0 Hz, 2H, CH2), 2.99 (t, 2H, J=8.0 Hz, 2H, CH2), 3.95-4.58 (m, 9H), 5.94 (s, 1H, H,'), 7.07-7.38 (m, 4H, Ar-H), 7.86 (s, 1H, He); 31PNMR (CD3OD): 5.03; LC/MS calculada para C27H38 70ioP 651.2, observado: 552.2 (M+1). Menor (que eluye último ("abajo") 8b-abajo: Rotación óptica [a]2 D -12.12 (c 0.13, MeOH), 1H-NMR (CD3OD): 0.97 (s, 3H, CH3), 1.15-1.17 (m, 6H, 2 x CH3), 1.34 (d, 3H, J=7.2 Hz, CH3), 2.62 (t, 2H, J=8.0 Hz, 2H, CH2), 2.99 (t, 2H, J=8.0 Hz, 2H, CH2), 3.96-4.51 (m, 9H), 5.91 (s, 1H, Hi'), 7.1'-7.30 (m, 4H, Ar-H), 7.86 (s, 1H; H8); 31PNMR (CD3OD): 4.98; LC/MS calculada para C27H38N7O10P 651.2, observado: 652.3 (M + 1).
Referencias: 1. (a) Perrone, P.; Daverio, F.; Valente, R.; Rajyaguru, S.; Martin J.A.,; Lévéque, V.; Pogam, S.L.; Najera, I.; Klumpp, K.; Smith, D.; B. y McGuigan, C. First Example of Phosphoramidate Approach Applied to a 4'-Substituted Purine Nucleoside (4'-Azidoadenosine): Conversión of an Inactive Nucleoside to a Submicromolar Compound versus Hepatitis C Virus. J. Med. Chem. 2007, 50, 5463-5470. (b) Uchiyama, M.; Aso, Y.; Noyori, R.; Hayakawa, Y. O-Selective fosforilation of nucleosides without N-protection. J. Org. Chem. 1993, 58, 373-379.
Ejemplo 2: Síntesis del profármaco de monofosfato 2,6-diamino purina 2'-C-Me 1 1 . £í/7 3-(2-(((((2R, 3R, 4R, 5R)-5-(2, 6-d¡amino-9H-pur¡n-9-il)-3, 4-dihidroxi-4-metiltetrahidrofuran-2-¡l)metoxi) (2-(3-etoxi-3-oxopropil)fenoxi)fosfor¡l)oxi)fenil)propanoato, 11 A una solución de 5 (630 mg, 0.91 mmol) y N-metilimidazol (0.35 mi, 4.5 mmol) en THF (3 mi) a 0°C se añadió por goteo una solución de dietil 3,3'-(((clorofosforil)bis(oxi))bis(2, 1 -fenileno))dipropanoato 9 en THF (9 mi, 4.5 mmol). La mezcla resultante se agitó toda la noche a ta. Después de eliminar el solvente a presión reducida, el residuo se purificó por cromatografía rápida de columna en un gradiente de MeOH (0% a 1 0% MeOH en CH2CI2) para proporcionar 540 mg de un sólido blanco 10 (53% de rendimiento). Una solución enfriada previamente (z1 0°C) de TFA (80%, 26 mi) se añadió a 10 enfriado previamente (~5°C (540 mg, 0.58 mmol) en un baño de hielo. La solución se agitó desde 0°C hasta ta, después se agitó a ta por 4 h (monitoreado por TLC y LC/MS). Después que la reacción se completó, el solvente se eliminó a presión reducida y el residuo se evaporó conjuntamente con el metanol (4 x 15 mi). El residuo se disolvió en metanol (20 mi) y se neutralizó con NaHC03 saturado. Después de la eliminación del solvente, el residuo se purificó por cromatografía rápida de columna (0% a 15% MeOH en CH2CI2) para proporcionar 270 mg de 1 1 como un sólido blanco (77%). LC/MS calculada para C22H30N7O8P 728.2, observado: 729.3 (M+1 ).
Ejemplo 3: Síntesis alternativa del profármaco de monofosfato 2,6-diamino purina 2'-C-Me. (2S)-etil 2-((((2R, 3R, 4R, 5R)-5-(2, 6-diamino-9H-purin-9-il)-3, 5-dihidroxi-4-metiltetrah¡drofuran-2-il)metoxi(fenox¡)fosforilamino)propanoato (8a) A una solución de 12 (30 mg, 0.1 mmol) en THF (1 mi) y DMF (1 mi) a 0°C se añadió (2R)-etil 2-(cloro(fenoxi)fosforilamino)propanoato1 (0.4 mi, 0.4 mmol), después se añadió t-BuMgCI (0.4 mi, 0.4 mmol) en porciones. Después de agitar por varios minutos la reacción se calentó hasta ta y se agitó toda la noche a ta. La mezcla de reacción se neutralizó con cloruro amónico(ac ) saturado, después se purificó por cromatografía rápida de columna ( 10% a 20% MeOH en C H2CI2) para dar 8a (1 mg, 1.8%).
LC/MS calculada para C22H30N7O8P 551.1, observado: 552.1 (M+1).
Referencias: 1. (a) Perrone, P.; Daverio, F.; Valente, R.; Rajyaguru, S.; Martin J.A.,; Lévéque, V.; Pogam, S.L.; Najera, I.; Klumpp, K.; Smith, D.; B. y McGuigan, C. First Example of Phosphoramidate Approach Applied to a 4'-Substituted Purine Nucleoside (4'-Azidoadenosine): Conversión of an Inactive Nucleoside to a Submicromolar Compound versus Hepatitis C Virus. J. Med. Chem. 2007, 50, 5463-5470. (b) Uchiyama, M.; Aso, Y.; Noyori, R.; Hayakawa, Y. O-Selective fosforilation of nucleosides without N-protection. J. Org. Chem. 1993, 58, 373-379.
Ejemplo 4: Síntesis de 17a y 17b; diastereómeros únicos para la síntesis del profármaco de monofosfato Etil 3-(2-hidroxifen¡l)propanoato, 14 A una solución de dihidrocumarina 13 ( 1 3 g, 87.74 mmol) en 500 mi de etanol anhidro se añadió H2S04 conc. Catalítico (0.1 0 mi) a 0°C bajo atmósfera de N 2. El baño de enfriamiento se eliminó y la reacción se agitó por 12 h hasta la temperatura ambiente. La solución se trató con NaHC03 sólido a 0°C hasta pH = 6.0-6.5 y se filtró la suspensión resultante. El filtrado se concentró a presión reducida y se purificó sobre una columna de gel de sílice para dar el compuesto 14 (16.2 g, 83.4 mmol) con 95% de rendimiento como un aceite amarillo. 1H NMR (400 MHz, CDCI3) d 7.35 (s, 1 H), 7.13-7.07 (m, 2H), 6.89-6.84 (m, 2H), 4.14 (q, J = 6.8 Hz, 2H), 2.90 (m, 2H), 2.72 (m , 2H), 1 .23 (t, J = 6.8 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCI3) d 175.89, 154.50, 130.74, 128.15, 127.52, 120.93, 1 1 7.33, 61 .51 , 35.39, 24.84, 14.25; MS-EST m/z 1 95 (M+H+) Etil 3-(2-(((((S)- 1-etoxi- 1-oxopropan-2-il)amino)(4-(metiltio)fenoxi)fosforil)oxi)fenil)propanoato, 16a y 16b: mezcla de Rp y SP (~ 1 : 1) A una solución de 14 (1 5.5 g, 79.7 mmol) en 300 mi de éter de dietilo anhidro se añadió oxicloruro de fósforo (12.2 g, 79.7 mmol) y trietilamina (8.5 g, 83.7 mmol) a -78°C bajo una atmósfera de N?. Después de agitar por 1 h a -78°C bajo una atmósfera de N2, la solución se agitó adicionalmente por 12 h hasta la temperatura ambiente, después los sólidos se eliminaron por filtración bajo una atmósfera de N2. El filtrado se concentró a presión reducida y se secó bajo alto vacío por 6 h a temperatura ambiente. A una solución del aceite pegajoso resultante en 300 mi de C H2CI2 anhidro se añadió 4-metilmercaptofenol (1 1 .1 g, 79.0 mmol) y Et3N (8.0 g, 79.0 mmol) durante 20 min a -78°C bajo una atmósfera de N2. Después, la solución resultante se agitó por 1 h a -78°C y además por 6 h a 0°C bajo una atmósfera de N2. A la solución se añadió una solución de L-alanina etil éster hidrocioruro (12.2 g, 79.0 mmol) en 200 mi de C H2CI2 anhidro y Et3N (16.2 g, 160 mmol) durante 20 min a -78°C bajo una atmósfera de N2. La solución se agitó por 12h a temperatura ambiente y los sólidos se filtraron. El filtrado se concentró a presión reducida y se purificó en una columna de gel de sílice (hexano: EtOAc = 3: 1 a 1 : 1 v/v) para dar el compuesto 16 (33.5 g, 67.7 mmol) en 85% de rendimiento en dos etapas. La relación de la mezcla de Rp y Sp fue 1 : 1 por el espectro 1 H- y 31 P-NMR. 1 H NMR (400 MHz, CDCh) d 7.43 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 7.22-7.1 5 (m, 6H), 7.15-7.07 (m, 1 H), 4.1 7-3.90 (m , 6H), 2.93 (q, J = 8.4 Hz, 2H), 2.58 (m, 2H), 2.45 (s, 3H), 1.39 (t, J = 6.4 Hz, 3H), 1.27-1.21 (m, 6H); 31P (162 Hz, CDCI3) d -2.28, -2.29; MS-ESI+ m/z 496 (M+H+) Etil 3-(2-(((((S)-1-etoxi-1-oxopropan-2-il)amino)(4-metilsulfonil)fenoxi)fosfor¡l)oxi)fenil)propanoato, 17a, 17b; mezcla de Rp y Sp (-1:1) A una solución de 16 (11.7 g, 23.6 mmol) en 200 mi de CH2CI2 anhidro se añadió ácido 3-cloroperoxibenzoico (77% máximo, 12.3 g, 53.2 mmol) a 0°C bajo una atmósfera de N2. Después de agitar por 12h a temperatura ambiente, el solvente se eliminó a presión reducida y el residuo se disolvió en 200 mi de acetato de etilo y se lavó con solución de NaHCOe fría saturada (50 mi x 2), agua fría (100 Im), y salmuera (50 mi). La capa orgánica se secó sobre a2S04, se filtró y se purificó en una columna de gel de sílice (hexano:EtOAc = 3:1 a 1:2 v/v) para dar el compuesto 17 (11.7 g, 22.2 mmol) con 94% de rendimiento como una mezcla de dos diastereómeros (RP:SP ~ 1:1 por espectro 1H- y 31P-NMR. 1H NMR (400 MHz, CDCI3) d 7.92 (m, 2H), 7.48-7.43 (m, 3H), 7.24-7.18 (m, 2H), 7.14-7.10 (m, 1H), 4.53 (m, 1H), 4.19-4.09 (m, 5H), 3.05 (m, 3H), 2.96-2.91 (m, 2H), 2.61-2.56 (m, 2H), 17a: 1.43 (d, J=6.8 Hz, 1.5H), 17b: 1.40 (d, J=6.8 Hz, 1.5H), 1.26-1.21 (m, 6H); 31P (162 MHz, CDCI3) d -2.50, -2.55; MS-EST m/z 528 (M + H*) Etil 3-(2-(((((S)-1-etoxi-1-oxopropan-2-il)amino)(4-(metiltio)fenoxi)fosforil)oxi)fenil)propanoato, 16a y 16b A una solución de los compuestos 17a y 17b (0.11 g, 0.21 mmol) en 8.0 mi de CH2CI2 anhidro se añadió 4-metilmercaptofenol (0.015 g, 0.11 mmol) y Et3N (0.01 g, 0.12 mmol) a 0°C bajo atmósfera de N2. Después de agitar por 48h a temperatura ambiente, la solución se concentró y se purificó sobre gel de sílice (hexano:EtOAc = 3:1 a 1:1 v/v) para dar 16a y 16b con 19% de rendimiento (0.02 g, 0.04 mmol) a la relación de 1:2 por el espectro 1H NMR. 1H NMR (400 MHz, CDCI3) d 7.42 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.23-7.15 (m, 6H), 7.11-7.07 (m, 1H), 4.18-4.09 (m, 5H), 3.91-3.83 (m, 1H), 2.92 (q, J = 8.0 Hz, 2H), 2.58-2.53 (m, 2H), 2.46 (s, 3H), 1.40 (t, J = 6.8 Hz, 3H), 1.26-1.21 (m, 6H); 31P (162 MHz, CDCh) d -2.33 Purificación del isómero Rp- o Sp a partir de la mezcla de Rp/Sp (1:1) de etil 3-(2-(((((S)-1-etoxi-1-oxopropan-2-il)amino) (4- (metilsulfonil)fenoxi)fosforil)oxi)fenil)propanoato, 17a/17b: Método de recristalización La mezcla de dos diastereómeros 17a y 17b (3.30 g) se disolvió en 50 mi de EtOAc y se trató con hexano a temperatura ambiente hasta que la solución comenzó a formar un precipitado blanco, después se mantuvo a 3°C por 12h. El sólido blanco se filtró, después se secó bajo alto vacío a temperatura ambiente por 12h. La relación de 17a y 17b en el sólido blanco fue 2:1 (2.4 g). El sólido blanco se disolvió en co-solvente (EtOAc:éter de dietilo = 1:1 v/v, 100 mi) y después se agitó por 10 min a temperatura ambiente. La solución se trató a temperatura ambiente con hexano hasta que resultó en una lechada clara, después se almacenó a 3°C por 24h. El sólido blanco se filtró y se secó bajo alto vacío a temperatura ambiente por 24h mientras el filtrado se usaba más abajo para obtener 17b. El producto 17a (0.90 g, 27%) se obtuvo con 95% de pureza basado en el análisis de los datos de 1H y 31P NMR: 1H NMR (400 MHz, CDCI3) d 7.92 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.42 (d, J = 8.8 Hz, 3H), 7.24-7.19 (m, 2H), 7.14-7.12 (m, 1H), 7.14-7.10 (m, 1H), 4.19-4.11 (m, 5H), 4.02 (m, 1H), 3.05 (s, 3H), 2.94 (m, 2H), 2.58 (dd, J = 7.2, 9.6 Hz, 2H), 1.43 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 1.24 (t, J = 6.8 Hz, 6H); 31P (162 MHz, CDCI3) d -2.68; MS-EST m/z 528 (M + H+). Un solo cristal de 17a se obtuvo por cristalización y se obtuvo una estructura de rayos X de 17a que confirmó inequívocamente la configuración del centro de fósforo como Sp (Figura 3).
El filtrado se concentró y se secó bajo alto vacío a temperatura ambiente por 12h. El aceite viscoso se disolvió en 5 mi de CH2CI2 y se trató con éter de diisopropiio (50 mi) y se agitó a temperatura ambiente por 10 min. La solución resultante se trató con hexano hasta que resultó una ligera turbidez y después se almacenó a 3|C por 24h. El sólido blanco se filtró y se secó a alto vacío a temperatura ambiente por 48 h. El producto 17b (0.50 g, 15%) se obtuvo con 90% de pureza basado en el análisis de los datos 1H y 31P NMR. 1H NMR (400 MHz, CDCI3) d 7.92 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.45 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.42 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.24-7.19 (m, 2H), 7.14-7.10 (m, 1H), 4.20-4.04 (m, 6H)¡ 3.05 (m, 3H), 2.93 (m, 2H), 2.58 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.40 (d, J = 7.2 Hz, 3H), 1.26-1.21 (q, J = 7.2 Hz, 6H); 31P (162 MHz, CDCI3) d -2.60; MS-EST m/z 528 (M+H+).
Etil 3-(2-(((((S)-1-etoxi-1-oxopropan-2-il)amino)(4-(metiltio)fenoxi)fosforil)oxi)fenil)propanoato, 16b A una solución del compuesto 17a (0.053 g, 0.10 mmol) en 2.0 mi de CH2CI2 anhidro se añadió 4-metilmercaptofenol (0.042 g, 0.30 mmol) y DIEA (0.052 g, 0.04 mmol) a 0°C bajo atmósfera de N2. Después de agitarse por 48 h a temperatura ambiente, la solución se concentró y se purificó en gel de sílice (hexano:EtOAc = 3:1 a 1:1 v/v) para dar 16b (0.047 g, 0.095 mmol) con 95% de rendimiento. 1H N R (400 MHz, CDCI3) d 7.42 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.23-7.15 (m, 6H), 7.11-7.07 (m, 1H), 4.18-4.09 (m, 5H), 3.91-3.83 (m, 1H), 2.92 (q, J = 8.0 Hz, 2H), 2.58-2.53 (m, 2H), 2.46 (s, 3H), 1.40 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 1.26-1.21 (m, 6H); 31P (162 MHz, CDCb) d -2.31 Etil 3-(2-(((((S)-1-etoxi-1-oxopropan-2-il)amino) (4-(metiltio)fenoxi)fosforil)oxi)fenil)propanoato, 16a A una solución del compuesto 17b (0.053 g, 0.10 mmol) en 2.0 mi de CH2CI2 anhidro se añadió 4-metilmercaptofenol (0.042 g, 0.30 mmol) y DIEA (0.052 g, 0.04 mmol) a 0°C bajo atmosfera de N2. Después de agitar por 72 h a temperatura ambiente, la solución se concentró y se purificó en gel de sílice (hexano.EtOAc = 3:1 a 1:1 v/v) para dar 16a (0.045 g, 0.091 mmol) con 91% de rendimiento. 1H NMR (400 MHz, CDCh) d 7.42 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.23-7.15 (m, 6H), 7.11-7.07 (m, 1H), 4.18-4.09 (m, 5H), 3.91-3.83 (m, 1H), 2.92 (q, J = (.0 Hz, 2H), 2.58-2.53 (m, 2H), 2.46 (s, 3H), 1.38 (d, J = 7.2 Hz, 3H), 1.26-1.21 (m, 6H); 31P (162 MHz, CDCI3) d -2.33 Ejemplo 5 Síntesis del diastereómero único 8b-arriba a partir de 17a Sb-arriba Eí/7 3-(2-(((((2R, 3R,4R, 5R)-5-(2-amino-6-(((benciloxi)carbonil)amino)-9H-purin-9-il)-3-((ter-butildimetilsilil)oxi)-4-hidroxi-4-metiltetrahidrofuran-2-il)metoxi((1-etoxi- 1-oxopropan-2-il)amino)fosforil)oxi)fenil)propanoato, 7 A una solución de 18 (0.036 g, 0.07 mmol) en 2 mi de THF anhidro se añadió cloruro de t-butilmagnesio (1 .0 M en THF, 0.1 8 mi, 2.5 equiv.) a 78°C bajo una atmósfera de N2. Después de agitar por 1 h a temperatura ambiente, una solución de 17a (0.07 g, 0.14 mmol, 2.0 equiv.) a -78°C se añadió a la mezcla de reacción bajo una atmosfera de 2. La mezcla de reacción se agitó por 48 h a temperatura ambiente y se trató con N H4CI saturado (0.5 mi) a 0°C, y después se vertió en agua fría (10 mi) y se extrajo con EtOAc (10 mi x 3). La capa orgánica recogida se lavó con salmuera (1 0 mi) , se secó sobre a2S04, se filtró y se purificó sobre una columna de gel de sílice (CH2CI2: MeOH = 50: 1 a 20: 1 v/v) para dar el compuesto 19 (0.025 g, 0.028 mmol) con 40% de rendimiento. 1 H NMR (400 MHz, CDC ) d 8.16 (s, 1 H), 7.83 (s, 1 H), 7.44-7.33 (m , 6H), 7.21 -7.05 (m, 3H), 5.99 (s, 1 H), 5.27 (s, 2H), 5.22 (s, 2H), 4.66-4.61 (m, 1 H), 4.42 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 4.39-4.34 (m, 1 H), 4.16-3.97 (m, 7H), 3.85 (m, 1 H), 3.19 (s, 1 H), 3.01 (m, 2H), 2.66 (m, 2H), 1 .86 (m, 1 H), 1 .26 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 1 .22-1 .14 (dt, J = 14.4, 7.2 Hz, 6H), 0.94 (s, 3H), 0.93 (s, 9H), 0.19 (s, 3H), 0.13 (s, 3H), 31 P (162 MHz, CDCU) d 3.40; MS-ESI+ m/z 900 (M+H+) Etil 3-(2-(((((2R, 3R, 4R, 5R)-5-(2, 6-diamino-9H-purin-9-il)-3, 4-dihidroxi-4-metiltetrahidrofuran-2-il)metoxi)((1-etoxi-1-oxopropan-2-il)amino)fosforil)oxi)fenil)propanoato, 8b-arriba A una solución de 19 (0.01 g, 0.01 1 mmol) en 2.0 mi de CH3CN anhidro se añadió cloruro de hidrógeno (2.0 M en éter de dietilo, 1 .0 mi) a 0°C. Después de agitar por 48 h a temperatura ambiente, el solvente y el cloruro de hidrógeno se eliminaron a presión reducida. El residuo se lavó con éter de dietilo (5 mi x 5) y se secó a alto vacío por 12 h a temperatura ambiente. El sólido se disolvió en 2.0 mi de EtOH y se agitó por 30 min a temperatura ambiente. A la solución se añadió Pd/C (5.0 mg, 10% Pd sobre carbono) y la solución resultante se agitó por 12h bajo una atmósfera de hidrógeno ( 1 atm) a temperatura ambiente. La solución se trató con celita (0.05 g) y se filtró. El filtrado se concentró a presión reducida y se purificó en columna de gel de sílice (CH2CI2: MeOH = 10: 1 v/v) para dar el compuesto 8b-arriba (0.007 g, 0.001 mmol) con 91 % de rendimiento. 1H NMR (400 MHz, CD3OD) d 7.82 (s, 1H), 7.33 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.22 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.13 (td, J = 7.6, 2.0 Hz, 1H), 7.06 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 5.90 (s, 1H), 4.60-4.53 (m, 1H), 4.48-4.20 (m, 1H), 4.10-4.04 (m, 2H), 4.02 (q, J = 7.6 Hz, 2H), 3.96-3.86 (m, 1H), 2.96 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 2.59 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 1.30 (dd, J = 1.2, 7.2 Hz, 3H), 1.16 (t, J = 7.8 Hz, 3H), 1.13 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 0.93 (s, 3H); 31P (162 MHz, CD3OD) d 5.01; MS-EST m/z 652 ( +H+).
Ejemplo 6: Síntesis de profármacos de fosforamidato (Sp) - 8b-abajo y (Rp) - 8b-arriba a partir de (Rp) -24 y (Sp) -25 respectivamente. 8b-abajo 8b-arriba Etil-3-(2-hidroxifenil)prop¡onato, 21 Dihidrocumarina, 20 (10.4 g, 70.0 mmol) se añadió a 60 mi de etanol seco. H2SO4 (0.1 mi) se añadió y la solución resultante se calentó toda la noche a reflujo. El etanol se eliminó a presión reducida, el residuo se disolvió en éter de dietilo y la fase orgánica se extrajo con solución de bicarbonato sódico. La fase orgánica se secó con sulfato sódico, el solvente se evaporó y el residuo se sometió a cromatografía sobre gel de sílice (MeOH/CH2CI2, gradiente MeOH 0 a 10%). El producto, 21 , se aisló como agujas incoloras (80% de rendimiento). 1H NMR (400 MHz, C DCI3) d 7.40 (s, 1 H), 7.05-7.1 5 (m, 2H), 6.84-6.90 (m, 2H), 4.14 (q, J=6.8 Hz, 2H), 2.90 (m, 2H), 2.72 (m, 2H), 1 .23 (t, J=6.8 Hz, 3H); LC-MS, m/z 195 (M+1 )+.
Etil 3-(2-((cloro(((R)-1-etoxi- 1-oxopropan-2-il)amino)fosforil)oxi)fenil)propanoato, 23 Una solución de 21 (5.0 g, 25.7 mmol) y trietilamina (3.6 mi, 25.7 mmol) en 80 mi de éter de dietilo anhidro se añadió por goteo a una solución de oxicloruro de fósforo (2.4 mi, 25.7 mmol) a -78°C en 70 mi de éter de dietilo anhidro bajo una atmósfera de Ar durante 2 h. Después de agitar por 1 h a -78°C bajo una atmósfera de Ar, la solución se agitó adicionalmente por 15 h hasta la temperatura ambiente, después los sólidos se eliminaron por filtración bajo una atmósfera de N 2. Los sólidos se lavaron con éter de dietilo anhidro y el filtrado combinado se concentró a presión reducida, después se secó bajo alto vacío toda la noche a temperatura ambiente para proporcionar 22 como un aceite incoloro que se usó sin purificación adicional.
A una mezcla de 22 y L-alanina etil éster hidrocloruro pre-secado (3.94 g, 25.7 mmol) en 20 mi de CH2CI2 anhidro a -78°C bajo una atmósfera de AR se añadió una solución de Et3 (7 mi, 51.4 mmol) en 20 mi de CH2CI2 anhidro durante 2h. La solución se agitó por 16 h a temperatura ambiente y los sólidos se filtraron. El filtrado se concentró a presión reducida y se purificó sobre una columna de gel de sílice (EtOAc/hexano, gradiente EtOAc 0 a 50%, v/v) para dar 9.52 g del compuesto 23 como un aceite casi incoloro con75% de rendimiento para dos etapas. El compuesto 23 podría ser almacenado por largos periodos de tiempo sin degradación apreciable mediante la preparación de solución 1M en THF y el almacenamiento sobre tamices de 4 A a -70°C. 1H NMR (400 MHz, CDC ) d 7.14-7.49 (m, 4H), 4.70-4.80 (m, 1H), 4.09-4.27 (m, 5H); 2.92-3.08 (m, 2H), 2.61-2.65 (m, 2H), 1.50-1.55 (m, 3H), 1.21-1.32 (m, 6H). 31P NMR (162 MHz, CDCI3) d 8.88, 8.72.
Etil 3-(2-(((R)-(((S)-1-etoxi-1-oxopropan-2-il)amino)(4-nitrofenox¡)fosforil)oxi)fenil)-propanoato 24 (Rp) y etil 3-(2-(((S)-(((S)-1-etoxi-1-oxopropan-2-il)amino)(4-nitrofenoxi)-fosforil)o i)fenil)propanoato 25 (Sp) Una solución de EÍ3 en éter de dietilo anhidro (100 mi) se añadió por goteo a una solución de 23 (10.0 g, 25.6 mmol) y p-nitro fenol (3.75 g, 27.0 mmol) en éter de dietilo (200 mi) a 0°C durante 30 min. La mezcla de reacción se agitó a 0°C por 1 h, después hasta la temperatura ambiente por 15 h. Los sólidos se filtraron y el filtrado se concentró a presión reducida. El residuo se purificó sobre una columna de gel de sílice (EtOAc/CH2CI2, gradiente EtOAc 0 a 10%, v/v) para dar 10.8 g de una mezcla de 24 y 25 con 85% de rendimiento en una relación ~1:1. La mezcla se recristalizó en 2% CH3CN en éter de diisopropilo con 24 cristalino como cristales de semilla que se obtuvieron por cromatografía de columna en gel de sílice. El diastereómero 24 se recogió por filtración (2.2 g, > 20:1 24:25). 1H NMR (400 Hz, CDCI3) d 8.22-8.24 (dd, J = 10 Hz, J=2.0 Hz, 2H), 7.11-7.44 (m, 6H), 4.06-4.20 (m, 6H); 2.88-3.00 (M, 2H), 2.54-2.59 (m, 2H), 1.40 (d, J=6.8 Hz, 3H), 1.25 (t, J=7.2 Hz, 3H), 1.23 (t, J=7.2 Hz, 3H). 31P NMR (162 MHz, CDCI3) d -2.01. LC-MS, m/z 495 (M+1)+. Un solo cristal de 24 se obtuvo por cristalización en 2% CH3CN en éter de diisopropilo y se obtuvo una estructura de rayos X de 24 que confirmó inequívocamente la configuración del centro de fósforo como Rp (Figura 1).
El filtrado se concentró a presión reducida hasta una presión de residuo y después se secó bajo alto vacío toda la noche a temperatura ambiente. El resido se disolvió en éter de diisopropilo (200 mi) con calentamiento suave y se añadieron los cristales de semilla de 25. Después de fraguar a temperatura ambiente por 3 días 25 (510 mg, -20:1 24:25) se recogió por filtración. 1H NMR (400 MHz, CDC ) d 8.22-8.24 (dd, J = 10 Hz, 2H), 7.11-7.43 (m, 6H), 4.00-4.18 (m, 6H), 2.93-2.98 (m, 2H), 2.55-2.60 (m, 2H), 1.43 (d, J=7.2 Hz, 3H), 1.24 (t, J=7.2 Hz, 3H), 1.24 (t, J=7.2 Hz, 3H). 31P NMR (162 MHz, CDCI3) d -2.07. LC-MS, m/z 495 (M+1)+. Un solo cristal de 25 se obtuvo por cristalización y se obtuvo una estructura de rayos X de 25 que confirmó inequívocamente la configuración del centro de fósforo como Sp (Figura 2) Etil 3-(2-(((R)-(((2R, 3R, 4R, 5R)-5-(2, 6-diamino-9H-purin-9-il)-3, 4-dihidroxi-4-metiltetrahidrofuran-2-il)metoxi(((S)-1-etoxi-1-oxopropan-2-il)amino)fosforil)oxi)fenil)Propanoato, 8b-arriba (Rp) A una solución de 5 (100 mg, 0.14 mmol) en THF (0.5 mi) se añadió 0.5 mi de solución de t-BuMgCI (1M, 0.5 mmol) a -78°C bajo atmósfera de AR. La mezcla de reacción se agitó por 30 min a esta temperatura y después se calentó a temperatura ambiente. Una solución de 13 (210 mg, 0.42 mmol) en 1 mi de THF anhidro se añadió. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente por 3 días bajo atmósfera de Ar para el completamiento. El solvente se evaporó a presión reducida, y el residuo se añadió a una solución de 80% TFA pre-enfriada (10 I) a 0°C. La mezcla de reacción se agitó además por 4 h hacia temperatura ambiente para el completamiento. Después de evaporar los solventes a presión reducida, al residuo se añadió una pequeña cantidad de NaHC03 saturado hasta pH 7.0. La mezcla se concentró a presión reducida y después se purificó sobre columna de gel de sílice (MeOH/DCM, gradiente MeOH 0 a 10% v/v) para proporcionar 37.5 mg 8b-arriba (Rp) en 41% en dos etapas. Rotación óptica [a]2 D -7.08 (0.24, MeOH); 1H NMR (400 MHz, CD3OD) d 0.97 (s, 3H, CH3), 1.15-1.20 (m, 6HM; 2 x CH3), 1.34 (d, 3H, J=7.2 Hz, CH3), 2.62 (t, 2H, J=8.0 Hz, 2H, CH2), 2.99 (t, 2H, J=8.0 Hz, 2H, CH2), 3.95-4.58 (m, 9H); 5.94 (s, 1H; Hi"), 7.07-7.38 (m, 4H, Ar-H), 7.86 (s, 1H, H8); 13C NMR (100 MHz, CDsOD) d 14.5, 14.6, 20.4, 20.6, 26.8, 35.4, 51,7, 61.7, 62.5, 67.0, 74.4, 80.1, 81.9, 92.8, 114.4, 121.0, 126.2, 128.8, 131.8, 133.2, 137.5, 150.6, 152.7, 147.7, 162.0, 174.8, 175.1; 31P NMR (162 MHz, CD3OD): 5.03; LC/MS calculada para C27H38N7O10P 651.2, observado: 552.2 (M+1).
Etil 3-(2-(((S)-(((2R, 3R, 4R, 5R)-5-(2, 6-diamino-9H-purin-9-il)-3, 4-dihidroxi-4-metiltetrahidrofuran-2-il)metoxi(((S)-1-etoxi-1-oxopropan-2-il)amino)fosforil)oxi)fenil)propanoato, 8b-abajo (Sp) Se empleó un procedimiento similar para la preparación de 8b-abajo con 39% de rendimiento. Rotación óptica [a]24D +12.12 (0.13, MeOH); 1H NMR (400 MHz, CD3OD) d 0.97 (s, 3H, CH3), 1.15-1.17 (m, 6H, 2 x CH3), 1.34 (d, 3H, J=7.2 Hz, CH3), 2.62 (t, 2H, J=8.0 Hz, 2H, CH2), 2.99 (t, 2H, J=8.0 Hz, 2H, CH2), 3.96-4.51 (m, 9H), 5.93 (s, 1H, Hi\ 7.10-7.39 (m, 4H, Ar-H), 7.86 (s, 1H, H8); 13C NMR (100 MHz, CD3OD) d 14.5, 14.6, 20.4, 20.8, 26.8, 35.4, 51.6, 61.6, 62.4, 67.7, 74.7, 80.0, 82.1, 93.0, 114.4, 121.1, 126.2, 128.8, 131.7, 133.1, 137.7, 150.5, 152.6, 157.6, 1616.9, 174.7, 174.8; 31P NMR (162 MHz, CD3OD): 4.98; LC/MS calculada para C27H38 7O10P 651.2, observado: 652.3 (M+1).
Ejemplo 7: Síntesis del profármaco de diastereómero único de etil pantenoato 30 1.4-nitrofenol Et3N, THF 0_C.1h POCI3 2.27 Et3N, THF 80r£, 2h 28 29 60% (relación Eluyente rápido Eluyente lento 55:45) "isómero arriba" "isómero aba 10" Obtenido en 37% en dos etapas a partir de 29 (R) -etil 3-(2,4-dihidroxi-3,3 dimetilbutanamido)propanoato, 27 A una suspensión agitada de pantenoato cálcico 26 (10 g, 42 mmol) en etanol (200 mi) se añadió una cantidad catalítica de ácido sulfúrico y la mezcla se calentó hasta reflujo toda la noche. La mezcla se filtró y se neutralizó con adición de una solución de NaHC03 saturada (50 mi). El etanol se eliminó por evaporación a presión reducida y se extrajo la fase acuosa EtOAc (30 mi x 5). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2S04, se filtraron y se evaporaron para dar 27 (7.1 g, 28.7 mmol) como un aceite ligeramente amarillo. 1H NMR (400 MHz, CDCU) d ppm 0.87 (s, 3H), 0.95 (s, 3H), 1.24 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 2.53 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 3.60-3.43 (m, 4H), 3.91 (s, 1H), 3.98 (s, 1H), 4.12 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 4.47 (s, 1H), 7.33 (t, J = 5.7 Hz, 1H). LC/MS calculada para C11H22NO5248.1, observado: 248.1 (M+1).
Etil 3-((4R)-5,5-dimetil-2-(4-nitrofenoxi)-2-oxido-1 ,3,2-dioxafosfinano-4-carboxamido)propanoato, 28 y 29 A la solución agitada de POCI3 (1 mmol, 83 µ?) en TFH (5 mi) a 0°C se añadió una solución de 4-nitrofenol (1 mmol, 139 mg) y Et3 (1 mmol, 139 µ?) en THF (1 mi). Después de agitar 1 h a temperatura ambiente, la mezcla se añadió a una solución de B (0.81 mmol, 200 mg) y Et3N (2 mmol, 83 µ?) en THF (10 mi). La mezcla resultante se calentó a 80°C por 2 h. La solución se hidrolizó por una solución acuosa al 10% de NaHC03 y se extrajo tres veces por EtOAc. Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera y se secaron sobre Na2SC>4. Después de la eliminación del solvente, el residuo se purificó por cromatografía de columna en gel de sílice (50% EtOAc en hexanos para el diastereómero de elución rápida, y después 65% EtOAc en hexanos para el diastereómero de elución lenta) para dar el diastereómero de elución rápida 28 (0.23 mmol, 100 mg) y el diastereómero de elución lenta 29 (0.27 mmol, 115 mg) con un rendimiento total de 60%. 28, diastereómero de elución rápida. 1H-NMR (400 MHz, CD3OD) d ppm 1.08 (s, 3H), 1.13 (s, 3H), 1.18 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 2.52 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 3.39-3.53 (m, 2H), 4.00-4.10 (m, 3H), 4.42 (d, J = 11.4 Hz, 1H), 4.88 (s, 1H), 7.47 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 8.24-8.28 (m, 2H); 31P NMR (CD3OD): -14.02; LC/MS calculada para C17H24N2O9P 431.1, observado: 431.1 (M+1). Rotación óptica [Q]24D +51.02 (c 0.184, MeOH). 29, diastereómero de elución lenta. 1H-N R (400 MHz, CD3OD) d ppm 0.89 (s, 3H), 1.18-1.23 (m, 6H), 2.49 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.45 (dt, J = 6.7, 2.4 Hz, 2H), 4.10 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 4.22 (t, J = 11.8 Hz, 1H), 4.57 (dd, J = 12.7, 11.1 Hz, 1H), 4.73 (d, J = 10.3 Hz, 1H), 7.50 dd, J = 9.14, 0.93 Hz, 2H), 8.26-8.32 (m, 2H); 31P NMR (CD3OD): -13.31; LC/MS calculada para C17H24N2O9P 430.1, observado: 431.1 (M+1). Rotación óptica [a]24D +46.94 (c 0.196, MeOH).
Etil 3-((4R)-2-(((2R, 3R.4R, 5R)-5-(2, 6-diamino-9H-purin-9-il)-3, 4-dihidroxi-4-metiltetrahidrofuran-2-il=)metoxi)-5,5-dimetil-2-oxido-1,3,2-dioxafosfinano-4-carboxamido)propanoato, 30 A una solución agitada de 5 (0.083 mmol, 52.8 mg) a 0°C se añadió por goteo una solución de 1 M de t-BuMgCI (0.25 mmol, 0.25 mi). Después de 30 min de agitación a 0°C se añadió por goteo una solución de 0.2M de 28 (0.41 mmol, 2.08 mi) en THF a temperatura ambiente. La solución se agitó 5 días a temperatura ambiente y después se evaporó hasta secarse. El residuo se purificó por cromatografía de columna en gel de sílice para eliminar la cantidad no reaccionada 28 (60% EtOAc en hexanos, y después 15% MeOH en CH2CI2). La fracción purificada se evaporó, se secó a alto vacío y se diluyó en CH2CI2 (5 mi). Se añadió ácido metanosulfónico (0.23 mmol, 14.1 µ?) y la solución se calentó hasta reflujo por 5h. La solución se neutralizó mediante la adición de EtsN (0.23 mmol, 30 pl) y se evaporaron hasta secarse. El residuo se purificó por cromatografía de columna en gel de sílice (hasta 10% MeOH en CH2CI2) para dar 30 (0.03 mmol, 18.0 mg). 1H NMR (400 MHz, CD3OD) d ppm 1.00 (s, 3H), 1.11 (s, 3H), 1.15 (s, 3H), 1.22 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 2.53 (dt, J = 6.7, 2.4 Hz, 2H), 3.53-3.36 (m, 2H), 4.09 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 4.33-4.13 (m, 4H), 4.55 (ddd, J = 11.7, 7.2, 2.0 Hz, 1H), 4.68 (ddd, J = 11.6, 6.6, 2.0 Hz, 1H), 4.75 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 5.98 (s, 1H), 7.90 (s, 1H); 31P NMR (CD3OD): -4.87; LC/MS calculada para C22H35N7O10P 588.2; observado: 588.1 (M + 1).
Ejemplo 8: Síntesis de profármaco 2'-F-2'-C-Me 2,6-diamino purina monofosfato 36. 3T (2R,3R,4R,5R)-5-(2, 6-diamino-9H-purin-9-il)-4-fluoro-2-(hidroximetil)-4-metiltetrahidrofuran-3-ol, 31 H NMR (CD3OD): 1.18 (d, J = 22.3 Hz, 3H), 3.87 (dd, J = 13.0, 3.3 Hz, 1H), 4.02-4.06 (m, 2H), 4.40 (dd, J = 24.4, 9.2 Hz, 1H), 6.12 (d, J = 18.0 Hz, 1H), 8.13 (s, 1H); 13C NMR (CD3OD): 15.6, 15.8, 59.6, 71.2, 71.4, 82.3, 89.0, 89.4, 100.2, 102.0, 113.1, 136.5, 151.1, 156.5, 160.8. LC/MS calculada para CiiHi5FN603298.1, observado: 299.2 ( + 1). (2R, 3R, 4R, 5R)-2-(((ter-butildimetilsilil)oxi)metil)-5-(2, 6-diamino-9H-purin-9-il)-4-fluoro-4-metiltetrahidrofuran-3-ol, 32 A una solución agitada de (2R,3R,4R,5R)-5-(2,6-diamino-9H-purin-9-il)-4-fluoro-2-(hidroximetil)-4-metiltetrahidrofuran-3-ol, 31 (230 mg, 0.77 mmol) en piridina se añadió TBDMSCI (254 mg, 1.69 mmol). La solución se agitó toda la noche y se añadió metanol (2 mi). Después de agitar por 20 min la solución se evaporó hasta secarse y se coevaporó dos veces con tolueno. El residuo se purificó por cromatografía de columna en gel de sílice (0% a 3% MeOH en CH2CI2) para proporcionar el compuesto 32 (275 mg, 0.67 mmol, 87%). 1H NMR (CD3OD): 0.17 (s, 6H), 0.98 (s, 9H); 1.19 (d, J = 22.2 Hz, 3H), 3.97 (dd, J = 12.0, 2.5 Hz, 1H), 4.06 (dd, J = 9.4, 1.3 Hz, 1H), 4.16 (dd, J = 12.0, 1.7 Hz, 1H), 4.27 (dd, J = 24.6, 9.4 Hz, 1H), 6.11 (d, J = 16.7 Hz, 1H), 8.24 (s, 1H); 13C NMR (CD3OD): -5.276, -5.209, 16.7, 17.0, 19.5, 26.6, 62.3, 71.9, 72.1, 83.4, 89.4, 89.8, 101.4, 103.2, 113.9, 137.7, 152.7, 156.5, 160.6. LC/MS calculada para C17H29F 6O3S1412.2, observado: 413.3 (M+1).
Bencil (2-am¡no-9-((2R,3R,4R,5R)-4-(((benciloxi)carbon¡l)oxi-5-(((ter-butildimetilsilil)oxi)metil)-3-fluoro-3-metiltetrahidrofuran-2-il)-9H-purin-6- il)carbamato, 33 A una solución agitada del compuesto 32 (225 mg, 0.55 mmol) en CH2CI2 (5 mi) a 0°C se añadió sucesivamente DMAP (266 mg, 2.2 mmol) y CBzCI (0.31 mi, 2.18 mmol). Después de agitar a temperatura ambiente por 6 h, la solución se enfrió hasta 0°C y DMAP (266 mg, 2.2 mmol) y CBzCI (0.31 mi, 2.18 mmol) se añadieron una vez más. Después de agitar toda la noche a temperatura ambiente, la reacción se apagó con agua y se añadió CH2CI2. Las capas orgánica y acuosa se separaron, y la capa orgánica se lavó dos veces más con agua. Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2S04, se filtraron y se evaporaron. El residuo se purificó por cromatografía de columna en gel de sílice (10% a 45% EtOAc en hexanos) para proporcionar el compuesto 33 (300 mg, 0.44 mol, 81%). 1H-NMR (CD3OD): 0.06 (d, J = 4.1 Hz, 6H); 0.91 (s, 9H), 1.17 (d, J = 22.4 Hz, 3H), 3.80 (dd, J = 12.1, 2.6 Hz, 1H), 4.05 (dd, J = 12.1, 2.1 Hz, 1H), 4.27 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 5.14-5.24 (m, 5H), 5.53 (dd, J = 22.6, 9.1 Hz, 1H), 6.16 (d, J = 16.7 Hz, 1H); 7.26-7.43 (m, 10H); 8.30 (s, 1H). 13C NMR (CD3OD): -54. 17.4, 17.6, 19.4, 26.5, 62.2, 68.3, 71.6, 75.5, 75.7, 81.2, 89.6, 90.9, 100.4, 102.2, 116.4, 129.2, 129.3, 129.5, 129.6, 129.7, 129.8, 136.5, 137.4, 138.9, 151.5, 153.3, 154.1, 155.9, 162.0; LC/MS calculada para C33H4iFN607Si 680.3, observado: 681.3 (M + 1).
Bencil (2-amino-9-((2R,3R,4R,5R)-4-(((benciloxi)carbonil)oxi)-3-fluoro-5-(hidroximetil)-3-metil tetrahidrofuran-2-il)-9H-purin-6-il)carbamato, 34 A una solución agitada del compuesto 33 (245 mg, 0.36 mmol) en THF (5 mi) a 0°C se añadió Et3N 3HF (0.234 mi, 1 .44 mmol). Después de agitar 24 h a temperatura ambiente, la solución se neutralizó con una solución saturada de NaHC03 y después se añadió EtOAc. Las capas orgánica y acuosa se separaron, y la capa orgánica se lavó una vez más con una solución saturada de NaHC03 y finalmente con agua. Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2S04, se filtraron y se evaporaron. El residuo se purificó por cromatografía de columna en gel de sílice (1 % y después 2% MeOH en C H2CI2) para dar el compuesto 34 (198 mg, 0.35 mmol, 97%). 1 H NMR (CD3OD): 1 .1 7 (d, J = 22.6, 3H), 3.78 (dd, J = 1 2.7, 3.2 Hz, 1 H), 3.97 (dd, J = 12.7, 2.4 Hz, 1 H), 4.24 (d, J = 9.0 Hz, 1 H), 5.23 (s, 2H), 5.19 (s, 2H), 5.62 (dd, J = 21 .2, 9.0 Hz, 1 H), 6.61 (d, J = 18.0 Hz, 1 H), 7.26-7.43 (m, 10H), 8.25 (s, 1 H); 13C NMR (CD3OD): 17.6, 17.8, 60.8, 68.3, 71 .5, 76.2, 76.4, 81 .6, 90.2, 90.6, 100.3, 102.2, 103.0, 1 16.6, 129.3, 129.4 (2C), 129.6, 129.7 (2C), 136.6, 137.4, 139.8, 151 .5, 153.4, 154.1 , 155.9, 161 .8; LC/MS calculada para C27H27F 6O7 566.2, observado: 567.2 (M + 1 ).
Etil 3-(2-(((S)-(((2R, 3R, 4R, 5R)-5-(2-amino-6- (((benciloxi)carbonil)amino)-9H-purin-9-il)-3-(((benciloxi)carbonil)oxi)-4-fluoro-4-metiltetrahidrofuran-2-il)metoxi)(((S)-1-etoxi-1-oxopropan-2-il)amino)fosforil)oxi)fenil)propanoato, 35 (2R)-etil 2-(cloro(fenoxi)fosforilamino)propanoato (0.5 M; 0.58 mi, 0.29 mmol) se añadió por goteo a una solución de 34 (32.8 mg, 0.057 mmol) y N-metilimidazol (23 µ?, 0.29 mmol) en THF (0.1 mi) a 0°C. La mezcla resultante se agitó toda la noche a ta. Después de eliminar el solvente a presión reducida, el residuo se purificó por cromatografía rápida de columna en un gradiente de MeOH (gradiente 0% a 10% MeOH en CH2CI2) para proporcionar 42 mg de un sólido blanco 35 (80% de rendimiento). 1H NMR (400 MHz, CD3OD) d 1.10 - 1.32 (m, 12H); 2.54 -2.64 (m, 2H), 2.89 - 2.97 (m, 2H), 3.89 - 4.11 (m, 6H), 4.40 - 4.61 (m, 2H), 5.16 - 5.28 (m, 4H), 5.86 - 5.99 (m, 1H), 6.14 - 6.21 (m, 1H), 6.90 - 7.45 (m, 14H), 7.97 (s, 1H); 31P NMR (162 MHz, CD3OD): 4.74, 4.77; LC/MS calculada para C43H50FN7O13P 922.3, observado: 922.2 (M+1)+.
Etil 3-(2-(((S)-(((2R, 3R, 4R, 5R)-5-(2, 6-diamino-9H-purin-9-il)-4-fluoro-3-h¡droxi-4-metiltetra-hidrofuran-2-il)metoxi)(((S)-1 -etox¡-1-oxopropan-2-il)amino)fosforil)oxi)fenH)propanoato, 36 Una mezcla de 35 (42 mg) y 10 mg de 10% Pd/C en 5 mi de etanol se cargó con atmósfera de hidrógeno a temperatura ambiente y se agitó toda la noche. La suspensión resultante se desgasificó con una corriente de nitrógeno, se filtró, el filtrado se concentró y el resido se purificó por columna de gel de sílice (gradiente 0 a 10% MeOH en DCM) para proporcionar 23 mg de profármaco 36 con 77% de rendimiento. 1NMR (400 MHz, CD3OD) d 1.14 - 1.34 (m, 12H), 2.59 - 2.64 (m, 2H), 2.96 - 3.00 (m, 2H), 3.93 - 4.19 (m, 6H), 4.47 - 4.62 (m, 3H), 6.08 -6.15 (m, 1H), 7.07 - 7.37 (m, 4H), 7.85 (s, 1H), 31P NMR (162 MHz, CD3OD): 4.88, 4.95; LC/MS calculada para C27H38FN7O9P 653.2, observado: 653.3 (M + 1)+.
Ejemplo 9 Isopropil 3-(2-(((((3R, 4R, 5R)-5-(2-amino-6-cloro-9H-purin-9-il)-3, 4-dihidroxi-4-metiltetrahidro-furan-2-il)metoxi(((S)-1-isopropoxi-1-oxopropan-2-il)amino)fosfori¡)ox¡)fenil)propanoato 3a A una solución agitada de 37 (630 mg, 1.91 mmol) y 38 (2.4 g, 5.71 mol) en THF anhidro (10 mi) y MeCN (1 mi) se añadió NMI (445 µ?, 5.71 mmol) a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se agitó a ta por 2.5 h. Los solventes se eliminaron a presión reducida y el residuo se purificó por cromatografía de columna en gel de sílice (0% a 8% MeOH en diclorometano). 1.2 g del compuesto 39 se obtuvo (82% de rendimiento). LC/M calculada para C29H40CI 6O10P 698.2, observado: 699.2 (M+1)+.
Isopropil 3-(2-(((((2R, 3R, 4R, 5R)-5-(2, 6-diamino-9H-purin-9-il)-3, 4-dihidrox¡-4-metiltetrahidro-furan-2-il)metoxi)(((S)-1-isopropoxi-1-oxopropan-2-il)amino)fosforil)oxi)fenil)propanoato 41 Una solución de 39 (1.2 g, 1.57 mmol); NaN3 (155 mg, 2.36 mmol), 'BU4 I (295 mg, 0.78 mol) en DMF (2 mi) se agitó a 90°C por 5 h. La mezcla de reacción se enfrió hasta temperatura ambiente, n-BuBr (0.22 mi, 2 mmol) se añadió y se agitó a ta por 1 h para convertir el exceso de NaN3 en BuN3. Después de la eliminación del solvente a presión reducida, el residuo se dividió entre EtOAc (100 mi) y agua (30 mi). La fase acuosa separada se extrajo con EtOAc (3 x 30 mi) y la capa orgánica combinada se secó sobre Na2S0 . Después de la eliminación del solvente, al residuo se añadió Pd(OH)/C e iPrOH (1 5 mi). La mezcla se cargó con hidrógeno (50 psi) toda la noche para el completamiento de la reacción de reducción. La mezcla de reacción se filtró a través de una almohadilla de celita y el filtrado se concentró a presión reducida. El residuo se dividió con EtOAc (100 mi) y agua (20 mi). La fase acuosa se extrajo con EtOAc (3 x 30 mi) y la capa orgánica combinada se secó sobre a2S04. Después de eliminar el solvente, el residuo se purificó por cromatografía rápida de columna (0% a 1 5% MeOH en CH2CI2) para proporcionar 650 mg de 41 como un sólido blanco (61 % de rendimiento; dos etapas). 1 H NM R (CD3OD) (1 : 1 mezcla de diastereómeros P): 0.97 (s, 3H , CH3), 1 .1 3-1 .21 (m, 9H, 3 x CH3), 1 .33 (s, 3H, CH3), 2.56-2.62 (m, 2H, CH2), 2.97-3.03 (m, 2H, CH2), 3.91 -3.95 (m, 1 H), 4.18-4.26 (m, 2H), 4.88-4.61 (m, 2H), 4.83-4.97 (m, 2H), (m, 14H), 5.93 (s, 1 H), 7.087-7.40 (M, 4H, Ar-H), 7.86 (s, 1 H , H8)¡ 31 P NMR (C D3OD) : 4.99, 5.09; LC/MS calculada para C29H42N7O10P 679.3, observado: 680.3 (M+1 )+.
Ejemplo 10 Reactivos y condiciones de reacción: a) TBSCI, imidazol, piridina, 0°C después ta, 6 h; b) ?, ?'-carbonil diimidazol, DMF, 0°C después ta, 4 h; c) Et3N-3HF, THF, 0°C después ta, 12 h; d) 38, NMI , THF, -78°C después ta, 12 h; e) NaN3, DMF, 70°C, 12 h; f) 10% Pd/C, H2 (50 psi), i-PrOH-EtOAc (2: 1 v/v), ta, 1 8h. (2R, 3R, 4R, 5R)-2-(2-amino-6-cloro-9H-purin-9-il)-5-(((ter-buti¡dimetilsilil)oxi)metil)-3-metiltetrahidrofuran-3, 4-diol (42) A una solución del compuesto 37 (1 .0 g , 3.20 mmol) en 20 mi de piridina anhidra se añadió imidazol (0.27 g, 4.0 mmol) y cloruro de t-butildimetilsililo (TBSCI) (0.72 g, 4.8 mmol) a 0°C bajo una atmósfera de N2. Después de agitar por 6 h, la solución se trató con MeOH (1 .0 mi) a temperatura ambiente y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía de columna en gel de sílice (CH2d2:MeOH; 10: 1 ) para dar el compuesto 42 (1 .32 g, 3.07 mmol) con 96% de rendimiento. MS-EST m/z 430 (M + H+). (3aR, 4R, 6R, 6aR)-4-(2-amino-6-cloro-9H-pur¡n-9-il)-6-(hidroximetil)-3a- metiltetrahidrofuro[3, 4-d][1, 3]dioxol-2-ona (43) A una solución del compuesto 42 (0.89 g, 2.10 mmol) en 10 mi de DMF anhidro se añadió ? , ?'-carbonildiimidazol (0.85 g, 5.18 mmol) a 0°C bajo una atmósfera de N2. Después de agitar por 4 h, la solución de reacción se concentró a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía de columna en gel de sílice (hexano: EtOAc; 4: 1 a 1 :2) para dar 2',3'-0,0-carbonato intermedio. A una solución de 2\3'-0,0- carbonato intermedio en 20 mi de THF se añadió Et3 N-3HF (1 .65 mi, 10.20 mmol) a 0°C bajo una atmósfera de N2. Después de agitar por 12 h a temperatura ambiente, la solución resultante se concentró a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía de columna en gel de sílice (hexano: EtOAc; 10: 1 a EtOAc: MeOH ; 20: 1 ) para dar el compuesto 43 (0.70 g, 2.04 mmol) con 97% de rendimiento (2 etapas). H NMR (400 MHz, DMSO-d6) d 8.34 (s, 1H), 7.12 (br, 2H), 6.37 (s, 1H), 5.34 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 5.08 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 4.40 (q, J = 3.6 Hz, 1H), 3.82-3.70 (m, 2H), 1.30 (s, 3H); MS-ESI+ m/z 342 (M+H+).
Isopropil 3-(2-(((((3aR,4R,6R,6aR)-6-(2-amino-6-cloro-9H-purin-9-il)-6a-metil-2-oxotetrahidrofuro[3,4-d][1 ,3]dioxol-4-il)metoxi)(((S)-1-isopropoxi-1-oxopropan-2-il)amino)fosforil)oxi)fenil)propanoato (44) A una solución del compuesto 43 (0.54 g, 1.58 mmol) en 10 mi de THF anhidro se añadió una solución de cloruro de fosforamidato 38 (1.66 g, 3.95 mmol) de 10 mi de THF y N-metilimidazol (0.65 g, 7.90 mmol) a -78°C bajo una atmósfera de N. Después de agitar por 12h a temperatura ambiente, la solución de reacción se concentró a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía de columna en gel de sílice (hexano:EtOAc¡ 4:1 a 1:2) para dar el compuesto 44 (0.89 g, 1.23 mmol) con 78% de rendimiento. H NMR (400 MHz, CDCI3) d 8.81-7.79 (s, 1H), 7.40-7.05 (m, 4H); 6.40-5.90 (br, 2H), 6.13-6.08 (s, 1H), 5.61 (d, J = 4.8 Hz, 0.5H), 5.34 (d, J = 4.4 Hz, 0.5H), 5.09-4.90 (m, 3H); 4.51-4.43 (m, 1H), 4.24-3.95 (m, 2H), 3.85-3.78 (m, 1H), 3.03-2.86 (m, 2H), 2.64-2.54 (m, 2H), 1.43-1.13 (m, 18H); MS-EST m/z 725 (M+H+).
Isopropil 3-(2-(((((3aR, 4R, 6R, 6aR)-6-(2, 6-diamino-9H-purin-9-il)-6a-metil-2-oxotetrah¡drofuro[3,4-d][1 ,3]dioxol-4-il)metoxi(((S)-1-isopropox¡-1-oxopropan-2-il)amino)fosforil)oxi)fenil)propanoato (45) A una solución del compuesto 44 (0.47 g, 0.65 mmol) en 10 mi de DMF anhidro se añadió NaN3 (0.13 g, 1.95 mmol) a temperatura ambiente bajo una atmósfera de 2. Después de agitar por 12 h a 70°C, la solución resultante se vertió en 50 mi de EtOAc y se lavó con agua fría (20 mi x 3) y salmuera (20 mi). La capa orgánica se secó sobre a2S04 y se concentró a presión reducida. A una solución del residuo en 15 mi de co-solvente i-PrOH:EtOAc; 2:1 se añadieron 0.04 g de Pd/C (10% Pd sobre carbón activado). Después de sacudir por 18 h bajo H2 (50 psi), la solución desgasificada de N2 se trató con celita, se agitó 30 min y se filtró. El filtrado se purificó por cromatografía de columna en gel de sílice (hexano:EtOAc; 1:5 a EtOAc:MeOH; 20:1) para dar el compuesto 45 (0.40 g, 0.57 mmol) con 87% de rendimiento (la relación de diastereómeros (Rp/Sp) = 1:1 por 31P NMR). 1H NMR (400 MHz, CD3OD) d 7.86-7.81 (s, 1H), 7.40-7.09 (M, 4H), 6.32-6.30 (s, 1H), 5.38-5.34 (m, 1H), 5.02-4.87 (m, 2H), 4.80-4.70 (m, 1H), 4.56-4.38 (m, 2H), 3.99-3.92 (m, 1H), 3.00-2.94 (m, 2H), 2.63-2.55 (m, 2H), 1.38-1.33 (m, 6H), 1.22-1.13 (m, 12H); 3 P NMR (162 MHz, CDCU) d 5.45, 5.25; MS- ESI+ m/z 706 (M+H+).
Ejemplo 11 (R)-isopropil 3-(2,4-dihidroxi-3,3-dimetilbutanamido)propanoato, 46 Una suspensión de pantenoato cálcico 26 (10 g, 42 mmol) en 2- propnaol (200 mi) se enfrió hasta 0°C y se trató con gas HCI hasta que se obtuvo una solución clara (ca. 15 min). La introducción de gas HCI se terminó, la mezcla se dejó calentar hasta temperatura ambiente y se agitó toda la noche. Los solventes se evaporaron a presión reducida y el residuo resultante se disolvió en EtOAc y se lavó con NaHCOs (5%). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2S04, se filtraron y se evaporaron para dar 46 como un aceite claro (10 g, 90%). 1H NMR (400 MHz, CDCI3) d ppm 0.86 (s, 3H), 0.97 (s, 3H), 1.22 (d, J = 6.4 Hz, 6H); 2.51 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.55-3.45 (m, 4H), 3.98 (s, 1H), 3.98 (s, 1H), 5.00 (t, 6.4 Hz, 1H), 7.33 (t, J = 5.7 Hz, 1H). LC/MS calculada para C12H24NO5262.1, observado: 262.1 (M+1).
Isopropil 3-((4R)-2-cloro-5,5-dimetil-2-oxido-1,3,2-dioxafosfinano-4-carboxamido)propanoato, 47 A una solución del compuesto 46 (1 g, 3.8 mmol) en THF (15 mi) se añadió Et3 (11.2 mmol, 1.6 mi) a 0°C. Después de agitar 30 min, esta solución se añadió gradualmente a una solución enfriada de POCU (4.7 mmol, 0.45 mi en THF (10 mi) a -75°C. La solución resultante se agitó por 1 h a 0°C y otros 30 min a temperatura ambiente. La solución se concentró a presión reducida, se disolvió en diclorometano (20 mi) y se lavó con NaHCÜ3 (sat). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2S04 y los solventes se evaporaron a presión reducida. El compuesto 47 se secó bajo alto vacío y se usó como tal sin purificación adicional. LC/MS cale. Para C12H22CINO6P 342.0, observado: 342.0 (M+1).
Isopropil 3-((4R)-2-(((2R, 3R, 4R, 5R)-5-(2-amino-6-cloro-9H-purin-9-il)-3,4-dihidroxi-4-metiltetrahidrofuran-2-il)metoxi)-5, 5-dimetil-2-oxido-1 ,3,2-dioxafosfinano-4-carboxamido)propanoato, 48 A una solución de 2-amino-6-cloro-purina nucleósido 37 (0.2 g, 0.63 mmol) en THF (9 mi) se añadió N-metilimidazol (0.1 5 mi, 1 .9 mmol) a temperatura ambiente. Después de agitar por 45 min, la solución se enfrió hasta 0°C y una solución de 47 (5 mi, 0.5 M en THF) se añadió por goteo. La mezcla de reacción se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó toda la noche. Los solventes se evaporaron a presión reducida y el residuo crudo se purificó por cromatografía rápida (eluyente: 5% a 15% MeOH en CH2CI2). Se obtuvo el Compuesto 48 (1 18 mg, 0.19 mmol) con 30% de rendimiento. LC/MS calculada para C23H35CI N6O10P 621 .1 , observado 621 .1 (M+1 ).
Isopropil 3-((4R)-2-(((2R, 3R, 4R, 5R)-5-(2, 6-diamino-9H-purin-9-il)-3, 4-dihidroxi-4-metiltetrahidrofuran-2-il)metoxi)-5, 5-dimetil-2-oxido- 1 , 3, 2-dioxafosfinano-4-carboxamido)propanoato, 49 Una solución de 48 ( 100 mg, 0.16 mmol) y NaN (52 mg, 0.8 mmol) en DMF (3 mi) se calentó a 80°C y se agitó por 5 h (el progreso de la reacción se monitoreó por LC-MS). Tras el completamiento de la reacción, la mezcla se concentró a presión reducida y el residuo crudo se purificó por cromatografía rápida (0% a 20% MeOH en C H2CI2) . El compuesto 6-azido se obtuvo en forma pura como un sólido blanco (60 mg, 0.095 mmol) con 59% de rendimiento. LC-MS calculada para C23H34N9O10P 627.2, observado 628.2 (m + 1 ).
El compuesto 6-azido anterior (60 mg, 0.095 mmol) y una cantidad catalítica de Pd(OH)2/C en etilacetato (3 mi), se sometió a hidrogenación a presión atmosférica a temperatura ambiente por 8 h. La mezcla depurada con N2 se filtró a través de una almohadilla de celita y la celita resultante se lavó con 50% de una solución de C H2CI2 y CH3OH . Los solventes se evaporaron a presión reducida y el residuo crudo se purificó por placa de TLC preparativa (eluyente: 15% MeOH en CH2CI2). Se obtuvo el compuesto 49 como una mezcla de díastereómeros (30 mg, 52%). 13P-NMR (CD3OD): -4.84, -7.21 ; LC-MS calculada para C23H37N7O10P 602.2, observado 602.2 (M + 1 ).
Ejemplo 12 Ensayo de la enzima NS5B La RNA polimerasa NS5B de HCV truncada en 21 -aminoácido del C-terminal se clonó a partir de células con replicones de HCV, modificó con una cola terminal de seis His, expresó en un vector de expresión procariótico (pQE60, Qiagen), y posteriormente se purificó sobre una columna con resina de afinidad de cobalto Talón (Clontech, Palo Alto, California).1 La purificación se supervisó por SDS-PAGE e inmunoelectrotransferencia. La proteína purificada resultante se dializó toda la noche contra 50 mM fosfato de sodio (pH 8.0)-300 mM cloruro de sodio- 0.5% Tritón X-100-50% glicerol-2 mM ditiotreitol. El dializado mantuvo la actividad constante por más de 6 meses cuando se almacenó a -20°C. La proteína se cuantificó con el reactivo de ensayo de proteínas Coomassie Plus (Pierce) usando un estándar de albúmina de suero bovino del mismo proveedor.
La reacción de la RNA polimerasa NS5B se estudió supervisando la incorporación de U MP marcado con P2 dentro de la cadena de RNA recientemente sintetizada usando IRES menos como el molde. Una reacción en estado estacionario se realizó en un volumen total de 140 mi que contiene 2.8 mg de molde RNA IRES menos, 140 unidades de anti-ribonucleasa (Ambion), 1 .4 mg de NS5B, una cantidad adecuada de [a-32P]UTP, varias concentraciones de nucleótidos naturales y modificados, 1 mM MgCh, 0.75 mM MnCI2, y 2 mM ditiotreitol en 50 mM amortiguador HEPES (pH 7.5). La concentración de nucleótidos se cambió dependiente del inhibidor. La temperatura de reacción fue 27°C. En los momentos deseados, se tomaron alícuotas de 20 mi y se apagó la reacción mezclando la mezcla de reacción con 80 mi de la solución de terminación que contiene 12.5 mM EDTA, 2.25 M NaCI, y 225 mM citrato de sodio. Para determinar los parámetros del estado estacionario para un sustrato de nucleótido natural TP (NTP), una concentración NTP se varió y las concentraciones de los otros tres NTPs se fijaron en concentraciones de saturación. Para la determinación de la K¡ para un análogo A, las concentraciones de UTP, GTP y CTP se fijaron a 10, 100, y 100 mM, respectivamente, y se variaron las concentraciones de ATP y el análogo A. Los productos ARN radioactivos se separaron de los sustratos sin reaccionar pasando la mezcla de reacción apagada a través de una membrana Hybond N+ (Amersham Biosciencies) usando un aparato de membrana de transferencia puntual. Los productos de RNA se retuvieron sobre la membrana y los nucleótidos libres se arrastraron por el agua. La membrana se lavó cuatro veces con una solución que contiene 0.6 M NaCI y 60 mM citrato de sodio. Después se enjuagó la membrana con agua seguido por lavado con etanol, los puntos se cortaron y se contó la radiactividad en un contador de centelleo líquido Packard. Se calculó la cantidad de producto sobre la base de la radiactividad total en la mezcla de reacción. La velocidad de reacción se determinó a partir d lea pendiente del curso en el tiempo de la formación de producto. Para determinar la constante de inhibición (K¡), las velocidades de reacción se determinaron con diferentes concentraciones del sustrato y el inhibidor y se ajustaron a una ecuación de inhibición competitivas: v = (Vmax [s])/{Km (1 + [l]/K') + [S]}, donde v es la velocidad observada, [S] es la concentración de sustrato, [I] es la concentración del inhibidor, y Vmax es la velocidad máxima. Km es la constante Michaelis, y K¡ es constante de inhibición.
Referencias: 1 ) Stuyver LJ; Whitaker T, McBrayer TR, Hernández-Santiago Bl , Lostia S, Tharnish PM, Ramesh M, Chu CK, Jordán R, Shi J , Rachakonda S, Watanabe KA, Otto MJ, Schinazi RF. Ribonucleoside Analogue That Blocks Replication of Bovine Viral Diarrhea and Hepatitis C Viruses in Culture Antímicrob. Agents Chemother. 2003, 47, 244.
Ejemplo 13 Síntesis de RNA y terminación de la cadena i) Expresión y purificación de HCV NS5B: La secuencia de HCV NS5B, insertad en el vector de expresión pET-22 (Novagen), se expresó como una enzima truncada en C terminalmente (?21 ) en Escherichia coli BL21 (DE3) y se purificó utilizando cromatografía de afinidad por iones metálicos (estuche Talón de Clonetech). Las secuencias se confirmaron por secuenciación (Sequetech). ii) Condiciones estándares de reacción: Las mezclas de reacción consistieron de 1 µ? RNA molde (RNA20), 1 .5 µ? HCV NS5B, 0.25 µ? cebador radiomarcado (P16) en un amortiguador que contiene 40 mM HEPES; pH 8, 10 mM NaCI, 1 mM ditiotreitol, y 0.2 mM MnCI2. Adicionalmente, las reacciones contuvieron 10 µ? GTP-UTP y 3 µ? análogo-TP de prueba. Las reacciones se terminaron después de 30 minutos y los productos se precipitaron con isopropanol, desnaturalizaron por calor por 5 minutos a 95°C y separaron en geles 12% de poliacrilamida, 7 M urea. La concentración del terminador de cadena requerido para inhibir el 50% de la formación de producto completo (EC50) se determinó para un sitio único de la incorporación del análogo de nucleótido con el molde/cebador. iii) Adquisición de datos y análisis: Los geles se escanearon y analizaron con un fosforimager (FLA_7000, Fujifilm) y se calcularon los valores EC50 La Figura 4 muestra la incorporación de trifosfato ((2R,3S,4R,5R)-5-(2,6-diamino-9H-purin-9-il)-3,4-dihidroxitetrahidrofuran-2-il)metil tetrahidrógeno por HCV NS5B.
La Figura 5 muestra la incorporación de trifosfato ((2R,3S,4R,5R)-5-(2-amino-6-hidroxi-9H-purin-9-il)-3,4-dihidroxitetrahidrofuran-2-il)metil tetrahidrógeno por HCV NS5B.
Ejemplo 14 Ensayos de toxicidad mitocondrial en células HepG2: i) Efecto de los profármacos de monofosfato de nucleósidos 2,6-diamino purina sobre el crecimiento celular y la producción de ácido láctico: El efecto sobre el crecimiento de células HepG2 se determinó incubando las células en presencia de 0 µ?, 0.1 µ?, 1 µ?, 1 0 µ? y 100 µ? del fármaco. Las células (5 x 10" por cavidad) se sembraron dentro de grupos de cultivo de células en 12 cavidades en medio esencial mínimo con aminoácidos no esenciales suplementados con 10% suero fetal bovino, 1 % piruvato de sodio, y 1 % penicilina/estreptomicina e incubaron por 4 días a 37°C. Al final del periodo de incubación el número de células se determinó usando un hemocitómetro. Además enseñado por Pan-Zhou X-r; Cui L, Zhou X-J, Sommadossi J-P, Darley-Usmer V . "Differential effects of antiretroviral nucleoside analogs on mitocondrial function ¡n HepG2 cells" (Antimicrob. Agents Chemother. 2000; 44: 496-503. Para medir los efectos de los análogos de nucleósidos en la producción de ácido láctico, células HepG2 a partir de un cultivo madre se diluyeron y sembraron en placas de cultivo de 12 cavidades a 2.5 x 1 04 por cavidad. Varias concentraciones (0 µ?, 0.1 µ?, 1 µ?, 10 µ? y 100 µ?) de análogo de nucleósido se añadieron, y los cultivos se incubaron a 37°C en una atmósfera humidificada 5% de CO2 por 4 días. En el día 4 se determinó el número de células en cada cavidad y se recogió el medio de cultivo. El medio de cultivo se filtró, y determinó el contenido de ácido láctico en el medio usando un ensayo colorimétrico de ácido láctico (Sigma - Aldrich). Desde que el producto ácido láctico puede considerarse un marcador para la función mitocondrial deteriorada, los niveles elevados de producción de ácido láctico detectado en células cultivadas en presencia de análogos del profármaco de monofosfato de nucleósido 2,6-diamino 2'-C C-Me purina puede indicar un efecto citotóxico inducido por el fármaco. ii) Efecto de profármacos de monofosfato de nucleósido 2,6-diamino purina en la Síntesis de DNA mitocondriales: se ha desarrollado un ensayo de PCR en tiempo real para cuantificar con precisión el contenido de DNA mitocondrial (ver Stuyver LJ, Lostia S, Adams M, Mathew JS, Pai BS, Grier J, Tharnish PM, Choi Y, Chong Y, Choo H, Chu CK, Otto MJ, Schinazi RF. Antiviral activities and celular toxicities of modified 2',3'-dideoxi-2' ,3'-didehydrocytidine analogs. Antimicrob. Agents Chemother. 2002; 46: 3854-60. Este ensayo se usó en todos los estudios descritos en esta solicitud que determinan el efecto de los análogos de nucleosidos en el contenido de DNA mitocondrial. En este ensayo, células HepG2 con número de pase bajo se sembraron a 5,000 células/cavidad en placas de 96 cavidades recubiertas con colágeno. Análogos de monofosfato de nucleosidos se añadieron al medio para obtener concentraciones finales de 0 µ?, 0.1 µ?, 1 0 µ? y 100 µ?. En el día de cultivo 7, los ácidos nucleicos celulares se prepararon mediante el uso de columnas disponibles comercialmente (estudio RNeasy 96, Qiagen). Estos estuches co-purifican RNA y DNA, y por lo tanto, los ácidos nucleicos totales se eluyeron de las columnas. El gene de la subunidad I I del citocromo c oxidasa mitocondrial (COXII) y gene de ß-actina o rRNA se amplificaron a partir de 5 µ? de ácidos nucleicos eluidos usando un protocolo Q-PCR m ultiplex con sondas y cebadores adecuados para tanto amplificaciones del objetivo como la referencia. Para COXI I se usan los sigu ientes cebadores sentido, sonda y antisentido, respectivamente: 5'-TGCCCGCCATCATCCTA-3', 5'-tetracloro-6-carboxifluorescein-TCCTCATCGCCCTCCCATCCC-TAM RA-3' y 5'-CGTCTGTTATGTAAAGGATGCGT-3'. Para el exón 3 del gene de la ß-actina (GenBank número de acceso E01 094) los cebadores de sentido, sonda y antisentido son 5'-GCGCGGCTACAGCTTCA-3\ 5'-6-FAMCACCACGGCCGACGGGATAMRA-3' y 5'- TCTCCTTAATGTCACGCACGAT-3' , respectivamente. Los cebadores y sondas para el gene de rRNA están disponibles comercialmente de Applied Biosystems. Dado que se obtuvieron eficiencia de amplificación iguales para todos los genes , se usó el método comparativo CT para investigar la inhibición potencial de la síntesis de DNA mitocondrial . El método comparativo CT usa fórmulas aritméticas en la que la cantidad de objetivo (gene COXI I) se normaliza a la cantidad de una referencia endógena (el gene de ß-actina o de rRNA) y es relativo a un calibrador (un control sin fármaco en el día 7). La fórmula aritmética para este enfoque está dado por 2-????, donde AACT es (CT para la muestra de prueba objetivo promedio - CT para el control objetivo) - (CT para la prueba de referencia promedio -CT para el control de referencia) (ver Johnson MR, K Wang , JB Sm ith, MJ Heslin, RB Diasio. Quantitation of dihydropyrimidine dehydrogenase expression by real-time reverse transcription polymerase chain reaction . Anal . Biochem . 2000; 278: 1 75- 184). Una disminución en el contenido de DNA mitocondrial en las células cultivadas en presencia del fármaco puede indicar toxicidad mitocondrial. iii) Evaluación morfológica en microscopía electrónica: La toxicidad inducida por N RTI se ha demostrado que causa cambios morfológicos en la mitocondria (por ejemplo, pérdida de crestas, disolución e hinchamiento de la matriz, y formación de gotita de lípido) que se pueden observar con análisis uitraestructural usando microscopía electrónica de transmisión (ver Cui L, Schinazi RF, Gosselin G, Imbach JL, Chu CK; Rando RF, Revankar GR, Sommadossi JP. Effect of enantimoeric and racemic nucleoside analogs on mitocondrial functions in HepG2 cells. Biochem. Pharmacol. 1996, 52, 1577-1584; Le is W, Levine ES, Griniuviene B, Tankersley KO, Colacino JM, Sommadossi JP, Watanabe KA, Perrino FW. Fialuridine and its metabolites inhibit DNA polymerase gamma at sites of múltiple adjacent analog incorporation, decrease mtDNA abundance, and cause mitocondrial structural defects in cultured hepatoblasts. Proc Nati Acad Sci Estados Unidos 1 996; 93: 3592-7; Pan-Zhou XR, L Cui, XJ Zhou, JP Sommadossi, VM Darley-Usmar. Differential effects of antiretroviral nucleoside analgos on mitocondrial function en HepG2 cells. Antimicrob. Agents Chemother. 2000, 44, 496-503). Por ejemplo, micrografías electrónicas de células HepG2 incubadas con 10 µ? fialuridina (FIAU; 1 ,2'-deoxi-2'-fluoro-1 -D-arabinofuranosil-5-yodo-uracilo) mostró la presencia de mitocondria aumentada con cambios morfológicos consistentes con la disfunción mitocondrial. Para determinar sí los profármacos de monofosfato de nucleósidos 2,6-diamino 2'-C-Me purina pueden promover cambios morfológicos en la mitocondria, las células HepG2 (2.5 x 104 células/ml) se pueden sembrar en placas de cultivos de tejidos (35 por 10 mm) en presencia de 0 µ?, 0.1 µ?, 1 µ?, 10 µ? y 100 µ? de análogo de nucleósido. En el día 8, las células se pueden fijar, deshidratar, y embeber en Epon como se describió anteriormente. Se pueden preparar secciones delgadas, teñir con acetato de uraniio y citrato de plomo, y después examinar mediante microscopía electrónica de transmisión.
El efecto de los compuestos 8b-arriba, 12, y 8a en el DNA nuclear o mitocondrial, o producción de ácido láctico, en células de hepatoma HepG2 se analizó durante un periodo de 14 días. El procedimiento resumido en la sección (i) anterior se usó para este análisis. Los resultados se tabulan más abajo: Los valores en rojo representan 3 50% de inhibición de los niveles de DNA total (tóxicos para el ensayo estándar) o niveles aumentados de ácido láctico.
Como se muestran en la tabla , 8b-arriba , 12 y 8a no exhibieron efecto significativo en el DNA nuclear o mitocondrial o producción de ácido láctico hasta 50 µ? (en células de hepatoma HepG2 , ensayo de 1 4 días) Ejemplo 15 Ensayos de toxicidad mitocondrial en células Neuro2A Para estimar el potencial de análogos de nucleósidos que causa toxicidad neuronal , células de ratón Neuro2A (Colección Americana de Cultivo tipo 1 31 ) se puede usar como un sistema modelo (ver Ray AS, Hernández-Santiago Bl , Mathew JS , Murakami E , Bozeman C, Xie MY, Dutschman GE , Gullen E , Yang Z, H urwitz S, Cheng YC , Chu CK, McCIure H , Schinazi RF , Anderson S. Mechanism of anti-human immunodeficiency virus activity of beta-D-6-cyclopropilamine-2' , 3'-didehydro-2', 3'-dideoxiguanosine. Antim icrob. Agents Chemother. 2005, 49, 1 994-2001 ). Las concentraciones necesarias para inhibir el crecim iento celular en 50% (CC50) se puede medir como se describió usando ensayo basado en colorante bromuro de 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2, 5 difeniltetrazolio. Las perturbaciones en los niveles de ácido láctico celular y DNA m itocondrial en concentraciones definidas de fármacos se pueden llevar a cabo como se describieron anteriormente. En todos los experimentos , ddC y AZT se pueden usar como análogos de nucleósidos de control.
Ejemplo 16 Efecto de los análogos de nucleótidos en las actividades de la DNA polimerasa y exonucleasa de DNA polimerasa mitocondrial ? i) Purificación de la polimerasa humana ?: Las subunidades mayores y menores de la polimerasa ? recombinante se pueden purificar como se describió anteriormente (ver Graves SW, Johnson AA, Johnson KA. Expression, purification, and initial kinetic characterization of the large subunit of the human mitocondrial DNA polymerase. Biochemistry. 1998, 37, 6050-8; Johnson AA, Tsai Y, Graves SW, Johnson KA. Human mitocondrial DNA polymerase holoenzyme: reconstitution and characterization. Biochemistry 2000; 39: 1702-8). La concentración de proteína se determinó espectrofotométricamente a 280 nm, con coeficientes de extinción de 234,420 y 71 ,894 -1 cm-1 para las subunidades mayor y menor de la polimerasa ?, respectivamente. ¡i) Análisis cinéticos de la incorporación de nucleótidos: Análisis cinéticos en estado pre-estacionario se llevaron a cabo para determinar la eficiencia catalítica de incorporación (k/K) para la DNA polimerasa ? para sustratos nucleósido-TP y dNTP naturales. Esto permitió la determinación de la capacidad relativa de esta enzima para incorporar análogos modificados y predecir la toxicidad. Los análisis cinéticos de estado pre-estacionario de incorporación de análogos de nucleótidos por DNA polimerasa ? se pueden llevar a cabo esencialmente como se describió anteriormente (ver Murakami E, Ray AS, Schinazi RF, Anderson KS. Investigation the effects of stereochemistry on incorporation and removal of 5-fluorocytidine analogs by mitocondrial DNA polymerase gamma: comparison of D- and L-D4FC-TP. Antiviral Res. 2004, 62, 57-64; Feng JY, Murakami E, Zorca SM , Johnson AA, Johnson KA, Schinazi RF, Furma PA, Anderson KS. Relationship between antiviral activity and host toxicity: comparison of the incorporation efficiencies of 2',3'-dideoxi-5-fluoro-3'-tiacytidine-triphosfate analogs by human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase and human mitocondrial DNA polymerase. Antimicrob Agents Chemother. 2004, 48, 1300-6). En resumen, una mezcla pre-incubada de subunidades mayores (250 nM) y menores (1 .25 mM) de DNA polimerasa ? y 6 OnM DNA molde/cebador en 50 mM Tris-HCI, 100 mM NaCI, pH 7.8 se añadió a una solución que contiene MgCb (2.5 mM) y varias concentraciones de análogos de nucleótidos. Las reacciones se pueden apagar y analizar como se describió anteriormente. Los datos se pueden ajustar a las mismas ecuaciones como se describió anteriormente. iii) Ensayo para la actividad de Exonucleasa 3' 5' de la polimerasa humana ?: La actividad de exonucleasa de la polimerasa humana ? se estudió midiendo la velocidad de formación de los productos de escisión en ausencia de dNTP. La reacción se inició añadiendo MgCh (2.5 mM) a una mezcla pre-incubada de la polimerasa ? subunidad mayor (40 nM), subunidad menor (270 nM) y 1 ,500 nM de molde/cebador de cadena terminada en 50 mM Tris-HCI, NaCI 100 mM, pH 7.8, y se apagó con 0.3 M EDTA en los intervalos de tiempo designados. Todas las mezclas de reacción se pueden analizar en geles 20% de secuenciación de poliacrilamida desnaturalizante (8 M urea), reflejar en un sistema de imagen molecular Bio-Rad GS-525, y cuantificar con Molecular Analyst (Bio-Rad). Los productos formados a partir de los intervalos de tiempo tempranos se pueden representar como una función de tiempo. Los datos se pueden fijar por regresión lineal con Sigma Plot (Jandel Scientific). La pendiente de la línea se dividió por la concentración de enzima activa en la reacción para calcular la kexo para la actividad de exonucleasa (ver Murakami E, Ray AS, Schinazi RF, Anderson KS. Investigating the effects of stereochemistry on incorporation and removal of 5-fluorocytidine analogs by mitocondrial DNA polymerase gamma: comparison of D- and L-D4FC-TP. Antiviral Res. 2004; 62: 57-64; Feng JY, Murakami E, Zorca SM , Johnson AA, Johnson KA; Schinazi RF, Furman PA; Anderson KS. Relationship between antiviral activity and host toxicity: comparison of the incorporation efficiencies of 2', 3'-dideoxi-5-fluoro-3'-tiacytidine-triphosfate analogs by human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase and human mitochondiral DNA polymerase. Antimicrob Agents Chemother. 2004; 48: 1300-6).
Ejemplo 17 Ensayo para la citotoxicidad de médula ósea Células mononucleares primarias de médula ósea humana se pueden obtener comercialmente de Cambrex Bioscience (Walkersville, MD). Ensayos CFU-GM se pueden llevar a cabo usando un agar blando bicapa en presencia de 50 unidades/ml de factor estimulante de colonias de granulocitos/macrófagos humanos recombinantes, mientras que los ensayos BFU-E usan una matriz de metilcelulosa que contiene 1 unidad/ml de eritropoyetina (ver Sommadossi JP, Carlisle R. Toxicity of 3'-azido-3'-deoxythymidine and 9-(1 ,3-dihydroxi-2-propoxymethyl) guanine for normal human hepatopoietic progenitor cells in vitro. Antimicrob. Agents Chemother. 1 987; 31 : 452-454; Sommadossi, JP, Schinazi, RF, Chu, CK, y Xie, MY. Comparison of Cytotoxicity of the (-) and (+) enantiomer of 2',3'-dideoxi-3'-tiacytidine in normal human bone marrow progenitor cells. Biochem. Pharmacol. 1992; 44: 1921 -1925). Cada experimento se realizó en duplicado en células de tres donantes diferentes. AZT se usó como un control positivo. Las células se pueden incubar en presencia del compuesto por 14-1 8 días a 37°C con 5% de CO2, y las colonias de más de 50 células se cuentan usando un microscopio invertido para determinar IC5o. La concentración inhibidora 50% ( I C50) se obtuvo por análisis de regresión lineal por mínimos cuadrados del logaritmo de la concentración de fármaco contra las fracciones de supervivencia BFU-E. El análisis estadístico se realizó con la prueba t de Student para muestras no pareadas independientes.
Ejemplo 18 Ensayo de citotoxicidad La toxicidad de los compuestos se evaluó en células Vero, PBM humana, CEM (linfoblastoide humano), y HepG2, como se describió anteriormente (ver Schinazi R.F. , Sommadossi J.-p. , Saalmann V. , Cannon D. L. , Xie M.-Y. , Hart G.C. , Smith G.A. & Hahn E. F. Antimicrob. Agents Chemother. 1990, 34, 1 064-67). La cicloheximida se incluyó como control positivo citotóxico, y las células sin tratar expuestas al disolvente se pueden incluir como controles negativos. La citotoxicidad IC50 se obtuvo a partir de la curva de concentración-respuesta usando la mediana del método eficaz descrito anteriormente (ver Chou T.-C. & Talalay P. Adv. Enzyme Regul. 1984, 22, 27-55; Belen'kii M. S. & Schinazi R. F. Antiviral Res. 1994, 25, 1 -1 1 ). Los datos se tabulan más abajo en la Tabla 2: Tabla 2: Datos de citoxocidad Citotoxicidad CCso (µ?) Citotoxicidad CCso (µ?) Citotoxicidad CC50 (µ?) PBM > 100 PBM > 100 PBM > 100 CEM > 100 CEM >100 CEM > 100 Vero > 100 Vero > 100 Vero > 100 Ejemplo 19 Ensayo de la adenosina deaminasa Para determinar la tendencia la desanimación de los nucleósido y profármacos de monofosfato por la adenosina desaminasa, análogos de nucleósidos pueden Incubarse con la enzima purificada disponible comercialmente, y la reacción puede seguirse espectrofotométricamente. Las condiciones de reacción típicas implican preparar una solución que contiene 50 µ? de análogo de nucleósido en 0.5 mi de 50 mM fosfato de potasio (pH 7.4) a 25°C. El tiempo de reacción típica es 7 minutos con 0.002 unidades de enzima, y 120 minutos con 0.2 unidades de enzima. (La definición de unidad de adenosina deaminasa es una unidad de deaminará 1 .0 mol de adenosina a ¡nosina por minuto a pH 7.5 a 25°C). La deoxiadenosina se usa típicamente como un control positivo. La deoxiadenosina es 59% desaminada en las condiciones dadas en 7 minutos con 0.002 unidades de enzima. La deoxiguanosinasa se usa típicamente como un control negativo. Se puede medir la densidad óptica a 265 nm o 285 nm . La diferencia en densidad óptica entre el comienzo y el final del experimento se divide por el coeficiente de extinción, y después se multiplica por el volumen de reacción para determinar el número de moles de sustrato transformado en producto. Los moles del producto se pueden dividir por moles de sustrato equivalente a 100% de reacción completa después de multiplicar por 100 para obtener el porcentaje de desanimación. El límite de detección es típicamente 0.001 unidades de densidad óptica.
Ejemplo 20 Síntesis de trifosfatos análogos de nucleósido Los trifosfatos análogos de nucleósido se sintetizaron a partir de los correspondientes nucleósidos, usando el método de Ludwig y Eckstein. (Ludwig J, Eckstein F. "Rapid and efficient synthesis of nucleoside 5'-0-(1 -triotrifosforotioates using 2-chloro-4-H-1 ,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one" J. Org. Chem . 1 989, 54 631 -5). El trifosfato análogo de nucleósido crudo puede purificarse, por ejemplo, mediante FPLC usando una columna HiLOad 26/10 Q Sepharose de Flujo rápido de Pharmacia y gradiente de amortiguador TEAB (pH 7.0). El producto puede caracterizarse mediante espectroscopia UV, NMR de protón y fósforo, espectrometría de masas y/o HPLC.
Los trifosfatos resultantes pueden usarse como controles para los ensayos de farmacología celular descritos anteriormente y para el trabajo cinético con HCV-Pol (por ejemplo, trifosfato de nucleósido 2,6-diamino 2'-C-Me purina con HCV-Pol).
Ejemplo 21 Ensayo del replicón de HCV1 Células Huh 7 Clon B que contienen replicón de RNA de HCV se sembraron en placa de 96 cavidades a 5000 células/cavidad, y los compuestos se probaron a 10 µ? en triplicado inmediatamente después de la siembra. Después de cinco días de incubación (37°C, 5% CO2), RNA celular total se aisló usando el estuche de purificación de RNA versaGene de Gentra. El replicón de RNA y un control interno (reactivos de control rRNA TaqMan, Applied Biosystems) se amplificaron en un ensayo de RT-PCR en un tiempo real multiplex de un solo paso. La eficacia antiviral de los compuestos se calculó restando el ciclo umbral de RT-PCR del compuesto de prueba a partir del ciclo umbral de RT-PCR del control sin fármaco (ACt HCV). Un ACt de 3.3 equivale a una reducción de 1 log (igual a 90% menos de material de partida) en los niveles de replicón de RNA. La citotoxicidad de los compuestos se calculó usando además los valores de rRNA ACt. (2'-C-Me-C) se usó como control. Para determinar EC90 y valores de I C502, ACt: los valores se convirtieron por primera vez en una fracción del material de partida,3 y se usaron después para calcular el % de inhibición. Los datos de tres compuestos (Compuesto 12, Compuesto 8a, y compuesto 8b-arriba) se muestran más abajo en la Tabla 3.
Tabla 3: Datos del replicón de HCV Como se muestra en la Tabla 3, 8b-arriba fue aproximadamente 10 veces más potente que 8b-abajo en el ensayo del replicón de HCV.
La Tabla 4 muestra el aumento múltiple contra 1 b WT a través de genotipos y replicones resistentes a la CE90*.
Tabla 4 + = 0.1 a 1 ; ++ = 1 . 1 a 2; +++ = 2.1 a 3 Referencias: 1 . Styuver L y otros, Ribonucleoside analogue that blocks replication or bovine viral diarrea and hepatitis C viruses in culture. Antimicrob. Agents Chemother. 2003, 47, 244-254. 2. Reed IJ & Muench H, A simple method for estimating fifty percent endpoints. Am. J. Hyg. 27: 497, 1 938. 3. Applied Biosystems Handbook Ejemplo 22 La susceptibilidad del virus del Nilo Occidental a los compuestos descritos en la presente descripción, se puede evaluar además usando el ensayo descrito anteriormente en: Song, G.Y., Paul, V. , Choo, H. , Morrey, J. , Sidwell, R.W. , Schinazi, R. F. , Chu, C. K. Enantiomeric synthesis of D- and L-ciclopentenil nucleosides and their antiviral activity against HIV and West Nile virus. J . Med. Chem. 2001 , 44, 3985-3993.
Ejemplo 23 La susceptibilidad de la Fiebre Amarilla a los compuestos descritos en la presente descripción se puede analizar además como se describió anteriormente: Julander, J.G. , Furuta, Y. , Shafer, K. , Sidwell, R.W. Activity of T-1 106 in a Hámster Model of Yellow Fever Virus Infection. Antimicrob. Agents Chemother. 2007, 51 , 1962-1966.
Ejemplo 24 La susceptibilidad del Dengue a los compuestos descritos en la presente descripción se puede evaluar usando el ensayo de alto rendimiento descrito por Lim y otros. A scinti liation proximity assay for dengue virus NS5 2'-0-metiltransferase-kinetic and inhibition analyses, Antiviral Research, volumen 80, número 3, diciembre 2008, páginas 360-369.
NS5 del virus del dengue (DENV) posee actividad de metiltransferasa (MTasa) en su secuencia de aminoácidos N - terminal y es responsable de la formación de una estructura cap de tipo 1 , m7GpppAm2'-0 en el RNA genómico viral. Las condiciones in vitro óptimas para la actividad DENV2 2'-0-MTAsa se pueden caracterizar usando la proteína recombinante purificada y un molde corte de RNA encapsulado GTP- biotinilado. Los parámetros de cinética en estado estacionario derivados de velocidades iniciales pueden usarse para establecer un ensayo de proximidad de centelleo robusto para probar el compuesto. Los estudios de pre-incubación por Lim y otros, Antiviral Research, volumen 80, número 3, diciembre de 2008, páginas 360-369, muestran que los complejos de MTAsa-AdoMet y MTasa-RNA fueron del mismo modo catalíticamente competente y la enzima soporta un mecanismo bi bi cinético al azar. Lim validó el ensayo con agentes inhibidores competitivos, S-adenosil-homocisteína y dos homólogos, sinefungina y dehidrosinfungina. Un bolsillo de unión a GTP presente en el extremo N-terminal de DENV2 MTasa se postuló anteriormente que es el sitio de unión a la caperuza. Este ensayo permite la detección rápida y altamente sensible de la actividad 2'-0-MTasa y se puede adaptar fácilmente para la clasificación de alto rendimiento de compuestos inhibidores. Es adecuado además para la determinación de las actividades enzimáticas de una amplia variedad de MTasas que encapsulan RNA.
Ejemplo 25 Actividad anti-Norovirus Los compuestos pueden exhibir actividad anti-norovirus por la inhibición de la polimerasa y/o heiicasa de norovirus, por la inhibición de otras enzimas necesarias en el ciclo de replicación, o por otras rutas.
Actualmente no hay ningún tratamiento farmacéutico aprobado para la infección por Norovirus, y esto probablemente ha sido al menos en parte debido a la falta de disponibilidad de un sistema de cultivo celular. Recientemente, un sistema de replicón se ha desarrollado para la cepa original Norwalk G-l (Chang, K.O. , y otros (2006) Virology 353:463-473).
Tanto los replicones de Norovirus como replicones de Hepatitis C requieren que sean funcionales la heiicasa, proteasa, polimerasa viral para que ocurra la replicación del replicón. Más recientemente, un ensayo de infectividad de cultivo celular in vitro se ha reportado utilizando inóculos del genogrupo I y I I de Norovirus (Straub, T. M. y otros (2007) Emerg. Infecí. Dis. 13(3):396-403). Este ensayo se realiza en un biorreactor de pared rotatoria utilizando células epiteliales intestinales pequeñas en perlas microportadoras. El ensayo de infectividad puede usarse para clasificar los inhibidores de entrada.
Ejemplo 26 Farmacología celular en células HepG2 Células HepG2 se obtienen de la Colección Americana de Cultivo Tipo (Rockville, MD), y se cultivan en frascos de cultivo de tejido de 225 cm2 en medio esencial mínimo suplementado con aminoácidos no esenciales, 1 % penicilina-estreptomicina. El medio se renueva cada tres días, y las células se subcultivan una vez a la semana. Después de la separación de la monocapa adherente con una exposición de 10 minutos a 30 mi de tripsina-EDTA y tres lavados consecutivos con medio, las células confluentes HepG2 se siembran a una densidad de 2.5 x 106 células por cavidad en un aplaca de 6 cavidades y se exponen a 10 µ? de compuesto activo marcado (500 dpm/pmol) con [3H] por periodos de tiempo especificados.
Las células se mantienen a 37°C bajo una atmósfera de 5% CO2. En los intervalos de tiempo seleccionados, las células se lavan tres veces con solución salina regulada con fosfato enfriado con hielo (PBS).
El compuesto activo intracelular y sus respetivos metabolitos se extraen incubando el sedimento celular toda la noche a -20°C con 60% de metanol seguido por extracción con un 20 pal adicional de metanol frío por una hora en un baño de hielo. Los extractos se combinan después, se secan bajo un flujo de aire filtrado moderado y almacenan a -20°C hasta su análisis pro HPLC.
Ejemplo 27 Farmacología celular en células Huh7 Similar al método descrito para la farmacología celular en HepG2, los compuestos se incuban en células Huh-7 por 4 h a la concentración de 50 µ? en triplicado. 3TC puede usarse como un control positivo y hecho en duplicado, mientras se puede incubar DMSO (10 µ?) como un control blanco en duplicado. 70% de metanol en hielo frío puede usarse como disolvente de extracción. ddATP (1 0 nM) puede usarse como estándar interno.
Cuando el nucleósido parental 2,6-diamino-2'-C-Me purina, 12, se incubó con las células Huh7 el análisis LC/MS reveló niveles extremadamente bajos de los correspondientes trifosfatos 2,6-diamino -2'C-Me purina. El trifosfato mayor detectado resultó de la conversión de la base 2,6-diamino al análogo de guanina correspondiente.
Cuando el fosforoamidato de 12 (es decir, 8a) se incubó con las células Huh7 el análisis LC/MS reveló inesperadamente altos niveles del correspondiente trifosfato 2,6-diamino-2'-C-Me purina. Además, se detectó también el trifosfato análogo de guanina. (Figura 7).
La Figura 8 muestra cómo el fosforamidato ha modificado inesperadamente la ruta metabólica de 2,6-diamino 2'-C-metil purina, 12, y trifosfato 2,6-diamino-2'-C-Me purina suministrado intracelularmente hasta ahora imposibbe de obtener en concentraciones terapéuticamente relevantes. Adicionalmente, el suministro intracelular de dos trifosfatos activos de HCV (un análogo A y un análogo G) tiene implicaciones en la saturación de la quinasa celular y selección de virus resistente.
La Figura 9 muestra el análisis LC/MS de nucleótidos formados después de 4 h de incubación en células Huh7 con 50 µ? de 8b-arriba. Estos resultados de farmacología celular en células Huh7 para 8b-arriba muestran supresión metabólica con suministro intracelular tanto de un2,6-diamino como un trifosfato G (Figura 10).
Ejemplo 28 Farmacología celular en céluals PBM Los compuestos de prueba se incuban en células PBM en 50 µ? por 4 h a 37°C. Después se elimina el medio que contiene el fármaco y las células PBM se lavan dos veces con PBS para eliminar los fármacos extracelulares. Los fármacos intracelulares se extraen a partir de 10 x 106 células PBM usando 1 mi de 70% metanol enfriado con hielo (que contiene 10 nM del estándar interno ddATP). A continuación de la precipitación, las muestras se mantienen a temperatura ambiente por 15 min seguido por agitación por 30 s, y después se almacenan 12 h a -20°C. El sobrenadante se evapora después hasta sequedad. Las muestras secas se pueden almacenar a -20°C hasta el análisis LC-MS/MS. Antes del análisis, cada muestra se reconstituye en 100 µ? de fase móvil A, y se centrifuga a 20,000 g para eliminar las partículas insolubles.
La separación por gradiente se realiza en una columna Hypersil GOLD (tamaño de partícula de 100 x 1 .0 mm, 3 pm; Thermo Scientific, Waltham, MA, Estados Unidos). La fase móvil A consiste de 2 mM fosfato de amonio y 3 mM hexilamina. El acetonitrilo se aumenta de 1 0 a 80% en 15 min, y se mantiene a 80% por 3 min. El equilibrio a 10% de acetonitrilo dura 15 min. El tiempo total de corrida es de 33 min. El régimen de flujo se mantiene a 50 µ?/min y se usa una inyección de 10 µ?. El automuestreador y el compartimiento de columna se mantienen típicamente a 4.5 y 30°C, respectivamente.
Los primeros 3.5 min del análisis se desvía a los desechos. El espectrómetro de masas se opera en modo de ionización positiva con un voltaje de pulverización de 3.2 kV.
En el caso de DAPD una supresión aún más dramática del metabolismo de la posición 6 se observó por la introducción de fosforamidato. En primer lugar, el examen del metabolismo intracelular de DAPD, que contiene un grupo 6-amino, en 50 µ? por 4 h en células PBM a 37°C resultó en la detección de altos niveles de DXG-TP adicionalmente a DXG y DXG-MP. Se observaron niveles bajos de DAPD, sin embargo, no se detectaron formas fosforiladas de DAPD (Figura 1 1 ).
Por el contrario, la incubación de fosforamidato RS-864, que contiene un grupo 6-amino y un profármaco 5'-MP, en las células PMB resultó en la detección de bajos niveles de DXG, DXG-MP, y DXG-TP (Figura 12). Sin embargo, en contraste con la incubación de DAPD, se detectaron niveles muy altos de DAPD-TP. Adicionalmente, también se observaron bajos niveles de DAPD, DAPD-MP, DAPD-DP. La relación de DXG-TP (6-OH) a DAPD-TP (6-NH2) fue aproximadamente de 2 a 98 como se determinó por análisis LC/MS/MS. Los altos niveles de DAPD-TP intercelular producido tras la incubación del profármaco DAPD-MP indican que el profármaco MP de manera eficiente ha limitado o terminado la conversión del grupo 6-amino a 6-OH.
Ejemplo 29 Ensayo de biodisponibilidad en monos cinomolgus El procedimiento siguiente puede usarse para determinar si los compuestos están biodisponibles. Dentro de 1 semana antes del inicio del estudio, un mono cinomolgus se puede implantar quirúrgicamente con un catéter venoso crónico y puerto de acceso venoso subcutáneo (VAP) para facilitar la recogida de sangre y se puede someter a un examen físico que incluye evaluaciones de hematología y química de suero y el registro del peso corporal. Cada mono (seis en total) recibe aproximadamente 250 pCi de actividad 3H con cada dosis de compuesto activo en un nivel de dosis de 10 mg/kg en una concentración de dosis de 5 mg/ml, ya sea a través de un bolo intravenoso (3 monos, IV) o a través de sonda oral (3 mins, PO). Cada jeringa de dosificación se pesa antes de la dosificación para determinar gravimétricamente la cantidad de formulación administrada. Las muestras de orina se recogen a través de bandeja recolectora en los intervalos designados (aproximadamente 18-0 horas pre-dosis, 0-4, 4-8 y 8-12 horas post-dosificación) y se procesan. Las muestras de sangre se recogen también (pre-dosis, 0.25, 0.5, 1 .2, 3.6, 8, 12 y 24 horas post-dosificación) a través del catéter venoso crónico y VAP o de un vaso periférico si no puede ser posible el procedimiento con el catéter venoso crónico. Las muestras de sangre y orina se analizan para la concentración máxima (Cmax) , tiempo cuando la concentración máxima se alcanza (Tmax), área bajo la curva (AUC), vida media de la concentración de la dosificación (TV), aclaramiento (CL), volumen de estado estacionario y distribución (Vss) y biodisponibilidad (F).
Ejemplo 30 Ensayo de protección celular (CPA) El ensayo se realiza prácticamente como se describe por Baginski, S.G. ; Pevear, D.C. ; Seipel, M. ; Sun, S. C. C; Benetatos, C.A.A; Chunduru, S. K. ; Rice, C. M. y M.S. Collett "Mechanism of action of a pestivirus antiviral compound" PNAS Estados Unidos 2000, 97 (14), 7981 -7986. Células mDBK (ATCC) se siembran en placas de cultivo de 96 cavidades (4,000 células por cavidad) 24 horas antes del uso. Después de la infección con BVDV (cepa ADI, ATCC) a una multiplicidad de infección (MOI) de 0.02 unidades formadoras de placas (PFU) por célula, se añaden diluciones en serie de compuestos de prueba tanto para las células infectadas como no infectadas en una concentración final de 0.5% DMSO en medio de crecimiento. Cada dilución se prueba en cuadruplicado. Las densidades celulares y los inóculos de virus se ajustan para asegurar el crecimiento celular continuo durante todo el experimento y para alcanzar más del 90% de destrucción celular inducida por el virus en los controles no tratados después de cuatro días post-infección. Después de cuatro días, las placas se fijan con 50% de TCA y tiñen con sulforrodamina B. La densidad óptima de las cavidades se lee en un lector de microplacas a 550 nm.
Los valores de concentración eficaz 50% (EC50) se definen como la concentración del compuesto que logra reducción del 50% de efecto citopático del virus.
Ejemplo 31 Ensayo de reducción de placas Para un compuesto la concentración eficaz se determina en placas de 24 cavidades duplicadas mediante ensayos de reducción de placas. Las monocapas de células se infectan con 100 PFU/cavidad de virus. Después, se añaden a las monocapas diluciones en serie de compuestos de prueba en MEM suplementado con 2% suero inactivado y 0.75% de metil celulosa. Los cultivos se incuban más aún a 37°C por 3 días, y después se fijan con 50% etanol y 0.8% de violeta cristal, se lavan y secan al aire. Después, las placas se cuentan para determinar la concentración para obtener 90% de supresión del virus.
Ejemplo 32 Ensayo de reducción del rendimiento Para un compuesto, la concentración para obtener una reducción de 6 log en la carga viral se determina en placas de 24 cavidades en duplicado mediante ensayos de reducción de rendimiento. El ensayo se realiza como se describe por Baginski, S.G. ; Pevear, D.C.; Seipel, M. ; SUN, s.c.c ; Benetatos, C.A. ; Chunduru, S. K. ; Rice, C. M. y M.S. Collett "Mechanism of action of a pestivirus antiviral compound" PNAS Estados Unidos 2000, 97 (14), 7981 -7986, con modificaciones menores.
En resumen, las células MDBK se siembran en placas de 24 cavidades (2 x 105 células por cavidad) 24 horas antes de la infección con BVDV (cepa NADL) a una multiplicidad de infección (MOI) de 0.1 PFU por célula. Las diluciones en serie de los compuestos de prueba se añaden a las células en una concentración final de 0.5% de DMSO en medio de crecimiento. Cada dilución se prueba por triplicado. Después de tres días, los cultivos de células (monocapas de células y sobrenadantes) se lisan mediante tres ciclos de congelación-descongelación, y la producción de virus se cuantifica por ensayo de placas. En resumen, las células MDBK se siembran en placas de 6 cavidades (5 x 105 células por cavidad) 24 h antes del uso. Las células se inoculan con 0.2 mi de Usados de prueba por 1 hora, se lavan y cubren con 0.5% agarosa en medio de crecimiento. Después de 3 días, las monocapas de células se fijan con 3.5% de formaldehído y se tiñen con 1 % de violeta cristal (p/v en 50% etanol) para visualizar las placas. Las placas se cuentan para determinar la concentración para obtener una reducción de 6 log en la carga viral.
Ejemplo 33 Diagnóstico de la infección por Norovirus Uno puede diagnosticar una infección por norovirus medíante la detección de RNA del virus en las heces de las personas afectadas, usando la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR). El virus puede identificarse a partir de muestras de heces tomadas dentro de 48 a 72 horas después del inicio de los síntomas, aunque uno puede obtener resultados satisfactorios usando RT-PCR en muestras tomadas mientras que sean 7 días después del inicio de los síntomas. Otros métodos de diagnóstico incluyen ensayos de microscopía electrónica y serológicos para un aumento en el título en sueros apareados recogidos al menos separados tres semanas. Están disponibles además inmunoensayos ligados a enzimas comerciales, pero estos tienden a tener relativamente baja sensibilidad, limitando su uso al diagnóstico de la etiología de los brotes. El diagnóstico clínico de la infección por norovirus se usa frecuentemente, en particular cuando otros agentes causantes de gastroenteritis se han descartado.
Ejemplo 34 Actividad anti-viral in vitro La actividad anti-viral in vitro puede evaluarse en las líneas celulares siguientes: La cepa Norwalk G-l (Chang, K.O, y otros (2006) Virology 353:463-473), el replicó de la cepa Gl 1-4, así como otros replicones de Norovirus pueden usarse en ensayos para determinar la actividad antiviral in vitro de los compuestos descritos en la presente descripción, u otros compuestos o bibliotecas de compuestos. En algunas modalidades, los sistemas de replicones son subgenómicos y permiten por lo tanto la evaluación de inhibidores de moléculas pequeñas de proteínas no estructurales. Esto puede proporcionar los mismos beneficios al descubrimiento de fármacos de Norovirus que los replicones de Hepatitis C contribuyen al descubrimiento de agentes terapéuticos útiles para el tratamiento de esos virus. (Stuyver, L.J . , y otros (2006) Antimicrob. Agents Chemother. 47:244-254). Tanto replicones de Norovirus como replicones de Hepatitis C requieren para que sean funcionales helicasa, proteasa y polimerasa viral para que ocurra la replicación del replicón. Se cree que los compuestos descritos en la presente descripción inhiben la polimerasa viral y/o helicasa viral.
El ensayo de infectividad de cultivo celular in vitro se reportó usando inóculos de genogrupo I y II de Norovirus (Straub, T. . y otros (2007) Emerg. Infect. Dis. 13(3):396-403) puede usarse además. Este ensayo se realiza en un biorreactor de pared rotatoria utilizando células epiteliales intestinales pequeñas en perlas microportadoras. El ensayo de infectividad puede usare para clasificar compuestos para su capacidad para inhibir el virus deseado.
Si bien la especificación anterior ilustra los principios de la presente invención, con ejemplos proporcionados con fines ilustrativos, se entenderá que la práctica de la invención abarca todas las variaciones, adaptaciones y/o modificaciones usuales, que están incluidas en el alcance de las siguientes reivindicaciones y sus equivalentes.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES 1 . Un com puesto de la Fórmula (A) o un compuesto de la Fórmula (B) : (A) (B) o una sal farmacéuticamente aceptable o profármaco del mismo, en donde: cuando hay quiralidad en el centro de fósforo este puede ser completamente o parcialmente Rp o Sp o cualquier mezcla de éstos R es OH o F; Y es O o S; R24 es seleccionado de OR15, alcoholes grasos, (en donde R1 5, R17 y R18 son como los defin idos más abajo) ; R2 y R3, cuando son adm inistrados in vivo, son capaces proporcionar el monofosfato o trimonofosfato de nucleósido, es decir ya sea parcialmente o completamente resistente a la deaminación de 6-NH2 en un sistema biológico. R2 y R3 representativos son independientemente seleccionados de: (a) OR15, donde R15 es seleccionado de H, Li, Na, K, fenilo y piridinilo; el fenilo y piridinilo son sustituidos con uno a tres sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de (CH2)0-6CO2R16 y (CH2)o-6CON(R16)2; R16 es independientemente H, C1 -20 alquilo, la cadena de carbono derivada de un alcohol graso o C 1 -20 alquilo sustituido con un alquilo inferior, alcoxi, di(alquilo inferior)-amino, fluoro, C3-10 cicloalquilo, cicloalquil alquilo, cicloheteroalquilo, arilo, heteroarilo, arilo sustituido, o heteroarilo sustituido; en donde los sustituyentes son d-5 alquilo, o C1 -5 alquilo sustituido con un alquilo inferior, alcoxi, di(alquilo inferior)-amino, fluoro, C3-i o cicloalquilo, o cicloalquilo; (c) el éster de un L-aminoácido. donde R1 7 está restringido a los L-aminoácidos naturales, y R 8 es H , C i -20 alquilo, la cadena de carbono derivada de un alcohol graso o Ci -20 alquilo sustituido con un alquilo inferior, alcoxi, di(alquilo inferior)-amino, fluoro, C3-10 cicloalquilo, cicloalquil alquilo, cicloheteroalquilo, arilo, heteroarilo, arilo sustituido, o heteroarilo sustituido; en donde los sustituyentes son C1.5 alquilo, o C1-5 alquilo sustituido con un alquilo inferior, alcoxi, di(alquilo inferior)-amino, fluoro, C3-10 cicloalquilo, o cicloalquilo; (d) R2 y R3 pueden unirse para formar un anillo donde R19 es H, C1-20 alquilo, C1-20 alquenilo, la cadena de carbono derivada de un alcohol graso o C1-20 alquilo sustituido con un alquilo inferior, alcoxi, di(alquilo inferior)-amino, fluoro, C3-10 cicloalquilo, cicloalquil alquilo, cicloheteroalquilo, arilo, heteroarilo, arilo sustituido, o heteroarilo sustituido; en donde los sustituyentes son C1-5 alquilo, o C1-5 alquilo sustituido con un alquilo inferior, alcoxi, di(alquilo inferior)-amino, fluoro, C3-10 cicloalquilo, o cicloalquilo; (e) R2 y R3 pueden unirse para formar un anillo seleccionado de de donde R20 es O o H y R2 es seleccionado de H, Ci-2o alquilo, C1-20 alquenilo, la cadena de carbono derivada de un ácido graso y C1.20 alquilo sustituido con un alquilo inferior, alcoxi, di(alquilo inferior)-amino, fluoro, C3-10 cicloalquilo, cicloalquil alquilo, cicloheteroalquilo, arilo, heteroarilo, arilo sustituido, o heteroarilo sustituido; en donde los sustituyentes son Ci-5 alquilo, o C1-5 alquilo sustituido con un alquilo inferior, alcoxi, di(alquilo inferior)-amino, fluoro, C3-10 cicloalquilo, o cicloalquilo. 2. Los compuestos de la reivindicación 1, en donde los compuestos están en la configuración ß-D. 3. Los compuestos de la reivindicación 1, en donde los compuestos se convierten en un sistema biológico con la mezcla C o D de trifosfatos de 6-NH2 y 6-OH purina. 4. Los compuestos de la reivindicación 1, en donde los compuestos se convierten en un sistema biológico con concentraciones terapéuticamente relevantes de trifosfato 2,6-diamino 2'-C-metil purina, E o trifosfato 2,6-diamino 2'-C-met¡l 2'-deoxi 2'-fluoropurina, F. 5. Un compuesto de la fórmula: en donde R1 es como se define en la reivindicación 1, y R4 es Ci-e alquilo o una cadena de carbono derivada de un alcohol graso. 6. El compuesto de la reivindicación 5, en donde los valores de R\ R4 y R5 se seleccionan como sigue: 7. Un compuesto de la fórmula: en donde R1 es como se define en la reivindicación 1 , R6 es H o un metal alcalino, y R7 una cadena de carbono derivada de un alcohol graso. 8. Un compuesto de la reivindicación 7, en donde los valores para R1 , R6 y R7 son los proporcionados más abajo: 9. Un compuesto de la fórmula: en donde R es como se define en la reivindicación 1 , y R8 es un radical de ácido graso. 10. Un compuesto de la reivindicación 9, en donde los valores para R y R8 son los proporcionados más abajo: Un compuesto de las fórmulas en donde R1 es como se define en la reivindicación 1, y R9 es O o NH, y R10 es un Ci-6 alquilo o una cadena de carbono derivada de un alcohol graso. 12. Un compuesto de la reivindicación 11, en donde los valores para R1, R9 y R10 son los proporcionados más abajo: Un compuesto que tiene las fórmulas en donde R1 es como se define en la reivindicación 1 , y R1 1 es un C 1 -6 alquilo o una cadena de carbono derivada de un alcohol graso. 14. Un compuesto de la reivindicación 13, en donde los valores de R1 y R1 1 son los proporcionados más abajo: Un compuesto de las fórmulas en donde R1 es como se define en la reivindicación 1 , y R12 y R13 son, independientemente, O o NH. 16. Un compuesto de la reivindicación 15, en donde los valores de R1 , R 2 y R13 son los proporcionados más abajo: compuesto que tiene la fórmula en donde R1 es como se define en la reivindicación 1 , R4 es C1 -6 alquilo o una cadena de carbono derivada de un alcohol graso, y R12 es O o NH. Un compuesto de la reivindicación 17, en donde los valores de R1 , R4 y R12 son los proporcionados más abajo: Un compuesto de la fórmula en donde R14 = y R1 1 , R7 y R13 son como los definidos anteriormente. 20. Un procedimiento para preparar compuestos de la reivindicación 1 en donde el enlace fósforo-5'-oxígeno se forma por reacción con un reactivo de las fórmulas generales G o H: en donde: la quiralidad en el centro de fósforo de las fórmulas G o H puede ser completamente o parcialmente Rp o Sp o cualquier mezcla de éstos, Y, R2 y R3 son como los definidos anteriormente, y R22 es, independiente, entre, H, C 1 -20 alquilo, C F3 , arilo, tal como fenilo, heteroarilo, tal como, piridinilo, arilo sustituido, o hetroarilo sustituido, o C 1 -20 alquilo sustituido con un alquilo inferior, alcoxi, di(alquilo inferior)-amino, cloro, fluoro, arilo, tal como fenilo, heteroarilo, tal como, piridinilo, arilo sustituido, o heteroarilo sustituido. 21 . El proceso de la reivindicación 20, en donde, donde R2 y/o R3 de fórmulas G o H contienen un centro quiral, el proceso implica además la etapa de separación de los diastereómeros de fósforo por cristalización de la mezcla diastereomérica de G o H. 22. El proceso de la reivindicación 20, en donde, donde R2 y/o R3 de fórmulas G o H contienen un centro quiral, el proceso implica además la etapa de separación de los diastereómeros de fósforo por la reacción de los compuestos de fórmula I con la mezcla diastereomérica de fórmulas G o H, donde R22 es como se definió anteriormente, y R23 es seleccionado de H, Li, Na, K, NH4 y sal bis con Ca, Mg . 23. El proceso de la reivindicación 20, en donde, donde R2 y/o R3 de fórmulas G o H contienen un centro quiral, el proceso implica además la etapa de invertir el estereocentro de fósforo por la reacción de los compuestos de fórmula I con un diastereómero único o enriquecido de fórmulas G o H. (I) donde R22 es como se definió anteriormente, y R23 es seleccionado de H, Li, Na, K, NH4, y sal bis con Ca o Mg. 24. El procedimiento para preparar un análogo de fósforo de un alcohol en donde el enlace fósforo-oxigeno se forma por la reacción con un reactivo de fórmulas generales G o H con un 1 o , 2° o 3o alcohol o 1 o, 2o o 3o alcóxido. (G) (H) en donde: la quiralidad en el centro de fósforo de fórmulas G o H puede ser completamente o parcialmente R o Sp o cualquier mezcla de éstas, Y, R2 y R3 son como los definidos anteriormente, y R22 es, independientemente, H , C 1.20 a lquilo, CF3, arilo, tal como fenilo, heteroarilo, tal como piridinilo, arilo sustituido, o heteroarilo, tal como, piridinilo, arilo sustituido, o heteroarilo sustituido, o C 1.20 alquilo sustitu ido con un alquilo inferior, alcoxi, di(alquilo inferior)-amino, cloro, fluoro, arilo, tal como fenilo , heteroarilo, tal como, piridinilo, arilo sustituido, o heteroarilo sustituido. 25. El proceso de la reivindicación 24, en donde, donde R2 y/o R3 de fórmulas G o H contienen un centro quiral , el proceso implica además la etapa de separación de los diastereomeros de fósforo por cristalización de la mezcla diastereomérica de G o H . 26. El proceso de la reivindicación 24, en donde, donde R2 y/o R3 de fórmulas G o H contienen u n centro quiral , el proceso implica además la etapa de separación de los diastereomeros de fósforo por la reacción de los compuestos de fórm ula I con la mezla d iastereomérica de fórmulas G o H, (I) donde R22 es como se definió anteriormente, y R23 es seleccionado de H, Li, Na, K, N H4 y sal bis con Ca, Mg. 27. El proceso de la reivindicación 24, en donde, donde R2 y/o R3 de fórmulas G o H contienen un centro quiral, el proceso implica además la etapa de invertir el estereocentro de fósforo por la reacción de los compuestos de fórmula I con un diastereómero único o enriquecido de fórmulas G o H . (I) donde R22 es como se definió anteriormente, y R23 es seleccionado de H, Li, Na, K, NH4 y sal bis con Ca, Mg. 28. Un proceso para la fabricación de compuestos de Fórmulas A o B, que comprende !a reacción de 2,6-diaminopurina o una purina que se puede convertir a una 2,6-diaminopurina con 1 '-azúcar sulfonato J: donde Pr es un grupo protector. 29. Un compuesto J en donde Pr es un grupo protector. 30. El uso de un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 -1 9 en la preparación de un medicamento para tratar una infección por Flaviridae, prevenir una infección por Flaviridae, o reducir la actividad biológica de una infección con la familia de virus Flaviridae. 31 . El uso de la reivindicación 30, en donde el virus se selecciona del grupo que consiste de HCV, fiebre amarilla, dengue, Chikungunya y virus del Nilo Occidental. 32. El uso de la reivindicación 30, en donde la infección que se trata es HCV. 33. Un método para tratar un huésped infectado con la familia de virus Flaviviridae que incluyen HCV, Fiebre amarilla, Dengue, Chikungunya y virus del Nilo Occidental, que comprende administrar una cantidad eficaz de un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 a un paciente que necesita tratamiento. 34. Un método para prevenir una infección de una familia de virus Flaviviridae que incluyen HCV, Fiebre amarilla, Dengue, Chikungunya y virus del Nilo Occidental, que comprende administrar una cantidad profilácticamente eficaz de un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 9 a un paciente que necesita profilaxis. 35. Un método para reducir la actividad biológica de una infección con la familia de virus Flaviviridae, que incluyen HCV, Fiebre amarilla, Dengue, Chikungunya y virus del Nilo Occidental en un huésped, que comprende administrar una cantidad eficaz de un compuesto de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 19 a un paciente que necesita tratamiento. 36. Un método para tratar un huésped infectado con uno de familia de virus Flaviviridae que incluyen HCV, Fiebre amarilla, Dengue, Chikungunya y virus del Nilo Occidental que incluye administrar una cantidad eficaz de un compuesto de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 19 en un portador farmacéuticamente aceptable en combinación con otro agente anti-virus Flaviviridae. 37. Un método para prevenir una infección de una familia de virus Flaviviridae que incluyen HCV, Fiebre amarilla, Dengue, Chikungunya y virus del Nilo Occidental, que comprende administrar una cantidad profilácticamente eficaz de un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en un portador farmacéuticamente aceptable, en combinación con otro agente anti-virus Flaviviridae a un paciente que necesita profilaxis. 38. La composición farmacéutica que comprende un compuesto de las reivindicaciones 1 a 19, y un portador farmacéuticamente aceptable. 39. Un método para tratar un huésped infectado con Norovirus o Saporovirus, que comprende administrar una cantidad eficaz de un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 9 a un paciente que necesita tratamiento. 40. Un método para prevenir una infección por Norovirus o Saporovirus, que comprende administrar una cantidad profilácticamente eficaz de un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 a un paciente que necesita profilaxis. 41 . Un método para reducir la actividad biológica de una infección por Norovirus o Saporovirus en un huésped, que comprende administrar una cantidad eficaz de un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 a un paciente que necesita tratamiento. 42. Un método para tratar un huésped infectado con Norovirus o Saporovirus que incluye administrar una cantidad eficaz de un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 9 en un portador farmacéuticamente aceptable en combinación con otro agente anti-Norovirus o anti-Saporovirus. 43. Un método para prevenir una infección por Norovirus o Saporovirus, que comprende administrar una cantidad profilácticamente eficaz de un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 en un portador farmacéuticamente aceptable, en combinación con otro agente anti-Norovirus o anti-Saporovirus, a un paciente que necesita profilaxis. 44. La composición farmacéutica de las reivindicaciones 1 a 19, que comprende además un segundo agente antiviral. 45. La composición farmacéutica de la reivindicación 40, en donde el segundo agente antiviral se selecciona del grupo que consiste de un interferón, ribavirina, un inhibidor de la proteasa NS3, un inhibidor de NS5A, un inhibidor no nucleósido de polimerasa, un inhibidor de helicasa, un inhibidor de polimerasa, un análogo de nucleótido o nucleósido, un inhibidor de la traducción dependiente de IRES, y combinaciones de éstos.
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