KR20140033446A

KR20140033446A - 바이러스 감염 치료용 퓨린 모노포스페이트 프로드럭

Info

Publication number: KR20140033446A
Application number: KR1020137033848A
Authority: KR
Inventors: 레이몬드 에프. 쉬나지; 조종현; 쥬롱후; 장홍왕; 유고 프라데르; 스티븐 제이. 코츠
Original assignee: 알에프에스 파마 엘엘씨; 에모리 유니버시티
Priority date: 2011-05-19
Filing date: 2012-05-16
Publication date: 2014-03-18
Also published as: EP2710023A2; RU2013125713A; CN103687866A; EP2710023A4; BR112013029761A2; CA2836579A1; WO2012158811A3; MX2013013570A; US20140212382A1; WO2012158811A2

Abstract

본 발명은 뉴클레오시드 유사체 모노포스페이트 프로드럭을 이용하여 ㅂkd이러스 감염, 보다 상세하게는 인간 환자 또는 다른 동물 숙주에서의 HCV, 노로바이러스, 사포바이러스, 뎅기열 바이러스, 치쿤구니야 바이러스 및 황열을 치료 또는 방지하는 화합물, 조성물 및 방법에 관한 것이다. 상기 화합물은 2,6-디아미노 2-C-메틸 퓨린 뉴클레오시드 모노포스페이트 프로드럭 및 변형된 프로드럭 유사체, 및 약학적으로 허용가능한 염, 프로드럭, 및 다른 그의 유도체에 관한 것이다. 특히, 상기 화합물은 HCV, 노로바이러스, 사포바이러스, 뎅기열 바이러스, 치쿤구니야 바이러스 및 황열에 대하여 효능 있는 항바이러스 활성을 보여준다. 본 발명은 2,6-디아미노 2'-C-메틸 퓨린의 물질 대사 경로를 변형하고 뉴클레오티드 트리포스페이트(들)를 지금까지 얻지 못했던 치료학적으로 연관된 농도로 폴리머라제로 전달하는 법을 교시한다.

Description

바이러스 감염 치료용 퓨린 모노포스페이트 프로드럭{Purine Monophosphate Prodrugs for Treatment of Viral Infections}

본원 발명은 뉴클레오티드 유사체((nucleotide analogs)를 이용한 바이러스성 감염 치료 또는 예방용 화합물, 방법 및 조성물에 관한 것이다. 더욱 자세하게는, 본원 발명은 2,6-디아미노 2'-C-Me 퓨린 뉴클레오시드 모노포스페이트 프로드럭(2,6-diamino 2'-C-Me purine nucleoside monophosphate prodrugs) 및 변형된 전구약 유사체, 약학적으로 허용가능한 염, 또는 그의 다른 유도체 및 구체적으로, 1) C형 간염 바이러스(hepatis C virus(HCV)), 웨스트 나일 바이러스(West Nile virus), 뎅기열 바이러스(Dengue virus), 치쿤구니야 바이러스(Chikungunya virus) 및 황열(Yellow fever)을 포함하는 플라비비리다에 과(Flaviviridae family); 및 2) 노로바이러스(Norovirus) 및 사포바이러스(Saporovirus)를 포함하는 칼리시바이러스과 감염(Caliciviridae infection) 치료에 있어서 그의 용도에 관한 것이다. 본원 발명은 2,6-디아미노 2'-C-메틸 퓨린의 대사 경로를 변형하고 뉴클레오티드 트리포스페이트(nucleotide triphosphates)를 이전에는 가능하지 않았던 치료학적으로-적절한 농도로 폴리머라제(polymerases)로 전달하는 방법에 관한 것이다.

동일한 계통으로서의 뉴클레오시드 유사체는 잘 정립된 규제 역사를 가지는데, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), B형 간염 바이러스(HBV), 또는 C형 간염 바이러스(HCV)를 치료하기 위해 현재 10개가 넘는 뉴클레오시드 유사체가 미국 식품 안전청(US FDA)에 의해 승인되었다. 항바이러스성 치료법의 발전에 있어서 시험대는 숙주 세포를 손상시키지 않으면서 바이러스의 복제를 막는 것이다. 일반적으로 항바이러스 활성을 나타내기 위하여 뉴클레오시드 유사체는 숙주의 인산화효소(kinase)의 대사 작용으로 상응하는 트리포스페이트 형태(NTP)로 전환되어야 한다. 트리포스페이트 형태에서, 핵산 중합효소 저해제(nucleotide polymerase inhibitors)들은 RNA나 DNA 사슬의 연장을 위하여 자연적으로 생성되는 5개의 뉴클레오시드 5'-트리포스페이트(nucleoside 5'-triphosphate. NTP), 다시 말해서, CTP, UTP, TTP, ATP, 또는 GTP 중의 하나와 경쟁한다. 이를 통해 뉴클레오시드 유사체는 서열 종결자(chain terminator) 또는 지연성 서열 종결자(delayed chain terminator)로 작용하여 바이러스성 복제를 저해한다.

C형 간염 바이러스(Hepatitis C virus(HCV))는 전 세계적으로 1억 8천만 명 이상의 사람들을 감염시켰다. 매년 3천만 내지 4천만 명의 사람들이 새롭게 감염되고, 그 중에서 70%가 만성 간염으로 진행되는 것으로 추정되고 있다. HCV는 전체 간암 케이스의 50-76%에 대하여 원인이 되고 있고, 선진국에서 전체 간 이식의 3분의 2를 차지한다. 기존 치료법 [pegylated interferon alfa plus ribavirin(뉴클레오사이드 유사체)]은 오직 50-60%의 환자에게만 효과적이고 중요한 부작용과 관련 있다. 그러므로 새로운 HCV 약물에 대한 긴급한 요구가 있다.

C형 간염 바이러스 게놈은 뉴클레오시드 및 지질 외피로 둘러싸인 양성-가닥 RNA로 구성되어 있고 9.6kb 리보뉴클레오티드로 이루어져 있으며, 약 3000개의 아미노산의 거대한 폴리펩티드를 암호화한다(Dymock et al. Antiviral Chemistry & Chemotherapy 2000, 11, 79). 성숙(maturation)함에 따라서, 이 폴리펩티드는 최소한 10개의 단백질로 잘린다. 상기 단백질 중의 하나인, NS5B는, 폴리머라제 활성을 가지고 주형(template)으로 제공되는 단일-가닥 바이러스 RNA 게놈으로부터 이중-가닥 RNA의 합성에 관여한다. 선택적으로 HCV 복제를 저해하는 신규한 항바이러스 전략의 발견은 HCV의 증식을 위한 편리한 세포 배양 모델의 부족으로 오랫동안 저해되었다. 이러한 장애물은 우선 1999년 HCV 리플리콘 시스템(Bartenschlager, R., Nat. Rev . Drug Discov . 2002, 1, 911-916 and Bartenschlager, R., J. Hepatol . 2005, 43, 210-216)의 확립 및 2005년 탄탄한 HCV 세포 배양 모델(Wakita, T., et al., Nat . Med . 2005, 11, 791-6; Zhong, J., et al., Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 2005, 102, 9294-9; Lindenbach, B.D., et al., Science 2005, 309, 623-6)의 발달에 따라 극복되었다.

HCV 복제는 NS5B 단백질의 경쟁적 저해를 통하여 NS5B의 폴리머라제 활성음 조작함으로써 예방할 수 있을지도 모른다. 다른 방법으로는 사슬-종결 뉴클레오시드 유사체를 성장하는 RNA 가닥으로 삽입하는 방법이 있다. 최근에, 몇몇 특허 출원들(WO 99/43691, WO 01/32153, WO 01160315, WO 01179246, WO 01/90121, WO 01/92282, WO 02/48165, WO 02/18404, WO 02/094289, WO 02/057287, WO 02/100415(A2), US 06/040890, WO 02/057425, EP 1674104(Al), EP 1706405(Al), US 06/199783, WO 02/32920, US 04/6784166, WO 05/000864, WO 05/021568을 포함하는) 은 항-HCV 물질로서 뉴클레오시드 유사체에 대하여 기술하고 있다.

치쿤구니야 바이러스(Chikungunya virus(CHIKV))는 바이러스를 가지는 이집트 얼룩 모기(Aedes Aegypti mosquitoes)에서 사람으로 전달되는 곤충 유래 바이러스이다(Lahariya C, Pradhan SK. Emergence of chikungunya virus in Indian subcontinent after 32 years: a review. J Vect Borne Dis. 2006;43(4):151-60). 치쿤구니야 바이러스(Chikungunya virus(CHIKV))는 토가바이러스과(Togaviridae) 알파바이러스속(Alphavirus)에 속한다. CHIKV는 1953년 탄자니아의 발열환자 피에서 처음으로 분리되었고, 그때부터 서, 중앙, 및 남 아프리카에서 반복적으로 확인되었으며, 그때부터 이 지역의 다양한 전염병의 원인으로서 지목되어왔다. 최근에 CHIKV가 심각한 질병과 연관되어 있다는 것이 알려졌다. CHIKV는 뎅기열과 비슷한 증상의 병을 일으킨다. CHIKV 감염증은 2 내지 5일 정도만 지속되는 급성 발열기와 뒤따르는 손발 관절에 영향을 미치는 관절통(관절 통증), 근육통, 두통, 피로, 메스꺼움, 구토 및 발진이 포함될 수 있는 만성기로 그 증상이 나타난다. CHIKV 감염에서의 관절통은 몇 주, 몇 달 또는 몇몇 케이스에서는 몇 년간 지속되었다. 잠복기(감염에서부터 발병까지의 시간)는 2-12일 일 수 있으나, 일반적으로는 3-7일이다. 급성 치쿤구니야 열병은 일반적으로 며칠에서 2주일 정도 지속하나, 어떤 환자들은 몇 주간의 지속적인 피로감을 호소하기도 하였다. 추가로, 몇몇 환자들에서는 일상생활이 불가능할 정도의 관절통 또는 관절염이 몇 주에서 몇 달간 지속한 것으로 보고되었다. CHIKV 감염과 연관하여 사망이나, 신경 감염 또는 출혈성 감염이 논문데이터 베이스 상 확정적으로 기록된 적은 없다. 현재 치쿤구니야 바이러스 감염을 치료할 수 있는 방법은 없으며, 감염을 예방할 수 있는 승인받은 백신도 존재하지 않는다.

노로바이러스(Norovirus)는 외피비보유 양성 가닥 RNA 칼리시바이러스 과(non-enveloped positive strandRNA family Caliciviridae)이다. 칼리시바이러스 과의 다른 세 가지 종은 라고바이러스(Lagovirus), 베시바이러스(Vesivirus), 및 사포바이러스(Sapovirus)이다. 사포바이러스는 숙주로서 인간을 이용하는 노로바이러스 외 상기 종의 유일한 구성원이다. 노로바이러스 게놈은 약 7.56kb에 이르는 3개의 오픈리딩프레임(open reading frames(ORFs))을 포함한다. 첫 번째 ORF는 헬리카제(helicase), 프로테아제(protease), 및 RNA 의존성 RNA 중합효소(RNA dependent RNA polymerase(RDRP))를 포함하는 바이러스의 복제에 필요한 모든 비구조 단백질(nonstructural proteins)을 암호화한다. 나머지 2개의 ORF는 캡시드 단백질(Capsid proteins)을 암호화 한다(Jiang, X.(1993) Virology 195(1):51- 61). 노로바이러스의 수많은 균주들은 I, IV, 및 V가 인간을 감염시키는 5가지 유전자 그룹으로 분류되었고(Zheng, D.P., et al.(2006) Virology 346(2):312- 323), CDC에 의하면 미국에서 매년 식품매개 질병의 40%에 대응하는, 약 2천 3백만 건의 위장염을 초래하는 것으로 추측되고 있다(Mead P. S.(1999) Emerg. Infect. Dis. 5(5):607-625).

공통적인 증상은 구토, 설사 및 장 경련이다. 구토는 어린이들에게 가장 흔한 [0018] 증상인 반면, 설사는 감염된 어른들에게 더 공통적이다. 탈수증은 중요한 관심사이다. 이 바이러스로 인하여 미국에서는 매년 300명 환자의 인명손실이 있고, 이러한 사망은 대개 약한 면역 시스템을 가진 환자들에게 발생한다(Centers for Disease Control and Prevention. "Norwalk- like viruses:" public health consequences and outbreak management. MMWR 2001;50(No. RR-9):3). 완전 감염에 이르는 잠복기는 대개 24시간 내지 48시간이고 약 30%의 감염 환자는 아무 증상도 보이지 않는다. 일반적으로 증상은 24시간 내지 60시간동안 지속된다(Adler, J. L. and Zickl, R., J.(1969) Infect. Dis. 119:668-673). 바이러스 발산(Viral shedding)은 감염 후 2주까지 지속할 수 있지만, 상기 바이러스가 전염성인지 여부는 명확하지 않다.

노로바이러스는 오염된 음식 또는 물, 개인 간의 접촉, 구토 또는 대변 샘플의 에어로졸을 통하여 분변-경구 경로를 통하여 우선적으로 전달된다. 대변 샘플에서 바이러스 역가는 mL당 10⁶ 내지 10⁷ 입자에 도달할 수 있고, 입자들은 0℃(32°F) 내지 600℃(140°F) 의 온도에서 안정하다(Duizer, E. et al.,(2004) Appl. Environ. Microbiol. 70(8); 4538-4543). 상기 바이러스는 높은 전염성을 가지고, 다양한 근원은 전염병이 10 내지 100 바이러스 입자만을 가지는 예방접종을 필요로 할지도 모른다는 것을 제시한다(Centers for Disease Control and Prevention. "Norwalk-like viruses:" public health consequences and outbreak management. MMR 2001; 50(No. RR-9):3- 6). 이것은 학교, 양로원, 유람선, 병원 또는 사람이 모이는 다른 장소에서 전염병을 유발한다.

노로바이러스는 노워크-유사 바이러스(Norwalk-like viruses)라고 불리며, 1968년 오하이오주 노워크에 있는 학교에서 발생한 사건으로부터 유래하였다. 상기 노워크 질병의 원인이 되는 바이러스 입자는 1972년 세 가지 유형의 자원봉사자들을 통하여 직장 도말 여과(rectal swab filtrates)의 패시지에 따른 면역전자현미경관찰법(immune electron microscopy)에 의하여 확인되었다(Kapikian, A.Z. et al.(1972) J. Virol. 10:1075-1081). 그 후 여러 해 동안, 상기 바이러스는 그것의 전자 현미경 사진 때문에 작고 둥근 모양을 가진 바이러스, 칼리시바이러스 과에 속하기 때문에 칼리시바이러스(calicivirus), 및/ 또는 아마도 공통적으로 최초로 분리된 이후로 노워크-유사 바이러스로 불렸다. 상기 바이러스의 공통적인 이름은 겨울 구토 바이러스(winter vomiting virus), 위장염, 식중독, 및 바이러스성 장염을 포함한다. 감염의 결과는 일반적으로 생명에 위협을 가져오지는 않는 반면, 기능 사용 및 생산성 손실의 비용이 크고, 결과적으로, 인간에게 있어서 노로바이러스 감염의 치료법은 매우 가치 있는 일이다.

아직까지 노로바이러스 감염을 위해 승인받은 약학적 치료법은 없으며(http://www.cdc.gov/ncidod/dvrd/revb/gastro/norovirus-qa.htm), 이것은 아마도 적어도 해당 분야에서 세포 배양 시스템이 부족하기 때문이었을 것이다. 최근에, 원본 노워크 G-I 균주에 대한 리플리콘 시스템(replicon system)이 개발되었다(Chang, K. O., et al.(2006) Virology 353:463-473). 노로바이러스 리플리콘 및 C형 간염 리플리콘 모두 존재하는 리플리콘의 복제가 실용적으로 일어나기 위하여 바이러스 헬리카제, 프로테아제, 및 폴리머라제를 필요로 한다. 가장 최근, 노로바이러스 유전자 그룹 I 및 II 접종원을 이용한 시험관 세포 배양 전염성 분석이 보고되었다(Straub, T. M. et al.(2007) Emerg. Infect. Dis. 13(3):396-403). 이러한 분석은 마이크로캐리어 비드(microcarrier beads) 상에서 소장 상피 세포를 이용하여 로테이팅-월 바이오리액터(rotating- wall bioreactor)에서 수행했었는데, 적어도 처음에는 이 시스템에서 의미 있는 숫자의 화합물들을 스크리닝하는 것이 어려운 것처럼 보였다. 결국, 전염성 분석은 저해제를 스크리닝하는데 유용하다는 것이 증명되었다. 리고사이트 제약회사(Ligocyte Pharmaceuticals, Inc., http://www.ligocyie.com/) 같은, 다른 그룹은 노로바이러스에 대한 백신을 개발하는데 초점을 맞추었지만, 이러한 노력은 아직 성공적이지 않고 낮은 리플리카아제 정확도가 진화적인 이익을 가져오는 바이러스 시스템 하에서 종종 상기와 같은 경우를 증명하는 것이 어려울 수 있다.

웨스트 나일 바이러스(WNV)는 플라비비리다에 과(Flaviviridae family)이고 [0030] 대부분 모기-매개성 질병이다. 그것은 1937년 우간다의 서쪽 나일 지역에서 최초로 발견되었다. 질병관리예방본부의 보고서의 의하면, WNV은 아프리카, 중동, 유럽, 오세아니아, 중서아시아, 북아메리카에서 발견되었다. 북아메리카에서 그것의 첫 번째 출현은 1999년 뉴욕 메트로폴리탄 지역에서 시작되었다. 그것은 북아메리카에서 환경 위생에 위협을 가하는, 보통 여름에 시작되어서 가을까지 계속되는 계절성 유행병이다. 그것의 자연적인 주기는 새-모기-새 및 포유동물이다. 모기, 특히 큘렉스 피피엔스(Culex pipiens) 종은 감염된 새로부터 피를 빨 때 감염된다. 감염된 모기는 그들이 물때, 다른 새 및 인간을 포함하는 포유동물들에게 WNV를 퍼뜨린다. 인간 및 말에서, 치명적인 뇌염은 WNV 감염의 가장 심각한 징후이다. WNV는 몇몇 감염된 새에서 사망을 초래할 수 있다. WNV 감염을 치료할 수 있는 특별한 치료법은 없다. 가벼운 증상에 있어서, 비록 건강한 사람이라도 몇 주 동안 아프기는 하지만, 자체적으로 치료할 수 있는 열과 재채기 같은 증상을 경험한다. 조금 더 심각한 상황에서는, 사람들은 대개 도움이 되는 치료를 받을 수 있는 병원으로 가는 것을 필요로 하게 된다.

뎅기열 바이러스 감염 또한 플라비비리다에 과(Flaviviridae family)이고, 싱가포르에서 가장 영향력이 큰 절족동물매개성 감염(arthropod- borne infection)이다(Epidemiol News Bull 2006, 32,62- 6). 전세계적으로 5천만 내지 1억 건의 뎅기열(DF) 및 평균적인 치사율이 5%에 이르는 매년 수만 건의 뎅기출혈열(DHF)이 발생하는 것으로 추정되고 있다. 많은 환자들은 최소한 또는 후유증 없이 뎅기열 바이러스 감염으로부터 회복된다. 뎅기열 바이러스 감염은 보통 증상이 없지만, 대표적인 뎅기열, 뎅기 출혈열 또는 뎅기쇼크증후군을 보인다. 외래환자조차도, 적절한 수분을 유지하는 것이 매우 필요하다. 뎅기열 바이러스 감염은 정맥으로 주입하는 액체 대안 요법에 의하여 효과적으로 처리될 수 있고, 만약 조기에 진단한다면, 치사율을 1% 미만으로 유지할 수 있다. 통증과 열을 견디기 위하여, 뎅기열 바이러스에 감염된 것으로 의심되는 환자들은 아세트아미노펜의 준비가 필요하게 된다. 아스피린 및 비-스테로이드 항-염증 약물치료는 몇몇 뎅기열 바이러스 감염과 관련한 출혈 경향(bleeding tendency)을 약화시킬 수 있다. 그러나, 이전에 묘사되었던 뎅기열 바이러스 감염의 몇몇 징후는 간 부전(Dig Dis Sci 2005, 50, 1146-7), 뇌증(J Trap Med Public Health 1987, 18, 398-406), 및 길랭-바레 증후군(Intern Med 2006, 45, 563-4)을 포함한다.

세포 배양 또는 인체 내에서 투여 시, 2,6-디아미노 2'-C-Me 퓨린 뉴클레오시드들(2,6-diamino 2'-C-Me purine nucleosides)이 대응하는 6-하이드록시-2,6-디아미노 2'-C-Me 퓨린 뉴클레오시드(6-hydroxy 2,6-diamino 2'-C-Me purine nucleosides)로 전환되는 것이 발견되었다. 우리는 또한 이것이 다양한 다른 종류의 6-서브스티튜티드 퓨린 뉴클레오시드(6-substituted purine nucleosides)에 대하여도 적용된다는 것을 발견하였다. 상기 화합물은 비록 프로드럭 아바카비어(Abacavir) 및 인체에서 G 유사체 카보비어(Carbovir((-)-carbocyclic 2',3'-didehydro-2',3'-dideoxyguanosine))에 대응하도록 변형되지만, G 또는 I 유사체의 프로드럭으로서 행동한다. 상기 변환은 인체 내에서 잠재적인 항바이러스제로 형성될 수 있는 6-서브스티튜티드 퓨린 뉴틀레오시드 트리포스페이트의 다양성을 매우 제한한다.

HCV, 노로바이러스, 사포바이러스, 뎅기열 바이러스, 치쿤구니야 바이러스 및 황열이 전 세계적으로 두렵고 현저한 단계에 도달하였으며, 감염된 몇몇 환자들에게는 비극적인 결과를 일으키는 것에 비추어 볼 때, 숙주 세포에 낮은 독성을 가져오면서 상기 질병들을 치료할 수 있는 새롭고 효과적인 약제를 제공하는 것이 필요하다.

상세하게는 약물 내성 돌연변이 바이러스를 치료하기 위한 새로운 항바이러스 또는 화학요법 약물, 상기 약물을 포함하는 구성물, 및 상기 약물을 이용하는 치료 방법을 제공하는 것은 유익할 것이다. 본 발명은 이러한 약물, 구성물 및 방법에 관한 것이다.

본 발명은 숙주 내의 HCV, 노로바이러스(Norovirus), 사포바이러스(Sapovirus), 뎅기열 바이러스(Dengue virus), 치쿤구니야 바이러스(Chikungunya virus) 또는 황열(Yellow fever) 감염을 치료 또는 방지하는 화합물, 방법 및 조성물을 제공한다. 상기 방법은 여기에 언급된 대로 HCV, 노로바이러스, 사포바이러스, 뎅기열 바이러스, 치쿤구니야 바이러스 또는 황열 감염에 의한 감염을 치료 또는 방지하기 위한 적어도 하나 이상의 화합물의 치료상 또는 예방활성-유효량 또는 생물학적 활성을 감소시키기에 충분한 양을 투입하는 것을 포함한다. 상기 약학적 조성물은 암을 가진 숙주 또는 HCV, 노로바이러스, 사포바이러스, 뎅기열 바이러스, 치쿤구니야 바이러스 또는 황열에 감염된 숙주를 치료하기 위한, 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 배합된, 여기 언급된 하나 또는 그 이상의 화합물을 포함한다. 상기 제형은 적어도 하나 이상의 추가의 치료제를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 화합물을 제조하는 방법을 포함한다.

C형 간염 리플리콘(Hepatitis C replicons)에 관하여, 노로바이러스 리플리콘은 리플리콘의 복제가 일어나도록 하기 위하여 바이러스 헬리카제, 프로테아제, 및 폴리머라제가 가동되는 것을 필요로 한다. 리플리콘은 노로바이러스 헬리카제, 프로테아제, 및/또는 폴리머라제가 기능하는 능력을 저해하는 활성을 위한 화합물이 스크리닝되는 지의 여부를 평가하는 고스루풋 에세이(high throughput assays)에 사용될 수 있다.

화합물은 다양한 2,6-디아미노 2'-C-메틸 퓨린 뉴클레오시드의 모노포스페이트 형태, 또는 모노포스페이트 형태의 유사체이며, 또한 생체 내에 투여할 때, 트리포스포릴레이트될 수 있다. 놀랍게도 본 발명자들은 G 유사체로의 전환에서 6-아미노기를 부분적으로(또는 잠재적으로 완전하게) 보호하는 이들 뉴클레오시드의 모노포스페이트 프로드럭의 제조를 발견하였다. 모노포스페이트 프로드럭을 제조함으로써 본 발명자들은 본 발명 전에는 가능하지 않았거나 적어도 치료상으로 연관된 농도에서 가능하지 않았던, 폴리머라제로 뉴클레오티드 트리포스페이트를 전달하는 방법을 개발하였다. 본 발명은 일 실시예에서, 하나는 G 유사체로 인식되고 나머지 하나는 A 유사체로 인식되는 폴리머라제로 2개의 트리포스페이트를 전달한다. 본 발명은 생체 내에서 제조되고, 항바이러스제로 이름을 올릴(대응되는 G 유사체를 포함하는 혼합물과 함께) 새롭고 신규한 시리즈의 뉴클레오티드 트리포스페이트를 제공한다.

여기 언급된 본 발명은 β-D-2,6-디아미노 2-C-메틸 퓨린 뉴클레오시드(β-D-2,6-diamino 2-C-methyl purine nucleosides)를 포함한다. 일 실시예에서 활성 화합물은 화학식(A)이고, 또 다른 실시예에서 활성 화합물은 화학식(B)이고, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 그의 프로드럭이다:

여기에서 인 중심에 키랄성이 존재할 때, 상기 화합물은 전체적으로 또는 부분적으로 R _p 또는 S _p 또는 그 혼합물이고,

R¹는 OH 또는 F이고;

Y는 O 또는 S이며;

R²⁴는 OR¹⁵,

,(예를 들면,

에 한정되지 않음) 유래된 지방알코올로부터 선택되고,

(여기에서 R¹⁵, R¹⁷ 및 R¹⁸는 하기에서 정의됨);

R² 및 R³는 생체 내로 투입될 때, 생물학적 시스템에서 6-NH₂ 탈아미노화에 부분적으로 또는 완전하게 내성인 뉴클레오시드 모노포스페이트 또는 티오모노포스페이트를 제공할 수 있고, 대표적인 R² 및 R³는 다음으로부터 선택된다:

(a) OR¹⁵, 여기에서 R¹⁵는 H, Li, Na, K, 페닐 및 피리디닐로부터 선택되고, 페닐 및 피리디닐은(CH₂)₀ _-6CO₂R¹⁶ 및(CH₂)₀ _-6CON(R¹⁶)₂으로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 내지 3개의 치환기로 치환되고;

R¹⁶은 독립적으로 H, C₁ _-20 알킬, 지방알코올로부터 유래된 탄소 사슬 또는 저급 알킬, 알콕시, 디(저급 알킬)-아미노, 플루오로, C₃ _-10 사이클로알킬, 사이클로알킬, 사이클로헤테로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 치환된 아릴, 또는 치환된 헤테로아릴로 치환된 C₁ _-20 알킬이며; 여기에서 상기 치환기는 C₁ _-5 알킬, 또는 저급 알킬, 알콕시, 디(저급 알킬)-아미노, 플루오로, C₃ _-10 사이클로알킬, 또는 사이클로알킬로 치환된 C₁ _-5 알킬임;

(b)

;

(c) L-아미노산

의 에스테르, 여기에서 R¹⁷는 천연 L-아미노산에서 존재하는 것으로 제한되고, R¹⁸는 H, C₁ _-20 알킬, 지방알코올로부터 유래된 탄소 사슬 또는 저급 알킬, 알콕시, 디(저급 알킬)-아미노, 플루오로, C₃ _-10 사이클로알킬, 사이클로알킬, 사이클로헤테로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 치환된 아릴, 또는 치환된 헤테로아릴로 치환된 C₁ _-20 알킬이며; 여기에서 상기 치환기는 C₁ _-5 알킬, 또는 저급 알킬, 알콕시, 디(저급 알킬)-아미노, 플루오로, C₃ _-10 사이클로알킬, 또는 사이클로알킬로 치환된 C₁ _-5 알킬임;

(d) R² 및 R³는 환

를 형성하기 위하여 함께 올 수 있고, 여기에서 R¹⁹는 H, C₁ _-20 알킬, 지방알코올로부터 유래된 탄소 사슬 또는 저급 알킬, 알콕시, 디(저급 알킬)-아미노, 플루오로, C₃ _-10 사이클로알킬, 사이클로알킬, 사이클로헤테로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 치환된 아릴, 또는 치환된 헤테로아릴로 치환된 C₁ _-20 알킬이며; 여기에서 상기 치환기는 C₁ _-5 알킬, 또는 저급 알킬, 알콕시, 디(저급 알킬)-아미노, 플루오로, C₃ _-10 사이클로알킬, 또는 사이클로알킬로 치환된 C₁ _-5 알킬임;

(e) R² 및 R³는

및

으로부터 선택된 환을 형성하기 위하여 같이 올 수 있으며, 여기에서 R²⁰는 O 또는 NH이고,

R²¹는 H, C₁ _-20 알킬, C₁ _-20 알케일, 지방산으로부터 유래된 탄소 사슬 또는 저급 알킬, 알콕시, 디(저급 알킬)-아미노, 플루오로, C₃ _-10 사이클로알킬, 사이클로알킬, 사이클로헤테로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 치환된 아릴, 또는 치환된 헤테로아릴로 치환된 C₁ _-20 알킬이며; 여기에서 상기 치환기는 C₁ _-5 알킬, 또는 저급 알킬, 알콕시, 디(저급 알킬)-아미노, 플루오로, C₃ _-10 사이클로알킬, 또는 사이클로알킬로 치환된 C₁ _-5 알킬임.

예를 들어, 상기 화합물은 5'-OH 유사체를 제조하고 나서 이들을 모노-포스페이트 유사체로 변환시킴으로써 제조할 수 있다.

또한, 여기에서 언급된 화합물들은 HCV, 노로바이러스, 사포바이러스 뎅기열 바이러스, 치쿤구니야 바이러스 및/또는 황열 억제제이다. 그러므로 이들 화합물들은 또한 HCV, 노로바이러스 사포바이러스, 뎅기열 바이러스, 치쿤구니야 바이러스 및/또는 황열로 공감염된 환자들을 치료하는 데에 사용될 수 있다.

본 발명에서 2,6-디아미노-2'-C-Me 퓨린 뉴클레오시드 모노포스페이트 프로드럭(2,6-diamino-2'-C-Me-purine nucleosides monophosphate prodrugs)은 HIV, 노로바이러스(Norovirus), 사포바이러스(Sapovirus), 뎅기열 바이러스(Dengue virus), 치쿤구니야 바이러스(Chikungunya virus) 및 황열(Yellow fever)에 대한 활성 억제를 나타낸다. 그러므로 상기 화합물은 숙주에서 바이러스 감염의 치료 또는 예방, 또는 바이러스의 생물학적 활성의 감소시키는 데 사용될 수 있다. 상기 숙주는 포유동물, 특히 HCV, 노로바이러스, 사포바이러스, 뎅기열 바이러스, 치쿤구니야 바이러스 및/또는 황열에 감염된 인간이 될 수 있다.

도 1은 24의 ORTEP 도면이다.
도 2는 25(S _p )의 ORTEP 도면이다.
도 3은 25(S _p )의 ORTEP 도면이다.
도 4는 HCV NS5B에 의한((2R,3S,4R,5R)-5-(2,6-디아미노-9H-퓨린-9-일)-3,4-디하이드록시테트라하이드로퓨란-2-일)메틸 테트라하이드로젠 트리포스페이트(((2R,3S,4R,5R)-5-(2,6-diamino-9H-purin-9-yl)-3,4-dihydroxytetrahydrofuran-2-yl)methyl tetrahydrogen triphosphate)의 투입을 도시한 도면이다.
도 5는 HCV NS5B에 의한((2R,3S,4R,5R)-5-(2-아미노-6-하이드록시-9H-퓨린-9-일)-3,4-디하이드록시테트라하이드로퓨란-2-일)메틸 테트라하이드로젠 트리포스페이트(((2R,3S,4R,5R)-5-(2-amino-6-hydroxy-9H-purin-9-yl)-3,4-dihydroxytetrahydrofuran-2-yl)methyl tetrahydrogen triphosphate)의 투입을 도시한 도면이다.
도 6은 50μM의 Huh7 세포 12에서 4시간 동안 인큐베이션한 후에 형성된 뉴클레오티드의 LC/MS 분석을 도시한 도면이다.
도 7은 50μM의 Huh7 세포 8a에서 4시간 동안 인큐베이션한 후에 형성된 뉴클레오티드의 LC/MS 분석을 도시한 도면이다.
도 8은 2,6-디아미노 및 G 트리포스페이트의 세포내 전달을 실시하는 8a의 물질대사억제의 도면이다.
도 9는 50μM의 Huh7 세포 8b-up에서 4시간 동안 인큐베이션한 후에 형성된 뉴클레오티드의 LC/MS 분석을 도시한 도면이다.
도 10은 2,6-디아미노 및 G 트리포스페이트의 세포내 전달을 실시하는 8b-up의 물질대사억제의 도면이다.
도 11은 37℃에서 4시간 동안 50μM 농도의 PBM 세포 내의 DAPD 세포내 물질대사를 나타낸 도면이다.
도 12는 37℃에서 4시간 동안 50μM 농도의 PBM 세포 내에서 6-아미노기 및 5'-MP 프로드럭을 포함하는 포스포라미데이트(phosphoramidate) RS-864의 인큐베이션을 나타낸 도면이다.

본 발명에서 2,6-디아미노-2'-C-Me 퓨린 뉴클레오시드 모노포스페이트 프로드럭(2,6-diamino-2'-C-Me-purine nucleosides monophosphate prodrugs)은 HIV, 노로바이러스(Norovirus), 사포바이러스(Sapovirus), 뎅기열 바이러스(Dengue virus), 치쿤구니야 바이러스(Chikungunya virus) 및 황열(Yellow fever)에 대한 활성 억제를 나타낸다. 그러므로 상기 화합물은 숙주에서 바이러스 감염의 치료 또는 예방, 또는 바이러스의 생물학적 활성의 감소시키는 데 사용될 수 있다. 상기 숙주는 포유동물, 특히 HCV, 노로바이러스, 사포바이러스, 뎅기열 바이러스, 치쿤구니야 바이러스 및/또는 황열에 감염된 인간이 될 수 있다. 상기 방법은 본 발명에서 기술된 2,6-디아미노-2'-C-Me 퓨린 뉴클레오시드 모노포스페이트 프로드럭의 하나 이상을 유효량으로 포함한다.

아울러, 본 발명에서 기술된 하나 이상의 화합물과 약학적으로 허용가능한 담체(carrier) 또는 부형제(excipient)의 조합을 포함하는 약학적 제형이 개시된다. 일 실시예에서, 상기 제형은 본 발명에서 기술된 화합물을 최소한 하나 포함하고 적어도 하나의 치료 약물을 포함한다.

본 발명은 이하 정의를 참고하면 더 명확히 이해될 수 있을 것이다:

Ⅰ. 정의

본 발명에서 사용된 용어 "독립적으로"는 출원인에 따라서 독립적으로 각각 다르게 사용되는 변수를 지칭하는 것으로 사용된다. 그러므로 R"은 "독립적으로 탄소 또는 질소"인 R"XYR" 같은 화합물에 있어서, 두 가지 R"은 모두 탄소 또는 두 가지 R"은 모두 질소이거나, 하나의 R"은 탄소이고 나머지 R"은 질소가 될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "거울상 이성질체적으로 순수한(enantiomerically pure)"은 최소한 약 95%, 바람직하게는 약 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 단일한 거울상 이성질체 뉴클레오티드로 구성된 뉴클레오티드 화합물을 의미한다.

본 발명에서 사용된 용어 "실질적으로 없는(substantially free of)" 또는 "실질적으로 부재(substantially in the absence of)"는 뉴클레오티드의 지정된 거울상 이성질체의 중량비가 85% 내지 90%, 바람직하게는 95% 내지 98%, 더욱 바람직하게는 99% 내지 100%인 뉴클레오티드 화합물을 의미한다. 본 발명에서 사용되는 화합물은, 바람직한 실시예에서, 실질적으로 거울상 이성질체를 포함하지 않는다.

마찬가지로, 용어 "분리된(isolated)"은 상기 뉴클레오티드가 85% 내지 90%, 바람직하게는 95% 내지 98%, 더욱 바람직하게는 99% 내지 100% 포함되고, 나머지는 다른 화학 종 또는 거울상 이성질체인 뉴클레오티드 화합물뉴클레오티드 화합물을 의미한다.

일부 경우에서 인 원자는 여기에서 "P*" 또는 "P"로 칭해진 키랄일 수 있는데, 이는 이와 같은 배열을 위한 칸-인골드-프렐로그 법칙(Cahn-Ingold-Prelog rules)의 인정된 의미에 해당하는 "R" 또는 "S"로 표시된다. 화학식 A 및 B의 프로드럭은 인 중심에서의 키랄성으로 인하여 부분입체 이성질체(diastereomer)의 혼합물로 존재한다. 인 중심에 키랄성이 존재할 때, 상기 화합물은 전체적으로 또는 부분적으로 R _p 또는 S _p 또는 그 혼합물일 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "알킬"은 다르게 정의되지 않는 한, 치환되거나 치환되지 않은 알킬 그룹을 포함하는, 포화된 직쇄, 측쇄 또는 사이클릭, 1급, 2급 또는 3급 탄화수소를 의미한다. 상기 알킬 그룹은 본원에 참고로 인용된 문헌(Greene, et al ., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, Second Edition, 1991)에 개시되고 , 보호되지 않거나 필요한 경우 보호된 할로(halo), 할로알킬(haloalkyl), 하이드록실(hydroxyl), 카르복실(carboxyl), 아실(acyl), 아릴(aryl), 아실옥시(acyloxy), 아미노(amino), 아미도(amido), 카르복실 유도체(carboxyl derivatives), 알킬아미노(alkylamino), 디알킬아미노(dialkylamino), 아릴아미노(arylamino), 알콕시(alkoxy), 아릴옥시(aryloxy), 나이트로(nitro), 시아노(cyano), 설폰산(sulfonic acid), 싸이올(thiol), 이민(imine), 설포닐(sulfonyl), 설파닐(sulfanyl), 설피닐(sulfinyl), 설파모닐(sulfamonyl), 에스터(ester), 카르복실 산(carboxylic acid), 아마이드(amide), 포스포닐(phosphonyl), 포스피닐(phosphinyl), 포스포릴(phosphoryl), 포스핀(phosphine), 티오에스터(thioester), 티오에터(thioether), 산 할라이드(acid halide), 언하이드라이드(anhydride), 옥심(oxime), 하이드라진(hydrazine), 카바메이트(carbamate), 포스포닉 산(phosphonic acid), 포스포네이트(phosphonate)를 포함하지만 제한되지 않는, 반응에 간섭하지 않거나 그렇지 않으면 반응 과정에서 개량되지 않는 어떠한 잔기로 필요에 따라 치환될 수 있다. 상세하게 포함된 것은 CF₃ 및 CH₂CF₃이다.

본 명세서에서, 용어 C(알킬 영역)가 사용되어질 때마다, 독립적으로 자세하고 개별적으로 구성되어진 분류로 이루어진 개개의 구성을 포함한다. 상기 용어 "알킬"은 C₁ _-22 알킬 잔기를 포함하고, 용어 "저급 알킬"은 C₁ _-6 알킬 잔기를 포함한다. 당업계에 있어서 관련 있는 알킬 라디칼은 접미사 "-에인(-ane)"을 접미사 "-일(-yl)"로 치환하여 명명한다.

용어 "알케닐(alkenyl)"은 하나 이상의 이중결합을 포함하는 불포화된, 탄화수소 라디칼, 직쇄 또는 측쇄를 의미한다. 본 발명에서 개시된 상기 알케닐 그룹은 알킬 잔기에서 치환기로서 개시된 다른 잔기를 포함하지만 제한되지 않는, 반응 과정에 반대의 영향을 주지 않는 잔기로 필요에 따라 치환될 수 있다. 알케닐 그룹의 제한되지 않는 예는 에틸렌(ethylene), 메틸에틸렌(methylethylene), 이소프로필리덴(isopropylidene), 1,2-에테인-디일(1,2-ethane-diyl), 1,1-에테인-디일(1,1-ethane-diyl), 1,3-프로판-디일(1,3-propane-diyl), 1,2-프로판-디일(1,2-propane-diyl), 1,3-부탄-디일(1,3-butane-diyl), 및 1,4-부탄-디일(1,4-butane-diyl)를 포함한다.

용어 "알키닐(alkynyl)"은 하나 이상의 삼중결합을 포함하는 불포화된, 비고리 탄화수소 라디칼, 직쇄 또는 측쇄를 의미한다. 본 발명에서 개시된 상기 알키닐 그룹은 알킬 잔기에서 치환기로서 개시된 다른 잔기를 포함하지만 제한되지 않는, 반응 과정에 반대의 영향을 주지 않는 잔기로 필요에 따라 치환될 수 있다. 적절한 알키닐 그룹의 제한되지 않는 예는 에티닐(ethynyl), 프로피닐(propynyl), 하이드록시프로피닐(hydroxypropynyl), 부틴-1-일(butyn-1-yl), 부틴-2-일(butyn-2-yl), 펜틴-1-일(pentyn-1-yl), 펜틴-2-일(pentyn-2-yl), 4-메톡시펜틴-2-일(4-methoxypentyn- 2-yl), 3-메틸부틴-1-일(3-methylbutyn-l-yl), 헥신-1-일(hexyn-1-yl), 헥신-2-일(hexyn-2-yl), 및 헥신-3-일(hexyn-3-yl), 3,3-디메틸부틴-1-일 라디칼(3,3-dimethylbutyn- 1-yl radical)을 포함한다.

용어 "알킬아미노(alkylamino)" 또는 "아릴아미노(arylamino)"는 각각 하나 또는 두 개의 알킬 또는 아릴 치환기를 가지는 아미노 그룹을 의미한다.

용어 "보호된(protected)"은 별도로 규정하지 않는 한, 산소, 질소, 또는 인 원자의 추가적인 반응을 막거나 다른 목적으로 이에 부가된 그룹을 나타낸다. 매우 다양한 산소 및 질소 보호기가 유기 합성 분야의 당업자에게 공지(예를 들면, Greene, et al, Protective Groups in Organic Synthesis, 전술한 바와 같음)되어 있다.

용어 "아릴(aryl)"은 하나만으로 또는 조합에서, 하나, 둘, 세 개의 고리를 포함하고 그러한 고리들이 매달린 채로 붙어있을 수 있거나, 결합되어 있을 수 있는 카르복실 방향족계를 의미한다. 아릴의 제한되지 않은 예는 페닐(phenyl), 바이페닐(biphenyl), 또는 나프틸(naphthyl), 또는 방향족계로부터 수소가 제거된 후에 남아있는 다른 방향족 그룹을 포함한다. 상기 용어 아릴은 양쪽 모두 치환되거나 치환되지 않은 잔기를 포함한다. 상기 아릴 그룹은 알킬 잔기에서 치환기로서 개시된 다른 잔기를 포함하지만 제한되지 않는, 반응 과정에 반대의 영향을 주지 않는 잔기로 필요에 따라 치환될 수 있다. 치환된 아릴의 제한되지 않는 예는 헤테로아릴아미노(heteroarylamino), N-아릴-N-알킬아미노(N-aryl-N-alkylamino), N-헤테로아릴아미노-N-알킬아미노(N-heteroarylamino-N-alkylamino), 헤테로아랄콕시(heteroaralkoxy), 아릴아미노(arylamino), 아랄킬아미노(aralkylamino), 아릴티오(arylthio), 모노아릴아미도설포닐(monoarylamidosulfonyl), 아릴설폰아미도(arylsulfonamido), 디아릴아미도설포닐(diarylamidosulfonyl), 모노아릴 아미도설포닐(monoarylamidosulfonyl), 아릴설피닐(arylsulfinyl), 아릴설포닐(arylsulfonyl), 헤테로아릴티오(heteroarylthio), 헤테로아릴설피닐(heteroarylsulfinyl), 헤테로아릴설포닐(heteroarylsulfonyl), 아로일(aroyl), 헤테로아로일(heteroaroyl), 아랄카노일(aralkanoyl), 헤테로아랄카노일(heteroaralkanoyl), 하이드록시아랄킬(hydroxyaralkyl), 하이드록시헤테로아랄킬(hydoxyheteroaralkyl), 할로알콕시알킬(haloalkoxyalkyl), 아릴(aryl), 아랄킬(aralkyl), 아릴옥시(aryloxy), 아랄콕시(aralkoxy), 아릴옥시알킬(aryloxyalkyl), 포화 헤테로사이클릴(saturated heterocyclyl), 부분적으로 포화 헤테로사이클릴, 헤테로아릴(heteroaryl), 헤테로아릴옥시(heteroaryloxy), 헤테로아릴옥시알킬(heteroaryloxyalkyl), 아릴알킬(arylalkyl), 헤테로아릴알킬(heteroarylalkyl), 아릴알케닐(arylalkenyl), 및 헤테로아릴알케닐(heteroarylalkenyl), 카보아랄콕시(carboaralkoxy)를 포함한다.

용어 "알칼릴(alkaryl)" 또는 "알킬아릴(alkylaryl)"은 아릴 치환기를 가지는 알킬 그룹을 의미한다. 상기 용어 "아랄킬(aralkyl)" 또는 "아릴알킬(arylalkyl)"은 알킬 치환기를 가지는 아릴 그룹을 의미한다.

본 발명에서 사용된 상기 용어 "할로(halo)"는 클로로(chloro), 브로모(bromo), 아이오도(iodo) 및 플루오로(fluoro)를 포함한다.

상기 용어 "아실(acyl)"은 직쇄, 측쇄, 또는 사이클릭 알킬 또는 저급 알킬, 메톡시메틸(methoxymethyl)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 알콕시알킬, 벤질(benzyl)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 아랄킬, 페녹시메틸(phenoxymethyl) 같은 아릴옥시알킬(aryloxyalkyl), 필요에 따라 할로겐(F, Cl, Br, I), 알킬(C₁, C₂, C₃, 및 C₄를 포함하지만 이에 제한되지 않는), 알콕시(C₁, C₂, C₃, 및 C₄를 포함하지만 이에 제한되지 않는)로 치환된 페닐을 포함하지만 이에 제한되지 않는 아릴, 알킬 또는 아랄킬 설포닐(aralkyl sulphonyl)같은 설포네이트 에스터(sulfonate esters), 모노-, 디-, 트리포스페이트 에스터, 트리틸(trityl)및 모노메톡시트리틸(monomethoxytrityl), 치환된 벤질, 트리알킬실릴(trialkylsilyl)(예, 디메틸-t-부틸실릴(dimethyl-tbutylsilyl)) 또는 디페닐메틸실릴(diphenylmethylsilyl)로부터 선택되어진 에스터 그룹의 비카보닐 잔기를 가지는 카복실산 에스터를 의미한다. 상기 에스터에서 아릴 그룹은 필요에 따라 페닐 그룹으로 구성된다. 상기 용어 "저급 아실"은 비카보닐(non-carbonyl) 잔기가 저급 알킬인 아실그룹을 의미한다.

상기 용어 "알콕시(alkoxy)" 및 "알콕시알킬(alkoxyalkyl)"은 메톡시 라디칼 같은 알킬 잔기를 가지는 라디칼을 포함하는 직쇄 또는 측쇄 산소를 포괄한다. 상기 용어 "알콕시알킬(alkoxyalkyl)"은 또한 알킬 라디칼이 붙어 있는 하나 이상의 알콕시 라디칼을 가지는 알킬 라디칼, 즉, 모노알콕시알킬 및 디알콕시알킬 라디칼을 형성하는 알킬 라디칼을 포괄한다. 아울러, 상기 "알콕시" 라디칼은 "할로알콕시(haloalkoxy)" 라디칼을 제공하기 위하여, 플루오로, 클로로 또는 브로모 같은 하나 이상의 할로겐 원자로 치환될 수 있다. 상기 라디칼들의 예는 플루오로메톡시(fluoromethoxy), 클로로메톡시(chloromethoxy), 트리클로로메톡시(trifluoromethoxy), 디플루오로메톡시(difluoromethoxy), 트리플루오로메톡시(trifluoroethoxy), 플루오로에톡시(fluoroethoxy), 테트라플루오로에톡시(tetrafluoroethoxy), 펜타플루오로에톡시(pentafluoroethoxy), 및 플루오로프로폭시(fluoropropoxy)를 포함한다.

상기 용어 “알킬아미노(alkylamino)”는 아미노 라디칼에 붙어있는, 각각, 하나 또는 두 개의 알킬 라디칼을 포함하는 “모노알킬아미노(monoalkylamino)" 및 ”디알킬아미노(dialkylamino)“를 나타낸다. 상기 용어 아릴아미노(arylamino)는 아미노 라디칼에 붙어있는, 각각, 하나 또는 두 개의 아릴 라디칼을 포함하는 “모노아릴아미노(monoarylamino)" 및 ”디아릴아미노(diarylamino)“를 나타낸다. 상기 용어 아랄킬아미노(aralkylamino)는 아미노 라디칼에 붙어있는, 각각, 하나 또는 두 개의 아랄킬 라디칼을 포함하는 “모노아랄킬아미노(monoaralkylamino)" 및 ”디아랄킬아미노(diaralkylamino)“를 나타낸다. 아울러 상기 용어 아랄킬아미노(aralkylamino)는 아미노 라디칼에 붙어 있는 하나의 아랄킬 라디칼 및 하나의 알킬 라디칼을 포함하는”모노아랄킬 모노알킬아미노(monoaralkyl monoalkylamino)를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 상기 용어 “헤테로원자(heteroatom)”는 산소, 황, 질소 및 인을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 “헤테로아릴(heteroaryl)” 또는 “헤테로아로마틱(heteroaromatic,)”은 방향족 고리에서 적어도 하나의 황, 산소, 질소, 또는 인을 포함하는 방향족성을 의미한다.

상기 용어 “헤테로사이클릭(heterocyclic)”, “헤테로사이클릴(heterocycly)” 및 “사이클로헤테로알킬(cycloheteroalkyl)”은 예를 들면, 고리에서 3개 내지 10개의 원자를 포함하고 적어도 하나의 산소, 황, 질소, 또는 인 같은 하나 이상의 헤테로원자가 고리에 포함되어 있는 비방향성 사이클릭 그룹을 의미한다.

헤테로아릴(heteroaryl) 및 헤테로사이클릭(heterocyclic) 그룹의 제한되지 않는 예는 퓨릴(furyl), 퓨라닐(furanyl), 피리딜(pyridyl), 피리미딜(pyrimidyl), 싸이에닐(thienyl), 이소싸이아졸릴(isothiazolyl), 이미다졸릴(imidazolyl), 테트라졸릴(tetrazolyl), 피라지닐(pyrazinyl), 벤조퓨라닐(benzofuranyl), 벤조티오페닐(benzothiophenyl), 퀴노릴(quinolyl), 이소퀴노릴(isoquinolyl), 벤조싸이에닐(benzothienyl), 이소벤조퓨릴(isobenzofuryl), 피라졸릴(pyrazolyl), 인돌릴(indolyl), 이소인돌릴(isoindolyl), 벤즈이미다졸릴(benzimidazolyl), 퓨리닐(purinyl), 카보졸릴(carbazolyl), 옥사졸릴(oxazolyl), 싸이아졸릴(thiazolyl), 이소싸이아졸릴(isothiazolyl), 1,2,4-싸이아디아졸릴(1,2,4-thiadiazolyl), 이소옥사졸릴(isooxazolyl), 피롤릴(pyrrolyl), 퀴나졸리닐(quinazolinyl), 신노리닐(cinnolinyl), 프탈아지닐(phthalazinyl), 산티닐(xanthinyl), 하이포산티닐(hypoxanthinyl), 티오펜(thiophene), 퓨란(furan), 피롤(pyrrole), 이소피롤(isopyrrole), 피라졸(pyrazole), 이미다졸(imidazole), 1,2,3-트리아졸(1,2,3-triazole), 1,2,4-트리아졸(1,2,4-triazole), 옥사졸(oxazole), 이소옥사졸(isoxazole), 싸이아졸(thiazole), 이소싸이아졸(isothiazole), 피리미딘(pyrimidine) 또는 피리다진(pyridazine), 및 프테리디닐(pteridinyl), 아지리딘(aziridines), 싸이아졸(thiazole), 이소싸이아졸(isothiazole), 1,2,3-옥사디아졸(1,2,3-oxadiazole), 싸이아진(thiazine), 피리딘(pyridine), 피라진(pyrazine), 피페라진(piperazine), 피롤리딘(pyrrolidine), 옥사지렌(oxaziranes), 페나진(phenazine), 페노싸이아진(phenothiazine), 모포리닐(morpholinyl), 피라조릴(pyrazolyl), 피리다지닐(pyridazinyl), 피라지닐(pyrazinyl), 퀴노산리닐(quinoxalinyl), 산티닐(xanthinyl), 하이포산티닐(hypoxanthinyl), 프테리디닐(pteridinyl), 5-아자사이티디닐(5-azacytidinyl), 5-아자우라실릴(5-azauracilyl), 트리아조로피리디닐(triazolopyridinyl), 이미다조로피리미디닐(imidazolopyridinyl), 피로로피리미디닐(pyrrolopyrimidinyl),피라조로피리미딜(pyrazolopyrimidinyl), 아데닌(adenine), N⁶-알킬퓨린(N⁶-alkylpurines), N⁶-벤질퓨린(N⁶-benzylpurine), N⁶-할로퓨린(N⁶-halopurine), N⁶-비닐퓨린(N⁶-vinypurine), N⁶-아세틸에닉 퓨린(N⁶- acetylenic purine), N⁶-아실 퓨린(N⁶-acyl purine), N⁶-하이드록시알킬 퓨린(N⁶-hydroxyalkyl purine), N⁶-티오알킬 퓨린(N⁶-thioalkyl purine), 티민(thymine), 시토신(cytosine), 6-아자피리미딘(6-azapyrimidine), 2-머갑토피리미딘(2-mercaptopyrimidine), 우라실(uracil), N⁵-알킬피리미딘(N⁵-alkylpyrimidines), N⁵-벤질피리미딘(N⁵-benzylpyrimidines), N⁵-할로피리미딘(N⁵-halopyrimidines), N⁵-비닐피리미딘(N⁵-vinylpyrimidine), N⁵-아세틸에닉 피리미딘(N⁵-acetylenic pyrimidine), N⁵-아실 피리미딘(N5-acyl pyrimidine), N⁵-하이드록시알킬 퓨린(N⁵-hydroxyalkyl purine) 및 N⁶-티오알킬 퓨린(N⁶- thioalkyl purine) 및 이소사졸릴(isoxazolyl)을 포함한다. 헤테로아로마틱 그룹은 필요에 따라 상기 아릴과 동일한 치환기로 치환되어질 수 있다. 헤테로사이클릭 또는 헤테로 아로마틱 그룹은 할로겐(halogen), 할로알킬(haloalkyl), 알킬(alkyl), 알콕시(alkoxy), 하이드록시(hydroxy), 카복실 유도체(carboxyl derivatives), 아미도(amido), 아미노(amino), 알킬아미노(alkylamino), 디알킬아미노(dialkylamino)로 구성되어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환기로 필요에 따라 치환될 수 있다. 상기 헤테로 아로마틱은 부분적으로 또는 완전히 원하는 만큼 수소화되어질 수 있다. 제한되지 않는 예로서, 디하이드로피리딘은 피리딘으로 대안되어 사용될 수 있다. 헤테로사이클릭 또는 헤테로아릴 그룹에서 기능을 가지는 산소 및 질소 그룹은 필요하거나 원하는 만큼 보호될 수 있다. 적절한 보호기는 당업계에서 잘 알려진 바와 같이, 트리메틸실릴(trimethylsilyl), 디메틸실릴(dimethylhexylsilyl), t-부틸디메틸실릴(t-butyldimethylsilyl), 및 t-부틸다이페닐실릴(t-butyldiphenylsilyl), 트리틸(trityl) 또는 치환된 트리틸(substituted trityl), 알킬 그룹(alkyl groups), 아세틸(acetyl) 및 프로피오닐(propionyl), 메테인설포닐(methanesulfonyl), 및 p-톨루엔설포닐(p-toluenelsulfonyl) 같은 아실 그룹(acyl groups)을 포함한다. 상기 헤테로사이클릭 또는 헤테로아로마틱 그룹은 아릴 잔기에서 치환기로서 개시된 다른 잔기를 포함하지만 제한되지 않는, 반응 과정에 반대의 영향을 주지 않는 잔기로 치환될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "숙주(host)"는 세포주 및 동물, 바람직하게는 사람을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 바이러스가 복제할 수 있는 단세포 또는 다세포 유기체를 의미한다. 그 대신에, 상기 숙주는 바이러스 게놈의 부분이 운반되어지도록 할 수 있고, 그러한 복제 또는 기능은 본 발명의 화합물에 의하여 변화시킬 수 있다. 상기 용어 숙주는 구체적으로 감염된 세포, 바이러스 게놈의 전체 또는 부분으로 감염되어진 세포 또는 동물, 더 상세하게는 영장류(침팬지를 포함하지만 이에 제한되지 않는) 및 사람을 의미한다. 본 발명의 대부분의 동물 실험에서, 숙주는 인간 환자이다. 그러나, 특정한 경우, 가축 적용이 본 발명에 의하여 분명히 예상된다(침팬지에 처리하는 경우와 마찬가지로).

상기 용어 "펩티드(peptide)"는 하나의 아미노산의 카복실 그룹에 의해 다른 아미노산의 아미노 그룹에 연결되어 있는 2개 내지 100개의 아미노산을 포함하는 다양한 천연물 및 합성 화합물을 의미한다.

상기 용어 "약학적으로 허용가능한 염(pharmaceutically acceptable salt) 또는 프로드럭(prodrug)"은 명세서 전반에 걸쳐 환자에게 투여시 뉴클레오티드 모노포스페이트 화합물을 제공하는, 뉴클레오티드 화합물의 약제학적으로 허용가능한 임의의 형태(에스터, 포스페이트 에스터, 에스터 또는 관련 그룹의 염)를 기재하는데 사용된다. 약학적으로 허용가능한 염은 약학적으로 허용가능한 무니 또는 유기 염기 및 산으로부터 유도된 염을 포함한다. 적절한 염으로는 약제학 분야에서 널리 알려진 다수의 기타 산 중에서, 칼륨 및 나트륨과 같은 알칼리 금속, 칼슘 및 마그네슘과 같은 알칼리토금속으로부터 유도된 염이 있다. 약제학적으로 허용되는 프로드럭은 숙주에서 대사되어, 예를 들면 가수분해 또는 산화되어 본 발명의 화합물을 형성하는 화합물을 의미한다. 프로드럭의 통상적인 예는 활성 화합물의 기능적 잔기에 생물학적으로 불안정한 보호 그룹을 갖는 화합물을 포함한다. 프로드럭은 산화(oxidized), 환원(reduced), 아민화(aminated), 탈아민화(deaminated), 하이드록시화(hydroxylated), 탈하이드록시화(dehydroxylated), 가수분해(hydrolyzed), 탈가수분해(dehydrolyzed), 알킬화(alkylated), 탈알킬화(dealkylated), 아실화(acylated), 탈아실화(deacylated), 포스포릴화(phosphorylated), 또는 탈포스포릴화( dephosphorylated)되어 활성 화합물을 생성할 수 있는 화합물을 포함한다. 본 발명의 화합물의 프로드럭 형태는 항바이러스 활성을 가지거나, 이러한 활성을 가지는 화합물로 대사될 수 있다.

아울러 프로드럭은 개시된 뉴클레오시드의 아미노산 에스터를 포함한다(예를 들면, 아시클로비어(acyclovir)의 아미노산 에스터를 기재하는, 구체적으로는 아시클로비어와 비교하여 개선된 수용성을 보이는 글라이신 및 알라닌 에스터에 대한 참조인 European Patent Specification No. 99493, 및 α-탄소원자에 가깝게 가지치는 측쇄에 의하여 특징되어지는, 알라닌 및 글라이신 에스터와 비교하여 경구 투여 후에 향상된 생물효용을 가지는, 아시클로비어의 발린 에스터를 개시하는 참조로서 US Pat. No. 4,957,924(Beauchamp). 그러한 아미노산 에스터를 준비하기 위한 과정은 참고로서 포함되어진 문헌인 US Pat. No. 4,957,924(Beauchamp)에서 개시되어 있다. 발린 그 자체에 대한 대안으로서, 아미노산의 기능을 가지는 등가물이 사용되어질 수 있다(예를 들면, 산 클로라이드 또는 산 언하이드라이드 같은 아실 할라이드). 상기와 같은 경우에 있어서, 원하지 않는 부반응을 피하기 위해서, 아미노-보호 유도체를 사용하는 것이 효과적이다.

Ⅱ. 활성 화합물

본원 발명의 일 실시예에서, 화합물은 하기 화학식으로 표현된다:

상기 식에서 R¹는 OH 또는 F이고, R⁴ 및 R⁵는 독립적으로 C₁ _-6 알킬 또는 지방알코올로부터 유래된 탄소 사슬이다. 탄소 사슬은 8 내지 34의 탄소원자를 가진 지방 알코올로부터 유래되고, 0, 1 또는 그 이상의 이중결합을 가질 수 있다. 지방알코올은, 흔히 그러나 언제나 그러는 것은 아니지만 대응하는 지방산의 환원에 의해 얻는다. 본 발명에서 사용된 용어 "지방산 라디칼(fatty acid radical)"는 결합점으로서 산의 카보닐기를 여전히 포함하고 있는 탄소 사슬을 가리킨다. 예를 들어, 올레일 알코올은 하나의 이중결합을 가진 18개의 탄소 사슬인 시스-9-옥타데센-1-올(cis-9-octadecen-1-ol)이다. 올레일 알코올(여기에서는 "올레일의 탄소 사슬"로도 일컬음)로부터 유래된 탄소 사슬은 시스-9-옥타데센(cis-9-octadecene)이다. 상기 R¹, R⁴ 및 R⁵의 값은 다음과 같다:

R¹	R⁴	R⁵
OH	Me	Me
F	Me	Me
OH	Et	Et
F	Et	Et
OH	i-Pr	i-Pr
F	i-Pr	i-Pr
OH	올레일(oleyl)의 탄소 사슬	올레일(oleyl)의 탄소 사슬
F	올레일(oleyl)의 탄소 사슬	올레일(eleyl)의 탄소 사슬

본원 발명의 다른 일 실시예에서 화합물은 하기의 화학식으로 표현된다:

상기 식에서 R¹는 청구항 1에 정의한 바와 같고, R⁶는 알칼리금속 또는 H이며, R⁷는 지방알코올로부터 유래된 탄소 사슬이다. 상기 R¹, R⁶ 및 R⁷의 대표적인 값은 다음과 같다:

R¹	R⁶	(탄소 사슬의) R⁷
OH	Na	리놀레일(linoleyl)
F	Na	리놀레일(linoleyl)
OH	K	리놀레일(linoleyl)
F	K	리놀레일(linoleyl)
OH	Na	올레일(oleyl)
F	Na	올레일(oleyl)
OH	K	올레일(oleyl)
F	K	올레일(eleyl)
OH	H	리놀레일(linoleyl)
F	H	리놀레일(linoleyl)
OH	H	올레일(oleyl)
F	H	올레일(oleyl)

상기 식에서 R¹는 청구항 1에서 정의한 바와 같고, R⁸는 -C(O)-C₈ _-34 알킬 또는 알케닐, 또는 지방산 라디칼이다. 상기 R¹, R⁶ 및 R⁷의 대표적인 값은 다음과 같다:

R¹	R⁸
OH	리놀레산 라디칼
F	리놀레일산 라디칼
OH	올레일산 라디칼
F	올레일산 라디칼

본원 발명의 4번째 실시예에서 화합물은 하기의 화학식으로 표현된다:

상기 식에서 R¹는 화학식 1에서 정의한 바와 같고, R⁹는 O 또는 NH이며, R¹⁰은 C₁ _-6 알킬 또는 지방알코올로부터 유래된 탄소 사슬이다. 상기 R¹, R⁹ 및 R¹⁰의 대표적인 값은 다음과 같다:

R¹	R⁹	R¹⁰
OH	O	Me
F	O	Me
OH	NH	Me
F	NH	Me
OH	O	Et
F	O	Et
OH	NH	Et
F	NH	Et
OH	O	i-Pr
F	O	i-Pr
OH	NH	i-Pr
F	NH	i-Pr
OH	O	올레일의 탄소 사슬
F	O	올레일의 탄소 사슬
OH	NH	올레일의 탄소 사슬
F	NH	올레일의 탄소 사슬

본원 발명의 5번째 실시예에서 화합물은 하기의 화학식으로 표현된다:

상기 식에서 R¹는 화학식 1에서 정의한 바와 같고, R¹¹는 C₁ _-6 알킬 또는 지방알코올로부터 유래된 탄소 사슬이다. 상기 R¹ 및 R¹¹의 대표적인 값은 다음과 같다:

R¹	R¹¹
OH	Me
F	Me
OH	Et
F	Et
OH	i-Pr
F	i-Pr
OH	올레일의 탄소 사슬
F	올레일의 탄소 사슬

본원 발명의 6번째 실시예에서 화합물은 하기의 화학식으로 표현된다:

상기 식에서 R¹는 화학식 1에서 정의한 바와 같고, R¹² 및 R¹³는 O 또는 NH이다. 상기 R¹, R¹² 및 R¹³의 대표적인 값은 다음과 같다:

R¹	R¹²	R¹¹
OH	O	O
F	O	O
OH	O	NH
F	O	NH
OH	NH	NH
F	NH	NH

본원 발명의 7번째 실시예에서 화합물은 하기의 화학식으로 표현된다:

상기 식에서 R¹는 화학식 1에서 정의한 바와 같고, R⁴는 C₁ _-6 알킬 또는 지방알코올로부터 유래된 탄소 사슬이며, R¹²는 O 또는 NH이다. 상기 R¹, R⁴ 및 R¹²의 대표적인 값은 다음과 같다:

R¹	R⁴	R¹²
OH	Me	O
F	Me	O
OH	Et	O
F	Et	O
OH	i-Pr	O
F	i-Pr	O
OH	올레일(oleyl)의 탄소 사슬	O
OH	Me	NH
F	Me	NH
OH	Et	NH
F	Et	NH
OH	i-Pr	NH
F	i-Pr	NH
OH	올레일(oleyl)의 탄소 사슬	NH
F	올레일(oleyl)의 탄소 사슬	NH

본원 발명의 8번째 실시예에서 화합물은 하기의 화학식으로 표현된다:

상기 식에서 R¹⁴는

이고, R¹¹, R⁷ 및 R¹³는 상기에서 정의한 바와 같다.

또한 본 발명은 4-(치환된 설포닐)페놀의 이탈기를 기초로 하여 인 중심에서 단일 또는 농축된 부분입체 이성질체를 제조하는 방법을 제공한다. 여기에서 *○는 고정된 키랄 중심을 포함하는 생물학적 시스템 내에서 모노포스페이트로 변환될 수 있는 작용기 또는 작용기들을 의미하고, G¹는 메틸, 트리플루오로메틸, 페닐 등과 같은 작용기이다. R _p /S _p 혼합물은 하나만 또는 대부분 하나만의 부분입체 이성질체가 상기 4-(치환된 티오)페놀과 반응하여 크로마토그래피 또는 결정화를 거쳐 분리되는 4-(치환된 티오)페놀과 반응함으로써 분리될 수 있다. 분리에 이어서, 티오에테르가 산화되어 설폰(sulfone)이 생성되며, 이는 모노포스페이트 프로드럭-형성제로서 사용한다.

본 발명은 4-(메틸설포닐)페놀의 이탈기를 기초로 하여 뉴클레오시드 중심에서 단일 또는 농축된 부분입체 이성질체를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 하기의 공정을 포함한다: a) 4-(메틸설포닐)페놀과 페닐 포스포로디클로리데이트(phenyl phosphorodichloridate) F1의 반응에 이어 에틸 알라닌(ethyl alanine)의 반응에 의해 약 1:1의 R _p /S _p 혼합물 G1의 제조; b) 설폰 H1으로의 산화; c) 단 하나의 부분입체 이성질체가 반응하여 크로마토그래피에 의해 분리되게 하는 H1 R _p /S _p 와 4-(메틸티오)페놀의 반응; d) 단일 또는 농축된 부분입체 이성질체 뉴클레오시드 J1의 형성을 유도하는 단일 또는 농축된 부분입체 이성질체 설폰 I1과 뉴클레오시드의 5'-OH의 반응; e) I1에 대하여 반대의 인 입체화학을 포함하는 L1을 형성하는 인 중심을 반전시키는 4-(메틸티오)페놀과 단일 또는 농축된 부분입체 이성질체 설폰 I1의 반응; f) J1에 대하여 반대의 인 입체화학인 단일 또는 농축된 뉴클레오시드 프로드럭 부분입체 이성질체의 형성을 위한 뉴클레오시드의 5'-OH와 L1의 산화에 의해 설폰의 제조.

상기 실시예에서, 일부 경우에 있어서 인 원자는 여기에서 "P*" 또는 "P"로 칭해진 키랄일 수 있는데, 이는 이와 같은 배열을 위한 칸-인골드-프렐로그 법칙(Cahn-Ingold-Prelog rules)의 인정된 의미에 해당하는 "R" 또는 "S"로 표시된다. 이들 실시예들은 인 중심에서의 키랄성으로 인하여 부분입체 이성질체(diastereomer)의 혼합물로 존재한다. 이들 실시예들의 인 중심에 키랄성이 존재할 때, 상기 화합물은 전체적으로 또는 부분적으로 R _p 또는 S _p 또는 그 혼합물일 수 있다.

Ⅲ. 입체이성질체( stereoisomerism ) 및 동질이상( polymorphism )

본 발명에서 기술된 상기 화합물은 비대칭 중심을 가질 수 있고, 본 발명에서 포함되는 모든 이성질체 형태로서, 라세미체, 라세믹 혼합물, 각각의 부분입체이성질체 및 입체이성질체가 발견될 수 있다. 키랄 중심을 가지는 본 발명의 화합물은 광학 활성 및 라세믹 형태로 존재할 수 있고 분리될 수 있다. 몇몇 화합물은 동질이상(polymorphism)으로 존재할 수 있다. 본 발명은 명세서에서 기술되어지는 유용한 성질을 가지는 본 발명의 화합물의 라세믹, 광학-활성 동질이상, 또는 입체이성질체 형태, 또는 그것들의 혼합물을 포함한다. 상기 광학 활성 형태는, 예를 들면, 재결정 기술, 광학-활성 시작 물질로부터의 합성, 키랄 합성 또는 키랄 정지상을 사용하는 크로마토그래피 분리 또는 효소 분리(enzymatic resolution)에 의하여 준비될 수 있다. 개별적인 뉴클레오시드를 분리하고 나서, 본 발명에서 기술되어진 화합물을 형성하기 위해 상기 뉴클레오시드를 합성하거나, 또는 상기 뉴클레오티드 자체를 분리하는 것 역시 가능하다.

상기 화합물의 광학적 활성 형태는 재결정 기술, 광학-활성 시작 물질로부터의 합성, 키랄 합성 또는 키랄 정지상을 사용하는 크로마토그래피 분리를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 당업계에서 알려진 어떠한 방법을 사용하여도 얻어질 수 있다.

광학 활성 물질을 얻는 방법의 예는 최소한 다음 사항을 포함한다.

ⅰ) 결정의 물리적 분리: 각 거울상 이성질체의 육안으로 보이는 결정(macroscopic crystals)을 수동으로 분리하는 기술. 상기 기술은 별개의 거울상 이성질체의 결정이 존재한다면, 예를 들어 물질이 복합체이거나, 결정이 시각적으로 구분되는 경우, 이용될 수 있다;

ⅱ) 동시 결정화( simultaneous crystallization ): 각 거울상이성질체가 상기 라세미체의 용액으로부터 개별적으로 결정화되는 기술로서, 마지막 결정이 고체 상태에서 복합체로 존재하는 경우에만 가능하다;

ⅲ) 효소 분해( enzymatic resolutions ): 효소의 존재 하에서 거울상 이성질체의 반응 속도가 다른 점을 이용하여 라세미체의 부분적 또는 완전한 분리를 가져오는 방법;

iv) 효소 비대칭 합성( enzymatic asymmetric synthesis ): 거울상이성질적으로 순수 또는 목적가는 거울상이 성질체를 얻기 위하여 최소한 한 단계의 효소 반응을 사용하는 반응을 가지는 합성 기술;

ⅴ) 화학적 비대칭 합성( chemical asymmetric synthesis ): 목적가는 거울상 이성질체가 비대칭(예. 키랄성) 생산물을 생산하는 조건 하, 키랄 촉매 또는 키랄 보조제(chiral auxiliaries)를 사용하여 얻어지는, 키랄 비키랄 전구물질로부터 합성되어지는 합성 방법;

ⅵ) 부분입체이성질체 분리( diastereomer separations ): 라세믹 화합물과, 각각의 거울상 이성질체를 부분입체이성질체로 바꾸는, 거울상이성질적으로 순수한 시약(키랄 보조제)이 반응하는 기술. 결과적으로 얻어진 부분입체이성질체는 그들의 조금 더 명확한 구조적 차이 및 목적가는 거울상이성질체를 얻기 위하여 나중에 제거되는 키랄 보조제에 의하여 크로마토그래피 또는 결정화됨으로써 분리된다;

ⅶ) 1차-2차-순 비대칭 변형( first - and second - order asymmetric transformations): 라세미체로부터 부분입체이성질체가 평형을 이루어 목적가는 거울상이성질체로부터의 부분입체이성질체가 용액에서 우세하거나, 목적가는 거울상이성질체로부터 부분입체이성질체의 우세한 결정화가 평형을 방해하여 결국에는 모든 물질이 목적가는 거울상이성질체로부터 결정질 부분입체이성질체로 전환되는 기술. 목적가는 거울상이성질체는 그 후에 부분입체이성질체로부터 분리된다;

ⅷ) 키네틱 분해( kinetic resolutions ): 이 기술은 키네틱 조건 하에서 거울상이성질체와가 키랄, 비-라세믹 시약 또는 촉매와 동등하지 않은 반응 속도를 가지는 점을 이용하여 라세미체(또는 부분적으로 분해된 화합물의 더 나은 분해능을 가지는 라세미체)의 완전한 부분적 또는 완전한 분해를 가져오는 것을 의미한다;

ⅸ) 비- 라세믹 전구물질로부터 거울상이성질 특이적 합성( enantio specific synthesis from non - racemic precursors ): 목적가는 거울상이성질체가 비-키랄 시작물질로부터 얻어지고 입체화학적 온전함이 없거나 전 반응 과정에 걸쳐서 아주 적게 얻어지는 합성 기술;

ⅹ) 키랄 액체크로마토그래피( chiral liquid chromatography ): 라세미체의 거울상이성질체가 정지상(HPLC를 포함하지만 이에 제한되지 않는)에서의 다른 반응을 보이는 점을 이용하여 액체이동상으로 분리되는 기술. 상기 정지상은 키랄 물질로 만들어질 수 있고 이동상은 다른 반응을 유도하기 위하여 추가적인 키랄 물질을 포함할 수 있다;

ⅷ) 키네틱 분해( kinetic resolutions ): 이 기술은 키네틱 조건 하에서 거울상이성질체와가 키랄, 비-라세믹 시약 또는 촉매와 동등하지 않은 반응 속도를 가지는 점을 이용하여 라세미체(또는 부분적으로 분해된 화합물;

ⅹⅰ) 키랄 가스 크로마토그래피( chiral gas chromatography ): 고정된 비-라세믹 키랄 흡착상을 포함하는 컬럼을 가지는 기체 이동상에서의 다른 반응을 이용하여 라세미체가 휘발되고 거울상이성질체가 분리되는 기술;

ⅹⅱ) 키랄용매와 함께 추출( extraction with chiral solvents ): 하나의 거울상이성질체가 특별한 키랄 용매로 우선적으로 용해됨에 의해 거울상 이성질체가 분리되는 기술;

ⅹⅲ) 키랄 막을 가로지르는 운반( transport across chiral membranes ): 라세미체가 얇은 막 장벽과 접촉하여 존재하는 기술이다. 상기 장벽은 일반적으로 하나의 층이 라세미체를 포함하는 두 개의 혼합성 액체로 분리되고, 농도 또는 압력 구배 같은 구동력이 막 장벽을 가로지르는 우선 운반을 초래한다. 분리는 라세미체에서 오직 하나의 거울상 이성질체만 통과를 허락하는 막의 비-라세믹 키랄 성질의 결과로서 일어난다.

연속 모사 이동층 크로마토그래피(simulated moving bed chromatography)를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 키랄 크로마토그래피는 하나의 구체예에서 사용된다. 매우 다양한 종류의 키랄 정지상을 상업적으로 구매할 수 있다.

Ⅳ. 뉴클레오티드 염 또는 프로드럭 제형

화합물이 안정하고 독성이 없는 산 또는 염기 염을 형성하기 위해서 충분히 염기성이거나 산성인 경우에 있어서, 약학적으로 허용가능한 염으로서 상기 화합물의 투여는 적절할 것이다. 약학적으로 허용가능한 염의 예는 산과 함께 생성되는 유기산 부가 염(organic acid addition salts)이고, 이것은 생리적으로 허용가능한 음이온, 예를 들면, 토실레이트(tosylate), 메탄설포네이트(methanesulfonate), 아세테이트(acetate), 시트레이트(citrate), 말로네이트(malonate), 타르타레이트(tartarate), 숙시네이트(succinate), 벤조에이트(benzoate), 아스코베이트(ascorbate), α-케토글루타레이트(α-ketoglutarate) 및 α-글리세로포스페이트(α- glycerophosphate)를 형성한다. 아울러, 설페이트(sulfate), 니트레이트(nitrate), 바이카보네이트(bicarbonate) 및 카보네이트(carbonate)염을 포함하지만 이에 제한되지 않는 적절한 무기염 역시 생성될 수 있다.

약학적으로 허용가능한 염은 당업계에서 알려진 통상적인 방법, 예를 들면 아민 같은 염기 화합물과 적절한 산과의 반응에 의하여, 생리학적으로 허용되는 염을 제공함으로써 얻어질 수 있다. 카복실산의 알칼리 금속(예. 소듐, 포타슘 또는 리튬) 또는 알칼리 토금속(예. 칼슘) 염 또한 만들어질 수 있다.

본 발명에서 기술하는 상기 뉴클레오티드 프로드럭은 활성,생물이용가능성, 안정성 또는 뉴클레오티드 모노포스페이트의 성질을 바꾸는 다른 것들을 높이기 위하여 추가적으로 투여될 수 있다.

다수의 뉴클레오티드 프로드럭 리간드가 알려져 있다. 일반적으로 알킬화, 아실화 또는, 상기의 모노포스페이트 또는 뉴클레오시드의 다른 유사체의 친유성 변형은 뉴클레오티드의 안정성을 증가시킬 것이다.

모노포스페이트 잔기상에서 하나 이상의 수소로 대안될 수 있는 치환 그룹의 예로는 알킬(alkyl), 아릴(aryl), 스테로이드(steroids), 카보하이드레이트(carbohydrates), 당(sugars)을 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 1,2-디아실글리세롤(1,2-diacylglycerol) 및 알콜(alcohols)가 있다. 많은 것이 R. Jones & N. Bischofberger, Antiviral Research, 1995, 27, 1-17 and S.J. Hecker & M.D. Erion, J. Med . Chem., 2008, 51, 2328-2345에 기술되어 있다. 개시된 뉴클레오티드가 조합된 어떤 것도 원하는 결과를 얻기 위하여 사용될 수 있다.

상기 활성 뉴클레오티드는 또한 하기 제시된 참고 문헌에 개시된 5'-포스포에터 리피드(5'-phosphoether lipid)로서 제공될 수 있으며, 참고문헌은 다음과 같다: Kucera, L.S., N. Iyer, E. Leake, A. Raben, Modest E.K., D.L.W., and C. Piantadosi, "Novel membrane-interactive ether lipid analogs that inhibit infectious HIV-I production and induce defective virus formation," AIDS Res . Hum. Retroviruses, 1990, 6, 491-501; Piantadosi, C, J. Marasco CJ. , S. L. Morris-Natschke, K.L. Meyer, F. Gumus, J.R. Surles, K.S. Ishaq, L.S. Kucera, N. Iyer, CA. Wallen, S. Piantadosi, and EJ. Modest, "Synthesis and evaluation of novel ether lipid nucleoside conjugates for anti-HIV activity," J. Med . Chem., 1991, 34, 1408-14; Hosteller, K.Y., D.D. Richman, D.A. Carson, L.M. Stuhmiller, G.M. T. van Wijk, and H. van den Bosch, "Greatly enhanced inhibition of human immunodeficiency virus type 1 replication in CEM and HT4-6C cells by 3'-deoxythymidine diphosphate dimyristoylglycerol, a lipid prodrug of 3,-deoxythymidine," Antimicrob . Agents Chemother., 1992, 36, 2025-29; Hostetler, K.Y., L.M. Stuhmiller, H. B. Lenting, H. van den Bosch, and D.D. Richman, "Synthesis and antiretroviral activity of phospholipid analogs of azidothymidine and other antiviral nucleosides." J. Biol . Chem., 1990, 265, 61127.

뉴클레오시드로 공유 결합적으로 함입될 수 있는, 바람직하게는 본 발명에서 기술된 뉴클레오티드의 R² 및/또는 R³ 위치에서, 적절한 친유성 치환기 또는 친유성 물질을 개시하는 제한되지 않는 예는 US Pat. Nos. 5,149,794(Yatvin et al .); 5,194,654(Hostetler et al.), 5,223,263(Hostetler et al.); 5,256,641(Yatvin et al.); 5,411,947(Hostetler et al.); 5,463,092(Hostetler et al.); 5,543,389(Yatvin et al.); 5,543,390(Yatvin et al.); 5,543,391(Yatvin et al.); and 5,554,728(Basava et al.)을 포함하고, 상기 모든 문헌은 참고문헌으로 포함된다. 본 발명의 뉴클레오시드에 붙을 수 있는 친유성 치환기 또는 친유성 물질을 개시하는 외국 특허출원은 WO 89/02733, WO 90/00555, WO 91/16920, WO 91/18914, WO 93/00910, WO 94/26273, WO 96/15132, EP 0 350 287, EP 93917054.4, 및 WO 91/19721를 포함한다.

Ⅴ. 치료 방법

HCV, 노로바이러스, 사포바이러스, 뎅기열 바이러스, 차쿤구니야 바이러스 및/또는 황열 뿐만 아니라 칼리시비리다에(Caliciviridae) 또는 플라비비리다에(Flaviviridae) 분류학상 과(taxonomic family) 내의 다른 바이러스, 또는 그것들의 유전자 조각에 의하여 감염된, 인간을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 숙주는 약학적으로 허용되는 담체 또는 담체의 존재 하에서, 상기 활성 화합물, 약학적으로 허용되는 프로드럭 또는 그것을의 염을 환자에게 유효량 투여함으로써 치료될 수 있다. 상기 활성 물질은 액체 또는 고체 형태로 적절한 어떠한 경로, 예를 들면, 경구, 비경구, 정맥 주사, 피부층내 주사, 피하 주사, 또는 국소성으로 투입되는 것이 가능하다.

바이러스 감염을 치료하기 위한 치료법의 용도에서, 상기 화합물 및/또는 조성물은 바이러스 감염으로 진단받은 환자들에게 치료적으로 도움을 얻기 위한 적당한 복용량으로 투여될 수 있다. "치료학적인 도움" 및 등가물에 의한다는 것은, 화합물의 투여가 시간이 지남에 EK라 환자에게 도움이 되는 효과를 이끌어낸다는 것을 의미한다. 예를 들면, 치료학적인 도움은 환자에게서 바이러스 역가 또는 바이러스 양이 감소하거나 증가를 멈출 때 얻어질 수 있다.

아울러 만약 화합물의 투여가 느리거나 바이러스 감염에 일반적으로 동반하게 되는 다양한 증상의 시작을 완전히 멈춘다면, 환자의 바이러스 역가 또는 바이러스 양과는 무관하게 치료학적 도움이 얻어질 수 있다. 본 발명에서 개시된 상기 화합물 및/또는 조성물은 또한 바이러스 감염의 위험이 있거나 바이러스에 노출된 환자에게 바이러스의 발달을 예방하기 위하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 상기 화합물 및/또는 그 조성물 는 상기 바이러스에 노출된 것으로 보이는 환자에게 투여될 수 있다.

Ⅵ. 조합 또는 대안 치료법

일 실시예에서, 본 발명의 상기 화합물은 유입 저해제(entry inhibitors), 리버스 트랜스크립타제 저해제(reverse transcriptase inhibitors), 프로테아제 저해제(protease inhibitors), 및 면역-기초 치료용 물질(immune-based therapeutic agents.)로부터 선택된 최소한 하나의 다른 항바이러스 물질과 함께 사용될 수 있다.

예를 들면, HIV 또는 HCV 감염 예방 또는 치료용으로 사용될 때, 상기 활성 화합물 또는 그것의 프로드럭 또는 약학적으로 허용가능한 염은 항-HCV 물질과 같은 상기 화학식을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다른 항바이러스 물질과 함께 조합하거나 또는 대안적으로 투여될 수 있다. 일반적으로, 조합 치료법에서, 둘 이상 물질의 효과적인 복용은 함께 투여되는 것인 반면, 대안 치료법에 있어서, 각각의 물질의 효과적인 복용은 연속적으로 투여되는 것이다. 상기 복용은 약물의 흡수, 불활성화 및 배설속도에 의존할 뿐만 아니라, 당업계에 알려진 다른 요인들에도 의존한다. 복용값은 또한 완화되는 상태의 혹독함에 따라 다양할 것임에 주목한다. 더욱이 어떤 특별한 사안에 있어서 특별한 복용 요법 및 스케쥴은 개인적 필요 및 투여하거나 상기 조성물의 투여를 감독하는 사람의 전문적인 지식에 따라서 시간이 조절되는 것으로 이해된다.

본 발명에서 개시된 상기 화합물과의 조합으로 사용되는 항바이러스 물질의 제한되지 않는 예는 하기 표 1에 개시되어 있다.

표 1: 현재 임상 개발에서의 항-C형 간염 화합물

Ⅶ. 노로바이러스 감염 치료용 결합 치료법

본 발명에서 기재된 상기 항바이러스 물질과 더불어, 다른 화합물 또한 존재할 수 있다. 예를 들면, 타입 I 인터페론(type I interferon(IFN))은 노로바이러스 복제를 저해하는 것으로 알려져 있다. 어떤 비타민, 구체적으로 비타민 C는 어떤 바이러스 감염을 치료하는데 효과적인 것으로 알려져 있다. 한 연구는 비타민 A 보충이 노로바이러스 GII 감염의 유행을 감소시키고, 노로바이러스 GI 및 GII 쉐딩(shedding) 모두의 길이를 증가시키고, NoV-연관 설사를 감소시키는 것을 보여준다(1: J Infect Dis. 2007 Oct l;196(7):978-85. Epub 2007 Aug 22). 리신(Lysine)은 항바이러스 물질로 알려져 있다. 아울러 유전자그룹 II 노로바이러스(genogroup II(GII) Norovirus)로부터 유래한 바이러스-유사 물질(VLPs)은 세포 표면 헤파란황산프로테오글리칸(heparan sulfate proteoglycan) 및 다른 음성 전하의 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycans)에 결합하는 것으로 알려져 있다. 감염 증상을 치료하기 위하여, 구토방지, 설사방지 물질, 및/또는 진통제가 함께 투여될 수 있다.

Ⅷ. 약학 조성물

플라비비리다에 바이러스 과 또는 칼리시비리다에 바이러스 또는 그것들의 유전자 조각, 또는 암에 의하여 감염된, 인간을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 숙주는 약학적으로 허용되는 담체 또는 담체의 존재 하에서, 상기 활성 화합물, 약학적으로 허용되는 프로드럭 또는 그것을의 염을 환자에게 유효량 투여함으로써 치료될 수 있다. 상기 활성 물질은 액체 또는 고체 형태로 적절한 어떠한 경로, 예를 들면, 경구, 비경구, 정맥 주사, 피부층내 주사, 피하 주사, 또는 국소성으로 투입되는 것이 가능하다.

상기 화합물의 바람직한 투여량은 하루에 수용자의 체중에 따라 0.1 내지 약 100mg/kg이 될 것이고, 조금 더 일반적으로는 1 내지 50mg/kg이며, 바람직하게는 1 내지 약 20mg/kg의 범위가 될 것이다. 상기의 약학적으로 허용되는 염 및 프로드럭의 효과적인 투여 범위는 배달되는 모뉴클레오시드의 무게에 기초하여 계산될 수 있다. 만약 염 또는 프로드럭이 그 자체로서 활성을 보인다면, 효과적인 투여량은 상기 염 또는 프로드럭의 무게를 이용하는 상기의 기재처럼 추산되거나 당업계에서 알려진 다른 방법에 의할 수 있다.

상기 화합물은, 유닛 제형당 7 내지 3000mg, 바람직하게는 70 내지 1400mg의 활성 성분을 가지지만 이에 제한되지 않는, 어떤 적절한 유닛 제형의 형태로 알맞게 투여된다. 50-1000mg의 경구 투여가 일반적으로 알맞다.

이론상 상기 활성 성분은 상기 활성 화합물의 최고혈장농도가 0.2 내지 70μM, 바람직하게는 1.0 내지 15μM에 이르도록 투여되어야 한다. 이것은, 예를 들면, 필요에 따라 식염수에서, 상기 활성 성분의 0.1 내지 5% 용액의 정맥 주사에 의하거나, 또는 활성 성분의 1회분으로 투여됨으로써 가능할 수 있다.

약학 조성물에서 활성 성분의 농도는 약물의 흡수, 불활성화 및 배설 속도에 의존할 뿐만 아니라, 당업계에 알려진 다른 요인들에도 의존한다. 복용값은 또한 완화되는 상태의 혹독함에 따라 다양할 것임에 주목한다. 더욱이 어떤 특별한 사안에 있어서 특별한 복용 요법 및 스케쥴은 개인적 필요 및 상기 조성물을 투여하거나 투여를 감독하는 사람의 전문적인 지식에 따라서 시간이 조절되는 것이고, 본 발명에서 제시하는 농도 범위는 오직 예시를 보이기 위한 것이고 청구항에 기재된 조성물의 범위나 실시를 제한하려는 것은 아니다. 상기 활성 성분은 한번에 투여될 수 있고, 또는 다양한 시간적 간격을 가지면서 소량 복용을 반복하여 투여될 수 있다.

상기 활성 화합물의 바람직한 투여 방법은 경구 투여이다. 경구 투여 조성물은 일반적으로 비활성의 희석액 또는 먹을 수 있는 담체를 포함할 것이다. 그것들은 젤라틴 캡슐 내에 넣어지거나 정제(tablets)로 압착될 수 있다. 경구 치료법 투여의 목적으로, 상기 활성 화합물은 첨가제를 포함할 수 있고, 정제, 트로키(troches), 또는 캡슐의 형태로 사용될 수 있다. 약학적으로 호환가능한 결합 물질, 또는/및 보조제가 상기 조성물의 일부로서 포함될 수 있다.

상기 정제, 알약, 캡슐, 트로키 및 그와 유사한 것은 다음 성분, 또는 비슷한 성질을 가지는 화합물을 포함할 수 있다 : 마이크로크리스달린 셀롤로즈(microcrystalline cellulose)같은 바인더; 트래캔거스 고무 또는 젤라틴; 녹말 또는 락토오즈 같은 첨가제, 알지닉 산(alginic acid) 같은 분해 물질, 프리모겔 또는 옥수수 전분; 마그네슘 스테아레이트(magnesium stearate) 또는 스테로데스(Sterotes)같은 윤활유; 콜로이달 실리콘 디옥사이드(colloidal silicon dioxide)같은 활택제; 설탕 또는 사카린 같은 단맛이 나는 물질; 또는 페퍼민트, 메틸살리시레이트 또는 오렌지 맛 같은 맛을 내는 물질. 유닛 제형이 캡슐일 때, 상기 타입의 재료에 더하여, 지방유(fatty oil)같은 액상 담체를 포함할 수 있다. 추가적으로, 유닛 제형은 ,예를 들면, 설탕코팅, 셀락(shellac), 또는 다른 장용성 물질과 같은 유닛제형을 생리적은 형태로 변형시키는 다양한 다른 물질을 포함할 수 있다.

상기 화합물은 엘릭서제(elixir), 현탁액, 시럽, 웨이퍼(wafer), 껌 또는 이와 유사한 것의 구성요소로서 투여될 수 있다. 상기 활성 구성요소에 추가적으로, 시럽은, 단맛을 내는 물질로서 설탕, 및 다른 보존제, 염료 및 색을 내고 맛을 내는 물질을 포함할 수 있다.

상기 화합물 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 전구 약물 또는 염은 또한 목적가는 반응을 악화시키지 않는 다른 활성 물질, 또는 목적가는 반응을 보충하는 항생제, 항진균제, 항염증제 또는 다른 뉴클레오시드 화합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는 항바이러스 물질과 함께 혼합될 수 있다. 비경구, 피내,피하, 국부 적용에 사용되는 용액 또는 현탁액은 다음 구성물을 포함할 수 있다: 주사용으로 물과 같은 살균 희석제, 식염수, 불휘발유(fixed oils), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycols), 글리세린(glycerine), 프로필렌 글리콜(propylene glycol) 또는 다른 합성 용매; 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤과 같은 항박테리아 물질; 아스코르빅 산 또는 소듐 비설파이트(sodium bisulfite)과 같은 항산화제, 에틸렌디아민테트라아세틱 산(ethylenediaminetetraacetic acid)과 같은 킬레이트제; 아세테이트, 시트레이트, 또는 포스페이트와 같은 버퍼(buffers), 및 소듐 클로라이드(sodium chloride) 또는 덱스트로즈(dextrose) 같은 긴장성 조정용 물질. 상기 비경구용 제제는 앰플, 일회용 주사기 또는 유리 또는 플라스틱으로 만들어진 다양한 병에 동봉할 수 있다.

만약 정맥 주사로 투여되는 경우, 바람직한 담체는 생리 식염수 또는 PBS(phosphate buffered saline)이다.

바람직한 실시예에서, 상기 활성 화합물은 신체에서 신속한 제거에 대항하여 상기 화합물을 보호할, 주입 및 마이크로캡슐로 싸여 있는 전달 시스템(microencapsulated delivery systems)을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 방출조절제(controlled release formulation) 같은 담체와 함께 조제된다. 에틸렌 비닐 아세테이트(ethylene vinyl acetate), 폴리언하이드라이드(polyanhydrides), 폴리글리코릭 산(polyglycolic acid), 콜라겐(collagen), 폴리오소에스터(polyorthoesters) 및 폴리악틱 산(polylactic acid) 같은 생분해성, 생체에 적합한 폴리머가 사용될 수 있다. 예를 들면, 장용 코팅 화합물은 위산에 의한 분해로부터 보호되도록 만들어진다. 그러한 제형을 준비하는 방법은 당업계에서 명백할 것이다. 적절한 재료는 또한 상업적으로 구매 가능할 것이다.

아울러 리포솜 현탁액(바이러스 항원에 대한 모노클로날 항체를 가지면서 감염 세포를 표적으로 하는 리포솜을 포함하지만 이에 제한되지 않는)은 약학적으로 허용가능한 담체로서 선호된다. 이것들은 당업계에서 널리 알려진 방법, 예를 들면 미국 특허 No. 4,522,811(참고문헌으로 포함된)에 개시된 바와 같이 조제될 수 있다. 예를 들면, 리포솜 제형은 용기의 표면에 건조된 지질의 얇은 층을 남기고 증발되는 무기 용매에 적절한 지질(스테아로릴 포스파티딜 에탄올 아민(stearoyl phosphatidyl ethanolamine), 스테아로릴 포스파티딜 콜린(stearoyl phosphatidyl choline), 아라카도일 포스파티딜 콜린(arachadoyl phosphatidyl choline), 및 콜레스테롤(cholesterol))을 용해시켜서 제조될 수 있다. 상기 활성 화합물 또는 그것의 모노포스페이트, 디포스페이트, 및/또는 트리포스페이트 유도체의 수용성 용액은 그 후에 용기 속으로 들어간다. 그 후 상기 용기는 용기의 벽면으로부터 지질이 없는 물질을 손으로 저어주게 되고 지질 응고물질이 용해되어 리포솜 현탁액이 생성된다.

상기 발명을 설명하기 위하여 사용되는 용어는 당업계에서 공통적이고 당업자에게 잘 알려져 있는 것이다. 본 발명에서 사용된, 축약형은 다음과 같은 의미를 가진다.

aq 수용성(aqueous)

CDI 카보닐디이미다졸(carbonyldiimidazole)

DMF N,N-디메틸포름아마이드(N,N -dimethylformamide)

DMSO 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide)

EDC 1-에틸-3-(3-디메틸라미노프로필)카보디이미드 하이드로클로라이드(1-ethyl-3-(3-dimethyllaminopropyl)carbodiimide hydrochloride)

EtOAc 에틸 아세테이트(ethyl acetate)

h 시(hour/hours)

HOBt N -하이드록시벤조트리아졸(N-hydroxybenzotriazole)

M 몰(molar)

min 분(minute)

rt 또는 RT 실내 온도(room temperature)

TBAT 테트라부틸암모늄 트리페닐디플로로실리케이트(tetrabutylammonium triphenyldifluorosilicate)

TBTU O-(벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄(O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium tetrafluoroborate)

THF 테트라하이드루퓨란(tetrahydrofuran)

Ⅸ. 활성 화합물 제조용 일반적인 반응식

2,6-디아미노 2'-C-Me 퓨린 뉴클레오시드 모노포스페이트(2,6-diamino 2'-C-Me purine nucleoside monophosphate) 및 포스포네이트 프로드럭(phonates prodrugs)의 용이한 제조를 위한 방법 또한 제공된다. 본 발명에서 개시된 상기 2,6-디아미노 2'-C-Me 퓨린 뉴클레오시드 모노포스페이트 및 포스포네이트 프로드럭은 이하 기재된 바와 같이 제조되거나, 또는 당업계에서 알려진 다른 방법으로 제조될 수 있다. 당업계에서 일반적인 기술자는 이러한 반응식이 제한이 없고 본 발명의 목적 및 범위를 벗어남이 없이 세부사항의 변경이 가능함을 이해할 것이다.

일반적으로, 먼저 대응하는 뉴클레오시드를 준비하고 생체 내에서 뉴클레오시드 모노포스페이트로 용이하게 변환될 수 있는 여기에 기재된 모노포스페이트 프로드럭으로서의 5'-하이드록시기(및 3'-하이드록시기)를 캡핑하고 결국에 활성 트리포스페이트 형태로 변환시킴으로써 화학식 A 및 B의 뉴클레오시드 모노포스페이트 프로드럭을 제조한다.

다양한 반응식이 이하에 요약되어 있다.

반응식 1은 본 발명의 활성 화합물의 합성에 있어서 제한이 없는 예시이고, 특히 뉴클레오시드 1로의 합성법이다.

반응식 2는 본 발명의 활성 화합물의 합성에 있어서 제한이 없는 예시이고, 특히 뉴클레오시드 1로의 대안합성법이다.

반응식 3은 본 발명의 활성 화합물의 합성에 있어서 제한이 없는 예시이고, 특히 모노포스페이트 프로드럭 I의 합성법이다.

반응식 4는 본 발명의 활성 화합물의 합성에 있어서 제한이 없는 예시이고, 특히, 모노포스페이트 프로드럭 II의 합성법이다.

반응식 5는 본 발명의 활성 화합물의 합성에 있어서 제한이 없는 예시이고, 특히, 모노포스페이트 프로드럭 III의 합성법이다.

반응식 6은 본 발명의 활성 화합물의 합성에 있어서 제한이 없는 예시이고, 특히, 모노포스페이트 프로드럭 IV-VI의 합성법이다.

반응식 7은 본 발명의 활성 화합물의 합성에 있어서 제한이 없는 예시이고, 특히, 모노포스페이트 프로드럭 VII의 합성법이다.

반응식 8은 본 발명의 활성 화합물의 합성에 있어서 제한이 없는 예시이고, 특히, 모노포스페이트 프로드럭 VIII-IX의 합성법이다.

반응식 9는 1'-α-메실레이트(1'-α-mesylate) 16으로의 경로에 있어서의 제한이 없는 예시이다.

반응식 10은 1'-α-메실레이트(1'-α-mesylate) 16으로의 경로에 있어서의 제한이 없는 대안예시이다.

본 분야의 당업자에 의하여 달성될 수 있는, 이하에서 제시된 방법에 의하여 우선 뉴클레오시드 I를 제조함으로써 일반적인 반응식 1-2에 의하여 화학식 A 및 B의 화합물이 제조된다: a) Rajagopalan, P.; Boudinot, F. D; Chu, C. K.; Tennant, B. C; Baldwin, B. H.; Antiviral Nucleosides: Chiral Synthesis and Chemotheraphy: Chu, C. K.; Eds. Elsevier: 2003. b) Recent Advances in Nucleosides: Chemistry and Chemotherapy: Chu, C. K.; Eds. Elsevier: 2002. c) Frontiers in Nucleosides & Nucleic Acids, 2004, Eds. R. F. Schinazi & D. C. Liotta, IHL Press, Tucker, GA, USA, pp: 319-37 d) Handbook of Nucleoside Synthesis: Vorbruggen H. & Ruh-Pohlenz C. John Wiley & sons 2001). 특히, TMSOTf와 같은 루이스산의 존재하에 슈가 2를 보호되고, 실릴화되거나 자유 퓨린 염기와 커플링시킴으로써 뉴클레오시드 1을 제조할 수 있다. 3'- 및 5'-하이드록시기의 탈보호화는 뉴클레오시드 1을 생성한다.

반응식 1 뉴클레오시드 1의 합성법(염기는 2,6-디아미노퓨린이거나(2-NH₂,6-Cl 퓨린과 같은) 2,6-디아미노퓨린으로 전환가능하다; R¹는 활성 화합물 섹션에서 정의한 바와 같다.).

대안으로서, 뉴클레오시드 1은 1'-할로, 1'-설포네이트 또는 1'-하이드록시 화합물 3으로부터 제조될 수 있다. 1'-할로 또는 1'-설포네이트의 경우에서는 트리에틸아민 또는 소듐 하이드라이드와 같은 염기의 존재하에서 보호화되거나 자유 퓨린 염기가 탈보호화되어 뉴클레오시드 1을 생성한다. 1'-하이드록시의 경우에서는 디이소프로필 아조디카복실레이트와 같은 미츠노부 커플링제(Mitsunobu coupling agent)의 존재하에서 보호화되거나 자유 퓨린 염기를 탈보호화하여 뉴클레오시드 1을 생성한다.

반응식 2 뉴클레오시드 1의 대안 합성법(염기는 2,6-디아미노퓨린이거나(2-NH₂,6-Cl 퓨린과 같은) 2,6-디아미노퓨린으로 전환가능하다; R¹는 활성 화합물 섹션에서 정의한 바와 같다.).

페놀 4로부터 출발하여 반응식 3에 기재된 대로 하여 모노포스페이트 프로드럭 I을 제조할 수 있다. 4를 포스포러스 옥시클로라이드(phosphorous oxychloride) 또는 포스포로티오일 트리클로라이드(phosphorothioyl trichloride)에 노출시켜 포스포라미데이트(phosphoramidate) 7을 생성한다. 그 후에 5'-하이드록시기와 클로로포스포릴아미노 프로파노에이트(chlorophosphorylamino propanoate) 7의 반응에 의해 뉴클레오시드 1을 모노포스페이트 유사체 8로 변환시킬 수 있다. 존재한다면, 염기 및/또는 8의 슈가로부터의 보호기의 제거는 모노포스페이트 프로드럭 I을 제공한다.

반응식 3 모노포스페이트 프로드럭 I의 합성법(염기는 2,6-디아미노퓨린이거나 2,6-디아미노퓨린으로 전환가능하다; R¹는 활성 화합물 섹션에서 정의한 바와 같다.).

포스포러스 옥시클로라이드(phosphorous oxychloride) 또는 포스포로티오일 트리클로라이드(phosphorothioyl trichloride)와 페놀 4의 반응에 의해 디페닐 포스포로클로리데이트(diphenyl phosphorochloridate) 9를 생성함으로써 모노포스페이트 프로드럭 II을 제조할 수 있다(반응식 4). 그 후에 5'-하이드록시기와 디페닐 포스포로클로리데이트 9의 반응에 의해 뉴클레오시드 1을 중간체 모노포스페이트 유사체로 변환시킬 수 있다. 필요하다면, 보호기의 제거는 모노포스페이트 프로드럭 II을 제공한다.

반응식 4 모노포스페이트 프로드럭 II의 합성법(염기는 2,6-디아미노퓨린이거나 2,6-디아미노퓨린으로 전환가능하다; R¹, Y, R¹⁶ 및 R¹⁷은 활성 화합물 섹션에서 정의한 바와 같다.).

포스포러스 옥시클로라이드 또는 포스포로티오일 트리클로라이드와 뉴클레오시드 1의 반응에 의해 모노포스페이트 프로드럭 III을 제조할 수 있다. 그 후에 생성된 중간체는 L-아미노 에스테르와 반응하고 물과 반응할 수 있다(반응식 5). 보호기의 제거는 모노포스페이트 프로드럭 III을 제공한다.

반응식 5 모노포스페이트 프로드럭 III의 합성법(염기는 2,6-디아미노퓨린이거나 2,6-디아미노퓨린으로 전환가능하다; R¹, Y, R¹⁷ 및 R¹⁸은 활성 화합물 섹션에서 정의한 바와 같다.).

포스포러스 옥시클로라이드 또는 포스포로티오일 트리클로라이드와 뉴클레오시드 1의 반응에 의해 모노포스페이트 프로드럭 IV을 제조할 수 있다. 생성된 중간체는 그 후에 L-아미노산의 에스테르와 반응하고 11과 반응할 수 있다(반응식 6). 필요하다면, 보호기의 제거는 모노포스페이트 프로드럭 IV을 제공한다. 10를 R¹⁵OH 또는 11로 치환하면서 유사한 공정을 이용하여 모노포스페이트 프로드럭 V 및 VI 또한 제조할 수 있다.

반응식 6 모노포스페이트 프로드럭 IV - VI의 합성법(염기는 2,6-디아미노퓨린이거나 2,6-디아미노퓨린으로 전환가능하다; R¹, Y, R¹⁷, R¹⁸ 및 R²⁰은 활성 화합물 섹션에서 정의한 바와 같다.).

포스포러스 옥시클로라이드 또는 포스포로티오일 트리클로라이드와 뉴클레오시드 1의 반응에 의해 사이클릭 포스페이트, 포스포라미데이트, 또는 포스포로디아미데이트 프로드럭 IV을 제조할 수 있다. 생성된 중간체는 그 후에 디뉴클레오필(dinucleophile) 12와 반응할 수 있다(반응식 7). 필요하다면, 보호기의 제거는 모노포스페이트 프로드럭 VII을 제공한다.

반응식 7 모노포스페이트 프로드럭 VII의 합성법(염기는 2,6-디아미노퓨린이거나 2,6-디아미노퓨린으로 전환가능하다; R¹, Y 및 R²⁰은 활성 화합물 섹션에서 정의한 바와 같다.).

포스포러스 옥시클로라이드 또는 포스포로티오일 트리클로라이드와 페놀 4와 같은 OH 또는 NH 함유 시약의 반응에 의해 3',5'-사이클릭 포스페이트 프로드럭 VIII을 제조할 수 있다. 생성된 중간체 15는 정제되거나 뉴클레오시드 1과 함께 직접 사용할 수 있다(반응식 8). 필요하다면, 보호기의 제거는 모노포스페이트 프로드럭 VIII을 제공한다. 10, 11, 13 또는 14와 유사한 방식으로 관련된 3',5'-사이클릭 포스페이트 프로드럭 IX를 제조할 수 있다. 또한, 포스포러스(III) 중간체와 1를 반응시키고 포스포러스(V)를 산화시키는 것과 연관된 공지의 방법에 의해 3',5'-사이클릭 포스페이트 프로드럭 VIII - IX를 제조할 수 있다(반응식 8).

반응식 8 모노포스페이트 프로드럭 VIII - IX의 합성법(염기는 2,6-디아미노퓨린이거나 2,6-디아미노퓨린으로 전환가능하다; R¹, Y, R¹⁷, R¹⁸ 및 R²⁰은 활성 화합물 섹션에서 정의한 바와 같다.).

16(반응식 9)과 같은 X=설포네이트일 때(반응식 2) 화학식 3의 경우에 설포닌산과의 커플링 조건 하에서 15로부터 제조할 수 있다. 예를 들면 아조 카복실레이트 및 포스포러스(III) 시약의 미츠노부 커플링과 같은 커플링의 조건은 16ㅇ을 제공할 수 있다. 설포닌산 또는 설포네이트 염의 존재하에 화합물 15는 디옥산 또는 톨루엔과 같은 용매 내에서 디이소프로필 아조디카복실레이트 및 트리페닐포스핀과 커플링될 수 있다.

반응식 9 1'-α-메실레이트 16의 경로

또한, 우선 카복실산 또는 카복실레이트염와의 미츠노부 커플링과 같은 커플링 조건에 의해(반응식 9) 15의 하이드록시기를 반전시킴으로써 15로부터 설포네이트 16을 제조할 수 있으며, 아조 카복실레이트 및 포스포러스(III) 시약은 17을 제조할 수 있다. 아세트산 또는 아세테이트염의 존재하에 화합물 17은 디옥산 또는 톨루엔과 같은 용매하에 디이소프로필 아조디카복실레이트 및 트리페닐포스핀과 커플링하여 15를 제조할 수 있다. 17의 아세테이트의 선택적인 제거는 메탄올과 같은 알코올성 용매 내에서 포타슘 카보네이트와 같은 염기와 함께 실시하여 1'-반전된 알코올 18을 제공할 수 있다. 16에서 18의 변환은 트리에틸아민 또는 디이소프로필 에틸과 같은 염기의 존재하에서 디클로로메탄 또는 디클로로에탄과 같은 용매 내에서 설포닐 클로라이드 또는 안하이드라이드와 함께 실시할 수 있다.

반응식 10 1'-α-메실레이트 16의 대체경로

상기 실시예에서, 일부 경우에 있어서 인 원자는 여기에서 "P*" 또는 "P"로 칭해진 키랄일 수 있는데, 이는 이와 같은 배열을 위한 칸-인골드-프렐로그 법칙의 인정된 의미에 해당하는 "R" 또는 "S"로 표시된다. 화학식 A 및 B의 프로드럭은 인 중심에서의 키랄성으로 인하여 부분입체 이성질체(diastereomer)의 혼합물로 존재할 수 있다. 인 중심에 키랄성이 존재할 때, 상기 화합물은 전체적으로 또는 부분적으로 R _p 또는 S _p 또는 그 혼합물일 수 있다.

본 발명의 또 다른 관점에서 화학식 G 또는 H의 제제와 1°, 2°또는 3°알코올 또는 1°, 2° 또는 3° 알콕사이드의 반응에 의해 인-산소 결합을 형성하는 것을 특징으로 하는 알코올의 인 유사체를 제조하는 방법에 관한 것이다.

여기에서 화학식 G 또는 H의 인 중심에서의 키랄성은 전체적으로 또는 부분적으로 R _p 또는 S _p 또는 그 혼합물이고,

Y, R² 및 R³는 상기에서 정의한 바와 같으며,

R²²는 독립적으로, H, C₁ _-20 알킬, 페닐과 같은 아릴, 피리디닐과 같은 헤테로아릴, 치환된 아릴, 또는 치환된 헤테로아릴, 또는 저급 알킬, 알콕시, 디(저급 알킬)-아미노, 클로로, 플루오로, 페닐과 같은 아릴, 피리디닐과 같은 헤테로아릴, 치환된 아릴 또는 치환된 헤테로아릴로 치환된 C₁ _-20 알킬이다.

본 실시예에서, 상기 알코올은 여기에서 언급한 퓨린 뉴클레오시드에 한정되지 않으나 모든 알코올이 될 수 있으며, 5'-OH 잔기와 같은 모든 슈가를 포함하는 뉴클레오시드 상에 모든 5'-OH 잔기를 포함하나, 한정되지 않는다. 이러한 공정을 이용함으로써 형성된 화합물은 원하는 포스페이트 에스테르일 수 있다.

본 발명의 다른 관점에서, 화학식 G 또는 H의 R² 및/또는 R³이 키랄 중심을 포함하고 있을 때, 화학식 G 또는 H의 부분입체 이성질체성(diastereomeric) 혼합물을 결정화함으로써 인 부분입체 이성질체를 분리하는 단계를 더욱 포함한다. 화학식 G 또는 H의 R² 및/또는 R³이 키랄 중심을 포함하고 있을 때, 하기 화학식 I를 화학식 G 또는 H의 부분입체 이성질체성 혼합물과 반응시킴으로써 인 부분입체 이성질체를 분리하는 단계를 더욱 포함할 수 있다.

여기에서 R²²는 상기에서 정의한 바와 같고,

R²³는 H, Li, Na, K, NH₄ 및 Ca, Mg와의 중복염(bis salt)이다.

화학식 G 또는 H의 R² 및/또는 R³이 키랄 중심을 포함하고 있을 때, 하기 화학식 I를 화학식 G 또는 H의 단일 또는 농축된 부분입체 이성질체성 혼합물과 반응시킴으로써 인 스테레오센터(phosphorous stereocenter)를 반전시키는(inverting) 단계를 더욱 포함할 수 있다.

여기에서 R²²는 상기에서 정의한 바와 같고,

R²³는 H, Li, Na, K, NH₄ 및 Ca, Mg와의 중복염(bis salt)이다.

본 발명은 하기 실시예 1~8에서 2,6-디아미노 2'-C-Me 퓨린 뉴클레오시드 및 프로드럭을 합성하는 제조법을 기재하고, 실시예 9~31에서 2,6-디아미노 2'-C-Me 퓨린 뉴클레오시드, 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체의 생물학적 평가방법을 기재한다. 당업계에서 일반적인 기술자는 이러한 실시예가 제한이 없고 본 발명의 목적 및 범위를 벗어남이 없이 세부사항의 변경이 가능함을 이해할 것이다.

실시예

이 발명을 대표하는 특정 구성물들은 하기 각 실시 예와 반응 순서마다 준비되었다; 실시 예들과 반응을 묘사하는 도면들은 발명에 대한 이해를 돕기 위하여 제공되는 것이며, 이것은 어떤 방식으로든 발명 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 아울러 본 발명의 화합물은 추가적인 화합물을 생산하기 위하여 그 다음 예에서 중간체로서 사용될 수 있다. 상기 반응의 어떠한 단계에서 얻어진 수득률을 최적화하기 위한 시도는 없었다. 당업자는 반응 시간, 온도, 용매 및/또는 시약의 일반적인 변형을 통하여 수득률을 증가시키는 방법을 알고 있을 것이다.

무수 용매들은 화학 회사(Aldrich Chemical Company, Inc., Milwaukee)에서 구입하였다. 시약들은 상업적으로 구입하였다. 별도로 언급하지 않는다면, 본 발명의 실시예에서 사용된 물질들은 쉽게 이용가능한 상업적 공급업체를 통해 얻었거나, 화학 합성 분야의 당업자에게 알려진 일반적인 방법에 의하여 합성되어진다. 녹는점(Melting point, mp)는 전열 디지털 녹는점 장치를 통해 측정되었고, 보정되지는 않았다. ¹H와 ¹³C NMR 스펙트라는 실온에서 Varian Unity Plus 400 스펙트로미터를 사용하였고, 내부 테트라메틸실레인(internal tetramethylsilane)으로 부터 ppm 다운필드(ppm downfield)가 보고 되었다. 중수소 교환, 디커플링(decoupling) 실험 또는 2D-COSY는 수소 배치를 확인하기 위하여 수행되었다. 신호 개수(Signal multiplicities)는 s(단일선, singlet), d(이중선, doublet), dd(복합이중선, doublet of doublets), t(삼중선, triplet), q(사중선, quadruplet), br(넓은 선, broad), bs(넓은 단일선, broad singlet), m(다중선, multiplet)으로 표현된다. 모든 J-값은 Hz이다. 질량 분석기(Mass spectra)는 일렉트로스프레이(electrospray) 기술을 이용하여 Micromass Platform LC 스펙트로미터로 분석된다. 기본적인 분석은 아틀란틱 마이크로랩사(노크로, 조지아주)에 의하여 수행되었다. 분석용 TLC는 왓트만 LK6F 실리카겔 판상에서, 조제용 TLC는 왓트만 PK5F 실리카겔 판상에서 수행되었다. 컬럼 크로마토그래피는 실리카겔 또는 역상 크로마토그래피(revers-phase high perfromance liquid chromatography)를 이용하여 수행되었다.

실시예 1 : 2,6-디아미노 퓨린 2'-C-Me 모노포스페이트 프로드럭 8a와 8b의 합성

(2R,3R,4R,5R)-5-(( 벤조일옥시 ) 메틸 )-2-(2,6- 디아미노 -9H-퓨린-9-일) -3-메틸테트라하이드롤퓨란-3,4- 디일 디벤조에이트 ((2R,3R,4R,5R)-5-((Benzoyloxy)methyl)-2-(2,6-diamino-9H-purin-9-yl) -3-methyltetrahydrofuran-3,4-diyl dibenzoate ) 3

무수 용매 -78℃ 조건 하에서(3R,4S,5R)-5-((benzoyloxy)methyl)-3- methyltetrahydrofuran-2,3,4-triyl tribenzoate 1(2.9g, 5mmol)과 2,6-디아미노퓨린 2(830mg, 5.5mmol) 함유되어 섞여진 혼합물에 DBU(2.3mL, 15.0mmol)을 첨가하고, 그 다음 TMSOTf(3.8mL, 20.0mmol)를 천천히 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 -78℃ 조건하에서 20분 동안 교반하고 난 후, 온도를 0℃로 올렸다. 0℃에서 30분 동안 교반한 후, 상기 반응 혼합물을 65℃까지 점차 가열시켰고, 하룻밤 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 디클로로메탄(CH₂Cl₂)(200mL)으로 희석시키고, 포화된 탄산수소나트륨(NaHCO₃)으로 세척하였다. 그 층들은 나누어져 있으며, 최종적인 액상 층은 디클로로메탄(CH₂Cl₂)(2X20mL)에 의해 분리하였다. 결합된 유기물 층들은 황산나트륨(Na₂SO₄)을 통해 건조되었다. 용매를 제거한 후, 잔여물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(메탄올(MeOH) 0%~10%로 포함된 에틸아세테이트(EtOAc))를 이용하여 정제하였다. 2.8g의 화합물 3을 얻었다(92% 수득률). LC/MS calcd. for C₃₂H₂₈N₆O₇ 608.2, observed: 609.2(M+1).

(2R,3R,4R,5R)-5-(( 벤조일옥시 ) 메틸 )-2-(2,6-bis( 비스(tert-부톡시카보닐)아미노 )-9H-퓨린-9-일)-3- 메틸테트라하이드로퓨란 -3,4- 디일 디벤조에이트 ((2R,3R,4R,5R)-5-((Benzoyloxy)methyl)-2-(2,6-bis(bis(tert- butoxycarbonyl)aino)-9H-purin-9-yl)-3-methyltetrahydrofuran-3,4-diyl dibenzoate) 4

화합물 3(1.4g, 2.3mmol)과 Boc 안하이드라이드(3.0g, 13.8mmol)과 DMAP(56mg, 0.46mmol)를 THF 용매(12mL)에 넣고 실온 조건에서 30시간 동안 교반하였다. 반응이 완전히 끝난 후, 용매는 감압 하에서 제거되고, 잔여물은 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(EtOAc가 0%~40% 포함된 헥산)를 이용하여 정제하였다. 2.1g의 하얀 고체 화합물 4를 얻었다(수득률 90%).

디- tert -부틸(9-((2R,3R,4R,5R)-3,4- 디하이드록시 -5-( 하이드록시메틸 ) -3- 메 틸테트라하이드로퓨란-2-일)-9H-퓨린-2,6- 디일 ) 비스 ( tert - 부톡시카보닐카바메이트 )(Di-tert-butyl(9-((2R,3R,4R,5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)-3- methyltetrahydrofuran -2- yl )-9H- purine -2,6- diyl ) bis ( tert -butoxycarbonylcarbamate)) 5

무수 메탄올 용매(50mL)에 화합물 4(1.7g, 1.68mmol)이 첨가된 용액에 메톡사이드나트륨(sodium methoxide, 4.37M, 0.3mL, 1.3mmol) 용액을 상온에서 첨가하고, 30분간 두었다(TLC와 LC-MS에 의해 관찰됨). 이 반응이 끝난 후, pH 7.0으로 조절하기 위해 도웩스 수지(Dowex resin, H⁺form)을 적가하였다. 수지는 필터링 하였고 메탄올로 세척하였으며, 여과된 액체는 농축하고, 1.08g의 하얀 고체 화합물 5를 얻기 위해(수득률 92%), 잔여물은 메탄올이 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(0%~10% 비율로 메탄올이 함유된 디클로로메탄(CH₂Cl₂))를 이용하여 세척하였다. ¹H-NMR(CD₃OD): 0.92(s, 3H, CH₃), 1.40(s, 18H, 6 x CH₃), 1.41(s, 18H, 6 x CH₃), 3.89(dd, 1H, J=2.8 Hz, J=12.4 Hz), 4.03-4.11(m, 2H), 4.22(d, 1H, J=8.8 Hz, H3’), 6.19(s, 1H, H1’), 9.09(s, 1H, H₈); ¹³C-NMR(CD₃OD): 20.2, 27.9, 28.1, 60.9, 73.1, 80.2, 84.6, 84.9, 85.4, 93.3, 128.8, 147.0, 151.2, 151.9, 152.0, 152.9, 155.0; LC/MS calcd. for C₃₁H₄₈N₆O₁₂ 696.3, observed: 697.4(M+1).

(2S)-에틸 2-((((2S,3R,4R,5R)-5-(2,6- 디아미노 -9H-퓨린-9-일)-3,4- 디하이드록시-4- 메틸테트라하이드로퓨란 -2-일) 메톡시 )( 페녹시 ) 프로포릴아미노 ) 프로파노에이트 ((2S)- ethyl 2-((((2S,3R,4R,5R)-5-(2,6- diamino -9H- purin -9- yl )-3,4- dihydroxy -4- methyltetrahydrofuran -2-yl)methoxy)(phenoxy)phosphorylamino)propanoate) 8a

THF 용매(5mL)에 화합물 5(780mg, 1.12mmol)와 N-메틸이미다졸(0.45mL, 5.8mmol)이 함유된 용액에 0℃에서 (2S)-에틸 2-(클로로(페녹시) 포스포릴아미노)프로파노에이트(2(S)-ethyl 2-(chloro(phenoxy) phosphorylamino)propanoate¹, 5.8mL, 5.8mmol)을 적가하였다. 상기 생성된 혼합물을 실온에서 하룻밤 동안 교반하였다. 감압 하에서 용매를 제거 후, 하얀색 고체인 576mg의 화합물 7a를 얻기 위하여(수득률 54%), 잔여물을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(0%~10% 비율로 메탄올이 함유된 디클로로메탄(CH₂Cl₂))를 이용하여 세척하였다. 예냉 처리한 용액(10℃ 이하의 TFA(80%, 23mL))을 아이스 배스 속에서 5℃ 이하로 예냉된 화합물 7a(550mg, 0.58mmol)에 첨가하였다. 용액을 아이스 배스 온도에서 상온이 되도록 하는 조건에서 교반하고, 상온에서 4시간 동안 교반하였다. 상기 반응이 끝난 후, 용매를 감압 하에서 제거하였고 잔여물을 메탄올(4x15mL)로 증발시켰다. 잔여물은 메탄올(20 mL)에 용해시키고, 포화된 탄산수소나트륨(NaHCO₃)으로 중화시켰다. 용매를 제거 후, 225mg의 하얀 고체 화합물 8a(71%)(두 단계 동안 38.3%)을 얻기 위해, 잔여물을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(0%~15%의 비율로 메탄올이 함유된 디클로로메탄(CH₂Cl₂))을 이용하였다. ¹H-NMR(CD3OD)(1:1 mixture of P diastereomers): 0.94(s, 3H, CH₃), 0.97(s, 3H, CH₃), 1.13-1.19(m, 6H, 2 x CH₃), 1.16-1.31(m, 6H, 2 x CH₃), 3.90-4.58(m, 14H), 5.93(s, 1H, H₁’), 5.96(s, 1H, H₁’), 7.14-7.34(m, 10H, Ar-H), 7.86(s, 2H, H₈); ³¹PNMR(CD₃OD): 4.77, 4.89; LC/MS calcd. for C₂₂H₃₀N₇O₈P 551.1, observed: 552.3(M+1).

에틸 3-(2-(((((2S,3R,4R,5R)-5-(2,6- 디아미노 -9H-퓨린-9-일)-3,4- 디하이드 록시-4- 메틸테트라하이드로퓨란 -2-일) 메톡시 )(((S)-1- 에톡시 -1- 옥소프로판 -2-일)아미노) 포스포릴 ) 옥시 ) 페닐 ) 프로파노에이트 ( Ethyl 3-(2-(((((2S,3R,4R,5R)-5-(2,6-diamino-9H-purin-9-yl)-3,4- dihydro xy-4-methyltetrahydrofuran-2- yl ) methoxy )(((S)-1- ethoxy -1- oxopropan -2-yl)amino)phosphoryl)oxy)phenyl)propanoate) 8b

프로드럭 8b를 합성하기 위해 비슷한 과정을 사용하였다. 화합물 8b(110mg)를 210mg의 화합물 5에게서 얻었다. 8b- up Major(첫번째 분리, first eluting "up"): Optical rotation [α]²⁴ _D -7.08(c 0.24, MeOH); ¹H-NMR(CD₃OD) 0.97(s, 3H, CH₃), 1.15-1.20(m, 6H, 2 x CH₃), 1.34(d, 3H, J=7.2 Hz, CH₃), 2.62(t, 2H, J=8.0 Hz, 2H, CH₂), 2.99(t, 2H, J=8.0 Hz, 2H, CH₂), 3.95-4.58(m, 9H), 5.94(s, 1H, H₁’), 7.07-7.38(m, 4H, Ar-H), 7.86(s, 1H, H₈); ³¹PNMR(CD₃OD): 5.03; LC/MS calcd. for C₂₇H₃₈N₇O₁₀P 651.2, observed: 552.2(M+1). 8b- down Minor(마지막 분리, last eluting "down" Optical rotation [α]²⁴ _D +12.12(c 0.13, MeOH); 1H-NMR(CD₃OD): 0.97(s, 3H, CH₃), 1.15-1.17(m, 6H, 2 x CH₃), 1.34(d, 3H, J=7.2 Hz, CH₃), 2.62(t, 2H, J=8.0 Hz, 2H, CH₂), 2.99(t, 2H, J=8.0 Hz, 2H, CH2), 3.96-4.51(m, 9H), 5.91(s, 1H, H₁’), 7.10-7.39(m, 4H, Ar-H), 7.86(s, 1H, H₈); ³¹PNMR(CD₃OD): 4.98; LC/MS calcd. for C₂₇H₃₈N₇O₁₀P 651.2, observed: 652.3(M+1).

참고 문헌:

1.(a) Perrone, P.; Daverio, F.; Valente, R.; Rajyaguru, S.; Martin J. A.; Leveque, V.; Pogam, S. L.; Najera, I.; Klumpp, K.; Smith, D.; B. and McGuigan, C. First Example of Phosphoramidate Approach Applied to a 4'-Substituted Purine Nucleoside(4'-Azidoadenosine): Conversion of an Inactive Nucleoside to a Submicromolar Compound versus Hepatitis C Virus. J. Med . Chem. 2007, 50, 5463-5470.(b) Uchiyama, M.; Aso, Y.; Noyori, R.; Hayakawa, Y. O-Selective phosphorylation of nucleosides without N-protection. J. Org . Chem. 1993, 58, 373-379.

실시예 2 : 2,6-디아미노 퓨린 2'-C-Me 모노포스페이트 프로드럭 11의 합성

에틸 3-(2-(((((2R,3R,4R,5R)-5-(2,6- 디아미노 -9H-퓨린-9-일)-3,4- 디하이드 록시-4- 메틸테트라하이드로퓨란 -2-일) 메톡시 )(2-(3- 에톡시 -3- 옥소프로필 ) 페녹시 ) 포스포릴 ) 옥시 ) 페닐 ) 프로파노에이트 ( Ethyl 3-(2-(((((2R,3R,4R,5R)-5-(2,6- diamino -9H-purin-9-yl)-3, 4- dihydroxy -4- methyltetrahydrofuran -2- yl ) methoxy )(2-(3-ethoxy-3-oxopropyl)phenoxy)phosphoryl)oxy)phenyl)propanoate) 11 .

화합물 5(630mg, 0.91mmol) 와 N-메틸이미다졸(0.35mL, 4.5mmol)이 포함된 THF(3mL)에 0℃에서 디에틸 3,3'-(((클로로포스포릴)비스(옥시))비스(2,1-페닐렌)) 디프로파노에이트 9가 함유된 THF(9mL, 4.5mmol)용액을 적가하였다. 생성된 혼합물은 실온에서 하룻밤 동안 교반하였다. 감압 하에서 용매를 제거한 후, 540mg의 하얀 고체 화합물 10(수득률 53%)을 생산하기 위하여, 잔여물을 메탄올(0%~10%의 비율로 메탄올이 함유된 디클로로메탄(CH₂Cl₂)) 기울기를 사용한 플래쉬 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 10℃ 이하로 예냉된 TFA(80%, 26mL)용액을 아이스 배스에서 5℃ 이하로 예냉한 화합물 10(540mg, 0.58mmol)에 첨가하였다. 상기 용액은 0℃에서 상온이 될 때까지 교반하였으며, 그 후 상온에서 4시간 동안 교반하였다(TLC와 LC/MS에 의해 관찰됨). 상기 반응이 종료된 후, 용매를 감압 하에서 제거하였고, 잔여물들은 메탄올(4x15mL)을 이용하여 증발시켰다. 잔여물은 메탄올(20 mL)에 용해되었고, 포화된 탄산수소나트륨에 의해 중화되었다. 용매 제거 후, 270 mg의 하얀색 고체 화합물 11을 생산(수득률 77%)하기 위하여, 잔여물들은 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(0%~15% 비율로 메탄올이 함유된 디클로로메탄(CH₂Cl₂))을 이용하여 정제하였다. LC/MS calcd. for C₂₂H₃₀N₇O₈P 728.2, observed: 729.3(M+1).

실시예 3: 2,6-디아미노 퓨린 2'-C-Me 모노포스페이트 프로드럭의 대체 합성

(2S)-에틸 2-((((2R,3R,4R,5R)-5-(2,6- 디아미노 -9H-퓨린-9-일)-3,4- 디하이드 록시-4- 메틸테트라하이드로퓨란 -2-일) 메톡시 )( 페녹시 ) 포스포릴아미노 ) 프로파노에이트 ((2S)- Ethyl 2-((((2R,3R,4R,5R)-5-(2,6- diamino -9H- purin -9- yl )-3, 4- dihydroxy -4- methyltetrahydrofuran -2-yl)methoxy)(phenoxy)phosphorylamino)propanoate) ( 8a )

화합물 12(30mg, 0.1mmol) 가 포함된 THF(1mL)와 DMF(1mL) 혼합 용매에 0℃ 에 (2R)-에틸 2-(클로로(페녹시)포스포릴아미노)프로파노에이트¹(0.4mL, 0.4mmol)을 첨가하고, t-BuMgCl(0.4mL, 0.4mmol)를 상기 용액에 적가하였다. 수분 동안 상기 용액을 교반한 후 상기 반응 혼합물을 실온까지 가열시키고 실온에서 하룻밤 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물은 포화된 염화암모늄(액체)로 중화시키고, 화합물 8a를 제공하기 위하여, 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(10% ~ 20% 비율로 메탄올이 함유된 디클로로메탄)를 이용하여 정제하였다. LC/MS calcd. for C₂₂H₃₀N₇O₈P 551.1, observed: 552.1(M+1).

참고문헌:

실시예 4: 화합물 17a와 17b의 합성; 모노포스페이트 프로드럭 합성을 위한 부분입체 이성질체

에틸 3-(2- 하이드록시페닐 ) 프로파노에이트 ( Ethyl 3-(2-hydroxyphenyl)propanoate) 14

디하이드로큐마린(dihydrocoumarin) 13이 함유된 500mL의 무수 에탄올에 촉매적인 농축 황화수소(0.10mL)를 0℃, 질소 존재 하에서 첨가하였다. 쿨링 배스를 제거하고, 반응물을 12시간동안 상온에서 교반하였다. 상기 용액을 0℃에서 고체 탄산수소나트륨으로 처리하여 pH를 6.0-6.5로 조정하였고, 생산된 혼합물을 필터로 여과하였다. 여과된 용액을 감압 하에서 농축하고, 화합물 14(16.2g, 83.4mmol, 노란색 오일)를 제공하기 위해 실리카겔 컬럼상에서 정제하였다(수득률 95%). ¹H NMR(400 MHz, CDCl₃) d 7.35(s, 1H), 7.13-7.07(m, 2H), 6.89-6.84(m, 2H), 4.14(q, J = 6.8 Hz, 2H), 2.90(m, 2H), 2.72(m, 2H), 1.23(t, J = 6.8 Hz, 3H); ¹³C NMR(100 MHz, CDCl₃) δ 175.89, 154.50, 130.74, 128.15, 127.52, 120.93, 117.33, 61.51, 35.39, 24.84, 14.25; MS-ESI⁺ m/z 195(M+H⁺)

에틸 3-(2-(((((S)-1- 에톡시 -1- 옥소프로판 -2-일)아미노)(4-( 메틸티오 ) 페녹 시) 포스포릴 ) 옥시 ) 페닐 ) 프로파노에이트 ( Ethyl 3-(2-(((((S)-1- ethoxy -1- oxopropan -2-yl)amino)(4-(methylthio)phenoxy)phosphoryl)oxy)phenyl)propanoate) 16a 및 16b: R _p 과 S _p 의혼합물 (~1:1)

화합물 14(15.5g, 79.7mmol)가 포함된 300mL의 무수 디에틸 에스테르 용액에 포스포러스 옥시클로라이드(phosphorus oxychloride, 12.2g, 79.7mmol)와 트리에틸아민(triethylamine, 8.5g, 83.7mmol)를 -78℃ 질소 분위기하에서 첨가하였다. 1시간 동안 -78℃ 질소 분위기하에서 교반한 후, 추가로 상기 용액은 온도가 실온으로 올라가도록 하며 12시간 동안 교반하고, 그 후 생성된 고체 물질을 질소 존재 하에서 여과를 통해 제거하였다. 상기 여과액은 감압 하에서 농축되었고 높은 진공 상태에서 6시간 동안 실온으로 건조되었다. 상기 생성된 끈적한 기름이 포함된 300mL의 무수 디클로로메탄 용액에 4-메틸머캅토페놀(4-methylmercaptophenol, 11.1g, 79.0mmol)과 Et₃N(8.0g, 79.0mmol)을 20분에 걸쳐 -78℃에서 적가하였다. 그 후 생성된 용액을 -78℃에서 1시간 동안, 그리고,추가로 질소 존재하에서 0℃에서 6시간 동안 교반하였다. 상기 용액에 L-알라닌 에틸 에스테르 하이드로클로라이드(L-alanine ethyl ester hydrochloride, 12.2g, 79.0mmol)이 포함된 200 mL의 무수 디클로로메탄과 Et₃N(16.2g, 160mmol)이 포함된 용액을 추가로 20분 동안 -78℃ 질소 존재하에서 적가하였다. 상기 용액을 12시간 동안 실온에서 교반하였고, 여과하였다. 상기 여과액을 감압하에서 농축시키고, 실리카겔 컬럼(hexane:EtOAc = 3:1 ~ 1:1 v/v)상에서 정제하여 화합물 16(33.5g, 67.7mmol)을 두 단계를 거쳐 85%의 수득률로 얻을 수 있었다. ¹H- 및 ³¹P-NMR 스펙트럼에 의한 R_p과 S_p 혼합물의 비율은 1:1 이었다.¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) d 7.43 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.22 - 7.15 (m, 6H), 7.15 - 7.07 (m, 1H), 4.17 - 3.90 (m, 6H), 2.93 (q, J = 8.4 Hz, 2H), 2.58 (m, 2H), 2.45 (s, 3H), 1.39 (t, J = 6.4 Hz, 3H), 1.27-1.21 (m, 6H); ³¹P (162 MHz, CDCl₃) δ -2.28, -2.29; MS-ESI⁺ m/z 496 (M+H⁺)

에틸 3-(2-(((((S)-1- 에톡시 -1- 옥소프로판 -2-일)아미노)(4-( 메틸설포닐 ) 페녹시 ) 포스포릴 ) 옥시 ) 페닐 ) 프로파노에이트 ( Ethyl 3-(2-(((((S)-1- ethoxy -1- oxopropan -2-yl)amino)(4-(methylsulfonyl)phenoxy) phosphoryl ) oxy ) phenyl ) propanoate ) 17a, 17b: R _p과 S _p 혼합물 (~1:1)

화합물 16(11.7g, 23.6mmol)이 포함된 무수 디클로로메탄 200mL에 3-질소 존재하에서, 0℃ 조건에서 클로로퍼옥시벤조산(chloroperoxybenzoic acid)(77% maximum, 12.3g, 53.2mmol)을 첨가하였다. 상온에서 12시간 동안 교반한 후에, 감압 하에서 용매를 제거하고, 잔여물을 200mL의 에틸아세테이트에 용해하고, 차가운 포화된 탄산수소나트륨 용액(50mLx2)과 차가운 물(100mL) 그리고 브라인(brine, 50mL)을 이용하여 세척하였다. 유기물 층은 황산나트륨을 통해 건조시켰고, 여과하고, 수득률 94%로 두 가지의 부분입체 이성질체(¹H- and ³¹P-NMR spectra에 의한 R _p:S _p ~ 1:1)의 화합물 17(11.7g, 22.2mmol)을 제공하기 위하여 실리카겔 컬럼(hexane:EtOAc = 3:1 ~ 1:2 v/v)을 통해 정제하였다. ¹H NMR(400 MHz, CDCl₃) d 7.92(m, 2H), 7.48-7.43(m, 3H), 7.24-7.18(m, 2H), 7.14-7.10(m, 1H), 4.53(m, 1H), 4.19-4.09(m, 5H), 3.05(m, 3H), 2.96-2.91(m, 2H), 2.61-2.56(m, 2H), 17a: 1.43(d, J = 6.8 Hz, 1.5H), 17b: 1.40(d, J = 6.8 Hz, 1.5H), 1.26-1.21(m, 6H); ³¹P(162 MHz, CDCl₃) δ -2.50, -2.55; MS-ESI⁺ m/z 528(M+H⁺)

에틸 3-(2-(((((S)-1- 에톡시 -1- 옥소프로판 -2-일)아미노)(4-( 메틸티오 ) 페녹시 ) 포스포릴 ) 옥시 ) 페닐 ) 프로파노에이트 ( Ethyl 3-(2-(((((S)-1- ethoxy -1- oxopropan -2-yl)amino)(4-(methylthio)phenoxy)phosphoryl) oxy ) phenyl ) propanoate ) 16a 및 16b

화합물 17a와 17b가 포함된 8mL의 무수 디클로로메탄 용액에 4-메틸머캅토페놀(4-methylmercaptophenol)(0.015g, 0.11mmol)와 Et₃N(0.01g, 0.12mmol)를 0℃에서 질소 분위기하에서 첨가하였다. 48시간 동안 실온에서 교반한 후, ¹H NMR 스펙트럼을 이용한 1:2의 비율로써 19%의 수득률의 화합물 16a와 16b를 제공하기 위하여, 상기 용액을 실리카겔(hexane:EtOAc = 3:1 에서 1:1 v/v)을 이용하여 농축하고, 정제하였다. ¹H NMR(400 MHz, CDCl₃) d 7.42(d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.23-7.15(m, 6H), 7.11-7.07(m, 1H), 4.18-4.09(m, 5H), 3.91-3.83(m, 1H), 2.92(q, J = 8.0 Hz, 2H), 2.58-2.53(m, 2H), 2.46(s, 3H), 1.40(t, J = 6.8 Hz, 3H), 1.26-1.21(m, 6H); ³¹P(162 MHz, CDCl₃) δ -2.33

에틸 3-(2-(((((S)-1- 에톡시 -1- 옥소프로판 -2-일)아미노)(4-( 메틸설포닐 ) 페녹 시) 포스포릴 ) 옥시 ) 페닐 ) 프로파노에이트 ( ethyl 3-(2-(((((S)-1- ethoxy -1- oxopropan -2-yl)amino)(4-(methylsulfonyl)phenoxy)phosphoryl)oxy)phenyl)propanoate) 17a/17b 의 R _p / S _p -혼합물(1:1)로부터 R _p - 또는 S _p -이성질체의 정제: 재결정화 방법

두 개의 부분입체 이성질체 17a와 17b의 혼합물을 50mL의 EtOAc에 용해시키고, 상기 용액이 하얀색 침전물이 생기기 시작할 때까지 실온에서 헥산으로 처리하고 12시간 동안 3℃에서 보관하였다. 하얀색 고체 물질을 여과처리하고, 상온에서 12시간 동안 높은 진공 하에서 건조시켰다. 고체인 화합물 17a와 17b의 비율은 2:1(2.4g)이었다. 상기 하얀색 고체 물질을 용매(에틸아세테이트:디에틸에테르 =1:1 v/v, 100 mL)에 녹이고, 상온에서 10분 동안 교반하였다. 밝은 색의 슬러리가 생길 때까지 상기 용액을 실온에서 헥산으로 처리하고, 3℃에서 24시간 동안 보관하였다. 상기 하얀 고체 물질을 여과하고, 상기 여과액에서 17b를 얻기 위하여 24시간 동안 상온의 높은 진공 상태하에서 건조시켰다. ¹H 및 ³¹P NMR 데이터 분석을 통해 95%의 순도의 생성물 17a을 얻었다. ¹H NMR(400 MHz, CDCl₃) δ 7.92(d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.42(d, J = 8.8 Hz, 3H), 7.24-7.19(m, 2H), 7.14-7.12(m, 1H), 7.14-7.10(m, 1H), 4.19-4.11(m, 5H), 4.02(m, 1H), 3.05(s, 3H), 2.94(m, 2H), 2.58(dd, J = 7.2, 9.6 Hz, 2H), 1.43(d, J = 6.8 Hz, 3H), 1.24(t, J = 6.8 Hz, 6H);³¹P(162 MHz, CDCl₃) δ -2.68; MS-ESI⁺ m/z 528(M+H⁺). 화합물 17a의 하나의 결정체가 결정화를 통해 얻어졌고, 화합물 17a의 x-ray 구조는 S _p 로써 인의 중심의 배열을 확인함으로 분명하게 얻어졌다(도 3).

상기 여과액을 농축하고, 12시간 동안 상온에서 높은 진공하에 건조시켰다. 상기 끈적한 기름을 5mL의 디클로로메탄에 용해시키고, 디이소프로필에테르(diisopropyl ether, 50mL) 를 이용하여 처리하고, 10분 동안 상온에서 교반하였다. 3℃에서 24시간 동안 저장하여 밝은 침전물이 생길 때까지 상기 생산된 용액을 헥산을 이용하여 처리하였다. 상기 하얀 고체 물질을 여과하고 높은 진공 하에 상온에서 48시간 동안 건조하였다. 생성물 17b(0.50g, 15%)는 ¹H and ³¹P NMR 데이터의 분석에 기초로 하여 순도 90%로 얻었다. ¹H NMR(400 MHz, CDCl₃) δ 7.92(d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.45(d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.42(d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.24-7.19(m, 2H), 7.14-7.10(m, 1H), 4.20-4.04(m, 6H), 3.05(m, 3H), 2.93(m, 2H), 2.58(t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.40(d, J = 7.2 Hz, 3H), 1.26-1.21(q, J = 7.2 Hz, 6H); ³¹P(162 MHz, CDCl₃) δ -2.60; MS-ESI⁺ m/z 528(M+H⁺).

에틸 3-(2-(((((S)-1- 에톡시 -1- 옥소프로판 -2-일)아미노)(4-( 메틸티오 ) 페녹시 ) 포스포릴 ) 옥시 ) 페닐 ) 프로파노에이트 ( Ethyl 3-(2-(((((S)-1- ethoxy -1- oxopropan -2-yl)amino)(4-(methylthio) phenoxy ) phosphoryl ) oxy ) phenyl ) propanoate ) 16b

화합물 17a가 포함된 2mL의 무수 디클로로메탄 용액에 4-메틸머캅토페놀(0.042g, 0.30mmol)과 DIEA(0.052g, 0.04mmol)을 0℃에서 질소 분위기 하에서 첨가하였다. 48시간 동안 실온에서 교반한 후, 95%의 수득률로 화합물 16b를 제공하기 위하여 상기 용액을 실리카겔(hexane:EtOAc = 3:1 ~ 1:1 v/v) 상에서 농축하고,정제시켰다. ¹H NMR(400 MHz, CDCl₃) δ 7.42(d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.23-7.15(m, 6H), 7.11-7.07(m, 1H), 4.18-4.09(m, 5H), 3.91-3.83(m, 1H), 2.92(q, J = 8.0 Hz, 2H), 2.58-2.53(m, 2H), 2.46(s, 3H), 1.40(d, J = 6.8 Hz, 3H), 1.26-1.21(m, 6H); ³¹P(162 MHz, CDCl₃) δ -2.31

에틸 3-(2-(((((S)-1- 에톡시 -1- 옥소프로판 -2-일)아미노)(4-( 메틸티오 ) 페녹시 ) 포스포릴 ) 옥시 ) 페닐 ) 프로파노에이트 ( Ethyl 3-(2-(((((S)-1- ethoxy -1- oxopropan -2-yl)amino)(4-(methylthio) phenoxy ) phosphoryl ) oxy ) phenyl ) propanoate ) 16a

화합물 17b(0.053g, 0.10mmol)이 포함된 2.0mL의 무수 디클로로메탄 용액에 4-methylmercaptophenol(0.042 g, 0.30 mmol)과 DIEA(0.052g, 0.04mmol)를 질소 분위기에서 0℃에서 첨가하였다. 72시간 동안 실온에서 교반한 후, 화합물 16a를 91%의 수득률로 얻기 위해, 상기 용액을 실리카겔(hexane:EtOAc =3:1~1:1 v/v)를 이용하여 농축하고 정제시켰다. ¹H NMR(400 MHz, CDCl₃) δ 7.42(d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.23-7.15(m, 6H), 7.11-7.07(m, 1H), 4.18-4.09(m, 5H), 3.91-3.83(m, 1H), 2.92(q, J = 8.0 Hz, 2H), 2.58-2.53(m, 2H), 2.46(s, 3H), 1.38(d, J = 7.2 Hz, 3H), 1.26-1.21(m, 6H); ³¹P(162 MHz, CDCl₃) δ -2.33

실시예 5: 화합물 17a로부터 단일 부분입체 이성질체 8b- up의 합성

에틸 3-(2-(((((2R,3R,4R,5R)-5-(2-아미노-6-((( 벤질옥시 ) 카보닐 )아미노)-9H-퓨린-9-일)-3-(( tert - 부틸디메틸실릴 ) 옥시 )-4- 하이드록시 -4- 메틸테트라하이드로 퓨란-2-일) 메톡시 )((1- 에톡시 -1- 옥소프로판 -2-일)아미노) 포스포릴 ) 옥시 ) 페닐 ) 프로파노에이트 ( Ethyl 3-(2-(((((2R,3R,4R,5R)-5-(2-amino-6-((( benzyloxy ) carbonyl ) amino )-9H- purin -9- yl )-3-(( tert - butyldimethylsilyl ) oxy )-4- hydroxy -4-methyltetrahydrofuran-2-yl)methoxy)((1-ethoxy-1-oxopropan-2-yl)amino) phosphoryl ) oxy ) phenyl ) propanoate ) 19

화합물 18(0.036g, 0.07mmol)가 포함된 2mL의 무수 THF 용액에 t-부틸마그네슘 클로라이드(1.0M in THF, 0.18mL, 2.5 equiv.)를 -78℃에 질소 분위기 하에서 첨가하였다. 1시간 동안 실온에서 교반한 후, -78℃에서 17a의 용액(0.07g, 0.14mmol, 2.0 equiv.)에 질소 분위기 하에서 상기 혼합물을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 48시간 동안 실온에서 교반하고, 포화 염화암모늄(NH₄Cl, 0.5mL)으로 0℃에서 처리한 후, 차가운 물(10mL)에 붓고, EtOAc(10mLx3)으로 추출하였다. 상기 수집된 유기물 층을 브라인으로 세척하고, Na₂SO₄로 건조시키고, 필터링하고 실리카겔 컬럼(CH₂Cl₂:MeOH = 50:1 ~ 20:1 v/v)상에서 정제하여 40%의 수득률의 화합물 19(0.025g, 0.028mmol)를 얻었다. ¹H NMR(400 MHz, CDCl₃) δ 8.16(s, 1H), 7.83(s, 1H), 7.44-7.33(m, 6H), 7.21-7.05(m, 3H), 5.99(s, 1H), 5.27(s, 2H), 5.22(s, 2H), 4.66-4.61(m, 1H), 4.42(d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.39-4.34(m, 1H), 4.16-3.97(m, 7H), 3.85(m, 1H), 3.19(s, 1H), 3.01(m, 2H), 2.66(m, 2H), 1.86(m, 1H), 1.26(d, J = 6.8 Hz, 3H), 1.22-1.14(dt, J = 14.4, 7.2 Hz, 6H), 0.94(s, 3H), 0.93(s, 9H), 0.19(s, 3H), 0.13(s, 3H); ³¹P(162 MHz, CDCl₃) δ 3.40; MS-ESI⁺ m/z 900(M+H⁺)

에틸 3-(2-(((((2R,3R,4R,5R)-5-(2,6- 디아미노 -9H-퓨린-9-일)-3,4- 디하이드 록시-4- 메틸테트라하이드로퓨란 -2-일) 메톡시 )((1- 에톡시 -1- 옥소프로판 -2-일)아미노) 포스포릴 ) 옥시 ) 페닐 ) 프로파노에이트 ( Ethyl 3-(2-(((((2R,3R,4R,5R)-5-(2,6-diamino-9H-purin-9-yl)-3,4-dihydroxy-4-methyltetrahydrofuran-2-yl)methoxy) ((1-ethoxy-1-oxopropan-2-yl)amino) phosphoryl ) oxy ) phenyl ) propanoate ) 8b- up

19(0.01g, 0.011mmol)가 포함된 2.0mL의 무수 CH₃CN 용액에 0℃에서 염화수소(2.0M in diethyl ether, 1.0mL)를 첨가하였다. 48시간 동안 실온에서 교반한 후, 상기 용매와 염화수소를 감압하에서 제거하였다. 상기 잔여물을 디에틸에테르(diethyl ether, 5mL x 5)를 이용하여 세척하고, 높은 진공과 실온 조건에서 12시간 동안 건조하였다. 상기 용액을 2.0mL의 에탄올에 용해하였고, 30분 동안 실온에서 교반하였다. 상기 용액에 Pd/C(5.0mg, 10% Pd on carbon)를 첨가하고, 생산된 혼합용액을 실온상태이며 수소 존재(1atm) 하에서 12시간 동안 교반하였다. 상기 용액을 셀라이트(Celite, 0.05g)를 이용하여 처리하고, 여과시켰다. 화합물 8b-up(0.007g, 0.001mmol)을 91%의 수득률로 얻기 위하여, 상기 여과액을 감압 하에서 농축하고, 실리카겔 컬럼(CH₂Cl₂:MeOH = 10:1 v/v) 상에서 정제하였다. ¹H NMR(400 MHz, CD₃OD) δ 7.82(s, 1H), 7.33(d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.22(d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.13(td, J = 7.6, 2.0 Hz, 1H), 7.06(t, J = 7.6 Hz, 1H), 5.90(s, 1H), 4.60-4.53(m, 1H), 4.48-4.20(m, 1H), 4.10-4.04(m, 2H), 4.02(q, J = 7.6 Hz, 2H), 3.96-3.86(m, 1H), 2.96(t, J = 8.0 Hz, 2H), 2.59(t, J = 8.0 Hz, 2H), 1.30(dd, J = 1.2, 7.2 Hz, 3H), 1.16(t, J = 7.8 Hz, 3H),1.13(t, J = 7.2 Hz, 3H), 0.93(s, 3H); ³¹P(162 MHz, CD₃OD) δ 5.01; MS-ESI⁺ m/z 652(M+H⁺).

실시예 6: (Rp)-24과 (Sp)-25 각각에서의 포스포라미데이트 프로드럭(phosphoramidate prodrugs)(Sp)-8b- down과 (Rp)-8b- up의 합성

에틸-3-(2- 하이드록시페닐 ) 프로피오네이트 ( Ethyl -3-(2- hydroxyphenyl ) propionate) 21

디하이드로쿠마린(Dihydrocoumarin), 20(10.4 g, 70.0 mmol)을 60mL의 건조 에탄올에 첨가하였다. H₂SO₄(0.1mL)를 첨가하고, 상기 생산된 용액을 리플럭스(reflux)에서 하룻밤 동안 가열시켰다. 에탄올을 감압 하에서 제거하고, 잔여물을 디에틸에테르(diethyl ether)에 용해하고, 상기 유기상 물질을 탄산수소나트륨을 이용하여 추출하였다. 상기 유기상 물질을 황산나트륨을 이용하여 건조시키고, 용매를 증발시킨 후 잔여물질을 실리카겔(MeOH/CH₂Cl₂, MeOH 기울기 0~ 10%) 상에서 크로마토그래피로 분리하였다. ¹H NMR(400 MHz, CDCl₃) δ 7.40(s, 1H), 7.05-7.15(m, 2H), 6.84-6.90(m, 2H), 4.14(q, J=6.8 Hz, 2H), 2.90(m, 2H), 2.72(m, 2H), 1.23(t, J=6.8 Hz, 3H); LC-MS, m/z 195(M+1)⁺.

에틸 3-(2-((클로로(((R)-1- 에톡시 -1- 옥소프로판 -2-일)아미노)포스포릴) 옥시 ) 페닐 ) 프로파노에이트 ( Ethyl 3-(2-((chloro(((R)-1- ethoxy -1- oxopropan -2-yl)amino)phosphoryl)oxy) phenyl ) propanoate ) 23

화합물 21(5.0g, 25.7mmol) 과 트리에틸아민(3.6mL, 25.7mmol)이 포함된 80mL의 무수 디에틸에테르 용액을 -78℃의 포스포러스 옥시클로라이드(phosphorus oxychloride, 2.4mL, 25.7mmol)가 포함된 70mL의 무수 디에틸에테르 용액에 아르곤 가스 존재 하에 2시간에 걸쳐 적가하였다. -78℃, 아르곤 가스 존재 하에서 1시간 동안 교반한 후, 상기 용액을 추가적으로 15시간, 실온에서 교반하고, 생산된 고체 물질을 질소 존재 하에서 여과를 통해 제거하였다. 상기 고체 물질들은 무수 디에틸에테르를 이용하여 세척하였고, 추가적인 정제 없이 사용하였던 무색의 기름인 화합물 22를 제공하기 위하여, 수집한 여과액은 감압 하에서 농축한 후, 실온에서 하룻밤동안 높은 진공 상태에서 건조되었다.

22와 미리 건조한 L-알라닌 에틸 에스테르 하이드로클로라이드(L-alanine ethyl ester hydrochloride, 3.94g, 25.7mmol)이 포함된 아르곤 존재 하에서 -78℃에 있는 무수 디클로로메탄 용액에 Et₃N(7mL, 51.4mmol)이 포함되어 있는 20mL의 무수 디클로로메탄 용액을 2시간 동안 첨가하였다. 상기 용액을 실온에서 16시간 동안 교반하고, 고체 물질들을 여과하였다. 거의 색이 없는 기름인 9.52g의 화합물 23을 두 단계의 과정을 통해 75%의 수득률로 제공하기 위하여, 상기 여과액을 감압 하에서 실리카겔 컬럼(EtOAc/hexane, EtOAc 기울기 0 ~ 50%, v/v) 상에서 농축하고, 정제하였다. 화합물 23은 -70℃에서 4Å체를 통해 저장하거나, 1M의 THF 용액 처리로 준비하는 현저한 분해 없이 오랫동안 저장할 수 있었다.

¹H NMR(400 MHz, CDCl₃) δ 7.14-7.49(m, 4H), 4.70-4.80(m, 1H), 4.09-4.27(m, 5H), 2.92-3.08(m, 2H), 2.61-2.65(m, 2H), 1.50-1.55(m, 3H), 1.21-1.32(m, 6H). ³¹P NMR(162 MHz, CDCl₃) δ 8.88, 8.72.

에틸 3-(2-(((R)-(((S)-1- 에톡시 -1- 옥소프로판 -2-일)아미노)(4- 니트로페녹 시) 포스포릴 ) 옥시 ) 페닐 )-프로파노에이트( Ethyl 3-(2-(((R)-(((S)-1- ethoxy -1-oxopropan-2-yl)amino)(4-nitrophenoxy)phosphoryl)oxy)phenyl)-propanoate) 24( R _p ) 및 에틸 3-(2-(((S)-(((S)-1- 에톡시 -1- 옥소프로판 -2-일)아미노)(4- 니트로페녹시 )-포스포릴) 옥시 ) 페닐 ) 프로파노에이트 ( ethyl 3-(2-(((S)-(((S)-1- ethoxy -1-oxopropan-2-yl)amino)(4-nitrophenoxy)-phosphoryl)oxy)phenyl)propanoate) 25( S _p )

Et₃N이 포함된 100mL의 무수 디에틸에스테르 용액을 화합물 23과 p-니트로페놀(3.75g, 27.0mmol)이 포함된 0℃의 200mL의 디에틸에스테르 용액에 30분 동안 적가하였다. 상기 반응 혼합액을 0℃에서 1시간 동안, 그 후 실온에서 15시간 동안 교반하였다. 생성된 고체 물질은 여과하였고, 여과액은 감압 하에서 농축하였다. 24와 25의 혼합물 10.8g을 1:1의 비율이며, 85%의 수득률로 제공하기 위하여, 상기 잔여물을 실리카겔 컬럼(EtOAc/CH₂Cl₂, EtOAc 기울기 0 ~10%, v/v)을 이용하여 정제하였다. 상기 혼합물은 CH₃CN이 2% 함유된 디이소프로필 에테르 용액에서 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 얻은 24의 결정체를 시드 결정으로 사용하여 재결정화되었다. 부분입체 이성질체 24는 여과를 통해 수집하였다(2.2g, > 20:1 24:25). ¹H NMR(400 MHz, CDCl₃) δ 8.22-8.24(dd, J=10 Hz, J=2.0 Hz, 2H), 7.11-7.44(m, 6H), 4.06-4.20(m, 6H), 2.88-3.00(m, 2H), 2.54-2.59(m, 2H), 1.40(d, J=6.8 Hz, 3H), 1.25(t, J=7.2 Hz, 3H), 1.23(t, J=7.2 Hz, 3H). ³¹P NMR(162 MHz, CDCl₃) δ -2.01. LC-MS, m/z 495(M + 1)⁺. CH₃CN이 2% 함유된 디이소프로필 에테르 용액에서의 결정화에 의해 단일 결정 24를 얻었으며, 24의 x선 구조는 R _p로써 인의 중심의 배열을 확인함으로 명확하게 얻었다(도 1).

상기 여과액은 감압 조건 하에서 농축하고, 잔여물을 실온에서 높은 진공 상태에서 하룻밤 동안 건조하였다. 상기 잔여물은 디이소프로필 에테르(200mL)에 낮은 온도의 열과 25의 시드 결정을 더하여 용해시켰다. 실온에서 3일 동안의 세팅 후, 25(510mg, ~20:1 24:25)를 여과를 통해 수집하였다. ¹H NMR(400 MHz, CDCl₃) δ 8.22-8.24(dd, J=10 Hz, 2H), 7.11-7.43(m, 6H), 4.00-4.18(m, 6H), 2.93-2.98(m, 2H), 2.55-2.60(m, 2H), 1.43(d, J=7.2 Hz, 3H), 1.24(t, J=7.2 Hz, 3H), 1.24(t, J=7.2 Hz, 3H). ³¹P NMR(162 MHz, CDCl₃) δ -2.07. LC-MS, m/z 495(M + 1)⁺. 화합물 25의 하나의 결정체를 결정화를 통해 얻었으며, 화합물 25의 x-ray 구조는 S _p로써 인 중심의 배열을 확인하여 명확하게 얻을 수 있었다.

에틸 3-(2-(((R)-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,6- 디아미노 -9H-퓨린-9-일)-3,4- 디하 이드록시-4- 메틸테트라하이드로퓨란 -2-일) 메톡시 )(((S)-1- 에톡시 -1- 옥소프로판 -2-일)아미노) 포스포릴 ) 옥시 ) 페닐 ) 프로파노에이트 ( Ethyl 3-(2-(((R)-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,6-diamino-9H-purin-9-yl)-3,4-dihydroxy-4-methyltetrahydrofuran-2-yl) methoxy)(((S)-1-ethoxy-1-oxopropan-2-yl)amino)phosphoryl)oxy)phenyl) propanoate) 8b-up( R _P )

5가 포함된 THF(0.5mL) 용액에 0.5mL의 t-BuMgCl 용액(1M, 0.5mmol)을 -78℃에서 아르곤 가스 존재 하에 첨가하였다. 상기 혼합 반응물은 30분 동안 상기 온도에서 교반하고, 그 후 실온이 될 때까지 따뜻하게 하였다. 13이 포함된 무수 THF 1mL의 용액을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물은 실온에서 3일 동안 아르곤 가스 존재 하에서 휘저어졌다. 용매는 감압 하에서 증발시켰고, 잔여물은 예냉한 80% TFA 용액(10 mL)에 0℃에서 첨가하였다. 상기 반응 혼합물은 추가적으로 4시간 동안 상온되어 완료되는 동안 교반하였다. 감압 하에서 용매들이 증발된 후, 잔여물을 약간의 양의 pH 7.0의 포화된 NaHCO₃에 첨가하였다. 상기 혼합물은 감압 하에서 농축되었고, 두 단계에서의 수득률이 41%로 37.5 mg의 화합물 8b- up ( R _p )를 얻기 위해, 그 후 실리카겔 컬럼(MeOH/DCM, MeOH 기울기 0 ~ 10%, v/v)상에서 정제되었다. 광학 회전(Optical rotation) [a]²⁴ _D-7.08(0.24, MeOH); ¹HNMR(400 MHz, CD₃OD) δ 0.97(s, 3H, CH₃), 1.15-1.20(m, 6H, 2 x CH₃), 1.34(d, 3H, J=7.2 Hz, CH₃), 2.62(t, 2H, J=8.0 Hz, 2H, CH₂), 2.99(t, 2H, J=8.0 Hz, 2H, CH₂), 3.95-4.58(m, 9H), 5.94(s, 1H, H₁, 7.07-7.38(m, 4H, Ar-H), 7.86(s, 1H, H₈); ¹³CNMR(100 MHz, CD₃OD) d 14.5, 14.6, 20.4, 20.6, 26.8, 35.4, 51.7, 61.7, 62.5, 67.0, 74.4, 80.1, 81.9, 92.8, 114.4, 121.0, 126.2, 128.8, 131.8, 133.2, 137.5, 150.6, 152.7, 157.7, 162.0, 174.8, 175.1; ³¹PNMR(162 MHz, CD₃OD): 5.03; LC/MS calcd. for C₂₇H₃₈N₇O₁₀P 651.2, observed: 552.2(M+1).

에틸 3-(2-(((S)-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,6- 디아미노 -9H-퓨린-9-일)-3,4- 디하 이드록시-4- 메틸테트라하이드로퓨란 -2-일) 메톡시 )(((S)-1- 에톡시 -1- 옥소프로판 -2-일)아미노) 포스포릴 ) 옥시 ) 페닐 ) 프로파노에이트 ( Ethyl 3-(2-(((S)-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,6-diamino-9H-purin-9-yl)-3, 4- dihydroxy -4- methyltetrahydrofuran -2-yl)methoxy)(((S)-1-ethoxy-1-oxopropan-2-yl)amino)phosphoryl)oxy)phenyl) propanoate) 8b-down( S _P )

유사한 과정을 이용하여 39%의 수득률의 8b- down을 제조하였다. 광학 회전(Optical rotation) [a]²⁴ _D+12.12(0.13, MeOH); ¹HNMR(400 MHz, CD₃OD) δ 0.97(s, 3H, CH₃), 1.15-1.17(m, 6H, 2 x CH₃), 1.34(d, 3H, J=7.2 Hz, CH₃), 2.62(t, 2H, J=8.0 Hz, 2H, CH₂), 2.99(t, 2H, J=8.0 Hz, 2H, CH₂), 3.96-4.51(m, 9H), 5.93(s, 1H, H₁, 7.10-7.39(m, 4H, Ar-H), 7.86(s, 1H, H₈); ¹³CNMR(100 MHz, CD₃OD) d 14.5, 14.6, 20.4, 20.8, 26.8, 35.4, 51.6, 61.6, 62.4, 67.7, 74.7, 80.0, 82.1, 93.0, 114.4, 121.1, 126.2, 128.8, 131.7, 133.1, 137.7, 150.5, 152.6, 157.6, 161.9, 174.7, 174.8; ³¹PNMR(162 MHz, CD₃OD): 4.98; LC/MS calcd. for C₂₇H₃₈N₇O₁₀P 651.2, observed: 652.3(M+1).

실시예 7: 에틸 팬데노에이트 단일 부분입체 이성질체 프로드럭(ethyl panthenoate single diastereomer prodrug) 30의 합성

(R)-에틸 3-(2,4- 디하이드록시 -3,3- 디메틸부탄아미도 ) 프로파노에이트 ((R)-Ethyl 3-(2,4- dihydroxy -3,3- dimethylbutanamido ) propanoate ) 27

판테노에이트 칼슘(panthenoate calcium) 26(10g, 42mmol)이 포함된 에탄올(200mL) 용액에 황산의 촉매적인 양을 더하였고, 상기 혼합물은 리플럭스로 하룻밤 동안 가열되었다. 상기 혼합물을 여과하고, 포화된 NaHCO₃ 용액(50mL)을 첨가하여 중화시켰다. 에탄올을 감압 하에서 증발을 이용하여 제거하였고, 액체 상 물질을 에틸아세테이트(EtOAc, 30mLX5)를 이용하여 추출하였다. 상기 결합된 유기 층은 황산나트륨을 이용하여 건조시켰고, 약간 노란색의 기름인, 화합물 27(7.1 g, 28.7 mmol) 을 제공하기 위하여 여과하고, 증발시켰다. ¹H-NMR(400 MHz, CDCl₃) δ ppm 0.87(s, 3H), 0.95(s, 3H), 1.24(t, J = 7.1 Hz, 3H), 2.53(t, J = 6.2 Hz, 2H), 3.60-3.43(m, 4H), 3.91(s, 1H), 3.98(s, 1H), 4.12(q, J = 7.1 Hz, 2H), 4.47(s, 1H), 7.33(t, J = 5.7 Hz, 1H). LC/MS calcd. For C₁₁H₂₂NO₅ 248.1, observed: 248.1(M+1).

에틸 3-((4R)-5,5-디메틸-2-(4- 니트로페녹시 )-2- 옥시도 -1,3,2- 디오사포스피 난-4- 카르복아미도 ) 프로파노에이트 ( Ethyl 3-((4R)-5,5- dimethyl -2-(4-nitrophenoxy)-2-oxido-1,3,2-dioxaphosphinane-4-carboxamido)propanoate) 28 및 29

POCl₃(1mmol, 83μL)가 포함된 THF(5mL) 휘저어진 용액에 0℃에서 4-니트로페놀(1mmol, 139mg)과 Et₃N(1mmol, 139μL)이 함유된 THF(1mL) 용액을 첨가하였다. 1시간 동안 실온에서 교반한 후, 상기 혼합물은 화합물 B(0.81mmol, 200mg)와 Et₃N(2mmol, 83μL) 이 함유된 THF(10mL) 용액에 첨가하였다. 생산된 혼합물은 2시간 동안 80℃로 가열하였다. 상기 용액은 10% NaHCO₃ 수용액에 의해 가수분해되었고, 에틸아세테이트에 의해 세 차례 추출되었다. 상기 결합 유기층 물질들은 브라인(brine)을 이용하여 세척하였고, Na₂SO₄으로 건조되었다. 용매 제거 후, 빠른 분리 부분입체이성질체 화합물 28(0.23mmol, 100mg)과 느린 분리 부분입체 이성질체 화합물 29(0.27mmol, 115mg)를 전체적으로 60%의 수득률로 제공하기 위해, 잔여물질은 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(빠른 분리 부분입체이성질체를 위한 에틸아세테이트가 50% 함유된 헥산, 느린 분리 부분입체이성질체를 위한 에틸아세테이트가 60% 함유된 헥산)를 통해 정제되었다.

28, 고속 용출 부분입체 이성질체(fast eluting diastereomer).¹H-NMR(400 MHz, CD₃OD) δ ppm 1.08(s, 3H), 1.13(s, 3H), 1.18(t, J = 7.1 Hz, 3H), 2.52(t, J = 6.7 Hz, 2H), 3.39-3.53(m, 2H), 4.00-4.10(m, 3H), 4.42(d, J = 11.4 Hz, 1H), 4.88(s, 1H), 7.47(d, J = 9.2 Hz, 2H), 8.24-8.28(m, 2H);³¹PNMR(CD₃OD): -14.02; LC/MS calcd. for C₁₇H₂₄N₂O₉P 431.1, observed: 431.1(M+1). Optical rotation [a]²⁴ _D+51.08(c 0.184, MeOH)

29, 저속 용출 부분입체 이성질체(slow eluting diastereomer). ¹H-NMR(400 MHz, CD₃OD) δ ppm 0.89(s, 3H), 1.18-1.23(m, 6H), 2.49(t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.45(dt, J = 6.7, 2.4 Hz, 2H), 4.10(q, J = 7.1 Hz, 2H), 4.22(t, J = 11.8 Hz, 1H), 4.57(dd, J = 12.7, 11.1 Hz, 1H), 4.73(d, J = 10.3 Hz, 1H), 7.50(dd, J = 9.14, 0.93 Hz, 2H), 8.26-8.32(m, 2H);³¹PNMR(CD₃OD): -13.31; LC/MS calcd. for C₁₇H₂₄N₂O₉P 430.1, observed: 431.1(M+1). Optical rotation [a]²⁴ _D+46.94(c 0.196, MeOH)

에틸 3-((4R)-2-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,6- 디아미노 -9H-퓨린-9-일)-3,4- 디하이 드록시-4- 메틸테트라하이드로퓨란 -2-일) 메톡시 )-5,5-디메틸-2- 옥시도 -1,3,2- 디옥사포스피난 -4- 카보아미도 ) 프로파노에이트 ( Ethyl 3-((4R)-2-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,6- diamino -9H- purin -9- yl )-3,4- dihydroxy -4- methyltetrahydrofuran -2- yl ) methoxy )-5,5-dimethyl-2-oxido-1,3,2-dioxaphosphinane-4-carboxamido)propanoate) 30

화합물 5(0.083mmol, 52.8mg) 0℃의 용액에 1M의 t-BuMgCl(0.25mmol, 0.25mL) 용액을 적가하였다.30분 동안 0℃에서 교반한 후, 0.2 M의 화합물 28(0.41mmol, 2.08mL)이 포함된 THF 용액을 실온에서 적가하였다. 상기 용액은 5일 동안 실온에서 교반하고, 그 후 증발시켜 건조시켰다. 반응하지 않은 다량의 화합물 28를 제거하기 위해, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 잔여물을 정제하였다(에틸아세테이트가 60% 함유된 헥산, 그리고 메탄올이 함유된 15%의 디클로로메탄). 상기 정제된 부분들을 증발시키고 고진공 상태에서 건조시켰으며 디클로로메탄(5 mL)에 희석시켰다. 메탄설포닌산(Methanesulfonic acid, 0.23mmol, 14.1μL) 를 첨가하였고, 상기 용액을 리플럭스에서 5시간 동안 가열하였다. 상기 용액은 Et₃N(0.23mmol, 30μL)을 첨가하여 중화시켰고, 증발시켜 건조하였다. 화합물 30(0.03mmol, 18.0mg)을 제공하기 위해, 상기 잔여물은 실리카겔 컬럼 크로마토그래피( 10% 이하의 메탄올이 포함된 디클로로메탄)에 의해 정제되었다. ¹H-NMR(400 MHz, CD₃OD) d ppm 1.00(s, 3H), 1.11(s, 3H), 1.15(s, 3H), 1.22(t, J = 7.1 Hz, 3H), 2.53(dt, J = 6.7, 2.4 Hz, 2H), 3.53-3.36(m, 2H), 4.09(q, J = 7.2 Hz, 2H), 4.33-4.13(m, 4H), 4.55(ddd, J = 11.7, 7.2, 2.0 Hz, 1H), 4.68(ddd, J = 11.6, 6.6, 2.0 Hz, 1H), 4.75(d, J = 4.0 Hz, 1H), 5.98(s, 1H), 7.90(s, 1H);³¹P-NMR(CD₃OD): -4.87; LC/MS calcd. for C₂₂H₃₅N₇O₁₀P 588.2, observed: 588.1(M+1).

실시예 8: 2'-F-2'-C-Me 2,6-디아미노 퓨린 모노포스페이트 프로드럭(2'-F-2'-C-Me 2,6-diamino purine monophosphate prodrug) 36의 합성

(2R,3R,4R,5R)-5-(2,6- 디아미노 -9H-퓨린-9-일)-4- 플루오로 -2-( 하이드록시메 틸)-4- 메틸테트라하이드로퓨란 -3-올((2R,3R,4R,5R)-5-(2,6- Diamino -9H- purin -9-yl)-4-fluoro-2-(hydroxymethyl)-4-methyltetrahydrofuran-3-ol) 31

¹H-NMR(CD₃OD): 1.18(d, J = 22.3 Hz, 3H), 3.87(dd, J = 13.0, 3.3 Hz, 1H), 4.02-4.06(m, 2H), 4.40(dd, J = 24.4, 9.2 Hz, 1H), 6.12(d, J = 18.0 Hz, 1H), 8.13(s, 1H).; ¹³C-NMR(CD₃OD): 15.6, 15.8, 59.6, 71.2, 71.4, 82.3, 89.0, 89.4, 100.2, 102.0, 113.1, 136.5, 151.1, 156.5, 160.8. LC/MS calcd. for C₁₁H₁₅FN₆O₃　298.1, observed: 299.2(M+1).

(2R,3R,4R,5R)-2-((( tert - 부틸디메틸실릴 ) 옥시 ) 메틸 ))-5-(2,6- 디아미노 -9H-퓨린-9-일)-4- 플루오로 -4- 메틸테트라하이드로퓨란 -3-올((2R,3R,4R,5R)-2-(((tert- Butyldimethylsilyl ) oxy ) methyl )-5-(2,6- diamino -9H- purin -9- yl )-4- fluoro -4-methyltetrahydrofuran-3-ol) 32

(2R,3R,4R,5R)-5-(2,6-디아미노-9H-퓨린-9-일)-4-플루오로-2-(하이드록시메틸)-4-메틸테트라하이드로퓨란-3-올((2R,3R,4R,5R)-5-(2,6-diamino-9H-purin-9-yl)-4-fluoro-2-(hydroxymethyl)-4-methyltetrahydrofuran-3-ol) 31(230mg, 0.77mmol) 이 함유된 섞여진 피리딘 용액에 TBDMSCl(256mg, 1.69mmol)을 첨가하였다. 상기 용액은 하룻밤 동안 교반하고, 메탄올(2 mL)을 첨가하였다. 20분 동안 교반한 후, 상기 용액은 건조를 위해 증발시켰고, 톨루엔(toluene)로 두 차례 증발시켰다. 화합물 32(275 mg, 0.67 mmol, 87%)를 제공하기 위해, 잔여물은 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(0% ~ 3% MeOH in CH₂Cl₂)를 이용하여 정제되었다. ¹H-NMR(CD₃OD): 0.17(s, 6H), 0.98(s, 9H), 1.19(d, J = 22.2 Hz, 3H), 3.97(dd, J = 12.0, 2.5 Hz, 1H), 4.06(dd, J = 9.4, 1.3 Hz, 1H), 4.16(dd, J = 12.0, 1.7 Hz, 1H), 4.27(dd, J = 24.6, 9.4 Hz, 1H), 6.11(d, J = 16.7 Hz, 1H), 8.24(s, 1H); ¹³C-NMR(CD₃OD): -5.276, -5.209, 16.7, 17.0, 19.5, 26.6, 62.3, 71.9, 72.1, 83.4, 89.4, 89.8, 101.4, 103.2, 113.9, 137.7, 152.7, 156.5, 160.6. LC/MS calcd. for C₁₇H₂₉FN₆O₃Si 412.2, observed: 413.3(M+1).

벤질 (2-아미노-9-((2R,3R,4R,5R)-4-((( 벤질옥시 ) 카보닐 ) 옥시 )-5-((( tert - 부틸디메틸실릴 ) 옥시 ) 메틸 )-3- 플루오로 -3- 메틸테트라하이드로퓨란 -2-일)-9H-퓨린-6-일) 카바메이트 ( Benzyl (2-amino-9-((2R,3R,4R,5R)-4-((( benzyloxy ) carbonyl ) oxy )-5-((( tert - butyldimethylsilyl ) oxy ) methyl )-3- fluoro -3- methyltetrahydrofuran -2-yl)-9H-purin-6-yl)carbamate) 33

화합물 32(225mg, 0.55mmol) 가 포함된 섞여진 디클로로메탄(5mL) 용액에 연속적으로 DMAP(266mg, 2.2mmol)와 CBzCl(0.31mL, 2.18mmol)을 첨가하였다. 실온에서 6시간 동안 교반한 후, 상기 용액은 0℃로 냉각되고, DMAP(266mg, 2.2mmol)와 CBzCl(0.31mL, 2.18mmol)가 다시 한번 추가되었다. 실온에서 하룻밤 동안 교반한 후, 반응은 물과 디클로로메탄을 추가함으로 멈추었다. 유기물 층과 액상 층을 분리하였으며, 유기물 층은 물로 두 차례 세척하였다. 상기 결합된 유기물 층은 황산나트륨을 통해 건조되고, 여과되고, 증발되었다. 화합물 33(300mg, 0.44mmol, 81%)을 제공하기 위하여, 잔여물은 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(EtOAc가 10% ~ 45% 로 함유된 헥산)를 이용하여 정제되었다. ¹H-NMR(CD₃OD): 0.06(d, J = 4.1 Hz, 6H), 0.91(s, 9H), 1.17(d, J = 22.4 Hz, 3H), 3.80(dd, J = 12.1, 2.6 Hz, 1H), 4.05(dd, J = 12.1, 2.1 Hz, 1H), 4.27(d, J = 9.1 Hz, 1H), 5.14-5.23(m, 5H), 5.53(dd, J = 22.6, 9.1 Hz, 1H), 6.16(d, J = 16.7 Hz, 1H), 7.26-7.43(m, 10H), 8.30(s, 1H). ¹³C-NMR(CD₃OD): -5.4, 17.4, 17.6, 19.4, 26.5, 62.2, 68.3, 71.6, 75.5, 75.7, 81.2, 89.6, 90.0, 100.4, 102.2, 116.4, 129.2, 129.3, 129.5, 129.6, 129.7, 129.8, 136.5, 137.4, 138.9, 151.5, 153.3, 154.1, 155.9, 162.0; LC/MS calcd. for C₃₃H₄₁FN₆O₇Si 680.3, observed: 681.3(M+1).

벤질 (2-아미노-9-((2R,3R,4R,5R)-4-((( 벤질옥시 ) 카보닐 ) 옥시 )-3- 플루오로 -5-(하 이드록시메 틸)-3- 메틸 테트라하이드로퓨란 -2-일)-9H-퓨린-6-일) 카바메이트 ( Benzyl (2- amino -9-((2R,3R,4R,5R)-4-((( benzyloxy ) carbonyl ) oxy )-3- fluoro -5-(hydroxymethyl)-3-methyl tetrahydrofuran -2- yl )-9H- purin -6- yl ) carbamate ) 34

화합물 33(245mg, 0.36mmol) 이 포함된 휘저어진 0℃의 THF(5mL) 용액에 Et₃N^.3HF(0.234mL, 1.44mmol)를 첨가하였다. 24시간 동안 실온에서 교반한 후, 상기 용액은 포화 NaHCO₃ 용액으로 중화되었고, 에틸아세테이트를 첨가하였다. 유기물층과 액상 층을 분리하였고, 상기 유기물층은 다시 한번 포화 NaHCO₃ 용액으로 , 마지막으론 물로 세척되었다. 상기 결합 유기물층을 황산나트륨을 통해 건조시키고, 여과하고, 증발시켰다. 화합물 34(198mg, 0.35mmol, 97%)를 제공하기 위해 잔여물은 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(메탄올이 1% ~2% 로 함유된 디클로로메탄) 로 정제하였다. ¹H-NMR(CD₃OD): 1.17(d, J = 22.6, 3H), 3.78(dd, J = 12.7, 3.2 Hz, 1H), 3.97(dd, J = 12.7, 2.4 Hz, 1H), 4.24(d, J = 9.0 Hz, 1H), 5.23(s, 2H), 5.19(s, 2H), 5.62(dd, J = 21.2, 9.0 Hz, 1H), 6.16(d, J = 18.0 Hz, 1H), 7.26-7.43(m, 10H), 8.25(s, 1H); ¹³C-NMR(CD₃OD): 17.6, 17.8, 60.8, 68.3, 71.5, 76.2, 76.4, 81.6, 90.2, 90.6, 100.3, 102.2, 103.0, 116.6, 129.3, 129.4(2C), 129.6, 129.7(2C), 136.6, 137.4, 139.8, 151.5, 153.4, 154.1, 155.9, 161.8; LC/MS calcd. for C₂₇H₂₇FN₆O₇ 566.2, observed: 567.2(M+1)

에틸 3-(2-(((S)-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2-아미노-6-((( 벤질옥시 ) 카보닐 )아미노)-9H-퓨린-9-일)-3-((( 벤질옥시 ) 카보닐 ) 옥시 )-4- 플루오로 -4- 메틸테트라하이드로 퓨란-2-일) 메톡시 )(((S)-1- 에톡시 -1- 옥소프로판 -2-일)아미노) 포스포릴 ) 옥시 ) 페닐 )프로파노에이트( Ethyl 3-(2-(((S)-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2- amino -6-((( benzyloxy ) carbonyl ) amino )-9H- purin -9- yl )-3-((( benzyloxy ) carbonyl ) oxy )-4- fluoro -4- methyltetrahydrofuran -2- yl ) methoxy )(((S)-1- ethoxy -1- oxopropan -2-yl)amino)phosphoryl)oxy)phenyl)propanoate) 35

(2R)-에틸 2-(클로로(페녹시)포스포릴아미노)프로파노에이트((2R)-Ethyl 2-(chloro(phenoxy)phosphorylamino)propanoate, 0.5M, 0.58mL, 0.29mmol)을 34(32.8 mg, 0.057 mmol)와 N-메틸이미다졸(23mL, 0.29 mmol)가 포함된 0℃ THF(0.1mL) 용액에 첨가하였다. 생산된 상기 혼합물은 실온에서 하룻밤 동안 휘저어졌다. 감압 하에서 용매가 제거된 후, 42mg의 하얀색 고체 화합물 35(수득률 80%)를 제공하기 위해 잔여물은 메탄올 기울기의 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(메탄올이 0~10%의 기울기인 디클로로메탄)에 의해 정제되었다. ¹H NMR(400 MHz, CD₃OD) δ 1.10 - 1.32(m, 12H), 2.54 - 2.64(m, 2H), 2.89 - 2.97(m, 2H), 3.89 - 4.11(m, 6H), 4.40 - 4.61(m, 2H), 5.16 - 5.28(m, 4H), 5.86 - 5.99(m, 1H), 6.14 - 6.21(m, 1H), 6.90 - 7.45(m, 14H), 7.97(s, 1H); ³¹PNMR(162 MHz, CD₃OD): 4.74, 4.77; LC/MS calcd. for C₄₃H₅₀FN₇O₁₃P 922.3, observed: 922.2(M+1)⁺.

에틸 3-(2-(((S)-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,6- 디아미노 -9H-퓨린-9-일)-4- 플루오 로-3- 하이드록시 -4- 메틸테트라 - 하이드로퓨란 -2-일) 메톡시 )(((S)-1- 에톡시 -1- 옥소프 로판-2-일)아미노) 포스포릴 ) 옥시 ) 페닐 ) 프로파노에이트 ( Ethyl 3-(2-(((S)-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,6- diamino -9H- purin -9- yl )-4- fluoro -3- hydroxy -4- methyltetra - hydrofuran -2- yl ) methoxy )(((S)-1- ethoxy -1- oxopropan -2-yl)amino)phosphoryl)oxy)phenyl) propanoate ) 36

35(42mg)와 10mg의 10% Pd/C가 함유된 5mL의 에탄올이 혼합된 물질을 수소로 가득 채우고, 실온에 하룻밤 동안 휘져어지게 하였다. 생산된 혼합물은 질소를 이용하여 가스를 제거하고, 여과하고, 23mg의 프로드럭 화합물 36을 수득률 77%로 제공하기 위해, 여과된 물질을 농축하고 잔여물을 실리카겔 컬럼(기울기 0 ~ 10% 메탄올이 포함된 DCM)으로 정제하였다. ¹H NMR(400 MHz, CD₃OD) δ 1.14 - 1.34(m, 12H), 2.59 - 2.64(m, 2H), 2.96 - 3.00(m, 2H), 3.93 - 4.19(m, 6H), 4.47 - 4.62(m, 3H), 6.08 - 6.15(m, 1H), 7.07 - 7.37(m, 4H), 7.85(s, 1H); ³¹PNMR(162 MHz, CD₃OD): 4.88, 4.95; LC/MS calcd. for C₂₇H₃₈FN₇O₉P 653.2, observed: 653.3(M+1)⁺.

실시예 9

이소프로필 3-(2-(((((3R,4R,5R)-5-(2-아미노-6- 클로로 -9H-퓨린-9-일)-3,4-디하이드록시-4- 메틸테트라하이드로 - 퓨란 -2-일) 메톡시 )(((S)-1- 이소프로폭시 -1- 옥소프로판 -2-일)아미노) 포스포릴 ) 옥시 ) 페닐 ) 프로파노에이트 ( Isopropyl 3-(2-(((((3R,4R,5R)-5-(2-amino-6-chloro-9H-purin-9-yl)-3,4-dihydroxy-4-methyl tetrahydro-furan-2-yl)methoxy)(((S)-1-isopropoxy-1-oxopropan-2-yl)amino) phosphoryl)oxy)phenyl)propanoate) 3a

37(630mg, 1.91mmol)과 38(2.4g, 5.71mmol) 을 포함한 섞인 무수 THF(10mL)과 MeCN(1mL)이 함께 있는 용액에 NMI(445μL, 5.71mmol)를 실온에서 첨가하였다. 상기 반응 혼합물은 2.5시간 동안 실온에서 휘져어졌다. 용매는 감압 하에서 제거되었고, 잔여물은 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(메탄올이 0%~8% 함유된 dichloromethane)를 통해 정제되었다.1.2g의 화합물 39를 얻었다(수득률 82%). LC/MS calcd. for C₂₉H₄₀ClN₆O₁₀P 698.2, observed: 699.2(M+1)⁺.

이소프로필 3-(2-(((((2R,3R,4R,5R)-5-(2,6- 디아미노 -9H-퓨린-9-일)-3,4-

디하이드록시 -4- 메틸테트라하이드로 - 퓨란 -2-일) 메톡시 )(((S)-1- 이소프로폭시 -1-옥 소프로 판-2-일)아미노) 포스포릴 ) 옥시 ) 페닐 ) 프로파노에이트 ( Isopropyl 3-(2-(((((2R,3R,4R,5R)-5-(2,6- diamino -9H- purin -9- yl )-3,4- dihydroxy -4- methyltetrahydro - furan -2- yl ) methoxy )(((S)-1- isopropoxy -1- oxopropan -2-yl)amino)phosphoryl)oxy)phenyl)propanoate) 41

화합물 39(1.2g, 1.57mmol), NaN₃ ₍155mg, 2.36mmol), ^tBu₄NI(295mg, 0.78mmol) 이 포함된 DMF(2mL) 용액을 5시간 동안 90℃에서 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 실온이 되도록 냉각시켰고, n-BuBr(0.22mL, 2mmol)을 첨가하고, 과도한 양의 NaN₃가 BuN₃으로 변환되도록 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 감압 하에서 용매의 제거 후, 잔여물을 에틸아세테이트(EtOAc, 100mL)와 물(30mL) 사이에서 분할하였다. 상기에서 분할한 물 상을 에틸아세테이트(3 x 30mL)로 추출하였고, 상기 결합된 유기층은 황산나트륨을 통해 건조되었다. 용매 제거 후, 잔여물은 Pd(OH)₂/C 과 iPrOH(15mL) 용액에 첨가되었다. 상기 혼합물은 수소(50 PSI)로 가득차게 하여 환원 반응이 완료시키기 위해 하룻밤 동안을 두었다. 상기 반응 혼합물은 셀라이트 패드를 통해 여과되었고, 여과물을 감압 하에서 농축하였다. 잔여물을 에틸아세테이트(100 mL)와 물(20 mL)로 분리하였다. 물상은 에틸아세테이트(3 x 30 mL) 로 추출하였고, 상기 결합된 유기층은 황산나트륨을 통해 건조되었다. 용매 제거 후, 650mg의 하얀색 고체의 화합물 41을 제공하기 위하여(수득률 61% ;두단계), 잔여물은 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(0%~15%의 메탄올이 함유된 디클로로메탄) 로 정제되었다. ¹H-NMR(CD₃OD)(1:1 mixture of P diastereomers): 0.97(s, 3H, CH₃), 1.13-1.21(m, 9H, 3 x CH₃), 1.33(s, 3H, CH₃), 2.56-2.62(m, 2H, CH₂), 2.97-3.03(m, 2H, CH₂), 3.91-3.95(m, 1H), 4.18-4.26(m, 2H), 4.88-4.61(m, 2H), 4.83-4.97(m, 2H), (m, 14H), 5.93(s, 1H), 7.08-7.40(m, 4H, Ar-H), 7.86(s, 1H, H₈); ³¹PNMR(CD₃OD): 4.99, 5.09; LC/MS calcd. for C₂₉H₄₂N₇O₁₀P 679.3, observed: 680.3(M + 1)⁺.

실시예 10

시약들 및 반응 조건들: a) TBSCl, 이미다졸, 피닐딘, 0℃ 그 후에 상온에서 6h; b) N,N' -카보닐 디이미다졸, DMF, 0℃ 그 후에 상온에서 4h; c) Et₃N-3HF, THF, 0℃ 그 후에 상온에서 12h; d) 38, NMI, THF, -78℃ 그 후에 상온에서 12h; e) NaN₃, DMF, 70℃, 12h; f) 10% Pd/C, H₂ (50 psi), i-PrOH-EtOAc(2:1 v/v), rt, 18h.

(2R,3R,4R,5R)-2-(2-아미노-6- 클로로 -9H-퓨린-9-일)-5-((( tert - 부틸디메틸실릴 ) 옥시 ) 메틸 )-3- 메틸테트라하이드로퓨란 -3,4- 디올 ((2R,3R,4R,5R)-2-(2- Amino -6-chloro-9H-purin-9-yl)-5-(((tert-butyldimethylsilyl)oxy)methyl)-3-methyl tetrahydrofuran-3,4-diol) (42)

화합물 37(1.0g, 3.20mmol)이 포함된 20mL의 무수 피리딘 용액에 0℃에서 질소 분위기 하에서 이미다졸(0.27g, 4.0mmol)과 t-부틸디메틸실릴 클로라이드(TBSCl)(0.72g, 4.8mmol)을 첨가하였다. 6시간 동안 교반한 후, 상기 용액은 메탄올(1.0 mL)로 상온에서 처리하였고, 감압 하에서 농축되었다. 화합물 42(1.32g, 3.07mmol)를 92%의 수득률로 제공하기 위하여 잔여물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(CH₂Cl₂ ~ CH₂Cl₂:MeOH; 10:1)로 정제하였다. MS-ESI⁺ m/z 430(M+H⁺).

(3 aR ,4R,6R,6 aR )-4-(2-아미노-6- 클로로 -9H-퓨린-9-일)-6-( 하이드록시메틸 )-3a-메 틸테트라하이드로퓨로[3,4-d][1,3]디옥 솔-2-온((3aR,4R,6R,6aR)-4-(2-Amino-6- chloro -9H- purin -9- yl )-6-( hydroxymethyl )-3a- methyltetrahydrofuro [3,4-d][1,3]dioxol-2-one) (43)

화합물 42(0.89g, 2.10mmol)가 포함된 10mL의 무수 DMF 용액에 N,N' -카보닐디이미다졸(0.85g, 5.18mmol)을 0℃, 질소 존재하에 첨가하였다. 4시간 동안 교반한 후, 상기 반응 용액은 감압 하에 농축되었다. 2'-3'-O,O-카보네이트 중간체를 제공하기 위해, 잔여물은 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(hexane:EtOAc; 4:1 ~ 1:2)로 정제되었다. 2'-3'-O,O-카보네이트 중간체가 포함되어 있는 20mL의 THF 용액에 Et₃N-3HF(1.65mL, 10.20mmol)를 0℃, 질소 존재 하에서 첨가하였다. 12시간 동안 실온에서 교반한 후, 생산된 용액은 감압 하에서 농축되었다. 화합물 43(0.70g, 2.04 mmol)을 97%의 수득률로 제공하기 위하여(2단계), 잔여물은 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(hexane:EtOAc; 10:1 ~ EtOAc:MeOH; 20:1) 로 정제되었다. ¹H NMR(400 MHz, DMSO-d ₆) δ 8.34(s, 1H), 7.12(br, 2H), 6.37(s, 1H), 5.34(t, J = 5.6 Hz, 1H), 5.08(d, J = 3.6 Hz, 1H), 4.40(q, J = 3.6 Hz, 1H), 3.82-3.70(m, 2H), 1.30(s, 3H); MS-ESI⁺ m/z 342(M+H⁺).

이소프로필 3-(2-(((((3 aR ,4R,6R,6 aR )-6-(2-아미노-6- 클로로 -9H-퓨린-9-일)-6a-메틸-2- 옥소테트라하이드로퓨로[3,4-d][1,3]디옥솔 -4-일) 메톡시 )(((S)-1- 이소프로폭시 -1- 옥소프로판 -2-일)아미노) 포스포릴 ) 옥시 ) 페닐 ) 프로파노에이트 (Isopropyl3-(2-(((((3 aR ,4R,6R,6 aR )-6-(2- amino -6- chloro -9H- purin -9- yl )-6a- methyl -2- oxotetrahydrofuro [3,4-d][1,3]dioxol-4- yl ) methoxy )(((S)-1- isopropoxy -1-oxopropan-2-yl)amino)phosphoryl)oxy)phenyl)propanoate) (44)

화합물 43(0.54g, 1.58mmol)이 포함된 10mL의 무수 THF 용액에 포스포라미데이트 클로라이드(phosphoramidate chloride) 38(1.66g, 3.95mmol)이 포함된 10mL의 THF 용액과 N-메틸이미다졸(0.65g, 7.90mmol)를 -78℃, 질소 존재 하에 첨가하였다. 12시간 동안 실온에서 교반한 후, 상기 반응 용액은 감압 하에서 농축되었다. 화합물 44(0.89g, 1.23mmol)를 78%의 수득률로 제공하기 위하여, 잔여물은 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(hexane:EtOAc; 4:1 ~ 1:2)로 정제되었다. ¹H NMR(400 MHz, CDCl₃) δ 8.81-7.79(s, 1H), 7.40-7.05(m, 4H), 6.40-5.90(br, 2H), 6.13-6.08(s, 1H), 5.61(d, J = 4.8 Hz, 0.5H), 5.34(d, J = 4.4 Hz, 0.5H), 5.09-4.90(m, 3H), 4.51-4.43(m, 1H), 4.24-3.95(m, 2H), 3.85-3.78(m, 1H), 3.03-2.86(m, 2H), 2.64-2.54(m, 2H), 1.43-1.13(m, 18H); MS-ESI⁺ m/z 725(M+H⁺).

이소프로필 3-(2-(((((3 aR ,4R,6R,6 aR )-6-(2,6- 디아미노 -9H-퓨린-9-일)-6a- 메 틸-2- 옥소테트라하이드로퓨로[3,4-d][1,3]디옥솔 -4-일) 메톡시 )(((S)-1- 이소프로폭시 - 이소프로판 -2-일)아미노) 포스포릴 ) 옥시 ) 페닐 ) 프로파노에이트 (Isopropyl3-(2-(((((3 aR ,4R,6R,6 aR )-6-(2,6- diamino -9H- purin -9- yl )-6a- methyl -2- oxotetrahydrofuro [3,4-d][1,3]dioxol-4- yl ) methoxy )(((S)-1- isopropoxy -1-oxopropan-2-yl)amino)phosphoryl)oxy)phenyl)propanoate) (45)

화합물 44(0.47g, 0.65mmol)이 포함된 10mL의 무수 THF 용액에 실온, 질소 존재 하에서 NaN₃(0.13g, 1.95mmol)를 첨가하였다. 12시간 동안 70℃에서 교반한 후, 생성된 용액을 50mL의 에틸아세테이트에 붓고, 차가운 물(20 mL x 3)과 브라인(20 mL)으로 세척하였다. 상기 유기층은 황산나트륨을 통해 건조되었고 감압 하에서 농축되었다. 잔여물이 포함된 15mL의 i-PrOH:EtOAc; 2:1 비율의 조용매(co-solvent) 용액에 0.04g의 Pd/C(10% Pd on activated carbon)을 첨가하였다. 18시간 동안 수소(50psi) 존재하에 혼합 후, 질소로 가스를 제거한 용액을 셀라이트로 처리하고, 30분 동안 교반, 여과하였다. 화합물 45(0.40g, 0.57mmol)를 87%의 수득률로 제공하기 위해(³¹P NMR 의한 부분입체 이성질체의 비율(R_p/S_p) =1:1), 상기 여과액은 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(hexane:EtOAc; 1:5 ~ EtOAc:MeOH; 20:1) 로 정제되었다. ¹H NMR(400 MHz, CD₃OD) δ 7.86-7.81(s, 1H), 7.40-7.09(m, 4H), 6.32-6.30(s, 1H), 5.38-5.34(m, 1H), 5.02-4.87(m, 2H), 4.80-4.70(m, 1H), 4.56-4.38(m, 2H), 3.99-3.92(m, 1H), 3.00-2.94(m, 2H), 2.63-2.55(m, 2H), 1.38-1.33(m, 6H), 1.22-1.13(m, 12H); ³¹P NMR(162 MHz, CDCl₃) d 5.45, 5.25; MS-ESI⁺ m/z 706(M+H⁺).

실시예 11

(R)-이소프로필 3-(2,4- 디하이드록시 -3,3- 디메틸부타나미도 ) 프로파노에이 트((R)- Isopropyl 3-(2,4- dihydroxy -3,3- dimethylbutanamido ) propanoate ), 46

2-프로파놀(200 ml)에 판테노에이트 칼슘, 26(10g, 42mmol)이 함유된 현탄액을 0℃까지 냉각한 후, 투명한 용액이 될 때까지 HCl 가스 처리하였다. HCL의 주입 후, 혼합물은 상온이 되도록 온도를 올려주었고, 하룻밤 동안 교반하였다. 용액은 압력을 경감시켜 증류시키고 잔여물은 EtOAc로 녹인 후, 5%의 NaHCO₃로 세척하였다. 유기물층은 Na₂SO₄로 건조시키고, 여과 후 증류하여 깨끗한 오일의 46을 얻었다(10 g, 90%). ¹H-NMR(400 MHz, CDCl₃) δ ppm 0.86(s, 3H), 0.97(s, 3H), 1.22(d, J = 6.4 Hz, 6H), 2.51(t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.55-3.45(m, 4H), 3.98(s, 1H), 3.98(s, 1H), 5.00(t, 6.4 Hz 1H), 7.33(t, J = 5.7 Hz, 1H). 262.1의 C₁₂H₂₄NO₅를LC/MS 분석 한 결과, 262.1(M+1)가 확인되었다.

이소프로필 3-((4R)-2- 클로로 -5,5-디메틸-2- 옥시도 -1,3,2- 디옥사포스피네인 -4-카 르복사미 도) 프로파노에이드 ( Isopropyl 3-((4R)-2- chloro -5,5- dimethyl -2-oxido-1,3,2-dioxaphosphinane-4-carboxamido)propanoate), 47

0℃에서 Et₃N(11.2mmol, 16mL)을 THF(15mL)에 함유된 화합물 46(1g, 3.8mmol)용액(THF 15mL)에 첨가하였다. 30분 동안 교반 후, -75℃에서 차가운 POCl₃(4.7mmol, 0.45mL, THF 10mL)를 서서히 더해주었고, 생성된 용액을 1시간 동안 0 ℃에서 교반 후, 다시 30분간 상온에서 교반하였다. 용액은 압력을 경감시켜 증류하였고 디클로로메탄(dichloromethane, 20 mL)에 녹인 후, NaHCO₃로 세척하였다. 결합된 유기물층은 Na₂SO₄로 건조하였고 용액은 압력을 경감시켜 증류하였다. 화합물 47을 고진공에서 건조하였고 추가정제 없이 사용하였다. 342의 C₁₂H₂₂ClNO₆P를 LC/MS로 측정한 결과, 342.0(M+1)를 확인하였다.

이소프로필 3-((4R)-2-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2-아미노-6- 클로로 -9H- 푸린 -9-일)-3,4- 디하이드록시 -4- 메틸테트라하이드로푸란 -2-일) 메톡시 )-5,5-디메틸-2- 옥시도 -1,3,2- 디옥사포스피네인 -4- 카르복사미도 )프로파노에이드( Isopropyl 3-((4R)-2-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2-amino-6-chloro-9H-purin-9-yl)-3,4- dihydroxy -4- methyltetrahydrofuran -2- yl ) methoxy )-5,5- dimethyl -2- oxido -1,3,2-dioxaphosphinane-4-carboxamido)propanoate), 48

상온에서 N-메틸이미다졸(0.15mL, 1.9mmol)을 2-아미노-6-클로로-퓨린 뉴클레오시드(2-amino-6-chloro-purine nucleoside), 37(0.2g, 0.63mmol) 용액(THF 9mL)에 첨가하였다. 45분 동안 교반 후, 용액을 0℃까지 냉각하였고, 47 용액(5mL, 0.5 M, THF에 녹아있음)을 한 방울씩 넣어 주었다. 반응물은 상온으로 온도를 올려주고 하룻밤 동안 교반하였다. 용액은 압력을 경감시켜 증류시키고 원래 잔유물은 플래쉬 크로마토그래피(용리액: 5%에서 15% MeOH)로 정제하였다. 30%의 합성된 48(118mg, 0.19mmol)를 얻었고, 621.1의 C₂₃h₃₅ClN₆O₁₀P를 LC/MS측정한 결과, 621.1(M+1)을 확인하였다.

이소프로필 3-((4R)-2-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,6- 디아미노 -9H- 푸린 -9-일)-3,4-디하이드록시-4- 메틸테트라하이드로푸란 -2-일) 메톡시 )-5,5-디메틸-2- 옥시도 -1,3,2- 디옥사포스피네인 -4- 카르복사미도 ) 프로파노에이드(Isopropyl 3-((4R)-2-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,6-diamino-9H-purin-9-yl)-3,4-dihydroxy-4- methyltetrahydrofuran -2- yl ) methoxy )-5,5- dimethyl -2- oxido -1,3,2-dioxaphosphinane-4-carboxamido)propanoate), 49

DMF(3mL)에 함유된 48(100mg, 0.16mmol)과 NaN₃(52mg, 0.8mmol) 용액에 열을 가하여 80℃로 만든 후 5시간 동안 교반하였다(반응의 진행은 LC-MS로 관찰하였다.). 반응 완료 후 혼합물은 압력을 경감시켜 증류시키고 원래 잔유물은 플래쉬 크로마토그래피(0%에서 20% MeOH, 바탕액: CH₂Cl₂)로 정제하였다. 59%의 하얀색 결정으로 된 순수한 6-아지도 화합물(6-azido compound, 60mg, 0.095mmol)을 얻었고, 627.2의 C₂₃H₃₄N₉O₁₀P를 LC/MS측정한 결과, 628.2(M+1)를 확인하였다. 상기 6-아지도 화합물과 에틸아세테이트(3mL)에 녹인 Pd(OH)₂/C의 촉매량을 8시간 동안 상온에서 대기압 조건하에 수소 첨가되었다. 질소 처리 된 혼합물은 셀라이트 패드(pad of celite)를 이용하여 여과하였고 사용된 셀라이트는 50%의 CH₂Cl₂와 CH₃OH 용액으로 세척하였다. 용액은 압력을 경감시켜 증류시키고, 원래 잔여물은 예비의 TLC 플레이트(용리액: 15% MeOH, 바탕액: CH₂Cl₂)로 정제하였다. 화합물 49는 부분입체 이성질체 혼합물로 얻었고, NMR 결과, -4.84와 -7.21에서; 602.2의 C₂₃H₃₇N₇O₁₀P를 LC/MS측정한 결과, 602.2(M+1)를 확인하였다.

실시예 12

NS5B 효소검사

HCV 레플리콘 세포로부터 클론되어 C-말단에 21-아미노산이 줄어든 HCV NS5B RNA 폴리머라제는 6개의 히스티딘 말단부를 갖고, 원핵생물 발현벡터(pQE60; Qiagen)에서 발현되며, 후에 탈론(코발트)친화성 수지 컬럼(Clontech, Palo Alto, Calif)으로 정제될 수 있다. SDS-PAGE와 웨스턴 블랏으로 정제를 확인하였고, 정제된 단백질은 50mM의 소듐 포스페이트(pH 8.0, 300mM sodium chloride, 0.5% Triton X100, 50% glycerol, 2 mM 디티오트레이틀)로 하루 동안 투석하였다. 투석물은 -20℃에서 보관하면 6개월 동안 활성이 유지되며, 쿠마시 플러스 단백질검사시약(Coomassie Plus protein assay reagent(Pierce))를 사용하여 정량하였다.

NS5B RNA 폴리머라제 반응은 마이너그 IRES를 사용하여 새로 합성된 RNA 가닥을 주형으로 하여, ³²P가 표지된 UMP가 결합하는 것을 관찰함으로써 진행되었다. 2.8mg 마이너스 IRES RNA 주형, 140 유닛의 anti-RNase(Ambion), 1.4mg NS5B, 적절한 양의 [a-³²P]UTP, 다양한 농도의 천연 또는 변형된 뉴클레오티드, 1mM MgCl₂, 0.75mM MnCl₂, 2mM 디티오트레이톨(dithiothreitol)이 함유된 50mM의 HEPES 버퍼(pH 7.5)의 전체 부피 140mL에서 정상적인 반응이 진행되었다. 뉴클레오티드의 농도는 억제제에 따라 변화를 주었고, 반응온도는 27℃에서 진행하였다. 기대한 시간에 따라 20mL의 부분표본을 채취하였고, 반응을 멈추기 위해 반응물을 80mL의 정지액(12.5mM EDTA, 2.25M NaCl, 및 225mM 구연산나트륨)과 혼합시켰다. 천연 뉴클레오티드 TP(NTP) 기질의 일정상태 파라미터를 결정하기 위하여 하나의 NTP 농도는 다양하게 하고, 다른 3가지 NTP의 농도는 고정시켰다. A 아날로그의 K _i의 결정을 위하여 UTP, GTP, CTP의 농도는 10, 100, 100mM로 각각 고정하였고, ATP의 농도와 A 아날로그의 농도는 다양하게 하였다. 방사성 RNA 산물은 점 블럿 장치(dot blot apparatus)에 의한 Hybond N+ 멤브레인(Amercham Biosciences)를 통해 반응이 멈춘 반응혼합물을 흘려 반응하지 않은 기질로부터 분리시켰다. RNA 산물은 멤브레인에 남았고, 반응하지 않은 뉴클레오티드는 씻겨 내어졌다. 멤브레인은 0.6M NaCl과 60mM 구연산나트륨이 함유된 용액으로 4차례 씻은 후, 물 및 에탄올로 세척하였다. 점의 방사능은 Packard liquid 신틸레이션 계수기(scintillation counter)로 측정하였다. 생산물의 양은 반응혼합물의 전체 방사능을 기준으로 계산되었고, 반응 비율은 생산물 형성의 시간경과에 따른 경사로 결정하였다. 저해상수(inhibition constant) K _i를 결정하기 위해, 반응비율은 다른농도의 기질과 억제제에 따라 결정하였고, 경쟁적 억제 방정식(n =(V _max · [s])/{K _m ·(1 + [I]/K _i) + [S]}, n: 관찰된 비율, [S]: 기질농도, [I]: 억제제농도, V _max: 최대반응비, K _m: 미카엘리스 상수, K _i: 저해상수)에 맞추었다.

참고문헌:

1) Stuyver LJ, Whitaker T, McBrayer TR, Hernandez-Santiago BI, Lostia S, Tharnish PM, Ramesh M, Chu CK, Jordan R, Shi J, Rachakonda S, Watanabe KA, Otto MJ, Schinazi RF. Ribonucleoside Analogue That Blocks Replication of Bovine Viral Diarrhea and Hepatitis C Viruses in Culture Antimicrob. Agents Chemother. 2003, 47, 244.

실시예 13

RNA 합성과 연쇄정지반응( chain termination )

i) HCV NS5B 의 발현과 정제: HCV NS5B 시퀀스는 발현 벡터 pET-22(Novagen)에 도입시켰다. E. coli BL21(DE3)를 사용하여 C-말단에 길이를 줄인 효소(D21)를 발현시켰고, 금속이온 친화력 크로마토그레피(Talon kit from Clonetech)를 사용하여 정제하였다. 시퀀스는 서열분석을 통해 확인하였다(Sequetech).

ii ) 표준반응조건: 반응 혼합물은 1mM RNA template(RNA20), 1.5mM HCV NS5B, 0.25mM 방사성동위원소가 표지된 프라이머(radiolabeled primer, P16)를 함유하는 40mM HEPES(pH 8.0)와 10mM NaCl, 1 mM 디티오트레이톨(dithiothreitol), 0.2mM MnCl₂로 구성되었으며, 여기에 10mM GTP-UTP과 3 mM 테스트 유도체-TP(test analog-TP) 를 첨부하였다. 반응은 30분 동안 이루어졌으며, 반응산물은 이소프로파놀(isopropanol)로 침전시킨 후, 95℃에서 5분간 열변성 시키면 상기 생성물이 7M 우레아-12% 폴리아크릴아마이드 겔 상에서 분리되어졌다. 전체 길이의 반응산물 형성(EC₅₀)의 50% 감소를 가져오는 체인 말단의 농도는 주형/프라이머(template/primer)의 뉴클레오티드 유사체와 혼합되는 단일위치로 결정되었다.

iii ) 데이터 수득 및 분석: 겔이 phosphorimager(FLA-7000, Fujifilm)를 이용하여 조사 및 분석 되었으며, EC₅₀ 값이 측정되었다.

도 4는 HCV NS5B에 의한((2R,3S,4R,5R)-5-(2,6-디아미노-9H-푸린-9-일)-3,4-디하이드록시테트라하이드로푸란-2-일)메틸 테트라하이드로젠 트리포스페이트(((2R,3S,4R,5R)-5-(2,6-diamino-9H-purin-9-yl)-3,4-dihydroxytetrahydrofuran-2-yl)methyl tetrahydrogen triphosphate)의 혼성을 보여준다.

도 5는 HCV NS5B에 의한((2R,3S,4R,5R)-5-(2-아미노-6-하이드록시-9H-푸린-9-일)-3,4-디하이드록시테트라하이드로푸란-2-일)메틸 테트라하이드로젠 트리포스페이트(((2R,3S,4R,5R)-5-(2-amino-6-hydroxy-9H-purin-9-yl)-3,4-dihydroxytetrahydrofuran-2-yl)methyl tetrahydrogen triphosphate)의 혼성을 보여준다.

실시예 14

HepG2 세포에서 미토콘드리아 독성 분석:

i) 세포 증식 및 젖산 생산에 있어 2,6- 디아미노 푸린 뉴클레오시드 모노포스페이트(2,6- diamino purine nucleoside monophosphate ) 프로드럭의 효과: HepG2 세포의 성장 결과는 0μM, 0.1μM, 1μM, 10μM 및 100μM 약물 존재하에서 세포를 배양함에 의해 확인되었다. 1-% 우태아 혈청, 1% 소듐 피루베이트(sodium pyruvate) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)이 추가된 비필수 아미노산이 처리된 최소한의 필수 배지에서 세포(well 당 5 x 10⁴ 세포)가 12-well 세포 배양 클러스터로 배양되었고 37 ℃에서 4시간 동안 처리되었다. 상기 배양 시간이 끝날 무렵에 세포 수는 혈구계수기(hemocyrometer)를 이용하여 측정되었다. 아울러 Pan-Zhou X-R, Cui L, Zhou X-J, Sommadossi J-P, Darley-Usmer VM. "Differential effects of antiretroviral nucleoside analogs on mitochondrial function in HepG2 cells" Antimicrob. Agents Chemother. 2000; 44: 496-503에 의하여 알려졌다. 젖산 생성에 있어서 뉴클레오시드 유사체의 효과를 측정하기 위하여, 보관용 배양의 HepG2 세포를 희석시키고 각 웰마다 2.5 x 10⁴ 세포를 가지도록 12-well 배양 플레이트에 심어주었다. 다양한 농도(0 μM, 0.1 μM, 1 μM, 10 μM 및 100 μM)의 뉴클레오시드 유사체가 추가되었고, 37 ℃, 습기가 많은 5% CO2 조건에서 상기 배양은 4일 동안 계속되었다. 4일째 되는 날 각각의 웰에서 세포의 숫자가 결정되었고 배양 배지가 수집되었다. 상기 배양 배지는 여과되었고, 상기 배지에서 젖산 함량은 비색분석 젖산 분석(colorimetric lactic acid assay(Sigma-Aldrich))으로 분석되었다. 젖산 생성물이 손상된 미토콘드리아의 작용을 위한 마커로 고려될 수 있고, 2,6-디아미노 푸린 뉴클레오시드 모노포스페이트(2,6-diamino purine nucleoside monophosphate)프로드럭 유사체의 존재하에서 증식한 세포를 탐지하는 젖산 생성물의 증가된 레벨은 약물-유도 독성 효과를 나타낼 수 있다.

ii ) 미토콘드리아 DNA 합성에 있어서 2,6- 디아미노 푸린 뉴클레오시드 모노포스페이트 프로드럭의 효과: 미토콘드리아 DNA 함량을 정확하게 수량화하기 위한 실시간 RNA(real-time PCR) 분석법이 개발되었다(참조 Stuyver LJ, Lostia S, Adams M, Mathew JS, Pai BS, Grier J, Tharnish PM, Choi Y, Chong Y, Choo H, Chu CK, Otto MJ, Schinazi RF. Antiviral activities and cellular toxicities of modified 2',3'-dideoxy-2',3'-didehydrocytidine analogs. Antimicrob. Agents Chemother. 2002; 46: 3854-60). 상기 분석법은 미토콘드리아 DNA 함량에 대한 뉴클레오시드 유사체의 효과를 결정하는 본 출원에 기술된 모든 실시예에서 사용되었다. 상기 분석법에서, 계대수가 적은(low-passage-number) HepG2 세포가 콜라겐-코팅 96-well 플레이트에서 well당 5,000세포가 되도록 심어졌다. 뉴클레오시드 모노포스페이트 유사체는 최후 농도가 0 μM, 0.1 μM, 10 μM 및 100 μM가 되도록 배지에 추가되었다. 배양 7일 째에, 세포의 핵산은 상업적으로 이용가능한 컬럼(RNeasy 96 kit; Qiagen)을 이용하여 준비되었다. 상기 키트는 RNA 및 DNA, 나아가 컬럼으로부터 녹여서 분리되는 전체 핵산을 함께 정제한다. 상기 미토콘드리아 시토크롬 c 산화효소 서브유닛 II(mitochondrial cytochrome c oxidase subunit II(COXII))유전자 및 ß-actin 또는 rRNA 유전자는 양쪽 표적 및 보조 증폭에 대한 적절한 프라이머(primers) 및 프로브(probes)를 가지는 복합 Q-PCR 프로토콜(multiplex Q-PCR protocol)을 이용하여 녹여서 분리된 핵산 5 μl로부터 증폭되었다. COXII에 대하여 이어지는 센스, 프로브 및 안티센스 프라이버(antisense primers)는 각각 다음과 같이 사용하였다: 5'-TGCCCGCCATCATCCTA-3', 5'-테트라클로로(tetrachloro)-6-카복시플루오레세인(carboxyfluorescein)- TCCTCATCGCCCTCCCATCCC-TAMRA-3' 및 5'-CGTCTGTTATGTAAAGGATGCGT-3'. ß-actin 유전자(GenBank accession number E01094)의 엑손 3(exon 3)에 대한 센스, 프로브, 및 안티센스 프라이머는 각각 5'-GCGCGGCTACAGCTTCA-3', 5'-6-FAMCACCACGGCCGAGCGGGATAMRA-3' 및 5'-TCTCCTTAATGTCACGCACGAT-3'이다. rRNA 유전자에 대한 상기 프라이머 및 프로브는 Applied Biosystems사로부터 사업적으로 구매가능하다. 모든 유전자에서 동일한 증폭 효율이 얻어졌기 때문에, 상대적인 CT 방법(The comparative CT method)은 미토콘드리아 DNA 합성의 저해 가능성을 연구하는데 사용되었다. 상기 상대적인 CT 방법은 표적(COXII gene)의 총량이 내생성 보조(endogenous reference(the ß-actin 또는 rRNA gene))의 총량으로 정상화되고 교정기(calibrator)(7일 동안 약품처리를 하지 않은 대조군)와 연관된 계산식을 사용한다. 상기 접근을 위한 계산식은 2-ΔΔCT에 의하여 얻어지고, 상기 ΔΔCT 는(평균 타겟 테스트 샘플용 CT(CT for average target test sample)-표적 대조군용 CT(CT for target control))-(평균 타겟 테스트 샘플용 CT(CT for average reference test)-보조 대조군용 CT(CT for reference control))이다(참조 Johnson MR, K Wang, JB Smith, MJ Heslin, RB Diasio. Quantitation of dihydropyrimidine dehydrogenase expression by real-time reverse transcription polymerase chain reaction. Anal. Biochem. 2000; 278:175-184). 약물 존재 하에서 증식한 세포에서 미토콘드리아 DNA 양의 감소는 미토콘드리아의 독성을 알려줄 수 있다.

iii ) 전자 현미경 형태 분석( Electron Microscopic Morphologic Evaluation): 독성을 유도하는 NRTI는 투과 전자 현미경(transmission electron microscopy)을 이용하는 초미세구조 분석법(ultrastructural analysis)에 의하여 발견될 수 있는 미토콘드리아에서 형태적인 변형(예. 크리스타(cristae), 매트릭스(matrix) 용해, 팽윤(swelling)의 감소 및 지질 정어리 형성)을 유도하는 것으로 관찰되었다(참조 Cui L, Schinazi RF, Gosselin G, Imbach JL. Chu CK, Rando RF, Revankar GR, Sommadossi JP. Effect of enantiomeric and racemic nucleoside analogs on mitochondrial functions in HepG2 cells. Biochem. Pharmacol. 1996, 52, 1577-1584; Lewis W, Levine ES, Griniuviene B, Tankersley KO, Colacino JM, Sommadossi JP, Watanabe KA, Perrino FW. Fialuridine and its metabolites inhibit DNA polymerase gamma at sites of multiple adjacent analog incorporation, decrease mtDNA abundance, and cause mitochondrial structural defects in cultured hepatoblasts. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996; 93: 3592-7; Pan-Zhou XR, L Cui, XJ Zhou, JP Sommadossi, VM Darley-Usmar. Differential effects of antiretroviral nucleoside analogs on mitochondrial function in HepG2 cells. Antimicrob . Agents Chemother. 2000, 44, 496-503). 예를 들면, 10 μM 피얼루리다인(fialuridine(FIAU; 1,2'-deoxy-2'-fluoro-1-D-arabinofuranosly-5-iodo-uracil))으로 배양한 HepG2 세포의 전자 현미경 사진은 미토콘드리아 기능장애와 일치하는 형태 변형과 함께 팽창된 미토콘드리아의 존재를 보여주었다. 2,6-디아미노 푸린 뉴클레오시드 모노포스페이트(2,6-diamino 2'-C-Me purine nucleoside monophosphate) 프로드럭이 미토콘드리아에서 형태학적 변형을 촉진하는 지를 확인하기 위하여, HepG2 세포(2.5 x 10⁴ cells/mL)가 0μM, 0.1μM, 1μM, 10μM 및 100μM 뉴클레오시드 유사체의 존재 하에서 세포 배양접시(35 by 10mm)로 심어진다. 8일째에, 상기 세포는 이전에 언급하였던 에포나스(Eponas)에서 고정되고, 탈수되고, 끼워 넣어진다. 얇은 부분이 우라닐 아세테이트(uranyl acetate) 및 리드 시트레이트(lead citrate)로 제조 및 염색되고 나서 투과 전자 현미경을 이용하여 검사되었다.

HepG2 헤파토마 세포(HepG2 Hepatoma cell)의 핵 또는 미토콘드리아 DNA, 또는 젖산 생성물에서의 화합물 8b-up, 12 및 8a의 효과는 14일 이상으로 분석되었다. 위에서 언급한 i) 의 방법으로 분석되었다.

표에서 볼 수 있는 바와 같이, 8b-up, 12 및 8a의 농도가 50μM까지 핵이나 미토콘드리아 DNA 또는 젖산 생성에 있어서 아무런 중요한 효과를 보이지 않는다 (HepG2 헤파토마 세포 (HepG2 Hepatoma cells)에서 14일간 분석한 것).

실시예 15

Neuro2A 세포에서 미토콘드리아 독성 분석

뉴런 독성 (neuronal toxicity)을 유래하는 뉴클레오시드 유사체의 가능성을 평가하기 위하여, 마우스 Neuro2A 세포 (American Type Culture Collection 131)가 모델시스템으로 이용될 수 있다 (참조 Ray AS, Hernandez-Santiago BI, Mathew JS, Murakami E, Bozeman C, Xie MY, Dutschman GE, Gullen E, Yang Z, Hurwitz S, Cheng YC, Chu CK, McClure H, Schinazi RF, Anderson KS. Mechanism of anti-human immunodeficiency virus activity of beta-D-6-cyclopropylamino-2',3'-didehydro-2',3'-dideoxyguanosine. Antimicrob . Agents Chemother . 2005, 49, 1994-2001). 50% (CC₅₀)에 의하여 세포 증식을 방해하는 필수 농도는 언급된 바와 같이, 3-(4,5-디메틸-싸이아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라이트라아조리움 브로마이드 (3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 시료-기반 분석법을 이용하여 측정될 수 있다. 약물의 정의된 농도에서 세포내 젖산 및 미토콘드리아 DNA 레벨의 변화는 상기 언급한 바와 같이 수행될 수 있다. 모든 실시예에서 ddC 및 AZT는 뉴클레오시드 유사체의 대조군으로 사용될 수 있다.

실시예 16

DNA 폴리머라제에서 뉴클레오시드 유사체의 효과 및 미토콘드리아 DNA 폴리 머라제 γ의 엑소뉴클리아제 ( Exonuclease )활성

i) 인간 폴리머라제 γ의 정제: 폴리머라제 γ의 대형과 소형 재조합체 서브유닛은 이전에 기술한 바와 같이 정제될 수 있다 (참조 Graves SW, Johnson AA, Johnson KA. Expression, purification, and initial kinetic characterization of the large subunit of the human mitochondrial DNA polymerase. Biochemistry. 1998, 37, 6050-8; Johnson AA, Tsai Y, Graves SW, Johnson KA. Human mitochondrial DNA polymerase holoenzyme: reconstitution and characterization. Biochemistry 2000; 39: 1702-8). 상기 단백질 농도는 280 nm에서 분광광도계 (spectrophotometrically)로 측정될 수 있고, 폴리머라제 γ의 대형 및 소형 재조합체 서브유닛 각각에 대하여 234, 420 및 71,894 M^-1 cm^-1의 흡광 계수를 가진다.

ii ) 뉴클레오티드 결합의 키네틱 분석: 예비-정상-상태 키네틱 분석 (Pre-steady-state kinetic analyses)은 뉴클레오티드-TP 및 천연 dNTP 기질에 대한 DNA 폴리머라제 γ 결합의 촉매 효율을 결정하는데 사용될 수 있다. 이것은 상기 효소가 변형된 유사체의 결합 및 독성 예측과 관련된 능력을 결정하도록 해준다. DNA 폴리머라제 γ에 의한 뉴클레오티드 유사체 결합의 예비-정상-상태 키네틱 분석은 이전에 언급한 바와 같이 필수적으로 수행될 수 있다 (참조 Murakami E, Ray AS, Schinazi RF, Anderson KS. Investigating the effects of stereochemistry on incorporation and removal of 5-fluorocytidine analogs by mitochondrial DNA polymerase gamma: comparison of D- and L-D4FC-TP. Antiviral Res. 2004, 62, 57-64; Feng JY, Murakami E, Zorca SM, Johnson AA, Johnson KA, Schinazi RF, Furman PA, Anderson KS. Relationship between antiviral activity and host toxicity: comparison of the incorporation efficiencies of 2',3'-dideoxy-5-fluoro-3'-thiacytidine-triphosphate analogs by human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase and human mitochondrial DNA polymerase. Antimicrob Agents Chemother. 2004, 48, 1300-6). 간단히, 50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 7.8 조건에서 폴리머라제 γ의 대형 (250 nM) 및 소형 (1.25 mM) 서브유닛과 60 nM DNA 주형/프라이머의 전-배양 (pre-incubated) 혼합물은 MgCl₂ (2.5 mM) 및 뉴클레오티드 유사체를 다양한 농도로 포함하는 용액으로 첨가될 수 있다. 반응은 이전에 언급한 바와 같이 멈추게하고, 분석될 수 있다. 데이터는 상기 언급한 바와 동일한 식으로 얻을 수 있다.

iii ) 인간 폴리머라제 γ 3' 5' 엑소뉴클리아제 활성 분석: 상기 인간 폴리머라제 γ 엑소뉴클리아제 활성은 dNTP 부재 하에서 절단 생성물의 형성 속도를 측정하여 연구될 수 있다. 상기 반응은 50mM Tris-HCl, 100mM NaCl, pH 7.8 조건에서 MgCl₂ (2.5mM)를 폴리머라제 γ의 대형 서브유닛 (40 nM), 소형 서브유닛 (270nM) 및 1,500nM의 사슬-종결 주형/프라이머의 전-배양 혼합물에 첨가하여 시작될 수 있고, 정해진 시간 조건에서, 정해진 시간 조건에서 0.3M EDTA로 멈추게 할 수 있다. 모든 반응 혼합물은 20% 변성 폴리아크릴 아미드 시퀀싱 겔 (denaturing polyacrylamide sequencing gels (8 M urea)) 상에서 분석, 바이오-라드 GS-525 몰레큘러 이미지 시스템 (Bio-Rad GS-525 molecular image system)에서 이미지화 및 몰레큘러 분석 (Molecular Analyst (Bio-Rad))로 정량화될 수 있다. 초기에 형성되는 생성물은 시간 함수로 표시할 수 있다. 데이터는 시그마 플롯 (Sigma Plot (Jandel Scientific))으로 선형회귀 (linear regression)로 얻어졌다. 상기 선의 기울기는 엑소뉴클레아제 활성에 대한 kexo를 계산하기 위하여 반응에서 활성 효소 농도에 의하여 나뉠 수 있다 (참조 Murakami E, Ray AS, Schinazi RF, Anderson KS. Investigating the effects of stereochemistry on incorporation and removal of 5-fluorocytidine analogs by mitochondrial DNA polymerase gamma: comparison of D- and L-D4FC-TP. Antiviral Res. 2004; 62: 57-64; Feng JY, Murakami E, Zorca SM, Johnson AA, Johnson KA, Schinazi RF, Furman PA, Anderson KS. Relationship between antiviral activity and host toxicity: comparison of the incorporation efficiencies of 2',3'-dideoxy-5-fluoro-3'-thiacytidine-triphosphate analogs by human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase and human mitochondrial DNA polymerase. Antimicrob Agents Chemother. 2004; 48: 1300-6).

실시예 17

골수 세포독성 분석

1차 인간 골수 단핵 세포 (Primary human bone marrow mononuclear cells)는 Cambrex Bioscience (Walkersville, MD)사로부터 상업적으로 얻어졌다. 1 unit/mL 에리스로포이에틴 (erythropoietin)을 포함하는 메틸셀룰로오즈 매트릭스를 사용하는 BFU-E 분석법에 반하여, CFU-GM 분석법은 50 units/mL 인간 재조합 과립구 대식세포집락자극인자 (human recombinant granulocyte/macrophage colony-stimulating factor)의 존재 하에서 이중층 한천 (bilayer soft agar)을 사용하여 수행되었다 (참조 Sommadossi JP, Carlisle R. Toxicity of 3'-azido-3'-deoxythymidine and 9-(1,3-dihydroxy-2-propoxymethyl) guanine for normal human hepatopoietic progenitor cells in vitro. Antimicrob. Agents Chemother. 1987; 31: 452-454; Sommadossi, JP, Schinazi, RF, Chu, CK, and Xie, MY. Comparison of Cytotoxicity of the (-) and (+) enantiomer of 2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine in normal human bone marrow progenitor cells. Biochem. Pharmacol. 1992; 44:1921-1925). 각각의 실험은 세 개의 다른 공여자 유래 세포의 사본으로 수행되었다. AZT는 양성 대조군으로 사용되었다. 세포는 상기 화합물의 존재 하에서 5% CO₂, 37℃ 조건에서 14-18일 동안 배양되었고, IC₅₀ (inhibitory concentration)를 결정하기 위하여 50 세포보다 더 큰 콜로니는 도립 현미경 (inverted microscope)을 사용하여 계산된다. 상기 50% 저해 농도 (IC₅₀)는 약물 농도 대 생존 분획 로그 (logarithm)의 최소제곱법 선형회귀분석 (least-squares linear regression analysis)에 의하여 얻어진다. 통계학적 분석은 독립 비대응 샘플 (independent non-paired samples)에 대하여 연구원들의 t-test로 수행되었다.

실시예 18

세포 독성 분석

상기 화합물의 독성은 이전에 언급한 바와 같이, 베로 (Vero), 인간 PBM, CEM (인간 임파섬유아세포 (human lymphoblastoid)), HepG2 세포에서 평가될 수 있다 (참조 Schinazi R.F., Sommadossi J.-P., Saalmann V., Cannon D.L., Xie M.-Y., Hart G.C., Smith G.A. & Hahn E.F. Antimicrob . Agents Chemother . 1990, 34, 1061-67). 사이클로헥스이미드 (Cycloheximide)는 양성 세포독성 대조군으로 포함될 수 있고, 용매에 노출된 비처리 세포는 음성 대조군으로서 포함될 수 있다. 상기 세포독성 IC₅₀ 은 이전에 언급되었던 메디안 이펙티브 메쏘드 (median effective method)를 이용하는 농도-반응 곡선으로부터 얻어질 수 있다 (참조 Chou T.-C. & Talalay P. Adv . Enzyme Regul . 1984, 22, 27-55; Belen?ii M.S. & Schinazi R.F. Antiviral Res . 1994, 25, 1-11).

표 2: 독성 데이터

실시예 19

아데노신 디아미나제 ( Adenosice Deaminase ) 분석

아데노신 디아민화효소 (adenosine deaminase)에 의한 뉴클레오시드와 모노포스페이트 프로드럭 (monophosphate prodrugs)의 디아민화경향을 측정하기 위하여, 뉴클레오시드 유사체는 상업적으로 이용가능한 효소와 함께 배양되었고, 상기 반응은 분광광도계 (spectrophotometrically)로 측정되었다. 전형적인 반응조건은 25℃에서 50μM 뉴클레오시드 유사체를 포함하는 pH 7.4, 50mM 포타슘 포스페이트이었다. 반응 시간은 효소의 0.002 유닛에 대하여 7분이고 효소의 0.2 유닛에 대하여 120분이었다. (아데노신 디아미나제의 유닛의 정의는 pH 7.5, 25°C에서 분당 아데노신 0.1μmol이 이노신으로 디아민화되는 것이 일 유닛이라고 정의한다.) 디옥시아데노신(Deoxyadenosine)은 효소 0.002유닛을 7분 동안 주어진 조건 하에서 59% 디아민시킨 양성 대조군 이었다. 디옥시구아노신 (Deoxyguanosine)은 음성 대조군이었다. 광학 밀도 (Optical density)는 265nm 또는 280nm에서 측정되었다. 상기 실험의 처음과 끝 사이에서 광학 밀도의 차이점은 생성물로 변형되는 기질의 몰수를 결정하기 위하여 흡광 계수에 의하여 나누어졌고 반응 부피로 곱해졌다. 생성물의 몰(Mol)수는 디아민화 퍼센트를 얻기 위하여 100% 완전 반응에 이르기까지 기질 등가물 몰수로 나누어졌고 그 후 100으로 곱하여졌다. 상기 검출의 한계는 0.001 광학 밀도 유닛이었다.

실시예 20

뉴클레오시드 유사체 트리포스페이트 ( Synthesis of Nucleoside analog triphosphates)의 합성

뉴클레오시드 유사체 트리포스페이트는 Ludwig 및 Eckstein 방법을 이용하여, 대응하는 뉴클레오시드로부터 합성되었다 (Ludwig J, Eckstein F. “Rapid and efficient synthesis of nucleoside 5'-O-(1-thiotriphosphates), 5'-triphosphates and 2',3'-cyclophosphorothioates using 2-chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one” J. Org . Chem. 1989, 54 631-5). 상기 미가공 뉴클레오시드 유사체 트리포스페이트는, 예를 들면, HiLoad 26/10 Q 세파로즈 패스트 플로 파마시아 컬럼 (Q Sepharose Fast Flow Pharmacia column) 및 TEAB 버퍼 (pH 7.0)의 기울기를 이용하는 FPLC에 의하여 정데될 수 있다. 상기 생성물은 UV 분광학 (UV spectroscopy), 수소 및 인 NMR (proton and phosphorus NMR), 질량분석기 (mass spectroscopy) 및 HPLC에 의하여 특성화 될 것이다.

상기 결과로 얻어진 트리포스페이트는 상기 언급한 세포 내 약리학 분석 및 HCV-pol(예를 들면, HCV-Pol과 함께 2,6-디아미노 푸린 뉴클레오시드 트리포스페이트(2,6-diamino 2'-C-Me purine nucleoside triphosphate))에 대한 키네틱 결과에 대한 대조군으로 사용될 수 있을 것이다.

실시예 21

HCV 복제 분석법

HCV 리플리콘 RNA를 포함하는 Huh 7 Clone B 세포는 96-well 플레이트에서 well당 5,000세포로 심어질 수 있고, 상기 화합물은 10μM에서 세포가 심어진 후 즉시 3배가 되는 것으로 시험되었다. 배양 (37℃, 5% CO₂) 5일 후, 전체 세포 내 RNA는 Gentra 유래의 versaGene RNA purification kit을 이용하여 분리되었다. 리플리콘 RNA 및 내부 대조군(TaqMan rRNA control reagents, Applied Biosystems)은 단일 단계 멀티플렉스 실시간 RT-PCR분석(single step multiplex Real Time RT-PCR Assay)에서 증폭되었다. 상기 화합물의 항바이러스 유효성은 상기 약물 비처리 대조군 (DCt HCV)의 한계값 RT-PCR 주기(threshold RT-PCR cycle)로부터 상기 실험 화합물의 한계값 RT-PCR 주기(threshold RT-PCR cycle)를 빼는 것에 의하여 계산되었다. 3.3의 △Ct는 리플리콘 RNA 레벨에서 1-로그 감소 (1-log reduction (90% 적은 시작물질과 동등한))와 동일하다. 아울러 상기 화합물의 세포독성은 △Ct rRNA값을 이용하여 계산되었다. (2'-C-Me-C)가 대조군으로 사용되었다. EC₉₀ 및 IC_5O 값을 결정하기 위하여, DCt: 값은 첫 번째로 출발 물질의 분획으로 변하였고, 그 후 % 저해를 계산하기 위하여 사용되었다. 3개의 화합물(화합물 12, 화합물 8a, 및 화합물 8b-up)의 데이타를 표 3에 나타낸다.

표 3: HCV 리플리콘 데이터

표 3에 나타난 바와 같이, HCV 리플리콘 어쎄이(replicon assay) 결과 8b-up이 8b-down보다 약 10배 강하였다.

표 4는 EC₉₀에서 1b의 원형(wild type)과 비교하였을 때 지노타입 (genotype)과 레지스턴트 (resistant)의 리플리콘 증가를 나타낸다.

표 4

참고문헌:

1. Stuyver L et al., Ribonucleoside analogue that blocks replication or bovine viral diarrhea and hepatitis C viruses in culture. Antimicrob . Agents Chemother. 2003, 47, 244-254.

2. Reed IJ & Muench H, A simple method or estimating fifty percent endpoints. Am . J. Hyg . 27: 497, 1938.

3. Applied Biosystems Handbook

실시예 22

웨스트 나일 바이러스 약물 민감성 분석 역시 이전에 언급된 바와 같이 진행될 수 있다: Song, G.Y., Paul, V., Choo, H., Morrey, J., Sidwell, R.W., Schinazi, R.F., Chu, C.K. Enantiomeric synthesis of D- and L-cyclopentenyl nucleosides and their antiviral activity against HIV and West Nile virus. J. Med. Chem . 2001, 44, 3985-3993.

실시예 23

황열 약물 민감성 분석 역시 이전에 언급된 바와 같이 진행될 수 있다: Julander, J.G., Furuta, Y., Shafer, K., Sidwell, R.W. Activity of T-1106 in a Hamster Model of Yellow Fever Virus Infection. Antimicrob . Agents Chemother. 2007, 51, 1962-1966.

실시예 24

상기 화합물의 뎅기열 민감성은 고처리 분석 (throughput assay)을 통해 평가될 수 있다: Lim et al., A scintillation proximity assay for dengue virus NS5 2′-O-methyltransferase?inetic and inhibition analyses, Antiviral Research, Volume 80, Issue 3, December 2008, Pages 360-369.

뎅기열 바이러스 (Dengue virus (DENV)) NS5는 그것의 N-말단 아미노산 시퀀스에서 메틸트랜스퍼라제 (methyltransferase (MTase)) 활성을 가지고 바이러스 게놈의 RNA에서 타입 1 모자구조 (type 1 cap structure), m7GpppAm2′-O의 형성 원인이 된다. 시험관 조건에서 DENV2 2′-O-MTase에 대한 최상의 활성은 정제된 재조합 단백질 및 짧은 바이오티니레이티드 GTP-모자씌어진 RNA 주형 (biotinylated GTP-capped RNA template)을 이용하여 특징지울 수 있다. 초기 속도로부터 파생된 정상-상태 키네틱 파라미터 (Steady-state kinetics parameters)는 화합물 시험용 강력한 근접 측정법 (scintillation proximity assay)을 설정하는데 사용될 수 있다. Lim et al., Antiviral Research, Volume 80, Issue 3, December 2008, Pages 360-369에 의하여 연구되었던 전배양 (Pre-incubation)은 무작위적인 bi bi 키네틱 반응을 지원하는 것을 보여준다. Lim은 경쟁적 저해제, S-아데노실-호모시스테인 (S-adenosyl-homocysteine) 및 2개의 동족체, 시네펑인 (sinefungin) 및 디하이드로시네펑인 (dehydrosinefungin)으로 상기 분석을 입증하였다. DENV2 MTase의 N-말단에 존재하는 GTP-결합주머니 (GTP-binding pocket)는 이전에 모자-결합 위치 (cap-binding site)로 생각되었다. 이러한 분석은 2′-O-MTase 활성의 신속, 고민감성 검출을 가능하게 하고 저해 화합물에 대한 고처리량 스크리닝 (high-throughput screening)을 즉시 조정하도록 할 수 있다. 그것은 다양한 종류의 RNA 모자씌어진 MTases (RNA capping MTases)의 효소 활성을 결정하는데 적절하다.

실시예 25

항- 노로바이러스 ( Anti - Norovirus ) 활성

화합물은 노로바이러스 폴리머라제 및/또는 헬리카제 저해, 복제에 필요한 다른 효소를 저해, 또는 다른 반응에 의하여 항-노로바이러스 활성을 보일 수 있다.

최근 노로바이러스 감염에 대하여 승인받은 약학적 치료법이 없고, 이것은 아마도 이용가능한 세포 배양 시스템이 부족하기 때문이다. 최근, 리플리콘 시스템이 원본 노워크 G-1 가닥 (Norwalk G-I strain)에 대하여 발전하였다 (Chang, K. O., et al. (2006) Virology 353:463-473).

노로바이러스 리플리콘 및 C형 간염 리플리콘 모두 생성되는 리플리콘의 복제를 위하여 바이러스 헬리바제, 프로테아제, 및 폴리머라제를 필요로 한다. 조금 더 최근에는, 시험관 내에서 세포 배양 감염성 분석이 노로바이러스 유전자 그룹 I 및 II 접종원을 이용하여 보고되었다 (Straub, T. M. et al. (2007) Emerg. Infect. Dis. 13(3):396-403). 이러한 분석은 마이크로캐리어 비드(microcarrier beads)상에서 소장 상피 세포를 이용하여 로테이팅-월 바이오리액터(rotating-wall bioreactor)에서 수행되어 진다. 상기 감염성 분석은 침입 저해제(entry inhibitors)를 스크리닝하는데 유용할 수 있다.

실시예 26

HepG2 세포에서의 세포 약리학 ( Cellular pharmacology )

HepG2 세포는 American Type Culture Collection (Rockville, MD)으로부터 얻어질 수 있고, 비 필수 아미노산, 1% 페니실린-스트렙토마이신 (penicillin-streptomycin)을 포함하는 최소한의 필수 배지에서 225 cm²세포 배양으로 자랄 수 있다. 상기 배지는 3일마다 교체하고, 상기 세포는 일주일에 한번씩 계대배양한다. 30 mL trypsin-EDTA에 10분 동안 노출하고 배지를 연속적으로 3번 세척하여 붙어있는 단일 층의 분리 후, 융합 HepG2 세포는 6-well 플레이트에서 well 당 2.5 x 10⁶ 세포밀도를 가지도록 심어질 수 있고 명시된 시간 동안 10 μM의 [³H]가 표지된 활성 화합물 (500 dpm/pmol)에 노출될 수 있다.

상기 세포는 5% CO₂, 37℃ 조건에서 유지된다. 선별된 시간점에서, 상기 세포는 아주 차가운 포스페이트버퍼드 셀라인 (phosphate-buffered saline (PBS))으로 세 번 세척된다.

세포내 활성 화합물 및 그것과 연관있는 대사물질은 60% 메탄올로 -20℃에서 하룻밤 동안 세포 펠렛을 배양하고 그 후 차가운 용기에서 1시간 동안 차가운 메탄올 추가 20 pal로 추출함에 따라 추출된다. 상기 추출물은 그 다음에, 결합, 가볍게 여과된 공기 흐름 하에서 건조 및 HPLC 분석까지 -20℃에서 보관된다.

실시예 27

Huh7 세포에서의 세포 약리학

HepG2 세포 약리학을 위한 방법과 비슷하며, 50 μM의 화합물을 Huh7 세포에 첨가한 후 4시간 동안 배양하며 세 차례 실시한다. 3TC는 실험군으로 사용될 수 있으며, 이중으로 준비하며, DMSO (10 μL)도 블랭크 컨트롤로 사용하기 위하여 이중으로 준비하였다. 아주 차가운 70% 메탄올은 추출용매로 사용될 수 있다. ddATP (10 nM)는 내부 표준 (internal standard)으로 사용할 수 있다.

모체 2,6-디아미노-2'-C-메틸 푸린 뉴클레오시드 (Parent 2,6-diamino-2'-C-Me purine nucleoside), 12를 Huh7 세포와 반응시켰을 때, LC/MS분석 결과 아주 낮은 수준의 2,6-디아미노-2'-C- 메틸 푸린 트리포스페이트 (2,6-diamino-2'-C-Me purine triphosphate)를 나타냈다. 주요한 트리포스페이트는 2,6-디아미노 베이스 (2,6-diamino base)가 그에 상응하는 구아닌 유사체 (guanine analog)로 변환된 결과라는 것을 알아냈다. (도 6)

12의 포스포라미데이트 (phosphoramidate, 즉, 8a)가 Huh7 세포와 배양될 때, LC/MS는 뜻밖에도 그에 상응하는 2,6-디아미노-2'-C-메틸 푸린 트리포스페이트 (2,6-diamino-2'-C-Me purine triphosphate)를 높은 수준으로 나타났다. 뿐만 아니라, 구아닌 유사체 트리포스페이트 (guanine analog triphosphate)도 확인되었다. (도 7)

도 8은 포스포라미데이트 (phosphoramidate)가 어떻게 2,6-디아미노-2'-C-메틸 푸린 (2,6-diamino 2'-C-methyl purine), 12의 대사경로를 변형시키는지 보여주며, 전달된 2,6-디아미노-2'-C-메틸 푸린 트리포스페이트 (2,6-diamino-2'-C-Me purine triphosphate)는 이전에는 세포 내에서 치료상으로 적절한 농도를 얻을 수 없었다. 게다가 두 HCV 활성 트리포스페이트 (A 및 G 유도체)의 세포 내 전달은 세포의 키나아제 포화 상태 (kinase saturation) 및 내성바이러스 선택 (resistant virus selection)에 영향을 준다.

도 9는 50μM의 8b- up을 Huh-7 세포에 처리하여 4시간 동안 배양시킨 후 형성된 뉴클레오티드의 LC/MS 분석이다. 이러한 세포 약리학은 8b- up에 대한 Huh7세포에서의 두 2,6-디아미노 (2,6-diamino)와 G 트리포스패이트 (triphospate)의 세포내 전달과 같은 대사 억제 (metabolic suppression)를 나타낸다. (도 10)

실시예 28

PBM 세포에서의 세포 약리학

테스트 화합물 50μM를 PBM 세포에 첨가한 후 37°C에서 4시간 동안 배양하였다. 약물이 포함된 배지는 제거하고 여분의 약물 제거를 위해 PBM 세포를 PBS로 두 번 행궈주었다. 세포내의 약물은 1 mL의 70% 아주 차가운 메탄올 (10 nM의 내부 표준 ddATP가 포함된 것)을 사용하여 10 x 10⁶PBS 세포로부터 추출하였다. 침전 후, 샘플은 15분간 상온에 둔 후, 30초 동안 볼텍싱 (vortexing)하였고, -20°C에서 12시간 동안 보관되었다. 상층액은 건조한 상태가 되도록 증류시켰고, 건조된 샘플은 LC-MS/MS분석 때까지 -20°C에 보관하였다. 분석 전에, 각각의 샘플은 100μL 의 이동상 A (mobile phase A)로 재구성하였고, 20,000 g로 원심분리하여 용해되지 않는 미립자를 제거하였다.

Hypersil GOLD column (100 x 1.0 mm, 3μm particle size; Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)을 사용하여 구배분리를 실시하였다. 이동상 A는 2 mM의 암모늄 포스패이트와 3 mM의 핵실아민으로 이루어져 있다. 아세트나이트릴 (Acetonitrile)은 10에서 80%까지 15분 후 올려주었고, 80%에서 3분간 유지하였다. 적어도 15분간 10%의 아세트나이트릴 평형상태를 유지하였으며, 전체 실행시간은 33분이다. 흐름 속도는 50 μL/min로 유지하였고, 10 μL 주입하였다. 자동 견본기 (autosampler)와 컬럼칸 (column compartment)은 각각 4.5 °C 및 30°C로 유지하였다.

처음 3.5분 분석은 제거 (waste)하였고, 질량 분석계 (mass spectrometer)는 3.2 Kv의 스프레이 전압 (spray voltage )의 양이온모드 (positive ionization mode)에서 작동되었다.

DAPD의 경우, 포스포라미데이트 (phosphoramidate)의 도입에 의한 6번째 자리 대사의 극적인 억제가 확인되었다. 첫 번째로, 6-아미노그룹을 갖는 DAPD의 세포내 대사 조사에서 50 mM을 PBM 세포에 처리하고 37?에서 4시간 동안 배양시킨 결과, 아주 높은 수준의 DXG-TP, DXG 및 DXG-MP가 확인되었다. 낮은 수준의 DAPD가 확인되었으나, 인산화된 DAPD는 확인되지 않았다(도 11).

결과적으로, 6-아미노 그룹 (6-amino group)과 5'-MP 프로드럭을 갖는 포스포라미데이트 RS-864를 PBM세포와 함께 배양시킨 결과 낮은 수준의 DXG, DXG-MP, 및 DXG-TP이 확인되었다(도 12). 그러나 반대로 DAPD를 배양하였을 때 아주 높은 수준의 DAPD-TP가 확인되었다. 뿐만 아니라, 낮은 수준의 DAPD, DAPD-MP 및 DAPD-예가 확인되었다. LC/MS/MS분석에 의하면 DXG-TP (6-OH)가 DAPD-TP (6-NH₂)로 바뀌는 비율은 약 2에서 98이다. DAPD-MP 프로드럭을 배양하여 산출된 높은 수준의 세포 내 DAPD-TP는 MP 프로드럭이 6-아미노그룹이 6-OH로 전환되는 것을 효과적으로 제한하거나 멈추게 한 것을 나타낸다.

실시예 29

키노몰구스 원숭이(Cynomolgus Monkeys)에서 생물학적 이용도 분석

이어지는 절차는 상기 화합물이 생물학적으로 이용가능한지 여부를 결정하기 위하여 사용될 수 있다. 본 연구 시작 전 1주일 이내, 키노몰구스 원숭이는 혈액을 수집 및 이용하기 위하여 만성 정맥 카테터(chronic venous catheter) 및 피하 정맥 접근 포트(subcutaneous venous access port (VAP))를 외과적으로 삽입할 수 있고 혈액학 및 세럼 화학 측정을 포함하는 생리적 시험 및 체중 측정을 가능하게 할 수 있다. 각각의 원숭이들 (총 6마리)은 복용 농도 5 mg/mL, 복용량 10 mg/kg으로, 정맥 볼누스(intravenous bolus (3 monkeys, IV)) 또는 경구 게비지(oral gavage (3 monkeys, PO))를 통하여 약 250μCi의 ³H활성을 받아들인다. 각각의 복용 시린지 (syringe)는 복용 전에 투여되는 화합물의 양을 중량 측정하여 결정된 무게이다. 소변 샘플은 목적하는 구간 (약 복용 전 18-0시간, 복용 후 0-4, 4-8, 8-12 시간)에서 팬 캣취 (pan catch)로 수집되고 보관되었다. 혈액 샘플 또한 만성 정맥 카테터(chronic venous catheter) 및 VAP 또는 만성 정맥 카테터 생산이 가능하지 않다면 말초 혈관으로부터 수집되었다(복용 전 0.25, 0.5, 1,2, 3,6, 8, 12 시간 및 복용 후 24시간). 상기 혈액 및 소변 샘플은 최대 농도(Cmax), 최대 농도가 얻어질 때의 시간(Tmax), 커브 지역(AUC), 상기 복용 농도의 반감기(TV), 소면(CL), 정상 상태 부피 및 분배(Vss) 및 생물학적 이용도(F)에 의하여 분석된다.

실시예 30

세포 보호 분석( Cell Protection Assay ( CPA ))

상기 분석은 Baginski, S. G.; Pevear, D. C.; Seipel, M.; Sun, S. C. C.; Benetatos, C. A.; Chunduru, S. K.; Rice, C. M. and M. S. Collett "Mechanism of action of a pestivirus antiviral compound" PNAS USA 2000, 97 (14), 7981- 7986에 언급된 바와 같이 필수적으로 수행된다. MDBK 세포(ATCC) 사용전 24시간에는 96-well 플레이트로 심어진다(well 당 4,000 세포). 세포당 0.02 플라그 형성 유닛(plaque forming units (PFU))의 감염 다양성 (multiplicity of infection (MOI))에서 BVDV(strain NADL, ATCC)로 감염되고 난 후, 테스트 화합물의 연속적인 희석액은 증식 배지에서 0.5% DMSO 최종농도에서 감염 및 비감염 세포 모두에 첨가된다. 각각의 희석액은 4번 테스트 되었다.

세포 밀도 및 바이러스 접종원은 실험을 통하여 계속적인 세포 성장을 보장하고 감연 4일 후에 비처리 대조군에서 90% 이상의 바이러스유래 세포 파괴를 얻기 위하여 적응된다. 플레이트는 50% TCA에서 고정되고 설포로다민 B(sulforhodamine B)로 염색된다. 상기 웰의 광학 밀도는 마이크로 플레이트 리더(microplate reader)에서 550nm로 읽힌다.

상기 유효 농도(effective concentration, (EC₅₀)) 값은 바이러스의 세포 용해력의 50% 감소를 가져오는 상기 화합물의 농도로 정의된다.

실시예 31

플라그 감소 분석 ( Plaque Reduction Assay )

화합물에 대하여, 상기 유효 농도는 플라그 감소 분석에 의하여 복제 24-well 플레이트에서 결정되었다. 세포 단일층은 바이러스의 well당 PFU로 감염된다. 그 후, 2% 비활성 세럼 및 0.75% 메틸 셀룰로오스(methyl cellulose)가 첨가된 MEM에서 테스트 화합물의 연속적인 희석액이 단일층으로 첨가된다. 나아가 37℃에서 3일 동안 배양한 배양액은 그 후, 50% 에탄올 및 0.8% 크리스탈 바이올렛(Crystal Violet)으로 고정, 세척 및 공기 건조된다. 그 후, 90% 바이러스 억제를 얻기 위한 농도를 결정하기 위하여 플라그가 계산된다.

실시예 32

수득량 감소 분석 ( Yield Reduction Assay )

화합물에 대하여, 바이러스량 (viral load)에서 6-로그 감소(6-log reduction)를 얻는 농도는 수득량 감소 분석에 의하여 복제된 24-well 플레이트에서 결정된다. 상기 분석은 Baginski, S. G.; Pevear, D. C.; Seipel, M.; Sun, S. C. C.; Benetatos, C. A.; Chunduru, S. K.; Rice, C. M. and M. S. Collett "Mechanism of action of a pestivirus antiviral compound" PNAS USA 2000,97 (14), 7981-7986에 기재된 바에 대하여 작은 변형을 가하여 수행된다.

간단하게, MDBK 세포는 세포당 0.1 PFU의 감염다중도(multiplicity of infection (MOI))에서 BVDV (NADL strain)로 감염되기 24시간 전에 24-well 플레이트 (well 당 2 x 10⁵세포)상으로 심어진다. 테스트 화합물의 연속적인 희석액은 증식 배지에서 최종 농도 0.5% DMSO를 가지는 세포로 첨가된다. 각각의 희석액은 3회 시험된다. 3일 후, 세포 배양액 (세포 단일층 및 상층액)은 3번의 동결 용해 부기 (freeze-thaw cycles)에 의하여 용해되고, 바이러스 수득량은 플라그 분석(plaque assay)에 의하여 수량화된다. 요약하면, MDBK 세포는 사용하기 24시간 전에 6-well 플레이트 (well 당 5 x 10⁵세포)로 심어진다. 세포는 1시간 동안 테스트 용해물 (lysates) 0.2mL로 접종되고 증식 배지에서 0.5% 한천으로 덮어 씌어진다. 3일 후, 세포 단일층은 3.5% 포름알데하이드로 고정되고, 플라그를 보기 위하여 1% 크리스탈 바이올렛 ((w/v 50% 에탄올에 포함)으로 염색된다. 상기 플라그는 바이러스량에서 6-로그 감소를 얻기 위한 농도를 결정하기 위하여 결정된다.

실시예 33

노로바이러스 감염 진단 ( Diagnosis of Norovirus Infection )

감염된 사람의 대변에서 역전사-폴리머라제 사슬 반응 (reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)) 분석법을 이용하여 바이러스 RNA를 검출함으로써 노로바이러스 감염 진단이 가능하다. 상기 바이러스는 비록 증상이 확인된 후 7일에 샘플에 대하여 RT-PCT을 사용하면 만족할만한 결과를 얻을 수 있지만, 증상이 확인된 후 48 내지 72시간 이내에 가검물로부터 확인될 수 있다. 다른 진단 방법은 전자 현미경 관찰 및 최소한 3주 후 수집된 대합혈청 (paired sera) 역가에서 상승에 대한 혈청분석법을 포함한다. 상업적으로 이용 가능한 효소관련 면역분석법 (immunoassay)이 있지만, 이것은 상대적으로 낮은 민감성, 발병의 원인 진단의 사용에 있어서 제한점을 가지는 경향이 있다. 노로바이러스 감염의 의학적인 진단은 종종 사용되고, 상세하게는 위장염의 다른 원인이 되는 물질이 배제되어질 때 사용된다.

실시예 34

시험관 내 항-바이러스 활성 ( In Vitro Anti - Viral Activity)

시험관 내 항-바이러스 활성은 다음의 세포주에서 평가될 수 있다 : 노워크 G-I 스트레인(The Norwlk G-I strain (Chang, K. O., et al. (2006) Virology 353:463-473)), GII-4 스트레인 리플리콘(GII-4 strain replicon). 뿐만 아니라, 다른 노로바이러스 리플리콘(Norovirus replicons) 역시 본 발명에 기재된 화합물, 또는 다른 화합물 또는 화합물 집단의 시험관 내 항-바이러스 활성을 결정하기 위한 분석에 사용될 수 있다.

몇몇 구제적인 예에서, 상기 리플리콘 시스템은 서브게노믹(subgenomic)이고 따라서 비구조 단백질의 작은 분자 저해제 평가가 가능하도록 한다. 이것은 노로바이러스 약물 발견이 상기 바이러스의 치료에 유용한 치료학적 발견 (Stuyver, L. J., et al. (2006) Antimicrob. Agents Chemother. 47:244-254)에 공헌하는 C형 감염 바이러스와 동일한 이익을 줄 수 있다. 노로바이러스 리플리콘 및 C형 간염 바이러스 리플리콘은 모두 생성되는 리플리콘의 복제를 위하여 바이러스 헬리카제, 프로테아제 및 폴리머라제를 필요로 한다. 본 발명에서 기술되어진 상기 화합물은 바이러스 폴리머라제 및/또는 바이러스 헬리카제를 저해한다고 믿어지고 있다.

노로바이러스 유전자 그룹 I 및 II 접종원을 이용하여 보고된 시험관 내 세포 배양 감염성 분석(Straub, T. M. et al. (2007) Emerg. Infect. Dis. 13(3):396-403)도 사용될 수 있다. 이러한 분석은 마이크로케리어 비드(microcarrier beads) 상에서 소장 상피 세포를 이용하여 로테이팅-월 바이오리액터(rotating-wall bioreactor)에서 수행되어진다. 상기 감염성 분석은 목적하는 바이러스를 저해하는 능력에 대한 스크리닝 화합물을 위하여 사용될 수 있다.

Claims

하기 화학식(A)의 화합물 또는 하기 화학식(B)의 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염 또는 그의 프로드럭:

여기에서 인 중심에 키랄성이 존재할 때, 상기 화합물은 전체적으로 또는 부분적으로 R _p 또는 S _p 또는 그 혼합물이고,
R¹는 OH 또는 F이고;
Y는 O 또는 S이며;
R²⁴는 OR¹⁵,
, 지방알코올로부터 선택되고,
여기에서 R¹⁵, R¹⁷ 및 R¹⁸는 하기로 정의되며;
R² 및 R³는 생체내로 투입될 때, 생물학적 시스템에서 6-NH₂ 탈아미노화에 부분적으로 또는 완전하게 내성인 뉴클레오시드 모노포스페이트 또는 티오모노포스페이트를 제공할 수 있고, 대표적인 R² 및 R³는 다음으로부터 선택됨:
(a) OR¹⁵, 여기에서 R¹⁵는 H, Li, Na, K, 페닐 및 피리디닐로부터 선택되고, 페닐 및 피리디닐은(CH₂)_0-6CO₂R¹⁶ 및(CH₂)_0-6CON(R¹⁶)₂으로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 내지 3개의 치환기로 치환되고;
R¹⁶은 독립적으로 H, C₁ _-20 알킬, 지방알코올로부터 유래된 탄소 사슬 또는 저급 알킬, 알콕시, 디(저급 알킬)-아미노, 플루오로, C₃ _-10 사이클로알킬, 사이클로알킬, 사이클로헤테로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 치환된 아릴, 또는 치환된 헤테로아릴로 치환된 C₁ _-20 알킬이며; 여기에서 상기 치환기는 C₁ _-5 알킬, 또는 저급 알킬, 알콕시, 디(저급 알킬)-아미노, 플루오로, C₃ _-10 사이클로알킬, 또는 사이클로알킬로 치환된 C₁ _-5 알킬임;
(b)
;
(c) L-아미노산
의 에스테르, 여기에서 R¹⁷는 천연 L-아미노산에서 존재하는 것으로 제한되고, R¹⁸는 H, C₁ _-20 알킬, 지방알코올로부터 유래된 탄소 사슬 또는 저급 알킬, 알콕시, 디(저급 알킬)-아미노, 플루오로, C₃ _-10 사이클로알킬, 사이클로알킬, 사이클로헤테로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 치환된 아릴, 또는 치환된 헤테로아릴로 치환된 C₁ _-20 알킬이며; 여기에서 상기 치환기는 C₁ _-5 알킬, 또는 저급 알킬, 알콕시, 디(저급 알킬)-아미노, 플루오로, C₃ _-10 사이클로알킬, 또는 사이클로알킬로 치환된 C₁ _-5 알킬임;
(d) R² 및 R³는 환
를 형성하기 위하여 함께 올 수 있고, 여기에서 R¹⁹는 H, C₁ _-20 알킬, 지방알코올로부터 유래된 탄소 사슬 또는 저급 알킬, 알콕시, 디(저급 알킬)-아미노, 플루오로, C₃ _-10 사이클로알킬, 사이클로알킬, 사이클로헤테로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 치환된 아릴, 또는 치환된 헤테로아릴로 치환된 C_1-20 알킬이며; 여기에서 상기 치환기는 C₁ _-5 알킬, 또는 저급 알킬, 알콕시, 디(저급 알킬)-아미노, 플루오로, C₃ _-10 사이클로알킬, 또는 사이클로알킬로 치환된 C₁ _-5 알킬임;
(e) R² 및 R³는

및
으로부터 선택된 환을 형성하기 위하여 같이 올 수 있으며, 여기에서 R²⁰는 O 또는 NH이고, R²¹는 H, C₁ _-20 알킬, C₁ _-20 알케일, 지방산으로부터 유래된 탄소 사슬 또는 저급 알킬, 알콕시, 디(저급 알킬)-아미노, 플루오로, C₃ _-10 사이클로알킬, 사이클로알킬, 사이클로헤테로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 치환된 아릴, 또는 치환된 헤테로아릴로 치환된 C₁ _-20 알킬이며; 여기에서 상기 치환기는 C₁ _-5 알킬, 또는 저급 알킬, 알콕시, 디(저급 알킬)-아미노, 플루오로, C₃ _-10 사이클로알킬, 또는 사이클로알킬로 치환된 C₁ _-5 알킬임.
제1항에 있어서,
상기 화합물은 β-D 배열인 것을 특징으로 하는 화합물.
제1항에 있어서,
상기 화합물은 생물학적 시스템에서 6-NH₂ 및 6-OH 퓨린 트리포스페이트의 혼합물 C 또는 D로 변환되는 것을 특징으로 하는 화합물.
제1항에 있어서,
상기 화합물은 생물학적 시스템에서 치료상 연관된 농도의 2,6-디아미노 2'-C-메틸 퓨린 트리포스페이트인 E 또는 2,6-디아미노 2'-C-메틸 2'-데옥시 2'-플루오로 퓨린 트리포스페이트 F로 변환되는 것을 특징으로 하는 화합물.
하기 화학식의 화합물:

여기에서 R¹는 제1항에서 정의한 바와 같고, R⁴는 C₁ _-6 알킬 또는 지방알코올로부터 유래된 탄소 사슬이다.
제5항에 있어서,
상기 R¹, R⁴ 및 R⁵의 값은 하기에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
하기 화학식의 화합물:

여기에서 R¹는 제1항에서 정의한 바와 같고, R⁶는 H 또는 알칼리금속이며, R⁷는 지방알코올로부터 유래된 탄소 사슬이다.
제7항에 있어서,
상기 R¹, R⁶ 및 R⁷의 값은 다음과 같은 것을 특징으로 하는 화합물.
하기 화학식의 화합물:

여기에서 R¹는 제1항에서 정의한 바와 같고, R⁸는 지방산 라디칼이다.
제9항에 있어서,
상기 R¹ 및 R⁸의 값은 다음과 같은 것을 특징으로 하는 화합물.
하기 화학식의 화합물:

여기에서 R¹는 제1항에서 정의한 바와 같고, R⁹는 O 또는 NH이며, R¹⁰는 C₁ _-6 알킬 또는 지방알코올로부터 유래된 탄소사슬이다.
제11항에 있어서,
상기 R¹, R⁹ 및 R¹⁰의 값은 다음과 같은 것을 특징으로 하는 화합물.
하기 화학식의 화합물:

여기에서 R¹는 제1항에서 정의한 바와 같고, R¹¹는 C₁ _-6 알킬 또는 지방알코올로부터 유래된 탄소 사슬이다.
제13항에 있어서,
상기 R¹ 및 R¹¹의 값은 다음과 같은 것을 특징으로 하는 화합물.
하기 화학식의 화합물:

여기에서 R¹는 제1항에서 정의한 바와 같고, R¹² 및 R¹³는 독립적으로 O 또는 NH이다.
제15항에 있어서,
상기 R¹, R¹² 및 R¹³의 값은 다음과 같은 것을 특징으로 하는 화합물.
하기 화학식의 화합물:

여기에서 R¹는 제1항에서 정의한 바와 같고, R⁴는 C₁ _-6 알킬 또는 지방알코올로부터 유래된 탄소 사슬이며, R¹²는 O 또는 NH이다.
제17항에 있어서,
상기 R¹, R⁴ 및 R¹²의 값은 다음과 같은 것을 특징으로 하는 화합물.
하기 화학식의 화합물:

여기에서 R¹⁴는

이고, R¹¹, R⁷ 및 R¹³는 상기에서 정의한 바와 같다.
화학식 G 또는 H의 제제와의 반응에 의해 인-5'-산소 결합을 형성하는 것을 특징으로 하는 제1항의 화합물을 제조하는 방법:

여기에서 화학식 G 또는 H의 인 중심에서의 키랄성은 전체적으로 또는 부분적으로 R _p 또는 S _p 또는 그 혼합물이고,
Y, R² 및 R³는 상기에서 정의한 바와 같으며,
R²²는 독립적으로, H, C₁ _-20 알킬, 페닐과 같은 아릴, 피리디닐과 같은 헤테로아릴, 치환된 아릴, 또는 치환된 헤테로아릴, 또는 저급 알킬, 알콕시, 디(저급 알킬)-아미노, 클로로, 플루오로, 페닐과 같은 아릴, 피리디닐과 같은 헤테로아릴, 치환된 아릴 또는 치환된 헤테로아릴로 치환된 C₁ _-20 알킬이다.
제20항에 있어서,
화학식 G 또는 H의 R² 및/또는 R³이 키랄 중심을 포함하고 있을 때, 화학식 G 또는 H의 부분입체 이성질체성(diastereomeric) 혼합물을 결정화함으로써 인 부분입체 이성질체를 분리하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제20항에 있어서,
화학식 G 또는 H의 R² 및/또는 R³이 키랄 중심을 포함하고 있을 때, 하기 화학식 I를 화학식 G 또는 H의 부분입체 이성질체성(diastereomeric) 혼합물과 반응시킴으로써 인 부분입체 이성질체를 분리하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.

여기에서 R²²는 상기에서 정의한 바와 같고,
R²³는 H, Li, Na, K, NH₄ 및 Ca, Mg와의 중복염(bis salt)이다.
제20항에 있어서,
화학식 G 또는 H의 R² 및/또는 R³이 키랄 중심을 포함하고 있을 때, 하기 화학식 I를 화학식 G 또는 H의 단일 또는 농축된 부분입체 이성질체성 혼합물과 반응시킴으로써 인 스테레오센터(phosphorous stereocenter)를 반전시키는(inverting) 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.

여기에서 R²²는 상기에서 정의한 바와 같고,
R²³는 H, Li, Na, K, NH₄ 및 Ca, Mg와의 중복염(bis salt)이다.
화학식 G 또는 H의 제제와 1°, 2°또는 3°알코올 또는 1°, 2° 또는 3° 알콕사이드의 반응에 의해 인-산소 결합을 형성하는 것을 특징으로 하는 알코올의 인 유사체를 제조하는 방법.

여기에서 화학식 G 또는 H의 인 중심에서의 키랄성은 전체적으로 또는 부분적으로 R _p 또는 S _p 또는 그 혼합물이고,
Y, R² 및 R³는 상기에서 정의한 바와 같으며,
R²²는 독립적으로, H, C₁ _-20 알킬, 페닐과 같은 아릴, 피리디닐과 같은 헤테로아릴, 치환된 아릴, 또는 치환된 헤테로아릴, 또는 저급 알킬, 알콕시, 디(저급 알킬)-아미노, 클로로, 플루오로, 페닐과 같은 아릴, 피리디닐과 같은 헤테로아릴, 치환된 아릴 또는 치환된 헤테로아릴로 치환된 C₁ _-20 알킬이다.
제24항에 있어서,
화학식 G 또는 H의 R² 및/또는 R³이 키랄 중심을 포함하고 있을 때, 화학식 G 또는 H의 부분입체 이성질체성 혼합물을 결정화함으로써 인 부분입체 이성질체를 분리하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제24항에 있어서,
화학식 G 또는 H의 R² 및/또는 R³이 키랄 중심을 포함하고 있을 때, 하기 화학식 I를 화학식 G 또는 H의 부분입체 이성질체성 혼합물과 반응시킴으로써 인 부분입체 이성질체를 분리하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.

여기에서 R²²는 상기에서 정의한 바와 같고,
R²³는 H, Li, Na, K, NH₄ 및 Ca, Mg와의 중복염(bis salt)이다.
제24항에 있어서,
화학식 G 또는 H의 R² 및/또는 R³이 키랄 중심을 포함하고 있을 때, 하기 화학식 I를 화학식 G 또는 H의 단일 또는 농축 부분입체 이성질체성 혼합물과 반응시킴으로써 인 스테레오센터(phosphorous stereocenter)를 반전시키는(inverting) 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.

여기에서 R²²는 상기에서 정의한 바와 같고,
R²³는 H, Li, Na, K, NH₄ 및 Ca, Mg와의 중복염(bis salt)이다.
2,6-디아미노퓨린으로 변환 가능한 2,6-디아미노퓨린 또는 퓨린과 1'-슈가 설포네이트(1'-sugar sulfonate) J의 반응을 포함하는 화학식 A 또는 B의 화합물을 제조하는 방법:

여기에서 Pr는 보호기이다.
하기 화학식 J의 화합물:

여기에서 Pr는 보호기이다.
플라비리다에(Flaviridae) 감염의 치료, 플라비리다에 감염의 방지 또는 플라비리다에 바이러스 패밀리로의 감염에 대한 생물학적 활성을 감소시키는 약제의 제조에 있어서의 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 화합물의 용도.
제30항에 있어서,
상기 바이러스는 HCV, 황열(Yellow fever), 뎅기열(Dengue), 치쿤구니야(Chikungunya) 및 웨스트 나일 바이러스(West Nile virus)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
제30항에 있어서,
치료대상 감염은 HCV인 것을 특징으로 하는 용도.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 화합물의 예방활성-유효량을 치료할 필요가 있는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 HCV, 황열, 뎅기열, 치쿤구니야 및 웨스트 나일 바이러스를 포함하는 플라비리다에 바이러스 패밀리에 감염된 숙주를 치료하는 방법.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 화합물의 유효량을 예방(prophylaxis)할 필요가 있는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 HCV, 황열, 뎅기열, 치쿤구니야 및 웨스트 나일 바이러스를 포함하는 플라비리다에 바이러스 패밀리에 감염된 숙주를 치료하는 방법.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 화합물의 유효량을 치료할 필요가 있는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 HCV, 황열, 뎅기열, 치쿤구니야 및 웨스트 나일 바이러스를 포함하는 플라비리다에 바이러스 패밀리의 감염에 대한 생물학적 활성을 감소시키는 방법.
다른 항-플라비리다에 바이러스 제제와 배합된 약학적으로 허용가능한 담체에서 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 화합물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 HCV, 황열, 뎅기열, 치쿤구니야 및 웨스트 나일 바이러스를 포함하는 플라비리다에 바이러스 패밀리에 감염된 숙주를 치료하는 방법.
다른 항-플라비리다에 바이러스 제제와 배합된 약학적으로 허용가능한 담체에서 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 화합물의 예방활성-유효량을 예방할 필요가 있는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 HCV, 황열, 뎅기열, 치쿤구니야 및 웨스트 나일 바이러스를 포함하는 플라비리다에 바이러스 패밀리의 감염을 예방하는 방법.
제1항 내지 제19항의 어느 한 항의 화합물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 화합물의 유효량을 치료할 필요가 있는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 노로바이러스(Norovirus) 또는 사포바이러스(Saporovirus)로 감염된 숙주를 치료하는 방법.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 화합물의 예방활성-유효량을 예방할 필요가 있는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 노로바이러스 또는 사포바이러스 감염을 예방하는 방법.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 화합물의 유효량을 치료할 필요가 있는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 숙주의 노로바이러스 또는 사포바이러스 감염의 생물학적 활성을 감소시키는 방법.
다른 항-노로바이러스 또는 항-사포바이러스 제제와 배합된 약학적으로 허용가능한 담체 내에서 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 화합물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 노로바이러스 또는 사포바이러스로 감염된 숙주를 치료하는 방법.
다른 항-노로바이러스 또는 항-사포바이러스 제제와 배합된 약학적으로 허용가능한 담체에서 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 화합물의 예방활성-유효량을 예방할 필요가 있는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 노로바이러스 또는 사포바이러스 감염을 예방하는 방법.
제2 항바이러스 제제를 더욱 포함하는 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물.
제44항에 있어서,
상기 제2 항바이러스 제제는 인터페론, 리바비린(ribavirin), NS3 프로테아제 억제제(NS3 protease inhibitor), NS5A 억제제, 비뉴클레오시드 폴리머라제 억제제(non-nucleoside polymerase inhibitor), 헬리카제 억제제(helicase inhibitor), 폴리머라제 억제제, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 유사체, IRES 의존적 번역 억제제(inhibitor of IRES dependent translation) 및 그 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.