CN110950828B - 一种黄芩素或其衍生物、制备方法与应用 - Google Patents

一种黄芩素或其衍生物、制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种黄芩素或其衍生物，结构如下所示：
Figure DDA0002260574770000011
其中，R1为氢、烷基、取代或未取代芳基；R2为氢、卤素、烷基、烷氧基、取代或未取代氨基、取代或未取代芳基；R3为氧、硫；R4为取代或未取代芳基。本发明制备的黄芩素或其衍生物合成方法比较简便，适合批量生产，催化剂可回收，减少污染，本发明制备的黄芩素或其衍生物具有抗基孔肯雅病毒活性，可以作为抗基孔肯雅病毒药物使用。

Description

一种黄芩素或其衍生物、制备方法与应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体地说，涉及一种黄芩素或其衍生物、制备方法与应用。
背景技术
基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)，属于披膜病毒科甲病毒属成员，人和非人灵长类动物是CHIKV的主要宿主。基孔肯雅病毒可以是基孔肯雅热病。基孔肯雅热病是经蚊虫叮咬传播的急性发热性传染病。该病毒病过去主要分布在非洲、南亚、东南亚热带和亚热带地区，近年来，随着全球变暖和现代交通工具等因素，该病毒疫情呈不断暴发和蔓延的趋势。2009年11月19日深圳口岸首次检出输入性基孔肯雅热病例。病人感染基孔肯雅病毒后肌肉和关节会剧烈疼痛，并伴有发热、恶心、呕吐。急性期后，大多数患者的关节疼痛及僵硬状态可完全恢复。部分患者持续性关节疼痛和僵硬可达数周至数月，甚至3年以上。个别患者留有关节功能受损等后遗症，严重危害人类健康。目前针对基孔肯雅热尚无获批的疫苗及特效抗病毒药物，治疗主要是退热、镇痛等对症治疗。
黄芩素，5,6,7-三羟基黄酮，是一种从中药黄芩中分离得到的黄酮类化合物。该化合物具有许多药理作用，但未见报道黄芩素具有抗基孔肯亚病毒活性。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种黄芩素或其衍生物。
本发明的第二个目的是提供一种所述黄芩素或其衍生物的制备方法。
本发明的第三个目的是提供一种黄芩素或其衍生物在制备抗基孔肯雅病毒药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明的第一个方面提供了一种黄芩素或其衍生物，结构如下所示：
Figure BDA0002260574760000011
其中，R1为氢、烷基、取代或未取代芳基；
R2为氢、卤素、烷基、烷氧基、取代或未取代氨基、取代或未取代芳基；
R3为氧、硫；
R4为取代或未取代芳基。
优选的，所述黄芩素或其衍生物中，
R1为氢、甲基、乙基、丙基；
R2为氢、氟、氯、溴、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、取代或未取代氨基、取代或未取代苯基；
R3为氧、硫；
R4为取代或未取代苯基。
较优选的，所述黄芩素或其衍生物中，
R1为氢、甲基、乙基、丙基；
R2为氢、氟、氯、溴、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、
Figure BDA0002260574760000021
R3为氧、硫；
R4为：
Figure BDA0002260574760000022
Figure BDA0002260574760000031
最优的，所述黄芩素或其衍生物的结构为以下结构的一种：
Figure BDA0002260574760000032
结构式S、T中R为
Figure BDA0002260574760000041
结构式A中R为氟、三氟甲基、甲基、三氟甲氧基、甲氧基；
Figure BDA0002260574760000042
结构式B、C中R为氟、三氟甲基、甲基、三氟甲氧基、甲氧基、氢；
结构式D中R为氟、三氟甲基、甲基、三氟甲氧基、甲氧基、羟基、氢；
Figure BDA0002260574760000043
结构式E中R为
Figure BDA0002260574760000044
结构式F中R为卤素、
Figure BDA0002260574760000045
Figure BDA0002260574760000051
结构式G、H中R为
Figure BDA0002260574760000052
R6为氢、卤素(氟、氯、溴、碘)、甲基、甲氧基、三氟甲基、三氟甲氧基，R7为氢、卤素(氟、氯、溴、碘)、甲基、甲氧基、三氟甲基、三氟甲氧基；
Figure BDA0002260574760000053
结构式J、K中分别为硝基、氨基；
Figure BDA0002260574760000054
所述黄芩素或其衍生物具体为实施例中表1和表2中所列出的化合物。
本发明的第二个方面提供了一种黄芩素或其衍生物的制备方法，包括以下步骤：
Mannich反应
Figure BDA0002260574760000061
将黄芩素溶解于溶剂中，依次加入甲醛、取代胺，黄芩素、甲醛、取代胺的摩尔比为1:(1.1～2):(1.1～2)，温度为20～50℃的条件下反应0.1～24h，得到化合物S。
所述溶剂为甲醇。
所述取代胺为二甲胺、二乙胺、二丙胺、二丁胺、吡咯烷、吗啉、哌啶、N-甲基哌嗪、N-乙基哌嗪。
Figure BDA0002260574760000062
将化合物S3加入到乙醇中，加入K2CO3、CH3I，化合物S3、K2CO3、CH3I的摩尔比为1:(3.5～5):(3.5～5)，回流反应1～48h，得到第一中间体；
将摩尔比为(1.5～2):1的第一中间体和劳森试剂加热回流反应1～48h，得到第二中间体；
在无水无氧的条件下，将第二中间体溶于DCM中，温度为-15℃的条件下滴加BBr3，第二中间体与BBr3的摩尔比为1:(6～10)，反应完全后重结晶，得到化合物T1。
Suzuki偶联反应：
Figure BDA0002260574760000071
将黄芩素溶解于丙酮中，然后依次加入碘甲烷(CH3I)和碳酸钾(K2CO3)，黄芩素、碘甲烷、碳酸钾的摩尔比为1:(10～20):(1.5～3)，加热回流1～24h，得到中间体2；
将中间体2溶解于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，加入N-溴代丁二酰亚胺(NBS)，化合物2与N-溴代丁二酰亚胺的摩尔比为1:(1.05～1.5)，冰浴条件下搅拌1～24h，得到中间体3；
将中间体3、硼酸化合物溶于溶剂中，加入碱、钯催化剂，中间体3、硼酸化合物、碱、钯催化剂的摩尔比为1:(1.1～1.5):(2.5～3.5):(0.08～0.12)，无水无氧条件下加热至90～110℃，反应1～24h，TLC检测反应，反应完全后得到化合物A。
所述溶剂为DMF。
所述硼酸化合物为对氟苯硼酸、间氟苯硼酸、对三氟甲基苯硼酸、间甲基苯硼酸、苯硼酸、对甲基苯硼酸、3,5-二氟苯硼酸、对三氟甲氧基苯硼酸、对甲氧基苯硼酸、3,4-二甲氧基苯硼酸。
所述碱为K2PO4。
所述钯催化剂为PdCl2(PPh3)2。
在无水无氧的条件下，将化合物A溶于溶剂中，温度为-15℃的条件下滴加BBr3，化合物A与BBr3的摩尔比为1:(6～10)，反应完全后重结晶，得到化合物D。
所述溶剂为DCM。
将化合物A溶于溶剂中，加入劳森试剂，化合物A与劳森试剂的摩尔比为1:(0.5～1)，温度为60～80℃条件下加热回流反应0.5～24h，分离纯化得到化合物B。
所述溶剂为THF。
在无水无氧的条件下，将化合物B溶于溶剂中，温度为-15℃的条件下滴加BBr3，化合物B与BBr3的摩尔比为1:(6～10)，反应完全后重结晶，得到化合物C。
所述溶剂为DCM。
Buchwald-Hartwig偶联反应：
Figure BDA0002260574760000081
将摩尔比为1:(1.3～2):(1.3～2)的3,4,5-三甲氧基苯酚、碳酸钾、乙酸酐溶于溶剂中，反应获得中间体4；
所述溶剂为THF。
将中间体4溶于溶剂中，加入BF3-Et2O回流反应，BF3-Et2O与中间体4的摩尔比为(2～5):1，获得中间体5；
所述溶剂为氯仿。
将中间体5溶于溶剂中，冰浴条件下加入氢氧化钠溶液、对溴苯甲醛，中间体5与对溴苯甲醛的摩尔比为1:(1～1.2)，中间体5与氢氧化钠摩尔比为1:(2-10)，反应完全后调pH至5～6，反应后抽滤，得到中间体6。
所述溶剂为甲醇。
将中间体6溶于溶剂中，加入碘单质，中间体6与碘单质的摩尔比为1:(2-10)，温度为120～140℃的条件下加热反应1～12h，得到中间体7。
所述溶剂为二甲基亚砜(DMSO)。
将摩尔比为1:(0.1～0.3):(0.1～0.3):(1.5～3):(1.05～1.5)的中间体7、Pd(dba)3、2,2’-双(二苯基膦)-1,1’-联萘、碳酸铯、取代胺溶于溶剂中，在无水无氧条件下加热到100～110℃反应1～24h，反应完全后得到化合物E。
所述溶剂为DMF。
所述取代胺为N-甲基哌嗪、
Figure BDA0002260574760000091
在无水无氧的条件下，将化合物E溶于溶剂中，温度为-15℃的条件下滴加BBr3，化合物E与BBr3的摩尔比为1:(6～10)，反应完全后重结晶，得到化合物F。
所述溶剂为DCM。
Sonogashira偶联反应
Figure BDA0002260574760000092
将摩尔比为1:(0.1～0.3):(4～8):(0.1～0.3):(1.01～1.5)的中间体7、CuI、二异丙胺、PdCl2(PPh3)2、炔类化合物溶于溶剂中，在无水无氧条件下加热到100～110℃反应1～24h，得到化合物G。
所述溶剂为DMF。
所述炔类化合物为苯乙炔、3-炔基-2-丁酮、4-苯基-1-丁炔、2-乙炔基吡啶。
在无水无氧的条件下，将化合物G溶于溶剂中，温度为-15℃的条件下滴加BBr3，化合物E与BBr3的摩尔比为1:(6～10)，反应完全后重结晶，得到化合物H。
所述溶剂为DCM。
Figure BDA0002260574760000101
将硝基取代的肉桂酸(R为硝基)溶于溶剂中，在冰浴条件下，缓慢滴加草酰氯，对硝基肉桂酸与草酰氯的摩尔比为1:(1.1～2)，反应完全后旋干，得到中间体8。
所述溶剂为DCM。
将摩尔比为(1-1.5):1的中间体8、3,4,5-三甲氧基苯酚溶于溶剂中使其溶解，冰浴条件下，缓慢滴加碱，中间体8与碱的摩尔比为1:(1-3)，反应完全后获得中间体9；
所述碱为无水碳酸钾、碳酸钠、三乙胺。
所述溶剂为DCM。
将中间体9溶于溶剂中，加入BF3-Et2O回流反应，BF3-Et2O与中间体9的摩尔比为(2～5):1，获得中间体10；
所述溶剂为氯仿。
将中间体10溶于溶剂中，加入碘单质，中间体10与碘单质的摩尔比为1:(2～3)，温度为120～140℃的条件下加热反应1～12h，得到化合物J。
在无水无氧的条件下，将化合物J溶于溶剂中，温度为-15℃的条件下滴加BBr3，化合物J与BBr3的摩尔比为1:(6～10)，反应完全后重结晶，得到化合物K。
所述溶剂为DCM。
Figure BDA0002260574760000111
将黄芩素BE溶解于丙酮中，然后依次加入碘甲烷(CH3I)和碳酸钾(K2CO3)，黄芩素、碘甲烷、碳酸钾的摩尔比为1:(10～20):(1.5～3)，加热回流1～24h，得到中间体2；
将中间体2溶于溶剂(THF)中，加入劳森试剂，中间体2与劳森试剂的摩尔比为1:(0.5～1)，温度为60～80℃条件下加热回流反应0.5～24h，分离纯化得到化合物BOES；
在无水无氧的条件下，将化合物BOES溶于溶剂(DCM)中，温度为-15℃的条件下滴加BBr3，化合物BOES与BBr3的摩尔比为1:(6～10)，反应完全后重结晶，得到化合物BES。
化合物M1的制备方法包括以下步骤：
Figure BDA0002260574760000112
将对硝基肉桂酸溶于无水DCM中，冰浴下滴加草酰氯，草酰氯与对硝基肉桂酸的摩尔比为(1.01～2):1，滴加一滴DMF，滴加完毕移到室温下反应两个小时，然后旋干除去溶剂得到化合物1；
向化合物1中加入DCM溶解，加入3,4,5-三甲氧基苯酚，3,4,5-三甲氧基苯酚与对硝基肉桂酸的摩尔比为1:1，在温度为10℃以下滴加三乙胺，三乙胺与对硝基肉桂酸的摩尔比为(1.01～2):1，反应得到化合物M0；
将化合物M0中加入氯仿溶解，然后缓慢滴加过量的三氟化硼乙醚，加热回流反应，得到化合物M1。
本发明的第三个方面提供了一种所述黄芩素或其衍生物、或其水合物，或者其药理学上允许的盐在制备抗基孔肯雅病毒药物中的应用。
所述黄芩素或其衍生物为化合物黄芩素、BES、BOES、G2、M1、E10、6、6-1、7-1、A8、D8、C3、C1、C2、D1、D2、D4、D5、D6、D7、E2、E4、F1、F2、F3、F4、F5、F6、G1、G3、H1、H3、H4、K2、L1、J1、J2。
由于采用上述技术方案，本发明具有以下优点和有益效果：
本发明制备的黄芩素或其衍生物合成方法比较简便，适合批量生产，催化剂可回收，减少污染，本发明制备的黄芩素或其衍生物具有抗基孔肯雅病毒活性，可以作为抗基孔肯雅病毒药物使用。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例1：化合物S1的制备
将黄芩素(BE)(500mg，1.85mmol)置于100ml单口瓶中，加入30mlMeOH溶解，然后依次加入甲醛(140μl，2.78mmol)、二乙胺(300μl，2.88mmol)，升温到40℃，然后在此条件下反应3h，TLC检测反应完毕，抽滤析出固体，然后滤饼烘干，置于50ml单口瓶中用乙醇重结晶得到化合物S1。
实施例2：化合物S2的制备参照化合物S1的制备方法，不同的是将二乙胺替换为吡咯烷。
实施例3：化合物S3的制备参照化合物S1的制备方法，不同的是将二乙胺替换为吗啉。
实施例4：化合物S3的制备参照化合物S1的制备方法，不同的是将二乙胺替换为吗啉。
将制备的化合物S3制备成化合物T1：
将化合物S3(5mmol)加入到20ml乙醇溶液中，加入K2CO3 2g、CH3I(7.1mg，20mmol)，回流反应24h。得到第一中间体；
将摩尔比为2.57:1.54的第一中间体和劳森试剂加热回流反应3h，得到第二中间体；
在无水无氧的条件下，将第二中间体溶于DCM中，温度为-15℃的条件下滴加BBr3，第二中间体与BBr3的摩尔比为1:8，反应完全后重结晶，得到化合物T1。
实施例5：化合物S5的制备参照化合物S1的制备方法，不同的是将二乙胺替换为哌啶。
实施例6：化合物S6的制备参照化合物S1的制备方法，不同的是将二乙胺替换为N-甲基哌嗪。
实施例7：化合物S7的制备参照化合物S1的制备方法，不同的是将二乙胺替换为N-乙基哌嗪。
实施例8：中间体3的制备
将黄芩素(20g，70mmol)置于500ml茄型瓶中，加入丙酮250ml使其溶解，然后依次加入碳酸钾(19g，140mmol)、CH3I(69.7ml，1120mmol)，设定温度至75℃，温度为75℃的条件下反应5-24小时，TLC检测反应，反应完全后加入大量的水，将析出的固体抽滤后得滤饼，然后将滤饼放至烘箱中烘干得到中间体2，直接用于下一步反应。
取上述中间体2(22g，71mmol)置于500ml茄型瓶中，加入DMF(250ml)溶解，在冰浴条件下分两批次加入NBS(15g，85mmol)，第一次加入NBS(7.1g，39.8mmol)，冰浴下反应2h，第二次加入NBS(7.9g，44.3mmol)，然后冰浴条件下继续搅拌反应6h，TLC检测反应，反应完全后加入850ml水，室温搅拌1小时，析出来的固体抽滤，滤饼用少量水洗涤，放置烘箱烘干，然后硅胶柱分离纯化，得到中间体3的纯品，是作为下一步偶联反应的关键中间体。
实施例9：化合物A1的制备
将中间体3(1.5g，3.7mmol)和对氟苯硼酸(622mg，4.46mmol)置于100ml茄型瓶中，然后用无水DMF(25ml)将其溶解，加入K2PO4(2356mg，11.1mmol)，快速加入PdCl2(PPh3)2(260g，0.37mmol)，然后无水无氧条件下加热到100℃，反应12小时，TLC检测反应，反应完全后将反应装置移到室温下使其冷却，加入大量EA(乙酸乙酯)，过滤除出不溶性固体，然后滤液用水洗两次，用饱和NaCl溶液洗两次除去DMF后，加入无水硫酸钠干燥半个小时，然后用漏斗过滤得到溶液，减压蒸除溶剂，硅胶柱纯化后得到化合物A1。
实施例10：化合物B1的制备
取上述化合物A1(1046mg，2.57mmol)置于100ml茄型瓶中，加入THF溶解，加入劳森试剂(624mg，1.54mmol)，在70℃条件下加热回流反应1h，TLC检测，反应完全后，将其移至室温条件下，待其冷却到室温，减压蒸除溶剂，硅胶柱(石油醚：乙酸乙酯＝6-15:1)分离纯化后得到化合物B1。
实施例11：化合物C1的制备
取上述化合物B1(300mg，0.74mmol)置于三口瓶(100ml)中，在无水无氧的条件下加入无水的DCM 50ml使其溶解，然后在-15℃的温度下以恒定的速度缓慢滴加BBr3(6.5mmol)的DCM 7ml溶液，恒速滴加结束，将反应装置移到室温下搅拌反应12h，TLC检测，反应完全后，加入73ml水，室温搅拌1小时将析出来的固体过滤，滤饼用水洗涤两次，放置烘箱烘干，然后用乙醇(EtOH)重结晶后得到化合物C1。
实施例12：化合物D1的制备参照化合物C1的制备方法，不同的是将化合物B1替换为A1。
实施例13：化合物A2的制备参照化合物A1的制备方法，不同的是将对氟苯硼酸替换为间氟苯硼酸(4.46mmol)。
实施例14：化合物B2的制备参照化合物B1的制备方法，不同的是将化合物A1替换为化合物A2。
实施例15：化合物C2的制备参照化合物C1的制备方法，不同的是将化合物B1替换为化合物B2。
实施例16：化合物D2的制备参照化合物D1的制备方法，不同的是将化合物A1替换为A2。
实施例17：化合物A3的制备参照化合物A1的制备方法，不同的是将对氟苯硼酸替换为对三氟甲基苯硼酸(4.46mmol)。
实施例18：化合物B3的制备参照化合物B1的制备方法，不同的是将化合物A1替换为化合物A3。
实施例19：化合物C3的制备参照化合物C1的制备方法，不同的是将化合物B1替换为化合物B3。
实施例20：化合物D3的制备参照化合物D1的制备方法，不同的是将化合物A1替换为A3。
实施例21：化合物A4的制备参照化合物A1的制备方法，不同的是将对氟苯硼酸替换为间甲基苯硼酸(4.46mmol)。
实施例22：化合物D4的制备参照化合物D1的制备方法，不同的是将化合物A1替换为A4。
实施例23：化合物A5的制备参照化合物A1的制备方法，不同的是将对氟苯硼酸替换为苯硼酸(4.46mmol)。
实施例24：化合物D5的制备参照化合物D1的制备方法，不同的是将化合物A1替换为A5。
实施例25：化合物A6的制备参照化合物A1的制备方法，不同的是将对氟苯硼酸替换为对甲基苯硼酸(4.46mmol)。
实施例26：化合物D6的制备参照化合物D1的制备方法，不同的是将化合物A1替换为A6。
实施例27：化合物A7的制备参照化合物A1的制备方法，不同的是将对氟苯硼酸替换为3,5-二氟苯硼酸(4.46mmol)。
实施例28：化合物D7的制备参照化合物D1的制备方法，不同的是将化合物A1替换为A7。
实施例29：化合物A8的制备参照化合物A1的制备方法，不同的是将对氟苯硼酸替换为对三氟甲氧基苯硼酸(4.46mmol)。
实施例30：化合物D8的制备参照化合物D1的制备方法，不同的是将化合物A1替换为A8。
实施例31：化合物A9的制备参照化合物A1的制备方法，不同的是将对氟苯硼酸替换为对甲氧基苯硼酸(4.46mmol)。
实施例32：化合物D9的制备参照化合物D1的制备方法，不同的是将化合物A1替换为A9。
实施例33：化合物A10的制备参照化合物A1的制备方法，不同的是将对氟苯硼酸替换为3,4-二甲氧基苯硼酸(4.46mmol)。
实施例34：化合物D10的制备参照化合物D1的制备方法，不同的是将化合物A1替换为A10。
实施例35：中间体6的制备
将3,4,5-三甲氧基苯酚(20g，110mmol)、K2CO3(163mmol，23g)置于500ml茄型瓶中，加入无水THF 200ml使其溶解，然后加入乙酸酐(17g，165mmol)，加料完毕后室温下搅拌两个小时，TLC监测反应，反应结束后加水，在室温条件下搅拌1h，无固体析出后，用DCM进行萃取三次，得到的有机相用饱和NaCl溶液洗两次，无水Na2SO4干燥，减压滤过，旋干，得到中间体4。
将中间体4(22g，100mmol)置于500ml的单口茄型瓶中，加入150mlCHCl3溶解，加入BF3-Et2O(10ml)，加热回流5h，TLC监测反应，反应结束后，将其移到室温下使其冷却，冷却完全后加入冷水至无白烟产生，无固体析出后，用DCM萃取三次得到有机相，然后将有机相用饱和NaCl溶液洗两次，无水Na2SO4干燥，减压滤过，旋干，得到中间体5。
将中间体5(20g，89mmol)置于500ml的三颈瓶中，加入250ml MeOH溶解，随后冰浴条件下缓慢的滴加浓度为10％的NaOH水溶液100ml，滴加完毕后加入对溴苯甲醛(91mmol)，移至室温下反应12h，TLC监测反应，反应结束后加水500ml，用2mol/L的盐酸(HCl)调节pH至5-6，室温下搅拌一个小时，抽滤，滤饼用水洗后放置烘箱烘干用于投下一步反应，得到中间体6。
实施例36：中间体6-1的制备参照上述实施例11中化合物C1的制备。
实施例37：中间体7的制备
将得到的中间体6(18g，45.8mmol)置于500ml单口瓶中，加入DMSO200ml溶解，加入碘单质(1.28g，101mmol)升温到125℃下反应4h。TLC检测反应完毕后，将加热装置关闭，使反应液冷却到室温后加入600ml水，有大量灰白色固体析出，固体析出来后再加入硫代硫酸钠1g除去多余的碘单质，室温下搅拌半个小时后抽滤，滤饼用水洗，然后烘干后硅胶柱层析得到纯品中间体7。
实施例38：中间体7-1的制备参照上述实施例11中化合物C1的制备。
实施例39：化合物J1的制备
称取对硝基肉桂酸(1g，5.2mmol)置于100ml茄型瓶中，加入无水DCM50ml使其溶解，然后在冰浴条件下缓慢的滴加草酰氯(790mg，6.2mmol)，加料完毕后室温下搅拌两个小时，TLC检测反应完毕后，旋干得到中间体8。
将上述5.3mmol中间体8、3,4,5-三甲氧基苯酚(957mg，5.2mmol)溶于DCM 50ml中使其溶解，冰浴条件下缓慢的滴加三乙胺(631mg，6.24mmol)，滴加结束后移到室温下反应两个小时。TLC检测反应，检测出反应结束后，加入70ml的水，析出固体，固体水洗一次，放烘箱烘干，得到中间体9。
将中间体9(100mmol)置于500ml的单口茄型瓶中，加入150mlCHCl3溶解，加入BF3-Et2O(10ml)，加热回流5h，TLC监测反应，反应结束后，将其移到室温下使其冷却，冷却完全后加入冷水至无白烟产生，无固体析出后，用DCM萃取三次得到有机相，然后将有机相用饱和NaCl溶液洗两次，无水Na2SO4干燥，减压滤过，旋干，得到中间体10。
将得到的中间体10(45.8mmol)置于500ml单口瓶中，加入DMSO 150-200ml溶解，加入碘单质(1.28g，101mmol)升温到125℃下反应4h。TLC检测反应完毕后，将加热装置关闭，使反应液冷却到室温后加入600ml水，有大量灰白色固体析出，固体析出来后再加入硫代硫酸钠1g除去多余的碘单质，室温下搅拌半个小时后抽滤，滤饼用水洗，然后烘干后硅胶柱层析得到化合物J1。
实施例40：化合物K1的制备参照上述化合物C1的制备。
实施例41：化合物L1的制备
将化合物K1(317mg，1mmol)置于三口瓶中，然后加入甲醇溶解，加入钯碳(64mg)，氢气保护下加热到40℃，反应4h，TLC检测反应完全，硅藻土过滤除去钯碳，旋干甲醇得到化合物L1。
实施例42：化合物J2的制备步骤参照化合物J1的制备步骤。
实施例43：化合物K2的制备步骤参照上述化合物C1的制备。
实施例44：化合物L2的制备步骤参照上述化合物L1的制备。
实施例45：化合物E1的制备
将中间体7(500mg，1.3mmol)置于100ml的茄型单口瓶中，然后依次加入Pd(dba)3(238mg，0.26mmol)、2,2’-双(二苯基膦)-1,1’-联萘(187mg，0.3mmol)、碳酸铯(Ce2CO3)(847mg，2.6mmol)、N-甲基哌嗪(156mg，1.6mmol)，最后加入无水DMF20ml使其全部溶解，在无水无氧条件下加热到105℃反应12h，TLC检测反应完全后，将其移到室温下，反应液冷却，加入EA，过滤除出不溶性固体，然后将滤液用水洗两次，饱和氯化钠溶液洗两次除去DMF，加入无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸除溶剂，硅胶柱纯化，得到化合物E1。
实施例46：化合物F1的制备参照化合物C1的制备方法。
实施例47：化合物E2的制备参照化合物E1的制备，不同的是将N-甲基哌嗪替换为对溴苯胺。
实施例48：化合物F2的制备参照化合物C1的制备方法。
实施例49：化合物E3的制备参照化合物E1的制备，不同的是将N-甲基哌嗪替换为对氯苯胺。
实施例50：化合物F3的制备参照化合物C1的制备方法。
实施例51：化合物E4的制备参照化合物E1的制备，不同的是将N-甲基哌嗪替换为对氟苯胺。
实施例52：化合物F4的制备参照化合物C1的制备方法。
实施例53：化合物E5的制备参照化合物E1的制备，不同的是将N-甲基哌嗪替换为N-(3-氯苯基)哌嗪。
实施例54：化合物F5的制备参照化合物C1的制备方法。
实施例55：化合物E6的制备参照化合物E1的制备，不同的是将N-甲基哌嗪替换为N-(4-羟基苯基)哌嗪。
实施例56：化合物F6的制备参照化合物C1的制备方法。
实施例57：化合物E7的制备参照化合物E1的制备，不同的是将N-甲基哌嗪替换为N-(4-氯苯基)哌嗪。
实施例58：化合物F7的制备参照化合物C1的制备方法。
实施例59：化合物E8的制备参照化合物E1的制备，不同的是将N-甲基哌嗪替换为N-(3,4,5三甲氧基苯甲酰基)哌嗪。
实施例60：化合物F8的制备参照化合物C1的制备方法。
实施例61：化合物E9的制备参照化合物E1的制备，不同的是将N-甲基哌嗪替换为(3,4,5三氟苯甲酰基)哌嗪。
实施例62：化合物F9的制备参照化合物C1的制备方法。
实施例63：化合物G1的制备
将中间体7(500mg，1.3mmol)置于100ml茄型单口瓶中，依次加入CuI(50mg，0.26mmol)、二异丙胺1ml、PdCl2(PPh3)2(182mg，0.26mmol)、苯乙炔(158mg，1.54mmol)，最后加入25ml无水DMF使其溶解。无水无氧条件下加热到105℃反应12h，TLC检测反应完全后，关闭加热装置并将其移到室温，加入大量EA，过滤除出不溶性固体，然后滤液用水洗两次，饱和氯化钠溶液洗两次除去DMF，加入无水硫酸钠干燥半个小时，用漏斗过滤得到滤液，减压蒸除溶剂，硅胶柱纯化，得到化合物G1。
实施例64：化合物H1的制备参照化合物C1的制备方法。
实施例65：化合物G2的制备参照化合物G1的制备方法，不同的是将苯乙炔替换为4-苯基-1-丁炔。
实施例66：化合物H2的制备参照化合物C1的制备方法。
实施例67：化合物G3的制备参照化合物G1的制备方法，不同的是将苯乙炔替换为2-乙炔基吡啶。
实施例68：化合物H3的制备参照化合物C1的制备方法。
实施例69：化合物G4的制备参照化合物G1的制备方法，不同的是将苯乙炔替换为3-炔基-2-丁酮。
实施例70：化合物H4的制备参照化合物C1的制备方法。
实施例71和实施例72：化合物BES和BOES的制备方法：
将黄芩素BE溶解于丙酮中，然后依次加入碘甲烷(CH3I)和碳酸钾(K2CO3)，黄芩素、碘甲烷、碳酸钾的摩尔比为1:16:2，加热回流1～24h，得到中间体2；
将中间体2溶于溶剂(THF)中，加入劳森试剂，中间体2与劳森试剂的摩尔比为1:1，温度为60～80℃条件下加热回流反应0.5～24h，分离纯化得到化合物BOES；
在无水无氧的条件下，将化合物BOES溶于溶剂(DCM)中，温度为-15℃的条件下滴加BBr3，化合物BOES与BBr3的摩尔比为1:9，反应完全后重结晶，得到化合物BES。
实施例73，化合物M1的制备方法
称取对硝基肉桂酸(1g，5.2mmol)于100ml茄型瓶中，加入无水DCM50ml使其溶解，然后在冰浴条件下缓慢的滴加草酰氯(790mg，6.2mmol)，滴加一滴DMF，加料完毕后室温下搅拌两个小时，TLC检测反应完毕后，旋干得到固体。按顺序先加入3,4,5-三甲氧基苯酚(957mg，5.2mmol)，然后加入DCM使其溶解，最后冰浴条件下缓慢的滴加三乙胺(631mg，6.24mmol)，滴加结束后移到室温下反应两个小时。TLC检测反应，检测出反应结束后，加入70ml的水，析出固体，固体水洗一次，放烘箱烘干得到化合物M0。
将化合物M0(1g,2.79mmol)于500ml的单口茄型瓶中，加入150mlCHCl3溶解，加入BF3-Et2O(1ml)，加热回流5h，TLC检测反应，反应完全后，将其移到室温下使其冷却，冷却完全后加入冷水至无白烟产生。因为无固体析出所以用DCM萃取三次得到有机相，然后将有机相用饱和NaCl溶液洗两次，无水Na2SO4干燥，减压滤过，旋干，得到化合物M1。
以上实施例制备的化合物的NMR数据如表1和表2所示：
表1
Figure BDA0002260574760000191
Figure BDA0002260574760000201
Figure BDA0002260574760000211
Figure BDA0002260574760000221
Figure BDA0002260574760000231
表2
Figure BDA0002260574760000232
Figure BDA0002260574760000241
Figure BDA0002260574760000251
Figure BDA0002260574760000261
Figure BDA0002260574760000271
药理学实验步骤及活性结果：
(一)实验药物、试剂及材料
1.人肝癌细胞Huh7购自中国科学院上海细胞所，由中国人民解放军海军军医大学海军医学系生物医学防御教研室保存。
2.DMEM细胞完全细胞培养液，含10％胎牛血清、0.03％谷氨酰胺、非必需氨基酸、氨苄青霉素和链霉素100U/mL，调pH至7.4。
3.细胞消化液，含0.25％胰蛋白酶，用磷酸缓冲液配制。
4.细胞活性检测试剂为同仁化学研究所(Dojindo)开发的检测细胞增殖、细胞毒性的试剂盒Cell Counting Kit-8(CCK-8试剂盒)。
(二)病毒：
基孔肯雅病毒(CHIKV)LR2006株，合成该病毒基因组，在非结构基因和结构基因之间插入EGFP表达框(EGFP启动子用CHIKV结构基因启动子)，制备的重组病毒LR2006-EGFP在感染Huh7细胞8小时以后即可见明显绿色荧光。
(三)抗病毒活性评价：
1.细胞接种，准备多瓶生长状态良好的Huh7细胞，PBS洗涤，胰酶消化，用含10％FBS的DMEM培养液悬浮细胞，混匀细胞，接种于96孔板，每孔100μl细胞悬液，15000个细胞，培养12h，此时细胞100％汇合，进行药物处理和病毒感染。
2.病毒感染，将96孔板置于4℃冰箱；分别用含10％FBS的DMEM培养液将病毒稀释到每孔中病毒感染复数(MOI)为0.1，充分混匀病毒，然后从4℃冰箱取出96孔板，加入病毒稀释液50μl，然后置于4℃冰箱。
3.药物处理，96孔板每孔加入DMEM完全培养液250μl，然后每孔加入浓度为10mM的FDA药物储存液2μl，再用8道移液器进行等体积稀释，稀释液仍用DMEM完全培养液，再用8道移液器向96孔板中每孔加入50μl药物稀释液，从而使药物终溶度为10mM，摇床上充分摇摆5min后，置于37℃培养箱进行细胞培养，以DMSO为阴性对照。
4.病毒感染检测，CHIKV感染12h以后，用EVOS M7000细胞成像系统每孔拍照四个视野，计数EGFP阳性细胞数量。
10mM浓度处理能降低细胞感染率超过50％的小分子，从50mM开始连续两倍稀释，共六个稀释度，检测各浓度的病毒抑制率，计算IC50，即抑制率为50％时的小分子浓度。
5.细胞毒活性测试采用Huh7细胞CCK-8方法测定。
结果如表3所示：
表3
Figure BDA0002260574760000281
Figure BDA0002260574760000291
从表3抗基孔肯亚病毒活性和细胞毒性数据可以看出，除化合物G2和M1具有较高的细胞毒性外(CC50＝42μM和CC50＝47μM)，其余化合物均表现出较好的抗基孔肯亚病毒的活性(IC50<18μM)和较低的细胞毒性，CC50>50μM。本发明公开化合物为研发一种抗基孔肯雅热的药物提供了基础。
以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。

Claims (2)

1.一种黄芩素衍生物，其特征在于，所述黄芩素衍生物的结构为以下结构的一种：
Figure FDA0003109781790000011
结构式A中R为氟、三氟甲基、甲基、三氟甲氧基、甲氧基；
Figure FDA0003109781790000012
结构式B、C中R为氟、三氟甲基、甲基、三氟甲氧基、甲氧基、氢；
结构式D中R为氟、三氟甲基、甲基、三氟甲氧基、甲氧基、羟基、氢；
Figure FDA0003109781790000013
结构式E中R为
Figure FDA0003109781790000014
结构式F中R为卤素、
Figure FDA0003109781790000015
Figure FDA0003109781790000021
结构式G、H中R为
Figure FDA0003109781790000022
R6为氢，R7为氢；
Figure FDA0003109781790000023
2.一种黄芩素衍生物或者其药理学上允许的盐在制备抗基孔肯雅病毒药物中的应用，其特征在于，所述黄芩素衍生物为以下结构中的一种：
Figure FDA0003109781790000024
Figure FDA0003109781790000031
Figure FDA0003109781790000041
Figure FDA0003109781790000051
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