PT1411954E - Nucleosídeos modificados para o tratamento de infecções virais e proliferação celular anormal - Google Patents

Nucleosídeos modificados para o tratamento de infecções virais e proliferação celular anormal Download PDF

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Description

1
DESCRIÇÃO "NUCLEOSÍDEOS MODIFICADOS PARA O TRATAMENTO DE INFECÇÕES VIRAIS E PROLIFERAÇÃO CELULAR ANORMAL"
CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção inclui compostos para utilização no tratamento de infecções por Flaviviridae. 0 presente pedido reivindica a prioridade do pedido provisional dos Estados Unidos N° 60/241.488, apresentado no dia 18 de Outubro de 2000, e o pedido de patente provisional dos Estados Unidos N° 60/282.156, apresentado no dia 6 de Abril de 2001. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Flaviviridae
Flaviviridae é um grupo de vírus de ARN de cadeia simples positivo com um tamanho genómico de 9-15 kb. São vírus com envelope de aproximadamente 40-50 nm. No International Committee for Taxonomy of Viruses está disponível uma visão geral da taxonomia dos Flaviviridae. A família Flaviviridae consiste em três géneros. 1. Flavivírus. Este género inclui o grupo do vírus da Dengue (vírus da Dengue, vírus da Dengue tipo 1, vírus da Dengue tipo 2, vírus da Dengue tipo 3, vírus da Dengue tipo 4), o grupo do vírus da encefalite japonesa (vírus Alfuy, vírus da encefalite japonesa, vírus Kookaburra, vírus Koutango, vírus Kunjin, vírus da encefalite de Murray Valley, vírus da encefalite de San Louis, vírus de Stratford, vírus Usutu e Vírus West Nile), o grupo do vírus Modoc, o grupo do vírus Rio Bravo (vírus Apoi, vírus Rio Bravo, vírus Saboya), o grupo do vírus Ntaya, o grupo da encefalite transmitida por carraças (vírus da encefalite 2 transmitida por carraças), o grupo do vírus Tyuleniy, o grupo de vírus Uganda S e o grupo de vírus da Febre Amarela. Aparte destes grupos principais, existem alguns Flavivírus adicionais que não estão classificados. 2. Hepacivírus. Este género contém apenas uma espécie, o vírus da Hepatite C (VHC), que é constituído por muitas classes, tipos e subtipos. 3. Pestivírus. Este género inclui o vírus da diarreia virai bovina-2 (vdvb-2), Pestivírus tipo 1 (inclusive VDVB), Pestivírus tipo 2 (inclusive Vírus da cólera suína) e Pestivírus tipo 3 (inclusive o Vírus da Doença da Fronteira).
Uma das infecções mais importantes por Flaviviridae em seres humanos produz-se pelo vírus da hepatite C (VHC). Esta é a segunda causa principal de hepatite virai, com uma estimativa de 17 0 milhões de portadores em todo o mundo (Organização Mundial da Saúde; Hepatite C: prevalência global, Registo Epidemiológico Semanal, 1997, 72, 341), dos quais 3,9 milhões residem nos Estados Unidos (Centros de Controlo da Doença; dados não publicados, http://www.cdc.gov/ncidod/diseases/hepatitis/heptab3.htm). A organização genómica dos Flaviviridae partilha muitas características comuns. O genoma do vírus da hepatite C (VHC) é utilizado com frequência como modelo. O VHC é um vírus pequeno, com envelope, com um genoma de ARN de cadeia simples positivo de ~ 9,6 kb dentro do nucleocapsídeo. O genoma contém só uma grelha de leitura aberta (ORF) que codifica uma poliproteína de pouco mais de 3.000 aminoácidos, que se divide para gerar as proteínas virais estruturais e não estruturais maturas. A ORF está flanqueada por regiões 5' e 3' não traduzidas (NTR) de uns poucos centenas de nucleótidos de comprimento, que são importantes para a tradução e replicação do ARN. A poliproteína traduzida contém o core estrutural (C) e as 3 proteínas do envelope (El, E2, p7) na extremidade N, seguido das proteínas não estruturais (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B) . As proteínas estruturais maturas criam-se por clivagem pela peptidase sinal do hospedeiro (ver: Hijikata, M. et al. Poc. Nat. Acad. Sei., USA, 1991, 88, 5547; Hussy, P. et al. Virology, 1996, 224, 93; Lin, C. et al J. Virol., 1994, 68, 5063; Mizushima, H. et al J.
Virol., 1994, 68, 2731; Mizushima, H. et al J. Virol., 1994, 68, 6215; Santolini, E. et al J. Virol., 1994, 68, 3631; Selby M. j. et al virology, 1994, 204, 114; e
Grakoui, A. et al Proc. Nat. Acad. Sei., USA, 1993, 90, 10538) . A união entre NS2 e NS3 divide-se autocataliticamente pela NS2/NS3 protease (ver: Hijikata, M. et al J. Virol., 1993, 67, 4665 w Bartenschlager, R. et al J. Virol., 1994, 68, 5045), enquanto as outras quatro uniões se dividem pelo domínio serina protease N-terminal de NS3 constituído com NS4A. (Ver: Failla, C. et al. J.
Virol., 1994, 68, 3753; Lin, C. et al J. Virol., 1994, 68, 8147; Tanji, Y. et al J. Virol., 1995, 69, 1575 e Tai, C. L. et al J. Virol., 1996, 70, 8477). A proteína NS3 também contém a actividade helicase dependente de NTP que desenrola o ARN duplex durante a replicação. A proteína NS5B possui actividade ARN polimerase dependente de ARN (RDRP) (ver: Behrens, S. E. et al EMBO J., 1996, 15, 12;
Lohmann, V. et al J. Virol., 1997, 71, 8416-8428 e Lohmann, V. et al, Virology, 1998, 249, 108), que é essencial para a replicação virai. (Ferrari, E. et al J. Virol., 1999, 73, 1649) . Sublinha-se que, ao contrário de VHB ou VIH, na replicação do VHC não está envolvido nenhum ADN.
Recentemente em experiências in vitro utilizando NS5B, foi estudada a especificidade de substrato por VHC-RDRP utilizando guanosina 5'-monofosfato (GMP), 5'-difosfato (GBP), 5'-trifosfato (GTP) e o 5'-trifosfato de 2'-desoxi e 2',3'-didesoxi guanosina (dGTP e ddGTP, respectivamente). Os autores reivindicaram que VHC-RDRP tem uma 4 especificidade estrita por ribonucleosideo 5'-trifosfatos e necessita dos grupos 2' e 3'-0H. (Lohmann; Virology, 108). As suas experiências sugerem que a presença de substituintes 2' e 3' seria o pré-requisito para que nucleosideo 5'-trifosfatos interagissem com VHC-RDRP e actuaram como substratos ou inibidores. É um objectivo da presente invenção proporcionar um composto, e uma composição para utilização no tratamento de um hospedeiro, inclusive animais e especialmente seres humanos, infectados com Flaviviridae. É um outro objectivo proporcionar uma composição para a sua utilização no tratamento de um hospedeiro, inclusive animais e especialmente seres humanos, infectados com encefalite C ou vdvb.
Também se descreve um processo mais eficaz para quantificar a carga virai e, em particular, a carga de VDVB ou VHC, num hospedeiro, inclusive animais, especialmente seres humanos.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona compostos como são definidos nas reivindicações para a sua utilização no tratamento de um hospedeiro infectado com um vírus que pertence à família Flaviviridae.
Especificamente, a invenção também inclui compostos para utilização no tratamento ou prevenção de uma infecção por Flaviviridae, inclusive todos os elementos do género Hepacivírus (VHC), género Pestivírus (VDVB, VCFP (vírus clássico da febre suína), VEB (vírus da doença de Borna)) ou género Flavivírus (vírus da Dengue, grupo do vírus da encefalite japonesa (inclusive o Vírus do Nilo Ocidental) e vírus da febre amarela).
Numa forma de realização, o nucleosideo tem um valor de CE50 (concentração eficaz para conseguir uma inibição virai de 50%), quando testado num ensaio à base de células 5 apropriado, inferior a 15 micromolar e, mais particularmente, inferior a 10 ou 5 micromolar. Numa realização preferida, o nucleosideo está enriquecido enantiomericamente. A actividade e toxicidade dos compostos descritos no presente documento podem avaliar-se de acordo com qualquer procedimento conhecido. De seguida é proporcionado um processo eficaz para quantificar a carga virai num hospedeiro utilizando a reacção em cadeia da polimerase em tempo real ("RT-PCR"). O processo envolve a utilização de uma molécula de sonda fluorescente extinta (quenched), que se pode hibridar com o ADN ou ARN virai alvo. Após a degradação exonucleolitica, pode monitorizar-se um sinal fluorescente detectável. Utilizando esta técnica, o ADN ou ARN amplificado por RT-PCR pode detectar-se em tempo real monitorizando a presença de sinais de fluorescência.
Esta memória descritiva apresenta: (a) um processo para quantificar a carga virai em tempo real utilizando RT-PCR como se descreve no presente documento; (b) um processo para quantificar a carga virai de um Flaviviridae, inclusive VDVB e VHC, num hospedeiro em tempo real utilizando a RT-PCR, como se descreve no presente documento; (c) um processo para quantificar a carga virai de VDVB numa linha celular MDBK ou numa amostra hospedeira em tempo real utilizando a RT-PCR, como se descreve no presente documento; (d) uma molécula de sonda concebida para emitir fluorescência após a degradação exonucleolitica e para ser complementar à região NS5B de VDVB NADL, como se descreve no presente documento; e (e) uma molécula de sonda com uma sequência de 5' -6-fam-AAATCCTCCTAACAAGCGGGTTCCAGG-tamara-3' (Sequência ID N° 1) e iniciadores com uma sequência sense: 5'- AGCCTTCAGTTTCTTGCTGATGT-3' (Sequência ID N° 2) e anti-sense: 5'-TGTTGCGAAAGCACCAACAG-3' (Sequência ID N° 3); (f) um processo para quantificar a carga virai de VHC numa amostra ou linha celular derivada de um hospedeiro em tempo real utilizando a RT-PCR, como se descreve no presente documento; (g) uma molécula de sonda concebida para emitir fluorescência após a degradação exonucleolitica e para ser complementar à região 5' não codificante de VHC, como se descreve no presente documento; e (h) uma molécula de sonda concebida para emitir fluorescência após a degradação exonucleolitica e para ser complementar à região codificante de VHC, como se descreve no presente documento; e (i) uma molécula de sonda concebida para emitir fluorescência após a degradação exonucleolitica e para ser complementar à região 3' não codificante de VHC, como se descreve no presente documento; e (j) una molécula de sonda com uma sequência de 5' —6— fam-CCTCCAGGACCCCCCCTCCC-tamara-3' (Sequência ID N° 4) e iniciadores com uma sequência sense: 5'- AGCCATGGCGTTAGTA(T/C)GAGTGT-3' (Sequência ID N° 5) e antí-sense: 5'-TTCCGCAGACCACTATGG-3' (Sequência ID N° 6) .
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona um nucleosideo de fórmula geral (i-a) como se define nas reivindicações ou o seu sal farmaceuticamente aceitável, para a sua utilização no tratamento de um hospedeiro infectado com um virus que pertence à familia Flaviviridae.
Também se revela a utilização de um dos compostos de fórmula (i-a) na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma infecção virai.
Também se revela uma composição farmacêutica que 7 inclui uma quantidade antiviralmente eficaz de um nucleosideo da presente invenção, ou o seu sal farmaceuticamente aceitável, juntamente com um veiculo ou diluente farmaceuticamente aceitável de acordo com a presente invenção.
Também se revela uma composição farmacêutica com um nucleosideo da presente invenção, ou o seu sal farmaceuticamente aceitável, em combinação com um ou mais agentes diferentes eficazes como produtos antivirais ou anti-proliferativos.
Noutra divulgação é proporcionado um processo para a preparação de nucleosideos da presente invenção, e o seu sal farmaceuticamente aceitável.
Em particular, a invenção inclui os compostos reivindicados para a sua utilização em métodos para tratamento ou prevenção, ou utilização na fabricação de um medicamento para uma infecção por Flaviviridae, incluindo todos os elementos do género Hepacivírus (VHC), género Pestivirus (VDVB, VCFP, VEB) ou género Flavivirus (vírus da Dengue, grupo do vírus da encefalite japonesa (inclusive o Vírus West Nile) e o vírus da febre amarela; I. Compostos da Divulgação
Numa realização, o nucleosideo anti-viral ou anti-proliferativamente eficaz é um β-D nucleosideo de fórmula geral (i-a)
como é definido na reivindicação 1.
Numa realização preferida, os β-D nucleosideos de fórmula geral (I-a) representam-se pelos exemplos 8 proporcionados na Tabela 1. Os compostos assinalados com um asterisco (*) incluem-se apenas como exemplos comparativos;
Tabela 1 x‘
9
ID X1 Y1 R1 (continuação) R1’ R! R2’ R3 R3' AC nh2 0 H H ΟΗ Η Η Cl AD nh2 0 H H ΟΗ Η Η Br LU < nh2 0 H H ΟΗ Η Η S-CN AF* nh2 0 H H ΟΗ Η Η n3 AG nh2 0 H H Η CI Η OH AH nh2 0 H H Η Br Η OH AI nh2 0 H H Η ΟΗ Br H AJ* nh2 0 H H Η ΟΗ Η H AK* nh2 0 H H Η ΟΗ O-Ms H AL* nh2 0 H H Η ΟΗ O-Ts H AM * ch2 0 H H O-Ms Η Η OH AN nh2 0 H H Cl Η Η OH O < ne2 0 □ D ΟΗ Η Η OH AP nh2 0 F H ΟΗ Η Η OH σ < nh2 0 F H Η ΟΗ Η OH AR* nh2 0 F H Η ΟΗ Η H AS nh2 0 F H Η ΟΗ CI H AT nh2 0 F H Η ΟΗ Br H AU nh2 0 F H Η CI Η OH AV* nh2 0 F H Η ΟΗ O-Ts H AW‘ nh2 0 F H Η ΟΗ O-Ms H > >< nh2 0 Cl H Η ΟΗ O-Ms H AY * nh2 0 Br H Η ΟΗ O-Ms H AZ* nh2 0 Br H Η ΟΗ Ο-Τε H BA* ch2 0 Br H Η ΟΗ Cl H BB* nh2 0 Br H Η ΟΗ Η OH BC* nh2 0 Br H ΟΗ Η Η OH BD* nh2 0 I H Η ΟΗ O-Ms H BE nh2 0 I H Η ΟΗ Br H BF* nh2 0 I H Η ΟΗ O-Ts H BG nh2 0 I H Η CI H OH BH nh2 0 I H Br Η H OH BI nh2 0 OH H ΟΗ Η H OH BJ* nh2 0 nh2 Η Η ΟΗ H OH BK nh2 0 ch3 Η Η ΟΗ Cl H BL* nh2 NH Η Η ΟΗ Η H OH BM* nh2 s H Η Η Se-fenilo H H BN NH-(2-Ph-Et) 0 H Η ΟΗ Η H OH 10 (continuação)
ID X1 Y1 R1 R1’ R2 R2' R3 R3' BO NH-COCHg 0 H H OH H H OH BP* nh-nh2 o H H OH H H OH σ □α nh-nh2 0 F H OH H H OH BR’ nh-nh2 0 ch3 H H OH H OH BS* NH-OH 0 H H H OH H OH BT* NH-OH 0 F H H OH H OH BU* NH-OH 0 Br H H OH H OH BV* NH-OH 0 I H H OH H OH BW NH-OH 0 H H OH H H OH BX OH 0 OH H OH H H OH BY* OH 0 nh2 H H OH H OH BZ OH 0 F H OH H H OH CA* OH 0 F H H O-Ts H OH CB* OH 0 F H H O-Ms H O-Ms CC* OH 0 F H H OH H OH CD* OH 0 F H H OH H O-Ts CE OH 0 F H H H H OH CF* O-Et 0 H H H O-Bz H O-Bz CG* s-ch3 0 H H H F H OH CH * SH 0 H H H OH H OH Cl* SH 0 F H H OH H OH CJ * n3 0 H H H H H H CK* NH-(2-Ph-Et) 0 H H H OH H OH CL* OH 0 OH H H OH H OH CM* OH 0 H H H OH H H
Numa realização, o nucleosídeo tem um CE50 (concentração eficaz para atingir uma inibição virai de 50%) , quando é ensaiada num ensaio baseado em células apropriado, de menos de 15 micromolar, e mais particularmente menos de 10 ou 5 micromolar. Numa realização preferida, o nucleosídeo está enantiomericamente enriquecido. II. Estereoisomeria e Polimorfismo
Os compostos da presente invenção que têm um centro quiral podem existir em, e isolar-se em formas opticamente 11 activas e racémicas. Alguns compostos podem mostrar polimorfismo. A presente invenção inclui a forma racémica, opticamente activa, polimórfica ou estereoisomérica, misturas das mesmas, de um composto da invenção, que possui as propriedades úteis descritas no presente documento. As formas opticamente activas podem preparar-se, por exemplo, por resolução da forma racémica por técnicas de recristalização, por síntese a partir de materiais de partida opticamente activos, por síntese quiral ou por separação cromatográfica usando uma fase estacionária quiral ou por resolução enzimática.
Como é apresentado de seguida, um nucleosídeo contém pelo menos dois átomos de carbono quirais críticos (*) . Em geral, os substituintes nos carbonos quirais [a base de purina ou pirimidina especificada (denominada substituinte Cl quando é utilizada a numeração do intermédio de anel de açúcar) e CH2OH (denominado substituinte C4)] do nucleosídeo podem ser cis (no mesmo lado) ou trans (em lados opostos) relativamente ao sistema de anel de açúcar. Os racematos eis e trans consistem num par de isómeros ópticos. Por isso, cada composto tem quatro estereoisómeros individuais. Os quatro estereoisómeros representam-se pelas seguintes configurações (quando é orientado o resto açúcar num plano horizontal de forma que o resto -0- está a preto): (1) eis, com os dois grupos "acima", que se denomina β-D; (2) a imagem especular, isto é, cis, com os dois grupos "abaixo", que é a imagem especular que se denomina β-L; (3) trans com o substituinte C4 "acima" e o substituinte Cl "abaixo" (denominado α-D); e (4) trans com o substituinte C4 "abaixo" e o substituinte Cl "acima" (denominado α-L) . Os dois enantiómeros cis juntos denominam-se mistura racémica de enantiómeros β, e os dois enantiómeros trans denominam-se mistura racémica de enantiómeros a. 12 Η
Os quatro estereoisómeros possíveis dos nucleosídeos apresentam-se de seguida.
-OH β-D β-L cis (β)
iram (a) A presente invenção inclui os estereoisómeros β-D dos compostos de fórmula (I-a) ui. Definições 0 termo "alquilo", como é utilizado no presente documento, excepto se for indicada uma alternativa, refere-se a um hidrocarboneto primário, secundário ou terciário, linear, ramificado ou cíclico, saturado, que inclui, mas sem limitação, os de Ci a Ci6, e especificamente inclui metilo, etilo, propilo, isopropilo, ciclopropilo, butilo, isobutilo, i-butilo, pentilo, ciclopentilo, isopentilo, 13 neopentilo, hexilo, isohexilo, ciclohexilo, ciclohexilmetilo, 3-metilpentilo, 2,2-dimetilbutilo e 2,3-dimetilbutilo. 0 grupo alquilo pode estar opcionalmente substituído com um ou mais restos seleccionados entre o grupo que consiste em alquilo, halo, haloalquilo, hidroxilo, carboxilo, acilo, aciloxi, amino, amido, derivados carboxilo, alquilamino, dialquilamino, arilamino, alcoxi, ariloxi, nitro, ciano, azido, tiol, imino, ácido sulfónico, sulfato, sulfonilo, sulfanilo, sulfinilo, sulfamonilo, éster, ácido carboxílico, amida, fosfonilo, fosfinilo, fosforilo, fosfina, tioéster, tioéter, haleto de ácido, anidrido, oxima, hidrozina, carbamato, ácido fosfónico, fosfato, fosfonato ou qualquer outro grupo funcional viável que não iniba a actividade farmacológica deste composto, em forma não protegida, ou protegida se for necessário, como é conhecido pelos peritos na especialidade, por exemplo, como se ensina em Greene, et al, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley e Sons, Segunda Edição, 1991. 0 termo "alquilo de cadeia curta", como é utilizado no presente documento, excepto se for indicada uma alternativa, refere-se a um grupo alquilo de Ci a C4 saturado, linear, ramificado, ou se for apropriado, cíclico (por exemplo, ciclopropilo), que inclui formas substituídas e sem substituir. 0 termo "alquileno" ou "alquenilo" refere-se a um radical hidrocarbildiílo saturado de configuração linear ou ramificada, incluindo, mas sem limitação, os que têm de uma a dez átomos de carbono. Dentro do âmbito deste termo incluem-se o metileno, 1,2-etano-diílo, 1,1-etano-diílo, 1.3- propano-diílo, 1,2-propano-diílo, 1,3-butano-diílo, 1.4- butano-diílo e semelhantes. 0 grupo alquileno ou outro resto divalente revelado no presente documento pode estar opcionalmente substituído com um ou mais restos seleccionados entre o grupo que consiste em alquilo, halo, 14 haloalquilo, hidroxilo, carboxilo, acilo, aciloxi, amino, amido, derivados carboxilo, alquilamino, azido, dialquilamino, arilamino, alcoxi, ariloxi, nitro, ciano, ácido sulfónico, tiol, imino, sulfonilo, sulfanilo, sulfinilo, sulfamonilo, éster, ácido carboxílico, amida, fosfonilo, fosfinilo, fosforilo, fosfina, tioéster, tioéter, haleto de ácido, anidrido, oxima, hidrozina, carbamato, ácido fosfónico, fosfonato ou qualquer outro grupo funcional viável que não iniba a actividade farmacológica deste composto, em forma não protegida, ou protegida segundo for necessário, como é conhecido pelos peritoas na especialidade, por exemplo, como se ensina em Greene, et al, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley e Sons, Segunda Edição, 1991. 0 termo "arilo", como é utilizado no presente documento, excepto se for indicada uma alternativa, refere-se a fenilo, bifenilo ou naftilo, e preferentemente fenilo. 0 termo inclui restos substituídos e sem substituir. 0 grupo arilo pode estar substituído com um ou mais restos seleccionados entre o grupo que consiste em bromo, cloro, flúor, iodo, hidroxilo, azido, amino, alquilamino, arilamino, alcoxi, ariloxi, nitro, ciano, ácido sulfónico, sulfato, ácido fosfónico, fosfato, ou fosfonato, em forma não protegida, ou protegida segundo for necessário, como é conhecido pelos peritos na especialidade, por exemplo, como se ensina em Greene, et al, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley e Sons, Segunda Edição, 1991. 0 termo "aralquilo", como é utilizado no presente documento, excepto se for indicada uma alternativa, refere-se a um grupo arilo como foi definido anteriormente unido à molécula através de um grupo alquilo como foi definido anteriormente. 0 termo "alcarilo" ou "alquilarilo", como é utilizado no presente documento, excepto se for indicada uma alternativa, refere-se a um grupo alquilo como foi definido anteriormente unido à molécula através de um grupo 15 arilo como foi definido anteriormente. Em cada um destes grupos, o grupo alquilo pode estar opcionalmente substituído como foi descrito anteriormente e o grupo arilo pode estar opcionalmente substituído com um ou mais restos seleccionados entre o grupo que consiste em alquilo, halo, haloalquilo, hidroxilo, carboxilo, acilo, aciloxi, amino, amido, azido, derivados carboxilo, alquilamino, dialquilamino, arilamino, alcoxi, ariloxi, nitro, ciano, ácido sulfónico, tiol, imino, sulfonilo, sulfanilo, sulfinilo, sulfamonilo, éster, ácido carboxílico, amida, fosfonilo, fosfinilo, fosforilo, fosfina, tioéster, tioéter, haleto de ácido, anidrido, oxima, hidrozina, carbamato, ácido fosfónico, fosfonato ou qualquer outro grupo funcional viável que não iniba a actividade farmacológica deste composto, em forma não protegida, ou protegida segundo for necessário, como é conhecido pelos peritos na especialidade, por exemplo, como se ensina em Greene, et al, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley e Sons, Segunda Edição, 1991. Dentro do âmbito do termo arilo incluem-se especificamente fenilo; naftilo; fenilmetilo; feniletilo; 3,4,5-trihidroxifenilo; 3,4,5-trimetoxifenilo; 3,4,5-trietoxifenilo; 4-clorofenilo; 4-metilfenilo; 3,5-di-terc-butil-4-hidroxifenilo; 4-fluorofenilo; 4-cloro-l-naftilo; 2-metil-l-naftilmetilo; 2-naftilmetilo; 4-clorofenilmetilo; 4-t-butilfenilo; 4-t-butilfenilmetilo e semelhantes. 0 termo "alquilamino" ou "arilamino" refere-se a um grupo amino que tem um ou mais dois substituintes alquilo ou arilo, respectivamente. 0 termo "halogéneo", como é utilizado no presente documento, inclui flúor, cloro, bromo e iodo. 0 termo "enantiomericamente enriquecido" é utilizado ao longo da memória descritiva para descrever um nucleosídeo que inclui pelo menos aproximadamente 95%, preferentemente pelo menos 96%, mais preferentemente pelo 16 menos 97%, ainda mais preferentemente, pelo menos 98%, e ainda mais preferentemente pelo menos aproximadamente 99% ou mais de um só enantiómero desse nucleosídeo. Quando se faz referencia a um nucleosídeo de uma configuração particular (D ou L) nesta memória descritiva, se supõe que o nucleosídeo é um nucleosídeo enantiomericamente enriquecido, excepto se for indicada uma alternativa. 0 termo "hospedeiro", como é utilizado no presente documento, refere-se a um organismo unicelular ou multicelular em que o vírus pode replicar-se, incluindo linhas celulares e animais, e preferentemente um ser humano. Como alternativa, o hospedeiro pode portar uma parte do genoma virai, cuja replicação ou função pode verse alterada pelos compostos da presente invenção. 0 termo hospedeiro refere-se especificamente a células infectadas, células transfectadas com todo, ou parte, do genoma virai e animais, em particular, primates (incluindo chimpanzés) e seres humanos. Relativamente à proliferação celular anormal, o termo "hospedeiro" refere-se a um organismo unicelular ou multicelular em que se pode imitar a proliferação celular anormal. O termo hospedeiro refere-se especificamente a células que proliferam de forma anormal, por causas naturais ou não naturais (por exemplo, a partir de uma mutação genética ou engenharia genética, respectivamente), e animais, em particular, primates (incluindo chimpanzés) e seres humanos. Na maioria das aplicações animais da presente invenção, o hospedeiro é um paciente humano. No entanto, as aplicações veterinárias, em determinadas indicações, antecipam-se claramente pela presente invenção (tal como o vírus da diarreia bovina virai no gado, vírus da cólera suína em porcos, e vírus da doença da fronteira em ovelhas). 0 termo "sal farmaceuticamente aceitável" utiliza-se ao longo da memória descritiva para descrever qualquer forma farmaceuticamente aceitável de um composto que, após 17 administração a um paciente, proporciona o composto activo. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os obtidos a partir de bases e ácidos inorgânicos ou orgânicos farmaceuticamente aceitáveis. Os sais adequados incluem os obtidos a partir de metais alcalinos como potássio e sódio, metais alcalinos-terrosos como cálcio e magnésio, entre muitos outros ácidos bem conhecidos na farmacêutica. IV. Sais Farmaceuticamente Aceitáveis
Nos casos em que os compostos são suficientemente básicos ou ácidos para formar sais de ácidos ou bases não tóxicas e estáveis, pode ser apropriada a administração do composto em forma de um sal farmaceuticamente aceitável: os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os obtidos a partir de bases e ácidos inorgânicos ou orgânicos farmaceuticamente aceitáveis. Os sais adequados incluem os obtidos a partir de metais alcalinos como potássio e sódio, metais alcalinos-terrosos como cálcio e magnésio, entre muitos outros ácidos bem conhecidos na farmacêutica. Em particular, são exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis sais de adição de ácidos orgânicos formados com ácidos, que formam um anião fisiologicamente aceitável, por exemplo, tosilato, metanossulfonato, acetato, citrato, malonato, tartarato, succinato, benzoato, ascorbato, a-cetoglutarato e α-glicerofosfato. Também se podem formar sais inorgânicos adequados, incluindo sais sulfato, nitrato, bicarbonato e carbonato.
Podem obter-se sais farmaceuticamente aceitáveis utilizando procedimentos convencionais bem conhecidos na especialidade, por exemplo, através da reacção de um composto suficientemente básico, como uma amina, com um ácido adequado, proporcionando um anião fisiologicamente aceitável. Também se podem fabricar sais de metais alcalinos (por exemplo, sódio, potássio ou litio) ou de metais alcalinos-terrosos (por exemplo, cálcio) de ácidos carboxilicos. 18 V. Composições Farmacêuticas
As composições farmacêuticas baseadas num composto β-D de fórmula (i-a) ou o seu sal farmaceuticamente aceitável podem preparar-se numa quantidade terapeuticamente eficaz para tratar uma infecção por virus Flaviviridae, opcionalmente em combinação com um aditivo, veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. A quantidade terapeuticamente eficaz pode variar com a infecção ou afecção a tratar, a sua gravidade, o regime de tratamento a utilizar, a farmacocinética do agente utilizado, bem como o paciente tratado.
Num aspecto de acordo com a presente divulgação, o composto de acordo com a presente invenção é formulado preferentemente misturado com um veículo farmaceuticamente aceitável. Em geral, é preferível administrar a composição farmacêutica em forma administrável por via oral, mas as formulações se podem administrar por via parentérica, intravenosa, intramuscular, transdérmica, bucal, subcutânea, por supositórios ou outra via. As formulações intravenosas e intramusculares preferentemente administram-se em solução salina esterilizada. Um perito habitual na especialidade pode alterar a formulação dentro dos ensinamentos da memória descritiva para proporcionar numerosas formulações para uma via de administração particular sem fazer com que as composições da presente invenção sejam instáveis ou se comprometa a sua actividade terapêutica. Em particular, uma alteração de um composto determinado para fazer com que seja mais solúvel em água ou outro veículo, por exemplo, pode realizar-se facilmente através de uma modificação rotineira (formulação de sal, esterificação, etc.).
Em determinadas formas de dosagem farmacêuticas, refere-se a forma de pró-fármaco do composto, especialmente incluindo derivados acilados (acetilados ou outros) e derivados éter, ésteres de fosfato e diferentes formas de 19 sal dos presentes compostos. Um perito habitual na especialidade reconhecerá como alterar facilmente o presente composto para proporcionar uma forma de pró-fármaco para facilitar a libertação do composto activo num sitio dirigido dentro do organismo do hospedeiro ou paciente. 0 perito também aproveitará parâmetros farmacocinéticos favoráveis da forma de pró-fármaco, quando aplicável, para libertar o composto desejado num sitio diana dentro do organismo hospedeiro ou paciente para maximizar o efeito pretendido do composto no tratamento de infecções por Flaviviridae (incluindo VHC) . A quantidade de composto incluída dentro de formulações terapeuticamente activas, de acordo com a presente invenção, é uma quantidade eficaz para tratar uma infecção por Flaviviridae (incluindo VHC). Em geral, uma quantidade terapeuticamente eficaz do presente composto em forma de dosagem farmacêutica normalmente varia de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg ou mais, consoante o composto utilizado, a afecção ou infecção tratada e a via de administração. Para a finalidade da presente invenção, uma quantidade profiláctica ou preventivamente eficaz das composições, de acordo com a presente invenção, está dentro do mesmo intervalo de concentrações que foi indicado anteriormente para uma quantidade terapeuticamente eficaz e normalmente é igual que uma quantidade terapeuticamente eficaz. A administração do composto activo pode variar desde administrações contínuas (perfusão intravenosa) a várias administrações orais por dia (por exemplo, Q.I.D., B.I.D., etc.) e pode incluir a administração oral, tópica, parentérica, intramuscular, intravenosa, subcutânea, transdérmica (que pode incluir um agente que potência a penetração), bucal e por supositórios, entre outras vias de administração. Também é possível utilizar comprimidos orais com recobrimento entérico para melhorar a 20 biodisponibilidade e a estabilidade dos compostos desde uma via de administração oral. A forma de dosagem mais eficaz dependerá da farmacocinética do agente particular escolhido, bem como da gravidade da doença no paciente. São particularmente preferidas as formas de dosagem oral, devido à facilidade de administração e à adesão favorável prospectiva do paciente.
Para preparar as composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais dos compostos de acordo com a presente invenção preferentemente é misturada com um veiculo farmaceuticamente aceitável de acordo com técnicas de composição farmacêuticas convencionais para produzir uma dose. Um veiculo pode adquirir uma ampla diversidade de formas consoante a forma de preparação pretendida para a administração, por exemplo, oral ou parentérica. Para preparar composições farmacêuticas em forma de dosagem oral, pode ser utilizado qualquer um dos meios farmacêuticos habituais. Desta forma, para preparações orais líquidas como suspensões, elixires e soluções, podem utilizar-se veículos e aditivos adequados incluindo água, glicóis, óleos, álcoois, agentes aromatizantes, conservantes, agentes corantes e semelhantes. Para preparações orais sólidas como pós, comprimidos, cápsulas e para preparações sólidas como supositórios, podem utilizar-se veículos e aditivos adequados incluindo amidos, veículos de açúcar, como dextrose, manitol, lactose e veículos relacionados, diluentes, agentes de granulação, lubrificantes, aglutinantes, agentes disgregantes e semelhantes. Se desejado, os comprimidos ou cápsulas podem ter um revestimento entérico para a libertação suportada por técnicas convencionais. A utilização destas formas de dosagem pode impactar significativamente sobre a biodisponibilidade dos compostos no paciente.
Para formulações parentéricas, o veículo normalmente 21 compreenderá água esterilizada ou solução aquosa de cloreto de sódio, embora também possam ser incluídos outros ingredientes, incluindo os que ajudam à dispersão. Quando vai ser utilizada água esterilizada e vai se manter esterilizada, as composições e veículos também se devem esterilizar. Também se podem preparar suspensões injectáveis, em cujo caso se podem utilizar veículos líquidos apropriados, agentes de suspensão e semelhantes.
Também podem ser preparadas suspensões lipossomais (incluindo lipossomas dirigidos a antígenos virais) por métodos convencionais para produzir veículos farmaceuticamente aceitáveis. Isto pode ser apropriado para a libertação de nucleosídeos, compostos de acordo com a presente invenção.
Em realizações particularmente preferidas de acordo com a presente invenção, os compostos e composições utilizam-se para tratar, prevenir ou atrasar o início das infecções por Flaviviridae (incluindo VHC). Preferentemente, para tratar, prevenir ou atrasar o início da infecção ou afecção, as composições serão administradas em forma de dosagem oral em quantidades que variam de aproximadamente 250 microgramas até aproximadamente 1 grama ou mais pelo menos uma vez por dia, preferentemente, ou até quatro vezes por dia. Os presentes compostos preferentemente administram-se por via oral, mas se podem administrar por via parentérica, tópica ou em forma de supositórios.
Os compostos de acordo com a presente invenção, devido à sua baixa toxicidade para as células hospedeiras em certos casos, podem utilizar-se vantajosamente de forma profiláctica para prevenir infecções por Flaviviridae (incluindo VHC) ou para prevenir o aparecimento de sintomas clínicos associados com essa infecção ou afecção virai. Desta forma, a presente invenção também inclui compostos para a sua utilização em métodos para o tratamento 22 profiláctico de Flaviviridae (incluindo VHC). Neste aspecto, de acordo com a presente invenção, as presentes composições utilizam-se para prevenir ou atrasar o inicio de uma infecção por Flaviviridae (incluindo VHC). Este método profiláctico compreende a administração a um paciente que necessita desse tratamento, ou que tem risco de desenvolver o vírus ou afecção, de uma quantidade de um composto de acordo com a presente invenção eficaz para aliviar, prevenir ou atrasar o início da infecção ou afecção virai. No tratamento profiláctico de acordo com a presente invenção, prefere-se que o composto antiviral ou antiproliferativo utilizado tenha baixa toxicidade e preferentemente não tenha toxicidade para o paciente. Prefere-se particularmente neste aspecto da presente invenção que o composto que se utilize seja maximamente eficaz contra o vírus ou afecção e apresente um mínimo de toxicidade para o paciente. No caso do Flaviviridae (incluindo VHC), os compostos de acordo com a presente invenção que se podem utilizar para tratar estes estados de doença podem administrar-se dentro do mesmo intervalo de dosagem para o tratamento terapêutico (isto é, de aproximadamente 250 microgramas até 1 grama ou mais de uma a quatro vezes por dia para uma forma de dosagem oral), como agente profiláctico para prevenir a proliferação de um Flaviviridae (incluindo VHC) ou, como alternativa, para prolongar o início de infecções por Flaviviridae (incluindo VHC) que se manifestam em sintomas clínicos.
Além disso, os compostos de acordo com a presente invenção podem ser administrados em combinação ou alternados com um ou mais agentes antivirais, anti-VHB, anti-VHC ou anti-herpéticos ou interferão, agentes anti-cancerigenos ou anti-bacterianos, incluindo outros compostos da presente invenção. Certos compostos de acordo com a presente invenção podem ser eficazes para aumentar a actividade biológica de certos agentes de acordo com a 23 presente invenção ao reduzir o metabolismo, catabolismo ou inactivação de outros compostos e, como tais, são co-administrados para esta finalidade pretendida. A presente invenção é representada adicionalmente nas seguintes secções. A secção de detalhes experimentais e exemplos contidos no presente documento proporcionam-se para ajudar a compreender a invenção. VI. Terapias para o tratamento de infecção por Flaviviridae
Reconheceu-se que após um tratamento prolongado com um agente antiviral podem aparecer variantes de vírus resistentes a fármacos. A resistência a fármacos a maioria das vezes é produzida tipicamente por mutação de um gene que codifica uma enzima utilizada no ciclo de replicação virai e, mais tipicamente no caso de VHC, a ARN polimerase dependente de ARN. Demonstrou-se que a eficácia de um fármaco contra uma infecção virai se pode prolongar, aumentar ou restaurar através da administração do composto em combinação ou alternado com um segundo, e talvez terceiro, composto antiviral que induz uma mutação diferente da provocada pelo fármaco principal. Como alternativa, através dessa terapia de combinação ou alternada podem alterar-se a farmacocinética, bio-distribuição ou outros parâmetros do fármaco. Em geral, a terapia de combinação tipicamente prefere-se relativamente à terapia alternada porque induz múltiplas tensões simultâneas sobre o vírus.
Os exemplos de agentes que foram identificados como activos contra o vírus da hepatite C e, portanto, podem ser utilizados em combinação ou alternados com um ou mais nucleosídeos de fórmula geral (I-a) incluem: (a) Interferão e ribavirina (Battaglia, A. M. et al Ann. Pharmacother. 2000, 34, 487; Berenguer, M. et al, Antivir. Ther. 1998, 3 (Supl. 3), 125); (b) Inibidores da protease NS3 baseados no substrato (Attwood et al, documento PCT WO 98/22496, 1998; 24
Attwood et al., Antiviral Chemistry and Chemotherapy 1999, 10, 259; Attwood et al. Publicação de Patente Alemã de 19914474; Tung et al documento PCT WO 98/17679), incluindo alfacetoamidas e hidrazinoureas, e inibidores que terminam num electrófilo como ácido borónico ou fosfonato (Llinas-Brunet, et al PCT WO 99/07734); (c) Inibidores não baseados em substrato como derivados de 2,4,6-trihidroxi-3-nitro-benzamida (Sudo K., et al, Biochemical and Biophysical Research Communications, 1997, 238, 643 e Sudo K. et al Antiviral Chemistry and Chemotherapy 1998, 9, 186) , incluindo RD3-4082 e RD3-4078, o primeiro substituído na amida com uma cadeia de 14 carbonos e o último processando um grupo para-fenoxifenilo; (d) Derivados de tiazolidina que apresentam uma inibição relevante num ensaio de HPLC de fase inversa com uma proteína de fusão NS3/4A e um substrato NS5A/5B (Sudo K. et al Antiviral Research 1996, 32, 9) especialmente o composto RD-1-6250, que possui um resto de cinamoílo condensado substituído com uma cadeia alquilo longa, RD4 6205 e RD4 6193; (e) Tiazolidinas e benzanilidas identificadas em Kakiuchi N. et al, J. EBS Letters 421, 217 e Takeshita N. et al Analytical Biochemistry 1997, 247, 242; (f) Uma fenantrenoquinona que possui actividade contra a proteasa de VHC num ensaio de SDS-PAGE e auto-radiografia, isolado do meio de cultura de fermentação de Streptomyces sp., Sch 68631 (Chu M. et al Tetrahedron Letters 1996, 37, 7229) e Sch 351633, isolada do fungo Penícillium griscofuluum, que demonstra actividade num ensaio de cintilação por proximidade (Chu M. et al, Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 9, 1949) ; 25 (g) Inibidores selectivos de NS3 baseados na macromolécula elgin C, isolada de sanguessuga (Qasim M.A. et al Biochemistry 1997, 36, 1598); (h) Inibidores da helicase de VHC (Diana G. D. et al, Patente dos Estados Unidos N° 5.633.358 e Diana G. D. et al documento PCT WO 97/36554); (i) Inibidores da polimerase de VHC como análogos de nucleótido, gliotoxina (Ferrari R. et al Journal of Virology, 1999, 73, 1649) e o produto natural cerulenina (Lohmann V. et al Virology 1998, 249, 108) ; (j) Oligodeoxinucleotideos de fosforotioato anti-sentido (S-ODN) complementares pelo menos a uma parte de uma Sequência do VHC (Anderson et al Patente dos Estados Unidos N° 6.174.868) e, em particular, os trechos de Sequência na região 5' não codificante (NCR) (Alt M. et al Hepatology 1995, 22, 707), ou nucleótidos 326-348 que compreendem o extremo 3' do NCR e nucleótidos 371-388 localizados na região codificante do núcleo do ARN de VHC (Alt M. et al Archives of Virology 1997, 142, 589 e Galderisi U. et al, Journal of Cellular Physiology 1999, 81:2151); (k) Inibidores da tradução dependente de IRES (Ikeda N. et al Publicação de Patente Japonesa JP-08268890; Kai Y. et al Publicação de Patente Japonesa JP-10101591); (l) Ribozimas resistentes a nuclease (Maccjak D. J. et al, Hepatology 1999, 30, abstract 995); (m) Amantadina, como rimantadina (Smith, Abstract from Annual Meeting of the American Gastoenterological Association and AASLD, 1996); (n) Quinolonas como ofloxacina, ciprofloxacina e levofloxacina (AASLD Abstracts, Hepatology, Oct. 1994, Program Issue, 20(4), pt. 2, abstract n° 293); 26 (o) Análogos de nucleosídeo (Ismaili et al,
documento WO 01/60315; Storer documento WO 01/32153); incluindo 2'-desoxi-L-nucleosideos (Watanabe et al, documento WO 01/34618), e 1— (β—L— ribofuranosil)-1,2,4-triazol-3-carboxamida (levovirin™) (Tam, documento WO 01/46212) . Por exemplo, o documento WO 01/60315, que está compreendido no estado da especialidade segundo o Art. 54(3) EPC, revela a utilização de 3'- desoxicitidina para o tratamento ou prevenção de uma infecção por Flavivírus. Além disso, o documento WO 02/18404, que está compreendido no estado da especialidade segundo o Art. 54(3) EPC, revela a utilização de F-fluorocitidina para o tratamento da infecção pelo virus da hepatite C. No documento WO 98/18324 descreve-se um protocolo geral para explorar uma biblioteca que contém milhões de análogos de ribonucleosídeo para ensaiar se têm actividade antiviral; (p) Outros compostos diferentes incluindo 1-amino- alquilciclohexanos (Gold et al, Patente dos Estados Unidos N° 6.034.134), alquil lípidos (Chojkier et al, Patente dos Estados Unidos N° 5.922.757), vitamina E e outros antioxidantes (Chojkier et al, Patente dos Estados Unidos N° 5.922.757), escualeno, ácidos biliares (Ozeki et al, Patente dos Estados Unidos N° 5.846.964), ácido N-(fosfonoacetil)-L-aspártico (Diana et al, Patente dos Estados Unidos N° 5.830.905), benzeno dicarboxamidas (Diana et al, Patente dos Estados Unidos N° 5.633.388), derivados de ácido poliadenilico (Wang et al, Patente dos Estados Unidos N° 5.496.546), 2',3'-didesoxiinosina (Yarchoan et al, Patente dos Estados Unidos N° 5.026.687), benzimidazoles (Colacino et al, Patente dos Estados Unidos N° 5.891.874), glucaminas 27 (Mueller et al, documento WO 01/08672), compostos de 1,5-imino-D-glucitol substituídos (Mueller et al, documento WO 00/47198) . vil. Protocolo Sintético
Os compostos de fórmula (I-a) podem sintetizar-se por qualquer meio conhecido na técnica. Em particular, os compostos podem fabricar-se por três rotas diferentes: (a) a partir de um nucleosídeo preformado, (b) condensação de um açúcar modificado ou ribose não modificada com purina ou pirimidina, e (c) combinação das duas rotas. Como a estrutura de 3-desoxi-D-eritropentofuranosa encontra-se no antibiótico nucleosídico, cordicepina, foi informado sobre numerosas sínteses totais deste antibiótico durante os anos 1960 (ver: Lee, w. w. et al J. Am. Chem. Soc., 1961, 83, 1906; Walton, E. et al J. Am. Chem, , Soc., 1964, 86, 2952; Suhadolnik, R. J. et al Carbohydr. Res., 1968, 61, 545; Ikehara, M. et al Chem. Pharm. Buli. , 1967, 15, 94 ; Kaneko, M. et al Chem. Pharm. Buli. 1972, 20, 63). Numa realização preferida da invenção, a preparação de nucleosídeos 3'-desoxi a partir de nucleosídeos preformados é realizada das seguintes formas; A. Compostos de Tipo Ia 28
Esquema 1 28
Um nucleosídeo de D-citidina N4-protegida 1 pode tratar-se com um haleto de ácido, como brometo de acetilo, para dar el 3'-halo-xilo-nucleosídeo correspondente 2. A desacetilação de 2 para dar 3, seguida de des-halogenação redutora, proporciona os derivados de 3'-desoxicitidina pretendidos 4. 0 tratamento de 2 com um ácido, preferentemente ácido acético aquoso em ebulição, dá o nucleosideo de uracilo protegido correspondente 5, que se pode converter facilmente no 3'-bromo-xilo nucleosídeo livre 6a, a partir do qual se podem obter os derivados de 3'-desoxiuridina 6b por desbromação redutora.
Numa realização alternativa para a preparação de nucleosídeos I-a, a 2',5'-di-O-tritylation de um ribonucleosideo da 7 (R2' = R5' = Tr) que se converte nos 3'-O-mesilatos correspondentes 8 (Esquema 2). 0 tratamento de 8 com hidróxido de potássio ou de sódio diluído dé o derivado de xilo correspondente 10 através do nucleosídeo anidro 9 que, após a des-O-tritylation, proporciona 12. A 29 mesilação de 10, seguida de des-O-tritylation, produz o xilo-nucleosídeo de 3'-0-mesilo. Após o tratamento de 8 com brometo de lítio ou iodeto de sódio, forma-se o derivado de 3'-desoxi-3'-halogéneo correspondente 11 através de 9 que, após a des-O- tritylation, seguida de hidrogenólise, se converte no derivado de 3'-desoxiuridina pretendido 6b.
Esquema 2
6b. X - OH (ii) Síntese por condensação de um açúcar apropriado com uma base.
Os derivados de açúcar apropriados deveriam preparar-se para condensação com a base seleccionada. Embora existam vários métodos para a síntese de derivados de 3-desoxi-D-eritropentofuranosa (3-desoxi-D-ribofuranosa) (ver: Lee, W. w. et al J. Am. Chem. Soc. , 1961, 83, 1906; Walton, E. et al J. Am. Chem. Soc., 1964, 86, 2952; Lin, T.-S. et 3.1 J. Med. Chem., 1991 , 34, 693; Ozols, A. M. et al Synthesis, 1980, 557), desenvolveram-se novos métodos para a presente invenção como é apresentado no Esquema 5. 30
Esquema 5 30
A 1,2-0-isopropilideno-5-0-metoxicarbonil-a-D-xilo-furanosa (25) converte-se no derivado de 3-tiocarbonilo correspondente 26, seguido de desoxigenação de radicais livres usando hidreto de trialquilestanho em presença de um iniciador de radicais, como 2,2'- azobisisobutironitrilo. O produto desoxigenado 27 é acilado com uma mistura de ácido acético, anidrido acético e ácido sulfúrico para dar 28, que depois é condensado com uma base siliada utilizando o procedimento de Vorbruggen (ver: Niedballa, U. et al J. Org. Chem., 1976, 41, 2084; Vorbruggen, H. et al Chem. Ber., 1981, 114, 1234; Kazinierczuk, Z. et al J. Am. Chem. Soc., 1984, 106, 6379) para obter o nucleosídeo de pirimidina 29 (Tipo I-a) ou um nucleosídeo de purina relacionado. O grupo 5-OH pode estar protegido, como alternativa, com outros grupos acilo, como benzoílos, p-nitrobenzoílos, p-clorobenzoílos o p-metoxibenzoílos bem como com outros grupos sililo, como grupos t- butildimetilsililo o t-butildifenilo.
Como alternativa, como é apresentado no Esquema 6, a 1,2-0-isopropilideno-5-0-(t-butildifenilsilil)-a-D-xilofuranosa (31) pode estar sulfonilada com cloreto de mesilo, cloreto de tosilo ou cloreto de tresilo em piridina 31 para obter 32. Após a metanólise de 32, o metilo xilósido 33 pode tratar-se com uma base, como metóxido sódico em metanol, para proporcionar o ribo-epóxido 34. A abertura do epóxido 34 com hidreto de lítio e alumínio produz estereoselectivamente o 3-desoxi açúcar 36. 0 tratamento de 34 com brometo de lítio ou ioduro de sódio em acetona ou 2-butanona dá o 3-halogeno-3-desoxi xilósido 35. A des-halogenação redutora de 35 proporciona 36. A retirada do grupo protector de 5'-sililo com uma fonte de iões fluoreto, como fluoreto de tri-n-butilamonio em tetrahidrofurano ou fluoreto ácido de trietilamonio da 37. A acilação de 37 com anidrido acético e ácido acético em presença de ácido sulfúrico da tri-0-acetil-3-desoxi-D-ribofuranosa 38. Além disso, o tratamento com fluoreto converte 33 em 39, que, após a acetilação, proporciona 40. Estes açúcares acetilados 38 e 40 podem condensar-se com bases de pirimidina pertrimetilsililadas utilizando o procedimento de Vorbrueggen para dar o nucleosídeo 3'-modifiçado. O grupo protector de t-butildifenilsililo pode substituir-se pelo grupo t-butildimetilsililo.
Esquema 6
33, R - Η, Ms, Ts 3$, R»T8DP5 3?, R = H (iii) Modificações pós-sintéticas (1-6) (a) Modificação em C-4 de nucleosídeos de pirimidina (I-a) Após a condensação de 28 ou 38 com uracilo ou uracilo 5-substituído, o derivado de 3'-desoxiuridina protegido 32 (29, R5'= CH3OCO, R2' =Ac ou R5'=R2'=Ac) trata-se com pentassulfureto de fósforo em piridina ou reactivo de Lawesson em tolueno para dar o nucleosídeo de 4-tiouracilo 41, que, depois do tratamento com amoníaco, se converte em 3'-desoxicitidina (43, Ri=R2=H) . Como alternativa, a metilação de 41 com iodeto de metilo ou dimetilssulfato numa base dá o derivado de 4-S-metilo 42. 0 deslocamento do grupo 4-S-metilo de 42 com diversos nucleófilos proporciona as 3'-desoxicitidinas N4-substituidas correspondentes 43. Além disso, 29 pode converter-se no derivado de 4-(triazol-2-ilo) 44, que se pode reagir com amoníaco ou diversas aminas para dar 43. Como alternativa, o tratamento de 44 com diversos álcoois ou fenóis proporciona as 3'-desoxiuridinas 4-0-substituidas correspondentes. 32 Esquema 7
0 44 43
Como alternativa, um nucleosídeo de uracilo, como uma uridina protegida com açúcar 45 (R = H) converte-se no 4-(metilimidazolio) 46 (Esquema 8) ou intermédio de 4-0-(2,4,6-triisopropilbencenosulfonilo) 47 e depois é tratado 33 com um nucleófilo, como hidroxilamina, para dar o nucleosídeo modificado em C-4 correspondente, como N4-hidroxi-citidina (48, R = H).
EsquemaS
T *
(b) Modificação em C-5 de nucleosídeos de pirimidina (I-a) (i) Haloqenação (Esquema 9) A 3' -desoxiuridina (6, R = H) pode fluorar-se com agentes de fluoração, dos quais alguns exemplos não limitadores incluem flúor em ácido acético, selectfluor num dissolvente inerte ou dissolventes como tetrahidrofurano ou fluoroxisulfato de césio em álcool (ver: Stovber, S. et al J. Chem. Soc. Chem. Commun., 1983, 563), para dar 5-fluoro-3'-desoxiuridina (49). Os derivados de 5-cloro, 5-bromo e 5-iodouridina (50-52) obtêm-se utilizando a N-halogenosuccinimida apropriada. O tratamento de 6 com bromo 34 em água ou iodo em ácido acético em presencia de um agente de oxidação como ácido nítrico proporciona o nucleosideo de 5-bromo- ou 5-iodo-uracilo, respectivamente. 0 derivado de citosina 43 (R=H) também pode converter-se no derivado de 5-halogéneo correspondente (44-56). A 5-fluoro-3'-desoxicitidina (53, R = H) prepara-se por condensação de 28 ou 38 com 5-fluorocitosina, seguida de saponificação.
Esquema 9
0 Esquema 10 representa a conversão do composto bromado 51 em 5-hidroxi-3'-desoxiuridina (63) por tratamento com uma solução de bicarbonato de sódio. A alquilação de 55 com um iodeto de alquilo com base proporciona 62. A reacção prolongada de 51 com um cianeto de metal alcalino dá o derivado de 5-ciano-uracilo 57, que se pode hidratar para dar a 5-carboxamida 58 e o ácido 5-carboxílico 59. A conversão de 59 num éster alquílico 60, seguida de redução com borohidreto de sódio, produz o derivado de 5-hidroximetilo 61. Como alternativa, o composto 60 pode tratar-se com dihidropirano e uma quantidade catalítica de ácido, como ácido clorídrico, sulfúrico ou p-toluenossulfónico, para produzir o nucleosideo 2', 5'-di-O-protegido 64, e a redução com borohidreto de sódio de 64 proporciona 65. Devido à natureza alílica de 65, o tratamento com cloreto de mesilo 35 ou cloreto de tosilo dá o derivado de 5-clorometil-uracilo 66. 0 tratamento com alcóxido de 66, seguido de desprotecção, dá a 5-alcoximetil-3' -desoxiuridina correspondente (69) . De forma análoga, a reacção de diversas aminas com 66 proporciona 67, que, após a hidrólise com um ácido moderado, se converte em 68. A reacção com 66 e tiourea dá o derivado de mercaptometilo (70, R=H), enquanto o tratamento com mercaptide de sódio dá o derivado de tioalquilo 70 (R = alquilo), que se pode oxidar com peróxido de hidrogénio para dar a sulfona correspondente (71) . 36
Esquema 1Q
(ii) Nitração (Esquema 11) 0 tratamento da uridina 6 com tetrafluoroborato de nitrónio em sulfolano (ver: Huang, G.-F. et al J. Org. Chem., 1977, 42, 3821; Huang, G.-F. et al J. Carbohyd. Nucleosides Nucleotides, 1978, 5, 317) proporciona do derivado de 5-nitro correspondente 72. A hidrogenação catalítica do nitro-nucleosídeo 72 dá o derivado de 5-amino correspondente 73. A diazotização de 73 com ácido nitroso 37 dá a 5-diazo-3'-desoxiuridina (74) que, após a hidrólise, se pode converter no 1,2,3-triazol 75. Informou-se sobre conversões semelhantes de 5-aminouridina em ribosililtriazol (ver: Roberts, M. et al J. Am. Chem. Soc., 1952, 74, 668; Thurber, T. C. et al J. Am. Chem. Soc., 1973, 95, 3081; J. Org. Chem., 1976, 41, 1041). A reacção de 72 com azida de sódio em dimetilformamida proporciona o nucleosideo de triazolopirimidina (8-azapurina) 76.
Esquema 11
No Esquema 12 é apresentada uma sequência semelhante de reacções, partindo de 3'-desoxicitidina 4 para dar a 5-nitro-3'-desoxicitidina (77), seguido da 5-amino-3'-desoxicitidina (78). No entanto, o tratamento de 78 com ácido nitroso dá como resultado a formação de outro nucleosideo de 8-azapurina 79. 38 Esquema 12
o (iii) Hidroximetilação 0 tratamento de 6 (R=H, R5'=R3'=R3"h) com formaldeído numa base como hidróxido de potássio ou hidróxido de sódio aquoso dá a 5-hidroximetil-3'-desoxiuridina (80) como é apresentado no Esquema 13, que se converte em 5-etoximetil-3'-desoxiuridina (81, X = OCH2CH3) por tratamento com cloreto de hidrogénio etanólico. O composto 80 (R5' = R3' = TBDPS) também se pode preparar a partir do derivado de timina 6 (R CH3, R5' = R3' = TBDPS) por bromação fotoquimica para dar 81 (X = Br), seguido de hidrólise (Matulic-Adamic, J. et al Chem. Pharm. Buli., 1988, 36, 1554). O composto 80 converte-se no derivado de 5-clorometilo (81, X = Cl) por acção de ácido clorídrico ou o derivado de 5-fluorometilo (81, X = F) por tratamento com trifluoreto de dietilaminoenxofre (DAST). A oxidação de 80 (R5 ’ = R2' = TBDPS, R3" = H) com dióxido de manganês proporciona o derivado de 5-formilo 82, que é um bom substrato para diferentes reacções, incluindo reacção de Wittig, Wittig-Homer, Grignard ou Reformatsky. Por exemplo, o tratamento de 82 com etoximetileno trifenil-fosforano [EtOC (=0) CH=PPh3] dá o derivado de 5— (2— etoxicarbonil)etileno-3'-desoxiuridina (83), que se pode converter no derivado de 5-etileno-, 5-(2-cloroetileno)- ou 5-(2-bromoetileno)-3'-desoxiuridina (85) através do derivado de 5-(ácido etileno-2-carboxílico) 84. O derivado de 5-difluorometilo 86 pode obter-se por tratamento de 82 com DAST. Estas rotas sintéticas apresentam-se no Esquema 13. 39 Esquema 13
I l
(iv) Metalação
Em tampão aquoso, pode tratar-se 6 ou 4 com acetato de mercúrio, seguido de cloreto de sódio, para dar o derivado de 5-cloromercúrio correspondente 87 ó 91, respectivamente (Esquema 14), com rendimento quantitativo. A reacção de 87 ou 91 com iodo em etanol dá o derivado de 5-iodo 52 ou 56, respectivamente. 0 composto 52 pode converter-se em derivados de 5-etinilo 88 por reacção com 1-alquinos e cloreto de bis(trifenilfosfina)paládio (Ph3P)2PdCl2 em presença de iodeto de cobre e trietilamina. 0 tratamento com trifluoroiodometano e cobre em pó, por outra parte, converte 52 na 5-trifluorometil-3'-desoxiuridina 89. O tratamento de 87 com cloreto de lítio e paládio (Li2PdCl4) e cloreto de alilo proporciona a 5-alil-3'-desoxiuridina (90) . O acrilato de metilo reage com 87 ou 91 em presença de Li2PdCl2 para dar 5-(E)-(2-metoxi-carbonil)vinil-3'-desoxiuridina (83) ou -citidina (92), respectivamente. A saponif icação de 83 para dar 84, seguida de N- halogenosuccinimida produz o nucleosídeo de 5-(£)-halogenoviniluracilo 85 (X=C1, Br ou I) . A descarboxilação 40 térmica de 84 dá o derivado de 5-viniluracilo 85 (X=H) . O composto 85 (X = H) também pode preparar-se por tratamento de 52 com acetato de vinilo em presença de complexo de acetato de paládio-trifenilfosfina. De forma análoga, 91 pode converter-se no derivado de acrilato correspondente 92 que, após a hidrólie para dar 93, se faz reagir com N-halogenosuccinimida para dar 5-(£)-(2-halogenovinil)-3'-desoxicitidinas (94). Deveria apreciar-se que a hidrogenação catalítica de derivados de 5-vinilo dá os nucleosídeos de 5-etil-pirimidina correspondentes. A hidratação de 5-etinil-3'-desoxiuridina (88, R = H) com ácido sulfúrico diluído dá 5-acetil-3'-desoxiuridina com alto rendimento.
Esquema 14
93, R = H (c) Modificação em C-6 de nucleosídeos de pirimidina (I-a ) 41 0 tratamento de 5-bromo-3'-desoxiuridina (51, Esquema 15) com cianeto sódico ou de potássio em dimetilformamide a temperatura ambiente proporciona a 6-ciano-3'-desoxiuridina (95) com alto rendimento. 0 tratamento adicional a temperatura elevada converte 95 em isómero 5-ciano 59. A hidrólise de 95 forma a 3'-desoxiorotidina 96. A metanólise de 95 dá o éster metilico 97 que, após a aminólise, se converte em 98, em que R' é alquilo de cadeia curta de Ci a C6 ou um grupo benzilo ou fenilo. A redução de 97 com borohidreto de sódio proporciona o derivado de 6-hidroximetilo 99, que se converte no nucleosideo de 6-clorometiluracilo 100 por acção de ácido clorídrico. Por reacção com diversas aminas, 100 converte-se na 6-aminometil-3'-desoxiuridina correspondente (101). Uma Sequência semelhante de reacções partindo de 3'-desoxicitidina (55) de ácido 3'-desoxicitidin-6-il-carboxílico (103) ou o seu éster metilico 104 através do intermédio de 6-ciano 102. Podem obter-se diversos nucleosídeos de 6-carboxamidocitosina 105 por tratamento de 104 com as aminas correspondentes. A redução com hidreto de boro de 104 proporciona o derivado de 6-hidroximetilo 104 que pode converter-se na 6-clorometil-3'-desoxicitidina 107 por acção de ácido clorídrico. O composto 107 pode converter-se na 6-aminometil-3'-desoxicitidina correspondente (108) por reacção com diversas aminas. 42
Esquema 15 42
M. R = och3 100, x= α 98, R ® NHR* 191. X = SRfT
55 102 103, R = OH 106, X» OH 104. R = OCW3 107. X - C! 105, R * NHR* 108, X = NR’R"
No Esquema 16 apresenta-se uma derivação adicional. A litiação de nucleosídeos de uracilo e citosina tem lugar em C-6 (ver: Tanaka, H. et al Tetrahedron Lett., 1979, 4755; Sergueeva, Z. A. et al Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 2000, 19, 275) . Portanto, o tratamento de 3'- desoxicitidina totalmente trimetilsiliada (109, R3 = R3 H) com n-butil litio a -45°C, seguido de tratamento com ioduro de metilo ou dióxido de carbono, dá a 6-metil-3'-desoxicitidina (110) ou o ácido 3'-desoxicitidin-6-carboxílico (103), respectivamente.
Esquema 16
110 43 0 tratamento de 2', 5'-di-O-(tetrahidropiran-2-il)-3 ' -desoxiuridina (6, R2' = R5' = THP, R3' = R3" = H) com diisopropilamida de lítio em tetrahidrofurano a -78°C e a reacção posterior com haleto de alquilo dá como resultado a formação de 6-alquil-3'-desoxiuridinas (111). A oxidação de 111 (n = 0) com dióxido de selénio dá o 3'-desoxiuridin-6-carboxaldehído (112), que, após o tratamento com nitrometano em presença de uma base dá o nitroalqueno 113. O composto 112 reage com diferentes reactivos de Wittig para dar as olefinas correspondentes 114-117. Além disso, o tratamento de Grignard de 112 dá os derivados de 6-hidroxialquilo 121. A oxidação de 121 proporciona as derivados de 6-acilo correspondentes 120 (R = alquilo). Por outro lado, 6 litiado (R5' = R2' = THP, R3' = R3" = H) com benzaldeido produz o derivado de 6-hidroxibenzilo 119 que se converte na 6-benzoil-3'-desoxiuridina (120, R=Ph) por oxidação moderada. Além disso, a reacção de 6 litiado com dissulfureto de difenilo proporciona a 6-feniltio-3 desoxiuridina 118, como é apresentado no Esquema 17.
Esquema 17
Os seguintes exemplos de trabalho proporcionam um 44 entendimento adicional do âmbito da presente invenção. Estes exemplos têm fins ilustrativos. Os dissolventes, reactivos ou condições de reacção equivalentes, semelhantes ou adequados podem ser substituídos pelos dissolventes, reactivos ou condições de reacção descritos sem afastar-se do âmbito geral do método.
Os compostos assinalados com um asterisco (*) incluem-se apenas como informação.
EXEMPLOS
Os pontos de fusão foram determinados em tubos de capilaridade abertos num aparelho digital Electrothermal para ponto de fusão e estão sem corrigir. Os espectros de absorção UV foram registados num espectrofotómetro Uvikon 931 (KONTRON) em etanol. Os espectros de RMN de 1H realizaram-se a temperatura ambiente com um espectrómetro Varian Unity Plus 400. Os deslocamentos químicos ocorrem em ppm campo abaixo a partir de tetrametilsilano interno como referência. As experiências de troca de deutério, desacoplamento ou 2D-COSY, realizaram-se com o objectivo de confirmar as atribuições de protões. As multiplicidades dos sinais representam-se por s (singlete), d (doblete), dd (doblete de dobletes), t (triplete), c (cuadruplete), 1 (largura), m (multiplete) . Todos os valores J estão em Hz. Os espectros de massas FAB registaram-se em forma de iões positivos (fab>0) ou negativos (FAB<0) num espectrómetro de massas JEOL DX 300. A matriz foi álcool 3-nitrobenzílico (NBA) ou uma mistura (50:50, v/v) de glicerol e tioglicerol (GT). As rotações específicas foram medidas num espectropolarímetro Perkin-Elmer 241 (comprimento da rota 1 cm) e em unidades de 10”1 grados cm2 g_1. As análises elementares realizaram-se por Atlantic Microlab Inc. (Norcross, GA) . As análises indicadas pelos símbolos dos elementos ou funções estavam dentro de + 0,4% dos valores teóricos. A cromatografia de capa fina realizou-se em placas de gel de sílice Whatman PK5F, realizando-se a 45 visualização dos produtos por absorvância de UV seguido de carbonização com ácido sulfúrico etanólico a 10% e aquecimento. A cromatografia em coluna realizou-se sobre sílica gel (Fisher, S733-1) a presão atmosférica.
Exemplo 1 * 1-(2, 5-DÍ-0-acetil-3-bromo-3-desoxi-$-D-xilofuranosil)- N4-acetilcitosina (2, R = H). A uma suspensão de N4-acetilcitidina (5,7 g, 0,02 mol) em acetonitrilo (300 ml) adicionou-se brometo de acetilo (15 ml, 0,2 mol) durante 30 minutos à temperatura de refluxo. A mistura é aquecida a refluxo durante 4 horas e depois concentrada a secagem em vácuo. O resíduo foi dissolvido em cloreto de metileno (150 ml) e lavado com água (150 ml). A fase orgânica foi seca (Na2S04), evaporada e o resíduo cristalizou em etanol, dando l-(2,5-Di-0-acetil-3-bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil) -N4-acetilcitosina (2, R = H, 3,4 g, 40%), p.f. 179-180°C. RMN 4H (CDC13) δ: 10,2 (s a, 1H, NfíAc) , 8,1 (d, 1H, H-6, J5,6 = 7,5 Hz), 7,5 (d, 1H, H-5, J5,e = 7,5 Hz), 6,0 (d, 1H, H-l',
Ji',2· <1 Hz), 5,5 (d, 1H, H-2', Ji.,2. < 1, J2.,3. = 0 Hz), 4,2 - 4,7 (m, 4H, H-3',4',5',5"), 2,0-2,4 (3s, 9H, 3Ac).
De uma forma semelhante, mas utilizando a citidina N-acetilada correspondente, prepararam-se os seguintes nucleosídeos: * 1- (2,5-Di-0-acetil-3-bromo-3-desoxi^-D-xilofuranosil)-N4-acetil-5-fluorocitosina, * 1-(2, 5-Di-0-acetil-3-bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-N4-acetil-5-clorocitosina, * 1-(2, 5-Di-0-acetil-3-bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-N4-acetil-5-bromocitosina, * 1- (2, 5-Di-0-acetil-3-bromo-3-desoxi^-D-xilofuranosil)-N4-acetil-5-iodocitosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-N4-acetil-5-metilcitosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-bromo-3-desoxi-p-D- 46 xilofuranosil)-N4-acetil-5-etilcitosina, * 1-(2, 5-Di-D-acetil-3-bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-N4-acetil-5-.n-propil citosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-N4-acetil-5-í-propilcitosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-N4-aceti1-5-vinilcitosina, * 1-(2, 5-Di-0-acetil-3-bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-N4-acetil-5-(2-clorovinil)citosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-N4-acetil-5-(2-bromovinil)citosina, * 1-(2, 5-Di-0-acetil-3-bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-N4-acetil-5-(2-iodovinil)citosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-N4-acetil-5-(2-metoxilcarbonil-vinil) citosina, * 1-(2, 5-Di-0-acetil-3-bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-N4-acetil-5-(2-hidroxicarbonil-vinil) citosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-N4-acetil-5-fenileitosina, * 1-(2, 5-Di-0-acetil-3-bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-N4-acetil-5-benzilcitosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-N4-benzoileitosina, * 1-(2, 5-Di-0-acetil-3-bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-N4-benzoil-5-fluorocitosina, * 1-(2, 5-Di-0-acetil-3-bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-N4-benzoil-5-clorocitosina, * 1-(2, 5-Di-0-acetil-3-bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-N4-benzoil-5-bromocitosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-N4-benzoil-5-iodocitosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-N4-benzoil-5-metilcitosina, 47 * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-N4-benzoil-5-etilcitosina, * 1-(2, 5-Di-0-acetil-3-bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-N4-benzoi1-5-n-propileitosina, * 1- (2, 5-Di-0-acetil-3-bromo-3-desoxi^-D-xilofuranosil)-N4-benzoi1-5-í-propileitosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-N4-benzoil-5-vinilcitosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-bromo-3-desoxi^-D-xilofuranosil)-N4-benzoil-5-(2-clorovinil)citosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-N4-benzoil-5-(2 bromovinil)citosina, * 1-(2, 5-Di-0-acetil-3-bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-N4-benzoil-5-(2-iodovinil)citosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-N4-benzoil-5-(2-metoxilcarbonil-vinil)citosina, * 1-(2, 5-Di-0-acetil-3-bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-N4-benzoil-5-(2-hidroxicarbonil-vinil)citosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-N4-benzoil-5-fenileitosina, * 1-(2, 5-Di-0-acetil-3-bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-N4-benzoil-5-benzilcitosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-N4-anisoileitosina, * 1- (2, 5-Di-0-acetil-3-bromo-3-desoxi^-D-xilofuranosil)-N4-anisoil-5-fluorocitosina, * 1-(2, 5-Di-0-acetil-3-bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-N4-anisoil-5-clorocitosina, * 1-(2, 5-Di-0-acetil-3-bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-N4-anisoil-5-bromocitosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-N4-anisoil-5-iodocitosina, * 1-(2, 5-Di-0-acetil-3-bromo-3-desoxi-p-D- 48 xilofuranosil)-N4-anisoil-5-metilcitosina, * 1-(2, 5-Di-0-acetil-3-bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-N4-anisoil-5-etilcitosina, * 1-(2, 5-Di-0-acetil-3-bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil) -N4-anisoil-5-.n-propilcitosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-bromo-3-desoxi^-D-xilofuranosil)-N4-anisoil-5-i-propilcitosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-N4-anisoil-5-vinilcitosina, * 1- (2,5-Di-0-acetil-3-bromo-3-desoxi^-D- xilofuranosil)-N4-anisoil-5-(2-clorovinil)citosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-bromo-3-desoxi^-D-xilofuranosil)-N4-anisoil-5-(2-bromovinil)citosina, * 1- (2, 5-Di-0-acetil-3-bromo-3-desoxi^-D-xilofuranosil)-N4-anisoil-5-(2-iodovinil)citosina, * 1- (2, 5-Di-0-acetil-3-bromo-3-desoxi^-D-xilofuranosil)-N4-anisoil-5-(2-metoxilcarbonilvinil)-citosina, * 1- (2, 5-Di-0-acetil-3-bromo-3-desoxi^-D-xilofuranosil)-N4-anisoil-5-(2-hidroxicarbonil-vinil)-citosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-N4-anisoil-5-fenilcitosina, e * 1-(2, 5-Di-0-acetil-3-bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-N4-anisoil-5-benzilcitosina.
Exemplo 2 * 1 —(2, 5-Di-0-acetil-3-desoxi-fi-D-eritropentofuranosil)-N4-acetilcitosina.
Hidrogenou-se 1-(2,5-di-0-acetil-3-bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-N4-acetilcitosina (2,15 g, 5 mmol) em metanol aquoso a 50% (100 ml) num aparelho Parr em presença de carbonato de cálcio em pó (1 g) e catalisador Pd-BaSCh (0,5 g) à presão inicial de 310,26 kPa (45 psi) . O catalisador é retirado por filtração e a filtragem concentrou-se em vácuo. O resíduo cristalizou-se em etanol, 49 dando 1- (2,5-di-0-acetil-3-desoxi-p-D- eritropentofuranosil)-N4-acetilcitosina (3, R = H, 1,06 g, 60%), p.f. 174-177°C. RMN 4H (CDC13) δ: 10,30 (s a, 1H, NHAc), 8,05 (d, 1H, H-6, J5,6 =7,5 Hz), 7,43 (d, 1H, H-5, J5, 6 = 7,5 Hz), 5,90 (d, 1H, H-l' , Jl',2' = 1,0 Hz), 5,46 (m, 1H, H-2'), 4,30-4,80 (3H, m, H-4', 5',5"), 2,10,2,27 (2s, 9H, 3Ao), 1, 60-2,00 (m, 2H, H-3',3").
De uma forma semelhante, mas utilizando os nucleosídeos de 3'-bromoxilo correspondentes, prepararam-se os seguintes nucleosídeos: * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-N4-benzoilcitosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-N4-benzoil-5-metilcitosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-N4-benzoil-5-etilcitosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-N4-benzoil-5-n-propilcitosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D- eritropentofuranosil)-N4-benzoi1-5-í-propileitosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-N4-benzoil-5-fenileitosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-N4-benzoil-5-benzilcitosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-N4-anisoileitosina, * 1- (2, 5-Di-0-acetil-3-desoxi^-D-eritropentofuranosil)-N4-anisoil-5-metilcitosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-N4-anisoil-5-etilcitosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D- eritropentofuranosil)-N4-anisoil-5-n-propilcitosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D- eritropentofuranosil)-N4-anisoil-5-i-propilcitosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D- 50 eritropentofuranosil)-N4-anisoil-5-fenilcitosina e * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-N4-anisoil-5-benzilcitosina.
Exemplo 3 1-(3-Bromo-3-desoxi-$-xilofuranosil)citosina (3, R = H).
Tratou-se 1-(2,5-di-0-acetil-3-bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-N4-acetilcitosina (4,31 g, 0,01 mol) com amoníaco metanólico saturado (100 ml) a 0°C durante 30 minutos e depois foi concentrado em vácuo a menos de 35°C. O resíduo cristalizou-se em metanol, dando 1-(3-bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)citosina (3, R = H). As UV e RMN ΧΗ (D20) foram coerentes com a estrutura de xilo.
De uma forma semelhante, mas utilizando as citidinas N-aciladas correspondentes, prepararam-se os seguintes nucleosídeos: 1- (3-Bromo-3-desoxi^-D-xilofuranosil) -5-fluorocitosina, * 1-(3-Bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-5- clorocitosina, * 1-(3-Bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-5-bromocitosina, 1- (3-Bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-5-iodocitosina, * 1-(3-Bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-5-metilcitosina, * 1-(3-Bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-5-etilcitosina, * 1-(3-Bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-5-n-propilcitosina, * 1-(3-Bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-5-i-propilcitosina, * 1- (3-Bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil) -5-vinilcitosina, * 1-(3-Bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-5-(2-clorovinil)citosina, * 1-(3-Bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-5-(2- 51 bromovinil)citosina, * 1-(3-Bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-5-(2-iodovinil)citosina, * 1-(3-Bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-5-(2-aminocarbonilvinil)citosina, * 1- (3-Bromo-3-desoxi^-D-xilofuranosil) -5- (2-hidroxicarbonilvinil)citosina, * 1-(3-Bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-5-fenilcitosina e * 1- (3-Bromo-3-desoxi-£-D-xilofuranosil) -5-benzilcitosina.
Exemplo 4 * 3 ' -Desoxicitidina (4, R = H) .
Dissolveu-se 1-(2,5-di-0-acetil-3-desoxi-p-D- eritropentofuranosil)-N4-acetilcitosina (3, R = H, 700 mg, 2 mmol) em amoníaco metanólico (20 ml, saturado a 0°C) e a solução manteve-se durante uma noite a temperatura ambiente. O dissolvente foi retirado por evaporação em vácuo, o resíduo dissolveu-se em etanol (20 ml) e depois o pH da solução foi ajustada a 3 com ácido sulfúrico 2 N. Os precipitados foram recolhidos e cristalizados em água-etanol, dando 3'-desoxicitidina (4) em forma do hemissulfato (408 mg, 74%). P.f. 202-203°C (descomp). RMN 4Η (D20) δ: 8,23 (d, 1H, H-6, J5,6 = 8,0 Hz), 6,27 (d, 1H, H-5, J5,6 = 8,0 Hz), 5,84 (d, 1H, H-l', Jllf2. = 1,0 Hz), 4,6 (m, 1H, H-2 '), 3,9 (m, 3H, H-4 ', 5 ', 5"), 1,95-2,15 (m, 2H, H-2',2 " ) .
De uma forma semelhante, mas utilizando os 3'-desoxinucleosídeos acilados correspondentes, prepararam-se os seguintes nucleosídeos: * 3'-desoxi-5-metilcitidina, * 3'-desoxi-5-etilcitidina, * 3'-desoxi-5-n-propilcitidina, * 3'-desoxi-5-i-propil-citidina, * 3'-desoxi-5-fenilcitidina, e 52 * 3'-desoxi-5-benzilcitidina.
Exemplo 5 * 2',5'-Di-O-acetil-3'-desoxiuridina.
Dissolveu-se 2',5'-di-0-acetil-3-desoxi-N'- acetilcitidina (1,06 g, 3 mol) em ácido acético a 70% e a solução foi aquecida suavemente a refluxo durante uma noite. Após a concentração da mistura em vácuo, o resíduo foi cristalizado em etanol, dando 2',5'-di-O-acetil-3'-desoxiuridina (660 mg, 96%) . O especto de RMN ΧΗ apresentou dois grupos acetilo, dois grupos metileno e dois protões olefínicos.
De uma forma semelhante, mas utilizando as 3'-desoxicitidinas correspondentes (4), prepararam-se as seguintes 2',5'-di-O-acetil-3'-desoxiuridinas: * 2',5'-Di-0-acetil-3-desoxi-5-metiluridina, * 2',5'-di-0-acetil-3-desoxi-5-etiluridina, * 2',5'-di-0-acetil-3-desoxi-5-n-propiluridina, * 2',5'-di-0-acetil-3-desoxi-5-i-propiluridina, * 2',5'-di-0-acetil-3-desoxi-5-feniluridina e * 2',5'-di-0-acetil-3-desoxi-5-benziluridina.
De uma forma semelhante, mas utilizando os nucleosídeos de 3'-desoxicitosina correspondentes (2), prepararam-se os seguintes nucleosídeos de uracilo: * 2',5'-Di-0-acetil-3-desoxi-5-fluorouridina, * 2',5'-Di-0-acetil-3-desoxi-5-clorouridina, * 2',5'-Di-0-acetil-3-desoxi-5-bromouridina, * 2',5'-Di-0-acetil-3-desoxi-5-iodouridina, * 2',5'-Di-0-acetil-3-desoxi-5-metiluridina, * 2',5'-Di-0-acetil-3-desoxi-5-etiluridina, * 2',5'-Di-0-acetil-3-desoxi-5-n-propiluridina, * 2',5'-Di-0-acetil-3-desoxi-5-i-propiluridina, * 2',5'-Di-0-acetil-3-desoxi-5-viniluridina, * 2',5'-Di-0-acetil-3-desoxi-5-(2-clorovinil)uridina, * 2', 5'-Di-0-acetil-3-desoxi-5-(2-bromovinil)uridina, * 2',5'-Di-0-acetil-3-desoxi-5-(2-iodovinil)uridina, 53 * 2',5'-Di-0-acetil-3-desoxi-5-(2-metoxilcarbonilvinil)uridina, * 2 ', 5'-Di-0-acetil-3-desoxi-5-(2-hidroxicarbonilvinil)uridina, * 2',5'-Di-0-acetil-3-desoxi-5-feniluridina e * 2',5'-Di-0-acetil-3-desoxi-5-benziluridina.
Exemplo 6 * 1-(2, 5-Di-0-acetil-3-bromo-3-desoxi-$-D- xilofuranosil)uracilo (5, R = H).
Dissolveu-se 1- (2,5-di-0-acetil-3-bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-N4-acetilcitosina (2, R = H, R' = CH3) (4,31 g, 0,01 mol) em ácido acético a 70% e a solução foi aquecida suavemente a refluxo durante 4 horas. Após a concentração da mistura em vácuo, o resíduo foi cristalizado em etanol, dando 2',5'-di-O-acetil-3'-bromo-3'-desoxiuridina (5, 2,80 g, 91%). O espectro de RMN 4H apresentou dois grupos acetilo, dois grupos metileno e dois protões olefínicos.
De uma forma semelhante, mas utilizando as 2',5'-di-O-acetil-3 '-bromo-3'-desoxi-N4-acilcitidinas correspondentes (2), prepararam-se as seguintes 1,5-di-0-acetil-3'-bromo-3'-desoxiuridinas: * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-5-fluorouracilo, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-5-clorouracilo, * 1- (2, 5-Di-0-acetil-3-desoxi^-D-xilofuranosil) -5-bromouracilo, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-5-iodouracilo, * 1- (2, 5-Di-0-acetil-3-desoxi^-D-xilofuranosil) -5-metiluracilo, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-5-etiluracilo, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-5-n- 54 propiluracilo, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-5-i-propiluracilo, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-5-viniluracilo, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-5- (2-clorovinil)uracilo, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-5-(2-bromovinil)uracilo, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-5-(2-iodovinil)uracilo, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-5-(2-metoxilcarbonilvinil)uracilo, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-5-(2-hidroxicarbonilvinil)uracilo, * 1- (2, 5-Di-0-acetil-3-desoxi^-D-xilofuranosil) -5-feniluracilo e * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-5-benziluracilo.
Exemplo 7 * 3'-Desoxiuridina (6b, R = H).
Dissolveu-se 2',5'-di-0-acetil-3'-desoxiuridina (1,06 g, 3 mol) em amoníaco metanólico (10 ml, saturado a 0°C) durante uma noite. Após a concentração da mistura em vácuo, o resíduo cristalizou-se em etanol, dando a 3'-desoxiuridina (6b, 660 mg, 96%).
De uma forma semelhante, mas utilizando os nucleosídeos de 3'-desoxi-uracilo acilados correspondentes (6b), prepararam-se os seguintes nucleosídeos: 3-Desoxi-5-metiluridina, 3-desoxi-5-etiluridina, 3-desoxi-5-n- propiluridina, 3-desoxi-5-i-propiluridina, 3-desoxi-5- feniluridina, e 3-desoxi-5-benziluridina.
Exemplo 8 * 1-(3-Bromo-3-desoxi-$-D-xilofuranosil) uracilo (6a, R = H) 55
Dissolveu-se 1-(2',5'-di-O-acetil-3'-bromo-3'-desoxi-β-D-xilofuranosil)uracilo (5, R = H) em amoníaco metanólico (10 ml, saturado a 0°C) . Após 1 hora a 0°C, a mistura foi concentrada em vácuo e o resíduo cristalizou-se em etanol, dando 3'-bromo-3'-desoxiuridina (6a, 660 mg, 96%). As UV e RMN :Η foram coerentes com a estrutura.
De uma forma semelhante, mas utilizando os 3'-bromo-xilosiluracilos acilados correspondentes, prepararam-se os seguintes nucleosídeos: * 1-(3-Bromo-3-desoxi-£-D-xilofuranosil)-5-fluorouracilo, * 1-(3-Bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-5-clorouracilo, * 1-(3-Bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-5-bromouracilo, * 1-(3-Bromo-3-desoxi-β-D-xilofuranosil)-5-iodouracilo, * 1-(3-Bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-5-metiluracilo, * 1-(3-Bromo-3-desoxi-β-D-xilofuranosil)-5-etiluracilo, * 1- (3-Bromo-3-desoxi^-D-xilofuranosil) -5-n-propiluracilo, * 1- (3-Bromo-3-desoxi^-D-xilofuranosil) -5-i-propiluracilo, * 1- (3-Bromo-3-desoxi^-D-xilofuranosil) -5-viniluracilo, * 1- (3-Bromo-3-desoxi^-D-xilofuranosil) -5- (2-clorovinil)uracilo, * 1- (3-Bromo-3-desoxi^-D-xilofuranosil) -5- (2-bromovinil)uracilo, * 1- (3-Bromo-3-desoxi^-D-xilofuranosil) -5- (2-iodovinil)uracilo, * 1- (3-Bromo-3-desoxi^-D-xilofuranosil) -5- (2-aminocarbonilvinil)uracilo, 56 * 1-(3-Bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-5-(2-hidroxicarbonilvinil)uracilo, * 1-(3-Bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-5-feniluracilo e * 1- (3-Bromo-3-desoxi^-D-xilofuranosil) -5-benziluracilo.
Exemplo 9 * 2',5'-Di-O-trifenilmetiluridina (7, R = H).
Uma mistura de uridina (24,4 g, 0,1 mol) e trifenilclorometano (83,5 g, 0,3 mol) em piridina anidra (250 ml) foi agitada durante uma noite a temperatura ambiente e depois aquecida a refluxo durante 4 horas. Depois de arrefecer a temperatura ambiente, a mistura foi vertida em água com agitação vigorosa. A água foi retirada por decantação e o resíduo gomoso foi tratado com água, agitado e a água decantada. Este processo repetiu-se várias vezes, depois disto, o resíduo foi tratado com água quente (500 ml) depois foi agitado e a água decantada. Este processo repetiu-se duas vezes. O resíduo dissolveu-se em cloreto de metileno, secou-se (Na2S04) e concentrou-se em vácuo. O resíduo dissolveu-se na quantidade mínima de benzeno, a solução diluiu-se com éter etílico até atingir a turvação e a mistura deixou-se durante uma noite a 15°C. Os precipitados recolheram-se e recristalizaram-se em benzeno-éter etílico, dando 7 (R = H) (22,8 g, 31%), p.f. 224-225°C. Os filtrados combinados foram concentrados e o resíduo dissolveu-se em cloreto de metileno e cromatografiou-se sobre uma coluna de silica gel utilizando cloreto de metileno-etanol (99:1 v/v), (98:2 v/v) e (97:3 v/v) . O composto 7 eluiu primeiro (10 g, 14%), seguido de 3',5'-di-O-trifenilmetiluridina (31,0 g, 42,5%).
De uma forma semelhante, mas utilizando os nucleosídeos correspondentes, prepararam-se os seguintes nucleosídeos 2',5'-di-O-protegidos e 3', 5'-di-O-protegidos: * 2',5'-Di-O-trifenilmetil-5-fluomuridina, 57 * 2',5'-Di-O-trifenilmetil-5-clorouridina, * 2',5'-Di-O-trifenilmetil-5-bromouridina, * 2 ', 5 '-Di-O-trifenilmetil-5-iodouridina, * 2 ', 5 '-Di-O-trifenilmetil-5-metiluridina, * 2 ', 5 '-Di-O-trifenilmetil-5-etiluridina, * 2 ', 5 '-Di-O-trifenilmetil-5-a-propiluridina, * 2',5'-Di-O-trifenilmetil-5-i-propiluridina, * 2 ', 5 '-Di-O-trifenilmetil-5-viniluridina, * 2',5'-Di-O-trifenilmetil-5-etiniluridina, * 2',5'-Di-O-trifenilmetil-5-(2-clorovinil)uridina, * 2',5'-Di-O-trifenilmetil-5-(2-bromovinil)uridina, * 2',5'-Di-O-trifenilmetil-5-(2-iodovinil)uridina, * 2',5'-Di-O-trifenilmetil-5-(2-metoxilcarbonilvinil)uridina, * 2', 5'-Di-O-trifenilmetil-5-(2-hidroxicarbonilvinil)uridina, * 2',5'-Di-O-trifenilmetil-5-feniluridina, * 2',5'-Di-O-trifenilmetil-5-benziluridina, * 3',5'-Di-O-trifenilmetil-5-fluorouridina, * 3',5'-Di-O-trifenilmetil-5-clorouridina, * 3', 5'-Di-O-trifenilmetil-5-bromouridina, * 3',5'-Di-O-trifenilmetil-5-iodouridina, * 3',5'-Di-O-trifenilmetil-5-metiluridina, * 3',5'-Di-O-trifenilmetil-5-etiluridina, * 3',5'-Di-O-trifenilmetil-5-n-propiluridina, * 3',5'-Di-O-trifenilmetil-5-í-propiluridina, * 3',5'-Di-O-trifenilmetil-5-viniluridina, * 3',5'-Di-O-trifenilmetil-5-etiniluridina, * 3',5'-Di-O-trifenilmetil-5-(2-clorovinil)uridina, * 3',5'-Di-O-trifenilmetil-5-(2-bromovinil)uridina, * 3',5'-Di-O-trifenilmetil-5-(2-iodovinil)uridina, * 3',5'-Di-O-trifenilmetil-5-(2-metoxilcarbonilvinil)uridina, * 3',5'-Di-O-trifenilmetil-5-(2-hidroxicarbonilvinil)uridina, 58 * 3',5'-Di-O-trifenilmetil-5-feniluridina e * 3',5'-Di-O-trifenilmetil-5-benziluridina.
Exemplo 10 * 3'-O-Mesil-2 ', 5'-di-O-trifenilmetiluridina (8, R = H). A uma solução arrefecida de 2',5'-di-O-trifenilmetiluridina (7, R = H, 7,28 g, 1 mmol) em piridina (100 ml) foi-lhe adicionado gota a gota cloreto de mesilo (1 ml) e a reacção manteve-se durante uma noite a 4°C. A reacção interrompeu-se através da adição de etanol (5 ml) . Após 2 horas de agitação a temperatura ambiente, a mistura concentrou-se em vácuo. O resíduo triturou-se com etanol (250 ml) e o sólido foi recolhidos e recristalizado em etanol, dando 8 (R = H) (7,45 g, 92%), p.f. 225-226°C.
De uma forma semelhante, mas utilizando os nucleosídeos correspondentes, prepararam-se os seguintes nucleosídeos 2',5'-di-O-trifenilmetilados e 3',5'-di-0-trifenilmetilados: * 3'-O-Mesil-2',5'-di-0-trifenilmetil-5-fluorouridina, * 3'-O-Mesil-2', 5'-di-O-trifenilmetil-5-clorouridina, * 3'-O-Mesil-2',5'-di-O-trifenilmetil-5-bromouridina, * 3'-O-Mesil-2',5'-di-0-trifenilmetil-5-iodouridina, * 3'-O-Mesil-2',5'-di-0-trifenilmetil-5-metiluridina, * 3'-O-Mesil-2',5-di-0-trifenilmetil-5-etiluridina, * 3'-O-Mesil-2',5'-di-0-trifenilmetil-5-n-propiluridina, * 3'-O-Mesil-2',5'-di-0-trifenilmetil-5-i-propiluridina, * 3'-O-Mesil-2',5'-di-O-trifenilmetil-5-viniluridina, * 3'-O-Mesil-2',5'-di-O-trifenilmetil-5-etiniluridina, * 3'-O-Mesil-2',5'-di-O-trifenilmetil-5-(2-clorovinil)uridina, * 3'-O-Mesil-2',5'-di-O-trifenilmetil-5-(2-bromovinil)uridina, * 3'-O-Mesil-2',5'-di-O-trifenilmetil-5-(2-iodovinil)uridina, 59 * 3'-O-Mesil-2',5'-di-O-trifenilmetil-5-(2-metoxilcarbonilvinil)uridina, * 3'-O-Mesil-2', 5'-di-O-trifenilmetil-5-(2-hidroxicarbonilvinil)uridina, * 3'-O-Mesil-2',5'-di-O-trifenilmetil-5-feniluridina, * 3'-O-Mesil-2',5'-di-O-trifenilmetil-5-benziluridina, * 2'-O-Mesil-3',5'-di-O-trifenilmetil-5-fluorouridina, * 2'-O-Mesil-3',5'-di-O-trifenilmetil-5-clorouridina, * 2'-O-Mesil-3', 5'-di-O-trifenilmetil-5-bromouridina, * 2'-O-Mesil-3',5'-di-O-trifenilmetil-5-iodouridina, * 2'-O-Mesil-3',5'-di-O-trifenilmetil-5-metiluridina, * 2'-O-Mesil-3',5'-di-O-trifenilmetil-5-etiluridina, * 2'-O-Mesil-3',5'-di-O-trifenilmetil-5-n-propiluridina, * 2'-O-Mesil-3',5'-di-O-trifenilmetil-5-i- propiluridina, * 2'-O-Mesil-3',5'-di-O-trifenilmetil-5-viniluridina, * 2'-O-Mesil-3',5'-di-0-trifenilmetil-5-etiniluridina, * 2'-O-Mesil-3',5'-di-O-trifenilmetil-5-(2-clorovinil)uridina, * 2'-O-Mesil-3',5'-di-O-trifenilmetil-5-(2-bromovinil)uridina, * 2'-O-Mesil-3',5'-di-O-trifenilmetil-5-(2-iodovinil)uridina, * 2'-O-Mesil-3',5'-di-O-trifenilmetil-5-(2-metoxilcarbonilvinil)uridina, * 2'-O-Mesil-3',5'-di-O-trifenilmetil-5-(2-hidroxicarbonilvinil)uridina, * 2'-O-Mesil-3',5'-di-0-trifenilmetil-5-feniluridina e * 2'-O-Mesil-3',5'-di-0-trifenilmetil-5-benziluridina. Exemplo 11 * 2,3 '-Anidro-1- (2,5-di-0-trifenilmetil-$-D- xilofuranosíl)uracilo (9, R = Η, X' = OH).
Uma mistura de 3'-0-mesil-2',5'-di-O- trif enilmetiluridina (806 mg, 1 mmol) e benzoato de sódio 60 (2 g) em dimetilformamida (40 ml) foi aquecida a 130-140°C durante uma noite. A mistura foi arrefecida a temperatura ambiente e vertida em 1 1 de água com agitação. Os precipitados recolheram-se por decantação e foram triturados com etanol (100 ml), dando 3'-anidro-1-(2,5-di-O-trifenilmetil^-D-xilofuranosil) uracilo (9, R = Η, X' = OH), (500 mg, 75%), p.f. 237°C.
De uma forma semelhante, mas utilizando as 3'-0-mesil-2',5'-di-O-trifenilmetiluridinas 5-substituidas correspondentes (8), prepararam-se os seguintes nucleosídeos 2,3'-anidro-di-O-trifenilmetilados: *2,3'-Anidro-1-(2,5-di-O-trifenilmetil-p-D-xilofuranosil)-5-fluorouracilo, *2,3'-Anidro-1-(2,5-di-O-trifenilmetil-p-D-xilofuranosil)-5-clorouridina, *2,3 '-Anidro-1- (2,5-di-0-t rifenilmetil^-D-xilofuranosil)-5-bromouridina, *2,3'-Anidro-1-(2,5-di-0-trifenilmetil-p-D-xilofuranosil)-5-iodouridina, *2,3'-Anidro-1-(2,5-di-0-trifenilmetil-p-D-xilofuranosil)-5-metiluridina, *2,3'-Anidro-1-(2,5-di-0-trifenilmetil-p-D-xilofuranosil)-5-etiluridina, *2,3'-Anidro-1-(2,5-di-0-trifenilmetil-p-D-xilofuranosil)-5-n-propiluridina, *2,3'-Anidro-1-(2,5-di-0-trifenilmetil-p-D-xilofuranosil)-5-i-propiluridina, *2,3'-Anidro-1-(2,5-di-O-t rifenilmetil^-D-xilofuranosil)-5-viniluridina, *2,3'-Anidro-1-(2,5-di-0-trifenilmetil-p-D-xilofuranosil)-5-etiniluridina, *2,3'-Anidro-1-(2,5-di-0-trifenilmetil-£-D-xilofuranosil)-5-(2-clorovinil)uridina, *2,3'-Anidro-1-(2,5-di-0-trifenilmetil-p-D-xilofuranosil)-5-(2-bromovinil)uridina, 61 *2,3' -Anidro-1-(2,5-di-O-trifenilmetil-p-D-xilofuranosil)-5-(2-iodovinil)uridina, *2,3'-Anidro-1-(2,5-di-O-trifenilmetil-p-D-xilofuranosil)-5-(2-metoxilcarbonilvinil)-uridina, *2,3' -Anidro-1- (2,5-di-O-t rifenilmetil^-D-xilofuranosil)-5-(2-hidroxicarbonilvinil)-uridina, *2,3'-Anidro-1-(2,5-di-O-trifenilmetil-p-D-xilofuranosil)-5-feniluridina e *2,3 '-Anidro-1- (2,5-di-O-t rifenilmetil^-D-xilofuranosil)-5-benziluridina.
De uma forma semelhante, mas utilizando as 2'-0-mesil-3',5'-di-O-trifenilmetiluridinas 5-substituidas correspondentes, prepararam-se os seguintes nucleosideos 2,2'-anidro-3',5'-di-O-trifenilmetilados: *2,2'-Anidro-1-(3,5-di-O-trifenilmetil-p-D-arabinofuranosil)-5-fluorouracilo, *2,2'-Anidro-1-(3,5-di-O-trifenilmetil-β-Ό-arabinofuranosil)-5-clorouridina, *2,2'-Anidro-1-(3,5-di-0-trifenilmetil-p-D-arabinofuranosil)-5-bromouridina, *2,2'-Anidro-1- (3, 5-di-0-trifenilmetil^-D-arabinofuranosil)-5-iodouridina, *2,2'-Anidro-1-(3,5-di-O-trifenilmetίΙ-β-D-arabinofuranosil)-5-metiluridina, *2,2'-Anidro-1-(3,5-di-O-trifenilmetίΙ-β-D-arabinofuranosil)-5-etiluridina, *2,2'-Anidro-1-(3,5-di-O-trifenilmetίΐ-β-ϋ-arabinofuranosil)-5-n-propiluridina, *2,2'-Anidro-1-(3,5-di-O-trifenilmetίΐ-β-ϋ-arabinofuranosil)-5-í-propiluridina, *2,2'-Anidro-1-(3,5-di-O-trifenilmetίΙ-β-D-arabinofuranosil)-5-viniluridina, *2,2' -Anidro-1- (3, 5-di-O-t rifenilmet ϋ-β-D-arabinofuranosil)-5-etiniluridina, *2,2'-Anidro-1-(3,5-di-O-trifenilmetil-p-D- 62 arabinofuranosil)-5-(2-clorovinil)uridina, *2,2'-Anidro-1-(3,5-di-0-trifenilmetil-p-D-arabinofuranosil)-5-(2-bromovinil)uridina, *2,2'-Anidro-1-(3,5-di-0-trifenilmetil-p-D-arabinofuranosil)-5-(2-iodovinil)uridina, *2,2'-Anidro-1-(3,5-di-0-trifenilmetil-p-D-arabinofuranosil)-5-(2-metoxilcarbonilvinil)-uridina, *2,2 '-Anidro-1- (3,5-di-0-trifenilmetil^-D-arabinofuranosil)-5-(2-hidroxicarbonilvinil)-uridina, *2,2'-Anidro-1-(3,5-di-0-trifenilmetil-p-D-arabinofuranosil)-5-feniluridina e *2,2'-Anidro-1-(3,5-di-0-trifenilmetil-p-D-arabinofuranosil)-5-benziluridina.
Exemplo 12 * 3'-Desoxi-3 '-iodo-2', 5'-di-O-trifenilmetiluridina (11, R = Η, X = I, X' = OH) .
Una mistura de 3'-0-mesil-2', 5'-di-O- trifenilmetiluridina (8, 1,61 g, 2 mmol) e ioduro de sódio (3 g, 20 mmol) em 1,2-dimetoxietano (40 ml) aqueceu-se a refluxo durante uma noite. O dissolvente retirou-se por evaporação em vácuo e o resíduo se disssolveu-se em cloreto de metileno. A solução lavou-se sucessivamente com tiossulfato de sódio a 5% e água, secou-se sobre sulfato de sódio e concentrou-se a secagem em vácuo. O resíduo cromatografia-se sobre uma coluna de sílica gel utilizando cloreto de metileno-éter etílico (3:1 v/v) como eluente, dando 703 mg (42%) de 3'-desoxi-3'-iodo-2',5'-di-O-trifenilmetiluridina (11, R = Η, X = I, X' = OH).
De uma forma semelhante, mas utilizando as 3'-0-mesil-2',5'-di-O-trifenilmetiluridinas 5-substituidas correspondentes (8), prepararam-se os seguintes derivados de 3'-iodo: * 3'-Desoxi-3'-iodo-2',5'-di-O-trifenilmetil-5- 63 fluorouridina, * 3'-Desoxi-3'-iodo-2', 5'-di-O-trifenilmetil-5-clorouridina, * 3'-Desoxi-3'-iodo-2', 5'-di-O-trifenilmetil-5-bromouridina, * 3'-Desoxi-3'-iodo-2', 5'-di-O-trifenilmetil-5-iodouridina, * 3'-Desoxi-3'-iodo-2', 5'-di-O-trifenilmetil-5-metiluridina, * 3'-Desoxi-3'-iodo-2', 5'-di-O-trifenilmetil-5-etiluridina, * 3 ' -Desoxi-3 ' -iodo-2 ', 5' -di-O-trifenilmetil-5-.n-propiluridina, * 3'-Desoxi-3'-iodo-2', 5'-di-O-trifenilmetil-5-i-propiluridina, * 3'-Desoxi-3'-iodo-2', 5'-di-O-trifenilmetil-5-viniluridina, * 3'-Desoxi-3'-iodo-2',5'-di-O-trifenilmetil-5-etiniluridina, * 3'-Desoxi-3'-iodo-2',5'-di-O-trifenilmeti1-5-(2-clorovinil)uridina, * 3'-Desoxi-3'-iodo-2',5'-di-O-trifenilmeti1-5-(2-bromovinil)uridina, * 3'-Desoxi-3'-iodo-2',5'-di-o-trifenilmeti1-5-(2-iodovinil)uridina, * 3'-Desoxi-3'-iodo-2',5'-di-O-trifenilmeti1-5-(2-metoxilcarbonilvinil)uridina, * 3'-Desoxi-3'-iodo-2',5'-di-D-trifenilmeti1-5-(2-hidroxicarbonilvinil)uridina, * 3'-Desoxi-3'-iodo-2',5'-di-O-trifenilmetil-5-feniluridina e * 3'-Desoxi-3'-iodo-2',5'-di-0-trifenilmetil-5-benziluridina.
De uma forma semelhante, mas utilizando as 2'-0-mesil-3', 5'-di-O-trifenilmetiluridinas 5-substituidas 64 correspondentes, prepararam-se os seguintes derivados de 2'-iodo: 2'-Desoxi-2'-iodo-3',5'-di-O-trifenilmetil-5-fluorouridina, * 2'-Desoxi-2'-iodo-3',5'-di-O-trifenilmetil-5-clorouridina, * 2'-Desoxi-2'-iodo-3',5'-di-O-trifenilmetil-5-bromouridina, 2'-Desoxi-2'-iodo-3',5'-di-O-trifenilmetil-5-iodouridina, 2'-Desoxi-2'-iodo-3',5'-di-O-trifenilmetil-5-metiluridina, 2'-Desoxi-2'-iodo-3',5'-di-O-trifenilmetil-5-etiluridina, 2'-Desoxi-2'-iodo-3',5',di-trif enilmetil-5-.n-propiluridina, 2'-Desoxi-2'-iodo-3',5'-di-O-trifenilmetil-5-ί-propiluridina, * 2'-Desoxi-2'-iodo-3',5'-di-O-trifenilmetil-5-viniluridina, * 2'-Desoxi-2'-iodo-3',5'-di-0-trifenilmetil-5-etiniluridina, * 2'-Desoxi-2'-iodo-3',5'-di-O-trifenilmeti1-5-(2-clorovinil)uridina, * 2'-Desoxi-2'-iodo-3',5'-di-O-trifenilmeti1-5-(2-bromovinil)uridina, * 2'-Desoxi-2'-iodo-3',5'-di-O-trifenilmeti1-5-(2-iodovinil)uridina, * 2'-Desoxi-2'-iodo-3',5'-di-O-trifenilmeti1-5-(2-metoxilcarbonilvinil)uridina, * 2'-Desoxi-2'-iodo-3',5'-di-O-trifenilmeti1-5-(2-hidroxicarbonilvinil)uridina, * 2'-Desoxi-2'-iodo-3',5'-di-0-trifenilmetil-5-feniluridina e * 2'-Desoxi-2'-iodo-3',5'-di-O-trifenilmetil-5- 65 benziluridina.
Exemplo 13 * 3'-lodo-3'-desoxiuridina.
Dissolveu-se 3'-desoxi-3'-iodo-2', 5'-di-O- trifenilmetiluridina (840 mg, 1 mmol) (11, R=H, X=I, X' = OH) numa mistura 10:1 de cloreto de metileno e ácido trifluoroacético (20 ml) e a mistura manteve-se a temperatura ambiente. O dissolvente retirou-se em vácuo e o resíduo triturou-se com éter etílico (15 ml x 2). O resíduo insolúvel em éter cristalizou-se em metanol éter, dando 3'-iodo-3'-desoxiuridina (312 mg, 88,1%).
De uma forma semelhante, mas utilizando as 3'-desoxi-3'-iodo-2', 5'-di-O-trifenilmetiluridinas 5-substituidas correspondentes, prepararam-se os seguientes derivados de 3'-iodouridina: * 3'-Desoxi-3'-iodo-5-fluorouridina, * 3'-desoxi-3'-iodo-5-clorouridina, * 3'-desoxi-3'-iodo-5-bromo-uridina, * 3'-desoxi-3'-iodo-5-iodouridina, * 3'-desoxi-3'-iodo-5-metil-uridina, * 3'-desoxi-3'-iodo-5-etiluridina, * 3'-desoxi-3'-iodo-5-n-propiluridina, * 3'-desoxi-3'-iodo-5-í-propiluridina, * 3'-desoxi-3'-iodo-5-viniluridina; * 3'- 3'-desoxi-3'-iodo-5-(2-3'-desoxi-3'-iodo-5-(2-3'-desoxi-3'-iodo-5-(2-3'-desoxi-3'-iodo-5-(2-3'-desoxi-3'-iodo-5-(2-3'-desoxi-3'-iodo-5- desoxi-3'-iodo-5-etiniluridina, cloro-vinil)-uridina, * bromovinil)uridina, * iodovinil)uridina, * metoxilcarbonil-vinil)uridina, * hidroxi-carbonil-vinil)-uridina, feniluridina, e * 3'-desoxi-3'-iodo-5-benzil-uridina.
De uma forma semelhante, mas utilizando as 2'-desoxi-2'-iodo-3',5'-di-O-trifenilmetilundinas 5-substituidas correspondentes, prepararam-se os seguintes derivados de 2'-iodouridina: 2'-desoxi-2'-iodo-5-fluorouridina, * 2'- desoxi-2'-iodo-5-clorouridina, * 2'-desoxi-2'-iodo-5-bromo-uridina, 2'-desoxi-2'-iodo-5-iodouridina, 2'-desoxi-2'-iodo-5-metil-uridina, 2'-desoxi-2'-iodo-5-etiluridina, 2'-desoxi-2'-iodo-5-n-propiluridina, 2'-desoxi-2'-iodo-5-i- 66 66 propil-uridina, 2'-desoxi-2'-iodo-5-viniluridina, 2'-desoxi-2'-iodo-5-(2-2'-desoxi-2'-iodo-5-(2-2'-desoxi-2'-iodo-5-(2-2'-desoxi-2'-iodo-5-(2-2'-desoxi-2'-iodo-5-(2-2'-desoxi-2'-iodo-5- desoxi-2'-iodo-5-etiniluridina, clorovinil)-uridina, * bromovinil)uridina, * iodovinil)uridina, * metoxilcarbonilvinil)uridina, * hidroxicarbonil-vinil)-uridina, feniluridina, e * 2'-desoxi-2'-iodo-5-benziluridina. Exemplo 20 * 1, 2-D-lsopropilideno-5-0-metoxicarbonil-3-0- fenoxitiocarboníl-a-D-xilofuranosa (26r R=Ph) . A uma solução de 1,2-0-isopropilideno-5-0-metoxicarbonil-a-O-xilofuranosa (25, 25,0 g, 0,1 mol) e 4-dimetilaminopiridina (25 g,0,2 mol) em piridina seca (250 ml) adicionou-se gota a gota uma solução de clorotionof ormiato de fenilo (50 g, 0,3 mol) em acetonitrilo (100 ml) e a mistura de reacção foi agitada a 50-60°C durante 24 horas. A solução concentrou-se em vácuo e o resíduo dividiu-se entre cloreto de metileno e água. A fase orgânica lavou-se sucessivamente com água, hidróxido sódico 0,1 N, água, ácido clorídrico 0,1 N e água, secou-se sobre sulfato de sódio e concentrou-se em vácuo, dando 26 (R = Ph) em forma de um xarope com rendimento quantitativo (38,2 g). Este xarope utilizou-se directamente na seguinte etapa.
Exemplo 21 *3-Desoxi-l,2-0-isopropilideno-5-0-metoxicarbonil-a-D-eritropentofuranosa (27) .
Uma solução de hidreto de tri-n-butilestanho (58 g, 0,2 mol) em tolueno (300 ml) adicionou-se durante um período de 3 horas a uma solução à temperatura de refluxo do composto 26 (R = Ph) anterior (19,2 g, 50 mmol) e 2,2'-azobisisobutironitrilo (2,5 g, 15 mmol) em tolueno (400 ml). A mistura concentrou-se em vácuo, o resíduo dissolveu-se em acetonitrilo (300 ml) e a solução extraiu-se com éter 67 de petróleo (4 x 100 ml) para retirar os derivados de tri-n-butilestanho. A fase de acetonitrilo concentrou-se. A cromatografia de camada fina do resíduo mostrou uma mancha principal e o espectro de RMN ΧΗ indicou a presença de três grupos metilo e nenhum protão aromático mas sim a contaminação de uma pequena quantidade de derivados de butilestanho. Sem purificação adicional, este produto utilizou-se na seguinte etapa.
Exemplo 22 *1, 2-Di-O-acetil-3-desoxi-5-O-metoxicarbonil-D-eritropentofuranosa (28). A uma solução agitada de 23 (2,32 g, 0,01 mol) numa mistura de ácido acético (60 ml) e anídrido acético (6 ml) adicionou-se gota a gota ácido sulfúrico concentrado (3 ml) com refrigeração com gelo a tal velocidade que a temperatura se manteve a 15-25°C. Após reposar durante uma noite a temperatura ambiente, foi adicionado à solução gelo (250 g) e depois a mistura foi extraída com cloreto de metileno (3 x 50 ml) . Os extractos combinados lavaram-se com uma solução saturada de bicarbonato de sódio (3 x 30 ml), secaram-se sobre sulfato de sódio e concentraram-se em vácuo, dando 28 (2,8 g, 100%) em forma de uma mistura anomérica. Este composto era suficientemente puro para se utilizar na seguinte etapa sem purificação adicional. Exemplo 23 *1-(2-0-acetil-3-desoxi-5-0-metoxicarbonil-$-D-eritropentofuranosil)-5-fluorouracilo (29, X=OH, Z=F).
Uma mistura de 5-fluorouracilo (2,6 g, 0,02 mol) e sulfato de amónio (aprox. 30 mg) em hexametildisilazano (15 ml) aqueceu-se a refluxo até obter uma solução transparente. O dissolvente retirou-se em vácuo e o resíduo dissolveu-se em 1,2-dicloroetano (20 ml) e adicionou-se 1,2-di-0-acetil-3-desoxi-5-0-metoxicarbonil-D-eritropentofuranosa (28, 5,5 g, 0,02 mol) em 1,2- dicloroetano (20 ml). À solução foi adicionado tetracloreto 68 de estanho (5,2 g, 0,02 mol) e a mistura agitou-se durante uma noite a temperatura ambiente e depois foi aquecida a 40-50°C durante 3 horas. Adicionou-se uma solução saturada de bicarbonato de sódio (40 ml) e agitou-se até cessar o desprendimento de dióxido de carbono. A mistura filtrou-se através de uma camada de Celite. A fase orgânica separou-se, lavou-se cuidadosamente com uma solução saturada de bicarbonato de sódio (20 ml x 2) e água (20 ml x 2), secou-se sobre sulfato de sódio e concentrou-se a secagem em vácuo. O resíduo cristalizou-se em etanol, dando 29 (4,3 g, 62%) .
De uma forma semelhante, mas utilizando as bases de pirimidina correspondentes, prepararam-se os seguintes 3'-desoxi-nucleosídeos 2',5'-protegidos: * 1-(2-0-Acetil-3-desoxi-5-0-metoxicarbonil-p-D-eritropentofuranosil)-5-clorouracilo, * 1-(2-0-Acetil-3-desoxi-5-0-metoxicarbonil-p-D-eritropentofuranosil)-5-bromouracilo, * 1-(2-0-Acetil-3-desoxi-5-0-metoxicarbonil-p-D-eritropentofuranosil)-5-iodouracilo, * 1-(2-0-Acetil-3-desoxi-5-0-metoxicarbonil-p-D-eritropentofuranosil)-5-cianouracilo, * 1-(2-0-Acetil-3-desoxi-5-0-metoxicarbonil-p-D-eritropentofuranosil)-5-etoxicarbonil-uracilo, * 1-(2-0-Acetil-3-desoxi-5-0-metoxicarbonil-p-D-eritropentofuranosil)-5-aminocarbonil-uracilo, * 1- (2-0-Acetil-3-desoxi-5-0-metoxicarbonil^-D-eritropentofuranosil)-5-acetiluracilo, * 1-(2-0-Acetil-3-desoxi-5-0-metoxicarbonil-p-D-eritropentofuranosil)-5-metiluracilo, * 1- (2-0-Acetil-3-desoxi-5-0-metoxicarbonil^-D-eritropentofuranosil)-5-etiluracilo, * 1-(2-0-Acetil-3-desoxi-5-0-metoxicarbonil-p-D-eritropentofuranosil)-5-n-propiluracilo, * 1-(2-0-Acetil-3-desoxi-5-0-metoxicarbonil-p-D- 69 eritropentofuranosil)- * 1-(2-0-Acetil-3-desoxi eritropentofuranosil)- * 1-(2-0-Acetil-3-desoxi eritropentofuranosil)- * 1-(2-0-Acetil-3-desoxi eritropentofuranosil)- * 1-(2-0-Acetil-3-desoxi eritropentofuranosil)- * 1-(2-0-Acetil-3-desoxi eritropentofuranosil)- * 1-(2-0-Acetil-3-desoxi eritropentofuranosil)- * 1-(2-0-Acetil-3-desoxi eritropentofuranosil)-vinil)uracilo, * 1-(2-0-Acetil-3-desoxi eritropentofuranosil)-vinil)uracilo, * 1-(2-0-Acetil-3-desoxi eritropentofuranosil)- * 1-(2-0-Acetil-3-desoxi eritropentofuranosil)- * 1-(2-0-Acetil-3-desoxi eritropentofuranosil)- * 1-(2-0-Acetil-3-desoxi eritropentofuranosil)- * 1-(2-0-Acetil-3-desoxi eritropentofuranosil)- * 1-(2-0-Acetil-3-desoxi eritropentofuranosil)- * 1-(2-0-Acetil-3-desoxi eritropentofuranosil)- * 1-(2-0-Acetil-3-desoxi eritropentofuranosil)--i-propiluracilo, 5-0-metoxicarbonil-p-D- -viniluracilo, 5-0-metoxicarbonil-p-D- -aliluracilo, 5-0-metoxicarbonil-p-D- -etiniluracilo, 5-0-metoxicarbonil-p-D- -(2-clorovinil)-uracilo, 5-0-metoxicarbonil-p-D- -(2-bromovinil)-uracilo, 5-0-metoxicarbonil-p-D- -(2-iodovinil)-uracilo, 5-0-metoxicarbonil-p-D- -(2-metoxilcarbonil- 5-0-metoxicarbonil-p-D--(2-hidroxicarbonil- 5-0-metoxicarbonil-p-D- -feniluracilo, 5-0-metoxicarbonil-p-D- -benziluracilo, 5-0-metoxicarbonil-p-D- -fluorocitosina, 5-0-metoxicarbonil-p-D- -clorocitosina, 5-0-metoxicarbonil-p-D- -bromocitosina, 5-0-metoxicarbonil-p-D- -iodocitosina, 5-0-metoxicarbonil-p-D- -cianocitosina, 5-0-metoxicarbonil-p-D- -etoxicarbonil-citosina, 70 * 1-(2-0-Acetil-3-desoxi-5-0-metoxicarbonil-p-D-eritropentofuranosil)-5-aminocarbonil-citosina, * 1-(2-0-Acetil-3-desoxi-5-0-metoxicarbonil-p-D-eritropentofuranosil)-5-acetilcitosina, * 1-(2-0-Acetil-3-desoxi-5-0-metoxicarbonil^-D-eritropentofuranosil)-5-metileitosina, * 1-(2-0-Acetil-3-desoxi-5-0-metoxicarbonil-p-D-eritropentofuranosil)-5-etilcitosina, * 1- (2-0-Acetil-3-desoxi-5-0-metoxicarbonil^-D-eritropentofuranosil)-5-n-propileitosina, * 1-(2-0-Acetil-3-desoxi-5-0-metoxicarbonil-p-D-eritropentofuranosil)-5-i-propileitosina, * 1-(2-0-Acetil-3-desoxi-5-0-metoxicarbonil-p-D-eritropentofuranosil)-5-vinilcitosina, * 1-(2-0-Acetil-3-desoxi-5-0-metoxicarbonil-p-D-eritropentofuranosil)-5-alilcitosina, * 1-(2-0-Acetil-3-desoxi-5-0-metoxicarbonil-p-D-eritropentofuranosil)-5-etinilcitosina, * 1-(2-0-Acetil-3-desoxi-5-0-metoxicarbonil-p-D-eritropentofuranosil)-5-(2-clorovinil)-citosina, * 1-(2-0-Acetil-3-desoxi-5-0-metoxicarbonil-p-D-eritropentofuranosil)-5-(2-bromovinil)-citosina, * 1-(2-0-Acetil-3-desoxi-5-0-metoxicarbonil-p-D-eritropentofuranosil)-5-(2-iodovinil)-citosina, * 1-(2-0-Acetil-3-desoxi-5-0-metoxicarbonil-p-D-eritropentofuranosil)-5-(2-metoxil-carbonilvinil)citosina, * 1-(2-0-Acetil-3-desoxi-5-0-metoxicarbonil-p-D-eritropentofuranosil)-5-(2-hidroxi-carbonilvinil)citosina, * 1-(2-0-Acetil-3-desoxi-5-0-metoxicarbonil-p-D-eritropentofuranosil)-5-fenileitosina e * 1-(2-0-Acetil-3-desoxi-5-0-metoxicarbonil-p-D-eritropentofuranosil)-5-benzilcitosina.
De uma forma semelhante, mas utilizando as bases de 71 pirimidina correspondentes, prepararam-se os seguintes 3'-desoxi-nucleosídeos de 2',5'-di-O-acetilo: * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-clorouracilo, * 1- (2, 5-Di-0-acetil-3-desoxi^-D-eritropentofuranosil)-5-bromouracilo, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-iodouracilo, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi^-D-eritropentofuranosil)-5-cianouracilo, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-etoxicarboniluracilo, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-aminocarboniluracilo, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-acetiluracilo, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-metiluracilo, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-etiluracilo, * 1-(2,5-Di-D-acetil-3-desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-n-propiluracilo, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-í-propiluracilo, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-viniluracilo, * 1- (2, 5-Di-0-acetil-3-desoxi^-D-eritropentofuranosil)-5-aliluracilo, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-etiniluracilo, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-(2-olorovinil)uracilo, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-(2-bromovinil)uracilo, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D- eritropentofuranosil)-5-(2-iodovinil)uracilo, 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-(2-metoxilcarbonilvinil)uracilo, 1- (2, 5-Di-0-acetil-3-desoxi^-D-eritropentofuranosil)-5-(2-hidroxicarbonilvinil)uracilo, 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-feniluracilo, 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-eritropentofuranosil)5-benziluracilo, 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-fluorocitosina, 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-clorocitosina, 1- (2, 5-Di-0-acetil-3-desoxi^-D-eritropentofuranosil)-5-bromocitosina, 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-iodocitosina, 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-cianocitosina, 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-etoxicarbonilcitosina 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-aminocarbonilcitosina 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-acetilcitosina, 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-metileitosina, 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-etilcitosina, 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-n-propileitosina, 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-i-propilcitosina, 73 * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-vinilcitosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-alilcitosina, * 1- (2, 5-Di-0-acetil-3-desoxi^-D-eritropentofuranosil)-5-etinilcitosina, * 1-(2, 5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-(2-clorovinil)citosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi^-D-eritropentofuranosil)-5-(2-bromovinil)citosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-(2-iodovinil)citosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-(2-metoxilcarbonilvinil)citosina, * 1-(2,5-Di-D-acetil-3-desoxi^-D-eritropentofuranosil)-5-(2-hidroxicarbonilvinil)citosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-fenilcitosina, * 1- (2, 5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-benzilcitosina,
Exemplo 25 * 1,2-0-Isopropilideno-5-0-t-butildifenilsilil-u-D- xilofuranosa (31).
Uma mistura de 12-0-isopropilideno-a-D-xilofuranosa (38,0 g, 0,2 mol) , t-butil-difenilclorosilano (70 g, 0,25 mol) e imidazol (21,5 g, 0,4 mol) em N,i\7-dimetilformamida (50 ml) agitou-se a temperatura ambiente durante 1 hora. O dissolvente retirou-se em vácuo e o resíduo dissolveu-se em acetato de etilo (1 1), extraiu-se com água (300 ml x 2) e salmoura (300 ml), secou-se sobre sulfato de sódio e concentrou-se a secagem em vácuo, dando 31 em bruto (86 g, 100%), que se usou directamente na seguinte etapa sem purificação adicional. 74
Exemplo 26 * 1, 2-0-Isopropilideno-3-0-mesil-5-0-t-butildipheny/silil-a-D-xilofuranosa (32, R = Ms).
Adicionou-se gota a gota cloreto de mesilo (17 g, 0,15 mol) a uma solução de 31 em bruto (43 g, 0,1 mol) em piridina (100 ml), e a mistura manteve-se em repouso durante uma noite a temperatura ambiente. À mistura adicionou-se gelo picado (11) e o produto extraiu-se com cloreto de metileno (300 ml x 3). Os extractos combinaram-se, lavaram-se com água (300 ml x 2) e salmoura (300 ml), secaram-se sobre sulfato de sódio e concentraram-se a secagem em vácuo. As quantidades restantes de piridina retiraram-se por destilação azeotrópica repetida com tolueno. O resíduo dissolveu-se em cloreto de metileno (500 ml) e lavou-se com ácido clorídrico 0,1 N (250 ml x 2) e água, secou-se sobre sulfato de sódio e concentrou-se a secagem, dando 32 em bruto (R = Ms), 50,1 g (99%). O espectro de RMN 1H deste material foi suficientemente puro para se utilizar directamente na seguinte etapa.
Exemplo 27 * 3-0-Mesil-5-0-t-butildifenilsilil-D-xilofuranósido de metilo (33, R = Ms).
Uma solução de 32 em bruto (50 g, 0,1 mol) em cloreto ácido Anidroico em metanol a 1% (1 1) manteve-se durante uma noite a temperatura ambiente e depois se evaporou em vácuo, resultando um xarope que foi dividido entre água (100 ml) e cloreto de metileno (150 ml) . A fase orgânica separou-se, lavou-se com água (100 ml), secou-se sobre sulfato de sódio e concentrou-se em vácuo, resultando 33 em bruto, um xarope, que pesaba 48 g (100%). Este material não foi purificado adicionalmente mas sim utilizado directamente na seguinte etapa.
Exemplo 28 * 2,3-Anidro-5-0-t-butildifenilsilil-D-ribofuranósido de metilo (34). 75
Dissolveu-se 33 em bruto (48 g, 0,1 mol) em cloreto de metileno (100 ml) e tratou-se com metóxido de sódio metanólico 2 M (60 ml) e aqueceu-se a refluxo durante 2 horas. O sal insolúvel retirou-se por filtração e a filtragem concentrou-se a secagem em vácuo. O residuo dissolveu-se em cloreto de metileno (150 ml), lavou-se com água (100 ml x 2), secou-se sobre sulfato de sódio e concentrou-se a secagem, dando 30 em bruto (38 g, 100%), que se podia utilizar directamente na seguinte etapa sem purificação.
Exemplo 29 * 3-Desoxi-3-iodo-5-D-i-butildifenilsilil-D-ribofuranósido de metilo (35, X = I).
Uma mistura de 34 (38 g, 0,1 mol), ioduro de sódio (60 g, 0,4 mol), acetato de sódio (0,6 g) e ácido acético (70 ml) em acetona (500 ml) aqueceu-se a refluxo durante 8 horas. A acetona retirou-se em vácuo e o residuo dividiu-se entre cloreto de metileno (500 ml) e água (250 ml) . A fase orgânica separou-se, lavou-se com 250 ml de cada um de água, solução 0,1 M de tiossulfato de sódio e água e secou-se sobre sulfato de sódio. Após retirar o dissolvente em vácuo, o resíduo cristalizou-se em etanol, proporcionando 31 g (60,5%) de 35 (X = I) .
Exemplo 30 * 3-Desoxi-5-0-t-butildifenilsilil-D-eritropentofuranósido de metilo (37, a partir de 35). O composto 35 (X = I, 25,6 g, 0,05 mol) foi hidrogenado em acetato de etilo (250 ml) com paládio a 5% sobre carvão (2 g) . Após cessar o consumo de hidrogénio, a mistura filtrou-se e a filtragem lavou-se com água (150 ml x 2), secou-se sobre sulfato de sódio e concentrou-se a secagem, dando 37 em bruto (19 g, rendimento quantitativo) que era suficientemente puro para se utilizar directamente na seguinte etapa.
Exemplo 31 76 * 3-Desoxi-5-D-i-butildifenilsilil-D-eritropentofuranósido de metilo (36, a partir de 34) .
Uma suspensão de hidreto de lítio e alumínio (8,4 g, 0,2 mol) em éter etílico seco (220 ml) agitou-se numa atmosfera de azoto e arrefeceu-se num banho de gelo. A esta suspensão foi adicionada gota a gota uma solução de 34 (19 g, 0,05 mol) em tetrahidrofurano seco (250 ml) a uma velocidade suficiente para que a temperatura permanecesse inferior a 25°C. Após 2 horas, carregou-se 1 g mais de hidreto de lítio e alumínio, e a mistura agitou-se durante uma noite a temperatura ambiente. A mistura agitada foi arrefecida num banho de gelo e adicionou-se gota a gota isopropanol (100 ml), seguido de acetona (50 ml). A mistura concentrou-se em vácuo e o resíduo dividiu-se entre éter etílico (250 ml) e água (150 ml) . Os materiais insolúveis filtraram-se através de uma camada de Celite que foi lavada com éter. A fase de éter separou-se, lavou-se sucessivamente com ácido clorídrico 0,2 N (150 ml x 2) e água (150 ml x 2), secou-se sobre sulfato de sódio e concentrou-se a secagem, dando 36 em bruto (16,5 g, 87%). Exemplo 32 * 3-Desoxi-D-eritropentofuranósido de metilo (38). A uma solução de 36 em bruto (13 g, 0,03 mol) em tetrahidrofurano (320 ml) adicionou-se gota a gota uma solução 1 M de fluoreto ácido de trietilamonio (100 ml) e a mistura agitou-se durante 24 horas. A mistura concentrou-se em vácuo e o resíduo dissolveu-se em água (200 ml). Adicionou-se carbonato de cálcio em pó (20 g) e a mistura agitou-se durante uma noite a temperatura ambiente e depois foi filtrada. A filtragem concentrou-se em vácuo, resultando um xarope que se dissolveu em cloroformo (200 ml), filtrou-se e evaporou-se em vácuo, proporcionando 38 em bruto (4,5 g, 100%).
Exemplo 33 * 1, 2, 5-Tri-0-acetil-3-desoxi-D-eritropentofuranosa (38). 77 A uma mistura agitada vigorosamente de 3-desoxi-D-eritropentofuranósido de metilo 37 em bruto (4,5 g, 0,03 mol) e ácido acético (80 ml) foi adicionado anídrido acético (40 ml), seguido de ácido sulfúrico (4 ml) w a mistura de reacção agitou-se durante uma noite a temperatura ambiente. A mistura dividiu-se entre cloreto de metileno (150 ml) e gelo-água (400 ml) . A fase de água extraiu-se com cloreto de metileno (100 ml x 2) . As fases orgânicas combinadas lavam-se duas vezes com volumes iguais de uma solução saturada de bicarbonato de sódio, uma vez com água, secaram-se sobre sulfato de sódio e concentraram-se a secagem em vácuo, as quantidades restantes de ácido acético retiraram-se por várias destilações azeotrópicas com tolueno, dando 38 em bruto (5,1 g, 66%). O espectro de RMN 1E mostrou que o constituinte principal deste produto continha 3 grupos acetilo e era o anómero β.
Exemplo 34 * 1-(3-Desoxi-$-D-eritropentofuranosil)-5-fluorouracilo (3'-desoxi-5-fluorouridina, 6b, X = OH, R = F).
Uma mistura de um derivado de acetilo de 39 (X = OH, Z = F, 3,3 g, 0,01 mol) e trietilamina (3 ml) em metanol (100 ml) agitou-se durante uma noite a temperatura ambiente. A mistura concentrou-se a secagem em vácuo e o residuo cristalizou-se em etanol, dando 3'-desoxi-5-fluorouridina (2,0 g, 83%), p.f. 169-171°c. RMN XH (D6-DMSO) δ: 11,7 (s a, 1H, N3-H, intercambiável), 8,44 (d, 1H, H-6, J6,f = 7,1
Hz),5,7 (d, 1H, 2'-OH, intercambiável), 5,5 (m estreito, 1H, H-l'), 5,3 (t, 1H, 5'-OH, intercambiável), 4,1-4,5 (m, 2H, H-2' e H-4'), 3,5-3,9 (m, 2H, H-5',5"), 1,6-2,2 (m, 2H, H-3',3").
De uma forma semelhante, mas utilizando o nucleosideo de 2 ',5 '-di-O-acetilpirimidina correspondente, prepararam-se os seguintes 3'-desoxi-nucleosídeos: * 1-(3-Desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-clorouracilo, 78 * 1-(3-Desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-bromouracilo, * 1-(3-Desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-iodouracilo, * 1-(3-Desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-cianouracilo, * 1-(3-Desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-etoxicarboniluracilo, * 1-(3-Desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-aminocarboniluracilo, * 1-(3-Desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-acetiluracilo, * 1-(3-Desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-metiluracilo, * 1-(3-Desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-etiluracilo, * 1-(3-Desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-n-propiluracilo, * 1-(3-Desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-í-propiluracilo, * 1-(3-Desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-viniluracilo, * 1-(3-Desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-aliluracilo, * 1-(3-Desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-etiniluracilo, * 1-(3-Desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-(2-clorovinil)uracilo, * 1-(3-Desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5- (2-bromovinil)uracilo, * 1-(3-Desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5- (2-iodovinil)uracilo, * 1-(3-Desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5- (2-metoxilcarbonilvinil)uracilo, * 1-(3-Desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5- (2-hidroxicarbonilvinil)uracilo, * 1-(3-Desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-feniluracilo, 79 * 1-(3-Desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-benziluracilo, * 1-(3-Desoxi-p-D-eritropentofuranosil)citosina, * 1-(3-Desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-fluorocitosina, * 1-(3-Desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-clorocitosina, * 1-(3-Desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-bromocitosina, * 1-(3-Desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-iodocitosina, * 1-(3-Desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-cianocitosina, * 1-(3-Desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-etoxicarbonilcitosina, * 1-(3—Desoxi—β—D—eritropentofuranosil)-5-aminocarbonilcitosina, * 1-(3-Desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-metilcitosina, * 1-(3-Desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-metilcitosina, * 1-(3-Desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-etilcitosina, * 1- (3-Desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-n-propilcitosina, * 1-(3-Desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-i-propilcitosina, * 1-(3-Desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-vinilcitosina, * 1-(3-Desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-alilcitosina, * 1-(3-Desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-etinilcitosina, * 1-(3-Desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5- (2-clorovinil)citosina, 80 * 1-(3-Desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-(2-bromovinil)citosina, * 1-(3-Desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5- (2-iodovinil)citosina, * 1- (3-Desoxi^-D-eritropentofuranosil) -5- (2-metoxilcarbonilvinil)citosina, * 1-(3-Desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5- (2-hidroxicarbonilvinil)citosina, * 1-(3-Desoxi-β-D-eritropentofuranosil)-5-fenilcitosina, * 1-(3-Desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-benzilcitosina,
Exemplo 35 * 1- (2, 5-Di-0-acetil-3-0-mesil-$-D-xilofuranosil) -5- fluorouracilo.
Uma mistura de 5-fluorouracilo (0,02 mol) e sulfato de amónio (aprox. 30 mg) em hexametildisilazano (15 ml) aqueceu-se a refluxo até obter uma solução transparente. O dissolvente retirou-se em vácuo, o resíduo dissolveu-se em 1,2-dicloroetano (20 ml) e adicionou-se 1,2,5-tri-O-acetil-3-O-mesil-D-xilofuranosa (5,5 g, 0,02 mol) em 1,2-dicloroetano (20 ml) . À solução adicionou-se tetracloreto de estanho (5,2 g, 0,02 mol) e a mistura agitou-se durante uma noite a temperatura ambiente e depois foi aquecida durante 3 horas a 40-50°C durante 3 horas. Adicionou-se uma solução saturada de bicarbonato sódico (40 ml) e agitou-se até cessar o desprendimento de dióxido de carbono. A mistura filtrou-se através de uma camada de Celite. A fase orgânica separou-se, lavou-se cuidadosamente com uma solução saturada de bicarbonato de sódio (20 ml x 2) e água (20 ml x 2), secou-se sobre sulfato de sódio e concentrou-se a secagem em vácuo. O resíduo cristalizou-se em etanol, resultando o produto do título (62%). O espectro de RMN ΧΗ de cogumelo apresenta que era compatível com a estrutura indicada. 81
De uma forma semelhante, mas utilizando as bases de pirimidina correspondentes, prepararam-se os seguintes xilo-nucleosídeos 2',5'-di-O-acetil 3'-substituídos: * 1- (2,5-Di-0-acetil-3-0-mesil-p-D-xilofuranosil)-5-clorouracilo, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-0-mesil-p-D-xilofuranosil)-5-bromouracilo, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-0-mesil-p-D-xilofuranosil)-5-iodouracilo, * 1-(2, 5-Di-0-acetil-3-0-mesil-p-D-xilofuranosil)-5-cianouracilo, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-0-mesil-p-D-xilofuranosil)-5-etoxicarboniluracilo, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-0-mesil-p-D-xilofuranosil)-5-aminocarboniluracilo, * 1- (2, 5-Di-0-acetil-3-0-mesil^-D-xilofuranosil) -5-acetiluracilo, * 1- (2,5-Di-0-acetil-3-0-mesil-p-D-xilofuranosil) -5-metiluracilo, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-0-mesil-p-D-xilofuranosil)-5-etiluracilo, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-0-mesil-p-D-xilofuranosil)-5-n-propiluracilo, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-0-mesil-p-D-xilofuranosil)-5-i-propiluracilo, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-0-mesil-p-D-xilofuranosil)-5-viniluracilo, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-0-mesil-p-D-xilofuranosil)-5-aliluracilo, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-0-mesil-p-D-xilofuranosil)-5-etiniluracilo, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-0-mesil-p-D-xilofuranosil)-5-(2-clorovinil)uracilo, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-0-mesil-p-D-xilofuranosil)-5-(2-bromovinil)uracilo, 82 * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-0-mesil-p-D-xilofuranosil)-5-(2-iodovinil)-uracilo, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-0-mesil-p-D-xilofuranosil)-5-(2-metoxilcarbonilvinil)uracilo, * 1- (2, 5-Di-0-acetil-3-0-mesil^-D-xilofuranosil) -5-(2-hidroxicarbonilvinil)uracilo, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-0-mesil-p-D-xilofuranosil)-5-feniluracilo, * 1- (2, 5-Di-0-acetil-3-0-mesil^-D-xilofuranosil) -5-benziluracilo, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-0-mesil-p-D-xilofuranosil)-5-fluorocitosina, * 1-(2, 5-Di-0-acetil-3-0-mesil-p-D-xilofuranosil)-5-clorocitosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-0-mesil-p-D-xilofuranosil)-5-bromocitosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-0-mesil-p-D-xilofuranosil)-5-iodocitosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-0-mesil-p-D-xilofuranosil)-5-cianocitosina, * 1-(2, 5-Di-0-acetil-3-0-mesil-p-D-xilofuranosil)-5-etoxicarbonilcitosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-0-mesil-p-D-xilofuranosil)-5-aminocarbonilcitosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-0-mesil-p-D-xilofuranosil)-5-acetilcitosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-0-mesil-β-D-xilofuranosil)-5-metilcitosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-0-mesil-p-D-xilofuranosil)-5-etilcitosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-0-mesil-p-D-xilofuranosil)-5-n propilcitosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-0-mesil-p-D-xilofuranosil)-5-i propilcitosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-0-mesil-p-D-xilofuranosil)-5- 83 vinilcitosina, * 1-(2, 5-Di-0-acetil-3-0-mesil-p-D-xilofuranosil)-alilcitosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-0-mesil-p-D-xilofuranosil)-etinilcitosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-0-mesil-p-D-xilofuranosil) -(2-clorovinil)citosina, * 1-(2, 5-Di-0-acetil-3-D-mesil-p-D-xilofuranosil)-(2-bromovinil)citosina, * 1-(2, 5-Di-0-acetil-3-0-mesil-p-D-xilofuranosil)-(2-iodovinil)citosina, * 1-(2, 5-Di-0-acetil-3-0-mesil-p-D-xilofuranosil)-(2-metoxilcarbonilvinil)citosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-0-mesil-p-D-xilofuranosil)-(2-hidroxicarbonilvinil)citosina, * 1- (2, 5-Di-0-acetil-3-0-mesil^-D-xilofuranosil) -fenilcitosina, * 1-(2, 5-Di-0-acetil-3-0-mesil-p-D-xilofuranosil)-benzilcitosina, * 1-(2, 5-Di-0-acetil-3-0-tosil-p-D-xilofuranosil)-clorouracilo, * 1-(2, 5-Di-0-acetil-3-0-tosil-p-D-xilofuranosil)-bromouracilo, * 1-(2, 5-Di-0-acetil-3-0-tosil-p-D-xilofuranosil)-iodouracilo, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-0-tosil-p-D-xilofuranosil)-cianouracilo, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-0-tosil-p-D-xilofuranosil) -etoxicarboniluracilo, * 1-(2, 5-Di-0-acetil-3-0-tosil-p-D-xilofuranosil)-aminocarboniluracilo, * 1-(2, 5-Di-0-acetil-3-0-tosil-p-D-xilofuranosil)-acetiluracilo, * 1-(2, 5-Di-0-acetil-3-0-tosil-p-D-xilofuranosil)-metiluracilo, 84 * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-0-tosil-p-D-xilofuranosil)-5-etiluracilo, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-0-tosil-p-D-xilofuranosil)-5-n propiluracilo, * 1- (2,5-Di-0-acetil-3-0-tosil-β-D-xilofuranosil)-5-i propiluracilo, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-0-tosil^-D-xilofuranosil)-5-viniluracilo, * 1-(2, 5-Di-0-acetil-3-0-tosil-β-D-xilofuranosil)-5-aliluracilo, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-0-tosil^-D-xilofuranosil)-5-etiniluracilo, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-0-tosil^-D-xilofuranosil)-5-(2-clorovinil)uracilo, * 1- (2, 5-Di-0-acetil-3-0-tosil^-D-xilofuranosil) -5-(2-bromovinil)uracilo, * 1- (2, 5-Di-0-acetil-3-0-tosil^-D-xilofuranosil) -5-(2-iodovinil)uracilo, * 1- (2, 5-Di-0-acetil-3-0-tosil^-D-xilofuranosil) -5-(2-metoxilcarbonilvinil)uracilo, * 1- (2, 5-Di-0-acetil-3-0-tosil^-D-xilofuranosil) -5-(2-hidroxicarbonilvinil)uracilo, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-0-tosil-β-D-xilofuranosil)-5-feniluracilo, * 1- (2, 5-Di-0-acetil-3-0-tosil^-D-xilofuranosil) -5-benziluracilo, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-0-tosil-β-D-xilofuranosil)-5-fluorocitosina, * 1- (2, 5-Di-0-acetil-3-0-tosil^-D-xilofuranosil) -5-clorocitosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-0-tosil-β-D-xilofuranosil)-5-bromocitosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-0-tosil-β-D-xilofuranosil)-5-iodocitosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-0-tosil-β-D-xilofuranosil)-5- 85 cianocitosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-0-tosil-p-D-xilofuranosil)-5-etoxicarbonilcitosina, * 1-(2, 5-Di-0-acetil-3-0-tosil-p-D-xilofuranosil)-5-aminocarbonilcitosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-0-tosil-p-D-xilofuranosil)-5-acetilcitosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-0-tosil-p-D-xilofuranosil)-5-metilcitosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-0-tosil-p-D-xilofuranosil)-5-etilcitosina, * 1- (2,5-Di-0-acetil-3-0-tosil-p-D-xilofuranosil)-5-n propilcitosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-0-tosil-p-D-xilofuranosil)-5-i propilcitosina, * 1- (2, 5-Di-0-acetil-3-0-tosil^-D-xilofuranosil) -5-vinilcitosina, * 1-(2, 5-Di-0-acetil-3-0-tosil-p-D-xilofuranosil)-5-alilcitosina, * 1-(2, 5-Di-0-acetil-3-0-tosil-p-D-xilofuranosil)-5-etinilcitosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-0-tosil-p-D-xilofuranosil)-5-(2-clorovinil)citosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-0-tosil-p-D-xilofuranosil)-5-(2-bromovinil)citosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-0-tosil-p-D-xilofuranosil)-5-(2-iodovinil)citosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-0-tosil-p-D-xilofuranosil)-5-(2-metoxilcarbonilvinil)citosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-0-tosil-p-D-xilofuranosil)-5-(2-hidroxicarbonilvinil)citosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-0-tosil-p-D-xilofuranosil)-5— fenilcitosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-0-tosil-p-D-xilofuranosil)-5-benzilcitosina,
Exemplo 36 * 1-(2, 3, õ-Tri-O-acetil-^-D-xilofuranosil)timina.
Una mistura de timina (0,02 mol) e sulfato de amónio (aprox. 30 mg) em hexametildisilazano (15 ml) aqueceu-se a refluxo até obter uma solução transparente. O dissolvente retirou-se em vácuo, o resíduo dissolveu-se em 1,2-dicloroetano (20 ml) e adicionou-se 1,2,3,5-tri-O-acetil-D-xilofuranosa (5,5 g, 0,02 mol) en 1,2-dicloroetano (20 ml). À solução adicionou-se tetracloreto de estanho (5,2 g, 0,02 mol) e a mistura agitou-se durante uma noite a temperatura ambiente e depois doi aquecida durante 3 horas a 40-50°C. Adicionou-se uma solução saturada de bicarbonato de sódio (40 ml) e agitou-se até cessar o desprendimento de dióxido de carbono. A mistura filtrou-se através de uma camada de Celite. A fase orgânica separou-se, lavou-se cuidadosamente com uma solução saturada de bicarbonato de sódio (20 ml x 2) e água (20 ml x 2), secou-se sobre sulfato de sódio e concentrou-se a secagem em vácuo. O resíduo cristalizou-se em etanol, resultando o produto (4,3 g, 62%). O espectro de RMN ΧΗ desta amostra era compatível com a estrutura indicada.
De uma forma semelhante, mas utilizando as bases de pirimidina e purina correspondentes, prepararam-se os seguintes xilo-nucleosídeos 2',5'-di-O-acetil 3'-substituidos: * 1-(2,3,5-Tri-0-acetil-p-D-xilofuranosil)-5-fluorouracilo, * 1- (2,3, 5-Tri-0-acetil^-D-xilofuranosil) -5-clorouracilo, * 1-(2,3,5-Tri-0-acetil-p-D-xilofuranosil)-5-bromouracilo, * 1- (2, 3, 5-Tri-0-acetil-£-D-xilofuranosil) -5-iodouracilo, * 1- (2, 3, 5-Tri-0-acetil-p-D-xilofuranosil) -5-cianouracilo, 87 * 1-(2,3,5-Tri-0-acetil-p-D-xilofuranosil)-5-etoxicarboniluracilo, * 1-(2,3,5-Tri-0-acetil-p-D-xilofuranosil)-5-aminocarboniluracilo, * 1-(2,3,5-Tri-0-acetil-β-D-xilofuranosil)-5-acetiluracilo, * 1-(2, 3,5-Tri-0-acetil-p-D-xilofuranosil)-5-metiluracilo, * 1- (2, 3, 5-Tri-0-acetil^-D-xilofuranosil) -5-etiluracilo, * 1- (2,3,5-Tri-0-acetil-p-D-xilofuranosil)-5-n-propiluracilo, * 1-(2,3,5-Tri-0-acetil-p-D-xilofuranosil)-5-i-propiluracilo, * 1-(2,3,5-Tri-0-acetil-p-D-xilofuranosil)-5-viniluracilo, * 1-(2,3,5-Tri-0-acetil-p-D-xilofuranosil)-5-aliluracilo, * 1-(2,3,5-Tri-0-acetil-p-D-xilofuranosil)-5-etiniluracilo, * 1-(2,3,5-Tri-0-acetil-p-D-xilofuranosil)-5- (2 clorovinil)uracilo, * 1-(2, 3,5-Tri-0-acetil-p-D-xilofuranosil)-5- (2 bromovinil)uracilo, * 1-(2,3,5-Tri-0-acetil-p-D-xilofuranosil)-5-(2 iodovinil)uracilo, * 1- (2, 3, 5-Tri-0-acetil^-D-xilofuranosil) -5- (2 metoxilcarbonilvinil)uracilo, * 1-(2,3,5-Tri-0-acetil-p-D-xilofuranosil)-5-(2 hidroxicarbonilvinil)uracilo, * 1-(2,3,5-Tri-0-acetil-p-D-xilofuranosil)-5-feniluracilo, * 1-(2,3,5-Tri-0-acetil-p-D-xilofuranosil)-5-benziluracilo, * 1-(2,3,5-Tri-0-acetil-p-D-xilofuranosil)-5- fluorocitosina, * 1- (2, 3, 5-Tri-0-acetil^-D-xilofuranosil) -5-clorocitosina, * 1-(2,3,5-Tri-0-acetil-p-D-xilofuranosil)-5-bromocitosina, * 1-(2, 3,5-Tri-0-acetil-p-D-xilofuranosil)-5-iodocitosina, * 1-(2,3,5-Tri-0-acetil-p-D-xilofuranosil)-5-cianocitosina, * 1-(2,3,5-Tri-0-acetil-p-D-xilofuranosil)-5-etoxicarbonilcitosina, * 1-(2,3,5-Tri-0-acetil-p-D-xilofuranosil)-5-aminocarbonilcitosina, * 1-(2,3,5-Tri-0-acetil-p-D-xilofuranosil)-5-acetilcitosina, * 1-(2,3,5-Tri-0-acetil-β-D-xilofuranosil)-5-metilcitosina, * 1-(2,3,5-Tri-0-acetil-p-D-xilofuranosil)-5-etilcitosina, * 1-(2, 3,5-Tri-0-acetil-p-D-xilofuranosil)-5-n-propilcitosina, * 1-(2,3,5-Tri-0-acetil-p-D-xilofuranosil)-5-i-propilcitosina, * 1-(2,3,5-Tri-0-acetil-p-D-xilofuranosil)-5-vinilcitosina, * 1-(2,3,5-Tri-0-acetil-p-D-xilofuranosil)-5-alilcitosina, * 1-(2,3,5-Tri-0-acetil-p-D-xilofuranosil)-5-etinilcitosina, * 1-{2, 3,5-Tri-0-acetil-p-D-xilofuranosil)-5-(2 clorovinil)citosina, * 1-(2,3,5-Tri-0-acetil-p-D-xilofuranosil)-5-(2 bromovinil)citosina, * 1-(2, 3,5-Tri-0-acetil-p-D-xilofuranosil)-5-(2 metoxilcarbonilvinil)citosina, * 1-(2,3,5-Tri-0-acetil-p-D-xilofuranosil)-5-fenilcitosina,
Exemplo 37 1 -(3-Desoxi-3-0-mesil-$-D-xilofurãnosil)-5-fluorouracilo.
Uma mistura de 1-(2,5-di-0-acetil-3-0-mesil^-D- xilofuranosil)-5-fluorouracilo (4,24 g, 0,01 mol) em amoníaco metanólico (100 ml) agitou-se durante 30 minutos a 0°C, concentrou-se a secagem em vácuo e o resíduo cristalizou-se em etanol, dando 1- (3-desoxi-3-0-mesil^-D-xilofuranosil)-5-fluorouracilo (2,82 g, 83%). A RMN (D6-DMSO) mostrou que mão havia nenhum grupo acetilo mas sim um grupo mesilo na molécula.
De uma forma semelhante, mas utilizando os nucleosideos de 2',5'-di-O-acetilpirimidina correspondentes, prepararam-se os seguintes 3'-0-mesil- nucleosideos: * 1- (3-0-Mesil-p-D-xilofuranosil) -5-clorouracilo, * 1-(3-0-Mesil-p-D-xilofuranosil)-5-bromouracilo, * 1-(3-0-Mesil-p-D-xilofuranosil)-5-iodouracilo, * 1-(3-0-Mesil-p-D-xilofuranosil)-5-cianouracilo, * 1-(3-0-Mesil-p-D-xilofuranosil)-5-etoxicarboniluracilo, * 1-(3-0-Mesil-p-D-xilofuranosil)-5-aminocarboniluracilo, * 1-(3-0-Mesil-p-D-xilofuranosil)-5-acetiluracilo, * 1-(3-0-Mesil-p-D-xilofuranosil)-5-metiluracilo, * 1- (3-0-Mesil^-D-xilofuranosil) -5-etiluracilo, * 1-(3-0-Mesil-p-D-xilofuranosil)-5-n-propiluracilo, * 1-(3-0-Mesil-p-D-xilofuranosil)-5-í-propiluracilo, * 1-(3-0-Mesil-p-D-xilofuranosil)-5-viniluracilo, * 1-(3-0-Mesil-β-D-xilofuranosil)-3-aliluracilo, * 1-(3-0-Mesil-p-D-xilofuranosil)-5-etiniluracilo, * 1-(3-0-Mesil-p-D-xilofuranosil)-5- (2-clorovinil)uracilo, * 1- (3-0-Mesil^-D-xilofuranosil) -5- (2- 90 bromovinil)uracilo, * 1-(3-0-Mesil-p-D-xilofuranosil)-5-(2-iodovinil)uracilo, * 1-(3-0-Mesil-p-D-xilofuranosil)-5-(2-metoxilcarbonilinil)uracilo, * 1-(3-0-Mesil-p-D-xilofuranosil)-5-(2-hidroxicarbonilvinil)uracilo, * 1-(3-0-Mesil-p-D-xilofuranosil)-5-feniluracilo, * 1- (3-0-Mesil^-D-xilofuranosil) -5-benziluracilo, * 1-(3-0-Mesil-p-D-xilofuranosil)citosina, * 1-(3-0-Mesil-p-D-xilofuranosil)-5-fluorocitosina, * 1-(3-0-Mesil-p-D-xilofuranosil)-5-clorocitosina, * 1-(3-0-Mesil-p-D-xilofuranosil)-5-bromocitosina, * 1-(3-0-Mesil-p-D-xilofuranosil)-5-iodocitosina, * 1-(3-0-Mesil-p-D-xilofuranosil)-5-cianocitosina, * 1-(3-0-Mesil-β-D-xilofuranosil)-5-etoxicarbonilcitosina, * 1-(3-0-Mesil-p-D-xilofuranosil)-5-aminocarbonilcitosina, * 1-(3-0-Mesil-p-D-xilofuranosil)-5-acetilcitosina, * 1-(3-0-Mesil-p-D-xilofuranosil)-5-metilcitosina, * 1-(3-0-Mesil-p-D-xilofuranosil)-5-etilcitosina, * 1-(3-0-Mesil-p-D-xilofuranosil)-5-u-propilcitosina, * 1-(3-0-Mesil-p-D-xilofuranosil)-5-i-propilcitosina, * 1-(3-0-Mesil-p-D-xilofuranosil)-5-vinilcitosina, * 1-(3-0-Mesil-p-D-xilofuranosil)-5-alilcitosina, * 1- (3-0-Mesil^-D-xilofuranosil) -5-etinilcitosina, * 1-(3-0-Mesil-p-D-xilofuranosil)-5-(2-clorovinil)citosina, * 1-(3-0-Mesil-p-D-xilofuranosil)-5- (2-bromovinil)citosina, * 1-(3-0-Mesil-p-D-xilofuranosil)-5- (2-iodovinil)citosina, * 1-(3-0-Mesil-p-D-xilofuranosil)-5-(2-metoxilcarbonilvinil)citosina, 91 * 1- (3-0-Mesil^-D-xilofuranosil) -5- (2-hidroxicarbonilvinil)citosina, * 1-(3—Ο-ΜβείΙ-β-ϋ—xilofuranosil)-5-fenilcitosina, * 1-(3-0-Mesil-p-D-xilofuranosil)-5-benzilcitosina, Exemplo 38 1 —($-D-Xilofuranosil)-5-fluorouracilo.
Uma mistura de 1-(2,3,5-tri-0-acetil-p-D- xilofuranosil)-5-fluorouracilo (3,88 g, 0,01 mol) e trietilamina (3 ml) em metanol (100 ml) agitou-se durante uma noite a temperatura ambiente. A mistura concentrou-se a secagem em vácuo e o resíduo cristalizou-se em etanol, dando 1-(β-D-xilo-furanosil)-5-fluorouracilo (2,0 g, 76%). Os espectros de UV e RMN 1H (Me2SO-d6) desta amostra foram coerentes com a estrutura do produto.
De uma forma semelhante, mas utilizando as bases de 2',5'-di-O-acetil pirimidina e purina correspondentes, prepararam-se os seguintes xilo-nucleosídeos: * 1-(β-D-Xilofuranosil)-5-clorouracilo, * 1-(β-D-Xilofuranosil)-5-bromouracilo, * 1-(β-D-Xilofuranosil)-5-iodouracilo, * 1-(β-D-Xilofuranosil)-5-cianouracilo, * 1-(β-D-Xilofuranosil)-5-etoxicarboniluracilo, * 1-(β-D-Xilofuranosil)-5-aminocarboniluracilo, * 1-(β-D-Xilofuranosil)-5-acetiluracilo, * 1-(β-D-Xilofuranosil)-5-metiluracilo, * 1-(β-D-Xilofuranosil)-5-etiluracilo, * 1-(β-D-Xilofuranosil)-5-n-propiluracilo, * 1-(β-D-Xilofuranosil)-5-í-propiluracilo, * 1-(β-D-Xilofuranosil)-5-viniluracilo, * 1-(β-D-Xilofuranosil)-5-aliluracilo, * 1-(β-D-Xilofuranosil)-5-etiniluracilo, * 1-(β-D-Xilofuranosil)-5-(2-clorovinil)uracilo, * 1-(β-D-Xilofuranosil)-5-(2-bromovinil)uracilo, * 1-(β-D-Xilofuranosil)-5-(2-iodovinil)uracilo, * 1-(β-D-Xilofuranosil)-5-(2- 92 metoxilcarbonilvinil)uracilo, * 1-(β-D-Xilofuranosil)-5-(2-hidroxicarbonilvinil)uracilo, * 1-(β-D-Xilofuranosil)-5-feniluracilo, * 1-(β-D-Xilofuranosil)-5-benziluracilo, * 1-(β-D-Xilofuranosil)citosina, * 1-(β-D-Xilofuranosil)-5-fluorocitosina, * 1-(β-D-Xilofuranosil)-5-clorocitosina, * 1-(β-D-Xilofuranosil)-5-bromocitosina, * 1-(β-D-Xilofuranosil)-5-iodocitosina, * 1-(β-D-Xilofuranosil)-5-cianocitosina, * 1-(β-D-Xilofuranosil)-5-etoxicarbonilcitosina, * 1-(β-D-Xilofuranosil)-5-aminocarbonilcitosina, * 1-(β-D-Xilofuranosil)-5-acetilcitosina, * 1- (β-D-Xilofuranosil)-5-metilcitosina, * 1-(β-D-Xilofuranosil)-5-etilcitosina, * 1-(β-D-Xilofuranosil)-5-n-propilcitosina, * 1- (β-D-Xilofuranosil)-5-i-propilcitosina, * 1-(β-D-Xilofuranosil)-5-vinilcitosina, * 1-(β-D-Xilofuranosil)-5-alilcitosina, * 1-(β-D-Xilofuranosil)-5-etinilcitosina, * 1-(β-D-Xilofuranosil)-5-(2-clorovinil)citosina, * 1-(β-D-Xilofuranosil)-5-(2-bromovinil)citosina, * 1-(β-D-Xilofuranosil)-5-(2-iodovinil)citosina, * 1-(β-D-Xilofuranosil)-5-(2-metoxilcarbonilvinil)citosina, * 1-(β-D-Xilofuranosil)-5-(2-hidroxicarbonilvinil)citosina, * 1-(β-D-Xilofuranosil)-5-fenilcitosina, * 1- (β-D-Xilofuranosil)-5-benzilcitosina,
Exemplo 39 * 2 ',3 ' -O-Isopropilideno-5'-O-trifenilmetil-N4- hidroxicitidina. A uma solução agitada de 2',3'-0-isopropilideno-5-0-trifenilmetiluridina (1 g) en 50 ml de acetonitrilo Anidro 93 e trietilamina (0,76 g) adicionou-se cloreto de 2,4,6-triisopropilbencenosulfonilo (1,15 g) e DMAP (232 mg) a 0°C e a mistura de reacção agitou-se durante 1 dia a temperatura ambiente. Depois, foi adicionado cloridrato de hidroxilamina (263 mg) e a mistura agitou-se adicionalmente durante 1 dia a temperatura ambiente. A reacção interrompeu-se mediante a adição de água e o produto extraiu-se com cloroformo (200 ml). A fase orgânica lavou-se com salmoura, secou-se sobre MgS04 e concentrou-se em vácuo. O resíduo purificou-se por cromatografia em coluna sobre sílica gel (MeOH a 5% em CHC13), dando 2',3'-0-isopropilideno-5'-0-tritil-N4-hidroxicitidina (723 mg, 70%) em forma de um sólido branco. P.f.: 99-101°C. RMN ΧΗ (CDC13) δ 1,34 (s, 3H), 1,56 (s, 3H), 3, 40-3, 73 (m, 2H), 4,26 (s a, 1H), 4,79-4,81 (m, 2H) , 5,34 (d, J = 8,12 Hz, 1H), 5,88 (s a, 1H), 6,88 m(d, J = 8,12 Hz, 1H), 7,22-7,41 (m, 15H).
De uma forma semelhante, mas utilizando os nucleosídeos de uracilo 5-substituidos correspondentes, sintetizaram-se os seguintes derivados de N4-hidroxi-2',3'-O-isopropilideno-5'-O-trifenilmetilcitidina: * 2',3'-O-lsapropilideno-5'-O-trifenilmetil-5-fluoro-N4-hidroxicitidina, * 2',3'-O-lsopropilideno-5'-O-trifenilmetil-5-cloro-N4-hidroxicitidina, * 2',3'-O-Isopropilideno-5'-O-trifenilmetil-5-bromo-N4-hidroxicitidina, * 2',3'-O-Isopropilideno-5'-O-trifenilmetil-5-iodo-N4-hidroxicitidina, * 2',3'-O-Isopropilideno-5'-O-trifenilmetil-5-metil-N4-hidroxicitidina, * 2',3'-O-Isopropilideno-5'-O-trifenilmetil-5-etil-N4-hidroxicitidina, * 2',3'-O-Isopropilideno-5'-O-trif enilmetil-5-.n-propil-N4-hidroxicitidina, 94 * 2',3'-O-Isopropilideno-5'-O-trifenilmetil-5-i-propil-N4-hidroxicitidina, * 2 ', 3 '-O-Isopropilideno-5'-O-trifenilmetil-5-vinil-N4-hidroxicitidina, * 2 ', 3 '-O-Isopropilidenc-5'-0-trifenilmetil-5-etinil-N4-hidroxicitidina, * 2',3'-O-Isopropilideno-5'-O-trifenilmetil-5-(2-clorovinil)-N4-hidroxicitidina, * 2',3'-O-Isopropilideno-5'-O-trifenilmetil-5-(2-bromovinil)-N4-hidroxicitidina, * 2 ', 3 '-O-Isopropilideno-5'-O-trifenilmetil-5-(2-iodovinil)-N4-hidroxicitidina, * 2', 3'-O-Isopropilideno-5'-O-trifenilmetil-5- (2-metoxicarbonilvinil)-N4-hidroxicitidina, * 2 ', 3 '-O-Isopropilideno-5'-O-trifenilmetil-5-(2-hidroxicarbonilvinil)-N4-hidroxicitidina, * 2', 3'-O-Isopropilideno-5'-O-trifenilmetil-5-fenil-N4-hidroxicitidina e * 2 ', 3 '-O-Isopropilidane-5'-O-triphcnyhnetil-5-benzil-N4-hidroxicitidina.
De uma forma semelhante, mas utilizando as 2',5'-di-0-acetil-3'-desoxiuridinas 5-substituidas correspondentes, sintetizaram-se os seguintes derivados de N4-hidroxi-2',5'-di-O-acetil-3'-desoxicitidina: * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-N4-hidroxicitosina, * 1- (2, 5-Di-0-acetil-3-desoxi^-D-eritropentofuranosil)-5-fluoro-N4-hidroxieitosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-cloro-N4-hidroxicitosina, * 1- (2, 5-Di-0-acetil-3-desoxi^-D-eritropentofuranosil)-5-bromo-N4-hidroxicitosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-bromo-N4-hidroxicitosina, * 1-(2, 5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D- eritropentofuranosil)-5-ciano-N4-hidroxicitosina, 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-etoxicarbonil-N4-hidroxicitosina, 1- (2, 5-Di-0-acetil-3-desoxi^-D-eritropentofuranosil)-5-aminocarbonil-N4-hidroxicitosina, 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D- eritropentofuranosil)-5-acetil-N4-hidroxicitosina, 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D- eritropentofuranosil)-5-metil-N4-hidroxicitosina, 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D- eritropentofuranosil)-5-etil-N4-hidroxicitosina, 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D- eritropentofuranosil)-5-n-etil-N4-hidroxicitosina, 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi^-D- eritropentofuranosil)-5-í-propil-N4-hidroxicitosina 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D- eritropentofuranosil)-5-vinil-N4-hidroxicitosina, 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D- eritropentofuranosil)-5-alil-N4-hidroxicitosina, 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D- eritropentofuranosil)-5-etinil-N4-hidroxicitosina, 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-(2-clorovinil)-N4-hidroxicitosina, 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi^-D-eritropentofuranosil)-5-(2-bromovinil)-N4-hidroxicitosina, 1- (2, 5-Di-0-acetil-3-desoxi^-D-eritropentofuranosil)-5-(2-iodovinil)-N4-hidroxicitosina, 1- (2, 5-Di-0-acetil-3-desoxi^-D- eritropentofuranosil)-5-(2-metoxilcarbonilvinil)-N4 hidroxicitosina, 96 * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-(2-hidroxicarbonilvinil)-N4-hidroxicitosina, * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-fenil-N4-hidroxicitosina e * 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-5-benzil-N4-hidroxicitosina,
De uma forma semelhante, mas utilizando as 3',5'-di-0-acetil-2'-desoxiuridina 5-substituída correspondente, sintetizaram-se os seguintes derivados de N4-hidroxi-3', 5'-di-0-acetil-N4-hidroxi-2'-desoxicitidina: * 3', 5'-Di-O-acetil-2'-desoxi-N4-hidroxicitidina, * 3', 5'-Di-O-acetil-2'-desoxi-5-fluoro-N4-hidroxicitidina, * 3',5'-Di-O-acetil-2'-desoxi-5-cloro-N4-hidroxicitidina, * 3',5'-Di-O-acetil-2'-desoxi-5-bromo-N4-hidroxicitidina, * 3', 5'-Di-O-acetil-2'-desoxi-5-iodo-N4-hidroxicitidina * 3', 5'-Di-O-acetil-2'-desoxi-5-ciano-N4-hidroxicitidina, * 3',5'-Di-O-acetil-2'-desoxi-5-etoxicarbonil-N4-hidroxicitidina, * 3 ',5'-Di-O-acetil-2'-desoxi-5-aminocarbonil-N4-hidroxicitidina, * 3', 5'-Di-O-acetil-2'-desoxi-5-acetil-N4-hidroxicitidina, * 3', 5'-Di-O-acetil-2'-desoxi-5-metil-N4-hidroxicitidina, * 3',5'-Di-O-acetil-2'-desoxi-5-etil-N4-hidroxicitidina * 3',5'-Di-O-acetil-2'-desoxi-5-n-propil-N4-hidroxicitidina, * 3', 5'-Di-O-acetil-2'-desoxi-5-í-propil-N4-hidroxicitidina, * 3',5'-Di-O-acetil-2'-desoxi-5-vinil-N4- 97 hidroxicitidina, * 3', 5'-Di-O-acetil-2'-desoxi-5-alil-N4-hidroxicitidina, * 3 ', 5 '-Di-O-acetil-2'-desoxi-5-etinil-N4-hidroxicitidina, * 3 ', 5 '-Di-O-acetil-2'-desoxi-5-(2-clorovinil)-N4-hidroxicitidina, * 3 ', 5 '-Di-O-acetil-2'-desoxi-5-(2-bromovinil)-N4-hidroxicitidina, * 3', 5'-Di-O-acetil-2'-desoxi-5-(2-iodovinil)-N4-hidroxicitidina, * 3 ', 5 '-Di-O-acetil-2'-desoxi-5-(2-metoxilcarbonilvinil)-N4-hidroxicitidina, * 3 ', 5 '-Di-O-acetil-2'-desoxi-5-(2-hidroxicarbonilvinil)-N4-hidroxicitidina * 3 ', 5 '-Di-O-acetil-2'-desoxi-5-fenil-N4-hidroxicitidina e * 3 ', 5 '-Di-O-acetil-2'-desoxi-5-benzil-N4-hidroxicitidina.
Exemplo 40 * N4-Hidroxicitidina.
Dissolveu-se 2 ',3 ' -O-isopropilideno-5'-O-tritil-N4-hidroxicitidina (500 mg, 0,92 mmol) em 50 ml de uma mistura de ácido trifluoroacético e água (2:1, v/v) e a solução agitou-se durante 3 h a 50°C. Após arrefecer a temperatura ambiente, o dissolvente retirou-se por evaporação e co-evaporou-se com etanol (3 x 20 ml). O resíduo purificou-se por cromatografia em coluna sobre sílica gel (MeOH al 20% em CHCI3), dando N4-hidroxicitidina (215 mg) em forma de um sólido branco que se recristalizou em etanol quente; p.f. 173-176°C. RMN XH (DMSO-d6) δ 3,66-3,71 (m, 2H) , 3,93 (s a, 1H), 4,08-4,15 (m, 2H), 5,17-5,23 (m, 2H, D20 intercambiável), 5,43 (d, J = 6,00 Hz, 1H, D20 intercambiável), 5,73 (d, J = 8,16 Hz, 1H), 5,90 (d, J = 8,12 Hz, 1H) , 7,28 (d, J = 8,40 Hz, 1H) , 9,65 (s, 1H, D20 98 intercambiável), 10,15 (s, 1H, D20 intercambiável). Anal.
Cale. para C9H13N306: C, 41,70; H, 5,05; N, 16,21. Encontrado: C, 41,85; H, 5,14; N, 16,34.
De uma forma semelhante, mas utilizando os nucleosídeos de 2',3'-O-isopropilideno-5-O-trifenilmetil-N4-hidroxicitidina 5-substituída correspondentes, sintetizaram-se as seguintes citidinas N4-hidroxi-5-substituidas: * 5-Fluoro-N4-hidroxicitidina, * 5-Cloro-N4-hidroxicitidina, * 5-Bromo-N4-hidroxicitidina, * 5-Iodo-N4-hidroxicitidina, * 5-Metil-N4-hidroxicitidina, * 5-Etil-N4-hidroxicitidina, * 5-n-Propil-N4-hidroxicitidina, * 5-i-Propil-N4-hidroxicitidina, * 5-Vinil-N4-hidroxicitidina, * 5-Etinil-N4-hidroxicitidina, * 5-(2-clorovinil)-N4-hidroxicitidina, * 5-(2-bromovinil)-N4-hidroxicitidina, * 5-(2-iodovinil)-N4-hidroxicitidina, * 5-(2-metoxicarbonilvinil)-N4-hidroxicitidina, * 5-(2-hidroxicarbonilvinil)-N4-hidroxicitidina, * 5-fenil-N4-hidroxicitidina e * 5-benzil-N4-hidroxicitidina.
De uma forma semelhante, mas utilizando amoníaco etanólico em lugar de ácido trifluoroacético, e os nucleosídeos de 1-(2,5-di-0-acetil-3-desoxi-p-D- eritropentofuranosil)-N4-hidroxicitosina 5-substituída correspondentes, sintetizaram-se as seguintes 3'-desoxicitidinas N4-hidroxi-5-substituidas: * 5-Fluoro-3'-desoxi-N4-hidroxicitidina, * 5-Cloro-3'-desoxi-N4-hidroxicitidina, * 5-Bromo-3'-desoxi-N4-hidroxicitidina, * 5-lodo-3'-desoxi-N4-hidroxicitidina, 99 * 5-Metil-3'-desoxi-N4-hidroxicitidina, * 5-Etil-3'-desoxi-N4-hidroxicitidina, * 5-a-Propil-3'-desoxi-N4-hidroxicitidina, * 5-í-Propil-3'-desoxi-N4-hidroxicitidina, * 5-Vinil-3'-desoxi-N4-hidroxicitidina, * 5-Etinil-3'-desoxi-N4-hidroxicitidina, * 5-(2-clorovinil)-3'-desoxi-N4-hidroxicitidina, * 5-(2-bromovinil)-3'-desoxi-N4-hidroxicitidina, * 5-(2-iodovinil)-3'-desoxi-N4-hidroxicitidina, * 5-(2-metoxicarbonilvinil)-3'-desoxi-N4-hidroxicitidina, * 5-(2-hidroxicarbonilvinil)-3'-desoxi-N4-hidroxicitidina, * 5-fenil-3'-desoxi-N4-hidroxicitidina e * 5-benzi1-3'-desoxi-N4-hidroxicitidina.
De uma forma semelhante, mas utilizando amoníaco metanólico em lugar de ácido trifluoroacético, e os nucleosideos de 3', 5'-di-0-acetil-2'-desoxi-N4- hidroxicitosina 5-substituida correspondentes, sintetizaram-se as seguintes 2'-desoxicitidinas N4-hidroxi-5-substituidas: 5-Fluoro-2'-desoxi-N4-hidroxicitidina, * 5-Cloro-2'-desoxi-N4-hidroxicitidina, * 5-Bromo-2'-desoxi-N4-hidroxicitidina, 5-lodo-2'-desoxi-N4-hidroxicitidina, 5-Metil-2'-desoxi-N4-hidroxicitidina, 5-Etil-2'-desoxi-N4-hidroxicitidina, 5-n-Propil-2'-desoxi-N4-hidroxicitidina, 5-í-Propil-2'-desoxi-N4-hidroxicitidina, * 5-Vinil-2'-desoxi-N4-hidroxicitidina, * 5-Etinil-2'-desoxi-N4-hidroxicitidina, * 5-(2-clorovinil)-2'-desoxi-N4-hidroxicitidina, * 5-(2-bromovinil)-2'-desoxi-N4-hidroxicitidina, * 5-(2-iodovinil)-2'-desoxi-N4-hidroxicitidina, * 5-(2-metoxicarbonilvinil)-2'-desoxi-N4- 100 hidroxicitidina, * 5-(2-hidroxicarbonilvinil)-2'-desoxi-N4-hidroxicitidina, * 5-fenil-2'-desoxi-N4-hidroxicitidina e * 5-benzil-2'-desoxi-N4-hidroxicitidina. VIII. Métodos biológicos A presente invención proporciona ainda um método eficaz para quantificar a carga virai num hospedeiro utilizando reacção em cadeia da polimerase de transcrição inversa em tempo real quantitativo ("Q-RT-PCR"). O método envolve a utilização de uma molécula de sonda fluorescente inactivada que pode hibridar com um ADN ou ARN virai diana. Por isso, após a degradação exonucleolitica, pode supervisionar-se un sinal fluorescente detectável. Portanto, o ADN ou ARN ampliado por RT-PCR pode detectar-se em tempo real supervisionando a presença de sinais de fluorescência.
Numa realização especifica da invenção, proporciona-se a utilização de RT-PCR para quantificar a carga virai de um virus Flaviviridae.
Numa realização mais especifica, proporciona-se a utilização de RT-PCR para quantificar a carga virai de VDVB numa linha celular MDBK ou uma amostra de hospedeiro.
Numa realização adicional da invenção, proporciona-se uma molécula de sonda concebida para emitir fluorescência após a degradação exonucleolitica e para ser complementar à região NS5B de VDVB NADL.
Numa realização mais especifica da invenção, proporciona-se uma molécula de sonda com uma Sequência de 5' 6-fam-AAATCCTCCTAACAAGCGGGTTCCAGG-tamara 3' (Sequência ID N° 1) e iniciadores com uma sequência com sentido: 5'-AGCCTTCAGTTTCTTGCTGATGT-3' (Sequência ID N° 2) e anti-sentido: 5'-TGTIGCGAAAGCACCAACAG-3' (Sequência ID N° 3).
Numa realização especifica da invenção, proporciona-se a utilização de RT-PCR para quantificar a carga virai de 101 VHC numa amostra proveniente de um hospedeiro ou numa linha celular em tempo real;
Numa realização mais especifica da invenção, proporciona-se a utilização de RT-PCR, uma molécula de sonda concebida para emitir fluorescência após a degradação exonucleolitica e para ser complementar ao genoma de VHC.
Numa realização mais específica da invenção, proporciona-se a utilização de RT-PCR, uma molécula de sonda concebida para emitir fluorescência após a degradação exonucleolitica e para ser complementar à região 5' não traduzida de VHC.
Numa realização mais específica da invenção, proporciona-se uma molécula de sonda com uma sequência de 5' β-fam-CCTCCAGGACCCCCCCTCCC-tamara 3' (Sequência ID N° 4) e iniciadores com uma sequência com sentido: 5'-AGCCATGGCGTTAGTA (T/C)GAGTGT-3' (Sequência ID N° 5) e anti-sentido: 5'-TTCCGCAGACCACTATGG-3' (Sequência ID N° 6). A. Isolamento de ARN e Análise de RT-PCR quantitativo
Proporciona-se um método eficaz para quantificar a carga virai num hospedeiro, que se denomina reacção em cadeia da polimerase em tempo real ("RT-PCR")· O método envolve utilizar uma molécula de sonda fluorescente inactivada que pode hibridar com ADN ou ARN virai. Por isso, após a degradação exonucleolitica, pode supervisionar-se um sinal fluorescente detectável. Portanto, o ADN ou ARN ampliado por RT-PCR detecta-se em tempo real supervisionando a presença de sinais de fluorescência.
Como ilustração deste método, no caso de VDVB em células MDBK, numa primeira etapa, isola-se ARN virai a partir de 140 μΐ do sobrenadante de cultura celular através de uma coluna disponível no mercado (kit de extracção de ARN virai, QiaGen, CA) . O ARN virai depois é eluído da columna produzindo um volume total de 60 μΐ e posteriormente amplifica-se com um protocolo de RT-PCR 102 quantitativo utilizando un iniciador adeauado para a cepa NADL de VDVB. Uma molécula de sonda fluorescente inactivada hibrida-se com o adn de VDVB, que depois experimenta degradação exonucleolitica dando como resultado um sinal fluorescente detectável. Potanto, o ADN ampliado por RT-PCR detectou-se em tempo real supervisionando a presença de sinais de fluorescência. A molécula de sonda TaqMan (5'—6— fam-AAATCCTCCTAACAAGCGGGTTCCAGG-tamara 3' [Sequência ID N° 1] e os iniciadores (con sentido: 5'- AGCCTTCAGTTTCTTGCTGATGT-3' [Sequência ID N° 2]; e anti-sentido: 5'-TGTTGCGAAAGCACCAACAG-3' [Sequência ID N° 3]) conceberam-se com a ajuda do software Primer Express (PE-Applied Biosystems) para que fossem complementares à região NS5B de vdvb nadl. Analisou-se um total de 10 μΐ de ARN numa mistura de 50 μΐ de RT-PCR. Os reactivos e as condições utilizadas na PCR quantitativa adquiriram-se em PE-Applied Biosystems. A curva padrão que foi criada utilizando o virus de inoculo não diluído variava de 6000 unidades formadoras de placas (UFP) para 0,6 UFP por mistura de RT-PCR. Rotineiramente obteve-se um intervalo linear de mais de 4-log.
Pode realizar-se uma abordagem comparável para medir a quantidade de outros Flaviviridae (ainda mais importante VHC, VFA (vírus da febre amarela), Dengue, Vírus West Nile e outros) numa amostra clínica ou numa amostra de cultura de tecidos. Por exemplo, a combinação da purificação de ARN de VHC com RT-PCR em tempo real utilizando os seguintes iniciadores (5'-TTCCGCAGACCACTATGG-3' [Sequência ID N° 4] e 5'-AGCCATGGCGTTAGTATGAGTGT-3' [Sequência ID N° 5]) e sonda (5'-6-fam-CCTCCAGGACCCCCCCTCCC-tamara-3' [Sequência ID N° 6] ) resultou um intervalo linear de 7-log de detenção de carga virai. B. Materiais celulares/virais
Um dos elementos melhor caracterizados do género Pestivírus é VDVB. VDVB e VHC partilham pelo menos três 103 características comuns, que são as seguintes: (1) experimentam tradução mediada por IRES; (2) é necessário o cofactor NS4A pela sua serina protease NS3; e (3) experimentam um processo de poliproteina semelhante com a região não estrutural, especialmente no local de união NS5A e NS5B. O sistema de replicação de VDVB utilizou-se para a descoberta de compostos anti-Flaviviridae. Os compostos descritos no presente documento são activos contra Pestivirus, Hepacivírus e/ou Flavivírus.
Cultivaram-se células de rim bovino Maldin-Darby (MDBK) e mantiveram-se num meio de Eagle modificado (DMEM/F12; GibcoBRL), complementado com soro de cavalo inactivado termicamente a 10% a 37 °C num incubador humidificado com 5% de C02. O vírus da diarreia virai bovina (VDVB), cepa NADL, produz um efeito citopatogénico (ECP) após a infecção destas células. C, Ensaio antiviral
Isolaram-se células MDBK, cultivadas em DMEM/F12 -soro de cavalo (SC) a 10%, em técnicas convencionais utilizando tripsina-EDTA. As células semearam-se numa placa de 96 cavidades a 5 x 104 células/cavidades, com o composto de ensaio (concentração 20 micromolar (μΜ)), para dar um volume total de 100 microlitros (μΐ). Após uma hora, o meio retirou-se e as células infectaram-se a uma multiplicidade de infecção (MDI) de 0,02 ou 0,002 num volume total de 50 μΐ durante 45 minutos. Posteriormente, o vírus retirou-se e as células lavaram-se duas vezes com 100 μΐ de meio de ensaio. Finalmente, as células infectadas incubaram-se num volume total de 100 μΐ que continha o composto de ensaio a uma concentração de 10, 40 ou 100 μΜ. Após de 22 horas, recolheu-se o sobrenadante celular retirando o resíduo celular por centrifugação a baixa velocidade, e posteriormente ensaio-se relativamente à presença de vírus 104 de uma forma quantitativa. D. Ensaio de citotoxicidade de compostos anti-Flaviviridae candidatos O ensaio de citotoxicidade realizado no presente documento é uma técnica convencional. Em resumo, semeam-se células em placas de 96 cavidades a diversas concentrações (consoante o tipo celular e a duração do ensaio), tipicamente a 5 x 103 células por cavidade, em presença de concentrações crescentes do composto de ensaio (0, 1, 3, 10, 33 e 100 μΜ). Após uma incubação de três dias, medem-se a viabilidade celular e a actividade mitocondrial adicionando o corante MTS (Promega), seguido de uma incubação de 3 horas. Posteriormente, as placas que contêm o corante leem-se a 490 nm. Essas metodologias descrevem-se correctamente e estão no fabricante (Promega).
Exemplo 53
A curva padrão de quantificação por RT-PCR de VDVB A solução mãe de virus de VDVB padrão continha 2 x 106 UFP/ml, como é determinado por um ensaio em placa rutineiro (Mendez, E. et al J. Virol. 1998, 72, 4737). Extraiu-se ARN virai a partir de 140 μΐ deste material de inoculo e eluiram-se de uma coluna utilizando 60 μΐ de um tampão de eluição. Este material de ARN purificado depois foi eluido por etapas desde 10_1 a 10~5. Utilizando a técnica de amplificação por RT-PCR em tempo real, ensaiaram-se 10 μΐ de cada diluição. A partir desta experiência, é evidente que esta tecnologia permite uma quantificação fiável em 4-logs de vírus (desde 6000 a 0,6 UFP/entrada na mistura de amplificação) . O limite inferior de detecção nesta experiência é 0,6 UFP ou -0,22 log UFP. Por isso, os valores de quantificação por RT-PCR em tempo real das amostras de ensaio inferiores a este limite de detecção, serão consideradas não fiáveis.
Exemplo 54
O ciclo de replicaçãio de VDVB em células MDBK 105
Para medir a producção de VDVB em células MDBK e para determinar o tiempo de recolha óptimo durante determinado período de tempo, semearam-se células a 5 x 104 células/vacidade e infectaram-se com MDI = 0,02 ou MDI = 0,002. Após a infecção, retirou-se o inoculo e as células lavaram-se duas vezes com meio de cultura. Em diferentes pontos de tempo recolheu-se o sobrenadante celular; e a quantidade de vírus mediu-se e comparou-se com o inoculo original e a lavagem celular. Foram necessárias pelo menos 2 etapas de lavagem para retirar o vírus do inoculo. A quantidade de vírus produzido 22 horas após a infecção equivale aproximadamente à quantidade de vírus utilizada para inocular as células. Com base nestes resultados, o tempo necessário para um ciclo de replicação de VDVB em células MDBK foi de 22 horas. Observe-se que o nível de detecção estabelecido nestas experiências foi baseado no limite inferior de detecção como é determinado pela curva padrão.
Exemplo 55
Avaliação de compostos antivirais candidatos utilizando RT-PCR
Semearam-se células MDBK a 5 x 104 células/cavidade, infectaram-se com VDVB com uma multiplicidade de infecção (MDI) igual a 0,02 e cultivaram-se durante 22 horas na presença de um composto de ensaio. As células que não foram tratadas com um composto de ensaio foram consideradas um controlo negativo, enquanto a ribavirina serviu como controlo positivo. Extraiu-se ARN virai e analisou-se por RT-PCR em tempo real. Uma experiência típica demonstra que o controlo negativo e a maioria das células tratadas produziram quantidades comparáveis de vírus (entre 1,5 e 2 log UFP/entrada), mostrando eficazmente que o composto de ensaio não era activo. No entanto, as células tratadas com o controlo positivo, ribavirina (RIB) ou com 5- hidroxiuridina (β-D-CL) * apresentam uma ausência quase 106 completa de ARN virai. RIB e β-D-CL * reduzen a produção virai aproximadamente em 2 log UFP, ou 99%, no período de reprodução de 22 horas. A potência exacta destes compostos não pode ser deduzida a partir deste tipo de experiência, uma vez que o limite de detecção nesta experiência estabelece-se a -0,22 log UFP e apenas se produz um ciclo de replicação virai nas condições experimentais indicadas.
As potências, ou o efeito da concentração de compostos que inibem a produção de vírus 50% ou 90% (valores de CE50 ou CE90, respectivamente), dos compostos anti-VDVB determinaram-se numa série semelhante de experiências, mas num amplo intervalo de concentrações de composto de ensaio (0, 1, 3, 10, 33, 100 μΜ) . O valor CE90 refere-se à concentração necessária para obter uma reducção 1-log na produção virai dentro de um período de 22 horas. Na Tabela 21 apresentam-se compostos que mostraram uma potente actividade antiviral. Esta tabela proporciona a máxima redução de carga virai observada a uma concentração ocorrida 22 horas após a infecção. 21: Carga ID virs n il de VDVB conc. (μΜ) 22 horas após a infecção Redução Log Média β-D-AA 4 100 2,43 β-D-AI 3 100 1,52 * β-D-AJ 3 100 1,34 * β-D-AK 4 100 1,90 * β-D-AL 3 100 1,55 β-D-AN 2 100 1,21 * β-D-AO 2 100 2,24 β-D-AP 3 100 1,36 * β-D-AQ 3 100 0,87 107 (cont.) ID n conc. (μΜ) Redução Log Média β-D-AT 4 100 1,42 β-D-BE 3 100 1,23 * β-D-BL 2 100 1,20 β-D-BO 3 100 O 00 o * β-D-HS 2 10 1,48 * β-D-CL 6 40 3,10 * β-D-CM 3 40 1,77
Exemplo 56
Sistemas de cultura celular alternativos para determinar actividades antivirais O ensaio descrito anteriormente pode adaptar-se aos outros elementos da familia Flaviviridae mudando o sistema celular e o patogénico virai. As metodologias para determinar a eficácia destes compostos antivirais incluem modificações das técnicas convencionais descritas por Holbrook, MR et al Vírus Refs. 2000, 69 (1), 31; Markland, W et al Antimicrob. Agents. Chemother. 2000, 44 (4), 859;
Diamond, MS et al, J. Virol. 2000, 74 (17), 7814; Jordan, I. et al J. Infect. Dis. 2000, 182, 1214; Sreenivasan, V. et al J. Virol. Methods 1993, 45 (1), I; ou Baginski, SG et al Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 2000, 97 (14), 7981 ou a tecnologia de RT-PCR em tempo real. Especificamente, pode utilizar-se um sistema replicão de VHC em células HuH7 (Lohmann, V et al Science, 1999, 285 (5424), 110) ou modificações do mesmo (Rice et al 2000, abstract Xth International Symposium for Virai Hepatitis and Liver Disease, Atlanta, GA).
Exemplo 59
Ensaio antiviral de compostos candidatos relativamente a Flaviviridae A. O sistema replicão de VHC em células Huh7
Podem cultivar-se células Huh7 que levam o replicão de 108 VHC em meio DMEM (alto conteúdo de glucose, sem piruvato) que contém soro bovino fetal a 10%, aminoácidos não essenciais lx, Pen-Estrep-Glu (100 unidades/litro, 100 microgramas/litro e 2,92 mg/litro, respectivamente) e de 500 a 1000 microgramas/mililitro de G418. Podem realizar-se ensaios de exploração antiviral no mesmo meio sem G418 como é indicado se seguida: para manter as células em fase de crescimento logarítmica, as células semeam-se numa placa de 96 cavidades a baixa densidade, por Exemplo 1000 células por cavidade. Adiciona-se o composto de ensaio imediatamente após semear as células e é incubada durante um período de 3 a 7 dias a 37°C num incubador. Depois é retirado o meio e as células são preparadas para a extracção do ácido nucleico total (incluindo o arn do replição e o ARN de hospedeiro) . O ARN do replicão depois se pode amplificar num protocolo de Q-RT-PCR e, por conseguinte, quantificar-se. As diferenças observadas na quantificação do ARN do replicão são uma forma de expressar a potência antiviral do composto de ensaio. Uma experiência tipica demosntra que no controlo negativo e nas situações de compostos não activos produz-se uma quantidade comparável de replicão. Isto pode concluir-se porque os ciclos limiar medidos para RT-PCR de VHC nas duas situações são semelhantes entre eles. Nessa experiência, uma forma de expressar a eficácia antiviral de um composto é restar do ciclo de RT-FCR limiar do composto de ensaio o ciclo de RT-PCR limiar médio do controlo negativo. Este valor denomina-se DeltaCt (Act o DCt) . Um Act de 3,3 equivale a uma redução de 1-log (que equivale a CE90) na produção do replicão. Os compostos que dão como resultado uma redução dos niveis de ARN do replicão de VHC maior de 2 valores ACt (redução de 75% do ARN do replicão) são compostos candidatos para a terapia antiviral. Esses compostos candidatos pertencem a estruturas com fórmula geral (I-a). A Tabela 24 proporciona os valores médios de ACt (N = vezes 109 que foi ensaiado) que se podem obter se os compostos diana se incubam na forma descrita durante 96 horas. Como controlo positivo toma-se interferão alfa-2a recombinante (Roferon-A, Hoffmann-Roche, New Jersey, Estados Unidos) juntamente como controlo positivo.
No entanto, este valor de ACt de VHC não inclui nenhum parâmetro de especificidade para o ARN polimerase dependente de ARN virai codificada pelo replicão. Numa situação tipica, um composto poderia reduzir tanto a actividade do ARN polimerase do hospedeiro como a actividade polimerase codificada pelo replicão. Portanto, a quantificação do ARNr (ou qualquer outro produto de ARN polimerase I do hospedeiro) ou ARNm da beta-actina (ou qualquier outro ARN polimerasw II do hospedeiro) e a comparação com os níveis de ARN do controlo sem fármaco é uma medida relativa do efeito do composto de ensaio sobre os ARN polimerases do hospedeiro. A Tabela 24 também representa os valores de ACt para o ARNr dos compostos de ensaio.
Com a disponibilidade dos dados de ACt de VHC e ACt de ARNr pode introduzirs-se um parâmetro de especificidade. Este parâmetro obtém-se restando os dois valores de ACt entre si. Isto dá como resultado os valores Delta-DeltaCT (AACt o DDCt); um valor superior a 0 significa que há mais efeito inibidor sobre a polimerase codificada pelo replicão, e um valor de AACT inferior a 0 significa que os níveis de ARNr do hospedeiro veêm-se mais afectados do que os níveis do replicão. A actividadE antiviral dos compostos ensaiados, expressada como valores de AACt, proporciona-se na Tabela 24. Como norma geral, os valores de AACt superiores a 2 consideram-se significativamente diferentes do controlo de tratamento sem fármaco e, por isso, apresentam uma actividade antiviral apreciável. No entanto, os compostos com um valor de AACt inferior a 2, mas que apresentam dados de citotoxicidade molecular limitada (ACT 110 de ARNr entre 0 e 2) também são possíveis compostos activos.
Noutra situação típica, um composto poderia reduzir a actividade ARN polimerase do hospedeiro, mas não a actividade ADN polimerase do hospedeiro. Por isso, a quantificação do ADNr ou ADN da beta actina (ou qualquer outro fragmento de ADN do hospedeiro) e a comparação com os níveis de ADN do controlo sem fármaco é uma medida relativa do efeito inibidor do composto de ensaio sobre ADN polimerases celulares. A Tabela 25 representa valores de ÁCt para o ADNr dos compostos de ensaio.
Com a disponibilidade tanto dos dados de ACt de VHC como de ACt de ADNr, pode introduzir-se um parâmetro de especificidade. Este parâmetro obtém-se restando os dois valores de ACt entre si. Isto dá como resultado valores de AACt; um valor superior a 0 significa que há mais efeito inibidor sobre a polimerase codificada pelo replicão, e um valor de AÀCt inferior a 0 significa que os níveis de ADNr do hospedeiro estão mais afectados do que os níveis do replicão. A actividade antiviral dos compostos ensaiados, expressada como valores de AACt, proporciona-se na Tabela 25. Como norma geral, os valores de AACt superiores a 2 consideram-se significativamente diferentes do controlo de tratamento sem fármaco e, por isso, é um composto interessante para uma avaliação adicional. No entanto, podem ser desejados compostos com um valor de AÁCt menor de 2, mas com citotoxicidade molecular limitada (ACT de ADNr entre 0 e 2).
Os compostos que dão como resultado uma redução específica dos níveis de ARN do replicão de VHC, mas com reduções limitadas nos niveis de ARN e/ou ADN celular, são compostos candidatos para uma terapia antiviral. Os compostos candidatos que pertencem ao grupo (i-a) de fórmula geral avaliaram-se relativamente à sua capacidade especifica de reduzir o ARN de Flaviviridae (incluindo VDVB 111 e VHC), e 25) . e detectaram-se compostos potentes Tabela 24 (Tabelas 21, 24 ID n ACt ARN de VHC Médio ARNr médio ACt Médio MCt β-D-AA 3 3, 83 2,41 1, 42 β-D-AI 3 2,93 2,43 0, 48 * β-D- 22 2,92 1, 74 1, 18 AJ * β-D- 4 3, 73 2,48 1, 25 AK * β-D- 2 3, 08 2,72 0, 36 AL β-D-AN 6 3, 33 2,11 1, 22 112 (cont.) ID n ACt ARN de VHC Médio ARNr médio ACt AAct Médio * β-D-AO 1 4,10 2,13 1, 97 β-D-AP 2 3,27 3,23 0, 05 * β-D-AQ 7 4,45 3,22 1, 22 β-D-AT 2 3, 71 3, 07 0, 64 β-D-BE 2 4,44 2,80 1, 64 * β-D-BF 2 4,37 2,69 1, 68 β-D-BH 1 3, 06 0, 91 2,15 * β-D-BJ 2 5, 06 3, 62 1, 44 * β-D-BL 1 2,28 1, 93 0, 35 β-D-BO 1 4,52 2,95 1, 57 * β-D-BS 40 4,89 1, 05 3, 83 * β-D-BT 5 4,83 3, 59 1, 24 * β-D-BU 4 3,46 2,18 1, 06 * β-D-BV 3 1, 88 0, 65 1, 22 * β-D-CC 6 5, 04 4,82 0,21 IFN 4 5,21 0, 69 4,52 ribavirina 2 3,13 2,35 0, 78 Tabela 25 ID N ACt de ARN de VHC Médio ACt de ARN Médio AACt Médio β-D-AA 3 3, 83 2,53 1, 88 β-D-AI 1 3,76 -0, 96 4,55 * β-D- 16 AJ 2,75 0,43 2,33 * β-D- 1 AK 3, 51 2,69 0,79 * β-D- 1 AL 3,18 2,56 0, 61 β-D-AN 2 3,86 2,53 1, 88 * β-D- 1 4,10 1, 84 2,26 113 AO β-D-AP 2 3,27 2,26 1, 02 * β-D- 3 4,75 1,78 2,73 AQ β-D-AT 1 3, 81 2,43 1, 43 β-D-BE 1 4,99 2,06 2, 98 114 (cont.) ID N Act de ARN de Médio VHC Act de ARN Médio AACt Médio * β-D-BF 1 5,27 2,04 3,28 β-D-BH 1 3,06 1, 42 1, 64 * β-D-BJ 1 4,34 0, 81 3, 53 * β-D-BL 1 2,28 1, 62 0, 65 * β—D— BS 14 4,81 0, 38 4,45 * β-D-BT 2 4,44 1, 17 3,39 * β-D-BU 4 3,46 1, 10 1,16 * β-D-BV 3 1, 88 0, 31 1, 65 * β-D- 3 5, 84 2,17 3, 66 cc 115
DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO
Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.
Documentos de patente referidos na descrição • US 24148800 P [0002] • US 282156 P [0002] • WO 9822496 A, Attwood [0052] • WO 1998 A [0052] • DE 19914474 [0052] WO 9817679 A, Tung [0052] WO 9907734 A [0052] US 5633358 A, Diana G. D. [0052] WO 9736554 A, Diana G. D. [0052] US 6174868 B [0052] JP 08268890 B [0052] JP 10101591 B [0052] WO 0160315 A, Ismaili [0052] WO 0132153 A, Storer [0052] WO 0134618 A, Watanabe [0052] WO 0146212 A, Tam [0052] WO 0218404 A [0052] WO 9818324 A [0052] US 6034134 A, Gold [0052] US 5922757 A, Chojkier [0052] US 5846964 A, Ozeki [0052] US 5830905 A, Diana [0052] US 5633388 A, Diana [0052] US 5496546 A, Wang [0052] US 5026687 A, Yarchoan [0052] US 5891874 A, Colacino [0052] 2 WO 0108672 A, Mueller [0052] WO 0047198 A, Mueller [0052] 105
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Claims (6)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um composto β-D nucleosídeo de fórmula geral [I-a]: PO,
N
1I-»! ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que: D é hidrogénio; X1 é independentemente hidrogénio, NH2, NHR4, NHOR4, OH ou OR4; Y1 é 0; R1 é hidrogénio, alquilo de cadeia curta, F, I, NHR5, NR5R5' ou OR5; e R1' é hidrogénio; R2 é hidrogénio, halogéneo (F, Cl, Br ou I), OH, ou 0CH3; R2' é hidrogénio ou halogéneo (F, Cl, Br ou I); cada R3 e R3' é independentemente hidrogénio, halogéneo (F, Cl, Br ou I), OH ou 0CH3; cada R4, R5 e R5' é independentemente hidrogénio, alquilo de cadeia curta, arilo ou arilalquilo como fenilo ou benzilo não substituído ou substituído; de forma a que para o nucleosídeo de fórmula geral [ΙΕ] pelo menos um de R2 e R2' seja hidrogénio e pelo menos um de R3 e R3' seja hidrogénio; em que "alquilo de cadeia curta" se refere a um grupo alquilo linear, ramificado ou cíclico, saturado, de Ci a C4, para utilização no tratamento ou profilaxia de infecção virai por Flaviviridae; 2 com a condição de que quando a infecção virai por Flaviviridae seja uma infecção pelo virus da hepatite C, o composto de fórmula geral [I-a] não seja 2'-desoxi-5-fluorouridina, 1- (β-D-arabinofuranosil)-5-fluorouracilo, 1-(β-D-arabinofuranosil)uracilo, 1 — (β— D-arabinofuranosil)-5-metiluracilo, 1-(β-D-arabinofuranosil) -5-iodouracilo, 1- (β-D-arabinofuranosil) -5-fluorocitosina, 2',3' -didesoxicitidina, 1-(β-D-arabinofuranosil)-5-etiluracilo, 2'-cloro-2'-desoxiuridina, 2'-bromo-2'-desoxiuridina, 1- (2-desoxi^-D-lixofuranosil) -5-metiluracilo, 2',3'-didesoxi-5-etil-3'-metoxiuridina, 2',3'-didesoxi-5-etil-3'-iodouridina ou 4-oximino-l-(β-D-arabinofuranosil)pirimidin-2(1H)-ona.
2. 0 composto para a utilização da reivindicação 1, em que o β-D nucleosideo da fórmula (I-a) é seleccionado entre um dos seguintes: 3 X1 Y1 R1 R1’ R2 R2’ R3 R3’ nh2 0 H H OH H H OH nh2 0 H H OH H H I nh2 0 H H OH H H Cl nh2 0 H H OH H H Br nh2 0 H H H Cl H OH nh2 0 H H H Br H OH nh2 0 H H Cl H H OH nh2 0 F H OH H H OH nh2 0 F H H Cl H OH nh2 0 I H H Cl H OH nh2 0 I H Br H H OH nh2 0 OH H OH H H OH NH-(2-Ph-Et) 0 H H OH H H OH NH-OH 0 H H OH H H OH OH 0 OH H OH H H OH OH 0 F H OH H H OH OH 0 F H H H H OH ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
3. Um composto de fórmula geral [I-a]: χΐ
R* R* }!-a] em que D é hidrogénio; e o β-D nucleosideo da fórmula (I-a) é seleccionado entre um dos seguintes: 4 4 X1 Y1 R1 R1' R2 R2' R3 R3 nh2 0 H H H OH Br H nh2 0 F H H OH Cl H nh2 0 F H H OH Br H nh2 0 I H H OH Br H nh2 0 ch3 H H OH Cl H ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, para utilização no tratamento ou profilaxia de infecção virai por Flaviviridae.
4. Um composto β-D nucleosídeo da fórmula: O HO. OH OH ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo para utilização no tratamento ou profilaxia de infecção virai por Flaviviridae.
5. 0 composto para a utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que a infecção por Flaviviridae é uma infecção pelo vírus da hepatite C.
6. 0 composto para a utilização de acordo com a reivindicação 5, em que a infecção por Flaviviridae é uma 5 infecção pelo vírus da hepatite C e em que o composto está num veiculo farmaceuticamente aceitável.
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