CZ303327B6 - Substitucní deriváty N6-benzyladenosin-5´-monofosfátu, zpusoby jejich prípravy, tyto deriváty pro použití jako léciva a terapeutický prípravek je obsahující - Google Patents

Substitucní deriváty N6-benzyladenosin-5´-monofosfátu, zpusoby jejich prípravy, tyto deriváty pro použití jako léciva a terapeutický prípravek je obsahující Download PDF

Info

Publication number
CZ303327B6
CZ303327B6 CZ20100332A CZ2010332A CZ303327B6 CZ 303327 B6 CZ303327 B6 CZ 303327B6 CZ 20100332 A CZ20100332 A CZ 20100332A CZ 2010332 A CZ2010332 A CZ 2010332A CZ 303327 B6 CZ303327 B6 CZ 303327B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
monophosphate
hydroxy
formula
riboside
substitution derivatives
Prior art date
Application number
CZ20100332A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ2010332A3 (cs
Inventor
Zatloukal@Marek
Doležal@Karel
Voller@Jirí
Spíchal@Lukáš
Strnad@Miroslav
Original Assignee
Univerzita Palackého v Olomouci
Bioapex, S.R.O.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univerzita Palackého v Olomouci, Bioapex, S.R.O. filed Critical Univerzita Palackého v Olomouci
Priority to CZ20100332A priority Critical patent/CZ303327B6/cs
Priority to EP20110763831 priority patent/EP2563801B1/en
Priority to US13/642,905 priority patent/US9073961B2/en
Priority to PCT/CZ2011/000044 priority patent/WO2011134444A2/en
Publication of CZ2010332A3 publication Critical patent/CZ2010332A3/cs
Publication of CZ303327B6 publication Critical patent/CZ303327B6/cs
Priority to ZA2012/07173A priority patent/ZA201207173B/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C07H19/167—Purine radicals with ribosyl as the saccharide radical
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
    • A61K31/7068—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines having oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. cytidine, cytidylic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/06—Antigout agents, e.g. antihyperuricemic or uricosuric agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C07H19/20—Purine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)

Abstract

Rešení se týká substitucních derivátu N.sup.6.n.-benzyladenosin-5´-monofosfátu obecného vzorce I, kde (R).sub.n .n.znamená 1 až 4 substituenty R (n je v rozmezí 1 až 4), pricemž R mohou být stejné nebo rozdílné, a R jsou vybrány ze skupiny zahrnující C.sub.1 .n.až C.sub.8 .n.alkyl, C.sub.1 .n.až C.sub.8.n. alkoxy, amino, halogen, hydroxy, merkapto a nitro skupinu, pricemž jeden ze substituentu R je hydroxyl, v poloze 2 fenylu, a jejich farmaceuticky prijatelné soli, které mají protinádorové, antimitotické a proapoptotické úcinky na živocišné bunky, zpusobu jejich prípravy a jejich použití pro lécení nádoru, leukémie, lupenky, Alzheimerovy choroby, atd.

Description

Substituční deriváty N6-benzyladenosin-5-monofosfátu, způsoby jejich přípravy, tyto deriváty pro použití jako léčiva a terapeutický přípravek je obsahující
Oblast techniky
Vynález se týká nových substitučních derivátů N6-benzyladenos i n-5'-monofosfátu, které mají protinádorové, antimitotické a proapoptotické účinky pro živočišné buňky, včetně lidských. Vynález se dále týká způsobů přípravy těchto derivátů, těchto derivátů jako léčiva, terapeutickéio ho přípravku, který tyto deriváty obsahuje jako účinnou látku a použití těchto derivátů pro výrobu léčiv a ve farmaceutických biotechnologiích.
Dosavadní stav techniky 15
Cytokin i ny jsou důležitou třídou rostlinných hormonů, definovanou jejich schopní iniciovat buněčné dělení v rostlinných tkáňových kulturách za přítomnosti auxinu (Skoog et al., Science 148, 532 až 533, 1965). Cytokininy doposud identifikované v rostlinách jsou deriváty adeninu substituované v poloze N6 isoprenoidním nebo aromatickým postranním řetězcem. Nejčastěji se vyskytujícím cytokin inem je ř/ww-zeatin (tZ). Hladiny ostatních isoprenoidních cytokininů Nť>~isopentenyladeninu (iP), cis-zeatinu (cZ) a jeho derivátu s nasyceným postranním řetězcem dihydrozeatinu (DHZ) se liší mezidruhově. Zatímco isoprenoidní cytokininy jsou v rostlinách všudypřítomné, aromatické cytokininy reprezentované Nó-benzyladeninem (BA) a jeho hydroxylovanými deriváty topoliny byly doposud identifikovány pouze v úzké skupině rostlinných druhů (Horgan et al., Phytochemistry 14, 1005 až 1008, 1975; Strnad, Physiol. Plant. 101, 674 až 688,
1997; Strnad et al., Plant Physiol. 99, 74 až 80, 1992). Nejrozšířenějším z nich je pravděpodobně or/Ao-topolin ribosid, vyskytující se v topolových listech po rozednění v mikromolámích koncentracích (Hewett et al., Planta 114, 119 až 129, 1973). V obou skupinách cytokininů jsou známi zástupci, kteří existují jako volné báze, ribosidy, ribosid-5'-monofosfáty, 3-, 7-, 9-, O30 glukosidy, a konjugáty s aminokyselinami.
V souvislosti s úlohou cytokininů v regulaci rostlinného růstu a diferenciaci byly tyto látky testovány také jako možná léčiva ve vztahu k řadě lidských onemocnění, způsobených disregulací buněčné proliferace a diferenciace. Schopnost cytokininových bází indukovat nebo podporovat diferenciaci lidských buněk byla demonstrována na keratinocytech (Berge et al., Ann. N. Y, Acad
Sci. 1067, 332 až 336, 2006) a několika leukemických buněčných liniích HL-60 a K-562 (Ishii et ak, Biochim, Biophys. Acta. 1643, 11 až 24, 2003). Zatímco volné báze indukují diferenciaci v poměrně vysokých koncentracích (25 až 100 μΜ), jejich ribosidy způsobují rychlý nástup apoptózy v mikromolámích koncentracích (Mlejnek, J. Cell Biochem. 83, 678 až 689, 2001).
Smrti buněk HL-60 předchází degradace adenosin trifosfátu, aktivace kaspáz a depolarizace mitochondrií (Mlejnek, J. Cell Biochem. 83, 678 až 689, 2001; Ishii et al., Biochim. Biophys. Acta. 1643, 11 až 24, 2002). Intracelulámí konverze ribosidů na jejich monofosfáty je nezbytná pro jejich funkci (Mlejnek and Doležel, Toxicol. In Vitro 19, 985 až 990, 2005). Inhibice kaspáz mění aktivitu N6-isopentenyladenosinu (iPR) v buňkách HL-60 na růstově-inhibiční a diferen45 cující (Ishii et al., Biochim. Biophys. Acta. 1643, 11 až 24, 2002). Pro kinetin ribosid (KR) bylo nedávno ukázáno, že může být zajímavou účinnou látkou pro léčbu mnohočetného myelomu (Tiedemann et ak, J. Clin. Invest. 118, 1750 až 1764, 2008). V různých modelech mnohočetného myelomu KR indukuje rychlou supresi transkripce cyklinů Dl a D2 následovanou zablokováním buněčného cyklu a tumor-specifickou apoptózou (Tiedemann et a., J. Clin. Invest. 118, 1750 až
1764, 2008). Cytotoxický efekt iPr, KR a N6-benzyladenosinu (BAR) na lidské buněčné linie odvozené z pevných tumorů byl publikován v pracech Cabelo et ak (Int. J. Cancer 120, 2744 až 2748, 2008). Choi et ak (Cancer Lett, 261, 37 až 45, 2008), Laezza et ak (Int. J. Cancer. 124, 1322 až 1329, 2009), Meisel et ak (FEBS Lett. 433, 265 až 268, 1998) a Spinola et ak (Int. J. Cancer 120, 2744 až 2748, 2007). V závislosti na buněčné linii a použitém cytokininů jeho apli55 kace způsobila bud’ blok buněčného cyklu (v G1 nebo G2/M fázi), nebo apoptózu. In vivo proti- 1 CZ 303327 B6 nádorová aktivita iPR, KR a BAR byla také demonstrována v několika zvířecích a xenograftových modelech nádorového bujení (Choi et at, Cancer Lett. 261, 37 až 45, 2008; Laezza et al., FASEB J. 20, 412 až 418, 2006; Tiedemann et al., J. Clin. Invest, U 8, 1750 až 1764, 2008). iPR a BAR také ukázaly perspektivní aktivitu na různé zhoubné nádory v klinických zkoušení malého rozsahu (Mittelman et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 255, 225 až 234, 1975).
Mikromolární koncentrace cytokin inových ribosidů i bází jsou také schopny indukovat buněčnou smrt se znaky apoptózy (aktivace kaspázám-podobných proteáz a fragmentace DNA) v rostlinných buněčných kulturách (Mlejnek and Procházka, Planta 215, 158 až 166, 2002). Buněčné smrti i v tomto případě předchází degradace adenosin trifosfátů a produkce reaktivních kyslíkových radikálů. Na rozdíl od jejich hormonální aktivity, která vyžaduje interakci s membránovým receptorem, intracelulámí konverze cytokininů na jejich monofosfáty je nezbytná pro jejich efekt cytotoxický. Cytotoxické koncentrace jsou vyšší než endogenní koncentrace cytokinů v rostlinných pletivech, ale stále v koncentračním rozsahu používaném v cytokin inových bíotestech (Carimi et al., Planta 216, 413 až 421, 2003; Mlejnek et al., Plant. Cell, Environ. 26, 1723 až 1735, 2003; Plant. Sci. 168, 389 až 395, 2005). Cytotoxická aktivita přirozeně se vyskytujících cytokininů, cytokin i nových ribosidů ajejich analog (Doležel et al., Bioorg. Med. Chem, 14, 875 až 884, 2006; Bioorg. Med. Chem. 15, 3737 až 3747, 2007) ve zvířecích a lidských experimentálních systémech byla opakovaně demonstrována. Cílem předkládaného vynálezu je proto poskytnout nové protinádorové a proapoptotické dusíkaté heterocyklícké sloučeniny na bázi na fenylu substituovaného Nó-benzy ladenosin-5'-monofosfátu s vysokou selektivitou a terapeutickým indexem účinnosti, tj. sloučeniny, které jsou málo toxické a přitom vysoce účinné. Tyto deriváty mohou být základem pro vývoj nových generací léčiv s protinádorovými, antimitotickými a proapoptotickými i dalšími medicínsky významnými účinky.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu jsou substituční deriváty N6- benzy ladenosin-5 -monofosfátu obecného vzorce I,
ve kterých (R)n znamená 1 až 4 substituenty R (n je v rozmezí 1 až 4), přičemž R mohou být stejné nebo rozdílné,
-2CZ 303327 B6 a R jsou vybrány ze skupiny zahrnující C| až C8 alkyl, Ct až C8 alkoxy, amino, halogen, hydroxy, merkapto a nitroskupinu, přičemž jeden ze substituentů Rje hydroxyl v poloze 2 fenylu, ajejich farmaceuticky přijatelné soli.
Farmaceuticky přijatelné soli sloučenin obecného vzorce I zahrnují soli s alkalickými kovy, amoniakem či aminy, nebo adiční soli s kyselinami. S výhodou jsou farmaceuticky přijatelné soli ío sloučenin obecného vzorce I vybrány ze skupiny zahrnující sodné a amonné soli.
Výše uvedené generické skupiny mají významy uvedené v následující legendě:
C, až C8 alkyl znamená přímou nebo rozvětvenou alkylovou skupinu obsahující 1 až 8 uhlíko15 vých atomů, s výhodou vybranou ze skupiny zahrnující methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, pentyl, isopentyl, hexyl a isohexyl,
Ci až Cg alkoxy znamená skupinu -O-Ra, kde Ra je Ci až C8 alkyl nebo C3 až C8 cykloalkyl, amino znamená skupinu -NH?, halogen je vybrán ze skupiny zahrnující atomy fluoru, bromu, chloru a jodu, hydroxy znamená skupinu -OH, merkapto znamená skupinu -SH, nitro znamená skupinu -NO2.
Předmětem vynálezu jsou dále substituční deriváty Nó-benzyladenosin-5-monofosfátu obecného ho vzorce l pro použití jako léčiva.
Předmětem vynálezu jsou rovněž substituční deriváty N6-benzy lade nos i n-5'-monofosfátu obecného vzorce I pro použití jako inhibitory proteinkinas, s výhodou lidské kinasy EPHB2.
Předmětem vynálezu jsou rovněž substituční deriváty N6-benzyladenosin-5'-monofosfátu obecného vzorce 1 pro použití pro inhibici buněčné proliferace a/nebo indukci apoptózy.
Předmětem vynálezu jsou dále substituční deriváty Nó-benzyladenosin-5-monofosfátu obecného vzorce I pro použití jako léčiva pro léčbu onemocnění, která zahrnují buněčnou proliferaci, jakými jsou nádory, leukémie, restenóza, revmatická artritis, lupenka, diabetes 1. typu, roztroušená skleróza, Alzheirnerova choroba, parazitózy, z působené živočichy, houbami a/nebo prvoky, polycystické onemocnění ledvin, odmítnutí transplantátu (host versus graft disease) a dna.
Předmětem vynálezu je také použití substitučních derivátů NĎ-benzyladenosin-5-monofosfátu obecného vzorce 1 pro výrobu léčiva pro léčbu onemocnění, která zahrnují buněčnou proliferaci, jakými jsou nádory, leukémie, restenóza, revmatická artritis, lupenka, diabetes I. typu, roztroušená skleróza, Alzheirnerova choroba, parazitózy, způsobené živočichy, houbami a/nebo prvoky, polycystické onemocnění ledvin, odmítnutí transplantátu (host versus graft disease) a dna.
so Látky podle vynálezu inhibují katalytickou aktivitu proteinkinas prostřednictvím interakce těchto sloučenin s ATP-vazebným místem těchto enzymů. Takovéto sloučeniny jsou zejména žádoucí pro redukci nadměrného buněčného růstu, neboť umožňují inhibici kinasové aktivity bez ohledu na příčinu nadměrné kinasové aktivity vedoucí k hyperproliferaci. Sloučeniny podle tohoto vynálezu jsou tedy aktivní v situacích, ve kterých je mutovaná kinasa hyperaktivní, a situacích, ve kterých je kinasa přítomná ve zvýšených hladinách. Sloučeniny podle vynálezu mohou rovněž
-3 CZ 303327 B6 blokovat nadbytečnou kinasovou aktivitu v situacích, kdy další proteinový partner regulující danou kinasu je přítomen v nadbytečných hladinách, neboje mutován či je jeho vazba ke kinase zvýšená. Konečně, sloučeniny podle tohoto vynálezu, které blokují kinasovou aktivitu prostřednictvím interakce s ATP vazebným místem enzymu, jsou rovněž vhodné pro inhibici kinasové aktivity v situacích, kdy přirozený proteinový inhibitor komplexů s kinasou je mutován.
Studie probíhající s deriváty podle tohoto vynálezu prokázaly, kromě jiného, silný účinek na apoptózu v řadě nádorových buněčných linií. Bylo pozorováno, že apoptóza může být indukována ve fázi Gi nebo G2 a v souvislosti s poškozením DNA; některé buňky zastaví v G] fázi a poté je indukována p53-dependentní apoptotická dráha. V jiných situacích dochází k tomu, že buňky zastavují v G2/M přechodu jako reakce na poškození DNA a pak je pozorována aktivace p53nezávislé apoptotické dráhy. Tato dráha je zejména významná v terapii nádorů, u kterých je pozorován nedostatek aktivního p53. Je proto důležitá i aplikace nových derivátů, které stimulují p53-nezávislou apoptózu v buňkách, které se zastavily v G2 fázi vlivem poškození DNA při použití léčiv jakými jsou mitoxantron nebo cis-platina. Inhibitory z tohoto vynálezu tak mohou zvýšit terapeutický potenciál současně používaných protinádorových látek.
Předmětem vynálezu jsou také substituční deriváty Nó-benzyladenosin-5'-monofosfátu obecného vzorce I pro použití jako léčiva pro potlačení imunostimulace, s výhodou pro léčbu arthritis nebo pro supresi odmítnutí transplantovaných orgánů.
Předmětem vynálezu jsou také použití substitučních derivátů N6-benzyladenosin-5'-monofosfátu obecného vzorce I pro výrobu léčiva pro potlačení imunostimulace, s výhodou pro léčbu arthritis nebo pro supresi odmítnutí transplantovaných orgánů,
Předmětem vynálezu je rovněž použití substitučního derivátu N6-benzyladěnosin-5'-monofosfátu obecného vzorce 1 v tkáňových kulturách k regulaci proliferace a morfogeneze buněk.
Předmětem vynálezu je rovněž použití sloučeniny obecného vzorce 1 při přípravě afinitních .io adsorpčních nosičů, i mobilizovaných enzymů pro kontrolu výrobních procesů, reagencií pro imunodetekci, diagnostických vzorků, 14C, Ή, avidinem a biotinem značených sloučenin a oligonukleotidů.
Předmětem vynálezu je také použití sloučeniny obecného vzorce 1 pro in vitro klonování rostl in35 ných i zvířecích, s výhodou savčích (s výjimkou člověka), zárodečných buněk a embryí, s výhodou oocytů.
Předmětem vynálezu je dále použití sloučeniny obecného vzorce I jako růstových regulátorů rostlin, mikroorganismů, kvasinek, hub a zvířat, s výhodou savců s výjimkou člověka.
4«
Předmětem vynálezu jsou rovněž terapeutické přípravky, obsahující alespoň jeden substituční derivát N6-benzyladenosin-5'-monofosfátu obecného vzorce I či farmaceuticky přijatelnou sůl takovéto sloučeniny a alespoň jeden farmaceuticky přijatelný nosič. S výhodou se jedná o farmaceutické přípravky.
Výhodnými sloučeninami podle vynálezu jsou sloučeniny obecného vzorce 1 vybrané ze skupiny zahrnující: 6-(2-hydroxybenzylamino)purin ribosid-5'-monofosfát, 6-(2-hydroxy-3-methoxybenzylamino)purin ribosid-5'-monofosfát, 6-(2-hydroxy-4-methoxybenzylamino)purin ribosid-5'-monofosfát, 6-{2-hydroxy-5-methoxybenzylamino)purin ribosid-5'-monofosfát, 6-{250 hydroxy-3-chlorbenzy1amino)purin ribosid-5'-monofosfát, 6-(2-hydroxy-5-chlorbenzylamino)purin ribosid-5'-monofosfát, 6-(2-hydroxy-3-jodbenzylamÍno)purin ribosid-5'-monofosfát, 6-(2-hydroxy-3-fluorbenzylamino)purin ribosid-5'-monofosfát, 6—(2~hydroxy-5-ťl uorbenzy lam inojpurin ribosíd-5'-monofosfát, 6-(2-hydroxy-3-methyl benzy lam ino)purin ribosid5'-monofosfát, 6-(2-hydroxy-5-methylbenzylamino)purin ribosid-5'-monofosfát.
-4CZ 303327 B6
Výchozím materiálem pro přípravu sloučenin obecného vzorce I je 6-chlorpurin ribosid-5 monofosfát. Dalším výchozím materiálem pro přípravu sloučenin obecného vzorce I je 6-brotnpurin. ribosid-5'-monofosfátu, oba výchozí materiály jsou známé z literatury a komerčně dostup5 né. Výchozím materiálem pro přípravu sloučenin obecného vzorce Ije také 6-fluorpurin ribosid5'-monofosfátu, který lze připravit z 6-chlorpurinu ribosid-5'-monofosfátu reakcí s triethylaminem za vzniku kvartémí amoniové soli, která pak reakcí s tetrabutylamonium trifenyldifluorsilikátem v dimethylformamidu může být převedena na 6-fluorpurin ribosíd-5'-monofosfát (Gurvich et al., Nucleos. Nucleot. 18: 2327 (1999)). ** io
Dalším výchozím materiálem pro přípravu sloučenin obecného vzorce 1 jsou substituované benzylaminy. Ty, které obsahují jednu nebo více hydroxylových skupin, nejsou komerčně dostupné a mohou být připraveny demethylaci příslušných methoxy derivátů pomocí 48% HBr v atmosféře N2.
is
Předmětem vynálezu je rovněž způsob přípravy substitučních derivátů N6-benzyladenosin-5'monofosfátu obecného vzorce I, ve kterém Ran mají výše uvedené významy a jehož podstata spočívá v tom, že se 6-halogenidpurin ribosid-5-monofosfát, kde halogen je vybrán ze skupiny zahrnující chlor, brom a fluor, nukleofilně substituuje benzylaminem substituovaným jedním až zo čtyřmi substituenty R, mající význam uvedený výše, stejnými nebo různými.
Terapeutické přípravky
Terapeutický přípravek obsahuje od 1 do 95 % aktivní látky, přičemž jednorázové dávky obsahu25 jí přednostně od 20 do 90 % aktivní látky a při způsobech aplikace, které nejsou jednorázové, obsahuje přednostně od 5 do 20 % aktivní látky. Jednotkové dávkové formy jsou např. potahované tablety, tablety, ampule, lahvičky, čípky nebo tobolky. Jiné formy aplikace jsou např. masti, krémy, pasty, pěny, tinktury, rtěnky, kapky, spreje, disperze atd. Příkladem jsou tobolky obsahující od 0,05 do 1,0 g aktivní látky.
Farmaceutické přípravky podle předloženého vynálezu jsou připravovány známými způsoby, např. běžným mícháním, granulací, potahováním, rozpouštěcími nebo lyofilizaěními procesy. Přednostně jsou používány roztoky aktivních látek a dále také suspenze nebo disperze, obzvláště izotonické vodné roztoky, suspenze nebo disperze, které mohou být připraveny před použitím, např. v případě lyofilizovaných preparátů obsahujících aktivní látku samotnou nebo s nosičem jako je mannitol. Terapeutické přípravky mohou být sterilizovány a/nebo obsahují excipienty, např. konzervační přípravky, stabilizátory, zvlhčovadla a/nebo emulgátory, rozpouštěcí činidla, soli pro regulaci osmotického tlaku a/nebo pufry. Jsou připravovány známým způsobem, např. běžným rozpouštěním nebo lyofilizací. Zmíněné roztoky nebo suspenze mohou obsahovat látky zvyšující viskozitu, jako např. sodnou sůl karboxymethylcelulózy, dextran, polyvinylpyrrolidon nebo želatinu.
Olejové suspenze obsahují jako olejovou složku rostlinné, syntetické nebo sem i syntetické oleje obvyklé pro injekční účely, například kapalné estery mastných kyselin, které obsahují jako kyse45 lou složku mastnou kyselinu s dlouhým řetězcem majícím 8 až 22, s výhodou pak 12 až 22 uhlíkových atomů, např. kyselinu laurovou, tridekanovou, myristovou, pentadekanovou, palmitovou, margarovou, stearovou, arachidonovou a behenovou, nebo odpovídající nenasycené kyseliny, např. kyselinu olejovou, alaidikovou, eurikovou, brasidovou a linolenovou, případně s přídavkem antioxidantu, např. vitaminu E, β-karotenu nebo 3,5-di-ter/-butyl-4-hydroxytoluenu. Alkoholo50 vá složka těchto esterů mastných kyselin má do 6 uhlíkových atomů a je mono- nebo polyhydrická, např. mono-, di- nebo trihydrické alkoholy jako methanol, ethanol, propanol, butanol nebo pentanol a jejich isomery, ale hlavně gly kol a glycerol. Estery mastných kyselin jsou s výhodou např. ethyloleát, isopropylmyristát, isopropylpalmitát, „Labrafril M 2375“ (polyoxyethylenglycerol trioleát, Gattefoseé, Paříž), „Labrafil M 1944 CS“ (nenasycené polyglykolované
- 5 CZ 303327 B6 acylgJyceroly připravené alkoholýzou oleje z meruňkových jader a složení z acylglycerolů a esterů polyethylenglykolu; Gattefoseé, Paříž), „Labrasol“ (nasycené po lyglykol ovane acylglyceroly připravené alkoholýzou TCM a složené z acylglycerolů a esterů polyethylenglykolu; Gattefoseé, Paříž) a/nebo „Miglyol 812“ (triacylglycerol nasycených mastných kyselin s délkou řetězce C8 až
C i2 od Hiils AG, Německo) a zvláště rostlinné oleje jako bavlníkový olej, mandlový olej, olivový olej, ricinový olej, sesamový olej, sójový olej a zejména olej z podzemnice olejně.
Příprava injekčního přípravku se provádí za sterilních podmínek obvyklým způsobem, např. plněním do ampuli nebo lahviček a uzavíráním obalů.
io
Farmaceutické přípravky pro orální použití se mohou získat smícháním aktivní látky s jedním nebo více tuhými nosiči, případnou granulací výsledné směsí, a pokud je to požadováno, zpracováním směsi nebo granulí do tablet nebo potahovaných tablet přídavkem dalších neutrálních látek.
Vhodné nosiče jsou obzvláště plnidla jako cukry, např. laktosa, sacharosa, mannitol nebo sorbitol, celulózové preparáty a/nebo fosforečnany vápníku, s výhodou fosforečnan vápenatý nebo hydrogenfosforečnan vápenatý, dále pojivá jako škroby, s výhodou kukuřičný, pšeničný, rýžový nebo bramborový škrob, methylcelulóza, hydroxypropylmethylcelulóza, sodná sůl karboxy20 methylcelulózy a/nebo polyvinylpyrrolidin, a/nebo popřípadě desintegrátory jako výše zmíněné škroby a dále karboxy methylový škrob, zesítěný polyvinylpyrrolidin, alginová kyselina a její soli, s výhodou alginát sodný. Další neutrální látky jsou regulátory toku a lubrikanty, s výhodou kyselina salicylová, talek, kyselina stearová a její soli jako stearát hořečnatý a/nebo vápenatý, polyethylenglykol nebojeho deriváty.
Jádra potahovaných tablet mohou být potažena vhodnými potahy, které mohou být odolné vůči žaludeční šťávě, přičemž používané potahy jsou mezi jinými koncentrované roztoky cukrů, které mohou obsahovat arabskou gumu, talek, polyvinylpyrrolidin, polyethylenglykol a/nebo oxid titaničitý, dále potahovací roztoky ve vhodných organických rozpouštědlech nebo směsích rozpouš30 tědel, či pro přípravu potahů odolných vůči žaludeční šťávě roztoky vhodných celulózových preparátů jako acetylcelulózaftalát nebo hyd roxy propyl methyl cel ulózafosfát. Barviva nebo pigmenty jsou přimíchávány do tablet nebo potahovaných tablet např. pro identifikaci nebo charakterizaci různých dávek účinné složky.
Farmaceutické přípravky, které mohou být užívány orálně, jsou také tvrdé tobolky ze želatiny nebo měkké uzavřené tobolky ze želatiny a změkčovadla jako glycerol nebo sorbitol. Tvrdé tobolky mohou obsahovat aktivní látku ve formě granulí, smíchanou např. s plnidly jako je kukuřičný škrob, pojivý nebo lubrikanty jako talek nebo stearát horečnatý, a se stabilizátory. V měkkých tobolkách je aktivní látka přednostně rozpuštěna nebo suspendována ve vhodných kapal40 ných látkách neutrální povahy jako mazací tuk, parafínový olej nebo kapalný polyethylenglykol či estery mastných kyselin a ethylen nebo propy lenglykolu, přičemž je také možno přidat stabilizátory a detergenty např. typu esterů polyethylensorbitanových mastných kyselin. Další formy orálního podávání jsou např, sirupy připravované běžným způsobem, které obsahují aktivní složku např. v suspendované formě a v koncentraci okolo 5 až 20 %, přednostně okolo 10 % nebo podobné koncentrace, která umožňuje vhodnou individuální dávku, např. když je měřeno 5 nebo 10 ml. Ostatní formy jsou např. práškové nebo kapalné koncentráty pro přípravu koktejlů, např. v mléce. Takovéto koncentráty mohou být také baleny v množství odpovídajícím jednotkové dávce.
Farmaceutické přípravky, které mohou být používány rektálně, jsou např. čípky, které obsahují kombinaci aktivní látky se základem. Vhodné základy jsou např. přírodní nebo syntetické triacylglyceroly, parafínové uhlovodíky, polyethylenglykoly nebo vyšší alkoholy.
Přípravky vhodné pro parenterální podání jsou vodné roztoky aktivní složky ve formě rozpustné ve vodě, např. ve vodě rozpustná sůl nebo vodná injekční suspenze, která obsahuje látky zvyšují-6CZ 303327 B6 cí viskozitu, např. sodnou sůl karboxymethy lcelulózy, sorbítol a/nebo dextran, a stabilizátory tam, kde je to vhodné. Aktivní látka může být také přítomna ve formě lyofílizátu společně s excipíenty, kde je to vhodné a může být rozpuštěna před parenterální aplikací přidáním vhodných rozpouštědel. Roztoky, které jsou použity pro parenterální aplikaci, mohou být použity např. i pro infúzní roztoky. Preferovaná konzervovadla jsou s výhodou antioxidanty jako kyselina askorbová, nebo mikrobicidy kyselina sorbová či benzoová.
Tinktury a roztoky obvykle obsahují vodně-ethanolickou bázi, ke které jsou přimíchána zvlhčovadla pro snížení odpařování jako jsou polyalkoholy, např. glycerol, glykoly a/nebo polyethylenio glykol, dále promazávadla jako estery mastných kyselin a nižších polyethyfenglykolů, tj. tipofilní látky rozpustné ve vodné směsi nahrazující tukové látky odstraněné z kůže ethanolem, a pokud je to nutné, i ostatní excipienty a aditiva.
Látky mohou být podávány profylakticky nebo terapeuticky, jako takové nebo ve formě terapeu15 tických přípravků, přednostně v množství které je efektivní proti zmíněným nemocem, přičemž u teplokrevných živočichů, např. člověka, vyžadujícího takového ošetření, je látka používána zejména ve formě farmaceutického přípravku. Na tělesnou hmotnost okolo 70 kg je aplikována denní dávka látky okolo 0,1 až 5 g, s výhodou 0,5 až 2 g.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1 ukazuje inhibici růstu nádorových buněčných linií CEM (A) a HL60 (B) sloučeninami obecného vzorce I. Cytotoxicita byla stanovena pomocí testu Calcein AM. Aktivita je vyjádřena v procentech maximální aktivity (v nepřítomnosti inhibitoru). ZR: zeatin r i bos id 5'mono fosfátu; sloučenina 21: oríAo-topoIin, ribosid-5'-monofostátu; 2: 6-(3-fluorbenzylamino)purin ribosid-5 -monofosfátu; 5: ó-(3-chlorbenzylamino)purin ribosid-5'-monofosfátu; 28: 6-(2hydroxy-3-methoxy benzy lamino)purin ribosid-5'-monofosfátu.
Obr. 2 ukazuje vliv sloučeniny 21 na konfiguraci DNA. Procento apoptotické sub Gl frakce. Nádorová linie CEM byla inkubována se sloučeninou 21 v koncentracích odpovídajících IC50 (tj. 1,3 μΜ, ·), trojnásobku 1C50 (A) a pětinásobku IC50 (). K buňkám v kontrolním experimentu (o) bylo přidáno DMSO vehikulum.
Obr. 3 ukazuje indukce aktivity kaspázy 3 látkou 21(10 μΜ).
Obr. 4 ukazuje vliv sloučeniny 21 na morfologii jader u buněk HL-60. a) Jádra buněk kultivovaných za standardních podmínek v médiu bez 21, b) jádra buněk kultivovaných v médiu s přídavkem 5 μΜ 21 po dobu 24 hodin.
Obr. 5 ukazuje indukci p21WAF_1 v buňkách MCF-7 po přídavku sloučeniny 28 v různých koncentracích.
Obr. 6 ukazuje indukci p21WAF_I v buňkách MCF—7 v rozmezí 6 až 24 hodin po přídavku slou45 ceniny 28 v 1 μΜ koncentraci.
Příklady provedení vynálezu
Vynález je dále popsán v následujících příkladech, aniž by byl jimi jeho rozsah jakkoliv omezen.
Výchozí suroviny pro sloučeniny obecného vzorce 1 jsou dostupné z komerčních zdrojů (SigmaAldrich, Fluka, Olchemim, atd.). Teploty tání byly stanoveny na Kofflerově bloku a nebyly korigovány. Odpařování rozpouštědel bylo prováděno na rotační vakuové odparce při teplotách
-7CZ 303327 B6 pod 80 °C. fH NMR spektra (σ, ppm; J, Hz) byla měřena na přístroji Varian VXR—400 (400 MHz) nebo na přístroji Varian Unity 300 (300 MHz). Všechna spektra byla změřena při 25 °C za použití tetramethylsilanu jako vnitřního standardu. ES+MS spektra m/z (rel. %, složení, odchylka) byla měřena na VG 7O7OE spektrometru (70 eV, 200 °C, přímý nástřik). Quad MS spektra byla měřena na přístroji Micromass ZMD detektoru s ionizací elektrosprayem. Merck silikagel Kieselgel 60 (zrnitost 230 až 400) byl použit na sloupcovou chromatografii. Všechny sloučeniny vykázaly uspokojivé elementární analýzy (± 0,4 %).
io Příklad I: Příprava sloučenin obecného vzorce I
Látky byly připraveny z 6-chlorpurin-9p-D-ribosidu-5'-O-monofosfátu, dihydrátu disodné soli, nukleofílní substitucí příslušným substituovaným benzylaminem v přítomnosti N,N-diisopropyl-N-ethy laminu v methanolu. Reakce byla prováděna při 90 °C 12 hodin za atmosférického tlaku. Po vakuovém odpaření rozpouštědla byl surový produkt přečištěn pomocí flash chromatografie na reverzní fázi Cl8; mobilní fáze: 15% methanol. Rekrystalizace z 2-propanolu jako disodná sůl. Čistota finálního produktu 95 % (HPLC), výtěžek 60 až 70 %.
Tabulka 1: Látky připravené způsobem podle příkladu 1 (uvedené sloučeniny jsou disodné soli bezvodé)
č. Substituent v poloze 6 purinu Elementární analýza vypočteno/nalezeno
%C %H %N ES-MS [M-H-]
21 2-hydroxy benzy lamí no 41,1/41,0 3,9/3,9 16,9/16,7 451
26 2,3-dihydroxybenzylamino 39,8/39,9 3,5/3,5 13,6/13,5 468
28 2-hy droxy-3- methoxybenzylamino 41,0/41,2 3,8/3,8 13,3/13,3 482
29 2-hydroxy-5- methoxy benzy lamino 41,0/41,1 3,8/3,7 13,3/13,2 482
42 2-hy droxy-3 - methy i benzy 1 ami no 42,3/42,3 3,9/3,8 13,7/13,5 466
43 2-hy droxy-3-fluorbenzy lamino 39,6/39,4 3,3/3,3 13,6/13,5 470
44 2-hy droxy-3-j odobenzy lamino 32,8/32,7 2,7/2,7 11,2/11,1 578
45 2-hydroxy-5- methoxybenzylamino 41,0/41,0 3,8/3,8 13,3/13,0 482
46 2-hydroxy-5- methylbenzy lamino 42,3/42,4 3,9/3,9 13,7/13,9 466
47 2-hydroxy-5- chlorbenzy lamino 38,4/38,5 3,2/3,2 13,2/13,0 486
48 2-hy droxy-5 -fluorbenzy lam ino 39,6/39,4 3,3/3,3 13,6/13,5 470
-8CZ 303327 B6
Příklad 2 mmol 6-fluorpurin ribosid-5 -monofosfátu byly rozpuštěny v 15 ml n-propanolu a bylo přidá5 no 3,15 mmol 2,3-d i hydroxy benzy laminu hydrobromidu a 10 mmol triethylaminu. Roztok byl zahříván na 90 °C po dobu 6 hodin. Po ochlazení byl surový produkt odfiltrován, promyt vychlazeným (5 °C) n-propanolem (2x 5 ml) a purifikován pomocí RP Cl8 flash chromatografie; mobilní fáze: 15 až 20% methanol. Rekrystalován z ethanolu. TLC: chloroform-methanolamoniak (90:9:0,1). Výtěžek 65 až 70 %. io
Tabulka 2: Látky připravené způsobem podle příkladu 2 (uvedené sloučeniny jsou disodné soli bezvodé)
č. Substituent v poloze 6 purinu Elementární analýza vypočteno/nal ezeno
%c %H %N ES-MS [M-H']
26 2,3 -dihy droxy benzy lamino 39,8/39,6 3,5/3,5 13,6/13,5 468
27 3,5 -dihy droxy benzy 1 amino 39,8/39,8 3,5/3,5 13,6/13,4 468
28 2-hydroxy-3- methoxybenzy lamino 41,0/41,2 3,8/3,8 13,3/13,3 482
Příklad 3: In vitro cytotoxická aktivita nových derivátů zo Protože toxické látky negativně ovlivňují metabolické procesy buňky, řada standardních metod hodnocení cytotoxicity je založena na měření metabolizace umělých substrátů. Vznikající produkt je potom kvantifikován pomocí spektrometrie. Tyto testy je snadné provádět v 96-jamkových destičkách. Sloučeniny, které jsou předmětem tohoto vynálezu, byly hodnoceny pomocí testu založeného na kvantifikaci metabolizace Calceinu AM v mikrotitračních destičkách. Tento test je využíván v programech pro screening léků a pro testy chemosensitivity. V živých buňkách je Calcein AM enzymaticky hydrolyzován a jeho kumulace se projeví jako zelená fluorescence.
V rutinním screeningu byly použity následující lidské linie: CEM (T-lymfoblastická leukémie), HL-60 (promyelocytická leukémie), K-562 (erythroidní leukémie), MCF-7 (adenokarcinom prsu), HOS (osteosarkom) a G-361 (melanom). Dále byly použity lidské fibroblasty BJ. Buňky byly udržovány v Nunc/Coming 80 cm2 plastikových lahvích a pěstovány v médiu pro buněčné kultury (DMEM obsahující 5 g/I glukózy, 2 mM glutaminu, 100 Li/ml penicilinu, 100 pg/ml streptomycinu, 10% fetálního telecího séra a hydrogenuhličitan sodný), sloučeniny byly připraveny podle postupu popsaného v této patentové přihlášce.
Buněčné suspenze byly připraveny a naředěny podle typu buněk a podle očekávané konečné hustoty buněk (2500 až 30 000 buněk na jamku na základě charakteristik buněčného růstu). Do jednotlivých jamek 96-jamkové mikrotitrační destičky se pípetovalo 80 μί buněčné suspenze. Inokuláty byly stabilizovány 24 hodinovou preinkubací při 37 °C v atmosféře CO2. Jednotlivé koncentrace testovaných látek byly do jamek mikrotitračních destiček přidány v čase nula jako 20μ1 alikvotní podíl. Obvykle se sloučeniny ředily do šesti koncentrací v trojnásobné ředicí řadě.
-9CZ 303327 B6
Pri rutinním testování byla nejvyšší koncentrace v jamce 166,7 μΜ, změny této koncentrace závisí na dané látce. Všechny koncentrace byly testovány v triplikátu. Inkubace buněk s testovanými deriváty trvala 72 hodin pří 37 °C, 100% vlhkosti a v atmosféře CO? Na konci inkubační periody byl k buňkám přidán roztok Calceinu AM (Molecular Probes) v PBS (finální koncentrace v mé5 diu I pg/ml). Inkubace probíhala další 1 hodinu. Fluorescence (FD) byla měřena pomocí Labsystem FIA readeru Fluoroskan Ascent (Microsystems). Přežití nádorových buněk (The tumor cell survival-TCS) bylo spočítáno podle následujícího vztahu: GI=50(FDjamka s derivátem /FDkontrolní jamka) x 100 %. Hodnota GI50, která odpovídá koncentraci látky, způsobující 50% redukci esterázové aktivity, byla vypočtena ze získaných dávkových křivek (Obr. 1).
io
Pro vyhodnocení protinádorové aktivity byla testována toxicita nových derivátů na panelech obsahujících buněčné linie rozdílného histogenetického a druhového původu (Tab. 3). Ukázalo se, že pro všechny testované nádorové linie bylo působení nových sloučenin, zatímco nemaligní buněčné linie, tzn. BJ fibroblasty, byly vůči tomuto působení rezistentní. Účinné deriváty zabily nádorové buňky pri koncentracích blízkých 0,1 až 50 μΜ.
Tabulka 3: Cytotoxicita Nó-substituovaných derivátů adenosinu pro různé nádorové buňky
Použitá buněčná linie / Gl 50 (pmol/L)
HOS K-562 MCF7 BJ G-361 CEM HL60
adenosin >166,7 >166,7 >166,7 >166,7 >166,7 >166,7 >166,7
zeatin ribosid >166,7 >166,7 >166,7 >166,7 >166,7 >166,7 >166,7
Substituent v poloze 6 purinu
2 -hydroxy benzy lamino 2,5 4 10,5 43,2 13,5 1,3 0,48
2-hydroxy-3-methoxybenzylamino 24,1 2,1 30,4 69,7 27,9 0,3 0,5
3-hydroxy-4-methoxybenzylamino >166,7 >166,7 >166,7 >166,7 79,3 68,9
2-hydroxy-5-methoxybenzylamino 6,4 15,4 21 87,9 12,3 0,9 0,54
2-hydroxy-5-chlorbenzylamino 10,6 15,7 18 63,4 12,5 0,6 0,47
2-hydroxy-5-fluorbenzylamino 9,1 13,4 16 58,7 10,7 0,5 0,53
Příklad 4: Indukce apoptózy nádorových buněk
Pro analýzu mechanizmu indukované cytotoxicity nových sloučenin je důležité odlišit apoptózu od druhé hlavní formy buněčné smrti, nekrózy. Zaprvé, na úrovni tkáně apoptóza produkuje malý nebo žádný zánět, protože okolní buňky, zvláště makrofágy, spíše než že jsou uvolněny do extracelulární tekutiny, pohltí jednotlivé části buňky. Naproti tomu při nekróze je buněčný obsah uvolněn do extracelulámí tekutiny, což způsobuje zánět. Zadruhé, na buněčné úrovni vykazují apoptotické buňky smršťování a blebbing (puchýřkování) cytoplasmy, zachování struktury buněčných organel včetně mitochondrií, kondenzaci chromatinu, fragmentaci jádra a tvorbu apoptotických tělísek, ačkoli ne všechny jsou vidět u všech typů buněk. Zatřetí, na molekulární úrovni hraje významnou roli v indukci apoptózy řada biochemických procesů. Většina z nich však není dobře pochopena a mají za následek aktivaci proteáz a nukleáz, které nakonec ničí klíčové biologické makromolekuly - proteiny a DNA:
- 10CZ 303327 B6
Hodnocení apoptózy pomocí měření aktivity kaspázy-3
Během apoptózy dochází k aktivaci kaspázové kaskády. Kaspáza-3 je efektorovou kaspázou hrající roli v indukci některých změn charakteristických pro apoptózu (kondenzace chromatinu, fragmentace DNA).
Nádorová linie CEM byla udržována v médiu pro buněčné kultury (DMEM obsahující 5 g/1 glukózy, 2 mM glutaminu, 100 U/ml penicilinu, 100 pg/ml streptomycinu, 10% fetálního telecího io séra a hydrogenuhličitan sodný). 24 hodin před otravou byly buněčné suspenze zcentri fugo vány, naředěny čerstvým médiem na koncentraci 500 000 buněk na 1 ml a rozpipetovány po 50 μί do jamkové desky. Po inkubaci s testovanou látkou po 12 a 24 hodin byla aktivita kaspázy-3 vyhodnocena pomoct komerčního kitu (Apo-ONE, Promega), jehož principem je hydrolýza fluorogenního substrátu Z-DEVD-R110 (excitace 480/ emise 520). Specifita reakce byla ověře15 na v kontrolním experimentu, kde byl kromě oTRMP přítomen i inhibitor kaspázy-3 Ac-DEVD~ CHO. Všechny experimenty byly provedeny v triplikátu.
Z obr. 2 je zřejmé, že ortho-topolin ribosid-5'-monofosfát (sloučenina 21) aktivuje kaspázu-3 a že míra aktivace je závislá na čase působení.
Příklad 5: Analýza apoptózy pomocí průtokové cytometrie (indukce fragmentace DNA).
Jedním z průvodních jevů apoptózy je fragmentace DNA. Tu je možné s výhodou detekovat pomocí průtokové cytometrie po obarvení jader propidium jodidem. Protože fragmentace vede ke ztrátě části jaderné DNA, apoptotické buňky mají nižší obsah DNA než buňky v Gl fázi buněčného cyklu a na histogram jsou patrné jako tzv. sub G1 frakce.
Nádorová linie CEM byla udržována v médiu pro buněčné kultury (DMEM obsahující 5 g/1 glukózy, 2 mM glutaminu, 100 U/ml penicilinu, 100 pg/ml streptomycinu, 10% fetálního telecího séra a hydrogenuhličitan sodný). 24 hodin před otravou byly buněčné suspenze zcentrifugovány, naředěny čerstvým médiem na koncentraci 100 000 buněk na 1 ml a rozpipetovány po 10 ml do Petriho misek. Po inkubaci s látkou po daný časový úsek, byly buňky zcentrifugovány (4 °C, 600 g), promyty PBS (4 °C) a fixovány 70% ethanolem při teplotě -20 °C přes noc. Fragmenty DNA o nízké molekulové hmotnosti byly extrahovány citrátovým pufrem (11,36 g citrátu trisod35 ného dihydrátu /1). Jádra byla obarvena roztokem propidium iodidu v PBS (10 pg/ml) obsahujícím RNasu A (60 IU na vzorek). Po 1 hodinové inkubaci byly vzorky analyzovány průtokovým cytometrem (excitace 488 nm, emise nad 620 nm).
Jak je vidět z Obr. 3, indukce fragmentace DNA v nádorové linii CEM je závislá na koncentraci sloučeniny 21 a čase jejího působení. Účinek je patrný již po 12 hodinách.
Příklad 6: Detekce apoptózy na základě morfologie buněk
Kultivace buněk. Suspenze lidských leukemických buněk, linie HL-60 byla kultivována v médiu RPMI-1640 doplněném 10% telecím fetálním sérem a antibiotiky v atmosféře 5% CO2 při 37 °C. Počet buněk je stanoven pomocí hemocytometru. Buňky byly získány z ECACC.
Viabilita buněk. Buňky jsou barveny kombinací fluorescein diacetátu (FDA, 2 pg/ml) a propi50 dium jodidu (Pl, 10 pg/ml) přímo v růstovém médiu. Rozlišování živých a mrtvých buněk se provádí pomocí fluorescenčního mikroskopu (Mlejnek and Kolman, Chem, Biol. Internet. 1999, 117: 219 až 239).
- 11 CZ 303327 Β6
Morfologická analýza buněčných jader. Buňky jsou promyty v PBS a pak fixovány ve směsi mcthanol/kyselina octová (3:1) při -20 °C po dobu 12 hodin. Fixované buňky jsou nakapány na podložní sklíčka a barveny Hoechst 33342 (2 pg/ml) v PBS/glycerol (v/v 70:30). Morfologie buněčných jader je pozorována pod fluorescenčním mikroskopem Olympus BX60, (Mlejnek and Kuglík 2000, J. Cell. Biochem. 2000, 77: 6 až 17). Průkaz apoptotických buněk touto metodou je znázorněn na obr. 4.
Příklad 7: Indukce proteinu p21WAF přirozeného inhibitoru cyklin-dependentních kinas, působením sloučeniny 28 v buněčné linii karcinomu prsu MCF-7 - molekulární mechanismus účinku Změny hladiny proteinu p21WAF 1 v závislosti na koncentraci sloučeniny 28
Na buňky MCF-7 kultivované pri 37 °C v atmosféře s 5% CCL v médiu D-MEM s přídavkem 10% fetálního telecího séra působily koncentrace 28 v rozmezí 0 až 100 μΜ. 28 byl do média přidáván ze lOOmM zásobního roztoku v DMSO. Po 12 hodinách byly buňky sklizeny seškrabáním do média, centrifugovány (1000 otáček za minutu, 4 °C, 5 min), 2x promyty ledovým PBS a následně opět centrifugovány. Následovala lyže buněk lx CSB (nanášecí pufr pro SDS-PAGE, tj. elektroforézu proteinů v polyakrylamidovém gelu za přítomnosti SDS). Proteiny v lyzátu byly separovány SDS-PAGE a přeneseny na nitrocelulózovou membránu. Membrána byla zablokována roztokem 5% odtučněného mléka + 0,1% Tween 20 v PBS. Hladina proteinů p21WAF 1 a akt i nu (jako kontrola nanášeného množství proteinu) byla sledována imunochemícky pomocí komerčně dostupných specifických monoklonálních protilátek Anti-WAFl (Ab-1, Calbiochem) a Anti-Actin (Cloně AC-40. Sígma-Aldrich). Pro detekci navázaných protilátek byla použita králičí sekundární protilátka značená peroxidázou (RAM-Px, DAKO) s následnou chemiluminiscencí (ECL, Amersham-Pharmacia). Účinné indukce proteinu p21WAF 1 je v buňkách MCF-7 dosaženo působením koncentrací 28 v řádu jednotek gmol na litr kultivačního média (Obr. 5). Změny hladiny proteinu p21WAF 1 v závislosti na době inkubace se sloučeninou 28
Buňky MCF-7 byly inkubovány v přítomnosti ΙμΜ sloučeniny 28. V různých časových intervalech od podání 28 byly buňky sklizeny a lyžovány. Následná SDS-PAGE a imunodetekce umožnila stanovení změn hladiny proteinu p21WAF1 v závislosti na délce inkubace v přítomnosti 28. Kultivace buněk, jejich sklizení, lyže a detekce proteinů p21WAF_1 a aktinu v lyzátech probíhala obdobně jako v bodě 1. K účinné indukci p21w F_1 v buňkách MCF-7 dochází v rozmezí 6 až 24 hodin po přídavku 28 v ΙμΜ koncentraci (Obr. 5).
Příklad 8; Imunosupresivní aktivita
Jedním z důležitých parametrů specifické buněčné imunity je odezva lymfocytů na antigeny nebo polyklonální mitogeny. Většina normálních savčích periferních lymfocytů je v klidové fázi buněčného cyklu. Antigeny i nespecifické polyklonální mitogeny mají schopnost aktivovat lymfatické buňky, což je doprovázeno dramatickými změnami ve vnitro buněčném metabolismu (mitochondriální aktivita, proteinová syntéza, syntéza nukleových kyselin, formování blastů a buněčná proliferace). Sloučeniny, které jsou schopné selektivně inhibovat proliferaci lymfocytů, jsou potenciálními imunosupresivy. Pro měření proliferační odpovědi lymfocytů bylo vyvinuto množství in vitro analýz. Nejběžněji používanou metodou je inkorporace H-thymidinu.
Během buněčné proliferace dochází nejprve k replikaci DNA, poté je buňka rozdělena na dvě dceřinné buňky. Tento úzký vztah mezi buněčným zdvojením a DNA syntézou poskytuje možnost pro vyhodnocení intenzity buněčné proliferace. Jestliže jsou značené DNA prekurzory přidány do buněčné kultury, dělící se buňky inkorporují značené nukleotidy do své DNA. Tyto testy obvykle vyžadují použití radioaktivně značených nukleotidů, konkrétně tritiovaný thymidin
- 12 CZ 303327 B6 ([3H]-TdR). Množství [3H]-TdR inkorporované do buněčné DNA je kvantifikováno pomocí scintilačního počítače.
Lidskou heparin izo vanou periferní krev jsme získali od zdravých dobrovolníků punkcí z kubitál5 ní žíly. Krev byla nareděna v PBS (1:3) a mononukleámí buňky byly odseparovány centrifugací ve Ficoll-Hypaque hustotním gradientu (Pharmacia, 1,077 g/ml) při 2200 g po dobu 30 minut. Při následující centrifugací byly lymfocyty promývány v PBS, poté resuspendovány v buněčném kultivačním médiu (RPMI 1640, 2 mM glutamin, 100 U/ml penicilín, 100 pg/ml streptomycin, 10% fetální telecí sérum a hydrogenuhličitan sodný).
io
Buňky byly naředěny na cílovou hustotu 1 100 000 buněk/ml a byly pipetovány (180 μΙ) do 96-ti jamkových mikrotitračních destiček. Testované látky byly přidány k buněčným suspenzím ve čtyřkovém ředění v 20μϊ alikvotech/jamku v čase nula. Obvykle byly testované sloučeniny vyhodnocovány v šesti koncentracích s nejvyšší testovanou koncentrací 266,7 μΜ. Jednotlivé kónus ccntrace derivátů byly testovány v dubletu. Lymfocyty ve všech jamkách s výjimkou nestimulovaných kontrol byly aktivovány přidáním 50 μΐ konkanavalinu A (25 pg/ml). Buněčné suspenze byly dále inkubovány 72 hodin při 37 °C a při 100% vlhkosti v atmosféře 5% CO2. Na konci inkubace byly buňky analyzovány pomocí [3H]-TdR:
io Buňky byly inkubovány s 0,5 pCi (20 μΐ zásobního roztoku 500 pCi/ml) na jamku po dobu 6 hodin pri 37 °C a 5% CO2. V dalším kroku byl použit automatizovaný buněčný harvestor pro lýzu buněk ve vodě a adsorpci DNA na filtr ze skleněných vláken o velikosti mikrotitračního panelu. DNA s inkorporovaným [3H]-TdR je zadržena na filtru, přičemž neinkorporovaný materiál filtrem prochází. Filtry byly usušeny při pokojové teplotě přes noc, uzavřeny v plastikových sáč25 cích s 10 až 12 ml scintilační tekutiny. Množství [3H]-TdR přítomné na každém filtru bylo stanoveno na scintilačním počítači. Efektivní imunosupresivní dávka (ED) byla spočítána podle následujícího vzorce: ED (CCPMjajn^a $test derivátem / prumema CCPM^q^q^í jamka) x 100 /o. Hodnota ED50, což je koncentrace látky inhibující proliferaci 50 % lymfocytů, byla spočítána z dávkových křivek.
Pro vyhodnocení imunosupresivní aktivity nových sloučenin byla analyzována jejich schopnost inhibovat polyklonálním mitogenem stimulovanou proliferaci normálních lidských lymfocytů (Tab. 4). Naše výsledky ukazují, že tyto sloučeniny mají minimální vliv na inkorporaci 3Hthymidinu v klidových (nestimulovaných) lymfocytech, nicméně účinně Ínhibují proliferaci mito35 genem aktivovaných lymfocytů. Efektivní imunosupresivní dávka nových derivátů za in vitro podmínek byla v rozmezí 10 až 40 μΜ.
Tabulka 4: Imunosupresivní aktivity nových sloučenin
SUBSTITUENT V Lidské lymFocyty
POLOZE 6 PURINU ED50 (μΜ)
2-hydroxybenzylammo 6,7
2-hydroxy-3-chlorbenzylamino 3,2
2-hydroxy-3-methoxybenzylamino 1,2
2-hydroxy-4-methoxybenzy lamino 2,1
- 13 CZ 303327 B6
Příklad 9: Suché tobolky
5000 tobolek, každá obsahující jako aktivní složku 0,25 g jedné ze sloučenin obecného vzorce I se připraví následujícím postupem:
Složení
Aktivní složka 1250g
Talek 180 g
Pšeničný škrob 120 g
Magnesium stearát 80 g Laktosa 20 g
Preparační postup: Rozetřené látky jsou protlačeny přes síto s velikostí ok 0,6 mm. Dávka 0,33 g směsi je přenesena do želatinové tobolky pomocí přístroje na plnění tobolek.
Příklad 10: Měkké tobolky
5000 měkkých želatinových tobolek, každá z nich obsahující jako aktivní složku 0,05 g jedné z látek sloučenin obecného vzorce 1 se připraví následujícím postupem:
Složení
Aktivní složka 250 g
Laurylglykol 2 litry
Preparační postup: Prášková aktivní látka je suspendována v Lauroglykolu® (propylenglykol laurát, Gattefcseé S. A., Saint Priest, Francie) a rozetřena ve vlhkém pulverizátoru na velikost částic asi 1 až 3 mm. Dávka o velikosti 0,419 g směsi je potom přenesena do měkkých želatinových tobolek pomocí přístroje na plnění tobolek.
Příklad 11: Měkké tobolky
5000 měkkých želatinových tobolek, každá z nich obsahující jako aktivní složku 0,05 g sloučeniny obecného vzorce I se připraví následujícím postupem:
Složení
Aktivní složka 250 g
PEG 400 1 litr
Tween 80 l litr
Preparační postup: Prášková aktivní látka je suspendována v PEG 400 (polyethylenglykol o Mr mezi 380 a 420, Sigma, Fluka, Aldrich, USA) a Tween* 80 (polyoxyethyíensorbitan monolaurát, Atlas Chem. Ind., Inc., USA, dodává Sigma, Fluka, Aldrich, USA) a rozetřena ve vlhkém pulverizátoru na částice o velikosti 1 až 3 mm. Dávka o velikosti 0,43 g směsi je potom přenesena do měkkých želatinových tobolek pomocí přístroje na plnění tobolek.

Claims (9)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    5 1. Substituční deriváty N‘'-benzy ladenos i n-5'-mono fosfátu obecného vzorce I, kde to (R)n znamená l az 4 substituenty R (n je v rozmezí 1 až 4), přičemž R mohou být stejné nebo rozdílné, a Rjsou vybrány ze skupiny zahrnující Ct až C8 alkyl, C| až C8 alkoxy, amino, halogen, hydroxy,
    15 merkapto a nitro skupinu, přičemž jeden ze substituentů R je hydroxyl v poloze 2 fenylu, a jejich farmaceuticky přijatelné soli.
  2. 2. Substituční deriváty N6-benzyladenosin-5'-monofosfátu obecného vzorce I podle nároku 1, vybrané ze skupiny zahrnující 6-(2-hydroxybenzylamino)purin ribosid-5 -monofosfát, 6-(2hydroxy-3-methoxybenzylamino)purin ribosid-5-monofosfát, 6-{2-hydroxy-4-methoxybenzylamino)purin ribosid-5'-monofosfát, 6-(2-hydroxy-5-methoxybenzylamino)purin
    25 ribosid-5-monofosfát, 6-(2-hydroxy-3-chlorbenzylamino)purin ribosid-5-monofosfát, 6—(2— hydroxy-5-chlorbenzylamino)purin ribosid-5'-monofosfát, 6-(2-hydroxy-3-jodbenzylamino)purin ribosid-5-monofosfát, 6-(2-hydroxy-3-fluorbenzylamino)purin ribosid-5-monofosfát, 6-(2-hydroxy-5-fluorbenzylamino)purin ribosid-5-monofosfát, 6-{2-hydroxy-3-methy 1benzylamino)purin ribosid~5'~monofosfát, 6-(2-hydiOxy-5-methylbenzylamino)purin ribosid30 5'-monofosfát.
  3. 3, Způsob přípravy substitučních derivátů Nó-benzyladenosin-5'-monofosfátu obecného vzorce I podle nároku 1, vyznačený tím, že se 6-halogenpurin ribosid-5-monofosfát, kde halogen je vybrán ze skupiny zahrnující chlor, brom a fluor, nukleofilně substituuje benzyl35 aminem substituovaným jedním až čtyřmi substituenty R, přičemž R má stejný význam jako v nároku 1, stejnými nebo různými.
    - 15 CZ 303327 B6
  4. 4. Substituční deriváty Nb-benzy ladenosin-5 '-monofosfátu obecného vzorce I podle nároku 1 pro použití jako léčiva.
  5. 5. Substituční deriváty N6-benzy ladenosin-5'-monofosfátu obecného vzorce I podle nároku I
    5 pro použití jako inhibitory proteinkinas.
  6. 6. Substituční deriváty Nň-benzy ladenosin-5'-monofosfátu obecného vzorce I podle nároku 1 pro použití pro inhibici buněčné proliferace a/nebo indukci apoptózy.
    io
  7. 7. Substituční deriváty N6-benzy ladenosin-5'-monofosfátu obecného vzorce I podle nároku I pro použití jako léčiva pro léčbu onemocnění, která zahrnují buněčnou proliferaci, s výhodou onemocnění vybraná ze skupiny zahrnující: nádory, leukémie, restenóza, revmatická artritis, lupenka, diabetes I. typu, roztroušená skleróza, Alzheimerova choroba, parazitózy způsobené živočichy, houbami a/nebo prvoky, polycystické onemocnění ledvin, odmítnutí transplantátu
    15 a dna.
  8. 8. Použití substitučních derivátů Nó-benzy ladenosin-5'-monofosfátu obecného vzorce I podle nároku 1 pro výrobu léčiva pro léčbu onemocnění, která zahrnují buněčnou proliferaci, s výhodou onemocnění vybraná ze skupiny zahrnující: nádory, leukémie, restenóza, revmatická artritis, io lupenka, diabetes l. typu, roztroušená skleróza, Alzheimerova choroba, parazitózy způsobené živočichy, houbami a/nebo prvoky, polycystické onemocnění ledvin, odmítnutí transplantátu a dna.
  9. 9. Terapeutický přípravek, vyznačený tím, že obsahuje alespoň jeden substituční deri25 vát N6-benzyladenosin-5'-monofosfátu obecného vzorce I podle nároku 1 či farmaceuticky přijatelnou sůl takovéto sloučeniny a alespoň jeden farmaceuticky přijatelný nosič.
CZ20100332A 2010-04-29 2010-04-29 Substitucní deriváty N6-benzyladenosin-5´-monofosfátu, zpusoby jejich prípravy, tyto deriváty pro použití jako léciva a terapeutický prípravek je obsahující CZ303327B6 (cs)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ20100332A CZ303327B6 (cs) 2010-04-29 2010-04-29 Substitucní deriváty N6-benzyladenosin-5´-monofosfátu, zpusoby jejich prípravy, tyto deriváty pro použití jako léciva a terapeutický prípravek je obsahující
EP20110763831 EP2563801B1 (en) 2010-04-29 2011-04-28 Substitution derivatives of n6-benzyladenosine-5´-monophosphate, methods of preparation thereof, use thereof as medicaments, and therapeutic preparation containing these compounds
US13/642,905 US9073961B2 (en) 2010-04-29 2011-04-28 Substitution derivatives of N6 -benzyladenosine-5′-monophosphate, methods of preparation thereof, use thereof as medicaments, and therapeutic preparations containing these compounds
PCT/CZ2011/000044 WO2011134444A2 (en) 2010-04-29 2011-04-28 Substitution derivatives of n6-benzyladenosine-5´-monophosphate, methods of preparation thereof, use thereof as medicaments, and therapeutic preparation containing these compounds
ZA2012/07173A ZA201207173B (en) 2010-04-29 2012-09-25 Substitution derivatives of n6-benzyladenosine-5'-monophosphate,methods of preparation thereof,use thereof as medicaments,and therapeutic preparation containing these compounds

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ20100332A CZ303327B6 (cs) 2010-04-29 2010-04-29 Substitucní deriváty N6-benzyladenosin-5´-monofosfátu, zpusoby jejich prípravy, tyto deriváty pro použití jako léciva a terapeutický prípravek je obsahující

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2010332A3 CZ2010332A3 (cs) 2011-11-09
CZ303327B6 true CZ303327B6 (cs) 2012-08-01

Family

ID=44720455

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20100332A CZ303327B6 (cs) 2010-04-29 2010-04-29 Substitucní deriváty N6-benzyladenosin-5´-monofosfátu, zpusoby jejich prípravy, tyto deriváty pro použití jako léciva a terapeutický prípravek je obsahující

Country Status (5)

Country Link
US (1) US9073961B2 (cs)
EP (1) EP2563801B1 (cs)
CZ (1) CZ303327B6 (cs)
WO (1) WO2011134444A2 (cs)
ZA (1) ZA201207173B (cs)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160038526A1 (en) * 2012-08-16 2016-02-11 Thomas Jefferson University Treatment of prostate cancer
CN108685936A (zh) * 2018-07-13 2018-10-23 大连理工大学 一类腺苷衍生物在人急性髓性白血病细胞中的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CS238548B1 (cs) * 1984-03-28 1985-11-13 Miroslav Kaminek Regulátor růstu zemědělských plodin a zahradnických kultur
WO2002032920A2 (en) * 2000-10-18 2002-04-25 Pharmasset Limited Modified nucleosides for treatment of viral infections and abnormal cellular proliferation
CZ294538B6 (cs) * 2002-12-30 2005-01-12 Ústav Experimentální Botaniky Akademie Vědčeské Re Substituční deriváty N6-benzyladenosinu, způsob jejich přípravy, jejich použití pro přípravu léčiv, kosmetických přípravků a růstových regulátorů, farmaceutické přípravky, kosmetické přípravky a růstové regulátory tyto sloučeniny obsahující

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CS238548B1 (cs) * 1984-03-28 1985-11-13 Miroslav Kaminek Regulátor růstu zemědělských plodin a zahradnických kultur
WO2002032920A2 (en) * 2000-10-18 2002-04-25 Pharmasset Limited Modified nucleosides for treatment of viral infections and abnormal cellular proliferation
CZ294538B6 (cs) * 2002-12-30 2005-01-12 Ústav Experimentální Botaniky Akademie Vědčeské Re Substituční deriváty N6-benzyladenosinu, způsob jejich přípravy, jejich použití pro přípravu léčiv, kosmetických přípravků a růstových regulátorů, farmaceutické přípravky, kosmetické přípravky a růstové regulátory tyto sloučeniny obsahující

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Chheda G.B., et al.: Journal of Pharmaceutical Science 1979, 68 (8), str. 1054-1056 *
Dole×al K., Popa I., et al.: Bioorganic & Medicinal Chemistry 2007, 15, str. 3737-3747 *
Ivanova M. et al.: Plant Growth Regulation 2006, 50, str. 219-230; sloucenina o-TRMP *

Also Published As

Publication number Publication date
US20130040908A1 (en) 2013-02-14
WO2011134444A3 (en) 2011-12-22
CZ2010332A3 (cs) 2011-11-09
US9073961B2 (en) 2015-07-07
ZA201207173B (en) 2013-05-29
WO2011134444A9 (en) 2012-02-16
WO2011134444A2 (en) 2011-11-03
EP2563801A2 (en) 2013-03-06
EP2563801B1 (en) 2014-09-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1575973B1 (en) Substitution derivatives of n sp 6 sp -benzyladenosine, methods of their preparation, their use for preparation of drugs, cosmetic preparations and growth regulators, pharmaceutical preparations, cosmetic preparations and growth regulators containing these compounds
EP1244668B1 (en) Purine derivatives, process for their preparation and use thereof
US10851107B2 (en) Dual selective P13 delta and gamma kinase inhibitors
CZ27399A3 (cs) Substituované dusíkaté heterocyklické deriváty, způsob jejich přípravy, tyto deriváty pro použití jako léčiva, farmaceutická kompozice a kombinovaný farmaceutický přípravek tyto deriváty obsahující a použití těchto derivátů pro výrobu léčiv
CZ20012818A3 (cs) Heterocyklické sloučeniny na bázi N6-substituovaného adeninu, způsoby jejich přípravy, jejich použití pro přípravu léčiv, kosmetických přípravků a růstových regulátorů a farmaceutické přípravky, kosmetické přípravky a růstové regulátory tyto sloučeniny obsahující
US10093675B2 (en) 6,8-disubstituted-9-(heterocyclyl)purines, compositions containing these derivatives and their use in cosmetic and medicinal applications
US20140066394A1 (en) Substituted 6-(Benzylamino) Purine Riboside Derivatives, Use Thereof and Compositions Containing These Derivatives
JP6215484B2 (ja) がん治療のための短鎖脂肪酸およびゼブラリンまたは１’−シアノ−シタラビンを含む相互プロドラッグ
US10179786B2 (en) Selective dual inhibitors of PI3 delta and gamma protein kinases
CZ303327B6 (cs) Substitucní deriváty N6-benzyladenosin-5´-monofosfátu, zpusoby jejich prípravy, tyto deriváty pro použití jako léciva a terapeutický prípravek je obsahující
US11643413B2 (en) 9-(2-oxacycloalkyl)-9H-purine-2,6-diamine derivatives and their use for the treatment of skin disorders
EP2755977B1 (en) 6,8-disubstituted purine compositions and their pharmaceutical and cosmetic use
HK1217949B (en) Dual selective pi3 delta and gamma kinase inhibitors
HK1236947A1 (en) Substituted chromene derivatives as selective dual inhibitors of pi3 delta and gamma protein kinases
HK1236947B (en) Substituted chromene derivatives as selective dual inhibitors of pi3 delta and gamma protein kinases
OA18327A (en) Substituted chromene derivatives as selective dual inhibitors of Pi3 delta and gamma protein kinases

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20180429