ES2200358T3

ES2200358T3 - 1-amino-alquilciclohexanos antagonistas del receptor de nmda.

Info

Publication number: ES2200358T3
Application number: ES98939579T
Authority: ES
Inventors: Markus Gold; Wojciech Danysz; Christopher Graham Raphael Parsons; Ivars Kalvinsh; Valerjans Kauss; Aigars Jirgensons
Original assignee: Merz Pharma GmbH and Co KGaA
Current assignee: Merz Pharma GmbH and Co KGaA
Priority date: 1997-06-30
Filing date: 1998-06-24
Publication date: 2004-03-01
Anticipated expiration: 2018-06-24
Also published as: EA002254B1; WO1999001416A3; AU724974B2; NO996548D0; HK1029574A1; WO1999001416A2; HUP0100266A2; PL337809A1; AU8804298A; FI19992801L; US6034134A; CZ457199A3; KR20010013738A; NO996548L; HUP0100266A3; TW593225B; CA2292558C; GEP20032995B; KR100630506B1; NO314353B1

Abstract

Un compuesto 1-aminoalquilciclohexano seleccionado entre los de fórmula: R en la que R* es - (CH2)n -(CR6R7)m-NR8R9, en la que n+m =0, 1, ó 2, en la que R1 a R9 se seleccionan independientemente entre hidrógeno y alquilo C1-6, con una primera condición de que al menos R1, R4, y R5 sean alquilo C1-6, y con una segunda condición de que dicho compuesto 1-aminoalquilciclohexano no sea 1-metilamino-1, 3, 3, 25 tetrametilciclohexano, y sus sales farmacéuticamente aceptables.

Description

1-Amino-alquilciclohexanos antagonistas del receptor de NMDA.

1. Campo de la invención

Los compuestos de 1-amino-alquilciclohexano que son activos sistémicamente como antagonistas del receptor de NMDA, las composiciones farmacéuticas que contienen esos compuestos, su método de preparación, y el método de tratamiento de trastornos del sistema nervioso central (SNC) relacionados con alteraciones de transmisión glutamatérgica con esos compuestos.

2. Técnica anterior

El antagonismo de receptores de glutamato del tipo N-metil-D-aspartato (NMDA) tiene una variedad potencialmente amplia de aplicaciones terapéuticas [19]. La inhibición funcional de receptores de NMDA se puede lograr mediante acciones en distintos sitios de reconocimiento, tales como el sitio transmisor primario, el sitio de glicina insensible a la estricnina (glicina_{B}), el sitio de poliamina, y el sitio de fenciclidina situado dentro del canal de cationes. Los bloqueadores del canal del receptor de NMDA actúan en forma "dependiente del uso", no competitiva, es decir, que usualmente bloquean el canal en el estado abierto. Muchos han interpretado que esta dependencia del uso significa que una activación más fuerte del receptor debe conducir a un mayor grado de antagonismo. Se ha interpretado adicionalmente que este modo de acción implica que esta clase de antagonista puede ser particularmente útil cuando se puede esperar una sobreactivación de los receptores de NMDA, como sucede en la epilepsia, la isquemia y estados traumáticos. Sin embargo, la experiencia clínica inicial con el antagonista (+)- 5-metil-10,11-dihidro-5H- dibenzociclohepten-5,10-imina maleato ((+)-MK-801) del receptor de NMDA, no competitivo, fuertemente dependiente del uso, de gran afinidad, selectivo, ha sido decepcionante. Es decir, la eficacia terapéutica en casos de epilepsia fue escasa, y se constataron al mismo tiempo efectos secundarios psicotrópicos en dosis terapéuticas. Estas observaciones, además del hecho de que las personas dependientes de la fenciclidina experimentan algunos síntomas psicotrópicos similares, llevaron a la conclusión que el antagonismo acompetitivo de los receptores de NMDA puede no ser un método terapéutico prometedor.

Sin embargo, el uso de métodos electrofisiológicos más elaborados indica que no existe una igualdad entre distintos antagonistas acompetitivos, porque factores como la velocidad de bloqueo del receptor (cinética on-off) y la dependencia del voltaje de este efecto, pueden determinar las características farmacodinámicas in vivo, es decir, también la seguridad terapéutica. Paradójicamente, los agentes con una afinidad baja a moderada, en vez de alta, pueden ser convenientes. Estas constataciones provocaron la reevaluación del concepto de antagonismo acompetitivo de receptores de NMDA en el desarrollo de drogas [19, 22]. Actualmente, muchos de estos agentes se hallan en distintas etapas de desarrollo, por ejemplo, carvedilol, ADCI, ES 242S, remacemida, felbamato, y budipina. Por otra parte, antagonistas acompetitivos de receptores de NMDA, como amantadina y memantina, que satisfacen estos criterios, se utilizaron clínicamente durante muchos años en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson y de la demencia, respectivamente, y ciertamente producen escasos efectos colaterales con las dosis terapéuticas administradas en sus respectivas indicaciones.

A la vista de la evidencia mencionada anteriormente, hemos desarrollado una serie de antagonistas de receptores de NMDA acompetitivos, novedosos, basados en una estructura de 1-aminoalquilciclohexano. El presente estudio se dedicó a comparar las propiedades antagonistas de receptores de NMDA de estos derivados de 1- aminoalquilciclohexano en ensayos de unión con los receptores, experimentos de pinzamiento de membrana, excitotoxicidad in vitro, tres modelos de convulsiones, y dos modelos de trastornos motores. Las substituciones de estos 1- aminoalquilciclohexanos se detallan en la Tabla 6.

La presente invención

Se constató que ciertos 1-aminoalquilciclohexanos presentan una notable e impredecible actividad antagónica del receptor de NMDA. Debido a la propiedad antes mencionada, las sustancias son apropiadas para el tratamiento de una amplia variedad de trastornos del SNC relacionados con alteraciones de la transmisión glutamatérgica, preferentemente en forma de una composición farmacéutica de esas sustancias, junto con uno o más diluyentes, portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables.

Objetos de la invención

Un objeto de la presente invención es proveer nuevos compuestos farmacéuticos 1-aminoalquilciclohexano que sean antagonistas del receptor de NMDA, y sus composiciones farmacéuticas. Otro objeto de la invención es proveer un método novedoso para tratar, eliminar, aliviar, paliar o mejorar trastornos del SNC indeseables relacionados con alteraciones de la transmisión glutamatérgica, al emplear un compuesto de la invención o una composición farmacéutica que lo contiene. Otro objeto de la invención es proveer un proceso para producir dichos principios activos 1- aminoalquilciclohexano. Sin embargo, otros objetos resultarán evidentes de la siguiente descripción, y aún otros objetos serán claros para un experto en la técnica.

Sumario de la invención

Por lo tanto, lo que entendemos que será abarcado por nuestra invención, se puede resumir entre otras de la siguiente manera:

Un compuesto 1-aminoalquilciclohexano seleccionado entre aquellos de fórmula:

1

donde R* es - (CH_{2})_{n} -(CR^{6}R^{7})_{m}-NR^{8}R^{9} donde n+m =0, 1, ó 2

donde R^{1} a R^{9} se seleccionan independientemente de hidrógeno y un alquilo C_{1-6}, con una primera condición de que al menos R^{1}, R^{4}, y R^{5} sean alquilo C_{1-6};

y con una segunda condición de que dicho compuesto 1-aminoalquilciclohexano no sea 1-metilamino-1,3,3,5-tetrametilciclohexano,

y sus sales farmacéuticamente aceptables.

Más específicamente la invención incluye:

un compuesto donde R^{1} a R^{5} son metilo;

un compuesto donde R^{1} es etilo;

un compuesto donde R^{2} es etilo;

un compuesto donde R^{3} es etilo;

un compuesto donde R^{4} es etilo;

un compuesto donde R^{5} es etilo;

un compuesto donde R^{5} es propilo;

un compuesto donde R^{6} o R^{7} es metilo;

un compuesto donde R^{6} o R^{7} es etilo; y

un compuesto seleccionado del grupo que consiste en:

1-amino-1,3,3,5,5-pentametilciclohexano,

1-amino-1,3,5,5-tetrametil-3-etilciclohexano,

1-amino-1,5,5-trimetil-3,3-dietilciclohexano,

1-amino-1,5,5-trimetil-cis-3-etilciclohexano,

1-amino-1,5,5-trimetil-trans-3-etilciclohexano,

1-amino-1-etil-3,3,5,5-tetrametilciclohexano,

1-amino-1-propil-3,3,5,5-tetrametilciclohexano,

N-metil-1-amino-1,3,3,5,5-pentametilciclohexano,

N-etil-1-amino-1,3,3,5,5-pentametilciclohexano,

y sales farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los compuestos anteriores.

Se rechaza el compuesto 1-metilamino-1,3,3,5-tetrametilciclohexano de acuerdo con la segunda condición mencionada a la vista de su descripción por de Savignac et al. en Bull. Soc. Chim. Fr., 1975 (9-10, Pt.2), páginas 2057-2065. Esta referencia atañe a la inducción asimétrica durante la adición nucleófila a iminas cíclicas y no sugiere de ninguna manera que tal compuesto pueda mostrar actividad farmacológica tal como actividad antagonista del receptor de NMDA.

Consecuentemente la invención también abarca una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva como antagonista del receptor NMDA de un compuesto 1-aminoalquilciclohexano o una de sus sales farmacéuticamente aceptables como se define anteriormente, pero no sometido a la segunda condición mencionada, en combinación con uno o más diluyentes, excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables. Dicho compuesto 1-aminoalquilciclohexano de esta realización de la invención ventajosamente es uno de los compuesto identificados anteriormente de forma específica.

La invención también se extiende al uso de un compuesto 1-aminoalquilcicolhexano o una de sus sales farmacéuticamente aceptables como se define anteriormente, pero no sometido a la primera y segunda condiciones mencionadas, en la fabricación de un medicamento que se emplee para aliviar una condición que se alivia mediante un antagonista del receptor de NMDA. Dicho compuesto 1-aminoalquilciclohexano en esta realización de la invención ventajosamente es uno de los compuestos identificados anteriormente de forma específica.

Descripción detallada de la invención

La siguiente descripción y Ejemplos detallados se dan a modo ilustrativo solamente, por lo tanto, no deben ser entendidos como restrictivos.

(Esquema pasa a página siguiente)

2

Preparación de 3-propil-5,5-dimetil-2-ciclohexen-1-ona (1-7)

Una disolución de 3-etoxi-5,5-dimetil-2-ciclohexen-1-ona [1] (5,04 g, 30 mmol) en éter se agregó gota a gota a una disolución agitada de yoduro de propilmagnesio, preparado a partir de 90 mg de magnesio y 90 mmol de 1-yodopropano en 60 ml de éter. Después de ser agitada durante 1 hora a temperatura ambiente, se trató la mezcla de reacción con una disolución de H_{2}SO_{4} al 5%. La fase orgánica se separó, se lavó con disolución salina, se secó sobre MgSO_{4} y se evaporó, para dar un aceite sin purificar que se separó en una columna de gel de sílice, eluyendo con una mezcla de hexano - acetato de etilo. Se obtuvo ciclohexenona (1-7) como un aceite incoloro (2,0 g, 70%).

^{1}H NMR ( CDCl_{3}, TMS ) \delta: 0,92 (3H, t, J=7 Hz); 1,03 (6H,s); 1,3 - 1,75 (2H,m); 2,16 (2H, t, J=7 Hz); 2,17 (2H, d, J=1,5 Hz); 2,21 (2H,s) y 5,87 ppm (^{1}H, t, J=1,5 Hz).

Las ciclohexenonas 1 conocidas se utilizaron para preparar los compuestos 2:

1-1 ( R^{1}=R^{2}=R^{3}=H ) [disponible a la venta],

1-2 (R^{3}=Me)* [disponible a la venta],

1-3 (R^{2}=R^{3}=Me) [disponible a la venta],

1-4 ( R^{1}=R^{2}=Me) [ 2 ] ,

1-5 (R^{1}=R^{2}=R^{3}=Me) [disponible a la venta],

1-6 (R^{1}=R^{2}=Me, R^{3}=Et ) [3] .

*R^{n}=H, si se ha omitido

Otros materiales iniciales 1 se preparan del mismo modo o de un modo similar.

Procedimiento general para preparar ciclohexanonas 2

Se agregó cloruro de cobre (1) anhidro (7,5 mmol) a una disolución enfriada de yoduro de alquilmagnesio (15-18 mmol) en éter. La mezcla se agitó en una atmósfera inerte durante 5 minutos, y se agregó gota a gota una disolución de 2-ciclohexen-1-ona 1 (10 mmol) en éter, mientras se mantenía la temperatura por debajo de -5ºC. Después de haber completado la adición de cetona, la mezcla de reacción se agitó durante 1 hora, y se neutralizó cuidadosamente con una disolución de NH_{4}Cl acuosa saturada. El tratamiento tradicional para las reacciones de Grignard dió un material sin purificar que se separó en una columna de gel de sílice y se eluyó con una mezcla de éter de petróleo - acetato de etilo. Las ciclohexanonas 2 se obtuvieron como aceites.

Los rendimientos y los datos de los espectros de ^{1}H RMN de los compuestos 2 se dan en la Tabla 1.

Las ciclohexanonas 2 conocidas se utilizaron para preparar los compuestos 3.

2-1 (R^{4}=Me)* [disponible a la venta],

2-2 (R^{4}=Et) [4],

2-3 (R^{4}=Pr) [5],

2-4 (R^{3}= R^{4}=Me) [6],

2-5 (R^{3}=Me, R^{4}=Et) [7],

2-6 (R^{3}=Me, R^{4}=Pr) [8],

2-7 (R^{1}=R^{4}=Me) [9],

2-8 (R^{2}= R^{3}= R^{4}=Me) [10] ,

2-9 (R^{2}= R^{3}=Me, R^{4}=Et) [11],

2-13 (R^{1}= R^{2}= R^{3}= R^{4}=Me) [disponible a la venta],

2-14 (R^{1}= R^{2}= R^{3}=Me, R^{4}=Et) [10],

2-15 (R^{1}= R^{2}= R^{3}=Me, R^{4}=Pr) [10].

*R^{n}=H, si se ha omitido.

Otras ciclohexanonas intermedias 2 se preparan del mismo modo o de modo similar. Las ciclohexanonas 2 se utilizaron para preparar los compuestos 3.

Procedimiento general para preparar alquilciclohexanoles 3

Una disolución de yoduro de alquilmagnesio (3-4 equivalentes) en éter se agregó gota a gota a una disolución enfriada de ciclohexanona 2 en éter. La mezcla se agitó durante una hora a temperatura ambiente y se eliminó cuidadosamente con cloruro de amonio acuoso saturado. El tratamiento tradicional para las reacciones de Grignard dio mezclas de alcoholes diastereoisómeros 3, que se separaron en una columna de gel de sílice eluyendo con éter de petróleo - acetato de etilo.

Los rendimientos y los datos espectrales de ^{1}H RMN de los compuestos 3 se indican en la Tabla 2.

Los ciclohexanoles 3 conocidos se utilizaron para preparar los compuestos 4.

3-1 (( R^{3} ) ( R^{4} ) =R^{5}=Me )* [ 9 ], es decir, R^{3} ó R^{4} y R^{5} son Me.

3-4 ( R^{3}=R^{4}=Me, R^{5}=Me ) [ 12 ],

3-5 ( R^{3}=R^{5}=Me, R^{4}=Et ) [ 13 ] ,

3-7 ( R^{1}=R^{4}=R^{5}=Me ) [ 14] ,

3-8 ( R^{1}=R^{3}=R^{4}=R^{5}=Me ) [ 10] ,

3-13 ( R^{1}=R^{2}=R^{3}=R^{4}=R^{5}=Me ) [ 10 ] ,

3-14 ( R^{1}=R^{2}=R^{3}=R^{4}=Me, R^{5}=Et ) [ 15] ,

*R^{n}=H, si se ha omitido.

Otros ciclohexenoles 3 intermedios se preparan del mismo modo o de modo similar.

Procedimiento general para preparar 1-alquil-1-azidociclohexanos 4.

Se mezcló el alcohol 3 con de una disolución de ácido hidrazoico 1,7-2 N (10-13 equivalentes) en cloroformo, y se enfrió en un baño de hielo. Se agregó gota a gota una disolución de TiCl_{4} (1,2 equivalentes) en cloroformo, mientras se mantenía la temperatura por debajo de 5ºC. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas, se pasó por una columna de alúmina y se eluyó con cloroformo. La evaporación de disolvente dio las azidas diastereoisómeras 4 que fueron purificadas por cromatografía de desarrollo rápido en gel de sílice, y se eluyó con éter de petróleo ligero.

Los rendimientos y datos espectrales de ^{1}H RMN de los compuestos 4 se indican en la Tabla 3.

Otros 1-alquil-1-azidociclohexanos 4 intermedios se preparan del mismo modo o de un modo similar.

Preparación de 1-nitrometil-3,3,5,5-tetrametilciclohexeno (6)

Una disolución de 3,3,5,5-tetrametilciclohexanona (2-13) (1,54 g, 10 mmol) y etilendiamina (60 mg) en nitrometano (45 ml) se sometió a reflujo en atmósfera de argón durante 25 horas. El exceso de nitrometano se eliminó luego al vacío y el residuo se purificó por cromatografía de desarrollo rápido en gel de sílice, eluyendo con hexano - acetato de etilo (6:1). Se obtuvo 1,2 g (61%) de 6 como aceite.

^{1}H NMR (CDCl_{3}, TMS) \delta 0, 96 y 1,03 (total 12H, ambos s, ciclohexano 3,5-CH_{3}); 1,34 (2H, s, 4-CH_{2}); 1,82 (2H, s ancho, 6- CH_{2}); 4,80 (2H, s, CH_{2}NO_{2}) y 5,64 ppm (^{1}H, s ancho,C=C-H).

Preparación de 3,3,5,5-tetrametilciclohexilidenacetato de etilo (7)

A una disolución agitada de fosfonoacetato de trietilo (49,32 g, 022 mol) en THF seco (180 ml) bajo argón se agregó NaH (8,8 g, 022 mol, suspensión al 60% en aceite mineral) en pequeñas porciones, mientras se enfriaba con agua con hielo. Se continuó agitando durante 1 hora a temperatura ambiente, luego se agregó una disolución de 3,3,5,5-tetrametilciclohexanona (2-13) (30,85 g, 0,2 mol) durante 10 minutos, y la mezcla resultante fue sometida a reflujo durante 22 horas. Luego, se vertió en hielo (400 g), el producto se extrajo con éter (4*150 ml), y la disolución se secó sobre MgSO_{4}. Luego de una concentración al vacío, el residuo aceitoso se destiló a 145ºC (11 mm), para dar 36,8 g (86%) de (6) como un aceite.

\newpage

^{1}H NMR (CDCl_{3}, TMS) \delta 0,96 y 0,98 (total 12H, ambos s, ciclohexano 3,5-CH_{3}); 1,27 (3H, t, CH_{3}-etilo); 1,33 (2H, m ciclohexano 4-CH_{2}); 1,95 y 2,65 (total 4H, ambos s, ciclohexano 2,6- CH_{2}), 4,14 (2H, q, CH_{2} -etilo) y 5,69 ppm (1H, s = C-H).

Preparación de 3,3,5,5-tetrametilciclohexilacetato de etilo (8)

Se hidrogenó 3,3,5,5-tetrametilciclohexillidenacetato de etilo (7) (4,48 g, 20 mmol) en etanol (100 ml) sobre Pd/C 10% (0,22 g, 5% en peso) a 1,01 MPa (10 atm) durante 18 horas. La filtración por Celite^{TM} y la evaporación dieron 4,28 g (95%) de 8 como un aceite.

^{1}H NMR (CDCl_{3}, TMS) \delta 0,89 y 1,02 (total 12H, ambos s, ciclohexano 3,5-CH_{3}); 1,26 (3H, t, J = 7 Hz, CH_{3}-etilo); 0,6 - 1,55 (7H, m protones del anillo), 2,13 (2H, m, 2-CH_{2}) y 4,12 ppm (2H, q, J = 7 Hz,CH_{2} - etilo).

Preparación de 2-metil-(3,3,5,5-tetrametilciclohexil)-propan-2-ol (9)

Una disolución de 3,3,5,5-tetrametilciclohexilacetato de etilo (8) (2,26 g, 10 mmol) en éter (20 ml) se agregó gota a gota a una disolución 2M de yoduro de metilmagnesio en éter (20 ml) durante 15 min, mientras se enfriaba con agua con hielo. La mezcla se sometió a reflujo durante 2 horas, se refrigeró y se detuvo la reacción con NH_{4}Cl acuoso saturado. Después de un tratamiento tradicional, el producto se purificó en una columna de gel de sílice y se eluyó con una mezcla de hexano - acetato de etilo (20:1), para dar 1,7 g (80%) de 9 como un aceite.

^{1}H NMR (CDCl_{3}, TMS) \delta 0,86 y 1,00 (total 12H, ambos s, ciclohexano 3,5-CH_{3}); 1,23 (6H, s, \alpha-CH_{3}); 1,36 (2H, d, J = 5 Hz,-CH_{2}-); 0,6 - 2,04 ppm (8H, m, protones del anillo y OH).

Preparación de 2-metil-(3,3,5,5-tetrametilciclohexil)-propil-2-azida (10)

Se agregó eterato de trfluoruro de boro (0,77 g, 0,69 ml, 5,44 mmol) gota a gota a una disolución agitada de
2-metil-(3,3,5,5-tetrametilciclohexil)-propan-2- ol (9) (0,96 g,4,53 mmol) y azida de trimetilsililo (0,63 g, 072 ml, 5,44 mmol) en benceno (10 ml). Luego de ser agitada a temperatura ambiente durante 24 horas, la mezcla se vertió en agua (20ml). La fase orgánica se separó y lavó con NaHCO_{3} saturado (10 ml) y disolución salina (10 ml). La disolución se secó sobre MgSO_{4}, se filtró y concentró. El producto sin purificar se purificó en una columna de gel de sílice y se eluyó con hexano, para dar 0,56 g (52%) de 10 como un aceite.

^{1}H NMR (CDCl_{3}, TMS) \delta: 0,87 y 1,01 (total 12H, ambos s, ciclohexano 3,5-CH_{3}); 1,27 (6H, s, \alpha-CH_{3}); 1,36 (2H, d, J=5Hz,- CH_{2}-); 0,6 - 1,85 ppm (7H, m, protones del anillo).

Preparación de 2-(3,3,5,5-tetrametilciclohexil)-etanol (11)

Una disolución de 3,3,5,5-tetrametilciclohexilacetato de etilo (8) (1,8 g, 8,0 mmol)en éter (30 ml) se agregó gota a gota a una suspensión agitada de hidruro de litio y alumnio (0,9 g, 24,0 mmol) en éter (30 ml), que se refrigeró en un baño de hielo. La mezcla de reacción se sometió a reflujo durante 3 horas, se enfrió, y el hidruro de litio y aluminio residual se destruyó con agua. Se separó la capa acuosa y se extrajo dos veces con éter. Las fases de éter combinadas se lavaron con disolución salina, se secaron sobre MgSO_{4}, se filtraron y evaporaron. El producto sin purificar se purificó mediante cromatografía de desarrollo rápido en gel de sílice y se eluyó con una mezcla de hexano - acetato de etilo (4:1), para dar 1,2 g (79%) de 11 como un aceite.

^{1}H NMR (CDCl_{3}, TMS) \delta 0,89 y 1,00 (total 12H, ambos s, ciclohexano 3,5-CH_{3}); 1,44 (2H, q, J = 7 Hz, 2-CH_{2}); 0,55 - 1,95 (8H, m, protones del anillo y OH) y 3,70 ppm (2H,t , J = 7Hz, CH_{2} O).

Preparación de 2-(3,3,5,5-tetrametilciclohexil)-etil metansulfonato (12)

Se agregó una disolución de cloruro de metansulfonilo (1,03 g, 0,7 ml, 9,0 mmol) en benceno seco (20 ml) a una disolución agitada de 2-(3,3,5,5- tetrametilciclohexil)-etanol (11) (1,1 g, 6,0 mmol) y trietilamina (1,2 g, 1,7 ml, 12 mmol) en benceno (40 ml), mientras se enfriaba en un baño de hielo. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas, luego se filtró por una columna corta de gel de sílice y se eluyó con benceno. La evaporación del disolvente dio 1,48 g (94%) de 12 como un aceite.

^{1}H NMR (CDCl_{3}, TMS) \delta 0,88 y 0,98 (total 12H, ambos s, ciclohexano 3,5-CH_{3}); 1,62 (2H, q, J = 7 Hz, 2-CH_{2}); 0,65 - 2,0 (7H, m, protones de anillo); 3,0 (3H, s, CH_{3} -SO_{2}) y 4,29 ppm (2H, t, J = 7 Hz, CH_{2} O).

Preparación de 2-(3,3,5,5-tetrametilciclohexil)-etilazida (13)

La mezcla de azida de sodio (2,27 g, 34,2 mmol), 2-(3,3,5,5- tetrametilciclohexil)- etilmetanosulfonato (12) (1,46 g, 5,57 mmol) y dimetil sulfóxido (20 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 48 horas, se diluyó con agua (50 ml) y se extrajo con éter (3*30 ml). La fase orgánica se lavó con disolución salina (30 ml), se secó sobre MgSO_{4}, se filtró y evaporó. El producto sin purificar se purificó por cromatografía de desarrollo rápido en gel de sílice, y se eluyó con hexano para dar 0,93 g (80%) de 13 como un aceite.

^{1}H NMR (CDCl_{3}, TMS) \delta 0,87 y 0,99 (total 12H, ambos s, ciclohexano 3,5-CH_{3}); 1,47 (2H, q, J = 7 Hz, 2-CH_{2}); 0,55 - 1,9 (7H, m, protones de anillo) y 3,31 ppm (2H, t, J =7 Hz, CH_{2} N_{3}).

Preparación de N-formil-1,3,3,5,5-pentametilciclohexanamina (14-1)

A una disolución bien agitada de 1,3,3,5,5-pentametilciclohexanol (3-13) (2,7 g, 15,6 mmol) y cianuro de trimetilsililo (2,36 g, 23,8 mmol) en ácido acético (2,5 ml) bajo argón, se agregó ácido sulfúrico del 98% (4,66 g, 47,6 mmol), mientras se mantenía la temperatura por debajo de -5ºC. La mezcla se agitó durante 22 horas a temperatura ambiente, luego, se vertió en hielo (100 g), se neutralizó con una disolución de NaOH al 50% hasta pH 7, y se extrajo con éter (3*30 ml). Las fases de éter combinadas se lavaron con disolución salina (50 ml), y luego se secaron sobre MgSO_{4} y se evaporaron. Un residuo cristalino ligeramente amarillo se trató con una pequeña cantidad de acetonitrilo y se separó por filtración, para dar 2,5 g (80%) de 14-1 como cristales blancos, con punto de fusión 104-106ºC.

^{1}H NMR (CDCl_{3}, TMS) \delta: 0,91 y 0,93 (total 6H, ambos s, 3,5- CH_{3eq}); 1,08 (2H, m, 2,6 -CH_{eq}); 1,13 y 1,15 (total 6H, ambos s, 3,5- CH_{3ax}); 1,25 (2H, m, 4-CH_{2}); 1,32 y 1,38 (total 3H, ambos s, 1- CH_{3}); 1,70 y 2,12 (total 2H, ambos d, 14,7 Hz, 2,6-CH_{ax}); 5,30 y 5,60 (total 1H, ambos s anchos, NH); 8,05 y 8,30 ppm (total 1H, ambos d, 2,0 y 12,7 Hz, resp., HCO).

Preparación de N-acetill-1,3,3,5,5-pentametilciclohexanamina (14-2)

Se agregó HNO_{3} fumante (6 ml) gota a gota a una disolución bien agitada de 1,3,3,5,5-pentametilciclohexanol (3-13) (3,0 g, 17,65 mmol) en acetonitrilo (20 ml),mientras se mantenía la temperatura por debajo de 45ºC. La mezcla resultante se agitó durante 6 horas a 45-50ºC, luego se enfrió, se vertió en agua (30 ml) y se neutralizó con NH_{3} acuoso. La fase acuosa se extrajo con éter (3*30 ml). Las fases de éter combinadas se lavaron con disolución salina (30 ml) luego se secaron sobre MgSO_{4}, se filtraron y se evaporaron. El producto sin purificar se cristalizó a partir de acetonitrilo frío para dar 2,23g (60%) de 14-2 como cristales blancos, con punto de fusión 110ºC.

^{1}H NMR (CDCl_{3}, TMS) \delta 0,90 y 1,12 (total 12H, ambos s, 3,5- CH_{3}); 1,33 (3H, s, 1-CH_{3}); 1,88 (3H, s,
CH_{3}C = O); 0,75 - 2,25 (6H, m, protones de anillo) y 5,3 ppm (1H, s ancho,NH).

Preparación de N-metoxicarbonil-N,1,3,3,5,5-hexametilciclohexanamina (15)

Se agregó cloroformato de metilo (0,97 g, 0,8 ml, 10,3 mmol) en una porción a una suspensión de hidrocloruro de 1,3,3,5,5-hexametilciclohexanamina (5-20) (1,13 g, 5,13 mmol) y Na_{2}CO_{3} (1,63 g, 15,4 mmol) en THF (30 ml). La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 6 horas y luego se diluyó con agua (50 ml) y se extrajo con éter (3*30 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con K_{2}SO_{4} al 10% disolución salina, se secaron sobre MgSO_{4}, se filtraron y see evaporaron. El producto sin purificar se purificó por cromatografía de desarrollo rápido y se eluyó con una mezcla de hexano - acetato de etilo (6:1), para dar 0,90 g (78%) de 15 como un aceite.

^{1}H NMR (CDCl_{3}, TMS) \delta: 0,93 y 1,07 (total 12H, ambos s, 3,5-CH_{3}); 1,23 (3H, s, 1-CH_{3}); 1,0 - 1,4 (4H, m, 4-CH_{2} y 2,6 - CH_{eq}); 2,56 (2H, d, J = 14 Hz, 2,6- CH_{ax}), 2,87 (3H, s, CH_{3} N) y 3,64 ppm (3H, s, CH_{3}O).

Preparación de (3,3,5,5-tetrametilciclohexilliden)cianoacetato de etilo (16)

La mezcla de 3,3,5,5-tetrametilciclohexanona (2-13) (2,64 g, 17 mmol), cianoacetato de etilo (1,93, 17 mmol), ácido acético (0,2 ml) y acetato de amonio (0,2 g) en benceno (6,4 ml), se sometió a reflujo con un aparato Dean- Stark durante 10 horas. Luego, se agregó benceno (30 ml) y disolución salina (30 ml), se separó la capa orgánica, se secó sobre Na_{2}SO_{4}, se filtró y se evaporó. El producto sin purificar se purificó por cromatografía de desarrollo rápido y se eluyó con hexano, para dar 2,0 g (50%) de 16 como un aceite.

^{1}H NMR (CDCl_{3}, TMS) \delta: 1,01 (6H, s, 3,5-CH3_{eq}); 1,05 (6H, s, 3,5-CH3_{ax}); 1,34 (3H, t, J = 7Hz, etilo-CH_{3}); 1,42 (2H, s, 4-CH_{2}), 2,46 y 2,79 (total 4H, ambos s, 2,6 CH_{2}) y 4,29 ppm (2H, q, J = 7 Hz, CH_{2}O).

Preparación de (1,3,3,5,5-pentametilciclohexil)-cianoacetato de etilo (17)

Se agregó cloruro de cobre (1) anhidro (0,8 g, 8 mmol) a una disolución enfriada de yoduro de alquilmagnesio (preparada a partir de magnesio (0,46 g, 19,2 mmol) y yodometano (2,84 g, 20 mmol) en éter (12 ml). La mezcla se agitó en atmósfera inerte durante 5 minutos, y se agregó gota a gota una disolución de (3,3,5,5- tetrametilciclohexiliden)cianoacetato de etilo (16) (2 g, 8 mmol) en éter (10 ml), mientras se mantenía la temperatura por debajo de -15ºC. Después de haber completado la adición de cetona, la mezcla de reacción se agitó durante 3 horas, y se neutralizó cuidadosamente con una disolución de NH_{4}Cl acuosa saturada. El tratamiento tradicional para las reacciones de Grignard dió un material sin purificar que fue separado en una columna de gel de sílice y eluído con una mezcla de éter de petróleo - acetato de etilo (20:1), para dar 1,0 g (47%) de 17 como un aceite.

^{1}H NMR (CDCl_{3}, TMS) \delta: 0,98 (9H, s, 3,5-CH_{3eq} y 1- CH_{3}); 1,06 (6H, s, 3,5- CH_{3ax}); 1,31 (3H, t, J = 7 Hz, etilo-CH_{3} ); 1,2 - 1,5 (6H, m, protones de anillo), 3,41 (1H, s, \alpha-CH) y 4,25 ppm (2H, q, J = 7Hz, CH_{2}O).

Preparación de 1-cianometil-1,3,3,5,5-pentametilciclohexano (18)

La mezcla de (1,3,3,5,5-pentametilciclohexil)cianoacetato de etilo (17) (1 g, 3,7 mmol), LiCl (0,05 g) y agua (0,15 ml) en DMSO (2,5 ml), se calentó a 150-160º durante 4 horas. La disolución se vertió en agua (70 ml) y se extrajo con éter (4*20 ml). El éter se lavó con disolución salina (2*50 ml), se secó sobre Na_{2}SO_{4}, se filtró y se evaporó. El producto sin purificar se purificó en una columna de gel de sílice y se eluyó con una mezcla de éter de petróleo - acetato de etilo (20:1), para dar 0,66 g (94%) de 18 como un aceite.

^{1}H NMR (CDCl_{3}, TMS) \delta: 0,98 (9H, s, 3,5-CH_{3eq} y 1- CH_{3}); 1,02 (6H, s, 3,5- CH_{3ax}); 1,21 (3H, s, protones de anillo); 1,31 (3H, s, protones de anillo) y 2,31 ppm (2H, s, CH_{2}CN).IR (limpio), \nu_{CN} = 2242 cm^{-1}.

Procedimiento general para preparar hidrocloruros de alquilciclohexanamina 5- 1-5-25

Una disolución de 4, 10 ó 13-15, 18 en éter se agregó gota a gota a una suspensión agitada de hidruro de litio y aluminio (4 equivalentes) en éter, que se enfrió en un baño de hielo. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente, en el caso de 4, 10, 13, o se sometió a reflujo, en el caso de 14, 15, 18, hasta que el material inicial se convirtió completamente (control TLC). El hidruro de litio y aluminio residual se destruyó con agua, se separó la capa acuosa y se extrajo dos veces con éter. Las fases de éter combinadas se lavaron con disolución salina, se secaron sobre NaOH, se filtraron y evaporaron. La amina obtenida se trató con HCl sin caracterización. El hidrocloruro de amina se preparó o bien pasando HCl gaseoso a través de la disolución de amina en hexano, o bien agregando una disolución1 N de HCl en éter a la disolución de amina. En ambos casos, el disolvente se eliminó después de la adición de HCl. El residuo se trató con hexano o acetonitrilo, y el producto cristalino se separó por filtración, para dar 5-1, 5-25 con una pureza excelente.

Las propiedades físicas y los rendimientos de los compuestos 5-1, 5-25 se indican en la Tabla 4.

Los datos espectrales de ^{1}H RMN de los compuestos 5-1, 5-25 se indican en la Tabla 5.

Otros 1-aminoalquilciclohexanos y sus hidrocloruros se preparan del mismo modo o de un modo similar. Los hidrocloruros se pueden convertir en la base libre o en otras sales de adición de ácido, como se describe en la sección "SALES DE ADICION DE ACIDO".

Preparación de hidrocloruro de 3,3,5,5-tetrametilciclohexilmetilamina (5-26)

Una disolución de 1-nitrometil-3,3,5,5-tetrametilciclohexeno (6) (1,1 g, 5,63 mmol) en una mezcla de etanol (140 ml) y cloroformo (2,8 ml) se hidrogenó sobre Pd/C 10% (280 mg) a 505 kPa (5 atm) durante 20 horas, se filtró y se evaporó. El producto sin purificar se trató con éter, se filtró y se lavó éter, para dar 0,57 g (50%) de la amina 5-26.

Las propiedades físicas y el rendimiento del compuesto 5-26 se indican en la Tabla 4.

Los datos espectrales de ^{1}H RMN del compuesto 5-26 se indican en la Tabla 5.

La amina 5-27 se preparó según el procedimiento conocido [16].

La amina 5-28 [17] se preparó según el procedimiento general a partir de la azida correspondiente [18]. Todas las propiedades físicas eran compatibles con los datos suministrados [17].

La pureza de todos los compuestos preparados se verificó por GC (MN-OV-1, 25m*0,53m, d_{f} =1,0 \mum, 50-270ºC (10ºC/min)).

Sales de adicion de ácido

Entre los ácidos apropiados para la formación de sales de adición de ácido según el procedimiento tradicional, es posible mencionar los siguientes ácidos de la serie mineral: ácidos clorhídrico, bromírico, metanosulfónico, isotiónico, sulfúrico, fosfórico, y sulfámico, y, de la serie orgánica, ácidos acético, propiónico, maleico, fumárico, tartárico, cítrico, oxálico, y benzoico, por nombrar unos pocos. Los ácidos preferidos son clorhídrico, cítrico y maleico. Se pueden preparar otras sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables, si se desea, y se puede convertir una sal de adición de ácido en otra neutralizando una sal, por ejemplo, el hidrocloruro, para originar una base libre, y reacidificarla luego con un ácido mineral u orgánico seleccionado distinto, para preparar otra sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable, como es usual en la técnica.

5

6

7

8

9

10

3

Composiciones farmacéuticas

Los ingredientes activos de la invención, junto con uno o más adyuvantes, vehículos o diluyentes convencionales, se pueden preparar como composiciones farmacéuticas y sus dosificaciones unitarias, y utilizarse de ese modo como sólidos, tales como comprimidos revestidos o sin revestir, o cápsulas rellenas, o líquidos, como disoluciones, suspensiones, emulsiones, elixires, o cápsulas llenas con los mismos, todos para uso oral; en forma de supositorios o cápsulas para administración rectal, o en forma de disoluciones inyectables estériles para uso parenteral (incluyendo intravenoso o subcutáneo). Estas composiciones farmacéuticas y sus formas de dosificación unitaria pueden consistir en ingredientes convencionales o nuevos en proporciones convencionales o especiales, con o sin compuestos o principios activos adicionales; y tales formas de dosificación por unidad pueden contener cualquier cantidad eficaz apropiada del excipiente activo, proporcionado para el intervalo que se pretende para la dosificación diaria especificado que se administrará. Los comprimidos con veinte (20) a cien (100) miligramos de ingrediente activo o, más en general, diez (10) a doscientos cincuenta (250) miligramos por comprimido, son por lo tanto formas de dosificación unitaria representativas convenientes.

Metodo de tratamiento

Debido a su alto grado de actividad y su baja toxicidad, además de presentar un índice terapéutico más que favorable, los principios activos de la invención se pueden administrar a un sujeto, por ejemplo, un cuerpo animal (incluso humano) vivo, que lo necesite para tratar, aliviar, o mejorar paliar o eliminar un síntoma o condición al cual es susceptible; o representativo de un síntoma o condición mencionada en esta aplicación, preferentemente en forma concurrente, simultánea, o junto con uno o más excipientes, vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables, particular y preferentemente en forma de una composición farmacéutica de ellos, ya sea por vía oral, rectal o parental (incluyendo intravenosa y subcutánea), o en algunos casos, incluso por vía tópica, en una cantidad eficaz. Los intervalos de dosificación apropiados son 1-1000 miligramos diariamente, preferentemente 10-500 miligramos diariamente, y particularmente 50-500 miligramos diariamente, dependiendo, como siempre, del modo de administración exacto, la forma en que es administrado, el síntoma al cual se dirige la administración, el sujeto involucrado y el peso corporal del sujeto involucrado, y la preferencia y experiencia del médico o veterinario encargado.

Ejemplos de composiciones farmacéuticas representativas

Con la ayuda de los disolventes, agentes auxiliares y vehículos utilizados comúnmente, los productos de la reacción se pueden procesar en comprimidos, comprimidos revestidos, cápsulas, disoluciones en gotas, supositorios, preparaciones para inyección e infusión, y similares, y se pueden administrar terapéuticamente por vía oral, rectal, parenteral, y otras adicionales. A continuación, se mencionan composiciones farmacéuticas representativas:

(a): Se pueden preparar comprimidos apropiados para administración oral que contengan el ingrediente activo mediante las técnicas de fabricación de comprimidos convencionales.

(b): Para los supositorios, se puede emplear cualquier base de supositorio usual para incorporar en ella el ingrediente activo, según los procedimientos habituales, tal como polietilenglicol que es sólido a temperatura ambiente, pero se funde a la temperatura corporal o próxima.

(c): Para disoluciones estériles parentales (incluyendo intravenosas y subcutáneas), se utilizan el ingrediente activo, junto con ingredientes convencionales, en cantidades habituales, tal como cloruro de sodio y agua destilada dos veces en cantidad suficiente, según los procedimientos usuales, como filtración, relleno aséptico en ampollas o botellas de goteo IV, y autoclavado para esterilidad.

Otras composiciones farmacéuticas apropiadas resultarán evidentes para los expertos en la técnica.

Los siguientes ejemplos se dan a modo ilustrativo solamente, y no deben ser interpretados como restrictivos.

Ejemplo 1 Formulación de Comprimido

Una formulación apropiada para un comprimido con 10 miligramos de ingrediente activo es la siguiente:

	mg
Ingrediente activo	10
Lactosa	63
Celulosa microcristalina	21
Talco	4
Estearato de magnesio	1
Dióxido de silicio coloidal	1

Ejemplo 2 Formulación de Comprimido

Otra formulación apropiada para un comprimido que contiene 100 miligramos es la siguiente:

	mg
Ingrediente activo	100
Almidón de patata	20
Película de polivinilpirrolidona
revestida y coloreada	10

El material de revestimiento de la película consiste en:

Lactosa	100
Celulosa microcristalina	80
Gelatina	10
Polivinilpirrolidona, entrecruzada	10
Talco	10
Estearato de magnesio	2
Dióxido de silicio coloidal	3
Pigmentos de color	5

Ejemplo 3 Formulación de Cápsula

Una formulación apropiada para una cápsula que contiene 50 miligramos del ingrediente activo es la siguiente:

	mg
Ingrediente activo	50
Almidón de maíz	20
Fosfato de calcio dibásico	50
Talco	2
Dióxido de silicio coloidal	2
relleno en una cápsula de gelatina.

Ejemplo 4 Disolución para Inyección

Una formulación apropiada para una disolución inyectable que contiene 1% de ingrediente activo es la siguiente:

Ingrediente activo	12 mg
Cloruro de sodio	8 mg
Agua estéril para completar	1 ml

Ejemplo 5 Formulación Oral Líquida

Una formulación apropiada para 1 litro de una mezcla líquida que contiene 2 miligramos de ingrediente activo en 1 militro de la mezcla es la siguiente:

	g
Ingrediente activo	2
Sacarosa	250
Glucosa	300
Sorbitol	150
Saborizante de naranja y
color amarillo	10
Agua purificada hasta completar
una cantidad total de 1000 ml

Ejemplo 6 Formulación Oral Líquida

Otra formulación apropiada para 1 litro de una mezcla líquida que contiene 20 miligramos de ingrediente activo en 1 mililitro de mezcla es la siguiente:

	g
Ingrediente activo	20
Adragante	7
Glicerol	50
Sacarosa	400
Metilparabeno	0,5
Propilparaben	0,05
Sabor grosella negra	10
Color rojo soluble	0,02
Agua purificada para hasta completar
una cantidad total de 1000 ml

Ejemplo 7 Formulación Oral Líquida

Otra formulación apropiada para 1 litro de una mezcla líquida que contiene 2 miligramos del ingrediente activo en 1 mililitro de la mezcla es la siguiente:

	g
Ingrediente activo	2
Sacarosa	400
Tintura piel de naranja amarga	20
Tintura piel de naranja dulce	15
Agua purificada hasta completar
una cantidad total de 1000 ml

Ejemplo 8 Formulación en Aerosol

Una disolución en aerosol de 180 g contiene:

	g
Ingrediente activo	10
Acido oleico	5
Etanol	81
Agua purificada	9
Tetrafluoroetano	75

Se llenan latas de aerosol de aluminio con 15 ml de la disolución, tapadas con una válvula dosificadora, purgadas con 3,0 bar.

Ejemplo 9 Formulación TDS

Una disolución de 100 g contiene:

	g
Ingrediente activo	10,0
Etanol	57,5
Propilenglicol	7,5
Dimetilsulfóxido	5,0
Hidroxietilcelulosa	0,4
Agua purificada	19,6

Se colocan 1,8 ml de la disolución en un fleece cubierto por una lámina de respaldo adhesiva. El sistema se cierra con un forro protector que se eliminará antes del uso.

Ejemplo 10 Formulación en Nanopartículas

10 g de partículas de polibutilcianoacrilato contienen:

	g
Ingrediente activo	1,0
Poloxamer	0,1
Butilcianoacrilato	8,75
Manitol	0,1
Cloruro de sodio	0,05

Se preparan partículas de polibutilcianoacrilato por polimerización de emulsión en una mezcla de agua/HCl 0,1 N/etanol como medio de polimerización. Las nanopartículas en la suspensión son liofilizadas finalmente al vacío.

Farmacología - sumario

Los principios activos de la presente invención, y sus composiciones farmacéuticas y el método de tratamiento con los mismos, se caracterizan por propiedades impredecibles y ventajosas exclusivas, al interpretarse "todo el contenido", como se reivindica en esta invención, como no evidente. Los compuestos y sus composiciones farmacéuticas han presentado, en procedimientos de ensayo fiables, aceptados y estándar, las siguientes propiedades y características valiosas:

Son antagonistas del receptor de NMDA acompetitivos, sistémicamente activos, con una rápida cinética de bloqueo/desbloqueo, y una fuerte dependencia de voltaje y en consecuencia, son útiles para tratar, eliminar, paliar, aliviar, y mejorar las condiciones receptivas mediante su aplicación o administración al animal hospedante vivo, para el tratamiento de una amplia variedad de trastornos del SNC que implican alteraciones de la transmisión glutamatérgica.

Farmacología In vitro Estudios de Enlace de Receptores

Se decapitaron ratas macho Sprague-Dawley (200-250g) y sus cerebros se extrajeron rápidamente. Se disecionó y homogeneizó la corteza en 20 volúmenes de sacarosa 0,32 M enfriada en hielo mediante un homogenizador de vidrio y Teflon. Se centrifugó el homogeneizado a 1000xg durante 10 minutos. Se descartó el gránulo y se centrifugó el líquido sobrenadante a 20.000xg durante 20 miutos. Se suspendió nuevamente el gránulo resultante en 20 volúmenes de agua destilada, y se centrifugó durante 20 minutos a 8000xg. Luego, el líquido sobrenadante y la capa leucoplaquetaria se centrifugaron tres veces (48.000xg durante 20 minutos) en presencia de Tris-HCl 50mM, pH 8,0. Todas las etapas de centrifugación tuvieron lugar a 4ºC. Después de ser suspendida nuevamente en 5 volúmenes de Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, la suspensión de la membrana se congeló rápidamente a –80ºC. El día del ensayo, las membranas se descongelaron y lavaron cuatro veces al suspenderlas nuevamente en Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, y al centrifugarlas a 48.000xg durante 20 minutos. El gránulo final se suspendió en una disolución reguladora de ensayo. Se determinó la cantidad de proteína en la preparación final de la membrana según el método de Lowry con algunas modificaciones. La concentración final de proteína utilizada para nuestros estudios estaba entre 250-500 \mug/ml.

Las membranas se suspendieron nuevamente e incubaron en Tris-HCl 50 mM, pH 8,0. Se iniciaron las incubaciones al agregar [^{3}H]-(+)-MK-801 (23,9 Ci/mmol, 5 nM) a viales con glicina (10\muM), glutamato (10 \muM), y 0,1-0,25 mg de proteína (volumen total 0,5 ml), además de diversas concentraciones de los agentes sometidos a ensayo (10 concentraciones por duplicado). Las incubaciones continuaron a temperatura ambiente durante 120 minutos, y siempre se logró el equilibrio en las condiciones existentes. Se definió un enlace no específico al agregar MK-801 (10\muM) sin marcar. Se terminaron las incubaciones al utilizar un sistema de filtración Millipore. Las muestras se enjuagaron tres veces con 2,5 ml de una disolución reguladora de ensayo enfriada en hielo por filtros de fibra de vidrio obtenidos de Schleicher & Schuell al vacío constante. La filtración se efectuó tan rápidamente como fue posible. Después de la separación y del enjuague, los filtros se colocaron en un líquido de centelleo (5 ml, Ultima Gold), y la radioactividad retenida en los filtros se determinó con un contador de centelleo líquido convencional (Hewlett Packard, Analizador de Centelleo Líquido).

Pinzamiento de membrana

Se obtuvieron hipocampos de embriones de rata (E20 a E21) y luego, se transfirieron a una disolución salina tamponada de Hank libre de calcio y magnesio (Gibco) en hielo. Las células se disociaron mecánicamente en 0,05% de ADNasa / 0,3% de ovomucoide (Sigma), después de una incubación previa de 8 minutos con 0,66% de tripsina / 0,1% ADNasa (Sigma). Las células disociadas se centrifugaron luego a 18xg durante 10 minutos, se volvieron a suspender en un medio esencial mínimo (Gibco), y se aplicaron con una densidad de 150.000 células x cm^{-2} sobre placas de cultivo (Falcon) de plástico prerevestidas con poli-L-lisina (Sigma). Las células se alimentaron con un medio esencial mínimo tamponado con NaHCO_{3}/HEPES, complementado por 5% de suero fetal de ternero y 5% de suero de caballo (Gibco), y se incubaron a 37ºC con 5% de CO_{2} y una humedad del 95%. El medio se intercambió completamente, después de inhibir otra mitosis glial con citosina-\beta-D-arabinofuranósido (20 \muM Sigma) después de 7 días in vitro. A partir de entonces, el medio se intercambió parcialmente dos veces por semana.

Se hicieron registros de pinzamiento de membrana de estas neuronas con electrodos de vidrio pulido (4-6 m\Omega) en todo los modos de las células a temperatura ambiente (20-22ºC), con la ayuda de un amplificador EPC-7 (List). Se aplicaron las sustancias de ensayo al cambiar los canales de un sistema de superfusión rápido hecho especialmente con un flujo de salida común (tiempos de intercambio 10-20 ms). Los contenidos de la disolución intracelular fueron los siguientes (mM): CsCl (120), TEACI (20), EGTA (10), MgCl_{2} (1), CaCl_{2} - (0,2), glucosa (10), ATP(2), cAMP (0,25); se ajustó el pH a 7,3 con CsOH o HCl. Las disoluciones extracelulares tenían las siguientes composiciones básicas (mM): NaCl (140), KCl (3), CaCl_{2} - (0,2), glucosa (10), HEPES (10), sacarosa (4,5), tetrodotoxina (TTX 3*10^{-4}). Todas las disoluciones tenían glicina (1\muM): una concentración suficiente para provocar una activación del 80 - 85% de los receptores de glicinaB. Se aceptaron solamente los resultados de células estables para ser incluidos en el análisis final, es decir, después de recuperar respuestas a NMDA al menos por 75% de su depresión por los antagonistas probados.

Excitotoxicidad

Se obtuvieron neuronas corticales de cortezas cerebrales de fetos de rata de 17/18 días (Wistar), en general según el procedimiento de disociación descrito por [23]. Después de una corta tripsinización y una suave trituración con pipetas Pasteur pulidas al fuego, se lavó la suspensión de células por centrifugación. Las células se suspendieron en un medio Neurobasal sin suero con complemento B27 (GIBCO), antes de ser aplicadas sobre placas (Falcon Primaria) de 96 receptáculos revestidas con laminina (Sigma; 2 \mug/ml, 1 hora, 37ºC) y poli-L-lisina (Sigma; 0,2 mg/ml, 20 horas, 4ºC), con una densidad de 5x104 células/receptáculo. Se mantuvieron las neuronas corticales a 37ºC en 10% CO_{2}/90% aire humectado. Un día después de la aplicación sobre las placas, se agregó citosina-\beta-D-arabinofuranosido 5 \muM (Sigma) a cada receptáculo para inhibir la proliferación de células gliales. El medio se cambió primero después de 4 días in vitro, y luego cada 4 días, al reemplazar 2/3 del medio por un medio acondicionado por astrocitos. Se utilizaron las neuronas corticales entre los días 12 y 14 de cultivo para los experimentos.

Se aislaron astrocitos de ratas recién nacidas en forma no enzimática, según el método de [24]. En resumen, se diseccionaron ambos hemisferios de ratas de 2 días de edad, se pasaron por un cendal de 80 \mum, y se trituraron con pipetas Pasteur. La suspensión celular se hizo en un medio esencial modificado de Dulbecco (DMEM, Gibco), complementado con 10% de suero fetal de ternero (FCS, Hyclona), glutamina 2 mM (Gibco) y gentamicina 50 \mug/ml y se transfirió a matraces de cultivo de plástico, sin tratar (Corning, 75 cm^{3}). Dos días después de la aplicación sobre placas, los matraces se agitaron durante 10 minutos en una plataforma rotatoria (150 U/min) para eliminar células microgliales. Los cultivos se cultivaron hasta lograr una confluencia en 14 días, y el medio de cultivo se cambió dos veces por semana. A partir de entonces, las monocapas gliales se lavaron bien con un medio Neurobasal sin suero (Gibco) para eliminar el suero. Luego, se agitaron los matraces varias veces para eliminar oligodendrocitos y neuronas. Para obtener un medio acondicionado de astrocitos primarios, los cultivos se incubaron con un medio Neurobasal fresco, complementado por B27 y glutamina. Cada 2-3 días, se recolectó y reemplazó el medio acondicionado por medio fresco hasta 4 veces.

La exposición a EAA se realizó en un medio Neurobasal sin suero que contenía glutamato 100 \muM y el fármaco que se ha de probar. Después de 20 horas de incubación, se examinó morfológicamente el efecto citotóxico en un microscopio de contraste de fase, y se cuantificó bioquímicamente midiendo la viabilidad celular con el ensayo MTT (Promega). Este ensayo colorimétrico mide la reducción de un componente tetrazolium (MTT) en un producto formazan insoluble por las mitocondrias de células vivas. Después de incubar las neuronas corticales con la disolución de tintura durante aproximadamente 1-4 horas, se agrega una disolución de solubilización para lisar las células y solubilizar el producto coloreado (incubación durante toda la noche a 37ºC, 10% de CO_{2}, 90% de HR). Luego, estas muestras se leyeron con un lector de placas ELISA (Thermomax, MWG Biotech) con una longitud de onda de 570 nm. La cantidad de color producido fue directamente proporcional al número de células viables.

In vivo Actividad anticonvulsiva

Se utilizaron ratones hembras NMR (18-28 g), alojadas 5 por jaula, para ensayos de deterioro motor y electroshock máximo (MES). Todos los animales se mantuvieron con agua y alimento ad libitum en un ciclo de luz y sombra de 12 horas (luz a las 6 a.m.) y a una temperatura controlada (20\pm0,5ºC). Todos los experimentos se realizaron entre las 10 a.m. y 5 p.m. Los agentes probados se inyectaron por vía parenteral 30 min antes de inducir las convulsiones, salvo que se indique lo contrario (véase a continuación). Todos los compuestos se disolvieron en disolución salina al 90%.

El ensayo MES se realizó junto con ensayos de acción miorelajante (reflejo de tracción) y coordinación motora (rotarod). Para la prueba del reflejo de tracción, se colocaron las ratas con sus patas delanteras en una varilla horizontal, y los animales debían poner las 4 patas en la varilla a los 10 segundos. Para probar la ataxia (coordinación motora), se colocó a los ratones en una rotarod (5 rpm), y los animales debían permanecer en la varilla durante 1 minuto. Solamente los ratones que no reunieron los criterios en las tres repeticiones de cada prueba se consideraró que presentaban miorelajación o ataxia, respectivamente. Estos ensayos se siguieron por MES (100 Hz, 0,5 segundos de duración del shock, 5 mA de intensidad del shock, 0,9 ms de duración del impulso, Ugo Basile), aplicado por electrodos córneos. Se anotó la presencia de convulsiones tónicas (extensión tónica de las patas traseras con ángulo mínimo de 90º con el cuerpo). El objetivo fue obtener ED_{50}s para todos los parámetros anotados (actividad anticonvulsiva y efectos colaterales motores) mediante la prueba de Litchfield Wilcoxon para respuestas cuantales a la dosis. La división de ED_{50} para efectos colaterales (ataxia o miorelajación) por ED_{50} para antagonismo de convulsiones de electroshock se utilizó como índice terapéutico (IT).

Análisis Estadístico

Se calcularon IC_{50}s en pinzamiento de membrana, excitotoxicidad, y estudios de enlace, según la ecuación logística de cuatro parámetros con el programa de computación Grafit (Erithacus Software, Inglaterra). Luego, se determinó el valor Ki para los estudios de enlace, según Cheng y Prusoff. Los valores de enlace presentados son promedio \pm error estándar de la media (EEM) de 3-5 determinaciones (cada una realizada por duplicado).

Se probaron 4-7 dosis de antagonistas en cada una de las pruebas in vivo (5-8 animales por dosis) para poder calcular ED_{50}s evaluados según análisis probit (Litchfield & Wilcoxon), con una corrección para efectos 0% a 100%. Los ED_{50}s se presentan con límites de confianza del 95% (Cl). Se utilizó el análisis de correlación de momento del producto de Pearson (Sigma Stat, Jandel Scientific) para comparar potencias in vitro y actividad anticonvulsiva in vivo.

Resultados Enlace

Todos los ciclohexanos desplazados [^{3}H]-(+)-MK-801 que se unen a membranas corticales de rata con IC_{50}s entre 4 y 150 \muM, mientras que los valores de Ki calculados según la ecuación de Cheng-Prussoff fueron dos veces menores (véase Tabla 17).

Pinzamiento de membrana

Las respuestas de corriente internas de estado constante de neuronas de hipocampo cultivadas a NMDA (200 \muM con glicina 1 \muM a -70mV), tuvieron como antagonistas a los ciclohexanos probados con IC_{50}s de 1,3-99 \muM (Tabla 7). Las corrientes de estado constante y pico fueron afectadas de modo similar, y resultó improbable que sus efectos fueran mediados en el sitio de glicinaB. La clara dependencia de su bloqueo tanto del uso como del voltaje, proporcionó un gran apoyo a la idea de la naturalea acompetitiva de este antagonista. Los antagonistas más débiles mostraron una cinética más rápida y una mayor dependencia de voltaje.

Excitotoxicidad

Bajas concentraciones en \muM de la mayoría de los ciclohexanos fueron neuroprotectores eficaces in vitro, y parece que Mrz 2/579 es más potente a este respecto (véase Tabla 7). Se logró una protección completa con 20\muM con la mayoría de los compuestos.

In vivo Actividad anticonvulsiva

Todos los derivados de ciclohexano inhibieron las convulsiones inducidas por MES en ratones con ED_{50}s entre 3,6 y 50 mg/kg parenteral (Tabla 7). También se probaron compuestos seleccionados contra convulsiones inducidas por PTZ y NMDA (véase [20,21] para los métodos), y mostraron una potencia comparable al ensayo MES (por ejemplo, Mrz 2/579 tenía ED_{50}s en los ensayos de PTZ y NMDA de 5,5 y 3,7 mg/kg respectivamente). Su potencia anticonvulsiva se incrementó después de una administración intravenosa (por ejemplo, Mrz 2/579 ED_{50} = 2,5 mg/kg). Mrz 2/579 también fue activo después de una administración subcutánea, y algo menos potente después de una administración por vía oral (ED_{50}s de 4,6 y 13,7 mg/kg, respectivamente). Con dosis en el intervalo anticonvulsivo, se observaron miorelajación (prueba de tracción) y ataxia (ensayo de rotarod) con algunos ciclohexanos. En la mayoría de ellos, no se constató una mortalidad importante hasta 50 mg/kg.

Análisis de correlación

Hubo una muy buena correlación cruzada entre los tres ensayos in vitro (todos coeficientes de correlación > 0,70, p < 0,001). También hubo una buena correlación entre potencias de antagonistas de corrientes internas inducidas por NMDA y la protección contra la toxicidad inducida por NMDA in vitro con actividad anticonvulsiva in vivo (coeficientes de correlación > 0,56, p < 0,01).

11

Los efectos de derivados de ciclohexanos y antagonistas del receptor de NMDA acompetitivos estándar en la unión [^{3}H]-(+)-MK-801, corrientes inducidas en NMDA en experimentos de pinzamiento de membrana, toxicidad de glutamato en neuronas corticales cultivadas y convulsiones por MES in vivo. Los valores de enlace de Ki son promedios \pm EEM de 3-5 experimentos. Se determinaron IC_{50}s (\pm EEM) en experimentos de toxicidad de glutamato y pinzamiento de membrana a partir de datos de al menos 3 concentraciones que produjeron entre 15 y 85% de inhibición y al menos 5 células por concentración. Para convulsiones inducidas por MES, los valores de ED_{50}s están en mg/kg (los límites de confianza de 95% se indican entre paréntesis).

En conclusión, de lo anterior resulta evidente que la presente invención proporciona aplicaciones y usos de los compuestos de la presente invención nuevos, valiosos e impredecibles, tales compuestos contienen el principio activo de la presente invención, así como sus nuevas composiciones farmacéuticas y sus métodos de preparación, y métodos de tratamiento con ellas, todos ellos presentan las características y ventajas específicamente mencionadas con anterioridad.

El alto grado de actividad del agente activo de la presente invención y de sus composiciones, como lo prueban los ensayos comunicados, indica la utilidad basada en una actividad valiosa en seres humanos así como en animales inferiores. Sin embargo, la evaluación clínica en seres humanos no se ha completado. Se entenderá claramente que la distribución y venta de cualquier compuesto o composición dentro del alcance de la presente invención para su uso en seres humanos se efectuará, por supuesto, con la aprobación previa de organismos gubernamentales, como la "Federal Food and Drug Administration" en EE.UU., que son responsables de y están autorizados para dictar veredictos en estos temas.

Conclusiones

Los 1-amino-alquilciclohexanos que se han presentado representan una clase novedosa de antagonistas del receptor de NMDA acompetitivos, sistémicamente activos, con una rápida cinética de bloqueo / desbloqueo, y una fuerte dependencia de voltaje. Debido a su potencia relativamente baja y una cinética rápida afín, constituirán métodos terapéuticos útiles en una amplia variedad de trastornos del SNC que implican alteraciones de transmisión glutamatérgica.

En consecuencia, estos compuestos encuentran aplicación en el tratamiento de los siguientes trastornos de un cuerpo animal vivo, en particular un ser humano. 1. Excitotoxicidad aguda, por ejemplo, isquemia en apoplejías, estados traumáticos, hipoxia, hipoglicemia y encefalopatía hepática. 2. Enfermedades neurodegenerativas crónicas como enfermedad de Alzheimer, demencia vascular, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, neurodegeneración por SIDA, atrofia olivopontocerebeloso, síndrome de Tourette, enfermedad de las neuronas motoras, disfunción mitocondrial, síndrome de Korsakoff, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob. 3. Otros trastornos relacionados con cambios plásticos de largo plazo en el SNC como dolor crónico, tolerancia, dependencia y adicción a las drogas (por ejemplo, opiáceos, cocaína, benzodiazepinas y alcohol), 4. Epilepsia, disquinesia tardía, esquizofrenia, ansiedad, depresión, dolor agudo, espasticidad y tinnitus.

Se entenderá que la invención no se limita a los detalles exactos de operación, o a las composiciones, métodos, procedimientos o realizaciones exactos mostrados y descritos, ya que modificaciones y equivalentes de los mismos serán evidentes para un experto en la técnica y por lo tanto, la invención solamente estará limitada por el alcance que se pueda acordar legalmente a las reivindicaciones adjuntas.

Referencias

1. R.L. Frank, H.K. Hall (1950) J. Am. Chem. Soc. 72 1645-1648.

2. G.A. Hiegel, P. Burk. (1973) J. Org. Chem. 38:3637-3639.

3. N.F. Firrell, P.W. Hickmott. (1970) J. Chem. Soc. C :716-719.

4. G.H. Posner, L.L. Frye. (1984) Isr. J. Chem. 24:88-92.

4. G.L. Lemiere, T.A. van Osselaer, F.C. Anderweireldt. 5. (1978) Bull. Soc. Chim. Belg. 87:771-782.

6. H.O. House, J.M. Wilkins. (1976) J. Org. Chem. 41 :(25) 4031-4033.

7. A.R. Greenaway, W.B. Whalley. (1976) J. Chem. Soc. P.T. 1. :1385-1389.

8. S. Matsuzawa, Y. Horiguchi, E. Nakamura, l. Kuwajima. (1989) Tetrahedron 45:(2) 349-362.

9. H.O. House, W.F. Fischer. (1968) J. Org. Chem. 33 :(3) 949-956.

10. Chiurdoglu, G., Maquestiau, A. (1954) Bull. Soc. Chim. Belg. 63:357-378.

11. Zaidlewicz, M., Uzarewicz A., Zacharewicz, W. (1964) Roczniki Chem. 38: 591-597.

12. Crossley, A.W., Gilling, C. (1910) J. Chem. Soc. 2218.

13. Zaidlewicz, M., Uzarewicz, A. (1971) Roczniki Chem. 45: 1187-1194.

14. Lutz, E.T., van der Maas, J.H. (1982) Spectrochim. Acta, A. 38A: 283.

15. Lutz, E.T., van der Maas, J.H. (1981) Spectrochim. Acta, A. 37A: 129-134.

16. Ramalingam K., Balasubramanian, M., Baliah, V. (1972) Indian J. Chem. 10: 366-369.

17. Hamlin, K.E., Freifelder, M. (1953) J. Am. Chem. Soc. 75: 369-373.

18. Hassner, A., Fibinger, R., Andisik, D. (1984) J. Org. Chem. 49: 4237-4244.

19. W. Danysz, C.G. Parsons, l. Bresink, G. Quack (1995) Drug News Perspect. 8:261-277.

20. J.D. Leander, R.R. Lawson, P.L., Ornstein, D.M. Zimmerman (1988) Brain Res. 448:115-120.

21. C.G. Parsons, G. Quack, l. Bresink, L. Baran, E. Przegalinski, W. Kostowski, P. Krzascik, S. Hartmann, W. Danysz (1995). Neuropharmacology 34:1239-1258.

22. M.A. Rogawski (1993) Trends Pharmacol. Sci. 14:325-331.

23. Booher J. y Sensenbrenner M. (1972). Neurobiology 2 :97-1 05.

24. Dichter, M. (1987) Brain Research 149:279.

Claims

1. Un compuesto 1-aminoalquilciclohexano seleccionado entre los de fórmula:

4

en la que R* es - (CH_{2})_{n} -(CR^{6}R^{7})m-NR^{8}R^{9},

en la que n+m =0, 1, ó 2,

en la que R^{1} a R^{9} se seleccionan independientemente entre hidrógeno y alquilo C_{1-6}, con una primera condición de que al menos R^{1}, R^{4}, y R^{5} sean alquilo C_{1-6},

y sus sales farmacéuticamente aceptables.

2. Un compuesto de la reivindicación 1, en el que R^{1} a R^{5} son metilo.

3. Un compuesto de la reivindicación 1, en el que R^{1} es etilo.

4. Un compuesto de la reivindicación 1, en el que R^{2} es etilo.

5. Un compuesto de la reivindicación 1, en el que R^{3} es etilo.

6. Un compuesto de la reivindicación 1, en el que R^{4} es etilo.

7. Un compuesto de la reivindicación 1, en el que R^{5} es etilo o propilo.

8. Un compuesto de la reivindicación 1, en el que R^{6} o R^{7} es metilo o en el que R^{6} o R^{7} es etilo.

9. Un compuesto de la reivindicación 1, seleccionado del grupo que consiste en:

1-amino-1,3,3,5,5-pentametilciclohexano,

1-amino-1,3,5,5-tetrametil-3-etilciclohexano,

1-amino-1,5,5-trimetil-3,3-dietilciclohexano,

1-amino-1,5,5-trimetil-cis-3-etilciclohexano,

1-amino-1,5,5-trimetil-trans-3-etilciclohexano,

1-amino-1-etil-3,3,5,5-tetrametilciclohexano,

1-amino-1-propil-3,3,5,5-tetrametilciclohexano,

N-metil-1-amino-1,3,3,5,5-pentametilciclohexano,

N-etil-1-amino-1,3,3,5,5-pentametilciclohexano, y sales farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.

10. El uso de un compuesto 1-aminoalquilciclohexano o una de sus sales farmacéuticamente aceptables como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, pero no sometido a la primera y segunda condiciones de la reivindicación 1, en la fabricación de un medicamento que se emplea para aliviar una condición que se alivia mediante un antagonista del receptor de NMDA.

\newpage

11. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad de un compuesto 1-aminoalquilciclohexano o una de sus sales farmacéuticamente aceptables como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que es efectiva como antagonista del receptor de NMDA, pero no sometido a la segunda condición de la reivindicación 1, en combinación con uno o más diluyentes, excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables.