NO314353B1

NO314353B1 - 1-amino-alkylsykloheksan NMDA-reseptorantagonister

Info

Publication number: NO314353B1
Application number: NO19996548A
Authority: NO
Inventors: Markus Gold; Wojciech Danysz; Christopher Graham Rap Parsons; Ivars Kalvinsh; Valerjans Kauss; Aigars Jirgensons
Original assignee: Merz Pharma Gmbh & Co Kgaa
Priority date: 1997-06-30
Filing date: 1999-12-29
Publication date: 2003-03-10
Also published as: JP2002511873A; HU226110B1; JP3963488B2; EP1009732A2; EP1009732B1; NO996548D0; DE69814878D1; KR100630506B1; NO996548L; IL133235A; HUP0100266A3; CN1266423A; FI19992801A; CZ293248B6; WO1999001416A3; DE69814878T2; AU724974B2; TW593225B; PT1009732E; IL133235A0

Description

Bakgrunn for oppfinnelsen

1. Område for oppfinnelsen

1-amino-alkylsykloheksanforbindelser som er systemisk-aktive som NMDA-reseptorantagonister, farmasøytiske preparater omfattende disse og anvendelse av forbindelsene for fremstilling av et medikament for behandling av CNS-sykdommer som innbefatter forstyrrelser av glutamatergisk transmisjon derved.

2 . Kjent teknikk

Antagonisme av glutamatreseptorer av N-metyl-D-aspar-tat(NMDA)-type har et potensielt bredt område av terapeutisk anvendelse [19]. Funksjonell inhibering av NMDA-reseptorer kan oppnås via virkningen ved forskjellige gjenkjennelsesseter, slik som det primære transmittersete, stryknin-ufølsomme gly-sinsete (glysinB) , polyaminsete og fensyklidinsete lokalisert på innsiden av kationkanalen. NMDA-reseptorkanalblokkerere virker på en ukonkurrerende "anvendelse-avhengig" måte, hvilket betyr at de vanligvis bare blokkerer kanalen i åpen tilstand. Denne anvendelse-avhengighet er blitt fortolket av mange til å bety at sterkere aktivering av reseptoren vil føre til en større grad av antagonisme. En slik virkningsmåte har enn videre blitt tatt til å medføre at denne klasse av antagonister kan være særlig anvendbare når overaktivering av NMDA-reseptorene kan forventes, slik som i epilepsi, ischemi og traume. Innledende klinisk erfaring med den selektive, høye affinitet, sterke anvendeIse-avhengige, ukonkurrerende NMDA-reseptorantagonist {+)-5-metyl-10,ll-dihydro-5H-dibenzosyklo-hepten-5,10-iminmaleat ((+)-MK-801) har imidlertid vært ned-slående. Den terapeutiske virksomhet i epilepsi var således dårlig, mens enkelte psykotropiske bivirkninger var tydelige ved terapeutiske doser. Disse observasjoner, sammen med det faktum at fensyklidinmisbrukere opplever lignende psykotrope symptomer, har ført til den konklusjon at ukonkurrerende antagonisme av NMDA-reseptorene ikke kan være noen lovende terapeutisk løsning.

Anvendelse av mer utviklende elektrofysiologiske metoder indikerer imidlertid at det ikke er noen likhet mellom forskjellige ukonkurrerende antagonister, da faktorer, slik som hurtigheten.av reseptorblokkade (på-av-kinetikk) og spen-ningsavhengigheten av denne effekt, kan bestemme de farmakody-namiske trekk in vivo, dvs. også terapeutisk sikkerhet. Para-doksalt kan midler med lav til moderat, snarere enn høy affinitet, være ønskelig. Slike observasjoner utløste en revurder-ing av teorien for ukonkurrerende antagonisme av NMDA-reseptorer i legemiddelutvikling [19, 22]. For tiden er mange slike midler i forskjellige utviklingstrinn, f.eks. karvedilol,

ADCI, ES 242S, remacemid, felbamat og budipin. På den annen side har ukonkurrerende NMDA-reseptorantagonister, slik som amantadin og memantin - som oppfyller de ovenfor angitte kri-terier - være anvendt klinisk i flere år ved behandling av Parkinsons sykdom og demens, og fremkaller sjelden bivirkninger ved de anvendte terapeutiske doser innen deres respektive indikasjoner.

I lys av de ovenfor nevnte bevis er det utviklet en serie av nye ukonkurrerende NMDA-reseptorantagonister basert på 1-aminoalkylsykloheksanstrukturen. Foreliggende studie ble konsentrert om å sammenligne de tre NMDA-reseptorantagonist-iske egenskaper av disse 1-aminoalkylsykloheksanderivater i reseptorbindende bestemmelser, plasterklemmeforsøk, eksitotoksisitet in vitro, tre konvulsjonsmodeller og to modeller for motorisk svekkelse. Substitusjoner av disse 1-aminoa1kylsyklo-heksaner er angitt i detalj i tabell 6.

Foreliggende oppfinnelse

Det er nå funnet at visse l-aminoalkylsykloheksaner har en utalt og uforutsigbar NMDA-reseptorantagonistisk aktivitet. Pga. den ovenfor nevnte egenskap er substansene egnet for behandling av et vidt område av CNS-sykdommer som innbefatter forstyrrelser av glutamatergisk transmisjon, fortrinnsvis i form av et farmasøytisk preparat derav, hvori de er til stede sammen med én eller flere farmasøytisk akseptable fortynningsmidler, bærere eller eksipienser.

Mål med oppfinnelsen

Et mål med foreliggende oppfinnelse er å tilveie-bringe nye farmasøytiske forbindelser som er 1-aminoalkyl-sykloheksan-NMDA-reseptorantagonister og farmasøytiske preparater derav. Et ytterligere mål ved oppfinnelsen er å tilveie-bringe en ny metode for behandling, eliminering, lindring eller forbedring av uønskede CNS-sykdommer som innbefatter forstyrrelser av glutamatergisk transmisjon, ved anvendelse av en slik forbindelse ifølge oppfinnelsen eller et farmasøytisk preparat inneholdende det samme. Et ytterligere mål ved oppfinnelsen er tilveiebringelse av en fremgangsmåte for fremstilling av angitte 1-aminoalkylsykloheksanforbindelser. <y>tterligere mål vil fremkomme i det etterfølgende og ytterligere mål vil være innlysende for fagmannen.

Sammendrag av oppfinnelsen

Hva som antas å være omfattet av foreliggende oppfinnelse' kan blant annet oppsummeres i det etterfølgende: En 1-aminoalkylsykloheksanforbindelse valgt fra de av formelen

hvori R<*> er - (CH2) a- (CRSR7) m-NRBR9,

hvori n + m = 0, 1 eller 2,

hvori Rx<->R<9> uavhengig er valgt fra hydrogen og lavere alkyl (1-6C) , og hvor minst R1, R<4> og R<5> er lavere alkyl;

slik som en forbindelse hvori R<1->Rs er metyl;

slik som en forbindelse hvori R<1> er etyl;

slik som en forbindelse hvori R<2> er etyl;

slik som en forbindelse hvori R<3> er etyl;

slik som en forbindelse hvori R<4> er etyl;

slik som en forbindelse hvori R<5> er etyl;

slik som en forbindelse hvori R<5> er propyl;

slik som en forbindelse hvori R<6> eller R<7> er metyl;

slik som en forbindelse hvori R<6> eller R7 er etyl; og

slik som en forbindelse hvori forbindelsen er valgt fra gruppen bestående av

1-amino-l,3,3,5,5-pentametylsykloheksan, 1-amino-l,3,5,5-tetrametyl-3-etylsykloheksan, 1-amino-l,5,5-trimetyl-3,3-dietylsykloheksan, 1-amino-l,5,5-trimetyl-cis-3-etylsykloheksan, 1-amino-l,5,5-trimetyl-trans-3-etylsykloheksan, 1-amino-l-etyl-3,3,5,5-tetrametylsykloheksan, l-amino-l-propyl-3,3,5,5-tetrametylsykloheksan, N-metyl-1-amino-l,3,3,5,5-pentametylsykloheksan og

N-etyl-1-amino-l,3,3,5,5-pentametylsykloheksan

og farmasøytisk akseptable salter av enhver av de foregående.

Enn videre omfatter et farmasøytisk preparat en NMDA-reseptorantagonist i en effektiv NMDA-reseptorantagonistisk mengde, eller en effektiv immunomodulerende, antimalaria, ant i-Borna-virus eller anti-hepatitt-C-mengde, av en 1-anyLno-alkylsykloheksanforbindelse valgt fra de av formelen

hvori R* er (CH2) a- (CR6R7) m-NRBR9,

hvori n + m = 0, 1 eller 2,

hvori R<1->R<9> uavhengig er valgt fra hydrogen og lavere alkyl (1-6C), hvor minst R1, R<4> og R<5> er lavere alkyl, i kombinasjon med én eller flere farmasøytisk akseptable fortynningsmidler, eksipienser eller bærere;

slik som et farmasøytisk preparat hvori R1-Rs er metyl;

slik som et farmasøytisk preparat hvori R<1> er etyl;

slik som et farmasøytisk preparat hvori R<2> er etyl;

slik som et farmasøytisk preparat hvori R<3> er etyl;

slik som et farmasøytisk preparat hvori R<4> er etyl;

slik som et farmasøytisk preparat hvori R<5> er etyl;

slik som et farmasøytisk preparat hvori Rs er propyl;

slik som et farmasøytisk preparat hvori R<6> eller R7 er metyl;

slik som et farmasøytisk preparat hvori R<6> eller R<7> er etyl; og

slik som et farmasøytisk preparat hvori forbindelsen er valgt fra gruppen bestående av

1-amino-l,3,3,5,5-pentametylsykloheksan, 1-amino-l,3,5,5-tetrametyl-3-etylsykloheksan, 1-amino-l,5,5-trimetyl-3,3-dietylsykloheksan, 1-amino-l,5,5-trimetyl-cis-3-etylsykloheksan, 1-amino-l,5,5-trimetyl-trans-3-etylsykloheksan, l-amino-l-etyl-3,3,5,5-tetrametylsykloheksan, 1-amino-l-propyl-3,3,5,5-tetrametylsykloheksan,

N-metyl-1-amino-l,3,3,5,5-pentametylsykloheksan og N-etyl-1-amino-l,3,3,5,5-pentametylsykloheksan,

og farmasøytisk akseptable salter av enhver av de foregående.

A

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

De etterfølgende detaljer og detaljerte eksempler er angitt av illustrative grunner.

Fremstilling av 3- propyl- 5, 5- dimetyl- 2- sykloheksen- l- on ( 1- 7)

En løsning av 3-etoksy-5,5-dimetyl~2-sykloheksen-l-on

[1] (5,04 g, 30 mmol) i eter ble dråpevis tilsatt til en om-rørt løsning av propylmagnesiumjodid, fremstilt fra 90 mg magnesium og 90 mmol 1-jodpropan i 60 ml eter. Etter omrøring i 1 t ved omgivende temperatur ble reaksjonsblandingen behandlet med 5 % H2S04-løsning. Den organiske fase ble fraskilt, ble vasket med saltvann, tørket over MgS04 og fordampet under dannelse av en uren olje som ble separert på en silikagelkolonne, og eluert med heksan-etylacetatblanding. Sykloheksenon ( 1- 7) ble erholdt som en fargeløs olje (2,0 g, 70 %).

<1>H-NMR (CDC13, TMS) 8: 0,92 (3 H, t, J = 7 Hz), 1,03 (6 H, s), 1,3-1,75 (2 H, m), 2,16 (2 H, t, J = 7 Hz), 2,17

(2 H, d, J = 1,5 Hz), 2,21 (2 H, s) og 5,87 ppm (1 H, t, J = 1,5 Hz).

Slike kjente sykloheksenoner 1 ble anvendt for å fremstille forbindelser 2:

1-1 (R<1>=R2=R<3>=H) [kommersielt tilgjengelig], ,

1-2 (R<3>=Me)<*> [kommersielt tilgjengelig],

1^-3 (R2=R<3>=Me) [kommersielt tilgjengelig],

1-4 (R<1>=R<2>=Me) [2],

1-5 (R<1>=R2=R<3>»Me) [kommersielt tilgjengelig],

1-6 (R<1>=R<2>=Me# R<3>-Et) [3].

<*>R<n>= H, hvis utelatt

Andre utgangsmaterialer 1 ble fremstilt på samme eller lignende måte.

Generell prosedyre for fremstilling av sykloheksanoner 2

Vannfritt kopper(1)klorid (7,5 mmol) ble tilsatt til

en avkjølt løsning av alkylmagnesiurajodid (15-18 mmol) i eter. Blandingen ble omrørt i en inert atmosfære i 5 min og en løsn-ing av 2-sykloheksen-l-on 1^ (10 mmol) i eter ble dråpevis tilsatt, idet temperaturen ble holdt under -5 °C. Etter at tilsetningen av ketonet var fullført, ble reaksjonsblandingen om-rørt i 1 t og ble forsiktig nøytralisert med mettet, vandig NH4C1-løsning. Tradisjonell opparbeidelse for Grignard-reaksjoner ga urent materiale som ble separert på en silikagel-

kolonne og eluert med en petroleumseter-etylacetatblanding. Sykloheksanonene 2 ble erholdt som oljer.

Utbytter og <1>H-NMR-spektraldata for forbindelser 2 er angitt i tabell 1.

Slike kjente sykloheksanoner 2 ble anvendt for å fremstille forbindelser 3.

2-1 (R<*>=Me)<*> [kommersielt tilgjengelig],

2-2 (R<*>=Et) [4],

2-3 (R<4>*Pr) [5],

2-4 (R<3>=R<*>=Me) [6],

2-5 (R<3>=Me, R<*>«Et) [7],

2-6 (R<3>=Me, R<4>=Pr) [8],

2-7 (R<x>=R<4>=Me) [9],

2-8 (R<2>=R<3>=<R4=>Me) [10],

2-9 (R<2>=R<3>=Me, R<4>=Et) [11],

2-13 (R<1>=R<2>=R<3>=R<4>=Me) [kommersielt tilgjengelig], 2-14 (R<1>=R<2>=R<3>=Me, R<4>-Et) [10],

2- 15 (R<x>=R<2>=R<3>=Me, R<4>=Pr) [10].

<*>R<n>= H, hvis utelatt.

Andre intermediære sykloheksanoner 2 ble fremstilt på samme eller lignende måte. Sykloheksanoner 2 ble anvendt for å fremstille forbindelser 3: Generell prosedyre for fremstilling av alkylsykloheksanoler 3

En eterløsning av alkylmagnesiumjodid (3-4 ekvivalenter) ble dråpevis tilsatt til en avkjølt løsning av syklo-heksanon 2 i eter. Blandingen ble otnrørt ilt ved omgivende temperatur og ble forsiktig ødelagt med mettet, vandig ammoni-umklorid. Tradisjonell opparbeidelse for Grignard-reaksjoner ga blandinger av diastereomeriske alkoholer 3, som ble separert på en silikagelkolonne og ble eluert med petroleumseter-etylacetat.

Utbytter og ^-NMR-spektraldata for forbindelser 3 er angitt i tabell 2.

Slike kjente sykloheksanoler 3 ble anvendt for å fremstille forbindelser 4.

3- 1 ((R<3>)(R<4>)»R<5>=Me)<*> [9], dvs. R<3> eller R<4> og Rs er Me.

3-4 (R<3>=R<4>=Me, R<9>=Me) [12],

3-5 (R3=R<5>=Me, R<4>=Et) [13],

3-7 (R<1>=R<*>=R<5>=Me) [14],

3-8 (R<1>=R<3>=R<*>=R<5>=Me) [10],

3-13 (R<1->R<2->R<3->R<*>=R<5>=Me) [10],

3-14 (R<x>=R<2>=R<3>=R<4>=Me, R<5>-Et) [15],

<*>R<n>= H, hvis utelatt.

Andre intermediære sykloheksenoler 3 ble fremstilt på samme eller lignende måte.

Generell prosedyre for fremstilling av 1- alkyl- l- azidosykloheksaner 4

Alkohol 3 ble blandet med 1,7-2 N hydrazosyre(10-13 ekvivalenter)-løsning i kloroform og ble avkjølt i et isbad. En løsning av TiCl4 (1,2 ekvivalenter) i kloroform ble dråpevis tilsatt, mens temperaturen ble opprettholdt under 5 °C. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 24 t og ble ført nedover en kolonne av alumina og ble eluert med kloroform. Fordampning av løsningsmidlet ga diastereomere azider 4 som ble renset ved flashkromatografi på silikagel og eluering med lett petroleumseter.

Utbytter og <1>H-NMR-spektraldata for forbindelser 4 er angitt i tabell 3.

Andre intermediære 1-alkyl-l-azidosykloheksaner 4 ble fremstilt på samme eller lignende måte.

Fremstilling av l- nitrometyl- 3, 3, 5, 5- tetrametylsykloheksen ( 6)

En løsning av 3,3,5,5-tetrametylsykloheksanon (2-13)

(1,54 g, 10 mmol) og etylendiamin (60 mg) i nitrometan (45 ml) ble kokt under tilbakeløpskjøling i argonatmosfære i 25 t.

Overskudd av nitrometan ble deretter fjernet i vakuum og residuet ble renset ved flashkromatografi på silikagel og ble eluert med heksan-etylacetat (6:1). 1,2 g (61 %) av 6 ble erholdt som en olje.

<1>H-nmr (CDC13, TMS) 5 0,96 og 1,03 (total 12 H, begge s, sykloheksan 3,5-CH3), 1,34 (2 H, s, 4-CH2), 1,82 (2 H, br s, 6-CH2), 4,80 (2 H, s, CH2N02) og 5,64 ppm (1 H, br s, C=C-H).

Fremstilling av etyl- 3, 3, 5, 5- tetrametylsykloheksylidenacetat

( 7)

Til en omrørt løsning av trietylfosfonoacetat

(49,32 g, 0,22 mol) i 180 ml tørr THF under argon ble det tilsatt NaH (8,8 g, 0,22 mol, 60 % suspensjon i mineralolje) i små porsjoner under avkjøling med isvann. Omrøringen ble fortsatt ilt ved romtemperatur, hvorpå en løsning av 3,3,5,5-tetrametylsykloheksanon (2-13) (30,85 g, 0,2 mol) ble tilsatt i løpet av 10 min og den resulterende blanding ble kokt under tilbakeløpskjøling i 22 t. Den ble deretter helt over på 400 g is, produktet ble ekstrahert med 4 x 150 ml eter og løsningen ble tørket over MgS04. Etter konsentrering i vakuum ble det oljeaktige residu destillert ved 145 °C (11 mm) under dannelse av 36,8 g (86 %) av 6 som en olje.

<X>H-NMR (CDC13, TMS) 5 0,96 og 0,98 (totalt 12 H, begge s, sykloheksan 3,5-CH3), 1,27 (3 H, t, CH3-etyl), 1,33 (2 H, m, sykloheksan 4-CH2), 1,95 og 2,65 (totalt 4 H, begge s, sykloheksan 2,6-CH2), 4,14 (2 H, q, CH2-etyl) og 5,69 ppm (1 H„ s,

-C-H).

Fremstilling av etyl- 3, 3, 5, 5- tetrametylsykloheksylacetat ( 8)

Etyl-3,3,5,5-tetrametylsykloheksylidenacetat (7)

(4,48 g, 20 mmol) i 100 ml etanol ble hydrogenert over 10 % Pd/C (0,22 g, 5 vekt%) ved 10 apm i 18 t. Filtrering gjennom celitt og fordampning ga 4,28 g (95 %) av 8 som en olje.

Hl-NMR (CDC13, TMS) 8 0,89 og 1,02 (totalt 12 H, begge s, sykloheksan 3,5-CH3), 1,26 (3 H, t, J = 7 Hz, CH3-etyl), 0,6-1,55 (7 H, m, ringprotoner), 2,13 (2 H, m, 2-CH2) og 4,12 ppm (2 H, q, J - 7 Hz, CH2-etyl).

Fremstilling av 2- metyl-( 3, 3, 5, 5- tetrametylsykloheksyl) propan-2- ol ( 9)

En løsning av etyl-3,3,5,5-tetrametylsykloheksylacetat (8) (2,26 g, 10 mmol) i 20 ml eter ble dråpevis tilsatt til en 2 M metylmagnesiumjodidløsning i 20 ml eter i løpet av 15 t under avkjøling med isvann. Blandingen ble kokt under tilbakeløpskjøling i 2 t, ble avkjølt og ble tilsatt mettet, vandig NH4C1. Etter vanlig opparbeidelse ble produktet renset på silikagelkolonne og ble eluert med en blanding av heksan-etylacetat (20:1) under dannelse av 1,7 g (80 %) av 9 som en olje.

<*>H-NMR (CDC13, TMS) 0,86 og 1,00 (totalt 12 H, begge s, sykloheksan 3,5-CH3), 1,23 (6 H, s, a-CH3), 1,36 (2 H, d, J = 5 Hz, -CH2-), 0,6-2,04 ppm (8 H, m, ringprotoner og 0H).

Fremstilling av 2- metyl- ( 3, 3, 5, 5- tetrametylsykloheksyl ) propyl-2- azid ( 10)

Bortrifluorideterat (0,77 g, 0,69 ml, 5,44 mmol) ble dråpevis tilsatt til en omrørt løsning av 2-raetyl-(3,3,5,5-tetrametylsykloheksyl)propan-2-ol (9) (0,96 g, 4,53 mmol) og trimetylsilylazid (0,63 g, 0,72 ml, 5,44 mmol) i 10 ml benzen. Etter omrøring i 24 t ved romtemperatur ble blandingen helt over i 20 ml vann. ben organiske fase ble fraskilt og ble vasket med 10 ml mettet, vandig NaHC03 og 10 ml saltvann. Løsn-ingen ble tørket over MgS04, ble filtrert og konsentrert. Det urene produkt ble renset på silikagelkolonne og ble eluert med heksan under dannelse av 0,56 g (52 %) av 10 som en olje.,

<1>H-NMR (CDCI3, TMS) 8: 0,87 og 1,01 (totalt 12 H, begge s, sykloheksan 3,5-CH3), 1,27 (6 H, s, <x-CH3), 1,36 (2 H, d, J = 5 Hz, -CH2-), 0,6-1,85 ppm (7 H, m, ringprotoner).

Fremstilling av 2-( 3, 3, 5, 5- tetrametylsykloheksyl) etanol ( 11)

En løsning av etyl-3,3,5,5-tetrametylsykloheksylacetat 8 (1,8 g, 8,0 mmol) i 30 ml eter ble dråpevis tilsatt til en omrørt suspensjon av litiumaluminiumhydrid (0,9 g,

24,0 mmol) i 30 ml eter under avkjøling i et isbad. Reaksjonsblandingen ble kokt under tilbakeløpskjøling i 3 t, ble av-kjølt og det gjenværende litiumaluminiumhydrid ble ødelagt med vann. Det vandige lag ble fraskilt og ekstrahert to ganger med eter. De kombinerte eterfaser ble vasket med saltvann, ble tørket over MgS04, filtrert og fordampet. Det urene produkt ble renset ved flashkromatografi på silikagel og ble eluert med heksan-etylacetatblanding (4:1) under dannelse av 1,2 g (79 %) av 11 som en olje.

<1>H-NMR (CDC13, TMS) 8: 0,89 og 1,00 (totalt 12 H, begge s, sykloheksan 3,5-CH3), 1,44 (2 H, q, J = 7 Hz, 2-CH2), 0,55-1,95 (8 H, m, ringprotoner og 0H) og 3,70 ppm (2 H, t, J = 7 Hz, CH20).

Fremstilling av 2-( 3, 3, 5, 5- tetrametylsykloheksyl) etylmetan-sulfonat ( 12)

En løsning av metansulfonylklorid (1,03 g, 0,7 ml, 9,0 mmol) i 20 ml tørr benzen ble tilsatt til en omrørt løsn-ing av 2-(3,3,5,5-tetrametylsykloheksyl)etanol (11) (1,1 g, 6,0 mmol) og trietylamin (1,2 g, 1,7 ml, 12 mmol) i 40 ml benzen, under avkjøling i et isbad. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 3 t, ble deretter filtrert gjennom en kort silikagelkolonne og ble eluert med benzen. Fordampning av løsningsmidlet ga 1,48 g (94 %) av 12 som en olje.

<1>H-NMR (CDC13, TMS) 8: 0,88 og 0,98 (totalt 12 H, begge s, sykloheksan 3,5-CH3), 1,62 (2 H, q, J = 7 Hz, 2-CH2), 0,65-2,0 (7 H, m, ringprotoner), 3,0 (3 H, s, CH3-S02) og 4,29 ppm (2 H, t, J = 7 Hz, CH20).

Fremstilling av 2-( 3, 3, 5, 5- tetrametylsykloheksyl) etylazid ( 13)

En blanding av natriumazid (2,27 g, 34,2 mmol),,2-(3,3,5,5-tetrametylsykloheksyl)etylmetansulfonat (12) (1,46 g, 5,57 mmol) og 20 ml dimetylsulfoksid ble omrørt ved romtemperatur i 48 t, ble fortynnet med 50 ml vann og ble ekstrahert med 3 x 30 ml eter. Den organiske fase ble vasket med 30 ml saltvann, ble tørket over MgS04, filtrert og fordampet. Det urene produkt ble renset ved flashkromatografi på silikagel og ble eluert med heksan under dannelse av 0,93 g (80 %) av (13) som en olje.

^-NMR (CDC13, TMS) 8: 0,87 og 0,99 (totalt 12 H, begge s, sykloheksan 3,5-CH3), 1,47 (2 H, q, J = 7 Hz, 2-CH2), 0,55-1,9 (7 H, m, ringprotoner) og 3,31 ppm (2 H, t, J = 7 Hz, CH2N3).

Fremstilling av N- formyl- 1- 3, 3, 5, 5- pentametylsykloheksanamin

(14-1)

Til en kraftig omrørt løsning av 1,3,3,5,5-penta-metylsykloheksanol (3-13) (2,7 g, 15,6 mmol) og trimetylsilyl-cyanid (2,36 g, 23,8 mmol) i 2,5 ml eddiksyre under argon ble det tilsatt 98 % svovelsyre (4,66 g, 47,6 mmol), idet temperaturen ble holdt under -5 °C. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 22 t, ble deretter, helt over på 100 g is, ble nøytralisert med 50 % NaOH-løsning til pH 7 og ble ekstrahert med 3 x 30 ml eter. De kombinerte eterfaser ble vasket med 50 ml saltvann og ble deretter tørket over MgS04 og fordampet. Et svakt gult, krystallinsk residu ble behandlet med en liten mengde acetonitril og ble filtrert fra under dannelse av 2,5 g (80 %) av 14-1 som hvite krystaller, smp.: 104-106 °C.

<1>H-NMR (CDC13, TMS) 5: 0,91 og 0,93 (totalt 6 H, begge s, 3,5-C<H>3ekv), 1,08 (2 H, m, 2,6-CH.kT), 1,13 og 1,15 (totalt 6 H, begge s, 3,5- CH3„), 1,25 (2 H, m, 4-CH2), 1,32 og 1,38 (totalt 3 H, begge s, 1-CH3), 1,70 og 2,12 (totalt 2 H, begge d, 14,7 Hz, 2,6-CH„), 5,30 og 5,60 (totalt 1 H, begge br s, NH), 8,05 og 8,30 ppm (totalt 1 H, begge d, 2,0 og 12,7 Hz, resp., HCO).

Fremstilling av N- acetyl- 1, 3, 3, 5, 5- pentametylsykloheksanamin

( 14- 2)

Til en kraftig omrørt løsning av 1,3,3,5,5-petametyl-sykloheksanol (3-13) (3,0 g, 17,65 mmol) i 20 ml acetonitril ble dråpevis tilsatt 6 ml rykende HN03 idet temperaturen ble holdt under 45 °C. Den resulterende blanding ble omrørt ved 45-50 °C i 6 t, ble deretter avkjølt, ble helt over i 30 ml vann og ble nøytralisert med vandig NH3. Den vandige fase ble ekstrahert med 3 x 30 ml eter. De kombinerte eterfaser ble vasket med 30 ml saltvann, ble deretter tørket over MgS04, filtrert og fordampet. Det urene produkt ble krystallisert fra kald acetonitril under dannelse av 2,23 g (60 %) av 14-2 som hvite krystaller, smp.: 110 °C.

^-NMR (CDC13, TMS) 5: 0,90 og 1,12 (totalt 12 H, begge s, 3,5-CH3), 1,33 (3 H, s, 1-CH3), 1,88 (3 H, s, CH3O0), 0,75-2,25 (6 H, m, ringprotoner) og 5,3 ppm (1 H, br s, NH).

Fremstilling av N- metoksykarbonyl- N- 1, 3, 3, 5, 5- heksametylsyklo-heksanamin ( 15)

Metylklorformiat (0,97 g, 0,8 ml, 10,3 mmol) ble tilsatt i én porsjon til en suspensjon av N, 1,3,3, 5,5-heksametyl-sykloheksanamin-hydroklorid (5-20) (1,13 g, 5,13 mmol) og Na2C03 (1,63 g, 15,4 mmol) i 30 ml THF. Den resulterende blanding ble omrørt ved romtemperatur i 6 t, ble deretter fortynnet med 50 ml vann og ble ekstrahert med 3 x 30 ml eter. De kombinerte, organiske faser ble vasket med 10 % K2S04r saltvann, ble tørket over MgS04, filtrert og fordampet. Det urene produkt ble renset ved flashkromatograf! og ble eluert med heksan-etylacetatblanding (6:1) under dannelse av 0,90 g (78 %) av (15) som en olje.

^-NMR (CDC13, TMS) 8: 0,93 og 1,07 (totalt 12 H, begge s, 3,5-CH3), 1,23 (3 H, s, 1-CH3), 1,0-1,4 (4 H, m, 4-CH2 og 2,6-CHakT), 2,56 (2 H, d, J = 14 Hz, 2,6-CH„), 2,87 (3 H, s, CH3N) og 3,64 ppm (3 H, s, CH30).

Fremstilling av etyl- ( 3, 3 f 5 1 5- tetrametylsykloheksyliden) cyano-acetat ( 16)

Blandingen av 3,3,5,5-tetrametylsykloheksanon (2-13)

(2,64 g, 17 mmol), etylcyanoacetat (1,93 g, 17 mmol), 0,2 ml eddiksyre og 0,2 g ammoniumacetat i 6,4 ml benzen ble kokt under tilbakeløpskjøling med en Dean-Stark-apparatur i 10 t. Til dette ble det tilsatt 30 ml benzen og 30 ml saltvann, det organiske lag ble fraskilt, ble tørket over Na2S04, filtrert og fordampet. Det urene produkt ble renset ved flashkromatografi og ble eluert med heksan under dannelse av 2,0 g (50 %) av (16) som en olje.

<1>H-NMR (CDC13, TMS) 8: 1,01 (6 H, s, 3, 5-CH3„kv), 1,05 (6 H, s, 3,5-CH3„), 1,34 (3 H, t, J = 7 Hz, etyl-CH3), 1,42

(2 H, s, 4-CH2), 2,46 og 2,79 (totalt 4 H, begge s, 2,6-CH2) og 4,29 ppm (2 H, q, J = 7 Hz, CH20).

Fremstilling av etyl-( 1, 3, 3, 5, 5- pentametylsykloheksyl) cyano-acetat ( 17)

Vannfritt kopper(1)klorid (0,8 g, 8 mmol) ble tilsatt til en avkjølt løsning av alkylmagnesiumjodid (fremstilt fra magnesium (0,46 g, 19,2 mmol) og jodmetan (2,84 g, 20 mmol) i 12 ml eter. Blandingen ble omrørt i en inert atmosfære i 5 min og en løsning av etyl (3,3,5,5-tetrametylsykloheksyliden )cyano-acetat (16) (2 g, 8 mmol) i 10 ml eter, ble dråpevis tilsatt, idet temperaturen ble holdt under -15 °C. Etter at tilsetningen av ketonet var fullført, ble reaksjonsblandingen omrørt i 3 t og ble forsiktig nøytralisert med mettet, vandig NH4C1-løsning. Tradisjonell opparbeidelse for Grignard-reaksjoner ga et urent materiale som ble separert på en silikagelkolonne og ble eluert med en petroleumseter-etylacetatblanding (20:1) under dannelse av 1,0 g (47 %) av 17 som en olje.

<1>H-NMR (CDC13, TMS) 8: 0,98 (9 H, s, 3,5-C<H>3ekv og 1-CH3), 1,06 (6 H, s, 3,5-CH3„), 1,31 (3 H, t, J = 7 Hz, etyl-CH3), 1,2-1,5 (6 H, m, ringprotoner), 3,41 (1 H, s, a-CH) og 4,25 ppm (2 H, q, 3 = 1 Hz, CH20).

Fremstilling av 1-cyanometyl-l , 3, 3, 5, 5- pentametylsykloheksan

( 18)

En blanding av etyl(1,3,3,5,5-pentametylsykloheksyl)-cyanoacetat (17) (1 g, 3,7 mmol), LiCl (0,05 g) og 0,15 ml vann i 2,5 ml DMSO ble oppvarmet til 150-160 °C i 4 t. Løsning-en ble helt over i 70 ml vann og ble ekstrahert med 4 x 20 ml eter. Eteren ble vasket med 2 x 50 ml saltvann, ble tørket over Na2S04, filtrert og fordampet. Det urene produkt ble renset på en silikagelkolonne og ble eluert med en petroleumseter-etylacetatblanding (20:1) under dannelse av 0,66 g (94 %) av 18 som en olje. >

<1>H-NMR (CDC13, TMS) 8: 0,98 (9 H, s, 3,5-CH3ekv og 1-CH3), 1,02 (6 H, s, 3,5-CH3aat), 1,21 (3 H, s, ringprotoner), 1,31 (3 H, s, ringprotoner) og 2,31 ppm (2 H, s, CH2CN).

IR (ren) vCff = 2 242 cm"<1>.

Generell prosedyre for fremstilling av alkylsykloheksanamin-hydroklorider 5- 1- 5- 25.

En løsning av 4, 10 eller 13-15, 18 i eter ble dråpevis tilsatt til en omrørt suspensjon av 4 ekvivalenter litiumaluminiumhydrid i eter under avkjøling i et isbad. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur når det gjelder 4, 10, 13, eller ble kokt under tilbakeløpskjøling når det gjelder 14, 15, 18 til endt omdannelse av utgangsmateriale (TLC-kon-troll). Gjenværende litiumaluminiumhydrid ble ødelagt med vann, det vandige lag ble fraskilt og ekstrahert to ganger med eter. De kombinerte eterfaser ble vasket med saltvann, ble tørket over NaOH, filtrert og fordampet. Det erholdte amin ble behandlet med HC1 uten karakterisering. Aminhydrokloridet ble fremstilt enten ved føring av HCl-gass gjennom aminløsningen i heksan, eller ved tilsetning av en 1 N HC1-løsning i eter til aminløsningen. I begge tilfeller ble løsningsmidlet fjernet etter HC1-tilsetningen, residuet ble behandlet med heksan eller acetonitril og det krystallinske produkt ble filtrert.av under dannelse av 5-1^ - 5-25 med glimrende renhet.

De fysikalske egenskaper og utbytter for forbindelser 5-1 - 5-25 er angitt i tabell 4.

<1>H-NMR-spektraldata for forbindelser 5-1 - 5-25 er angitt i tabell 5.

Ytterligere 1-aminoalkylsykloheksaner og deres hydro-klorider ble fremstilt på den samme eller lignende måte. Hydrokloridene kan omdannes til den frie base eller andre syreaddisjonssalter som angitt under "SYREADDISJONSSALTER".

Fremstilling av 3, 3, 5, 5- tetrametylsykloheksylmetylamin- hydro-klorid ( 5- 26)

En løsning av l-nitrometyl-3,3,5,5-tetrametylsykloheksen (6) (1,1 g, 5,63 mmol) i en blanding av 140 ml etanol og 2,8 ml kloroform ble hydrogenert over 280 mg 10 % Pd/C ved 5 atm i 20 t, ble filtrert og fordampet. Det urene produkt ble behandlet med eter, ble filtrert og vasket med eter under dannelse av 0,57 g (50 %) av amin 5-26.

De fysikalske egenskaper og utbytte av forbindelse 5-26 er angitt i tabell 4.

<1>H-NMR-spektraldata for forbindelser 5-26 er angitt i tabell 5.

Amin 5-27 ble fremstilt i henhold til den kjente prosedyre [16].

Amin 5-28 [17] ble fremstilt i henhold til den gene-relle prosedyre fra det tilsvarende azid [18]. Alle fysikalske egenskaper var i god overensstemmelse med beskrevne data [17].

Renheten av alle fremstilte forbindelser ble kontrollert ved GC [MN-OV-1, 25 m x 0,53 m, df = 1,0 um, 50-270 °C

10 °C/min)].

Syreaddisjonssalter

Som syrer egnet for dannelse av syreaddisjonssalter i henhold til konvensjonelle prosedyrer, kan nevnes følgende syrer fra den uorganiske serie: saltsyre, hydrobromsyre, metansulfonsyre, isotion-syre, svovelsyre, fosforsyre og sulfamsyre og fra den organiske serie: eddiksyre, propionsyre, maleinsyre, fumarsyre, vinsyre, sitronsyre, oksalsyre og benzosyre for å nevne noen få syrer. Foretrukne syrer er saltsyre, sitronsyre og raalein-syre. Andre farmasøytisk akseptable syreaddisjonssalter kan fremstilles om ønsket, og et syreaddisjonssalt kan omdannes til et annet ved nøytralisering av saltet, f.eks. hydroklorid-et, resulterende i den frie base, og deretter surgjøring på nytt med en forskjellig valgt uorganisk eller organisk syre, for å fremstille et annet farmasøytisk akseptabelt syreaddisjonssalt som kjent innen faget.

Tabell 6

Basisstruktur av amlno- og aminoalkylsYkloheksaner

Farmasøytiske preparater

De aktive bestanddeler ifølge oppfinnelsen, sammen med én eller flere konvensjonelle adjuvanser, bærere eller fortynningsmidler, kan formuleres i form av farmasøytiske preparater og enhetsdoser derav, og kan i slik form anvendes som faste materialer, slik som belagte eller ubelagte tabletter eller fylte kapsler, eller som væsker, slik som løsninger, suspensjoner, emulsjoner, eliksirer, eller kapsler fylt med det samme, alle for oral bruk; i form av stikkpiller eller kapsler for rektal administrering eller i form av sterile, in-jiserbare løsninger for parenteral bruk (innbefattende intra-venøs eller subkutan). Slike farmasøytiske preparater og enhetsdoseringsformer derav, kan omfatte konvensjonelle eller nye bestanddeler i konvensjonelle eller spesielle proporsjon-er, med eller uten ytterligere aktive forbindelse eller sub-stanser, og slike enhetsdoseringsformer kan inneholde enhver egnet effektiv mengde av den aktive bestanddel i overensstemmelse med det beregnede daglige doserlngsområde som skal anvendes. Tabletter inneholdende tyve (20) til hundre (100) mg aktiv bestanddel, eller mer bredt fra ti (10) til to hundre og femti (250) mg pr. tablett, er egnede representative enhetsdoseringsformer .

Behandlingsmetoder

Pga. deres høye grad av aktivitet og deres lave toksisitet som sammen tilveiebringer et svært fordelaktig terapeutisk indeks, kan de aktive bestanddeler ifølge oppfinnelsen administreres til en pasient, f.eks. et levende dyr (innbefattende et menneske) med behov derav, for behandling, lindring, forbedring eller eliminering av en indikasjon eller tilstand som er mottakelig derfor, eller som er representativt for en indikasjon eller tilstand som ellers angitt i foreliggende beskrivelse, fortrinnsvis samtidig eller sammen med én eller flere farmasøytisk akseptable eksipienser, bærere eller fortynningsmidler, og fortrinnsvis i form av et farmasøytisk preparat derav ved oral, rektal eller parenteral rute (innbefattende intravenøs og subkutan) eller i enkelte tilfeller også med topisk rute i en effektiv mengde. Egnede doseområder er 1-1 000 mg daglig, fortrinnsvis 10-500 mg daglig og spesielt 50-500 mg daglig, avhengig av den eksakte administreringsmåte, den form som administreres, den indikasjon mot hvilken admini-streringen er rettet, den involverte pasient og kroppsvekten av den involverte pasient, og legens eller veterinærens bedøm-melse og erfaring.

Eksempler på representative, farmasøytiske preparater

Ved hjelp av vanlig anvendte løsningsmidler, hjelpe-stoffer og bærere, kan reaksjonsproduktene bearbeides til tabletter, belagte tabletter, kapsler, dryppeløsninger, stikkpiller, injeksjons- og infusjonspreparater og lignende og kan administreres terapeutisk ved oral, rektal, parenteral og andre ytterligere ruter. Representative, farmasøytiske preparater er angitt i det etterfølgende. (a) Tabletter egnet for oral administrering som inneholder den aktive bestanddel, kan fremstilles ved konvensjonelle tabletteringsteknikker. (b) For stikkpiller kan enhver vanlig stikkpil^ebase anvendes for inkorporering av den aktive bestanddel deri ved vanlig prosedyre, slik som en polyetylenglykol som er fast ved normal romtemperatur, men som smelter ved eller rundt kropps-temperaturen . (c) For parenterale (innbefattende intravenøse og subkutane), sterile løsninger anvendes den aktive bestanddel sammen med konvensjonelle bestanddeler i vanlige mengder, slik som f.eks. natriumklorid og dobbeltdestillert vann, i henhold til konvensjonelle prosedyrer, slik som filtrering, aseptisk fylling i ampuller eller IV-dryppflasker, og autoklavering for å bevirke steril tilstand.

Andre egnede farmasøytiske preparater vil lett fremgå for fagmannen.

De etterfølgende eksempler er angitt av illustrative grunner.

Eksempel 1

Tablettformulering

En egnet formulering for en tablett inneholdende

10 mg aktiv bestanddel, er som følger:

Eksempel 2

Tablettformulering

En annen egnet formulering for en tablett inneholdende 100 mg, er som følger:

Eksempel 3

Kapselformulering

En egnet formulering for en kapsel inneholdende 50 mg aktiv bestanddel, er som følger:

fylt i en gelatinkapsel.

Eksempel 4

Løsning for Injeksjon

En egnet formulering for en injiserbar løsning inneholdende én prosent aktiv bestanddel, er som følger:

Eksempel 5

Væskeformlg, oral formulering

En egnet formulering for 1 1 av en væskeblanding inneholdende 2 mg aktiv bestanddel i én ml av blandingen, er som følger:

Eksempel 6

Væskeformig, oral formulering

En annen egnet formulering for 1 1 av en væskeblanding inneholdende 20 mg aktiv bestanddel i én ml av blandingen, er som følger:

Eksempel 7

Væskeformig, oral formulering

En annen egnet formulering for 1 1 av en væskeblanding inneholdende 2 mg aktiv bestanddel i én ml av blandingen, er som følger:

Eksempel 8

Aerosolformulering

180 g aerosolløsning inneholder:

15 ml av løsningen ble fylt i aluminiuraaerosolbokser, ble korket med en doseringsventil og fylt med 3,0 bar.

Eksempel 9

TDS- formulering *

100 g løsning inneholder:

1,8 ml av løsningen ble anbrakt på bomull dekket med en kleb-ende bakfolie. Systemet ble lukket med en beskyttende foring som fjernes før bruk.

Eksempel 10

Nanopartikkelformulering

10 g polybutylcyanoakrylatnanopartikler inneholder:

Polybutylcyanoakrylatnanopartiklene fremstilles ved emulsjons-polymerisering i en vann/0,1 N HCl/etanolblanding som poly-mer iseringsmedium. Nanopartiklene i suspensjonen lyofiliseres sluttelig under vakuum.

Farmakologi - sammendrag

De aktive bestanddeler ifølge foreliggende oppfinnelse og farmasøytiske preparater derav og metoder for behandling dermed, er karakterisert med unike, fordelaktige og uforutsigbare egenskaper som gjør foreliggende søknads gjenstand ikke-nærliggende. Forbindelsene og de farmasøytiske preparater derav har utvist, i standard aksepterte og pålitelige test-prosedyrer, følgende verdifulle egenskaper og karakteristika: De er systemisk aktive, ukonkurrerende NMDA-reseptorantagonister med hurtig blokkerende/avblokkerende kinetikk og sterk spenningsavhengighet, og er følgelig anvendbare ved behandling, eliminering, forbedring og lindring av behandlings-bare tilstander, ved påføring eller administrering til en levende dyrevert, for behandling av et vidt område av CNS-sykdommer som innbefatter forstyrrelser av glutamaterg transmisjon.

Farmakologi

In vitro

Reseptorbindingsstudier

Sprague-Dawley-hannrotter (200-250 g) ble halshugget og deres hjerner ble hurtig fjernet. Cortex ble dissekert og homogenisert i 20 volumer iskald 0,32 M sukrose under anvendelse av en glass-teflon-homogenisator. Homogenatet ble sentrifugert ved 1 000 x g i 10 min. Pelleten ble kastet og supernatanten ble sentrifugert ved 20 000 x g i 20 min. Den resulterende pellet ble resuspendert i 20 volumer destillert vann og ble sentrifugert i 20 min ved 8 000 x g. Supernatanten og "buffy coat "-en ble sentrifugert 3 ganger (48 000 x g i 20 min) i nærvær av 50 mM Tris-HCl, pH 8,0. Alle sentrifuger-ingstrinn ble utført ved 4 °C. Etter resuspendering i 5 volumer 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, ble membransuspensjonen hurtig fryst ved -80 °C. På prøvedagen ble membranene tint og vasket fire ganger ved resuspendering i 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, og sentri-fugering ved 48 000 x g i 20 min. Den sluttelige pellet ble suspendert i prøvebuffer. Mengden av protein i det sluttelige membranpreparat ble bestemt i henhold til metoden ifølge Lowry med enkelte modifikasjoner. Den sluttelige proteinkonsentra-sjon som ble anvendt ved studiene, var mellom 250-500 ug/ml.

Membranene ble resuspendert og inkubert i 50 mM Tris-HCl, pH 8,0. Inkuberinger ble startet ved tilsetning av [<3>H]-(+)-MK-80l (23,9 Ci/mmol, 5 nM) til ampuller med glysin (10 HM), glutamat (10 uM) og 0,1-0,25 mg protein (totalt volum 0,5 ml) og forskjellige konsentrasjoner av de testede midler (10 konsentrasjoner in duplo). Inkuberingene ble fortsatt ved romtemperatur i 120 min, idet likevekt alltid ble oppnådd under de anvendte betingelser. Ikke-spesifikk binding ble definert ved tilsetning av umerket MK-801 (10 uM). Inkuberingene ble avsluttet under anvendelse av et Millipore filter-system. Prøvene ble skylt tre ganger med 2,5 ml iskald prøve-buffer over glassfiberfiltre erholdt fra Schleicher & Schuell under konstant vakuum. Filtrering ble utført så hurtig som mulig. Etter separering og skylling ble filtrene anbrakt i seintillasjonsvæske (5 ml; Ultima Gold) og den gjenværende radioaktivitet på filtrene ble bestemt med en konvensjonell vsskescintillasjonsteller (Hewlett Packard, Liguid Scintillation Analyser).

" Patch Clamp"

Hippocampi ble erholdt fra rottefostere (E20 til E21) og ble deretter overført til kalsium og magnesiumfri Hank's buffret saltløsning (Gibco) på is. Cellene ble mekanisk disso-siert i 0,05 % DNAase/0,3 % ovomukoid (Sigma), etter en 8 min preinkubering med 0,66 % trypsin/0,1 % DNAase (Sigma). De dis-sosierte celler ble deretter sentrifugert ved 18 x g i 10 min, ble resuspendert i minimalt essensielt medium (Gibco) og ble utstrøket til en densitet på 150 000 celler/cm-<2> på poly-L-lysin(Sigma)-prebelagte plastpetriskåler (Falcon). Cellene ble ernært med NaHC03/HEPES-buffret, minimalt essensielt medium supplert med 5 % kalvefosterserum og 5 % hesteserum (Gibco) g ble inkubert ved 37 °C med 5 % C02 ved 95 % fuktighet. Mediet ble utbyttet fullstendig etter inhibering av ytterligere glialmitose med cytosin-p-D-arabinofuranosid (20 uM Sigma) etter ca. 7 dager in vitro. Mediet ble deretter utbyttet delvis to ganger pr. uke.

"Patch clamp"-registreringer ble foretatt fra disse neuroner med polerte glasselektroder (4-6 mfi) på helcellemåten ved romtemperatur (20-22 °C) ved hjelp av en EPC-7-forsterker (List). Testsubstansene ble tilført ved å skifte kanaler av et hurtig superfusjonssystem laget på bestilling med en felles utstrømning (10-20 ms utbyttingstider). Innholdet av den intracellulære løsning var som følger (mM): CsCl (120), TEACI (20), EGTA (10), MgCl2 (1), CaCl2- (0,2), glukose (10), ATP (2), cAMP (0,25); pH ble justert til 7,3 med CsOH eller HC1. De ekstracellulære løsninger hadde følgende basissammensetning (mM): NaCl (140), KC1 (3), CaCl2 (0,2), glukose (10), HEPES (10), sukrose (4,5), tetrodotoksin (TTX 3 x 10"<*>). Glysin (1 uM) var til stede i alle løsninger: en konsentrasjon til-strekkelig til å forårsake rundt 80-85 % aktivering av glyslnB-reseptorer. Bare resultater fra stabile celler ble akseptert for innbefattelsen i den sluttelige analyse, dvs. etter gjen-vinning av responser på NMDA med minst 75 % av deres nedsett-else av de testede antagonister.

Eksitotoksisitet

Kortikale neuroner ble erholdt fra cerebral korteks av 17/18 dagers gamle rottefostere (Wistar) ved generelt å følge dissosiasjonsprosedyren beskrevet av [23]. Etter kort trypsinering og forsiktig triturering med flammebehandlede Pasteur-pipetter, ble cellesuspensjonen vasket ved sentrifuge-ring. Cellene ble suspendert i serumfritt neurobasalmedium med B27-supplement (GIBCO) før utstrykning på poly-L-lysin (Sigma; 0,2 mg/ml, 20 t, 4 °C) og laminxn(Sigma; 2 Jig/ml, 1 t, 37 °C)-belagte 96-brønns plater (Falcon, Prlmaria) til en densitet på 5 x IO<4> celler/brønn. Kortikale neuroner ble opprettholdt ved 37 °C i fuktet 10 % C02/90 % luft. Én dag etter utstrykning ble 5 \ M cytosin-P-D-arabinofuranosid (Sigma) tilsatt til hver brønn for inhibering av glial celleproliferering. Mediet ble forandret først etter 4 dager in vitro og deretter hver 4. dag ved erstatning av 2/3 av mediet med astrocytt-kondisjonert medium. Kortikale neuroner mellom dag 12 og 14 i kultur ble anvendt for forsøkene.

Nyfødte rotteastrocytter ble isolert ikke-enzymatisk i henhold til metoden ifølge [24]. Kort angitt ble begge hem-isfærer dissekert fra 2-dagers gamle rotter, ført gjennom en 80 (im sikt og ble triturert med Pasteur-pipetter. Cellesuspensjonen ble fremstilt i Dulbeccos modifiserte essensielle medium (DMEM, Gibco) supplert med 10 % kalvefosterserum (FCS, Hyc-lone), 2 mM glutamin (Gibco) og 50 |xg/ml gentamycin, og ble overført i ubehandlede plastdyrkningskolber (Corning; 75 cm<3>). To dager etter utstrykning ble kolbene ristet i 10 min på, en roterende plattform (150 U/min) for å fjerne mikrogliale celler. Kulturene ble dyrket til sammenflyt innen 14 dager, og kulturmediet ble forandret to ganger pr. uke. De gliale mono-lag ble deretter grundig vasket med serumfritt neurobasal medium (Gibco) for å fjerne serumet. Kolbene ble deretter ristet flere ganger for å fjerne oligodendrocytter og neuroner. For å oppnå kondisjonert medium fra primære astrocytter, ble kulturene inkubert med friskt neurobasalt medium supplert med B27 og glutamin. Hver 2. til 3. dag ble kondisjonert medium oppsamlet og erstattet med friskt medium opp til 4 ganger.

Eksponering overfor EAA ble utført i serumfritt neurobasalmedium inneholdende 100 uM glutamat og det legemiddel som skulle testes. Etter 20 timers inkubering ble den cytotok-siske effekt undersøkt morfologisk under et fasekontrastmikro-skop, og ble biokjemisk kvantifisert ved måling av celleleve-dyktighet med.MTT-testen (Promega). Denne koiorimetriske be-stemmelse måler reduksjonen av en tetrazoliumkomponent (MTT) over i et løselig formazanprodukt av mitokondriene av levende celler. Etter inkubering av de kortikale neuroner med farge-løsning i ca. 1-4 timer ble en oppløselig hjørneløsning tilsatt for å lysere cellene og oppløseliggjøre det fargede produkt (inkubering over natten ved 37 °C, 10 % C02 , 90 % relativ fuktighet). Disse prøver ble deretter avlest under anvendelse av en Elisa-plateleser (Thermomax, MWG Biotech) ved en bølge-lengde på 570 nm. Mengden av fremkalt farge var direkte pro-porsjonal med antallet av levedyktige celler.

In vivo

Antikonvulsiv aktivitet

NMR-hunnraus (18-28 g) anbrakt 5 pr. bur, ble anvendt for maksimal elektrosjokk (MES) og motorisk svekkelsestest. Alle dyr ble holdt med vann og for ad libitum under en 12 timers lys-mørke-syklus (lys på kl. 6 om morgenen) og ved en kontrollert temperatur (20 ± 0,5 °C). Alle forsøk ble utført mellom kl. 10 om morgenen og 5 på ettermiddagen. Testmidlene ble injisert 30 min i.p. før fremkallelse av konvulsjoner om ikke annet er angitt (se nedenfor). Alle forbindelser ble opp-løst i 0,9 % saltvann.

MES-testen ble utført sammen med tester for myorelak-serende virkning (strekkrefleks) og motorisk koordinasjon (roterende stav). For strekkreflekstesten ble mus anbrakt med deres forpoter på en horisontal stav og ble forlangt å plas-sere alle 4 poter på vaieren innen 10 sek. For å teste ataksi (motorisk koordinering) ble musen plassert på en roterende stav (5 opm) og ble forlangt å forbli på staven i 1 min. Bare mus som ikke oppfylte kriteriene i alle tre repetisjoner av hver test, ble betraktet å utvise myorelaksasjon eller ataksi. Disse tester ble etterfulgt av MES (100 Hz, 0,5 sekunders sjokkvarighet, 50 mA sjokkintensitet, 0,9 ms impulsvarighet, Ugo Basile) påført via korneale elektroder. Nærvær av toniske konvulsjoner ble bedømt (tonisk utstrekkelse av bakpoter med minimal vinkel til kroppen på 90 °). Målet var å oppnå EDS0-verdier for alle bedømte parametere (antikonvulsiv aktivitet og motorisk bieffekt) ved anvendelse av Litchfield Wilcoxon-test for kvantale doseresponser. Dividering av ED50-verdien for bieffekter (ataksi eller myorelaksasjon) med ED50-verdien for antagonisme av elektrosjokkonvulsjoner, ble anvendt som et terapeutisk indeks (TI).

Statistisk analyse

IC50-verdier i "patch clamp", eksitotoksisitet og bindingsstudier, ble beregnet i henhold til den fire paramet-ers logistiske ligning under anvendelse av Grafit dataprogram (Erith-acus Software, England). Ki-verdien for bindingsstudier ble deretter bestemt i henhold til Cheng og Prusoff. Bindings-verdier som er angitt, er middelverdier ± SEM for 3-5 bestemmelser (hver utført in duplo).

4-7 doser av antagonister ble testet i hver av in vivo-testene (5-8 dyr pr. dose) for å muliggjøre beregning av graverte ED50-verdier i henhold til probit-analyse (Litchfield and Wilcoxon) med korreksjon for 0 % til 100 % effekt. ED50-verdler er angitt med 95 % sikkerhetsgrenser (Cl). Pearson-produkt-momentkorrelasjonsanalyse (Sigma Stat, Jandel Scienti-fic) ble anvendt for å sammenligne in vitro-styrker og in vivo-antikonvulsiv aktivitet.

RESULTATER

Binding

Alle sykloheksaner utviste [<3>H]-(+)-MK-801-binding til rottekortikale membraner med IC50-verdier på mellom 4 og 150 uM, mens Ki-verdier som bestemt med Cheng-Prussoff-ligning-en var 2 ganger lavere (se tabell 7).

" Patch Clamp"

Stabile, innoverrettede strømresponser av dyrkede hippocampale neuroner til NMDA (200 uM med 1 uM glysin til -70 mV) ble antagonisert av de testede sykloheksaner med IC50-verdier på 1,3-99 uM (tabell 7). Topp og stabile strømmer ble påvirket i en lignende grad, hvilket gjør det usannsynlig at deres effekt ble formidlet ved glysinB-setet. Sterk støtte for den ukonkurrerende art av denne antagonisme, ble tilveiebrakt av den klare bruks- og spenningsavhengighet av deres blokade. De svakere antagonister utviste hurtigere kinetikk og sterkere spenningsavhengighet.

Eksltotoksisitet

Lave uM-konsentrasjoner av de fleste sykloheksaner var effektive, neurobeskyttende midler in vitro, med Mrz 2/579 som den mest kraftige i dette henseende (se tabell 7). Med de fleste forbindelser ble full beskyttelse erholdt med 20 MM.

In vivo

Antikonvulsiv aktivitet

Alle sykloheksanderivater inhiberte MES-fremkalte konvulsjoner i mus med ED50-verdier varierende fra 3,6 til 50 mg/kg i.p. (tabell 7). Utvalgte forbindelser ble også testet mot PTZ- og NMDA-fremkalte konvulsjoner (se [20, 21] for metoder) og utviste sammenlignbar styrke ved MES-testen (eks-empelvis hadde Mrz 2/579 ED50-verdier i PTZ- og NMDA-testene på 5,5 og 3,7 mg/kg). Deres antikonvulsive styrke ble økt etter i.v.-administrering (f.eks. Mrz 2/579 ED50 = 2,5 mg/kg).

Mrz 2/579 var også aktiv etter s.c. og noe mindre kraftig etter p.o.-administrering (ED50-verdier på 4,6 og 13,7 mg/kg). Ved doser innen det antikonvulsive området, ble myorelaksasjon (strekktest) og ataksi (roterende stavtest) observert med enkelte sykloheksaner. For størstedelen av disse ble ingen akutt letalitet sett opp til 50 mg/kg.

Korrelasj onsanalyse

Det var en meget god krysskorrelasjon mellom alle tre in vitro-bestemmelser (alle korrelasjonskoeffisienter > 0,70, p < 0,001). Det var også en god korrelasjon mellom styrker i antagoniserende, NMDA-fremkalte, innoverrettede strømmer og beskyttelse mot NMDA-fremkalt toksisitet in vitro med antikonvulsiv aktivitet in vivo (korrelasjonskoeffisienter > 0,56, p < 0,01).

Effekter av sykloheksanderivater og standard ukonkurrerende NMDA-reseptorantagonister på [<3>H]-(+)-MK-801-binding, NMDA-fremkalte strømmer i "patch clamp"-forsøk, glutamattoksi-sitet i dyrkede, kortikale neuroner og MES-konvulsjoner in vivo, er angitt ovenfor. Bindende Ki-verdier er middelverdier ± SEM av 3-5 forsøk. ICS0-verdier (±SEM) i "patch damp" og glutamattoksisitetsforsøk ble bestemt fra dataene fra minst 3 konsentrasjoner som gir mellom 15 og 85 % inhibering og minst 5 celler pr. konsentrasjon. For MES-fremkalte konvulsjoner er verdiene ED50-verdier i mg/kg (95 % sikkerhetsgrenser er vist i parentes).

På grunn, i det minste delvis, av deres aminsubstituent, er i tillegg forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse også effektive i ikke-NMDA-indikasjoner, idet de utviser immunomodulerende aktivitet, antimalariastyrke, anti-Borna-virusaktivitet og anti-hepatitt-C-aktivitet.

Fra det foregående er det sammenfatningsvis tydelig at foreliggende oppfinnelse tilveiebringer nye, verdifulle og uforutsigbare anvendelsesområder for forbindelsene ifølge oppfinnelsen, hvilke forbindelser omfatter den aktive bestanddel ifølge foreliggende oppfinnelse, så vel som nye farmasøytiske preparater derav, og metoder for fremstilling derav og behandling dermed, som alle er utstyrt med de tidligere spesifikke, angitte karakteristika og fordeler.

Den høyere grad av aktivitet av det aktive middel ifølge oppfinnelsen og preparater derav, som vist ved de beskrevne tester, er indikativ for anvendelse basert på dets verdifulle aktivitet i mennesker så vel som i lavere dyr. Klinisk evaluering i mennesker er imidlertid ennå ikke full-ført. Det vil klart forstås at distribusjonen og markedsføring av enhver forbindelse eller preparat som faller innen rammen for foreliggende oppfinnelse for anvendelse i mennesker, selv-sagt må være avhengig av foregående godkjennelse av myndighet-ene, slik som U.S. Federal Food and Drug administration, som er ansvarlig for og autorisert til bedømmelse av slike spørs-mål.

Konklusjoner

Foreliggende 1-amino-alkylsykloheksaner representerer en ny klasse av systemisk aktive, ukonkurrerende NMDA-reseptorantagonister med hurtig blokkerende/avblokkerende kinetikk og sterk spenningsavhengighet. I lys av deres relativt lave styrke og assosierte, hurtige kinetikk vil de være anvendbare, terapeutiske midler i et bredt område av CNS-sykdommer som innbefatter forstyrrelser av glutamatergisk transmisjon.

Disse forbindelser finner følgelig anvendelse ved behandling av følgende sykdommer i en levende dyrekropp, spesielt et menneske. 1. Akutt eksitotoksisitet, slik som ischemi under slag, traume, hypoksi, hypoglyseml og hepatisk encefalo-ipati. 2. Kroniske, neurodegenerative sykdommer, slik som Alzheimers sykdom, vaskulær demens, Parkinsons sykdom, Huntingtons sykdom, multippel sklerose, amyotropisk lateral sklerose, AIDS-neurodegenerering, olivopontocerebellar atrofi, Tourettes syndrom, motorisk neuronsykdom, mitokondrial dys-funksjon, Korsakoff syndrom, Creutzfeldt-Jakob sykdom. 3.' Andre sykdommer relatert til langtidsplastiske forandringer i sentralnervesystemet, slik som kronisk smerte, legemiddeltole-ranse, avhengighet og misbruk (f.eks. opioider, kokain, benzo-diazepiner og alkohol). 4. Epilepsi, tardiv dyskinesi, schizo-freni, angst, depresjon, akutt smerte, spastisitet og tinni-tus. 5. Som allerede angitt, på grunn, i det minste delvis, av deres aminsubstituent, er i tillegg forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse effektive i ikke-NMDA-indikasjoner, utviser immunomodulerende aktivitet, antimalariastyrke, anti-iBorna-virusaktivitet og antihepatitt C-aktivitet.

Referanser

1. R.L. Frank, H.K. Hall (1950) J. Am. Chem. Soc. 72:1645-1648. 2. 6.A. Kiegel, P. Burk. (1973) J. Org. Chem. 38:3637-3639. 3. N.F. Firrell, <p>.w. Hickraotrt. (1970) J. Chem. Soc. £: 716-719. 4. G.H. Posner, L.L. Frye. (1984) Isr. J. Chem. 24:88-92. 5. G.L. Lemiere, T.A. van Osselaer, F.C. Anderweireldt.

(1978) Bull.. Soc. Chim. Belg. 87:771-782. 6. H.O. House, J.M. Wilkins. (1976) J. Org. Chem. 41:(25) 4031-4033. 7. A.R. Greenaway, W.B. Whalley. (1976) J. Chem. Soe. P.T. 1. :1385-1389. 8. S. Matsuzawa, Y. Horiguchi, E. Nakaraura, I. Kuwajiraa.

(1989) Tetrahedron 45_:(2) 349-362. 9. H.O. House, W.F. Fischer. (1968) J. Org. Chem. 33:(3) 949-956. 10. Chiurdoglu, G., Maguestiau, A. (1954) Bull. Soc. Chim.

Belg. 63i 357-378. 11. Zaidlewicz, M., Uzarewicz A., Zacharewicz, W. (1964) Roczniki Chem. 38: 591-597. 12. Crossley, A.W., Gilling, C. (1910) J. Chem. Soc. 2218. 13. Zaidlewicz, M-, Uzarewicz, A. (1971) Roczniki Chem. 45: 1187-1194. 14. Lutz, E.T., van der Maas, J.H. (1982) Spectrochim.

Acta, A. 38A: 283.

15. Lutz, E.T., van der Maas, J.H. (1981) Spectrochira.

Acta, A. 37A: 129-134. 16. Ramalingam K., Balasubramanian, M., Baliah, V. (1972) Indian J. Chem. 10: 366-369. - 17. Hamlin, K.E., Freifelder, M. (1953) J. Am. Chem. Soc.

J5z 369-373. 18. Hassner, A., Fibinger, R., Andislk, o. (1984) J. Org. Chem. 49: 4237-4244. 19. W. Danysz, C.G. Parsons, I. Bresink, G. Quack (1995) Drug News Perspect. 8_: 261-277.

I 20. J.D. Leander, R.R. Lawson, P.L., Ornstein, D.M.-I Zimmerman (1988) Brain Res. 448:115-120. 21. C.G. Parsons, G. Quack, I. Bresink, L. Baran, E. Przegalinski, W. Kostowski, P. Krzascik, S. Hartmann, W. Danysz (1995). Neuro<p>harmacoloov 34:1239-1258. 22. M.A. Rogawski (1993) Trends Pharmacol. Sei. 14:2T25-331. 23. Booher J. and Sensenbrenner M. (1972). Neurobiology 2:97-105. 24. Dichter, M. (1987) Brain Research 149:279. <!>

Claims

1. l-aminoalkylsykloheksanforbindelse, karakterisert ved at den er valgt fra de av formelen: hvori R<*> er - (CH2) „- (CR6R7) m-NR8R9, hvori n + m = 0, 1 eller 2, hvori R<1->R<9> uavhengig er valgt fra hydrogen og C^-alkyl, hvor minst R<1>, R<4> og R<5> er Cj.g-alkyl, og farmasøytisk akseptable salter derav, forutsatt at angitte 1-aminoalkylsykloheksanforbindelse ikke er 1-metylamino-l,3,3,5-tetrametylsykloheksan.

2. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at R1-R5 er metyl.

3. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at R1 er etyl.

4. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at R2 er etyl.

5. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at R<3>er etyl.

6. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at R* er etyl.

7. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at R5 er etyl.

8. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at R<5>er propyl.

9. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at Rs eller R7 er metyl.

10. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved atRs eller R7 er etyl.

11. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at forbindelsen er valgt fra gruppen bestående av 1-amino-l,3,3,5,5-pentametylsykloheksan, 1-amino-l,3,5,5-tetrametyl-3-etylsykloheksan, 1-amino-l,5,5-trimetyl-3,3-dietylsykloheksan, t 1-amino-l,5,5-trimetyl-cis-3-etylsykloheksan( 1-amino-l,5,5-trimetyl-trans-3-etylsykloheksan, l-amino-l-etyl-3,3,5,5-tetrametylsykloheksan, 1-amino-l-propyl-3,3,5,5-tetrametylsykloheksan, N-metyl-1-amino-l,3,3,5,5-pentametylsykloheksan og N-etyl-1-amino-l,3,3,5,5-pentametylsykloheksan og farmasøytisk akseptable salter av enhver av de foregående.

12. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det omfatter en effektiv NMDA-reseptorantagonistisk mengde, eller en effektiv immunomodulerende, antimalaria, anti-Borna-virus eller antihepatitt C-mengde av en 1-aminoalkylsykloheksanforbindelse valgt fra de av formlen I hvori R<*> er - (CHS) a- (CR6R7)m-NRsR9, hvori n + m = 0, 1 eller 2, hvori R<1->R<9> uavhengig er valgt fra hydrogen og C^-alkyl, hvor minst R<1>, R<*> og R<5> er C^-alkyl, og farmasøytisk akseptable salter derav, i kombinasjon med én eller flere farmasøytisk akseptable fortynningsmidler, eksipienser eller bærere.

13. Farmasøytisk preparat ifølge krav 12, karakterisert ved at forbindelsen er valgt fra gruppen bestående av 1-amino-l,3,3,5,5-pentametylsykloheksan, 1-amino-1,3,5,5-tetrametyl-3 -etylsykloheksan, 1-amino-l,5,5-trimetyl-3,3-dietylsykloheksan, 1-amino-l,5,5-trimetyl-cis-3-etylsykloheksan, 1-amino-l,5,5-trimetyl-trans-3-etylsykloheksan, 1-amino-l-etyl-3,3,5,5-tetrametylsykloheksan, 1-amino-l-propyl-3,3,5,5-tetrametylsykloheksan,( N-metyl-1-amino-l,3,3,5,5-pentametylsykloheksan og N-etyl-l-amino-1,3,3,5,5-pentametylsykloheksan og farmasøytisk akseptable salter av enhver av de foregående.

14. Anvendelse av en forbindelse ifølge krav 1 for fremstilling av et medikament for behandling av et levende dyr for lindring av en tilstand som lindres av en NMDA-reseptorantagonist, eller for dens immunomodulerende, antimalaria, anti-Borna-virus eller antihepatitt C-effekt.