PT2251015E - Nucleosídeos modificados para o tratamento de infeções virais e de proliferação celular anormal - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "NUCLEOSÍDEOS MODIFICADOS PARA O TRATAMENTO DE INFEÇÕES VIRAIS E DE PROLIFERAÇÃO CELULAR ANORMAL"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção inclui compostos para utilização no tratamento da infeção por Flaviviridae. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Flaviviridae 0 Flaviviridae é um grupo de virus de ARN de cadeia simples positiva, com um tamanho de genoma de 9-15 kb. São virus com envelope de aproximadamente 40-50 nm. Uma visão geral da taxonomia de Flaviviridae está disponível no Comité Internacional de Taxonomia de Vírus. O Flaviviridae consiste em três géneros. 1. Flavivírus. Este género inclui o grupo de vírus do dengue (vírus do dengue, vírus do dengue tipo 1, vírus do dengue tipo 2, vírus do dengue tipo 3, vírus do dengue tipo 4), o grupo de vírus da encefalite japonesa (vírus de Alfuy, vírus da encefalite japonesa, vírus de Kookaburra, vírus de Koutango, vírus de Kunjin, vírus da encefalite de Murray Valley, vírus da encefalite de St. Louis, vírus de Stratford, vírus de Usutu, vírus do Nilo Ocidental), o grupo de vírus de Modoc, o grupo de vírus de Rio Bravo (vírus de Apoi, vírus de Rio Bravo, vírus de Saboya), o grupo de vírus de Ntaya, o grupo da encefalite transmitida por carraça (vírus da encefalite transmitida por carraça), o grupo de vírus de Tyuleniy, o grupo de vírus de Uganda S e o grupo de vírus da febre amarela. Para além destes grupos principais, existem alguns flavivírus adicionais que 2 não estão classificados. 2. Hepacivirus. Este género contém apenas uma espécie, o virus da hepatite C (VHC), que é composto por várias classes, tipos e subtipos. 3. Pestivirus. Este género inclui o virus da diarreia virai bovina-2 (VDVB-2), o pestivirus tipo 1 (incluindo o VDVB), o pestivirus tipo 2 (incluindo o virus da cólera de Hog) e o pestivirus tipo 3 (incluindo o virus da doença da fronteira).

Uma das infeções mais importante por Flaviviridae em humanos é causada pelo vírus da hepatite C (VHC). Esta é a segunda maior causa de hepatite virai, com uma estimativa de 170 milhões de portadores em todo o mundo (Organização Mundial de Saúde; Hepatitis C: global prevalence, Weekly Epidemiological Record, 1997, 72, 341), 3,9 milhões dos quais residem nos Estados Unidos (Centros de Controlo de Doenças, dados não publicados, http://www.cdc.gov/ncidod/diseases/hepatitis/heptab3.htm). A organização genómica do Flaviviridae partilha muitas características comuns. O genoma do vírus da hepatite C (VHC) é frequentemente usado como um modelo. 0 VHC é um vírus pequeno, com envelope, com um genoma de ARN de cadeia simples positiva de ~ 9,6 kb no interior da nucleocápside. O genoma contém uma única grelha de leitura aberta (ORF) que codifica uma poliproteína de pouco mais de 3000 aminoácidos, a qual é clivada para gerar as proteínas virais maturas estruturais e não estruturais. O ORF é flanqueado por regiões 5' e 3' não traduzidas (NTRs) de algumas centenas de nucleotídeos de comprimento, que são importantes para a tradução e replicação do ARN. A poliproteína traduzida contém as proteínas estruturais do 3 núcleo (C) e as do envelope (El, E2, p7) , no terminal N, seguidas pelas proteínas não estruturais (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B). As proteínas estruturais maturas são geradas através de clivagem pela peptidase de sinal do hospedeiro (veja-se: Hijikata, M. et al., Proc. Nat. Acad. Sei., USA, 1991, 88, 5547; Hussy, P. et al., Virology, 1996, 224, 93; Lin, C. et al., J. Virol., 1994, 68, 5063;

Mizushima, H. et al., J. Virol., 1994, 68, 2731; Mizushima, H. et al., J. Virol., 1994, 68, 6215; Santolini, E . et al., J. Virol., 1994, 68, 3631; Selby, M. J. et al • r Virolog, 1994, 204, 114; e Grakoui, A. et al., Proc. Nat. Acad. Sei., USA, 1993, 90, 10538) . A junção entre NS2 e NS3 é autocataliticamente clivada pela protease NS2/NS3 (veja-se: Hijikata, M. et al., J. Virol., 1993, 67, 4665 e Bartenschlager, R. et al., J. Virol., 1994, 68, 5045), enquanto que as quatro junções restantes são clivadas pelo terminal N do domínio protease serina da NS3 complexada com a NS4A. (veja-se: Failla, C. et al., J. Virol., 1994, 68, 3753; Lin, C. et al., J. Virol., 1994, 68, 8147; Tanji, Y. et al., J. Virol., 1995, 69, 1575 e Tai, C. L. et al., J. Virol., 1996, 70, 8477). A proteína NS3 também contém a atividade de helicase dependente de NTP, que desenrola a hélice de ARN durante a replicação. A proteína NS5B possui atividade de polimerase de ARN dependente de ARN (RDRP) (veja-se: Behrens , s. . E. et al . , EMBO J., 1996, 15, 12; Lohmann, V. et al., J. Virol ., 1997, 71, 8416-8428 e Lohmann, V. et al., Virology, 1998, 249, 108), que é essencial para a replicação virai (Ferrari, E. et al., J. Virol., 1999, 73, 1649) . É aqui enfatizado que, ao contrário do VHB ou do VIH, o ADN não está envolvido na replicação do VHC. Recentemente, em experiências in vitro 4 utilizando NS5B, foi estudada a especificidade de substrato para o VHC-RDRP utilizando guanosina 5'-monofosfato (GMP) , 5'-difosfato (GDP), 5'-trifosfato (GTP) e o 5 '-trifosfato de 2'-desoxi e de 2',3'-didesoxi guanosina (dGTP e ddGTP, respetivamente). Os autores afirmaram que o VHC-RDRP tem uma especificidade estrita para os ribonucleosideos 5'-trifosfatos, e requer os grupos 2'- e 3'-OH (Lohmann, Virology, 108). As suas experiências sugerem que a presença de 2'- e 3'-substituintes seria o pré-requisito para os nucleosideos 5'-trifosfatos interagirem com o VHC-RDRP, e para atuarem como substratos ou como inibidores. A WO 99/43691 divulga 2'-fluoronucleosideos para o tratamento de infeções de hepatite B. A WO 98/18324 divulga a identificação e utilização de análogos de ribonucleosideo de ocorrência natural em bibliotecas genéricas, para induzir uma mutação num virus de ARN, a fim de inibir a replicação virai.

Smee et al., (Antiviral Research, vol. 18, 1 de janeiro de 1992, páginas 151-162) divulga a 3'-fluoro-3'-desoxiadenosina, e a sua atividade antiviral in vitro contra vários virus de artrópodes e arenavirus. A WO 02/18404 foi publicada após este pedido ter sido apresentado, e reivindica o beneficio de uma data anterior eficaz. A WO 02/18404 divulga vários derivados de nucleosideos, incluindo a 3'-desoxiadenosina, para o tratamento de doenças mediadas pelo virus da hepatite C. A WO 01/60315 foi publicada após os documentos prioritários deste pedido, mas reivindica o beneficio de uma data anterior eficaz. A WO 01/60315 divulga a 6-cloro-3'-desoxiguanosina para o tratamento ou prevenção de infeções por flavivirus num hospedeiro, compreendendo a 5 administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de 6-cloro-3'-desoxiguanosina. É um objeto da presente invenção proporcionar um composto e uma composição para utilização no tratamento de um hospedeiro, incluindo animais e especialmente seres humanos, infetado com Flaviviridae. É ainda um outro objeto proporcionar uma composição para utilização no tratamento de um hospedeiro, incluindo animais e especialmente seres humanos, infetado com hepatite C ou VDVB. É também descrito um processo mais eficaz para quantificar a carga virai, e em particular a carga de VDVB ou de VHC, num hospedeiro, incluindo animais, especialmente seres humanos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona compostos tal como definidos nas reivindicações, para o uso no tratamento de um hospedeiro infetado com um vírus pertencente à família Flaviviridae.

Especificamente, a invenção também inclui compostos para o uso no tratamento ou prevenção de uma infeção por Flaviviridae, incluindo todos os membros do género hepacivírus (VHC), do género pestivírus (VDVB, VFSC, VDB) , ou do género flavivírus (vírus do dengue, grupo do vírus da encefalite japonesa (incluindo o vírus do Nilo Ocidental), e vírus da febre amarela).

Numa realização, o nucleosídeo da presente invenção tem uma EC5o (concentração eficaz para alcançar 50% de inibição virai), quando testado num ensaio baseado em células adequado, de menos de 15 micromolar, e mais particularmente, de menos de 10 ou 5 micromolar. Numa 6 realização preferida, o nucleosídeo é enantiomericamente enriquecido. A atividade e a toxicidade dos compostos aqui descritos podem ser avaliadas de acordo com qualquer procedimento conhecido. É proporcionado em seguida um processo eficiente para quantificar a carga virai num hospedeiro, utilizando uma reação de polimerização em cadeia em tempo real ("RT-PCR"). 0 processo envolve a utilização de uma molécula de sonda fluorescente extinta, que pode ser hibridada com o ADN ou ARN virai alvo. Após a degradação exonucleolitica, pode ser monitorizado um sinal detetável de fluorescência. Utilizando esta tecnologia, o ADN ou ARN amplificado por RT-PCR pode ser detetado em tempo real, por monitorização da presença de sinais de fluorescência.

Esta especificação demonstra: (a) um processo para quantificar a carga virai em tempo real utilizando a RT-PCR, tal como aqui descrito, (b) um processo para quantificar a carga virai de um Flaviviridae num hospedeiro, incluindo o VDVB e o VHC num hospedeiro, em tempo real utilizando a RT-PCR, tal como aqui descrito, (c) um processo para quantificar a carga virai de VDVB numa linha celular MDBK, ou uma amostra de hospedeiro, em tempo real utilizando a RT-PCR, tal como aqui descrito, (d) uma molécula de sonda concebida para apresentar fluorescência mediante a degradação exonucleolitica, e para ser complementar à região NS5B VDVB NADL, tal como aqui descrita, e (e) uma molécula de sonda com uma sequência de 5'-6-fam-AAATCCTCCTAACAAGCGGGTTCCAGG-tamara-3'(sequência ID n° 1), e 7 oligonucleotídeos iniciadores com uma sequência de sentido: 5'-AGCCTTCAGTTTCTTGCTGATGT-3' (sequência ID n° 2) e de anti-sentido: 5'-TGTTGCGAAAGCACCAACAG-3'(sequência ID n° 3) , (f) um processo para quantificar a carga virai de VHC numa amostra derivada de hospedeiro, ou uma linha celular, em tempo real utilizando a RT-PCR, tal como aqui descrito, (g) uma molécula de sonda concebida para apresentar fluorescência mediante a degradação exonucleolitica, e para ser complementar com a região 5' não codificada do VHC, tal como aqui descrita, e (h) uma molécula de sonda concebida para apresentar fluorescência mediante a degradação exonucleolitica, e para ser complementar com a região codificante do VHC, tal como aqui descrita, e (i) uma molécula de sonda concebida para apresentar fluorescência mediante a degradação exonucleolitica, e para ser complementar com a região 3' não codificante do VHC, tal como aqui descrita, e

(j) uma molécula de sonda com uma sequência de 5'-6-fam-CCTCCAGGACCCCCCCTCCC-tamara-3' (sequência ID n° 4), e oligonucleotídeos iniciadores com uma sequência de sentido: 5'-AGCCATGGCGTTAGTA(T/C)GAGTGT-3' (sequência ID n° 5) e de anti-sentido: 5'-TTCCGCAGACCACTATGG-3' (sequência ID n° 6). DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona um nucleosideo com a fórmula geral I-b, ou o seu enantiómero β-L, tal como definido nas reivindicações, ou sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo, para utilização no tratamento de um hospedeiro infetado com um virus pertencente à familia Flaviviridae.

Também é divulgado o uso de um dos compostos descritos nas reivindicações, no fabrico de um medicamento para o tratamento de uma infeção virai, tal como aqui proporcionado.

Também é divulgada uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade antiviral eficaz de um nucleosideo da presente invenção, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, juntamente com um veiculo ou diluente farmaceuticamente aceitável, de acordo com a presente invenção.

Também é divulgada uma composição farmacêutica com um nucleosideo da presente invenção, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em combinação com um ou mais outros agentes antivirais ou antiproliferativos eficazes.

Numa outra divulgação é fornecido um processo para a preparação dos nucleosideos da presente invenção, e do sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

Em particular, a invenção inclui os compostos reivindicados para a utilização em métodos para tratar ou prevenir, ou usos para o fabrico de um medicamento para, uma infeção por Flaviviridae, incluindo todos os membros do género hepacivirus (VHC), do género pestivírus (VDVB, VFSC, VDB), ou do género flavivirus (virus do dengue, grupo do virus da encefalite japonesa (incluindo o virus do Nilo Ocidental), e virus da febre amarela). 1. Compostos da divulgação

Numa realização, o nucleosideo antiviral ou antiproliferativo eficaz é um nucleosideo β-D com a fórmula geral [I-b], tal como definido nas reivindicações, ou o seu enantiómero β-L: 9 X1

[I-b]

Numa realização preferida da invenção, os nucleosídeos β-D com a fórmula geral (I-b) e (ΙΙΙ-b), são representados pelos exemplos fornecidos no Quadro 2.

Quadro 2

X*' 'N ID X1 X2 w1 RJ RJ *DA OH nh2 N H OH H OH DB OH nh2 CH F H H OH DC NH- H CH H H H H ciclohexilo *DD nh2 H CH H OH H F DE nh2 H CH H H H H *DF nh2 nh2 N H OH H OH *DG nh2 nh2 CH H OH H OH DH Cl H CH F H H H *DI Cl I CH H O-Ac H O-Ac 10 ID X1 —X2 w1 R* RJ RJ *DJ Cl H CH H OH H OH DK nh2 H CH H OH H H Dl Cl H CH H OH H H * não reivindicado

Numa realização, o nucleosídeo tem uma EC5o (concentração eficaz para alcançar 50% de inibição virai), quando testado num ensaio baseado em células adequado, de menos de 15 micromolar, e mais particularmente, de menos de 10 ou 5 micromolar. Numa realização preferida, o nucleosídeo é enantiomericamente enriquecido. II. Estereoisomerismo e polimorfismo

Os compostos da presente invenção possuindo um centro quiral podem existir e ser isolados em formas opticamente ativas e racémicas. Alguns compostos podem exibir polimorfismo. A presente invenção engloba a forma racémica, a opticamente ativa, a polimórfica ou a estereoisomérica, ou misturas das mesmas, de um composto da invenção, que possui as propriedades úteis aqui descritas. As formas opticamente ativas podem ser preparadas por exemplo, através de resolução da forma racémica por técnicas de recristalização, através de síntese a partir de materiais de partida opticamente ativos, através de síntese quiral, ou através de separação cromatográfica usando uma fase estacionária quiral, ou através de resolução enzimática.

Como mostrado em seguida, um nucleosídeo contém pelo menos dois átomos de carbono quirais críticos (*). Em geral, os substituintes nos carbonos quirais [a base purina ou pirimidina especificada (referida como o substituinte Cl ao utilizar a numeração do intermediário do anel de açúcar) 11 e CH2OH (referido como o substituinte C4)] do nucleosídeo, podem ser tanto cis (do mesmo lado) ou trans (em lados opostos), em relação ao sistema do anel de açúcar. Tanto os racematos cis como trans consistem num par de isómeros óticos. Portanto, cada composto tem quatro estereoisómeros individuais. Os quatro estereoisómeros são representados pelas seguintes configurações (quando se orienta a porção de açúcar num plano horizontal, de forma que a porção -0-está atrás) : (1) cis, com ambos os grupos "para cima", que é referido como β-D, (2) a imagem no espelho, ou seja, cis, com ambos os grupos "para baixo", que é a imagem no espelho e é referido como β-L, (3) trans, com o substituinte C4 "para cima" e o substituinte Cl "para baixo" (referido como oí-D) , e (4) trans, com o substituinte C4 "para baixo" e o substituinte Cl "para cima" (referido como α-L). Os dois enantiómeros cis em conjunto são referidos como uma mistura racémica de enantiómeros-β, e os dois enantiómeros trans são referidos como uma mistura racémica de enantiómeros-a.

Os quatro estereoisómeros possíveis dos nucleosideos são ilustrados em seguida. 12

trans (α) A presente invenção engloba os compostos com a fórmula I-b e os seus enantiómeros β-L, tal como definido nas reivindicações. III. Definições 0 termo "alquilo" tal como aqui utilizado, a menos que especificado de outra forma, refere-se a um hidrocarboneto saturado, linear, ramificado, ou ciclico, primário, secundário, ou terciário, incluindo aqueles de Ci a Ci6, e inclui especificamente o metilo, o etilo, o propilo, o isopropilo, o ciclopropilo, o butilo, o isobutilo, o 1- butilo, o pentilo, o ciclopentilo, o isopentilo, o neopentilo, o hexilo, o iso-hexilo, o ciclo-hexilo, o ciclo-hexilmetilo, o 3-metilpentilo, o 2,2-dimetilbutilo e o 2,3-dimetilbutilo. 0 grupo alquilo pode ser opcionalmente substituído com uma ou várias porções selecionadas de entre o grupo que consiste de alquilo, halo, haloalquilo, hidroxilo, carboxilo acilo, aciloxi, amino, amido, 13 derivados de carboxilo, alquilamino, dialquilamino, arilamino, alcoxi, ariloxi, nitro, ciano, azido, tiol, imina, ácido sulfónico, sulfato, sulfonilo, sulfanilo, sulfinilo, sulfamonilo, éster, ácido carboxilico, amida, fosfonilo, fosfinilo, fosforilo, fosfina, tioéster, tioéter, haloqeneto de ácido, anidrido, oxima, hidrozina, carbamato, ácido fosfónico, fosfato, fosfonato, ou qualquer outro grupo funcional viável que não inibe a atividade farmacológica deste composto, quer desprotegido, ou protegido conforme necessário, tal como é conhecido dos peritos na tecnologia, por exemplo, tal como ensinado em Greene, et al., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, Segunda edição, 1991. 0 termo "alquilo de cadeia curta " tal como aqui utilizado, e a menos que especificado de outra forma, refere-se a um Ci a C4 saturado, linear, ramificado, ou se for caso disso, um grupo alquilo ciclico (por exemplo, ciclopropilo), incluindo ambas as formas substituídas e não substituídas. 0 termo "alquileno" ou "alcenilo" refere-se a um radical de hidrocarbildiilo saturado de configuração linear ou ramificada, incluindo aqueles que possuem de um a dez átomos de carbono. Estão incluídos no âmbito deste termo o metileno, o 1,2-etano-diilo, o 1, 1-etano-diilo, o 1,3-propano-diilo, o 1,2-propano-diilo, o 1,3-butano-diilo, o 1,4-butano-diilo e similares. 0 grupo alquileno, ou outra porção divalente aqui divulgada, podem ser substituídos opcionalmente com uma ou mais porções selecionadas de entre o grupo consistindo de alquilo, halo, haloalquilo, hidroxilo, carboxilo, acilo, aciloxi, amino, amido, derivados de carboxilo, alquilamino, azido, dialquilamino, 14 arilamino, alcoxi, ariloxi, nitro, ciano, ácido sulfónico, tiol, imina, sulfonilo, sulfanilo, sulfinilo, sulfamonilo, éster, ácido carboxílico, amida, fosfonilo, fosfinilo, fosforilo, fosfina, tioéster, tioéter, halogeneto de ácido, anidrido, oxima, hidrozina, carbamato, ácido fosfónico, fosfonato, ou qualquer outro qrupo funcional viável que não inibe a atividade farmacológica deste composto, quer desprotegido, ou protegido conforme necessário, tal como é conhecido dos peritos na tecnologia, por exemplo, tal como ensinado em Greene, et al., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, Segunda edição, 1991. 0 termo "arilo" tal como aqui utilizado, e a menos que especificado de outra forma, refere-se a fenilo, bifenilo, ou naftilo, e preferivelmente fenilo. 0 termo inclui tanto as porções substituídas como não substituídas. 0 grupo arilo pode ser substituído com uma ou mais porções selecionadas de entre o grupo que consiste de bromo, cloro, flúor, iodo, hidroxilo, azido, amino, alquilamino, arilamino, alcoxi, ariloxi, nitro, ciano, ácido sulfónico, sulfato, ácido fosfónico, fosfato, ou fosfonato, quer desprotegido, ou protegido conforme necessário, tal como é conhecido dos peritos na tecnologia, por exemplo, tal como ensinado em Greene, et al., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, Segunda edição, 1991. 0 termo "aralquilo" tal como aqui utilizado, e a menos que especificado de outra forma, refere-se a um grupo arilo tal como definido anteriormente, ligado à molécula através de um grupo alquilo tal como definido anteriormente. 0 termo "alcarilo" ou "alquilarilo" tal como aqui utilizado, e a menos que especificado de outra forma, refere-se a um grupo alquilo tal como definido anteriormente, ligado à 15 molécula através de um grupo arilo tal como definido anteriormente. Em cada um destes grupos, o grupo alquilo pode ser substituído opcionalmente tal como descrito anteriormente, e o grupo arilo pode ser substituído opcionalmente com uma ou mais porções selecionadas de entre o grupo consistindo de alquilo, halo, haloalquilo, hidroxilo, carboxilo, acilo, aciloxi, amino, amido, azido, derivados de carboxilo, alquilamino, dialquilamino, arilamino, alcoxi, ariloxi, nitro, ciano, ácido sulfónico, tiol, imina, sulfonilo, sulfanilo, sulfinilo, sulfamonilo, éster, ácido carboxílico, amida, fosfonilo, fosfinilo, fosforilo, fosfina, tioéster, tioéter, halogeneto de ácido, anidrido, oxima, hidrozina, carbamato, ácido fosfónico, fosfonato, ou qualquer outro grupo funcional viável que não inibe a atividade farmacológica deste composto, quer desprotegido, ou protegido conforme necessário, tal como é conhecido dos peritos na tecnologia, por exemplo, tal como ensinado em Greene, et al., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, Segunda edição, 1991. Estão incluídos especificamente dentro do âmbito do termo arilo, o fenilo, o naftilo, o fenilmetilo, o feniletilo, o 3,4,5-trihidroxifenilo, o 3,4,5-trimetoxifenilo, o 3,4,5-trietoxifenilo, o 4-clorofenilo, o 4-metilfenilo, o 3,5-di-butil terciário-4-hidroxifenilo, o 4-fluorofenilo, o 4-cloro-l-naftilo, o 2-metil-l naftilmetilo, o 2-naftilmetilo, o 4-clorofenilmetilo, o 4-t-butilfenilo, o 4-t-butilfenilmetilo. 0 termo "alquilamino" ou "arilamino" refere-se a um grupo amino, que possui um ou dois substituintes alquilo ou arilo, respetivamente. 0 termo "halogénio" tal como aqui utilizado, inclui o 16 flúor, o cloro, o bromo e o iodo. 0 termo "enriquecido enantiomericamente" é usado ao longo da especificação para descrever um nucleosideo que inclui pelo menos cerca de 95%, de preferência pelo menos 96%, mais preferivelmente pelo menos 97%, ainda mais preferencialmente pelo menos 98%, e ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 99% ou mais, de um único enantiómero desse nucleosideo. Quando um nucleosideo de uma configuração particular (D ou L) é referido nesta especificação, presume-se que o nucleosideo é um nucleosideo enriquecido enantiomericamente, salvo indicação em contrário. 0 termo "hospedeiro" tal como aqui utilizado, refere-se a um organismo unicelular ou multicelular no qual o virus pode-se replicar, incluindo linhas celulares e animais, e de preferência um ser humano. Alternativamente, o hospedeiro pode ser portador de uma parte do genoma virai, cuja replicação ou função pode ser alterada pelos compostos da presente invenção. 0 termo hospedeiro refere-se especificamente a células infetadas, a células transfectadas com todo ou parte do genoma virai, e a animais, em particular, primatas (incluindo chimpanzés) e seres humanos. Em relação à proliferação celular anormal, o termo "hospedeiro" refere-se ao organismo unicelular ou multicelular, no qual a proliferação celular anormal pode ser imitada. 0 termo hospedeiro refere-se especificamente a células que proliferam anormalmente, quer por causas naturais ou não naturais (por exemplo, a partir de uma mutação genética ou de engenharia genética, respetivamente) , e a animais, em particular primatas (incluindo chimpanzés) e seres humanos. Na maioria das 17 aplicações de animais da presente invenção, o hospedeiro é um paciente humano. No entanto, estão claramente previstas pela presente invenção as aplicações veterinárias, em certas indicações (tais como o virus da diarreia virai bovina no gado, o virus da cólera de hog nos suinos, e o virus da doença da fronteira nos ovinos). 0 termo "sal farmaceuticamente aceitável" é usado ao longo da especificação para descrever qualquer forma farmaceuticamente aceitável de um composto, que após administração a um paciente, proporciona o composto ativo. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem aqueles derivados de bases e ácidos inorgânicos ou orgânicos farmaceuticamente aceitáveis. Os sais adequados incluem aqueles derivados de metais alcalinos tais como o potássio e o sódio, de metais alcalinoterrosos tais como o cálcio e o magnésio, entre numerosos outros ácidos bem conhecidos na tecnologia farmacêutica. IV. Sais farmaceuticamente aceitáveis

Nos casos em que os compostos são suficientemente básicos ou ácidos para formar sais de ácido ou base não tóxicos estáveis, pode ser apropriada a administração do composto como um sal farmaceuticamente aceitável. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem aqueles derivados de bases e ácidos inorgânicos ou orgânicos farmaceuticamente aceitáveis. Os sais adequados incluem aqueles derivados de metais alcalinos tais como o potássio e o sódio, de metais alcalinoterrosos tais como o cálcio e o magnésio, entre numerosos outros ácidos bem conhecidos na tecnologia farmacêutica. Em particular, são exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis os sais de adição de ácidos orgânicos formados com ácidos, que formam um anião 18 fisiológico aceitável, por exemplo, o tosilato, o metanossulfonato, o acetato, o citrato, o malonato, o tartarato, o succinato, o benzoato, o ascorbato, o a-cetoglutarato, e o α-glicerofosfato. Também podem ser formados sais inorgânicos adequados, incluindo os sais de sulfato, de nitrato, de bicarbonato e de carbonato.

Os sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser obtidos usando procedimentos padrão bem conhecidos na tecnologia, por exemplo através da reação de um composto suficientemente básico, tal como uma amina, com um ácido adequado, proporcionando um anião fisiologicamente aceitável. Podem também ser feitos sais de ácidos carboxilicos de um metal alcalino (por exemplo, o sódio, o potássio ou o litio) ou de um metal alcalinoterroso (por exemplo, o cálcio). V. Composições farmacêuticas

As composições farmacêuticas com base num composto β-Ό com a fórmula I-b, ou o seu enantiómero β-L, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, podem ser preparadas numa quantidade terapeuticamente eficaz para o tratamento de uma infeção virai por Flaviviridae, opcionalmente em combinação com um aditivo, veiculo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. A quantidade terapeuticamente eficaz pode variar com a infeção ou condição a ser tratada, a sua gravidade, o regime de tratamento a ser empregue, a farmacocinética do agente usado, bem como do paciente tratado.

Num aspeto, de acordo com a presente divulgação, o composto de acordo com a presente invenção é formulado de preferência em mistura com um veiculo farmaceuticamente aceitável. Em geral, é preferível administrar a composição 19 farmacêutica em forma administrável por via oral, mas as formulações podem ser administradas por via parentérica, intravenosa, intramuscular, transdérmica, bucal, subcutânea, supositório ou outra via. As formulações intravenosa e intramuscular são preferivelmente administradas numa solução salina estéril. Um vulgar perito na tecnologia pode modificar a formulação dentro dos ensinamentos da especificação, para proporcionar numerosas formulações para uma via particular de administração, sem tornar as composições da presente invenção instáveis ou comprometer a sua atividade terapêutica. Em particular, uma modificação de um composto desejado para torná-lo mais solúvel em água ou outro veiculo, por exemplo, pode ser facilmente alcançada através de modificação de rotina (formulação de sal, esterificação, etc).

Em certas formas de dosagem farmacêutica é preferida a forma de pró-fármaco do composto, incluindo especialmente derivados acilados (acetilados ou outros) e de éter, ésteres de fosfato, e várias formas de sal dos compostos da presente invenção. Um vulgar perito na tecnologia reconhecerá como modificar facilmente o composto da presente invenção numa forma de pró-fármaco, para facilitar a entrega do composto ativo a um sitio alvo no organismo hospedeiro ou paciente. 0 vulgar perito também irá tirar partido dos parâmetros farmacocinéticos favoráveis da forma de pró-fármaco, onde aplicável, na entrega do composto desejado a um sitio alvo no organismo hospedeiro ou paciente, para maximizar o efeito pretendido do composto no tratamento da infeção por Flaviviridae (incluindo o VHC). A quantidade de composto incluido nas formulações terapeuticamente ativas, de acordo com a presente invenção, 20 é uma quantidade eficaz para o tratamento de um Flaviviridae (incluindo o VHC) . Em geral, uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto da presente invenção numa forma de dosagem farmacêutica, varia geralmente de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 100 mg/kg ou mais, dependendo do composto utilizado, da condição ou infeção tratada, e da via de administração. Para os fins da presente invenção, uma quantidade profilaticamente ou preventivamente eficaz das composições, de acordo com a presente invenção, está compreendida no mesmo intervalo de concentração como definido anteriormente para a quantidade terapeuticamente eficaz, e é geralmente a mesma que uma quantidade terapeuticamente eficaz. A administração do composto ativo pode variar entre continua (gotejamento intravenoso) até várias administrações orais por dia (por exemplo, Q.I.D., B.I.D., etc) , e pode incluir a administração oral, tópica, parentérica, intramuscular, intravenosa, subcutânea, transdérmica (que pode incluir um agente de melhoramento da penetração) , bucal, e supositório, entre outras vias de administração. Os comprimidos orais com revestimento entérico, podem também ser utilizados para aumentar a biodisponibilidade e a estabilidade dos compostos de uma via de administração oral. A forma de dosagem mais eficaz dependerá da farmacocinética do agente particular escolhido, assim como da gravidade da doença no paciente. São particularmente preferidas as formas de dosagem oral, por causa da facilidade de administração, e da possível favorável adesão do paciente.

Para preparar as composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção, é de preferência misturada uma 21 quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais dos compostos de acordo com a presente invenção com um veiculo farmaceuticamente aceitável, de acordo com técnicas de composição farmacêuticas convencionais para produzir uma dose. Um veículo pode assumir uma ampla variedade de formas dependendo da forma de preparação desejada para administração, por exemplo, oral ou parentérica. Na preparação de composições farmacêuticas na forma de dosagem oral, pode ser utilizado qualquer um dos meios farmacêuticos usuais. Assim, para preparações orais líquidas, tais como suspensões, elixires e soluções, podem ser utilizados veículos e aditivos adequados incluindo a água, os glicóis, os óleos, os álcoois, os agentes aromatizantes, os conservantes, os agentes corantes e semelhantes. Para preparações orais sólidas, tais como pós, comprimidos, cápsulas, e para preparações sólidas tais como supositórios, podem ser utilizados veículos e aditivos adequados incluindo os amidos, os veículos de açúcar, tais como a dextrose, o manitol, a lactose e veículos relacionados, os diluentes, os agentes de granulação, os lubrificantes, os ligantes, os agentes desintegrantes e semelhantes. Se desejado, os comprimidos ou as cápsulas podem ser revestidos entericamente para libertação sustentada, através de técnicas padrão. A utilização destas formas de dosagem pode ter um impacto significativo na biodisponibilidade dos compostos no paciente.

Para formulações parentéricas, o veículo compreenderá habitualmente água esterilizada ou uma solução aquosa de cloreto de sódio, apesar de também poderem ser incluídos outros ingredientes, incluindo os que ajudam a dispersão. Onde a água estéril é para ser usada e mantida como 22 estéril, também devem ser esterilizados as composições e os veiculos. Também podem ser preparadas suspensões injetáveis, podendo neste caso ser empregues veículos liquidos apropriados, agentes de suspensão e similares.

As suspensões de lipossomas (incluindo os lipossomas direcionados para antigénios virais) podem também ser preparadas por métodos convencionais para a produção de veículos farmaceuticamente aceitáveis. Isto pode ser adequado para a entrega de compostos de nucleosideo de acordo com a presente invenção.

Em particular, realizações preferidas de acordo com a presente invenção, são os compostos e as composições utilizadas para tratar, prevenir ou atrasar o aparecimento da infeção por Flaviviridae (incluindo o VHC) . De preferência, para tratar, prevenir ou atrasar o início da infeção ou da condição, as composições serão administradas em formas de dosagem oral em quantidades que variam desde cerca de 250 microgramas até cerca de 1 grama ou mais, pelo menos uma vez por dia de preferência, ou até quatro vezes por dia. Os compostos da presente invenção são administrados de preferência por via oral, mas podem ser administrados parentericamente, topicamente ou na forma de supositório.

Os compostos de acordo com a presente invenção, devido à sua baixa toxicidade para as células do hospedeiro em certas circunstâncias, podem ser utilizados vantajosamente profilacticamente para prevenir a infeção por Flaviviridae (incluindo o VHC), ou para prevenir a ocorrência de sintomas clínicos associados com a infeção virai ou condição referida. Assim, a presente invenção também engloba compostos para utilização em métodos para o 23

tratamento profilático da infeção por Flaviviridae (incluindo o VHC) . Neste aspeto, de acordo com a presente invenção, as composições da presente invenção são utilizadas para prevenir ou atrasar o aparecimento de uma infeção por Flaviviridae (incluindo o VHC) . Este método profilático compreende a administração a um paciente em necessidade de tal tratamento, ou que está em risco para o desenvolvimento do virus ou da condição, de uma quantidade de um composto de acordo com a presente invenção, eficaz para aliviar, prevenir ou atrasar o aparecimento da infeção virai ou condição. No tratamento profilático de acordo com a presente invenção, prefere-se que o composto antiviral ou antiproliferativo utilizado seja de baixa toxicidade, e preferivelmente não tóxico para o paciente. E particularmente preferido neste aspeto da presente invenção, que o composto que é utilizado seja maximamente eficaz contra o virus ou condição, e deva apresentar um mínimo de toxicidade para o paciente. No caso de uma infeção por Flaviviridae (incluindo o VHC), os compostos de acordo com a presente invenção, que podem ser usados para tratar estes estados de doença, podem ser administrados dentro da mesma gama de dosagem para o tratamento terapêutico (isto é, cerca de 250 microgramas até 1 grama ou mais, de uma a quatro vezes por dia, para uma forma de dosagem oral) como um agente profilático para prevenir a proliferação de uma infeção por Flaviviridae (incluindo o VHC) , ou em alternativa, prolongar o início de uma infeção por Flaviviridae (incluindo o VHC), que se manifesta em sintomas clínicos.

Além disso, os compostos de acordo com a presente invenção podem ser administrados em combinação ou em 24 alternância com um ou mais agentes ou interferão antiviral, anti-VHB, anti-VHC, ou anti-herpético, agentes anticancerígenos ou antibacterianos, incluindo outros compostos da presente invenção. Certos compostos de acordo com a presente invenção podem ser eficazes para aumentar a atividade biológica de certos agentes de acordo com a presente invenção, reduzindo o metabolismo, catabolismo, ou inativação de outros compostos, e como tal, são coadministrados para este efeito pretendido.

Esta invenção é ainda melhor ilustrada nas seguintes secções. A secção de detalhes experimentais e os exemplos ai contidos são estabelecidos para ajudar na compreensão da invenção. VI. Terapêuticas para o tratamento de infeção por Flaviviridae

Tem sido reconhecido que podem surgir variantes de virus resistentes aos fármacos depois de um tratamento prolongado com um agente antiviral. A resistência ao fármaco ocorre mais normalmente pela mutação de um gene que codifica para uma enzima utilizada no ciclo de replicação virai, e mais tipicamente no caso do VHC, a polimerase de ARN dependente de ARN. Tem sido demonstrado que a eficácia de um fármaco contra a infeção virai pode ser prolongada, aumentada, ou restabelecida, por administração do composto em combinação ou em alternância com um segundo, e talvez terceiro, composto antiviral, que induz uma mutação diferente da que foi causada pelo fármaco principal. Alternativamente, a farmacocinética, a biodistribuição, ou outro parâmetro do fármaco pode ser alterado pela terapêutica de combinação ou de alternância referida. Em geral, a terapêutica de combinação é geralmente preferida à 25 terapêutica de alternância, porque induz tensões múltiplas simultâneas no virus.

Exemplos de agentes que foram identificados como ativos contra o virus da hepatite C, e que portanto podem ser usados em combinação ou em alternância com um ou mais nucleosideos com a fórmula geral I-b, ou o seu enantiómero β-L, incluem: (a) Interferão e ribavirina (Battaglia, A. M. et al., Ann. Pharmacother. 2000, 34, 487; Berenguer, M. et al., Antivir. Ther. 1998, 3 (Suppl. 3), 125), (b) Inibidores da protease NS3 com base no substrato (Attwood et al., PCT WO 98/22496, 1998; Attwood et al., Antiviral Chemistry and Chemotherapy 1999, 10, 259; Attwood et al., publicação de patente Alemã DE 19914474; Tung et al., PCT WO 98/17679), incluindo as alf a-cetoamidas e as hidrazinoureias, e os inibidores que terminam num eletrófilo tais como um ácido borónico ou fosfonato (Llinas-Brunet et al., PCT WO 99/07734), (c) Inibidores sem base no substrato tais como os derivados de 2,4,6-trihidroxi-3-nitro-benzamida (Sudo K. et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 1997, 238, 643 e Sudo K. et al., Antiviral Chemistry and Chemotherapy 1998, 9, 186), incluindo RD3-4082 e RD3-4078, sendo o primeiro substituído na amida com uma cadeia de 14 carbonos, e o último processando um grupo para-fenoxifenilo, (d) Derivados de tiazolidina que mostram inibição relevante num ensaio de HPLC de fase inversa, com uma proteína de fusão NS3/4A e substrato NS5A/5B (Sudo K. et al., Antiviral Research 1996, 32, 9), especialmente o composto RD-1-6250, possuindo uma porção fundida de cinamoílo substituída com 26 uma cadeia de alquilo longa, RD4 6205 e RD4 6193, (e) Tiazolidinas e benzanilidas identificadas em Kakiuchi N. et al., J. EBS Letters 421, 217 e Takeshita N. et al., Analytical Biochemistry 1997, 247, 242, (f) Uma fenantrenequinona possuindo atividade contra a protease de VHC num ensaio de SDS-PAGE e autorradiografia, isolada a partir do meio de cultura de fermentação de Streptomyces sp., Sch 68 631 (Chu M. et al., Tetrahedron Letters 1996, 37, 7229), e Sch 351633, isolada a partir do fungo Penicillium griscofuluum, que demonstra atividade num ensaio de proximidade de cintilação (Chu M. et al., Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 9, 1949), (g) Inibidores seletivos de NS3 com base na macromolécula elgin c, isolados a partir de sanguessuga (Qasim Μ. A. et al., Biochemistry 1997, 36, 1598), (h) Inibidores da helicase de VHC (Diana G. D. et al., patente US N° 5 633 358 e Diana G. D. et al., PCT WO 97/36554), (i) Inibidores da polimerase de VHC, tais como análogos de nucleotideos, gliotoxina (Ferrari R. et al., Journal of Virology 1999, 73, 1649), e o produto natural cerulenina (Lohmann V. et al., Virology 1998, 249, 108), (j) Oligodesoxinucleotideos anti-sentido de fosforotioato (S-ODN) complementares a pelo menos uma parte de uma sequência de VHC (Anderson et al., patente US N° 6 174 868), e nomeadamente, os trechos de sequência na região 5' não codificante (NCR) (Alt M. et al., Hepatology 1995, 22, 707), ou os nucleotideos 326-348 compreendendo a extremidade 3' da NCR, e os nucleotideos 371-388 localizados no centro da região codificante do ARN do VHC (Alt M. et al., Archives of Virology 1997, 142, 589 e 27

Galderisi U. et al., Journal of Cellular Physiology 1999, 81: 2151), (k) Inibidores da tradução dependente de IRES (Ikeda N. et al., publicação de patente Japonesa JP-08268890; Kai Y. et al., publicação de patente Japonesa JP-10101591), (l) Ribozimas resistentes a nuclease (Maccjak D. J. et al., Hepatology 1999, 30, abstract 995), (m) Amantadina, tal como rimantadina (Smith, resumo da Reunião Anual da Associação Gastoenterologica Americana AASLD, 1996), (n) Quinolonas, tais como a ofloxacina, a ciprofloxacina e a levofloxacina (resumos da AASLD, Hepatology, outubro de 1994, edição do programa, 20 (4), pt. 2, resumo n° 293), (o) Análogos de nucleosideos (Ismaili et al., WO 01/60315; Storer WO 01/32153), incluindo os 2'-desoxi-L-nucleosideos (Watanabe et al., WO 01/34618), e a 1-(β-L-ribofuranosil)-1,2,4-triazol-3-carboxamida (levovirin™) (Tam WO 01/46212), e (p) Outros compostos diversos, incluindo os 1-amino-alquilciclohexanos (Gold et al., patente US N° 6 034 134), os lípidos de alquilo (Chojkier et al., patente US N° 5 922 757), a vitamina E e outros antioxidantes (Chojkier et al., patente US N° 5 922 757), o esqualeno, os ácidos biliares (Ozeki et al., patente US N° 5 846 964), o ácido N-(fosfonoacetil)-L-aspártico (Diana et al., patente US N° 5 830 905), as benzenodicarboxamidas (Diana et al., patente US N° 5 633 388), os derivados do ácido poliadenilico (Wang et al., patente US N° 5 496 546), a 2',3'-didesoxi-inosina (Yarchoan et al., patente US N° 5 026 687), os benzimidazóis (Colacino et al., patente US N° 5 891 874), as glucaminas (Mueller et al., WO 01/08672), os compostos 28 1,5-imino-D-glucitol substituídos (Mueller et al., WO 00/47198). VII. Protocolo sintético

Os compostos com a fórmula [I-b], ou o seu enantiómero β-L, podem ser sintetizados por quaisquer meios conhecidos na tecnologia. Em particular, os compostos podem ser feitos por meio de três vias diferentes: (a) a partir de um nucleosídeo pré-formado, (b) condensação de um açúcar modificado ou ribose não modificada com purina ou pirimidina, e (c) uma combinação das duas vias. Uma vez que a estrutura da 3-desoxi-D-eritropentofuranose é encontrada no antibiótico nucleosídeo cordicepina, um certo número de sínteses totais deste antibiótico foram relatadas durante os anos 1960 (veja-se: Lee, W. W. et al., J. Am. Chem. Soc., 1961, 83, 1906; Walton, E. el al., J. Am. Chem. Soc., 1964, 86, 2 952; Suhadolnik, R. J. et al . , Carbohydr. Res., 1968, \—1 kO 545; Ikehara, M. et al., Chem. Pharm. Buli., 1967, LO \—1 94; Kaneko, M. et al., Chem. Pharm. Buli. 1972, 20, 63) . Numa realização preferida da invenção, a preparação de nucleosídeos 3'-desoxi a partir de nucleosídeos pré-formados, é feita das seguintes formas: A. Compostos de tipos I-b (i) Um exemplo para a preparação do composto do tipo I-b, nucleosídeo de purina, é a síntese de nucleosídeos 3'-desoxipurina (Esquema 3) . O ribonucleosídeo 13 é tratado com halogeneto de 2-metoxi-isobutirilo (X = Cl ou Br), para dar uma mistura de derivados de 3'-halogeno-xilo-furanosilo e 2'-halogeno-arabinofuranosilo (14 e 15). A hidrogenólise, seguida por separação por cromatografia, origina o 3'-desoxinucleosídeo 17 correspondente, juntamente com o 2'-desoxinucleosídeo 16. A saponificação de 17 dá o 3'- 29 desoxinucleosideo 20 desejado. O tratamento da mistura de reação de 14 e de 15 com uma base, dá o epóxido 18 único com um rendimento quantitativo, o qual mediante tratamento com iodeto de amónio ou de sódio proporciona exclusivamente o 3'-xilo-iodeto 19. A hidrogenólise de 19 proporciona o 20. A redução de 18 com um agente de redução tal como o niquel de Raney, o hidreto de alumínio de lítio ou o boro-hidreto de sódio também dá o 20.

De um modo semelhante, partindo de um L-ribonucleosídeo de purina, pode ser sintetizado o L-nucleosídeo correspondente de 20.

Esquema 3

(ii) Síntese por condensação de um açúcar apropriado com base.

Os derivados de açúcar apropriados devem ser preparados para a condensação com a base selecionada. Embora existam vários métodos para a síntese de derivados 30 de 3-desoxi-D-eritropentofuranose (3-desoxi-D-ribofuranose) (veja-se: Lee, W. W. et al., J. Am. Chem. Soc., 1961, 83, 1906; Walton, E. et al., J. Am. Chem. Soc., 1964, 86, 2952; Lin, T. -S. et al., J. Med. Chem., 1991, 34, 693; Ozols, A. M. et al., Synthesis, 1980, 557), foram desenvolvidos novos métodos para a presente invenção, tal como mostrado no Esquema 5. 30 HXO-O·!

Esquema 5

f? - SCBj SCjHs, SO^Ph. OPiM

H3CO-

P «jCO-O-l

28 •OAC ÕAà 30

OAc A 1,2-0-isopropilideno-5-0-metoxicarbonil-a-D-xilo-furanose (25) é convertida no derivado 3-tiocarbonilo 26 correspondente, seguido por desoxigenação de radicais livres usando hidreto de trialquilo de estanho na presença de um radical iniciador, tal como o 2,2'-azobisisobutironitrilo. O produto desoxigenado 27 é acilado com uma mistura de ácido acético, anidrido acético e ácido sulfúrico para dar o 28, o qual é então condensado com uma base sililada utilizando o procedimento de Vorbruggen (veja-se: Niedballa, U. et al., J. Org. Chem., 1976, 41, 2084; Vorbruggen, H. et al., Chem. Ber., 1981, 114, 1234; 31

Kazinierczuk, Z. et al., J. Am. Chem. Soc., 1984, 106, 637 9), para se obter o nucleosídeo de pirimidina 29 ou um nucleosídeo de purina relacionado (Tipo I-b). O grupo 5-OH pode ser protegido alternativamente com outros grupos acilo, tais como benzoilos, p-nitrobenzoílos, p- clorobenzoílos ou ρ-metoxibenzoílos, bem como com outros grupos sililo, tais como os grupos t-butildimetilsililo ou t-butildifenilo. Da mesma forma, a L-xilose pode ser convertida no L-açúcar correspondente de 25, o qual pode ser ainda mais derivado para alcançar o L-nucleosideo de 30.

Alternativamente, tal como mostrado no Esquema 6, a l,2-0-isopropilideno-5-0-(t-butildifenilsililo)-a-D-xilofuranose (31) pode ser sulfonilada com cloreto de mesilo, cloreto de tosilo ou cloreto de tresilo em piridina para se obter o 32. Após a metanólise de 32, o xilosido de metilo 33 pode ser tratado com uma base, tal como metóxido de sódio em metanol, para se obter o ribo-epóxido 34. A abertura do epóxido 34 com hidreto de alumínio de lítio produz estereoselectivamente o açúcar 3-desoxi 36. O tratamento de 34 com brometo de lítio ou iodeto de sódio em acetona ou 2-butanona, dá o xilosido 3-halogeno-3-desoxi 35. A desalogenação redutiva de 35 proporciona o 36. A remoção do grupo de proteção 5'-sililo com uma fonte de ião fluoreto, tal como o fluoreto de tri-n-butilamónio em tetrahidrofurano ou o fluoreto de trietilamónio de hidrogénio, dá o 37. A acilação de 37 com anidrido acético e ácido acético na presença de ácido sulfúrico dá a tri-O-acetil-3-desoxi-D-ribofuranose 38. Além disso, o tratamento com fluoreto converte o 33 no 39, o qual após acetilação proporciona o 40. Estes açúcares acetilados 38 e 40 podem 32 ser condensados com pirimidina pertrimetilsililada ou com bases de purina, usando o procedimento de Vorbrueggen, para dar o nucleosídeo 3' modificado. 0 grupo protetor t-butildifenilsililo pode ser substituído pelo grupo t-butildimetilsililo.

Esquema6

ΌΑα 001¾

3Ae 49. r » Ati W*. Ts

3S,

QAe

M.S-TBDP3 3tx Ft«H (a) Modificação de nucleosideos de purina na posição C-6 (I-b e IlI-b) 0 composto 28 ou o 38 é convertido em halogenase 122 (Esquema 18) , por tratamento com cloreto de hidrogénio ou brometo de hidrogénio em ácido acético ou brometo de hidrogénio em diclorometano, e condensado com 6-cloropurina pelo procedimento de sódio em acetonitrilo, proporcionando o 3'-desoxinucleosideo 123. 0 tratamento aquoso de

hidróxido de sódio ou de potássio de 123 dá a 3'-desoxi-inosina (124) . 0 tratamento de 123 com metóxido de sódio em metanol proporciona a 6-0-metil-3'-desoxi-inosina (125). A saponificação suave seguida por hidrogenólise catalítica de 123 resulta na produção de 3'-desoxinebularina (126). A 33 tioureia reage com o 123 para se obter o nucleosídeo de 6-tiopurina 127, que é S-alquilado para o 128. Os compostos 123, 127 e 128 reagem facilmente com várias aminas, hidroxilamina, hidrazina, e aminoálcoois, para dar os análogos de 3'-desoxiadenosina 129-133. 0 tratamento de 123 com azida de sódio dá o nucleosideo de 6-azidopurina 134. A mesma sequência de reações pode ser aplicada para os L-nucleosideos ΙΙΙ-b correspondentes. 34

Esquema 18

131, R « NHÍCH2}nCH3

132, R-NHÍG^OH 133, R = NH(CH2)nNH2

Estes compostos também podem ser sintetizados por tratamento com ácido nitroso do nucleosideo de 6-hidrazidopurina 130. A redução de 129, 130 ou 134 dá a 3'-desoxiadenosina (isto é, a cordicepina). 0 composto 125 ou cordicepina esperam-se ser convertidos in vivo em 124, por ação da desaminase de adenosina. 0 nucleosideo de purina 6- 35 não substituído 126 pode ser oxidado in vivo para 124. A condensação de 122 com 6-cloropurina 2-substituída dá o análogo 2-substituído de 123. A funcionalidade 6-cloro pode ser convertida em vários grupos funcionais, por meio de reações de substituição nucleofílica. Assim, a 2-amino-6-cloropurina é convertida em 135 (Esquema 19) , que pode ser convertido em vários nucleosídeos de 2-aminopurina (136-147). Deve notar-se que os nucleosídeos de 2,6-diamino (141) e de 2-amino-purina (138) são precursores potenciais para a 3'-desoxi-guanosina (136). De um modo semelhante, mas começando a partir dos L-nucleosídeos correspondentes, são preparados os nucleosídeos ΙΙΙ-b correspondentes. 36

Esquema 19

142, R " OH 143, R = NH2 144, R = NHÍG^CHa 145, R « NH(CH2)nOH 146, R * NH(CH2}nNH2

De um modo semelhante são sintetizados os nucleosídeos de 2-oxo, 2-metoxi, 2-tio, 2-alquilmercapto, 2-metilo, 2-metil-amino ou 2-dimetil-amino-purina (148-154) (Esquema 20) . Além disso, de uma forma semelhante, mas utilizando os L-nucleosídeos correspondentes, são preparados os compostos do tipo IlI-b. 37 Esquema 20

(b) Modificação de nucleosídeos de purina na posição C-2 (I-b e IlI-b). 0 grupo 2-amino de 135-147 pode ser modificado para se obter o 155 (Esquema 21) , por acilação com vários haletos de alcanoilo ou de aroilo. Em seguida, o 155 pode ainda ser derivado para o derivado 2-alquilamino ou 2-arilamino correspondente 156, por redução com um complexo de borano-amina (Sergueeva, Z. A. et al., Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 2000, 19, 275). Em alternativa, o grupo 2- amino do composto 135 pode ser substituído por se submeter a uma reação de Schiemann, diazotizando na presença de fluoroborato, seguido por decomposição térmica, para se obter o nucleosideo de 2-fluoro-6-cloro-purina 157. Além disso, o substituinte 6-cloro destes nucleosideos pode ser deslocado com vários reagentes nucleófilos, como descrito anteriormente. Deve notar-se, que a presença do substituinte 2-fluoro protege o grupo 6-amino de um ataque 38 de desaminase de adenosina. 38

Esquema 21

(c) Modificação de nucleosideos de purina na posição C-8 (I~b) Deve notar- se, que a modificação da posição 8 de nucleosídeos de purina é importante, uma vez que a substituição nesta posição altera a conformação preferida dos nucleosideos para ser sin. A cordicepina (158, R3 = R3 = H) , a 3'-desoxi-inosina (124, R3' = R3" = H) e a 3'-desoxiguanosina (136, R3' = R3" = H) podem ser bromadas na posição C-8, por tratamento com bromo em ácido acético na presença de acetato de sódio, para 159-161 (Esquema 22). 0 substituinte bromo na posição C-8 em 159-161 pode ser substituído por enxofre, pela ação da tioureia, para se obter 162-164, que pode ser alquilado ou aralquilado com haleto de alquilo ou de aralquilo, num solvente polar tal como a água, o álcool ou a dimetilf ormamida, na presença de uma base tal como o carbonato de sódio ou de potássio, para dar 165-167. 0 derivado de metilmercapto 165-167 (R = metilo) pode ser oxidado na sulfona correspondente 168-170. Após o tratamento destas sulfonas com várias aminas, são obtidos os derivados de 8-amino 171-173 correspondentes. Muitos dos 39 derivados de 8-amino podem ser obtidos diretamente a partir de 159-161, por tratamento com aminas. Além disso, o 159 pode ser convertido no derivado de 8-oxo 174, por tratamento com acetato de sódio em anidrido acético, seguido por hidrólise. A O-alquilação de 174 com fluoroborato de trietiloxónio dá a 8-etoxicordicepina 175.

15$, X=Nhj,Y = H 424, X = OH, Y « H 133, X = OH, Y - Ny

Esquema 22

153, Χ '-Ν^,Υ-Η 160, X =· OH, Y = H 161, 162, X = Y - H 183. X s OH. Y “ H 461. X - OH, Y = Ny 165, X « Y ··· H 166, X * OH. Y - H 167, X = OH. Y-NH

¥

¥

171, X * Nft, Y s H 168, X=NH>,Y»H 172, X=OH,Y = H 160, X-CH,Y = N 173, X = QH, Y*Nl3 176, X=OH,Y«Ny

Os derivados de 8-alquilo 176 (Esquema 23) são preparados a partir de 123 (R5' = R2' = THP) , mediante tratamento com di-isopropilamida de litio em tetrahidrofurano abaixo de -70 °C, seguido de um tratamento de halogeneto de alquilo. Este método foi utilizado com sucesso noutros ribonucleosideos (Tanaka, H. et al., Chem. Pharm. Buli., 1983, 31, 787), mas nunca foi aplicado aos 40 3' -desoxinucleosídeos. Quando o dióxido de carbono é usado em vez de halogeneto de alquilo, é obtido o nucleosideo de purina ácido 8-carboxilico 177. A esterificação para 178 seguida por amonólise dá a amida 181, a qual é desidratada para o nucleosideo de 8-cianopurina 182. A redução de 178 com borano-dimetilsulfureto proporciona o álcool 179. A oxidação suave com dimetilsulfóxido e cloreto oxálico proporciona o aldeido 180. Os compostos 179 e 180 são intermediários versáteis para várias modificações. 40 Esquema 23

Os exemplos de trabalho seguintes proporcionam uma melhor compreensão do âmbito da presente invenção. Estes exemplos são para fins ilustrativos. Os solventes, reagentes ou condições de reação equivalentes, semelhantes ou adequados, podem ser substituídos por aqueles solventes, reagentes ou condições de reação específicos descritos, sem se afastarem do âmbito geral do método. 41

EXEMPLOS

Os pontos de fusão foram determinados em tubos capilares abertos num aparelho de ponto de fusão digito Electrothermal, e não estão corrigidos. Os espectros de absorção de UV foram registados num espectrofotómetro Uvikon 931 (KONTRON), em etanol. Os espectros de ^-RMN foram realizados à temperatura ambiente com um espectrómetro Varian Unity Plus 400. Os desvios quimicos são dados em campo baixo ppm a partir de tetrametilsilano interno como referência. Foram realizadas a troca de deutério, as experiências de desacoplamento ou 2D-C0SY, a fim de confirmar as atribuições de protões. As multiplicidades de sinal são representadas por s

(singuleto), d (dupleto), dd (dupleto de dupletos), t (tripleto), q (quádruplo), br (largo), m (múltiplo). Todos os valores de J estão em Hz. Os espectros de massa FAB foram registados no modo de ião positivo (FAB > 0) ou negativo (FAB < 0), num espectrómetro de massa JEOL DX 300. A matriz era álcool 3-nitrobenzílico (NBA) ou uma mistura (50:50, v/v) de glicerol e tioglicerol (GT) . As rotações especificas foram medidas com um espectropolarímetro Perkin-Elmer 241 (comprimento do caminho de 1 cm) , e são apresentadas em unidades de 10_1 deg cm2 g”1. As análises elementares foram realizadas por Atlantic Microlab Inc. (Norcross, GA) . As análises indicadas pelos símbolos dos elementos ou funções estavam dentro de ± 0,4% dos valores teóricos. A cromatografia em camada fina foi realizada em placas Whatman PK5F de gel de sílica, sendo a visualização de produtos realizada por absorvência de UV, seguida por carbonização com ácido sulfúrico etanólico a 10%, e de aquecimento. A cromatografia em coluna foi realizada em gel 42 de sílica (Fisher, S733-1), a pressão atmosférica. (Referência) Exemplo 14 9- (2-0-Acetil-3-bromo-3-desoxi-fi-D-xylofuranosil) adenina (14, R = Η, X = Br, Y = NH2, Z = H) . 0 composto 14 (R = 2,5,5-trimetil-l,3-dioxolan-4-on-2-ilo, X = Br, Y = NH2, Z = H, 500 mg, 1 mmol) é dissolvido em cloreto de hidrogénio metanólico, preparado por adição de 3 gotas de cloreto de acetilo em 10 ml de metanol. Após 30 minutos à temperatura ambiente, são adicionados 3 ml de uma solução saturada de bicarbonato de sódio, e a mistura é concentrada sob vácuo até à secura. O resíduo é triturado com etanol até que o sobrenadante não mostra absorção de UV significativa a 260 nm. Os extratos de etanol são concentrados, e o resíduo é cristalizado a partir de

me tanol para dar 0 14 dese j ado (R = Η, X = = Br, Y = NH2, Z ' H) , 325 g (87%) . RMN (D6 -DMSO) õ: 8,16, 8,32 (2s , H-2 . H- 8), 6, , 10 (d, 1H, H- '1' , Jl',2' : = 3 ,9 Hz), 5, 91 (dd, 1H, H 2 ' , Jl',2 t = 3, 9, J2 ' , 3 ' = 4,1 Hz) , 5, 85 (dd, 1H, H- -3', J2 ', 3 ' : 4, 1, J3- ,4’ = 5,1 Hz) , 4,38 (dt, 1H , H-4 ' , J3', 4 = = 5, 1, J4 ' , 5 = J4 ',5" = 5,0 Hz ) , 3, 79 ( dd, 2H, H-5 ' ,5 "), 2, 09 (s, 3H

Ac) .

De uma maneira semelhante, mas utilizando os nucleosídeos de purina correspondentes, são preparados os seguintes nucleosídeos 2 ' -O-acetil-3'-bromo-3'-desoxi-D-xilo (14) e os seus correspondentes L: 9-(2-0-Acetil-3-bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil) guanina, 9-(2-0-Acetil-3-bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-6-cloropurina, 9-(2-0-Acetil-3-bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-2,6-dicloropurina, 9-(2-0-Acetil-3-bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-2-amino- 43 6-cloropurina, 9-(2-0-Acetil-3-bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-6-metiltiopurina e 9-(2-0-Acetil-3-bromo-3-desoxi-p-D-xilofuranosil)-6-metoxipurina. (Referência) Exemplo 15 9-[2-0-Acetil-3-bromo-3-desoxi-5-0-(2,5,5-trimetil-l,3-dioxolan-4-on-2-il)-β-D-xilo-furanosil] adenina (14, R = 2,5,5-trimetil-l,3-dioxalan-2-ona~2-ilo, X = Br, Y = NH2, Z = H) .

Uma mistura de adenosina (13, Y = NH2, Z = H, 10 g, 0,037 mol) e brometo de a-aoetoxi-isobutirilo (24 g, 0,117 mol) em acetonitrilo (120 ml) , é agitada à temperatura ambiente durante 45 minutos. O solvente é removido sob vácuo, e o residuo é dissolvido em acetato de etilo, lavado com uma solução de bicarbonato de sódio e água, seco sobre sulfato de sódio, e concentrado sob vácuo. O residuo é cristalizado a partir de metanol para dar 6,5 g (35 %) de 14 (X = Br, Y = NH2, Z = H) , pf 169-170 °C. ΧΗ RMN (D6-DMSO) δ 8, 17, 8,26 (2s, 1H cada um, H-2 e H-6), 6,16 (d, 1H, H- 1' , Jl',2' = 3,5 Hz) , 5, 94 (dd , 1H, H-2', Ji',2' = 3,5 Hz, Ó2 ' , 3' = 3,0 Hz) , 4,92 (dd, , 1H, H-3 ' , J2 ’ , 3' = 3, 0 Hz, J3',4' = 4, 8 Hz), 4 ,54 (m, 1H, H- -4') , 3, 94 (m, 2H, H-5 ',5"), 2,10 (s, 3H, Ac), 1,73, 1,58, 1,47 (3s, 3H cada um, grupos CH3 em 5') . A solução mãe da cristalização de 14 contém uma mistura do isómero 2'-bromo-2'-desoxi-D-arabinosilo 15, tal como avaliado por ΧΗ RMN.

De uma maneira semelhante, mas utilizando os nucleosideos de purina correspondentes, são preparados os -seguintes derivados de 3'-bromo-3'-desoxi (14) e os seus 44 correspondentes L: 9-[2-0-Acetil-3-bromo-3-desoxi-5-0-(2,5,5-trimetil-l, 3-dioxolan-4-on-2-il)-β-D-xilofuranosil]-guanina, 9-[2-0-Acetil-3-bromo-3-desoxi-5-0-(2,5,5-trimetil-l, 3-dioxolan-4-on-2-il)-β-D-xilo-furanosil]-6-cloropurina, 9-[2-0-Acetil-3-bromo-3-desoxi-5-0-(2,5,5-trimetil-l,3-dioxolan-4-on-2-il)-β-D-xilo-furanosil]-2,6-dicloropurina, 9-[2-0-Acetil-3-bromo-3-desoxi-5-0-(2,5,5-trimetil-l, 3-dioxolan-4-on-2-il)-β-D-xilo-furanosil]-2-amino-6-cloropurina, 9-[2-0-Acetil-3-bromo-3-desoxi-5-0-(2,5,5-trimetil-l, 3-dioxolan-4-on-2-il)-β-D-xilo-furanosil]-6-metiltiopurina, 9-[2-0-Acetil-3-bromo-3-desoxi-5-0-(2,5,5-trimetil-l, 3-dioxolan-4-on-2-il)-β-D-xilo-furanosil]-6-metoxipurina, 9-[3-0-Acetil-2-bromo-2-desoxi-5-0-(2,5,5-trimetil-l, 3-dioxolan-4-on-2-il)-β-D-arabino-furanosil] guanina, 9-[3-0-Acetil-2-bromo-2-desoxi-5-0-(2,5,5-trimetil-l, 3-dioxolan-4-on-2-il)-β-D-arabino-furanosil]-6-cloropurina, 9-[3-0-Acetil-2-bromo-2-desoxi-5-0-(2,5,5-trimetil-l, 3-dioxolan-4-on-2-il)-β-D-arabino-furanosil] -2, 6-dicloropurina, 9-[3-0-Acetil-2-bromo-2-desoxi-5-0-(2,5,5-trimetil-l, 3-dioxolan-4-on-2-il)-β-D-arabino-furanosil]-2-amino-6-cloropurina, 9-[3-0-Acetil-2-bromo-2-desoxi-5-0-(2,5,5-trimetil-l, 3-dioxolan-4-on-2-il)-β-D-arabino-furanosil]-6-metiltiopurina e 9-[3-0-Acetil-2-bromo-2-desoxi-5-0-(2,5,5-trimetil-l, 3-dioxolan-4-on-2-il)-β-D-arabino-furanosil]-6-metoxipurina. Exemplo 16 45 2 ', 3 '-Anidroadenosina (18, Y = NH2, Z = Η) . A 9-[2-0-acetil-3-bromo-3-desoxi-5-0-(2,5,5-trimetil-1,3-dioxolan-4-on-2-il)-β-D-xilo-fiuanosil] adenina 14 (5,0 g, 0,01 mol) é tratada com metóxido de sódio a 1 M em metanol (20 ml), durante 1 hora à temperatura ambiente. A mistura é neutralizada com ácido acético glacial, e é mantida num frigorifico durante a noite. O 18 cristalino

depositado é recolhido por filtração, 2,1 g (84%). O espectro de ΧΗ RMN desta amostra é idêntico ao preparado por um procedimento alternativo por Mendez, E. et al., J. Virol. 1998, 72, 4737.

De uma maneira semelhante, mas utilizando os nucleosideos de purina correspondentes, são preparados os seguintes derivados de 2' ,3'-anidro-D-ribo (18) e os seus correspondentes L: 2 ' ,3'-anidroguanosina, 9-(2,S-anidro-β-D-ribofiuanosil]-6-metil-mercaptopurina e 9-(2,3-anidro-p-D-ribo-furanosil]-2-amino-6-metoxipurina.

Exemplo 17 9- ('3-Desoxi-3-iodo-/3-D-xiioíuranosil/) adenina (19, X = I, Y = NH2r Z = H) .

Uma mistura de 18 (Y = NH2, Z = Η, 1 g, 4 mmol) , de iodeto de sódio (1,5 g, 10 mmol), de acetato de sódio (100 mg) e de ácido acético (5 ml), em butanona (30 ml) é suavemente submetida a refluxo durante 3 horas. A evaporação do solvente sob vácuo, e a trituração do resíduo com água origina o 19 (X = I, Y = NH2, Z = H) , 1,2 g (80%). ΧΗ RMN (D6-DMSO) δ: 8,24, 8,34 (2s, 1H cada um, H-2 e H-8), 5,90 (d, 1H, Η-1 ' , J1' , 2 ' = 4,7 Hz), 4,96 (dd, 1H, H-2',

Jl\2'= 4,7, J2 ' , 3 ' = 4,9 Hz), 4,60 (dd, 1H, H-3\ J2 ' , 3 ' = 4,9, J3',4' = 4,7 Hz), 4,80 (d, 2H, H-5',5"), 4,40 (m, 1H, H-4 ' ) . 46

De uma maneira semelhante, mas usando os nucleosídeos de 2',3'-anidro-D-ribo purina (14) correspondentes, são preparados os seguintes nucleosideos de 3'-desoxi-3'-iodo-D-xilo e os seus correspondentes L: referência 9-(3-Desoxi-3-iodo-p-D-xilofuranosil) guanina, referência 9- (3-Desoxi-3-iodo-p-D-xilofuranosil)-6- metilmercaptopurina, referência 9- (3-Desoxi-3-iodo-p-D-xilofuranosil)-6- metoxipurina, referência 9-(3-Desoxi-3-iodo-p-D-xilofuranosil)-2-amino-6-metilmercaptopurina e referência 9-(3-Desoxi-3-iodo-p-D-xilofuranosil)-2-amino-6-metoxipurina.

Exemplo 18 3 '-Desoxiadenosina (20, Y = NH2, Z = H) .

Uma solução de 19 (Y = NH2, Z = H, 380 mg, 1 mmol) em metanol (75 ml) é agitada numa atmosfera de hidrogénio, na presença de 5% de catalisador PdBaSCU (100 mg) e de trietilamina (1 ml), à pressão inicial de 3 atm durante a noite. Após a remoção do catalisador, o solvente é evaporado sob vácuo, e o residuo é cristalizado a partir de metanol para se obter 3'-desoxiadenosina 20 (Y = NH2, Z = H) , 200 mg (80%). O espectro de RMN desta amostra é idêntico ao da cordicepina.

De uma maneira semelhante, mas utilizando os nucleosideos de 3'-iodo-D-xilo purina (19) correspondentes, são preparados os seguintes 3'-desoxi-nucleosideos e os seus correspondentes L: 9- (3-desoxi^-D-eritropentofuranosil) guanina, 9-(3-desoxi-3-D-eritropentofuranosil)-purina, 9-(3-desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-6-metoxipurina, 47 9- (3-desoxi^-D-eritropentofuranosil)-2-amino-purina e 9-(3-desoxi^-D-eritropentofuranosil)-2-amino-6-metoxipurina. (Referência) Exemplo 19 3- (β-D-Ribofuranosil)-8-azaxantina (24, X = OH, Y = N). A uma solução de 5-nitrouridina (300 mg) em DMF (60 ml) é adicionada azida de sódio (100 mg), e a mistura é agitada durante a noite à temperatura ambiente. O solvente é removido sob vácuo, e o resíduo é dissolvido numa quantidade mínima de água quente, e o pH é ajustado para 3-4 com ácido clorídrico diluído. Os precipitados são recristalizados a partir de água, pf 164-166 °C (dec). Análise calculada para C9H11N5O6H2O: C, 35, 64, H, 4,29, N, 23,1. Encontrado: C, 35,96, H, 4,01, N, 23,43. (Referência) Exemplo 20 1,2-0-Isopropilideno-5-0-metoxicarbonil-3-0-fenoxitiocarbonil-a-D-xilofuranose (26, R = Ph) . A uma solução de l,2-0-isopropilideno-5-0-metoxicarbonil-a-D-xilofuranose (25, 25,0 g, 0,1 mol) e 4-dimetilaminopiridina (25 g, 0,2 mol) em piridina seca (250 ml), é adicionada gota a gota uma solução de clorotionoformato de fenilo (50 g, 0,3 mol) em acetonitrilo (100 ml), e a mistura de reação é agitada a 50-60 °C durante 24 horas. A solução é concentrada sob vácuo, e o resíduo é repartido entre cloreto de metileno e água. A camada orgânica é lavada sucessivamente com água, 0,1 N de hidróxido de sódio, água, 0,1 N de ácido clorídrico, e água, e seca sobre sulfato de sódio, e concentrada em vácuo para dar o 26 (R = Ph) como um xarope com rendimento quantitativo (38,2 g) . Este xarope é utilizado diretamente na etapa seguinte. 48 (Referência) Exemplo 21 3-Desoxi-l,2-0-isopnopilideno-5-0-metoxicarbonil-a-D-eritropentofuranose (27) .

Uma solução de hidreto de tri-n-butilo de estanho (58 g, 0,2 mol) em tolueno (300 ml), é adicionada ao longo de um período de 3 horas a uma solução sob refluxo do composto 26 (R = Ph) anterior (19,2 g, 50 mmol) e 2,2'- azobisisobutironitrilo (2,5 g, 15 mmol) em tolueno (400 ml) . A mistura é concentrada sob vácuo, e o resíduo é dissolvido em acetonitrilo (300 ml), e a solução é extraída com éter de petróleo (4 x 100 ml) para remover os derivados de tri-n-butilo de estanho. A camada de acetonitrilo é concentrada. A cromatografia em camada fina do resíduo mostra uma mancha principal, e o espectro de 1H RMN indica a presença de três grupos metilo e nenhuns protões aromáticos, mas contaminação de uma pequena quantidade de derivados de butilo de estanho. Sem posterior purificação, este produto é utilizado na etapa seguinte. (Referência) Exemplo 22 1,2-Di-0-acetil-3-desoxi-5-0-metoxicarbonil-D-eritropentofuranose (28) . A uma solução agitada de 23 (2,32 g, 0,01 mol) numa mistura de ácido acético (60 ml) e de anidrido acético (6 ml), é adicionado gota a gota ácido sulfúrico concentrado (3 ml) com arrefecimento com gelo, a uma velocidade tal que a temperatura é mantida a 15-25 °C. Depois de repousar durante a noite à temperatura ambiente, é adicionado gelo (250 g) à solução, e em seguida a mistura é extraída com cloreto de metileno (3 x 50 ml). Os extratos combinados são lavados com uma solução saturada de bicarbonato de sódio (3 x 30 ml), secos sobre sulfato de sódio, e concentrados em 49 vácuo para dar o 28 (2,8 g, 100%) como uma mistura anomérica. Este composto é suficientemente puro para ser utilizado na etapa seguinte sem purificação adicional. (Referência) Exemplo 23 1-(2-0-acetil-3-desoxi-5-0-metoxicarbonil-β-D-eritropentofuranosil)-5-fluorouracilo (29, X = OH, Z = F).

Uma mistura de 5-fluorouracilo (2,6 g, 0,02 mol) , sulfato de amónio (ca. 30 mg) em hexametildisilazano (15 ml) é submetida a refluxo até ser obtida uma solução transparente. O solvente é removido sob vácuo, e o residuo é dissolvido em 1,2-dicloroetano (20 ml), e é adicionada 1,2-di-0-acetil-3-desoxi-5-0-metoxicarbonil-D-eritropentofuranose (28, 5,5 g, 0,02 mol) em 1,2- dicloroetano (20 ml) . É adicionado à solução tetracloreto de estanho (5,2 g, 0,02 mol), e a mistura é agitada durante a noite à temperatura ambiente, em seguida é aquecida durante 3 horas a 40-50 °C, durante 3 horas. É adicionada uma solução saturada de bicarbonato de sódio (40 ml), e agitada até cessar a evolução de dióxido de carbono. A mistura é filtrada através de uma almofada de Celite. A camada orgânica é separada, lavada cuidadosamente com uma solução saturada de bicarbonato de sódio (20 ml x 2) e água (20 ml x 2), seca sobre sulfato de sódio, e concentrada até à secura sob vácuo. O residuo é cristalizado a partir de etanol para se obter o 29 (4,3 g, 62%).

De uma maneira semelhante, mas utilizando as bases de purina correspondentes, são preparados os seguintes 2 ',5' — di-O-acetil 3'-desoxi-nucleosideos e os seus correspondentes L: 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-N6-benzoíladenina, 50 1- (2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-eritropentofuranosil) -6-cloropurina, 1- (2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-2, 6-dicloropurina, 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-2-acetamido-6-cloropurina, 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi^-D-eritropentofuranosil)-2-acetamido-6-metoxipurina, 1-(2,5-Di-0-acetil-3-desoxi^-D-eritropentofuranosil)-6-metoxipurina e 1- (2,5-Di-0-acetil-3-desoxi^-D-eritropentofuranosil) -6-metilmercaptopurina. (Referência) Exemplo 24 1 - (2-0-acetil-3-desoxi -δ-Ο-πίθίοχίσάτόοηϊΙ-β-Ό-eritropentofuranosil)-6-cloropurina (30, X = Cl, Y = H).

Uma mistura de 6-cloropurina (3,1 g, 0,02 mol), sulfato de amónio (ca. 30 mg) em hexametildisilazano (25 ml) , é submetida a refluxo até ser obtida uma solução transparente. O solvente é removido sob vácuo, e o residuo é dissolvido em 1,2-dicloroetano (30 ml), e é adicionada 1,2-di-0-acetil-3-desoxi-5-0-metoxicarbonil-D-eritropentofuranose (28, 5,5 g, 0,02 mol) em 1,2- dicloroetano (20 ml) . É adicionado à solução tetracloreto de estanho (5,2 g, 0,02 mol), e a mistura é agitada durante a noite à temperatura ambiente, em seguida é aquecida durante 3 horas a 40-50 °C, durante 3 horas. É adicionada uma solução saturada de bicarbonato de sódio (50 ml) , e agitada até cessar a evolução de dióxido de carbono. A mistura é filtrada através de uma almofada de Celite. A camada orgânica é separada, lavada cuidadosamente com uma solução saturada de bicarbonato de sódio (30 ml x 2) e água 51 (30 ml x 2), seca sobre sulfato de sódio, e concentrada até à secura sob vácuo. O resíduo é cristalizado a partir de etanol para se obter o 30 (4,3 g, 62%).

De uma maneira semelhante, mas utilizando as bases de purina correspondentes, são preparados os seguintes 2',5'-protegidos 3'-desoxi-nucleosídeos e os seus correspondentes L: 1-(2-0-Acetil-3-desoxi-5-0-metoxicarbonil-p-D-eritropentofuranosil)-N6-benzoíladenina, 1-(2-0-Acetil-3-desoxi-5-0-metoxicarbonil^-D-eritropentofuranosil)-6-cloropurina, 1-(2-0-Acetil-3-desoxi-5-0-metoxicarbonil^-D-eritropentofuranosil)-2,6-dicloropurina, 1-(2-0-Acetil-3-desoxi-5-0-metoxicarbonil-p-D-eritropentofuranosil)-2-acetamido-6-cloropurina, 1-(2-0-Acetil-3-desoxi-5-0-metoxicarbonil-p-D-eritropentofuranosil)-2-acetamido-6-metoxipurina, 1-(2-0-Acetil-3-desoxi-5-0-metoxicarbonil-p-D-eritropentofuranosil)-6-metoxipurina e 1-(2-0-Acetil-3-desoxi-5-0-metoxicarbonil-p-D-eritropentofuranosil)-6-metilmercapto-purina. (Referência) Exemplo 25 1,2-0-Isopropilideno-5-O-t-bulildifenilsilil-a-D-xilofuranose (31).

Uma mistura de 1,2-0-isopropilideno-a-D-xilofuranose (38,0 g, 0,2 mol) , t-butil-difenilclorosilano (70 g, 0,25 mol) e imidazol (21,5 g, 0,4 mol) em i\7,i7-dimetilformamida (50 ml) é agitada à temperatura ambiente durante 1 hora. O solvente é removido sob vácuo, e o resíduo é dissolvido em acetato de etilo (1 L), e extraído com água (300 ml x 2) e uma solução salina (300 ml), seco sobre sulfato de sódio, e 52 concentrado até à secura sob vácuo para dar o 31 em bruto (86 g, 100%), que é utilizado diretamente na etapa seguinte sem purificação adicional. (Referência) Exemplo 26 1,2-0-1sopropilideno-3-0-mesil-5-0-t-butildifenilsilil-a-D-xilofuranose (32, R = Ms). É adicionado gota a gota cloreto de mesilo (17 g, 0,15 mol) a uma solução de 31 em bruto (43 g, 0,1 mol) em piridina (100 ml), e a mistura é mantida em repouso durante a noite à temperatura ambiente. É adicionado à mistura gelo triturado (1 L) , e o produto é extraído com cloreto de metileno (300 ml x 3) . Os extratos são combinados, lavados com água (300 ml x 2) e uma solução salina (300 ml), secos sobre sulfato de sódio, e concentrados sob vácuo até à secura. São removidos os vestígios de piridina por destilação azeotrópica com tolueno repetida. O resíduo é dissolvido em cloreto de metileno (500 ml), e lavado com ácido clorídrico a 0,1 N (250 ml x 2) e água, seco sobre sulfato de sódio, e concentrado até à secura para dar origem ao 32 em bruto (R = Ms), 50,1 g (99 %). O espectro de ΧΗ RMN deste material é suficientemente puro para ser utilizado diretamente na etapa seguinte. (Referência) Exemplo 27

Metil-3-0-mesil-5-0-t-butildifenilsilil-D-xilofuranosida (33, R = Ms) .

Uma solução de 32 em bruto (50 g, 0,1 mol) em 1% de cloreto de hidrogénio metanólico anidro (1 L) é mantida durante a noite à temperatura ambiente, e depois evaporada sob vácuo até um xarope, o qual é repartido entre água (100 ml) e cloreto de metileno (150 ml) . A camada orgânica é separada, lavada com água (100 ml), seca sobre sulfato de 53 sódio e concentrada sob vácuo, dando o 33 em bruto, um xarope, pesando 48 g (100%) . Este material não é mais purificado, mas utilizado diretamente na etapa seguinte. (Referência) Exemplo 28 2,3-Anidro-5-0-t-butildifenilsilil-D-ribofuranosido de metilo (34) . O 33 em bruto (48 g, 0,1 mol) é dissolvido em cloreto de metileno (100 ml), e tratado com metóxido de sódio metanólico a 2 M (60 ml), e submetido a refluxo durante 2 horas. O sal insolúvel é removido por filtração, e o filtrado é concentrado sob vácuo até à secura. O residuo é dissolvido em cloreto de metileno (150 ml), lavado com água (100 ml x 2), seco sobre sulfato de sódio, e concentrado até à secura para dar origem ao 30 em bruto (38 g, 100%), o qual pode ser utilizado diretamente na etapa seguinte sem purificação. (Referência) Exemplo 29 3-Desoxi-3-iodo-5-0-t-butildifenilsilil-D-ribofuralosideo de metilo (35, X = I).

Uma mistura de 34 (38 g, 0,1 mol), de iodeto de sódio (60 g, 0,4 mol), de acetato de sódio (0,6 g) e de ácido acético (70 ml) em acetona (500 ml), é aquecida sob refluxo durante 8 horas. A acetona é removida sob vácuo, e o residuo é repartido entre cloreto de metileno (500 ml) e água (250 ml). A camada orgânica é separada, lavada com 250 ml de cada vez de água, uma solução de 0,1 M de tiossulfato de sódio, água, e seca sobre sulfato de sódio. Após a remoção do solvente sob vácuo, o residuo é cristalizado a partir de etanol para se obter 31 g (60,5%) de 35 (X = I) . (Referência) Exemplo 30 3-Desoxi-5-O-t-butilfenilsilil-D-eritropentofuranosideo de 54 metilo (37, a partir de 35) . 0 composto 35 (X = I, 25,6 g, 0,05 mol) é hidrogenado em acetato de etilo (250 ml) com 5% de paládio sobre carvão (2 g) . Após o consumo de hidrogénio ter cessado, a mistura é filtrada, e o filtrado é lavado com água (150 ml x 2), seco sobre sulfato de sódio, e concentrado até à secura para dar origem ao 37 em bruto (19 g, rendimento quantitativo) , que é suficientemente puro para ser utilizado diretamente na etapa seguinte. (Referência) Exemplo 31 3-Desoxi-5-0-t-butildifenilsilil-D-eritropentofuranosídeo de metilo (36, a partir de 34) .

Uma suspensão de hidreto de litio e alumínio (8,4 g, 0,2 mol) em éter etílico seco (220 ml) é agitada sob atmosfera de azoto, e arrefecida num banho de gelo. A esta suspensão é adicionada gota a gota uma solução de 34 (19 g, 0,05 mol) em tetrahidrofurano seco (250 ml), a uma velocidade tal que a temperatura permanece abaixo de 25 °C. Depois de 2 horas, é carregada mais 1 g de hidreto de litio e alumínio, e a mistura é agitada durante a noite à temperatura ambiente. A mistura agitada é arrefecida num banho de gelo, e é adicionado gota a gota isopropanol (100 ml) , seguido de acetona (50 ml) . A mistura é concentrada sob vácuo, e o resíduo é repartido entre éter etílico (250 ml) e água (150 ml) . Os materiais insolúveis são filtrados através de uma almofada de Celite, que é lavada com éter. A camada de éter é separada, lavada sucessivamente com ácido clorídrico a 0,2 N (150 ml x 2) e água (150 ml x 2), seca sobre sulfato de sódio, e em seguida concentrada até à secura para dar origem ao 36 em bruto (16,5 g, 87%). (Referência) Exemplo 32 55 3-Desoxi-D-eritropentofuranosideo de metilo (38). A uma solução de 36 em bruto (13 g, 0,03 mol) em tetrahidrofurano (320 ml) é adicionada gota a gota uma solução a 1 M de fluoreto de trietilamónio de hidrogénio (100 ml), e a mistura é agitada durante 24 horas. A mistura é concentrada sob vácuo, e o resíduo é dissolvido em água (200 ml). É adicionado carbonato de cálcio em pó (20 g), e a mistura é agitada durante a noite à temperatura ambiente, e em seguida filtrada. O filtrado é concentrado sob vácuo até um xarope, que é dissolvido em clorofórmio (200 ml), filtrado, e evaporado sob vácuo para proporcionar o 38 em bruto (4,5 g, 100%) . (Referência) Exemplo 33 1,2,5-Tri-0-acetil-3-desoxi-D-eritropentofuranose (38). A uma mistura agitada vigorosamente de 3-desoxi-D-eritropentofuranosídeo de metilo 37 em bruto (4,5 g, 0,03 mol) e de ácido acético (80 ml) é adicionado anidrido acético (40 ml), seguido por ácido sulfúrico (4 ml), e a mistura de reação é agitada durante a noite à temperatura ambiente. A mistura é repartida entre cloreto de metileno (150 ml) e água gelada (400 ml) . A camada de água é extraída com cloreto de metileno (100 ml x 2) . As camadas orgânicas combinadas são lavadas duas vezes com volumes iguais de uma solução saturada de bicarbonato de sódio, uma vez com água, secas sobre sulfato de sódio, e concentradas até à secura sob vácuo. São removidos os vestígios de ácido acético através de várias destilações azeotrópicas com tolueno para dar origem ao 38 em bruto (5,1 g, 66%) . O espectro de 1H RMN mostra que o principal constituinte deste produto contém 3 grupos acetilo, e é o β-anómero. (Referência) Exemplo 34 56 1- (Β-ΟθΞοχϊ-β-ΰ-θΓΪίΓορθηίοίιΐΓάηοΞίΙ) -5-fluorouracilo (3 ' -desoxi-5-fluorouridina, 6b, X = OH, R = F).

Uma mistura de um derivado de acetilo de 39 (X = OH, Z = F, 3,3 g, 0,01 mol) e de trietilamina (3 ml) em metanol (100 ml), é agitada durante a noite à temperatura ambiente. A mistura é concentrada sob vácuo até à secura, e o residuo é cristalizado a partir de etanol para se obter a 3'-desoxi-5-fluorouridina (2,0 g, 83%), pf 169-171 °C. 1H RMN (D6-DMSO) δ: 11,7 (bs, 1H, N3-H, permutável), 8,44 (d, 1H, H-6, Je,F = 7,1 Hz), 5,7 (d, 1H, 2'-OH, permutável), 5,5 (m estreito, 1H, H-l'), 5,3 (t, 1H, 5'-OH, permutável), 4,1- 4,5 (m, 2H, H-2' e H-4') , 3,5-3,9 (m, 2H, H-5',5"), 1,6-2,2 (m, 2H, H-3',3").

De uma maneira semelhante, mas usando o nucleosideo de 2',5'-di-O-acetilo purina correspondente, são preparados os seguintes 3'-desoxi-nucleosideos e os seus correspondentes L: 1- (3-Desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-2-cloroadenina, 1-(3-Desoxi^-D-eritropentofuranosil)-6-cloropurina, 1-(3-Desoxi^-D-eritropentofuranosil)-2,6-dicloropurina, 1-(3-Desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-2-acetamido-6-cloropurina, 1- (3-Desoxi^-D-eritropentofuranosil)-2-acetamido-6-metoxipurina, 1-(3-Desoxi-p-D-eritropentofuranosil)-6-metoxipurina e 1- (3-Desoxi^-D-eritropentofuranosil) -6-metilmercaptopurina. (Referência) Exemplo 35 1- (2, S-Di-O-acetil-d-O-mesil-je-D-xiloburanosil,) -5- fluorouracilo.

Uma mistura de 5-fluorouracilo (0,02 mol), sulfato de 57 amónio (ca. 30 mg) em hexametildisilazano (15 ml) é submetida a refluxo até ser obtida uma solução transparente. O solvente é removido sob vácuo, e o resíduo é dissolvido em 1,2-dicloroetano (20 ml), e é adicionada 1,2,5-tri-0-acetil-3-0-mesil-D-xilofuranose (5,5 g, 0,02 mol) em 1,2-dicloroetano (20 ml). É adicionado à solução tetracloreto de estanho (5,2 g, 0,02 mol), e a mistura é agitada durante a noite à temperatura ambiente, em seguida é aquecida durante 3 horas a 40-50 °C, durante 3 horas. É adicionada uma solução saturada de bicarbonato de sódio (40 ml), e agitada até cessar a evolução de dióxido de carbono. A mistura é filtrada através de uma almofada de Celite. A camada orgânica é separada, lavada cuidadosamente com uma solução saturada de bicarbonato de sódio (20 ml x 2) e água (20 ml x 2), seca sobre sulfato de sódio, e concentrada até à secura sob vácuo. O resíduo é cristalizado a partir de etanol para dar o produto do título (62%). O espectro de ^ RMN desta amostra é compatível com a estrutura indicada.

De uma maneira semelhante, mas utilizando as bases de purina correspondentes, são preparados os seguintes 2',5'-di-O-acetilo 3'-substituído xilo-nucleosídeos e os seus correspondentes L: 1-(2,5-Di-0-acetil-3-0-tosil-p-D-xilofuranosil)-N6-benzoíladenina, 1-(2,5-Di-0-acetil-3-0-tosil^-D-xilofuranosil)-6-cloropurina, 1-(2,5-Di-0-acetil-3-0-tosil-p-D-xilofuranosil)-2,6-dicloropurina, 1-(2,5-Di-0-acetil-3-0-tosil^-D-xilofuranosil)-2-acetamido-6-cloropurina, 1-(2,5-Di-0-acetil-3-0-tosil-p-D-xilopentofuranosil)-2- 58 acetamido-6-metoxipurina, 1- (2,5-Di-0-acetil-3-0-tosil^-D-xilopentofuranosil) -6-metoxipurina e 1- (2,5-Di-0-acetil-3-0-tosil^-D-xilofuranosil)-6-metilmercaptopurina. (Referência) Exemplo 36 1- (2,3,5-rrí-0-acetíi-/3-D-xíioíurar!osíl/) timina.

Uma mistura de timina (0,02 mol), sulfato de amónio (ca. 30 mg) em hexametildisilazano (15 ml) é submetida a refluxo até ser obtida uma solução transparente. O solvente é removido sob vácuo, e o residuo é dissolvido em 1,2-dicloroetano (20 ml), e é adicionada 1,2,3,5-tri-O-acetil-D-xilofuranose (5,5 g, 0,02 mol) em 1,2-dicloroetano (20 ml). É adicionado à solução tetracloreto de estanho (5,2 g, 0,02 mol), e a mistura é agitada durante a noite à temperatura ambiente, em seguida é aquecida durante 3 horas a 40-50 °C, durante 3 horas. É adicionada uma solução saturada de bicarbonato de sódio (40 ml), e agitada até cessar a evolução de dióxido de carbono. A mistura é filtrada através de uma almofada de Celite. A camada orgânica é separada, lavada cuidadosamente com uma solução saturada de bicarbonato de sódio (20 ml x 2) e água (20 ml x 2), seca sobre sulfato de sódio, e concentrada até à secura sob vácuo. O residuo é cristalizado a partir de etanol para dar o produto (4,3 g, 62%). O espectro de ΧΗ RMN desta amostra é compatível com a estrutura indicada.

De uma maneira semelhante, mas utilizando as bases de purina correspondentes, são preparados os seguintes 2',5'-di-O-acetilo 3'-substituído xilo-nucleosídeos e os seus correspondentes L: 1- (2,3,5-Tri-0-acetil^-D-xilofuranosil) -N6-benzoíladenina, 59 1-(2,3,5-Tri-0-acetil^-D-xilofuranosil)-6-cloropurina, 1-(2,3,5-Tri-0-acetil^-D-xilofuranosil)-2,6-dicloropurina, 1-(2,3, 5-Tri-0-acetil-3-D-xilofuranosil)-2-acetamido-6-cloropurina, 1-(2,3,5-Tri-0-acetil-p-D-xilopentofuranosil)-2-acetamido-6-metoxipurina, 1- (2,3,5-Tri-0-acetil-p-D-xilopentofuranosil)-6-metoxipurina e 1- (2,3,5-Tri-0-acetil-p-D-xiloftiranosil)-6-metilmercaptopurina. (Referência) Exemplo 37 1- (3-Desoxi-3-0-mesil-p-D-xilofuranosil) -5-fluorouracilo.

Uma mistura de 1-(2,5-di-0-acetil-3-0-mesil-p-D-xilofuranosil)-5-fluorouracilo (4,24 g, 0,01 mol) em amónia metanólica (100 ml) é agitada durante 30 minutos a 0 °C, e é concentrada sob vácuo até à secura, e o residuo é cristalizado a partir de etanol para dar o 1-(3-desoxi-3-0-mesil-p-D-xilofuranosil)-5-fluorouracilo (2,82 g, 83%). O 1H RMN (D6-DMSO) revelou que não há nenhum grupo acetilo, mas um grupo mesilo na molécula.

De uma maneira semelhante, mas utilizando os nucleosideos de 2',5'-di-O-acetilo purina, são preparados os seguintes 3'-O-mesil-nucleosideos e os seus correspondentes L: 1-(3-0-Mesil-p-D-xilofuranosil)-2-cloroadenina, 1-(3-0-Mesil-p-D-xilofuranosil)-6-cloropurina, 1-(3-0-Mesil-p-D-xilofuranosil)-2,6-dicloropurina, 1-(3-0-Mesil-p-D-xilofuranosil)-2-acetamido-6-cloropurina, 1-(3-0-Mesil-p-D-xilofuranosil)-2-acetamido-6-metoxipurina, 1-(3-0-Mesil-£-D-xilofuranosil)-6-metoxipurina e 1-(3-0-Mesil-£-D-xilofuranosil)-6-metilmercaptopurina. 60 (Referência) Exemplo 38 1-(β-D-Xilofuranosil)-5-fluorouracilo

Uma mistura de 1-(2,3,5-tri-0-acetil-p-D- xilofuranosil)-5-fluorouracilo (3,88 g, 0,01 mol) e de trietilamina (3 ml) em metanol (100 ml), é agitada durante a noite à temperatura ambiente. A mistura é concentrada sob vácuo até à secura, e o resíduo é cristalizado a partir de etanol para dar o 1-(β-D-xilo-furanosil)-5-fluorouracilo (2,0 g, 76%) . Os espectros de UV e de 1H RMN (Me2SO-d6) desta amostra são consistentes com a estrutura do produto.

De uma maneira semelhante, mas utilizando as bases de 2',5'-di-O-acetilo purina correspondentes, são preparados os seguintes xilo-nucleosídeos e os seus correspondentes L: 1-(β-D-Xilofuranosil)-2-cloroadenina, 1- (β-D-Xilofuranosil)-6-cloropurina, 1- (β-D-Xilofuranosil)-2,6-dicloropurina, 1-(β-D-Xilofuranosil)-2-acetamido-6-cloropurina, 1-(β-D-Xilofuranosil)-2-acetamido-6-metoxipurina, 1-(β-D-Xilofuranosil)-6-metoxipurina e 1-(β-D-Xilofuranosil)-6-metilmercaptopurina. VIII Métodos biológicos

Esta divulgação proporciona ainda um processo eficaz para quantificar a carga virai num hospedeiro, utilizando uma reação quantitativa de polimerização em cadeia de transcriptase reversa em tempo real ("Q-RT-PCR"). 0 processo envolve a utilização de uma molécula de sonda fluorescente extinta, que pode ser hibridada com um alvo de ADN ou ARN virai. Por conseguinte, mediante a degradação exonucleolítica pode ser monitorizado um sinal detetável de fluorescência. Portanto, o ADN ou ARN amplificado por RT-PCR pode ser detetado em tempo real, por monitorização da 61 presença de sinais de fluorescência.

Numa realização especifica da divulgação, é proporcionada a utilização de RT-PCR para quantificar a carga virai de um virus Flaviviridae.

Numa realização mais especifica, é proporcionada a utilização de RT-PCR para quantificar a carga virai de VDVB numa linha celular MDBK, ou uma amostra de hospedeiro.

Numa realização adicional da divulgação, é proporcionada uma molécula de sonda concebida para apresentar fluorescência mediante a degradação exonucleolítica, e para ser complementar à região NS5B NADL VDVB.

Numa realização mais especifica da divulgação, é proporcionada uma molécula de sonda com uma sequência de 5' 6-fam-AAATCCTCCTAACAAGCGGGTTCCAGG-tamara 3' (sequência ID n° 1), e oligonucleotideos iniciadores com uma sequência de sentido: 5'-AGCCTTCAGTTTCTTGCTGATGT-3'(sequência ID n° 2), e de anti-sentido: 5'-TGTTGCGAAAGCACCAACAG-3' (sequência ID n° 3) .

Numa realização especifica da divulgação, é proporcionada a utilização de RT-PCR para quantificar a carga virai de VHC numa amostra derivada de hospedeiro, ou uma linha celular, em tempo real.

Numa realização mais especifica da divulgação, é proporcionada a utilização de RT-PCR, uma molécula de sonda concebida para apresentar fluorescência mediante a degradação exonucleolitica, e ser complementar do genoma de VHC.

Numa realização mais especifica da divulgação, é proporcionada a utilização de RT-PCR, uma molécula de sonda concebida para apresentar fluorescência mediante a 62 degradação exonucleolítica, e para ser complementar à região 5' não traduzida de VHC.

Numa realização mais especifica da divulgação, é proporcionada uma molécula de sonda com uma sequência de 5' 6-fam-CCTCCAGGACCCCCCCTCCC-tamara 3' (sequência ID n° 4), e oligonucleotideos iniciadores com uma sequência de sentido: 5'-AGCCATGGCGTTAGTA(T/C)GAGTGT-3'(sequência ID n° 5), e de anti-sentido: 5'-TTCCGCAGACCACTATGG-3' (sequência ID n° 6). A. Isolamento de ARN e análise quantitativa de RT-PCR É divulgado um processo eficaz para quantificar a carga virai num hospedeiro, denominado por reação de polimerização em cadeia em tempo real ("RT-PCR"). 0 processo envolve a utilização de uma molécula de sonda fluorescente extinta, que pode ser hibridada com o ADN ou o ARN virai. Por conseguinte, mediante a degradação exonucleolítica pode ser monitorizado um sinal detetável de fluorescência. Portanto, o ADN ou o ARN amplificado por RT-PCR é detetado em tempo real, por monitorização da presença de sinais de fluorescência.

o ADN

Como uma ilustração deste método, no caso de VDVB em células MDBK, numa primeira etapa, o ARN virai é isolado a partir de 140 μΐ de sobrenadante da cultura celular por meio de uma coluna comercialmente disponível (kit de extração de ARN virai, QiaGen, CA) . O ARN virai é então eluído da coluna para se obter um volume total de 60 μΐ, e subsequentemente amplificado com um protocolo de RT-PCR quantitativa, utilizando um oligonucleotídeo iniciador adequado para a estirpe NADL VDVB. Uma molécula de sonda fluorescente extinta é hibridada com o ADN de VDVB, o qual sofre em seguida degradação exonucleolítica, resultando num sinal detetável de fluorescência. Portanto, 63 amplificado por RT-PCR foi detetado em tempo real, por monitorização da presença de sinais de fluorescência. A molécula de sonda TaqMan (5'-6-fam-AAATCCTCCTAACAAGCGGGTTCCAGG-tamara 3'[sequência ID n° 1], e os oliqonucleotideos iniciadores (sentido: 5'-AGCCTTCAGTTTCTTGCTGATGT-3' [sequência ID n° 2], e anti-sentido: 5'-TGTTGCGAAAGCACCAACAG-3' [sequência ID n° 3]) foram concebidos com o auxilio do programa Primer Express (PE-Applied Biosystems), para serem complementares à reqião NS5B NADL VDVB. Um total de 10 μΐ de ARN foi analisado em 50 μΐ de uma mistura de RT-PCR. Os reaqentes e as condições utilizadas na PCR quantitativa foram adquiridos a partir de PE-Applied Biosystems. A curva padrão que foi criada utilizando o inoculo de vírus não diluído variou de 6000 unidades formadoras de placas (UFP) a 0,6 UFP por mistura de RT-PCR. Foi obtida rotineiramente uma qama linear de mais de 4 logs.

Pode ser adotada uma abordagem semelhante para medir a quantidade de outros Flaviviridae (mais importante, o VHC, o VFA, o dengue, o virus do Nilo Ocidental e outros) numa amostra clinica, ou numa amostra de cultura de tecido. Por exemplo, a combinação da purificação de ARN de VHC com a RT-PCR em tempo real, utilizando os seguintes oligonucleotideos iniciadores (5'-TTCCGCAGACCACTATGG-3' [sequência ID N° 4], e 5'-AGCCATGGCGTTAGTATGAGTGT-3' [sequência ID N° 5]), e sonda (5'-6-fam-CCTCCAGGACCCCCCCTCCC-tamara-3' [sequência ID N° 6]), resultou num intervalo linear de 7 log de deteção de carga virai. B. Materiais celulares / virais

Um dos membros mais bem caracterizados do género 64 pestivírus é o VDVB. 0 VDVB e o VHC partilham pelo menos, três caracteristicas comuns, que são as seguintes: (1) ambos sofrem tradução mediada por IRES, (2) o cofator NS4A é necessário pela sua NS3 protease serina, e (3) sofrem processamento semelhante por poliproteina dentro da região não estrutural, especialmente no local de junção de NS5A e NS5B. 0 sistema de replicação de VDVB foi utilizado para a descoberta dos compostos anti-Flaviviridae. Os compostos aqui descritos são ativos contra pestivírus, hepacivírus e/ou flavivírus.

As células de rim de bovino de Maldin-Darby (MDBK) foram cultivadas e mantidas em meio de Eagle modificado (DMEM/F12, GibcoBRL), suplementado com 10% de soro de cavalo inativado pelo calor, a 37 °C, num incubador humidificado, a 5% de CO2. A estirpe NADL do vírus da diarreia virai bovina (VDVB) provoca um efeito citopatogénico (CPE) após a infeção destas células. C. Ensaio antiviral

As células MDBK, cultivadas em DMEM/F12 - 10% de soro de cavalo (HS), foram isoladas com técnicas convencionais utilizando tripsina-EDTA. As células foram plaqueadas numa placa de 96 poços a 5xl04 células/poço, com o composto de teste (concentração de 20 micromolar (μΜ) ) , para dar um volume total de 100 microlitros (μΐ). Após uma hora o meio foi removido, e as células foram infetadas a uma multiplicidade de infeção (MOI) de 0,02 ou 0,002, num volume total de 50 μΐ, durante 45 minutos. Em seguida o vírus foi removido, e as células foram lavadas duas vezes com 100 μΐ de meio de ensaio. Finalmente, as células 65 infetadas foram incubadas num volume total de 100 μΐ, contendo o composto de teste a 10, 40 ou 100 μΜ de concentração. Após 22 horas o sobrenadante celular foi recolhido, por remoção dos detritos celulares por centrifugação a baixa velocidade, e subsequentemente testado para a presença de virus de uma maneira quantitativa. D. Testes de citotoxicidade de compostos anti-Flaviviridae candidatos O teste de citotoxicidade tal como aqui realizado é uma técnica padrão. Resumidamente, as células são plaqueadas em placas de 96 poços a várias concentrações (dependendo do tipo de célula, da duração do ensaio), tipicamente a 5xl03 células por poço, na presença de concentrações crescentes do composto de teste (0, 1, 3, 10, 33 e 100 μΜ) . Depois de um período de três dias de incubação, são medidas a viabilidade celular e a atividade mitocondrial pela adição do corante MTS (Promega), seguido por uma incubação de 3 horas. Em seguida as placas contendo o corante são lidas a 490 nm. Tais metodologias estão bem descritas e disponíveis a partir do fabricante (Promega). Exemplo 53

A curva padrão de quantificação RT-PCR de VDVB 0 stock de vírus VDVB padrão continha 2xl06 UFP/ml, tal como determinado por ensaio de placas de rotina (Mendez, E. et al., J. Virol. 1998, 72, 4737). O ARN virai foi extraído a partir de 140 μΐ deste material inoculo, e eluído de uma coluna utilizando 60 μΐ de um tampão de eluição. Este material de ARN purificado foi em seguida diluído por passos de 10_1 a 10“5. Usando a técnica de amplificação RT-PCR em tempo real, foram testados 10 μΐ de 66 cada diluição. A partir desta experiência é evidente que esta tecnologia permite a quantificação fiável ao longo de 4-logs de virus (de 6000 a 0,6 UFP/entrada na mistura de amplificação) . O limite inferior de deteção nesta experiência é de 0,6 UFP ou -0,22 log UFP. Portanto, os valores de quantificação RT-PCR em tempo real de amostras de teste abaixo deste limite de deteção foram considerados não fiáveis.

Exemplo 54

O ciclo de replicação de VDVB em células MDBK A fim de medir a produção de VDVB em células MDBK, e para determinar o tempo ótimo de colheita ao longo de um certo periodo de tempo, as células foram plaqueadas a 5xl04 células/poço, e infetadas quer com MOI = 0,02 ou com MOI = 0,002. Após a infeção o inoculo foi removido, e as células foram lavadas duas vezes com meio de cultura. A pontos diferentes no tempo foi recolhido o sobrenadante de células, e a quantidade de vírus foi medida e comparada com o inoculo original e com a lavagem de células. Foram necessárias pelo menos 2 etapas de lavagem para remover o inoculo de vírus. A quantidade de vírus produzido 22 horas após a infeção, iguala aproximadamente a quantidade de vírus utilizada para inocular as células. Com base nestes resultados, o tempo necessário para um ciclo de replicação de VDVB em células MDBK foi de 22 horas. Note-se que o nível de deteção definido nestas experiências foi baseado no limite inferior de deteção, tal como determinado pela curva padrão.

Exemplo 55

Avaliação de compostos antivirais candidatos utilizando RT-PCR 67

As células MDBK foram plaqueadas a 5xl04 células/poço, infetadas com VDVB com uma multiplicidade de infeção (MOI) igual a 0,02, e cultivadas durante 22 horas na presença de um composto de teste. As células que não foram tratadas com um composto de teste foram consideradas um controlo negativo, enquanto que a ribavirina serviu como um controlo positivo. O ARN virai foi extraído e analisado por RT-PCR em tempo real. Uma experiência típica demonstra que o controlo negativo e a maioria das células tratadas produziu quantidades comparáveis de vírus (entre 1,5 e 2 log UFP/entrada), mostrando de forma eficaz os compostos de teste como não ativos. No entanto, as células tratadas com o controlo positivo, a ribavirina (RIB) ou com a 5-hidroxiundina (β-D-CL) não reivindicada, mostram uma quase completa ausência de ARN virai. A RIB e a β-D-CL não reivindicada, reduzem a produção virai por aproximadamente 2 log UFP, ou 99%, no período de reprodução de 22 horas. A potência exata destes compostos não pode ser deduzida a partir deste tipo de experiência, uma vez que o limite de deteção nesta experiência é fixado em -0,22 log UFP, e apenas ocorre um ciclo de replicação virai sob as condições experimentais especificadas.

As potências, ou o efeito de concentração dos compostos que inibe a produção de vírus em 50% ou 90% (valores de EC50 ou EC90, respetivamente) , de compostos anti-VDVB foram determinadas num conjunto semelhante de experiências, mas ao longo de uma ampla gama de concentrações dos compostos de teste (0, 1, 3, 10, 33, 100 μΜ) . O valor de EC90 refere-se à concentração necessária para obter uma redução de 1 log na produção virai, dentro de um período de 22 horas. Os compostos que demonstraram 68 uma atividade antiviral potente estão listados no Quadro 21. Este quadro apresenta a redução máxima da carga virai observada a uma dada concentração, 22 horas após a infeção.

Quadro 21: Carga virai de VDVB 22 horas após a infeção ID n conc. (μΜ) Redução média de log # β-D-DJ 1 40 1,58 β-D-DK 2 100 2,17 β-D-DL 2 100 1,33 # não reivindicado

Exemplo 56

Sistemas de cultura celular alternativos para determinar as atividades antivirais 0 ensaio descrito anteriormente pode ser adaptado para os outros membros Flaviviridae, alterando o sistema celular e o patogénico virai. As metodologias para determinar a eficácia destes compostos antivirais incluem modificações das técnicas padrão, tal como descrito por Holbrook, M. R. et al., Virus Res. 2000, 69 (1), 31; Markland, W. et al.,

Antimicrob. Agents. Chemother. 2000, 44 (4), 859; Diamond, M. S. et al., J. Virol. 2000, 74 (17), 7814; Jordan, I. et al., J. Infect. Dis. 2000, 182, 1214; Sreenivasan, V. et al., J. Virol. Methods 1993, 45 (1), 1, ou Baginski, S. G. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 2000, 97 (14), 7981, ou a tecnologia de RT-PCR em tempo real. Especificamente, pode ser usado um sistema de replicão de VHC em células HuH7 (Lohmann, V. el al., Science, 1999, 285 (5424), 110) ou modificações do mesmo (Rice et al., 2000, resumo Xth simpósio internacional para a hepatite virai e a doença hepática, Atlanta, GA). 69

Exemplo 58

Teste antiviral de compostos candidatos para vírus respiratórios

Durante o curso destas experiências foram testados compostos com a fórmula geral (I), para as suas atividades antivirais contra um conjunto de virus que infetam o trato respiratório superior. As metodologias utilizadas para estes fins estão bem descritas. Os seguintes protocolos são procedimentos operacionais padrão retirados do ramo de virologia da divisão de microbiologia e doenças infeciosas, MAID, NIH. A. Virus e linhas celulares utilizados no rastreio primário

(i) Influenza A e B

Estirpes de virus: A/Beijing/262/95 (H1N1) (fonte: CDC) , A/Sydney/05/97 (H3N2) (fonte: CDC), B/Beijing/184/93 (fonte: CDC).

Linha celular: rim canino de Maldin Darby (MDCK) (ii) Virus Sincicial Respiratório (VSR)

Estirpe de virus: A2 (fonte: ATCC).

Linha celular: células de rim de macaco verde Africano (MA-104) (iii) Virus da Parainfluenza Tipo 3

Estirpe de virus: 14702 (fonte: isolado 5/95 Boivin, Montreal, Canadá)

Linha celular: células de rim de macaco verde Africano (MA-104) B. Métodos para a atividade antiviral (i) Inibição do efeito citopático virai (CPE)

Este teste é executado em placas de micro titulação de 96 poços. Neste teste de inibição de CPE, serão adicionadas quatro diluições logio de cada composto de teste a 3 copos 70 contendo a mono-camada de células, dentro de 5 minutos é então adicionado o virus, e a placa selada, incubada a 37 °C, e o CPE é lido microscopicamente quando controlos não tratados infetados desenvolvem um CPE de 3 a 4 + (aproximadamente de 72 a 120 horas). Um fármaco de controlo positivo conhecido é avaliado em paralelo com o fármaco de teste em cada teste. Este fármaco é ribavirina para a influenza, sarampo, VSR e para-influenza. (ii) Aumento de absorção do corante Vermelho Neutro (VN) .

Este teste é executado para validar a inibição de CPE observada no teste inicial, e utiliza a mesma micro-placa de 96 poços após o CPE ter sido vermelho. É adicionado vermelho neutro ao meio, as células não danificadas por virus incorporam uma maior quantidade de corante, que é lido num leitor computorizado de micro-placas. É usado o método tal como descrito por McManus (Appl. Environment. Microbiol. 31: 35-38, 1976). É determinada uma EC50 a partir desta incorporação de corante. (iii) Teste de confirmação: CPE-visual e ensaio de rendimento de virus

Os compostos considerados ativos por inibição de CPE e pela incorporação do corante VN vão ser novamente testados, usando tanto a inibição de CPE como o efeito na redução do rendimento de virus. Os eluidos recolhidos do teste inicial são testados quanto ao titulo de virus, por diluição em série em mono-camadas de células suscetíveis. 0 desenvolvimento de CPE nestas células é indicativo da presença de virus infecioso. A EC90, que é o fármaco que inibe a produção de virus por 1-loq, é determinada a partir destes dados. O Quadro 23 resume os resultados de parte do ensaio 71 antiviral. 0 composto β-D-CL é um potente composto anti-VSR in vitro, com um índice de seletividade de 150. não reivindicado.

Quadro 23: Efeito antiviral em vírus respiratórios. Teste inicial, rastreio antiviral com vírus respiratórios por inibição de CPE (visual) β-ο-ου β-ϋ-ϋό# Influenza A (H1N1) EC50 (μΜ) > 5 > 500 SI** 0 0 Influenza A (H3N2) EC50 (μΜ) > 5 > 500 SI** 0 0 Influenza B EC50 (μΜ) > 5 50 SI** 0 > 10 VSR* EC50 (μΜ) 0,5 500 SI** 150 0 Vírus parainfluenza tipo 3 EC50 (μΜ) 90 > 500 SI** 0 0 Teste inicial, rastreio antiviral com vírus respiratórios por Vermelho Neutro β-ο-ου β-ϋ-ϋό# Influenza A (H1N1) EC50 (μΜ) 8 > 500 SI** 1,1 0 Influenza A (H3N2) EC50 (μΜ) > 5 > 500 SI** 0 0 Influenza B EC50 (μΜ) > 5 110 SI** 0 > 4,5 VSR* EC50 (μΜ) < 0,5 > 500 SI** > 170 0 Vírus parainfluenza tipo 3 EC50 (μΜ) 40 500 72 β-ϋ-οΐι# β-ϋ-ϋυ# SI** 1 > 1 *VSR: Virus Sincicial Respiratório A **SI: índice de Seletividade (IC50/EC90)

Exemplo 59

Teste antiviral de compostos candidatos para Flaviviridae A. 0 sistema de replicão de VHC em células Huh7.

As células Huh7 portadoras do replicão de VHC podem ser cultivadas em meio DMEM (glucose elevada, sem piruvato) contendo 10% de soro fetal bovino, IX de aminoácidos não essenciais, Pen-Strep-Glu (100 unidades/litro, 100 microgramas/litro, e 2,92 mg/litro, respetivamente), e 500 a 1000 microgramas/mililitro de G418. Os ensaios de rastreio antiviral podem ser feitos no mesmo meio sem a G418, como se segue: a fim de manter as células em fase logarítmica de crescimento, plaquear as células numa placa de 96 poços a uma densidade baixa, por exemplo de 1000 células por poço. Adicionar o composto de teste imediatamente após o plaqueamento das células, e incubar durante um periodo de 3 a 7 dias a 37 °C num incubador. O meio é então removido, e as células são preparadas para a extração total dos ácidos nucleicos (incluindo o replicão de ARN e o ARN hospedeiro) . O replicão de ARN pode então ser amplificado num protocolo de Q-RT-PCR, e quantificado em conformidade. As diferenças observadas na quantificação do replicão de ARN é uma maneira de expressar a potência antiviral do composto de teste. Uma experiência tipica demonstra que nas configurações do controlo negativo e dos compostos não ativos, é produzida uma quantidade comparável de replicão. Isto pode concluir-se, porque o limiar do 73 ciclo medido para o VHC por RT-PCR em ambas as configurações está perto um do outro. Em tais experiências, uma maneira de expressar a eficácia antiviral de um composto, é subtrair o limiar do ciclo de RT-PCR do composto de teste com o limiar médio do ciclo de RT-PCR do controlo negativo. Este valor é chamado de DeltaCt (ACt ou DCT) . Um ACt de 3,3 equivale a uma redução de 1-log (igual a EC90) na produção de replicão. Os compostos que resultam numa redução dos niveis de replicão de ARN de VHC de mais de 2 valores de ACt (redução de 75% do replicão de ARN) , são compostos candidatos para a terapia antiviral. Tais compostos candidatos são pertencentes a estruturas com a fórmula geral I-b, ou o seu enantiómero β-L. 0 Quadro 24 apresenta os valores médios de ACt (N = vezes testadas) que podem ser obtidos, se os compostos alvo são incubados do modo descrito durante 96 horas. Como controlo positivo, o interferão recombinante alfa-2a (Roferon-A, Hoffmann-Roche, New Jersey, EUA) é tomado juntamente como controlo positivo.

No entanto, este valor de ACt de VHC não inclui qualquer parâmetro de especificidade para o replicão codificado para a polimerase virai de ARN dependente de ARN. Numa configuração tipica, um composto poderia reduzir tanto a atividade da polimerase de ARN do hospedeiro, como a atividade da polimerase codificada por replicão. Assim, a quantificação de ARNr (ou qualquer outro produto de polimerase I de ARN do hospedeiro) , ou ARNm de beta-actina (ou qualquer outra polimerase II de ARN do hospedeiro), e a comparação com os niveis de ARN do controlo sem fármaco é uma medida relativa do efeito do composto de teste em polimerases de ARN do hospedeiro. 0 Quadro 24 também 74 ilustra os valores de ACt para o ARNr dos compostos de teste.

Com a disponibilidade tanto dos dados de ACt de VHC como de ACt de ARNr, pode ser introduzido um parâmetro de especificidade. Este parâmetro é obtido subtraindo os dois valores de ACt um do outro. Isto resulta em valores de Delta-DeltaCT (AACt ou DDCT), um valor superior a 0 significa que há mais efeito inibidor na polimerase codificada por replicão, um valor de AACt inferior a 0 significa que os níveis de ARNr do hospedeiro são mais afetados do que os níveis de replicão. A atividade antiviral dos compostos testados, expressa como valores de AACt, é dada no Quadro 24. Como regra geral, os valores de AACt acima de 2 são considerados como significativamente diferentes do tratamento controlo sem fármaco, e por conseguinte, exibe uma atividade antiviral significativa. No entanto, os compostos com um valor de AACt inferior a 2, mas mostrando poucos dados de citotoxicidade molecular (ACT de ARNr entre 0 e 2) , são também possiveis compostos ativos.

Numa outra configuração típica, um composto poderia reduzir a atividade da polimerase de ARN do hospedeiro, mas não a atividade da polimerase de ADN do hospedeiro. Assim, a quantificação de ADNr ou ADN de beta-actina (ou qualquer outro fragmento de ADN do hospedeiro) , e a comparação com os níveis de ADN do controlo sem fármaco é uma medida relativa do efeito inibidor do composto de teste sobre as polimerases de ADN celulares. 0 Quadro 25 ilustra os valores de ACt de ADNr dos compostos de teste.

Com a disponibilidade tanto dos dados de ACt de VHC como de ACt de ADNr, pode ser introduzido um parâmetro de 75 especificidade. Este parâmetro é obtido subtraindo os dois valores de ACt um do outro. Isto resulta em valores de AACt, um valor superior a 0 significa que há mais efeito inibidor na polimerase codificada por replicão, um valor de AACt inferior a 0 significa que os niveis de ADNr do hospedeiro são mais afetados do que os niveis de replicão. A atividade antiviral dos compostos testados, expressa como valores de AACt, é dada no Quadro 25. Como regra geral, os valores de AACt acima de 2 são considerados como significativamente diferentes do tratamento controlo sem fármaco, e por conseguinte, é um composto interessante para posterior avaliação. No entanto, os compostos com um valor de AACt inferior a 2, mas com citotoxicidade molecular limitada (ACT de ADNr entre 0 e 2), podem ser desejados.

Os compostos que resultam na redução especifica dos níveis do replicão de ARN de VHC, mas com reduções limitadas nos níveis de ARN celular e/ou de ADN, são compostos candidatos para a terapêutica antiviral. Foram detetados os compostos candidatos pela sua capacidade específica de reduzir o ARN de Flaviviridae (incluindo o VDVB e o VHC), e os compostos potentes (Quadros 21, 24 e 25) .

Quadro 24 ID n ACt médio de ARN de VHC ACt médio de ARNr AACt médio #β-Ό-Βϋ 1 6, 60 4, 99 1, 61 β-D-DH 3 4,13 2, 91 1,21 #β-D-DJ 5 3,51 3, 62 -0,11 IFN 4 5,21 0, 69 4,52 76 ribavirina 2 3, 13 2,35 0,78 # não reivindicado ID Quadro 25 n ACt médio de ARN de VHC ACt médio de ADNr AACt médio #p-D-DD 1 6, 60 3,30 3,30 β-D-DH 1 4,14 0,89 3,25 #β-D-DJ 1 4,84 2,70 2,14 # não reivindicado 77

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para a conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento de Patente Europeia. Embora tenha sido tomado muito cuidado na compilação das referências, não se poderão excluir erros e omissões e o IEP não assume qualquer responsabilidade neste sentido.

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Claims (5)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um composto com a fórmula geral [I-b]: x1

l.y R1' [l-b| ou o seu enantiómero β-L ou um sal f armaceuticamente aceitável do mesmo, em que: D é hidrogénio, W1 é CH, W2 é N, cada X1 e X2 é independentemente hidrogénio, halogéneo (F, Cl, Br ou I), NH2, NHR4, ou NR4R4, R2 é hidrogénio, halogéneo (F, Cl, Br ou I) ou OH, R2' é hidrogénio, Cl, Br, I ou OH, R3 é hidrogénio, halogéneo (F, Cl, Br ou I) ou OH, R3’ é hidrogénio, Cl, Br ou I, cada R4 e R4' é independentemente hidrogénio, alquilo de cadeia curta, alcenilo de cadeia curta, arilo, ou arilalquilo, de tal forma que para o nucleosideo com a fórmula geral (I-b) pelo menos um de R e R e hidrogénio, e pelo menos um de R3 e R3< é hidrogénio, em que "alquilo de cadeia curta" refere-se a um grupo alquilo Ci a C4 saturado, linear, ramificado, ou cíclico, 2 para utilização no tratamento ou profilaxia de infeções virais por Flaviviridae, desde que: o composto com a fórmula I-b não seja a 3'-desoxiadenosina, quando a utilização referida é o tratamento de doenças mediadas pelo virus da hepatite C, e o composto com a fórmula I-b não seja a 6-cloro-3'-desoxiguanosina, quando a utilização referida é um método para o tratamento ou prevenção de infeções por flavivirus num hospedeiro, compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de 6-cloro-3'-desoxiguanosina.

2. 0 composto para uso da reivindicação 1, no qual o nucleosideo β-D com a fórmula (I-b) é selecionado a partir de um dos seguintes: X1 X" W1 R* -R^~ RJ nh2 H CH H H H H Cl H CH F H H H nh2 H CH H OH H H Cl H CH H OH H H ou o seu enantiómero β-L ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

3. Um composto com a fórmula: 3

ou o seu aceitável profilaxia enantiómero β-L ou um sal farmaceuticamente do mesmo, para utilização no tratamento ou de infeção virai por Flaviviridae.

4. Um composto com a fórmula: OH

ou o seu enantiómero β-L ou um sal f armaceuticamente aceitável do mesmo, para utilização no tratamento ou profilaxia de infeção virai por Flaviviridae.

5. 0 composto para uso de acordo com a reivindicação 1, em que cada R4 e R4' é independentemente não substituído ou substituído por fenilo ou benzilo. 4 6. 0 composto para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, em que a infeção virai por Flaviviridae é a infeção do virus da hepatite C. 7. 0 composto para uso de acordo com a reivindicação 6, em que a infeção virai por Flaviviridae é a infeção do vírus da hepatite C, e em que o composto está num veículo farmaceuticamente aceitável.