BRPI0410846B1 - nucleosídeo e composição farmacêutica compreendendo o mesmo - Google Patents

Abstract

"compostos, composições e usos para o tratamento de uma infecção por flaviviridae". a invenção apresentada fornece composições e métodos de tratamento de uma infecção por flaviviridae, incluindo vírus da hepatite c, vírus do oeste do nilo, vírus da febre amarela, e uma infecção por rinovírus em um hospedeiro, incluindo animais, e especialmente humanos, com o uso de (2<39>r)-2<39>-desoxi-2<39>flúor -2<39>-c-metil nucleosídeos, ou um sal ou pró-medicamento farmaceuticamente aceitável desses.

Description

NUCLEOSÍDEO E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA COMPREENDENDO O

MESMO [0001] Esse pedido está sendo depositado em 21 de abril de 2004 como um Pedido de Patente Internacional PCT no nome de PHARMASSET LTD. um residente dos EUA, requerentes para todas as designações exceto a US.

Campo da Invenção:

[0002] A presente invenção inclui (2^,R)-2'-desoxi-2^,-flúor-2^,-C-metil nucleosídeos tendo a configuração β-D natural e métodos para o tratamento de infecções por Flaviviridae, especial mente vírus da hepatite C (HCV).

Fundamento da Invenção:

[0003] A infecção por vírus da hepatite C (HCV) é um grande problema de saúde que leva à doença hepática crônica, como cirrose e carcinoma hepatocelular, em um número substancial de indivíduos infectados, estimados como sendo de 2-15% da população mundial. Há um número estimando de 4,5 milhões de pessoas infectadas nos Estados Unidos isoladamente, de acordo com o U. S. Center for Disease Control. De acordo com a Organização Mundial da Saúde, há mais de 200 milhões de indivíduos infectados pelo mundo, com pelo menos 3 a 4 milhões sendo infectados a cada ano. Uma vez infectadas, cerca de 20% das pessoas eliminam o vírus, mas o restante pode abrigar o HCV para o resto de suas vidas. Dez a vinte porcento de indivíduos cronicamente infectados desenvolvem, com o tempo, cirrose ou câncer que destroem o fígado. A doença viral é transmitida por via parenteral por sangue e produtos de sangue contaminados, agulhas contaminadas ou por via sexual e verticalmente de mães infectadas ou mães portadoras para sua prole. Os tratamentos atuais para infecção por HCV, que estão restritos

Petição 870180061311, de 16/07/2018, pág. 16/130

2/122 a imunoterapia com interferon-a recombinante isoladamente ou em combinação com o análogo de nucleosídeo ribavirina, são de benefício clínico limitado uma vez que a resistência se desenvolve rapidamente. Além disso, não há qualquer vacina estabelecida para HCV. Consequentemente, há uma necessidade urgente por melhores agentes terapêuticos que combatam de forma eficaz a infecção crônica por HCV.

vírion do HCV é um vírus de RNA filamento-positivo com envelope com uma única sequência genômica de oligorribonucleotídeo de cerca de 9.600 bases que codificam uma poliproteína de cerca de 3.010 aminoácidos. Os produtos de proteína do gene de HCV consistem nas proteínas estruturais C, El e E2, e as proteínas não estruturais NS2, NS3, NS4A e NS4B e NS5A e NS5B. Acredita-se que as proteínas não estruturais (NS) forneçam o mecanismo catalítico para a replicação viral. A protease NS3 libera NS5B, a RNA polimerase dependente de RNA da cadeia de poliproteína. NS5B polimerase de HCV é necessária para a síntese de um RNA de duplo filamento a partir de um RNA viral de filamento único que serve como um modelo no ciclo de replicação de HCV. Portanto, NS5B polimerase é considerada como sendo um componente essencial no complexo de replicação de HCV (K. Ishi, e cols., Expression of Hepatitis C Virus NS5B Protein: Characterization of Its RNA Polymerase Activity e RNA Binding, Heptology, 29: 12271235 (1999); V. Lohmann, e cols., Biochemical e Kinetic Analysis of NS5B RNA-Dependent RNA Polymerase of the Hepatitis C Virus, Virology, 249: 108-118 (1998)). A inibição de NS5B polimerase de HCV evita a formação do RNA de duplo filamento de HCV e constitui, portanto, em uma

3/122 abordagem atrativa para o desenvolvimento de terapias antivirais específicas para HCV.

HCV pertence a uma família muito maior de vírus que partilham várias características comuns.

Vírus Flaviviridae:

A família Flaviviridae de vírus compreende pelo menos três gêneros distintos: pestivírus, que causam doenças em gado e porcos; flavi vírus, que são a causa primária de doenças como febre da dengue e febre amarela; e hepacivírus, cujo único membro ê HCV. O gênero flavivírus inclui mais de 68 membros separados em grupos com base na relevância sorológica (Calisher e cols., J. Gen. Virol, 1993,70, 37-43). Os sintomas clínicos variam e incluem febre, encefalite e febre hemorrágica (Fields Virology, Editors: Fields, Β. N. , Knipe, D. M. , e Howley, P. M. , Lippincott-Raven Publishers, Filadélfia, PA, 1996, capítulo 31, 931-959). Flavivírus de interesse global que estão associados a doença humana incluem os vírus da febre da dengue hemorrágica (DHF), vírus da febre amarela, síndrome do choque e Vírus da encefalite Japonesa (Halstead, S. B., Rev. Infect. Dis., 1984, 6, 251-264; Halstead, S. B.,

Science, 239: 476-481, 1988; Monath, Τ. P., New Eng. J.

Med, 1988, 319, 641-643).

O gênero pestivírus inclui o vírus da diarréia viral bovina (BVDV), vírus da febre suína clássica (CSFV, também chamado vírus da cólera de porcos) e vírus da doenã da fronteira dos ovinos (BDV) (Moennig, V. e cols., Adv. Vir. Res. 1992,41, 53-98). Infecções por pestivírus de animais de fazenda domesticados (gado, porções e carneiros) causam perdas econômicas significativas em todo o mundo. BVDV

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causa doença mucosa em gado e é de importância econômica

significativa para	a indústria de	gado	(Meyers,	G.	e Thiel,
H. J. , Advances	in	Virus	Research,	1996,	47,	53-118;
Moennig V., e cols.,	Adv.	Vir.	Res.	1992,	41,	53-98).
Pestivírus humanos	não	foram	tão	bem caracterizados	como os

pestivírus animais. No entanto, análises sorológicas indicam uma considerável exposição de pestivírus em humanos.

Pestivírus e hepacivírus são grupos de vírus intimamente relacionados com a família Flaviviridae. Outros vírus intimamente relacionados nessa incluem o vírus GB A, agentes semelhantes ao vírus GB A, o vírus GB B e o vírus GB C (também chamado vírus da hepatite G, HGV). O grupo de hepacivírus (vírus da hepatite C; HCV) consiste em inúmeros vírus intimamente relacionados mas genotipicamente distinguíveis que infectam humanos. Há pelo menos 6 genótipos de HCV e mais de 50 subtipos. Devido às similaridades entre pestivírus e hepacivírus, combinadas à pouca capacidade dos hepacivírus de crescer eficientemente em cultura de células, vírus da diarréia viral bovina (BVDV) é freqüentemente usado como um substituto para o estudo do vírus HCV.

A organização genética de pestivírus e hepacivírus é muito similar. Esses RNA vírus de filamento positivo possuem uma única estrutura de leitura aberta (ORF) grande que codifica todas as proteínas virais necessárias para a replicação viral. Essas proteínas são expressas como uma poliproteína que é processada junto e após a tradução tanto por proteinases celulares quanto codificadas por vírus para gerar as proteínas virais maduras. As proteínas virais

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responsáveis pela replicação do RNA do genoma viral estão localizadas aproximadamente no terminal carboxi. Dois terços da ORF são denominados proteínas não estruturais (NS). A organização genética e processamento de poliproteína da porção da proteína não estrutural da ORF para pestivírus e hepacivírus é muito similar. Tanto para os pestivírus quanto os hepacivírus, as proteínas não estruturais (NS) maduras, em ordem seqüencial do terminal amino da região codificadora da proteína não estrutural apo terminal carboxi da ORF, consistem em p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, e NS5B.

As proteínas NS de pestivírus e hepacivírus partilham domínios de sequência que são característicos de funções específicas de proteína. Por exemplo, as proteínas NS3 de vírus em ambos os grupos possuem motivos de sequência de aminoácidos característicos de serina proteinases e de helicases (Gorbalenya e cols., (1988) Nature 333: 22; Bazan e Fletterick (1989) Virology 171: 637-639; Gorbalenya e cols., (1989) Nucleic Acid Res. 17.3889-3897). De forma similar, as proteínas NS5B de pestivírus e hepacivírus têm os motivos característicos de RNA polimerases direcionadas

a RNA (Koonin,	Ε. V. e Dolja, V	. V.	(1993)	Cr ir. Rev.
Biochem. Molec.	Biol. 28: 375-430).
Os papéis	e funções reais	das	proteínas NS de
pestivírus e hepacivírus no ciclo	da	vida dos	vírus são
diretamente análogos. Em ambos	os	casos,	a serina
proteinase NS3	é responsável	por	todo o	processo

proteolítico dos precursores de poliproteína abaixo de sua posição na ORF (Wiskerchen e Collett (1991) Virology 184 : 341-350; Bartenschlager e cols., (1993) J. Virol. 67:3835

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3844; Eckart e cols., (1993) Biochem. Biophys. Res. Comm. 192: 399-406; Grakoui e cols., (1993) J. Virol. 67:28322843; Grakoui e cols., (1993) Proc. Natl. Acad Sei. USA90: 10583- 10587;Hijikata e cols., (1993) J. Virol. 67: 46654675; Tome e cols., (1993) J. Virol. 67: 4017-4026). A proteína NS4A, em ambos os casos, age como um cofator com a serina protease NS3 (Bartenschlager e cols., (1994) J. Virol. 68: 5045-5055; Failla e cols., (1994) J. Virol. 68 : 3753-3760; Xu e cols., (1997) J. Viral. 71:53 12-5322). A proteína NS3 de ambos os vírus também funciona como uma helicase (Kim e cols., (1995) Biochem. Biophys. Res. Comm. 215: 160-166; Jin e Peterson (1995) Arch. Biochem. Biophys., 323: 47-53; Warrener e Collett (1995) J. Virol. 69: 1720-1726). Finalmente, as proteínas NS5B de pestivírus e hepacivírus têm a atividade de RNA polimerases direcionadas a RNA previstas (Behrens e cols., (1996) EMBO. 15: 12-22; Lechmann e cols., (1997) J. Virol. 71: 84168428; Yuan e cols., (1997) Biochem. Biophys. Res. Comm. 232: 231-235; Hagedorn, PCT WO 97/12033; Zhong e cols., (1998) J. Virol. 72.9365-9369).

Tratamento de infecção por HCV com Interferon:

Interferons (IFNs) têm sido comercialmente disponíveis para o tratamento de hepatite crônica por quase uma década. IFNs são glicoproteínas produzidas por células imunes em resposta a infecção viral. IFNs inibem a replicação de inúmeros a vírus, incluindo HCV quando usados como o único tratamento para a infecção de hepatite C, IFN pode, em certos casos, suprimir HCV-RNA sérico a níveis indetectáveis. Adicionalmente, IFN pode normalizar os níveis de amino transferase sérica. Infelizmente, o efeito

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de IFN é temporário e uma reposta sustentada ocorre em apenas 8%-9% dos pacientes cronicamente infectados com HCV (Gary L. Davis. Gastroenterology 18:S104-S114, 2000). A maior parte dos pacientes, entretanto, têm dificuldade em tolerar o tratamento com interferon, o que causa severos sintomas semelhantes a gripe, perda de peso e ausência de energia e vigor.

Inúmeras patentes revelam Flaviviridae, incluindo HCV e tratamentos que usam terapias baseadas em interferon. Por exemplo, Patente U.S. N° 5.980.884 para Blatt e cols., revela métodos para tratamento de pacientes com HCV que usa interferon de consenso. Patente U.S. N° 5.942.223 para Bazer e cols., revela uma terapia anti-HCV que usa interferon-tau ovino ou bovino. Patente U.S. N° 5. 928.636 para Alber e cols., revela a terapia de combinação de interleucina-12 e interferon alfa para o tratamento de doenças infecciosas incluindo HCV. Patente U.S. N° 5.849.696 para Chretien e cols., revela o uso de timosinas, isoladamente ou em combinação com interferon, para tratar HCV. Patente U.S. N° 5.830.455 para Valtuena e cols., revela uma terapia de combinação para HCV que emprega interferon e um scavenger de radical livre. Patente U.S. N° 5.738.845 para Imakawa revela o uso de proteínas de interferon tau humano para tratar HCV. Outros tratamentos para HCV baseados em interferon são revelados na Patente U.S. N° 5.676.942 para Testa e cols., Patente U.S. N° 5.372.808 para Blatt e cols. e Patente U.S. N° 5.849.696. Inúmeras patentes também revelam formas peguiladas de interferon, como Patente U.S. N°^s. 5.747.646, 5.792.834 e

5.834.594 para Hoffmann-La Roche; Publicação PCT No. WO

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99/32139 e WO 99/32140 para Enzon; WO 95/13090 e Patente U.S. N^oS. 5.738.846 e 5.711.944 para Schering; e Patente U.S. N° 5.908.621 para Glue e cols.

Interferon alfa-2a e interferon alfa-2b são atualmente aprovados como monoterapia para o tratamento de HCV. ROFERON®-A (Roche) é a forma recombinante de interferon alfa-2a. PEGASYS® (Roche) é a forma peguilada (ou seja, modificada por polietileno glicol) de interferon alfa-2a. INTRON®A (Schering Corporation) é a forma recombinante de Interferon alfa-2b, e PEG-INTRON (Schering Corporation) é a forma peguilada de interferon alfa-2b.

Outras formas de interferon alfa, assim como de interferon beta, gama, tau e omega estão atualmente em desenvolvimento clínico para o tratamento de HCV. Por exemplo, INFERGEN (interferon alfacon-1) por InterMune, OMNIFERON (interferon natural) por Viragen, ALBUFERON por Human Genome Sciences, REBIF (interferon beta-la) por AresSerono, Interferon Omega por BioMedicine, Interferon Alfa Oral por Amarillo Biosciences e interferon gama, interferon tau e interferon gama-lb por InterMune são em desenvolvimento.

Ribavirina:

Ribavirina (Ι-β-D-ribofuranosil-l,2,4-triazol-3carboxamida) é um análogo nucleosídeo antiviral sintético, não indutor de interferon, de amplo espectro vendido sob o nome comercial Virazole (The Merck Index, llth edition, Editor: Budavari, S., Merck & Co., Inc., Rahway, NJ, pl304, 1989). Patente U.S. No. 3.798.209 e RE29.835 revelam e reivindicam a ribavirina. Ribavirina é estruturalmente similar à guanosina, e tem atividade in vitro contra vários

9/122 vírus DNA e RNA incluindo Flaviviridae (Gary L. Davis Gastroenterology 118:5104-5114, 2000). Ribavirina reduz os níveis séricos de amino transferase ao normal em 40% dos pacientes, mas não diminui os níveis séricos de HCV-RNA 5 (Gary L. Davis 2 000) . Portanto, ribavirina isoladamente não é eficaz na redução dos níveis de RNA viral. Adicionalmente, ribavirina tem toxicidade significativa e é conhecida por induzir anemia. Ribavirina não é aprovada para monoterapia contra HCV. Ela foi aprovada em combinação 10 com interferon alfa-2a ou interferon alfa-2b para o tratamento de HCV.

Ribavirina é um inibidor conhecido de inosina monofosfato desidrogenase que não tem atividade específica anti-HCV nos sistema de replicon de HCV (Stuyver e cols., 15 Journal of Virology, 2003, 77, 10689-10694).

Combinação de Interferon e Ribavirina:

padrão atual de tratamento de hepatite crônica C é a terapia de combinação com um interferon alfa e ribavirina. A combinação de interferon e ribavirina para o tratamento 20 de infecção por HCV foi relatada como sendo eficaz no tratamento de pacientes que nunca tiveram contato com interferon (Battaglia, A. M. e cols., Ann. Pharmacother. 34: 487-494,2000) assim como para o tratamento de pacientes quando a doença histológica já está presente (Berenguer, M.

e cols. Antivir. Ther. 3 (Suppl. 3) : 125-136, 1998) . Estudos mostraram que mais pacientes com hepatite C respondem à terapia de combinação de interferon-alfa peguilado/ribavirina que à terapia de combinação com interferon alfa não peguilado. Entretanto, como com monoterapia, efeitos colaterais significativos se

10/122 desenvolvem durante a terapia de combinação, incluindo hemólise, sintomas semelhante a gripe, anemia, e fadiga. (Gary L. Davis, 2000) . Terapia de combinação com cápsulas de PEG-INTRON® (peginterferon alfa-2b) e REBETOL® (Ribavirina, USP) são disponíveis por Schering Corporation. REBETOL® (Schering Corporation) também foi aprovado em combinação com ÍNTRON® (Interferon alfa-2b, recombinante, Schering Corporation). PEGASYS® de Roche (interferon alfa2^a pequilado) e COPEGUS® (ribavirina), assim como Ribosphere® de Three River Pharmacetical também são aprovados para o tratamento de HCV.

As Publicações PCT N^os WO 99/59621, WO 00/37110, WOOl/81359, WO 02/32414 e WO 03/024461 por Schering Corporation revelam o uso de terapia de combinação de interferon alfa peguilado e ribavirina para o tratamento de HCV. As Publicações PCT Nos. WO 99/15194, WO 99/64016 e WO 00/24355 por Hoffmann-La Roche Inc. também revelam o uso de terapia de combinação de interferon alfa peguilado e ribavirina para o tratamento de HCV.

Métodos adicionais para tratar infecções por Flaviviridae:

O desenvolvimento de novos agentes antivirais para infecções por Flaviviridae, especialmente hepatite C, está atualmente em progresso. Inibidores específicos de enzimas derivadas de HCV como inibidores de protease, helicase, e polimerase estão sendo desenvolvidos. Medicamentos que inibem outras etapas na replicação de HCV também estão sendo desenvolvidos, por exemplo, medicamentos que bloqueiam a produção de antígenos de HCV do RNA (inibidores de IRES), medicamentos que evitam o processamento normal de

122 proteínas

medicamentos

que bloqueia a entrada de HCV nas células (por bloqueio de seu receptor) e agentes citoprotetores não específicos que bloqueiam o dano celular causado pela infecção viral. Além disso, abordagens moleculares também estão sendo desenvolvidas para tratar a hepatite C, por exemplo, ribozimas, que são enzimas que quebram moléculas específicas de RNA viral, oligonucleotídeos anti-senso, que são segmentos complementares pequenos de DNA que se ligam ao RNA viral e inibem a replicação viral, e técnicas de interferência de RNA estão sob investigação (Bymock e cols., Antiviral Chemistry & Chemoterapia, 11: 2; 79-95 (2000); De Francesco e cols., in Antiviral Research, 58: 116 (2003); e Kronke e cols., J. Virol., 78: 3436-3446 (2004).

Vírus da diarréia viral bovina (BVDV) é um pestivírus que pertence à família Flaviviridae e tem sido usado como um substituto para teste in vitro dos agentes antivirais potenciais. Embora atividade contra BVDV possa sugerir atividade contra outros flavivírus, um composto pode ser freqüentemente inativo contra BVDV e ativo contra um outro flavivírus. Sommadossi e La Colla revelaram (Methods and compositions for treating flaviviruses and pestiviruses, PCT WOOl/92282) que ribonucleosídeos que contêm um grupo metil na posição 2' acima têm atividade contra BVDV. Entretanto, não está claro se esses compostos podem inibir outros flavivírus, incluindo HCV em cultura de células ou o nível de HCVNS5B. Surpreendentemente, embora essa publicação revele um grande número de compostos que são 2'metil-2'-X-ribonucleosídeos, onde X é um halogênio, flúor

12/122 não é considerado. Além disso, uma via sintética que leva aos nucleosídeos halogenados na posição 2' abaixo não é conhecida por esses inventores.

vírus da dengue (DENV) é o agente causador da febre da Dengue hemorrágica (DHF). De acordo com a Organização Mundial de Saúde (WHO), dois quintos da população mundial estão agora em risco de infecção por esse vírus. Um número estimado de 500.000 casos de DHF requer hospitalização a cada ano com uma taxa de mortalidade de 5% em crianças.

vírus do oeste do Nilo (WNV) , um flavivírus previamente conhecido como existindo apenas em regiões intertropicais, tem surgido nos últimos anos em áreas temperadas da Europa e América do Norte, apresentando uma ameaça à saúde pública. A manifestação mais séria de infecção por WNV é a encefalite fatal em humanos. Surtos em nova Iorque e ocorrências esporádicas no sul dos Estados unidos têm sido relatados desde 1999.

Não há atualmente qualquer tratamento preventivo de infecção por HCV, vírus da Dengue (DENV) ou vírus do oeste do Nilo. As terapias atualmente aprovadas, que existem apenas contra HCV, são limitadas. Exemplos de agentes antivirais que foram identificados como ativos contra o flavivírus da hepatite C incluem:

1) Inibidores da Protease:

Inibidores da protease NS3 baseados em substrato (Attwood e cols., PCT WO 98/22496 1998; Attwood e cols., Antiviral Chemistry and Chemotherapy 1999, 10,259-273;

Attwood e cols., (1999) Preparation and use of amino acid derivatives as anti-viral agents, Publicação de Patente Germânica DE 19914474; Tung e cols. Inhibitors of serine

13/122 proteases, particularmente hepatitis C virus NS3 protease, PCT WO 98/17679), incluindo alfacetamidas e hidrazinouréias e inibidores que terminam em um eletrófilo tal como ácido borônico ou fosfonato (Llinas-Brunet e cols., Hepatitis C inhibitor peptide analogues, PCT WO 99/07734) estão sendo investigados.

Inibidores de protease NS3 não baseados em substrato tal como derivados de 2,4,6-trihidroxi-3-nitro-benzamida (Sudo, K. e cols., Biochemical and Biophysical Research Communicátions, 1997, 238:643-647; Sudo, K. e cols., Antiviral Chemistry and Chemotherapy 1998, 9:186,), incluindo RD3-4082 e RD3-4078, o primeiro substituído na amida com uma cadeia de 14 carbonos e o último processando um grupo para-fenoxifenil também estão sendo investigados.

SCH 68631, uma fenantrenoquinona, é um inibidor de protease de HCV (Chu M. e cols., Tetrahedron Letters 37: 7229-7232,1996). Em um outro exemplo, pelos mesmos autores, SCH 351633, isolado do fungo Penicillium griseofulvum, foi identificado como um inibidor de protease (Chu M. e cols., Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 9:1949-1952). A potência nanomolar contra a enzima de protease NS3 de HCV foi atingida pelo desenho de inibidores seletivos baseados na macromolécula eglina c. Eglina c, isolada de sanguessuga, é um potente inibidor de várias serinas proteases tais como proteases A e B de S. griseus, (Xquimiotripsina, quimase e subtilisina. Qasim Μ. A. e cols., Biochemistry 36: 1598-1607, 1997.

Várias patentes U.S. revelam inibidores de protease para o tratamento de HCV. Por exemplo, a Patente U.S. No. 6.004.933 para Spruce e cols., revela uma classe de

122

cisteína inibição protease

Zhang e cols., revela inibidores sintéticos da protease NS3 do vírus de hepatite C. O inibidor é uma subseqüência de um substrato da protease NS3 ou um substrato do co-fato NS4A. 0 uso de enzimas de restrição para tratar HCV é revelado na Patente U.S. No. 5.538.865 para Reyes e cols. Peptídeos como inibidores de serina protease NS3 de HCV são revelados em WO 02/008251 para Corvas International, Inc, e WO 02/08187 e WO 02/008256 para Schering Corporation. Tripeptídeos inibidores de HCV são revelados nas Patentes U.S. Nos. 6.534.523, 6.410.531, e 6.420.380 para Boehringer Ingelheim e WO 02/060926 para Bristol Myers Squibb. Diaril peptídeos como inibidores de serina protease NS3 de HCV são revelados em WO 02/48172 para Schering Corporation. Imidazolidinonas como inibidores de serina protease NS3 de HCV são reveladas em WO 02/08198 para Schering Corporation e WO 02/48157 para Bristol Myers Squibb. WO 98/17679 para Vertex Pharmaceuticals e WO 02/48116 para Bristol Myers Squibb também revelam inibidores protease de HCV.

(2) Derivados de tiazolidina que mostram inibição relevante em um de ensaio de HPLC de fase reversa com uma proteína de fusão NS3/4A e substrato NS5A/5B (Sudo, K. e cols., Antiviral Research 1996, 32:9-18,), especialmente o composto RD-1-6250, que possui uma porção cinamoil fundida substituída com uma cadeia longa de alquil, RD4 6205 e RD4 6193 ;

3) Tiazolidinas e benzanilidas identificadas em Kakiuchi N. e cols., J. EBS Letters 421:217-220; Takeshita N. e cols.,, Analytical Biochemistry 1997, 247:242-246;

15/122

possuindo

contra

ensaio

SDS

PAGE

auto-radiografia isolada do caldo de cultura de fermentação de Streptomyces sp. , Sch 68631 (Chu M. e cols., Tetrahedron Letters 1996, 37: 7229-7232), e Sch 351633, isolado do fungo Penicillium griseofulvum, que demonstrou atividade em um ensaio de proximidade de cintilação (Chu M. e cols., Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 9:1949-1952);

5) inibidores de helicase de HCV (Diana G. D. e cols., Compounds, composições and métodos for treatment of hepatitis C, Patente U.S. No. 5.633.358; Diana G. D. e cols., Piperidine derivatives, composições farmacêuticas thereof and their use in the treatment of hepatitis C, PCT WO 97/36554);

6) Inibidores de polimerase de nucleotídeo e gliotoxina (Ferrari R. e cols. Journal of Virology, 1999,73, 1649-1654) e o produto natural cerulenina (Lohmann V. e cols., Virology, 1998, 249, 108-118);

7) Oligodesoxinucleotídeos de fosforotioato anti-senso (S-ODN) complementar a estiramentos de seqüência na região não codificadora 5' (NCR) do vírus (Alt M. e cols., Hepatology, 1995,22, 707-717), ou nucleotídeos 326-348 que compreendem a extremidade 3' da NCR e nucleotídeos 371-388 localizados no núcleo da região codificador do RNA de HCV (Alt M. e cols., Archives of Virology, 1997, 142, 589-599; Galderisi U. e cols., Journal of Cellular Physiology, 1999,181, 251-257);

8) inibidores de tradução dependente de IRES (Ikeda N e cols. Agents for the prevention and treatment of hepatitis C, Publicação de Patente japonesa JP-08268890;

16/122

Kai, Y. e cols. Prevention and treatment of viral diseases,

Publicação de Patente japonesa JP-10101591) (9) Ribozimas, tais como ribozimas resistentes a nuclease (Maccjak, D. J. e cols., Hepatology 1999,30, abstract 995) e aquelas reveladas na Patente U. S. No. 6.043.077 para Barber e cols. e Patentes U. S. Nos. 5.869.253 e 5.610.054 para Drapere cols.;

10) Análogos de nucleosídeo também estão sendo desenvolvidos para o tratamento de Infecções por Flaviviridae.

Idenix Pharmaceuticals revela o uso de certos nucleosídeos ramificados no tratamento of Flavivírus (incluindo HCV) e pestivírus nas Publicações Internacionais N^os WO 01/90121 e WO 01/92282. Especificamente, um método para o tratamento de infecção de hepatite C (e Flavivírus e pestivírus) em humanos e outros hospedeiros animais é revelado nas publicações Idenix que incluem a administração de uma quantidade eficaz de um nucleosídeo β-D ou β-L 1', 2', 3' ou 4'-ramificado biologicamente ativo ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado desse, administrado isoladamente ou em combinação com um outro agente antiviral, opcionalmente em um transportador farmaceuticamente aceitável.

WO 2004/002422 para Idenix publicada em 8 de janeiro de 2004 revela uma família de 2'-metil nucleosídeos para o tratamento de infecções por flavivírus. WO 2004/002999 para Idenix, publicada em 8 de janeiro de 2004 revela uma série de 2' ou 3' pró-medicamentos de nucleosídeos 1', 2', 3', ou 4' ramificados para o tratamento de infecções por flavivírus incluindo infecções por HCV.

17/122

Outros pedidos de patentes que revelam o uso de certos análogos de nucleosídeo para tratar infecção por vírus da hepatite C incluem: PCT/CA00/01316 (WOOl/32153; depositada em 3 de novembro de 2000) e PCT/CAOl/00197 (WO 01/60315;

depositada em 19 de fevereiro de 2001) depositada por

BioChem Pharma, Inc. (agora Shire Biochem, Inc.);

PCT/US02/01531 (WO 02/057425; depositada em 18 de janeiro de 2002) e PCT/US02/03086 (WO 02/057287; depositada em 18 de janeiro de 2 0 02) depositada por Merck & Co., Inc., 10 PCT/EPOT/09633 (WO 02/18404; publicada em 21 de agosto de 2001) depositada por Roche, e Publicação PCT Nos.

WOOl/79246 (depositada em 13 de abril de 2001), WO 02/32920 (depositada em 18 de outubro de 2001) e WO 02/48165 por Pharmasset, Ltd.

WO 2004/007512 para Merck & Co. revela inúmeros compostos de nucleosídeo revelados como inibidores de RNA polimerase viral dependente de RNA. Os nucleosídeos revelados nessa publicação são primariamente nucleosídeos substituídos com 2'-metil-2'-hidroxi. WO 02/057287 para

Merck e cols., publicada em 25 de julho de 2002, revela um grande gênero de nucleosídeos derivados de pirimidina de substituições 2'-metil-2'-hidroxi. WO 2004/009020 para

Merck e cols., revela uma série de derivados de tionucleosídeo como inibidores de RNA polimerase viral dependente de RNA. WO 03/105770 para Merck e cols., revela a series de derivados carbocíclicos nucleosídeo que são úteis para o tratamento de infecções por HCV.

Publicação PCT Publication N° WO 99/43691 para Emory

University, intitulada 2'-Fluoronucleosides revela o uso de certos 2'-fluornucleosídeos para tratar HCV.

18/122

Eldrup e cols. (Oral Session V, Hepatite C Virus,

Flaviviridae; 16^th International Conference on Antiviral

Research (Abril 27, 2003, Savannah, Ga.)) descreve a relação estrutura atividade de nucleosídeos 2'-modificados para inibição de HCV.

Bhat e cols. (Oral Session V, Hepatitis C Virus, Flaviviridae; 16^th International Conference on Antiviral

Research (Abril 27, 2003, Savannah, Ga.) p A75) descrevem a síntese e as propriedades farmacocinéticas de análogos de nucleosídeo como possíveis inibidores da replicação de RNA de HCV. Os autores relatam que nucleosídeos 2'-modificados demonstram potente atividade inibitória em ensaios de replicon baseados em célula.

Olsen e cols. (Oral Session V, Hepatite C Virus, Flaviviridae; 16^th International Conference on Antiviral

Research (Abril 27,2003, Savannah, Ga.) p A76) também descrevem o efeitos dos nucleosídeos 2'-modificados sobre a replicação de RNA de HCV.

(11) outros compostos mistos incluindo 1-aminoalquilciclohexanos (Patente U. S. No. 6.034.134 para Gold e cols), lipídeos de alquila (Patente U.S. No. 5.922.757 para Chojkier e cols), vitamina E e outros antioxidantes (Patente U.S. No. 5.922.757 para Chojkier e cols), esqualeno, amantidina, ácidos de bile (Patente U.S. No. 5.846.964 para Ozeki e cols.), ácido N-(fosfonoacetil)-Laspártico, (Patente U.S. No. 5.830.905 para Diana e cols.), benzenodicarboxamidas (Patente U.S. No. 5.633.388 para Diana e cols.), derivados de ácido poliadenílico (Patente U.S. No. 5.496.546 para Wang e cols.), 2',3'didesoxiinosina (Patente U.S. No. 5.026.687 para Yarchoan e

19/122 cols.), benzimidazóis (Patente U.S.

No. 5.891.874 para

859

Colacino (extratos plantas

Patente . 056.961) ,

Omer

905

piperidenas (Patente

Diana

(12) Outros compostos atualmente em desenvolvimento pré-clínico ou clínico para o tratamento do vírus da hepatite C incluem: Interleucina-10 por Schering-Plough, IP-SO1 por Interneuron, Merimebodib (VX-497) por Vertex, AMANTADINE® (Symmetrel) por Endo LabsSolvay, HEPTAZYME® por

RPI, IDN-6556 by por Idun Pharma. , XTL-002 por XTL., HCV/MF59 por Chiron, CIVACIR® (Globulina Imune de Hepatite C) por NABI, LEVOVIRIN® por ICN/Ribapharm, VIRAMIDINE® por ICN/Ribapharm, ZADAXIN® (alfa-1 timosina) por Sei Clone, timosina mais interferon de reação com PEG por Sei Clone, CEPLENE® (diidrocloreto de histamina) por Maxim, VX 950/LY 570310 por Vertex/Eli Lilly, ISIS 14803 por Isis Pharmaceutical/Elan, IDN-6556 por Idun Pharmaceuticals, Inc., JTK 003 por AKROS Pharma, BILN-2061 por Boehringer Ingelheim, CellCept (micofenolato mofetil) por Roche, T67, um inibidor de β-tubulina, por Tularik, uma vacina terapêutica direcionada para E2 por Innogenetics, FK788 por Fujisawa Healthcare, Inc., ldB 1016 (Siliphos, silibinfosfatidileolina fitosoma oral), inibidores de replicação de RNA (VP50406) por ViroPharma/Wyeth, vacina terapêutica por Intercell, vacina terapêutica por Epimmune/Genencor, inibidor de IRES por Anadys, ANA 245 e ANA 246 por Anadys, imunoterapia (Therapore) por Avant, inibidor de protease por Corvas/SChering, inibidor de helicase por Vertex,

20/122 inibidor de fusão por Trimeris, terapia de células T por

CellExSys, inibidor de polimerase por Biocryst, química de RNA de alvo por PTC Therapeutics, Dication por Immtech, Int., inibidor de protease por Agouron, inibidor de protease por Chiron/Medivir, terapia anti-senso por

AVIBioPharma, terapia anti-senso por Hybridon, hemopurificador por Aethlon Medicai, vacina terapêutica por Merix, inibidor de protease por Bristol-Myers Squibb/Axys,

Chron-VacC, uma vacina terapêutica, por Tripep, UT231B por 10 United Therapeutics, inibidor de protease, helicase e polimerase por Genelabs Technologies, inibidores de IRES por Immusol, R803 por Rigel Pharmaceuticals, INFERGEN® (interferon alfacon-1) por InterMune, OMNIFERON® (interferon natural) por Viragen, ALBUFERON® por Human 15 Genome Sciences, REBIF® (interferon beta-la) por AresSerono, Interferon Omega por BioMedicine, Alfa Interferon Oral por Amarillo Biosciences, interferon gama, interferon tau, e Interferongama-lb por InterMune. Rigel

Pharmaceuticals está desenvolvendo um inibidor de 20 polimerase de HCV não nucleosídico, R803, que está sendo promissor como sinérgico com IFN e ribavirina.

13) um resumo de vários medicamentos em investigação, que cinlui vários dos aqui discutidos, que estão atualmente em várias fases de desenvolvimento para o tratamento de 25 HCV, são sumarizados abaixo:

Medicamento	Mecanismo/alvo	Companhia	Status nos EUA
BILN-2061	inibidor de Serina- protease NS3	Boehringer Ingelheim	Fase II

21/122

ISIS 14803	Anti-senso/ evita tradução de RNA	ISIS/Elan	Fase II
Viramidina	Pró- medicamento de Ribavirina	Ribapharm	Fase II
NM 2 83	Inibidor de RNA polimerase de HCV	Idenix	Fase II/III
VX-497	Inibidor de IMPDH	Vertex	Fase I/II
JKT-003	Inibidor de RNA polimerase de HCV	Japan Tobacco/Akros	Fase I/II
Levovírin	Análogo de L- Ribavirina	Ribapharm/Roche	Fase I/II
Isatoribine ANA245	Análogo de nucleosídeo Interage com receptor TLR7	Anadys	Fase I
Albuferon	Modulador imune	Human Genome Sciences	Fase I
Peg-Infergen	Modulador imune	Intermune	Fase I
VX-950	Inibidor de HCV NS3-4A protease	Vertex	Pré-clínica
SCH 6	Inibidor de HCV NS3-4A protease	Schering Plough	Pré-clínica

22/122

R803	Inibidor de RNA polimerase de HCV	Rigel	Fase	I
HCV-086	-	ViroPharma/Wyeth	Fase	I
R1479	Inibidor de RNA polimerase de HCV	Roche	Fase	I

Pró-medicamentos de nucleosídeo foram previamente descritos para o tratamento de outras formas de hepatite. WO 00/09531 e WOOl/96353 para Idenix Pharmaceuticals, revelam 2'-desoxi-p-L-nucleosídeos e seus pró-medicamentos 3' para o tratamento de HBV. A Patente U.S. No. 4.957.924 para Beauchamp revela vários ésteres terapêuticos de aciclovir.

Em vista do fato de que a infecção por HCV atingiu níveis epidêmicos ao redor do mundo, e tem efeitos trágicos sobre o paciente infectado, permanece uma forte necessidade de suprir novos agentes farmacêuticos para tratar hepatite C que tenham baixa toxicidade para o hospedeiro.

Adicionalmente, em face da ameaça crescente de outras infecções por flaviviridae, permanece uma forte necessidade de suprir novos agentes farmacêuticos eficazes que tenham baixa toxicidade para o hospedeiro.

Sumário da Invenção:

Não há atualmente qualquer tratamento preventivo de infecção por Vírus da hepatite C (HCV), vírus da Dengue (DENV) vírus do oeste no Nilo (WNV) e as terapias atualmente aprovadas, que existem não apenas contra HCV, são limitadas. O desenho e desenvolvimento de compostos farmacêuticos é essencial, especialmente aqueles que são

23/122 sinérgicos com outros medicamentos aprovados e investigados para Flaviviridae e em particular HCV, para a evolução de padrões de tratamento, incluindo terapias de combinação mais eficazes.

A presente invenção fornece um (2'R)-2'-desoxi-2'f lúor-2'-C-metil nucleosídeo (β-D ou β-L) , ou seu sal ou pró-medicamento farmaceuticamente aceitável desse, e o uso de tais compostos para o tratamento de um hospedeiro infectado com um vírus que pertence à família Flaviviridae, incluindo vírus da hepatite C, vírus do oeste do Nilo e vírus da febre amarela. Em adição, os nucleosídeos da presente invenção se mostram ativos contra rinovírus. Rinovírus (RVs) são pequenos vírus (30 nm), não envelopados que contêm um genoma de ácido ribonucleico (RNA) de filamento único em um capsídeo icosaédrico (de 20 lados). RVs pertence à família Picornaviridae, que inclui os gêneros Enterovírus (poliovíus, oxsackievírus grupos A e B, echovíus, enterovírus numerados) e Hepatovírus (vírus da hepatite A) . Aproximadamente 101 sorotipos são identificados atualmente. Rinovírus são mais frequentemente associados ao resfriado comum, nasofaringite, crupe, pneumonia, otite média e exacerbações de asma.

inventor fez a descoberta inesperada de que as substituições 2' nos nucleosídeos β-D ou β-L da presente invenção transmitem maior especificidade para o vírus da hepatite C assim como exibem menor toxicidade após administração a um hospedeiro. A invenção também inclui um método para tratar uma infecção por Flaviviridae, que inclui vírus da hepatite C, vírus do oeste do Nilo e vírus da febre amarela e infecção por rinovírus, que inclui a

24/122 administração de uma quantidade antiviral eficaz de um

nucleosídeo β-D ou β-L aqui revelado, ou seu sal ou pró medicamento farmaceuticamente aceitável, opcionalmente em um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável, opcionalmente em combinação ou alternância com um outro agente antiviral eficaz.

Os nucleosídeos da presente invenção, possuem as propriedades únicas de terem maior especificidade pelo vírus da hepatite C menor toxicidade em cultura ou quando administrados a um animal. Uma razão potencial, mas não limitante para isso no anel de ribose. Por exemplo, Patente U. S. No. 6.348.587 para Schinazi e cols., revela uma família de compostos de

2'-flúor nucleosídeo que são úteis no tratamento de vírus da infecção de hepatite

C.

Em contraste, estão as metilcitidina

2'-metil como como mostrado em encontradas em 2'-CWO 2004/02999 para Idenix

Portanto, em um aspecto, o nucleosídeo antiviral eficaz é um (2'R)-2'-desoxi-2'-flúor-2'-C-metil nucleosídeo (β-D farmaceuticamente ou β-L)

sal de fórmula geral:

ou pró-medicamento onde:

uma base de purina ou pirimidina de ocorrência natural ou modificada;

25/122 (b) X é O, S, CH₂, Se, NH, N-alquil, CHW (R, S, ou racêmico), C(W)₂, onde W é F, Cl, Br, ou I;

(c) R¹ e R⁷ são independentemente H, fosfato, incluindo 5'- monofosfato, difosfato, trifosfato, ou um pró-medicamento de fosfato estabilizado, H-fosfonato, incluindo H-fosfonatos estabilizados, acil, incluindo fenil e acil inferior opcionalmente substituídos, alquil, incluindo alquil inferior, carboxialquilamino O-substituído ou seus derivados peptídicos, éster de sulfonato, incluindo

alquil ou arilalquil sulfonil, incluindo metanossulfonil e benzil, onde o grupo fenil é opcionalmente substituído, um lipídeo, incluindo a fosfolipídeo, um L ou D-aminoácido, um carboidrato, um peptídeo, um colesterol, ou outro grupo de partida farmaceuticamente aceitável que quando administrado in vivo é capaz de fornecer um composto onde R¹ é H ou fosfato; R² é OH ou fosfato; R¹ e R² ou R⁷ também podem ser ligados com grupo fosfato cíclico; e (d) R² e R²' são independentemente H, C_x-₄ alquil, C_x_₄ alquenil, C_X-₄ alquinil, vinil, N₃, CN, Cl, Br, F, I, N0_2/

C(O)O(Ci-₄ alquil), C(O)O(C_X-₄ alquil), C(O)O(C_X_₄ alquinil),

C(O)O(Ci-₄ alquenil), 0(C_X-₄ acil), 0(C_X-₄ alquil), 0(C_X-₄ alquenil), S (C_x.₄ acil), S (C_x_₄ alquil), S (C_X-₄ alquinil), S(C_X-₄ alquenil), SO(C_X.₄ acil), SO(C_X_₄ alquil), SO(C_X-₄ alquinil), SO (C_x_₄ alquenil), S0₂ (C_x_₄ acil), S0₂ (C_x_₄ alquil), SO₂ (C_x_₄ alquinil), SO₂ (C_x_₄ alquenil), O₃S (C_x.₄ acil), 0₃S (C_x_₄ alquil), 0₃S (C_x_₄ alquenil), NH₂, NH(C_X-₄ alquil), NH(C_x_₄ alquenil), NH(C_X-₄ alquinil), NH(C_X_₄ acil), N(C_X-4 alquil)₂, N (C_x.₄ acil)₂, onde alquil, alquinil, alquenil e vinil são opcionalmente substituídos por N₃, CN, um a três halogênios (Cl, Br, F, I), N0₂, C(O)O(C_X_₄

26/122 alquil), C(O)O(Ci-₄ alquil), C(O)O(C_X_₄ alquinil) , C(O)O(C_X-₄

alquenil), O(C_X_₄ acil) , O(Ci_₄ alquil), O(C_X-₄ alquenil),

S (Ci_₄ acil) ,

S (Ci_₄ alquil) ,

S (Ci_4 alquinil), S (C_x_₄ alquenil),

SO(Ci_₄ acil), SO(Ci_₄ alquil),

SO(Ci-₄ alquinil),

SO(Ci-4 alquenil),	SO2 (Ci_4 acil) ,	SO2 (Ci-4	alquil)	, so2 (Cx.4
alquinil), SO2 (C	i_4 alquenil) ,	O3S (CX-4	acil),	O3S(CX.4
alquil), O3S (Ci-4	alquenil), NH2/	NH(Ci_4	alquil)	, NH(Cx.4
alquenil), NH(CX_4	alquinil), NH(CX	-4 acil) ,	• N(Cx_4	alquil)2,
N(Ci-4 acil) 2, R2	e R2' podem se unir para	formar	um vinil

opcionalmente substituído por um ou dois de N₃, CN, Cl, Br,

F, I, N0₂; OR⁷ e (e) R⁶ é um alquil opcionalmente substituído (incluindo alquil inferior) , ciano (CN) , CH₃, OCH₃, OCH₂CH₃, hidroxi metil (CH₂OH) , fluormetil (CH₂F) , azido (N₃) , CHCN,

CH₂N₃, CH₂NH₂, CH₂NHCH₃, CH₂N(CH₃)₂, alcino (opcionalmente substituído), ou flúor.

Em vários aspectos da invenção, a base pode ser selecionada de:

(a) Y é N ou CH;

(b) R³, R⁴ e R⁵ são independentemente H, halogênio (incluindo F, Cl, Br, I), OH, OR', SH, SR', NH₂, NHR', NR'2, alquil inferior de Ci-C₆, alquil inferior de C_x-C₆ halogenado (F, Cl, Br, I) como CF₃ e CH₂CH₂F, alquenil inferior de C₂-C₆ como CH=CH₂, alquenil inferior de C₂-C₅ halogenado (F, Cl, Br, I) como CH=CHC1, CH=CHBr e CH=CHI, alquinil inferior de C₂-C₆ como C=CH, alquinil inferior de

27/122

C₂-C₆ halogenado (F, Cl, Br, I), alcóxi inferior de Ci-C₆

Ί

como CO₂H, CO₂R', CONH₂, CONHR',

CONR'_2z ch=chco₂h,

CH=CHCO₂R' ;

onde R' é um alquil opcionalmente substituído de Ci-C_i2 (particularmente quando o alquil é um resíduo de aminoácido) , cicloalquil, alquinil opcionalmente substituído de C₂-C₆, alquenil inferior opcionalmente substituído de C₂-C₆ ou acil opcionalmente substituído.

Ainda em um outro aspecto, o (2'R)-2'-desoxi-2'-flúorpró-medicamento de fórmula:

2'-C-metil nucleosídeo

onde:

(a) base, como acima descritro;

Vários aspectos da presente invenção também incluem (2'R)-2'-desoxi-2'-flúor-2'-C-metil nucleosídeo (β-D ou βL) aqui descritos ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis desse ou pró-medicamentos e um transportador farmaceuticamente aceitável.

A presente invenção também fornece em vários aspectos, métodos para o tratamento ou profilaxia de uma infecção por vírus da hepatite C, infecção por vírus do oeste do Nilo, uma infecção viral de febre amarela ou uma infecção por rinovírus em um hospedeiro que compreende a administração de uma quantidade eficaz de (2'R)-2'-desoxi

28/122

2'-flúor-2'-C-metil nucleosídeos (β-D ou β-L) aqui revelados. A invenção também inclui métodos para tratamento ou prevenção de infecção por Flaviridae, incluibndo todos os membros do gênero Hepacivírus (HCV), gênero Pestivírus (BVDV, CSFV, BDV) ou gênero Flavivírus (grupo de vírus da Dengue, Vírus da encefalite Japonesa (incluindo vírus do oeste do Nilo), e Vírus da febre amarela).

Em vários aspectos, o (2'R)-2'-desoxi-2'-flúor-2'-Cmetil β-D-nucleosídeo tem uma EC₅₀ (concentração eficaz 10 para atingir 50% de inibição) quando testado em um ensaio adequado baseado em célula, de menos que 15 micromolar e mais particularmente, menos que 10 ou 5 micromolar. Em outros aspectos, o nucleosídeo é enantiomericamente enriquecido.

A presente invenção também fornece métodos para o tratamento ou profilaxia de uma infecção por vírus da hepatite C, Infecção por vírus do oeste do Nilo, uma infecção viral de febre amarela ou uma infecção por rinovírus em um hospedeiro que compreende a administração 20 de uma quantidade eficaz de (2' R)-2'-desoxi-2'-flúor-2 ' -Cmetil nucleosídeos (β-D ou β-L) aqui revelados, ou seu sal ou pró-medicamento farmaceuticamente aceitável desse, em combinação ou alternância com um ou mais de outros agentes antivirais eficazes , opcionalmente em um transportador ou 25 diluente farmaceuticamente aceitável desse, como aqui descrito. Exemplos não limitantes dos tipos de agentes antivirais ou seus pró-medicamentos que podem ser usados em combinação com os compostos aqui revelados incluem, mas não se limitam a: interferon, incluindo interferon alfa 2a, interferon alfa 2b, um interferon peguilado, interferon

29/122 beta, interferon gama, interferon tau e interferon omega; uma interleucina, incluindo interleucina 10 e interleucina 12; ribavirina; interferon em combinação com ribavirina; um inibidor de protease incluindo inibidor de NS3; um inibidor de helicase; um inibidor de polimerase; gliotoxina; um inibidor de IRES; e oligonucleotídeo anti-senso; um derivado de tiazolidina; uma benzanilida, uma ribozima; um outro nucleosídeo, pró-medicamento de nucleosídeo ou derivado de nucleosídeo; um 1-amino-alquilciclohexano; um antioxidante incluindo vitamina E; squalene; amantadina; um ácido de bile; ácido N-(fosfonoacetil)-L-aspártico; uma benzenodicarboxamida; ácido poliadenílico; benzimidazóis; timosina; um inibidor de beta tubulina; uma vainc profilática; silibin-fosfatidilcolina fitosoma; e micofenolato.

Os aspectos não limitantes a seguir ilustram alguma metodologia geral de como obter os nucleosídeos da presente invenção. Especificamente, a síntese dos nucleosídeos pode ser realizada por um de dois meios gerais:

1) alquilação do bloco de construção de carboidrato modificado adequado, subsequente fluorinação, seguida por ligação para formar os nucleosídeos da presente invenção (Esquema 1) ou

2) glicosilação para formar o nucleosídeo seguido por alquilação e fluorinação dos nucleosídeos pré-formados da presente invenção (Esquema 2).

Adicionalmente, os L-enantiômeros que correspondem aos compostos da invenção podem ser preparados seguindo os mesmos métodos gerais (Esquemas 1 ou 2), iniciando com o bloco de construção de L-carboidrato correspondente ou L-

30/122 enantiômero do nucleosídeo como o material de iniciação.

seguintes características gerais:

(a) β-D e β-L nucleosídeos com as fórmulas gerais reveladas, ou seus sais ou pró-medicamentos farmaceuticamente aceitáveis desses, como aqui descrito;

(b) processos para a preparação de β-D e β-L nucleosídeos com a fórmula geral revelada, ou seus sais ou pró-medicamentos farmaceuticamente aceitáveis desses, como aqui descrito;

(c) composições farmacêuticas que compreendem um β-D ou β-L nucleosídeo de fórmulas gerais reveladas, ou seu sal ou pró-medicamento farmaceuticamente aceitável desse, em um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável desse, como aqui descrito, para o tratamento ou profilaxia de uma infecção viral em um hospedeiro;

(d) composições farmacêuticas que compreendem um β-D ou β-L nucleosídeo de fórmulas gerais reveladas, ou seu sal ou pró-medicamento farmaceuticamente aceitável desse, em combinação com um ou mais de outros agentes antivirais eficazes, opcionalmente em um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável desse, como aqui descrito, para o tratamento ou profilaxia de uma infecção viral em um hospedeiro;

(e) métodos para o tratamento ou profilaxia de uma infecção por Flaviviridae, incluindo vírus da hepatite C, vírus do oeste do Nilo e vírus da febre amarela e infecção por rinovírus em um hospedeiro que compreende a administração de uma quantidade eficaz de um β-D ou β-L nucleosídeo das fórmulas gerais reveladas, ou seu sal ou

122 pró-medicamento farmaceuticamente aceitável desse, opcíonalmente em um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitavel desse, como aqui descrito;

(f) métodos para o tratamento ou profilaxia de uma infecção por Flaviviridae, incluindo vírus da hepatite C, vírus do oeste do Nilo e vírus da febre amarela e infecção por rinovírus em um hospedeiro que compreende administração de uma quantidade eficaz de um β-D ou β-L nucleosídeo das fórmulas gerais reveladas, ou seu sal ou pró-medicamento farmaceuticamente aceitável desse, em combinação ou alternância com um ou antivirais eficazes, opcionalmente mais de outros agentes em um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável desse, como aqui descrito;

(g) uso de um β-D ou β-L nucleosídeo das fórmulas gerais reveladas, ou seu sal ou pró-medicamento farmaceuticamente aceitável desse, opcionalmente em um transportador farmaceuticamente aceitável, como aqui descrito, para o tratamento ou profilaxia de uma infecção por Flaviviridae, incluindo vírus da hepatite C, vírus do oeste do Nilo e vírus da febre amarela e infecção por rinovírus em um hospedeiro;

(h) uso de um β-D ou β-L nucleosídeo das fórmulas gerais reveladas, ou seu sal ou pró-medicamento farmaceuticamente aceitável desse, em combinação ou alternância com um ou mais de outros agentes antivirais eficazes, opcionalmente em um transportador farmaceuticamente aceitável, como aqui descrito, para o tratamento ou profilaxia de uma infecção por Flaviviridae, incluindo vírus da hepatite C, vírus do oeste do Nilo e

122

(í) uso de um β-D ou β-L ss-L nucleosídeo das fórmulas gerais reveladas, ou seu sal ou pró-medicamento farmaceuticamente aceitável desse, opcionalmente em um transportador farmaceuticamente aceitável, como aqui descrito, na manufatura de um medicamento para o tratamento ou profilaxia de uma infecção por Flaviviridae, incluindo vírus da hepatite C, vírus do oeste do Nilo e vírus da febre amarela e infecção por rinovírus em um hospedeiro;

(j) uso de um β-D ou β-L nucleosídeo das fórmulas gerais reveladas, ou seu sal ou pró-medicamento farmaceuticamente aceitável desse, em combinação ou alternância com um ou mais de outros agentes antivirais eficazes, opcionalmente em um transportador farmaceuticamente aceitável, como aqui descrito, na manufatura de um medicamento para o tratamento ou profilaxia de uma infecção por Flaviviridae, incluindo vírus da hepatite C, vírus do oeste do Nilo e vírus da febre amarela e infecção por rinovírus em um hospedeiro;

(k) uso de um β-D ou β-L nucleosídeo das fórmulas gerais reveladas, ou seu sal ou pró-medicamento farmaceuticamente aceitável desse, opcionalmente em um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável, como aqui descrito, em uma terapia médica, ou seja, como antiviral, por exemplo, para o tratamento ou profilaxia de uma infecção por Flaviviridae, incluindo vírus da hepatite C, vírus do oeste do Nilo e vírus da febre amarela e infecção por rinovírus;

(l) uso de um β-D ou β-L nucleosídeo das fórmulas

33/122 gerais reveladas, como aqui descrito, ou seu sal ou prómedicamento farmaceuticamente aceitável desse, ou seja, como agente antiviral, em combinação ou alternância com um ou mais de outros agentes terapêuticos, ou seja, um outro 5 agente antiviral, opcionalmente em um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável, como aqui descrito, em uma terapia médica, por exemplo, para o tratamento ou profilaxia de uma infecção por Flaviviridae, incluindo vírus da hepatite C, vírus do oeste do Nilo e vírus da 10 febre amarela e infecção por rinovírus em um hospedeiro.

Breve Descrição das Figuras:

Figura 1 é uma descrição gráfica da redução dependente de dose do RNA de replicon de HCV baseada no tratamento com β-D-(2'R)-2'-desoxi-2'-flúor-2'-C-metilcitidina. (A): a 15 redução viral foi comparada à redução dos níveis de RNA celular (RNA ribossômico) para obter valores de índice terapêutico. EC₉₀ que representa 90% da concentração eficaz em 96 horas após a administração dependente de dose de (2'R)-2'-desoxi-2'-flúor-2'-C-metilcitidina foi determinada

como sendo 5 μΜ. (B) : RNA de HCV foi significativamente reduzido em uma maneira dependente de dose por 7 dias após tratamento com 25 μΜ.

Figura 2 apresenta a mudança média de peso (%) de camundongos fêmeas de tipo Swiss no estudo de toxicidade de 25 β-D-(2' R)-2'-desoxi-2'-flúor-2'-C-metilcitidina em várias doses. Injeções intraperitoniais foram administradas no dias 0 a 5 de 0, 3,3, 10, 33, 100 mg/kg. Cada grupo de dosagem continha 5 camundongos e nenhum camundongo morreu durante o estudo de 30 dias.

Figura 3 apresenta a farmacocinética de β-D-(2'R)-2'34/122 desoxi-2'-flúor-2'-C- metilcitidina em macacos Rhesus que receberam uma única dose (33,3 mg/kg) oral ou intravenosa de β-D-(2'R)-2'-desoxi-2'-flúor-2'-C-metilcitidina.

Descrição Detalhada da Invenção:

Várias modalidades da invenção são agora descritas em detalhe. Como usado nessa descrição e através das reivindicações que se segue, o significado de um, uns e o/a inclui referência no plural a menos que o contexto indique claramente de outra forma. Além disso, como usado nessa descrição e nas reivindicações que se segue, o significado de em inclui em e sobre a menos que o contexto indique claramente de outra forma.

Os termos usados nessa especificação geralmente têm seus significados comuns na técnica, dentro do contexto da invenção e no contexto específico onde cada termo é usado. Certos termos que são usados para descrever a invenção são discutidos abaixo, ou em outra parte na especificação, para fornecer um guia adicional para o profissional na descrição das composições e métodos da invenção e como fazê-los e usá-los. Para conveniência, certos termos podem ser enfatizados, por exemplo, o uso de itálico e/ou aspas. O uso de enfatização não tem influência sobre o escopo e significado de um termo; o escopo e significado de um termo são o mesmo, no mesmo contexto, seja ou não enfatizado. Deve ser observado que as mesmas coisas podem ser ditas em mais de uma maneira. Consequentemente, linguagem alternativa e sinônimos podem ser usados para qualquer um dos termos aqui discutidos, também não deve ser dada qualquer significância especial ao fato de um termo ser ou não elaborado como aqui discutido. Sinônimos para certos

35/122 termos são fornecidos. Um relato de um ou mais sinônimos não exclui o uso de outros sinônimos. O uso de exemplos em qualquer parte nessa especificação, incluindo exemplos de quaisquer termos aqui discutidos, é apenas ilustrativo e, de nenhuma forma, limita o escopo e significado da invenção oud e qualquer termo exemplificado. Da mesma forma, a invenção não ê limitada a várias modalidades apresentadas nessa especificação.

Como aqui usado, cerca de ou aproximadamente devem significar 20 por cento, preferivelmente 10 por cento e mais preferivelmente 5 por cento de um valor ou faixa dada. Quantidades numéricas aqui apresentadas são aproximadas, significando que o termo cerca de ou aproximadamente pode ser deduzido, se não expressamente determinado.

A presente invenção fornece (2'R)-2'-desoxi-2'-flúor2'-C-metil nucleosídeos e seus sais e pró-medicamentos farmaceuticamente aceitáveis para o tratamento de infecção por vírus da hepatite C, infecção por vírus do oeste do Nilo, uma infecção viral de febre amarela ou uma infecção por rinovírus em um hospedeiro.

Os compostos revelados ou seus derivados ou sais farmaceuticamente aceitáveis ou formulações farmaceuticamente aceitáveis que contêm esses compostos são úteis na prevenção e tratamento de infecções por HCV. Além disso, esses compostos ou formulações podem ser usados profilaticamente para prevenir o retardar o progresso de doença clínica em indivíduos que são antígeno anti-HCV positivos ou que forma expostos ao HCV.

Os compostos aqui revelados podem ser convertidos em um éster farmaceuticamente aceitável por reação com um

36/122 anidrido ácido.

composto farmaceuticamente aceitável pode ser farmaceuticamente aceitável desse convencional, por exemplo, um haleto ou ou seu derivado convertido em um sal em uma maneira exemplo, por tratamento com uma base adequada. O éster ou sal do composto pode ser convertido no composto parente, por exemplo, por hidrólise.

Definições:

O termo independentemente é usado nessa para indicar que a variável, que é independentemente aplicada, varia composto tal como R^aXYR^a, onde R^a é independentemente carbono ou nitrogênio, ambos R^a podem ser carbono, ambos R^a podem ser nitrogênio, ou um R^a pode ser carbono e o outro R^a nitrogênio.

Como aqui usado, os termos enantiomericamente puro ou enantiomericamente enriquecido se referem a uma nucleosídeo que compreende pelo menos aproximadamente

95%, e preferivelmente aproximadamente 97%,

98%, 99% ou

100% de um único enantiômero daquele

nucleosídeo.

Como aqui usado, termo substancialmente livre de ou substancialmente na ausência de se refere a uma composição de nucleosídeo que inclui pelo menos 85 ou

90% em peso, preferivelmente

95% a 98% em peso, e ainda mais preferivelmente 99% a

100% em peso, do enantiômero designado daquele nucleosídeo. Em uma modalidade preferida, substancialmente livres de enantiômeros.

De forma similar, o termo isolado se refere a uma

37/122

preferivelmente 99% a 100% em peso, do nucleosídeo, o restante compreendendo outras espécies químicas ou enantiômeros.

0 termo	alquil, como aqui usado, a menos que
especificado	de outra maneira, se refere a um

hidrocarboneto saturado primário, secundário ou terciário, linear, ramificado ou cíclico de tipicamente Ci a C₁₀, e especificamente inclui metil, trifluormetil, etil, propil, isopropil, ciclopropil, butil, isobutil, t-butil, pentil,

ciclopentil,	isopentil, neopentil, hexil, isohexil,
ciclohexil,	ciclohexilmetil, 3-metilpentil, 2,2-
dimetilbutil,	e 2,3-dimetilbutil. 0 termo inclui tanto

grupos alquil substituídos quanto não substituídos. Grupos alquil podem ser opcionalmente substituídos com uma ou mais porções selecionadas do grupo que consiste em hidroxil, amino, alquilamino, arilamino, alcoxi, ariloxi, nitro,

ciano, ácido	sulfônico, sulfato, ácido fosfônico, fosfato,
ou fosfonato,	ou qualquer outro grupo funcional viável que
não iniba a	atividade farmacológica desse composto, não
protegido ou	protegido, como necessário, como é conhecido
por aqueles	habilitados na técnica, por exemplo, como

ensinado em T. W. Greene e P. G. M.Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3^a ed. , John Wiley & Sons, 1999, aqui incorporado por referência.

O termo alquil inferior, como aqui usado, e a menos que especificado de outra maneira, se refere a um grupo alquil saturado linear, ramificado, ou se adequado cíclico, (por exemplo, ciclopropil) Ci a C₄, incluindo tanto formas

38/122 substituídas quanto não substituídas. A menos que determinado especificamente de outro modo nesse pedido, quando o alquil e uma porção adequada, o alquil inferior é preferido. De forma similar, quando alquil ou alquil inferior é uma porção adequada, alquil não substituído ou alquil inferior é preferido.

O termo alquilamino ou arilamino se refere a um grupo amino que tem um dois substituintes de alquil ou aril, respectivamente.

O termo protegido como aqui usado e a menos que definido de outra forma se refere a um grupo que é adicionado a um oxigênio, nitrogênio, ou átomo de fósforo para prevenir sua reação adicional ou para outros propósitos. Uma ampla variedade de grupos de proteção de oxigênio e nitrogênio é conhecida por aqueles habilitados na técnica de síntese orgânica. Exemplos não limitantes incluem: C(O)-alquil, C(0)Ph, C(O)aril, CH_3/ CH₂-alquil, CH₂-alquenil, CH₂Ph, CH₂-aril, CH₂O-alquil, CH₂O-aril, SO₂alquil, S0₂-aril, terc-butildimetilsilil, tercbutildifenilsilil, e 1,3-(1,1,3,3- tetraisopropil disiloxanilideno).

O termo aril, como usado nessa, e a menos que do de outra forma, se refere a fenil, bifenil, ou naftil, e preferivelmente fenil. 0 termo inclui porções substituídas e não substituídas. O grupo aril pode ser substituído com uma ou mais porções selecionadas do grupo que consiste em hidroxil, amino, alquilamino, arilamino, alcoxi, ariloxi, nitro, ciano, ácido sulfônico, sulfato, ácido fosfônico, fosfato, ou fosfonato, protegidos ou não protegidos como necessário, como conhecido por aqueles habilitados na

39/122 técnica, por exemplo, como ensinado em Greene, e P.G.M.

Y

Is

Wuts, Protective Groups in Organic

Synthesis,

3^a ed.,

John Wiley & Sons, 1999.

O termo alcaril ou alquilaril se refere a um grupo alquil com um substituinte de aril. 0 arilalquil se refere a um grupo aril termo aralquil ou com um substituinte de alquil.

termo halo, como aqui usado, inclui cloro, bromo, iodo, e flúor.

termo acil se refere a um éster de ácido carboxílico no qual a porção não-carbonil do grupo éster é selecionada de alquil ou alquil inferior linear, ramificado ou cíclico, alcoxialquil incluindo metoximetil, aralquil incluindo benzil, ariloxialquil tal como fenoximetil, aril incluindo fenil opcionalmente substituído com halogênio (F, Cl, Br ou I), Ci a C₄ alquil ou C_x a C₄ alcoxi, ésteres de sulfonato tal como alquil ou aralquil sulfonil incluindo metanossulfonil, o mono, di ou trifosfato éster, tritil ou monometoxitritil, benzil substituído, trialquilsilil (por exemplo dimetil-t-butilsilil) ou difenilmetilsilil (por exemplo, dimetil-t- butilsilil) ou difenilmetilsilil. Grupos aril nos ésteres compreendem um grupo fenil.

O termo acil inferior se refere a um grupo acil no qual a porção não carbonil é alquil inferior.

O termo base de purina ou pirimidina inclui, mas não é limitado a, adenina, N⁶-alquilpurinas, N^s-acilpurinas (onde acil é C(O)(alquil, aril, alquilaril, ou arilalquil), N⁶-benzilpurina, N⁶-halopurina, N⁶-vinilpurina, purina N⁶acetilênica, N⁶-acilpurina, N⁶-hidroxialquil purina, N⁶alquilaminopurina, N⁶-tioalquil purina, N²-alquilpurinas,

40/122

N²-alquil-6-tiopurinas, timina, citosina, 5-fluorcitosina,

5-metilcitosina, 6-azapirimidina, incluindo 6-azacitosina,

2- e/ou 4-mercaptopirimidina, uracil, 5-halouracil, incluindo 5-fluoruracil, C⁵-alquilpirimidinas, C⁵benzilpirimidinas, C⁵-halopirimidinas, C⁵-vinilpirimidina, pirimidina C⁵-acetilênica, C⁵-acil pirimidina, C⁵hidroxialquil purina, C⁵-amidopirimidina, C⁵cianopirimidina, C⁵-iodopirimidina, C⁶-iodopirimidina, C⁵Br-vinilpirimidina, C⁶-Br-vinilpirimidina, C⁵nitropirimidina, C⁵-aminopirimidina, N²-alquilpurinas, N²- alquil-6 -1iopurinas,

5-azacitidinil,

5-azauracilil, triazol-piridinil, imidazolpiridinil, pirrolpirimidinil, e pirazolopirimidinil. Bases de purina incluem, mas não são limitadas a, guanina, adenina, hipoxantina, 2,6diaminopurina, e 6-cloropurina. Grupos de oxigênio e nitrogênio funcionais na base podem ser protegidos como necessário ou desejado. Grupos de proteção adequados são bem conhecidos por aqueles experientes na técnica, e incluem trimetilsilil, dimetil-hexilsilil, t-butil dimetilsilil, e t-butil difenilsilil, tritil, grupos alquil e grupos acil tais como acetil e propionil, metanossulfonil, e p-toluenossulfonil.

termo acil ou éster O-ligado se refere a um grupo de fórmula C(O)R', onde R' é um alquil linear, ramificado ou cíclico (incluindo alquil inferior), aminoácido, aril incluindo fenil, alcaril, aralquil incluindo benzil, alcoxialquil incluindo metoximetil, ariloxialquil tal como fenoximetil; ou alquil substituído (incluindo alquil inferior), aril incluindo fenil opcionalmente substituído com cloro, bromo, flúor, iodo, C_x

41/122 a C₄ alquil ou Ci a C₄ alcoxi, éster de sulfonato tal como alquil ou aralquilsulfonil incluindo metanossulfonil, o éster mono, di ou trifosfato, tritil ou monometoxi-tritil, benzil substituído, alcaril, aralquil incluindo benzil, alcoxialquil incluindo metoximetil, ariloxialquil tal como fenoximetil. Grupos aril nos ésteres compreendem um grupo fenil. Em particular, grupos acil incluem acetil, trifluoracetil, metilacetil, ciclopropilacetil, ciclopropil carboxi, propionil, butiril, hexanoil, heptanoil, octanoil, neo-heptanoil, fenilacetil, 2-acetoxi-2-fenilacetil, difenilacetil, α-metoxi-a-triflúormetil-fenilacetil, bromoacetil, 2-nitro-benzenoacetil, 4-cloro-benzenoacetil,

trimetilacetil, fluoracetil, tiofenoacetil, fenoxiacetil,

2-difenilacetil,

2-cloro-2-fenilacetil, clorodifluoracetil, bromodifluoracetil, perfluoracetil, metoxiacetil,

2clorossulfonilacetil, 3-metoxifenilacetil, terc-butilacetil, tricloroacetil, monocloroacetil, dicloroacetil, 7H-dodecaflúor-heptanoil, perflúorheptanoil,

7H-dodeca-fluorheptanoil, 7-clorododecaflúorheptanoil,

7-cloro-dodecaflúor-heptanoil, 7H-dodecaflúorheptanoil,

7H-dodeca-fluorheptanoil, nona-flúor-3, 6-dioxaheptanoil, nonaflúor-3,6-dioxaheptanoil, perfluorheptanoil, metoxibenzoil, metil 3-amino-5-feniltiofeno-2carboxil,

3,6-dicloro-2-metoxi-benzoil,

4- (1,1,2,2tetraflúor-etoxi)-benzoil,

2-bromo-propionil, omegaaminocAbril, decanoil, n-pentadecanoil, estearil, 3ciclopentil-propionil,

1-benzeno-carboxil,

O-acetil mandelil, pivaloil acetil,

1-adamantano-carboxi1, ciclohexane-carboxil, 2,6-piridinadicarboxil, ciclopropanocarboxi1, c i c1obut ano-carboxi1, perfluorciclohexil

42/122 carboxil, 4-metilbenzoil, clorometil isoxazolilcarbonil, perfluorciclohexil carboxil, crotonil, 1-metil-lH-indazol-

3- carbonil, 2-propenil, isovaleril, 1-pirrolidinacarbonil,

4- fenilbenzoil. Quando o termo acil é usado, significa uma revelação específica e independente de acetil, trifluoracetil, metilacetil, ciclopropilacetil, propionil, butiril, hexanoil, heptanoil, octanoil, neo-heptanoil, fenilacetil, difenilacetil, ct-trifluormetil-fenilacetil,

bromoacetil,

4-cloro-benzeneacetil,

2-cloro-2,2difenilacetil,

2-cloro-2-fenilacetil, trimetilacetil, clorodifluoracetil, perfluoracetil, fluoracetil, bromodifluoracetil,

-tiofenoacetil, terc-butilacetil, tricloroacetil, monocloro-acetil, dicloroacetil, metoxibenzoil,

2-bromo-propionil, decanoil, npentadecanoil, estearil,

3-ciclopentil-propionil,

1benzeno-carboxil, pivaloil acetil, 1-adamantano-carboxil, ciclohexano-carboxil, 2,6-piridinadicarboxil, ciclopropano carboxil, ciclobutane-carboxil, 4-metilbenzoil, crotonil, l-metil-lH-indazol-3-carbonil, 2-propenil, isovaleril, 4fenilbenzoil.

termo aminoácido inclui a, β, γ ou δ aminoácidos de ocorrência natural e sintéticos, inclui mas não são limitados a, aminoácidos encontrados em proteínas, ou seja glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptofano, prolina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina, glutamina, aspartato, glutamato, lisina, arginina e histidina. Em uma modalidade preferida, o aminoácido está na configuração L.

Alternativamente, o aminoácido pode ser um derivado de alanil, valinil, leucinil, isoleuccinil, prolinil,

43/122 fenilalaninil, triptofanoil, metioninil, glicinil, serinil, treoninil, cisteinil, tirosinil, asparaginil, glutaminil, aspartoil, glutaroil, lisinil, argininil, histidinil, βalanil, β-valinil, β-leucinil, β-isoleuccinil, β-prolinil, β-fenilalaninil, β-triptofanoil, β-methioninil, β-glicinil, β-serinil, β-treoninil, β-cisteinil, β-tirosinil, βasparaginil, β-glutaminil, β-aspartoil, β-glutaroil, βlisinil, β-argininil ou β-histidinil.

Quando o termo aminoácido é usado, ele é considerado como uma específica e independente de cada um dos ésteres de α, β, γ ou δ glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptofano, prolina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina, glutamina, aspartato, glutamato, lisina, arginina e histidina nas configurações D e L.

termo hospedeiro, como usado nessa, se refere a um organismo unicelular ou multicelular no qual o vírus pode se replicar, incluindo linhas de células e animais, e preferivelmente um humano. Alternativamente, o hospedeiro pode estar carregando uma parte do genoma viral, cuja replicação ou função pode ser alterada pelos compostos da presente invenção. O termo hospedeiro especificamente se refere a células infectadas, células transfectadas com todo ou parte do genoma viral e animais, em particular, primatas e humanos. Na maior parte das aplicações da presente invenção, o hospedeiro é um paciente humano. Aplicações veterinárias, em certas indicações, entretanto, são claramente percebidas pela presente invenção.

O termo sal ou pró-medicamento farmaceuticamente aceitável é usado através da especificação para descrever

44/122 qualquer forma farmaceuticamente aceitável (tal como um éster, éster de fosfato, sal de um éster ou um grupo relacionado) de um composto que sob administração a um paciente fornece o composto ativo. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem aqueles derivados de bases e ácidos inorgânicos ou orgânicos farmaceuticamente aceitáveis. Sais adequados incluem aqueles derivados de metais alcalinos tais como potássio e sódio, metais alcalinos terrosos tais como cálcio e magnésio entre numerosos outros ácidos bem conhecidos na técnica farmacêutica. Pró- medicamentos farmaceuticamente aceitáveis se referem a um composto que é metabolizado, por exemplo, hidrolisado ou oxidado, no hospedeiro para formar o composto da presente invenção. Exemplos típicos de pró-medicamentos incluem compostos que têm grupos de proteção biologicamente instáveis em uma porção funcional do composto ativo. Pró-medicamentos incluem compostos que podem ser oxidados, reduzidos, aminados, desaminados, hidroxilados, desidroxilados, hidrolisados, desidrolisados, alquilados, desalquilados, acilados, desacilados, fosforilados, desfosforilados para produzir o composto ativo.

I. Composto ativo e derivados e sais fisiologicamente aceitáveis desses:

Um (2'R)-2'-desoxi-2'-flúor-2'-C-metil nucleosídeo ou seu sal ou pró-medicamento farmaceuticamente aceitável desse é fornecido com a estrutura:

45/122 onde Base se refere a uma base de purina ou pirimidina de ocorrência natural ou modificada; X é O, S, CH₂, Se, NH, N-alquil, CHW, C(W)₂, onde W é F, Cl, Br, ou I;

R¹ e R⁷ são independentemente H, fosfato, incluindo monofosfato, difosfato, trifosfato, ou um pró-medicamento de fosfato estabilizado, H-fosfonato, incluindo Hfosfonatos estabilizados, acil, incluindo fenil e acil inferior opcionalmente substituídos, alquil, incluindo alquil inferior, carboxialquilamino O-substituído ou seus derivados peptídicos, éster de sulfonato, incluindo alquil ou arilalquil sulfonil, incluindo metanossulfonil e benzil, onde o grupo fenil é opcionalmente substituído, um lipídeo, incluindo a fosfolipídeo, um L ou D-aminoácido, um carboidrato, um peptídeo, um colesterol, ou outro grupo de partida farmaceuticamente aceitável que quando administrado in vivo ê capaz de fornecer um composto onde R¹ é H ou fosfato; R² é OH ou fosfato; R¹ e R² ou R⁷ também podem ser ligados com grupo fosfato cíclico; e

R² e alquenil,

C(O)O(C_X_₄

C(O)O(C_X.₄

R²' são independentemente H, C_x.₄ alquil, C_x_₄

C_x-₄ alquinil, vinil, N₃, CN, Cl, Br, F, I, NO₂, alquil), C(O)O(C_X-₄ alquil), C(O)O(C_X-₄ alquinil), alquenil), O(C_X_₄ acil), O(C_X-₄ alquil), O(C_X-₄ alquenil),

S (C_X-₄ acil), S (C_x_₄ alquil),

S (C_X-₄ alquinil) ,

S (C_x_₄ alquenil), SO (C_x.₄ acil)

SO(C_X-₄ alquil)

SO(C_X_4 alquinil), SO(C_X_₄ alquenil),

SO₂(C_X_4 acil),

SO₂(C_X-₄ alquil), SO₂ (C_X-₄ alquinil), SO₂ (C_x.₄ alquenil),

O₃S(C_X.₄ acil), O₃S (C_x_4 alquil), O₃S (C_x-₄ alquenil), NH₂,

NH(C_X_4 alquil), NH(C_x_₄ alquenil), NH(C_X-₄ alquinil), NH(C_x_₄ acil),

N(C_x.₄ alquil) ₂,

N(C_x_4 acil)₂, onde alquil, alquinil, alquenil e vinil são opcionalmente substituídos por N₃, CN,

46/122 um a três halogênios (Cl, Br, F, I), N0₂,

C (O)O(C_X-4 alquil), C(O)O(C_X-₄ alquil), C(0)0(C_x_₄ alquinil),

C(O)O(C_X_₄

O(C_X_₄ alquenil),

S (C1-4 acil), S (C_x_₄ alquil),

S(C_X_₄ alquinil), S (C_x_₄ alquenil), SO(C_X_₄ acil), SO(C_X_₄

SO (C_X-₄ alquenil), S0₂ (C_x.₄ acil) alquinil), SO₂ (C_X-₄ alquenil), alquil),

S0₂ (C_X-₄

O₃S (C_X-₄

SO(C_X_₄ alquinil), alquil),

SO₂ (C_x_₄ acil),

O₃S(C_X.₄ alquil), O₃S(C_X_₄ alquenil), NH₂, alquenil),

NH(C_X-₄

NH(C_x_₄ alquinil) ,

NH(C_x_4

NH(Ci-₄ acil),

N(C_X-4 alquil) ₂, para formar um dois de

N₃, CN,

N(C_X-4 vinil

R⁶ alquil metil

CH₂NH₂, acil)₂, OR⁷, R² e R²’ podem opcionalmente

Cl, Br, F, I, NO₂; e é um alquil opcionalmente inferior), ciano (CN), CH₃, (CH₂OH) , fluormetil (CH₂F) ,

CH₂NHCH₃,

CH₂N(CH₃)₂, substituídos), ou flúor.

Em uma segunda modalidade, flúor-2'-C-metil nucleosídeo farmaceuticamente aceitável estrutura:

onde Base, se ligar substituído por um ou substituído (incluindo

OCH₃, OCH₂CH₃, hidroxi azido (N₃) , CHCN, CH₂N₃, alcino um ou seu sal desse é

(opcionalmente (2'R)-2'-desoxi-2'ou pró-medicamento fornecido com a são como acima definido.

Uma terceira modalidade fornece um (2'R) -2'-desoxi-2' flúor-2'-C-metil nucleosídeo ou seu sal ou pró-medicamento

aceitavel desse com a estrutura:

122

onde X, R¹, R², R²

R⁶ e R⁷ são como acima definido, e

Base é selecionada de

R⁴

(a)

Y é N ou CH;

R³, R⁴ e R⁵ são independentemente H, halogênio (incluindo F, Cl, Br, I), OH, OR' , SH, SR', NH₂, NHR',

NR'2, alquil inferior de Ci-C₆, alquil inferior de Ci-C₆ halogenado (F, Cl, Br, I) como CF₃ e CH₂CH₂F, alquenil inferior de C₂-C₆ como CH=CH₂, alquenil inferior de C₂-C₆ halogenado (F, Cl, Br, I) como CH=CHC1, CH=CHBr e CH=CHI, alquinil inferior de C₂-C₆ como C^CH, alquinil inferior de

C₂-C₆ halogenado (F, Cl, Br, I), alcoxi inferior de Ci-Cg como CH₂OH e CH₂CH₂OH, alcoxi inferior de Ci-C₆ halogenado (F, Cl, Br, I), CO₂H, CO₂R' , CONH₂, CONHR' , CONR'₂, CH=CHCO₂H, CH=CHCO₂R' ;

R' é um alquil opcionalmente substituído de Ci-Ci₂ (particularmente quando o alquil é um resíduo de aminoácido), cicloalquil, alquinil opcionalmente substituído de C₂-C₆, alquenil inferior opcionalmente substituído de C₂-C₆ou acil opcionalmente substituído.

Em uma quarta modalidade, um (2'R)-2'-desoxi-2'-flúor2'-C-metil nucleosídeo ou seu sal ou pró-medicamento

48/122

η.

farmaceuticamente aceitável desse é fornecido com a estrutura :

definido.

Uma quinta modalidade fornece nucleosídeo ou seu flúor-2'-C-metil (2'R)-2'-desoxi-2'

e Y sao como acima ou pró-medicamento farmaceuticamente aceitável desse com a estrutura:

onde Base se refere a uma base de purina ou pirimidina de ocorrência natural ou modificada;

R⁷ é independentemente H, fosfato, incluindo monofosfato, difosfato, trifosfato, ou um pró-medicamento de fosfato estabilizado, H-fosfonato, incluindo Hfosfonatos estabilizados, acil, incluindo fenil e acil inferior opcionalmente substituídos, alquil, incluindo alquil inferior, carboxialquilamino O-substituído ou seus derivados peptídicos, éster de sulfonato, incluindo alquil

49/122 ou arilalquil sulfonil, incluindo metanossulfonil e benzil, onde o grupo fenil é opcionalmente substituído, um lipídeo, incluindo a fosfolipídeo, um L ou D-aminoácido, um carboidrato, um peptídeo, um colesterol, ou outro grupo de partida farmaceuticamente aceitável que quando administrado in vivo é capaz de fornecer um composto onde R¹ ou R⁷ é independentemente H ou fosfato; R¹ e R⁷ também podem ser ligados com grupo fosfato cíclico; e onde X e R¹ são como acima definido.

Em uma sexta modalidade, um (2'R)-2'-desoxi-2'-flúor2'-C-metil nucleosídeo ou seu sal ou pró-medicamento farmaceuticamente aceitável desse é fornecido com a estrutura:

onde Base se refere a uma base de purina ou pirimidina de ocorrência natural ou modificada; e onde R¹ e R⁷ são como acima definido.

Uma sétima modalidade fornece um (2'R)-2'-desoxi-2'flúor-2'-C-metil nucleosídeo ou seu sal ou pró-medicamento farmaceuticamente aceitável desse com a estrutura:

onde Base é selecionada de

122

(a)

e onde X, Y, R¹, R³, R⁴, R⁵, R⁷ e R' são como acima definido.

Em uma oitava modalidade, um (2'R)-2'-desoxi-2'-flúor2'-C-metil nucleosídeo ou seu sal ou pró-medicamento estrutura:

definido.

farmaceuticamente

com a

Uma nona modalidade fornece

como acima (2'R)-2'-desoxi-2' flúor-2'-C-metil nucleosídeo ou seu sal ou pró-medicamento farmaceuticamente aceitável desse com a estrutura:

51/122 onde Base é:

«rw* e onde X é definido como acima, R¹ é H, R² é OH, R²' é H, R³ é H, R⁴ é NH₂ ou OH, e R⁶ é H.

Em uma décima modalidade, um (2'R)-2'-desoxi-2'-flúor2'-C-metil nucleosídeo ou seu sal ou pró-medicamento farmaceuticamente aceitável desse fornecido com a estrutura:

onde Base é:

R⁴

e onde R¹ é H, R² é OH, R²' é H, R³ é H, R⁴ é NH₂ ou OH, e R⁶ é H.

Uma décima-primeira modalidade fornece um (2'R)-2'desoxi-2'-flúor-2'-C-metil nucleosídeo ou seu sal ou prómedicamento farmaceuticamente aceitável desse com a estrutura:

r⁷o f

52/122 onde Base e onde X

é definido como acima, R¹ é

H, R³ é H, R⁴ é

NH₂ ou OH, R⁶ é H, e R⁷ é H.

Em uma décima-segunda modalidade, um (2'R)-2'-desoxi2'-flúor-2'-C-metil nucleosídeo ou seu sal ou promedicamento farmaceuticamente aceitável desse é fornecido com a estrutura:

onde Base é:

R⁴

e onde R¹ é H, R³ é H, R⁴ é NH₂ ou OH, e R⁷ é H.

Uma décima-terceira modalidade fornece um (2'R)-2'~ desoxi-2'-flúor-2'-C-metil nucleosídeo ou seu sal ou prómedicamento farmaceuticamente aceitável desse com a estrutura:

53/122

Em uma décima-quarta modalidade, um (2'R)-2'-desoxi2'-flúor-2'-C-metil nucleosídeo, seu sal ou produto farmaceuticamente aceitável desse é fornecido pela estrutura:

onde X, R¹, R⁶ e R⁷ são como acima definido.

Em uma décima-quinta modalidade, um (2'R)-2'-desoxi2'-flúor-2'-C-metil nucleosídeo, seu sal ou produto farmaceuticamente aceitável desse é fornecido pela estrutura:

onde R¹

Em uma décima-sexta modalidade, um (2'R)-2'-desoxi-2'flúor-2'-C-metil nucleosídeo, seu sal ou produto farmaceuticamente aceitável desse é fornecido pela estrutura:

54/122

Em uma décima-sétima modalidade, um (2'R)-2'-desoxi-

2'-fluor-2'-C-metil nucleosídeo, seu sal ou produto farmaceuticamente aceitável desse é fornecido pela estrutura:

onde X e R¹ são como acima definido.

Em uma décima-oitava modalidade

2'-flúor-2'-C-metil nucleosídeo farmaceuticamente estrutura:

nucleosídeo, flúor-2'-C-metil farmaceuticamente aceitável aceitável

produto produto soxi-2' (2'R)-2'-desoxifornecido pela pela estrutura:

onde X e R¹ são como acima definido.

55/122

Em uma vigésima modalidade, um (2'R)-2'-desoxi-2'

L/ flúor-2'-C-metil nucleosídeo, seu sal ou produto farmaceuticamente aceitável desse é fornecido pela estrutura:

A presente invenção também contempla derivados de éster de ácido 5'-trifosfato trifosfórico do grupo 5'hidroxil de um composto de nucleosídeo da presente invenção tendo a seguinte fórmula estrutural geral:

onde Base, X, R², R²' e R⁶ são as definido como acima.

Os compostos da presente invenção também devem incluir sais do éster de trifosfato farmaceuticamente aceitáveis assim como sais farmaceuticamente aceitável de derivados de éster de 5'-difosfato e 5'-monofosfato com as seguintes fórmulas estruturais, respectivamente.

O li ~ «_.p «—Q

OH

56/122

-i

onde Base, X, R², R²' e R⁶ são como acima definido.

Exemplos não limitantes adicionais de derivados de ácido fosfórico são os nucleosídeos da presente invenção que são mostrados abaixo:

H*

F

57/122

Ο

ΗΟ-Ρ-Ο

ΟΗ

Η'

58/122

A presente invenção também contempla que qualquer derivado de fosfato nucleosídeo pode incluir um 5'-(S-acil2-tioetil)fosfato ou SATE derivado de mono ou di-éster dos 5'-monofosfatos.

Modalidades alternativas são também contempladas onde o grupo N-4 amino em um derivado de fosfato nucleosídeo pode ser substituído com H, F, Cl, Br ou I.

Modalidades adicionais incluem pró-medicamentos 3' e/ou 5' como descrito em mais detalhes nessa.

Nas várias modalidades, os derivados fluorinados são preferidos. Flúor é visto como isoestérico com hidrogênio devido a seu tamanho (raio de Van der Waals para H é l,20A e para F 1,35A). Entretanto, o peso atômico (18,998) e eletronegatividade do flúor (4,0 [escala de Pauling], 4,000 [escala de Sanderson]) são mais similares ao oxigênio (3,5 [Pauling] 3,654 [Sanderson]) que ao hidrogênio (2,1 [Pauling], 2,592 [Sanderson]) (March, J., Advances in Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, ans Structure terceira edição, 1985, p. 14., Wiley Interscience, New York) . Flúor é conhecido por ser capaz de formar uma ligação de hidrogênio, mas diferente de um grupo hidroxil (que pode agir tanto como aceitador de próton quando doador de próton) flúor age apenas como um aceitador de próton. Por outro lado, 2'-flúor-ribonucleosídeos podem ser vistos como análogos tanto de ribonucleosídeos quanto de desoxinucleosídeos. Eles podem ser melhor reconhecidos por RNA polimerase viral no nível de trifosfato que pela RNA polimerase do hospedeiro assim inibindo seletivamente a enzima viral.

II. Sais e pró-medicamentos farmaceuticamente

59/122 aceitáveis :

Em casos onde os compostos são suficientemente básicos ou ácidos para formar sais básicos ou ácidos estáveis não tóxicos, a administração do composto como um sal farmaceuticamente aceitável pode ser adequada. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem aqueles derivados de bases e ácidos inorgânicos ou orgânicos farmaceuticamente aceitáveis. Sais adequados incluem aqueles derivados de metais alcalinos como potássio e sódio, metais alcalinos terrosos como cálcio e magnésio, entre numerosos outros ácidos bem conhecidos no campo farmacêutico. Em particular, exemplos de sais farmaceuticamente aceitável são sais de adição de ácido orgânico formados com ácidos, que formam um ânion fisiologicamente aceitável, por exemplo, tosilato, metanossulfonato, acetato, citrato, malonato, tartarato, succinato, benzoato, ascorbato, α-cetoglutarato, e aglicerofosfato. Sais inorgânicos adequados também podem ser formados, incluindo, sais de sulfato, nitrato, bicarbonato, e carbonato.

Sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser obtidos usando procedimentos padrão bem conhecidos na técnica, por exemplo pela reação de um composto suficientemente básico tal como uma amina com um ácido adequado gerando um ânion fisiologicamente aceitável. Metal alcalino (por exemplo, sódio, potássio ou lítio) ou metal alcalino terroso (por exemplo, cálcio) sais de ácidos carboxílicos também podem ser feitos.

Qualquer um dos nucleosídeos aqui descritos podem ser administrados como um pró-medicamento de nucleotídeo para aumentar a atividade, biodisponibilidade, estabilidade ou

60/122 de outra forma alterar as propriedades do nucleosídeo. Inúmeros ligantes de pró-medicamento de nucleotídeo são

TX conhecidos.

Em geral, alquilação, acilação ou outra modificação lipofílica do mono, di ou trifosfato do nucleosídeo aumentará a estabilidade do nucleotídeo.

Exemplos de grupos substituintes que podem substituir um ou mais hidrogênios na porção fosfato são alquil, aril, esteróides, carboidratos, incluindo açúcares, 1,2diacilglicerol e álcoois. Vários são descritos em R. Jones e N. Bischofberger, Antiviral Research, 27 (1995) 1-17.

Qualquer um desses pode ser usado em combinação com os nucleosídeos revelados para atingir um efeito desejado.

nucleosídeo ativo pode ser também fornecido como um 5'-fosfoéter lipídeo ou um 5'-éter lipídeo, como revelado nas referências a seguir, que são aqui incorporadas por referência: Kucera, L. S., N. Iyer, E. Leake, A. Raben, Modest Ε. K. , D. L. W. , e C. Piantadosi. 1990. Novel membrane-interactive ether lipid analogs that inhibit infectious HIV-1 production and induce defective virus formation AIDS Res. Hum. Retro Viruses. 6:491- 501;

Piantadosi, C., J. Marasco C. J., S. L. Morris-Natschke, K. L. Meyer, F. Gumus, J. R. Surles, K. S. Ishaq, L. S. Kucera, N. Iyer, C. A. Wallen, S. Piantadosi, e E. J. Modest. 1991. Synthesis and evaluation of novel ether lipid nucleoside conjugates for anti-HIV activity. J. Med. Chem. 34: 1408.1414; Hosteller, K. Y. , D. D. Richman, D.

A. Carson, L. M. Stuhmiller, G. Μ. T. van Wijk, e H. van den Bosch. 1992. Greatly enhanced inhibition of human immunodeficiency virus type 1 replication in CEM and HT4-6C cells by

3'-deoxyithymidine diphosphate

61/122 dimyristoylglycerol, lipid prodrug of deoxythymidine.

Antimicrob.

Agents

Chemother.

2025.2029 ; Hosetler, K. Y. ,

L. M. Stuhmiller,

H.

B.

Lenting, H. van den Bosch, e D. D. Richman,

1990 .

Synthesis and antiretroviral activity of phospholipid analogs of azidothymidine and other antiviralnucleosides

J. Biol. Chem. 265: 61127.

Exemplos não limitantes de patentes

U. S. que revelam substituintes lipofílicos adequados que podem se incorporados de forma covalente no nucleosídeo, nucleosídeo ou preparações lipofílicas, incluem Patentes U. S. Nos.

5.149.794; 5.194.654; 5.223.263; 5.256.641; 5.411.947;

5.463.092; 5.543.389; 5.543.390; 5.543.391; e 5.554.728, todas aqui incorporadas por referência. Pedidos de patente estrangeiras que revelam substituintes lipofílicos que podem ser unidos aos nucleosídeos da presente invenção, ou preparações lipofílicas, incluem WO 89/02733, WO 90/00555, WO 91/16920, WO 91/18914, WO 93/00910, WO 94/26273, WO 96/15132, EP 0 350 287, EP 93917054.4, e WO 91/19721.

III. Composições Farmacêuticas:

Composições farmacêuticas baseadas em um composto β-D ou β-L aqui revelado ou seu sal ou pró-medicamento farmaceuticamente aceitável podem ser preparadas em uma quantidade terapeuticamente eficaz para tratar uma infecção por Flaviviridae, incluindo vírus da hepatite C, vírus do oeste do Nilo, vírus da febre amarela, e uma infecção por rinovírus, opcionalmente em combinação com um aditivo, transportador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. A quantidade terapeuticamente eficaz pode variar com a

122

regime de tratamento a ser empregado, da farmacocinética do j

agente usado, assim como do paciente tratado. 47 *

V

Em um aspecto de acordo com a presente invenção, o composto de acordo com a presente invenção é formulado preferivelmente em uma mistura com um transportador farmaceuticamente aceitável.

Em geral, preferível administrar a farmacêutica em forma de administração oral, porém podem ser administradas por via parenteral, intravenosa, intramuscular, transdérmica, bucal, subcutânea, supositórios ou intravenosas e intramusculares são preferivelmente administradas em solução salina estéril. Uma pessoa habilitada na técnica pode modificar a formulação dentro dos ensinamentos da especificação para fornecer numerosas formulações para uma via de administração em particular sem transformar as composições da presente invenção em instáveis ou que comprometam sua atividade terapêutica. Em particular, uma modificação de um composto desejado para torná-la mais solúvel em água ou outro veículo, por exemplo, pode ser facilmente realizada por modificação rotineira (formulação de sal, esterificação etc.).

Em certas formas de dosagem farmacêutica, a forma de pró-medicamento do composto, especialmente incluindo aciladas (acetilada ou outra) e derivados de éter, ésteres de fosfato e varias formas de sal dos presentes compostos, é preferida. Uma pessoa habilitada na técnica reconhecerá como modificar facilmente o presente composto a uma forma de pró-medicamento para facilitar a liberação do composto

63/122 ativo a um local desejado no organismo hospedeiro ou paciente. O profissional também pode tirar vantagem dos parâmetros farmacocinéticos favoráveis da forma de próÁ medicamento, quando aplicável, na liberação do composto desejado a um local desejado no organismo hospedeiro ou paciente para maximizar o efeito pretendido do composto no tratamento de uma infecção por Flaviviridae, incluindo vírus da hepatite C, vírus do oeste do Nilo, vírus da febre amarela, e uma infecção por rinovírus.

A quantidade de composto incluída em formulações terapeuticamente ativas, de acordo com a presente invenção, é uma quantidade eficaz para tratar a infecção ou condição, em modalidades preferidas, uma infecção por Flaviviridae, incluindo vírus da hepatite C, vírus do oeste do Nilo, vírus da febre amarela, e uma infecção por rinovírus. Em geral, uma quantidade terapeuticamente eficaz do presente composto em forma de dosagem farmacêutica varia comumente de cerca de 50 mg a cerca de 2.000 mg ou mais, dependendo do composto usado, da condição ou infecção tratada e da via de administração. Para os objetivos da presente invenção, uma quantidade profilaticamente ou preventivamente eficaz das composições, de acordo com a presente invenção, está na mesma faixa de concentração como acima apresentado para quantidade terapeuticamente eficaz e é comumente a mesma que a quantidade terapeuticamente eficaz.

A administração do composto ativo pode variar de contínua (gotejamento intravenoso) a várias administrações orais por dia (por exemplo, Q.I.D., etc.) e pode incluir administração oral, tópica, parenteral, intramuscular, intravenosa, subcutânea, transdérmica (que

64/122 inclui um agente de intensificação de penetração), bucal e supositorio, entre outras vias de administração. Ç,

Comprimidos orais revestidos entéricos também podem ser usados para melhorar a biodisponibilidade e estabilidade dos compostos de uma via de administração oral. A forma de dosagem mais eficaz dependerá da farmacocinética do agente particular escolhido, assim como da severidade da doença no paciente. Formas de dosagem oral são particularmente preferidas, pela facilidade de administração e provável adaptação favorável do paciente.

Para preparar as composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais dos compostos de acordo com a presente invenção são preferivelmente misturados com um transportador farmaceuticamente aceitável de acordo com técnicas farmacêuticas de formação de compostos convencionais para produzir a dose. Um transportador pode ter uma variedade de formas dependendo da forma da preparação desejada para administração, por exemplo, oral ou parenteral. Na preparação de composições farmacêuticas em forma de dosagem oral, qualquer um dos meios farmacêuticos usuais pode ser usado. Portanto, para preparações orais líquidas como suspensões, elixires e soluções, transportadores adequados e aditivos incluindo água, glicóis, óleos, álcoois, agentes flavorizantes, conservantes, agentes colorantes e outros podem ser usados. Para preparações orais sólidas como pós, comprimidos, cápsulas e para preparações sólidas como supositórios, podem ser usados veículos e aditivos adequados, incluindo amidos, veículos de açúcar, tais como dextrose, manitol,

65/122 lactose e veículos relacionados, diluentes, agentes de granulação, lubrificantes, ligantes, agentes de desintegração e semelhantes. Se desejado, os comprimidos ou cápsulas podem ter revestimento entérico para a liberação 5 sustentada por técnicas padronizadas. 0 uso destas formas

de dosagem pode ter um impacto significativo sobre a biodisponibilidade dos compostos no paciente.

Para formulações parenterais, o veículo compreenderá normalmente água estéril ou solução aquosa de cloreto de 10 sódio, embora outros ingredientes, incluindo aqueles que auxiliam na dispersão, também podem ser incluídos. Quando se usa água e esta tiver que ser mantida estéril, as composições e veículos também devem ser esterilizados. Suspensões injetáveis também podem ser preparadas, quando 15 então podem ser empregados veículos líquidos adequados, agentes de suspensão e semelhantes.

Suspensões lipossômicas (incluindo lipossomos dirigidos a antígenos virais) também podem ser preparadas por métodos convencionais para a produção de veículos 20 farmaceuticamente aceitáveis. Isto pode ser adequado para a liberação de nucleosídeos livres, nucleosídeos de acil ou formas de pró-medicamento de éster fosfato dos compostos de nucleosídeo de acordo com a presente invenção.

Em modalidades particularmente preferidas de acordo com a presente invenção, os compostos e composições são usados para tratar, prevenir ou retardar o surgimento de infecções por Flaviviridae, incluindo vírus da hepatite C, vírus do oeste do Nilo, vírus da febre amarela, e uma infecção por rinovírus. Os presentes compostos são preferivelmente administrados por via oral, mas podem ser

66/122

supositório.

via parenteral

compostos

com

presente invenção,

função de sua baixa toxicidade para as células hospedeiras em certos casos, podem ser empregados de forma vantajosa profilaticamente para evitar infecções por Flaviviridae incluindo vírus da hepatite C, vírus do oeste do Nilo, vírus da febre amarela, e uma infecção por rinovírus ou para evitar a ocorrência de sintomas clínicos associados à infecção viral ou condição. Dessa forma, a presente invenção também engloba métodos para o tratamento profilático de infecção viral e, em particular, infecções por Flaviviridae (incluindo HCV) ou de uma condição relacionada à proliferação celular anormal. Dessa forma, a presente invenção também engloba métodos para o tratamento profilático de infecção viral, e em particular de uma infecção por Flaviviridae, incluindo vírus da hepatite C, vírus do oeste do Nilo, vírus da febre amarela, e uma infecção por rinovírus. Nesse aspecto, de acordo com a presente invenção, as presentes composições são usadas para prevenir ou retardar o surgimento de uma infecção por Flaviviridae, incluindo vírus da hepatite C, vírus do oeste do Nilo, vírus da febre amarela, e uma infecção por rinovírus. Esse método profilático compreende a administração a um paciente em necessidade de tal tratamento, ou que está em risco de desenvolvimento do vírus ou condição, de uma quantidade de um composto de acordo com a presente invenção eficaz para aliviar, prevenir ou retardar o surgimento da infecção viral ou condição. No tratamento profilático, de acordo com a

67/122

presente invenção,

preferível

composto

utilizado deva ter baixa toxicidade e preferivelmente deva z?7 γ ser não toxico ao paciente. E particularmente preferível, ' nesse aspecto da presente invenção, que o composto que é usado seja eficaz ao máximo contra o vírus ou condição e deve exibir um mínimo de toxicidade ao paciente. No caso de uma infecção por Flaviviridae, incluindo vírus da hepatite C, vírus do oeste do Nilo, vírus da febre amarela, e uma infecção por rinovírus, compostos de acordo com a presente invenção, que podem se usados para tratar esses estados de doença, podem ser administrados na mesma faixa de dosagem para tratamento terapêutico (ou seja, cerca de 250 microgramas até 1 grama ou mais de uma quatro vezes por dia para uma forma de dosagem oral) como um agente profilático para prevenir a proliferação da infecção viral, ou alternativamente, para prolongar o surgimento de infecção viral, que se manifesta em sintomas clínicos.

Além disso, compostos de acordo com a presente invenção podem ser administrados em combinação ou alternância com um ou mais agentes antivirais, incluindo outros compostos da presente invenção. Certos compostos de acordo com a presente invenção podem ser eficazes para melhorar a atividade biológica de certos agentes de acordo com a presente invenção por redução do metabolismo, catabolismo ou inativação de outros compostos e como tal, são co-administrados para esse efeito pretendido.

IV. Estereoisomerismo e Polimorfismo:

Estima-se que os nucleosídeos da presente invenção possuem vários centros quirais e podem existir e ser isolados em formas oticamente ativas e racêmicas. Alguns

68/122

compostos podem

polimorfismo. Deve ser compreendido que a presente invenção engloba qualquer forma racêmica, oticamente ativa, diastereomérica, polimórfica, ou estereoisomérica ou misturas dessas, de um composto da invenção, que possui as propriedades úteis aqui descritas. É bem conhecido na técnica como preparar formas oticamente ativas (por exemplo, por resolução da forma racêmica por técnicas de recristalização, por síntese de materiais de iniciação oticamente ativos, por síntese quiral ou por separação cromatográfica usando uma fase estacionária quiral).

Carbonos do nucleosídeo são quirais, seus substítuintes não hidrogênio (a base e os grupos CHOR, respectivamente) podem ser cis (no mesmo lado) ou trans (nos lados opostos) com relação ao sistema de anel de açúcar. Os quatro isômeros óticos, portanto, são representados pelas seguintes configurações (quando orientam a porção de açúcar em um plano horizontal de forma que o átomo de oxigênio está na parte de trás) : cis (com ambos grupos acima, que corresponde à configuração de nucleosídeos β-D de ocorrência natural), cis (com ambos grupos abaixo, que é uma configuração β-L de ocorrência não natural), trans (com o substituinte de C2' acima e o substituinte de C4' abaixo), e trans (com o substituinte de C2' abaixo e o com o substituinte de C4' acima). Os nucleosídeos D são nucleosídeos cis em uma configuração natural e os nucleosídeos L são nucleosídeos cis na configuração de ocorrência não natural.

Do mesmo modo, a maioria dos aminoácidos é quiral (desenahda como L ou D, onde o enantiômero L é a

69/122 configuração de ocorrência natural) e pode existir como enantiômeros separados. /3^

Exemplos de métodos para obter materiais oticamente ativos são conhecidos na técnica, e incluem pelo menos os seguintes.

i) separação física de cristais - uma técnica por onde cristais macroscópicos dos enantiômeros individuais são separados manualmente. Essa técnica pode ser usada se os cristais dos enantiômeros separados existirem, ou seja, o material é um conglomerado, e os cristais são visualmente distintos;

ii) cristalização simultânea - uma técnica por onde os enantiômeros individuais são cristalizados separadamente a partir de uma solução do racemato, possível apenas se o último for um conglomerado no estado sólido;

iii) resoluções enzimáticas - uma técnica por onde separação parcial ou completa de um racemato em virtude de diferentes taxas de reação para os enantiômeros com uma enzima;

iv) síntese assimétrica enzimática - uma técnica sintética por onde pelo menos uma etapa da síntese usa uma reação enzimática para obter um precursor enantiomericamente puro ou sintético enriquecido do enantiômero desejado;

v) síntese assimétrica química - uma técnica sintética por onde o enantiômero desejado é sintetizado a partir de um precursor aquiral sob condições que produzem assimetria (ou seja, quiralidade) no produto, que pode ser atingida usando catalisadores quirais ou auxiliares quirais;

vi) separações de diastereômero - uma técnica por onde

70/122 um composto racêmico reage com um reagente enantiomericamente puro (o auxiliar quiral) que converte os enantiômeros individuais diastereômeros.

Os diastereômeros resultantes são então separados por cromatografia em virtude de suas diferenças estruturais agora mais distintas e o auxiliar quiral posteriormente removido para obter o enantiômero desejado;

vii) transformações assimétricas de primeira e segunda ordem - uma técnica por onde diastereômeros do racemato se equilibram para produzir uma preponderância na solução do diastereômero do enantiômero desejado ou onde cristalização preferencial do diastereômero do enantiômero desejado perturba o equilíbrio de forma que eventualmente em princípio todo o material é convertido ao diastereômero cristalino do enantiômero desejado. 0 enantiômero desejado é então liberado do diastereômero;

viii) resoluções cinéticas - essa técnica se refere à realização de resolução parcial ou completa de um racemato (ou de uma resolução adicional de um composto parcialmente resolvido) em virtude de taxas de reação desigual dos enantiômeros com um reagente quiral, não racêmico ou catalisador sob condições cinéticas;

ix) síntese enantio-específica de precursores não racêmicos - uma técnica sintética por onde o enantiômero desejado é obtido a partir de materiais de iniciação não quirais e onde a integridade estereoquímica não é ou é apenas minimamente comprometida pelo curso da síntese;

x) cromatografia líquida quiral - uma técnica por onde os enantiômeros de um racemato são separados em uma fase

122 móvel líquida em virtude de suas interações diferentes com uma fase estacionária. A fase estacionária pode ser feita de material quiral ou a fase móvel pode conter um material quiral adicional para provocar as interações diferentes;

xi) cromatografia a gás quiral - uma técnica por onde o racemato é volatilizado e os enantiómeros são separados em virtude de suas interações diferentes na fase móvel gasosa com uma coluna contendo uma fase adsorvente quiral não racêmica fixa;

xii) extração com solventes quirais - uma técnica por onde os enantiómeros são separados em virtude de dissolução preferencial de um enantiômero em um solvente quiral particular;

xiii) transporte através de membranas quirais - uma técnica por onde um racemato é colocado em contato com uma fina barreira de membrana. A barreira tipicamente separa dois fluidos miscíveis, um contendo o racemato, e um que dirige força tal como concentração ou pressão diferencial causa transporte preferencial através da barreira de membrana. A separação ocorre como um resultado da natureza quiral não racêmica da membrana que permite que apenas um enantiômero do racemato passe através dela.

Cromatografia quiral, incluindo cromatografia em leito móvel simulada, é usada em uma modalidade. Uma ampla variedade de fases quirais estacionárias é comercialmente disponível.

Alguns dos compostos aqui descritos contêm ligações duplas olefínicas e, a menos que especificado de outra maneira, devem incluir ambos isómeros geométricos E e Z.

Além disso, alguns dos nucleosídeos aqui descritos,

72/122 podem existir como tautômeros, como, tautômeros de cetoenol. Os tautômeros individuais assim como misturas desses

devem ser englobados nos compostos da presente invenção como ilustrado abaixo.

Uma (2' R)-2'-desoxi-2'-flúor-2'-C-metilcitidina:

Uma (2'R)-2'-desoxi-2'-flúor-2'-C-metilguanosina:

Uma

metiladenosina:

73/122

Em cada um dos exemplos acima, a primeira estrutura desenhada é a forma preferida.

V. Pró-medicamentos e Derivados.· composto ativo pode ser administrado como qualquer sal ou pró-medicamento que sob administração ao recipiente é capaz de fornecer diretamente ou indiretamente o composto parente, ou que exibe atividade em si. Exemplos não limitantes são os sais farmaceuticamente aceitáveis (alternativamente referidos como sais fisiologicamente aceitáveis), e um composto, que foi alquilado, acilado ou modificado na posição 5' ou na base de purina ou pirimidina (um tipo de pró-medicamento farmaceuticamente aceitável). Além disso, as modificações podem afetar a atividade biológica do composto, em alguns casos aumentado a atividade sobre o composto parente. Isso pode ser facilmente avaliado por preparação do sal ou prómedicamento e teste de sua atividade antiviral de acordo com os métodos aqui descritos, ou outros métodos conhecidos por aqueles habilitados na técnica.

Sais Farmaceuticamente Aceitáveis:

Em casos onde os compostos são suficientemente básicos ou ácidos para formar sais básicos ou ácidos estáveis não tóxicos, a administração do composto como um sal farmaceuticamente aceitável pode ser adequada. Exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis são sais de adição de ácido orgânico formados pela adição de ácidos, que formam um ânion fisiologicamente aceitável, por exemplo, tosilato, metanossulfonato, acetato, citrato, malonato, tartarato, succinato, benzoato, ascorbato, α-cetoglutarato, aglicerofosfato, formato, fumarato, propionato, glicolato,

74/122 lactato, piruvato, oxalato, maleato, e salicilato. Sais ·?

A

inorgânicos adequados também podem ser formados, incluindo, sais de sulfato, nitrato, bicarbonato, sais de carbonato, hidrobromato e ácido fosfórico. Em uma modalidade preferida, o sal é um sal mono- ou di-hidrocloreto.

Sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser obtidos usando procedimentos padrão bem conhecidos na técnica, por exemplo pela reação de um composto suficientemente básico tal como uma amina com um ácido adequado gerando um ânion fisiologicamente aceitável. Metal alcalino (por exemplo, sódio, potássio ou lítio) ou metal alcalino terroso (por exemplo, cálcio) sais de ácidos carboxílicos também podem ser feitos. Em uma modalidade, o sal é um sal de hidrocloreto, hidrobrometo ou mesilato do composto. Em uma modalidade adicional, o sal farmaceuticamente aceitável é um sal de dihidrocloreto dihidrobrometo ou dimesilato.

Formulações de Pró-medicamento de Nucleotídeo:

Os nucleosídeos aqui descritos podem ser administrados como um pró-medicamento de nucleotídeo para aumentar a atividade, biodisponibilidade, estabilidade ou de outra forma alterar as propriedades do nucleosídeo. Inúmeros ligantes de pró- medicamento de nucleotídeo são conhecidos. Em geral, alquilação, acilação ou outra modificação lipofílica do mono, di ou trifosfato do nucleosídeo reduz a polaridade e permite a passagem em células. Exemplos de grupos substituintes que podem substituir um ou mais hidrogênios na porção fosfato são alquil, aril, esteróides, carboidratos, incluindo açúcares, 1,2-diacilglicerol e álcoois. Vários são descritos em R. Jones e N. Bisehoferger, Antiviral Research, 1995,27: 1-17. Qualquer

75/122

um desses	pode	ser usado	em combinação com os	nucleosídeos
revelados	para	atingir um	efeito desejado.
Em	uma	modalidade	alternativa, o	composto	é

administrado como um fosfonato ou derivado de SATE

O nucleosídeo ativo pode ser também fornecido como um 2', 3' e/ou 5'-fosfoéter lipídeo ou um 2', 3' e/ou 5'-éter lipídeo. Exemplos não limitantes são descritos e incluem as referências a seguir, que são aqui incorporadas por referência: Kucera, L.S., N. Iyer, E. Leake, A. Raben, Modest E.K., D.L.W., e C. Piantadosi. 1990. Novel membrane-interactive ether lipid analogs that inhibit infectious HIV-1 production and induce defective virus formation AIDS Res. Hum. Retro Virus. 6:491- 501; Piantadosi, C., J. Marasco C.J., S.L. Morris- Natschke, K.L. Meyer, F. Gumus, J.R. Surles, K. S. Ishaq, L. S. Kucera, N. Iyer, CA. Wallen, S. Piantadosi, e E. J. Modest. 1991. Synthesis and evaluation of novel ether lipid nucleoside conjugates for anti-HIV activity. J. Med Chem. 34: 1408.1414; Hosteller, K. Y. , D. D. Richman, D. A. Carson, L. M. Stuhmiller, G. Μ. T. van Wijk, e H. van den Bosch. 1992. Greatly enhanced inhibition of human immunodeficiency virus type 1 replication in CEM and HT46C cells by 3'-deoxythymine diphosphate dimyristoilglycerol, a lipid prodrug of 3,- deoxythymine Antimicrob. Agents Chemother. 36: 2025.2029; Hosetler, K. Y., L. M. Stuhmiller, Η. B. Lenting, H. van den Bosch, e D.

D. Richman, 1990. Synthesis and antiretroviral activity of phospholipid analogs of azidothymidine and other antiviral nucleosides J. Biol. Chem. 265: 61127.

Exemplos não limitantes de Patentes U.S. que revelam

76/122 substituintes lipofílicos adequados que podem ser X i incorporados de forma covalente no nucleosídeo,

preferivelmente	na	posição 2'	,3' e/ou 5'-OH do	nucleosídeo
ou preparações	lipofílicas,	incluem Patentes	U.	S. Nos.
5.149.794	(22	de	setembro	de 1992, Yatvin	e	colS.);
5.194.654	(16	de	março de	1993, Hostetler	e	cols.) ,
5.223.263	(29	de	junho del993, Hostetler	e	cols.) ;
5.256.641	(26	de	outubro	de 1993, Yatvin	e	cols.) ;
5.411.,947	(2	de	maio de	1995, Hostetler	e	cols.) ;
5.463.092	(31	de	outubro de 1995, Hostetler	e	cols.) ;
5.543.389	(6 de	agosto de 1996, Yatvin e cols.)	; 5	.543.390

(6 de agosto de 1996, Yatvin e cols.); 5.543.391 (6 de agosto de 1996 Yatvin e cols.); e 5.554.728 (10 de setembro de 1996; Basava e cols.), todas aqui incorporadas por referência. Aplicações de patente estrangeiras que revelam substituintes lipofílicos que podem ser unidos aos nucleosídeos da presente invenção, ou preparações lipofílicas, incluem WO 89/02733, WO 90/00555, WO 91/16920, WO 91/18914, WO 93/00910, WO 94/26273, WO 96/15132, EP 0 350 287, EP 93917054.4, e WO 91/19721.

Aril ésteres, especialmente fenil ésteres, também são fornecidos. Exemplos não limitantes são revelados em DeLambert e cols., J. Med. Chem. 37: 498 (1994) . Fenil ésteres contendo um orto éster carboxílico para o fosfato também são fornecidos. Khaninei e Torrence, J. Med Chem.; 39: 4109-4115 (1996). Em particular, benzil ésteres, que geram o composto parente, em alguns casos usando substituintes na posição orto ou para para acelerar a hidrólise, são fornecidos. Exemplos dessa classe de prómedicamentos são descritos por Mitchell e cols., J. Chem.

77/122

Soc. Perkin Trans. I 2345 (1992); Brook, e cols. WO

91/19721; e Glazier e cols. WO 91/19721.

Também são fornecidos ésteres fosfonados cíclicos.

Exemplos não limitantes são revelados em Hunston e cols., J. Med. Chem. 27: 440-444 (1984) e Starrett e cols. J. Med. Chem. 37: 1857- 1864 (1994). Adicionalmente, são fornecidos ésteres de 35'-fosfato cíclicos. Exemplos não limitantes são revelados em Meier e cols. J. Med. Chem. 22: 811-815 (1979). ésteres de 1',3'-propanil fosfonado e ésteres de fosfato cíclicos, tais como os que contêm um anel de aril fundidos, ou seja, o éster ciclosaligenil, também são fornecidos (Meier e cols., Bioorg. Med. Chem. Lett. 7: 99104 (1997)). Ésteres de 1',3'-propanil cíclicos não substituídos dos monofosfatos também são fornecidos (Farquhar e cols., J. Med. Chem. 26: 1153 (1983); Farquhar e cols., J. Med Chem. 28: 1358 (1985)). Além disso, ésteres de 1',3'-propanil cíclicos substituídos com um grupo pivaloiloxi metiloxi em C-l' são forncidos (Freed e cols., Biochem. Pharmac. 38: 3193 (1989); Biller e cols., Pat. U. S. No. 5.157.027) .

Fosforamidatos cíclicos são conhecidos por clivar in vivo por um mecanismo oxidativo. Portanto, em uma modalidade da presente invenção, vários l',3' propanil cíclico fosforamidatos substituídos são fornecidos. Exemplo não limitantes são reveldos por Zon, Progress in Med. Chem. 19,1205 (1982). Adicionalmente, são fornecidos inúmeros pró-ésteres 2' e 3' substituídos. Substituintes de 2' incluem metil, dimetil, bromo, trifluormetil, cloro, hidroxi, e metoxi; substituintes de 3' incluindo fenil, metil, trifluormetil, etil, propil, i-propil, e ciclohexil.

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Também são fornecidos vários análogos 1'-substituídos.

Ésteres cíclicos de compostos contendo fósforo também são fornecidos. Exemplo não limitantes são descritos a seguir:

- di e tri ésteres de ácido fosfóricos como relatado em Nifantyev e cols., Phosphorus, Sulfur Silicon and Related Elements, 113: 1 (1996); Wijnberg e cols., EP180276 Al;

ésteres de ácido de fósforo (III) . Kryuchkov e cols., Izv. Akad. Nauk SSSR, Ser. Khim. 6: 1244 (1987).

Alguns dos compostos foram reivindicados como sendo úteis para a síntese assimétrica de precursores de L-Dopa. Sylvain e cols., DE3512781 Al;

- fosforamidatos. Shih e cols., Bull. Inst. Chem. Acad Sin, 41: 9 (1994); Edmundson e cols., J. Chem. Res. Synop. 5:122 (1989); e

- fosfonatos. Neidlein e cols., Heterocycles 35: 1185 (1993) .

Pró-medicamentos de t^-acil:

A invenção também fornece pró-medicamentos de N4-acil.

Um exemplo não limitante de um derivado de N4-acil de (2'R)-2'-F-2'-C-metilcitidina é mostrado abaixo:

HO'

O

onde R pode ser qualquer grupo acil como aqui descrito.

A invenção também contempla outras modalidades, onde o

79/122 pró-medicamento de um (2'R)-2'-desoxi-2'-flúor-2'-C-metil nucleosídeo (β-D ou β-L) inclui porções biologicamente cliváveis nas posições 3' e/ou 5'. Porções preferidas são ésteres de aminoácido D ou L naturais ou sintéticos, incluindo d ou L-valil, embora preferivelmente ésteres de L- aminoácidos, como L-valil, e ésteres de alquil incluindo acetil. Portanto, essa invenção inclui especificamente éster de aminoácido 3'-L ou D e éster de diaminoácido 3',5'-L ou D de (2'R)-2'-desoxi-2'-flúor-2'-C-metil nucleosídeos (β-D ou β-L) preferivelmente aminoácido L, com qualquer base desejada de purina ou pirimidina, onde o medicamento parente tem opcíonalmente um EC₅₀ de menos que 15 micromolar, e ainda mais é preferivelmente de menos que 10 micromolar; 3'-(alquil ou aril)éster ou 3',5'-Ldi (alquil ou aril)éster de nucleosídeos β-D ou β-L 1', 2', 3' ou 4' ramificados com qualquer base desejada de purina ou pirimidina, onde o medicamento parente opcionalmente tem um EC₅₀ de menos que 15 micromolar e ainda mais preferivelmente menos que 10 micromolar; éster 3'-(alquil ou aril) ou éster 3',5'-L- di(alquil ou aril) de (2'R)-2'desoxi-2'-flúor-2'-C-metil nucleosídeo (β-D ou β-L) com qualquer base de purina ou pirimidina desejada, onde o medicamento parente tem opcionalmente um EC₅₀ de menos que 10 ou 15 micromolar; e pró-medicamentos de 3',5'-diésteres de (2'R)-2'- desoxi-2'-flúor-2'-C-metil nucleosídeos (β-D ou β-L) onde (i) o éster 3' é um éster de aminoácido e o éster 5' é um éster de alquil ou aril; (ii) ambos ésteres são ésteres de aminoácido; (iii) ambos ésteres rs são independentemente ésteres de alquil ou aril; e (iv) o éster 3' é independentemente um éster de alquil ou aril e o éster

80/122

5' é um éster de aminoácido, onde o medicamento parente tem opcionalmente um EC₅₀ de menos que 10 ou 15 micromolar.

Exemplos não limitantes de pró-medicamentos que estão de acordo com a invenção são:

VI. Terapia de Combinação ou Alternância:

Em uma outra modalidade, para o tratamento, inibição, prevenção e/ou profilaxia de qualquer infecção viral aqui descrita, o composto ativo ou seu derivado ou sal pode ser administrado em combinação ou alternância com um outro agente antiviral. Em geral, em terapia de combinação, dosagens eficazes de dois ou mais agentes são administradas juntas, enquanto durante a terapia de alternância, uma dosagem eficaz de cada agente é administrada em série. As dosagens dependerão das taxas de absorção, inativação e excreção do medicamento assim como de outros fatores conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Deve ser observado que os valores de dosagem também irão variar com a severidade da condição a ser aliviada. Deve ser compreendido que para qualquer pessoa em particular, os regimes e esquemas de dosagem específicos devem ser ajustados pelo tempo de acordo com a necessidade individual e com o julgamento profissional da pessoa que administra de

81/122 ou supervisiona a administração das composições.

Foi reconhecido que variantes resistentes a

medicamentos Flavivírus, pestivírus ou HCV podem surgir depois de tratamento prolongado com um agente antiviral. A resistência a medicamentos ocorre mais tipicamente por mutação de um gene que codifica para uma enzima usada na replicação viral. A eficácia de um medicamento contra infecção viral pode ser prolongada, aumentada, ou restabelecida por administração do composto em combinação ou alternância com um segundo, e talvez um terceiro composto antiviral que induz uma mutação diferente daquela causada pela droga mestra. Alternativamente, a farmacocinética, biodistribuição ou outros parâmetros do medicamento podem ser alterados por tal terapia de combinação ou alternância. Em geral, a terapia de combinação é tipicamente preferida sobre a terapia de alternância porque ela induz múltiplos estresses simultâneos no vírus.

Por exemplo, uma pessoa habilitada na técnica reconhecerá que qualquer medicamento ou terapia antiviral pode ser usada em combinação ou alternância com qualquer nucleosídeo da presente invenção. Qualquer um dos tratamentos antivirais descritos no Fundamento da Invenção pode ser usado em combinação ou alternância com os compostos descritos nessa especificação. Exemplos não limitantes dos tipos de agentes antivirais ou seus prómedicamentos que podem ser usados em combinação com os compostos aqui revelados incluem: interferon, incluindo interferon alfa 2a, interferon alfa 2b, um interferon peguilado, interferon beta, interferon gama, interferon tau

82/122 interferon omega ;

uma interleucina, incluindo interleucina 10 e interleucina 12; ribavirina; interferon te alfa ou interferon alfa peguilado em combinação com ribavirina ou levovirina; levovirina; um inibidor de protease incluindo um inibidor de NS3, um inibidor de NS34A; um inibidor de helicase; um inibidor de polimerase incluindo HCV RNA polimerase e um inibidor de NS5B polimerase; gliotoxina; um inibidor de IRES; e oligonucleotídeo anti-senso; um derivado de tiazolidina; uma benzanilida, uma ribozima; um outro nucleosídeo, prómedicamento de nucleosídeo ou derivado de nucleosídeo; um 1-amino-alquilciclohexano; um antioxidante incluindo vitamina E; squalene; amantadina; um ácido da bile; ácido N-(fosfonoacetil)-L-aspártico; uma benzenodicarboxamida; ácido poliadenílico; um benzimidazol; timosina; um inibidor de beta tubulina; uma vacina profilática; um modulador imune, um inibidor de IMPDH; silibin-fosfatidilcolina fitosoma; e micofenolato.

Exemplos não limitantes adicionais dos tipos de medicamentos ou seus pró-medicamentos acima descritos incluem: aciclovir (ACV), ganciclovir (GCV ou DHPG) e seus pró-medicamentos (por exemplo, valil-ganciclovir), E-5-(2bromovinil)-2'-desoxiuridina (BVDU), (E)-5-vinil-Ι-β-Darabonosiluracil (VaraU), (E)-5-(2-bromovinil)-Ι-β-Darabinosiluracil (BV-araU), 1-(2-desoxi-2-flúorte~Darabinosil)-5-iodocitosina (D-FIAC), 1-(2-desoxi-2-flúorβ-L-arabinosyl)-5-metiluracil (L-FMAU, ou clevudine) , (S) 9-(3-hidroxi-2 -fosfonilmetoxipropil)adenina[(S)-HPMPA], (S)-9-(3-hidroxi-2-fosfonilmetoxipropil)-2,6-diaminopurina [(S)-HPMPDAP] , (S) -1-(3-hidroxi-2-fosfonil-metoxipropil)

83/122 citosina [ (S)-HPMPC ou ciclofivir] e (2S, 4S)-1-[2(hidroximetil)-1,3-dioxolan-4-il]-5-iodouracil (L-5-IoddU),

entecavir, lamivudine (eTC), LdT, LdC, tenofovir e adefovir, o enantiômero (-) de

2-hidroximetil-5-(5fluorcitosin-l-il)-1,3-oxatiolano ((-)-FTC); o enantiômero (-) de 2-hidroximetil-5-(5-citosin-l-il)-1,3-oxatiolano (3TC) ; carbovir, aciclovir, famciclovir, penciclovir, AZT,

DDI, DDC,	L-(-)-FMAU, D4T, amdoxovir, Reverset, Racivir,
abacavir,	L-DDA, pró-medicamentos de fosfato e β-D-

dioxolanil-6-cloropurina (ACP), inibidores de RT não nucleosídicos como nevirapine, MKC-442, DMP-226 (sustiva), inibidores de protease como indinavir, saquinavir, Kaletra, atazanavir; e compostos anti-HIV como BILN-2061, ISIS

14803; viramidine, NM 283, VX-497, JKT-003, levovirin, isatoribine, albuferon, Peg-infergen, VX-950, R803, HCV

086, R1479 e DMP45.

Composições Farmacêuticas:

Hospedeiros, incluindo humanos, infectados com pestivírus, flavivírus, HCV ou um outro organismo que se replica através de uma RNA polimerase viral dependente de RNA,, ou para tratamento de qualquer distúrbio aqui descritos, podem ser tratados pela administração ao paciente de uma quantidade eficaz do composto ativo ou um pró-medicamento ou sal farmaceuticamente aceitável desse na presença de um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável. Os materiais ativos podem ser administrados por qualquer via adequada, por exemplo, via oral, parenteral, intravenosa, intradérmica, subcutânea, ou tópica, em forma líquida ou sólida.

Uma dose de preferência do composto para infecção por

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Flaviviridae, incluindo vírus da hepatite C, vírus do oeste do Nilo e vírus da febre amarela e infecção por rinovírus estará na faixa de cerca de 50 a 2.000 mg uma a quatro vezes por dia. Doses menores podem úteis e as faixas podem incluir de 50 a 1.000 mg uma a quatro vezes por dia. A escala de dosagem eficaz dos sais e pró-medicamentos farmaceuticamente aceitáveis pode ser calculada baseada no peso do nucleosídeo parente a ser liberado. Se o sal ou pró- medicamento exibe atividade em si, a dosagem eficaz pode ser estimada como acima usando o peso do sal ou prómedicamento, ou por outros meios conhecidos por aqueles experientes na técnica.

O composto é convenientemente administrado em uma unidade de qualquer forma de dosagem adequada, incluindo mas não limitadas a uma que contém 25 a 3.000 mg, preferivelmente 50 a 2.000 mg de ingrediente ativo por forma de dosagem unitária. Uma dosagem oral de 50-1.000 mg é usualmente conveniente, incluindo em formas de uma dosagem ou de dosagens múltiplas de 50, 100, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 ou 1.000 mg. Doses menores também são contempladas de 0,1-50 mg, ou 0,1-20 mg ou 0,ΙΙΟ, 0 mg. Além disso, doses menores podem ser utilizadas no caso de administração por uma via não oral, como, por exemplo, por injeção ou inalação.

Idealmente o ingrediente ativo deve ser administrado para atingir concentrações plasmáticas de pico (Cmax) do composto ativo de cerca de 5,0 a 70 μΜ, preferivelmente cerca de 5,0 a 15 μΜ. Isso pode ser realizado, por exemplo, pela injeção intravenosa de uma solução 0,1 a 5% do ingrediente ativo, opcionalmente em solução salina, ou

85/122 administrado como um bolo do ingrediente ativo.

A concentração do composto ativo na composição de medicamento dependerá das taxas de absorção, inativação, e excreção do medicamento assim como de outros fatores conhecidos por aqueles experientes na técnica. Deve-se notar que os valores de dosagem também irão variar de acordo com a severidade da condição a ser aliviada. Deve ser também entendido que para qualquer objetivo particular, os regimes de dosagem específicos devem ser ajustados pelo tempo de acordo com a necessidade individual e o julgamento profissional da pessoa que administra ou supervisiona a administração das composições e que as faixas de concentração apresentadas adiante nessa são apenas para fins de exemplo e não pretendem limitar o escopo ou prática da composição reivindicada. O ingrediente ativo pode ser administrado em uma, ou pode ser dividido em várias doses menores a serem administradas em intervalos variados de tempo.

Uma via de administração de preferência do composto ativo é a via oral. Composições orais geralmente incluirão um diluente inerte ou um transportador comestível. Eles podem ser incluídos em cápsulas de gelatina ou compressos em comprimidos. Para o objetivo da administração terapêutica oral, o composto ativo pode ser incorporado com excipientes e usado na forma de comprimidos, pastilhas ou cápsulas. Agentes de ligação farmaceuticamente compatíveis, e/ou materiais adjuvantes podem ser incluídos como parte da composição.

Os comprimidos, pílulas, cápsulas, pastilhas e semelhantes podem conter vários dos seguintes ingredientes,

86/122 ou compostos de natureza similar: um ligante tal como celulose microcristalina, goma tragacanto ou gelatina; um

excipiente tal como amido ou lactose, um agente de desintegração tal como ácido algínico, Primogel, ou amido de milho; um lubrificante tal como estearato de magnésio ou Sterotes; um glidante tal como dióxido de silicone coloidal; um agente adoçante tal como sacarose ou sacarina;

ou um agente flavorizante tal como hortelã, metil salicilato ou sabor de laranja. Quando a forma de dosagem unitária é uma cápsula, ela pode conter, em adição a material do tipo acima, um transportador líquido tal como um óleo graxo. Em adição, formas de dosagem unitárias podem conter vários outros materiais que modificam a forma física da unidade de dosagem, por exemplo, coberturas de açúcar, goma-laca, ou outros agentes entéricos.

Os compostos podem ser administrados como um componente de um elixir, suspensão, xarope, wafer, goma de mascar ou semelhante. Um xarope pode conter, em adição aos compostos ativos, sacarose como um agente adoçante e certos preservativos, corantes e colorante e flavorizantes.

O composto ou seus derivados ou sais farmaceuticamente aceitáveis desses podem também ser misturados com outros materiais ativos que não prejudicam a ação desejada, ou com materiais que suplementam a ação desejada, tal como antibióticos, antifúngicos, antiinflamatórios ou outros agentes antivirais incluindo outros compostos nucleosídicos. Soluções ou suspensões usadas para aplicação parenteral, intradérmica, subcutânea, ou tópica podem incluir os seguintes componentes: um diluente estéril tal como água para injeção, solução salina, óleos fixados,

87/122 polietileno glicóis, glicerina, propileno glicol, ou outros

solventes sintéticos; agentes antibacterianos tal como álcool benzílico ou metil parabeno; antioxidantes tal como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes tal como ácido etilenodiaminatetra-acético; tampões tais como acetatos, citratos ou fosfatos e agentes para o ajuste de tonicidade tal como cloreto de sódio ou dextrose. A preparação parenteral pode ser colocada em ampolas, seringas descartáveis ou frascos de dose múltipla feitos de vidro ou plástico.

Se administrado por via intravenosa, transportadores de preferência são a solução salina fisiológica ou solução salina tamponada por fosfato (PBS).

Em uma modalidade preferida, os composto ativos são preparados com transportadores que irão proteger o composto contra eliminação rápida do corpo, tal como formulação de liberação controlada, incluindo implantes, e sistemas de liberação micro-encapsulados. Polímeros biodegradáveis, biocompatíveis podem ser usados, tal como acetato de etileno vinila, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido polilático. Métodos para preparação de tais formulações estarão aparentes àqueles habilitados na técnica. Os materiais também podem ser obtidos comercialmente de Alza Corporation.

Suspensões lipossômicas (incluindo lipossomos que visam células infectadas com anticorpos monoclonais para antígenos virais) são também preferidos como transportadores farmaceuticamente aceitáveis. Esses podem ser preparados de acordo com métodos conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Por exemplo, formulações de

88/122 lipossomo podem ser preparadas pela dissolução do(s) lipídeo(s) adequado(s) (tais como estearoil fosfatidil etanolamina, estearoil fosfatidil colina, aracadoil fosfatidil colina e colesterol) em um solvente inorgânico

que é então evaporado, deixando para trás uma fina película de lipídeo seco na superfície do recipiente. Uma solução aquosa do composto ativo ou seu derivado de monofosfato, difosfato, e/ou trifosfato é então introduzida no recipiente. 0 recipiente é então agitado manualmente para liberar o material lipídico das laterais do recipiente e para dispersar os agregados lipídicos, dessa forma formando a suspensão lipossômica.

VII. Métodos Biológicos:

Teste Antiviral de Compostos Candidatos com sistema de Replicon de HCV em células Huh7:

Células Huh7 com replicon de HCV contendo podem ser cultivadas em meio DMEM (alta glicose, sem piruvato) contendo soro bovino fetal 10%, 1 x aminoácidos não essenciais (100 unidades/ml), Pen-Strep-Glu (100 unidades/litro, lOOmicrogram/liter, e 2.92mg/liter, respectivamente) e 500 a 1000 microgramas/mililitro de G418. Os ensaios de rastreamento antivirais podem ser realizados no mesmo meio, sem G418, como se segue: para manter as células em fase de crescimento logarítmico, as células são semeadas em placa de 96 cavidades em baixa densidade, por exemplo, 1.000 células por cavidade. O composto de teste é adicionado imediatamente depois de semear as células e é incubado por um período de 3 a 7 dias a 3 7°C em um incubador. O meio é então removido, e as células são preparadas para extração total de ácido

89/122 nucleico (incluindo RNA de replicon e RNA de hospedeiro).

RNA de replicon pode ser então amplificado em um protocolo

IP de Q-RT-PCR, e quantificado pelo mesmo critério. As diferenças observadas nos níveis de RNA de replicon de HCV comparadas ao controle não tratado é um modo de expressar a potência de antiviral do composto de teste.

Em um outro ambiente típico, um composto deve reduzir a atividade de RNA polimerase viral, mas não a atividade de

RNA polimerase do hospedeiro. Portanto, a quantificação de rRNA ou beta-actinamRNA (ou qualquer outro fragmento de RNA de hospedeiro) e comparação com níveis de RNA do controle sem medicamento é uma medição relativa do efeito inibidor do composto de teste sobre as RNA polimerases celulares.

Ensaio de fosforilação de nucleosídeo para trifosfato ativo:

• 20

Para determinar o metabolismo celular dos compostos, células Huh-7 são btidas da American Type Culture Collection (Rockville, MD) , e cresceram em frascos de cultura de tecido de 225 cm² em meio essencial mínimo suplementado com aminoácidos não essenciais, 1% penicilinaestreptomicina. O meio é renovado a cada três dias, e as células são sub-cultivadas uma vez por semana. Depois da separação das monocamadas aderentes com uma exposição de 10 minutos a 3 0 mL de tripsina-EDTA e três lavagens consecutivas com meio, células Huh-7 confluentes são semeadas em uma densidade de 2,5 x 10⁶ células por cavidade em uma placa de 6 cavidades e expostas a 10 μΜ de composto ativo marcado com [³H] (500 dpm/pmol) pelos períodos de tempo especificado. As células são mantidas a 37°C sob uma atmosfera de CO₂ a 5%. Nos pontos de tempo selecionados, as

90/122 células foram lavadas três vezes com solução salina tamponada por fosfato gelada (PBS). Composto ativo extracelular e seus respectivos metabólitos são extraídos

por incubação do pélete de célula de um dia para o outro a -20 °C com 60% metanol seguido por extração com 2 0 μΣ adicionais de metanol frio por uma hora em um banho de gelo. Os extratos são então combinados, secos sob fluxo de ar filtrado leve e estocados a -20°C até análise por HPLC.

Ensaio de Biodisponibilidade em Macacos Cinomolgus:

Uma semana antes do início do estudo, o macaco

Cinomolgus é implantado cirurgicamente com um cateter venoso crônico e porta de acesso venoso subcutâneo (VAP) para facilitar a coleta de sangue e passa por exame físico incluindo avaliações de hematologia e de química sérica e o peso corporal é registrado. Cada macaco (total de seis), recebe aproximadamente 250 μΰί composto marcado com ³H combinado com cada dose de composto ativo, em um nível de dose de 10 mg/kg em uma concentração de dose de 5 mg/mL, por meio de um bolo intravenoso (3 macacos, IV) , ou via engorda oral (3 macacos, PO). Cada seringa de dose é pesada antes da dosagem para determinar gravimetricamente a quantidade de formulação administrada. Amostras de urina são coletadas por meio de um pan catch nos intervalos designados (aproximadamente 18-0 horas pré-dose, 0-4, 4-8 e 8-12 horas pós-dosagem) e processadas. Amostras de sangue são coletadas também (pré-dose, 0,25, 0,5, 1, 2, 3, 6, 8, 12 e 24 horas pós-dosagem) via cateter venoso crônico e VAP ou de uma veia periférica se o procedimento de cateter venoso crônico não for possível. As amostras de sangue e urina são analisadas para a concentração máxima (Cmax),

91/122 tempo quando a concentração máxima é atingida (TmaX), área sob a curva (AUC), meia-vida da concentração de dosagem (Ti/₂) , depuração (CL) , volume e distribuição de estado estável (V_ss) e biodisponibilidade (F) .

Ensaio de Toxicidade de Medula Óssea:

Células de medula óssea humana são coletadas de voluntários saudáveis normais e a população mononuclear é separada por centrifugação de gradiente Ficoll-Hypaque como descrito previamente em Sommadossi J-P, Carlisle R. Toxicity of 3'-azido-3'-deoxythymidine and 9-(1,3dihydroxy-2-propoxymethyl)guanine for normal human hematopoietic progenitor cells in vitro Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1987; 31:452-454; e Sommadossi J-P, Schinazi RF, Chu CK, Xie M-Y. Comparison of cytotoxicity of the (-)- and (+)-enantiomer of 2',3'-dideoxy-3'thiacytidine in normal human bone marrow progenitor cells Biochemical Pharmacology 1992; 44:1921-1925. Os ensaios de cultura para CFU-GM e BFU-E são realizados usando um método de Agar macio de bicamada ou metilcelulose. Drogas são diluídas em meio de cultura de tecido e filtradas. Depois de 14 a 18 dias a 37°C em uma atmosfera umidificada de C0₂ a 5% em ar, as colônias maiores que 50 células são contadas usando um microscópio invertido. Os resultados são apresentados como a inibição percentual da formação de colônias na presença de droga comparada às culturas controladas por solvente.

Ensaio de Toxicidade Mitocondrial:

Cinqüenta microlitros de 2X diluições de medicamento foram adicionados por cavidade em uma placa de 96 cavidades. Um controle sem medicamento (apenas meio) foi

92/122 usado para determinar a quantidade máxima de DNA mitocondrial produzida e de DNA ribossômico. 3TC @ 10 μΜ foi usado como um controle negativo, e ddC @ 10 μΜ foi usado como um controle tóxico. Os níveis de DNA ribossômico foram suados para determinar a toxicidade específica para a mitocôndria ou citotoxicidade. Células HepG2 (5.000 células/cavidades a 50 μΐ) foram adicionadas à placa. A placa foi incubada a 37°C em uma atmosfera de CO₂ a 5% umidificada por 7 dias. Após incubação, o sobrenadante foi removido e estocado para quantificação de ácido lático e o DNA total foi extraído das células como descrito em RNeasy 96 handbook (fevereiro de 1999), páginas 22-23. Não foram realizadas digestões de DNA, portanto o RNA e DNA total foram extraídos.

O DNA extraído foi amplificado e a mudança no DNA mitocondrial e DNA ribossômico para cada amostra foi determinada. A diferença em vezes em DNA mitocondrial normalizado para DNA ribossômico em relação ao controle foi calculada.

Foi realizada quantificação de ácido lático pelo kit de teste de ácido lático D/ácido lático L (BoehringerMannheim/R-Biopharm/Roche). A quantidade total de ácido lático produzida para cada amostra foi encontrada assim como a mudança em vezes na produção de ácido lático (% de ácido lático/% de rDNA) como descrito nas instruções do fabricante.

Ensaio de Citotoxicidade:

μΐ de 2X diluições de medicamento foram adicionados por cavidade em uma placa de 96 cavidades. As concentrações finais do medicamento variaram de 1 a 100 μΜ. Um controle

93/122 sem medicamento (apenas meio) foi usado para determinar os valores de absorvência mínima e um controle células + meio apenas foi usado para valor de absorvência máxima. Um controle de solvente também foi usado. As células foram • 5 então adicionadas (PBM: 5 x 10⁴ células/cavidade ; CEM: 2,5 x 10³ células/cavidade; Vero, HepG2, Huh-7, e Clone A: 5 x 10³ células/cavidade) e incubadas a 37°C em atmosfera umidifiçada de C0₂ a 5% por 3-5 dias (PBM: 5 dias; CEM: 3 dias, todos os outros: 4 dias) . Após incubação, 20 μΐ de 10 corante MTS foram adicionados do ensaio de proliferação celular de solução aquosa de título de célula a cada cavidade e as placas foram novamente incubadas por 2-4 horas. A absorvência (490 nm) foi então lida em um leitor de placa de ELISA usando as cavidades de meio 15 apenas/nenhuma célula como vazios. A inibição percentual foi encontrada e usada para calcular a CC₅₀.

Toxicidade in vivo em Camundongos:

Toxicidade in vivo também foi determinada após injeções nos camundongos fêmeas Swiss dos vários 20 nucleosídeos revelados na presente invenção. Injeções intraperitoniais foram administradas nos dias 0, dia 1, dia 2, dia 3, e dia 5 de doses variáveis do nucleosídeo particular, animais separados foram injetados com veículo como grupos de controle. Nesses estudos, cada grupo de 25 dosagem continha 5-10 camundongos. A mudança de peso médio em cada um dos camundongos foi medida como um sinal de toxicidade do composto.

Ensaio de redução de rendimento (BVDV):

Células Madin-Darby Bovine Kidney (MDBK) cresceram em 30 meio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado com 10%

94/122 de soro eqüino e 100 μ9/ιη1 penicilina-estreptomicina.

As

células foram semeadas em placas de cavidades em 5 x

10³ células/cavidade e incubadas por

72h a

37°C em uma atmosfera umidifiçada de CO₂ a

5%. As células foram infectadas com BVDV citopático (cepa

NADL) ou não citopático (cepa SD-1) em uma diluição de vírus de 10-2 e incubadas por 45 min.

As monocamadas de células foram lavadas três vezes com meio. Compostos de teste contendo meio fresco em concentrações de resposta de dose ou ribavirina, como um controle positivo, foram adicionados às culturas e meio não contendo medicamento foi adicionado ao controle sem medicamento. Após 72h de incubação, o sobrenadante foi coletado e e RNA viral foi extraído usando o mini kit QIAmp Viral RNA (Qiagen, CA) . A carga viral foi determinada por Q-RT-PCR usando iniciadores específicos para NADL ou SD-1 (1).

VIII. Protocolo Sintético:

As modalidades não limitantes a seguir ilustram algumas metodologias gerais para obter os nucleosídeos da presente invenção. Dois métodos gerais representativos para a preparação de compostos da presente invenção são apresentados nos Esquemas 1 e 2 enquanto exemplos mais específicos desses métodos gerais são fornecidos no Esquema 3 (Exemplo 1) , Esquema 4 (Exemplo 2) , Esquema 5 (Exemplo 3) , e Esquema 6 (Exemplo 4) . O Esquema 1 representa um processo generalizado que se inicia de um (2R) 2-desoxi-2metil-2-flúor-carboidrato e forma os nucleosídeos da presente invenção por condensação com uma nucleobase. O Esquema 2 se inicia a partir de um nucleosídeo pré-formado de purina ou pirimidina, opcionalmente substituído em C-4'

95/122 e constrói C-2' (R) metil, flúor nucleosídeos da presente invenção. Embora esses esquemas ilustrem a síntese de

compostos da presente invenção de fórmulas gerais (I) e (II) onde há um anel de furanose na configuração β-D-ribo, isso não pretende ser uma limitação ao escopo do processo da invenção de qualquer forma e não deve ser assim interpretado. Aqueles habilitados na técnica de síntese de

variações conhecidas das

processos

seguintes procedimentos

condições

podem ser manipulações

esses e outros compostos da presente invenção. Além disso, os L-enantiômeros que correspondem aos compostos da invenção podem ser preparados seguindo os mesmos métodos, iniciando com o bloco de construção de L-carboidrato correspondente ou L-enantiômero de nucleosídeo como o material de iniciação.

1. Glicosilação da nucleobase com um açúcar modificado adequado

Esquema 1:

1-4

1-5

96/122

HC

Base

h₃ l-€

Pg = grupo de proteção

R= alquil inferior, acil, mesil, benzoil

Base = como aqui definido

Etapa 1 no esquema 1 introduz o grupo 2-metil pelo uso de um agente de alquilação adequado como brometo de metil lítio, trimetilalumínio, ou metilmagnésio em um solvente anidro como tetrahidrofurano (THF), clorofórmio, ou éter dietílico. Compostos 1-1 até 1-4 podem ser puramente α ou β ou podem existir como uma mistura anomérica contendo α e β anômeros em qualquer proporção. Entretanto, a configuração anomérica preferida de estrutura 1-1 é β.

Etapa 2 introduz o átomo de flúor na posição 2 do alquil furanosídeo. Isso pode ser realizado por tratamento do álcool terciário, 1-2, com um reagente de fluorinação comercialmente disponível como trifluoreto de (dietilamino) enxofre (DAST) ou Deoxofluor em um solvente anidro, aprótico como tetrahidrofurano, clorofórmio, diclorometano, ou tolueno. Preferivelmente a estereoquímica procede com inversão na configuração em C-2. Ou seja, iniciando de um C-2 hidroxil acima (arabinofuranosídeo) na estrutura 1-2, o C-2 flúor é abaixo no ribofuranosídeo intermediário 13 .

Na etapa 3, os grupos de proteção opcionais (Pg) podem ser desprotegidos e re-protegidos para grupos mais adequados para as manipulações remanescentes (T. W. Greene

97/122 e P. G. M. Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis, 3^a ed. , John Wiley & Sons, 1999) . Por exemplo, éteres de benzila (Bn) podem ser difíceis de remover no nucleosídeo protegido, 1-5 e podem ser desprotegidos e substituídos com um grupo mais fácil de remover do nucleosídeo de tipo estrutural 1-5. Além disso, a posição anomérica (C-l) também pode ser opcíonalmente manipulada a um grupo adequado para a reação de ligação com a nucleobase (etapa

4) . Vários métodos para manipulações anoméricas são estabelecidos para aqueles habilitados na técnica de síntese de nucleosídeos. Alguns exemplos não limitantes por tratamento do alquil furanosídeo (1-3, R = alquil) com uma mistura de anidrido acético, ácido acético e uma quantidade catalítica de ácido sulfúrico (acetólise) para fornecer a estrutura 1-4 onde R = Ac, com grupos de proteção opcionais. Também, o grupo alquil em 1-3 pode ser convertido a um acetato, benzoato, mesilato, tosilato, triflato ou tosilato, por exemplo, por hidrólise do grupo 1-Oalquil a um grupo 1-hidroxil pelo uso de um ácido mineral que consiste em, mas não se limita a, ácido sulfúrico, ácido clorídrico e ácido hidrobrômico ou um ácido orgânico que consiste em, mas não se limita a, mas ácido trifluoracético, ácido acético e ácido fórmico (em temperatura ambiente ou temperatura elevada). O açúcar de redução pode ser então convertido ao carboidrato desejado por tratamento com cloreto de acetila, anidrido acético, cloreto de benzoila, anidrido benzóico, cloreto de metanossulfonila, anidrido tríflico, cloreto de trifila cloreto de tosila na presença de uma base adequada como trietilamina, piridina ou dimetilaminopiridina.

98/122

A ligação nucleosídica é construída por tratamento de intermediário 1-3 ou 1-4 com a nucleobase persililada adequada na presença de um ácido de Lewis como tetracloreto de estanho, tetracloreto de titânio, trimetilsililtriflato ou um reagente de mercúrio (II) (HgO/HgBr₂) usualmente em uma temperatura elevada em um solvente aprótico como

tolueno, acetonitrila, benzeno, ou uma mistura de qualquer um ou de todos esses solventes.

Os grupos de proteção opcionais nesses nucleosídeos protegidos ou fórmula estrutural 1-5 podem ser clivados seguindo metodologias de desproteção estabelecidas (T. W. Greene e P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3^a ed., John Wiley & Sons, 1999).

2. Modificação de um nucleosídeo pré-formado:

Esquema 2

Nucleosídeo

2-1

2-2 pré-formado

2-3

2-4

99/122

Pg = grupo de proteção

Base = como aqui definido (opcionalmente protegida)

X = como aqui definido

R^s = como aqui definido material de iniciação para esse processo é um nucleosídeo de purina ou pirimidina adequadamente substituído com um 2'-OH e 2'-H. O nucleosídeo pode ser comprado ou pode ser preparado por qualquer meio incluindo técnicas padrão de ligação. O nucleosídeo pode ser opcionalmente protegido com grupos de proteção adequados, preferivelmente com grupos acil ou silil, por métodos bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica, como ensinado por T.W. Greene e P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis 3^a ed. , John Wiley & Sons, 1999.

O nucleosídeo de purina ou pirimidina pode ser então oxidado na posição 2' com o agente de oxidação adequado em um solvente compatível em uma temperatura adequada para gerar o nucleosídeo modificado 2' . Possíveis agentes de oxidação são uma mistura de dimetilsulfóxido, anidrido trifluoracético ou anidrido acético (uma oxidação de Swern/Moffat), trióxido de cromo ou outro reagente de cromato, periodinano de Dess-Martin ou por tetróxido de rutênio/periodato de sódio.

O nucleosídeo 2'-cetona opcionalmente protegido é

100/122 então alquilado usando tais agentes de alquilação, metil lítio, trimetilalumínio, brometo de metilmagnésio ou reagentes similares em um solvente anidro como tetrahidrofurano (THF), clorofórmio, ou éter dietílico usualmente em temperaturas abaixo de 0°C. Compostos da estrutura de fórmula 2-3 são preferidos tendo a configuração 2'(S) ou 2'-metil abaixo, 2'-OH acima.

O nucleosídeo de estrutura 2-3 pode ser desprotegido e re-protegido com inúmeros grupos de proteção como um O-acil (alquil ou aril), O-sulfonil, ou um N-acil (alquil ou aril) para a base. Essa etapa opcional de re-proteção não precisa ser limitada aos grupos de proteção que funcionam como grupos de proteção química. Outros grupos de proteção como grupos acil de cadeia longa entre 6 e 18 unidades de carbono ou aminoácidos podem ser introduzidos independentemente da nucleobase ou do açúcar. Os grupos de proteção podem servir como pró-medicamentos da substância ativa.

Etapa 5 introduz o átomo de flúor na posição 2' do

nucleosídeo	pré-formado.	Isso	pode	ser	realizado	por
tratamento	do álcool terciário,	2-4,	com	um	reagente	de
fluorinação	comercialmente	disponível	como	as	trifluoreto

de (dietilamino) enxofre (DAST) ou Deoxofluor em um solvente anidro, aprótico como tetrahidrofurano, clorofórmio, diclorometano, ou tolueno. Preferivelmente a estereoquímica procede com inversão na posição 2'. Ou seja, iniciando de um C-2 (arabinofuranosídeo) na estrutura 2-4, configuração na hidroxi1 acima o C-2 flúor é abaixo no nucleosídeo intermediário 2-5. A configuração absoluta de um nucleosídeo de estrutura 2-4 é (2'S)

101/122 enquanto a configuração absoluta de um nucleosídeo de estrutura 2-5 é (2'R).

Subsequentemente, os nucleosídeos de estrutura tipo 25 podem ser desprotegidos por métodos bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica, como ensinado por T. W. Greene e P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis 3^a ed. , John Wiley & Sons, 1999.

Os exemplos de trabalho seguintes fornecem uma compreensão adicional do método da presente invenção e também exemplificam os exemplos gerais nos esquemas 1 e 2 acima. Esses exemplos têm finalidade ilustrativa e não visam limitar o escopo da invenção. Solventes, reagentes ou condições de reação equivalentes, similares ou adequadas podem ser substituídos por aqueles solventes, reagentes ou condições de reação em particular descritos, sem se afastar do escopo geral do método.

Exemplos:

Exemplo 1: Síntese de (2'R)-2'-Desoxi-2'-flúor-2'-CMetilcitidina iniciando a partir de um Carboidrato Esquema 3

3-5

102/122

Bz = C(O)Ph

Bn”CH₂JPh

Etapa 1: Composto 3-1 (7,7 g, 0,022 mmol) foi dissolvido em éter dietílico anidro e resfriado a -78°C. A essa solução foi adicionado MeLi (30 mL, 1,6 M em éter dietílico). Após a reação estar completa, a mistura foi tratada com cloreto de amônio (1 M, 65 mL) e a fase orgânica foi separada, seca (Na₂SO₄) , filtrada e concentrada até secar. Cromatografia em sílica gel seguida por cristalização de éter dietílico-hexanos gerou composto puro 3-2 (6,31 g) . ^TH NMR (400 MHz, CDC1₃) : δ 1,40 (s, 3H) ,

3,41 (s,	3H) ,	3,49 (dd,	, 1H,	J= 10,3,	6,89 Hz), 3,57	(dd,
1H, J= 10	,3,	3,88 Hz),	3,84	(d, 1H,	J= 7,3 Hz), 4,03	(m,
1H), 4,48	(s,	1H), 4,58	(m,	3H), 4,83	(d, 1H, J= 11,6	Hz) ,
7,31-7,36	(m,	10H) ; 13C	NMR	(100 MHz,	CDC13) : δ 18,4, 55,4,

72,2, 73,4, 79,5, 80,2, 84,7, 107,4, 127,7, 127,8, 127,83,

128,5, 138,2, 138,3.

Etapa 2: Composto 3-2 foi dissolvido em CH₂C1₂ e foi tratado com DAST (4,0 mL, 30,3 mmol) em temperatura ambiente. A solução foi agitada em temperatura ambiente de um dia para o outro. A mistura assim obtida foi despejada em NaHCO₃ saturado (100 mL) e lavada com NaHCO₃ saturado (1 x 15 mL) . A camada orgânica foi também trabalhada da maneira usual. Cromatografia em sílica gel (1:5 EtOAchexanos) gerou composto bruto 3-3 (0,671 g) que era

103/122 suficientemente puro para a próxima etapa. NMR (400 MHz, CDC1₃) : δ 1,43 (d, 3H, J= 22,8 Hz) , 3,35 (s, 3H) , 3,49 (dd, 1H, J= 10,5, 5,4 Hz), 3, 55 (dd,lH, J = 10,5, 4,1 Hz), 3,87 (dd,1H, J= 23,5, 7,5 Hz) , 4,26 (m,1H), 4,56 (d, 2H, J = 6,9 Hz) , 4,66 (d, 2H, J = 8,2 Hz) , 4,72 (d, 1H, J = 10,8 Hz) , 7,29- 7,36 (m, 10H) ; ¹³C NMR (100 MHz, CDC1₃) : δ 17,0 (d,J = 24,4 Hz), 55,2, 77,1, 73,4, 73,8, 77,3, 80,3, 81,2 (d, J= 16 Hz), 99,7 (d, J= 178,9 Hz), 106,8 (d,J= 32,0 Hz), 127,7, 127,8, 128,1, 128,3, 128,5, 128,6, 137,8, 138,3; ¹⁹F NMR (100 MHz, CDCI3) : ô-8,2(m,lF).

Etapa 3: Composto 3-3 (0,39 g, 1,1 mmol) foi dissolvido em 1:2 EtOH-EtOAc e tratado com Pd/C (~0,l g) e ciclohexeno (~1 mL). A mistura foi aquecida até refluxo de um dia para o outro e então filtrada através de celite. O

solvente foi removido in vacuo e o resíduo foi dissolvido em piridina (~5 mL). A essa solução foi adicionado cloreto de benzoila (0,22 mL, 1,83 mmol) e a mistura foi agitada em temperatura ambiente de um dia para o outro. A piridina foi removida in vacuo e o resíduo foi dividido entre CH₂C1₂ e NaHCO₃ saturado (10,0 mL) . A fase orgânica foi seca (Na₂SO₄) , filtrada, e a solução foi concentrada até secar.

Cromatografia em coluna forneceu 0,350 g de composto pureo 3-4. ³H NMR (400 MHz, CDC1₃) : δ 1,53 (d, 3H,J= 22,4 Hz) ,

3,39 (s, 3H), 4,46 (dd, 1H,J= 11,6, 4,7 Hz), 4,58 (m, 1H),

4,65 (dd, 1H, J= 11,6, 3,9Hz), 4,87 (d, 1H, J= 9,9 Hz) ,

5,64 (dd, 2H, J= 24,1, 7,8 Hz) , 7,29-7,36 (m, 10H) ; ¹⁹F

NMR (100 MHz, CDC1₃) : δ -7,5 (m, 1F) .

Etapa 4: Uma solução de bis(trimetilsilil)-Nbenzoilcitosina (0,28 g, 0,77 mmol) e composto 3-4 (0,20 g, 0,5 mmol) em 1,2 dicloroetano (2 mL) e tolueno (2 mL) foi

104/122 tratado com TMSOTf (0,15 mL, 0,77mmol). Depois da maior parte do material de iniciação ter desaparecido como julgado por TLC, a solução foi resfriada até a temperatura ambiente, lavada com água (1x5 mL) , salmoura (1x5 mL) , seca (Na₂SO₄) , filtrada e concentrada até secar. Cromatografia instantânea seguida por cristalização de CH₂Cl-hexanos gerou o composto 3-5 (68 mg). P.f.241°C; 1H

NMR (400 MHz, CDC1₃) : δ 1,49 (d, 3H, J= 22,4 Hz) , 4,64 (dd, 1H, J= 12,9, 3,4 Hz) , 4,73 (app d, 1H, J= 9,5 Hz) , 4,89 (dd, 1H,J = 12,7, 2,2 Hz), 5,56 (dd, 1H, J = 20,7, 8,6 Hz), 6,52 (d, 1H, J= 15,9 Hz), 7,38-7,67 (m, 10H), 7,89 (d, 2H, J= 6,9 Hz) , 8,07-8,11 (m, 5H) , 8,67 (s, 1H) ; ¹⁹F NMR (100

MHz, CDC13)	: δ	2,85 (m, 1F) .
Etapa	5 :	Composto 3-5 (40	mg, 0,05	mmol) foi
dissolvido	em	amônia metanólica e	agitado em	temperatura

ambiente por 48 h. A solução foi concentrada até secar e cromatograf ada (SiO₂) eluição com 1:4 EtOH-CH₂Cl₂. O rendimento foi de cerca de 12 mg de (2'R)-2'-desoxi-2'flúor-2'-C-metilcitidina pura, 3-6. ^ΧΗ NMR (400 MHz, DMSOd6) : δ 1,16 (d, 3H, J= 22,0 Hz) , 3,61 (dd, 1H, J= 11,6, 5,2 Hz) , 3,60-3,83 (m, 3H, J= 10,5, 5,4 Hz) , 5,24 (s, 1H, intercambiável com D20), 5,59 (s, 1H, intercambiável com

D20) , 5,71 (d, 1H, J= 7,3 Hz) , 6,08 (d, 1H, J= 19,0 Hz) ,

7,24 (d, 1H, J = 17,7 Hz, intercambiável com D20), 7,87 (d, 1H) ; ¹⁹F NMR (100 MHz, DMSO-d6) : δ 4,13 (m, 1F) .

Exemplo 2: Síntese de (2'R)-2'-Desoxi-2'-flúor-2'-CMetilcitidina a partir de Citidina

Esquema 4:

105/122

TIDPS= 1,3-(1,1,3,3-Tetraisopropildisiloxanilideno)

Etapa 1: A uma suspensão de citidina (100 g, 0,411 mol) em DMF (2,06 L) é adicionado anidrido benzóico (102,4 g, 0,452 mol). A mistura foi agitada em temperatura ambiente por 20 h. 0 DMF foi removido in vacuo e o resíduo foi triturado com éter dietílico. 0 sólido resultante foi coletado por filtração de sucção e lavado com éter dietílico (2 x 200 mL) . Secagem adicional in vacuo em temperatura ambiente gerou a N4 benzamida (140,6 g, 98, 3%). Uma porção desse material (139,3 g, 0,401 mol) foi 10 dissolvida em piridina anidra (1,2 L) e foi tratada com

106/122

1,3-dicloro-1,1,3,3-tetraisopropil-disiloxano (141,4 mL, 0,441 mol) em temperatura ambiente. A solução foi agitada em temperatura ambiente de um dia para o outro. A mistura foi concentrada quase até secar in vacuo e co-evaporada com tolueno (3 x 200 mL). 0 resíduo foi tratado com EtOAc (1,8 L) e lavado com HC1 (2 x 200 mL, 0,05 N) , NaHCO₃ (5%, 2 x 400 mL) . A camada orgânica foi lavada, seca (Na₂SO₄) , filtrada, e evaporada até secar. Composto 4-1 (256,5 g, >

100%) foi isolado como uma espuma branca e usado sem posterior purificação.

Etapa 2: Composto 4-1 (236,5 g, 0,40 mol) foi dissolvido em THF seco (1,22 L). DMSO anidro (180,8 mL, 2,1 mol) foi adicionado e a solução resultante foi resfriada entre -20°C e -15°C. Anidrodo trifluoracético (90,6 mL, 0,64 mol) foi adicionado em gotas por 45 minutos e a solução foi agitada entre -20°C e -15°C por 2 hrs após o que trietilamina anidra (223,5 mL, 1,6 mol) foi adicionada por 20 min. A reação bruta contendo cetona 4-2 foi dissolvida em EtOAc (500 mL) , e a solução resultante foi lavada com H₂O (3 x 400 mL) , seca (Na₂SO₄) e os solventes foram removidos in vacuo para gerar um sólido amarelo que foi purificado em uma coluna de silica gel eluindo com um gradiente escalonado de Et₂O (0-60%) em hexanos seguido por um gradiente escalonado de EtOAc (50-100%) em hexanos. A cetona bruta assim obtida (-192 g) foi cristalizada de éter de petróleo para gerar cetona 4-2 (138,91 g, 57,5% de citidina) como um sólido branco e 22 g de material de iniciação que não reagiu, 4-1, como um sólido amarelo.

Etapa 3: Composto 4-2 (48,57 g, 8,26 mmol) foi dissolvido em tolueno anidro (-400 mL) e o solvente foi

107/122 removido in vacuo com inclusão de umidade. O resíduo foi então posteriormente seco in vacuo (bomba de óleo) por mais 2 h. Com inclusão estrita de umidade, a espuma residual foi dissolvida em éter dietílico anidro (1,03 L) sob argônio. A solução resultante foi resfriada a -78°C sob argônio e MeLi (1,6 M, 258,0 mL, 0,413 mol) foi adicionado em gotas via funil de adição. Depois da adição estar completa, a mistura foi agitada por 2 h a -78°C. 1 M de NH₄C1 aquoso (500 mL) foi adicionado lentamente. Após aquecimento até a temperatura ambiente, a mistura foi lavada com H₂O (2 x 500 mL) , seca (Na₂SO₄) , e então concentrada até secar para gerar uma espuma marrom (~60 g, > 100%).

A reação foi realizada duas vezes mais usando 37,62 g e 56,4 g do composto 4-2. Os produtos brutos combinados (128,0 g, 0,212 mol) foram dissolvidos em THF (1,28 L) e tratado com HOAc concentrado (23 mL, 0,402 mol). Ã solução foi adicionado TBAF (384,0 mL, 1 M em THF) . A solução foi agitada em temperatura ambiente por 0,75 h e a mistura foi tratada com silica gel (750 g) e concentrada até secar. 0 pó foi colocado em uma coluna de silica gel embalada em CH₂C1₂. Eluição com 1:7 EtOH-CH₂Cl₂ gerou um sólido marrom ceroso escuro que foi pré-adsorvido em silica gel (300 g) e cromatografado como antes. O composto 4-3 (46,4 g, 53,0 % de 4-2) foi isolado como um sólido quase branco. ^XH NMR (DMSO-d6) :δ 1,20 (s, 3H, CH₃) , 3,62-3,69 (m, 2H) , 3,73-3,78 (m, 2H) , 5,19 (t, 1H, J= 5,4 Hz, OH-5'), 5,25 (s, 1H, OH2'), 5,52 (d, 1H, J= 5,0 Hz, OH-3'), 5,99 (s, 1H, H-1'), 7,32 (d, 1H, J= 5,8 Hz) , 7,50(Tt, 2H, J= 7,7 Hz) , 7,62 (Tt,lH, J= 7,3 Hz) , 8,00 (d, 2H, J= 7,3 Hz) , 8,14 (d, 1H, J= 6,9 Hz) , 11,22 (s, 1H, NH) , Análise calculada para

108/122

C₁₇Hi₉N₃O₆ _ 0,5 H₂O: C, 55,13; H, 5,44

N, 11,35,

Encontrado:	c,	55,21; H, 5,47;	N, 11,33.
Etapa	4 :	Composto 4-3	(46,0 g,	0,	13	mol)	foi
dissolvido	em	piridina anidra	e concentrado	até	secar	in

vacuo. O xarope resultante foi dissolvido em piridina anidra sob argônio e resfriado a 0°C com agitação. A solução marrom foi tratada com cloreto de benzoíla (30 mL, 0,250 mol) em gotas por 10 min. 0 banho de gelo foi removido e a agitação foi continuada por 1,5 h onde TLC não mostrou qualquer material de iniciação remanescente. A mistura foi extinta pela adição de água (5 mL) e concentrada até secar. O resíduo foi dissolvido em uma quantidade mínima de CH₂C1₂ e lavado com NaHCO₃ sat. (1 x 500 mL) e H₂O (1 x 500 mL) . A fase orgânica foi seca (Na₂SO₄) e filtrada, concentrada até secar e cromatografada em sílica gel eluição com um gradiente escalonado de EtOAchexanos (25-60%) para fornecer o composto 4-4 como uma espuma amarela (48,5 g, 67%) . ‘Ή NMR (CDC1₃) : δ 1,64 (s,

3H, CH₃) , 4,50 (m, IH, H-4), 4,78-4,85 (m, 2H, H-5', 5a'), 5,50 (d, IH, J= 3,4 Hz, H-3'), 6,42 (s, IH, H-1'), 7,447,54 (m, 7H, Ar), 7,57-7,66 (m, 3H, Ar), 7,94 (d, 2H, J= 7,8 Hz) , 8,05-8,09 (m, 4H, Ar), 8,21 (d, IH, J= 7,3 Hz) ,

Análise Calculada para C₃iH₂₇N₃O₈ : C, 65,37; H, 4,78; N, 7,38, Encontrado: C, 65,59; H, 4,79; N, 7,16.

Etapa 5: Composto 4-4 (7,50 g, 0,013 mol) foi dissolvido em tolueno anidro (150 mL) sob argônio e resfriado a -20°C. DAST (2,5 mL, 18,9 mmol) foi adicionado lentamente e o banho de resfriamento foi removido depois da adição estar completa. A agitação foi continuada por lhe a mistura foi despejada em NaHC0₃ saturado (100 mL) e

109/122 foi seca (Na₂SO₄) , concentrada e purificada por cromatografia em sílica gel eluição com 1:1 EtOAc-hexanos.

O rendimento foi 1,22 g (16,3%) de 4-5 puro como um sólido branco. P.f. 241°C (CH₂Cl₂-hexanos) ;

(d, 3H, J = 22,4 Hz, CH₃) ,

H-5'), 4,73 (d,

12,7 Hz,H-5a'), (d, 1H, J= 18,0

4,64 (dd,

1H, J= 9,5

Hz, H-4'),

5,56 (dd,

Hz,H-l'), (m, 3H, Ar), 7,89 (d, 2H,

1H, J= 8,6, te NMR(CDC1₃) : δ 1,49

1H, J= 3,44, 12,9 Hz,

4,90 (dd, 1H, J= 2,4,

20,7 Hz, H-3'), 6,52

7,47-7,57 (m, 7H, Ar), 7,62-7,71

J= 6,9 Hz), 8,07-8,11(m,

8,67 (bs, 1H, NH) , ¹⁹F NMR (CDC1₃)

Calculada para C31H26FN3O7

7,20, Encontrado: C, 63,71;

Etapa 6: Composto 4-5 em amônia temperatura removido in

3,3 (m) ,

0,7 H₂O:

H, 4,54;

(6,30 g,

C,

N,

63,74;

7,20.

0,011 mol)

H, foi

5H, Ar),

Análise

4,72; N, suspenso metanólica (ca

N,

150 mL) agitado em ambiente de um dia para vacuo, co-evaporado com pré-adsorvido em sílica gel. O pó o outro.

metanol (1 branco foi uma coluna de sílica gel (embalada em CHC1₃) e eluída com 9% EtOH

5% EtOH em CHC1₃.

solvente x 20 mL) colocado coluna foi em foi em CHCI3, então 17% EtOH finalmente contendo através de um disco de

NMR (DMSO-d6): δ 1,17 (d, 3H,

1H, J= 2,7, 13,7 Hz,

H-5a' ) , 5,24 (app s,

5')

Hz,

1H,

5,74 (d, 1H, J=

H-l'), 7,31 (s, 1H,

J= 7,3 Hz, H-6) .

o e

H-5'),

7,71

0,4 μιη

1H, OH-

composto 4-6,	2,18 g (76%), te
J = 22,3 Hz,	, ch3)	, 3,63 (dd,
3,70-3,84 (m,	3H,	H-3', H-4',
J'), 5,60 (d,	1H, J=	5,4 Hz, H-
J, H-5), 6,07	(d,	1H, J= 18,9

(d, , 7,90

NH₂) , 7,42 (s, 1H, NH₂) ¹⁹F NMR (DMSO-d6)

Análise Calculada para Ci₀H₁₄FN₃O₄

2,60

1,4 H₂O: C, 44,22; H,

110/122

5,95; Ν, 14,77, Encontrado: C, 42,24; Η, 5,63; N, 14,54.

Composto 4-6 (0,10 g, 0,386 mmol) foi convertido ao sal de cloridrato por dissolução em água (2 mL) e ajuste do pH a aproximadamente 3,0 com 1 M HCI. A água foi removida in vacuo e o resíduo foi cristalizado de EtOH aquoso para gerar 4-6 como o sal de cloridrato (71,0 mg). P. f. 243°C (dec) ; ^τΗ NMR (DMSO-d6) :δ 1, 29 (d, 3H, J = 22,6 Hz, CH₃) ,

3,65 (dd, 1H, J= 2,3, 12,7 Hz, H-5'), 3,76-3,90 (m, 3H, H3', H-4', H-5a'), 5,96 (d, 1H, J= 17,3 Hz,H-l'), 6,15 (d, 1H,J= 7,9 Hz, H-5), 8,33 (d, 1H, J= 7,9 Hz, H-6), 8,69 (s, 1, 5H, NH) , 9,78 (s, 1,5H, NH) . ¹⁹F NMR (DMSO-d6):ô 1,69 (m) , Análise Calculada para Ci₀Hi₄FN₃O - HCI: C, 40,62; H,

5,11; N, 14,21, Encontrado: C,

40,80; H, 5,09; N, 14,23.

Exemplo 3 : Síntese de (2'R)-6-Cloro-2'-Desoxi-2'flúor-2'-C-Metilpurina a partir de

6Cloropurina Ribosídeo.

Esquema 5:

5-3

5-4

111/122

TIDPS = 1,3-(1,1,3,3-Tetraisopropildisiloxanilideno)

Etapa 1: O nucleosídeo, 6-cloropurina ribosídeo, (3,18 g, 11,09 mmol) foi dissolvido em piridina anidra (300 mL) e foi tratado em gotas com 1,3-dicloro-1,1,3,3 tetraisopropil-disiloxano (4,08mL, 12,75 mmol) a 0°C sob uma atmosfera de argônio. A solução foi trazida até a temperatura ambiente e agitada de um dia para o outro. A mistura foi concentrada até quase secar in vácuo, dissolvida em uma quantidade mínima de clorofórmio e lavada com HCI (100 mL, 0,05 N) e NaHCO₃ (5%, 100 mL) . A camada orgânica foi seca (Na₂SO₄), filtrada, e evaporada até secar para gerar composto 5-1 como um vidro âmbar (6,10 g, > 100%) que foi usado sem purificação adicional. ¹H NMR (CDC1₃) : δ 1,01-1, 13 (m, 24H) , 4,03-4,18 (m, 3H) , 4,58 (d, 1H, J= 5,2 Hz) , 5,01(m, 1H) , 6,07 (s, 1H) , 8,31 (s, 1H) , 8,71 (s, 1H).

Etapa 2: Composto 5-1 (7,13 g, 13,47 mmol) foi dissolvido em THF seco (35 mL). DMSO anidro (5,11 mL, 72,06 mmol) foi adicionado e a solução resultante foi resfriada entre -20°C e -15°C. Anidrido trifluoracético (3,06 mL, 21,69 mmol) foi adicionado em gotas por 45 minutos e a solução foi agitada entre -20°C e -15°C por 2 hrs após o que trietilamina anidra (8,08 mL, 57,92 mmol) foi adicionada por 20 min. A reação bruta contendo cetona 5-2

112/122 foi dissolvida em Et₂O (25 mL) e a solução resultante foi lavada com H₂0 (2 x 50 mL) , seca (Na₂SO₄) e os solventes foram removidos in vacuo para gerar um sólido amarelo que foi purificado em uma coluna de silica gel eluição com um gradiente escalonado de 0-50% éter de petróleo-éter dietílico gerou o composto 5-2 como uma mistura com o diol geminal correspondente. O vidro foi dissolvido em CH₂C1₂ e agitado em um excesso de MgSO₄ por 36 h. A mistura, livre do diol geminal, foi filtrada e evaporada até secar para gerar composto 5-2 como um vidro âmbar (7,0 g, 97%). ¹H NMR (CDC1₃) : δ 1,01-1,13 (m, 24H) , 4,09-4,22 (m, 3H) , 5,55 (d, 1H, J= 9,6 Hz), 5,80 (s, 1H), 8,19 (s, 1H), 8,61 (s, 1H).

Etapa 3: Uma solução do composto 5-2 (7,0 g, 13,26 mmol) em tetrahidrofurano anidro (45 mL) foi resfriada a 78°C com agitação sob uma atmosfera de argônio. À solução foi adicionado brometo de metilmagnésio (15,85mL, 3,0 M em éter etílico) em gotas por um período de 30 min. Aps agitação por mais 3 h a -78°C, a reação foi extinta pela adição cuidadosa de 1 MNH+C1 aquoso (50,0 mL) . Depois de aquecer até a temperatura ambiente, a mistura foi lavada com H₂0 (2 x 500 mL) , seca (Na₂SO₄) e concentrada até secar para gerar uma espuma marrom (3,8 g) que foi dissolvida em tetrahidrofurano (50 mL) e tratada com a solução de TBAF (18,9 mL, 1 M solução em THF) e ácido acético glacial (0,85 mL) em temperatura ambiente. A solução foi agitada em temperatura ambiente por 2h, concentrada até secar e purificada por e cromatografia em silica gel para gerar composto 5-3 (2,0 g, 50%).

Etapa 4: Composto 5-3 (0,491 g, 1,63 mmol) foi dissolvido em piridina (3 mL) e tratado com anidrido

113/122 acético (0,38 mL, 4,08 mL) em temperatura ambiente. A solução foi agitada em temperatura ambiente por 2 h após o que, a solução foi concentrada até secar e tratada com éter dietílico (10 mL) e água (5 mL) . A camada orgânica foi também lavada com água (2 x 10 mL) , seca (Na₂SO₄) , filtrada, e evaporada até secar para gerar o composto 5-4 como uma espuma (0,450 g, 91,0%), ^XH NMR(CDC1₃) : δ 1,39 (s,

3H) , 2,15 (s, 3H) , 2,21 (s, 3H) , 4,27 (m, 1H) , 4,49 (dd,

1H, J= 4,2, 11,9 Hz), 4,57 (dd, 1H, J= 6,16, 11,9 Hz), 5,14 (d, 1H, J= 3,1 Hz) , 6,25 (s, 1H) , 8,54 (s, 1H) , 8,75 (s,

1H) .

Etapa 5: Composto 5-4 (0,100 g, 0,259 mmol) foi dissolvido em tolueno anidro (3,0 mL) sob argônio e resfriado a -20°C. DAST (0,2 mL, 1,55 mmol) foi adicionado lentamente e o banho de resfriamento foi removido após a adição estar completa. A agitação foi continuada por lhe a mistura foi despejada e, NaHCO₃ saturado (100 mL) e lavada até a evolução de gás cessar. A fase orgânica foi seca (Na₂SO₄), concentrada e purificada por e cromatografia em sílica gel eluição com 30% Et₂O-éter de petróleo deu 5-5 puro (0,028 g, 27,9%), ^XH NMR(CDC1₃): δ 1,24 (d, 3H,J =

22,8 Hz) , 2,20 (s, 3H) , 2,22 (s, 3H) , 4,41-4, 55 (m, 3H) , 4,47 (dd, 1H, J= 9,2, 22,0 Hz) , 6,37 (d, 1H,J= 17,6 Hz) , 8,45 (s, 1H), 8,82 (s, 1H).

Etapa 6: Composto 5-5 (0,018 g, 0,047 mmol) foi dissolvido em metanol (5 mL) e tratado com uma solução de metóxido de sódio (3,6 mg, 0,67 mmol) em metanol (5 mL). A solução foi agitada em temperatura ambiente por 1 h, neutralizada com ácido acético concentrado e cromatografada em sílica gel eluição dom um gradiente escalonado de

114/122

Et₂0/metanol (0-5%) para gerar composto 5-6 (0,010 g,

70,9%), ^XH NMR(CDC1₃): δ 1,23 (d, 3H,J = 22,4 Hz) , 4,04 (dd, 1H,J= 2,11, 12,5 Hz) , 4,17 (dd,lH,J= 1,5, 9,2 Hz) ,

4,25 (dd, 1H,J= 1,9, 12,3 Hz) , 4,61 (dd, 1H, J= 9,2, 22,3 Hz), 6,37 (d, 1H,J= 17,3 Hz), 8,70 (s, 1H), 8,78 (s, 1H).

Exemplo 4: Síntese de (2'R)-2'-Desoxi-2'-flúor-2'-CMetiladenosina a partir de (2R)-6-Cloro-2'-Desoxi-2'-flúor2'-C-Metilpurina

Esquema 6:

Etapa 1: Composto 5-5 (0,100 g, 0,26 mmol) foi aquecido em um tubo de pressão com amônia metanolica (ca. 7

N, 25 mL) a 80°C por 12 h. A reação bruta foi pré-adsorvida em sílica gel e purificada por cromatografia em coluna e eluição com um gradiente escalonado de Et2O-MeOH (0-5%). O produto impuro foi convertido no sal de cloridrato por dissolução do composto em uma quantidade mínima de etanol e tratamento da solução com 0,5 mL de uma solução de HCl de

O, 6 M. Concentração até quase secar gerou o composto 6-1 como cristais quase brancos (0,020g, 24, 2%), ¹H NMR (CD₃0D) :δ 1,19 (d,3H, J = 22,3 Hz), 3,88 (dd, 1H, J= 2,7, 12,7 Hz) , 4,06 (dd, 1H, J= 2,1, 12,5 Hz) , 4,11 (app d, 1H, J= 9,2 Hz) , 4,35 (dd,lH, J= 9,4, 24,5 Hz) , 6,35 (d, 1H, J=

115/122

16,5 Hz), 8,43 (s,lH), 8,85 (s,lH).

Exemplo 5: Atividade antiviral de f (2R)-2'-Desoxi-2'flúor-2'-C-Metilcitidina

241

Ensaio de replicon de HCV:

A atividade anti-flavivírus dos compostos foi determinada como descrito por Stuyver, e cols., (Ribonucleoside analogue that blocks replication of bovine viral diarrhea and hepatitis C viruses in culture, Antimicrobial Agents and Chemoterapia 47: 244-254 (2003)). O composto foi dissolvido em DMSO e adicionado ao meio de cultura em concentrações finais que variam de 3 a 100 μΜ. uma incubação de 4 dias resultou na redução dependente de dose do RNA de replicon de HCV (Figura IA) . Uma redução de 1-log de RNA de replicon (ou valor de EC₉₀) foi atingida em aproximadamente 2,5 μτη. A medida da redução de rRNA deu uma indicação do efeito inibidor sobre as polimerases celulares. Subtração desse valor de toxicidade celular dos valores antivirais resultou na linha de índice terapêutico e valor de EC₉₀. Baseado nesses cálculos, um valor médio de EC₉₀, corrigido para toxicidade celular, de aproximadamente 2,5 μΜ foi obtido. A Figura IA mostra a redução dependente de dose do RNA de replicon de HCV baseada no tratamento com (2'R)-2'-desoxi-2'-flúor-2'-C-metilcitidina. A redução viral foi comparada à redução de níveis celulares de RNA (RNA ribossômico) para obter valores de índice terapêutico. EC₉₀ representa 90% de concentração eficaz em 96 horas seguida por administração dependente de dose de(2'R)-2'desoxi-2'-flúor-2'-C-metilcitidina. A Figura 1B mostra a redução prolongada no RNa de replicon de HCV até 7 dias após tratamento com 5 e 25 μΜ.

116/122

A atividade de (2'R)-2'-desoxi-2'-flúor-2'-Cmetilcitidina no sistema de replicon é sumarizada na Tabela 1. Os valores de EC₉₀ para (2'R)-2'-desoxi-2'-flúor-2'-Cmetilcitidina assim como de 2'-C-metilcitidina e 2'-Cmetiladenosina são mostrados para três clones separados de replicon (HCV-WT (De tipo selvagem), 9-13 e 21-5) assim como dois outros clones (S282T e rRNA). Os valores de EC₉₀ para (2'R)-2'-desoxi-2'-flúor-2'-C-metilcitidina estavam na faixa de 1,6 a 4,6 μΜ para os clones de replicon. Em contraste os valores de EC₉₀ para 2'-C-metilcitidina estavam na faixa de 6,6-37,4 μΜ. Surpreendentemente, os valores de EC₉₀ para 2'-C-metiladenosina eram comparáveis àqueles de (2' R) -2'-desoxi-2'-flúor-2'-C-metilcitidina. A atividade de (2'R)-2'-desoxi-2'-flúor-2'-C-metilcitidina e

2'-C-metilcitidina em outros replicons testados é mostrada na tabela 2.

Ensaio de Polimerase:

A Tabela 3 mostra a potência de (2'R)-2'-desoxi-2'flúor-2'-C-metilcitidina- 5'-trifosfato (TP) no ensaio de polimerase NS5B. A concentração inibidora 50% foi determinada como estando na faixa de 1,7 a 7,7 μΜ.

Toxicidade:

Um sumário dos dados de toxicidade para (2'R)-2'desoxi-2'-flúor-2'-C-metilcitidina usando o ensaio de toxicidade mitocondrial é mostrado nas Tabelas 6 e 7. A Tabela 7 mostra a ausência de efeitos de (2'R)-2'-desoxi2'-flúor-2'-C-metilcitidina e 2'-C-metilcitidina sobre a síntese de DNA mitocondrial e ausência de efeitos sobre aumento de ácido lático nesse ensaio. Os resultados mostram a relativa ausência de toxicidade de (2'R)-2'-desoxi-2'117/122 flúor-2'-C-metilcitidina.

A Tabela 6 mostra uma análise de citotoxicidade em várias linhas de células (Clone A, Huh7,

HepG2,MDBK, PBM, CEM,

Vero,

A concentração citotóxica 50% (CC₅₀) foi maior que 75-100 μΜ em todos os clones testados para (2'R)-2'-desoxi-2'-flúor-2'-Cmetilcitidina assim como

2'-C-metilcitidina. Em contraste está a toxicidade relativa efeito dos análogos de nucleosídeos testados sobre as células de medula óssea humana é mostrado na tabela 9.

como mostrado, os valores de IC₅₀ para 2'-metil-2'fluorcitidina foram significativamente maiores (98,2, BFUE) e 93,9 (CFU-GM) quando comparados à 2'-metilcitidina ou AZT. Os resultados mostram que 2'-metil-2'-fluorcitidina era significativamente menos tóxica quando comparada aos outros compostos de nucleosídeo.

Estudos em Animal:

A Figura 2 descreve a mudança média de peso (%) de camundongos fêmeas Swiss in vivo, a análise de toxicidade de (2'R)-2'-desoxi-2'-flúor-2'-C-metilcitidina em várias doses. Injeções intraperitoniais foram dadas no dia 0 ao dia 5 de 0, 3,3, 10, 33, 100 mg/kg. Cada grupo de dosagem continha 5 camundongos e nenhum camundongo morreu durante o estudo de 30 dias. Nenhuma toxicidade significativa foi observada nos camundongos.

A Figura 3 e Tabela 6 resumem os parâmetros farmacocinéticos de (2'R)-2^Z- desoxi-2'-flúor-2'-Cmetilcitidina em macacos Rhesus que receberam dose única (33,3 mg/kg) oral (Tabela 6, Figura 3) ou dose intravenosa (Figura 3) de (2'R)-2'-desoxi-2'- fluoro-2'-Cmetilcitidina.

118/122

Outra Atividade Antiviral:

Um sumário da faixa de atividade antiviral de (2'R)2'-desoxi-2'-flúor-2'-C-metilcitidina é mostrado na Tabela 4. A Tabela mostra que em adição ao vírus HCV (2'R)-2'5 desoxi-2'-flúor-2'-C-metilcitidina mostra atividade contra Rinovírus, vírus do oeste do Nilo, Vírus da febre amarela, e vírus da Dengue.

A Tabela 5 mostra ausência de atividade de (2'R)-2'desoxi-2'-flúor-2'-C-metilcitidina sobre BVDV de modelos 10 que substituem HCV assim como de outros vírus incluindo HIV, HBV e Corona vírus. Em contraste, 2'-C-metilcitidina e 2'-C-metiladenosina mostram maior atividade no modelo que substitui HCV, BVDV. Esses resultados mostram a necessidade de rastreamento dessa série de compostos contra o sistema 15 de replicon de HCV versus sistemas que substituem HCV.

Tabela 1: Sumario da Atividade de Replicon Anti-HCV de (2'R)-2'-desoxi-2'-flúor-2'-C-metilcitidina*:

replicon	(2'R)-2'-desoxi- 2'-flúor-2'-C- metilcitidina	2' -C- metilcitidina	2'-C-metil adenosina
HCV-WT lb	4,6 ± 2,0	21,9 ± 4,3	2,1 ± 0,27
S282T mut.lb	30,7 ± 11,7	37,4 ± 12,1	> 100
9-13 (subgenômi co)	4,6 ± 2,3	13,0	0,7
21-5 (comprimento total)	1,6 ± 0,7	6,6	0,6

Tabela 2: Atividade de (2 ' R)-2'-desoxi-2'-flúor-2'-Cmetilcitidina e 2'-C-metilcitidina em outros Replicons

119/122

	2'R)-2'-desoxi-2'flúor-2'-Cmetilcitidina	2'-C-metilcitidina
replicon	ec90 (μΜ)	IC90	(μΜ)	ec90 (μΜ)	IC90	(μΜ)
		GAPDH	MTT		GAPDH	MTT
lb (Ntat)	3,8	> 100	> 100	27,2	> 100	> 100
lb (Btat)	11,5	> 100	> 100	31,1	> 100	> 100
la (pplaSI-7)	34,7	> 100	> 100	35,0	> 100	> 100

Tabela 3: Ensaio de polimerase de NS5B de HCV lb (IC50, μΜ)

	(2'R)-2'- desoxi-2'- flúor-2'-C- metilcitidina TP	2' -C- metilcitidina TP	2' -C- adenosina TP
NS5B de tipo selvagem	1,7 ± 0,4a	6,0 ± 0,5	20,6 ± 5,2
	7,7 ± 1,2b
S282T	2,0a	26,9 ± 5,5	> 100
	8,3 ± 2,4C

^a valores determinado usando lote 1; ^b valores determinado usando lotes 2 e 3; e ^c valores determinado usando lote 2.

Tabela 4: Sumário da Atividade Antiviral de (2'R)-2' desoxi-2'-flúor-2'-C-metilcitidina

Vírus	Célula	ec50, cpe (μΜ)	ECso, NRa (μΜ)	CC50, CPE (μΜ)	CC50, NRa (μΜ)
Oeste do Nilo	Vero	32	12	> 100	32

120/122

Dengue tipo 2	Vero	32/55	> 100/> 100	> 100	> 100
Febre amarela	Vero	19/3,2	32/12	> 100	> 100
Influenza A (H1N1)	MDCK	> 100	> 100	> 100	> 100
Influenza A (H3N2)	MDCK	> 100	> 100	> 100	> 100
Influenza B	MDCK	> 100	> 100	> 100	> 100
Rinovírus tipo 2	KB	25	20	> 100	> 100
VEE	Vero	> 100	> 100	> 100	> 100
SARSCoV	Vero	> 100	> 100	> 100	> 100

^aNr = red. neutra

Tabela 5: Sumário da Atividade Antiviral de (2'R)-2'desoxi-2'-flúor-2'-C- metilcitidina

Vírus	(2'R)-2'-desoxi- 2'-flúor-2'-Cmetilcitidina (ECg0, μΜ)	2' -C- metilcitidina (ECg0, μΜ)	2' -Cadenosina (EC90, μΜ)
BVDV ncp	> 22	0,5	1,2
BVDV cp	>100	2	1,5
RSV	>100	>100	>100
HIVa	>100	ND	ND
HBV	>10	>10	ND
Coronavírus 229E	>100	ND	ND

ND = não determinado

Tabela 6: Estudos de Citotoxicidade

121/122

Linha de células	(2' R)-2'-desoxi- 2'-flúor-2'-C — metilcitidina CC5o, μΜ	2' -C- metilcitidina CC50, μΜ	2' -C- adenosina CC50, μΜ
Clone A	>100	>100	37
Huh7	>100	>100	30
HepG2	75	>100	58
MDBK	>100	>100
PBM	>10
CEM	>100
VERO	>100
MCR-5	>100

^a Resultados determinados usando ensaio MTS

Tabela 7: Estudo de Toxicidade Mitocondrial

composto	Síntese de mtDNA IC5o, μΜ	Aumento de ácido lático
(2'R)-2'-desoxi- 2'-flúor-2'-C- metilcitidina	>25	Nenhum efeito, >33 μΜ
2'-C-metilcitidina	>25	Nenhum efeito, >33 μΜ

Tabela 8: Parâmetros PK Preliminares em macacos Rhesus após uma única Dose Oral de (2'R)-2'-desoxi-2'-flúor-2'-C5 metilcitidina em 33,3 mg/kg

Parâmetro	unidades	Média ± SD
Cmax	μΜ	9,6 ± 2,7
Tmax	Horas	2 ± 1
AUC0-último	μΜχύ	44,2 ± 22,2
T 1/2	Horas	3,9 ± 0,1
Biodisponibilidade	F%	21 ± 11

122/122

Tabela 9: Efeito de Análogo de nucleosídeos sobre células de medula óssea humanas

Composto	BFU-E	CFU-GM
	IC50, μΜ
(2'R)-2'-desoxi-2'- flúor-2'-C- metilcitidina	98,2	93,9
2'-C-metilcitidina	20,1	13,2
AZT	0,08	0,95

1/1

Claims (2)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Nucleosídeo ou o sal farmacêutica mente aceitável deste, caracterizado por ser o (2^,R)-2'-desoxi-2^,-fluor-2^,-C-metil nucleosídeo (β-D) da fórmula:
2. 2. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender um nucleosídeo definido na reivindicação 1, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e um veículo farmaceuticamente aceitável.