CN111363712B - 一种表达微管β亚基与蛋白A的D结构域融合蛋白的基因工程菌株及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明以变形杆菌(Prosthecobacter dejongeii)的微管β亚基作为基础蛋白，与蛋白A的D结构域进行融合，通过大肠杆菌表达系统进行表达，得到融合蛋白βA，该融合蛋白βA既保留了原核微管的自组装特性，又保留了蛋白A的D结构域结合VH Ⅲ家族单链抗体的活性。本发明融合蛋白βA具备微管亚基自组装活性，能与微管蛋白α亚基自组装形成微管结构，融合蛋白βA又可借助蛋白A的D结构域结合VH Ⅲ家族抗体，形成工程化微管‑抗体‑抗原的复合物，突破冷冻电镜技术对样品的尺寸限制。

Description

一种表达微管β亚基与蛋白A的D结构域融合蛋白的基因工程 菌株及其构建方法

技术领域

本发明涉及蛋白质超分子自组装领域，具体涉及一种变形杆菌(Prosthecobacterdejongeii)的微管β亚基与蛋白A的D结构域融合且保持微管自组装活性以及蛋白A的D结构域结合VHⅢ家族单链抗体的活性的融合蛋白的大肠杆菌基因工程菌株及其构建方法。

背景技术

蛋白质作为生命活动的基础，是机体细胞中最重要的组成部分，几乎参与到细胞中的每一个过程，如酶催化、机械运动、细胞信号传导、激素调节、免疫应答等。在机体中，绝对多数蛋白质本身可以通过自组装形成高度有序的规则结构来发挥各种作用，包括多面羧酶体、片状细菌S-layer等。因此，蛋白质是具有高度的自组装特性，并结构特殊、功能丰富的生物大分子，它来源丰富、可生物降解以及具有生物可溶性等优点。利用蛋白质的自组装特性构建具有生物功能的可控自组装体系是纳米科学、材料科学以及生物医学等学科重要的课题之一。

蛋白质是结构复杂的生物大分子，其表面无规则分布着多个疏水相互作用、静电相互作用位点，很难对其自组装过程进行有效控制以获得结构精确的组装体，这限制了蛋白质组装材料的应用。目前，常用的方法是通过氨基酸序列突变来进行蛋白质表面相互作用的调控，从而实现蛋白质的自组装。但是，此方法存在突变位点设计困难、重组表达繁琐、蛋白质扩量困难等缺点。

蛋白质天然存在多种自组装方式，如微管的组装、病毒衣壳蛋白的组装等，因此寻找一种利用天然存在的蛋白质自组装体系，不仅可以推动对蛋白质设计的理解，同时可以多层次利用天然蛋白质。

本发明以变形杆菌(Prosthecobacter dejongeii)的微管β亚基与蛋白A的D结构域融合为例，通过大肠杆菌表达系统成功表达出同时具备微管β亚基自组装活性和蛋白A的D结构域结合VHⅢ家族单链抗体活性的融合蛋白，对利用天然蛋白质自组装体系的研究有示范性作用。同时，本发明设计的微管蛋白β亚基-蛋白A的D结构域的融合蛋白(以下称为融合蛋白βA)可作为富集VHⅢ家族抗体的配体，用于抗体纯化；同时，改造后的融合蛋白βA与微管α亚基组装成微管后，可以通过蛋白A的D结构域结合VHⅢ家族抗体，再通过抗体结合抗原蛋白(即靶蛋白)，进行抗原表位解析。

发明内容

本发明的目的，就是为了解决上述问题而提供了一种将来自变形杆菌(Prosthecobacter dejongeii)的微管β亚基与蛋白A的D结构域融合且保持两种亚基活性的大肠杆菌(E.coli)基因工程菌株。本发明的另一目的是提供一种构建过表达微管蛋白亚基-蛋白A的D结构域融合蛋白的大肠杆菌(E.coli)基因工程菌株的构建方法。

本发明的目的是这样实现的：

本发明提供了所述菌株命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)C43(DE3)/pET-22b-βA3，已于2020年3月2日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC No.19441。

本发明还提供了一种表达微管β亚基与蛋白A的D结构域融合蛋白的基因工程菌株的构建方法，包括以下步骤：

(1)对微管β亚基序列和蛋白A的D结构域序列分别进行PCR扩增，

所述微管β亚基序列，碱基序列如SEQ ID NO.1所示；

采用PCR扩增方式，对微管β亚基序列进行扩增，PCR扩增时引物序列设计如下：

正向引物：5’-CCAATTCCATATGCATCACCATCACCATCACCATCACAGAGAGATTTTAAGCATTCACG-3’，

反向引物：5’-GCATGTTCAAGATTTCATAAGATTGGGCGAGAGTGGCG-3’；

所述蛋白A的D结构域序列，碱基序列如SEQ ID NO.2所示；

采用PCR扩增方式，对蛋白A的D结构域序列进行扩增，PCR扩增时引物序列设计如下：

正向引物：5’-CGCCACTCTCGCCCAATCTTATGAAATCTTGAACATGC-3’，

反向引物：5’-CCGCTCGAGTTATTTCGGTGCTTGAGATTCGTTT-3’；

(2)融合PCR制备βA融合基因序列

所述βA融合基因序列，碱基序列如SEQ ID NO.3所示；

以步骤(1)中所回收的微管β亚基序列的PCR扩增产物和蛋白A的D结构域序列的PCR扩增产物为模板，融合PCR扩增时，引物序列设计如下：

正向引物：5’-CCAATTCCATATGCATCACCATCACCATCACCATCACAGAGAGATTTTAAGCATTCACG-3’，

反向引物：5’-CCGCTCGAGTTATTTCGGTGCTTGAGATTCGTTT-3’；

(3)pET-22b(+)载体进行NdeI和XhoI酶切，并与步骤(2)中的βA融合基因序列进行连接，获得表达重组质粒pET-22b(+)-βA；

(4)将步骤(3)中的表达重组质粒pET-22b(+)-βA转化大肠杆菌C43(DE3)感受态细胞，筛选阳性重组子；

(5)对阳性重组子进行发酵表达，筛选出高效表达βA融合基因序列的大肠杆菌基因工程菌株。

本发明将蛋白A的D结构域与天然自组装体系——原核微管蛋白β亚基进行融合，开发了利用天然存在的蛋白质自组装体系的方法，通过大肠杆菌表达系统成功表达了具有活性的融合蛋白βA。实验结果表明，融合后的微管亚基具备微管的自组装活性和蛋白A的D结构域亲和VHⅢ家族单链抗体的活性，即可作为配体进行VHⅢ家族抗体的富集，又可组装后通过单链抗体结合抗原，进行抗原表位解析，推动了对蛋白质自组装体系的设计和理解。

附图说明

图1是实施例2中pET-22b(+)-βA表达菌株的PCR鉴定图；

图2是实施例2中融合蛋白βA的表达纯化图；其中1到8道分别为：1、沉淀，2、上清液，3、穿出液，4、50mM咪唑洗脱液，5、100mM咪唑洗脱液，6、150mM咪唑洗脱液，7、300mM咪唑洗脱液，8、500mM咪唑洗脱液；框出的是目的蛋白；

图3是实施例3中微管蛋白α亚基的表达纯化图；其中1到9道分别为：1、22b空白对照，2、上清液，3、穿出液，4、25mM咪唑洗脱液，5、50mM咪唑洗脱液，6、100mM咪唑洗脱液，7、150mM咪唑洗脱液，8、300mM咪唑洗脱液，9、500mM咪唑洗脱液；框出的是目的蛋白；

图4是实施例4中微管蛋白β亚基的表达纯化图；其中1到7道分别为：1、上清液，2、穿出液，3、50mM咪唑洗脱液，4、100mM咪唑洗脱液，5、150mM咪唑洗脱液，6、300mM咪唑洗脱液，7、500mM咪唑洗脱液；框出的是目的蛋白；

图5是实施例6中融合蛋白βA通过ELISA检验蛋白A的D结构域对于VHⅢ家族单链抗体的亲和结果图；

图6a是实施例7中对照组微管蛋白α亚基和微管蛋白β亚基通过负染TEM检验微管蛋白自组装活性结果图；

图6b是实施例7中实验组微管蛋白α亚基与融合蛋白βA通过负染TEM检验微管蛋白自组装活性结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。下述实施例中所述试剂原料除非注明来源外，均为市售的常见原料，试剂的配制采用常规方法。实施例中未详述的方法均为本领域常规操作。

本发明主要是以变形杆菌(Prosthecobacter dejongeii)的微管β亚基作为基础蛋白，与蛋白A的D结构域进行融合，通过大肠杆菌表达系统进行表达，得到的纯化融合蛋白βA，既保留了原核微管的自组装特性，又保留了蛋白A的D结构域结合VHⅢ家族单链抗体的活性。

生物材料：

变形杆菌(Prosthecobacter dejongeii)的微管蛋白β亚基基因，全基因合成，GenBank编号：AY186783，包括1305bp,碱基序列如SEQ ID NO.1所示，具体如下：

ATGCATCACCATCACCATCACCATCACAGAGAGATTTTAAGCATTCACGTCGGACAGTGTGGCAACCAGATCGCCGATAGCTTTTGGAGGTTGGCTTTGCGCGAGCATGGCCTCACAGAAGCAGGTACCCTGAAAGAAGGCAGCAATGCTGCGGCAAATTCCAACATGGAAGTCTTCTTTCACAAGGTGCGTGATGGCAAGTATGTGCCACGGGCTGTTTTGGTGGACTTGGAGCCTGGAGTCATCGCCCGTATTGAAGGGGGCGACATGTCTCAGCTTTTTGATGAGAGCAGCATCGTGCGCAAGATCCCCGGTGCGGCGAACAACTGGGCGCGTGGTTACAATGTCGAGGGTGAGAAGGTCATTGACCAGATCATGAACGTCATTGATAGCGCGGTCGAAAAAACCAAGGGCCTACAAGGGTTCTTGATGACGCACTCCATCGGTGGCGGTTCCGGCTCAGGCCTTGGCTCGCTGATCTTGGAGCGGCTGCGCCAGGCATATCCGAAAAAGCGTATCTTCACTTTTTCGGTGGTGCCCTCTCCCCTGATTTCCGATTCGGCTGTGGAGCCCTACAATGCCATCCTGACTCTGCAGCGCATCTTGGACAATGCGGATGGAGCTGTGTTGCTGGATAACGAGGCGCTGTTCCGCATCGCTAAAGCGAAGCTGAATCGCAGCCCGAACTACATGGACCTGAATAACATCATCGCGCTCATTGTGAGCTCAGTGACGGCGTCTTTGCGTTTCCCGGGTAAATTAAACACCGACCTGAGTGAGTTTGTGACCAATCTGGTGCCGTTCCCTGGCAATCATTTCCTCACGGCTAGCTTTGCGCCGATGCGTGGGGCGGGACAGGAAGGGCAGGTGCGGACGAATTTCCCAGACCTGGCTCGTGAGACCTTTGCTCAGGATAATTTCACAGCGGCTATTGATTGGCAGCAGGGCGTTTATCTGGCAGCGAGCGCCCTCTTCCGGGGAGATGTGAAGGCGAAGGATGTGGATGAAAATATGGCCACCATTCGCAAATCCCTCAACTATGCGAGCTACATGCCTGCCTCGGGCGGTCTGAAACTGGGGTATGCGGAGACAGCGCCGGAAGGTTTTGCCTCCAGTGGCCTGGCCCTGGTGAATCACACGGGCATCGCGGCGGTTTTTGAGCGCTTGATTGCCCAGTTTGACATCATGTTCGATAACCATGCATACACGCACTGGTATGAGAACGCGGGTGTCTCCCGTGACATGATGGCGAAGGCGCGTAACCAGATCGCCACTCTCGCCCAATCTTACCGCGACGCGAGTTAA；

蛋白A的D结构域基因,全基因合成，GenBank编号：NC_00779574673-74521bp，包括153bp,碱基序列如SEQ ID NO.2所示，具体如下：

GATCAACAAAGCGCCTTCTATGAAATCTTGAACATGCCTAACTTAAACGAAGCGCAACGTAACGGCTTCATTCAAAGTCTTAAAGACGACCCAAGCCAAAGCACTAACGTTTTAGGTGAAGCTAAAAAATTAAACGAATCTCAAGCACCGAAA。

变形杆菌(Prosthecobacter dejongeii)的微管蛋白α亚基基因，全基因合成，GenBank编号：AY186779，包括1446bp，碱基序列如SEQ ID NO.4所示，具体如下：

ATGCATCACCATCACCATCACCATCACAAGGTCAACAACACCATTGTCGTTTCGATAGGTCAGGCAGGTAATCAGATCGCGGCTTCCTTTTGGAAGACGGTTTGCCTTGAGCATGGGATAGACCCGCTCACAGGACAGACGGCCCCAGGGGTAGCGCCACGTGGGAACTGGAGCTCTTTTTTCTCCAAGTTGGGCGAATCTTCCTCTGGCAGCTACGTGCCACGCGCCATCATGGTGGATCTGGAGCCGAGTGTGATTGATAACGTGAAGGCAACAAGTGGCTCTCTTTTCAATCCGGCAAACTTGATTTCCCGCACAGAAGGGGCGGGCGGCAACTTTGCCGTGGGTTACCTGGGCGCAGGACGCGAAGTGTTGCCAGAGGTGATGAGCCGACTGGACTATGAAATTGATAAATGCGATAATGTAGGTGGCATCATCGTACTGCACGCCATCGGTGGCGGTACAGGGTCGGGTTTTGGGGCTCTTTTGATCGAGTCCTTGAAGGAGAAATATGGCGAAATCCCAGTGCTGAGTTGTGCGGTACTGCCATCTCCTCAGGTGTCTTCGGTGGTGACGGAGCCTTACAACACAGTCTTCGCGCTAAACACGCTGCGCCGTTCTGCCGATGCGTGCCTGATCTTTGACAATGAGGCGCTTTTTGACCTGGCTCACCGCAAATGGAATATCGAGAGCCCGACGGTGGATGACCTGAATCTGTTGATCACGGAAGCTCTGGCTGGCATCACCGCCTCCATGCGTTTCAGTGGGTTCCTGACGGTGGAAATCACCCTGCGAGAGCTGCTGACGAACTTGGTTCCTCAACCCTCGCTGCACTTCCTCATGTGCGCCTTTGCTCCGTTGACACCGCCAGACCGCAGTAAGTTTGAGGAATTGGGCATTGAGGAGATGATCAAGTCTCTCTTCGATAACGGGTCCGTCTTTGCTGCTTGTTCACCCATGGAAGGGCGCTTCCTCAGCACGGCGGTGCTTTACCGCGGGATCATGGAGGATAAACCTCTGGCTGATGCGGCCCTGGCTGCGATGAGGGAGAAGCTGCCGCTGACTTACTGGATCCCCACGGCATTTAAAATCGGCTATGTGGAGCAGCCCGGTATTTCTCACCGTAAGAGCATGGTGCTGCTGGCGAACAACACGGAAATTGCCCGTGTGCTGGACCGGATCTGCCACAACTTTGACAAACTCTGGCAGCGCAAGGCCTTCGCTAACTGGTATCTCAACGAAGGCATGTCTGAGGAGCAGATCAATGTCCTGCGTGCTTCTGCCCAGGAACTGGTGCAGAGCTATCAAGTGGCGGAAGAGAGCGGTGCTAAGGCCAAGGTGCAGGATAGCGCTGGCGATACTGGCATGCGTGCTGCTGCCGCTGGTGTGAGTGATGATGCACGAGGCTCCATGAGCCTGCGTGACCTGGTGGATCGCCGCCGCTAA。

VHⅢ家族单链抗体(即抗酪氨酸激酶受体2的单链抗体)基因，全基因合成，GenBank编号：AM402973，包括726bp，碱基序列如SEQ ID NO.5所示，具体如下：

GATATTCAGATGACCCAGAGCCCGAGCAGCCTGAGCGCAAGCGTTGGTGATCGTGTTACCATTACCTGTAAAGCAAGCCAGGATGTTAGCATTGGTGTTGCATGGTATCAGCAGAAACCGGGTAAAGCACCGAAACTGCTGATTTATAGCGCAAGCTATCGTTATACCGGTGTTCCGAGCCGTTTTAGCGGTAGCGGTAGCGGTACCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAAGATTTTGCAACCTATTATTGTCAGCAGTATTATATTTATCCGTATACCTTTGGTCAGGGTACCAAAGTTGAAATTAAACGTGGTGGTGGTGGTAGCGGTGGTGGTGGTAGCGGTGGTGGTGGTAGCGAAGTTCAGCTGGTTGAAAGCGGTGGTGGTCTGGTTCAGCCGGGTGGTAGCCTGCGTCTGAGCTGTGCAGCAAGCGGTTTTACCTTTACCGATTATACCATGGATTGGGTTCGTCAGGCACCGGGTAAAGGTCTGGAATGGGTTGCAGATGTTAATCCGAATAGCGGTGGTAGCATTTATAATCAGCGTTTTAAAGGTCGTTTTACCCTGAGCGTTGATCGTAGCAAAAATACCCTGTATCTGCAGATGAATAGCCTGCGTGCAGAAGATACCGCAGTTTATTATTGTGCACGTAATCTGGGTCCGAGCTTTTATTTTGATTATTGGGGTCAGGGTACCCTGGTTACCGTTAGCAGC。

实施例1

本实施例就微管蛋白β亚基-蛋白A的D结构域的融合基因βA的获得过程，简要介绍如下：

(1)对微管β亚基序列和蛋白A的D结构域序列分别进行PCR扩增，

所述微管β亚基序列，碱基序列如SEQ ID NO.1所示；

采用PCR扩增方式，对微管β亚基序列进行扩增，PCR扩增时引物序列设计如下：

正向引物：5’-CCAATTCCATATGCATCACCATCACCATCACCATCACAGAGAGATTTTAAGCATTCACG-3’，

反向引物：5’-GCATGTTCAAGATTTCATAAGATTGGGCGAGAGTGGCG-3’；

以人工合成的微管β亚基cDNA为模板进行PCR扩增。

PCR扩增时，50μL扩增体系设计如下：

cDNA，1μL(500ng/L)；

10×PCR缓冲液，5μL；

dNTP混合物(2、5mM/each)，2μL；

Taq聚合酶(5U/L)，0、5μL；

上游引物(10μM)，5μL；

下游引物(10μM)，5μL；

ddH2O，31、5μL；

PCR程序：变性，退火和延伸，参数分别是：95℃、3min；94℃、40sec，55℃、40sec，72℃、40sec，25个循环；72℃延伸10min。

对PCR扩增产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测鉴定。

所述蛋白A的D结构域序列，碱基序列如SEQ ID NO.2所示；

采用PCR扩增方式，对蛋白A的D结构域序列进行扩增，PCR扩增时引物序列设计如下：

正向引物：5’-CGCCACTCTCGCCCAATCTTATGAAATCTTGAACATGC-3’，

反向引物：5’-CCGCTCGAGTTATTTCGGTGCTTGAGATTCGTTT-3’；

以人工合成的蛋白A的D结构域的cDNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增体系及扩增程序参考上述微管β亚基序列即可。

对PCR扩增产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测鉴定。

(2)融合PCR制备βA融合基因序列

所述βA融合基因序列，包括1425bp，碱基序列如SEQ ID NO.3所示，具体如下：

ATGCATCACCATCACCATCACCATCACAGAGAGATTTTAAGCATTCACGTCGGACAGTGTGGCAACCAGATCGCCGATAGCTTTTGGAGGTTGGCTTTGCGCGAGCATGGCCTCACAGAAGCAGGTACCCTGAAAGAAGGCAGCAATGCTGCGGCAAATTCCAACATGGAAGTCTTCTTTCACAAGGTGCGTGATGGCAAGTATGTGCCACGGGCTGTTTTGGTGGACTTGGAGCCTGGAGTCATCGCCCGTATTGAAGGGGGCGACATGTCTCAGCTTTTTGATGAGAGCAGCATCGTGCGCAAGATCCCCGGTGCGGCGAACAACTGGGCGCGTGGTTACAATGTCGAGGGTGAGAAGGTCATTGACCAGATCATGAACGTCATTGATAGCGCGGTCGAAAAAACCAAGGGCCTACAAGGGTTCTTGATGACGCACTCCATCGGTGGCGGTTCCGGCTCAGGCCTTGGCTCGCTGATCTTGGAGCGGCTGCGCCAGGCATATCCGAAAAAGCGTATCTTCACTTTTTCGGTGGTGCCCTCTCCCCTGATTTCCGATTCGGCTGTGGAGCCCTACAATGCCATCCTGACTCTGCAGCGCATCTTGGACAATGCGGATGGAGCTGTGTTGCTGGATAACGAGGCGCTGTTCCGCATCGCTAAAGCGAAGCTGAATCGCAGCCCGAACTACATGGACCTGAATAACATCATCGCGCTCATTGTGAGCTCAGTGACGGCGTCTTTGCGTTTCCCGGGTAAATTAAACACCGACCTGAGTGAGTTTGTGACCAATCTGGTGCCGTTCCCTGGCAATCATTTCCTCACGGCTAGCTTTGCGCCGATGCGTGGGGCGGGACAGGAAGGGCAGGTGCGGACGAATTTCCCAGACCTGGCTCGTGAGACCTTTGCTCAGGATAATTTCACAGCGGCTATTGATTGGCAGCAGGGCGTTTATCTGGCAGCGAGCGCCCTCTTCCGGGGAGATGTGAAGGCGAAGGATGTGGATGAAAATATGGCCACCATTCGCAAATCCCTCAACTATGCGAGCTACATGCCTGCCTCGGGCGGTCTGAAACTGGGGTATGCGGAGACAGCGCCGGAAGGTTTTGCCTCCAGTGGCCTGGCCCTGGTGAATCACACGGGCATCGCGGCGGTTTTTGAGCGCTTGATTGCCCAGTTTGACATCATGTTCGATAACCATGCATACACGCACTGGTATGAGAACGCGGGTGTCTCCCGTGACATGATGGCGAAGGCGCGTAACCAGATCGCCACTCTCGCCCAATCTTATGAAATCTTGAACATGCCTAACTTAAACGAAGCGCAACGTAACGGCTTCATTCAAAGTCTTAAAGACGACCCAAGCCAAAGCACTAACGTTTTAGGTGAAGCTAAAAAATTAAACGAATCTCAAGCACCGAAATAA。

融合PCR扩增时，引物序列设计如下：

正向引物：5’-CCAATTCCATATGCATCACCATCACCATCACCATCACAGAGAGATTTTAAGCATTCACG-3’，

反向引物：5’-CCGCTCGAGTTATTTCGGTGCTTGAGATTCGTTT-3’；

PCR扩增时，50μL扩增体系设计如下：

回收的微管β亚基序列的PCR扩增产物，1μL(500ng/L)；

回收的蛋白A的D结构域序列的PCR扩增产物，1μL(500ng/L)；

10×PCR缓冲液，5μL；

dNTP混合物(2、5mM/each)，2μL；

Taq聚合酶(5U/L)，0、5μL；

上游引物(10μM)，5μL；

下游引物(10μM)，5μL；

ddH2O，30、5μL；

PCR程序：变性，退火和延伸，参数分别是：95℃、3min；94℃、40sec，55℃、40sec，72℃、110sec，25个循环；72℃延伸10min。

对PCR扩增产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测鉴定。

实施例2融合基因βA的表达菌株构建及纯化

(1)利用实施例1中获得的融合基因βA，与载体pET-22b(+)质粒分别进行NdeI和XhoI酶切，通过T4连接酶于22℃连接1h；

(2)通过热激法将连接产物导入至感受态E、coli DH5α菌株，然后通过含100ug/mL氨苄青霉素的LB固体平板和引物PCR；

(3)将步骤(2)得到的含重组质粒的E、coli DH5α菌株接种于5mL含100ug/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，以温度37℃、搅拌速度220rpm的条件培养过夜；

(4)利用质粒抽提试剂盒抽提出重组质粒pET-22b(+)-βA，通过热激法将重组质粒导入至E、coli C43(DE3)中，然后通过含100ug/mL氨苄青霉素的LB固体平板和引物PCR筛选阳性克隆，即获得表达菌株，如图1所示；

(5)将表达菌株接种于10-15mL含100ug/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，以温度37℃、搅拌速度220rpm的条件培养8-9h。按2％转接500mL含100ug/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，以温度37℃、搅拌速度220rpm的条件培养2-4h至OD 0、8-1、2，加入终浓度为0、1mM的IPTG，以温度20℃、搅拌速度220rpm的条件诱导过夜；

(6)将发酵液按照8000×g，离心3min的条件收集菌体，按每1g菌体加入10mL缓冲液重悬菌体，按照超声5s-暂停5s、400W功率条件超声破碎，每20mL超声30min，破碎的菌液于4℃、18000×g的条件离心30min收集上清液；

(7)将破碎上清过0、22μm的无机水膜，通过镍柱进行纯化，咪唑洗脱液梯度为50-100-150-300-500mM，检测波长为280nm，收集100mM和150mM洗脱液，进行10％SDS-PAGE电泳鉴定目的蛋白表达纯化情况母，如图2所示。

(8)测定融合蛋白βA的产率约100g/L(纯度＞90％)。

实施例3微管蛋白α亚基的表达菌株构建及纯化

(1)利用全基因合成的微管蛋白α亚基cDNA作为模板，进行PCR扩增，扩增时的引物设计如下：

正向引物：5’-CCAATTCCATATGCATCACCATCACCATCACCATCACAAGGTCAACAACACCATTGTCG-3’，

反向引物：5’-CCGCTCGAGTTATTTCGGTGCTTGAGATTCGTTT-3’；

通过PCR扩增得到N-端带有8×His tag的α亚基基因，与载体pET-22b(+)质粒分别进行NdeI和XhoI酶切，通过T4连接酶于22℃连接1h；

(2)通过热激法将连接产物导入至感受态E、coli DH5α菌株，然后通过含100ug/mL氨苄青霉素的LB固体平板和引物PCR；

(3)将步骤(2)得到的含重组质粒的E、coli DH5α菌株接种于5mL含100ug/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，以温度37℃、搅拌速度220rpm的条件培养过夜；

(4)利用质粒抽提试剂盒抽提出重组质粒pET-22b(+)-α，通过热激法将重组质粒导入至E、coli C43(DE3)中，然后通过含100ug/mL氨苄青霉素的LB固体平板和引物PCR筛选阳性克隆，即获得表达菌株；

(5)将表达菌株接种于10-15mL含100ug/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，以温度37℃、搅拌速度220rpm的条件培养8-9h。按2％转接500mL含100ug/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，以温度37℃、搅拌速度220rpm的条件培养2-4h至OD 0、8-1、2，加入终浓度为0、1mM的IPTG，以温度20℃、搅拌速度220rpm的条件诱导过夜；

(6)将发酵液按照8000×g，离心3min的条件收集菌体，按每1g菌体加入10mL缓冲液重悬菌体，按照超声5s-暂停5s、400W功率条件超声破碎，每20mL超声30min，破碎的菌液于4℃、18000×g的条件离心30min收集上清液；

(7)将破碎上清过0、22μm的无机水膜，通过镍柱进行纯化，咪唑洗脱液梯度为50-100-150-300-500mM，检测波长为280nm，收集150mM和300mM洗脱液，进行10％SDS-PAGE电泳鉴定目的蛋白表达纯化情况，如图3所示。

(8)测定α亚基产率约60mg/mL(纯度＞90％)。

实施例4微管蛋白β亚基的表达菌株构建及纯化

(1)利用全基因合成的微管蛋白β亚基cDNA作为模板，进行PCR扩增，扩增时的引物设计如下：

正向引物：5’-CCAATTCCATATGCATCACCATCACCATCACCATCACAGAGAGATTTTAAGCATTCACG-3’，

反向引物：5’-CCGCTCGAGTTATTTCGGTGCTTGAGATTCGTTT-3’；

通过PCR扩增得到N-端带有8×His tag的β亚基基因，与载体pET-22b(+)质粒分别进行NdeI和XhoI酶切，通过T4连接酶于22℃连接1h；

(2)通过热激法将连接产物导入至感受态E、coli DH5α菌株，然后通过含100ug/mL氨苄青霉素的LB固体平板和引物PCR；

(3)将步骤(2)得到的含重组质粒的E、coli DH5α菌株接种于5mL含100ug/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，以温度37℃、搅拌速度220rpm的条件培养过夜；

(4)利用质粒抽提试剂盒抽提出重组质粒pET-22b(+)-α，通过热激法将重组质粒导入至E、coli C43(DE3)中，然后通过含100ug/mL氨苄青霉素的LB固体平板和引物PCR筛选阳性克隆，即获得表达菌株；

(5)将表达菌株接种于10-15mL含100ug/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，以温度37℃、搅拌速度220rpm的条件培养8-9h。按2％转接500mL含100ug/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，以温度37℃、搅拌速度220rpm的条件培养2-4h至OD 0、8-1、2，加入终浓度为0、1mM的IPTG，以温度20℃、搅拌速度220rpm的条件诱导过夜；

(6)将发酵液按照8000×g，离心3min的条件收集菌体，按每1g菌体加入10mL缓冲液重悬菌体，按照超声5s-暂停5s、400W功率条件超声破碎，每20mL超声30min，破碎的菌液于4℃、18000×g的条件离心30min收集上清液；

(7)将破碎上清过0、22μm的无机水膜，通过镍柱进行纯化，咪唑洗脱液梯度为50-100-150-300-500mM，检测波长为280nm，收集150mM和300mM洗脱液，进行10％SDS-PAGE电泳鉴定目的蛋白表达纯化情况，如图4所示。

(8)测定β亚基产率约60mg/mL(纯度＞90％)。

实施例5VHⅢ家族单链抗体表达菌株的构建与表达

(1)利用全基因合成的抗酪氨酸激酶受体2的单链抗体(scFv)基因cDNA作为模板，进行PCR扩增使得该段cDNA的N端获得NdeI酶切位点、C端获得XhoI酶切位点(此处省略引物设计)，将PCR扩增产物与载体pET-22b(+)质粒分别进行NdeI和XhoI酶切，通过T4连接酶于22℃连接1h；

(2)通过热激法将连接产物导入至感受态E、coli DH5α菌株，然后通过含100ug/mL氨苄青霉素的LB固体平板和引物PCR；

(3)将步骤(2)得到的含重组质粒的E、coli DH5α菌株接种于5mL含100ug/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，以温度37℃、搅拌速度220rpm的条件培养过夜；

(4)利用质粒抽提试剂盒抽提出重组质粒pET-22b(+)-α，通过热激法将重组质粒导入至E、coli C43(DE3)中，然后通过含100ug/mL氨苄青霉素的LB固体平板和引物PCR筛选阳性克隆，即获得表达菌株；

(5)将表达菌株接种于10-15mL含100ug/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，以温度37℃、搅拌速度220rpm的条件培养8-9h。按2％转接500mL含100ug/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，以温度37℃、搅拌速度220rpm的条件培养2-4h至OD 0、8-1、2，加入终浓度为0、1mM的IPTG，以温度20℃、搅拌速度220rpm的条件诱导过夜；

(6)将发酵液按照8000×g，离心3min的条件收集菌体，按每1g菌体加入10mL缓冲液重悬菌体，按照超声5s-暂停5s、400W功率条件超声破碎，每20mL超声30min，破碎的菌液于4℃、18000×g的条件离心30min收集上清液；

(7)将破碎上清过0、22μm的无机水膜，通过镍柱进行纯化，咪唑洗脱液梯度为50-100-150-300-500mM，检测波长为280nm，收集150mM和300mM洗脱液，进行10％SDS-PAGE电泳鉴定目的蛋白表达纯化情况。

(8)测定抗酪氨酸激酶受体2的单链抗体(scFv)产率为0、5mg/mL。

实施例6微管蛋白β亚基-蛋白A的D结构域融合蛋白βA的VHⅢ家族抗体结合活性测定

(1)将抗酪氨酸激酶受体2的单链抗体稀释至5ug/mL，以每孔加入100uL、4℃过夜的条件包被96孔板；每孔加入200uL PBST洗涤液，洗涤三次，每次5min；

(2)配置5％的BSA(w/v)，每孔加入200uL、37℃、2h的条件封闭96孔板；每孔加入300uL PBST洗涤液，洗涤三次，每次5min；

(3)融合蛋白βA梯度稀释浓度0-0、00052-0、0052-0、052-0、52-5、2-52-520ug/mL，以每孔加入100uL、37℃、1h的条件孵育96孔板；每孔加入200uL PBST洗涤液，洗涤三次，每次5min；

(4)按照1：125(v/v)稀释HRP-山羊抗兔IgG(H+L)抗体，以每孔加入100uL、37℃、1h的条件孵育96孔板；每孔加入200uL PBST洗涤液，洗涤三次，每次5min；

(5)以每孔加入100uL、37℃避光的条件加入TMB底物显色30min，每孔加入50uL 2M硫酸终止反应，于450nm波长处测定吸光度。

如图5所示的结果表明：实施例2制备的融合蛋白βA具有蛋白A的D结构域亲和VHⅢ家族抗体的活性。

实施例7微管蛋白β亚基-蛋白A的D结构域融合蛋白βA的自组装活性测定

(1)将实施例2、3、4中制备的含融合蛋白βA、微管蛋白α亚基和β亚基的溶液分别用3kD的透析袋，于4℃的条件置换成组装缓冲液；

(2)将微管蛋白α亚基、微管蛋白β亚基以及融合蛋白βA均配置浓度为2mg/mL的溶液，将微管蛋白α亚基与融合蛋白βA按照等体积混合，加入终浓度为1mM的GTP，室温下组装10min，作为实验组；将微管蛋白α亚基和微管蛋白β亚基按照等体积混合，加入终浓度为1mM的GTP，室温下组装10min，作为对照组。

(3)取3uL组装后样品滴在200目的镀碳膜铜网上，0、1％磷钨酸染色，通过120kVTEM观察形貌。

图6a所示的是对照组微管蛋白α亚基和微管蛋白β亚基的TEM检验结果，图6b所示的是实验组微管蛋白α亚基与融合蛋白βA的TEM检验结果，通过与对照组相比发现，微管蛋白α亚基与融合蛋白βA组装成功，观察到条形的组装后微管形貌。

以上实验说明，融合蛋白βA具有变形杆菌(Prosthecobacter dejongeii)来源的微管自组装活性。

由实验结果可以看出，本发明设计的融合蛋白βA同时具备蛋白A的D结构域亲和VHⅢ家族抗体的活性和微管亚基自组装活性。

目前，抗体纯化种常使用蛋白A的B结构域的突变体Z结构域结合抗体恒定区或蛋白L结合kappa轻链纯化抗体，本发明设计的融合蛋白βA具有蛋白A的D结构域亲和VHⅢ家族抗体的活性，可用作富集、纯化VHⅢ家族抗体的配体蛋白。

此外，抗原表位的鉴定限制了抗体药物的发展，冷冻电镜技术可实现快速、准确的抗原表位鉴定。然而，冷冻电镜技术很难直接解析100kDa以下的蛋白质结构。本发明设计的融合蛋白βA具备微管亚基自组装活性，能与微管蛋白α亚基自组装形成微管结构，融合蛋白βA又可借助蛋白A的D结构域结合VHⅢ家族抗体，形成工程化微管-抗体-抗原的复合物，突破冷冻电镜技术对样品的尺寸限制。

以上实施例仅供说明本发明之用，而非对本发明的限制，有关技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以作出各种变换或变型，因此所有等同的技术方案也应该属于本发明的范畴，应由各权利要求所限定。

SEQUENCE LISTING

<110> 华东师范大学

<120> 一种表达微管β亚基与蛋白A的D结构域融合蛋白的基因工程菌株

<130> 1

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1305

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

atgcatcacc atcaccatca ccatcacaga gagattttaa gcattcacgt cggacagtgt 60

ggcaaccaga tcgccgatag cttttggagg ttggctttgc gcgagcatgg cctcacagaa 120

gcaggtaccc tgaaagaagg cagcaatgct gcggcaaatt ccaacatgga agtcttcttt 180

cacaaggtgc gtgatggcaa gtatgtgcca cgggctgttt tggtggactt ggagcctgga 240

gtcatcgccc gtattgaagg gggcgacatg tctcagcttt ttgatgagag cagcatcgtg 300

cgcaagatcc ccggtgcggc gaacaactgg gcgcgtggtt acaatgtcga gggtgagaag 360

gtcattgacc agatcatgaa cgtcattgat agcgcggtcg aaaaaaccaa gggcctacaa 420

gggttcttga tgacgcactc catcggtggc ggttccggct caggccttgg ctcgctgatc 480

ttggagcggc tgcgccaggc atatccgaaa aagcgtatct tcactttttc ggtggtgccc 540

tctcccctga tttccgattc ggctgtggag ccctacaatg ccatcctgac tctgcagcgc 600

atcttggaca atgcggatgg agctgtgttg ctggataacg aggcgctgtt ccgcatcgct 660

aaagcgaagc tgaatcgcag cccgaactac atggacctga ataacatcat cgcgctcatt 720

gtgagctcag tgacggcgtc tttgcgtttc ccgggtaaat taaacaccga cctgagtgag 780

tttgtgacca atctggtgcc gttccctggc aatcatttcc tcacggctag ctttgcgccg 840

atgcgtgggg cgggacagga agggcaggtg cggacgaatt tcccagacct ggctcgtgag 900

acctttgctc aggataattt cacagcggct attgattggc agcagggcgt ttatctggca 960

gcgagcgccc tcttccgggg agatgtgaag gcgaaggatg tggatgaaaa tatggccacc 1020

attcgcaaat ccctcaacta tgcgagctac atgcctgcct cgggcggtct gaaactgggg 1080

tatgcggaga cagcgccgga aggttttgcc tccagtggcc tggccctggt gaatcacacg 1140

ggcatcgcgg cggtttttga gcgcttgatt gcccagtttg acatcatgtt cgataaccat 1200

gcatacacgc actggtatga gaacgcgggt gtctcccgtg acatgatggc gaaggcgcgt 1260

aaccagatcg ccactctcgc ccaatcttac cgcgacgcga gttaa 1305

<210> 2

<211> 153

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

gatcaacaaa gcgccttcta tgaaatcttg aacatgccta acttaaacga agcgcaacgt 60

aacggcttca ttcaaagtct taaagacgac ccaagccaaa gcactaacgt tttaggtgaa 120

gctaaaaaat taaacgaatc tcaagcaccg aaa 153

<210> 3

<211> 1425

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

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ggcaaccaga tcgccgatag cttttggagg ttggctttgc gcgagcatgg cctcacagaa 120

gcaggtaccc tgaaagaagg cagcaatgct gcggcaaatt ccaacatgga agtcttcttt 180

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gtcatcgccc gtattgaagg gggcgacatg tctcagcttt ttgatgagag cagcatcgtg 300

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gtcattgacc agatcatgaa cgtcattgat agcgcggtcg aaaaaaccaa gggcctacaa 420

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ttaggtgaag ctaaaaaatt aaacgaatct caagcaccga aataa 1425

<210> 4

<211> 1446

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

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caggcaggta atcagatcgc ggcttccttt tggaagacgg tttgccttga gcatgggata 120

gacccgctca caggacagac ggccccaggg gtagcgccac gtgggaactg gagctctttt 180

ttctccaagt tgggcgaatc ttcctctggc agctacgtgc cacgcgccat catggtggat 240

ctggagccga gtgtgattga taacgtgaag gcaacaagtg gctctctttt caatccggca 300

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gctcttttga tcgagtcctt gaaggagaaa tatggcgaaa tcccagtgct gagttgtgcg 540

gtactgccat ctcctcaggt gtcttcggtg gtgacggagc cttacaacac agtcttcgcg 600

ctaaacacgc tgcgccgttc tgccgatgcg tgcctgatct ttgacaatga ggcgcttttt 660

gacctggctc accgcaaatg gaatatcgag agcccgacgg tggatgacct gaatctgttg 720

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cgctaa 1446

<210> 5

<211> 726

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gatattcaga tgacccagag cccgagcagc ctgagcgcaa gcgttggtga tcgtgttacc 60

attacctgta aagcaagcca ggatgttagc attggtgttg catggtatca gcagaaaccg 120

ggtaaagcac cgaaactgct gatttatagc gcaagctatc gttataccgg tgttccgagc 180

cgttttagcg gtagcggtag cggtaccgat tttaccctga ccattagcag cctgcagccg 240

gaagattttg caacctatta ttgtcagcag tattatattt atccgtatac ctttggtcag 300

ggtaccaaag ttgaaattaa acgtggtggt ggtggtagcg gtggtggtgg tagcggtggt 360

ggtggtagcg aagttcagct ggttgaaagc ggtggtggtc tggttcagcc gggtggtagc 420

ctgcgtctga gctgtgcagc aagcggtttt acctttaccg attataccat ggattgggtt 480

cgtcaggcac cgggtaaagg tctggaatgg gttgcagatg ttaatccgaa tagcggtggt 540

agcatttata atcagcgttt taaaggtcgt tttaccctga gcgttgatcg tagcaaaaat 600

accctgtatc tgcagatgaa tagcctgcgt gcagaagata ccgcagttta ttattgtgca 660

cgtaatctgg gtccgagctt ttattttgat tattggggtc agggtaccct ggttaccgtt 720

agcagc 726

Claims (2)

1.一种表达微管β亚基与蛋白A的D结构域融合蛋白的基因工程菌株，其特征在于，所述菌株命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli）C43(DE3)/pET-22b-βA3，已保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC No.19441。

2.一种表达微管β亚基与蛋白A的D结构域融合蛋白的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）对微管β亚基序列和蛋白A的D结构域序列分别进行PCR扩增，

所述微管β亚基序列，碱基序列如SEQ ID NO.1所示；

采用PCR扩增方式，对微管β亚基序列进行扩增，PCR扩增时引物序列设计如下：

正向引物：5’-CCAATTCCATATGCATCACCATCACCATCACCATCACAGAGAGATTTTAA GCATTCACG-3’，

反向引物：5’-GCATGTTCAAGATTTCATAAGATTGGGCGAGAGTGGCG-3’；

所述蛋白A的D结构域序列，碱基序列如SEQ ID NO.2所示；

采用PCR扩增方式，对蛋白A的D结构域序列进行扩增，PCR扩增时引物序列设计如下：

正向引物：5’-CGCCACTCTCGCCCAATCTTATGAAATCTTGAACATGC-3’，

反向引物：5’-CCGCTCGAGTTATTTCGGTGCTTGAGATTCGTTT-3’；

（2）融合PCR制备βA融合基因序列，

所述βA融合基因序列，碱基序列如SEQ ID NO.3所示；

以步骤（1）中所回收的微管β亚基序列的PCR扩增产物和蛋白A的D结构域序列的PCR扩增产物为模板，融合PCR扩增时，引物序列设计如下：

正向引物：5’-CCAATTCCATATGCATCACCATCACCATCACCATCACAGAGAGATTTTAA GCATTCACG-3’，

反向引物：5’-CCGCTCGAGTTATTTCGGTGCTTGAGATTCGTTT-3’；

（3）pET-22b（+）载体进行NdeI和XhoI酶切，并与步骤（2）中的βA融合基因序列进行连接，获得表达重组质粒pET-22b（+）-βA；

（4）将步骤（3）中的表达重组质粒pET-22b（+）-βA转化大肠杆菌C43（DE3）感受态细胞，筛选阳性重组子；

（5）对阳性重组子进行发酵表达，筛选出高效表达βA融合基因序列的大肠杆菌基因工程菌株。

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