CN111057688B

CN111057688B - 一种制备n-乙酰氨基半乳糖转移酶的方法

Info

Publication number: CN111057688B
Application number: CN201911267015.3A
Authority: CN
Inventors: 张延�; 梁涛; 许之珏; 贾文娟
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2019-12-11
Filing date: 2019-12-11
Publication date: 2022-09-23
Anticipated expiration: 2039-12-11
Also published as: WO2021115011A1; CN111057688A

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种用于表达N‑乙酰氨基半乳糖转移酶的原核表达系统。本发明提供一种用于表达N‑乙酰氨基半乳糖转移酶的原核表达载体，所述表达载体中包括ppGalNAc‑T蛋白表达框和PDI蛋白表达框。本发明所提供的用于表达N‑乙酰氨基半乳糖转移酶的原核表达载体和原核表达系统使用共表达单一质粒及具有胞内氧化环境的宿主细胞、并通过常规的通用培养基进行表达，表达系统和操作方法均简单，一步表达、纯化，不需要重折叠等后续操作，且获得ppGalNAc‑T2酶的产量优于人源HEK 293T细胞系表达纯化的ppGalNAc‑T2酶。

Description

一种制备N-乙酰氨基半乳糖转移酶的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种用于表达N-乙酰氨基半乳糖转移酶的原核表达系统，并进一步提供了通过上述用于表达N-乙酰氨基半乳糖转移酶的原核表达系统制备N-乙酰氨基半乳糖转移酶的方法。

背景技术

糖基化修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰形式，不仅参与蛋白质剪切加工、细胞增殖分化、免疫炎症等过程，还对重组蛋白类药物具有重要影响。约70％重组蛋白类药物在天然状态下带有糖基化修饰，其中N-糖链和O-糖链在蛋白质药物中最为常见。缺乏糖基化修饰会导致这些蛋白药物在体内的半衰期变短或药效降低，例如缺少N-糖基化修饰的人干扰素γ会被蛋白酶降解，从而导致其半衰期缩短；促排卵药物Corifollitropin alfa(FSH)缺乏N-糖基化修饰会导致其热变性，效价降低；母乳蛋白中的O-糖基化修饰对母乳喂养婴儿的健康有益，这种人乳寡糖(HMOs)不仅可以为大脑提供营养，还可以调节肠道微生物，诱导免疫细胞应答。

目前糖链合成共存在三种方法：1、从天然产物中分离纯化；2、使用化学合成法合成；3、使用糖基转移酶催化合成。糖基转移酶用于酶法合成糖链不仅特异性好，且获得糖链的纯度极高，但是体外酶法合成N-糖链和O-GalNAc糖链需要大量糖基转移酶。目前为止除了合成O-GalNAc糖链的ppGalNAc-T糖基转移酶以外，多数人源糖基转移酶可用细菌或酵母来源的同工酶进行人源酶的替代，例如甘露糖基转移酶Alg1、Alg2、Alg3、Alg9；N-乙酰氨基葡萄糖转移酶β3GNT；唾液酸转移酶ST3Gal1；半乳糖转移酶B4GalT1。细菌或其他物种来源的糖基转移酶或糖苷酶不仅可以用于人源N-糖链和O-GalNAc糖链的合成，还可以用于糖基化工具酶的开发。2019年，Hong,S.等人对细菌来源的岩藻糖转移酶进行改造，开发了一种细胞表面糖链编辑的技术。该技术可以用于细胞表面糖链合成与标记，肿瘤细胞表面被标记的糖链可以被单克隆抗体所特异性识别从而用于肿瘤的靶向治疗。由于迄今为止，尚未在细菌或酵母体内发现ppGalNAc-T酶的同工酶，因此，ppGalNAc-T酶成为蛋白质初始O-GalNAc糖基化体外快速合成、大量制备O-GalNAc糖链的限速因素，开发制备活性稳定高产的ppGalNAc-T酶对填补蛋白质O-糖链合成技术缺陷以及后续运用酶工程改良生产糖基化工具酶具有重要意义。目前ppGalNAc-T酶的获得主要通过真核表达纯化系统，如人源模式细胞HEK293、昆虫细胞SF9、SF21中表达纯化。2002年，Guo,J.M.等人使用昆虫细胞Sf21表达纯化了有活性的ppGalNAc-T12酶。2003年，Zhang,Y.等人使用Sf21细胞表达纯化了有活性的ppGalNAc-T13酶。利用真核表达纯化系统获得ppGalNAc-T酶的优势是：纯化得到的糖基转移酶保持了原有翻译后修饰，不需要进行密码子优化。但缺点是分泌量低，表达细胞培养成本高，无法实现糖基转移酶的大批量生产等。因此建立低成本，高效，大量生产活性ppGalNAc-T酶的原核表达系统，对于后续将ppGalNAc-T酶应用于重组蛋白药物生产，控制其O-GalNAc糖基化水平，提升重组蛋白药物的效价、以及糖基化工具酶的开发都具有十分重要意义。

在原核系统中表达真核蛋白质，通常由于物种密码子差异，蛋白质成熟系统的差异等，造成所表达蛋白质的错误折叠，形成包涵体，不可溶等现象。在大肠杆菌中表达的ppGalNAc-T酶同样存在该现象，因此在细菌中大量生产具有酶活的ppGalNAc-T酶在技术可行性上具有缺陷。S·萨里巴斯等人采用了体外重折叠的方法获得了有活性的ppGalNAc-T2，但是该方法操作复杂，步骤繁琐，无法直接从大肠杆菌中获得可溶且高活性的ppGalNAc-T2酶(CN 101151367A)。2015年Jennifer Lauber等人首次在细菌中表达出有活性的ppGalNAc-T酶，该系统使用了两个多顺反子构成的共表达质粒，先后表达三个分子伴侣和ppGalNAc-T2酶，使用EnPresso B培养基在Shuffle T7宿主菌株中生产ppGalNAc-T2酶。该系统的缺陷是，表达系统复杂，使用多个表达质粒；培养基成分复杂，原料价格高昂，整体收率低。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种用于表达N-乙酰氨基半乳糖转移酶的原核表达系统，并进一步提供了通过上述用于表达N-乙酰氨基半乳糖转移酶的原核表达系统制备N-乙酰氨基半乳糖转移酶的方法，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明一方面提供一种用于表达N-乙酰氨基半乳糖转移酶的原核表达载体，所述表达载体中包括ppGalNAc-T蛋白表达框和PDI蛋白表达框。

在本发明一些实施方式中，所述ppGalNAc-T蛋白是人源的。

在本发明一些实施方式中，所述ppGalNAc-T蛋白选自ppGalNAc-T1蛋白、ppGalNAc-T2蛋白、ppGalNAc-T3蛋白、ppGalNAc-T4蛋白、ppGalNAc-T5蛋白、ppGalNAc-T6蛋白、ppGalNAc-T7蛋白、ppGalNAc-T8蛋白、ppGalNAc-T9蛋白、ppGalNAc-T10蛋白、ppGalNAc-T11蛋白、ppGalNAc-T12蛋白、ppGalNAc-T13蛋白、ppGalNAc-T14蛋白、ppGalNAc-T15蛋白、ppGalNAc-T16蛋白、ppGalNAc-T17蛋白、ppGalNAc-T18蛋白、ppGalNAc-T19蛋白、ppGalNAc-T20蛋白。

在本发明一些实施方式中，所述ppGalNAc-T蛋白的氨基酸序列包括如SEQ ID NO:2所示序列。

在本发明一些实施方式中，所述PDI蛋白是人源的。

在本发明一些实施方式中，所述PDI蛋白的氨基酸序列包括如SEQ ID NO:4所示序列。

在本发明一些实施方式中，所述表达载体中，还包括Mistic蛋白表达框，所述Mistic来源于枯草芽孢杆菌。

在本发明一些实施方式中，所述Mistic蛋白的氨基酸序列包括如SEQ ID NO:6所示序列。

在本发明一些实施方式中，所述ppGalNAc-T蛋白表达框和/或PDI蛋白表达框和/或Mistic蛋白表达框包括相同的启动子。

在本发明一些实施方式中，所述表达载体为多基因共表达载体。

在本发明一些实施方式中，所述表达载体由pRSFDuet-1载体构建获得。

本发明另一方面提供一种用于表达N-乙酰氨基半乳糖转移酶的原核表达系统，所述表达系统中包括上述的原核表达载体。

在本发明一些实施方式中，原核表达系统的宿主细胞选自具有胞内氧化环境的菌株。

在本发明一些实施方式中，所述原核表达系统的宿主细胞选自大肠杆菌，优选选自Rosetta-gami 2。

本发明另一方面提供一种N-乙酰氨基半乳糖转移酶的制备方法，包括如下步骤：培养上述的原核表达系统，从而表达出N-乙酰氨基半乳糖转移酶，纯化分离出所述的N-乙酰氨基半乳糖转移酶。

附图说明

图1A显示为ppGalNAc-T酶的催化形式示意图。

图1B显示为对人源ppGalNAc-T2蛋白(RefSeq Accession Number:Q10471)结构分析示意图。

图1C显示为人源PDI蛋白(RefSeq Accession Number:P07237)结构分析示意图。

图1D显示为本发明实施例1质粒构建策略示意图。

图1E显示为本发明实施例1质粒构建策略示意图。

图2A显示为pRSFDuet-1质粒双酶切、PDI目的片段双酶切后的凝胶电泳结果示意图。

图2B显示为将PDI片段连接入经上述内切酶双酶切后的pRSFDuet-1质粒、Mistic目的片段和Recombinant ppGalNAc-T2目的片段连接后的凝胶电泳结果示意图。

图2C显示为将Recombinant ppGalNAc-T2目的片段经双酶切后的凝胶电泳结果示意图。

图2D显示为将PDI片段连接入经上述内切酶双酶切后的pRSFDuet-1质粒、FullLength ppGalNAc-T2目的片段经双酶切后的凝胶电泳结果示意图。

图2E显示为Mistic目的片段和Full Length ppGalNAc-T2目的片段连接后的凝胶电泳结果示意图。

图3A显示为本发明实施例2考马斯亮蓝染色结果示意图。

图3B显示为本发明实施例2Western Blot结果示意图。

图4A显示为本发明实施例3考马斯亮蓝染色结果、Western Blot结果示意图。

图4B显示为本发明实施例3考马斯亮蓝染色结果、Western Blot结果示意图。

图5A显示为本发明实施例4Western Blot结果示意图。

图5B显示为本发明实施例4考马斯亮蓝染色结果示意图。

图6显示为本发明实施例5各多肽的O-糖肽的酶活反应前后的HPLC谱图示意图。

图7显示为本发明实施例5O-糖基化修饰的Muc5AC、APP多肽质谱检测结果示意图。

图8显示为本发明实施例6凝集素印记进行检测结果示意图。

具体实施方式

为了使本发明的发明目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容容易地了解本申请发明的其他优点及功效。

本发明发明人经过大量研究，提供了一种更为简单的用于表达N-乙酰氨基半乳糖转移酶的原核表达载体和表达系统，所述表达载体和表达系统可以利用通用培养基，通过一次表达和纯化，即可获得大量具有酶活的ppGalNAc-T酶，后续体外可以快速进行蛋白质初始O-GalNAc糖基化、合成O-糖修饰糖肽/糖蛋白，在此基础上完成了本发明。

本发明第一方面提供一种用于表达N-乙酰氨基半乳糖转移酶的原核表达载体，所述表达载体中包括ppGalNAc-T蛋白表达框和PDI蛋白表达框。本发明发明人发现，ppGalNAc-T酶在原核表达系统中表达经常会存在错误折叠或表达在包涵体中等现象，而在单一的ppGalNAc-T酶的原核表达质粒中同时共表达人源PDI(Protein DisulfideIsomerase，蛋白质二硫键异构酶)，可以帮助蛋白质二硫键异构形成，不仅可以帮助蛋白质在大肠杆菌中正确折叠，还可促进蛋白质可溶，解决蛋白质表达存在于包涵体中等问题。

本发明所提供的用于表达N-乙酰氨基半乳糖转移酶的原核表达载体中，所述ppGalNAc-T蛋白通常是人源的，优选可以是重组的ppGalNAc-T蛋白，从而可以适用于原核表达系统。所述ppGalNAc-T蛋白可以选自其酶家族(例如，ppGalNAc-T蛋白家族)的各个成员，例如，所述ppGalNAc-T蛋白可以是ppGalNAc-T1蛋白、ppGalNAc-T2蛋白、ppGalNAc-T3蛋白、ppGalNAc-T4蛋白、ppGalNAc-T5蛋白、ppGalNAc-T6蛋白、ppGalNAc-T7蛋白、ppGalNAc-T8蛋白、ppGalNAc-T9蛋白、ppGalNAc-T10蛋白、ppGalNAc-T11蛋白、ppGalNAc-T12蛋白、ppGalNAc-T13蛋白、ppGalNAc-T14蛋白、ppGalNAc-T15蛋白、ppGalNAc-T16蛋白、ppGalNAc-T17蛋白、ppGalNAc-T18蛋白、ppGalNAc-T19蛋白、或ppGalNAc-T20蛋白等。在本发明一具体实施例中，所述ppGalNAc-T蛋白可以是ppGalNAc-T2蛋白。在本发明另一具体实施例中，所述ppGalNAc-T蛋白的氨基酸序列包括如SEQ ID NO:2所示序列。在本发明另一具体实施例中，所述ppGalNAc-T蛋白的核酸编码序列包括如SEQ ID NO:1所示序列。

本发明所提供的用于表达N-乙酰氨基半乳糖转移酶的原核表达载体中，所述PDI蛋白是人源的，优选可以是重组的PDI蛋白，从而可以适用于原核表达系统。在本发明另一具体实施例中，所述PDI蛋白的氨基酸序列包括如SEQ ID NO:4所示序列。在本发明另一具体实施例中，所述PDI蛋白的核酸编码序列包括如SEQ ID NO:3所示序列。

本发明所提供的用于表达N-乙酰氨基半乳糖转移酶的原核表达载体中，所述表达载体中，还可以包括Mistic蛋白表达框。本发明发明人发现，在单一的ppGalNAc-T酶的原核表达质粒中同时共表达Mistic蛋白，可以提升蛋白质的可溶性，具体来说可以帮助穿膜蛋白插入大肠杆菌细胞膜中，从而实现蛋白质可溶，解决蛋白质表达存在于包涵体中等困难。所述Mistic蛋白通常来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。在本发明另一具体实施例中，所述Mistic蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。在本发明另一具体实施例中，所述Mistic蛋白的编码序列包括如SEQ ID NO:5所示序列。

本发明所提供的用于表达N-乙酰氨基半乳糖转移酶的原核表达载体中，所述表达载体通常为原核表达载体，更具体可以为细菌表达载体，优选为大肠杆菌表达载体。所述表达载体通常为多基因共表达载体，即各蛋白表达框(例如，ppGalNAc-T蛋白表达框和/或PDI蛋白表达框和/或Mistic蛋白表达框)可以均位于单一的表达载体中。在本发明一具体实施例中，所述表达载体由pRSFDuet-1载体构建获得。

本发明所提供的用于表达N-乙酰氨基半乳糖转移酶的原核表达载体中，所述ppGalNAc-T蛋白表达框和/或PDI蛋白表达框和/或Mistic蛋白表达框可以各自分别包括启动子，也可以多个蛋白表达框共用一个启动子。在本发明一具体实施例中，所述ppGalNAc-T蛋白表达框和PDI蛋白表达框均可以包括启动子，可以由ppGalNAc-T蛋白表达框和PDI蛋白表达框中的启动子分别调控ppGalNAc-T蛋白和PDI蛋白的表达。在本发明另一具体实施例中，所述表达载体中包括顺序连接的Mistic蛋白表达框和ppGalNAc-T蛋白表达框，所述Mistic蛋白表达框可以包括第一启动子，从而可以由Mistic蛋白表达框中的启动子同时调控Mistic蛋白和ppGalNAc-T蛋白的表达，所述PDI蛋白表达框可以包括第二启动子，可以由PDI蛋白表达框中的启动子调控PDI蛋白的表达。

本发明所提供的用于表达N-乙酰氨基半乳糖转移酶的原核表达载体中，当表达载体中包括多个启动子时，这些启动子可以是相同的，从而可以通过单一的条件即可诱导ppGalNAc-T蛋白和/或PDI蛋白和/或Mistic蛋白的同时表达，例如，所述ppGalNAc-T蛋白表达框和/或PDI蛋白表达框和/或Mistic蛋白表达框包括相同的启动子。本领域技术人员可调整表达载体中的启动子的选择，例如，所述启动子可以是T7 promoter、Sp6 promoter、trp promoter等。

本发明第二方面提供一种用于表达N-乙酰氨基半乳糖转移酶的原核表达系统，所述表达系统中包括本发明第一方面所提供的原核表达载体。所述原核表达系统的宿主细胞通常可以是细菌细胞，更具体可以是大肠杆菌细胞，且需要具有胞内氧化环境的菌株。在本发明一具体实施例中，所述原核表达系统的宿主细胞可以是Rosetta-gami 2。Rosetta-gami 2宿主菌株结合了Rosetta 2和Origami 2菌株的优势，胞内的硫氧还蛋白还原酶trxB和谷胱甘肽还原酶gor基因发生了突变，当在大肠杆菌中表达异源蛋白时，可缓解密码子偏好性并增强细胞质中二硫键的形成。Rosetta-gami 2宿主菌株同时带有抗氯霉素的pRARE2质粒，该质粒可提供7种罕见的tRNA，可以提高含有稀有密码子的蛋白质的表达水平。

本发明第三方面提供一种N-乙酰氨基半乳糖转移酶的制备方法，包括如下步骤：培养本发明第二方面所提供的原核表达系统，从而表达出N-乙酰氨基半乳糖转移酶，纯化分离出所述的N-乙酰氨基半乳糖转移酶。所述制备方法中，需要选择适用的培养基，在适于宿主细胞生长的条件下进行培养，当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。在上面的方法中的N-乙酰氨基半乳糖转移酶可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。在本发明一具体实施方式中，可以使用通用培养基对原核表达系统进行诱导表达，可适用的通用培养基可以是TB培养基、LB培养基等。在本发明一具体实施方式中，可以使用IPTG对原核表达系统进行诱导表达，诱导表达的时间可以为4～24h、4～8h、8～12h、或12～24h，诱导表达的浓度可以为0.01～1mM、0.01～0.05mM、0.05～0.1mM、0.1～0.2mM、0.2～0.4mM、0.4～0.6mM、0.6～0.8mM、或0.8～1mM。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明所提供的用于表达N-乙酰氨基半乳糖转移酶的原核表达载体和原核表达系统使用共表达单一质粒及具有胞内氧化环境的宿主细胞、并通过常规的通用培养基进行表达，表达系统和操作方法均简单，一步表达、纯化，不需要重折叠等后续操作，且获得ppGalNAc-T2酶的产量优于人源HEK 293T细胞系表达纯化的ppGalNAc-T2酶。此外，通过本系统表达获得的ppGalNAc-T2酶具有良好的活性，对EA2多肽在15分钟即反应完全，对Muc5AC多肽在60分钟即反应完全，对APP-peptide2在2小时可反应69.2％，对APP-peptide3在2小时可反应24.2％。

下面通过实施例对本申请的发明予以进一步说明，但并不因此而限制本申请的范围。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例中所涉及的试剂信息具体如下：

人源ppGalNAc-T2基因、PDI基因合成于通用生物系统(安徽)有限公司；

KOD DNA聚合酶、Ligation High连接酶等购于东洋纺(上海)生物科技有限公司；

限制性内切酶购于New England Biolabs；

胶回收、PCR产物纯化和质粒提取试剂盒、IPTG及抗生素购于上海生工；

DH5α感受态细胞购于天根生化科技(北京)有限公司；

Ni-NTA

Resin、pRSFDuet-1载体、Rosetta-gaimi2(pLysS)表达菌株购于Millipore；

UDP-GalNAc购于Sigma-Aldrich；

EA2-FAM多肽、Muc5AC-FAM多肽、APP-peptide2-FAM多肽、APP-peptide3-FAM多肽合成于吉尔生化有限公司(上海)；

人源重组P53蛋白表达于BL21大肠杆菌，PCR引物合成及测序均在上海派森诺生物科技有限公司。

实施例1

pYZL2质粒的构建：

(1)人源ppGalNAc-T2酶及人源PDI核苷酸序列的确立：

ppGalNAc-T酶的催化形式如图1A所示。在UniProt网站上对人源ppGalNAc-T2蛋白(RefSeq Accession Number:Q10471)进行结构分析(图1B)，进行密码子优化，使其适合于大肠杆菌表达，人源ppGalNAc-T2密码子优化后(即Recombinant ppGalNAc-T2)的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。人源PDI蛋白(RefSeq AccessionNumber:P07237)进行结构分析(图1C)，截去其N端信号肽(PDIΔSP，aa:18-508)，进行密码子优化，使其适合于大肠杆菌表达，人源PDI密码子优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

(2)pYZL2质粒的构建：

枯草芽孢杆菌Mistic的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，氨基酸序列如SEQ IDNO:6所示；根据pRSFDuet-1的多克隆位点和ppGalNAc-T2、PDI、Mistic的DNA序列设计引物：

Full Length ppGalNAc-T2(对应上文中的RefSeq Accession Number:Q10471)上游引物：

5’CGCGGATCCATGCGTCGCCGTAGTC 3’(SEQ ID NO:7)

Full length ppGalNAc-T2下游引物：

5’GGCTGGTCGACCTACTGCTG 3’(SEQ ID NO:8)

Recombinant ppGalNAc-T2(对应上文中的RefSeq Accession Number:Q10471的52–571氨基酸片段)上游引物：

5’CGCGGATCCAAGAAGAAGGA 3’(SEQ ID NO:9)

Recombinant ppGalNAc-T2下游引物：

5’GGCTGGTCGACCTACTGCTG 3’(SEQ ID NO:10)

PDI上游引物：5’AAAGATATCGATGGATGCACC 3’(SEQ ID NO:11)

PDI下游引物：5’CGGGGTACCTTACAGTTCATC 3’(SEQ ID NO:12)

Mistic上游引物：5’CGCGGATCCATGTTTTGTAC 3’(SEQ ID NO:13)

Mistic下游引物：5’GGCTGGTCGACCTGCTGTTC 3’(SEQ ID NO:14)

按照附图质粒构建策略进行质粒构建：以合成的ppGalNAc-T2及PDI及Mistic DNA序列为模板，通过PCR扩增得到目的片段，PCR反应条件为：94℃ 2min；94℃ 15s，52℃ 30s，68℃ 2min，38个循环；68℃ 10min；Mistic目的片段经EcoR I、Nhe I双酶切；Full LengthppGalNAc-T2和Recombinant ppGalNAc-T2目的片段经BamH I、Sal I双酶切；PDI目的片段经EcoR V、Kpn I双酶切后胶回收，以Ligation High连接酶将PDI片段连接入经上述内切酶双酶切后的pRSFDuet-1质粒，再连接入插入蛋白(human ppGalNAc-T2)，构建策略如图1D和图1E所示，连接反应条件为：

构建表达质粒名称为：pYZL2

具体插入蛋白(human ppGalNAc-T2)名称为：

human Recombinant ppGalNAc-T2(hRT2)，即上述Recombinant ppGalNAc-T2目的片段；

Mistic human Recombinant ppGalNAc-T2(MishRT2)，N端至C端包括依次连接的上述Mistic目的片段和上述Recombinant ppGalNAc-T2目的片段；

human Full Length ppGalNAc-T2(hFLT2)，即上述Full Length ppGalNAc-T2目的片段；

Mistic human Full Length ppGalNAc-T2(MishFLT2)，N端至C端包括依次连接的上述Mistic目的片段和上述Full Length ppGalNAc-T2目的片段。

质粒构建过程的凝胶电泳图如图2所示，其中，图2A为pRSFDuet-1质粒双酶切、PDI目的片段双酶切后的凝胶电泳结果示意图；图2B为将PDI片段连接入经上述内切酶双酶切后的pRSFDuet-1质粒、Mistic目的片段和Recombinant ppGalNAc-T2目的片段连接片段经双酶切后的凝胶电泳结果示意图；图2C为将Recombinant ppGalNAc-T2目的片段经双酶切后的凝胶电泳结果示意图；图2D为将PDI片段连接入经上述内切酶双酶切后的pRSFDuet-1质粒、Full Length ppGalNAc-T2目的片段经双酶切后的凝胶电泳结果示意图；图2E为Mistic目的片段和Full Length ppGalNAc-T2目的片段连接后再经双酶切后的凝胶电泳结果示意图。

将所构建的上述4种质粒热休克法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于LB/Kan⁺(卡那霉素50μg/ml)平板上进行筛选，37℃过夜筛选培养；挑取单菌落后摇菌，提取质粒并测序验证。

实施例2

高表达人源ppGalNAc-T2酶质粒的筛选：

(1)四种人源ppGalNAc-T2酶原核表达菌株构建：

将上述四种pYZL2质粒热休克法转化大肠杆菌Rosetta-gami 2(pLysS)感受态细胞，涂布于LB/Kan⁺/Cam⁺/Str⁺/Tet⁺(卡那霉素50μg/ml，氯霉素34μg/ml，链霉素50μg/ml，四环素10μg/ml)平板上进行筛选，37℃过夜培养。获得如下表达菌株：

Rosetta-gami 2(pLysS)::hRT2(RG2::hRT2)；

Rosetta-gami2(pLysS)::MishRT2(RG2::MishRT2)；

Rosetta-gami2(pLysS)::hFLT2(RG2::hFLT2)；

Rosetta-gami2(pLysS)::MishFLT2(RG2::MishFLT2)；

(2)四种人源ppGalNAc-T2酶原核表达菌株的小量诱导表达及筛选：

从-80℃冰箱挑取RG2::hRT2、RG2::MishRT2、RG2::hFLT2、RG2::MishFLT2甘油菌接种于10ml Kan⁺/Cam⁺/Str⁺/Tet⁺(卡那霉素50μg/ml，氯霉素34μg/ml，链霉素50μg/ml，四环素10μg/ml)LB液体培养基中，37℃220rpm过夜培养。

取100μl菌液以1:100的比例接种于10ml Kan⁺/Cam⁺/Str⁺/Tet⁺(卡那霉素50μg/ml,氯霉素34μg/ml，链霉素50μg/ml，四环素10μg/ml)TB液体培养基中，37℃220rpm摇菌至OD600＝0.6-0.8。

16℃220rpm摇菌1h，加入IPTG至终浓度为0.2mM，16℃220rpm诱导表达24h。

8000g离心5min收集菌体，加入1ml裂解Buffer A(25mM Tris-HCl(pH 8.0),150mMNaCl)，超声破碎30min，4℃14000g离心30min，弃沉淀，收集裂解上清用于考马斯亮蓝染色(图3A)和Western Blot(图3B)检测，由图3可知，四种人源ppGalNAc-T2酶均成功进行原核表达，在相同的培养条件下，四种ppGalNAc-T2酶的表达水平hRT2>MishFLT2>MishRT2>hFLT2。

实施例3

ppGalNAc-T2酶诱导表达条件优化：

(1)IPTG诱导表达时间摸索：

从-80℃冰箱挑取RG2::hRT2甘油菌接种于10ml Kan⁺/Cam⁺/Str⁺/Tet⁺(卡那霉素50μg/ml,氯霉素34μg/ml，链霉素50μg/ml，四环素10μg/ml)LB液体培养基中，37℃ 220rpm过夜培养。

取100μl菌液以1:100的比例接种于10ml Kan⁺/Cam⁺/Str⁺/Tet⁺(卡那霉素50μg/ml,氯霉素34μg/ml，链霉素50μg/ml，四环素10μg/ml)TB液体培养基中，37℃ 220rpm摇菌至OD600＝0.6-0.8。

16℃ 220rpm摇菌1h，加入IPTG至终浓度为0.2mM，16℃ 220rpm诱导表达0、2、4、6、8、12、16、24h。

8000g离心5min收集菌体，加入1ml裂解Buffer A(25mM Tris-HCl(pH 8.0),150mMNaCl)，超声破碎30min，4℃ 14000g离心30min，弃沉淀，收集裂解上清用于考马斯亮蓝染色，并进行Western Blot检测，结果如图4A所示(图中，anti-T2为抗ppGalNAc-T2抗体，购自Sigma-Aldrich公司，货号HPA011222，anti-His为抗His标签抗体，购自Abmart公司，货号M20001M，下同)，由图4A可知，随着诱导时间的延长，hRT2的表达量逐渐上升。

(2)IPTG诱导表达浓度摸索：

从-80℃冰箱挑取RG2::hRT2甘油菌接种于10ml Kan⁺/Cam⁺/Str⁺/Tet⁺(卡那霉素50μg/ml,氯霉素34μg/ml，链霉素50μg/ml，四环素10μg/ml)LB液体培养基中，37℃220rpm过夜培养。

16℃ 220rpm摇菌1h，加入IPTG至终浓度为0、0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1mM，16℃220rpm诱导表达24h。

8000g离心5min收集菌体，加入1ml裂解Buffer A(25mM Tris-HCl(pH 8.0),150mMNaCl)，超声破碎30min，4℃ 14000g离心30min，弃沉淀，收集裂解上清用于考马斯亮蓝染色，并进行Western Blot检测，结果如图4B所示，由图4B可知，各浓度的诱导条件下，均能够表达hRT2。

实施例4

高表达人源ppGalNAc-T2酶的纯化：

(1)hRT2的大量诱导表达：

取4ml菌液以1:100的比例接种于400ml Kan⁺/Cam⁺/Str⁺/Tet⁺(卡那霉素50μg/ml,氯霉素34μg/ml，链霉素50μg/ml，四环素10μg/ml)TB液体培养基中，37℃220rpm摇菌至OD600＝0.6-0.8。

8000g离心5min收集菌体，加入60ml裂解Buffer A(25mM Tris-HCl(pH 8.0),150mM NaCl)，高压600Bar破碎5min，4℃ 14000g离心30min，弃沉淀，收集裂解上清用于蛋白纯化。

(2)hRT2的镍柱纯化：

向亲和层析柱中加入2ml Ni-NTA

Resin(Millipore)；

用5个柱体积的超纯水清洗，加入5个柱体积的Wash Buffer(25mM Tris-HCl(pH8.0)；150mM NaCl；10mM咪唑)进行柱平衡；

然后加入60ml上述裂解上清。分别用含20、50、100、200、400、600、800、2000mM咪唑的裂解Buffer A各5ml洗柱子，分别收集于15ml离心管中。

各取10μl进行SDS-PAGE电泳；考马斯亮蓝染色，并进行Western Blot检测，结果如图5A所示，其中，WCL表示(Whole Cell Lysate，全细胞裂解液)，FL表示(Flow through，流穿液)。可见，在梯度洗脱的条件下，可以对hRT2进行有效纯化，在50～400mM的咪唑洗脱液中可以获得较高浓度的hRT2。

(3)hRT2蛋白超滤浓缩：

超滤管(Millipore,50ml,30k)提前加入10ml超纯水4000g离心5min。

将50-400mM组分依次加至超滤管，4℃ 4000g离心15min；

加入1ml裂解Buffer A稀释咪唑，4000g离心15min，重复10次以上(此时咪唑理论浓度降至2mM以下)。

共获得200μl hRT2用于O-糖肽或O-糖蛋白的制备以及SDS-PAGE电泳(分别加入0.01ul、0.02ul、0.05ul产物)，考马斯亮蓝染色，结果如图5B所示(其中BSA为对照浓度)，重组的ppGalNAc-T2产量计算如表1所示。

表1

实施例5

O-糖肽的制备：

EA2-FAM多肽(SEQ ID NO:15)、Muc5AC-FAM多肽(SEQ ID NO:16)、APP-peptide2-FAM多肽(SEQ ID NO:17)、APP-peptide3-FAM多肽(SEQ ID NO:18)合成于上海吉尔生化有限公司。

O-糖肽的酶活反应体系：

Pro Thr Thr Asp Ser Thr Thr Pro Ala Pro Thr Thr Lys-5,6FAM(SEQ ID NO:15)

Ser Ala Pro Thr Thr Ser Thr Thr Ser Ala Pro Thr Lys-5,6FAM(SEQ ID NO:16)

Ala Met Ser Gln Ser Leu Leu Lys Thr Thr Gln Glu Pro Leu Ala Lys(SEQID NO:17)

Arg Val Pro Thr Thr Ala Ala Ser Thr Pro Asp Ala Val Asp Lys(SEQ IDNO:18)

上表中所使用的ppGalNAc-T酶由实施例4制备获得，反应体系在37℃下孵育30min。

向上述反应产物加入80ul超纯水，通过反相高效液相色谱仪reverse-phase HPLC(Shimadzu,Kyoto,Japan)自动进样40ul至C18分析色谱柱(COSMOSIL 5C18-AR-II,4.6×250mm)。O-糖肽的检测方法：

HPLC流动相为溶液A：H2O+0.05％TFA；溶液B：CH3CN+0.05％TFA；HPLC分离条件：0-16min，20％-28％B；16-18min，,28-80％B；18-23min，80％B；23-25min，80％-20％B；25-30min，20％B；流速：1ml/min，荧光检测器激发波长495nm，发射波长520nm。各多肽的O-糖肽的酶活反应前后的HPLC谱图如图6所示，由图6可知，相对于没有加入ppGalNAc-T酶的体系，含有ppGalNAc-T酶的体系均发生明显的O-糖肽的酶活反应。

O-糖肽糖基化位点质谱检测，质谱仪Quadrupole-Time-of Flight MassSpectrometer(Bruker Daltonics,Germany)，二级碎裂模式为CID，能量范围是60–100％；质谱仪Orbitrap Fusion(Thermo Fisher,U.S.A),二级碎裂模式为EThcD，ETD激活时间150ms，HCD能量范围15％。O-糖基化修饰的Muc5AC、APP多肽质谱检测结果如图7所示，由图7可知，Muc5AC、APP多肽经上述酶活反应后均成功合成为O-糖肽。

实施例6

O-糖蛋白的制备：

(1)人源重组p53蛋白的表达、纯化：

人源p53蛋白(SEQ ID NO:19)重组于pET28a原核表达载体中，为pET28a-p53原核表达质粒，人源p53蛋白N端连有His标签。pET28a-p53质粒热休克法转化大肠杆菌BL21感受态细胞，涂布于Kan⁺(卡那霉素50μg/ml)平板上进行筛选，37℃过夜培养，获得pET28a-p53表达菌株。

从-80℃冰箱挑取pET28a-p53甘油菌接种于10ml Kan⁺(卡那霉素50μg/ml)LB液体培养基中，37℃ 220rpm过夜培养。取2.5ml菌液以1:100的比例接种于250ml Kan⁺(卡那霉素50μg/ml)LB液体培养基中，37℃ 220rpm摇菌至OD600＝0.6-0.8。16℃ 220rpm摇菌1h，加入IPTG至终浓度为0.2mM，16℃ 220rpm诱导表达22h。8000g离心5min收集菌体，加入60ml裂解Buffer A(25mM Tris-HCl(pH 8.0),150mM NaCl)，高压600Bar破碎5min，4℃ 14000g离心30min，弃沉淀，收集裂解上清用于蛋白纯化。

向亲和层析柱中加入2ml Ni-NTA

Resin(Millipore)，用5个柱体积的超纯水清洗，加入5个柱体积的Wash Buffer(25mM Tris-HCl(pH8.0)；150mM NaCl；10mM咪唑)进行柱平衡，然后加入60ml上述裂解上清。分别用含20、50、100、200、400、600、800、2000mM咪唑的裂解Buffer A各2ml洗柱子，分别收集于15ml离心管中。

超滤管(Millipore,0.5ml,10k)提前加入0.5ml超纯水4000g离心5min。将50-200mM组分依次加至超滤管，4℃ 14000g离心15min；加入0.5ml裂解Buffer A稀释咪唑，144000g离心15min，重复10次以上(此时咪唑理论浓度降至2mM以下)。共获得100μl人源重组p53蛋白。

(2)O-糖蛋白的反应体系：

上表中所使用的ppGalNAc-T酶由实施例4制备获得，反应体系在37℃下孵育12h。

(3)O-糖蛋白的检测方法：

O-糖蛋白使用凝集素印记进行检测。上述反应体系在10％SDS-PAGE中进行电泳分离，随后转印到硝酸纤维素膜(NC膜)上。载有O-糖蛋白的NC膜在含有3％BSA的PBS溶液中室温封闭1h，随后在含有1ng/μl辣根过氧化物酶融合的丁香凝集素(VVA-HRP，购自EYLaboratories公司，货号H-4601)的PBS溶液中室温孵育1h，再经含有0.1％tween-20的PBS溶液清洗3次，清洗过的NC膜与ECL发光底物室温反应1min，ECL发光信号使用AI600(GEHealthcare,China)进行图片采集，随后该载有O-糖蛋白的NC膜在含有3％BSA的TBS溶液中室温封闭1h，随后在含有1ng/μl蛋白抗体(p53 antibody，购自Santa Cruz公司，货号sc-126)的TBS溶液中室温孵育1h，在经含有0.1％tween-20的TBS溶液清洗3次，清洗过的NC膜在含有0.1ng/μl DyLight 680融合的二抗室温孵育1h，在经含有0.1％tween-20的TBS溶液清洗2次，经TBS溶液清洗1次，清洗过的NC膜使用Odyssey(LI-COR,USA)进行图片采集，结果如图8所示。由图8可知，相对于不含有ppGalNAc-T酶的反应体系，在含有ppGalNAc-T酶的反应体系中，明显产生了O-糖蛋白。

综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 一种制备N-乙酰氨基半乳糖转移酶的方法

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1563

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aagaagaagg atctgcatca tagcaatggt gaagaaaaag cacagagcat ggaaaccctg 60

ccgccgggta aagttcgttg gccggatttt aatcaggaag catacgttgg tggtacaatg 120

gttcgcagcg gccaggaccc ttatgcacgt aataagttta atcaggtgga aagcgataaa 180

ctgcgcatgg atcgtgccat tccggatacc cgccatgatc agtgtcagcg caaacagtgg 240

cgtgtggatc tgccggccac cagtgttgtt attacctttc ataatgaagc ccgtagcgcc 300

ctgctgcgta ccgtggttag cgtgctgaaa aaatctccgc cgcatctgat taaggaaatt 360

attctggttg atgattacag caatgatccg gaagatggtg cactgctggg caaaattgaa 420

aaagttcgcg tgctgcgtaa tgatcgccgt gaaggtctga tgcgcagtcg cgttcgtggt 480

gccgatgcag cccaggcaaa agttctgacc tttctggata gtcattgtga atgtaatgaa 540

cattggctgg aaccgctgct ggaacgtgtt gcagaagatc gcacccgtgt tgttagcccg 600

attattgatg ttattaatat ggataacttc cagtacgttg gtgccagtgc cgatctgaaa 660

ggtggttttg attggaatct ggtttttaaa tgggattata tgaccccgga acagcgtcgt 720

agccgccagg gtaatccggt ggccccgatt aagaccccga tgattgccgg cggcctgttt 780

gttatggata aattttattt cgaggagctg ggcaaatatg atatgatgat ggatgtttgg 840

ggcggcgaaa atctggaaat tagctttcgc gtttggcagt gcggtggtag cctggaaatt 900

attccgtgta gccgcgttgg tcatgttttt cgtaaacagc atccgtatac ctttccgggc 960

ggcagtggca ccgtgtttgc acgtaatacc cgtcgtgccg cagaagtttg gatggatgaa 1020

tataaaaatt tctactacgc ggccgtgccg agtgcacgca atgtgccgta tggtaatatt 1080

cagagccgcc tggaactgcg caaaaaactg agctgtaaac cgtttaaatg gtatctggaa 1140

aatgtttatc cggaactgcg tgttccggat catcaggata ttgcctttgg tgcactgcag 1200

cagggcacca attgtctgga taccctgggc cattttgccg atggcgttgt tggcgtttat 1260

gaatgtcata atgcaggcgg taatcaggaa tgggcactga ccaaagaaaa aagcgtgaaa 1320

cacatggatc tgtgtctgac cgttgttgat cgtgcaccgg gcagcctgat taagctgcag 1380

ggttgccgcg aaaatgatag ccgccagaaa tgggaacaga ttgaaggtaa tagtaaactg 1440

cgccatgttg gcagtaatct gtgtctggat agccgcaccg caaaaagtgg cggcctgagt 1500

gttgaagtgt gtggcccggc cctgagtcag cagtggaaat tcactctgaa tctgcagcag 1560

tag 1563

<210> 2

<211> 520

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Lys Lys Lys Asp Leu His His Ser Asn Gly Glu Glu Lys Ala Gln Ser

1 5 10 15

Met Glu Thr Leu Pro Pro Gly Lys Val Arg Trp Pro Asp Phe Asn Gln

20 25 30

Glu Ala Tyr Val Gly Gly Thr Met Val Arg Ser Gly Gln Asp Pro Tyr

35 40 45

Ala Arg Asn Lys Phe Asn Gln Val Glu Ser Asp Lys Leu Arg Met Asp

50 55 60

Arg Ala Ile Pro Asp Thr Arg His Asp Gln Cys Gln Arg Lys Gln Trp

65 70 75 80

Arg Val Asp Leu Pro Ala Thr Ser Val Val Ile Thr Phe His Asn Glu

85 90 95

Ala Arg Ser Ala Leu Leu Arg Thr Val Val Ser Val Leu Lys Lys Ser

100 105 110

Pro Pro His Leu Ile Lys Glu Ile Ile Leu Val Asp Asp Tyr Ser Asn

115 120 125

Asp Pro Glu Asp Gly Ala Leu Leu Gly Lys Ile Glu Lys Val Arg Val

130 135 140

Leu Arg Asn Asp Arg Arg Glu Gly Leu Met Arg Ser Arg Val Arg Gly

145 150 155 160

Ala Asp Ala Ala Gln Ala Lys Val Leu Thr Phe Leu Asp Ser His Cys

165 170 175

Glu Cys Asn Glu His Trp Leu Glu Pro Leu Leu Glu Arg Val Ala Glu

180 185 190

Asp Arg Thr Arg Val Val Ser Pro Ile Ile Asp Val Ile Asn Met Asp

195 200 205

Asn Phe Gln Tyr Val Gly Ala Ser Ala Asp Leu Lys Gly Gly Phe Asp

210 215 220

Trp Asn Leu Val Phe Lys Trp Asp Tyr Met Thr Pro Glu Gln Arg Arg

225 230 235 240

Ser Arg Gln Gly Asn Pro Val Ala Pro Ile Lys Thr Pro Met Ile Ala

245 250 255

Gly Gly Leu Phe Val Met Asp Lys Phe Tyr Phe Glu Glu Leu Gly Lys

260 265 270

Tyr Asp Met Met Met Asp Val Trp Gly Gly Glu Asn Leu Glu Ile Ser

275 280 285

Phe Arg Val Trp Gln Cys Gly Gly Ser Leu Glu Ile Ile Pro Cys Ser

290 295 300

Arg Val Gly His Val Phe Arg Lys Gln His Pro Tyr Thr Phe Pro Gly

305 310 315 320

Gly Ser Gly Thr Val Phe Ala Arg Asn Thr Arg Arg Ala Ala Glu Val

325 330 335

Trp Met Asp Glu Tyr Lys Asn Phe Tyr Tyr Ala Ala Val Pro Ser Ala

340 345 350

Arg Asn Val Pro Tyr Gly Asn Ile Gln Ser Arg Leu Glu Leu Arg Lys

355 360 365

Lys Leu Ser Cys Lys Pro Phe Lys Trp Tyr Leu Glu Asn Val Tyr Pro

370 375 380

Glu Leu Arg Val Pro Asp His Gln Asp Ile Ala Phe Gly Ala Leu Gln

385 390 395 400

Gln Gly Thr Asn Cys Leu Asp Thr Leu Gly His Phe Ala Asp Gly Val

405 410 415

Val Gly Val Tyr Glu Cys His Asn Ala Gly Gly Asn Gln Glu Trp Ala

420 425 430

Leu Thr Lys Glu Lys Ser Val Lys His Met Asp Leu Cys Leu Thr Val

435 440 445

Val Asp Arg Ala Pro Gly Ser Leu Ile Lys Leu Gln Gly Cys Arg Glu

450 455 460

Asn Asp Ser Arg Gln Lys Trp Glu Gln Ile Glu Gly Asn Ser Lys Leu

465 470 475 480

Arg His Val Gly Ser Asn Leu Cys Leu Asp Ser Arg Thr Ala Lys Ser

485 490 495

Gly Gly Leu Ser Val Glu Val Cys Gly Pro Ala Leu Ser Gln Gln Trp

500 505 510

Lys Phe Thr Leu Asn Leu Gln Gln

515 520

<210> 3

<211> 1479

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggatgcac cggaagaaga agatcatgtg ctggtgctgc gtaaaagcaa ttttgcagaa 60

gcactggcag cacataaata tctgctggtt gaattttatg caccgtggtg cggtcattgt 120

aaagcactgg caccggaata tgcaaaagca gcaggtaaac tgaaagcaga aggtagcgaa 180

attcgcctgg ccaaagtgga tgccaccgaa gaaagcgatc tggcacagca gtatggcgtg 240

cgtggctatc cgaccattaa gtttttccgt aatggtgaca ccgcaagccc gaaagaatat 300

accgccggtc gtgaagcaga tgatattgtt aattggctga aaaaacgtac cggtccggcc 360

gccaccaccc tgcctgatgg tgcagcagca gaaagcctgg tggaaagtag tgaagttgca 420

gtgattggct ttttcaaaga tgttgaaagt gatagcgcaa aacagtttct gcaggcagcc 480

gaagccattg atgatattcc gtttggcatt accagtaata gcgatgtgtt tagcaaatat 540

cagctggata aagatggtgt ggtgctgttt aaaaaatttg atgaaggccg taataacttc 600

gaaggtgaag ttaccaaaga aaatctgctg gattttatta agcacaatca gctgccgctg 660

gttattgagt ttactgaaca gaccgcaccg aaaatttttg gtggcgaaat taagacccat 720

attctgctgt ttctgccgaa aagcgttagc gattatgatg gtaaactgag caattttaag 780

accgcagcag aatcattcaa aggtaaaatt ctgtttatct tcatcgacag tgatcatacc 840

gataatcagc gtattctgga atttttcggc ctgaaaaaag aagaatgccc ggccgttcgc 900

ctgattaccc tggaagaaga aatgaccaaa tataaaccgg aaagtgaaga actgaccgca 960

gaacgcatta ccgaattttg ccatcgtttt ctggaaggta aaattaagcc gcatctgatg 1020

agccaggaac tgccggaaga ttgggataaa cagccggtga aagttctggt gggtaaaaat 1080

tttgaagatg tggcctttga tgaaaagaaa aatgtttttg tggagttcta cgcaccgtgg 1140

tgtggtcatt gcaaacagct ggccccgatt tgggataaac tgggtgaaac ctataaagat 1200

catgaaaata tcgtgatcgc aaaaatggat agtaccgcaa atgaagttga agccgttaaa 1260

gttcatagtt ttccgaccct gaaatttttc ccggccagcg ccgatcgtac cgtgattgat 1320

tataatggtg aacgcaccct ggatggcttt aaaaaattcc tggaaagtgg tggtcaggat 1380

ggtgcaggcg atgatgatga tctggaagat ctggaagaag ccgaagaacc ggatatggaa 1440

gaagatgatg atcagaaagc cgttaaagat gaactgtaa 1479

<210> 4

<211> 492

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Asp Ala Pro Glu Glu Glu Asp His Val Leu Val Leu Arg Lys Ser

1 5 10 15

Asn Phe Ala Glu Ala Leu Ala Ala His Lys Tyr Leu Leu Val Glu Phe

20 25 30

Tyr Ala Pro Trp Cys Gly His Cys Lys Ala Leu Ala Pro Glu Tyr Ala

35 40 45

Lys Ala Ala Gly Lys Leu Lys Ala Glu Gly Ser Glu Ile Arg Leu Ala

50 55 60

Lys Val Asp Ala Thr Glu Glu Ser Asp Leu Ala Gln Gln Tyr Gly Val

65 70 75 80

Arg Gly Tyr Pro Thr Ile Lys Phe Phe Arg Asn Gly Asp Thr Ala Ser

85 90 95

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100 105 110

Leu Lys Lys Arg Thr Gly Pro Ala Ala Thr Thr Leu Pro Asp Gly Ala

115 120 125

Ala Ala Glu Ser Leu Val Glu Ser Ser Glu Val Ala Val Ile Gly Phe

130 135 140

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145 150 155 160

Glu Ala Ile Asp Asp Ile Pro Phe Gly Ile Thr Ser Asn Ser Asp Val

165 170 175

Phe Ser Lys Tyr Gln Leu Asp Lys Asp Gly Val Val Leu Phe Lys Lys

180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

Thr Glu Gln Thr Ala Pro Lys Ile Phe Gly Gly Glu Ile Lys Thr His

225 230 235 240

Ile Leu Leu Phe Leu Pro Lys Ser Val Ser Asp Tyr Asp Gly Lys Leu

245 250 255

Ser Asn Phe Lys Thr Ala Ala Glu Ser Phe Lys Gly Lys Ile Leu Phe

260 265 270

Ile Phe Ile Asp Ser Asp His Thr Asp Asn Gln Arg Ile Leu Glu Phe

275 280 285

Phe Gly Leu Lys Lys Glu Glu Cys Pro Ala Val Arg Leu Ile Thr Leu

290 295 300

Glu Glu Glu Met Thr Lys Tyr Lys Pro Glu Ser Glu Glu Leu Thr Ala

305 310 315 320

Glu Arg Ile Thr Glu Phe Cys His Arg Phe Leu Glu Gly Lys Ile Lys

325 330 335

Pro His Leu Met Ser Gln Glu Leu Pro Glu Asp Trp Asp Lys Gln Pro

340 345 350

Val Lys Val Leu Val Gly Lys Asn Phe Glu Asp Val Ala Phe Asp Glu

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Lys Lys Asn Val Phe Val Glu Phe Tyr Ala Pro Trp Cys Gly His Cys

370 375 380

Lys Gln Leu Ala Pro Ile Trp Asp Lys Leu Gly Glu Thr Tyr Lys Asp

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His Glu Asn Ile Val Ile Ala Lys Met Asp Ser Thr Ala Asn Glu Val

405 410 415

Glu Ala Val Lys Val His Ser Phe Pro Thr Leu Lys Phe Phe Pro Ala

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Ser Ala Asp Arg Thr Val Ile Asp Tyr Asn Gly Glu Arg Thr Leu Asp

435 440 445

Gly Phe Lys Lys Phe Leu Glu Ser Gly Gly Gln Asp Gly Ala Gly Asp

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Asp Asp Asp Leu Glu Asp Leu Glu Glu Ala Glu Glu Pro Asp Met Glu

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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atgttttgta cattttttga aaaacatcac cggaagtggg acatactgtt agaaaaaagc 60

acgggtgtga tggaagctat gaaagtgacg agtgaggaaa aggaacagct gagcacagca 120

atcgaccgaa tgaatgaagg actggacgcg tttatccagc tgtataatga atcggaaatt 180

gatgaaccgc ttattcagct tgatgatgat acagccgagt taatgaagca ggcccgagat 240

atgtacggcc aggaaaagct aaatgagaaa ttaaatacaa ttattaaaca gattttatcc 300

atctcagtat ctgaagaagg agaaaaagaa gacgacgacg acaag 345

<210> 6

<211> 115

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Met Phe Cys Thr Phe Phe Glu Lys His His Arg Lys Trp Asp Ile Leu

1 5 10 15

Leu Glu Lys Ser Thr Gly Val Met Glu Ala Met Lys Val Thr Ser Glu

20 25 30

Glu Lys Glu Gln Leu Ser Thr Ala Ile Asp Arg Met Asn Glu Gly Leu

35 40 45

Asp Ala Phe Ile Gln Leu Tyr Asn Glu Ser Glu Ile Asp Glu Pro Leu

50 55 60

Ile Gln Leu Asp Asp Asp Thr Ala Glu Leu Met Lys Gln Ala Arg Asp

65 70 75 80

Met Tyr Gly Gln Glu Lys Leu Asn Glu Lys Leu Asn Thr Ile Ile Lys

85 90 95

Gln Ile Leu Ser Ile Ser Val Ser Glu Glu Gly Glu Lys Glu Asp Asp

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Asp Asp Lys

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<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggctggtcga cctactgctg 20

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aaagatatcg atggatgcac c 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cggggtacct tacagttcat c 21

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cgcggatcca tgttttgtac 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ggctggtcga cctgctgttc 20

<210> 15

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Pro Thr Thr Asp Ser Thr Thr Pro Ala Pro Thr Thr Lys

1 5 10

<210> 16

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Ser Ala Pro Thr Thr Ser Thr Thr Ser Ala Pro Thr Lys

1 5 10

<210> 17

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Ala Met Ser Gln Ser Leu Leu Lys Thr Thr Gln Glu Pro Leu Ala Lys

1 5 10 15

<210> 18

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

Arg Val Pro Thr Thr Ala Ala Ser Thr Pro Asp Ala Val Asp Lys

1 5 10 15

<210> 19

<211> 393

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

Met Glu Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln

1 5 10 15

Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu

20 25 30

Ser Pro Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp

35 40 45

Asp Ile Glu Gln Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro

50 55 60

Arg Met Pro Glu Ala Ala Pro Pro Val Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro

65 70 75 80

Thr Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser

85 90 95

Val Pro Ser Gln Lys Thr Tyr Gln Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly

100 105 110

Phe Leu His Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro

115 120 125

Ala Leu Asn Lys Met Phe Cys Gln Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gln

130 135 140

Leu Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met

145 150 155 160

Ala Ile Tyr Lys Gln Ser Gln His Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys

165 170 175

Pro His His Glu Arg Cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gln

180 185 190

His Leu Ile Arg Val Glu Gly Asn Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp

195 200 205

Arg Asn Thr Phe Arg His Ser Val Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu

210 215 220

Val Gly Ser Asp Cys Thr Thr Ile His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser

225 230 235 240

Ser Cys Met Gly Gly Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile Thr

245 250 255

Leu Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val

260 265 270

Arg Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn

275 280 285

Leu Arg Lys Lys Gly Glu Pro His His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr

290 295 300

Lys Arg Ala Leu Pro Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gln Pro Lys Lys

305 310 315 320

Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly Arg Glu

325 330 335

Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp

340 345 350

Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala His Ser Ser His

355 360 365

Leu Lys Ser Lys Lys Gly Gln Ser Thr Ser Arg His Lys Lys Leu Met

370 375 380

Phe Lys Thr Glu Gly Pro Asp Ser Asp

385 390

Claims

1.一种用于表达N-乙酰氨基半乳糖转移酶的原核表达载体，所述表达载体中包括ppGalNAc-T蛋白表达框和PDI蛋白表达框，所述ppGalNAc-T蛋白是人源的，所述ppGalNAc-T蛋白的核酸编码序列如SEQ ID NO:1所示，所述PDI蛋白是人源的，所述PDI蛋白的核酸编码序列如SEQ ID NO:3所示。

2.如权利要求1所述的原核表达载体，其特征在于，所述表达载体中，还包括Mistic蛋白表达框，所述Mistic来源于枯草芽孢杆菌，所述Mistic蛋白的氨基酸序列包括如SEQ IDNO:6所示序列。

3.如权利要求2所述的原核表达载体，其特征在于，所述ppGalNAc-T蛋白表达框和PDI蛋白表达框和Mistic蛋白表达框包括相同的启动子。

4.如权利要求1所述的原核表达载体，其特征在于，所述表达载体由pRSFDuet-1载体构建获得。

5.一种用于表达N-乙酰氨基半乳糖转移酶的原核表达系统，所述表达系统中包括如权利要求1~4任一项所述的原核表达载体。

6.如权利要求5所述的原核表达系统，其特征在于，原核表达系统的宿主细胞选自具有胞内氧化环境的菌株。

7.如权利要求6所述的原核表达系统，其特征在于，所述原核表达系统的宿主细胞选自大肠杆菌。

8.如权利要求7所述的原核表达系统，其特征在于，所述大肠杆菌选自Rosetta-gami2。

9.一种N-乙酰氨基半乳糖转移酶的制备方法，包括如下步骤：培养如权利要求5~8任一项所述的原核表达系统，从而表达出N-乙酰氨基半乳糖转移酶，纯化分离出所述的N-乙酰氨基半乳糖转移酶。