CN108103039B

CN108103039B - 一组岩藻糖基转移酶突变体及其筛选方法和应用

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Publication number: CN108103039B
Application number: CN201611051529.1A
Authority: CN
Inventors: 杨广宇; 谭玉萌; 冯雁; 韩云宾; 刘新平
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2016-11-25
Filing date: 2016-11-25
Publication date: 2021-10-22
Anticipated expiration: 2036-11-25
Also published as: CN108103039A

Abstract

本发明涉及一组岩藻糖基转移酶突变体及其筛选方法和应用。本发明通过针对岩藻糖基转移酶的荧光底物设计，结合流式细胞荧光分选的高通量筛选方法，获得了一组催化活力明显提高的岩藻糖基转移酶突变体。本发明还涉及了岩藻糖基转移酶突变体在岩藻糖基化寡糖及其糖缀合物合成中的应用。

Description

一组岩藻糖基转移酶突变体及其筛选方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一组催化活性提高的α1,3-岩藻糖基转移酶突变体。

背景技术

岩藻糖基化是生物体内一类常见的糖基化修饰，在许多复杂的生理过程中发挥着不可替代的重要作用。许多含岩藻糖基的异常糖链结构与肿瘤的发生和发展密切相关，因此含岩藻糖基的寡糖和糖缀合物(包括糖蛋白、糖脂等)可以作为肿瘤诊断的关键分子标记，也被研究开发成抗肿瘤糖疫苗用于癌症免疫治疗。而且，在人乳中富含岩藻糖基化的寡糖，是重要的益生元，具有增强婴儿免疫力、促进大脑发育等功能,可应用于婴儿配方奶粉、食品添加剂等领域。因此，岩藻糖类寡糖和糖缀合物的合成日益受到科学家和医药公司的重视。

但目前化学法只能合成极少数寡糖，而且需要复杂的保护/脱保护步骤来控制产物的区域选择性和立体选择性，导致合成路线长、产率低、成本极高。岩藻糖基转移酶(Fucosyltranferase，FucT)催化糖苷键合成具有高度的区域选择性和立体选择性，与化学法相比具有条件温和、产率高、分离纯化容易等一系列优点，在合成岩藻糖相关的化合物中具有重要价值。应用现代生物技术，开发具有优良性质的岩藻糖基转移酶对于发展酶法合成寡糖具有重要意义，是受到世界各国学者高度关注的研究热点。

岩藻糖基转移酶广泛地分布于脊椎动物、无脊椎动物、植物和细菌中。由于来源于细菌的岩藻糖基转移酶比真核生物来源的更容易过量表达，且受体底物选择性更为宽泛，被广泛用于寡糖和糖缀合物的合成。但与其他糖基转移酶相比，这类酶的催化活性较低，因此限制了其大规模的广泛应用，如天然能够产生岩藻糖基转移酶的原始菌种(如Helicobacter pylori NCTC11639)催化活性较低，不能满足工业生产岩藻糖基化寡糖的要求。由于糖基转移酶催化反应不直接产生荧光或光吸收信号，对其进行高通量筛选一直是个难题。现行的方法均基于96孔板进行筛选，需用到大量昂贵底物，筛选成本极高，而且存在耗时、费力、筛选通量低(不超过10⁵)等弱点。

综上，亟需找到一种岩藻糖基转移酶高通量筛选的方法，并获取高催化活性的岩藻糖基转移酶，以应用于含岩藻糖基的寡糖和糖缀合物的合成中。

发明内容

本发明的目的在于提供一种岩藻糖基转移酶突变体及其筛选方法和应用。

在本发明的第一方面，提供一种岩藻糖基转移酶突变体，所述糖基转移酶突变与SEQ ID NO:2具有至少90％的氨基酸序列一致性，且包含以下至少一个或多个位置的突变，所述的突变位点包括SEQ ID NO:2的第45、127、128、131、146、199、223、340、368、383或407位中的至少一个或者其相应的位置；

优选地，所述糖基转移酶的突变与SEQ ID NO:2具有至少93％的氨基酸序列一致性；更优选地，与SEQ ID NO:2具有至少95％的氨基酸序列一致性；

所述的突变为在所述的突变位点上发生取代、插入或删除一个或多个氨基酸残基；

优选地，所述岩藻糖基转移酶的催化活性可提高至少40％。

优选地，所述的突变为取代突变，至少包含以下一个或多个氨基酸残基的取代：

第45位的丝氨酸被苯丙氨酸取代；或

第127位天冬氨酸被天冬酰胺取代；或

第128位的精氨酸被谷氨酸或酪氨酸取代；或

第131位的组氨酸被异亮氨酸或亮氨酸或甲硫氨酸取代；或

第146位的赖氨酸被天冬酰胺取代；或

第199位的酪氨酸被天冬酰胺取代；或

第223位的赖氨酸被谷氨酸取代；或

第340位的谷氨酸被天冬氨酸取代；或

第368位的缬氨酸被丙氨酸取代；或

第383位的天冬酰胺被赖氨酸取代；或

第407位的天冬氨酸被天冬酰胺取代。

更优选地，所述的突变为以上突变的组合，选自：

(1)包含第127位天冬氨酸被天冬酰胺取代和第131位组氨酸被甲硫氨酸取代；或

(2)包含第128位精氨酸被酪氨酸取代和第131位组氨酸被亮氨酸取代；或

(3)包含第340位谷氨酸被天冬氨酸取代和第368位缬氨酸被丙氨酸取代；或

(4)包含第199位的酪氨酸被天冬酰胺取代和第368位的缬氨酸被丙氨酸取代；或

(5)包含第199位的酪氨酸被天冬酰胺取代、第368位的缬氨酸被丙氨酸取代和第340位的谷氨酸被天冬氨酸取代；或

(6)包含第45位的丝氨酸被苯丙氨酸取代、第199位的酪氨酸被天冬酰胺取代和第223位的赖氨酸被谷氨酸取代；或

(7)包含第127位天冬氨酸被天冬酰胺取代、第128位的精氨酸被谷氨酸取代和第131位的组氨酸被异亮氨酸取代；或

(8)包含第45位的丝氨酸被苯丙氨酸取代、第199位的酪氨酸被天冬酰胺取代、第368位的缬氨酸被丙氨酸取代和第340位的谷氨酸被天冬氨酸取代；或

(9)包含第45位的丝氨酸被苯丙氨酸取代、第127位天冬氨酸被天冬酰胺取代、第128位的精氨酸被谷氨酸取代、第199位的酪氨酸被天冬酰胺取代、第368位的缬氨酸被丙氨酸取代和第340位的谷氨酸被天冬氨酸取代；或

(10)包含第45位的丝氨酸被苯丙氨酸取代、第127位天冬氨酸被天冬酰胺取代、第128位的精氨酸被谷氨酸取代、第199位的酪氨酸被天冬酰胺取代、第131位的组氨酸被异亮氨酸取代和第223位的赖氨酸被谷氨酸取代。

在一优选实施例中，所述的突变为以上突变间的重新组合。

在本发明的另一方面，提供一种多核苷酸，所述的多核苷酸编码所述的岩藻糖基转移酶突变体。

在一优选实施例中，可以在所述多核苷酸的末端增加上用于下一步纯化与分析的分子标签，如组氨酸标签等。

在本发明的另一方面，提供一种表达载体，所述的表达载体包括所述的多核苷酸。

在一优选实施例中，所述的表达载体选用pET21b。

在本发明的另一方面，提供一种基因工程化的细胞，所述的细胞包括所述的表达载体或其基因组中整合有所述的多核苷酸。

所述的基因工程化细胞可以为革兰氏阳性细菌，如枯草芽孢杆菌；也可以是革兰氏阴性细菌，如大肠杆菌；也可以是放线菌，如链霉菌；还可以是真菌，如酵母类、曲酶菌等其他宿主微生物；

在一优选实施例中，所述的基因工程化细胞选用大肠杆菌。

在本发明的另一方面，提供一种获取高催化活性糖基转移酶突变体的筛选方法，包括以下步骤：

(1)建立所述糖基转移酶的突变库；

(2)设计基于所述糖基转移酶底物的一种以上的荧光底物，所述荧光底物分别连接上具有不同波长的吸收光与发射光的荧光基团；

(3)提供表达糖基转移酶突变肽的宿主细胞；

(4)将(2)所述的荧光底物与(3)所述的宿主细胞进行孵育；

(5)获取包含至少两种阳性荧光信号，且荧光强度相对于野生型均提高至少70％的突变体即为阳性突变。

在一优选例中，所述糖基转移酶为岩藻糖基转移酶，所述荧光底物选自其天然受体底物二糖半乳糖-β-1,4-N-乙酰葡萄糖酰胺连接上荧光基团，所述的荧光基团选自氧杂茶邻酮和氟硼二吡咯。

在一优选例中，受体底物可以选自其他岩藻糖基转移酶可以作用的底物，包括但不限于：半乳糖-β-1,4-葡萄糖，岩藻糖-α-1,2-半乳糖-β-1,4-N-乙酰葡萄糖酰胺，半乳糖-β-1,4-N-乙酰葡萄糖酰胺，唾液酸-α-2,3-半乳糖-β-1,4-N-乙酰葡萄糖酰胺，唾液酸-α-2,6-半乳糖-β-1,4-N-乙酰葡萄糖酰胺，半乳糖-β-1,3-N-乙酰葡萄糖酰胺，半乳糖-β-1,6-N-乙酰葡萄糖酰胺；

在一优选例中，荧光基团可以选自可与上述底物发生共价连接的荧光物质，包括但不限于6-羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、六氯-6-甲基荧光素、2,7-二甲基-4,5-二氯-6-羧基荧光素、6-羧基四甲基若丹明。

在本发明的另一方面，提供一种提高岩藻糖基转移酶催化活性的方法，在生物酶法催化体系中，使用所述岩藻糖基转移酶的突变酶。

在一优选实施例中，所述的生物酶法催化体系为体外酶法；

在一优选实施中，所述的生物酶法催化体系为全细胞催化；

所述的生物酶法催化体系还包括固定化酶催化、纯化后的酶催化以及含有人工代谢途径的细胞工厂等。

在本发明的另一方面，提供一种糖基转移酶在获得岩藻糖基化寡糖及其糖缀合物的应用，所述的糖基转移酶为岩藻糖基转移酶突变体。

在一优选实施例中，糖缀合物为糖蛋白；

在一优选实施例中，糖缀合物为糖脂；

在一优选实施例中，岩藻糖基化寡糖为具有半乳糖或半乳糖胺模块的受体特征，包括但不限于半乳糖-β-1,4-葡萄糖-α-1,3-岩藻糖，半乳糖-β-1,4-N-乙酰葡萄糖酰胺-α-1,3-岩藻糖，岩藻糖-α-1,2-半乳糖-β-1,4-N-乙酰葡萄糖酰胺-α-1,3-岩藻糖，唾液酸-α-2,3-半乳糖-β-1,4-N-乙酰葡萄糖酰胺-α-1,3-岩藻糖，唾液酸-α-2,6-半乳糖-β-1,4-N-乙酰葡萄糖酰胺-α-1,3-岩藻糖。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1.用于突变库筛选的荧光底物设计图

图2.荧光底物的合成路线

图3.基于FACS的岩藻糖基转移酶的高通量筛选方法

图4.代表性的岩藻糖基化寡糖及其糖缀合物

具体实施方式

本发明人经过研究筛选，提供了一组新型的岩藻糖基转移酶，其具备显著提高的催化活性。本发明的岩藻糖基转移酶特别适用于岩藻糖基化寡糖及其糖缀合物的合成。本发明还提供了用于高通量筛选糖基转移酶突变体的方法。

本发明的岩藻糖基转移酶突变酶可以是重组多肽、合成多肽。其可以是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。本发明的突变酶的序列与SEQ ID NO:2具有至少90％至100％范围内的任意氨基酸序列一致性，且包含以下至少一个或多个位置的突变，所述的突变位点包括SEQ IDNO:2的第45、127、128、131、146、199、223、340、368、383或407位中的至少一个或者与其相对应的位置。

本发明还包括突变酶的衍生物和类似物。如本文所用，术语“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的突变酶相同的生物学功能或活性的蛋白。本发明的蛋白片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的蛋白，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，岩藻糖基转移酶突变酶还包括具有与上述突变酶相同功能的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(如1-3个、1-2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(例如为300个以内，较佳地200个以内，更佳地100个以内，更佳地50个以内，例如40、30、20、10、5、3、2、1)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括突变酶的活性片段和活性衍生物。

本发明中，也包括为了增加突变酶的稳定性、半衰期、促进功效而对一个或几个氨基酸加以修饰后构成的修饰形式的多肽(通常不改变一级结构)，包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了抗水解性能或优化了溶解性能的突变酶。

本发明还提供了编码本发明岩藻糖基转移酶的多核苷酸序列。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是编码链或非编码链。也即，“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或岩藻糖基转移酶的编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

术语“表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

包含上述的适当多核苷酸序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达多肽。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。

生物酶法催化体系为一类利用生物酶为催化剂，实现氧化、合成、水解等功能，制备或生产相应大分子或小分子化合物的过程，现有主要的生物酶法反应系统包括，体外酶法、全细胞催化、固定化酶催化、纯化后的酶催化以及含有人工代谢途径的细胞工厂等。

体外酶法催化是指酶在体外作为催化剂进行工业生产。

全细胞催化是指利用完整的生物有机体(即全细胞、组织甚至个体)作为催化剂进行生物转化，其本质是利用细胞内的酶进行催化。

固定化酶，是指在一定的空间范围内起催化作用，并能反复和连续使用的酶。通常酶催化反应都是在水溶液中进行的，而固定化酶是将水溶性酶用物理或化学方法处理，使之成为不溶于水的，但仍具有酶活性的状态。固定化酶催化是指用固定化酶作为催化剂在体外进行的催化反应。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本发明所述的生物材料的来源的一般性说明：

1、引物合成：本发明中所使用的引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成制备。部分引物采用简并碱基，相关的简并碱基包括：

n为a，c，g或t；k为g或t；m为a或c。

2、实验中所使用T4DNA连接酶等购自于NewEngland Biolabs公司；PrimeSTAR HS高保真酶购自TakaRa公司；Phanta Max高保真酶购自Vazyme公司；限制性内切酶均购自于Fermentas公司；使用的DNA胶回收试剂盒及质粒小提试剂盒均购自于Axygen公司。

3、本发明所改造的岩藻糖基转移酶来源于Helicobacter pylori NCTC11639α1,3-岩藻糖基转移酶(Fucosyltranferase A,FutA)。

实施例1、FutA超高通量筛选方法的建立

为构建针对FutA的超高通量筛选方法，我们基于FACS的岩藻糖基转移酶的高通量筛选策略，进行了筛选宿主菌株构建、荧光底物设计合成以及对筛选条件进行一系列优化，模式筛选。具体操作如下：

1、构建筛选专用的大肠杆菌菌株

我们选用大肠杆菌细胞JM107NanA-作为筛选的专用细胞，该细胞本身缺失β半乳糖苷酶(LacZ)活性，从而防止产物的分解，同时具有半乳糖透酶(LacY)和岩藻糖转运蛋白(FucP)活性，满足了筛选系统的需要。此外，大肠杆菌体内GDP-岩藻糖是在GDP-fucose合成酶(FKP)的作用下合成的，因此我们将携带有fkp的重组质粒fkp-packc18电击法转化JM107NanA-，以满足该系统内源GDP-岩藻糖的合成。

2、合成针对岩藻糖基转移酶的FACS筛选荧光底物

由于FutA的天然受体底物为LacNAc二糖(半乳糖-β-1,4-N-乙酰葡萄糖酰胺)，我们选择了氧杂茶邻酮(Coumarin)和氟硼二吡咯(Bodipy)两种荧光基团(图1)，设计了其结构类似物LacNAc-Coumarin及LacNAc-Bodipy作为荧光底物，以实现对FutA进行活性筛选，底物结构与合成路线如图2。

3、高通量筛选体系的建立与优化

根据图3建立的FACS筛选策略，将FutA两种荧光受体底物与FutA供体底物前体岩藻糖同时饲喂携带FutA表达质粒的JM107NanA-筛选菌株，经过孵育及洗涤后，观察细胞内荧光信号的积累。对反应时间、反应温度、底物浓度、样品洗涤条件对荧光信号的影响进行考察，并优化FACS条件及阳性基因回收条件等关键因素，建立并优化FutA的超高通量筛选系统。

4、模式筛选

为了进一步验证该方法的可行性，即该方法能否将有活性的细胞从无活性的细胞中挑选出来，我们按照图3.的方法对野生型FutA进行了模式筛选。在该方法中，我们将阳性细胞与阴性细胞分别以1:10，1:100，1:1000，1:10000的比例混合后，与荧光底物反应30分钟，洗涤后，在流式细胞上进行分选，该方法都可以将阳性细胞从阴性细胞里分出来，通过一轮筛选即可使有活力的菌株被富集10000倍。具体结果如表1：

表1、FACS对含不同阳性比例样品中含FutA基因细胞的富集效率

实施例2 FutA突变库的构建

1、FutA随机突变库的构建

采用易错PCR技术，以带有野生型futA基因(SEQ ID NO：1，编码如SEQ ID NO：2蛋白)的pUC18质粒作为模板，采用低保真度DNA聚合酶进行目的基因扩增，通过提高镁离子浓度、加入锰离子、改变体系中四种的dNTPs浓度来改变扩增过程中的突变频率，从而以一定的频率向目的基因中随机引入突变。

引物序列如下：

上游引物：

5’CCGGAATTCGCATATGTTTCAGCCGCTGC 3’(SEQ ID NO:3)

下游引物：

5’AATCCCAAGCTTTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGC 3’(SEQ ID NO:4)

体系如下：

PCR反应条件为：首先95℃预变性3分钟；每个循环包括95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸90秒，共30个循环；最后72℃延伸10分钟。反应结束后用1％琼脂糖凝胶电泳检测易错PCR产物。

反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，得到1.2kb大小的条带，与预期结果相符。DpnI消化模板，回收，纯化该目的片段，将其用限制性内切酶EcoR I和Hind III进行双酶切后与经同样酶双酶切的质粒pUC18进行连接，纯化后的连接产物电击法转化大肠杆菌JM107(FKP)电转化感受态细胞中，将转化细胞涂布于含有100ug/ml的氨苄青霉素和氯霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜，第二天计数菌落数以计算得到库容量。随机从平板上挑取10个转化子，送测序，计算突变率。以此获得4个不同突变率的突变库，分别为1.3个碱基突变/基因，2.0个碱基突变/基因，3.1个碱基突变/基因，4.2个碱基突变/基因的突变库。将4个突变库以1:1:1:1的比例混合，得到总库容量为4×10⁶，平均突变率为2.5个碱基突变/基因的突变库。

2、FutA半理性突变库的构建。

以重组质粒FutA-pUC18为模板，以带有突变位点的一对互补的寡核苷酸为引物，用Phanta Max高保真酶(Vazyme公司)进行全质粒PCR扩增，获得具有特定突变位点的重组质粒。引物序列如下：

引物序列如下：

CAST 1(V30/W33):

5’CCGCTGAAAATTGCANNKGCAAATNNKTGGGGTGATGAA 3’(SEQ ID NO:5)

5’TTCATCACCCCAMNNATTTGCMNNTGCAATTTTCAGCGG 3’(SEQ ID NO:6)

CAST 2(E37/E38/E41):

5’TGGTGGGGTGATNNKNNKATCAAANNKTTTAAAAACAGC 3’(SEQ ID NO:7)

5’CTGTTTTTAAAMNNTTTGATMNNMNNATCACCCCACCA 3’(SEQ ID NO:8)

CAST 3(N44/S45/V46):

5’ATCAAAGAGTTTAAANNKNNKNNKCTGTACTTTATTCTG 3’(SEQ ID NO:9)

5’CAGAATAAAGTACAGMNNMNNMNNTTTAAACTCTTTGAT 3’(SEQ ID NO:10)

CAST 4(G72/P74/L75):

5’AGCGATCTGGTTTTTNNKAATNNKNNKGGTAGCGCACGT 3’(SEQ ID NO:11)

5’ACGTGCGCTACCMNNMNNATTMNNAAAAACCAGATCGCT 3’(SEQ ID NO:12)

CAST 5(D127/R128/H131):

5’CCGCTGTATTATNNKNNKCTGCATNNKAAAGCAGAAAGC 3’(SEQ ID NO:13)

5’GCTTTCTGCTTTMNNATGCAGMNNMNNATAATACAGCGG 3’(SEQ ID NO:14)

CAST 6(K223/N226):

5’CTGGGTTATAATGTGNNKAACAAANNKGAGTTCCTGAGC 3’(SEQ ID NO:15)

5’GCTCAGGAACTCMNNTTTGTTMNNCACATTATAACCCAG 3’(SEQ ID NO:16)

CAST 7(K40):

5’TGGGGTGATGAAGAAATCNNKGAGTTTAAAAACAGCGTC 3’(SEQ ID NO:17)

5’GACGCTGTTTTTAAACTCMNNGATTTCTTCATCACCCCA 3’(SEQ ID NO:18)

CAST 8(Y92):

5’AATGCAAAACGCGTGTTTNNKACCGGTGAAAATGAAAGC 3’(SEQ ID NO:19)

5’GCTTTCATTTTCACCGGTMNNAAACACGCGTTTTGCATT 3’(SEQ ID NO:20)

扩增体系为：Phanta Max Buffer(2×)25μL、dNTP(10mM)1μL、重组质粒模板20ng、引物(20μM)各1μL、Phanta Max高保真酶1μL、补充双蒸水至50μL。扩增条件为95℃预变性3分钟；95℃变性15秒、55℃退火15秒及72℃延伸5分钟(30个循环)。胶回收PCR产物，用DpnI酶(Fermentas公司)在37℃条件下消化2小时，降解初始模板。胶回收后电转化至JM107(FKP)，涂布到含有100μg/mL氨苄青霉素和氯霉素的LB平板上，37℃过夜培养，第二天计数菌落数以计算得到库容量。随机从平板上挑取5个转化子，测序，计算突变率。

实施例3 突变库的高通量筛选

1、突变库的FACS筛选

将突变库的质粒电转化JM107(FKP)，800ul 2YT 37℃复苏45分钟后，取10ul涂布平板，第二天计数菌落数以计算库容量，剩余加到装液量为4ml的含有100μg/mL氨苄青霉素和氯霉素的LB试管中。37℃过夜培养。第二天按2％的接种量转接到含有100ug/ml L氨苄青霉素和氯霉素的M9培养基，培养6小时后，加入0.8mM的IPTG诱导16小时。离心收集菌体后，与0.1mM的荧光底物LacNAc-Coumarin和LacNAc-Bodipy及5mM的岩藻糖反应半小时后，清洗，去除未结合的荧光底物，具体的清洗流程如下：

加入1ml LB培养基，5000rpm离心3分钟收集菌体，去上清；再次加入1mL LB培养基，重悬细胞，在37℃摇床中清洗10分钟；5000rpm离心3分钟收集菌体，去上清，加入1ml 4℃预冷的PBS缓冲液重悬细胞，5000rpm离心3分钟收集菌体(本步骤重复1次)；最后菌体用50μl PBS重悬置于冰上。

通过阴性与阳性细胞分析，确定阳性门，在流式细胞仪上对以上突变库进行分选，分选2轮后，经过富集的菌体对两种荧光底物的活性均明显提高，分选1000个细胞，涂布含100μg/mL氨苄青霉素和氯霉素的X-gal LB平板上，37℃过夜培养，可进入复筛流程。

2、突变库的复筛

随机挑选90个单克隆到96浅孔板，同时挑选6个野生型单克隆作对照，在每孔中加入200ul含100ug/ml氨苄青霉素和氯霉素的LB培养基。37℃400rpm培养18个小时后，转接到1ml含100ug/ml氨苄青霉素和氯霉素的LB培养基的96深孔板，放入摇床37℃，400rpm培养至菌液0D₆₀₀为0.6-0.8(约4小时)，加入0.8mM IPTG诱导表达，20℃培养18小时。将装有菌液的96孔板用高速冷冻离心机4500rpm，离心1小时，取出并弃尽上清液，反复冻融3次，使细胞充分破碎，再加入50ul 25mM Tris-Hcl(PH 7.5)，放置于震板仪上充分摇匀，用高速冷冻离心机4500rpm离心15min后，所得上清液即为粗酶液。取6ul的粗酶液与0.1mM的LacNAc-Bodipy反应50min后，进行HPLC分析，筛选并获得了一批催化活性提高的突变体。

实施例4FutA突变体的克隆，表达和纯化

由于pUC18的表达量较低，我们需要先将突变基因构建到高表达量的载体上，再进行突变蛋白的表达与纯化。我们选用高表达量的载体pET21a作为表达载体，设计了如下引物扩增阳性突变体中的FutA基因:

FutA-pET21a-F 5’GGAATTCCATATGTTTCAGCCGCTGCTGG 3’

(SEQ ID NO:21)

FutA-pET21a-R 5’CCGCTCGAGATAATTAACACGCAGG 3’

(SEQ ID NO:22)

目的基因经PCR后，使用限制性内切酶Nde I和Xho I对其进行双酶切，与经过酶切的质粒载体pET21a进行连接反应，连接产物转化E.coli BL21(DE3)，挑取单克隆进行菌落PCR验证，送阳性克隆测序以验证重组克隆构建成功。

由于pET21a表达质粒会在目的蛋白的C端带上组氨酸标签，故可用镍离子亲和柱进行纯化。粗酶液直接挂镍柱，然后用含有40mM咪唑的清洗缓冲液除杂，最后用含有200mM的洗脱缓冲液洗脱，SDS-PAGE结果显示经过亲和层析纯化后，蛋白的纯度达95％以上。

实施例5 突变体的性质表征

糖苷键的形成并不直接产生光吸收，因此我们利用酶偶联法通过间接测定反应中释放出的GDP测定了各个突变体针对天然受体底物LacNAc的催化活力。NADH生成NAD+的反应会引起340nm光吸收的变化，因而可以用来评估糖基转移酶的催化活力。酶联法涉及到磷酸激酶(PK)，乳酸脱氢酶(LDH)以及糖基转移酶(GT)共三个酶，在37℃检测OD340的降低情况，摩尔消光系数＝0.00622μM，反应体系为：

结果表明，相关突变体的催化活性较野生型都有所提高。用同样的方法测了对非天然底物乳糖(Lactose)的催化活性，这些突变体的催化活性也有所提高。

我们将活性提高的突变体进行累加组合，并逐一表达、纯化、表征。所有组合突变体与单点突变体相比均表现出催化活性提高的叠加效果。表2详细总结了FutA野生型酶、催化活性突变体酶学性质，最优突变体对天然底物半乳糖-β-1,4-N-乙酰葡萄糖酰胺(LacNAc)和非天然底物乳糖半乳糖-β-1,4-葡萄糖(乳糖，Lactose)相对活性分别提高4倍和8倍。

表2.FutA野生型及单点突变体的酶学性质表征

实施例6 利用FutA糖基转移酶突变体体外酶法和全细胞催化合成寡糖以及糖缀合物(图4)。

首先选取实施例5中相关突变体的粗酶液，具体制备方法如下：培养重组菌至OD₆₀₀为0.6-0.8时，添加0.8mM IPTG，在低温20℃诱导表达16小时。4℃，6000rpm离心收集细胞，将细胞重悬于25mM缓冲液中，1L的培养细胞最终重悬于100mL的破碎缓冲液中。超声破碎后，4℃，14000rpm离心，收集上清即获得粗酶液。

体外酶法合成：以5mM GDP-岩藻糖，15mM半乳糖-β-1,4-葡萄糖(Lactose)或5mM半乳糖-β-1,4-N-乙酰葡萄糖酰胺(LacNAc)或5mM岩藻糖-α-1,2-半乳糖-β-1,4-N-乙酰葡萄糖酰胺(H-type II)或唾液酸-α-2,3-半乳糖-β-1,4-N-乙酰葡萄糖酰胺(Sialyl-LacNAc)或唾液酸-α-2,6-半乳糖-β-1,4-N-乙酰葡萄糖酰胺(Sialyl-type II)或神经节苷脂(GM1)，25mM Tris-Hcl(pH 7.5)配制反应溶液。按10％(v/v)比例添加FutA糖基转移酶突变体粗酶液于反应液中，37℃，180rpm，反应3小时，在体外合成了包括半乳糖-β-1,4-葡萄糖-α-1,3-岩藻糖，半乳糖-β-1,4-N-乙酰葡萄糖酰胺-α-1,3-岩藻糖，岩藻糖-α-1,2-半乳糖-β-1,4-N-乙酰葡萄糖酰胺-α-1,3-岩藻糖，唾液酸-α-2,3-半乳糖-β-1,4-N-乙酰葡萄糖酰胺-α-1,3-岩藻糖，唾液酸-α-2,6-半乳糖-β-1,4-N-乙酰葡萄糖酰胺-α-1,3-岩藻糖等产物。

加热煮沸10分钟以终止反应，进行HPLC检测分析与定量。使用TOSOH公司的TSK柱(型号：TSKgel Amide-80 5um)，流动相使用75％乙腈，25％水洗脱。柱温40℃，流速：1mL/min，检测波长210nm。HPLC鉴定获知FutA糖基转移酶突变体催化合成岩藻糖基化产物的效率比野生型提高35％-50％。

全细胞催化合成：首先构建了适合人乳寡糖人工合成途径的底盘细胞大肠杆菌JM107。敲除了半乳糖苷酶基因lacZ，去除了产物消耗途径；敲除了唾液酸醛缩酶基因NanA，岩藻糖异构酶基因fucI，岩藻糖激酶基因fucK，去除了其消耗底物的旁路途径，使其能够更加高效地合成人乳寡糖；

其次构建工程菌JM107/pET21b-fkp-futa，重组菌的构建采用ClonExpress MutiSOne Step Cloning Kit(Vazyme,Nanjing,China)试剂盒的方法进行构建。引物的设计如下：

fkp-for:GGTCGCGGATCCGAATTCATGCCGGAGC(SEQ ID NO：23)

fkp-rev:GCTGAAACATTCTCCTTTTAGCTTCTC(SEQ ID NO：24)

futa-for:AAGGAGAATGTTTCAGCCGCTGCTGGAT(SEQ ID NO：25)

futa-rev:GGTGGTGGTGCTCGAGTCAGTGGTGG(SEQ ID NO：26)

以fkp-pACKC18为模板，fkp-for和fkp-rev为引物，扩增上游片段fkp，以futa-pUC18为模板，以futa-for和futa-rev为引物，扩增下游片段futa，上下游片段具有RBS同源序列，PCR结束后，取少量产物进行琼脂糖凝胶电泳以检测扩增产量和特异性，PCR clean后与用EcoR I和Xho I进行酶切的线性化克隆载体pET21b进行重组反应，重组体系如下：

置于37℃反应30min，待反应完成后，立即置于冰上5min，取10ul冷却反应液电击转化JM107感受态细胞，37℃过夜培养后，用引物fkp-for和futa-rev进行PCR鉴定，得到正确的阳性克隆，命名为重组菌1。以重组质粒pET21b-fkp-futa为模板，以带有突变位点的一对互补的寡核苷酸为引物，用Prime STAR HS高保真酶(TakaRa公司)进行全质粒PCR扩增，获得具有特定突变位点的重组质粒。

扩增体系为：Prime STAR Buffer(5×)10μL、dNTP(2.5mM)4μL、重组质粒模板20ng、引物(10μM)各2μL、PrimeSTAR HS高保真酶0.5μL、补充双蒸水至50μL。扩增条件为98℃预变性1分钟；98℃变性10秒、68℃退火及延伸8分钟(30个循环)。胶回收PCR产物，用DpnI酶(Fermentas公司)在37℃条件下消化胶回收产物2h，降解初始模板。消化产物转化至JM107，涂布到含有100μg/mL氨苄青霉素LB琼脂平板上，37℃过夜培养，筛选阳性克隆，测序验证。得到正确的克隆，命名为重组菌2。

重组菌于50ml含有100μg/mL LB液体培养基中，制备种子培养基，37℃，220rpm条件下培养16小时。按5％的接种量接种于含有150ml大肠杆菌发酵培养基中，氨苄青霉素的终浓度为100μg/mL，34℃培养至OD600＝0.8-1.0，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，25℃诱导培养30h。

取诱导培养后的发酵液和菌体细胞，超声破碎(功率500W，振幅35％，每个循环超声4s，冷却5s，10min)，4℃，12 000r/min下离心10min，收集上清进行HPLC分析。并对发酵液进行LC-MS分析，仪器为HPLC 1290-MS 6230(Agilent)。使用TOSOH公司的TSK柱(型号：TSKgel Amide-80 5um)，流动相使用梯度洗脱：0-20min，45-100％乙腈；20-25min，100％乙腈；25-28min，45％乙腈。柱温40℃，流速：0.4mL/min。化合物使用负离子模式离子化，离子化方式为电喷雾(ESI)。根据分子量判断，重组菌1、2发酵液提取物中均含有目标产物：半乳糖-β-1,4-葡萄糖-α-1,3-岩藻糖，半乳糖-β-1,4-N-乙酰葡萄糖酰胺-α-1,3-岩藻糖，岩藻糖-α-1,2-半乳糖-β-1,4-N-乙酰葡萄糖酰胺-α-1,3-岩藻糖，唾液酸-α-2,3-半乳糖-β-1,4-N-乙酰葡萄糖酰胺-α-1,3-岩藻糖，唾液酸-α-2,6-半乳糖-β-1,4-N-乙酰葡萄糖酰胺-α-1,3-岩藻糖。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 一种岩藻糖基转移酶突变体及其筛选方法和应用

<130> <待立案后补入>

<160> 26

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1236

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> futA编码序列

<400> 1

atgtttcagc cgctgctgga tgcctatgtt gaaagcgcaa gcattgaaaa aatggcaagc 60

aaaagtccgc ctccgctgaa aattgcagtt gcaaattggt ggggtgatga agaaatcaaa 120

gagtttaaaa acagcgtcct gtactttatt ctgagccagc gttataccat taccctgcat 180

cagaatccga atgagtttag cgatctggtt tttggtaatc cgctgggtag cgcacgtaaa 240

attctgagct atcagaatgc aaaacgcgtg ttttataccg gtgaaaatga aagcccgaac 300

ttcaacctgt ttgattatgc cattggtttc gatgagctgg attttaatga tcgttatctg 360

cgtatgccgc tgtattatga tcgtctgcat cataaagcag aaagcgttaa tgataccacc 420

gcaccgtata aactgaaaga taatagcctg tacgcactga aaaaaccgag ccattgcttt 480

aaagaaaaac atccgaatct gtgtgccgtg gttaatgatg aaagcgatcc tctgaaacgt 540

ggttttgcca gctttgttgc aagcaatccg aacgcaccga ttcgtaatgc attctatgat 600

gcactgaata gcattgaacc ggttaccggt ggtggtagcg ttcgtaatac cctgggttat 660

aatgtgaaaa acaaaaacga gttcctgagc cagtacaaat ttaacctgtg ctttgaaaac 720

acccagggtt atggttatgt gaccgaaaaa atcatcgatg cctatttcag ccataccatt 780

ccgatttatt ggggtagccc gagcgttgca aaagatttca atccgaaaag ttttgtgaac 840

gtgcacgact ttaaaaactt tgatgaggcc atcgattata tcaaatatct gcacacccac 900

aaaaacgcct atctggatat gctgtatgaa aatccgctga atacactgga tggtaaagcc 960

tatttttacc agaacctgag cttcaaaaaa atcctggcct ttttcaaaac catcctggaa 1020

aacgatacca tctatcacga taacccgttt atcttttgcc gtgatctgaa tgaaccgctg 1080

gttaccattg atgatctgcg tgttaattat gatgacctgc gcgtgaacta cgacgatctg 1140

cgcatcaatt atgatgatct gcgggtaaac tatgatgatc tgcgtatcaa ctacgacgac 1200

ctgcgtgtga actatgacga cctgcgtgtt aattat 1236

<210> 2

<211> 412

<212> PRT

<213> Helicobacter pylori

<400> 2

Met Phe Gln Pro Leu Leu Asp Ala Tyr Val Glu Ser Ala Ser Ile Glu

1 5 10 15

Lys Met Ala Ser Lys Ser Pro Pro Pro Leu Lys Ile Ala Val Ala Asn

20 25 30

Trp Trp Gly Asp Glu Glu Ile Lys Glu Phe Lys Asn Ser Val Leu Tyr

35 40 45

Phe Ile Leu Ser Gln Arg Tyr Thr Ile Thr Leu His Gln Asn Pro Asn

50 55 60

Glu Phe Ser Asp Leu Val Phe Gly Asn Pro Leu Gly Ser Ala Arg Lys

65 70 75 80

Ile Leu Ser Tyr Gln Asn Ala Lys Arg Val Phe Tyr Thr Gly Glu Asn

85 90 95

Glu Ser Pro Asn Phe Asn Leu Phe Asp Tyr Ala Ile Gly Phe Asp Glu

100 105 110

Leu Asp Phe Asn Asp Arg Tyr Leu Arg Met Pro Leu Tyr Tyr Asp Arg

115 120 125

Leu His His Lys Ala Glu Ser Val Asn Asp Thr Thr Ala Pro Tyr Lys

130 135 140

Leu Lys Asp Asn Ser Leu Tyr Ala Leu Lys Lys Pro Ser His Cys Phe

145 150 155 160

Lys Glu Lys His Pro Asn Leu Cys Ala Val Val Asn Asp Glu Ser Asp

165 170 175

Pro Leu Lys Arg Gly Phe Ala Ser Phe Val Ala Ser Asn Pro Asn Ala

180 185 190

Pro Ile Arg Asn Ala Phe Tyr Asp Ala Leu Asn Ser Ile Glu Pro Val

195 200 205

Thr Gly Gly Gly Ser Val Arg Asn Thr Leu Gly Tyr Asn Val Lys Asn

210 215 220

Lys Asn Glu Phe Leu Ser Gln Tyr Lys Phe Asn Leu Cys Phe Glu Asn

225 230 235 240

Thr Gln Gly Tyr Gly Tyr Val Thr Glu Lys Ile Ile Asp Ala Tyr Phe

245 250 255

Ser His Thr Ile Pro Ile Tyr Trp Gly Ser Pro Ser Val Ala Lys Asp

260 265 270

Phe Asn Pro Lys Ser Phe Val Asn Val His Asp Phe Lys Asn Phe Asp

275 280 285

Glu Ala Ile Asp Tyr Ile Lys Tyr Leu His Thr His Lys Asn Ala Tyr

290 295 300

Leu Asp Met Leu Tyr Glu Asn Pro Leu Asn Thr Leu Asp Gly Lys Ala

305 310 315 320

Tyr Phe Tyr Gln Asn Leu Ser Phe Lys Lys Ile Leu Ala Phe Phe Lys

325 330 335

Thr Ile Leu Glu Asn Asp Thr Ile Tyr His Asp Asn Pro Phe Ile Phe

340 345 350

Cys Arg Asp Leu Asn Glu Pro Leu Val Thr Ile Asp Asp Leu Arg Val

355 360 365

Asn Tyr Asp Asp Leu Arg Val Asn Tyr Asp Asp Leu Arg Ile Asn Tyr

370 375 380

Asp Asp Leu Arg Val Asn Tyr Asp Asp Leu Arg Ile Asn Tyr Asp Asp

385 390 395 400

Leu Arg Val Asn Tyr Asp Asp Leu Arg Val Asn Tyr

405 410

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 3

ccggaattcg catatgtttc agccgctgc 29

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 4

aatcccaagc tttcagtggt ggtggtggtg gtgc 34

<210> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (16)..(17)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (25)..(26)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 5

ccgctgaaaa ttgcannkgc aaatnnktgg ggtgatgaa 39

<210> 6

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(15)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (23)..(24)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 6

ttcatcaccc camnnatttg cmnntgcaat tttcagcgg 39

<210> 7

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<220>

<221> misc_feature

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<223> n is a, c, g, or t

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<221> misc_feature

<222> (16)..(17)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (25)..(26)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 7

tggtggggtg atnnknnkat caaannkttt aaaaacagc 39

<210> 8

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(14)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (22)..(23)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (25)..(26)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 8

ctgtttttaa amnntttgat mnnmnnatca ccccacca 38

<210> 9

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (16)..(17)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(20)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (22)..(23)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 9

atcaaagagt ttaaannknn knnkctgtac tttattctg 39

<210> 10

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

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<222> (17)..(18)

<223> n is a, c, g, or t

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<222> (20)..(21)

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<220>

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<222> (23)..(24)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 10

cagaataaag tacagmnnmn nmnntttaaa ctctttgat 39

<210> 11

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (16)..(17)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (22)..(23)

<223> n is a, c, g, or t

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<222> (25)..(26)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 11

agcgatctgg tttttnnkaa tnnknnkggt agcgcacgt 39

<210> 12

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(15)

<223> n is a, c, g, or t

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<221> misc_feature

<222> (17)..(18)

<223> n is a, c, g, or t

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<222> (23)..(24)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 12

acgtgcgcta ccmnnmnnat tmnnaaaaac cagatcgct 39

<210> 13

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(14)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (16)..(17)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (25)..(26)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 13

ccgctgtatt atnnknnkct gcatnnkaaa gcagaaagc 39

<210> 14

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(15)

<223> n is a, c, g, or t

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<221> misc_feature

<222> (23)..(24)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(27)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 14

gctttctgct ttmnnatgca gmnnmnnata atacagcgg 39

<210> 15

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (16)..(17)

<223> n is a, c, g, or t

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<221> misc_feature

<222> (25)..(26)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 15

ctgggttata atgtgnnkaa caaannkgag ttcctgagc 39

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(15)

<223> n is a, c, g, or t

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<221> misc_feature

<222> (23)..(24)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 16

gctcaggaac tcmnntttgt tmnncacatt ataacccag 39

<210> 17

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 人工引物

<220>

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<222> (19)..(20)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 17

tggggtgatg aagaaatcnn kgagtttaaa aacagcgtc 39

<210> 18

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 人工引物

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<222> (20)..(21)

<223> n is a, c, g, or t

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gacgctgttt ttaaactcmn ngatttcttc atcacccca 39

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(20)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 19

aatgcaaaac gcgtgtttnn kaccggtgaa aatgaaagc 39

<210> 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<220>

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<222> (20)..(21)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 20

gctttcattt tcaccggtmn naaacacgcg ttttgcatt 39

<210> 21

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 21

ggaattccat atgtttcagc cgctgctgg 29

<210> 22

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 22

ccgctcgaga taattaacac gcagg 25

<210> 23

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 23

ggtcgcggat ccgaattcat gccggagc 28

<210> 24

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 24

gctgaaacat tctcctttta gcttctc 27

<210> 25

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 25

aaggagaatg tttcagccgc tgctggat 28

<210> 26

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 26

ggtggtggtg ctcgagtcag tggtgg 26

Claims

1.一种岩藻糖基转移酶，其特征在于，所述糖基转移酶在SEQ ID NO:2的基础上发生如下突变：

第127位天冬氨酸被天冬酰胺取代；或

第128位的精氨酸被谷氨酸或酪氨酸取代；或

第131位的组氨酸被异亮氨酸或亮氨酸或甲硫氨酸取代；或

第146位的赖氨酸被天冬酰胺取代；或

第199位的酪氨酸被天冬酰胺取代；或

第223位的赖氨酸被谷氨酸取代；或

第340位的谷氨酸被天冬氨酸取代；或

第368位的缬氨酸被丙氨酸取代；或

第383位的天冬酰胺被赖氨酸取代；或

第407位的天冬氨酸被天冬酰胺取代；或

第127位天冬氨酸被天冬酰胺取代和第131位组氨酸被甲硫氨酸取代；或

第128位精氨酸被酪氨酸取代和第131位组氨酸被亮氨酸取代；或

第340位谷氨酸被天冬氨酸取代和第368位缬氨酸被丙氨酸取代；或

第199位的酪氨酸被天冬酰胺取代和第368位的缬氨酸被丙氨酸取代；或

第199位的酪氨酸被天冬酰胺取代、第368位的缬氨酸被丙氨酸取代和第340位的谷氨酸被天冬氨酸取代；或

第45位的丝氨酸被苯丙氨酸取代、第199位的酪氨酸被天冬酰胺取代和第223位的赖氨酸被谷氨酸取代；或

第127位天冬氨酸被天冬酰胺取代、第128位的精氨酸被谷氨酸取代和第131位的组氨酸被异亮氨酸取代；或

第45位的丝氨酸被苯丙氨酸取代、第199位的酪氨酸被天冬酰胺取代、第368位的缬氨酸被丙氨酸取代和第340位的谷氨酸被天冬氨酸取代；或

第45位的丝氨酸被苯丙氨酸取代、第127位天冬氨酸被天冬酰胺取代、第128位的精氨酸被谷氨酸取代、第131位的组氨酸被异亮氨酸取代、第199位的酪氨酸被天冬酰胺取代、第368位的缬氨酸被丙氨酸取代和第340位的谷氨酸被天冬氨酸取代；或

第45位的丝氨酸被苯丙氨酸取代、第199位的酪氨酸被天冬酰胺取代、第127位天冬氨酸被天冬酰胺取代、第128位的精氨酸被谷氨酸取代、第131位的组氨酸被异亮氨酸取代和第223位的赖氨酸被谷氨酸取代。

2.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码如权利要求1所述的岩藻糖基转移酶。

3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含有权利要求2所述的多核苷酸。

4.一种基因工程化的细胞，其特征在于，所述的细胞包括权利要求3所述的表达载体或其基因组中整合有权利要求2所述的多核苷酸。

5.一种提高岩藻糖基转移酶催化活性的方法，其特征在于，在生物酶法催化体系中，使用如权利要求1所述的岩藻糖基转移酶。

6.一种糖基转移酶在合成岩藻糖基化寡糖及其糖缀合物中的应用，其特征在于，使用了包含权利要求1所述的岩藻糖基转移酶。