CN105392883A - 聚唾液酸、血型抗原以及糖蛋白表达 - Google Patents

Abstract

在此描述的本发明总体上涉及用于产生治疗用途的糖蛋白的糖工程宿主细胞。对宿主细胞进行修饰以表达生物合成糖基化途径。对新型原核生物宿主细胞进行工程化以产生N-连接糖蛋白，其中，该糖蛋白包含聚唾液酸或血型抗原。

Description

聚唾液酸、血型抗原以及糖蛋白表达

联邦资助的研究和开发的声明

本发明是在由国立卫生研究院资助号1R43GM093483-01、5R43AI091336-01和5R43AI091336-02的政府支持下完成的。政府具有本发明中一定的权利。

相关申请的交叉引用

本申请涉及2013年3月15日递交的美国临时申请No.61/801,948，出于所有的目的将其通过引用方式全部并入文中。

序列表

本申请包含已经经由EFS-Web提交的序列表，并且特此将其通过引用全部并入。创建于[DATE]的所述ASCII副本名称为[.txt]并且大小是[#######]字节。

技术领域

本公开在此总体上涉及糖生物学以及蛋白质工程领域。更确切地说，在此描述的实施方式涉及寡糖组合物以及治疗性糖蛋白在重组宿主中的产生。

背景技术

蛋白质和肽类药物具有巨大的临床影响，并且构成了700亿美元的市场。遗憾的是，由蛋白质降解、网状内皮组织系统的细胞吸收、肾脏排除以及免疫复合物的形成而产生的限制经常会破坏蛋白药物的功效。这可导致在达到有效浓度之前就从血液中消除，并且可导致不能接受的较短的治疗窗。有助于这些药物动力学限制的主导因素是稳定性和免疫原性。已经作出努力来解决这些问题，其中包括改变一级结构、将聚糖或多聚体缀合至蛋白质、或截留纳米颗粒中的蛋白质，以改善停留时间和降低免疫原性。迄今为止最流行的方法是通常被称为聚乙二醇化的单甲氧基聚乙二醇(mPEG)的缀合。聚乙二醇化可以赋予蛋白质和肽类药物更长的循环半衰期并降低免疫原性。许多聚乙二醇化药物现在用于临床(例如天冬酰胺酶、干扰素α、肿瘤坏死因子和粒细胞集落刺激因子)。然而，PEG通过正常解毒机制是不可生物降解的，并且已发现施用聚乙二醇化蛋白质可引发抗-PEG抗体。

聚乙二醇化是一种用以提高稳定性并降低免疫原性的广为接受的方法，由此将蛋白质缀合至聚乙二醇(PEG)[1]。这种聚乙二醇化涉及经由化学反应性侧链(如羟基琥珀酰亚胺酯(hydroxysuccinimidylester)或醛基)的直链或支链PEG的共价结合，用于连接到蛋白上的α氨基或ε氨基上[2]。聚乙二醇化可以赋予蛋白质和肽类药物更长的循环半衰期并降低免疫原性，因为PEG是水溶性的，并且增加了该蛋白质的大小，并通过阻塞裂解位点来减少溶蛋白性裂解[1]。聚乙二醇化值被证明用于许多蛋白质，包括：(i)天冬酰胺酶[3]，一种在白血病的治疗中使用的酶，以及(ii)参与嘌呤代谢的腺苷脱氨酶[4]。聚乙二醇化也被用于增强免疫因子的活性，这些免疫因子如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)[5]、肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素α-2a上的活动(IFNα-2a)和干扰素α-2b[1]。尽管聚乙二醇化是一种可提高药物动力学性质的化学修饰，但它并非没有缺点。第一，聚乙二醇化的不均匀性产生了许多生物活性不同的的异型体。这主要是多聚体的多分散特性的结果。第二，已经担心会将看来不是可完全生物降解的合成多聚体引入人体[6]。第三，经常观察到的聚乙二醇化蛋白的半衰期的延长可以伴有与由缀合导致的分子结构改变有关的生物活性降低[2]。第四，聚乙二醇化的工艺很昂贵，并且需要许多体外化学反应以及多次纯化[7]。因此，虽然聚乙二醇化已被临床证实是一种增加循环半衰期和降低免疫原性的方法，显然这不是最佳的解决方案。

一种新兴的聚乙二醇化的临床替代是聚唾液酸化(polysialylation)，其涉及天然N-乙酰神经氨酸(聚唾液酸或PSA)的多聚体附着到蛋白质上。PSA具有高度亲水性，与PEG具有相似的水合性质，对于先天性和获得性免疫系统来说是不引人注意的，并且是在人体细胞中自然合成和显示。PSA最近被开发用于分别显示出改善的耐受性和药代动力学的胰岛素和促红细胞生成素的聚唾液酸化产物的临床用途。遗憾的是，与聚乙二醇化一样，该PSA缀合过程在技术上具有挑战性且昂贵，使得该最终产物的成本对医疗消费者来说是不能接受的。PSA缀合要求目标蛋白和PSA的单独产生和纯化以及PSA的非还原端的体外还原胺化，以允许化学连接到蛋白质的伯胺基团上。

PSA缀合已被证明是一种增加治疗性蛋白质的有效寿命并防止其被免疫系统识别的非常有效的方法。PSA缀合对于聚乙二醇化具有多个性能优点，并且当前在临床上进行测试。

对于先天免疫系统和适应性免疫系统不显眼的分子有可能在循环中长时间存活。聚唾液酸(PSA；N-乙酰神经(唾液)酸的聚合物)是这样一种分子，并提供了一个PEG的天然替代物来作为能够改变蛋白质的血清耐久性的缀合物。PSA是一种几乎只在神经细胞黏附分子(NCAM)中发现的人源多聚体，在此它在大脑发育中具有防粘连功能[8]。当用于蛋白质和治疗性肽药物的递送时，缀合的PSA提供了一种保护性微环境。这增加了治疗性蛋白质在循环中的有效寿命，并且防止其被免疫系统所识别。与PEG不同，PSA作为一种天然糖分子而被组织唾液酸酶代谢[9]。PSA的高度亲水性质造成了与PEG类似的水合性质，赋予其在血液中的高表观分子量。这增加了循环的时间，因为迄今为止确定没有具有PSA特异性的受体[10]。

虽然PSA是在人体内自然存在的，但它也可而由细菌(如脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)和大肠杆菌的某些菌株)合成而作为荚膜[11]。这些聚唾液酸化细菌利用分子模拟而逃避人体的防御系统。即使在连接到蛋白质上时，细菌PSA也是完全非免疫原性的，并且与人体内的的PSA是在化学上完全相同的，在此方面PSA已经开发用于临床。氧化的PSA的非还原端的还原性胺化允许通过蛋白质上的伯胺基团进行体外化学缀合，并且通过用天冬酰胺酶[12]和胰岛素[13]分别治疗白血病和糖尿病已经证明了PSA缀合的治疗益处。聚唾液酸化的胰岛素和促红细胞生成素的试验的最近临床数据表明，这些生物药物具有增强药物动力学的良好的耐受性[14]。最近，有两个令人兴奋的发现增加了对于PSA缀合的热情。首先，观察到化学聚唾液酸化抗肿瘤Fab片段与未修饰的Fab相比引起了生物利用度增加5倍，相应的肿瘤摄取增加3倍[15]。其次，PSA与工程化C-末端硫醇的位点特异性的(而不是随机的)连接导致了具有完全免疫反应性的抗体片段、增加的血液半衰期、更高的肿瘤摄取以及提高的特异性比率[14]。PSA缀合可以增加重要的治疗价值，并且聚唾液酸化抗体片段可以通过改善血清半衰期并改善与Fc结构域相关联的问题而成为一个可行的整个IgG的替代物。

遗憾的是，即使是PSA缀合也不是没有缺点。在治疗有效的同时，PSA缀合的产生过程是集约化的，并带来显著的资金和加工成本。目前，产生涉及一种费力的八步骤过程，包括：(ⅰ)大肠杆菌K1的发酵及(ii)其荚膜覆层的纯化，(iii)表达治疗性蛋白质的大肠杆菌的发酵及(iv)治疗性蛋白质的纯化，(v)膜锚定的PSA的化学裂解，(vi)PSA的纯化，(vii)通过氧化PSA的非还原端的还原性胺化的PSA与治疗性蛋白上的伯胺基团的化学交联，以及(viii)PSA缀合蛋白的纯化。这个八步过程需要两次发酵、两次体外化学反应和四次纯化。PSA的标准胺定向化学缀合导致出现不希望的异质性的随机附接模式的事实使该过程进一步复杂化[14]。为了解决这个问题，可以使用位点特异性的硫醇定向化学缀合。然而，这需要加入多C-末端硫醇，其难以在大肠杆菌发酵中表达并需要哺乳动物表达系统[14]。

相应地，因此所需要的是用于与寡糖组合物连接的治疗性蛋白质的重组生产的方法和组合物，该寡糖组合物是结构同源的并可以受控的、快速的、具成本效益的与人体类似的方式产生。

发明内容

在此描述的是用于包括聚唾液酸和蛋白质上的血型抗原的人聚糖或类人聚糖的重组产生的方法和组合物。本发明提供了用于包括A抗原、H抗原、B抗原、T抗原、唾液酸T抗原、LewisX抗原和聚唾液酸化抗原的人聚糖或类人聚糖的重组生产的方法和组合物。该方法进一步用于产生含有原核宿主细胞中的人聚糖并将该人聚糖作为N-连接聚糖而附接到蛋白质上的非天然碳水化合物。多种宿主细胞被工程化以表达产生合成特定寡糖结构所需的必需糖核苷酸和糖基转移酶活性所需的蛋白质。

在某些方面，提供了用于产生寡糖组合物的方法和组合物，该方法包含：培养重组宿主细胞以表达GalNAc转移酶活性(EC2.4.1.-)(EC2.4.1.290)和半乳糖基转移酶活性(EC2.4.1.-)(EC2.4.1.309)；其中，该宿主细胞产生包含与脂质载体连接的一种或多种GalNAc残基、半乳糖残基或半乳糖-GalNAc残基的寡糖组合物。

另外的实施方式提供了从岩藻糖基转移酶(EC2.4.1.69)、唾液酸转移酶(EC2.4.99.4、EC2.4.99.-、EC2.4.99.8)以及N-乙酰葡糖胺基转移酶(EC2.4.1-)中选择的一种或多种酶活性的表达，用于产生包含至少一种与脂质载体连接的岩藻糖残基、唾液酸残基或GlcNAc残基的寡糖组合物。

某些实施方式提供了从UndPN-乙酰葡糖胺基转移酶(EC7.8.33)、UndPPGalNAc差向异构酶(EC5.1.3.c)和UndP杆菌胺(bacillosamine)转移酶(EC2.7.8.36)中选择的一种或多种活性的表达。

某些实施方式提供了α1,3-N-乙酰半乳糖胺转移酶活性(EC2.4.1-，EC2.4.1.306)的表达。

某些实施方式提供了从β1,3半乳糖基转移酶(EC2.4.1-)、β1,4半乳糖基转移酶(EC2.4.1.22)和α1,3半乳糖基转移酶(EC2.4.1.309)中选择的一种或多种活性的表达。

某些实施方式提供了从α1,2岩藻糖基转移酶(EC2.4.1.69)、α1,3岩藻糖基转移酶(EC2.4.1.152)和α1,3/1,4岩藻糖基转移酶(EC2.4.1.65)中选择的一种或多种活性的表达。

某些实施方式提供了β1,3N-乙酰葡糖胺基转移酶活性(EC2.4.1.101)的表达。

某些实施方式提供了从α2,3NeuNAc转移酶(EC2.4.99.4)、α2,6NeuNAc转移酶(EC2.4.99.1)、双官能α2,3α2,8NeuNAc转移酶(EC2.4.99.-、EC2.4.99.4、EC2.4.99.8)和α2,8-聚唾液酸转移酶(EC2.4.99.8)中选择的一种或多种活性的表达。

某些实施方式提供了十一异戊烯磷酸α-N-乙酰葡糖胺基转移酶活性(EC2.7.8.33)的表达。

某些实施方式提供了N-乙酰-α-D-葡糖胺基-二磷酸-二反、八顺-十一萜醇4-差向异构酶活性(EC5.1.3.c)的表达。

某些实施方式提供了十一异戊烯磷酸N,N’-二乙酰杆菌胺1-磷酸转移酶活性(EC2.7.8.36)的表达。

另外的实施方式提供了在从N-乙酰神经氨酸裂解酶(EC4.1.3.3)、十一异戊烯磷酸葡萄糖磷酸转移酶(EC2.7.8.-)(EC2.7.8.31)和O-抗原连接酶活性中选择的至少一种酶活性的衰减。

某些实施方式提供了从N-乙酰神经氨酸合酶(EC2.5.1.56)、N-乙酰神经氨酸胞苷酰转移酶(EC2.7.7.43)、UDP-N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶(EC5.1.3.14)和N-乙酰神经氨酸乙酰转移酶(EC2.3.1.45)中选择的一种或多种活性的表达。

某些实施方式提供了GalNAc差向异构酶活性(EC5.1.3.2)的表达。

某些实施方式提供了Gal差向异构酶活性(EC5.1.3.2)的表达。

某些实施方式提供了从GDP-甘露糖-4,6-脱水酶(EC4.2.1.47)、GDP-岩藻糖合成酶(EC1.1.1.271)、GDP甘露糖甘露糖基水解酶(EC3.2.1.42)、甘露糖-1-磷酸鸟苷酰转移酶(EC2.7.7.13)和磷酸甘露糖变位酶(EC5.4.2.8)中选择的一种或多种酶活性的表达。

某些实施方式提供了从UDP-N-乙酰杆菌胺N-乙酰转移酶(EC2.3.1.203)、UDP-N-乙酰葡糖胺-4,6-脱水酶(EC4.2.1.135)和UDP-N-乙酰杆菌胺转氨酶(EC2.6.1.34)中选择的一种或多种酶活性的表达。

在一个实施方式中，本发明提供了一种包含在糖蛋白上的N-连接唾液酸残基的糖蛋白组合物。优选地，该包含N-连接唾液酸残基的糖蛋白组合物包含以下的糖型式之一：(Siaα2,8)_n-Siaα2,8-Siaα2,3-Galβ1,3-GalNAcα1,3-GalNAcα1,3-GlcNAc；(Siaα2,8)_n-Siaα2,8-Siaα2,3-Galβ1,3-GalNAcα1,3-GlcNAc；(Siaα2,8)_n-Siaα2,8-Siaα2,3-Galβ1,3-GalNAcα1,3-GalNAc，和(Siaα2,8)_n-Siaα2,8-Siaα2,3-Galβ1,3-(GalNAcα1,3)。可替选地，引入将UDP-GlcNAc转化为CMP-NeuNAc的酶活性并在所选的宿主系统中表达。例如，将UDP-GlcNAc转化为CMP-NeuNAc的Neu酶活性包含NeuB(合酶)、NeuC(差向异构酶)和NeuA(合酶)。另外，表达合成聚唾液酸和/或包括NeuE、NeuS(聚唾液酸转移酶)、NeuD(酰基转移酶家族)、NeuO(PSAO-乙酰转移酶)和KpsCS的乙酰化形式所需的酶活性。在某些实施方式中，用最小基因neuES和kpsCS生成[α(2→3)Neu5Ac]_n、[α(2→6)Neu5Ac]_n、[α(2→8)Neu5Ac]_n[α(2→9)Neu5Ac]_n、或[α(2→8)Neu5Ac-α(2→9)Neu5Ac]_n或其组合来生成PSA。在又一实施方式中，该糖蛋白组合物的限定聚合度为约1至约500个唾液酸残基，优选地在2至125个唾液酸残基之间。

在本发明的各种其他方面，糖基转移酶的组合被表达以产生含有例如H-抗原(Fucα1,2-Galβ1,3-GalNAcα1,3-GlcNAc)、T-抗原(Galβ1,3-GalNAcα1,3-GlcNAc、Galβ1,3-GalNAcα1,3-GalNAcβ)和唾液酸T-抗原(Siaα2,3-Galβ1,3-GalNAcα1,3-GlcNAc)的聚糖。

虽然可以将多种宿主细胞工程化以产生寡糖和糖蛋白组合物，但是优选的表达系统包括原核宿主细胞。原核宿主细胞还包含寡糖基转移酶活性(EC2.4.1.119)，能够将寡糖组合物转移到目标蛋白质的N-糖基化受体位点上。

在优选的方面，本发明提供了包含目标异源蛋白质的方法和宿主细胞。在某些实施方式中，目标蛋白质包含所需的寡糖组合物。因此，本发明提供了如本文所述产生的各种寡糖组合物。

在其他优选的方面，在此描述了由该宿主细胞产生的这些糖蛋白组合物。在更优选的方面，该糖蛋白提高了药物动力学性质，如改善的血清半衰期、提高的稳定性、降低的免疫原性或无免疫原性的或不当的期望的免疫应答。

在其他方面，提供包含宿主细胞的细胞培养物。此外，提供了用于产生包含培养的重组原核宿主细胞的寡糖组合物的各种方法。还提供了用于产生包含培养的重组原核宿主细胞的糖蛋白组合物的各种方法。

附图说明

图1描绘了用于重组产生含有多种人聚糖和类人聚糖结构和聚唾液酸(PSA)的寡糖的代表性的生物合成途径。

图2表示由RCA(左图)、SBA(中间)以及通过SDS-PAGE检测的糖基化hGH(右图)来检测的细菌的细胞表面上的工程化人T抗原的FACS分析。

图3表示用缓冲液或β1,3-半乳糖苷酶处理的重组表达的人T抗原的MS。

图4表示重组产生的未糖基化MBP8xDQNAT(pMW07)或者携带T抗原聚糖的MBP8xDQNAT(pJD-07)的蛋白质印迹分析。

图5表示使用来源于用与T抗原聚糖缀合的MBP8xDQNAT或未糖基化的MBP8xDQNAT进行免疫的小鼠的血清的IgM-或IgG-族特异性ELISA。矩形代表均值。

图6表示使用来源于用T抗原-MBP8xDQNAT(糖基化)或MBP8xDQNAT(未糖基化)进行免疫的小鼠的血清的ELISA结果。将T抗原-GFP4xDQNAT或GFP4xDQNAT涂在孔上。

图7表示在胰高血糖素上的重组表达的人2,3-唾液酸T抗原的MS。

图8表示通过neuDBAC在胰高血糖素质粒上的表达来改善在胰高血糖素上的重组表达的人2,3唾液酸T抗原的MS。

图9表示在α2,3-神经氨酸酶处理后在胰高血糖素上的重组表达的人唾液酸T抗原的MS，来确认唾液酸化和连接。

图10表示只有胰高血糖素(左)或胰高血糖素与人2,3-唾液酸T抗原(右)的随着时间的MS。

图11表示在胰高血糖素上的重组表达的2,6-唾液酸化T抗原的MS。

图12表示用α2,3-神经氨酸酶或非连接特异性神经氨酸酶处理的在胰高血糖素上的重组表达的2,6-唾液酸化T抗原的MS。

图13表示在添加NeuNAc的大肠杆菌ΔnanA的细胞表面上的重组PSA表达的斑点印迹(a)、以及示例性聚糖的预期连接(b)。

图14表示在存在pJLic3BS-07和NeuNAc添加时使用αPSA抗体的蛋白质印迹(顶部)以及通过具有αHis抗血清的六组氨酸标签的存在而检测的总蛋白(底部)。

图15表示突出了neuD表达对由pJLic3BS-07表达产生的细胞表面PSA的效果的斑点印迹。

图16表示具有CstII-SiaD融合质粒的MBP4xGT的抗PSA(顶部)和抗His(底部)的活体外聚唾液酸化的SDSPAGE和蛋白质印迹。

图17表示缓冲液对照的重组表达岩藻糖化人H抗原聚糖的MS(a)或用1,2-岩藻糖苷酶处理的重组表达岩藻糖化人H抗原聚糖的MS以及具有GDP-岩藻糖生物合成基因的表达的重组表达岩藻糖化H抗原聚糖的MS(b)。

图18表示用PJK-07糖基化质粒表达的TNFaFab的蛋白质印迹。

图19表示带有人H抗原的重组岩藻糖化胰高血糖素肽(左)以及带有人H抗原和GDP-岩藻糖生物合成基因的附加表达的胰高血糖素肽(右)的MS。

图20表示只用缓冲液或用确认岩藻糖基化和连接的α1,2-岩藻糖苷酶进行处理的重组表达岩藻糖化胰高血糖素肽的MS。

图21表示通过αhGH抗体检测的、用pJK-07表达的GH2的SDSPAGE和蛋白质印迹(左)、以及用H抗原糖基化的GH2的MS(右)。

图22表示在使GH2或GH2-H抗原涡流之后浊度随时间的增加(a)以及GH2和GH2-H抗原的受体结合。

图23表示在注射各蛋白之后在大鼠血清中检测到的GH2或GH2-H抗原随时间变化的ELISA。

具体实施方式

缩写和术语

以下的术语和方法的解释是为了更好地对本披露进行描述，并在本披露的实践中指导本领域普通技术人员。如在此使用的，“包含(comprising)”是指“包括(including)”，并且除非上下文另有明确指示，单数形式“一种(a)”、“一种(an)”以及“该”包括复数个参照物。例如，提及“包含一个细胞”包括一个或多个这种细胞。除非上下文另有明确说明，术语“或”指是指所述替代的元素中的单一元素或两种或更多种元素的组合。

本文所提及的全部出版物、专利和其他参考文献通过引用方式全部并入文中。

EC号由生物化学与分子生物学国际联盟命名委员会(NC-IUBMB)(http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/上获得)建立。在此引用的EC编号来源于京都基因和基因组学百科全书(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomics)所有的、由东京大学(UniversityofTokyo)部分赞助的KEGG配体数据库。除非另外指明，EC号是由截止到2013年3月的数据库提供的。

在此引用的登记号来源于美国国立卫生研究院(NationalInstituteofHealth,U.S.A)所有的NCBI数据库(国家生物技术信息中心)。除非另外指明，登记号是由截止到2013年3月的数据库提供的。

除非另外指示，否则本发明的方法和技术一般是根据本领域中众所周知的常规方法并且如本说明书全篇所引用并且论述的各种通用和更特定的参考文献中所描述来进行。参见例如Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册》(MolecularCloning：ALaboratoryManual)，第二版，冷泉港实验室出版社(ColdSpringHarborLaboratoryPress)，冷泉港(ColdSpringHarbor)，纽约(N.J.)(1989)；Ausubel等人，分子生物学现代方法(CurrentProtocolsinMolecularBiology)，格林出版协会(GreenePublishingAssociates)(1992，以及到2002为止的增刊)；Harlow和Lane，抗体：实验室手册(Antibodies：ALaboratoryManual)，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(1990)；泰勒(Taylor)和德里卡默(Drickamer)，糖生物学简介(IntroductiontoGlycobiology)，牛津大学出版社(OxfordUniv.Press)(2003)；沃辛顿酶手册(WorthingtonEnzymeManual)，沃辛顿生物化学公司(WorthingtonBiochemical)，Freehold，纽约；生物化学手册：A篇，蛋白质(HandbookofBiochemistry：SectionAProteins)，第I版，CRC出版社(CRCPress)(1976)；生物化学手册：A篇，蛋白质，第II版，CRC出版社(1976)；糖生物学基础(EssentialsofGlycobiology)，冷泉港实验室出版社(1999)。

在临时申请中的术语“权利要求”与实施方式或优选实施方式是同义的。

关于糖蛋白的术语“类人(human-like)”是指具有附接的与蛋白质中的天冬酰胺残基的酰胺氮连接的(N连接)N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)残基或N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)残基的蛋白质，该蛋白质与在人体中产生的蛋白质相似甚至完全相同。

“N-聚糖”或“N-连接聚糖”是指N-连接的糖结构。N-聚糖可以附接到蛋白质或合成糖蛋白中间体上，进一步可以在体外或体内对其进行操纵。在糖蛋白中发现的主要的糖是葡萄糖(Glu)、乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、岩藻糖(Fuc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和唾液酸(例如N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac、NeuAc、NeuNA、NeuNAc、Sia或NANA))。己糖(Hex)是指甘露糖或半乳糖。

术语“血型抗原”、“BGA”或“人抗原”可互换使用，并且包含一个或多个寡糖部分。

术语“聚唾液酸”或“PSA”是指一种包含至少两个NeuNAc残基的寡糖结构。

除非另外指明并作为所有在此描述的通式为“SEQIDNO：”的序列中的一个实施例，否则“包含SEQIDNo：1的核酸”是指至少一部分具有(i)SEQIDNO：1的序列或(ii)与SEQIDNO：1互补的序列的一种核酸。这两者之间的选择是由上下文决定的。例如，如果该核酸被用作探针，则这两者之间的选择是由该探针与所需目标互补的要求所决定的。

“分离的”或“基本上纯的”核酸或多核苷酸(例如，RNA、DNA或混合多聚体)或糖蛋白是指与在其天然宿主细胞中天然伴随天然多核苷酸的其他细胞组分(例如核糖体、聚合酶以及与其自然相关的基因组序列)基本上分离的核酸或多核苷酸或糖蛋白。该术语涵盖这样的核酸、多核苷酸，其(1)已经从其天然存在的环境中去除的、(2)在自然界中发现的“分离的多核苷酸”不与全部或部分多核苷酸相关、(3)可操作地连接到多核苷酸、在自然界中不连接到多核苷酸，或(4)在自然界中不存在。术语“分离的”或“基本上纯的”还可以指的是重组的或克隆的DNA分离物、化学合成的多核苷酸类似物、或由异源系统生物合成的多核苷酸类似物。

然而，“分离的”不一定要求如此描述的核酸、多核苷酸或糖蛋白本身是从其天然环境中物理地移除的。例如，如果异源序列被置于邻近该内源核酸序列，则在生物体基因组中的内源核酸序列被视为“分离的”，使得此内源核酸序列的表达被改变。在这种情况下，异源序列是一种与内源核酸序列天然不相邻的序列，无论该异源序列是否本身为内源的(源自相同的宿主细胞或其后代)或外源的(源自不同的宿主细胞或其后代)。通过举例，启动子序列可以取代(例如通过同源重组)宿主细胞的基因组中的一个基因的天然启动子，使得此基因具有改变的表达模式。从而此基因将成为“分离的”，因为它是从天然地与该基因侧接的至少一些序列中分离出来的。

如果核酸包含对于基因组中的相应核酸不会天然发生的任何修饰，则该核酸也被认为是“分离的”。例如，如果包含插入、缺失或人工引入(例如通过人为干预)的点突变，则内源性编码序列被认为是“分离的”。“分离的核酸”还包括在异源位点整合进宿主细胞染色体中的核酸、以及作为附加体的核酸构建体。同时，当通过重组技术产生时，“分离的核酸”能够基本上不含其他细胞材料或基本上不含培养基；或者当化学合成时，“分离的核酸”基本上不含化学前体或其他化学品。

术语“结合亲和性”是指一种蛋白质结合到靶受体上。糖基化蛋白或肽的结合亲和力的范围可以是相应的未糖基化蛋白或肽的结合亲和力的约0.01％至30％，或约0.1％至约20％，或约1％至约15％，或约2％至约10％。与该未糖基化蛋白或肽的结合亲和力相比，糖基化蛋白或肽的结合亲和力可增加或降低至少约3倍，或至少约5倍，或至少约6倍，或至少约7倍，或至少约8倍,或至少约9倍，或至少约10倍，或至少约12倍，或至少约15倍，或至少约17倍，或至少约20倍，或至少约30倍，或至少约50倍，或至少约100倍或更少。

适用于蛋白质或肽的术语“血清持久性”是指这些蛋白质或肽在血液或其组分中承受降解的能力，这通常涉及血清或血浆中的蛋白酶。可通过在实施例20所示对血清降解抗性进行测量。

除非另外说明，否则在此所使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。尽管在本公开的实践或测试中可以使用类似于或等效于在此所述的方法和材料的方法和材料，但适合的方法和材料描述如下。这些材料、方法以及实施例仅是说明性的并且不意图具有限制性。本公开的其他特征通过以下详细描述以及权利要求书将会变得显而易见。

实施方式的详细说明

在各个方面，本发明提供了糖工程化(glycoengineered)宿主细胞以在单次发酵中重组产生寡糖(如BGA-缀合蛋白或PSA-缀合蛋白)，而无需体外化学修饰的附加步骤。有利地，糖基工程化宿主表达技术使得能够对附接的多糖的的位置和化学计量进行控制，并且消除对多余的硫醇以及体外化学反应的需要。因此，在某些实施方式中，本发明提供了用于产生寡糖组合物的方法和组合物，包含：培养以表达GalNAc转移酶活性(EC2.4.1.-)(EC2.4.1.290)和半乳糖基转移酶活性(EC2.4.1.-)(EC2.4.1.309)的重组宿主细胞，其中，该宿主细胞产生一种包含与脂质载体连接的一种或多种GalNAc、半乳糖或半乳糖-GalNAc残基的寡糖组合物。

图1提供了在原核生物中产生BGA-缀合蛋白、唾液酸蛋白或PSA缀合蛋白的示例性生物合成的机制的概观。在优选的实施方式中，重组寡糖合成是由α1,3-N-乙酰半乳糖胺转移酶活性(EC2.4.1.-，EC2.4.1.306)的表达而启动。另外的实施方式包括如WbiP和CgtA等其他半乳糖基转移酶活性的表达以启动重组寡糖合成。可替选地，重组寡糖合成可以通过表达UDP-N-乙酰葡糖胺4-差向异构酶的活性而在蛋白的N-连接位点上直接启动(Rush等，(2010)JBC285(3)1671-1680)。又一种替选方式是提供杆菌胺以引发寡糖合成。因此，本发明提供了用于在可N-连接到目标蛋白的GlcNAc残基、GalNAc残基或杆菌胺上的重组寡糖合成的方法。

还提供了用于表达从UndPN-乙酰葡糖胺基转移酶活性(EC7.8.33)、UndPPGalNAc差向异构酶活性(EC5.1.3.c)和UndP杆菌胺转移酶活性(EC5.1.3.c)中选择的一种或多种活性的方法和组合物。

人T抗原

在示例性实施方式中，本发明提供了用以重组表达产生各种BGA所需的遗传机制的方法。一种产生人T抗原的优选方法包含：GalNAc转移酶活性(EC2.4.1.-)(EC2.4.1.290)的重组表达，其催化UDP-GalNAc残基转移到受体底物β1,4GlcNAc上。宿主细胞还表达一种半乳糖基转移酶活性(EC2.4.1.-)(EC2.4.1.309)，其覆盖了导致人T抗原的GalNAc受体寡糖。图3提供了与以下结构相关的重组产生的糖型的实验支持：人T抗原Galβ1,3-GalNAcα1,3-GlcNAc。

人唾液酸T抗原

在本发明的另一个方面，提供了一种产生人唾液酸T抗原的方法，其包含GalNAc转移酶活性(EC2.4.1.-)(EC2.4.1.290)、半乳糖基转移酶活性(EC2.4.1.-)(EC2.4.1.309)和2,3-NeuNAc转移酶活性(EC2.4.99.4，EC2.4.99.-，EC2.4.99.8)的重组表达。图7表示胰高血糖素肽上的与以下结构相关的重组产生的糖型的MS：Siaα2,3-Galβ1,3-GalNAcα1,3-GlcNAc。

在更优选的实施方式中，通过对从唾液酸生物合成蛋白、N-乙酰神经氨酸合酶(EC2.5.1.56)、N-乙酰神经氨酸胞苷酰转移酶(EC2.7.7.43)、UDP-N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶(EC5.1.3.14)和N-乙酰神经氨酸乙酰转移酶(EC2.3.1.45)(例如neuDBAC)中选择的一个或多个酶活性进行表达而产生改进水平的糖型。图8描述经由糖核苷酸酶活性的异位表达或增加表达，胰高血糖素肽上的重组产生的糖型以及胰高血糖素肽上的唾液酸T糖型的改进水平。利用α2,3-神经氨酸酶处理糖基化胰高血糖素肽来确认加入了唾液酸，图9。

在另外的实施方式中，通过一个或多个α2,6NeuNAc转移酶(EC2.4.99.1)的表达而产生α2,6唾液酸T糖型。图11示出了包含有除α2,3-连接以外的连接的胰高血糖素肽。

聚唾液酸

在其他示例性实施方式中，本发明提供了一种用于产生寡糖组合物的方法，其包含：培养以表达以下一种或多种酶的重组宿主细胞：将GalNAc残基转移到受体底物上的GalNAc转移酶活性(EC2.4.1.-)；半乳糖基转移酶活性(EC2.4.1.-)；岩藻糖基转移酶活性(EC2.4.1.69)；以及唾液酸转移酶活性(EC2.4.99.4，EC2.4.99.-，EC2.4.99.8)，其中该宿主细胞产生聚唾液酸。

细胞壁上的PSA的证据在图13和图15中示出。PSA糖型的预期结构连接包括：

(Siaα2,8)_n-Siaα2,8-Siaα2,3-Galβ1,3-GalNAcα1,3-GalNAcα1,3-GlcNAc；

(Siaα2,8)_n-Siaα2,8-Siaα2,3-Galβ1,3-GalNAcα1,3-GlcNAc；和

(Siaα2,8)_n-Siaα2,8-Siaα2,3-Galβ1,3-(GalNAcα1,3)_n。

在选择性实施方式中，本发明提供了用以重组表达对于产生PSA所需的遗传机制的方法。如在实施例12中所述，将代表拥有大肠杆菌K1和K92的kps基因和neu基因的荚膜生物合成基因座的基因克隆到用于大肠杆菌优选菌株的转化的质粒pACYC184中。

在其他选择的实施方式中，N-连接寡糖组合物包含或或由以下成分构成：[α(2→3)Neu5Ac]_n、[α(2→6)Neu5Ac]_n、[α(2→8)Neu5Ac]_n、[α(2→9)Neu5Ac]_n或其组合。

还公开了用于产生所需的PSA寡糖组合物的基因。在某些实施方式中，表达了一种或多种Neu活性，如NeuDBACES和Kps活性(如KpsSCUDEF)。在另外其他实施方式中，对一个或多个编码KpsMT的基因进行衰减。本发明提供了一种用于在糖蛋白上产生N-连接唾液酸的方法，包含：培养宿主细胞而从UDP-GlcNAc中产生CMP-Neu5Ac并从CMP-Neu5Ac中产生PSA；以及表达OST活性；其中该OST活性将唾液酸转移到所得的糖蛋白的受体天冬酰胺上。

优选地，该寡糖结构是与蛋白质N-连接的，包含一个末端唾液酸残基，更优选地是一种聚唾液酸，该聚唾液酸是一种包含通过α2-8或α2-9连接的至少2个唾液酸残基的多糖。合适的聚唾液酸的重均分子量的范围为2-100kDa，优选范围为1-35kDa。最优选的聚唾液酸的分子量在10-20kDa的范围内，通常为约14kDa。

更优选地，N-连接PSA糖蛋白包含约2-125个唾液酸残基。聚合PSA可以被转移到糖蛋白上，是N-连接的，一些含有10-80个唾液酸残基，其他含有20-60个唾液酸残基、或40-50个唾液酸残基。优选的N-连接PSA糖蛋白组合物具有限定的聚合度。

在另外的实施方式中，所述糖蛋白组合物还包括一种第二N-连接寡糖结构，例如真核、人或类人聚糖，如Neu5Ac_1-4Gal_1-4GlcNAc_1-5Man₃GlcNAc₂、Man_3-5GlcNAc_1-2、GlcNAc_1-2，例如细菌聚糖，如GalNAc-αl,4-GalNAc-α1,4-[Glcβ1,3]GalNAc-α1,4-GalNAc-α1,4-GalNAc-α1,3-Bac-β1,N-Asn(GalNAc₅GlcBac，其中Bac为杆菌胺或2,4-二乙酰胺基-2,4,6-三脱氧葡萄糖)。N-连接PSA和N-连接寡糖组合物的混合物也是可考虑的。

糖基工程化大肠杆菌已被用来使多样的脂质连接O-抗原聚糖与受体蛋白中的相应的天冬酰胺在体内附接(FeldmanMF等，(2005)大肠杆菌中的具有多样的O抗原脂多糖结构的工程N-连接蛋白糖基化，美国国家科学院院刊(ProcNatlAcadSciUSA.)2005年2月22日；102(8)：3016-21)。能够控制如PSA等所附接的多糖的位置和化学计量可能是极其重要的，因为PSA的胺定向化学缀合是随机的并导致不可接受的异构产物。只是最近才通过PSA至工程化C-末端硫醇的位点特异性的化学缀合实现了有利的缀合。

PSA缀合蛋白预计改善循环半衰期并提供稳定性。因为PSA是一种人体的自然成分，化学上和免疫学上与人PSA类似(不像PEG)的重组PSA组合物预计被降解或通过组织神经氨酸酶或唾液酸酶代谢成为唾液酸残基。重组PSA组合物作为生物可降解多聚体在免疫生物学上也是不可见的。

重组生物合成的其他优点如下。尽管PSA缀合需要多个复杂的体外化学反应和多次纯化，但经由宿主细胞表达的PSA的直接重组产生则不需要体外化学反应。不需要在体外化学交联之前从大肠杆菌K1荚膜中分离PSA。还可避免在PSA的标准胺定向化学缀合中产生的随机附接模式和不希望的异质性。尽管可以使用位点特异性、硫醇定向化学缀合，但这需要多个C-末端硫醇的附加以及从哺乳动物宿主的表达。使用糖基化改造宿主对于有效生产和加工保持较低的资金成本和生产。因此，在本发明的一个方面，这些方法和宿主细胞用作产生具有结构同源的类人聚糖的N-连接糖蛋白的糖蛋白表达系统，并且克服了上述许多限制和挑战。宿主细胞解决了对于PSA缀合蛋白质疗法的明确的临床需求。

人H抗原

在另外的示例性实施方式中，本发明提供了一种用于产生寡糖组合物的方法，其包含培养重组宿主细胞以表达以下一种或多种酶：将GalNAc残基催化至受体底物上的GalNAc转移酶活性(EC2.4.1.-)；半乳糖基转移酶活性(EC2.4.1.-)；以及从α1,2-岩藻糖基转移酶(EC2.4.1.69)、α1,3-岩藻糖基转移酶(EC2.4.1.152)和α1,3/l,4-岩藻糖基转移酶(EC2.4.1.65)中选择的一种或多种活性。利用α1,2-岩藻糖苷酶处理聚糖证实GDP-岩藻糖转移，图17A。重组产生的糖型与以下结构相关：α1,2Fuc-Galβ1,3-GalNAcα1,3-GlcNAc，人H抗原如图17B所示。人H抗原还可通过培养重组宿主以表达GDP-岩藻糖生物合成机制而转移到胰高血糖素肽上(实施例18)。图19提供了包括H抗原的岩藻糖化糖肽的产生增加。利用α1,2-岩藻糖苷酶处理聚糖证实GDP-岩藻糖在胰高血糖素上的转移，图20。

图18表示具有人H抗原的糖基化TNFαFab重链。因此，在一个示例性实施方式中，本发明提供了一种用于包含人H抗原的TNFαFab重链的重组表达的方法。

原核表达系统

在优选的方面，本发明提供了一种糖蛋白的产生系统，该系统可作为克服与真核细胞培养系统或体外化学缀合有关的重大障碍一个有吸引力的解决方案。使用细菌作为产生载体预期可产生结构同源的糖蛋白，而同时显著降低了与蛋白质药物开发和制造有关的成本和时间。其他重要优点包括：(i)围绕细菌的基因操作的巨大数据容量；(ii)所建立的用于产生蛋白质的细菌的跟踪纪录--自2003年以来30％的由FDA批准的蛋白治疗剂是在大肠杆菌细菌中产生的；以及(iii)用于蛋白质药物的细菌产生的众多公司内的现有基础设施。

以前，已经显示出将外源聚糖附接到大肠杆菌中的受体蛋白上的能力(Wacker等，2002，中空肠弯曲杆菌中的N-连接糖基化及其功能转移进入大肠杆菌，科学(Science)，2002年11月29日；298(5599)：1790-3)。此外，已经证明了使用我们专有的C-末端Glyc标签、以位点定向的、化学计量方式将外源聚糖附接到重组蛋白上的能力(PCT/US2009/030110)。此外，已经描述了将脂质连接多糖(例如聚-FucNAc)附接到大肠杆菌中的受体蛋白上的能力(Feldman2005)。近来，Valderrama-Rincon等(Valderrama-Rincon等，“大肠杆菌中的工程化真核蛋白质糖基化途径”，自然化学生物学杂志(Nat.Chem.Biol.)AOP(2012))公开了一种用于大肠杆菌的胞质膜中的Und-PP上的Man₃GlcNAc₂的生物合成和组装的生物合成途径，然而，迄今为止，没有研究证明从简单发酵和纯化过程中的表达平台中直接重组生产BGA或PSA-缀合蛋白的能力。

核酸序列

在选择性实施方式中，本发明提供了分离的核酸分子、其变体、公开的基因的表达优化形式及其改进方法。

在一个实施方式中，提供了一种分离的核酸分子，该分离的核酸分子的核酸序列包含野生型编码序列的糖基转移酶基因同源物、变体和衍生物或由其组成。本发明提供了包含野生型基因的结构和功能优化版本的序列或由其组成的核酸分子。在一个优选的实施方式中，提供了包含优化对于底物的亲和力、特异性和/或底物催化转化率、改善不同pH值下的热稳定性和活性和/或优化密码子使用以用于在宿主细胞中的改善的表达的序列或由其组成的核酸分子以及同源物、变体和衍生物。

在另一实施方式中，提供了包含具有至少60％同一性的糖基转移酶基因的变体的序列或由其组成的核酸分子以及同源物、变体和衍生物。在另一实施方式中，提供了包含与野生型基因具有62％、65％、68％、70％、75％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、90％、92％、95％、98％、99％、99.9％或甚至更高的同一性的变体的序列或由其组成的核酸分子以及同源物、变体和衍生物。

在另一个实施方式中，这些编码的多肽与野生型基因具有至少50％，优选地至少55％、60％、70％、80％、90％或95％，更优选地98％、99％、99.9％或甚至更高的同一性。

还提供了在严格条件下与上述核酸分子杂交的核酸分子。如上述所定义以及如本领域中所熟知的，可在热熔点(Tm)以下约25℃处，对特异性DNA杂交体在一组特定的条件下进行严格杂交，其中Tm是50％的靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度。可在Tm以下约5℃的温度处，对特异性DNA杂交体在一组特定的条件下进行严格漂洗。

核酸分子包括DNA分子(例如线形的、圆形的、cDNA、染色体DNA、双链的或单链的)、RNA分子(例如tRNA、rRNA、mRNA)以及在此所述的采用核苷酸类似物的的DNA或RNA分子的类似物。本发明的分离的核酸分子包括该核酸来源的生物体的染色体DNA中的不含天然侧翼序列(即位于核酸分子的5’和3’端的序列)的核酸分子。在各种实施方式中，分离的核酸分子可以含有少于约10kb、5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb、0.1kb、50bp、25bp或10bp的该核酸分子所来源的微生物的天然侧翼核苷酸染色体DNA序列。

如本文所述的这些基因，包括核酸分子，例如，多肽或RNA编码核酸分子，是通过基因间DNA(例如天然侧翼于该基因和/或将生物体的染色体DNA中的基因分离的干扰DNA或间隔DNA)而与另一种基因或其他基因分离的。

还提供了包含上述核酸序列中的任何一个的片段的核酸分子。这些片段优选包含至少20个连续核苷酸。更优选的是，核酸序列的片段含有至少25个、30个、35个、40个、45个、50个、60个、70个、80个、90个、100个或甚至更多个连续核苷酸。

在另一个实施方式中，分离的编码核酸分子的糖基转移酶基因与具有序列表中所述的核苷酸序列的核酸分子的全部或一部分进行杂交，或与具有编码具有序列表中所述的任一氨基酸序列的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的核酸分子的全部或一部分进行杂交。这类杂交条件是本领域技术人员已知的(参见例如分子生物学现代方法(CurrentProtocolsinMolecularBiology)，Ausubel等人，编辑，约翰威立国际出版公司(JohnWileyandSons,Inc.)(1995)；分子克隆：实验室手册(MolecularCloning：ALaboratoryManual)，Sambrook等人，冷泉港出版社，冷泉港，纽约(1989))。在另一个实施方式中，分离的核酸分子包含与本文所述的编码核苷酸序列的neu或kps基因互补的核苷酸序列。

核酸序列片段在各种系统和方法中显示出通用性。例如，所述片段可以在各种杂交技术中用作探针。根据方法，靶核酸序列可以是DNA或RNA。靶核酸序列可以在杂交之前被分组(例如通过凝胶电泳)，或可原位对样品进行杂交。本领域技术人员将理解，发现已知序列的核酸探针在确定染色体结构(例如，通过DNA印迹法)以及测定基因表达(例如RNA印迹法)中是通用的。在这类实验中，优选地对这些序列片段进行检测标记，使得可以对它们与靶序列的特异性杂交进行检测以及可选地进行定量。本领域技术人员将理解，可以在各种各样在此未具体描述的印迹技术中使用这些核酸片段。

还应当理解，在此公开的核酸序列片段当被固定在微阵列上时还可用作探针。通过在支架底物上沉积并固定核酸来创建微阵列是公知的现有技术。参见：DNA微阵列：实用方法(实用方法系列)，Schena(编辑)，牛津大学出版社(OxfordUniversityPress)(1999)(ISBN：0199637768)；自然遗传学(NatureGenet.)21(l)(suppl)：l-60(1999)；微阵列生物芯片：工具和技术，Schena(编辑)，伊顿出版公司(EatonPublishingCompany)/《生物技术》(BioTechniques)分卷(2000)(ISBN：1881299376)，这些公开通过引用全文并入文中。例如采用包含核酸序列片段(如在此披露的核酸序列片段)的微阵列对基因表达进行分析，在细胞和分子生物学领域是一个用于序列片段的完善的手段。固定在微阵列上的序列片段的其他应用如以下所描述的：Gerhold等人，生物化学科学趋势(TrendsBiochem.Sci.)24：168-173(1999)以及Zweiger，《生物技术趋势》(TrendBiotechnol.)17：429-436(1999)；DNA微阵列：实用方法(实用方法系列)，Schena(编辑)，牛津大学出版社(1999)(ISBN：0199637768)；自然遗传学(NatureGenet.)21(l)(suppl)：l-60(1999)；微阵列生物芯片：工具和技术，Schena(编辑)，伊顿出版公司/《生物技术》(BioTechniques)分卷(2000)(ISBN：1881299376)，各公开通过引用全文并入文中。

如在本领域中熟知的，以不同方式对酶活性进行测定。例如，对OMP焦磷酸解作用进行光谱学追踪，Grubmeyer等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)268：20299-20304(1993)。可替选地，采用色谱技术(如通过高效液相色谱法)追踪酶活性，Chung和Sloan，层析杂志(J.Chromatogr.)371：71-81(1986)。作为另一种替代方案，通过测定由酶活性得到的产物的水平来间接测量该活性。更现代的技术包括：使用气相层析结合质谱测定(Niessen,W.M.A.(2001)，气相层析-质谱测定的当前实践(Currentpracticeofgaschromatography--massspectrometry)，纽约：马塞尔德克(MarcelDekker)(ISBN：0824704738))。用于鉴定重组蛋白的活性和产物的另外的现代技术包括：液相色谱-质谱(LCMS)、高效液相色谱(HPLC)、毛细管电泳、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)、核磁共振(NMR)、近红外(NIR)光谱、粘度测定法(Knothe,G.、R.O.Dunn和M.O.Bagby，1997，Biodiesel:Theuseofvegetableoilsandtheirderivativesasalternativedieselfuels，J.Am.Chem.Soc.Symp.Series，666：172-208)、基于物理性质的方法、湿化学法等，被用于对生物体产生的产物的水平和同一性进行分析。如本领域技术人员所知的，其他方法和技术也可以适用于酶活性的测定。

另一个实施方式包括突变体或嵌合核酸分子或基因。典型地，突变核酸分子或突变基因是由具有至少一种改变的核苷酸序列组成的，这种改变包括但不限于简单的替换、插入或缺失。所述突变体的多肽可以表现出不同于由野生型核酸分子或基因编码的多肽的活性。通常，嵌合突变多肽包括来自被基因改造成为与相应结构域共线的另一种多肽的整个结构域。优选地，突变核酸分子或突变基因编码一种多肽，该多肽具有提高的活性(如底物亲和力、底物特异性)、改善的热稳定性和不同pH下的活性、提高的溶解度、改进的表达或优化的密码子使用，以改进在宿主细胞中的表达。

分离多肽

在一个实施方式中，由核酸序列编码的多肽是通过重组DNA技术产生的，并且可以通过采用标准多肽纯化技术的适当的纯化方案从表达宿主细胞中分离。在另一个实施方式中，由核酸序列编码的多肽是采用标准肽合成技术化学合成的。

在本发明的范围内包括糖基转移酶多肽或作为衍生多肽的基因产物或由天然存在的细菌基因编码的基因产物。此外，在本发明范围之内包括：细菌来源的多肽或与野生型基因不同的基因产物，其包括的基因具有已改变、插入或删除的核酸但其编码的多肽在结构和/或功能上是基本相似的。

例如，可以清楚地认识到，本领域技术人员可以使由于遗传密码的简并为与通过天然存在的基因编码的氨基酸相同的氨基酸编码的核酸发生突变(例如取代)。这可能是所希望的，以便改善将要在特定的生物体中表达的核酸的密码子使用。同时，容易理解，本领域技术人员可以使为保守性氨基酸置换编码的核酸发生突变(例如取代)。进一步很好理解的是，本领域技术人员可以替换、添加或删除氨基酸到一定程度，与天然存在的基因产物相比能改进或至少非实质性地影响基因产物(例如糖基转移酶活性)的功能和/或结构，其各个实施例旨在被包括在本发明的范围之内。例如，在不同pH下的糖基转移酶活性、酶/底物亲和力、酶的热稳定性和/或酶的活性可以是未受影响的或合理改变的，并且可使用在此所述的测定法容易地进行评估。

在各个方面，提供了由核酸分子编码的分离多肽(包括突变蛋白、等位基因变体、片段、衍生物和类似物)。优选地，该分离多肽与底物亲和力和/或底物催化转化率优化的序列优选具有50％、60％-70％、70％-80％、80％-90％、90％-95％、95％-98％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或甚至更高的同一性。

根据其他实施方式，提供了包括上述多肽序列的片段的分离多肽。这些片段优选地包含至少20个连续氨基酸，更优选地包括至少25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100个或甚至更多个连续氨基酸。

这些多肽还包括上述多肽序列与异源多肽之间的融合体。异源序列可以例如包括设计为促进纯化(例如组氨酸标签)和/或重组表达蛋白的可视化的序列。蛋白融合体的其他非限制性实施例包括：允许在噬菌体或细胞的表面上显示所编码的蛋白、改变蛋白质的亚细胞定位、融合到本征荧光蛋白(如绿色荧光蛋白(GFP))以及融合到IgG的Fc区上的蛋白融合体。

分泌信号序列

在所选择的实施方式中，寡糖缀合多肽用一种分泌信号序列来表达。该分泌信号可以是有利于跨膜转运的氨基末端序列。在宿主生物体是原核生物体的实施方式中，分泌信号是蛋白的便于插入膜或通过膜来转运的先导肽结构域。在跨过内膜后去除该信号序列，并且蛋白质可被保留在周质间隙中。

使用各种分泌信号，例如pelB。Lei等人在自然杂志(Nature)331:543-546(1988)中对胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwiniacarotova)的两个PelB基因产物变体的分泌信号结构域的预测氨基酸残基序列进行了描述。PelB蛋白的前导序列以前已被用作融合蛋白的分泌信号(Better等人，科学杂志(Science)，240：1041-1043(1988)；Sastry等人，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，86：5728-5732(1989)；以及Mullinax等人，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，87：8095-8099(1990))。可用于本发明的来自于大肠杆菌的其他分泌信号多肽结构域的氨基酸残基序列包括在以下文献中描述的序列：Oliver，大肠杆菌和鼠伤寒沙门菌(EscherichiacoliandSalmonellaTyphimurium)，Neidhard，F.C.(编辑)，《美国微生物学会》(AmericanSocietyforMicrobiology)，华盛顿(Washington,D.C.)，1：56-69(1987)。

另一个典型的分泌信号序列是基因III(gill)分泌信号。基因HI编码Pill，Pill来自于丝状噬菌体fd的次要衣壳蛋白之一(与Ml3和rl相似)。Pill利用18氨基酸、氨基末端信号序列合成，并且需要细菌Sec系统用于插入到膜中。

另一个典型的分泌信号序列是SRP分泌信号。例如为了改善用于噬菌体展示的融合蛋白的产生，已经使用了SRP分泌信号(Steiner等，自然生物技术(Nat.Biotechnology)，24：823-831(2006))。最常使用的II型分泌信号，如PelB分泌信号，使用该SecB途径。因此，在此呈现的用于人mAb重链和轻链表达的分泌构建体采用SRP分泌信号，称为大肠杆菌的dsbA基因的分泌信号。在这些方法中可以采用其他SRP分泌信号，在此提供的多核苷酸和多肽包括SfmC(分子伴侣)、ToIB(转运蛋白)和TorT(呼吸调节剂)。这些信号的序列是本领域已知的。

通过大肠杆菌SecB机制的分泌涉及新生多肽首先附着到触发因子上、然后附着到SecB上。该ScB蛋白然后引导使完整的多肽附着到II型分泌复合物上，该II型分泌复合物将蛋白质分泌到周质中。在没有被理论约束的情况下，认为某些重组蛋白可以折叠成通过该机制分泌很差的形式。与此相反，该SRP机制识别不同组的分泌信号，并且通过该II型分泌复合物引导新生多肽共转译和分泌进入周质。这种机制可以用来避免在通过SecB通路的分泌中可能发生的问题。

对于本领域的普通技术人员显而易见的是，任何合适的分泌信号序列可用于促进所表达的多肽的分泌。

将蛋白质分泌到周质和培养基中

为了确定活性抗体被分泌到培养基中，对于在各种P构建体的表达分析过程中收集的培养基样品通过ELISA测定其抗原结合活性。

本发明的多核苷酸或核酸分子指的是长度至少为10个碱基的核苷酸的聚合型。这些包括DNA分子(例如线形的、环形的、cDNA的、染色体的、基因组的或合成的、双链的、单链的、三链的、四倍体的、部分双链的、支链的、发夹式的、环形的或一种荷包锁构象)、和RNA分子(例如tRNA、rRNA、mRNA、基因组的或合成的)、和所述DNA或RNA分子的类似物以及含有非天然核苷酸类似物、非天然核苷间键或两者的DNA或RNA的类似物。本发明的分离的核酸分子包括该核酸来源的生物体的染色体DNA中的不含天然侧翼序列(即位于核酸分子的5’和3’端的序列)的核酸分子。在各种实施方式中，分离的核酸分子可以含有少于约10kb、5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb、0.1kb、50bp、25bp或10bp的该核酸分子所来源的微生物的天然侧翼核苷酸染色体DNA序列。

异源核酸分子在适当的正义(5’-3’)取向上相对于该启动子及任何其他5’调控分子和正确的阅读框插入到该表达系统或载体中。可以采用本领域中公知的标准克隆方法制备这些核酸构建体，如由Sambrook等人在分子克隆：实验室手册(MolecularCloning:ALaboratoryManual)(冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(1989))中所述的，将通过引用全部并入文中。美国专利号4,237,224，Cohen和Boyer，通过引用全部并入文中，也描述了采用限制酶裂解和使用DNA连接酶的连接而产生重组质粒形式的表达系统。可替代地可以使用酵母中的同源重组来制备核酸构建体，如Shanks等人(AEM，72,2，(2006))所述的。

合适的表达载体包括含有复制子以及来源于与宿主细胞相配的物种的控制序列的表达载体。例如，如果使用大肠杆菌作为宿主细胞，则可以使用质粒，如pUC19、pUC18或pBR322。在分子克隆：实验室手册(MolecularCloning：ALaboratoryManual)第3版(Sambrook和Russell，2001年，冷泉港实验室出版社)中描述了其他合适的表达载体，在此通过引用全部并入文中。在分子生物学现代方法(CurrentProtocolsinMolecularBiology)(Ausubel等人编辑，(1992))中详细描述了例如在核酸构建体的制备、诱变、测序、将DNA引入细胞和基因表达以及蛋白质分析中用于核酸操作的许多已知的技术和方案，在此通过引用全部并入文中。

不同的遗传信号和加工事件对多层水平的基因表达(例如DNA转录和信使RNA(“mRNA的”)的转译)进行控制，并且随后对显示在核糖体表面上的融合蛋白的量进行控制。DNA的转录取决于启动子的存在，该启动子是对RNA聚合酶的结合进行引导的一个DNA序列，从而促进mRNA的合成。启动子的“强度”(即其促进转录的能力)有所不同。出于对克隆基因进行表达的目的，经常希望使用强启动子以获得高水平转录，因而获得高水平的表达和表面呈现。因此，根据所利用的宿主系统，众多合适的启动子中的任何一个也可以结合到携带对偶联到失速序列上的目标蛋白质进行编码的脱氧核糖核酸分子的表达载体上。例如，当使用大肠杆菌或其噬菌体或质粒时，可以使用启动子来引导高水平的邻接DNA片段的转录，这些启动子如T7噬菌体启动子、lac启动子、trp启动子、recA启动子、核糖体RNA启动子、大肠杆菌噬菌体lambda及其他(包括但不限于lacUV5、ompF、bla、lpp等)的P_R和P_L启动子等。此外，可采用杂合trp-lacUV5(tac)启动子或其他通过重组DNA或其他合成DNA技术产生的大肠杆菌启动子来提供插入基因的转录。

mRNA在原核生物中的转译取决于合适的原核生物信号的存在，其不同于真核生物的信号。mRNA在原核生物中的有效转译需要该mRNA上的被称为Shine-Dalgarno(“SD”)序列的核糖体结合位点。这个序列是位于起始密码子之前的mRNA的一个很短的核苷酸序列，通常是AUG，其编码蛋白质的氨基末端蛋氨酸。该SD序列是与16SrRNA(核糖体RNA)的3’末端互补的，并且很可能通过与rRNA形成双链以允许该核糖体的正确定位来促进mRNA的结合至核糖体。关于使基因表达最大化的综述，参见Roberts和Lauer，酶学方法(MethodsinEnzym，68：473(1979)，在此通过引用全部并入文中。

宿主细胞

按照本发明，宿主细胞可以是原核生物细胞。这类细胞作为用于重组蛋白的表达的宿主而用于产生目标重组治疗性蛋白质。示例性的宿主细胞包括大肠杆菌(E.coli)以及肠杆菌(Enterobacteriaceae)、埃希氏菌属(Escherichiasp.)、弯曲杆菌属(Campylobactersp.)、沃廉菌属(Wolinellasp.)、硫弧菌属(Wolinellasp.)、弧菌属(Vibriosp.)、假单胞菌属(Pseudomonassp.)、芽孢杆菌属(Bacillussp.)、李斯特菌属(Listeriasp.)、葡萄球菌属(Staphylococcussp.)、链球菌属(Streptococcussp.)、消化链球菌属(Peptostreptococcussp.)、巨球型菌(Megasphaerasp.)、梳状菌属(Pectinatussp.)、月形单胞菌属(Selenomonassp.)、嗜发酵菌属(Zymophilussp.)、放线菌属(Actinomycessp.)、节杆菌属(Arthrobactersp.)、弗兰克氏菌属(Frankiasp.)、单孢丝菌属(Micromonosporasp.)、诺卡尔菌属(Nocardiasp.)、丙酸杆菌属(Propionibacteriumsp.)、链霉菌属(Streptomycessp.)、乳杆菌属(Lactobacillussp.)、乳球菌属(Lactococcussp.)、明串珠菌属(Leuconostocsp.)、片球菌属(Pediococcussp.)、醋酸杆菌属(Acetobacteriumsp.)、真细菌属(Eubacteriumsp.)、螺杆菌属(Heliobacteriumsp.)、Heliospirillum属(Heliospirillumsp.)、鼠孢菌属(Sporomusasp.)、螺原体属(Spiroplasmasp)、脲原体属(Ureaplasmasp.)、丹毒丝菌属(Erysipelothrix,sp.)、棒状杆菌属(Corynebacteriumsp.)、肠球菌属(Enterococcussp.)、梭菌属(Clostridiumsp.)、支原体属(Mycoplasmasp.)、分枝杆菌属(Mycobacteriumsp.)、放线菌属(Actinobacteriasp.)、沙门氏菌属(Salmonellasp.)、志贺氏菌属(Shigellasp.)、莫拉氏菌属(Moraxellasp.)、幽门螺杆菌属(Helicobactersp.)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonassp.)、微球菌属(Micrococcussp.)、奈瑟氏球菌属(Neisseriasp.)、蛭弧菌属(Bdellovibriosp.)、嗜血杆菌属(Hemophilussp.)、克雷伯氏菌属(Klebsiellasp.)、奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)、阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae.)、柠檬酸杆菌属(Citrobactersp.)、变形杆菌属(Proteussp.)、沙雷氏菌属(Serratiasp.)、耶尔森氏菌属(Yersiniasp.)、不动杆菌属(Acinetobactersp.)、放线杆菌属(Actinobacillussp.)、博德特菌属(Bordetellasp.)、布鲁氏菌属(Brucellasp.)、噬二氧化碳细胞菌属(Capnocytophagasp.)、心杆菌属(Cardiobacteriumsp.)、艾肯菌属(Eikenellasp.)、弗朗西斯菌属(Francisellasp.)、嗜血杆菌属(Haemophilussp.)、金氏菌属(Kingellasp.)、巴斯德氏菌属(Pasteurellasp.)、黄杆菌属(Flavobacteriumsp.)、黄单胞菌属(Xanthomonassp.)、伯克霍尔德菌属(Burkholderiasp.)、气单胞菌属(Aeromonassp.)、邻单胞菌属(Plesiomonassp.)、军团病杆菌属(Legionellasp.)以及α-变形菌，如沃尔巴克体属(Wolbachiasp.)、蓝细菌、螺旋体属细菌、绿硫细菌和绿色非硫细菌、苛求的革兰阴性球菌和革兰阴性杆菌、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)葡萄糖发酵革兰阴性杆菌、革兰阴性杆菌-非葡萄糖发酵菌、葡萄糖发酵的、氧化酶阳性的革兰阴性杆菌。

在本发明的一个实施方式中，采用大肠杆菌宿主菌株C41(DE3)，因为此菌株已经被事先优化用于一般膜蛋白的过度表达(Miroux等人，“大肠杆菌中的蛋白质的过度产生：允许在高水平下合成某些膜蛋白和球状蛋白的突变宿主”，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)，260：289-298(1996)，在此通过引用全部并入文中)。宿主菌株的进一步优化包括编码DnaJ蛋白(例如A.dnaJ细胞)的基因的缺失。这种缺失的原因是：已知dnaJ的失活增加过表达的膜蛋白的积聚并抑制通常与膜蛋白过度表达有关的严重的细胞毒性(Skretas等人，“大肠杆菌中G蛋白缀合受体表达的遗传分析：DnaJ对于人中枢大麻素受体的膜整合的抑制作用”，生物技术与生物工程(BiotechnolBioeng)(2008)，在此通过引用全部并入文中)。申请人已经观察到Algl和Alg2的以下表达。此外，可能需要竞争糖生物合成反应的缺失来确保N-聚糖生物合成的最优水平。例如，大肠杆菌O抗原生物合成途径中的基因的缺失(Feldman等人，“参与大肠杆菌O抗原组装的假定的聚异戊二烯连接的糖转位酶(Wzx)的活性不依赖于O重复单位的化学结构”，生物化学杂志(JBiolChem)274：35129-35138(1999)，在此通过引用全部并入文中)会确保细菌萜醇-GlcNAc-PP底物可用于其他反应。为了消除不想要的副反应，下述是可以从大肠杆菌宿主菌株中去除的有代表性的基因：wbbL、glcT、glf、gafT、wzx、wzy、waaL、nanA、wcaJ。

采用表达载体转化/转染宿主细胞的方法是本领域公知的，并且取决于所选择的宿主系统，如在Sambrook等人的分子克隆：实验室手册(冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(1989年))中所描述的。对于真核细胞，合适的技术可包括磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖、电穿孔、脂质体介导的转染以及采用逆转录病毒或用于昆虫细胞的其他病毒(例如牛痘、杆状病毒)的转导。对于细菌细胞，合适的技术可包括氯化钙转化、电穿孔以及使用噬菌体的转染。

本发明的一个方面是一种糖蛋白缀合物，该糖蛋白缀合物包含蛋白和至少一种与该蛋白融合的肽，该肽包含一个D-X₁-N-X₂-T部分，其中，D是天冬氨酸，X₁和X₂是除了脯氨酸以外的任何氨基酸，N是天冬酰胺，T是苏氨酸。

各种宿主细胞可用于重组产生PSA。在选择的实施方式中，对宿主细胞进行遗传修饰以去除现有的天然糖基转移酶，并进行工程化以表达本发明的用于PSA产生的糖基转移酶。为了去除现有的糖基化，例如，对真核宿主细胞进行工程化以表达内切糖苷酶或酰胺酶，这些酶在最内侧GlcNAc与天冬酰胺残基之间将高甘露糖、混合型和复合寡糖从N-连接糖蛋白上裂解下来。由于糖基化是至关重要的，人们不可能完全消除天然聚糖。在其他实施方式中，承载聚糖的唾液酸可以在宿主细胞中进行工程化，并用作如ST8SiaII、ST8SiaIV或NeuS等聚唾液酸化的底物以将多个α2-8唾液酸转移到受体N-聚糖上。

在优选的方面，本发明提供了用于各种糖蛋白的体内重组产生的方法。在一个实施方式中，PSA缀合高血糖素肽是在糖工程化的大肠杆菌中产生的。采用糖基化标签(GlycTag)[PCT/US2009/030110]，对来自具有PSA遗传机制的糖工程化的大肠杆菌的胰高血糖素肽进行表达和纯化。PSA的缀合是采用市售的抗PSA抗体通过蛋白质印迹分析来证实的。

替代的表达系统

可以采用真核表达系统，如哺乳动物、酵母、真菌、植物或昆虫的细胞，来产生PSA缀合蛋白。在这些实施方式中，也可以为了减少工程化聚糖途径的干扰而破坏天然糖基化途径。

使用酵母或真菌系统产生PSA

已经在毕赤酵母(P.pastoris)中证明了唾液酸转移酶的表达(Hamilton等人，“酵母的人源化以产生复合终末唾液酸化糖蛋白”，科学杂志(Science)，第313卷，第1441-1443页(2006))。通过对大肠杆菌neuA、neuB和neuC基因进行扩增，显示CMP-唾液酸池在酵母中积聚。酵母或其他真菌系统是适宜的表达宿主以表达用于产生人抗原或PSA的各种糖基转移酶。

在植物细胞(例如烟草、浮萍或藻类)中PSA操纵子的表达

如在美国专利号6,040,498中所描述的，可以同时使用农杆菌和冲击法对浮萍(水萍)进行转化。采用所述的方案，对浮萍进行转化，并且将所得的寡糖组合物转移到靶蛋白上。可对转基因植物进行测定，用于根据已知的筛选技术使用所需的人抗原或PSA残基产生蛋白质的转基因植物。

使用昆虫细胞系统产生PSA

本发明可用于来源于Sf9细胞的代谢转化的细胞系。基于其与哺乳动物细胞相比对于蛋白的克隆、表达与纯化相对容易，Sf9已被用来作为用于重组蛋白(如尤其干扰素、IL-2、纤溶酶原激活物)的产生宿主。与许多脊椎动物细胞相比，Sf9更易接受编码重组蛋白的外源基因，因为它非常容易接受病毒感染和复制[BishopD.H.L.和PosseeR.D.，先进基因技术(Adv.GeneTechnoL)，1，55，(1990)]。在Sf9中重组蛋白的表达水平是非常高的，可以接近500mg/L[Webb,N.R.和Summers,M.D，技术杂志(Technique)，2，173(1990)]。该细胞系进行了若干关键的转译后修饰；然而，它们与脊椎动物中的细胞系是不相同的，因此可以改变蛋白质的功能[Fraser,M.J.，体外细胞发育生物学(InVitroCell.Dev.Biol)，25，225(1989)]。尽管如此，在昆虫细胞中经历了转译后修饰的大多数重组蛋白质在免疫上和功能上与其天然负体相似[Fraser,M.J.，体外细胞发育生物学(InVitroCell.Dev.Biol)，25，225(1989)]。相比于动物细胞培养，通过对相对较低水平的蛋白酶进行表达并且与天然蛋白表达相比具有较高的重组率，Sf9有利于蛋白质的纯化[Goswami,B.B.和Glazer,R.O.，生物技术(BioTechniques)，10，626(1991)]。

杆状病毒作为表达系统用于在昆虫细胞中产生重组蛋白。这些病毒对于特定种类的昆虫是致病的，从而导致细胞裂解[Webb,N.R.和Summers,M.D.，技术杂志(Technique)，2，173(1990)]。

通过病毒感染或稳定转化来实现昆虫细胞中的重组蛋白表达。对于前者，将所需的基因克隆到杆状病毒中的野生型多角体基因的位点[Webb,N.R.和Summers,M.D.，技术杂志(Technique)，2，173(1990)；BishopD.H.L.和PosseeR.D.，先进基因技术(Adv.GeneTechnoL)，1，55，(1990)]。该多角体基因对于杆状病毒的感染或复制是非必需的。它是一种在封装病毒颗粒的包藏物中的蛋白质外壳的主要成分。当在多角体基因中形成缺失或插入时，不能形成包藏物。包藏阴性的病毒产生具有与野生型病毒不同的形态差异。这些差异使研究人员能够识别和纯化重组病毒。在杆状病毒中，克隆的基因处于多角体启动子的控制下，该多角体启动子是对表征该系统的高表达水平的重组蛋白质负责的一种强启动子。重组蛋白的表达典型地是在病毒感染后24小时之内开始，并在Sf9培养物溶解时72小时后终止。

稳定转化的昆虫细胞提供了一种用于重组蛋白质产生的替代的表达系统[Jarvis,D.L.、Fleming,J.-A.G.W.、Kovacs,G.R.、Summers,M.D.和Guarino,L.A.，生物技术(Biotechnology)，8，950(1990)；Cavegn,C、Young,J.、Bertrand,M.和Bernard,A.R.，在动物细胞技术中：今天的产品，明天的希望，Spier,R.E.、Griffiths,J.B.和Berthold,W.编辑(巴特沃思-海纳曼出版社(Butterworth-Heinemann)，牛津(Oxford)，1994，第43-49页)]。在这些细胞中，目的基因是在没有病毒感染的条件下持续表达的。当重组蛋白产生需要对杆状病毒缺乏抵抗力的细胞过程时，稳定转化在病毒感染时是有利的。这在例如Sf9细胞分泌重组人组织纤溶酶原激活物的过程中发生[Jarvis,D.L.、Fleming,J.-A.G.W.、Kovacs,G.R.、Summers,M.D.和Guarino,L.A.，生物技术(Biotechnology)，8，950(1990)]。因为在该系统中的蛋白质表达是瞬时的，故当重组蛋白质具有细胞毒性时，病毒感染是有利的。

已经产生了用于体外培养的昆虫细胞，并且一些细胞系是可商购的。此过程包括使用能够如在此所述进行培养的昆虫细胞，无论其来源是什么。优选的细胞系是鳞翅目(Lepidoptera)Sf9细胞。其他细胞系包括欧洲细胞培养物保藏中心(EuropeanCollectionofCellCultures)的果蝇细胞(索尔兹伯里(Salisbury)，英国)或英杰公司(InvitrogenCorp.)包括高五(HighFive)的粉纹夜蛾(cabbagelooperTrichoplusiani)(圣迭戈，加利福尼亚州)。英杰公司或美国种质保存中心(AmericanTypeCultureCollection)(罗克维尔，马里兰州)的Sf9昆虫细胞是优选的细胞系，并且在从JRH生物科技公司(JRHBiosciences)(莱内克萨，堪萨斯州)购得的无血清EX-CELL401培养基中自由悬浮的生物反应器中培养并保持在27℃下。

寡糖组合物

原核生物系统可以相对较高的收率产生同源聚糖。在优选的实施方式中，该寡糖组合物包括至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％(摩尔)的单一糖型或基本上由其组成。在进一步的实施方式中，该寡糖组合物基本上是由至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％(摩尔)的两种目标糖型组成。在又进一步的实施方式中，该寡糖组合物基本上是由至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％(摩尔)的三种目标糖型组成。本发明因此提供了大量的新型寡糖组合物的立体定向生物合成以及包括用于BGA和PSA的聚糖的N-连接糖蛋白。对聚糖或糖蛋白的同质性和收率进行估算的方法可以包括质谱法、NMR、凝集素印迹法、荧光辅助糖电泳(FACE)或色谱方法[16-18]。

选择的PSA寡糖组合物，包括：

(Siaα2,8)_n-Siaα2,8-Siaα2,3-Galβ1,3-GalNAcα1,3-GalNAcα1,3-GlcNAc；(Siaα2,8)_n-Siaα2,8-Siaα2,3-Galβ1,3-GalNAcα1,3-GlcNAc；(Siaα2,8)_n-Siaα2,8-Siaα2,3-Galβ1,3-(GalNAcl,3)_n-GlcNAc。

选择的唾液酸化T抗原寡糖组合物，包括：

Siaα2,3-Galβ1,3-GalNAcα1,3-GlcNAc；Siaα2,3-Galβ1,3-GalNAcα1,3-GalNAcαl,3；Siaα2,6-Galβ1,3-GalNAcα1,3-GlcNAc。

选择的H抗原寡糖组合物，包括：

Fucα1,2-Galβ1,3-GalNAcα1,3-GlcNAc；Fucα1,2-Galβ1,3-GalNAcα1,3-GalNAc。

选择的T抗原寡糖组合物，包括：

Galβ1,3-GalNAcα1,3-GlcNAc；和Galβ1,3-GalNAcα1,3-GalNAcα1,3。

其他选择的PSA寡糖组合物，包括：

[βGlcNAc][αGalNAc][βGalNAc]Gal[β1,3][α(2→3)Neu5Ac]_n；[α(2→6)Neu5Ac]_n；[α(2→8)Neu5Ac]_n；[α(2→8)Neu5Ac-α(2→9)Neu5Ac]或[α(2→9)Neu5Ac]_n。

使用本发明的方法和组合物产生的各种不同的寡糖组合物包括但不限于以下所述：

(Siaα2,8)_n–Siaα2,8–Siaα2,3–Galβ1,3–GalNAcα1,3–GalNAcα1,3–GlcNAcβ1-；

(Siaα2,8)_n–Siaα2,8–Siaα2,3–Galβ1,3–GalNAcα1,3–GlcNAcβ1-；

(Siaα2,8)_n–Siaα2,8–Siaα2,3–Galβ1,3–GalNAcα1,3–GalNAcα1-；

(Siaα2,8)_n–Siaα2,8–Siaα2,3–Galβ1,3–GalNAcα1,3–Bacα1-；

Siaα2,8–Siaα2,3–Galβ1,3–GalNAcα1,3–GlcNAcβ1-；

Siaα2,8–Siaα2,3–Galβ1,3–GalNAcα1,3–GalNAcα1-；

Siaα2,8–Siaα2,3–Galβ1,3–GalNAcα1,3–Bacα1-；

Siaα2,3–Galβ1,3–GalNAcα1,3–GlcNAcβ1-；

Siaα2,3–Galβ1,3–GalNAcα1,3–GalNAc1-；

Siaα2,3–Galβ1,3–GalNAcα1,3–Bacα1-；

Siaα2,6–Galβ1,3–GalNAcα1,3–GlcNAcβ1-；

Siaα2,6–Galβ1,3–GalNAcα1,3–GalNAcα1-；

Siaα2,6–Galβ1,3–GalNAcα1,3–Bacα1-；

Fucα1,2–Galβ1,3–GalNAcα1,3–GlcNAcβ1-；

Fucα1,2–Galβ1,3–GalNAcα1,3–GalNAcα1-；

Fucα1,2–Galβ1,3–GalNAcα1,3–Bacα1-；

Galα1,3[Fucα1,2]Galβ1,3–GalNAcα1,3–GlcNAcβ1-；

Galα1,3[Fucα1,2]Galβ1,3–GalNAcα1,3–GalNAcα1-；

Galα1,3[Fucα1,2]Galβ1,3–GalNAcα1,3–Bacα1-；

GalNAcα1,3[Fucα1,2]Galβ1,3–GalNAcα1,3–GlcNAcβ1-；

GalNAcα1,3[Fucα1,2]Galβ1,3–GalNAcα1,3–GalNAcα1-；

GalNAcα1,3[Fucα1,2]Galβ1,3–GalNAcα1,3–Bacα1-；

Galβ1,4[Fucα1-3]GlcNAcβ1,3–Galβ1,3–GlcNAcβ1-；

Galβ1,4[Fucα1-3]GlcNAcβ1,3–Galβ1,3–GalNAcα1-；

Galβ1,4[Fucα1-3]GlcNAcβ1,3–Galβ1,3–Bacα1-；

Galβ1,3–GalNAcα1,3–GlcNAcβ1-；

Galβ1,3–GalNAcα1,3–Bacα1-；和

Galβ1,3–GalNAcα1,3–GalNAc1-。

靶糖蛋白

根据本发明可以产生合适的靶糖蛋白的各种实施例，包括但不限于：细胞因子(如干扰素)，G-CSF，凝血因子(如因子VIII、因子IX和人蛋白C)，可溶性IgE受体α-链，IgG，IgG片段，IgM，白细胞介素，尿激酶，胃促胰酶和尿素胰蛋白酶抑制剂，IGF结合蛋白，表皮生长因子，生长激素释放因子，膜联蛋白V融合蛋白，血管抑素，血管内皮生长因子-2，骨髓祖抑制因子-1，骨保护素，α-1抗胰蛋白酶，DNA酶II，α-胎蛋白，AAT，rhTBP-1(又名TNF结合蛋白1)，TACI-Ig(跨膜激活物和钙调节物以及亲环配体相互作用物)，FSH(卵泡刺激素)，GM-CSF，胰高血糖素，胰高血糖素肽，GLP-1W型/和W/O型FC(胰高血糖素样蛋白1)，GLP-1受体激动剂(例如艾塞那肽)，直接凝血酶抑制剂(例如比伐卢定)，IGF-1(例如美卡舍明)，甲状旁腺激素(例如特立帕肽)，血浆激肽释放酶抑制剂(例如艾卡拉肽)，IL-I受体激动剂，sTNFr(又名可溶性TNF受体Fc融合)，CTLA4-Ig(细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4-Ig)，受体，激素(如人生长激素)，促红细胞生成素，肽，钉合肽，人用疫苗，动物疫苗，血清白蛋白以及酶(如ATIII、重组人凝血酶、葡糖脑苷脂酶和天冬酰胺酶)。

抗体及其片段，以及更具体地，Fab片段，如阿达木单抗(adalimumab)、阿托木单抗(atorolimumab)、夫苏木单抗(fresolimumab)、高利单抗(golimumab)、乐地单抗(lerdelimumab)、美替木单抗(metelimumab)、莫罗木单抗(morolimumab)、西法木单抗(sifalimumab)、伊匹单抗(ipilimumab)、曲美木单抗(tremelimumab)、柏替木单抗(bertilimumab)、比阿克单抗(briakinumab)、康纳单抗(canakinumab)、非扎奴单抗(fezakinumab)、优特克单抗(ustekinumab)、阿德木单抗(adecatumumab)、贝利单抗(belimumab)、西妥木单抗(cixutumumab)、可那木单抗(conatumumab)、芬妥木单抗(figitumumab)、英妥木单抗(intetumumab)、伊妥木单抗(iratumumab)、来沙木单抗(lexatumumab)、鲁卡木单抗(lucatumumab)、马帕木单抗(mapatumumab)、奈昔木单抗(necitumumab)、奥法木单抗(ofatumamb)、帕尼单抗(panitumumab)、普托木单抗(pritumumab)、利妥木单抗(rilotumumab)、罗妥木单抗(robatumumab)、伏妥莫单抗(votumumab)、扎妥木单抗(zalutumumab)、扎木单抗(zanolimumab)、德尼单抗(denosumab)、司他芦单抗(stamulumab)、依芬古单抗(efungumab)、艾韦单抗(exbivirumab)、夫瑞韦如(foravirumab)、利韦单抗(libivirumab)、瑞非韦鲁(rafivirumab)、瑞加韦单抗(regavirumab)、司韦单抗(sevirumab)、妥韦单抗(tuvirumab)、奈巴库单抗(nebacumab)、帕诺库单抗(panobacumab)、雷昔库单抗(raxibacumab)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、甘替鲁单抗(gantenerumab)。

由于其亲本杂交瘤来源、分子的复杂性以及单克隆抗体的糖基化的可取性，全长单克隆抗体历来是在哺乳动物细胞培养中产生的。通常，大肠杆菌是用于如Fv、scFv、Fab或F(ab’)₂等抗体片段的表达的宿主系统的选择。这些片段可相对快速地大量制成，保留有抗原结合活性。然而，由于抗体片段缺少Fc结构域，它们不与FcRn受体结合并被迅速清除。全长抗体链也可以在大肠杆菌中表达为不溶性聚集物，然后在体外重新折叠，但是此方法的复杂性限制了其有用性。因此，在周质中产生抗体。

相比于用于对抗体片段进行表达的细菌系统的广泛用途，已经有一些尝试来在大肠杆菌中表达并以高收率回收功能完整的抗体。由于这些复杂特征以及较大的完整抗体，常常难以实现所表达的轻链和重链多肽的正确折叠和装配，这导致了重构的四聚抗体的收率较差。此外，在原核生物中取得的抗体不是糖基化的。由于Fc受体介导的活性需要糖基化，传统上认为大肠杆菌不会是用于制造完整抗体的有用的系统。(Pluckthun和Pack(1997)，免疫技术(Immunotech)3：83-105；Kipriyanov和Little(1999)，分子生物技术(Mol.Biotech.)12：173-201)。重组寡糖合成改变了这种范式。

研究和临床研究的最新进展表明，在许多情况下，与抗体片段相比，优选完整抗体。含有Fc区的完整抗体趋于更耐受体内降解和清除，从而在循环中具有较长的生物半衰期。此特征是尤其可取的，其中该抗体作为治疗剂用于需要持续治疗的疾病。

目前，抗TNF抗体是在哺乳动物细胞中产生的，并且被糖基化。在哺乳动物细胞中(经常是在CHO细胞中)产生抗体的成本较高，并且过程复杂。抗体的糖基化有两个作用：第一，它可以增加血清中的抗体的寿命，以便其循环很多天或甚至数周。这可能是因为肾清除率降低，或是因为对蛋白酶解具有更大的耐受性。第二，如在此所提供的，抗体的恒定区中的糖基化对于激活抗体的“效应子功能”很重要，当抗体结合到附着于细胞表面上的靶标时使其触发。这些功能都与免疫系统的活化有关，并可导致自然杀伤细胞(NK)介导的细胞杀伤。

本发明部分涉及包含表征为具有增强的药物动力学性质(如血清半衰期改善、稳定性提高，免疫原性的或非免疫原性的或不正当期望的免疫应答降低)的肽的糖蛋白组合物。实施例19提供了包含H抗原的重组表达的人生长激素胎盘变种(GH2)。图21表示与具有H抗原的GH2糖基化相关的质量。如图22对稳定性和结合进行测定。在某些实施方式中，糖蛋白组合物被构造成具有与未糖基化肽相比降低的或增加的相应肽的靶受体的结合亲和力。

本发明还提供表征为血清持久性增加的新型肽，如在实施例20中详尽描述的。大鼠模型的体内半衰期检测提供了与未糖基化的GH2相比包含H抗原的GH2的血清持久性增加的证据，如在图23中所证明的。因此，本发明部分地证明，这些糖蛋白具有增强的药物动力学性质，如血清半衰期提高、稳定性提高，免疫原性的或非免疫原性的或不正当期望的免疫应答降低。

药物组合物以及药物的给药

本发明的另一个方面是如上定义的组合物，该组合物是一种药物组合物，并且还包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。该药物组合物可以是水性悬浮液的形式。水性悬浮液含有该新型化合物，该化合物混有适于制备水性悬浮液的赋形剂。这些药物组合物可以是无菌可注射水性或均质悬浮液的形式。这种悬浮液可以按照本领域中已知的使用适当的分散剂或湿润剂以及悬浮剂来配制。

药物组合物可以通过口服、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、鼻内、皮内、局部或气管内给药而用于人或兽用。

本发明的蛋白质、肽、抗体和抗体部分可以包含在适于给予对象的药物组合物中。典型地，该药物组合物包含本发明的抗体或抗体部分以及药学上可接受的载体。如在此所使用的，“药学上可接受的载体”包括任何以及全部的生理学上相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药学上可接受的载体的实施例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等中的一种或多种及其组合。在许多情况下，优选将等渗剂，例如糖、多元醇(例如甘露醇、山梨醇)或氯化钠包括在该组合物中。药学上可接受的物质或少量的助剂物质(例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液)增加了该蛋白质、肽、抗体或抗体部分的保质期或有效性。

本发明的组合物可以是各种形式的。这些包括例如液体、半固体和固体剂型，例如液体溶液(例如可注射溶液和可输注溶液)、分散体或悬浮液、片剂、丸剂、粉剂、脂质体和栓剂。该优选形式取决于给药和治疗应用的预期方式。典型的优选组合物的形式是可注射溶液或可输注溶液，如与用于使用其他抗体的人被动免疫中的组合物相似的组合物。给药的优选方式是肠胃外给药(例如静脉内、皮下、腹膜内、肌内给药)。在一个优选的实施方式中，通过静脉内输注或注射给予该抗体。在另一个优选的实施方式中，通过肌肉注射或皮下注射给予该抗体。

治疗性组合物典型地必须在制造以及储存条件下是无菌并且稳定的。该组合物可以配制为一种溶液、微乳液、分散液、脂质体或适合于高药物浓度的其他有序结构。无菌可注射溶液可通过将所需量的该活性化合物(即蛋白、肽、抗体或抗体部分)根据需要与以上列举的成分中的一种或其组合一起并入适当溶剂中、随后过滤灭菌来制备。通常，分散液通过将该活性化合物并入一种无菌媒介物中来制备，该无菌媒介物包含一种基础分散介质以及来自以上列举的那些成分的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，所述方法从其先前的无菌过滤溶液中产生活性成分和任何其他所需的成分的粉末。溶液的适当流动性可以例如通过使用一种包衣(例如卵磷脂)在分散液的情况下通过维持所需粒径以及通过使用表面活性剂来维持。可以通过在该组合物中包括例如单硬脂酸盐以及明胶的延迟吸收的药剂来实现可注射组合物的延长的吸收。

本发明的蛋白质、肽、抗体和抗体部分可以通过多种本领域已知的方法来给药，尽管对于许多治疗应用来说，优选的给药途径/模式是静脉注射或输液。如被技术人员所理解的，给药途径和/或给药模式将取决于所希望的结果而变化。在某些实施方式中，该活性化合物可以使用一种保护该化合物(例如控释制剂，包括植入物、经皮贴片以及微囊化递送系统)免于快速释放的载体来制备。可以使用可生物降解的、生物相容的聚合物，如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯以及聚乳酸。用于制备这类配制品的许多方法是授予专利的或通常是本领域技术人员已知的。参见例如，持续以及受控释放药物递送系统(SustainedandControlledReleaseDrugDeliverySystems)，J·R·罗宾逊(Robinson)编辑，马塞尔德克有限公司(MarcelDekker,Inc.)，纽约，1978。

在某些实施方式中，本发明的抗体或抗体部分可以经口给药，例如伴随惰性稀释剂或可同化的食用载体。还可以将该化合物(以及其他成分，如果希望的话)包在一种硬壳或软壳胶囊中、压制成片剂、或直接并入对象饮食中。对于经口的治疗性给药，可以将这些化合物与赋形剂合并，并且以可吸收的片剂、口含片、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮剂、糖浆、薄片等的形式使用。为了通过非肠胃外给药来给予本发明的化合物，可能必要的是将该化合物用一种材料来包覆，或者将该化合物与该材料共同给予，以预防其钝化。

以上公开对本发明进行了总体描述。在以下实施例中提供了如下更具体的描述。这些实施方式仅描述了用于说明的目的，并不旨在限制本发明的范围。形式变化以及等同的取代，视情况建议或权宜之计是预期中的。尽管已经在此使用了特定术语，但是此类术语旨在是描述意义的，而不是为了限制的目的。

实施例1

质粒构建

在此研究中，使用标准同源重组在酵母中构建质粒(ShanksRM，CaiazzaNC，HinsaSM，ToutainCM，O’TooleGA：用于操纵革兰氏阴性菌的基因的基于酿酒酵母的分子工具包，应用环境微生物(ApplEnvironMicrobiol)2006，72(7)：5027-5036)。从酵母中回收质粒，并经由PCR和/或测序转移到大肠杆菌菌株DH5α中进行确认。下面的列表描述了此研究的过程中构建的质粒。质粒名称的后面是顺序为从5’到3’的插入的基因/序列，随后是括号中的载体。在载体pMW07中构造聚糖表达质粒(Vaderrama-Rincon等人)。在载体pTRCY中典型地构建蛋白表达质粒。在pTrcY、pMQ70中克隆糖核苷酸合成质粒。

按图的顺序：

pMW07：(载体)pBAD，ChlorR，ura3，CENORI[19]

pDis-07：galE，pglB，pglA(pMW07)

pDisJ-07：galE，pglB，pglA，wbnJ(pMW07)

pTrcY：(载体)pTRC，AmpR，pBR322ORI，2μ

pMBP-hGH-Y：ssdsbA-malE(非信号序列)-六组氨酸-TEV-hGH(pTrcY)

pTrc-spMBP-GT-MBP-GT：ssmalE-4xdqnat-malE-六组氨酸(pTrc99a)[20]

pDisJD-07：galE，pglB，pglA，neuD，neuB，neuA，neuC，wbnJ(pMW07)

pTrc-spTorA-GFP-GT：sstorA-gfp-4xdqnat-六组氨酸(pTrc99a)[20]

pJDLST-07：galE，pglB，pglA，neuD，neuB，neuA，neuC，lst，wbnJ(pMW07)

pMG4X-Y：ssdsbA-malE-3XTEV-胰高血糖素-4Xdqnat六组氨酸(pTrcY)

pMG1X-Y：ssdsbA-malE-3XTEV-胰高血糖素-1Xdqnat-六组氨酸(pTrcY)

pMG1XD-Y：ssdsbA-malE-3xTEV-胰高血糖素-1Xdqnat-六组氨酸，neuDBAC(pTrcY)

pJDPdST6-07：galE，pglB，pglA，neuD，neuB，neuA，neuC，Pdst6(pMW07)

pJCstIIS-07：galE，pglB，pglA，neuS，neuB，neuA，neuC，cstII260，wbnJ(pMW07)

pJLic3BS-07：galE，pglB，pglA，neuS，neuB，neuA，neuC，lic3B，wbnJ(pMW07)

pNeuD-Y：neuD(pTrcY)

pMBP4X-Y：ssdsbA-malE-4XGlycTag-六组氨酸(pTrcY)

pCstII*SiaD-Y：cstII153S260-siaD(pTrcY)

pCstIISiaD-Y：cstII260-siaD(pTrcY)

pJK-07：galE，pglB，pglA，wbnJK(pMW07)

pGNF-70：galE(Cj)，galE(K12)，gmd，fcl，gmm，cpsBG(pMQ70)

pTnfαFab4X-Y：tnfα轻链，tnfα重链-4Xdqnat-六组氨酸(pTrcY)

pMG1XGNF-Y：ssdsbA-malE-3XTEV-胰高血糖素-1Xdqnat-六组氨酸，galE(CJ)，galE(K12)，wbnK，gmd，fcl，gmm，cpsBG(pTrcY)

pMG1xKGF-Y：ssdsbA-malE-3XTEV-胰高血糖素-1Xdqnat-六组氨酸，galE(Ec)，wbnK，gmd，fcl，gmm，cpsBG(pTrcY)

pG4-His-GNF-Y(ssdsbA-malE-1XTEV-hGHv-六组氨酸，galECj，galEEc，gmd，fcl，gmm，cpsBG(pTrcY)

菌株(按图的顺序)

MC4100

MC4100ΔwaaL

MC4100ΔwaaLΔnanA

MC4100ΔnanA

LPS1ΔwaaL

LPS1

选择大肠杆菌MC4100作为功能测试的宿主，是因为其本身不表达含唾液酸的聚糖结构，并且先前曾用作糖基化的功能性宿主(Vaderrama-Rincon等人，“一种大肠杆菌中的工程化真核细胞蛋白糖基化途径”，自然化学生物学(NatChemBio)8，434-436(2012))。从基因剔除变异株集(Keiocollection)中的相应突变体上转导waaL和nanA基因中的突变。之后从MC4100ΔnanA菌株中去除kan盒。对于聚糖的表面表达，采用目标质粒来转化MC4100、MC4100ΔnanA或MC4100ΔnanAΔwaaL。蛋白糖基化实验是在如所指示的菌株中进行。

培养基及试剂

抗生素选择维持为：100μg/mL氨苄青霉素(Amp)、25μg/mL氯霉素(Chlor)，10μg/mL的四环素(Tet)以及50μg/mL卡那霉素(Kan)。在添加有0.2％(w/v)葡萄糖以及如有必要添加有抗生素的LB培养基中进行常规的大肠杆菌生长。对于PSA质粒的表达，在LB培养基中添加最终浓度为0.25％(w/v)的唾液酸(Sigma或Millipore)，并且调节培养基的pH至7.5并灭菌。通过分别添加0.2％的L-阿拉伯糖或100mM的异丙基的β-D-半乳糖苷(IPTG)来对用于聚糖和蛋白表达的质粒进行诱导。在YPD培养基中保持酵母FY834，并且采用合成的、确定成分的尿嘧啶培养基来选择或保持酵母质粒。

细胞表面聚糖的检测

采用2.5μL或4μL来自于所示菌株的过夜LB培养基进行斑点印迹。将细胞点在硝酸纤维素膜上，并且通过免疫印迹法对PSA聚糖进行如下检测。对于流式细胞术，将培养物接种在酌情添加有抗生素的LB培养基中。采用如所指示的凝集素以及BDFACSCalibur流式细胞仪进行分析。

蛋白表达和纯化

将用于N-糖基化的分析而采收的菌株接种到具有适当的抗生素的LB培养基中，并且在30℃下振荡孵育，直至培养物的OD₆₀₀达到1.5-2。采用加入阿拉伯糖来诱导用于聚糖表达的质粒，并且用IPTG诱导受体蛋白的产生。在诱导之后16-18小时采收培养物。采用Ni-NTA试剂盒(Qiagen)进行小规模培养(50-100mL)来进行细胞裂解和糖蛋白纯化。在结合缓冲液(50mMTris，30mMNa₂HPO₄，30mM咪唑，500mMNaCL，pH＝7.4)中采用HisTrapFF柱(GE医疗公司(GEHealthcare))对较大的制剂进行纯化，随后用含有终浓度为500mM的咪唑的结合缓冲液进行洗脱。通常随后在DEAEFFHiTrap柱(GE医疗公司)上采用20mM的pH值为6.8的Tris作为结合缓冲液进行纯化，并且采用同样缓冲液中的梯度0-500mMNaCl进行洗脱。对于含有T抗原聚糖的糖蛋白的纯化，将蛋白交换至10mMHEPES(pH7.5)、0.15MNaCl、0.1mMCaCl₂、0.01mMMnCl₂，并且进一步采用花生凝集素(PNA)-琼脂糖(Vectorlabs)进行分离。采用半乳糖来分离糖蛋白。

蛋白质分析

通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶(Lonza)将蛋白分离出来，并且如前所述进行蛋白质印迹法(DeLisaMp等人，通过细菌双精氨酸易位途径进行的蛋白输出的折叠质量控制，美国国家科学院院刊(ProcNatlAcadSciUSA)2003，100(10):6115-6120)。简言之，将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，并且采用下述之一对这些膜进行探测：与HRP缀合的抗-6x-His抗体(Sigma)，anti-PSA-NCAM(Millipore)或PNA-生物素(VectorLabs)。在抗PSA抗血清的情况下，抗小鼠IgG-HRP(Promega)用作第二抗体。对于PNA生物素，链霉亲和素-HRP(VectorLabs)被用于二次检测。

实施例2

用于人Thomsen-Friedenreich抗原(T抗原)表达的工程化大肠杆菌

T抗原聚糖(T-抗原，Galβ1,3GalNAcα-)是在许多人源相关的人聚糖的核心处发现的结构。为了在大肠杆菌中对含有人T抗原的聚糖进行组装，构建一种质粒，用于产生使用天然UndPP-GlcNAc作为底物的结构所必需的糖基转移酶和糖核苷酸差向异构酶活性的表达。质粒pMW07(Valderrama-Rincon等人)被用作载体，因为其包含一个低拷贝数复制起始区(ORI)、一个诱导型pBAD启动子以及允许经由同源重组在酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中进行克隆的酵母ORI。pMW07的序列被提供为SEQIDNO：1。

为了产生具有GalNAcα1,3GlcNAc结构的二糖聚糖，构建了一种质粒以表达空肠弯曲杆菌GalNAc转移酶PglA和差向异构酶GalE以促进UDP-GalNAc底物的合成。还包括来自于空肠弯曲杆菌的编码OSTPglB的基因而用于将来的糖基化。包括galE、pglB和pglA的PCR片段与线性化pMW07一起被用来对啤酒酵母进行共转化，并且如前所述通过同源重组在酵母中进行克隆(Shanks等)。这些基因的序列分别被提供为SEQIDNo：2、SEQIDNo：3和SEQIDNo：4。从合成的确定成分的尿嘧啶培养基上所选的菌落中分离质粒，并用于对大肠杆菌DH5a进行转化而用于确认构建体。将所得质粒命名为pDis-07。

人源Thomsen-Friedenreich或T-抗原聚糖由Galβ1-3GalNAcα结构组成。选择来自大肠杆菌086的半乳糖转移酶WbnJ作为糖基转移酶，以结合末端半乳糖残基，因为据报道其以β1,3-连接将半乳糖附着在到GalNAc残基上，并且是一种天然细菌酶(YiW，ShaoJ，ZhuL，LiM，SinghM，LuY，LinS，LiH，RyuK，ShenJ等人，大肠杆菌086O-抗原生物合成基因簇以及人血型B抗原四糖的分步酶催化合成，美国化学会志(JournaloftheAmericanChemicalSociety)2005，127(7)：2040-2041)。来自Mr.Gene的合成质粒扩增wbnJ基因，并且采用酵母中的同源重组来使所得的PCR产物与线性化pDisJ-07质粒相结合。所得质粒被命名为pDisJ-07，并包含下列基因作为pBAD启动子控制下的合成操纵子：(5’-3’)galE、pglB、pglA、wbnJ。包含的wbnJ的序列被提供为SEQIDNO：5。

在其天然环境中，用于糖基转移酶PglA和WbnJ两者的底物是组装在脂质十一异戊烯焦磷酸(UndPP)上的糖类。作为大肠杆菌K12LPS合成途径的一部分，首先经由天然WecA的活性将GlcNAc残基加在UndPP上，然后通过WaaL连接酶将得到的GlcNAc转移到周质中的脂质A核心寡糖上。最后，将脂质A部分转运到外膜上，导致了在细胞表面上呈现这些聚糖。携带waaL基因缺失的细胞无法将UndPP-连接的聚糖转运到细胞表面，因而这种突变可用于确认聚糖被连接到UndPP上。

事先使waaL(rfaL)基因突变而作为基因剔除变异株集的一部分，并且从耶鲁大肠杆菌遗传保藏中心(theColiGeneticStockCenter，CGSC)获得所得的菌株rfaL734(del)::kan(JW3597-1)(BabaT，AraT，HasegawaM，TakaiY，OkumuraY，BabaM，DatsenkoKA，TomitaM，WannerBL，MoriH：大肠杆菌K-12的框内单个基因剔除突变体的构建：基因剔除变异株集，分子系统生物学(MolSystBiol)2006，2)。采用P1vir噬菌体将waaL突变转导到MC4100受体中以生成菌株MC4100ΔwaaL::kan。然后采用质粒pCP20来去除kan盒(DatsenkoKA，WannerBL：采用PCR产物的大肠杆菌K12中染色体基因的一步失活法，美国科学院论文集(ProceedingsoftheNationalAcademyofScience)2000，97(12):6640-6645)而得到菌株MC4100ΔwaaL。

流式细胞术用于对由表达pDisJ-07的大肠杆菌MC4100中产生的细胞表面聚糖进行分析，以确认与对照质粒pDis-07相比的半乳糖终端结构的存在。将培养物接种到含有1000μL的添加有25μg/ml氯霉素和0.2％阿拉伯糖(v/v)的LB培养基的1.5mL试管中。在30℃下振荡孵育24小时后，将培养物压丸，并且重新悬浮于200μLPBS中。将各100μL等分试样在95℃下加热10分钟，然后冷却到室温。将400μLPBS加入各样品中和优先结合到半乳糖末端聚糖上的3μL荧光素标记的大豆凝集素(SBA，载体实验室)或蓖麻凝集素I(RCAI，载体实验室)。在流式细胞术之前，在摇摆台上在室温下避光孵育样品10分钟。

采用RCAI凝集素的流式细胞术提示，MC4100细胞的细胞表面上存在表达pDisJ-07、而不是表达pDis-07的半乳糖末端聚糖(图2，左图)。这一结果与以前报道的WbnJ酶作为半乳糖基转移酶的功能相一致。与暗示可用的末端GalNAc残基的量减少的pDis-07质粒相比，在表达pDisJ-07质粒的细胞中SBA-荧光素的细胞表面标记减少(图2，中央)。在MC4100ΔwaaL突变体中，对于表达各质粒的细胞，荧光大大降低，暗示它们都是作为UndPP-连接聚糖而合成的。

实施例3

携带在人T抗原中终止的V-聚糖的蛋白的体内合成

利用OSTPglB将UndPP-连接的寡糖转移到特定的天冬酰胺残基上。这需要一种由D/EX1NX₂S/T序列子组成的、将要被定位到周质中的、承载PglB识别位点的靶蛋白，以及一种适当的聚糖底物的存在。在这项研究中，我们还构建了载体pTRCY用于糖蛋白表达。

通过将URA3基因和酵母2微米ORI加入到pTRC99a中而经由同源重组在酿酒酵母中对pTRCY进行克隆，从而产生能够在酵母中复制的一种新型载体。采用含有与pTRC99a同源的引物对URA3基因和2微米ORI进行扩增，用于在pBR322ORI与lacI基因之间进行插入。载体pTRCY的序列是SEQIDNO：6。

对hGH进行克隆而作为大肠杆菌DsbA的信号肽、MBP、六组氨酸标签以及tev裂解位点之后的C-末端转译融合。进一步对该hGH基因进行修饰以包含单个糖基化受体位点DQNAT，并且最终构建体被命名为pMBP-hGH-Y。该基因融合的序列是SEQIDNO：7。

只承载质粒pDisJ-07和pMBP-hGH-Y或pMBP-hGH-Y的菌株MC4100ΔnanAΔwaaL分别在氨苄青霉素(100μg/mL)和氯霉素(25μg/mL)或氨苄青霉素(100μg/mL)的选择条件下进行生长。在16小时左右加入0.2％(v/v)阿拉伯糖和IPTG(0.lmM)来诱导pDisJ-07以诱导蛋白质的产生。通过镍亲和层析纯化对蛋白质进行部分纯化，并且用TEV蛋白酶(Sigma)进行处理以在通过SDS-PAGE和考马斯染色进行分析之前释放hGH。在pDisJ-07质粒存在的条件下的可见迁移率改变与糖基化相一致(图2，右图)。

实施例4

对人T抗原中的半乳糖残基的同一性和连接进行确认

为了进一步探查pDisJ-07表达产生的聚糖的同一性，我们提取了脂质连接寡糖，并且通过质谱法对释放的聚糖进行分析。采用1:100接种物来对包含添加有25μg/ml氯霉素的LB的4个250mL培养物进行接种。在30℃下使培养物产生，并且在ABS₆₀₀达到～2.0时进行诱导。在～20个小时之后通过Gao和Lehrman的方法采收细胞用于脂质连接寡糖的分离(GaoN，LehrmanM：通过荧光辅助糖电泳进行脂质连接寡糖组合物的非放射性分析，酶学方法(MethodsEnzymol)2006，415:3-20)。简言之，将球粒重新悬浮于10mL甲醇中，则并通过超声处理溶解。将材料在60℃下干燥，随后经由超声处理在1mL2:1氯仿：甲醇(v/v，CM)中重新悬浮，并且将物质在CM中洗涤两次。然后将球粒在水中洗涤，然后用10：10：3的氯仿：甲醇：水(v/v/v，CMW)对脂质进行萃取，随后用甲醇萃取。将CMW萃取物和甲醇萃取物合并，并装在DEAE纤维素柱中。CMW被用于对柱进行洗涤，并且在CMW中用300mMNH₄OAc对脂质连接的寡糖进行洗脱。用氯仿对这些脂质连接寡糖物进行洗涤并干燥。

为了从聚糖上释放脂质，将该材料重新悬浮在1.5mL的异丙醇：水(1：1，v/v)中的0.1NHCl中。将该溶液在50℃下加热2小时，然后在75℃下干燥。将残留物在正丁醇饱和的水中悬浮，并将含有聚糖的水相干燥、重新悬浮于水中、并且用AG50W-H8(氢原子)阳离子加热交换树脂和Agl-X8(甲酸盐形式)阴离子交换树脂顺序进行纯化。

为了对末端聚糖的同一性进行确认，将样品分组，一半用β1,3-半乳糖苷酶(NEB)处理，另一半用水对照处理。样品在37℃下孵育48小时。质谱测定揭示，在缓冲对照样品中的主峰值(m/z609)(图3，上图)与预期T抗原聚糖的大小相一致。在用半乳糖苷酶处理的样品中，检测的主峰值(m/z447)与预期二糖GalNAcGlcNAc的大小一致，暗示末端β1,3-半乳糖损失。

实施例5

采用人T抗原的免疫

经常发现人T抗原在癌症中异常(abberently)表达，因而被称作泛癌(pancarcinoma)抗原。据估计，多达90％的癌症的细胞表面上携带T抗原，包括乳腺癌、结肠癌、膀胱癌、肺癌、前列腺癌、肝癌和胃癌[21，22]。因为其在多种癌症中的特异性表达，认为T抗原是抗癌免疫治疗的靶标。

为了能够在体内制备在载体蛋白上承载多个T抗原聚糖的免疫原，获得一种对在N-末端和C-末端均与4倍Glyc标签(承载4个DQNAT基序)融合、并与6倍his标签融合用于纯化的MBP蛋白进行编码的质粒(pTrc-spMBP-GT-MBP-GT)[20]。构建第二个质粒(pJD-07)以表达终止在T抗原中的均匀聚糖。通过将neuDBAC基因插入pDisJ-07，在酵母中采用同源重组而对pJD-07进行克隆。pJD-07包含下列基因作为pBAD启动子控制下的合成操纵子：(5’-3’)galE、pglB、pglA、neuD、neuB、neuA、neuC和wbnJ。

采用质粒pTrc-spMBP-GT-MBP-GT以及pJD-07或者pMW07对大肠杆菌菌株MC4100ΔwaaL进行转化，其中pJD-07用于表达T抗原聚糖糖基化的靶蛋白、pMW07用于表达未糖基化的靶蛋白。由质粒pTrc-spMBP-GT-MBP-GT表达的目标MBP蛋白总共包含8个糖基化位点(MBP8xDQNAT)。在采用氨苄青霉素(100ug/mL)和氯霉素(25μg/mL)进行选择的条件下，在30℃下对菌株进行培养，并且在ABS₆₀₀为约1.5的条件下采用0.2％(v/v)阿拉伯糖和0.1mMIPTG进行诱导～16小时。在HisTrapFF柱(GE医疗公司)上对MBP靶蛋白进行纯化，随后通过DEAEFFHiTrap柱(GE医疗公司)进行纯化，并且在20mMTris(pH6.8)中用NaCl梯度(0-500mM)洗脱。采用花生凝集素(PNA)-琼脂糖(Vectorlabs)对糖基化蛋白进行亲和纯化以分离结合到T抗原聚糖上的蛋白。通过PAGE对所得的蛋白进行分离，并且采用β-His(左)、生物素结合的PNA(5μg/mL，Vectorlabs)以及过氧化物酶结合的链亲和素(1：3333，Vectorlabs，右)通过蛋白质印迹进行分析以确认糖基化。正如所料，采用糖基化质粒PJD-07表达的MBP比阴性对照(pMW07)的迁移更慢，并且与PNA凝集素的反应与糖基化一致(图4)。

本研究中利用的约8-10周龄的雌性C3H小鼠分为5组，自由进食和饮水。在PBS中将如上所述制备的未糖基化MBP8xDQNAT和T-抗原-MBP8xDQNAT的浓度调整到0.4mg/mL。在使用前立即将蛋白质与等量的Sigma佐剂系统(Sigma)混合，并且在第0天、第7天和第13天通过腹膜内(IP)途径用0.1mL中20μg的蛋白质对小鼠进行免疫。在第-1天(免疫前)、第14天和第21天采集血清样品。

抗体反应的分析

采用ELISA法测定所得血清中的特异性抗体的存在。为了评估对于载体蛋白的免疫反应，将上述制备的未糖基化MBP8xDQNAT在包被缓冲液(4.2g/LNaHCO₃，1.78g/LNa₂CO₃，pH9.6)中的浓度调整到2μg/mL，并且将50μL一式三份加到PolySorp微量滴定板(Nunc)的孔中，并在4℃下孵育过夜。用一式三份200μL含有吐温-20的PBS(PBST：4g/LNaCl，0.1g/LKCl，0.72g/LNa₂HPO₄，0.12g/LKH₂PO₄+0.05％v/v吐温-20)洗涤板孔，之后用200μL的10％牛血清白蛋白(BSA)在PBST中在室温下对板孔进行阻断60分钟。采用PBST中1％的BSA将血清样品稀释1：500，将50μL样品一式三份加入涂布的孔上，并在室温下孵育60分钟。用200μLPBST将板洗涤4次，然后用50μL的1：5000稀释度的HRP缀合的抗小鼠IgM或HRP缀合的抗小鼠IgG特异性二抗(杰克逊免疫研究实验室(JacksonImmunoResearchLaboratories))在室温下孵育60分钟。用200μLPBST将微量滴定板洗涤7次，用100μL一步法TMB-ELISA(Thermo)在室温下避光孵育10-30分钟。通过加入100μL的2NHCl终止反应，并且在450nm处读取吸光度(图5)。对于糖基化和未糖基化基团，IgM抗体对MBP8xDQNAT的检测在约第14天达到峰值(图5，上图)，而IgG抗体的检测在研究过程中增加(图5，下图)。

进行第二次ELISA以确定抗体对使用类似标签修饰的GFP的免疫原的C-末端部分的反应。获得表达GFP蛋白的质粒(pTrc-spTorA-GFP-GT)[20]，该GFP蛋白用包含4次DQNAT基序迭代的4xGlyc标签修饰、然后被6x-His标签(GFP4xGT)修饰。采用pTrc-spTorA-GFP-GT，以用pMW07或pJD-07与MC4100ΔwaaL细胞共转移。在采用氨苄青霉素(100ug/mL)和氯霉素(25μg/mL)进行选择的条件下，在30℃下对所得的菌株进行培养，并且在ABS₆₀₀为约1.5的条件下采用0.2％(v/v)阿拉伯糖和0.1mMIPTG进行诱导约16小时。在HisTrapFF柱(GE医疗公司)上对GFP靶蛋白进行纯化，随后通过DEAEHiTrapFF柱(GE医疗公司)进行纯化，并且在20mMTris(pH6.8)中用NaCl梯度(0-500mM)洗脱。采用花生凝集素(PNA)琼脂糖(载体labs)另外对糖基化蛋白进行亲和纯化以分离结合到T抗原聚糖上的分离蛋白。

将所得T抗原-GFP4xGT或未糖基化GFP4xGT的浓度在包被缓冲液中调整到2μg/mL，将50μg一式三份涂布到PolySorp微量滴定板(Nunc)的孔中，并且在4℃下孵育过夜。在用PBST中10％的BSA对孔在室温下阻断60分钟之前，用200μLPBST将孔洗涤3次。如所述的在PBST中按1：500用1％BSA对血清样品进行稀释，并且将50μL样品一式三份加入涂布的孔上，并在室温下孵育60分钟。用200μLPBST将板孔洗涤4次，并且用50μL的稀释度为1：5000的HRP缀合的抗小鼠二抗(Promega)在室温孵育60分钟。PBST清洗7次后，通过加入100μL的1步法UltraTMB-ELISA(Thermo)开始反应，并避光孵育10-30分钟。通过加入100μL的2NHCl终止反应，并且在450nm处读取吸光度(图6)。在图表的下方指示用于涂覆板孔的蛋白质，在图例中指示用于处理小鼠的免疫原。与糖基化T抗原-MBP8xDQNAT相比，在GFP包被的孔中结合的抗体在未糖基化MBP8xDQNAT免疫的小鼠的血清中平均是升高的(灰色矩形)，暗示这些聚糖可能干扰抗体应答。

实施例6

用于人源(2,3)唾液酸T抗原的表达的工程化大肠杆菌

人源(2,3)唾液酸-T抗原是由末端α2,3-神经氨酸(NeuNAc)残基修饰的T抗原聚糖组成的，导致以下结构：NeuNAcα2,3-Galβ1,3GalNAcα-。为了在大肠杆菌宿主中产生以唾液酸T抗原结构为终止的聚糖，上述对合成T-抗原聚糖(pDisJ-07)所需的基因进行表达的质粒被修饰，以包括在大肠杆菌Kl中编码唾液酸转移酶的基因以及其产物包含胞苷5’单磷酸-N-乙酰神经氨酸(CMP-NeuNAc)合成途径的基因。

采用PCR从包括neuB、neuA和neuC基因的大肠杆菌Kl基因组中对DNA区域进行扩增。其分别编码Neu5Ac合酶、CMP-Neu5Ac合成酶和UDP-GlcNAc2差向异构酶。还包括neuD基因，因为它可能有助于稳定neuB基因产物(DainesDA，WrightLF，ChaffinDO，RubensCE，SilverRP：NeuD在大肠杆菌Kl中的唾液酸的合成中发挥作用，FEMS微生物学通讯(FEMSmicrobiologyletters)2000，189(2):281-284)。还对编码脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)α2,3-唾液酸转移酶的lst基因进行扩增，采用两种PCR产物连同线性化pDisJ-07来对啤酒酵母进行共转化，以通过同源重组得到质粒pJDLST-07。neuB、neuA、neuC和neuD的序列被提供为SEQIDNO_S：8-11，1st基因的序列被提供为SEQIDNO：12。质粒pJDLST-07含有一种pBAD启动子控制下的合成操纵子，具有以下基因：galE、pglB、pglA、neuD、neuB、neuA、neuC、1st、wbnJ。

为了用于对唾液酸化聚糖进行表达，构建菌株，其中，编码唾液酸醛缩酶NanA的nanA基因靶向用于断裂。nanA基因的缺失阻止来自外源唾液酸的降解(VimrER，TroyFA：用于大肠杆菌中唾液酸(nan)的诱导性分解代谢系统的鉴别，细菌学杂志(JBacteriol)1985，164(2):845-853)。经由Plvir噬菌体转导将ΔnanA::kan突变从作为基因剔除变异株集(CGSC#10423，耶鲁遗传保藏中心)的一部分生成的相应的突变体中引入MC4100大肠杆菌(Baba等)。通过Datsenko和Wanner的方法去除卡那霉素盒(Datsenko等)。为了促进糖基化，随后通过上述相同的方法引入ΔwaaL::kan突变并固化卡那霉素抗性。

实施例7

携带终止在人源(2,3)唾液酸-T抗原中的V-聚糖的蛋白的体内合成

为了允许通过质谱测定对唾液酸化糖肽进行分析，对含有DQNAT基序的1XGlycTag修饰的胰高血糖素肽进行克隆。为了构建此质粒，采用与载体pTRCY同源的含有用于TEV蛋白酶位点的序列的引物对该DsbA信号肽序列和malE基因(其编码MBP)进行扩增。类似地，采用含有编码TEV蛋白酶位点的序列或用于4XGlycTag和6x-His标签的序列而与pTRCY同源的引物，从合成寡核苷酸对胰高血糖素进行扩增。这些PCR产物与线性化pTRCY一起用于对啤酒酵母进行共转化，用于通过同源重组进行克隆，以生成质粒pMG4X-Y。相关的质粒pMGlX-Y是通过用1XGlycTag取代4XGlycTag而生成的pMG4X-Y的衍生物。简言之，将pMG4X-Y线性化，并且在酿酒酵母中通过同源重组采用编码lXGlycTag的寡核苷酸来取代4XGlycTag。编码蛋白质MBP-3TEV-GLUC-4XGlycTag-6H和MBP-3TEV-GLUC-lXGlycTag-6H的序列被提供为SEQIDNO：13和SEQIDNO：14。

为了在体内产生含有人唾液酸-T抗原的糖蛋白，采用如上所述的菌株MC4100ΔnanAΔwaaL来促进唾液酸化聚糖的周质积聚。用编码糖基化受体蛋白的质粒pMGlX-Y和pJDLST-07对该菌株进行共转化，pJDLST-07表达合成唾液酸-T抗原聚糖所必需的机制。

采用包含MC4100ΔnanAΔwaaLpMGlX-Y和pJDLST-07的过夜培养物来接种50mL培养物，该LB中的培养物具有100μg/mL氨苄青霉素和25μg/mL氯霉素。当ABS₆₀₀达到约1.5时，用0.2％阿拉伯糖和0.1mM的IPTG诱导培养物，并在诱导后约19小时通过离心采收细胞。细胞裂解后，在NiNTA柱上纯化蛋白质，并使用TEV蛋白酶对30μL所得到的洗脱液进行裂解。将样品在30℃下孵育3h，在ABSCIEXTOF/TOF质谱仪上、采用二羟基苯甲酸(DHB)作为基质通过质谱测定对等分试样进行分析。

质谱测定揭示，主峰值与唾液酸-T抗原(m/z6251)修饰的胰高血糖素的预期大小以及承载T抗原末端聚糖(m/z5960)的胰高血糖素的预期大小一致(图7)。

实施例8

通过TRCY的neuDBAC的表达的唾液酸化作用的相对改善

用于提高本系统中的唾液酸化作用的一个潜在策略是提高CMP-NeuNAc的细胞内有效性。尽管必要的生物合成基因存在于质粒pJDLST-07上，但假设另外的拷贝可以改善唾液酸化作用。将基因neuDBAC进行扩增作为单个PCR产物，并且利用同源重组在酿酒酵母中插入到胰高血糖素融合蛋白下游的pMGlX-Y中。这导致了质粒pMGlXD-Y的生成。

在菌株MC4l00ΔnanAΔwaaL中，质粒pMGlXD-Y与pJDLST-07结合，以如上所述在50mL培养物中对糖基化进行测试。TEV裂解肽产物的质谱测定揭示了与含有聚糖的(2,3)唾液酸-T抗原(m/z6250)修饰的胰高血糖素的预期大小相一致的主峰值。还对与T抗原聚糖(m/z5959)修饰的胰高血糖的预期大小相一致的第二个较小的峰进行了检测(图8)。

实施例9

唾液酸化胰高血糖素肽的α2,3-神经氨酸酶处理

为了对胰高血糖素肽的唾液酸化作用进行验证，进行了神经氨酸酶处理。携带质粒pMGlXDY和pJDLST-07的菌株MC4l00ΔnanAΔwaaL在具有100μg/mL氨苄青霉素和25μg/ml氯霉素的LB中的50mL培养物中生长，并用0.2％阿拉伯糖和0.1mMIPTG诱导约16小时。采用镍亲和层析从裂解物中对重组蛋白进行纯化，并且将洗出液在50mMTris(pH8.0)的100mMNaCl中进行缓冲液更换，并且在30℃下用TEV蛋白酶孵育3小时，孵育之前进行浓缩。将该蛋白质分组，并用α2,3-神经氨酸酶(NEB)或缓冲液对照在37℃下孵育2小时，之后通过质谱测定进行分析(图9)。缓冲液对照样品中的主峰值(m/z6253，黑色)是与唾液酸-T抗原聚糖修饰的胰高血糖素的预期大小一致的。在唾液酸酶处理的样品中，主峰值(m/z5961，灰色)与T抗原糖肽的预期大小一致。没有证据表明在神经氨酸酶处理后存在唾液酸化糖肽。

实施例10

确定糖基化对体外稳定性的影响

糖基化是用于提高蛋白质的稳定性的公知策略，并且是用于提高体内或体外持久性的合理方法。为了确定细菌中的N-糖基化是否可被用于此目的，将(2,3)唾液酸-T抗原缀合到胰高血糖素上用于分析。

质粒pMGlXDy与pJDLST-07在菌株MC4l00ΔnanAΔwaaL中结合，以生成唾液酸化胰高血糖素，并且得到的细胞被用于对含有添加了100μg/mL氨苄青霉素和25μg/mL氯霉素的LB培养基的100mL培养物进行接种。为了产生未糖基化胰高血糖素，包藏质粒pMGlXMCB-07的Origami2ΔnanAΔwaaLΔgmd::kan被用于对含有LB培养基和100μg/mL氨苄青霉素的100mL培养物进行接种。基于我们对未糖基化肽进行检测的能力选择菌株。在30℃下振荡这两种培养物，直到ABS₆₀₀达到约2.3，然后用0.1mM的IPTG(两者)和0.2％v/v阿拉伯糖(仅糖基化的)进行诱导。将培养物在30℃下保持过夜。通过Ni亲和性(NiNTA，Qiagen)对胰高血糖素融合蛋白进行分离，并且对洗脱物进行浓缩。将1μlTEV蛋白酶加入到50μl糖基化或未糖基化的胰高血糖素中，并且在30℃下孵育3小时进行反应，然后转移至37℃。通过MALDITOF质谱随时间监测胰高血糖素的存在。孵育21小时之后不再检测未糖基化胰高血糖素，而承载(2,3)唾液酸T抗原的胰高血糖素的预期m/z的峰值仍然是最突出的，(图10)暗示唾液酸化增强了胰高血糖素肽的体外持久性。

实施例11

用于末端α2,6-NeuNAc修饰的T抗原的表达的工程化大肠杆菌

人源唾液酸-T抗原是由末端α2,3-神经氨酸(NeuNAc)残基修饰的T抗原聚糖组成的，导致以下结构：NeuNAcα2,3-Galβ1,3GalNAcα-。还对相关的聚糖进行探讨，不同的只是末端NeuNAc残基的连接：NeuNAcα2,6Galβ1,3GalNAcα。为了在大肠杆菌宿主中产生以2,6-唾液酸化T抗原结构终止的聚糖，通过用编码2,6-唾液酸转移酶取代lst基因来修饰上述表达对合成2,3-唾液酸T-抗原聚糖所需的基因的质粒(pJDLST-07)。

为了表达结构NeuNAcα2,6Galβ1,3GalNAcα1,3GlcNAc，通过Mr.Gene对来自于美人鱼发光杆菌(Photobacteriumdamselae)JT0160的编码2,6-唾液酸转移酶的Pdst6的密码子优化型式进行合成并通过PCR进行扩增。通过在酵母中同源重组替代pJDLST-07中的lst基因来对Pdst6基因进行克隆以生成pJDPdST6fi-07。该PdST6基因的序列是SEQIDNO：15。质粒pJDPdST6fl-07含有一种pBAD启动子控制下的合成操纵子，具有以下基因：galE、pglB、pglA、neuD、neuB、neuA、neuC、Pdst6、wbnJ。

携带终止在2,6-唾液酸中的V-聚糖的蛋白的体内合成

为了在体内产生含有2,6唾液酸化-T抗原的糖蛋白，采用如上所述的菌株MC4100ΔnanAΔwaaL来促进唾液酸化聚糖的周质积聚。用编码糖基化受体蛋白的质粒pMGlX-Y和pJDPdST6fl-07对该菌株进行共转化，pJDPdST6fl-07表达合成2,6-唾液酸末端聚糖所必需的机制。

采用包含MC4l00ΔnanAΔwaaLpMGlXD-Y和pJDPdST6fl-07的过夜培养物以将50mL培养物接种在LB中，该LB具有100μg/mL氨苄青霉素和25μg/mL氯霉素。当ABS₆₀₀达到约1.5时，用0.2％阿拉伯糖和0.1mMIPTG诱导培养物，并在诱导后约19小时通过离心采收细胞。细胞裂解后，在NiNTA柱上纯化蛋白质，并使用TEV蛋白酶对30μL所得到的洗脱液进行裂解。将样品在30℃下孵育3h，在ABSCIEXTOF/TO质谱仪上、采用二羟基苯甲酸(DHB)作为基质通过质谱测定对等分试样进行分析。

质谱测定揭示，主峰值与2,6-唾液酸化T抗原修饰的胰高血糖素的预期大小(m/z6257)以及承载T抗原末端聚糖的胰高血糖素的预期大小(m/z5964)是一致的(图11)。

为了确认从质粒pJDPdST6fl-07制备的聚糖实际上并不终止在2,3-唾液酸化T抗原中，用具有不同特异性的神经氨酸酶对以上产生的糖肽进行处理。对唾液酸化胰高血糖素肽进行划分，并在37℃下用据报道可从聚糖或糖蛋白上水解α2,3-、α2,6-和α2,8-连接的唾液酸的α2,3-神经氨酸酶(NEB)或神经氨酸酶(NEB)孵育30分钟。通过MaldiTOF质谱测定对得到的肽进行分析(图12)。发现用α2,3-神经氨酸酶处理的组分(图12，左)含有唾液酸化产物的预期大小的实质峰(m/z6256)，但是这个峰在神经氨酸酶处理的样品中不存在(图12，右)。神经氨酸酶处理的样品中的主峰值(m/z5963)与预期大小的T抗原糖肽是一致的，与唾液酸损失一致。用神经氨酸酶(而不是α2,3-神经氨酸酶)处理的m/z6257的峰值缺失，与具有预期末端α2,6NeuNAc残基的唾液酸化糖肽的产生是一致的。

实施例12

在大肠杆菌中产生重组产生的唾液酸聚糖

已知有许多细菌产生聚唾液酸(PSA)聚糖，包括大肠杆菌K1和脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)的菌株。在这些菌株中，PSA形成了保护性荚膜多糖。在大肠杆菌K1中对PSA荚膜进行了充分研究，但是用于PSA合成的脂质底物尚未确定。为了使PSA适于N-糖基化，则很可能需要引导其在适于OST的底物上的合成，并提供PSA聚合酶延长唾液酸化所需的必要的二唾液酸“引物”。在此所述的终止在人T抗原中的聚糖是一个很好的聚唾液酸化的候选者，因为在此系统中它可有效地用在糖基化中。为了对具有二唾液酸基序的T抗原进行详细描述，基于其报道的双官能2,3和2,8唾液酸转移酶活性而选择空肠弯曲杆菌的cstII基因和流感嗜血杆菌(H.influenza)的lic3B基因。对于聚合作用，选择neuS基因用于连续2,8-唾液酸化，因为它是一种大肠杆菌基因。

为了对用于探索聚唾液酸化的质粒进行克隆，获得cstII和lic3b基因的合成型式(Mr.Gene)。cstII和lic3b的序列被供给为SEQIDNo：16和17。

采用neuBAC、大肠杆菌K1聚唾液酸转移酶neuS(SEQIDNO：18)以及可利用同源重组在酿酒酵母中合成T抗原聚糖的基因，对编码双官能α2,3α2,8唾液酸转移酶的最初260个氨基酸的cstII基因的截短型式进行克隆。也以相同的方式对全长双官能α2,3α2,8唾液酸转移酶lic3b进行克隆。得到的质粒分别称为pJCstIIS-07和pJLic3bS-07。

质粒pJCstIIS-07被用于对MC4100ΔnanA和MC4100ΔnanAΔwaaL进行转化而用于功能测试。单个菌落用于接种1mL的含有0.25％的NeuNAc(w/v)、25μg/ml氯霉素和0.2％(v/v)阿拉伯糖的LB培养基。在30℃下在1.5mL试管中使培养物生长约18小时，并压丸。用PBS洗涤后，通过光密度使培养物归一化，在95℃下加热10分钟，并且在冷却后将所有细胞点样在硝酸纤维素上。用抗PSA抗体、然后用抗小鼠辣根过氧化物酶对膜进行印迹(图13a)。与PSA抗体的反应性表明，在waaL存在的条件下在细胞表面上呈现PSA-聚糖。对预期的聚糖结构进行图解(图13b)。

为了对糖基化反应中的推定的PSA末端聚糖进行测试，用编码糖基化受体蛋白的pMG4X-Y对MC4100ΔwaaLΔnanA菌株进行转化。将得到的菌株用质粒pDisJ-07或pJLlc3B-07进行转化。所得菌株在50mLLB+/-0.25％的NeuNAc和适当的抗生素中生长。在近似光密度为2-4之间的条件下用0.2％阿拉伯糖和0.1mMIPTG对培养物进行诱导。通过镍亲和层析对蛋白进行纯化、浓缩、并用TEV蛋白酶进行处理，之后通过蛋白质印迹进行分析(图14)。

采用αPSA抗体的检测(图14，顶部)显示出只在pJLic3BS-07并且NeuNAc补充与PSA聚糖存在相一致的条件下存在的一些反应性材料。通过具有αHis抗血清的六组氨酸标签的存在对总靶蛋白进行检测(图14，底部)。

实施例13

NeuD对于在大肠杆菌MC4100中唾液酸化聚糖的合成很重要

neuD基因是用于大肠杆菌K1以及产生唾液酸化聚糖的其他菌株中的PSA合成的基因座的一部分，尽管NeuD功能的分配有冲突。为了确认NeuD在唾液酸化平台中的重要性，将其作为独立的基因克隆到在酿酒酵母中利用同源重组的载体pTRCY中。在Trc启动子的控制下含有NeuD的所得质粒称为pNeuD-Y。

为了测试pNeuD-Y，此质粒与pJLic3BS-07一起用于对菌株MC4100ΔnanA进行共转化。单个菌落用于接种lmL含有25μg/ml氯霉素和0.2％阿拉伯糖的LB培养基。用或不用唾液酸制成的LB培养基的的终浓度是0.25％(w/v)，并进行pH调整并过滤除菌。在30℃下在1.5mL试管中使培养物生长约18小时，并将培养物压丸。用PBS洗涤后，通过光密度使培养物归一化，在95℃下加热10分钟，并且在冷却时将所有细胞点样在硝酸纤维素上。用抗PSA抗体、然后用抗小鼠辣根过氧化物酶对膜进行印迹(图15)。

PSA抗体的反应性暗示了在pNeuD-Y或NeuNAc的存在下存在细胞表面PSA聚糖。这一结果暗示了NeuD在实验室大肠杆菌中的唾液酸化化合物中的重要性(图15)。

实施例14

活体外聚唾液酸化

作为以确认聚唾液酸转移酶在实验室大肠杆菌中的功能性的可替代方法，利用一种聚唾液酸化的活体外方法。对于这种方法，从表达聚唾液酸转移酶的菌株中产生裂解物，并且它与CMP-NeuNAc以及在一个单独的菌株中产生的受体蛋白相结合。MBP被选择用作受体蛋白，因为它在此系统中被有效地表达和糖基化。

为了制备受体蛋白质粒，DsbA信号肽和4XGlycTag以及六组氨酸基序修饰的MBP的编码序列从pTRC99-MBP4XDQNAT中进行亚克隆(FisherAC，HaitjemaCH，GuarinoC，CelikE，EndicottCE，ReadingCA，MerrittJH，PtakAC，ZhangS，DeLisaMP：分泌性细胞外N-连接糖蛋白在大肠杆菌中的产生，应用和环境微生物学(AppliedandEnvironmentalMicrobiology)2011，77(3):871-881)。所得质粒被称为pMBP4XGT-Y。CstII也被克隆而作为与奈瑟氏球菌聚唾液酸转移酶SiaD(从Genwiz获得)的转译融合物以生成自启聚唾液酸转移酶，如Willis等人所描述的(WillisLM，GilbertM，KarwaskiM-F，BlanchardM-C，WakarchukWw：采用合成受体对来自于脑膜炎奈瑟氏球菌的α-2,8-聚唾液酸转移酶进行表征、以及自启聚唾液酸转移酶融合酶的发展，糖生物学(Glycobiology)2008，18(2)：177-186)。两个译本都采用同源重组在酿酒酵母中进行克隆，得到质粒pCstII-SiaD-Y和pCstII153S-SiaD-Y，后者包括异亮氨酸53突变成为半胱氨酸，据报道可改善α2,8唾液酸转移酶活性。siaD的序列被提供为SEQIDNO：19。

首先通过将含有T抗原的聚糖加到MBP4XGT蛋白中来制备受体糖蛋白。质粒pMBP4XGT-Y和pDisJ-07用于转化菌株MC4100ΔwaaL。得到的菌株用于接种1L含有LB、氨苄青霉素(100ug/ml)和氯霉素(25ug/mL)的培养物。将培养物在30℃下孵育，直至光密度达到OD1.5，然后用0.2％阿拉伯糖和0.1mMIPTG分别诱导聚糖和糖蛋白两者的产生。16小时后采收球粒，并通过镍亲和层析对his-标记的蛋白进行纯化。对洗脱的蛋白进行缓冲液更换而成为含有50mMTris7.5、10mMMgCl₂的活体外唾液酸化缓冲液，并进行浓缩。

为了制备聚唾液酸转移酶裂解物，含有质粒pTRCY、pCstII-SiaD-Y或pCstII153S-SiaD-Y的菌株MC4l00ΔwaaL在含有LB和氨苄青霉素的50mL培养物中生长。当光密度达到1.5-1.9时，通过添加IPTG至终浓度为0.1mM来诱导蛋白表达，并且在20℃下进行诱导约16小时。采收团粒，并在活体外唾液酸化缓冲液中重新悬浮。细胞裂解后，将材料在1000×g下离心11分钟，并且保留上清液。

对于活体外反应，20μL的MBP糖蛋白与30μL聚唾液酸化或对照裂解物以及CMP-NeuNAc相结合。反应物在37℃下孵育45分钟，之后通过SDS-PAGE和蛋白质印迹进行分析(图16)。采用抗PSA抗血清的孵育(图16，上图)导致在CMP-NeuNAc以及含有与PSA聚糖的形成一致的pCstII153S-SiaD-Y的裂解物存在的条件下出现高分子量材料。看来，用含有pCstII-SiaD-Y质粒的裂解物生成的反应材料的量减少，用载体对照没有检测到。用抗组氨酸蛋白质印迹确认MBP4XGT蛋白的存在(图16，下图)。

实施例15

终止在人血型O聚糖(H抗原)中的V-聚糖在大肠杆菌中的体内合成

人血型O决定子或H抗原是由与人T抗原类似的岩藻糖化聚糖组成的。III型H-抗原结构包括岩藻糖α1,2半乳糖β1,3GalNAcα－。为了在大肠杆菌中合成终止在人H-抗原结构中的聚糖，来自上述表达对合成T-抗原聚糖所需的基因的质粒的基因与编码岩藻糖基转移酶的基因相结合。

选择来自大肠杆菌086的岩藻糖基转移酶WbnK，是因为它是一种在其天然情况下对具有相似结构的聚糖进行岩藻糖化的细菌酶。wbnK的序列是SEQIDNO：20。采用Genewiz的合成模板生成含有wbnJ和wbnK基因的PCR产物。利用同源重组使PCR产物与线性pDis-07质粒在酵母中结合以生成质粒pDisJK-07。得到的质粒pDisJK-07含有一种pBAD启动子控制下的合成操纵子，具有以下基因：galE、pglB、pglA、wbnJ、wbnK。

为了用于表达岩藻糖基化血型H-抗原，大肠杆菌菌株LPS1(YavuzE，MaffioliC，IlgK，AebiM，PriemB：Glycomimicry:displayoffucosylationonthelipo-oligosaccharideofrecombinantEscherichiacoliK12，糖缀合物杂志(Glycoconjugatejournal)2011，28(L)：39-47)被用于促进GDP-岩藻糖(GDP-Fuc)的积聚。大肠杆菌对用于GDP-Fuc合成的天然途径进行编码。然而，这个糖核苷酸然后正常并入含有岩藻糖的胞外多糖荚膜异多糖酸。为了防止在这个竞争途径使用GDP-Fuc，在编码推定UDP-葡萄糖脂质载体转移酶的基因wcaJ(ECK2041)中存在一个突变。为了进一步促进菌株中的糖基化，在waaL基因中引入了一个突变。已经事先对waaL(rfaL)基因进行了突变而作为基因剔除变异株集的一部分，得到的菌株rfaL734(del)::kan(JW3597-1)(Baba等人)是从耶鲁大肠杆菌遗传保藏中心(CGSC)获得的。采用P1vir噬菌体将waaL突变转导到LPS1受体中以生成菌株LPS1ΔwaaL::kan。

为了确认通过pDisJK-07编码的糖基转移酶产生的聚糖结构，该质粒用于转化菌株LPSlΔwaaL::kan以用于脂质释放寡糖的分析。所得菌株的250mL培养物在30℃下生长，并当光密度达到ABS₆₀₀约2.0时进行诱导。约20小时后采收细胞，以通过Gao和Lehrman的方法进行脂连接寡糖的分离。简言之，将球粒重新悬浮于10mL甲醇中，并通过超声处理溶解。将材料在60℃下干燥，随后经由超声处理重新悬浮在1mL2:1氯仿：甲醇(v/v，CM)中，并且将物质在CM中洗涤两次。然后将球粒在水中洗涤，然后用10：10：3的氯仿：甲醇：水(v/v/v，CMW)对脂质进行萃取，随后用甲醇萃取。将CMW和甲醇萃取物合并，并装在DEAE纤维素柱中。CMW被用于对柱进行洗涤，并且在CMW中用300mMNH₄OAc对脂质连接的寡糖进行洗脱。用氯仿对这些脂质连接的寡糖物进行洗涤并干燥。

为了从脂质释放聚糖，将该材料重新悬浮在1.5ml的异丙醇：水(1：1，v/v)中的0.1NHCl中。将该溶液在50℃下加热2小时，然后在75℃下干燥。将残留物在正丁醇饱和的水中悬浮，并将含有聚糖的水相干燥、重新悬浮于水中、并且用AG50W-H8(氢原子)阳离子交换树脂和Agl-X8(甲酸盐形式)阴离子交换树脂顺序进行纯化。

对溶解于水的纯化寡糖用α1,2-岩藻糖苷酶(NEB)处理或用只用缓冲液对照进行孵育，并且使用二羟基苯甲酸(DHB)作为基质在ABSCIEXTOF/TOF质谱仪分析上进行分析(图17a)。在缓冲液对照(上图)中，存在的两个主峰值(m/z755)和(m/z609)分别与预期的(m/z)岩藻糖化产物(FucHexHexNAc₂)和T抗原聚糖(HexHexNAc₂)相一致。以下岩藻糖苷酶处理(下图)中，在(m/z755)处的峰值大大降低，而在(m/z609)处的峰值相对较大。这些峰值之间的差(146)是与岩藻糖残基的大小(脱氧己糖)一致的。

实施例16

通过对GDP-岩藻糖生物合成基因的表达来提高相对岩藻糖基化

为了改善从T抗原聚糖到岩藻糖基产物的转化，设计了一个系统用于允许GDP-岩藻糖、UDP-Gal和UDP-GalNAc的生物合成机制的另外的拷贝的表达。为了实现这一点，将以下基因克隆作为在pMQ70中的pBAD启动子控制下的合成操纵子：galE(空肠弯曲杆菌)、galE、gmd、fcl、gmm、cpsB、cpsG(大肠杆菌K12)，以利用同源重组在酵母中生成质粒pGNF-70。在pGNF-70中克隆的大肠杆菌基因的序列被提供为SEQIDNO：21-26。

菌株LPS1ΔwaaL：kan用质粒pJK-07和pGNF-70进行转化。将得到的菌株在氨苄青霉素和氯霉素选择的条件下在250mL的LB培养基中培养，并且在光密度约2.0的条件下对两种质粒的表达进行诱导，诱导在30℃下持续约16小时。采收球粒，并且如先前所述的Gao和Lehrman的方法对LLO进行纯化。

将纯化的寡糖通过如上所述的质谱测定进行分析(图17b)。在这种处理之后确定的主峰值(m/z755)与所需的岩藻糖基聚糖(dHexHexHexNAc₂)一致，暗示了有效的岩藻糖基化。另外的一个峰出现在(m/z609)，其与聚糖(HexHexNAc₂)是一致的。

实施例17

在大肠杆菌中体内生成岩藻化糖蛋白

在岩藻糖化聚糖的分析之后，有必要确认聚糖是适合用于糖基化反应。TNFαFab被选为糖基化的初始目标。包括用于各链的信号肽序列的Fab的密码子优化译本是从DNA2.0中获得的，并利用同源重组在酿酒酵母中克隆到pTRCY中以将4XGlycTag和六组氨酸标签附加到重链上。所得质粒被命名为pTnfαFab4X-Y。所修饰的TNFαFab轻链和重链的序列被提供为SEQIDNo：27和28。

pTnfαFab4X-Y用于对承载糖基化质粒PJK-07或空载体pMW07的菌株LPSl进行转化，并且得到的菌株被用于接种50mL的LB培养物并在选择氨苄青霉素和氯霉素的条件下生长。在ABS₆₀₀光密度为1.5时，通过添加0.2％的阿拉伯糖和0.1mMIPTG对这两种质粒的表达进行诱导，并且将培养物保持在30℃下约16小时。使用镍亲和层析对蛋白进行纯化，进行SDSPAGE，接着是利用抗组氨酸抗体的蛋白质印迹。对于在糖基化质粒PJK-07而不是与糖基化一致的载体pMW07存在的条件下生长的Fab重链，迁移率变化是很明显的(图18)。

实施例18

在血型H抗原修饰的大肠杆菌中体内生成岩藻糖化糖肽

如上所述的实验表明如利用质谱测定所测定的通过GDP-岩藻糖生物合成途径的另外拷贝的表达的用于增加岩藻糖化产物的相对量的潜能。利用酵母同源重组进行修饰的编码糖基化受体肽的质粒pMGlX-Y包括以下基因：galE(空肠弯曲杆菌)、galE(大肠杆菌)、gmd、fcl、gmm、cpsB和cpsG以生成质粒pMGlX-GNF-Y。除胰高血糖素构建体以外，以相同的方式利用下面的基因(wbnK、galE(大肠杆菌)、gmd、fcl、gmm、cpsB和cpsG)克隆类似的质粒，称为pMGlX-KGF-Y。

在用于糖基化的制备中，利用质粒pDisJK-07对菌株LPS1进行转化。对此，加入对糖基化受体蛋白(pMGlX-Y)或具有GDP-岩藻糖生物合成机制的受体蛋白进行编码的质粒(pMGlX-GNF-Y，pMGlX-KGF-Y)。在30℃下在含有氨苄青霉素和氯霉素的LB培养基中的50mL培养物中使所得的菌株生长。当培养物达到近似光学密度ABS₆₀₀1.5时，利用加入0.2％阿拉伯糖和0.1mMIPTG对两种质粒均进行诱导。16小时后，采收球粒，并通过镍亲和层析对蛋白进行纯化。将洗脱液交换到50mM的Tris中，用TEV蛋白酶对100mM的NaCl和30ul的浓缩蛋白处理3小时以释放糖肽。

在ABSCIEXTOF/TOF质谱仪上利用二羟基苯甲酸(DHB)作为基质对糖肽进行分析(图19)。在由具有质粒pMGlX(左)的菌株制备而得的糖肽中出现了与预期大小的岩藻糖化糖肽(dHexHexHexNAc₂，m/z6103)及半乳糖基化糖肽(HexHexNAc₂，m/z5957)一致的峰值。副产物标有星号。包藏pMGlXGNF-Y的菌株的糖肽表现出一个与预期m/z的H-抗原糖肽一致的主峰值(dHexHexHExNAc2，m/z6105)。还在(m/z5960)出现一个另外的较小峰值，可能代表包含T抗原聚糖的剩余的未岩藻糖化糖肽(HexHexNAc₂)。

从菌株LPS1PJK-07pMGlXKGF-Y制备的糖肽被划分，并用α1,2岩藻糖苷酶(NEB)或缓冲液对照在37℃下处理8小时，之后利用DHB作为基质在ABSCIEXTOF/TOF质谱仪上分析(图20)。在只有缓冲液的样品(m/z6107)中出现的主峰值与预期大小的H-抗原聚糖(dHexHexHexNAc₂)是一致的。用岩藻糖苷酶处理的样品在(m/z5963)处具有与预期大小的gal末端T抗原聚糖(HexHexNAc₂)一致的主峰值。

实施例19

具有H抗原聚糖的GH2的糖基化

为了对重组人蛋白的糖基化进行检查，人生长激素胎盘变体(GH2)适于在大肠杆菌平台中表达。酵母中同源重组被用于将具有3’TEV蛋白酶裂解位点的malE基因序列与编码承载pTrcY中C-末端六组氨酸基序的基因进行融合。另外，围绕此蛋白的天然糖基化位点的序列被修饰以编码DQNAT。发现以改善H抗原聚糖的产生的基因(galECj、galEEc、gmd、fcl、gmm、cpsB、cpsG)插在编码GH2融合蛋白的序列的3’端的后面，以形成质粒pG4-His-GNF-Y。GH2融合蛋白的DNA序列被提供为SEQIDNO29。

pG4-HisGNF-Y用于转化大肠杆菌菌株LPS1，以用于具有H抗原聚糖的最优岩藻糖基化。将得到的菌株制成电效能的，并利用含有表达对于产生H抗原聚糖和寡糖转移酶PglB(pJK-07)所必需的糖基转移酶的基因的第二质粒进行转化。为了表达GH2和GH2-H抗原，用50mL过夜培养物接种1升LB，并在30℃下在分别选择100μg/mL氨苄青霉素或100ug/mL氨苄青霉素和25μg/mL氯霉素的条件下生长。在30℃下在振动台上对培养物进行孵育，直到ABS₆₀₀近似达到3.0。在30℃下用0.1mMIPTG对只含有pG4-His-GNF-Y质粒的培养物进行诱导，同时用0.1mMIPTG和0.2％v/v阿拉伯糖对含有G4-His-GNF-Y和pJK-07质粒的培养物进行诱导。

糖基化的纯化和测定

使细胞成球粒，然后在具有1mg/mL溶菌酶的Ni-NTA柱结合缓冲液中重新悬浮。在冰上将细胞孵育30分钟，然后通过超声处理用5秒脉冲进行破碎。超声处理后，然后将澄清的裂解物通过5μm过滤器和0.45μm过滤器进行过滤，并利用5mLHisTrapFF柱(GE医疗公司)进行Ni-亲和纯化。对蛋白进行缓冲交换到DEAE加样缓冲液中(20mMTris，pH6.8)，利用5mLDEAEHiTrapFF柱(GE医疗公司)进行纯化，并用NaCl梯度(0-500mM)在20mMTris(pH6.8)中洗脱。将洗脱的蛋白合并、浓缩、并交换到含有17mM的β巯基乙醇(BME)的Ni-NTA柱结合缓冲液中，然后用约1000UTEV蛋白酶处理并在室温下孵育过夜。通过考马斯染色的SDS-PAGE来对MBP裂解的成功进行评估。一旦裂解完成，然后将蛋白再带入20mLNi-NTA结合缓冲液中，并如上所述通过Ni-NTA树脂进行纯化。将组分浓缩至1mL并装入GST/直链淀粉混合树脂重力流动柱，以除去MPB和TEV。在柱洗涤缓冲液中发现hGH(50mMTris，1mMEDTA，200mMNaCl，pH7.4)。然后将各蛋白浓缩至约1mg/mL，在-80℃下保存。

将纯化的GH2-H抗原进行分析以对糖基化进行评估。通过SDS-PAGE对纯化的蛋白进行分离，并转移到PVDF上用于采用αhGH抗体进行检测的蛋白质印迹(AbeamAB9821)(图21，左图)。双峰出现与糖基化是一致的。通过MALDITOF质谱测定对GH2-H抗原进行进一步的分析。分析揭示，主峰值(m/z23047.8)与岩藻糖基化H抗原修饰的GH2蛋白的预期大小是一致的(图21，右图)，暗示有效的糖基化。在m/z22328.5处注意到的另外的峰是与预期大小的未糖基化蛋白是一致的。

实施例20

GH2-H抗原的体外和体内性质的评价

为了确定是否糖基化对蛋白稳定性有利，对糖基化和未糖基化形式的GH2进行比较。对各GH2形式的0.5mg/mL的溶液在0-10分钟范围内进行不同时间长度的涡旋。在ABS₄₀₅nm立即记录，以确定溶液的浊度。另外，还在ABS₂₈₀nm处进行监测，以确定浊度的增加是否是由于聚集引起的，其中，可溶性蛋白的损失会导致在ABS₂₈₀nm的计数的降低。对各个数据集作图，并确定变性的速率(图22a)。浊度的增加较慢，对于GH2-H抗原蛋白与单独GH2相比严苛度较小，与由变性诱导的较大的抗搅拌性是一致的。

为了确定GH2的糖基化是否影响受体结合，GH2的未糖基化和糖基化形式均接受基于ELISA的受体结合测定。利用2μg/mL的与IgG(hGHR)(R系统和D系统)融合的hGH受体的胞外域，使MaxiSorpELISA板在室温下孵育2小时。随后用封闭缓冲液(在PBS中，5％BSAw/v，0.1％吐温-20v/v)对板进行封闭1小时，然后用PBS洗涤。浓度范围为0-500nM的各个GH2形式在室温下在hGHR包被的ELISA板中孵育1小时，随后用封闭缓冲液洗涤。在室温下用抗HisTag-HRP抗体或抗-hGH抗体对各孔孵育1小时，随后用封闭缓冲液洗涤。在抗-hGH抗体的情况下，在室温下在各孔中对小鼠HRP-缀合2°抗体孵育45分钟。然后洗涤板孔，并用1步法UltraTMB-ELISA(Thermo)使其发展，用2M盐酸使反应停止，并在450nm处读数。通过在GraphPadPrism软件上绘制数值来确定各K_d值。计算的解离常数(K_d)：对于GH2是1.5±0.7×10¹nM，对于GH2-H抗原是1.6±0.9×10¹nM，暗示糖基化对于受体结合的效果是可以忽略的(图22b)。

体内半衰期

为了确定糖基化是否对GH2的半衰期有任何影响，在体内半衰期测定的大鼠模型中对每种形式进行了研究。对一组4只SpragueDawley雄性大鼠通过单次静脉推注给予300μg的1mg/mL的GH2或GH2-H抗原溶液。在24小时内的不同时间点抽取血液样品，并且通过离心分离血清。在碳酸盐缓冲液(pH9.6)中将抗-hGH抗体(Abeam)稀释成浓度2μg/mL，并用于在室温下对MaxisorpELISA板包被2小时。然后对板进行封闭、洗涤并在室温下在各时间点用血清孵育30min。在室温下将抗-HisTag-HRP缀合物抗体加入到各孔中30分钟，随后用1步法UltraTMB-ELISA(Thermo)使其发展。通过加入2MHCl使反应停止，并在450nm处记录吸光度。GH2-H抗原蛋白的检测比未糖基化型式更加稳健，在最后三个时间点上最为突出，这暗示H抗原聚糖的糖基化增强了血清持久性(图23)。

实施例21

具有相关结构的聚糖的产生

在用于在大肠杆菌中产生N-糖蛋白的策略设计中，一个重要的考虑因素是可能由许多因素决定的糖基化反应的效率。其中一个因素是可以对特定的聚糖结构显示的OST的任何选择性。在前述实施例中概述的糖型都是由GalNAcα1,3GlcNAc聚糖组成的有效转化的“基本”聚糖的扩展，从中形成的结构包括T抗原、(2,3)唾液酸T抗原、H抗原和(2,6)唾液酸化T抗原。这些例子已经部分地用作说明生成含有半乳糖化、唾液酸化和岩藻糖基化聚糖的大肠杆菌糖蛋白的能力的工具，然而并不意味着是能够从基本结构构成的聚糖结构的独有的表示。

例如除了相关的结构以外，Lewisx聚糖(Galβ1,4[Fucα1-3]GlcNAc)可以从T抗原聚糖中构成。要做到这一点，编码糖基转移酶的基因(例如来自流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)的具有β1,3GlcNAc转移酶(LsgE)和β1,4Gal转移酶(LsgD)活性的基因)与α1,3岩藻糖基转移酶(如幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)FucT[23])一起被插入到pdisJ-07质粒中。当与pGNF-70或pMGlX-GNF-Y共表达以允许所需的糖核苷酸的足够积聚时，将预期此质粒会导致具有结构Galβ1,4[Fucα1-3]GlcNAcβ1,3Galβ1,3GlcNAc的聚糖的产生。LsgE、LSGD和FucT蛋白的序列被包含作为SEQIDNO：30-32。

类似地，在实施方式中讨论的H抗原聚糖15-19可以进一步建立产生另外的相关结构。人血型决定簇AB和O是基于血型O聚糖(H抗原)的关联结构。大肠杆菌086天然形成一种与人血型B聚糖类似的寡糖，并且因而是对于H抗原聚糖延长所需的半乳糖基转移酶活性的潜在来源。通过将编码α1,3-半乳糖基转移酶WbnI[24]的基因插入现有的PJK-07质粒中并在与用以生成H抗原聚糖的条件类似的条件下进行表达，预期会导致产生具有结构Galα1,3[Fucα1,2]Galβ1,3GalNAcα1,3GlcNAc的聚糖。同样，α1,3GalNAc转移酶(例如源自雪貂螺杆菌(Helicobactermutelae)[25]的BgtA)可以被用来生成含有具有结构GalNAcα1,3[Fucα1,2]Galβ1,3GalNAcα1,3GlcNAc的A抗原的聚糖。WbnI和BgtA的氨基酸序列被包括作为SEQIDNO：33-34。

还进一步预期在此所述的寡糖可被组装在交替UndPP连接糖上。替代物可以包括GalNAc，GalNAc可通过空肠弯曲杆菌的糖基转移酶PglC(SEQIDNO：36)和糖核苷酸合成蛋白PglFED[27](SEQIDNO：37-39)的活性、通过来自于大肠杆菌O157[26](SEQIDNO：35)的GNE或杆菌胺被附着到UndP上。

非正式序列表

序列IDNo1

pMW07:载体

7610bpds-DNA

//

SEQIDNO2

galE:差向异构酶，空肠弯曲杆菌

EC5.1.3.2

987bpds-DNA

//

SEQIDNO3

pglB:OST，空肠弯曲杆菌

EC2.4.1.119

2142bpds-DNA

//

SEQIDNO4

pglA:α1,3-N-乙酰半乳糖胺转移酶

EC2.4.1.-

1131bpds-DNA

//

SEQIDNO5

wbnJ:β1,3半乳糖基转移酶

EC2.4.1.307

765bpds-DNA

//

SEQIDNO6

pTRC99Y

6866bpds-DNA

//

SEQIDNO7

MBP-hGH

1791bpds-DNA

//

SEQIDNO8

neuB:N-乙酰神经氨酸合酶

EC2.5.1.56

1041bpds-DNA

//

SEQIDNO9

neuA:N-乙酰神经氨酸胞苷酰转移酶

EC2.7.7.43

1257bpds-DNA

//

SEQIDNO10

neuC:UDP-N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶

EC5.1.3.14

1176bpds-DNA

//

SEQIDNO11

neuD:唾液酸生物合成蛋白，乙酰转移酶家族

EC2.3.1.45

624bpds-DNA

//

SEQIDNO12

lst:2,3NeuNAc转移酶

脑膜炎奈瑟氏球菌

EC2.4.99.4

1116bpds-DNA

//

SEQIDNO13

MBP-3TEV-胰高血糖素-4XGlycTag-6X-His

1416bpds-DNA

//

SEQIDNO14

MBP-3TEV-胰高血糖素-1XGlycTag-6X-His

1371bpds-DNA

//

SEQIDNO15

Pdst6:α2,6唾液酸转移酶

美人鱼发光杆菌

EC2.4.99.1

2028bpds-DNA直链的

//

SEQIDNO16

cstII:双官能2,32,8唾液酸转移酶

EC2.4.99.4,2.4.99.8

空肠弯曲杆菌

876bpds-DNA

//

SEQIDNO17

lic3b:双官能2,32,8唾液酸转移酶

EC2.4.99.4,2.4.99.8

流感嗜血杆菌

999bpds-DNA

//

SEQIDNO18

neuS:2,8聚唾液酸转移酶

EC2.4.99.8

大肠杆菌K1

1230bpds-DNA

//

SEQIDNO19

siaD:2,8聚唾液酸转移酶

EC2.4.99.8

脑膜炎奈瑟氏球菌

1431bpds-DNA

//

SEQIDNO20

wbnK:α1,2岩藻糖基转移酶

大肠杆菌O86

EC2.4.1.69

909bpds-DNA

//

SEQIDNO21

galE

大肠杆菌K12

EC5.1.3.2

1017bpds-DNA

//

SEQIDNO22

gmd:GDP–甘露糖4,6脱水酶

大肠杆菌K12

EC4.2.1.47

1122bpds-DNA

//

SEQIDNO23

Fcl:GDP-岩藻糖合成酶

大肠杆菌K12

EC1.1.1.271

966bpds-DNA

//

SEQIDNO24

gmm:GDP-甘露糖甘露糖基水解酶

大肠杆菌K12

EC3.2.1.42

480bpds-DNA

//

SEQIDNO25

cpsB:甘露糖-1-磷酸鸟苷酰转移酶

大肠杆菌K12

EC2.7.7.13

1437bpds-DNA

//

SEQIDNO26

cpsG:磷酸甘露糖变位酶

大肠杆菌K12

EC5.4.2.8

1371bpds-DNA

//

SEQIDNO27

TNFα轻链

708bpds-DNA

//

SEQIDNO28

TNFα重链-4Xdqnat-六组氨酸

876bpds-DNA

//

SEQIDNO29

malE-tev-gh2-六组氨酸

1797bpds-DNA

//

SEQIDNO30

LsgE:N-乙酰葡糖胺基转移酶

流感嗜血杆菌

EC2.4.1-

294a.a.

1MLSIIVPSYNRKAEVPALLE

21SLTQQTSSNFEVIIVDDYSK

41ERVVVEQRYSFPVTVIRNET

61NQGAAESRNIGARASKGDWL

81LFLDDDDRFMPEKCEKILQV

101IEQNPDINFIYHPAKCEMVN

121EGFTYVTQPIEPQEISTERI

141LLANKIGGMPMVAIKKEMFL

161KIGGLSTALRSLEDYDFLLK

181LLQESSFTPYKINEPLTYCT

201FHTKRSSVSTDTTNTQKAID

221YIREHYVKTVEQARNFDINA

241SYILAYPHIMNLSRKAAKYY

261FDIFKKTKSIKQFIITLVIL

281ISPKLAINLKRLGK*

//

SEQIDNO31

LsgD:半乳糖基转移酶

流感嗜血杆菌

EC2.4.1-

1MLKKYLISLDKDIQRRKLFF

21SQKNTEDFQIFSAINTMQKD

41WDELASIFNIEQFKAHYFRN

61VTKGEIGCTLSHLSVYQKIV

81EDNDIAEDSYALVCEDDALF

101HLDFQQNLTALLSEKLEAEI

121ILLGQSNINNFNDTDLEINY

141PTTFSFLCKKTGNVNYAFPY

161KSYFAGTVGYLIKKSAARRF

181IQQISQNKPFWLADDFLLFE

201QNFNIRNKVVRPLMVIENPV

221LISNLESVRGSLSNNLLKKL

241MKYPLKKIFAIKKNLAN*

SEQIDNO32

FucT:岩藻糖基转移酶

幽门螺杆菌

2.4.1.152

1MFQPLLDAYVESASIEKMASKSPPPLKIAV

31ANWWGDEEIKEFKNSVLYFILSQRYTITLH

61QNPNEFSDLVFGNPLGSARKILSYQNAKRV

91FYTGENESPNFNLFDYAIGFDELDFNDRYL

121RMPLYYDRLHHKAESVNDTTAPYKLKDNSL

151YALKKPSHCFKEKHPNLCAVVNDESDPLKR

181GFASFVASNPNAPIRNAFYDALNSIEPVTG

211GGSVRNTLGYNVKNKNEFLSQYKFNLCFEN

241TQGYGYVTEKIIDAYFSHTIPIYWGSPSVA

271KDFNPKSFVNVHDFKNFDEAIDYIKYLHTH

301KNAYLDMLYENPLNTLDGKAYFYQNLSFKK

331ILAFFKTILENDTIYHDNPFIFCRDLNEPL

361VTIDDLRVNYDDLRVNYDDLRINYDDLRVN

391YDDLRINYDDLRVNYDDLRVNYDDLRINYD

421DLRVNYDDLRVNYERLLSKATPLLELSQNT

451TSKIYRKAYQKSLPLLRAIRRWVKKLGL*

SEQIDNO33

WbnI

大肠杆菌086

EC2.4.1.37

1MVINIFYICTGEYKRFFDKF

21YLSCEDKFIPEFGKKYYVFT

41DSDRIYFSKYLNVEVINVEK

61NCWPLNTLLRFSYFLKVIDK

81LQTNSYTFFFNANAVIVKEI

101PFSTFMESDLIGVIHPGYKN

121RISILYPWERRKNATCYLGY

141LKKGIYYQGCFNGGKTASFK

161RLIQICNMMTMADLKKNLIA

181KVHDESYLNYYYYYNKPLLL

201SELYSWPEKYGENKDAKIIM

221RDKERESWYGNIKK*

SEQIDNO34

BgtA:α-N-乙酰半乳糖胺基转移酶

雪貂螺杆菌(Helicobactermustelae)

EC2.4.1.40

1MQSTAQNTQQNTHFAGSSQT

21TPQAAQSVQQASLALPKSSP

41TCYKIAILYICTGAYSIFWQ

61DFYDSAKVHLLPAHRLTYFV

81FTDADSLYAEEASDVRKIYQ

101ENLGWPFNTLKRFEMFLGQE

121EALREFDFVFFFNANCLFFQ

141HIGDEFLPIEEDILVTQHYG

161FRDASPECFTYERNPKSLAY

181VPFGKGKAYVYGSTNGGKAG

201AFLALARTLQERIQEDLSRG

221IIAIWHDESHLNAYIIDHPN

241YKMLDYGYGFPEGYGRVPGG

261GVYIFLRDKSRVIDVNAIKG

281MGSPANRRLKNALRKLKHFS

301KRLLGR*

SEQIDNO35

GNE:akaz3206UDP-N-乙酰葡糖胺4-差向异构酶

大肠杆菌

EC5.1.3.c

1MNDNVLLIGASGFVGTRLLE

21TAIADFNIKNLDKQQSHFYP

41EITQIGDVRDQQALDQALAG

61FDTVVLLAAEHRDDVSPTSL

81YYDVNVQGTRNVLAAMEKNG

101VKNIIFTSSVAVYGLNKHNP

121DENHPHDPFNHYGKSKWQAE

141EVLREWYNKAPTERSLTIIR

161PTVIFGERNRGNVYNLLKQI

181AGGKFMMVGAGTNYKSMAYV

201GNIVEFIKYKLKNVAAGYEV

221YNYVDKPDLNMNQLVAEVEQ

241SLNKKIPSMHLPYPLGMLGG

261YCFDILSKITGKKYAVSSVR

281VKKFCATTQFDATKVHSSGF

301VAPYTLSQGLDRTLQYEFVH

321AKKDDITFVSE*

SEQIDNO36

PglC:杆菌胺转移酶

空肠弯曲杆菌

EC2.7.8.6

1MYEKVFKRIFDFILALVLLV

21LFSPVILITALLLKITQGSV

41IFTQNRPGLDEKIFKIYKFK

61TMSDERDEKGELLSDELRLK

81AFGKIVRSLSLDELLQLFNV

101LKGDMSFVGPRPLLVEYLSL

121YNEEQKLRHKVRPGITGWAQ

141VNGRNAISWQKKFELDVYYV

161KNISFLLDLKIMFLTALKVL

181KRSGVSKEGHVTTEKFNGKN

201*

SEQIDNO37

PglD:UDP-N-乙酰杆菌胺N-乙酰转移酶

空肠弯曲杆菌

EC2.3.1.203

1MARTEKIYIYGASGHGLVCE

21DVAKNMGYKECIFLDDFKGM

41KFENTLPKYDFFIAIGNNEI

61RKKIYQKISENGFKIVNLIH

81KSALISPSASVEENAGILIM

101PYVVINAKAKIEKGVILNTS

121SVIEHECVIGEFSHVSVGAK

141CAGNVKIGKNCFLGINSCVL

161PNLSLADDSILGGGATLVKS

181QNEKGVFVGVPAKRKI*

SEQIDNO38

PglE:氨基转移酶

空肠弯曲杆菌

EC2.6.1.34

1MRFFLSPPHMGGNELKYIEE

21VFKSNYIAPLGEFVNRFEQS

41VKDYSKSENALALNSATAAL

61HLALRVAGVKQDDIVLASSF

81TFIASVAPICYLKAKPVFID

101CDETYNIDVDLLKLAIKECE

121KKPKALILTHLYGNAAKMDE

141IVEICKENEIVLIEDAAEAL

161GSFYKNKALGTFGEFGAYSY

181NGNKIITTSGGGMLIGKNKE

201KIEKARFYSTQARENCLHYE

221HLDYGYNYRLSNVLGAIGVA

241QMEVLEQRVLKKREIYEWYK

261EFLGEYFSFLDELENSRSNR

281WLSTALIDFDKNELNACQKD

301INISQKNITLHPKISKLIED

321LKNEQIETRPLWKAMHTQEV

341FKGTKAYLNGNSELFFQKGI

361CLPSGTAMSKDDVYEISKLI

381LKSIKA*

SEQIDNO39

PglF:脱水酶

空肠弯曲杆菌

EC4.2.1.135

1MIFYKSKRLAFFLTSDIVLI

21LLSVYLAFSLRFSGDIPSIF

41YHGMMVSAIILLVLKLSFLF

61VFRIYKVAWRFFSLNEARKI

81FIALLLAEFCFFLIFYFFSD

101FFNPFPRSAIVIDFVLSYMF

121IGTLRISKRMLVDFKPSKMK

141EEETPCIVVGATSKALHLLK

161GAKEGSLGLFPVGVVDARKE

181LIGTYCDKFVVEEKEKIKSY

201VEQGVKTAIIALRLEQEELK

221KLFEELVAYGICDVKIFSFT

241RNEARDISIEDLLARKPKDL

261DDSAVAAFLKDKVVLVSGAG

281GTIGSELCKQCIKFGAKHLI

301MVDHSEYNLYKINDDLNLYK

321EKITPILLSILDKQSLDEVL

341KTYKPELILHAAAYKHVPLC

361EQNPHSAVINNILGTKILCD

381SAKENKVAKFVMISTDKAVR

401PTNIMGCTKRVCELYTLSMS

421DENFEVACVRFGNVLGSSGS

441VIPKFKAQIANNEPLTLTHP

461DIVRYFMLVAEAVQLVLQAG

481AIAKGGELFVLDMGKPVKII

501DLAKKMLLLSNRNDLEIKIT

521GLRKGEKLYEELLIDENDAK

541TQYESIFVAKNEKVDLDWLN

561KEIENLQICEDISEALLKIV

581PEFKHNKEGI*

SEQIDNO40

WbnH:α1,3GalNAc转移酶

大肠杆菌

EC2.4.1.306

1017bpds-DNA

//

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25.YiW,ShenJ,ZhouG,LiJ,WangPG:BacterialHomologueofHumanBloodGroupATransferase.JournaloftheAmericanChemicalSociety2008,130(44):14420-14421.

26.RushJS,AlaimoC,RobbianiR,WackerM,WaechterCJ:ANovelEpimeraseThatConvertsGlcNAc-P-P-undecaprenoltoGalNAc-P-P-undecaprenolinEscherichiacoli0157.JournalofBiologicalChemistry2010,285(3):1671-1680.

27.GloverKJ,WeerapanaE,NumaoS,ImperialiB:ChemoenzymaticSynthesisofGlycopeptideswithPglB,aBacterialOligosaccharylTransferasefromCampylobacterjejuni.Chemistryandbiology2005,12(12):1311-1316.

Claims (27)

1.一种包含GalNAc转移酶活性和半乳糖基转移酶活性的重组宿主细胞，其中，该宿主细胞产生包含与脂质载体连接的一个或多个GalNAc残基、半乳糖残基或半乳糖-GalNAc残基的寡糖组合物。

2.如权利要求1所述的宿主细胞，其中，该宿主细胞还包含从岩藻糖基转移酶、唾液酸转移酶和N-乙酰葡糖胺基转移酶中选择的一种或多种酶活性，其中，该宿主细胞产生包含与脂质载体连接的至少一种岩藻糖残基、唾液酸残基或GlcNAc残基的寡糖组合物。

3.如权利要求1所述的宿主细胞，该宿主细胞包含从UndPN-乙酰葡糖胺基转移酶、UndPPGalNAc差向异构酶和UndP杆菌胺转移酶中选择的一种或多种活性。

4.如权利要求1所述的宿主细胞，其中，该GalNAc转移酶活性包含α1,3N-乙酰半乳糖胺转移酶活性。

5.如权利要求1所述的宿主细胞，其中，该半乳糖基转移酶活性包含从β1,3半乳糖基转移酶、β1,4半乳糖基转移酶和α1,3半乳糖基转移酶活性中选择的一种或多种活性。

6.如权利要求2所述的宿主细胞，其中，该岩藻糖基转移酶活性包含从α1,2岩藻糖基转移酶、α1,3岩藻糖基转移酶和α1,3/1,4岩藻糖基转移酶中选择的一种或多种活性。

7.如权利要求2所述的宿主细胞，其中，该N-乙酰葡糖胺基转移酶活性包含β1,3N-乙酰葡糖胺基转移酶活性。

8.如权利要求2所述的宿主细胞，其中，该唾液酸转移酶活性包含从α2,3NeuNAc转移酶、α2,6NeuNAc转移酶、双官能α2,3α2,8NeuNAc转移酶和α2,8聚唾液酸转移酶活性中选择的一种或多种活性。

9.如权利要求3所述的宿主细胞，其中，该UndPN-乙酰葡糖胺基转移酶活性包含十一异戊烯磷酸α-N-乙酰葡糖胺基转移酶活性。

10.如权利要求3所述的宿主细胞，其中，该UndPPGalNAc差向异构酶活性包含N-乙酰-α-D-葡糖胺基-二磷酸-二反、八顺-十一萜醇4-差向异构酶活性。

11.如权利要求3所述的宿主细胞，其中，该UndP杆菌胺转移酶活性包含十一异戊烯磷酸N,N’-双乙酰杆菌胺1-磷酸转移酶活性。

12.如权利要求1所述的宿主细胞，其中，该宿主细胞还包含从N-乙酰神经氨酸裂解酶、十一异戊烯磷酸葡萄糖磷酸转移酶和O-抗原连接酶活性中选择的至少一种酶活性的衰减。

13.如权利要求1所述的宿主细胞，其中，该宿主细胞还包含从N-乙酰神经氨酸合酶、N-乙酰神经氨酸胞苷酰转移酶、UDP-N-乙酰葡糖胺-2-差向异构酶和N-乙酰神经氨酸乙酰转移酶中选择的一种或多种活性。

14.如权利要求1所述的宿主细胞，其中，该宿主细胞还包含GalNAc差向异构酶活性。

15.如权利要求1所述的宿主细胞，其中，该宿主细胞还包含Gal差向异构酶活性。

16.如权利要求1所述的宿主细胞，其中，该宿主细胞还包含从GDP-甘露糖-4,6-脱水酶、GDP-岩藻糖合成酶、GDP-甘露糖甘露糖基水解酶、甘露糖-1-磷酸鸟苷酰转移酶和磷酸甘露糖变位酶中选择的一种或多种酶活性。

17.如权利要求1所述的宿主细胞，其中，该宿主细胞还包含从UDP-N-乙酰杆菌胺-N-乙酰转移酶、UDP-N-乙酰葡糖胺-4,6-脱水酶和UDP-N-乙酰杆菌胺转氨酶中选择的一种或多种酶活性。

18.如权利要求1所述的宿主细胞，其中，该宿主细胞产生表征为人或类人抗原的一种或多种寡糖组合物，该人或类人抗原选自A抗原、H抗原、B抗原、T抗原、唾液酸T抗原、LewisX抗原和聚唾液酸化抗原。

19.如权利要求1或2所述的宿主细胞，其中，该宿主细胞产生一种或多种选自于以下的寡糖组合物：

a.(Siaα2,8)_n–Siaα2,8–Siaα2,3–Galβ1,3–GalNAcα1,3–GalNAcα1,3–GlcNAcβ1-；

b.(Siaα2,8)_n–Siaα2,8–Siaα2,3–Galβ1,3–GalNAcα1,3–GlcNAcβ1-；

c.(Siaα2,8)_n–Siaα2,8–Siaα2,3–Galβ1,3–GalNAcα1,3–GalNAcα1-；

d.Siaα2,8)_n–Siaα2,8–Siaα2,3–Galβ1,3–GalNAcα1,3–Bacα1-；

e.Siaα2,8–Siaα2,3–Galβ1,3–GalNAcα1,3–GlcNAcβ1-；

f.Siaα2,8–Siaα2,3–Galβ1,3–GalNAcα1,3–GalNAcα1-；

g.Siaα2,8–Siaα2,3–Galβ1,3–GalNAcα1,3–Bacα1-；

h.Siaα2,3–Galβ1,3–GalNAcα1,3–GlcNAcβ1-；

i.Siaα2,3–Galβ1,3–GalNAcα1,3–GalNAc1-；

j.Siaα2,3–Galβ1,3–GalNAcα1,3–Bacα1-；

k.Siaα2,6–Galβ1,3–GalNAcα1,3–GlcNAcβ1-；

l.Siaα2,6–Galβ1,3–GalNAcα1,3–GalNAcα1-；

m.Siaα2,6–Galβ1,3–GalNAcα1,3–Bacα1-；

n.Fucα1,2–Galβ1,3–GalNAcα1,3–GlcNAcβ1-；

o.Fucα1,2–Galβ1,3–GalNAcα1,3–GalNAcα1-；

p.Fucα1,2–Galβ1,3–GalNAcα1,3–Bacα1-；

q.Galα1,3[Fucα1,2]Galβ1,3–GalNAcα1,3–GlcNAcβ1-；

r.Galα1,3[Fucα1,2]Galβ1,3–GalNAcα1,3–GalNAcα1-；

s.Galα1,3[Fucα1,2]Galβ1,3–GalNAcα1,3–Bacα1-；

t.GalNAcα1,3[Fucα1,2]Galβ1,3–GalNAcα1,3–GlcNAcβ1-；

u.GalNAcα1,3[Fucα1,2]Galβ1,3–GalNAcα1,3–GalNAcα1-；

v.GalNAcα1,3[Fucα1,2]Galβ1,3–GalNAcα1,3–Bacα1-；

w.Galβ1,4[Fucα1-3]GlcNAcβ1,3–Galβ1,3–GlcNAcβ1-；

x.Galβ1,4[Fucα1-3]GlcNAcβ1,3–Galβ1,3–GalNAcα1-；

y.Galβ1,4[Fucα1-3]GlcNAcβ1,3–Galβ1,3–Bacα1-；

z.Galβ1,3–GalNAcα1,3–GlcNAcβ1-；

aa.Galβ1,3–GalNAcα1,3–Bacα1-；和

bb.Galβ1,3–GalNAcα1,3–GalNAc1-。

20.如权利要求1或2所述的宿主细胞，其中，该宿主细胞还包含编码目的异源蛋白的基因。

21.如权利要求20所述的宿主细胞，其中，该目的蛋白包含该寡糖组合物。

22.如权利要求20所述的宿主细胞，其中，该宿主细胞还包含能够将该寡糖组合物转移到目的蛋白的N-糖基化受体位点上的寡糖基转移酶活性。

23.一种由如权利要求1或2所述的宿主细胞产生的寡糖组合物。

24.一种由如权利要求20所述的宿主细胞产生的糖蛋白组合物。

25.一种包含如权利要求1或2所述的宿主细胞的细胞培养物。

26.一种用于产生寡糖组合物的方法，该方法包含对如权利要求1或2所述的重组宿主细胞进行培养。

27.一种用于产生糖蛋白组合物的方法，该方法包含对如权利要求20所述的重组宿主细胞进行培养。