KR101589554B1 - 원핵생물에서의 글리코실화 단백질 발현 - Google Patents

Abstract

본 발명은 진핵생물 글리코실 트랜스퍼라제 활성을 포함하는 원핵생물 숙주 세포로서, 이 진핵생물 글리코실 트랜스퍼라제 활성이 진핵생물 돌리킬 연결 UDP-GlcNAc 트랜스퍼라제 활성 및 진핵생물 만노실 트랜스퍼라제 활성인 원핵생물 숙주 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 진핵생물 글리코실 트랜스퍼라제 활성을 포함하는 원핵생물 숙주 세포를 제공하고 글리코실화 단백질을 생산하기에 효과적인 조건하에 원핵생물 숙주 세포를 배양하여 글리코실화 단백질을 생산하는 방법을 개시한다. 본 발명의 다른 양태는 박테리아 표면 위에 하나 이상의 글리칸을 발현시키고, 박테리아 표면 또는 그 박테리아 유래의 박테리오파지 표면 위의 하나 이상의 글리칸에 표지를 부착시키고, 상기 표지를 고속 작업 방식으로 분석하여 박테리아 또는 박테리오파지를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 자연 항원을 인식하여 이에 결합하는 Fv 부분, 및 보존된 아스파라긴 잔기에서 글리코실화된 Fc 부분을 포함하는 글리코실화 항체를 개시한다.

Description

원핵생물에서의 글리코실화 단백질 발현{GLYCOSYLATED PROTEIN EXPRESSION IN PROKARYOTES}

본원은 2008년 1월 3일자에 출원된 미국 가출원 제61/018,772호의 우선권 이익을 주장하고, 이는 본원에 그 전문이 참조문헌으로 포함된다.

[기술분야]

본 발명은 원핵생물에서의 글리코실화 단백질 발현에 관한 것이다.

글리코요법

현재 FDA에 의해 승인받은 신규한 약물 4개 중 1개가 단백질 기반 치료제이다(Walsh, G., "Biopharmaceutical Benchmarks," Nat Biotechnol 18:831-3 (2000); Walsh, G., "Biopharmaceutical Benchmarks," Nat Biotechnol 21:865-70 (2003); Walsh, G., "Biopharmaceutical Benchmarks," Nat Biotechnol 24:769-76 (2006)).

이. 콜라이(E. coli)와 같은 원핵생물 발현 시스템을 이용하여 일부 단백질 치료제(예를 들면, 인슐린)를 생산할 수 있지만, 매우 많은 치료용 단백질은 이의 완전한 생물학적 기능을 획득하기 위해 원핵생물에서는 없는 것으로 생각되는 추가의 번역후 변형(post-translational modification)을 요한다. 특히, N 연결 단백질 글리코실화는 모든 진핵생물 단백질 종의 절반 이상에 영향을 미치는 것으로 예상되고(Apweiler et al., "On the Frequency of Protein Glycosylation, as Deduced From Analysis of the SWISS-PROT Database," Biochim Biophys Acta 1473:4-8 (1999)), 많은 단백질에서 적절한 폴딩, 약동학적 안정성, 조직 표적화 및 유효성에 대개 필수적이다(Helenius et al., "Intracellular Functions of N-linked Glycans," Science 291:2364-9 (2001)). 대부분의 박테리아가 그 자체의 단백질을 글리코실화하지 않으므로, 항체를 비롯한 대부분의 치료학적 관련 당단백질의 발현은 포유동물 세포로 전락한다. 그러나, 포유동물 세포 배양물은 (ⅰ) 박테리아에 비해 CHO 세포와 같은 진핵생물 숙주의 매우 높은 제조 비용 및 낮은 부피 생산성; (ⅱ) 레트로바이러스 오염; (ⅲ) 안정한 세포주를 생성시키는 데 필요한 비교적 긴 시간; (ⅳ) 유전자 변형을 통해 안정한 "고생산" 진핵생물 세포주를 신속히 생성시키는 상대적 불능; 및 (ⅴ) 내인성 비인간 글리코실화 경로를 갖는 CHO와 같은 숙주 세포를 사용할 때 발생하는 당형태 이종성에 의해 일어나는 높은 제품 다양성을 비롯한 다수의 단점을 겪는다(Choi et al., "Use of Combinatorial Genetic Libraries 내지 Humanize N-linked Glycosylation in the Yeast Pichia pastoris," Proc Natl Acad Sci U S A 100:5022-7 (2003)). 반면, 이. 콜라이에서의 발현은 이러한 제한을 겪지 않는다.

이. 콜라이에서의 치료용 글리코실화 단백질의 발현

많은 치료용 재조합 단백질은 현재 숙주 생물체로서 이. 콜라이를 사용하여 발현된다. 가장 좋은 실례 중 하나는 인간 인슐린이고, 이는 1982년에 일라이 릴리(Eli Lilly)가 이. 콜라이에서 처음 생산하였다. 이후로, 인간 성장 호르몬(hGH), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 인슐린양 성장 인자(IGF-1, IGFBP-3), 케라티노사이트 성장 인자, 인터페론(IFN-α, IFN-β1b, IFN-γ1b), 인터류킨(IL-1, IL-2, IL-11), 조직 괴사 인자(TNF-α) 및 조직 플라스미노겐 활성제(tPA)를 비롯하여 이. 콜라이 발현에 의존하는 매우 많은 인간 치료용 단백질이 미국 및 유럽에서 승인받았다. 그러나, 거의 모든 당단백질은 포유동물 세포에서 생산된다. 정상적으로 글리코실화된 단백질이 이. 콜라이에서 발현될 때, 그 숙주 내에서의 글리코실화의 결여는 기능이 손상된 단백질을 생성시킬 수 있다. 예를 들면, 비글리코실화 인간 단일클론 항체(mAb)(예를 들면, 항조직 인자 IgG1)가 이. 콜라이에서 가용성 형태로 및 높은 수준으로 발현될 수 있다(Simmons et al., "Expression of Full-length Immunoglobulins in Escherichia coli: Rapid and Efficient Production of Aglycosylated Antibodies," J Immunol Methods 263:133-47 (2002)). 그러나, 이. 콜라이 유래의 mAb가 그의 동족체 항원 및 신생아 수용체에 단단한 결합을 보유하고 포유동물 세포 유래의 항체에 필적하는 순환 반감기를 나타내지만, 이 mAb는 N-글리칸의 부재로 인해 C1q 및 FcγRI 수용체에 결합할 수 없다.

진핵생물 및 원핵생물 N 연결 단백질 글리코실화

N 연결 단백질 글리코실화는 진핵생물 생물체의 소포체(ER)에서 필수적 및 보존적 과정이다(Burda et al., "The Dolichol Pathway of N-linked Glycosylation," Biochim Biophys Acta 1426:239-57 (1999)). N 연결 단백질 글리코실화는 분비 및 막 단백질의 단백질 폴딩, 올리고머화, 품질 관리, 분류 및 수송에 중요하다(Helenius et al., "Intracellular Functions of N-linked Glycans" Science 291:2364-9 (2001)). 진핵생물 N 연결 단백질 글리코실화 경로(도 1)는 (ⅰ) 소포체 막에서의 지질 연결 올리고사카라이드의 어셈블리 및 (ⅱ) 지질 고정체 돌리킬 피로포스페이트로부터 신생 폴리펩티드의 선택된 아스파라긴 잔기로의 올리고사카라이드의 이동의 2개의 다른 과정으로 세분될 수 있다. N 연결 단백질 글리코실화의 특징, 즉 (ⅰ) 올리고사카라이드 어셈블리에 대한 캐리어로서의 돌리킬 피로포스페이트(Dol-PP)의 사용, (ⅱ) 완전 조립된 Glc₃Man₉GlcNAc₂ 올리고사카라이드만의 수송 및 (ⅲ) 서열 N-X-S/T(여기서, N은 아스파라긴이고, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이며, S/T는 세린/트레오닌임)를 특징으로 하는 아스파라긴 잔기의 인식(Gavel et al., "Sequence Differences Between Glycosylated and Non-glycosylated Asn-X-Thr/Ser Acceptor Sites: Implication for Protein Engineering," Protein Eng 3:433-42 (1990))는 진핵생물에서 고도로 보존된다. 올리고사카릴트랜스퍼라제(OST)는 지질 도너(donor) 돌리킬피로포스페이트로부터 억셉터(acceptor) 단백질로의 올리고사카라이드의 이동을 촉매한다. 효모에서, 생체내 착체를 구성하는 8개의 상이한 막 단백질이 동종되었다(Kelleher et al., "An Evolving View of the Eukaryotic Oligosaccharyltransferase," Glycobiology 16:47R-62R (2006)). STT3는 OST의 촉매 서브유닛인 것으로 생각된다(Nilsson et al., "Photocross-linking of Nascent Chains 내지 the STT3 Subunit of the Oligosaccharyltransferase Complex," J Cell Biol 161:715-25 (2003); Yan et al., "Studies on the Function of Oligosaccharyl Transferase Subunits. Stt3p is Directly Involved in the Glycosylation Process," J Biol Chem 277:47692-700 (2002)). STT3는 OST 착체에서 가장 잘 보존된 서브유닛이다(Burda et al., "The Dolichol Pathway of N-linked Glycosylation," Biochim Biophys Acta 1426:239-57 (1999)).

반대로, 박테리아에서의 글리코실화 경로의 결여는 치료용 단백질 생산용 원핵생물 발현 숙주의 사용을 크게 제한하는데, 이는 특히 일부 견해에 의하면 "자연의 모든 단백질의 절반 이상이 결국 당단백질인 것으로 밝혀질 것"이기 때문이다(Apweiler et al., "On the Frequency of Protein Glycosylation, as Deduced From Analysis of the SWISS-PROT Database," Biochim Biophys Acta 1473:4-8 (1999)). 그러나, 최근에 병원성 박테리아인 씨. 제주니(C. jejuni)의 게놈이 N 연결 단백질 글리코실화에 대한 경로를 코딩한다는 것이 밝혀졌다(Szymanski et al., "Protein Glycosylation in Bacterial Mucosal Pathogens," Nat Rev Microbiol 3:225-37 (2005)). 지만스키(Szymanski) 및 그 동료에 의해 1999년에 처음 동종된 이 경로에 대한 유전자(Szymanski et al., "Evidence for a System of General Protein Glycosylation in Campylobacter jejuni," Mol Microbiol 32:1022-30 (1999))는 단백질 글리코실화에 대해 pgl이라 명칭된 17 kb 유전자좌를 포함한다. pgl 유전자좌 발견 이후, 린톤(Linton) 등은 2002년에 PEB3 및 CgpA의 2개의 씨. 제주니 당단백질을 동종하였고, 씨. 제주니 유래의 당단백질이 N-아세틸 갈락토사민(GalNAc) 특이적 렉틴 대두 응집소(SBA)에 결합한다는 것을 밝혔다(Linton et al., "Identification of N-acetylgalactosamine-containing Glycoproteins PEB3 and CgpA in Campylobacter jejuni," Mol Microbiol 43:497-508 (2002)). 그 직후, 영(Young) 등은 PEB3 및 CgbA를 비롯한 30개 이상의 잠재적 씨. 제주니 당단백질을 동종하였고, 질량 분광법 및 NMR을 사용하여 N 연결 글리칸이 구조 GalNAc-α1,4-GalNAc-α1,4-[Glcβ1,3]GalNAc-α1,4-GalNAc-α1,4-GalNAc-α1,3-Bac-β1,N-Asn(GalNAc₅GlcBac, 여기서 Bac는 바실로사민 또는 2,4-디아세트아미도-2,4,6-트리데옥시글루코스)를 갖는 헵타사카라이드라는 것을 밝혔다(Young et al., "Structure of the N-linked Glycan Present on Multiple Glycoproteins in the Gram-negative Bacterium, Campylobacter jejuni," J Biol Chem 277:42530-9 (2002))(도 2). 내부 막의 세포질 측에서의 지질 캐리어 운데카프레닐피로포스페이트 상에 뉴클레오티드 활성화 당을 연속 첨가하여 분지된 헵타사카라이드를 합성하고(Feldman et al., "Engineering N-linked Protein Glycosylation with Diverse O Antigen Lipopolysaccharide Structures in Escherichia coli," Proc Natl Acad Sci U S A 102:3016-21 (2005)), 일단 조립되면, 추상적 ATP 결합 카세트(ABC) 수송체 WlaB에 의해 막을 거쳐 역전된다(Alaimo et al., "Two Distinct But Interchangeable Mechanisms for Flipping of Lipid-linked Oligosaccharides," Embo J 25:967-76 (2006); Kelly et al., "Biosynthesis of the N-linked Glycan in Campylobacter jejuni and Addition Onto Protein Through Block Transfer," J Bacteriol 188:2427-34 (2006)). 다음에, 주변 세포질 내 기질 단백질로의 헵타사카라이드의 이동은 진핵생물 OST STT3의 촉매 서브유닛과 상당한 서열 유사성을 갖는 단일 내재성 막 단백질인 PglB라 명칭된 OST에 의해 촉매된다(Young et al., "Structure of the N-linked Glycan Present on Multiple Glycoproteins in the Gran-negative Bacterium, Campylobacter jejuni," J Biol Chem 277:42530-9 (2002)). PglB는 진핵생물 글리코실화 과정에서 사용되는 세쿠온(N-X-S/T)과 유사한 세쿠온인 모티프 D/E-X₁-N-X₂-S/T(여기서, D/E는 아스파트산/글루탐산이고, X₁ 및 X₂는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이며, N은 아스파라긴이고, S/T는 세린/트레오닌임) 내 아스파라긴에 헵타사카라이드를 부착시킨다(Kowarik et al., "Definition of the Bacterial N-Glycosylation Site Consensus Sequcence," Embo J 25:1957-66 (2006)).

미생물의 글리코 조작

포유동물, 효모 또는 심지어 박테리아 숙주 세포 내에서 치료용 당단백질을 발현시킬 때 마주치는 대부분의 문제점은 비인간 글리칸의 추가이다. 예를 들면, 치료용 당단백질의 생산에 가장 흔히 사용되는 2개의 시스템 중 1개인 효모는 (100개까지의 만노스 잔기를 함유하는) 고도의 면역원성 만난형 N-글리칸을 재조합 당단백질로 이동시킨다. 또한, 포유동물 발현 시스템은 (CHO 세포 및 젓에서 생산된) 살리실산의 N-글리코실뉴라민산(Neu5Gc) 형태 또는 (쥐과 세포에서 생산된) 말단 α(1,3)-갈락토스(Gal)와 같은 비인간 당 잔기를 갖는 치료용 단백질을 변형시킬 수 있다. 비인간 당을 보유하는 치료용 단백질의 반복 투여에 의해 인간에서의 면역 반응을 비롯한 부작용이 생길 수 있다.

치료용 당단백질을 생산하기 위한 자연 글리코실화 시스템의 사용에 대한 대안적으로, 글리코 조작된 발현 시스템의 사용으로 치료용 단백질의 글리코실화가 맞춤화될 수 있고 개선된 치료용 당단백질이 개발될 수 있다. 이러한 시스템은 원치않는 글리칸을 제거하고 고도의 동종성으로 인간 글리코실화를 수행하는 가능성을 가질 것이다. 현재까지, 효모 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)만이 글리코 조작되어 특정한 치료학적 기능에 대해 글리코실화를 제어하고 최적화하는 능력을 발현 시스템에 제공하였다(Gerngross, T. U., "Advances in the Production of Human Therapeutic Proteins in Yeasts and Filamentous fungi," Nat Biotechnol 22:1409-14 (2004); Hamilton et al., "Glycosylation Engineering in Yeast: The Advent of Fully Humanized Yeast," Curr Opin Biotechnol 18:387-92 (2007); Wildt et al., "The Humanization of N-glycosylation Pathways in Yeast," Nat Rev Microbiol 3:119-28 (2005)).

예를 들면, 일련의 글리코 조작된 피. 파스토리스 균주를 사용하여 단일클론 항체 리투산(Rituxan)(항CD20 IgG1 항체)의 다양한 당형태를 생성하였다(Li et al., "Optimization of Humanized IgGs in Glycoengineered Pichia pastoris," Nat Biotechnol 24:210-5 (2006)). 이 항체가 상업용 리투산과 동일한 아미노산 서열을 공유하지만, 특정한 당형태는 관련 FcγIII 수용체에 약 100배 더 높은 결합 친화도를 나타내고 개선된 시험관내 인간 B 세포 고갈을 나타냈다(Li et al., "Optimization of Humanized IgGs in Glycoengineered Pichia pastoris," Nat Biotechnol 24:210-5 (2006)). 약간의 단점이 없는 글리코 조작된 피. 파스토리스의 엄청난 성공 및 가능성은 존재하지 않는다. 예를 들면, 효모 및 모든 다른 진핵생물에서, N 연결 글리코실화는 생존능력에 필수적이다(Herscovics et al., "Glycoprotein Biosynthesis in Yeast," FASEB J 7:540-50 (1993); Zufferey et al., "STT3, a Highly Conserved Protein Required for Yeast Oligosaccharyl Transferase Activity In Vivo," EMBO J 14:4949-60 (1995)). 따라서, 게른그로스(Gerngross) 및 그 동료에 의한 많은 원치않는 효모 N-글리코실화 반응의 전신 제거 및 재조작(Choi et al., "Use of Combinatorial Genetic Libraries 내지 Humanize N-linked Glycosylation in the Yeast Pichia pastoris," Proc Natl Acad Sci U S A 100:5022-7 (2003))은 야생형 원세포와 비교하여 "병적인" 균주를 생성시킨다. 이는 효모 글리코실화 시스템에 대한 큰 대사 부담으로 인해 고수준 당단백질 발현 동안 약화될 수 있다. 그 결과, 대규모 발효 동안 얻을 수 있는 세포 수율은 제한된다. 또한, 만난형 N-글리칸의 제거는 효모에서 글리코실화 사건(story)의 절반에 불과하다. 이는 효모가 또한 O 연결 글리코실화를 수행하고, O-글리칸은 당단백질에서 Ser 또는 Thr 잔기에 연결되기 때문이다(Gentzsch et al., "The PMT Gene Family: Protein O-glycosylation in Saccharomyces cerevisiae is Vital," EMBO J 15:5752-9 (1996)). N 연결 글리코실화에 의해, O-글리코실화는 생존능력에 필수적이고(Gentzsch et al., "The PMT Gene Family: Protein O-glycosylation in Saccharomyces cerevisiae is Vital," EMBO J 15:5752-9 (1996)), 따라서 글리코 조작된 효모로부터 유전적으로 결실될 수 없다. 효모와 인간의 O-글리코실화 기계 사이에 차이가 존재하므로, 글리코 조작된 효모 균주에 의한 O-글리칸의 가능한 추가는 면역 반응을 비롯한 부작용을 유발할 가능성을 갖는다.

최근, 에비(Aebi) 및 그 동료는 씨. 제주니 글리코실화 유전자좌를 이. 콜라이로 이동시키고 N-글리칸을 갖는 단백질을 번역후 변형시키는 놀라운 능력을 이 세포에 부여하였다(Wacker et al., "N-linked Glycosylation in Campylobacter jejuni and its Functional Transfer into E. coli," Science 298:1790-3 (2002)). 그러나, 원핵생물 및 진핵생물 글리코실화 메카니즘이 공유하는 기능적 유사성에도 불구하고, 원핵생물 글리코실화 기계에 의해 부착된 올리고사카라이드 사슬(GalNAc₅GlcBac)은 진핵생물 글리코실화 경로에 부착된 것과 구조적으로 구별된다(Szymanski et al., "Protein Glycosylation in Bacterial Mucosal Pathogens," Nat Rev Microbiol 3:225-37 (2005); Young et al., "Structure of the N-linked Glycan Present on Multiple Glycoproteins in the Gram-negative Bacterium, Campylobacter jejuni," J Biol Chem 277:42530-9 (2002); Weerapana et al., "Asparagine-linked Protein Glycosylation: From Eukaryotic 내지 Prokaryotic Systems," Glycobiology 16:91R-101R (2006)). 구조적 동종성 인간형 글리칸을 갖는 N 연결 당단백질을 발현시키는 진핵생물 N-글리코실화 경로를 갖는 이. 콜라이를 재프로그래밍하기 위한 다양한 시도가 있었지만, 성공하지는 못했다.

본 발명은 당해 분야에서의 결함을 극복하는 것에 관한 것이다.

본 발명의 제1 양태는 진핵생물 글리코실 트랜스퍼라제 활성을 포함하는 원핵생물 숙주 세포로서, 이 진핵생물 글리코실 트랜스퍼라제 활성은 진핵생물 돌리킬 연결 UDP-GlcNAc 트랜스퍼라제 활성 및 진핵생물 만노실 트랜스퍼라제 활성인 원핵생물 숙주 세포에 관한 것이다.

본 발명의 일 양태는 단백질 및 이 단백질에 융합된 D-X₁-N-X₂-T 모티프(서열 번호 17; 여기서, D는 아스파트산이고, X₁ 및 X₂는 프롤린이 아닌 임의의 아미노산이며, N은 아스파라긴이고, T는 트레오닌임)를 포함하는 하나 이상의 펩티드를 포함하는 당단백질 접합체에 관한 것이다.

본 발명의 다른 양태는 글리코실화 단백질의 생산 방법에 관한 것이다. 이 방법은 진핵생물 돌리킬 연결 UDP-GlcNAc 트랜스퍼라제 활성 및 진핵생물 만노실 트랜스퍼라제 활성인, 진핵생물 글리코실 트랜스퍼라제 활성을 포함하는 원핵생물 숙주 세포를 제공하는 단계를 포함한다. 이후, 상기 원핵생물 숙주 세포를 글리코실화 단백질을 생산하기에 효과적인 조건하에 배양한다.

본 발명의 추가 양태는 박테리아 또는 박테리오파지의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 이 방법은 박테리아 표면 위에 하나 이상의 글리칸을 발현시키는 단계 및 박테리아 표면 또는 그 박테리아 유래의 박테리오파지 표면 위의 하나 이상의 글리칸에 표지를 부착시키는 단계를 포함한다. 이후, 상기 표지를 고속 작업 방식으로 분석한다.

본 발명의 다른 양태는 자연 항원을 인식하여 이에 결합하는 Fv 부분 및 보존된 아스파라긴 잔기에서 글리코실화된 Fc 부분을 포함하는 글리코실화 항체에 관한 것이다.

본 발명의 일 양태는 구조적 동종성 인간형 글리칸을 갖는 N 연결 당단백질을 발현시키는 N-글리코실화 경로를 갖는 재프로그래밍된 원핵생물 숙주에 관한 것이다. 상기 원핵생물 숙주 세포는 돌리킬 연결 UDP-GlcNAc 트랜스퍼라제 및 만노실 트랜스퍼라제 형태의 글리코실 트랜스퍼라제 활성을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 상기 UDP-GlcNAc 트랜스퍼라제는 alg13 및 alg14 유전자 활성을 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 만노실 트랜스퍼라제는 alg1 및 alg2 유전자 활성을 포함한다. 추가 실시양태에서, 상기 원핵생물 숙주 세포는 pglK 및 rft1을 비롯한 플립파제 활성을 포함한다. 추가 실시양태에서, 상기 원핵생물 숙주 세포는 pglB 및 STT3과 같은 하나 이상의 올리고사카릴 트랜스퍼라제 활성을 포함한다.

바람직한 양태에서, 본 발명은 당단백질 진단 및 치료의 설계, 발견 및 개발을 위한 기법을 상업화한다. 구체적으로, 본 발명은 치료용 단백질의 제조를 둘러싼 사업을 혁명시킬 가능성을 갖는 미생물 세포 내에서 진정한 인간 당단백질의 효과적인 생산에 대한 저비용 전략의 개발을 제공한다. 다양한 양태에서, 본 발명의 글리코 조작된 박테리아는 N 연결 당단백질을 입체특이적으로 생산할 수 있다. 일 실시양태에서, 특이적 아스파라긴 억셉터 부위에서 표적 단백질을 효과적으로 글리코실화(예를 들면, N 연결 글리코실화)할 수 있는 신규한 글리코실화 경로를 코딩하는 유전자의 수집으로 박테리아가 유전적으로 조작된다. 이러한 특수하게 조작된 세포주를 사용하여, 실질적으로 관심있는 임의의 재조합 단백질을 발현 및 글리코실화시킬 수 있고, 따라서 다양한 진정한 인간 당단백질의 생산이 가능하다.

또한, 본 발명은 당 구조의 치환을 조작하는 독점적인 플랫폼 기법을 제공하여, 처음으로 "박테리아 당단백질 조작"이 가능하게 한다. 글리코 조작 - 단백질의 약동학 특성을 변경시키는 단백질 관련 탄수화물의 의도적인 조작 - 의 한가지 기대되는 것은 생물학적 현상에서 글리코실화의 역할을 설명하는 것이다. 따라서, 다양한 양태에서, 본 발명은 연구, 산업 및 치료 분야에 대해 신규한 글리코접합체 및 면역자극제의 생명공학 합성을 제공한다.

당단백질 발현에 대한 숙주로서 이. 콜라이의 주요 이점은, 효모 및 모든 다른 진핵생물과 달리, 자연 글리코실화 시스템이 존재하지 않는다는 점이다. 따라서, 글리코실화 관련 유전자의 추가(또는 후속 제거)는 글리코 조작된 이. 콜라이 세포의 생존능력에 영향을 미치지 않는다는 것이다. 또한, 내인성 글리코실화 반응에 의한 표적 단백질에 대한 비인간 글리칸 부착의 가능성이 이 세포에서 제거된다.

따라서, 다양한 실시양태에서, 본 발명은 원핵생물 숙주 세포를 사용하여 N 연결 당단백질을 생산하는 당단백질 발현에 대한 별법을 개시하고, 이는 진핵생물 세포 배양과 관련된 상당한 난관을 모면하는 매력적인 해결책을 제공한다. 생산 비히클로서 박테리아의 사용은 구조적 동종성 인간형 N-글리칸을 생성함과 동시에 단백질 약물 발전 및 제조와 관련된 비용 및 시간을 인상적으로 감소시킬 것으로 기대된다.

다른 중요한 이점으로는 (ⅰ) 박테리아의 유전 조작을 둘러싼 많은 양의 데이터; (ⅱ) 단백질 생산에 박테리아를 사용하는 것의 입증된 추적 기록 -- 2003년 이후 FDA에 의해 승인받은 단백질 치료제 중 30%가 이. 콜라이 박테리아에서 생산됨; 및 (ⅲ) 단백질 약물의 박테리아 생산에 대한 다양한 회사 내의 기존 인프라를 들 수 있다.

다양한 진핵생물 단백질 발현 시스템과 비교하여, 본 발명의 방법 및 조성물을 사용하여 이용되는 방법은 인간 병원균이 없고, 면역원성 N 및 O 연결 글리코실화 반응이 없으며, 신속한 클로닝 및 빠른 성장 속도, 빠른 2배 시간(약 20 분), 높은 성장(높은 OD), 높은 역가 및 (총 가용성 단백질(TSP)의 50% 범위의) 단백질 수율, 주변 세포질 또는 상청액으로부터 생성물 정제의 용이함이 가능하고, 유전적으로 추적가능하며, 철저히 연구되었고, 발현 최적화 방법(예를 들면, 프로모터 조작, mRNA 안정화 방법, 샤페론 동시 발현, 프로테아제 결실 등)의 광범위한 수집물에 필적하는, 측정용 비용 효과적 최적 재조합 당단백질 발현을 제공한다.

도 1은 지질 연결 올리고사카라이드의 생합성 개요 및 에스. 세레비시아(S. cerevisiae)에서 소포체 막에서 단백질로의 이동을 도시한 것이다. 개별 반응에 필요한 유전자좌를 표시하였다. 만노스 잔기가 GDP-만노스로부터 직접 유래된 것(밝은 음영) 또는 돌리킬포스포만노스로부터 유래된 것(어두운 음영)인식 표시하였다. 문헌[Burda et al., "The Dolichol Pathway of N-linked Glycosylation," Biochim Biophys Acta 1426:239-57 (1999), 그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함됨]을 참조한다.
도 2는 박테리아에서 N 연결 당단백질의 생합성 과학을 도시한 것이다. 씨. 제주니에서, 지질 캐리어에 뉴클레오티드 활성화 당의 연속 추가를 통해 N 연결 글리코실화가 진행되어 분지형 헵타사카라이드가 형성된다. 이 글리칸은 이후 PglK(이전에 WlaB)에 의해 내부 막에 걸쳐 역전되고, OTase PglB는 이후 아스파라긴 측쇄로의 글리칸의 이동을 촉매한다. Bac는 2,4-디아세트아미도-2,4,6-트리데옥시글루코스이고; GalNAc는 N-아세틸갈락토사민이며; HexNAc는 N-아세틸헥속사민이고; Glc는 글루코스이다. 문헌[Szymanski et al., "Protein Glycosylation in Bacterial Mucosal Pathogens," Nat Rev Microbiol 3:225-37 (2005), 그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함됨]을 참조한다.
도 3a 및 도 3b는 글리코 조작된 이. 콜라이에서 글리코실화 PEB3의 웨스턴 블롯(Western blot)의 사진이다. C 말단 6x his 태그를 보유하는 씨. 제주니 글리코실화 기질 PEB3이 발현되고, pACYC184-pgl로부터의 pgl 유전자의 완벽 세트(pgl+) 또는 필수 OTase를 코딩하는 pglB 유전자가 결여된 변형 pgl 유전자 클러스터(pgl-) 중 어느 하나를 동시 발현하는 이. 콜라이 세포의 주변 세포질로부터 정제된다. 정제된 PEB3이 pgl+ 및 pgl- 세포 둘 다에서 검출되고, 항폴리히스티딘 항체를 사용한 웨스턴 블롯팅에 의해 입증된다(도 3a). 그러나, PEB3이 GalNAc 특이적 렉틴 SBA에의 결합에 기초한 pgl+ 세포에서 유일하게 글리코실화되지만, pgl- 세포로부터의 PEP3는 글리코실화되지 않는다(도 3b). 정제된 PEB3은 기재한 바대로 연속 희석된다.
도 4a 내지 도 4d는 이. 콜라이 말토스 결합 단백질(MBP)의 글리코실화의 결과를 나타낸 것이다. 도 4a는 펩티드 글리코실화 태그(서열 번호 16)를 나타낸 것이다. 도 4b는(왼쪽에서부터 오른쪽으로) C 말단 GlycTag(GT)를 갖는 MBP, 씨. 제주니 당단백질 cjAcrA, N 말단 GT를 갖는 MBP, 분비 신호 펩티드를 갖지 않는 MBP C 말단 GT 및 각각 C 말단 GT 및 Tat 특이적(ssTorA) 신호 펩티드를 갖는 MBP & GFP의 항His 웨스턴 블롯을 나타낸 것이다. 단백질은 글리코 조작된 이. 콜라이(pgl+, 2 레인 제외)로부터 Ni 정제되고 항HIS 혈청으로 면역블롯팅된다. 도 4c는 항Hept 혈청을 사용한 박테리아 헵타사카라이드에 대한 웨스턴 블롯을 보여주는 것이다. 도 4d는 MBP C 말단 GT(왼쪽) 및 MBP N 말단 GT(오른쪽)에 대해 다중 N-글리칸에 특징적인 3개 이상의 별개의 밴드를 보여주는 것이다.
도 5a 내지 도 5c는 pgl+ 이. 콜라이에서 글리코실화 IgG M18.1의 결과를 도시한 것이다. 도 5a는 C_H2 내 Asn297에서의 글리코실화가 적절한 수용체 분자에 결합하는 부여하는 IgG의 Fc 영역에서 형태를 변경시켜 이펙터 기능을 알아내는 것을 보여주는 것이다. 단백질 A-G 수지 컬럼(Pierce)을 사용하여 pgl- 이. 콜라이로부터 정제된 IgG M18.1(도 5b) 및 pgl+ 이. 콜라이로부터 정제된 IgG M18.1(도 5c)의 웨스턴 블롯 분석. 샘플은 비환원 12% SDS 겔에서 수행하고, 항인간 IgG 및 hR6P 항혈청을 사용하여 면역블롯팅한다.
도 6a는 당단백질 특이적 항혈청(hR6P)를 통한 pgl+ 및 pgl- 세포에서 CjaA의 당단백질 표면 디스플레이 및 글리코실화를 입증하는 웨스턴 블롯 분석의 개요를 보여주는 것이다. 도 6b는 지질 A에 대한 WaaL 매개 결찰을 통한 외부 표면으로의 헵타사카라이드의 이동을 보여주는 것이다. 도 6c는 유세포분석기를 사용한 SBA-Alexa Fluor 표지의 정량화를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명에 따른 글리코파지 시스템의 도식례이다. 지질 연결 올리고사카라이드 합성, 올리고사카라이드 이동(OTase) 및 억셉터 scFv-g3p 융합 단백질에 대해 단백질을 코딩하는 플라즈미드 또는 파지미드가 도시되어 있다. 올리고사카라이드는 (개별 글리코실 트랜스퍼라제에 의해 촉매된) 플라즈마 막의 세포질 부위(Cyt)에서 지질 캐리어, 박토프레닐피로포스페이트에서 조립된다. 이후, 올리고사카라이드는 내부 막(IM)에 걸쳐 주변 세포질 공간(Per)으로 전위되고 올리고사카릴트랜스퍼라제에 의해 억셉터 단백질의 특이적 아스파라긴 잔기으로 이동된다. 글리코실화 억셉터 단백질을 디스플레이하는 파지(글리코파지)는 보조 파지 VCSM13에 의해 감염된 후, 고정된 대두 응집소(SBA)에 결합되고 갈락토스에 의해 용리된다. 파지미드에 존재하는 항생제 내성에 선택된 이. 콜라이(F+) 세포를 감염시키기 위해 용리된 글리코파지를 사용한다. 파지의 글리코-표현형은 ori M13의 존재에 따라 필요한 단계 및 파지 입자로의 파지미드의 후속 팩키징 중 어느 하나의 유전형에 연결될 수 있다. Dhfr은 디히드로폴레이트 리덕타제이고; bla는 β-락타메제이며; cat는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제이다.
도 8a 내지 도 8d는 면역검출에 의해 시각화된 pgl+ 세포(도 8a 및 도 8c) 및 pglmut 세포(도 8b 및 도 8d)에서 AcrA-g3p의 시간 의존적 발현 및 글리코실화를 나타낸 것이다. 비유도 세포(1 레인) 또는 1 시간(2 레인), 3 시간(3 레인), 5 시간(4 레인) 및 16 시간(5 레인) 동안 50 mM 아라비노스로 유도된 세포로부터 전체 세포 용리액이 제조된다. 10% SDS-PAGE에 의해 단백질이 분리되고 니트로셀룰로스 막으로 이동된다. AcrA-g3p 및 글리코실화 AcrA-g3p(글리코-AcrA)는 AcrA 특이적 항체(도 8a 또는 도 8b) 또는 R12 항혈청(도 8c 또는 도 8d)에 의해 시각화된다. MW 마커를 오른쪽에 표시하였다.
도 9a는 SBA 바이오패닝에 의한 글리코파지 증폭의 정량화를 나타낸 것이다. 글리코실화 경쟁 세포로부터 생산된 파지(pgl, 흑색 막대) 또는 글리코실화 비경쟁 세포로부터 생산된 파지(pglmut, 회색 막대)를 SBA 컬럼 정제에 적용한다. TG1 세포의 감염 후 측정될 때, SBA 패닝 절차의 각 분획 내 존재하는 콜로니 형성 단위(cfu)의 총 양을 나타내는 값은 3개 이상의 독립 실험의 평균이다. SBA 패닝에 적용되는 파지 및 이. 콜라이 감염 후 수득된 cfu의 양은 6% 미만으로 변한다. 1 분획, SBA 컬럼에 적용된 cfu; 2 분획, SBA 유동; 3 분획 및 4 분획, PBS 세척 단계; 5 분획, 6 분획 및 7 분획, PBS 중 30 mM 갈락토스에 의한 세척 단계; 8 분획, 9 분획 및 10 분획, PBS 중 300 mM 갈락토스에 의한 용리 단계. 도 9b는 파지에 디스플레이되는 AcrA-g3p 및 글리코실화 AcrA-g3p(글리코-AcrA-g3p)의 면역검출의 사진이다. 파지는 pgl+ 세포(a 패널, c 패널) 또는 pglmut 세포(b 패널, d 패널)로부터 생산되고 SBA 패닝에 적용된다. AcrA 및 글리코-AcrA의 존재는 항AcrA(a 패널, b 패널) 또는 R12 항혈청(c 패널, d 패널)에 의해 가시화된다. 1 레인, 원료 파지 제조; 2 레인, SBA 유동; 3 레인 및 4 레인, PBS에 의한 세척 분획; 5 레인 내지 7 레인, PBS 중 30 mM 갈락토스에 의한 세척 분획; 8 레인 내지 10 레인, PBS 중 300 mM 갈락토스에 의한 용리 분획. 1 레인 내지 4 레인에서, 1×10⁸개의 파지가 SDS-PAGE에 적용된다. 5 레인 내지 10 레인에서, pgl+ 세포(a 패널, c 패널)로부터 제조된 3.5×10⁷개, 1.2×10⁴개, 4.0×10³개, 1.3×10⁶개, 2.5×10⁶개, 1.2×10⁶개의 파지 또는 pglmut 세포(b 패널, d 패널)로부터 제조된 1.5×10⁶개, 3.5×10³ 개, 3.0×10³개, 4.5×10³개, 0.5×10⁴개, 1.5×10³개의 파지를 각각 사용하였다. MW 마커를 오른쪽에 표시하였다. SBA 패닝에 의해 얻고 SDS-PAGE에 도포된 파지의 양은 ±6% 미만으로 변한다.
도 10a 및 도 10b는 이. 콜라이에서 글리칸 조작을 도시한 도면이다. 도 10a는 박테리아로부터 포유동물 당형태로의 진화 과정을 보여주는 것이다. 도 10b는 생합성에 대한 경로 및 박테리아 기질 단백질로의 Man₃GlcNAc₂ 코어 당형태의 이동을 보여주는 것이다.
도 11a 및 도 11b는 이. 콜라이에서 Alg13/14의 발현을 도시한 웨스턴 블롯의 사진이다. 도 11a는 Alg13-his를 검출하기 위해 항his 항체로 프로브된 wt 이. 콜라이 세포로부터 가용성 세포질 분획의 웨스턴 블롯 분석을 보여주는 것이다. 도 11b는 Alg14-FLAG를 검출하기 위해 항FLAG 항체로 프로브된 wt 및 ΔdnaJ 세포로부터 단리된 상이한 분획의 웨스턴 블롯 분석을 보여주는 것이다. 샘플을 Alg13의 경우 유도 후 시간(hpi; hour post induction) 0, 1, 2 및 3 시간에서 및 Alg14의 경우 hpi 3 시간에서 수집하였다. 20 분 동안 20,000xg에서 용리된 세포를 원심분리하고 가용성 분획으로서 상청액 및 불용성 분획(insol)으로서 펠렛을 수집하여 샘플을 제조하였다. Alg14의 경우, 가용성 분획을 1 시간 동안 100,000xg에서 추가로 회전시키고 상청액 및 펠렛을 각각 가용성(sol) 및 막(mem) 분획으로서 수집하였다.
도 12는 이. 콜라이에서 Alg1 및 Alg2의 발현을 도시한 웨스턴 블롯의 사진이다. 이 웨스턴 블롯은 hpi 3, 4 및 5 시간에서 수학된 ΔdnaJ 세포로부터의 막 분획을 가졌다. 블롯을 항his 항체로 프로브하였다.
도 13은 Alg1에 대한 야생형 뉴클레오티드 서열(서열 번호 5)과 코돈 최적화 뉴클레오티드 서열(서열 번호 6) 사이의 정렬이다. Alg1의 해당 아미노산 서열(서열 번호 19)은 정렬 위에 나타냈다.
도 14는 Alg2에 대한 야생형 뉴클레오티드 서열(서열 번호 7)과 코돈 최적화 뉴클레오티드 서열(서열 번호 8) 사이의 정렬이다. Alg2의 해당 아미노산 서열(서열 번호 20)은 정렬 위에 나타냈다.
도 15는 Alg13에 대한 야생형 뉴클레오티드 서열(서열 번호 1)과 코돈 최적화 뉴클레오티드 서열(서열 번호 2) 사이의 정렬이다. Alg3의 해당 아미노산 서열(서열 번호 21)은 정렬 위에 나타냈다.
도 16은 Alg14에 대한 야생형 뉴클레오티드 서열(서열 번호 3)과 코돈 최적화 뉴클레오티드(서열 번호 4) 서열 사이의 정렬이다. Alg14의 해당 아미노산 서열(서열 번호 22)은 정렬 위에 나타냈다.
도 17은 Rft1에 대한 야생형 뉴클레오티드 서열(서열 번호 9)과 코돈 최적화 뉴클레오티드 서열(서열 번호 10) 사이의 정렬이다. Rft1의 해당 아미노산 서열(서열 번호 23)은 정렬 위에 나타냈다.
도 18은 Sttc3에 대한 야생형 뉴클레오티드 서열(서열 번호 11)과 코돈 최적화 뉴클레오티드 서열(서열 번호 12) 사이의 정렬이다. Sttc3의 해당 아미노산 서열(서열 번호 24)은 정렬 위에 나타냈다.

정의

하기의 용어 정의 및 방법은 본 개시내용을 더 잘 기재하기 위해 그리고 본 개시내용의 실행시 당업자를 지시하기 위해 제공된다.

달리 기재되지 않은 한, 본원에서 사용되는 모든 기법 및 과학 용어는 개시내용이 속하는 분야의 당업자가 통상 이하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사한 또는 균등한 방법 및 재료를 본 개시내용의 실행 또는 시험에서 사용할 수 있더라도, 적합한 방법 및 재료를 하기 기재하였다. 재료, 방법 및 실시예는 오직 예시적이며, 제한하기 위한 것이 아니다. 본 개시내용의 다른 특징은 하기 상세한 설명 및 특허청구범위로부터 명확할 것이다.

본원에서 사용되는 "포함하는"은 "함유하는"을 의미하고, 단수형 또는 지시형용사는 문맥에서 달리 명확히 기재하지 않은 한 복수 언급을 포함한다. 예를 들면, "세포를 포함하는"을 언급하는 것은 이 세포를 1개 또는 복수 포함하는 것을 포함한다. "또는"이란 용어는 문맥에서 달리 명확히 기재하지 않은 한 언급된 대안적인 구성성분 중 단일 구성성분 또는 2개 이상의 구성성분의 조합을 의미한다.

당단백질과 관련하여 "인간형"이란 용어는 인간에서 생산된 것과 유사한 또는 심지어 동일한, 단백질에서 (N 연결) 아스파라긴 잔기의 아미드 질소에 연결된 N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 잔기가 부착된 단백질을 의미한다.

"N-글리칸" 또는 "N 연결 글리칸"은 N 연결 올리고사카라이드 구조를 의미한다. N-글리칸은 단백질 또는 합성 당단백질 중간체에 부착될 수 있고, 이는 시험관내 또는 생체내 추가 조작될 수 있다. 당단백질에서 발견되는 주요 당은 글루코스, 갈락토스, 만노스, 푸코스, N-아세틸갈락토사민(GalNAc), N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 및 시알산(예를 들면, N-아세틸-뉴라민산(NeuAc))이다.

달리 기재되지 않은 한, 그리고 본원에서 "서열 번호"의 일반 포맷 하에 기재된 모든 서열에 대한 실례로서, "서열 번호 1을 포함하는 핵산"은 핵산의 적어도 일부분이 (ⅰ) 서열 번호 1의 서열 또는 (ⅱ) 서열 번호 1에 상보적인 서열 중 어느 하나를 갖는 핵산을 의미한다. 둘 사이의 선택은 문맥에 지시된다. 예를 들면, 핵산이 프로브로서 사용되는 경우, 둘 사이의 선택은 프로브가 바람직한 표적에 상보적이라는 요건으로 지시된다.

"단리된" 또는 "실질적으로 순수한" 핵산 또는 폴리뉴클레오티드(예를 들면, RNA, DNA 또는 혼합 중합체) 또는 당단백질은 천연적으로 관련되는 리보솜, 중합효소 및 게놈 서열과 같은 그 천연 숙주 세포에서 천연 폴리뉴클레오티드를 천연적으로 동반하는 다른 세포 성분으로부터 실질적으로 분리된 것이다. 상기 용어는 (1) 그 자연 환경으로부터 제거되거나, (2) "단리된 폴리뉴클레오티드"가 자연에서 발견되는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부와 관련되지 않거나, (3) 자연에서 연결되지 않은 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결되거나, (4) 자연에서 존재하지 않는 폴리뉴클레오티드인 핵산을 포함한다. 또한, "단리된" 또는 "실질적으로 순수한"이란 용어는 재조합 또는 클로닝된 DNA 단리물, 화학적으로 합성된 폴리뉴클레오티드 유사체 또는 이종성 시스템에 의해 생물학적으로 합성된 폴리뉴클레오티드 유사체와 관련하여 사용될 수 있다.

그러나, "단리된"은 상기 기재된 핵산, 폴리뉴클레오티드 또는 당단백질이 그 자체가 그 자연 환경으로부터 물리적으로 제거될 것을 반드시 요하지 않는다. 예를 들면, 생물체의 게놈에서 내인성 핵산 서열은 이종성 서열이 내인성 핵산 서열에 인접하게 위치하는 경우, "단리된" 것으로 간주되고, 그 내인성 핵산 서열의 발현이 변경된다. 이와 관련하여, 이종성 서열이 그 자체가 내인성(동일한 숙주 세포 또는 그 선조 세포 유래) 또는 외인성(상이한 숙주 세포 또는 그 선조 세포 유래)이든지 간에 이종성 서열은 내인성 핵산 서열에 천연적으로 인접하지 않은 서열이다. 실례의 방식으로, 숙주 세포의 게놈에서 유전자의 천연 프로모터의 경우 그 프로모터 서열은 (예를 들면, 상동 재조합에 의해) 치환될 수 있어, 이 유전자는 변경된 발현 패턴을 갖는다. 이 유전자가 천연적으로 이를 플랭킹하는 서열의 적어도 일부로부터 분리되므로 이제 이 유전자는 "단리"된다.

또한, 핵산은 게놈에서 대응하는 핵산에 천연적으로 존재하지 않는 임의의 변형을 함유하는 경우 이는 "단리된" 것으로 간주된다. 예를 들면, 내인성 코딩 서열이 예를 들면 인간 개재에 의해 인공적으로 도입된 삽입, 결실 또는 점 돌연변이를 함유하는 경우 이는 "단리된" 것으로 간주된다. 또한, "단리된 핵산"은 이종성 부위에서 숙주 세포 염색체로 통합된 핵산 및 에피솜으로서 존재하는 핵산 작제물을 포함한다. 또한, "단리된 핵산"은 실질적으로 다른 세포 물질을 포함하지 않거나, 또는 재조합 기법에 의해 생산될 때 실질적으로 배양 매질을 포함하지 않거나, 또는 화학적으로 합성된 화학 전구체 또는 다른 화학물질을 실질적으로 포함하지 않을 수 있다.

글리코실화 조작

본 발명의 제1 양태는 진핵생물 돌리킬 연결 UDP-GlcNAc 트랜스퍼라제 활성 및 진핵생물 만노실 트랜스퍼라제 활성인, 진핵생물 글리코실 트랜스퍼라제 활성을 포함하는 원핵생물 숙주 세포에 관한 것이다.

본 발명의 원핵생물 숙주 세포는 Alg13 활성 및 Alg14 활성을 포함할 수 있는 진핵생물 돌리킬 연결 UDP-GlcNAc 트랜스퍼라제 활성을 포함한다. Alg13 활성 및 Alg14 활성은 야생형 뉴클레오티드 서열 또는 코돈 최적화 서열 중 어느 하나에 의해 성취된다. 도 10b에 도시된 바대로, 이 효소는 GlcNAc 단위를 박토프레놀에 추가하도록 작용한다. alg13 야생형 핵산 분자는 서열 번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는다:

alg13 코돈 최적화 핵산 분자는 다음과 같이 서열 번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는다:

alg14 야생형 핵산 분자는 다음과 같이 서열 번호 3의 뉴클레오티드 서열을 갖는다:

alg14 코돈 최적화 핵산 분자는 다음과 같이 서열 번호 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는다:

본 발명의 원핵생물 숙주 세포는 Alg1 활성 및 Alg2 활성을 포함하는 진핵생물 만노실 트랜스퍼라제 활성을 포함한다. Alg1 활성 및 Alg2 활성은 다음과 같이 야생형 핵산 분자 또는 코돈 최적화 핵산 서열에 의해 성취된다. 도 10b에 도시된 바대로, 이 효소는 만노스 단위를 GlcNAc 단위에 추가한다. alg1 야생형 핵산 분자는 다음과 같이 서열 번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는다:

alg1 코돈 최적화 핵산 분자는 다음과 같이 서열 번호 6의 뉴클레오티드 서열을 갖는다:

alg2 야생형 핵산 분자는 다음과 같이 서열 번호 7의 뉴클레오티드 서열을 갖는다:

alg2 코돈 최적화 핵산 분자는 다음과 같이 서열 번호 8의 뉴클레오티드 서열을 갖는다:

본 발명의 원핵생물 숙주 세포는 Rft1 활성 형태의 진핵생물 플립파제 활성을 포함한다. 도 10b에 도시된 바대로, Rft1(또는 PglK)은 GlcNAc 단위 및 만노스 단위의 올리고사카라이드 어셈블리를 원핵생물 숙주의 내부 막의 세포질 측으로부터 주변 세포질 측으로 이동시킨다. Rft1 야생형 핵산 분자는 다음과 같이 서열 번호 9의 뉴클레오티드 서열을 갖는다:

rft1 코돈 최적화 핵산 분자는 다음과 같이 서열 번호 10의 뉴클레오티드 서열을 갖는다:

본 발명의 원핵생물 숙주 세포는 STT3 활성 형태의 진핵생물 올리고사카릴 트랜스퍼라제 활성을 포함한다. 도 10b에 도시된 바대로, STT3 효소(또는 PlgB 효소)는 올리고사카라이드 어셈블리를 내부 막으로부터 숙주 세포의 외부 막에 이동되는 억셉터 단백질로 이동시킨다. STT3 야생형 핵산 분자는 서열 번호 11의 뉴클레오티드 서열을 갖는다:

STT3 코돈 최적화 핵산 분자는 다음과 같이 서열 번호 12의 뉴클레오티드 서열을 갖는다:

이. 콜라이 및 다른 박테리아에서 진핵생물 단백질, 특히 막 단백질의 성공적인 발현은 흔치않은 일이다(Baneyx et al., "Recombinant Protein Folding and Misfolding in Escherichia coli," Nat Biotechnol 22:1399-1408 (2004), 이는 그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함됨). 따라서, 정확하게 폴딩되고 정확하게 편재된 단백질의 고발현 수율(예를 들면, 내부 막으로의 삽입)을 성취하기 위해 다양한 안건을 고려해야 한다. 이러한 인자 모두는 총체적으로 진핵생물 단백질이 이. 콜라이 세포 내에서 발현될 때 이 진핵생물 단백질이 기능적인식를 설명한다.

본 발명의 일 실시양태에서, 이. 콜라이(및 다른 박테리아)와 효모 및 포유동물 세포와 같은 고등 생물체 사이에 코돈 사용빈도 편향과 관련된 제한을 극복하기 위해 진핵생물 글리코실 트랜스퍼라제를 코돈 최적화할 수 있다. 코돈 사용빈도 편향은 단백질 코딩 DNA 서열(유전자)에서 코돈 존재 빈도에서 생물체 사이의 차이를 의미한다. 코돈은 폴리펩티드 사슬에서 특이적 아미노산 잔기를 코딩하는 일련의 3개(3중)의 뉴클레오티드이다. 특이적 전환 뉴클레오티드 변경, 즉 퓨린을 피리미딘으로 또는 피리미딘을 퓨린 뉴클레오티드로 변경 또는 전위 뉴클레오티드 변경, 즉 퓨린을 퓨린으로 또는 피리미딘을 피리미딘 뉴클레오티드로 변경하여 코돈 최적화를 성취할 수 있다. 야생형 진핵생물 돌리킬 연결 UDP-GlcNAc 트랜스퍼라제(서열 번호 1 및 3), 진핵생물 만노실 트랜스퍼라제(서열 번호 5 및 7), 진핵생물 플립파제(서열 번호 9) 및 진핵생물 올리고사카릴 트랜스퍼라제(서열 번호 11)에 해당하는 예시적인 코돈 최적화 핵산 분자가 각각 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10 및 12로 상기 기재되어 있다.

도 13 내지 도 18은 각각 Alg1, Alg2, Alg3, Alg4, Rft1 및 Sttc3의 야생형 서열에서 코돈 최적화 뉴클레오티드 서열을 성취하기 위해 전환 및 전위 변경되는 특이적 뉴클레오티드를 보여주는 서열 정렬이다. 예시적인 최적화 서열을 서열 정렬로 도시하고 "최적화 서열"이라 확인하고, 야생형 서열은 "질의(query) 서열"이라 확인한다. 야생형 서열에서 뉴클레오티드 변경의 위치는 다음의 관례를 이용하여 나타낸다: "|"는 비변경 뉴클레오티드(즉, 야생형 서열의 뉴클레오티드는 최적화 서열에서 변경되지 않음)을 나타내고; "*"는 전환 변경(예를 들면, 아데닌 "A"는 사이토신 "C" 또는 티민 "T"로 변경되고; 구아닌 "G"는 C 또는 T로 변경되고; C는 A 또는 G로 변경되고; T는 A 또는 G로 변경됨)의 위치를 나타내고; "#"는 전위 변경(예를 들면, A가 G로 또는 G가 A로; C가 T로 또는 T가 C로)의 위치를 나타낸다. 예시적인 최적화 서열을 각각 도 13 내지 도 18에 도시하였지만, 당업자라면 코돈 최적화 서열을 성취하기 위해 확인된 뉴클레오티드가 모두가 변경되어야 하는 것은 아니고, 전환 변경의 경우에, 2개의 뉴클레오티드 변경이 각각의 위치(즉, 퓨린은 피리미딘(C 또는 T 중 어느 하나)으로 변경될 수 있고, 피리미딘은 퓨린(A 또는 G 중 어느 하나)로 변경될 수 있음)에서 가능하다는 것을 용이하게 이해할 수 있을 것이다.

alg 유전자의 핵산 분자 및 동족체, 변이체 및 유도체는 서열 번호 6과 적어도 75%의 동일성, 서열 번호 8과 적어도 77%의 동일성, 서열 번호 2와 적어도 77%의 동일성 및 서열 번호 4와 적어도 77%의 동일성을 갖는다.

다른 실시양태에서, 본 발명의 핵산 분자는 서열 번호 2, 4, 6, 8의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 코딩한다. 바람직하게는, 핵산 분자는 서열 번호 2, 4, 6, 8과 적어도 75%, 77%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 폴리펩티드 서열을 코딩하고, 동일성 값은 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.9% 또는 그 이상 더 상승한다.

추가 실시양태에서, 플립파제 유전자의 핵산 분자, 동족체, 변이체 및 유도체는 서열 번호 10과 적어도 76% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 추가로, 본 발명의 핵산 분자는 서열 번호 10의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 코딩한다. 바람직하게는, 상기 핵산 분자는 서열 번호 10과 적어도 76%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 폴리펩티드 서열을 코딩하고, 동일성 값은 98%, 99%, 99.9% 또는 그 이상 더 상승한다.

다양한 다른 실시양태에서, OST 유전자의 핵산 분자 및 동족체, 변이체 및 유도체는 서열 번호 12와 적어도 79% 동일성을 갖는다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 핵산 분자는 서열 번호 12의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 코딩한다. 바람직하게는, 상기 핵산 분자는 서열 번호 12와 적어도 79%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 폴리펩티드 서열을 코딩하고, 동일성 값은 98%, 99%, 99.9% 또는 그 이상 더 상승한다.

또한, 본 발명은 엄격한 조건하에 상기 기재된 핵산 분자에 하이브리드화하는 핵산 분자를 포함한다. 상기 한정되어 있고 또한 당해 분야에 공지된 바대로, 특정 조건 설정하에 특이적 DNA 하이브리드에 대해 열 용점(T_m)보다 낮은 약 25℃에서 엄격한 하이브리드화를 수행하고, 여기서 T_m은 표적 서열의 50%가 완벽하게 매칭되는 프로브로 하이브리드화하는 온도이다. 특정 조건 설정하에 특이적 DNA 하이브리드에 대해 T_m보다 약 5℃ 더 낮은 온도에서 엄격한 세척을 수행할 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 분자는 길이가 10개 이상의 염기의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 의미한다. 이는 DNA 분자(예를 들면, 선형, 원형, cDNA, 염색체, 유전자 또는 합성, 이중 가닥, 단일 가닥, 삼중 가닥, 사중 가닥, 부분 이중 가닥, 분지형, 헤어핀, 원형 또는 자물쇠(padlocked) 형태) 및 RNA 분자(예를 들면, tRNA, rRNA, mRNA, 유전자 또는 합성) 및 기재된 DNA 또는 RNA 분자의 유사체 및 비천연 뉴클레오티드 유사체, 합성 뉴클레오시드간 결합 또는 둘 다를 포함하는 DNA 또는 RNA의 유사체를 포함한다. 본 발명의 단리된 핵산 분자는 핵산이 유래된 생물체의 염색체 DNA에서 천연 플랭킹 서열(즉, 핵산 분자의 5' 및 3' 말단에 위치한 서열)을 포함하지 않는 핵산 분자를 포함한다. 다양한 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 핵산 분자가 유래된 미생물의 천연 플랭킹 뉴클레오티드 염색체 DNA 서열을 약 10 kb, 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb, 0.1 kb, 50 bp, 25 bp 또는 10 bp 미만 함유할 수 있다.

이종성 핵산 분자는 프로모터 및 임의의 다른 5' 조절 분자 및 정확한 판독 틀에 대해 적절한 센스(5'→3') 배향으로 발현 시스템 또는 벡터로 삽입된다. 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Laboratory Press, Cold Springs Harbor, New York (1989), 그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함됨]에 기재된 바대로 당해 분야에 널리 공지된 표준 클로닝 방법을 이용하여 핵산 작제물의 제조를 수행할 수 있다. 또한, 미국 특허 제4,237,224호(Cohen 및 Boyer)(그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함됨)는 제한 효소 절단 및 DNA 리가제에 의한 결찰을 이용한 재조합 플라즈미드 형태의 발현 시스템의 생산을 기재한다.

적합한 발현 벡터는 숙주 세포와 양립하는 종으로부터 유래된 레플리콘 및 조절 서열을 함유하는 것을 포함한다. 예를 들면, 이. 콜라이가 숙주 세포로서 사용되는 경우, pUC19, pUC18 또는 pBR322와 같은 플라즈미드를 사용할 수 있다. 다른 적합한 발현 벡터는 문헌[Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 3rd edition, Sambrook and Russell, 2001, Cold Springs Harbor Laboratory Press, 그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함됨]에 기재되어 있다. 예를 들면, 핵산 작제물의 제조에서 핵산의 작제, 돌연변이, 서열분석, DNA의 세포로의 도입 및 유전자 발현 및 단백질 분석에 대한 많은 공지된 기법 및 프로토콜이 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. ed., (1992), 그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함됨]에 자세히 기재되어 있다.

상이한 유전 신호 및 처리 사건은 유전자 발현(예를 들면, DNA 전사 및 메신저 RNA("mRNA") 번역)의 여러 수치 및 이후 리보솜 표면에 디스플레이되는 융합 단백질의 양을 제어한다. DNA의 전사는 RNA 중합효소의 결합을 지시하여 mRNA 합성을 촉진하는 DNA 서열인 프로모터의 존재에 따라 달라진다. 프로모터는 그 "강도"(즉, 전사를 촉진하는 이의 능력)가 변한다. 클로닝된 유전자를 발현시킬 목적으로, 고도의 전사 및 이에 따른 발현을 얻기 위해 강한 프로모터 및 표면 디스플레이를 사용하는 것이 바람직하다. 따라서, 이용되는 숙주 시스템에 따라, 다수의 적합한 프로모터 중 임의의 하나를 또한 스톨(stall) 서열에 연결된 관심있는 단백질을 코딩하는 데옥시리보핵산 분자를 보유하는 발현 벡터로 도입시킬 수 있다. 예를 들면, 이. 콜라이, 이의 박테리오파지 또는 플라즈미드, 프로모터, 예컨대 T7 파지 프로모터, lac 프로모터, trp 프로모터, recA 프로모터, 리보솜 RNA 프로모터를 사용할 때, 인접 DNA 분절의 고도의 전사를 지시하기 위해 콜라이파지 람다의 P_R 및 P_L 프로모터 및 lacUV5, ompF, bla, lpp 및 등을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는 다른 것을 사용할 수 있다. 추가로, 삽입된 유전자의 전사를 제공하기 위해 하이브리드 trp-lacUV5(tac) 프로모터 또는 재조합 DNA 또는 다른 합성 DNA 기법에 의해 생성된 다른 이. 콜라이 프로모터를 사용할 수 있다.

원핵생물에서 mRNA의 번역은 적절한 원핵생물 신호의 존재에 따라 달라지고, 이 신호는 진핵생물의 신호와 다르다. 원핵생물에서 mRNA의 효과적인 번역은 mRNA에서 샤인-달가노("SD"; Shine-Dalgarno) 서열이라 불리는 리보솜 결합 부위를 요한다. 이 서열은 단백질의 아미노 말단 메티오닌을 코딩하는 개시 코돈, 일반적으로 AUG 앞에 위치한 mRNA의 단쇄 뉴클레오티드 서열이다. 이 SD 서열은 16S rRNA(리보솜 RNA)의 3' 말단에 상보적이고 아마도 rRNA와의 이중화에 의해 리보솜에 대한 mRNA의 결합을 촉진시켜 리보솜이 정확히 위치하도록 한다. 유전자 발현 최대화를 검토하기 위해, 문헌[Roberts and Lauer, Methods in Enzymology, 68:473 (1979), 그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함됨]을 참조한다.

본 발명에 따라, 숙주 세포는 원핵생물이다. 이 숙주 세포는 관심있는 치료용 재조합 단백질의 생산을 위해 재조합 단백질의 발현에 대한 숙주로서 기능한다. 예시적인 숙주 세포로는 이. 콜라이 및 다른 엔테로박테리아세아(Enterobacteriaceae), 에스체리키아 종(Escherichia sp .), 캄필로박터 종(Campylobacter sp .), 울리넬라 종(Wolinella sp .), 데술포비브리오 종(Desulfovibrio sp .), 비브리오 종(Vibrio sp .), 슈도모나스 종(Pseudomonas sp.), 바실루스 종(bacillus sp .), 리스테리아 종(Listeria sp .), 스타필로코커스 종(Staphylococcus sp .), 스트렙토코커스 종(Streptococcus sp .), 펩토스트렙토코커스 종(Peptostreptococcus sp .), 메가스페에라 종(Megasphaera sp .), 페티나투스 종(Pectinatus sp .), 셀레노모나스 종(Selenomonas sp .), 지모필루스 종(Zymophilus sp .), 악티노마이세스 종(Actinomyces sp .), 아스로박터 종(Arthrobacter sp .), 프란키아 종(Frankia sp .), 마아크로모노스포라 종(Micromonospora sp.), 노카르디아 종(Nocardia sp .), 프로피오니박테리움 종(Propionibacterium sp .), 스트렙토마이세스 종(Streptomyces sp .), 락토바실루스 종(Lactobacillus sp .), 락토코커스 종(Lactococcus sp .), 루코노스톡 종(Leuconostoc sp .), 페디오코커스 종(Pediococcus sp .), 아세토박테리움 종(Acetobacterium sp .), 유박테리움 종(Eubacterium sp .), 헬리코박테리움 종(Heliobacterium sp .), 헬리오스피릴룸 종(Heliospirillum sp .), 스포로무사 종(Sporomusa sp .), 스피로플라즈마 종(Spiroplasma sp .), 우레아플라즈마 종(Ureaplasma sp .), 에리시펠로트릭스 종(Erysipelothrix , sp .), 코리네박테리움 종(Corynebacterium sp .), 엔테로코커스 종(Enterococcus sp .), 클로스트리디움 종(Clostridium sp .), 미코플라즈마 종(Mycoplasma sp .), 미코박테리움 종(Mycobacterium sp .), 악티노박테리아 종(Actinobacteria sp .), 살모넬라 종(Salmonella sp .), 시겔라 종(Shigella sp .), 모락셀라 종(Moraxella sp .), 헥리코박터 종(Helicobacter sp.), 스테노트로포모나스 종(Stenotrophomonas sp .), 마이크로코커스 종(Micrococcus sp .), 나이세리아 종(Neisseria sp .), 델로비브리오 종(Bdellovibrio sp .), 헤모필루스 종(Hemophilus sp .), 클렙시엘라 종(Klebsiella sp.), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 엔테로박터 클로아카(Enterobacter cloacae), 세라티아 종(Serratia sp .), 시트로박터 종(Citrobacter sp .), 프로테우스 종(Proteus sp .), 세라티아 종(Serratia sp .), 예르시니아 종(Yersinia sp .), 아시네토박터 종(Acinetobacter sp .), 악티노바실루스 종(Actinobacillus sp .), 보데텔라 종(Bordetella sp .), 브루셀라 종(Brucella sp .), 카프노사이토파가 종(Capnocytophaga sp .), 카디오박테리움 종(Cardiobacterium sp .), 에이케넬라 종(Eikenella sp .), 프란시셀라 종(Francisella sp .), 헤모필루스 종(Haemophilus sp.), 킨젤라 종(Kingella sp.), 파스츄렐라 종(Pasteurella sp .), 플라보박테리움 종(Flavobacterium sp .), 크산토모나스 종(Xanthomonas sp .), 버크홀데리아 종(Burkholderia sp .), 에어로모나스 종(Aeromonas sp .), 플레시오모나스 종(Plesiomonas sp .), 레지오넬라 종(Legionella sp .) 및 알파-프로테오박테리아, 예컨대 울바키아 종(Wolbachia sp .), 시아노박테리아, 스피로훼타(spirochaete), 녹색 유황 및 녹색 비황 박테리아, 그람 음성 코커스, (배양하기 어려운) 그람 양성 바실루스, 엔테로박테리아세아-글루코스-발효 그람 음성 바실루스, 그람 음성 바실루스-비글루코스 발효조, 그람 음성 바실루스-글루코스 발효 옥시다제 양성을 들 수 있다.

본 발명의 일 실시양태에서, 이. 콜라이 숙주 균주 C41(DE3)가 사용되는데, 왜냐하면 이 균주는 일반 막 단백질 과발현에 대한 이미 최적화되어 있기 때문이다(Miroux et al., "Over-production of Proteins in Escherichia coli: Mutant Hosts That Allow Synthesis of Some Membrane Proteins and Globular Proteins at High Levels," J Mol Biol 260:289-298 (1996), 그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함됨). 숙주 균주의 추가 최적화로 DnaJ 단백질(예를 들면, DdnaJ 세포)을 코딩하는 유전자의 결실을 들 수 있다. 이 결실의 이유는 dnaJ의 불활성화가 과발현된 막 단백질의 축척을 증가시키고 막 단백질 과발현과 통상적으로 관련되는 심각한 세포 독성을 억제하는 것으로 알려져 있다는 것이다(Skretas et al., "Genetic Analysis of G Protein-coupled Receptor Expression in Escherichia coli: Inhibitory Role of DnaJ on the Membrane Integration of the Human Central Cannabinoid Receptor," Biotechnol Bioeng (2008), 그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함됨). 본 출원인은 이러한 Alg1 및 Alg2의 후속 발현을 관찰하였다. 또한, 경쟁 당 생합성 반응의 결실은 N-글리칸 생합성의 최적 수치를 보장하는데 필요하다. 예를 들면, 이. 콜라이 O16 항원 생합성 경로에서 유전자의 결실(Feldman et al., "The Activity of a Putative Polyisoprenol-linked Sugar Translocase (Wzx) Involved in Escherichia coli O Antigen Assembly is Independent of the Chemical Structure of the O Repeat," J Biol Chem 274:35129-35138 (1999), 그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함됨)은 박토프레놀-GlcNAc-PP 기질이 원하는 포유동물 N-글리칸 반응에 이용가능하다는 것을 보장할 것이다. 원치않는 부작용을 제거하기 위해, 이. 콜라이 숙주 균주로부터 결실된 대표적인 유전자로는 wbbL, glcT, glf, gafT, wzx, wzy, waaL을 들 수 있다.

발현 벡터를 사용한 숙주 세포의 형질전환/형질감염 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Laboratory Press, Cold Springs Harbor, New York (1989), 그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함됨]에 기재된 바대로 선택된 숙주 시스템에 따라 달라진다. 진핵생물 세포의 경우, 적합한 기법으로는 레트로바이러스 또는 다른 바이러스, 예를 들면 백시니아를 사용하는 또는, 곤충 세포의 경우, 바쿨로바이러스를 사용하는 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란, 전기천공, 리포솜 매개 형질감염 및 형질유도를 들 수 있다. 박테리아 세포의 경우, 적합한 기법으로는 염화칼슘 혈질전환, 전기천공 및 박테리오파지를 이용한 형질감염을 들 수 있다.

본 발명의 일 양태는 단백질 및 단백질에 융합된 D-X₁-N-X₂-T 모티프(서열 번호 17; 여기서, D는 아스파트산이고, X₁ 및 X₂는 프롤린이 아닌 임의의 아미노산이며, N은 아스파라긴이고, T는 트레오닌임)를 포함하는 하나 이상의 펩티드를 포함하는 당단백질 접합체에 관한 것이다.

본 발명의 다른 양태는 글리코실화 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 진핵생물 돌리킬 연결 UDP-GlcNAc 트랜스퍼라제 활성 및 진핵생물 만노실 트랜스퍼라제 활성인 진핵생물 글리코실 트랜스퍼라제 활성을 포함하는 원핵생물 숙주 세포를 제공하는 단계를 포함한다. 이후, 원핵생물 숙주 세포는 글리코실화 단백질을 생산하기에 효과적인 조건하에 배양된다.

본 발명의 방법은 본 발명에 따른 글리코실화 항체를 생산하기 위해 사용될 수 있다.

따라서, 다양한 양태에서, 본 발명은 아주 많은 양의 N 연결 당단백질의 입체특이적 생합성을 위한 플랫폼으로서 N 연결 단백질을 "인간화"시키도록 조작된 원핵생물 단백질 발현 시스템을 제공한다. 특정 실시양태에서, 대사 경로 및 단백질 조작 기법을 이용한 이. 콜라이에서에서 진핵생물 N-글리코실화 경로의 재조합은 구조적 동종성 인간형 글리칸을 갖는 N-당단백질을 생성시킨다. 자연 글리코실화 경로는 대부분의 박테리아에서 부재하므로, 글리코 조작된 박테리아는 세포마다 합성되는 동종성 당형태를 갖는 N 연결 당단백질의 입체특이적 생산을 가능하게 하는 것으로 생각된다. 이는 각각의 글리코 조작된 세포주가 독특한 탄수화물 서명에 대응할 것이라는 것을 보장한다. 따라서, 본 발명의 목적은 인간형 글리코실화를 생산하기 위해 박테리아를 조작하는 것이다.

원핵생물 글리코실화 기계에 의해 부착된 올리고사카라이드 사슬은 더욱 고등의 진핵생물 및 인간 글리코실화 경로에 의해 부착된 것과 구조적으로 구별된다(Weerapana et al., "Asparagine-linked Protein Glycosylation: From Eukaryotic to Prokaryotic Systems," Glycobiology 16:91R-101R (2006), 그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함됨]. 특정 실시양태에서, 박테리아 글리코실화 기계의 "인간화"를 시작하기 위해(도 10a), 본 발명의 목적은 Man₃GlcNAc₂ 올리고사카라이드 구조를 생성시키는 것이다. 제1 양태에서, 지질 연결 Man₃GlcNAc₂의 생합성을 포함하는 재조합 경로는 이. 콜라이에서 작제된다(도 10b). 이러한 경로 제1 부분은 지질 연결 Man₃GlcNAc₂의 효소 합성이다. 구체적으로, 몇몇 진핵생물 글리코실 트랜스퍼라제 중 하나는 이. 콜라이에서 기능적으로 발현되고 수득된 지질 연결 올리고사카라이드는 ³H-GlcNAc 및 ³H-만노스 또는 형광 렉틴(예를 들면, AlexaFluor-ConA)에 의한 세포의 대사 표지에 의해 분석된다. Man₃GlcNAc₂ 올리고사카라이드 구조는 진핵생물 세포에서 발견되는 대부분의 N-글리칸의 코어 구조를 나타낸다. 이 구조의 어셈블리에 필요한 글리코실 트랜스퍼라제는 진핵생물에서 공지되어 있고, 이 효소의 대부분은 이. 콜라이에서 기능적으로 발현되지만, 현재까지 이러한 올리고사카라이드 구조를 성취하는 데 성공한 것은 없다. 또한, 이 글리코실 트랜스퍼라제의 기질, 즉 UDP-GlcNAc 및 GDP-Man은 둘 다 이. 콜라이의 세포질에서 존재한다.

표적 단백질로의 Man ₃ GlcNAc ₂ 코어의 부위 특이적 이동

원핵생물에서 인간형 올리고사카라이드 구조를 생산하는 경로의 추가 부분은 폴리펩티드 사슬에서 N-X-S/T 부위로 Man₃GlcNAc₂ 올리고사카라이드가 이동하게 한다. 이는 표적 단백질로의 올리고사카라이드의 이동을 담당하는 올리고사카릴트랜스퍼라제(OST)로서 공지된 내부 막 단백질 또는 단백질 착체의 기능적 발현을 요한다. 다양한 원핵생물 및 진핵생물 OST는 지질 연결 Man₃GlcNAc₂ 올리고사카라이드를 표적 단백질로 이동시키는 능력을 갖는다. 따라서, 원핵생물 단백질 발현 시스템은 하나 이상의 OST 활성을 포함한다.

다양한 양태에서, 이. 콜라이에서 진핵생물 글리코실화 경로를 재조합하는 것은 플립파제 및 OST(씨. 제주니에서 각각 PglK 및 PglB 및 효모에서 각각 Rft1 및 STT3)(도 10b 참조)의 활성을 요한다. PglK 플립파제는 내부 막을 통한 지질 연결 씨. 제주니 헵타사카라이드의 전좌를 담당한다. 우연히도, PglK는 지질 연결 올리고사카라이드 중간체의 글리칸 구조에 대해 감소된 특이성을 나타낸다(Alaimo et al., "Two Distinct But Interchangeable Mechanisms for Flipping of Lipid-linked Oligosaccharides," Embo J 25:967-76 (2006); Wacker et al., "Substrate Specificity of Bacterial Oligosaccharyltransferase Suggest a Common Transfer Mechanism for the Bacterial and Eukaryotic Systems," Proc Natl Acad Sci U S A 103:7088-93 (2006), 그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함됨]. 따라서, 이 효소가 지질 연결 Man₃GlcNAc₂을 인식하고, 그래서 추가 조작이 필요치 않는 것으로 생각된다. 대안적으로, PglK가 지질 연결 Man₃GlcNAc₂를 인식하지 않는 예상 밖의 경우에도, 본 발명은 다른 Rft1 중에서 예컨대 진핵생물 플립파제의 발현을 제공한다.

"표적 단백질", "관심있는 단백질" 또는 "치료용 단백질"은 에리쓰로포이에틴, 사이토킨, 예컨대 인터페론, G-CSF, 응집 인자, 예컨대 인자 VIII, 인자 IX 및 인간 단백질 C, 가용성 IgE 수용체 α-사슬, IgG, IgG 단편, IgM, 인터류킨, 유로키나제, 키마제 및 우레아 트립신 억제제, IGF 결합 단백질, 표피 성장 인자, 성장 호르몬 방출 인자, 아넥신 V 융합 단백질, 안지오스타틴, 혈관 내피 성장 인자-2, 골수 전구세포 억제 인자-1, 오스테오프로테게린, α-1 항트립신, DN아제(DNase) II, α-페토 단백질, AAT, rhTBP-1(소위, TNF 결합 단백질 1), TACI-Ig(막간 활성제 및 칼슘 조정제 및 시클로필린 리간드 작용자), FSH(여포 자극 호르몬), GM-CSF, FC 포함 및 불포함 GLP-1(글루카곤 유사 단백질 1), IL-1 수용체 효능제, sTNFr(엔브렐, 소위 가용성 TNF 수용체 Fc 융합) ATIII, rh트롬빈(rhThrombin), 글루코세레브로시다제, CTLA4-Ig(세포독성 T 림프구 관련 항원 4-Ig), 수용체, 호르몬, 인간 백신, 동물 백신, 펩티드 및 혈청 알부민을 들 수 있으나, 이들로 제한되지는 않는다.

비글리코실화 IgG 대 글리코실화 IgG

본 발명의 다른 양태는 자연 항원을 인식하여 이에 결합하는 Fv 부분 및 보존된 아스파라긴 잔기에서 글리코실화된 Fc 부분을 포함하는 글리코실화 항체에 관한 것이다.

본 발명의 글리코실화 항체는 단일클론 또는 다클론 항체 형태일 수 있다.

단일 면역글로불린 분자는 2개의 동일한 경쇄(LC) 및 2개의 동일한 중쇄(HC)로 이루어진다. 경쇄는 1개의 불변 도메인(C_L) 및 1개의 가변 도메인(V_L)으로 구성되지만, 중쇄는 3개의 불변 도메인(C_H1, C_H2 및 C_H3) 및 1개의 가변 도메인(V_H)으로 구성된다. 함께, V_H 도메인 및 V_L 도메인은 Fv로서 공지된 분자의 항원-결합 부분을 구성한다. Fc 부분은 보존된 Asn297 잔기(별표로 표시된 도 5a)에서 글리코실화된다. 이 위치에서의 N-글리칸의 부착은 이펙터 상호작용에 필수적인 "개방" 배열을 생성시킨다.

재조합 DNA 방법을 이용하여 단일클론 항체를 제조할 수 있고, 그 방법은 미국 특허 제4,816,567호(특허권자: Cabilly 등) 및 문헌[Anderson et al., "Production Technologies for Monoclonal Antibodies and their Fragments," Curr Opin Biotechnol. 15:456-62 (2004), 그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함됨]에 기재되어 있다. 단일클론 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 예컨대 성숙 B 세포 또는 하이브리도마 세포로부터, 예컨대 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자를 특이적으로 증폭시키는 올리고뉴클레오티드 프라이머을 이용하여 RT-PCR에 의해 단리되고, 그 서열은 종래 절차를 이용하여 측정된다. 이후, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드는 적합한 발현 벡터에 의해 클로닝되고, 이후 이 발현 벡터는 본 발명의 숙주 세포로 형질감염되고, 단일클론 항체가 생성된다. 일 실시양태에서, 재조합 DNA 기법을 이용하여 N 말단 유출 신호 펩티드(예를 들면, PelB 신호 펩티드)를 갖는 중쇄 및 경쇄를 변경시켜 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드를 박테리아 주변 세포질로 지시한다. 또한, 중쇄 및 경쇄는 2중 시스트론 작제물(예를 들면, 2개의 폴리펩티드를 생성하도록 번역된 단일 mRNA) 중 하나로부터 발현될 수 있거나, 또는 대안적으로 2개의 시스트론 시스템(예를 들면, 중쇄 및 경쇄 각각에 대해 2개의 별개의 mRNA가 생산됨) 중 하나로부터 발현될 수 있다. 박테리아 주변 세포질에서 전장 IgG의 고수치 발현 및 효과적인 어셈블리를 성취하기 위해, 2중 시스트론 및 2개의 시스트론 작제물 둘 다를 조작하여 바람직한 발현비를 성취할 수 있다. 예를 들면, 발현 벡터에서 2중 시스트론 및 2개의 시스트론 작제물의 바로 상류로 삽입된 일련의 번역 개시 영역(TIR)을 사용하여 번역 수준을 증가 또는 감소시킬 수 있다(Simmons et al., "Translational Level is a Critical Factor for the Secretion of Heterologous Proteins in Escherichia coli," Nat Biotechnol 14:629-34 (1996), 그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함됨). 글리코실화 효소를 발현하기 위한 플라즈미드 또는 게놈 코딩된 유전자를 또한 갖는 박테리아 숙주로 플라즈미드를 생산하는 항체가 도입될 때, 수득된 항체는 주변 세포질에서 글리코실화된다. 또한, 문헌(McCafferty et al., "Phase Antibodies: Filamentous Phage Displaying Antibody Variable Domains," Nature 348:552-554 (1990); Clackson et al., "Making Antibody Fragments using Phage Display Libraries," Nature 352:624-628 (1991); Mark et al., "By-Passing Immunization. Human Antibodies from V-Gene Libraries Displayed on Phage," J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), 그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함됨)에 기재된 바대로 파지 디스플레이 라이브러리로부터 바람직한 종의 재조합 단일클론 항체 또는 이의 단편이 단리될 수 있다.

또한, 단일클론 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(들)는 대안적인 항체를 생성시키는 재조합 DNA 기법을 이용하여 다수의 상이한 방식으로 변경될 수 있다. 일 실시양태에서, 예를 들면, 키메라 항체를 생성시키기 위해 마우스 단일클론 항체의 경쇄 및 중쇄의 불변 도메인이 인간 항체의 영역에 대해 치환될 수 있다. 대안적으로, 융합 항체를 생성시키기 위해 마우스 단일클론 항체의 경쇄 및 중쇄의 불변 도메인이 비면역글로불린 폴리펩티드에 대해 치환될 수 있다. 다른 실시양태에서, 단일클론 항체의 바람직한 항체 단편을 생성시키기 위해 불변 영역이 절두 또는 제거된다. 또한, 단일클론 항체의 특이성 및 친화도를 최적화하기 위해 가변 영역의 부위 지정 또는 고밀도 돌연변이가 이용될 수 있다.

몇몇 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간화 항체이다. 인간화 항체는 가변 영역 내에 비인간(예를 들면, 쥐과) 항체 유래의 최소 서열을 함유하는 항체이다. 이 항체가 인간 개체에게 투여될 때, 이 항체는 항원성 및 인간 항마우스 항체 반응을 감소시키기 위해 치료학적으로 사용된다. 실제로, 인간화 항체는 통상적으로 비인간 서열을 최소로 갖지 않는 인간 항체이다. 인간 항체는 인간에 의해 생산되는 항체 또는 인간에 의해 생산된 항체에 해당하는 아미노산 서열을 갖는 항체이다.

당해 분야에 공지된 다양한 기법을 이용하여 인간화 항체를 생성할 수 있다. 인간 항체의 상보적 결정 영역(CDR)을 바람직한 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 비인간 항체(예를 들면, 마우스, 랫트, 래빗, 햄스터 등)의 상보적 결정 영역(CDR)에 의해 치환시켜 항체를 인간화시킬 수 있다(Jones et al., "Replacing the Complementarity-Determining Regions in a Human Antibody With Those From a Mouse," Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., "Reshaping Human Antibodies for Therapy," Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., "Reshaping Human Antibodies: Grafting an Antilysozyme Activity," Science 239:1534-1536 (1988), 전문이 본원에 참조문헌으로 포함됨). 또한, 항체 특이성, 친화도 및/또는 능력을 정제 및 최적화하기 위해 Fv 구조체 영역에서 및/또는 대체된 비인간 잔기 내에 추가 잔기의 치환에 의해 인간화 항체를 변형시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 방법에서 2중 특이적 항체가 사용하기에 적합하다. 2중 특이적 항체는 2개 이상의 상이한 에피토프를 특이적으로 인식하여 이에 결합할 수 있는 항체이다. 2중 특이적 항체는 온전한 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 2중 특이적 항체를 제조하기 위한 기법은 당해 분야에 통상적이다(Traunecker et al., "Bispecific Single Chain Molecules (Janusins) Target Cytotoxic Lymphocytes on HIV Infected Cells," EMBO J. 10:3655-3659 (1991); Gruber et al., "Efficient Tumor Cell Lysis Mediated by a Bispecific Single Chain Antibody Expressed in Escherichia coli," J. Immunol. 152:5368-74 (1994), 그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함됨).

글리칸 스크리닝 기법

본 발명의 추가 양태는 박테리아 또는 박테리오파지를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 박테리아 표면 위에 하나 이상의 글리칸을 발현시키는 단계 및 박테리아 표면 또는 그 박테리아 유래의 박테리오파지 표면 위의 하나 이상의 글리칸에 표지를 부착시키는 단계를 포함한다. 파지 디스플레이에서 사용되는 가장 통상적인 박테리오파지는 M13 및 fd 섬유성 파지이지만, T4, T7 및 λ 파지시 사용된다. 이후, 표지는 고속 작업 방식으로 분석된다.

박테리오파지가 표지 및 분석될 때, 본 발명의 방법은 또한 하나 이상의 글리칸을 표면 위에 갖는 박테리오파지를 생산시키기에 효과적인 조건하에 세포 표면 위에 하나 이상의 글리칸을 발현하는 박테리아를 보조 파지로 감염시키는 단계를 포함한다. 이후, 하나 이상의 글리칸을 표면 위에 갖는 박테리오파지를 농축된다. 대안적으로, 신규한 '박테리아 팩키징 세포주' 기법을 이용하여 보조 파지의 사용이 제거될 수 있다(Chasteen et al., "Eliminating Helper Phage From Phage Display," Nucleic Acids Res 34:e145 (2006), 그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함됨).

박테리아 또는 박테리오파지 표면 위의 글리칸을 인식하고 검출 가능한 표지를 갖는 렉틴으로 표지를 수행할 수 있다. 대안적으로, 박테리아 또는 박테리오파지 표면 위의 글리칸을 인식하고 검출 가능한 표지를 갖는 항체에 의해 표지 단계를 수행한다. 대안적으로, 96웰 플레이트의 표면과 같은 고체 지지체에 관련 단백질 표적(들)(예를 들면, 렉틴, 항체)를 고정시킴으로써 표면에서 상기 표적 중 하나에 결합하는 단백질을 디스플레이하는 세포 또는 파지는 남지만, 다른 것은 세척에 의해 제거된다. 남아 있는 것은 용리되고, (세포를 배양함으로써) 더 많은 세포 또는 (보조 파지에 의한 박테리아 감염에 의해) 파지를 생산하도록 그래서 관련(즉, 결합) 세포 또는 파지가 농축된 세포 또는 파지 혼합물을 생산하도록 사용될 수 있다. 이러한 단계의 반복된 사이클을 '패닝'이라 칭한다.

이러한 본 발명의 양태는 조작된 박테리아 세포주가 각양각색의 글리칸 및 당단백질을 신속하고 비용 효과적인 방식으로 생산하는 당단백질의 세포 표면 디스플레이 및 글리코파지 디스플레이에 의해 스크리닝을 허용한다. 이러한 분석은 정량적 고속 작업 글리칸 분석 및 바람직한 표현형을 부여하는 돌연변이체의 신속한 단리를 허용한다. 이러한 분석에 대한 이러한 기초 전제는 세포 표면 디스플레이 및 파지 디스플레이 둘 다 표현형(즉, 단백질 활성 또는 글리코실화와 같은 변형) 연결에 독특한 유전형(즉, DNA)을 생성한다는 것이다. 유전형과 표현형 사이의 이러한 연결은 단백질의 대형 라이브러리가 시험관내 선택이라 불리는 과정에서 스크리닝되고 증폭되게 하고, 이는 천연 선택과 유사하다. 2개 이상의 상이한 라이브러리 유형을 스크리닝하는 데 이러한 디스플레이 기법을 이용한다. 제1 전략은 당단백질 그 자체의 라이브러리(즉, 에러가 발생하기 쉬운 PCR, DNA 서플링 등의 이용)를 생성시키는 것이고, 여기서 추가의(그러나 동일한) 글리칸 구조의 도입 이후에 활성 또는 안정성과 관련하여 개선될 수 있는 추가 글리코실화 부위를 갖는 변이체가 생산될 수 있다. 제2 전략은 상이한 글리칸 구조의 조합 라이브러리가 생산되고 세포 또는 파지 표면에서 디스플레이되도록 개별적인 경로 효소의 라이브러리(즉, 에러가 발생하기 쉬운 PCR, DNA 서플링 등의 이용) 또는 상이한 효소 조합을 제조함으로써 상이한 글리칸 구조의 대형 수집물을 만드는 것이다. 변이체 당단백질 또는 변이체 글리칸 구조의 표현형은 단리된 세포(즉, 플라즈미드의 서열) 또는 파지(즉, 파지미드로 알려진 팩키징된 DNA의 서열)의 유전형에 물리적으로 연결된다. 따라서, 라이브러리 클론의 확인은 용이하게 결정된다.

박테리아 세포 표면 위의 N 연결 당단백질의 디스플레이

진핵생물 글리코실 트랜스퍼라제 활성, 진핵생물 플립파제 활성 및 진핵생물 올리고사카릴 활성을 이용하여 상기 기재된 숙주 세포 및 방법에 의해 고속 작업 스크리닝을 위해 이. 콜라이에서 글리코실화를 수행할 수 있다. 그러나, 스크리닝 실시양태에서, 다른 공급원으로부터의 활성을 이용할 수 있다. 예를 들면, 외부 막 앵커로서 씨. 제주니 CjaA 단백질에 의해 이 박테리아 표면 디스플레이를 수행할 수 있다(도 6a). 이 단백질이 주로 적합한데, 왜냐하면 이 단백질은 (ⅰ) 씨. 제주니 및 이. 콜라이 세포에서 외부 막에 편재되고, (ⅱ) 이. 콜라이에서 pgl 시스템에 의해 글리코실화되기 때문이다(도 6a). CjaA에서 N-글리칸 헵타사카라이드가 표면 노출되는지를 결정하기 위해, pgl+ 이. 콜라이를 렉틴 SBA의 형광 표지 버젼(SBA-Alexa Fluor 488 접합체, Molecular Probes)에 의해 처리할 수 있다. 또한, 세포에 올리고사카라이드를 박토프레놀 지질 캐리어로부터 지질 A 코어 분자로 이동시키는 천연 이. 콜라이 WaaL 리가제가 결여된다(Raetz et al., "Lipopolysaccharide endotoxins," Annu Rev Biochem 71:635-700 (2002), 그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함됨)(도 6b). 이 리가제는 감소된 기질 특이성을 갖고 박테리아 헵타사카라이드의 박토프레놀피로포스페이트로부터 지질 A 코어(이후 외부 막의 외부 측으로 이동되는 분자)로의 이동을 담당하는 것으로 알려져 있다. waaL가 결여된 pgl+ 세포가 CjaA를 발현하도록 CjaA 플라즈미드에 의해 형질전환되고 유도되는 경우, SBA-Alexa Fluor 표지 이후 강한 형광 신호가 검출된다(도 6c). 중요한 것은 pgl-대조 벡터를 보유하는 waaL 돌연변이체의 SBA-Alexa Fluor 표지 이후 형광의 완전 소실이 관찰되면서 이 신호가 pgl 시스템에 의존한다는 것이다(도 6c). 따라서, 글리칸 분석을 고속 작업 스크리닝에 필적하는 형광 방식에서 살아 있는 이. 콜라이 세포에 의해 직접 수행할 수 있다.

코어 글리칸의 트리-만노스 구조에 대해 높은 친화도를 갖는 형광 버젼의 렉틴 콘카나발린 A(ConA)를 사용하여, 이. 콜라이 세포의 표면에서 Man₃GlcNAc₂를 분석할 수 있다. 이 전략에 대한 근거는 박토프레놀피로포스페이트 연결 올리고사카라이드가 올리고사카라이드를 박토프레놀 지질 캐리어로부터 지질 A 코어 분자로 이동시키는 이. 콜라이 WaaL 리가제에 대한 기질이라는 관찰에 의한다(Raetz et al., "Lipopolysaccharide endotoxins," Annu Rev Biochem 71:635-700 (2002), 그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함됨)(도 6b 참조). 본 출원인은 Man₃GlcNAc₂ 올리고사카라이드가 박토프레놀피로포스페이트로부터 지질 A 코어(이후, 외부 막의 외부 측으로 이동되는 분자)로 이동한다는 것을 예상하였다. 형광 버전의 ConA(AlexaFluor-ConA)를 사용하여 표면 염색에 의해 이. 콜라이 세포의 표면 위에서 Man₃GlcNAc₂의 디스플레이가 성취될 수 있다. 이는 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 이용하여 올리고사카라이드 생합성을 검출하고 정량화하는 것을 가능케 해야 한다. 중요한 것은 이러한 측정은 플립파제 또는 OST 활성에 의존하지 않는다. 박테리아 올리고사카라이드가 형광 SBA에 의한 표지 이후 강한 FACS 신호에 의해 입증된 바대로 TG1 pgl+ 세포의 외부 표면에 편재된다는 것이 관찰되었다. TG1 pglmut 세포의 동일한 표지는 동일한 형광 프로파일을 생성시켰고, 이는 지질 A로의 이동이 PglB에 의존하지 않는다는 것을 나타낸다. 최종적으로, pgl 발현 벡터가 결여된 대조 세포는 검출 가능한 세포 형광을 생성시키지 않았다. 본 출원인은 이러한 분석에 의해 상이한 유도가능한 프로모터에 의해 이. 콜라이에서 올리고사카라이드 발현의 최적화가 허용될 것이고, 필요한 경우, 플라즈마 막으로의 정확한 삽입을 지시하는 상이한 신호 펩티드가 사용될 것으로 예상하였다. 예를 들면, 본 발명에 기재된 기대되는 발현 결과에도 불구하고, 이종성 막 단백질의 고수준 발현에 대해 특이적으로 조작된 C41(DE3)과 같은 이. 콜라이 숙주 균주와 조합하여 Alg 막 단백질 각각의 SRP 또는 YidC-의존적 표적화(Luirink et al., "Biogenesis of Inner Membraen Proteins in Escherichia coli," Annu Rev Microbiol 59:329-55 (2005), 그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함됨)를 이용하는 것이 유용한 것으로 증명될 것이다(Miroux et al., "Over-production of Proteins in Escherichia coli: Mutant Hosts That Allow Synthesis of Some Membrane Proteins and Globular Proteins at High Levels," J Mol Biol 260:289-98 (1996), 그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함됨). 또한, waaL 결여가 지질 A(도 6c)로의 올리고사카라이드 이동을 제거하므로, 개선된 또는 신규한 특성(예를 들면, 활성 또는 안정성 증가)을 갖는 당단백질 변이체 또는 개선된 또는 신규한 활성(예를 들면, 상이한 또는 신규한 글리칸 구조를 생성하는 능력)을 갖는 경로 효소, 예컨대 글리코실 트랜스퍼라제, 플립파제 또는 OST(도 10b 참조)에 대해 분석하기 위해 표면 디스플레이된 당단백질(예를 들면, CjaA, 도 6 참조)과 조합하여 ConA 표지 전략을 이용할 수 있다. 이는 다음과 같이 성취할 수 있다: 관심있는 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 DNA는 그 자체가 표면 단백질(예를 들면, 씨. 제주니 CjaA)이거나, 또는 세포 표면 단백질(예를 들면, 이. 콜라이 ClyA, OmpA, OmpX 등)에 인프레임으로 결찰된다. 단편이 모든 3개의 가능한 프레임으로 삽입되어 cDNA 단편이 적절한 프레임에서 번역되도록 보장하기 위해 다중 클로닝 부위가 대개 사용된다. 세포 표면 하이브리드 단백질을 코딩하는 유전자는 발현 벡터에서 클로닝되고 박테리아 세포, 예컨대 TG1 또는 XL1-Blue 이. 콜라이로 형질전환된다. 당단백질 변이체를 생성시키기 위해, 세포 표면 단백질 유전자에 대한 융합체로서 표적 당단백질을 코딩하는 많은 상이한 DNA 단편의 혼입은 관심있는 부재가 단리될 수 있는 표면 디스플레이된 라이브러리를 생성시킨다. 신규한 또는 개선된 활성을 갖는 경로 효소를 생성시키기 위해, 효소의 DNA 라이브러리는 글리칸 구조 또는 글리칸 구조의 라이브러리에 대한 캐리어로서 작용하는 리포터 세포 표면 디스플레이된 당단백질(예를 들면, CjaA)을 발현하는 플라즈미드와 함께 박테리아로 동시 형질전환된다. 이후, 동시 형질전환된 박테리아는 표면 디스플레이된 캐리어에 부착된 특정한 글리칸 구조의 존재하에 스크리닝된다.

이. 콜라이 글리코파지 디스플레이 시스템

본 발명의 다른 양태는 글리칸에 대한 박테리아 파지 디스플레이 시스템에 관한 것이다. 이 글리코파지 디스플레이 시스템은 도 7에 도시된 일 실시양태로 신규한 글리코-표현형을 조작하기 위한 강력한 도구이다. 이 글리코파지 디스플레이 시스템은 섬유성 파지 디스플레이의 변형 버젼에 기초하고(Smith, G.P., "Filamentous Fusion Phage: Novel Expression Vectors that Display Cloned Antigens on the Virion Surface," Science 228:1315-7 (1985), 그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함됨), 여기서 소형 파지 코트 단백질 g3p의 N 말단에 융합된 N 말단 지질 고정 서열이 결여된 씨. 제주니의 AcrA를 발현하는 파지미드(Nita-Lazar et al., "The N-X-S/T Consensus Sequence is Required But Not Sufficient for Bacterial N-linked Protein Glycosylation," Glycobiology 15:361-7 (2005), 그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함됨)가 작제된다. 이. 콜라이의 주변 세포질 공간으로의 Sec 의존적 전좌에 대해 acrA 코딩 서열의 상류에 펙테이트 리아제B 신호 서열(pelB)이 클로닝된다. 융합 단백질의 발현은 아라비노스 유도 가능한 및 글루코스 억제 가능한 pBAD 프로모터에 의해 지시된다(Miyada et al., "Regulation of the araC Gene of Escherichia coli: Catabolite Repression, Autoregulation, and Effect on araBAD Expression," Proc Natl Acad Sci U S A 81:4120-4 (1984), 그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함됨). 24개의 아미노산 링커는 파지미드 pAcrA-g3p에서 발현된 AcrA와 g3p 도메인 사이에 병치된다. 이 링커 서열은 앰버 중지 코돈(UAG) 바로 앞의 엔테로키나제 절단 부위 및 헥사-히스티딘 태그를 포함하고, 이는 80~90%의 효율로 이. 콜라이 supE^- 균주(예를 들면, XL1-Blue, ER2738 또는 TG1)에서 글루타민으로 전사된다(Miller et al., "Effects of Surrounding Sequence on the Suppression of Nonsense Codons," J Mol Biol 164:59-71 (1983), 그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함됨). 이 벡터에서 파지 F1 유전자간 영역(ori M13)의 포함으로 보조 파지에 의한 중복 감염 후 단일 가닥 파지미드가 팩키징된다. 개선된 또는 신규한 특성(예를 들면, 활성 또는 안정성 증가)을 갖는 당단백질 변이체 또는 개선된 또는 신규한 활성(예를 들면, 상이한 또는 신규한 글리칸 구조를 생성하는 능력)을 갖는 경로 효소, 예컨대 글리코실 트랜스퍼라제, 플립파제 또는 OST를 분석하기 위해 이 기법을 이용할 수 있다(도 10b 참조). 당단백질 변이체를 생성시키기 위해, 관심있는 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 DNA가 pIII 또는 pVIII 유전자에 결찰된다. 단편이 모든 3개의 가능한 프레임으로 삽입되어 cDNA 단편이 적절한 프레임에서 번역되도록 보장하기 위해 다중 클로닝 부위가 대개 사용된다. 이후, 파지 유전자 및 삽입 DNA 하이브리드는 박테리아 세포, 예컨대 TG1 또는 XL1-Blue 이. 콜라이로 형질전환된다. 파지 입자는 보조 파지로 감염될 때까지 이. 콜라이 세포로부터 방출되지 않고, 이는 소수(pIII) 또는 주요(pVIII) 코드 단백질 중 하나 위의 외부 코트의 일부로서 관련 단백질 단편에 의한 성숙 비리온의 어셈블리 및 파지 DNA의 팩키징을 가능하게 한다. pIII 또는 pVIII 유전자로의 많은 상이한 DNA 단편의 혼입은 관심있는 부재가 단리될 수 있는 라이브러리를 생성시킨다. 개선된 또는 신규한 활성, 예컨대 상이한 글리칸 구조를 합성하는 능력을 갖는 경로 효소를 생성하기 위해, 효소(들)의 DNA 라이브러리는 글리칸 구조 또는 글리칸 구조의 라이브러리에 대한 캐리어로서 작용하는 리포터 파지 디스플레이된 당단백질(예를 들면, N 또는 C 말단 glyc-태그를 갖는 AcrA 또는 MBP)을 발현하는 플라즈미드와 함께 박테리아로 동시 형질전환된다. 동시 형질전환된 박테리아는 파지 라이브러리를 생성하도록 사용되고, 이후 이는 파지 디스플레이된 캐리어에 부착된 특정한 글리칸 구조의 존재하에 스크리닝된다.

상기 개시내용은 일반적으로 본 발명을 설명한다. 더 구체적인 설명은 다음의 실시예에서 하기에 기재하였다. 실시예는 예시 목적으로만 기재되어 있고 본 발명의 범위를 제한하도록 의도되지 않는다. 상황이 제안하거고 또는 합당해 지면서 형태 변경 및 균등물 대체가 고려된다. 특정 용어가 본원에서 이용되지만, 이 용어는 서술 방식으로 의도되고 제한 목적을 위한 것이 아니다.

[실시예]

실시예 1 - 유전 변형된 이. 콜라이에서의 N 연결 단백질 글리코실화

Wacker 등의 실험을 재현하였고, 여기서 씨. 제주니 pgl 유전자좌는 기능적으로 이. 콜라이로 이동되었고, 이로써 이 세포에 N 연결 단백질 글리코실화를 수행하는 능력을 부여하였다(Wacker et al., "N-linked Glycosylation in Campylobacter jejuni and its Functional Transfer into E. coli," Science 298:1790-3 (2002), 그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함됨). 이 연구의 경우, 플라즈미드 pACYC184-pgl(pgl+) 및 필수 OST를 코딩하는 pglB 유전자에서 삽입 돌연변이를 보유하는 pACYC184-pgl 유래의 대조 플라즈미드(pACYC184-pglB::kan; pgl-)를 사용하였다. BL21(DE3) 이. 콜라이 세포를 씨. 제주니 당단백질 PEB3를 코딩하는 제2 벡터와 함께 pgl+ 또는 pgl- 벡터 중 어느 하나와 동시 형질전환시켰다. His 태그된 PEB3을 pgl+ 및 pgl- 세포에서 주변 세포질에서 발현시키고 니켈 친화도 크로마토그래피; Ni-NTA Spin Kit(QIAGEN)를 사용하여 주변 세포질 분획으로부터 정제하였다. 정제된 PEB3을 연속 희석하고 항폴리히스티딘 항체(Sigma)를 사용하여 웨스턴 블롯팅으로 검출하였다. 헵타사카라이드 글리칸의 말단 α-연결 GalNAc에 결합하는 GalNAc 특이적 렉틴 대두 응집소(SBA)를 사용하여 글리코실화 PEB3을 검출하였다. 예상한 바대로, PEB3이 pgl+ 및 pgl- 세포 둘 다에서 효과적으로 발현되었지만(도 3a), pgl+ 세포 유래의 PEB3만이 글리칸의 말단 α-연결 GalNAc에 결합하고 완전 글리코실화 단백질을 나타내는 렉틴 SBA와 교차 반응한다는 것이 관찰되었다(도 3b).

실시예 2 - 글리코 조작된 이. 콜라이에서 펩티드 태그를 갖는 MBP의 N 연결 글리코실화

이. 콜라이 말토스 결합 단백질(MBP)은 pTRC99A[Amersham Biosciences]의 SacI 및 HindIII 부위에서 4개의 연속적 글리코실화 세쿠온(GAT CAG AAC GCG ACC GGC GGT GAC CAA AAT GCC ACA GGT GGC GAT CAA AAC GCC ACC GGC GGT GAC CAG AAT GCG ACA)(서열 번호 13)을 코딩하는 유전자에 융합되었다. 이 유전자는 2개의 글리신 잔기에 의해 분리된 4개의 연속적 DQNAT 서열 번호　14 펩티드의 펩티드 태그를 코딩하였다. 시험관내 실험 동안 PglB에 의해 DQNAT(서열 번호 14) 세쿠온을 효과적으로 글리코실화하였다(Chen et al., "From Peptide to Protein: Comparative Analysis of the Substrate Specificity of N-linked Glycosylation in C. jejuni," Biochemistry 46:5579-85 (2007), 그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함됨). MBP의 C 말단에 융합되고, 또한 정제를 위해 C 말단 6xHi 태그가 부착된 이 태그를 pACYC-pgl 및 pACYC-pglmut(PglB W458A, D459A)로 형질전환된 BL21(DE3) 이. 콜라이에서 발현시켰다(Wacker et al., "N-linked Glycosylation in C. jejuni and its Functional Transfer into E. coli," Science 298:1790-3 (2002), 그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함됨). 추가로, 씨. 제주니 당단백질 cjAcrA, MBP의 성숙 도메인 전에 N 말단 태그를 갖는 MBP, C 말단 태그를 갖는 자연 분비 신호 펩티드가 결여된 MBP 및 C 말단 태그를 갖는 MBP & 그린 형광 단백질(GFPmut2) 및 Tat 특이적(ssTorA) 신호 펩티드는 동일한 방식으로 발현되었고 니켈 친화도 크로마토그래피(Ni-NTA Spin Kit, Quiagen)로 정제하였다. 단백질에 대한 항HIS 혈청(Promega) 및 박테리아 헵타사카라이드에 대해 상승된 hR6P 혈청에 의한 웨스턴 블롯에 의해 성숙 MBP의 N 말단 또는 C 말단에서의 태그는 글리코실화된 것으로 측정되었다. 글리코실화는 기능적 PglB 및 주변 세포질로의 분비 둘 다에 의존하고, pACYC-pglmut에 의해 형질전환된 이. 콜라이에서 생성된 MBP 및 분비 신호 펩티드가 결여된 MBP 중 어떤 것도 글리코실화되지 않았다. MBP의 글리코실화 및 이러한 방식으로 분비에 대해 표적화된 그린 형광 단백질(GFP)에 의해 입증된 2중 아르기닌 전좌(Tat) 경로를 통해 글리코실화가 발생했다. 항헵타사카라이드 혈청은 다중 결합 N-글리칸의 3개 이상의 별개의 밴드 특징을 나타냈다.

이 결과는 4개의 연속적 D-X₁-N-X₂-T 세쿠온을 함유하는 펩티드가 시험관내 실험 동안 PglB에 의해 효과적으로 글리코실화된다는 것을 보여준다(Chen et al., "From Peptide to Protein: Comparative Analysis of the Substrate Specificity of N-linked Glycosylation in C. jejuni," Biochemistry 46:5579-85 (2007), 그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함됨). MBP의 C 말단에 융합된 GlycTag가 pgl+ 및 pgl- 이. 콜라이에서 발현되고 정제되어 20 mg/L가 되었다. 수득된 단백질을 다중 부위에서 효과적으로 글리코실화하였다(도 4c 및 도 4d). GlycTag가 MBP의 N 말단으로 이동될 때 유사한 결과가 관찰되었다. pgl- 이. 콜라이에서 생성되거나, 또는 분비 신호 펩티드 없이 발현된 MBP-GlycTag 융합체가 글리코실화되지 않고(도 4c), 이는 글리코실화가 PglB에 의존적이고 주변 세포질로 배출된다는 것을 각각 확인시켜 주었다. GlycTag는 2중 아르기닌 전좌(Tat) 의존적 배출에 표적화된 MBP 및 GFP의 글리코실화로 입증된 바대로 Tat 경로와 같은 다른 분비 경로에 적합하였다(도 4c). 일부 양태에서, MBP에서의 GlycTag의 글리코실화는 심지어 천연 당단백질 씨. 제주니 AcrA의 글리코실화보다 더 효과적이었다(도 4c). MBP가 최근 글리코접합체 백신에 대한 모델 단백질 캐리어로서 입증되었으므로(Fernandez et al., "Potential Role for Toll-like Receptor 4 in Mediating Escherichia Coli Maltose-binding Protein Activation of Dendritic Cells," Infect Immun 75:1359-63 (2007), 그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함됨), MBP-GlycTag 융합체가 병원성 박테리아 씨. 제주니에 대한 또는, 새로운 글리칸 구조가 생성되면서, 다른 감염성 제제에 대한 강력한 글리코접합체 백신으로서 작용할 수 있는 것으로 고려된다. GlycTag가 N 말단 및 C 말단 둘 다에 삽입되고, 또한 MBP 내 허용 부위로 삽입되는 경우 단백질마다 12개 만큼의 글리칸이 가능하였다(Betton et al., "Creating a Bifunctional Protein by Insertion of Beta-lactamase into the Maltodextrin-binding Protein," Nat Biotechnol 15:1276-9 (1997), 그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함됨). 이 MBP 글리코접합체는 임의의 천연 당단백질보다 훨씬 더 많은 글리칸을 함유할 것이다(Ben-Dor et al., "Biases and Complex Patterns in the Residues Flanking Protein N-Glycosylation Sites," Glycobiology 14:95-101 (2004), 그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함됨).

실시예 3 - 이. 콜라이에서의 IgG M18.1 글리코실화

이 실시예는 글리코 조작된 이. 콜라이의 주변 세포질에서 착체 인간 당단백질의 글리코실화를 설명하는 것이다. 구체적으로, 탄저병 독소에 대한 전장 인간 면역글로불린(IgG M18.1)을 pMAZ360 M18.1에서 발현되었고(Mazor et al., "Isolation of Engineered, Full-length Antibodies from Libraries Expressed in Escherichia coli," Nat Biotechnol 25:563-5 (2007), 그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함됨)), 부위 지정 돌연변이(Quik Change Kit, Qiagen)를 통해 돌연변이시켜 IgG 중쇄(C_H2)에서 295번 잔기에서의 글루타민 잔기가 아스파트산으로 돌연변이되어 프라이머(각각 5'-gacaaagccgcgggaggaggattacaacagcacgtaccgtg-3' 및 5'-cacggtacgtgctgttgtaatcctcctcccgcggctttgtc-3'서열 번호15 및 서열 번호 18)를 사용하여 박테리아 글리코실화 모티프 D-X₁-N-X₂-S/T를 도입시켰다(도 5a). pACYC-pgl 또는 pACYC-pglmut(PglB W458A, D459A)에 의해 형질전환된 BL21(DE3) 이. 콜라이의 주변 세포질에서의 발현 이후(Wacker et al., "N-linked Glycosylation in Campylobacter jejuni and its Functional Transfer into E. coli," Science 298:1790-3 (2002), 그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함됨), IgG M18.1을 단백질 A/G 친화도 크로마토그래피(Nab 단백질 AG 스핀 키트, Pierce)를 통해 세포 용리액으로부터 정제하고 비환원 12% SDS 겔에서 SDS-PAGE로 처리하고 박테리아 헵타사카라이드에 대해 상승된 hR6P 및 항혈청 항인간 IgG(Promega)를 통한 검출로 웨스턴 블롯팅하였다. pACYC-pgl 또는 pACYC-pglmut에 의해 형질전환된 BL21(DE3) 이. 콜라이로부터 단리된 IgG M18.1에 대해 특징적인 IgG 밴드 패턴이 관찰되었다. pACYC-pgl에 의해 형질전환된 BL21(DE3) 이. 콜라이 유래의 IgG M18.1만이 박테리아 N-글리칸 특이적 항혈청(hR6P)과 교차 반응하였다. pgl+ 및 pgl- 세포에 대한 이러한 IgG 밴드 패턴이 도 5b 및 도 5c에서 관찰되었다. 그러나, pgl+ 세포 유래의 IgG M18.1이 박테리아 N-글리칸 특이적 항혈청(hR6P)과 교차 반응하였다(도 5b 및 도 5c). 이 결과는 인간 IgG가 글리코 조작된 이. 콜라이 세포의 주변 세포질에서 글리코실화될 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 다양한 실시양태에서, 본 발명은 글리코 조작된 이. 콜라이 세포에서 생산된 글리코실화 인간 IgG를 제공한다.

실시예 4 - 박테리아 세포 표면에서 N 연결 당단백질의 디스플레이

외부 막 앵커로서 플라즈미드 pCjaA 유래의 C.제주니 CjaA 단백질을 발현하는 pACYC-pgl(Wacker et al., "N-linked Glycosylation in Campylobacter jejuni and its Functional Transfer into E. coli," Science 298:1790-3 (2002), 그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함됨)에 의해 형질전환된 이. 콜라이 BW25113 waaC:Kan은 세포 표면에 박테리아 헵타사카라이드를 디스플레이하였다. 씨. 제주니 CjaA에 대한 코딩 영역을 C 말단 FLAG 에피토프 태그에 대한 코딩 영역에 부착된 pBAD18로 삽입하여 플라즈미드 pCjaA를 작제하였다. 형광 염료에 접합된 대두 응집소를 갖는 세포(SBA-Alexa Fluor 488 접합체, Molecular Probes)를 배양하고 유세포분석기에 의해 분석하여 디스플레이를 검출하였다. pCjaA 및 pACYC-pglmut(Wacker et al., "N-linked Glycosylation in Campylobacter jejuni and its Functional Transfer into E. coli," Science 298:1790-3 (2002), 그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함됨)에 의해 또는 오직 pCjaA에 의해서만 형질전환된 이. 콜라이 BW25113 waaC:Kan은 형광 표지를 생성시키지 않았다. pACYC-pgl 또는 pACYC-pglmut(Wacker et al., "N-linked Glycosylation in Campylobacter jejuni and its Functional Transfer into E. coli," Science 298:1790-3 (2002), 그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함됨) 중 어느 하나에 의해 형질전환된 플라즈미드 pCjaA 유래의 C.제주니 CjaA 단백질을 발현하는 이. 콜라이 BW25113 waaC:Kan 유래의 총 세포 단백질을 웨스턴 블롯 분석 처리한 후, 박테리아 헵타사카라이드에 대한 상승된 hR6P 항혈청으로 프로빙하여 글리칸 부착을 확인하였다.

실시예 5 - 이. 콜라이 글리코파지 디스플레이 시스템

씨. 제주니 글리코실화 유전자좌의 천연형(pgl+) 또는 돌연변이형(pglmut) 중 어느 하나를 보유하는 이. 콜라이 TG1 세포에서 파지미드 pAcrA-g3p 유래의 AcrA-g3p의 발현을 수행하였고, 전체 세포 용리액에서 AcrA-g3p의 외관은 분석하였다. AcrA 특이적 항혈청에 의한 면역블롯 분석은 50 mM 아라비노스에 의한 유도 3, 5 및 16 시간 후 TG1 pgl+ 및 TG1 pglmut 둘 다의 세포 용리액에서 신호를 나타냈다(도 8a 및 도 8b, 3 레인 내지 5 레인). 약 80 kDa의 명확한 분자 질량을 갖는 항AcrA 교차 반응 단백질은 80.8 kDa의 AcrA-g3p 융합 단백질의 계산 질량에 잘 맞았다. 동일한 용리액을 씨. 제주니 전체 세포 추출물에 대해 상승된 글리코실화 특이적 항혈청(R12)으로 프로빙하고 AcrA의 글리코실화형에 대해 강한 선호도를 나타냈다(Wacker et al., "N-linked Glycosylation in Campylobacter jejuni and its Functional Transfer into E. coli," Science 298:1790-3 (2002), 그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함됨)(도 8c). 여기서, 약 80 kDa의 분자 질량을 갖는 면역반응성 밴드는 유도 3, 5 및 16 시간 후 TG1 pgl+ 세포의 전체 세포 용리액에서만 오직 관찰될 수 있었다(도 8c, 3 레인 내지 5 레인). 이 데이터는 AcrA-g3p 융합 단백질이 씨. 제주니 pgl 시스템에 의해 글리코실화된다는 것을 입증하였다.

실시예 6 - AcrA-g3p의 시간 의존적 발현 및 글리코실화

이. 콜라이 TG1은 pAra-AcrA-g3p로 이루어진 플라즈미드 유래의 g3p 파지 코트 단백질에 대한 씨. 제주니 AcrA의 융합체를 발현하였다. pAra-Acra-g3p에서, 펙테이트 리가제 B 신호 서열(pelB)을 이. 콜라이의 주변 세포질에 Sec 의존적 전좌에 대해 acrA 코딩 서열의 상류에 클로닝하였다. 아라비노스 유도 가능한 및 글루코스 억제 가능한 pBAD 프로모터에 의해 융합 단백질의 발현을 지시하였다. 24개의 아미노산 링커를 발현된 AcrA 도메인과 g3p 도메인 사이에 병치시켰다. 이 링커 서열은 앰버 정지 코돈(UAG) 바로 앞의 엔테로키나제 절단 부위 및 헥사-히스티딘 태그를 포함하고, 이는 이. 콜라이 supE 균주(예를 들면, TG1)에서 글루타민으로 전사된다. 이 벡터에서 파지 F1 유전자간 영역(ori M13)의 포함으로 보조 파지에 의한 중복 감염 후 단일 가닥 파지미드가 팩키징되었다. pAra-AcrA-g3p를 포함하는 TG1 세포는 pACYC-pgl 또는 pACYC-pglmut 중 어느 하나에 의해 형질전환되었고(Wacker et al., "N-linked Glycosylation in Campylobacter jejuni and its Functional Transfer into E. coli," Science 298:1790-3 (2002), 그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함됨), 비유도 세포 또는 50 mM 아라비노스에 의해 1 시간, 3 시간, 5 시간 및 16 시간 동안 배양된 세포 중 어느 나라로부터 전체 세포 용리액을 제조하였다. 단백질 표준품에 의한 10% SDS-PAGE에 의해 단백질을 분리시키고, 니트로셀룰로스 막으로 이동시키고, 박테리아 헵타사카라이드에 대해 상승된 R12 항혈청 또는 AcrA 특이적 혈청으로 가시화하였다.

실시예 7 - SBA 바이오패닝에 의한 글리코파지 농축의 정량화

pAra-AcrA-g3p 및 pACYC-pgl 또는 pACYC-pglmut(Wacker et al., "N-linked Glycosylation in Campylobacter jejuni and its Functional Transfer into E. coli," Science 298:1790-3 (2002), 그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함됨) 중 어느 하나를 포함하는 TG1 세포로부터 생산된 파지를 컬럼 정제에 대해 고정화된 대두 응집소(SBA)에 적용하였다. 새로운 TG1 세포의 감염에 의해 SBA 패닝 절차의 각 분획에 존재하는 총 콜로니 형성 단위(CFU)를 측정하였고, 이는 3개 이상의 비의존적 실험의 평균이었다. SBA 패닝으로 처리된 다수의 파지 및 새로운 감염 후 수득된 CFU의 수는 6% 미만으로 변했다. 이 분획은 1 분획, SBA 컬럼에 적용된 CFU; 2 분획, SBA 유동; 3 분획 및 4 분획, PBS 세척 단계; 5 분획, 6 분획 및 7 분획, PBS 중 30 mM 갈락토스에 의한 세척 단계; 8 분획, 9 분획 및 10 분획, PBS 중 300 mM 갈락토스에 의한 용리 단계이었다. AcrA의 존재를 항AcrA 혈청에 의해 가시화하고, 박테리아 헵타사카라이드의 존재를 박테리아 글리칸에 대해 상승된 R12 항혈청으로 가시화하였다: 1 레인, 원료 파지 제조; 2 레인, SBA 유동; 3 레인 및 4 레인, PBS에 의한 세척 분획; 5 레인 내지 7 레인, PBS 중 30 mM 갈락토스에 의한 세척 분획; 8 레인 내지 10 레인, PBS 중 300 mM 갈락토스에 의한 용리 분획. 1 레인 내지 4 레인에서, 1×10⁸개의 파지를 SDSPAGE에 적용하였다. 5 레인 내지 10레인에서, pAra-AcrA-g3p 및 pACYC-pgl을 포함하는 TG1 세포로부터 제조된 3.5×10⁷개, 1.2×10⁴개, 4.0×10³개, 1.3×10⁶개, 2.5×10⁶개, 1.2×10⁶개의 파지 또는 pAra-AcrA-g3p 및 pACYC-pglmut를 포함하는 TG1 세포로부터 제조된 1.5×10⁶개, 3.5×10³개, 3.0×10³개, 4.5×10³개, 0.5×10⁴개, 1.5×10³개의 파지를 각각 분석하였다.

배양 상청액 ml당, 각각 pAcrA-g3p를 발현하는 TG1 pgl+에 대해 <9.0×10¹¹ 및 TG1 pglmut에 대해 <8.7×10¹¹의 파지 역가를 얻었다. 글리코실화 AcrA-g3p 융합 단백질이 파지 제조에서 존재하는지를 결정하기 위해, 글리코파지의 특이적 농축을 허용하는 SBA 바이오패닝 절차를 개발하였다(도 7). 각각 pAcrA-g3p을 발현하는 TG1 pgl+ 또는 TG1 pglmut로부터의 파지 제조물을 아가로스 결합 SBA와 혼합하였고, PBS 및 30 mM 갈락토스 함유 PBS에 의한 연속 세척 단계로 비결합 파지를 제거하였다. 갈락토스는 2×10² M^-1의 평형 결합 상수로 SBA에 결합하여, 결합 올리고사카라이드와 경쟁하는데 사용되었다(Swamy et al., "Thermodynamic and Kinetic Studies on Saccharide Binding to Soya-Bean Agglutinin," Biochem J 234:515-22 (1986), 그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함됨). 파지 제조물 둘 다에 대한 각각의 세척 분획에서 유사한 역가가 발견되었다. 대조적으로, pAcrAg3p를 발현하는 TG1 pgl+ 유래의 파지에 대해 300 mM 갈락토스를 갖는 용리액에서 파지 역가에서 10³배 증가(10³ 내지 10⁶ cfu/ml)가 관찰되었지만, 그 역가는 pAcrA-g3p를 발현하는 TG1 pglmut 유래의 파지에 대해 10³ cfu/ml의 배경 수치로 머물렀다(도 9a). SBA 결합 파지의 PglB 의존적 축척은 감염성 글리코파지의 생산 및 패닝 절차에 의한 그 특이적 농축을 입증하였다. 다음에, SBA 패닝 실험 둘 다의 분획에서 글리코실화 AcrA-g3p 융합 단백질의 존재가 확인되었다. 총 파지 단백질의 SDS-PAGE 분리 후 면역검출시, AcrA-g3p에 해당하는 신호가 AcrA 특이적 항체에 의해 검출되었다(도 9a 및 도 9b, 1 레인). AcrA-g3p 특이적 밴드가 또한 유동 및 PBS 세척 단계에서 존재하였다(도 9a 및 도 9b, 2 레인, 3 레인 및 4 레인). pAcrA-g3p를 발현하는 TG1 pgl+로부터 생산된 파지가 패닝에 사용될 때(도 9b, c 패널, 8 레인, 9 레인 및 10 레인), 용리 분획에서 R12 항혈청을 갖는 깨끗한 글리코실화 특이적 신호가 존재하였다. R12 항혈청은 AcrA의 글리코실화형에 높은 선호도를 나타내지만, 또한 다양으로 존재할 때 비글리코실화 AcrA와 반응하였다(도 9b, c 패널 및 d 패널, 1 레인 내지 4 레인). 중요한 것은 갈락토스가 고농도로 용리된 파지 제조물에서 검출된 AcrA 융합 단백질(도 9b, c 패널, 8 레인, 9 레인 및 10 레인)은 단백질의 글리코실화와 일치하는 유동에서 관찰된 융합 단백질(도 9b, c 패널, 1 레인)보다 더 느리게 이동한다는 것이다. 예상된 바대로, pAcrA-g3p을 발현하는 글리코실화 결핍 균주 TG1 pglmut 유래의 파지는 R12 반응 융합 단백질을 디스플레이하지 않았다(도 9b, d 패널, 8 레인, 9 레인 및 10 레인). 따라서, 기능성 씨. 제주니 pgl 오페론의 존재하에 생산된 파지는 표면에 글리코실화 AcrA를 디스플레이하였고, 이 글리코파지는 SBA 패닝에 의해 농축되었다.

이 방법의 특이성을 추가로 시험하기 위해, TG1(pgl+, pAcrA-g3p)에 의해 생성된 정제된 글리코파지(8×10⁶ cfu)를 TG1(pglmut, pAcrA-g3p)에 의해 생성된 과량(1 내지 10⁴배)의 비글리코실화 파지와 혼합하였고, 단일 SBA 패닝 단계에 적용하였다. 이 실험 셋업으로 이 파지미드의 제한 분석에 의해 글리코파지와 비글리코실화 파지가 구별되었다. 글리코파지는 AcrA-g3p 발현 카세트에서 앰버 중지 코돈을 함유하였지만, 비글리코실화 파지는 함유하지 않았다. 글리코파지만이 SBA 패닝에 적용될 때, 약 96%(7.7×10⁶±0.3×10⁶)의 파지가 회수되었다. 글리코파지가 동량 또는 10² 내지 10⁴배 과량의 비글리코실화 파지와 혼합될 때, 각각 평균 96%(7.8×10⁶±0.2×10⁶), 93%(7.4×10⁶±0.5×10⁶) 및 79%(6.3×10⁶±1.0×10⁶)의 파지가 SBA에 의해 결합되었고, 이후 용리물에서 관찰되었다. 배타적으로 비글리코실화된 파지(8×10¹⁰)를 적용하여 SBA에 결합된 감염성 입자(3.8×10⁴±0.2×10⁴)의 양을 현저히 감소시켰다. 용리 분획에서의 파지가 실제로 글리코파지인식를 입증하기 위해, 글리코파지와 비글리코실화 파지 사이의 차이를 허용하는 EagI-EheI 분해에 의해 각각 재조합으로부터 12개의 파지미드를 분석하였다. 12개의 파지미드 중 적어도 11개가 TG1(pgl+, pAcrA-g3p) 세포에 의해 생산된 글리코파지로 팩킹된 파지미드 pAcrA-g3p의 제한 패턴을 나타냈다. 글리코파지만이 사용되는 용리 분획(양성 대조군)에서, 12개의 파지미드 중 12개가 글리코-파지미드 특이적 DNA 단편을 나타냈다. 이 데이터는 (ⅰ) N 연결 헵타사카라이드를 보유하는 글리코실화 단백질이 섬유성 파지에서 다중 디스플레이로 보정될 수 있다는 것; (ⅱ) 글리코파지 정제 절차가 효과적으로 작동한다는 것, 10⁴ 만큼 높은 농축 인자가 SBA 패닝 1회 당 얻어진다는 것 및 (iii) 글리코파지가 SBA 패닝 2회로 처리될 때에도 전염성을 잃지 않는다는 것을 분명히 입증하였다.

실시예 8 - 이. 콜라이에서 효모 글리코실 트랜스퍼라제의 발현 및 편재

Man₃GlcNAc₂ 올리고사카라이드 구조의 생성이 이. 콜라이에서 몇몇 진핵생물 글리코실 트랜스퍼라제의 기능적 발현을 요하였고, "경로 조작"의 고전적 예를 나타내었다(도 10b 참조).

제1 GlcNAc의 지질 캐리어로의 WecA 촉매 이동

박토프레닐피로포스페이트는 내부 막의 세포질 측에서 올리고사카라이드의 어셈블리에 대한 캐리어로서 작용하였다(Feldman et al., "Engineering N-linked Protein Glycosylation With Diverse O Antigen Lipopolysaccharide Structures in Escherichia doli," Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 102:3016-3021 (2005), 그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함됨). 이. 콜라이에서, 박토프레놀-PP-GlcNAc는 WecA 단백질에 의해 박토프레놀-P 및 UDP-GlcNAc로부터 생성되었다(Valvano, M. A., "Export of O-specific Lipopolysaccharide," Frontiers in Bioscience 8:S452-S471 (2003), 그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함됨). 따라서, Man₃GlcNAc₂ 올리고사카라이드를 생성하는 인공 경로에서 이 내인성 기질을 출발 분자로서 사용할 수 있다. 환원 말단 GlcNAc 잔기는 진핵생물 OST에 의한 기질 인식에 필수적이지만(Tai et al., "Substrate Specificity of the Glycosyl Donor for Oligosaccharyl Transferase," J Org Chem 66:6217-28 (2001), 그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함됨), 또한 원핵생물 OST 기질의 요건을 충족시켰다(Wacker et al., "Substrate Specificity of Bacterial Oligosaccharyltransferase Suggests a Common Transfer Mechanism for the Bacterial and Eukaryotic Systems," Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 103:7088-7093 (2006), 그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함됨).

실시예 9 - 이. 콜라이에서 효모 Alg13/14의 발현

제2 GlcNAc 잔기를 추가를 위한 β1,4 GlcNAc 트랜스퍼라제를 최근 효모에서 동정하였다(Bickel et al., "Biosynthesis of Lipid-linked Oligosaccharides in Saccharomyces cerevisiae - Alg13p AND Alg14p Form a Complex Required for the Formation of GlcNAc(2)-PP-dolichol," J. Biol. Chem. 280:34500-34506 (2005), 그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함됨). 이 효소는 사카로마이세스 세레비시아 유래의 ALG13 및 the ALG14 유전자좌에 의해 코딩되는 2개의 단백질의 착체이었다. Alg14는 내부 막 단백질인 반면, Alg13은 Alg14와의 결합에 의해 ER 막의 세포질 측과 말단 결합되었다. ΔdnaJ 세포를 시험하는 이유는 dnaJ의 불활성화가 막 단백질 발현을 증가시키고, 그 발현과 관련된 중증 세포 독성을 억제하는 것으로 공지되었기 때문이다(Skretas et al., "Genetic Analysis of G Protein-coupled Receptor Expression in Escherichia coli: Inhibitory Role of DnaJ on the Membrane Integration of the Human Central Cannabinoid Receptor," Biotechnol Bioeng (2008), 그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함됨).

Alg13을 발현하는 MC4100 이. 콜라이 세포로부터의 총 단백질은 플라즈미드 pBAD18-Cm으로부터의 C 말단 6xHIS 태그와 부착시켰다. C 말단 FLAG 에피토프 태그와 부착된 Alg14를 20,000xg에서 20 분 동안 원심분리를 수행하였다. 상청액은 가용성 분획 및 펠렛, 불용성 분획을 나타냈다. 가용성 분획을 100,000xg에서 1 시간 동안 추가로 회전시키고, 상청액 및 펠렛을 각각 가용성 및 막 분획으로서 수집하였다. 0.2% 아라비노스에 의한 유도 0, 1, 2 및 3 시간 후 수집된 가용성 세포질 분획을 항6xHIS 항체(Promega)로 프로빙하여 Alg13-6xHIS를 검출하였다. 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 MC4100 및 MC4100 ΔdnaJ 세포로부터 단리된 분획과 비교하였고, 항FLAG 항체에 의해 프로빙하여 유도 3 시간 후에 수집된 Alg14-FLAG를 검출하였다. 세포질에서의 Alg13의 가용성 발현(도 11a) 및 내부 막에서의 Alg14의 정확한 삽입(도 11b)을 관찰하였다.

다음에, 형질전환된 이. 콜라이 세포 유래의 추출물에서 GlcNAc 트랜스퍼라제 활성을 시험하였고(Bickel et al., "Biosynthesis of Lipid-linked Oligosaccharides in Saccharomyces cerevisiae - Alg13p and Alg14p Form a Complex Required for the Formation of GlcNAc(2)-PP-dolichol," J. Biol. Chem. 280:34500-34506 (2005), 그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함됨), ³H-GlcNAc에 의해 세포를 표지하고 표준 방법을 이용하여 당지질을 분석하여 박토프레놀-PP-GlcNAc₂의 생체내 형성을 분석하였다(Bickel et al., "Biosynthesis of Lipid-linked Oligosaccharides in Saccharomyces cerevisiae - Alg13p and Alg14p Form a Complex Required for the Formation of GlcNAc(2)-PP-dolichol," J. Biol. Chem. 280:34500-34506 (2005), 그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함됨).

실시예 10 - 이. 콜라이에서의 Alg1 및 Alg2의 발현

또한, 본 발명의 방법은 활성 Alg1 단백질, β1,4 만노실 트랜스퍼라제 및 올리고사카라이드로의 α1,3 및 α1,6 만노스 잔기 둘 다의 첨가를 촉매하는 2작용성 Alg2 만노실 트랜스퍼라제의 발현을 필요로 하였다. 이 효소 각각은 이. 콜라이에서 활성형으로 이미 발현되었다(O'Reilly et al., "In vitro Evidence for the Dual Function of Alg2 and Alg11: Essential Mannosyltransferases in N-linked Glycoprotein Biosynthesis," Biochemistry 45:9593-603 (2006); Wilson et al., "Dolichol is Not a Necessary Moiety for Lipid-linked Oligosaccharide Substrates of the Mannosyltransferases Involved in In vitro N-linked-oligosaccharide Assembly," Biochem J 310(Pt 3):909-16 (1995), 그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함됨).

Alg1 및 Alg2를 발현하는 MC4100 ΔdnaJ 이. 콜라이 세포 유래의 총 단백질을 각각 C 말단 6xHIS 태그에 부착시켰고, Alg2의 경우, N 말단 티오레독신(TrxA) 용해도 태그를 20,000xg에서 20 분 동안 원심분리를 수행하였고, 상청액을 수집하였고, 100,000xg에서 1 시간 동안 추가로 회전시켰고, 이 스핀으로부터의 펠렛을 막 분획으로서 수집하였다. 막 분획을 유도 후 3, 4 및 5 시간에 세포로부터 수확하였다. 블롯을 항6xHIS 항체(Promega)에 의해 프로빙하였다. 도 12에 도시된 바대로, 각각은 이. 콜라이의 내부 막에 정확히 편재되었다.

다음에, 입증된 프로토콜에 따라 형질전환된 이. 콜라이 세포 유래의 추출물에서 만노실 트랜스퍼라제 활성을 시험할 필요가 있었다(O'Reilly et al., "In vitro Evidence for the Dual Function of Alg2 and Alg11: Essential Mannosyltransferases in N-linked Glycoprotein Biosynthesis," Biochemistry 45:9593-603 (2006); Schwarz et al., "Deficiency of GDP-Man:GlcNAc2-PP-dolichol Mannosyltransferase Causes Congenital Disorder of Glycosylation Type Ik," Am J Hum Genet 74:472-81 (2004), 그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함됨).

예측예 11 - 인공 Alg 오페론의 작제

각각의 효소가 이. 콜라이에서 기능적으로 발현될 수 있음을 입증한 후, 상기 효모 효소의 4개 모두를 코딩하는 유전자 클러스터를 단일 플라즈미드 백본에서 작제하였다. wt, DdnaJ 돌연변이체에서, 및 막 단백질 발현에 이미 최적화된 균주 C41(DE3)에서 4개의 Alg 효소의 동시 발현을 수행하였다(Miroux et al., "Over-production of Proteins in Escherichia coli: Mutant Hosts That Allow Synthesis of Some Membrane Proteins and Globular Proteins at High Levels," J Mol Biol 260:289-98 (1996), 그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함됨). 본 출원인은 4개의 Alg 효소의 동시 발현이 박토프레놀-PP-GlcNAc₂Man₃을 생체내 형성시킬 것이라는 것을 예상하였다. 이는 30 분 동안 37℃에서 ³H-만노스에 의한 세포의 대사 표지에 의해 확인되었다. 박토프레놀 연결 올리고사카라이드를 추출하였고, 방출시켰고, 문헌[Korner et al., "Abnormal Synthesis of Mannose 1-phosphate Derived Carbohydrates in Carbohydrate-deficient Glycoprotein Syndrome Type I Fibroblasts with Phosphomannomutase Deficiency," Glycobiology 8:165-71 (1998), 그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함됨]에 기재된 바대로 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 분석하였다.

바람직한 실시양태가 본원에 자세히 도시되고 기재되어 있지만, 관련 분야의 당업자라면 본 발명의 정신을 벗어나는 일 없이 다양한 변경, 추가, 대체 등을 할 수 있다는 것을 명확히 알 것이고, 따라서 이는 하기의 특허청구범위에 의해 한정되는 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.

SEQUENCE LISTING <110> Cornell Research Foundation, Inc. DELISA, Matthew GUARINO, Cassandra MANSELL, Thomas FISHER, Adam <120> GLYCOSYLATED PROTEIN EXPRESSION IN PROKARYOTES <130> 19603/5922 <150> 61/018,772 <151> 2008-01-03 <150> PCT/US2009/030110 <151> 2009-01-05 <160> 24 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 609 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 1 atgggtatta ttgaagaaaa ggctcttttt gttacgtgtg gggcaacggt gccatttcca 60 aagctcgtct catgtgtgct aagcgacgaa ttctgccaag aattgattca atatggattc 120 gtacgtctaa tcattcagtt tgggagaaac tacagttctg aatttgagca tttagtgcaa 180 gaacgcgggg gccaaagaga aagccaaaaa attccaattg accagtttgg ctgtggcgac 240 accgcaagac agtatgtcct gatgaacggg aaattaaagg tgatcgggtt tgacttttcg 300 accaagatgc aaagtattat acgtgattat tcagatttgg tcatatcaca cgctggaacg 360 ggctctatac tagattctct acggttgaat aaaccgttga tagtttgcgt aaacgattct 420 ttgatggata accaccagca gcagatagca gacaagtttg tagagttggg ctacgtatgg 480 tcttgtgcac ccactgaaac aggtttgata gctggtttac gtgcatctca aacagagaaa 540 ctcaaaccat tcccagtttc tcataacccg tcatttgagc gattgctagt 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Saccharomyces cerevisiae Alg2 <400> 8 atgatcgaaa aagacaaacg taccatcgct ttcatccacc cggacctggg tatcggtggt 60 gctgaacgtc tggttgttga cgctgctctg ggtctgcagc agcagggtca ctctgttatc 120 atctacacct ctcactgcga caaatctcac tgcttcgaag aagttaaaaa cggtcagctg 180 aaagttgaag tttacggtga cttcctgccg accaacttcc tgggtcgttt cttcatcgtt 240 ttcgctacca tccgtcagct gtacctggtt atccagctga tcctgcagaa aaaagttaac 300 gcttaccagc tgatcatcat cgaccagctg tctacctgca tcccgctgct gcacatcttc 360 tcttctgcta ccctgatgtt ctactgccac ttcccggacc agctgctggc tcagcgtgct 420 ggtctgctga aaaaaatcta ccgtctgccg ttcgacctga tcgaacagtt ctctgtttct 480 gctgctgaca ccgttgttgt taactctaac ttcaccaaaa acaccttcca ccagaccttc 540 aaatacctgt ctaacgaccc ggacgttatc tacccgtgcg ttgacctgtc taccatcgaa 600 atcgaagaca tcgacaaaaa attcttcaaa accgttttca acgaaggtga ccgtttctac 660 ctgtctatca accgtttcga aaaaaaaaaa gacgttgctc tggctatcaa agctttcgct 720 ctgtctgaag accagatcaa cgacaacgtt aaactggtta tctgcggtgg ttacgacgaa 780 cgtgttgctg aaaacgttga atacctgaaa gaactgcagt 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cttttcacca aactggtaac gttcatacta 120 aataatttgt tgatcaggtt tctgtcgccc agaattttcg gtatcacggc ctttctagaa 180 tttatacagg gcacagtgtt attttttagc agagatgcga ttcgtctgtc gacgttgaga 240 atctcagact ccggtaatgg aataatcgat gatgacgacg aggaggagta ccaggaaact 300 cattacaagt ctaaagtttt gcaaaccgca gtcaattttg cttacattcc gttttggatc 360 gggtttccac tgtccattgg tcttatcgcc tggcagtaca gaaacatcaa cgcgtatttc 420 atcactcttc cattcttcag gtggtcgatt tttcttatct ggctgagtat catcgtggag 480 ctgttaagcg agccattctt catcgtcaac cagtttatgt tgaactatgc cgcaaggtca 540 agatttgaaa gcatcgcggt gactacagga tgtattgtca attttatagt tgtttatgcc 600 gttcagcaat cccgctaccc aatgggggtt gtcacatcgg acattgacaa agaaggcatc 660 gccatattgg catttgcctt gggaaagtta gcacattcga tcaccctgct agcatgttac 720 tactgggact atctcaagaa tttcaaacca aagaaattgt tcagtaccag gctaacgaag 780 ataaaaacgc gtgaaaataa cgaattgaag aaaggctacc caaagagcac atcttatttt 840 ttccaaaacg acattttaca gcacttcaaa aaagtttatt ttcaactatg ttttaagcat 900 ttgttgacag agggtgataa gttgattatc aattctttat 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codon-optimized Saccharomyces cerevisiae Rft1 <400> 10 atggctaaaa aaaactctca gctgccgtct acctctgaac agatcctgga acgttctacc 60 accggtgcta ccttcctgat gatgggtcag ctgttcacca aactggttac cttcatcctg 120 aacaacctgc tgatccgttt cctgtctccg cgtatcttcg gtatcaccgc tttcctggaa 180 ttcatccagg gtaccgttct gttcttctct cgtgacgcta tccgtctgtc taccctgcgt 240 atctctgact ctggtaacgg tatcatcgac gacgacgacg aagaagaata ccaggaaacc 300 cactacaaat ctaaagttct gcagaccgct gttaacttcg cttacatccc gttctggatc 360 ggtttcccgc tgtctatcgg tctgatcgct tggcagtacc gtaacatcaa cgcttacttc 420 atcaccctgc cgttcttccg ttggtctatc ttcctgatct ggctgtctat catcgttgaa 480 ctgctgtctg aaccgttctt catcgttaac cagttcatgc tgaactacgc tgctcgttct 540 cgtttcgaat ctatcgctgt taccaccggt tgcatcgtta acttcatcgt tgtttacgct 600 gttcagcagt ctcgttaccc gatgggtgtt gttacctctg acatcgacaa agaaggtatc 660 gctatcctgg ctttcgctct gggtaaactg gctcactcta tcaccctgct ggcttgctac 720 tactgggact acctgaaaaa cttcaaaccg aaaaaactgt tctctacccg tctgaccaaa 780 atcaaaaccc gtgaaaacaa cgaactgaaa 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720 acttggtacg ctattggaac tgttgcatcc atgcagatcc catttgtcgg tttcctacct 780 atcaggtcta acgaccacat ggccgcattg ggtgttttcg gtttgattca gattgtcgcc 840 ttcggtgact tcgtgaaggg ccaaatcagc acagctaagt ttaaagtcat catgatggtt 900 tctctgtttt tgatcttggt ccttggtgtg gtcggacttt ctgccttgac ctatatgggg 960 ttgattgccc cttggactgg tagattttat tcgttatggg ataccaacta cgcaaagatc 1020 cacattccta tcattgcctc cgtttccgaa catcaacccg tttcgtggcc cgctttcttc 1080 tttgataccc actttttgat ctggctattc cccgccggtg tattcctact attcctcgac 1140 ttgaaagacg agcacgtttt tgtcatcgct tactccgttc tgtgttcgta ctttgccggt 1200 gttatggtta gattgatgtt gactttgaca ccagtcatct gtgtgtccgc cgccgtcgca 1260 ttgtccaaga tatttgacat ctacctggat ttcaagacaa gtgaccgcaa atacgccatc 1320 aaacctgcgg cactactggc caaattgatt gtttccggat cattcatctt ttatttgtat 1380 cttttcgtct tccattctac ttgggtaaca agaactgcat actcttctcc ttctgttgtt 1440 ttgccatcac aaaccccaga tggtaaattg gcgttgatcg acgacttcag ggaagcgtac 1500 tattggttaa gaatgaactc tgatgaggac agtaaggttg cagcgtggtg ggattacggt 1560 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Leu Ile Val Ser Thr Ala 1 5 10 15 Tyr Val Ile Arg Leu Ile Ala Ile Leu Pro Phe Phe His Thr Gln Ala 20 25 30 Gly Thr Glu Lys Asp Thr Lys Asp Gly Val Asn Leu Leu Lys Ile Arg 35 40 45 Lys Ser Ser Lys Lys Pro Leu Lys Ile Phe Val Phe Leu Gly Ser Gly 50 55 60 Gly His Thr Gly Glu Met Ile Arg Leu Leu Glu Asn Tyr Gln Asp Leu 65 70 75 80 Leu Leu Gly Lys Ser Ile Val Tyr Leu Gly Tyr Ser Asp Glu Ala Ser 85 90 95 Arg Gln Arg Phe Ala His Phe Ile Lys Lys Phe Gly His Cys Lys Val 100 105 110 Lys Tyr Tyr Glu Phe Met Lys Ala Arg Glu Val Lys Ala Thr Leu Leu 115 120 125 Gln Ser Val Lys Thr Ile Ile Gly Thr Leu Val Gln Ser Phe Val His 130 135 140 Val Val Arg Ile Arg Phe Ala Met Cys Gly Ser Pro His Leu Phe Leu 145 150 155 160 Leu Asn Gly Pro Gly Thr Cys Cys Ile Ile Ser Phe Trp Leu Lys Ile 165 170 175 Met Glu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Gly Ser Ser His Ile Val Tyr Val 180 185 190 Glu Ser Leu Ala Arg Ile Asn Thr Pro Ser Leu Thr Gly Lys Ile Leu 195 200 205 Tyr Trp Val Val Asp Glu Phe Ile Val Gln Trp Gln Glu Leu Arg Asp 210 215 220 Asn Tyr Leu Pro Arg Ser Lys Trp Phe Gly Ile Leu Val 225 230 235 <210> 23 <211> 574 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 23 Met Ala Lys Lys Asn Ser Gln Leu Pro Ser Thr Ser Glu Gln Ile Leu 1 5 10 15 Glu Arg Ser Thr Thr Gly Ala Thr Phe Leu Met Met Gly Gln Leu Phe 20 25 30 Thr Lys Leu Val Thr Phe Ile Leu Asn Asn Leu Leu Ile Arg Phe Leu 35 40 45 Ser Pro Arg Ile Phe Gly Ile Thr Ala Phe Leu Glu Phe Ile Gln Gly 50 55 60 Thr Val Leu Phe Phe Ser Arg Asp Ala Ile Arg Leu Ser Thr Leu Arg 65 70 75 80 Ile Ser Asp Ser Gly Asn Gly Ile Ile Asp Asp Asp Asp Glu Glu Glu 85 90 95 Tyr Gln Glu Thr His Tyr Lys Ser Lys Val Leu Gln Thr Ala Val Asn 100 105 110 Phe Ala Tyr Ile Pro Phe Trp Ile Gly Phe Pro Leu Ser Ile Gly Leu 115 120 125 Ile Ala Trp Gln Tyr Arg Asn Ile Asn Ala Tyr Phe Ile Thr Leu Pro 130 135 140 Phe Phe Arg Trp Ser Ile Phe Leu Ile Trp Leu Ser Ile Ile Val Glu 145 150 155 160 Leu Leu Ser Glu Pro Phe Phe Ile Val Asn Gln Phe Met Leu Asn Tyr 165 170 175 Ala Ala Arg Ser Arg Phe Glu Ser Ile Ala Val Thr Thr Gly Cys Ile 180 185 190 Val Asn Phe Ile Val Val Tyr Ala Val Gln Gln Ser Arg Tyr Pro Met 195 200 205 Gly Val Val Thr Ser Asp Ile Asp Lys Glu Gly Ile Ala Ile Leu Ala 210 215 220 Phe Ala Leu Gly Lys Leu Ala His Ser Ile Thr Leu Leu Ala Cys Tyr 225 230 235 240 Tyr Trp Asp Tyr Leu Lys Asn Phe Lys Pro Lys Lys Leu Phe Ser Thr 245 250 255 Arg Leu Thr Lys Ile Lys Thr Arg Glu Asn Asn Glu Leu Lys Lys Gly 260 265 270 Tyr Pro Lys Ser Thr Ser Tyr Phe Phe Gln Asn Asp Ile Leu Gln His 275 280 285 Phe Lys Lys Val Tyr Phe Gln Leu Cys Phe Lys His Leu Leu Thr Glu 290 295 300 Gly Asp Lys Leu Ile Ile Asn Ser Leu Cys Thr Val Glu Glu Gln Gly 305 310 315 320 Ile Tyr Ala Leu Leu Ser Asn Tyr Gly Ser Leu Leu Thr Arg Leu Leu 325 330 335 Phe Ala Pro Ile Glu Glu Ser Leu Arg Leu Phe Leu Ala Arg Leu Leu 340 345 350 Ser Ser His Asn Pro Lys Asn Leu Lys Leu Ser Ile Glu Val Leu Val 355 360 365 Asn Leu Thr Arg Phe Tyr Ile Tyr Leu Ser Leu Met Ile Ile Val Phe 370 375 380 Gly Pro Ala Asn Ser Ser Phe Leu Leu Gln Phe Leu Ile Gly Ser Lys 385 390 395 400 Trp Ser Thr Thr Ser Val Leu Asp Thr Ile Arg Val Tyr Cys Phe Tyr 405 410 415 Ile Pro Phe Leu Ser Leu Asn Gly Ile Phe Glu Ala Phe Phe Gln Ser 420 425 430 Val Ala Thr Gly Asp Gln Ile Leu Lys His Ser Tyr Phe Met Met Ala 435 440 445 Phe Ser Gly Ile Phe Leu Leu Asn Ser Trp Leu Leu Ile Glu Lys Leu 450 455 460 Lys Leu Ser Ile Glu Gly Leu Ile Leu Ser Asn Ile Ile Asn Met Val 465 470 475 480 Leu Arg Ile Leu Tyr Cys Gly Val Phe Leu Asn Lys Phe His Arg Glu 485 490 495 Leu Phe Thr Asp Ser Ser Phe Phe Phe Asn Phe Lys Asp Phe Lys Thr 500 505 510 Val Ile Ile Ala Gly Ser Thr Ile Cys Leu Leu Asp Trp Trp Phe Ile 515 520 525 Gly Tyr Val Lys Asn Leu Gln Gln Phe Val Val Asn Val Leu Phe Ala 530 535 540 Met Gly Leu Leu Ala Leu Ile Leu Val Lys Glu Arg Gln Thr Ile Gln 545 550 555 560 Ser Phe Ile Asn Lys Arg Ala Val Ser Asn Ser Lys Asp Val 565 570 <210> 24 <211> 718 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 24 Met Gly Ser Asp Arg Ser Cys Val Leu Ser Val Phe Gln Thr Ile Leu 1 5 10 15 Lys Leu Val Ile Phe Val Ala Ile Phe Gly Ala Ala Ile Ser Ser Arg 20 25 30 Leu Phe Ala Val Ile Lys Phe Glu Ser Ile Ile His Glu Phe Asp Pro 35 40 45 Trp Phe Asn Tyr Arg Ala Thr Lys Tyr Leu Val Asn Asn Ser Phe Tyr 50 55 60 Lys Phe Leu Asn Trp Phe Asp Asp Arg Thr Trp Tyr Pro Leu Gly Arg 65 70 75 80 Val Thr Gly Gly Thr Leu Tyr Pro Gly Leu Met Thr Thr Ser Ala Phe 85 90 95 Ile Trp His Ala Leu Arg Asn Trp Leu Gly Leu Pro Ile Asp Ile Arg 100 105 110 Asn Val Cys Val Leu Phe Ala Pro Leu Phe Ser Gly Val Thr Ala Trp 115 120 125 Ala Thr Tyr Glu Phe Thr Lys Glu Ile Lys Asp Ala Ser Ala Gly Leu 130 135 140 Leu Ala Ala Gly Phe Ile Ala Ile Val Pro Gly Tyr Ile Ser Arg Ser 145 150 155 160 Val Ala Gly Ser Tyr Asp Asn Glu Ala Ile Ala Ile Thr Leu Leu Met 165 170 175 Val Thr Phe Met Phe Trp Ile Lys Ala Gln Lys Thr Gly Ser Ile Met 180 185 190 His Ala Thr Cys Ala Ala Leu Phe Tyr Phe Tyr Met Val Ser Ala Trp 195 200 205 Gly Gly Tyr Val Phe Ile Thr Asn Leu Ile Pro Leu His Val Phe Leu 210 215 220 Leu Ile Leu Met Gly Arg Tyr Ser Ser Lys Leu Tyr Ser Ala Tyr Thr 225 230 235 240 Thr Trp Tyr Ala Ile Gly Thr Val Ala Ser Met Gln Ile Pro Phe Val 245 250 255 Gly Phe Leu Pro Ile Arg Ser Asn Asp His Met Ala Ala Leu Gly Val 260 265 270 Phe Gly Leu Ile Gln Ile Val Ala Phe Gly Asp Phe Val Lys Gly Gln 275 280 285 Ile Ser Thr Ala Lys Phe Lys Val Ile Met Met Val Ser Leu Phe Leu 290 295 300 Ile Leu Val Leu Gly Val Val Gly Leu Ser Ala Leu Thr Tyr Met Gly 305 310 315 320 Leu Ile Ala Pro Trp Thr Gly Arg Phe Tyr Ser Leu Trp Asp Thr Asn 325 330 335 Tyr Ala Lys Ile His Ile Pro Ile Ile Ala Ser Val Ser Glu His Gln 340 345 350 Pro Val Ser Trp Pro Ala Phe Phe Phe Asp Thr His Phe Leu Ile Trp 355 360 365 Leu Phe Pro Ala Gly Val Phe Leu Leu Phe Leu Asp Leu Lys Asp Glu 370 375 380 His Val Phe Val Ile Ala Tyr Ser Val Leu Cys Ser Tyr Phe Ala Gly 385 390 395 400 Val Met Val Arg Leu Met Leu Thr Leu Thr Pro Val Ile Cys Val Ser 405 410 415 Ala Ala Val Ala Leu Ser Lys Ile Phe Asp Ile Tyr Leu Asp Phe Lys 420 425 430 Thr Ser Asp Arg Lys Tyr Ala Ile Lys Pro Ala Ala Leu Leu Ala Lys 435 440 445 Leu Ile Val Ser Gly Ser Phe Ile Phe Tyr Leu Tyr Leu Phe Val Phe 450 455 460 His Ser Thr Trp Val Thr Arg Thr Ala Tyr Ser Ser Pro Ser Val Val 465 470 475 480 Leu Pro Ser Gln Thr Pro Asp Gly Lys Leu Ala Leu Ile Asp Asp Phe 485 490 495 Arg Glu Ala Tyr Tyr Trp Leu Arg Met Asn Ser Asp Glu Asp Ser Lys 500 505 510 Val Ala Ala Trp Trp Asp Tyr Gly Tyr Gln Ile Gly Gly Met Ala Asp 515 520 525 Arg Thr Thr Leu Val Asp Asn Asn Thr Trp Asn Asn Thr His Ile Ala 530 535 540 Ile Val Gly Lys Ala Met Ala Ser Pro Glu Glu Lys Ser Tyr Glu Ile 545 550 555 560 Leu Lys Glu His Asp Val Asp Tyr Val Leu Val Ile Phe Gly Gly Leu 565 570 575 Ile Gly Phe Gly Gly Asp Asp Ile Asn Lys Phe Leu Trp Met Ile Arg 580 585 590 Ile Ser Glu Gly Ile Trp Pro Glu Glu Ile Lys Glu Arg Asp Phe Tyr 595 600 605 Thr Ala Glu Gly Glu Tyr Arg Val Asp Ala Arg Ala Ser Glu Thr Met 610 615 620 Arg Asn Ser Leu Leu Tyr Lys Met Ser Tyr Lys Asp Phe Pro Gln Leu 625 630 635 640 Phe Asn Gly Gly Gln Ala Thr Asp Arg Val Arg Gln Gln Met Ile Thr 645 650 655 Pro Leu Asp Val Pro Pro Leu Asp Tyr Phe Asp Glu Val Phe Thr Ser 660 665 670 Glu Asn Trp Met Val Arg Ile Tyr Gln Leu Lys Lys Asp Asp Ala Gln 675 680 685 Gly Arg Thr Leu Arg Asp Val Gly Glu Leu Thr Arg Ser Ser Thr Lys 690 695 700 Thr Arg Arg Ser Ile Lys Arg Pro Glu Leu Gly Leu Arg Val 705 710 715

Claims (41)

1. 하나 이상의 진핵생물 UDP-GlcNAc 트랜스퍼라제 효소 및 하나 이상의 진핵생물 만노실 트랜스퍼라제 효소를 포함하는 원핵생물 숙주 세포로서, 상기 효소는 진핵생물 글리코실 트랜스퍼라제 활성을 숙주 세포에 부여하는 원핵생물 숙주 세포.
2. 제1항에 있어서, 관심있는 단백질을 더 포함하는 원핵생물 숙주 세포.
3. 재조합 원핵생물 숙주 세포를 배양하여 하나 이상의 진핵생물 UDP-GlcNAc 트랜스퍼라제 효소 및 하나 이상의 진핵생물 만노실 트랜스퍼라제 효소를 발현시키는 단계로서, 상기 효소는 진핵생물 글리코실 트랜스퍼라제 활성을 숙주 세포에 부여하며, 상기 배양은 글리코실화 단백질을 생산하기에 효과적인 조건 하에서 수행되는 단계
   를 포함하는 글리코실화 단백질의 생산 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 글리코실화 단백질은
   자연 항원을 인식하여 이에 결합하는 Fv 부분, 및
   보존된 아스파라긴 잔기에서 글리코실화된 Fc 부분
   을 포함하는 글리코실화 항체인 생산 방법.
5. 제1항에 있어서, UDP-GlcNAc 트랜스퍼라제 효소는 Alg13 활성 및 Alg14 활성을 포함하는 것인 원핵생물 숙주 세포.
6. 제1항에 있어서, 만노실 트랜스퍼라제 효소는 Alg1 활성 및 Alg2 활성을 포함하는 것인 원핵생물 숙주 세포.
7. 제1항에 있어서, 플립파제 활성을 더 포함하는 것인 원핵생물 숙주 세포.
8. 제1항에 있어서, 올리고사카릴 트랜스퍼라제 활성을 더 포함하는 것인 원핵생물 숙주 세포.
9. 제3항에 있어서, 글리코실화 단백질은 에리쓰로포이에틴, 사이토킨, 인터페론, G-CSF, 응집 인자, 인자 VIII, 인자 IX, 인간 단백질 C, 가용성 IgE 수용체 α-사슬, IgG, IgG 단편, IgM, 인터류킨, 유로키나제, 키마제, 우레아 트립신 억제제, IGF 결합 단백질, 표피 성장 인자, 성장 호르몬 방출 인자, 아넥신 V 융합 단백질, 안지오스타틴, 혈관 내피 성장 인자-2, 골수 전구세포 억제 인자-1, 오스테오프로테게린, α-1 항트립신, DN아제 II, α-페토 단백질, TNF 결합 단백질 1(rhTBP-1), 막간 활성제 및 칼슘 조정제 및 시클로필린 리간드 작용자(TACI-Ig), 여포 자극 호르몬(FSH), GM-CSF, 글루카곤 유사 단백질 1(GLP-1), IL-1 수용체 효능제, 가용성 TNF 수용체 Fc 융합(sTNFr), ATIII, rh트롬빈, 글루코세레브로시다제, 세포독성 T 림프구 관련 항원 4-Ig(CTLA4-Ig) 및 혈청 알부민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 생산 방법.
10. 제3항에 있어서, 원핵생물 숙주 세포는 경쟁 당 생합성 반응과 관련된 하나 이상의 유전자의 결실을 더 포함하는 것인 생산 방법.
11. 제3항에 있어서, 진핵생물 글리코실 트랜스퍼라제 활성은 GlcNAc₂를 포함하는 하나 이상의 올리고사카라이드 조성물을 생산시키는 것인 생산 방법.
12. 제11항에 있어서, GlcNAc₂를 포함하는 올리고사카라이드 조성물은 하나 이상의 만노스 잔기를 더 포함하는 것인 생산 방법.
13. 제11항에 있어서, 진핵생물 글리코실 트랜스퍼라제 활성은 Man₃GlcNAc₂를 포함하는 하나 이상의 올리고사카라이드 조성물을 생산시키는 것인 생산 방법.
14. 제3항에 있어서, UDP-GlcNAc 트랜스퍼라제 효소는 Alg13 활성 및 Alg14 활성을 포함하는 것인 생산 방법.
15. 제3항에 있어서, 만노실 트랜스퍼라제 효소는 Alg1 활성 및 Alg2 활성을 포함하는 것인 생산 방법.
16. 제3항에 있어서, 원핵생물 숙주 세포는 플립파제 활성을 더 포함하는 것인 생산 방법.
17. 제3항에 있어서, 원핵생물 숙주 세포는 올리고사카릴 트랜스퍼라제 활성을 더 포함하는 것인 생산 방법.
18. 제5항에 있어서, 상기 Alg13 활성은 서열 번호 1 또는 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 의해 코딩되거나 또는 상기 Alg14 활성은 서열 번호 3 또는 4의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 의해 코딩되는 것인 원핵생물 숙주 세포.
19. 제6항에 있어서, 상기 Alg1 활성은 서열 번호 5 또는 6의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 의해 코딩되거나 또는 상기 Alg2 활성은 서열 번호 7 또는 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 의해 코딩되는 것인 원핵생물 숙주 세포.
20. 제14항에 있어서, 상기 Alg13 활성은 서열 번호 1 또는 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 의해 코딩되거나 또는 상기 Alg14 활성은 서열 번호 3 또는 4의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 의해 코딩되는 것인 생산 방법.
21. 제15항에 있어서, 상기 Alg1 활성은 서열 번호 5 또는 6의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 의해 코딩되거나 또는 상기 Alg2 활성은 서열 번호 7 또는 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 의해 코딩되는 것인 생산 방법.
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