JP2020202832A - 非フコシル化タンパク質および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
a)転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ構築物を取得するステップ;および、
b)ステップa)の構築物を細胞に遺伝子導入し、フコシル化活性を持たない細胞を取得するステップ
を含む方法に関する。
非フコシル化タンパク質を取得する方法であって、該方法は:
a)転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ構築物を取得するステップ;
b)ステップa)の構築物を細胞に遺伝子導入し、フコシル化活性を持たない細胞を取得するステップ;および、
c)ステップb)の細胞により発現された非フコシル化タンパク質を取得するステップ
を含む方法に関する。
1)タンパク質安定化剤:この賦形剤は、タンパク質の未変性高次構造を安定化する。例として、ポリオール、糖、アミノ酸、アミンおよび塩析塩が含まれる。ショ糖とトレハロースは最も頻繁に使用される糖であり、大型のポリオールは小型のポリオールより優れた安定化剤である。
2)高分子化合物とタンパク質:ポリエチレングリコール(PEG)などの親水性高分子化合物、多糖および不活性タンパク質が、タンパク質を非特異的に安定化するため、またタンパク質会合を促進するために使用される。例として、デキストラン、ヒドロキシルエチルデンプン(HETA)、PEG-4000およびゼラチンが含まれる。
3)界面活性剤:非イオン性界面活性剤は、タンパク質を安定化するため、凝集を抑制するため、またタンパク質の再折りたたみを支援するために広く利用される。ポリソルベート80およびポリソルベート20(それぞれツイーン80およびツイーン20としても知られる。)がmAb治療において一般に使用される。他の例には、ブリッジ35、トリトンX-100、プルロニックF127およびドデシル硫酸ナトリウム(SDS)が含まれる。
4)アミノ酸:この賦形剤は、さまざまな機序によりタンパク質を安定化する。例として、ヒスチジン、アルギニンおよびグリシンが含まれる。製剤の賦形剤として使用される他のアミノ酸には、メチオニン、プロリン、リジン、グルタミン酸およびアルギニン混合物が含まれる。
5)防腐剤:この化合物は、微生物増殖を防止するために製剤中に含有される。例として、ベンジルアルコール、m-クレゾールおよびフェノールが含まれる。
AGAは、位置365のアルギニンをコードする。
CGCは、位置366のアルギニンをコードする。
GACは、位置368のアスパラギン酸をコードする。
AAAは、位置369のリジンをコードする。
GAAは、位置373のグルタミン酸をコードする。
Advanced(改良)DMEM完全増殖培養液(500 mL)
1)50 mLのFBS(終濃度10%)を、500 mLフィルターユニットの上室に添加する。
2)10 mLの200 mMグルタミン(終濃度4 mM)を添加する。
3)5 mLの100×ペニシリン−ストレプトマイシン溶液(終濃度1×)を添加する。
4)改良DMEM培養液で、容量を500 mLに調整する。
5)完全培養液を0.22 μmのフィルターでろ過する。
6)上室を取り外し、容器または培養液瓶を閉じる。
7)培養液は、調整後30日以内に使用できる。
8)培養液は2℃〜8℃で貯蔵し、連続的な光暴露を避ける。
9)LCA選別培養液を調製する場合には、10 mLのストックLCA試薬(10 mg/mL)を500 mLの調製したDMEM培養液と混合し、DMEM培養液中でLCA終濃度200 μg/mLとする。
1)バイオ安全キャビネット
2)Sorvall ST 16R遠心分離機
3)水槽
4)倒立位相差顕微鏡
5)CO2インキュベーター
6)ミリポアGUAVA 8HT easyCyte卓上フローサイトメーター
7)Vi-cell XR細胞生存率アナライザー
8)血球計数器
9)冷蔵庫
10)エッペンドルフ・ミニスピン遠心分離機
11)マイクロピペット
12)マイクロチップ
13)96ウェル組織培養プレート
14)12ウェル組織培養プレート
15)6ウェル組織培養プレート
16)血清用ピペット(10 mL、25 mL及び50 mL)
17)1000 mLろ過ユニット(0.22 μmポアサイズ)
18)70%エタノール
19)改良DMEM
20)ダルベッコりん酸緩衝食塩液(DPBS)
21)ウシ胎児血清(FBS)
22)ペニシリン ストレプトマイシン(Penstrep)
23)グルタミン
24)0.05%トリプシンEDTA
25)0.4%トリパンブルー
26)マイクロチューブ(1.5 mLおよび2 mL)
27)ファルコンチューブ(15 mLおよび50 mL)
28)ウシ血清アルブミン フラクションV
29)フルオレセイン‐レンズマメ(Lens Culinaris)アグルチニン(LCA-FITC)
30)フルオレセイン‐ストレプトアビジン(Strep-FITC)
この実験の目的は、FUT8対立遺伝子の特異的不活性化のためのTALEN(転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ)を設計することである。
FUT8は、N末端コイルドコイルドメイン、触媒ドメイン及びC末端SH3ドメインの3種類のドメインを含む。FUT8の触媒ドメインC末端部分は、α-1,6-フコシルトランスフェラーゼ;α-1,2-フコシルトランスフェラーゼ;およびタンパク質O-フコシルトランスフェラーゼにおける3つの保存領域を持つロスマンフォールドを含む。さらに、部位特異的な突然変異誘発実験により、このフォールド中の3種類のフコシルトランスフェラーゼにすべて高度に保存される数個の残基は、FUT8の酵素活性に必須であることが示される。
TALEN構築物は、ゲノムDNA配列上のTALENの位置に基づき、左および右TALENと呼ばれる二量体形で機能する。2つのTALEN結合部位間の配列が、FokIエンドヌクレアーゼを用いて二重鎖切断を作成する標的であり、スペーサー配列と呼ばれる。各TALENは、20塩基対のDNA配列を認識し、結合するように設計される。左および右TALENは、逆鎖のDNA配列を標的とする。TALEN酵素は、TALE DNA結合ドメインおよび単量体FokIヌクレアーゼドメインを含む融合タンパク質として構築される。FokIヌクレアーゼは、二量体触媒ドメイン立体配置においてのみ機能する。左および右TALEN融合タンパク質が、約14〜20塩基対領域の間隔に結合すると、直ちに、FokI二量体化が起こる。
T-SEQ ID No.6
T-SEQ ID No.11
T-SEQ ID No.17
T-SEQ ID No.23
T-SEQ ID No.29
T-SEQ ID No.35
T-SEQ ID No.8
T-SEQ ID No.14
T-SEQ ID No.20
T-SEQ ID No.26
T-SEQ ID No.32
T-SEQ ID No.38
1.TALENの設計
2.プライマーの設計
3.オリゴヌクレオチドの合成
4.LB(Luria培地)+アンピシリンプレート上でのTALEN構築物(pcDNA3.1+TAL6_左およびpcDNA3.1+TAL6_右)の形質転換
5.アンピシリン含有LB培地への形質転換細胞(TALEN構築物)の播種
6.DH10BまたはDH5α細胞から、プラスミドDNAであるpcDNA3.1+TAL6_左およびpcDNA3.1+TAL6_右の単離
7.CHOK1細胞への遺伝子導入;LCAアッセイによるスクリーニングと選択
8.キアゲンDNeasy Blood & Tissueキットを用いた、選択したクローンのゲノムDNAの単離
9.分光光度法による定量
10.PCR条件の最適化
11.PCRによるゲノムDNAサンプルの照合確認
12.アガロースゲルによる電気泳動
13.Phusionポリメラーゼを用いるPCR増幅およびTaqポリメラーゼを用いるテーリング
14.キアゲンキットを用いるPCR産物のゲル溶出
15.pTZ57R/Tベクターを用いるTAクローニング
16.DH10BまたはDH5α細胞における連結サンプルpTZ57R/T+TAL(PCR)の形質転換
17.アンピシリン含有LB培地への形質転換細胞(pTZ57R/T+TAL(PCR))の播種
18.キアゲン・プラスミドDNA単離キットを用いたプラスミドDNA(pTZ57R/T+TAL(PCR))の単離
19.制限消化による挿入物の存在の照合確認(部位)
20.プライマーの配列決定;および、
21.配列決定によるINDEL(挿入欠失)の確認
NCBI参照配列:XM_003501735.1
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選択的エクソンは、大文字および小文字で表される。
Ser-469の位置のアミノ酸残基は、FUT8酵素の触媒ドメインにおいて重要な役割を果たしている。その結果、本発明において、アミノ酸位置Arg-365、Arg-366、Asp-368、Lys-369およびGlu-373でのINDEL(挿入/欠失)突然変異およびフレームシフト突然変異が、FUT8酵素機能を破壊するためにTALENを介して導入される。
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(TAL組み合わせ1:TALEN 1Lおよび1R)
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TGTGCTCTCCACTTCTCCCCAGAGTCCATGTCAGACGCACTGACAAAGTGGGAACAGAAGCAGCCTTCCATCC
構築物−pcDNA3.1-TALEN_L6は、本発明の図3に示される。
構築物−pcDNA3.1-TALEN_R6は、本発明の図4に示される。
合成TAL-L6は、合成オリゴヌクレオチドおよび/またはPCR産物から構築される。断片は、100%配列検証されたサブ断片を用いて、TALtrunc_FokIにクローン化される。得られたプラスミドDNAは形質転換細菌から精製され、紫外分光法により定量化される。最終構築物は、配列決定により確認される。
RVDのアミノ酸配列‐
(T)-HD-HD-NI-HD-NG-NG-HD-NG-HD-HD-HD-HD-NI-NN-NI-NN-NG-HD。これは、本発明のSEQ ID No. 6としても与えられる。
合成TAL-R6は、合成オリゴヌクレオチドおよび/またはPCR産物から構築される。断片は、100%配列検証されたサブ断片を用いて、TALtrunc_FokIにクローン化される。得られたプラスミドDNAは形質転換細菌から精製され、紫外分光法により定量化される。最終構築物は、配列決定により確認される。
RVDのアミノ酸配列:
(T)-NN-HD-NG-NG-HD-NG-NN-NG-NG-HD-HD-HD-NI-HD-NG-NG-NG-NN
構築物‐pcDNA3.1-TALEN_R6は、本発明の図4に示される。
この実施例は、TALEN構築物でのCHOK1細胞遺伝子導入の方法を含む。また、この実施例は、TALEN技術を用いるFUT8ノックアウトCHOK1細胞株の開発のための単細胞安定細胞株の選択と確認、およびフローサイトメトリーに基づく機能分析による陽性クローンの選択を提示する。
遺伝子導入は、接着型、浮遊型ともに、CHOK1細胞を用いて最適化される。リポソームおよび修飾リポソームを用いる遺伝子導入試薬、例えば、リポフェクタミン2000、リポフェクタミン3000、Plus(登録商標)試薬を伴うリポフェクタミンLTX、MIRUS TransIT×2、MIRUS TransIT 2020、MIRUS TransIT 293、MIRUS TransIT CHOK1遺伝子導入キットが試される。0.5 μg〜5 μgの濃度のDNAが、種々のインキュベーション時間、例えば、4時間、24時間および48時間で検査される。複数のDNAと遺伝子導入試薬の比率(μg:μL)も検査される。最適遺伝子導入効率は、1:5のDNAと遺伝子導入試薬の比率、24時間インキュベーションおよびPlus(登録商標)試薬を伴うリポフェクタミンLTXを用いて達成される。最適化実験は、プラスミドDNAを発現している赤色蛍光タンパク質(Red Fluorescence Protein(RFP))を用いて行われる。
遺伝子導入効率=(RFP発現細胞数/細胞の総数)×100
(2.1)遺伝子導入
CHOK1細胞を、6ウェル組織培養プレートに、90%を超える生存率および0.25×106細胞/ウェルの密度で接種し、4時間接着させる。pcDNA3.1-TALEN_L6およびpcDNA3.1-TALEN_R6構築物は、Plus(登録商標)試薬を伴うリポフェクタミンLTXを用いて遺伝子導入される。2.5 μgの各DNA構築物を、1:5のDNAと遺伝子導入試薬の比率で使用する。細胞は、遺伝子導入後20〜24時間培養する。遺伝子導入前に、DNAの量と質を紫外分光光度法により測定する。A260/280値DNAは、質とタンパク質混入を表す。260 nmおよび280 nmでの吸光度の比が、DNAの純度を評価するために用いられる。A260/280 >1.8であることが、一般に、純粋な、または高品質のDNAとして受け入れられる。3〜4 μLのDNAサンプルをミクロキュベットに入れ、エッペンドルフ・バイオフォトメーターD30を用い、適当なブランクに対してDNA濃度を見積もる。
これは、非フコシル化(afucosylated)膜タンパク質を用いる、クローンを選択する機能分析である。フコシル化は多くの細胞タンパク質に対する不可欠の生化学プロセスであり、これらの細胞タンパク質の多くは膜タンパク質である。レンズマメアグルチニン(LCA)は、すべてのフコシル化されたタンパク質に選択的に結合するレクチンである。
フルオレセインイソチオシアネート(FITC)は、LCAに結合される蛍光色素である。したがって、対照CHOK1細胞の細胞膜上のフコシル化されたタンパク質の存在は、フルオレセイン結合型LCAにより認識される。これらの細胞は、特定のフローサイトメーターチャネルでより明るく蛍光を発する。観察される蛍光は、相対蛍光単位(RFU)として表される。フコース経路が破壊された細胞である細胞株は、フコシル化された細胞タンパク質を産生することができないので、細胞膜タンパク質は非フコシル化されている。これらの細胞をフルオレセインLCA複合体で検査すると、背景と同等の蛍光という結果になる。したがって、フコースノックアウト細胞は、対照CHOK1細胞株と比較して、はるかに低いレベル(100 RFU未満)で蛍光を発する。
遺伝子導入したクローンのLCA選択の間において、第1日のクローンの写真は、本願明細書の図5に示され、第11日の写真は図6に示される。これらの写真より、次のクローン、TAL R4 #003、TAL R4 #013、TAL R4 #023およびTAL R4 #024が、200 μg/mLのLCA処理の後であっても、コロニー形態を維持するのが観察される。したがって、これらのクローンは、FUT 8ノックアウト表現型である可能性が考えられる。
LCA選択の第2セットは、25個のクローンに対して行う。1個のクローンだけは、LCA耐性コロニー形態のTAL-R4#111を示す。細胞形態は顕微鏡で観察され、観察結果は、第1、9及び11日に記録される。細胞は定期的に倒立位相差顕微鏡下で観察され、コロニー形態を検査する。これは、本願明細書の図9でも示される。
LCA-FITC結合アッセイの第2セットのため、次の選択された5個のクローン、TAL R4#003、TAL R4#013、TAL R4#023、TAL R4#024およびTAL R4#111が選別される。フルオレセイン‐レンズマメアグルチニン(LCA-FITC)保存液5 mg/mLを分析緩衝液(2%BSAを含むDPBS)で希釈し、終濃度2 μg/mLとする。細胞は、エッペンドルフ・ミニスピン遠心分離機を使用して、1500 rpmで5分間回転させる。培養液を吸引し、沈渣を、2 μg/mLのLCA-FITCを含む分析緩衝液0.25〜1 mLに再懸濁する。CHOK1対照細胞は、分析緩衝液単独(非染色対照)0.25〜1 mLおよび2 μg/mLのLCA-FITCを含む分析緩衝液(染色対照)0.25〜1 mLに再懸濁する。すべてのサンプルは最終的な分析緩衝液で希釈し、0.1〜0.2×106細胞/mLとする。次に、サンプルを、暗所、30分間、氷上でインキュベートする。その次に、各サンプルの200 μLを、96ウェルプレートに等分する。それから、プレートを、データ収集と分析のために、ミリポアGUAVA easyCyte 8HT卓上フローサイトメーターに載せる。データ分析は、Incyteソフトウェアを使用して行う。
TALEN 遺伝子導入されたCHOK1細胞の出現頻度を改良する、高い細胞数によるTALEN 遺伝子導入。
(3.1)遺伝子導入
CHOK1細胞を、6ウェル組織培養プレートに、90%を超える生存率および0.5×106細胞/ウェルの密度で接種し、4時間接着させる。pcDNA3.1-TALEN_L6およびpcDNA3.1-TALEN_R6構築物は、Plus(登録商標)試薬を伴うリポフェクタミンLTXを用いて遺伝子導入される。2.5 μgの各DNA構築物を、1:5のDNAと遺伝子導入試薬の比率で使用する。細胞は、遺伝子導入後20〜24時間培養する。遺伝子導入前に、DNAの量と質を紫外分光光度法により測定する。A260/280値DNAは、質とタンパク質混入を表す。260 nmおよび280 nmでの吸光度の比が、DNAの純度を評価するために用いられる。A260/280 >1.8であることが、一般に、純粋な、または高品質のDNAとして受け入れられる。3〜4 μLのDNAサンプルをミクロキュベットに入れ、エッペンドルフ・バイオフォトメーターD30を用い、適当なブランクに対してDNA濃度を見積もる。
クローンのLCA選択は、クローンTAL R5 #1〜115に対して200 μg/mLで開始する。次のクローン、TAL R5#007、TAL R5#009、TAL R5#010、TAL R5#016、TAL R5#032、TAL R5#045、TAL R5#047、TAL R5#052、TAL R5#064、TAL R5#066、TAL R5#067、TAL R5#095、TAL R5#099およびTAL R5#114は、LCA選択下で健康なコロニー形態を示した。細胞は、第11日まで定期的に顕微鏡下で観察する。これらのクローンは、それらのLCA耐性表現型のために選択される。細胞は、マスタープレート(レプリカプレート法)からトリプシン処理によって6ウェルプレートの2ウェルへと拡大され、5%CO2インキュベーター中で37℃、6〜7日間増殖させる。
別々のセットのLCA-FITC結合アッセイを、以下の14クローンを用いて行った:TAL R5#007、TAL R5#009、TAL R5#010、TAL R5#016、TAL R5#032、TAL R5#045、TAL R5#047、TAL R5#052、TAL R5#064、TAL R5#066、TAL R5#067、TAL R5#095、TAL R5#099およびTAL R5#114。フルオレセイン‐レンズマメアグルチニン(LCA-FITC)保存液5 mg/mLを分析緩衝液(2%BSAを含むDPBS)で希釈し、終濃度2 μg/mLとする。細胞は、エッペンドルフ・ミニスピン遠心分離機を使用して、1500 rpmで5分間回転させる。培養液を吸引し、沈渣を、2 μg/mLのLCA-FITCを含む分析緩衝液0.25〜1 mLに再懸濁する。CHOK1対照細胞は、分析緩衝液単独(非染色対照)0.25〜1 mLおよび2 μg/mLのLCA-FITCを含む分析緩衝液(染色対照)0.25〜1 mLに再懸濁する。すべてのサンプルは最終的な分析緩衝液で希釈し、0.1〜0.2×106細胞/mLとする。次に、サンプルを、暗所、30分間、氷上でインキュベートする。その次に、各サンプルの200 μLを、96ウェルプレートに等分する。それから、プレートを、データ収集と分析のために、ミリポアGUAVA easyCyte 8HT卓上フローサイトメーターに載せる。データ分析は、Incyteソフトウェアを使用して行う。
もう1セットの細胞株が、TAL R5 # 116〜TAL R5#209のクローンに対する200 μg/mLでのLCA選択に使用される。細胞形態パラメータが比較される場合、以下のクローンは健康に増殖していることが分かる:TAL R5#125、TAL R5#131、TAL R5#154、TAL R5#161、TAL R5#165、TAL R5#171、TAL R5#172およびTAL R5#176。細胞は、第11日まで定期的に顕微鏡下で観察する。これらのクローンは、それらのLCA耐性表現型のために選択される。細胞は、マスタープレート(レプリカプレート法)からトリプシン処理によって6ウェルプレートの2ウェルへと拡大され、5%CO2インキュベーター中で37℃、6〜7日間増殖させる。
次の8クローン:TAL R5#125、TAL R5#131、TAL R5#154、TAL R5#161、TAL R5#165、TAL R5#171、TAL R5#172およびTAL R5#176に対するLCA-FITC結合アッセイを実施する。
クローンのストレプトアビジン結合型FITC(Strep-FITC)染色は、FITC色素の非特異的結合がないことを保証するために行う。細胞膜タンパク質はストレプトアビジン‐FITC複合体に結合しないが、フコシル化膜タンパク質はLCA-FITC複合体に特異的に結合する。対照CHOK1細胞は、別々の反応でLCA-FITCおよびStrep-FITCで染色し、この特異性を確認する。すべてのクローンはストレプトアビジン‐FITCおよびLCA-FITC複合体で同様に染色し、非特異的結合を測定する。
選択されたクローンの増殖曲線の測定は、増殖特性が、ノックアウト細胞株開発のプロセス中において、野生型CHOK1細胞と比較して有意に変化しないことを保証するために行う。0.1×106個のCHOK1細胞を、6ウェル組織培養プレートに播種する。播種は、各クローンについて、5つの時点に対して行う。時点ごとに、3重に播種する(例えば、5つの時点に対して15ウェル)。細胞計数は、時点ごとに3重で行う。生細胞計数は、血球計数器またはVi-cell XR細胞生存アナライザーのいずれかを用いて行った。それぞれの増殖曲線は、エラーバーとしてSEMを用いて作り出される。表10は、FUT8ノックアウト細胞株のひとつであるTAL-R4#013からの代表的な増殖データを示す。
機能分析すなわちLCA-FITCフローサイトメトリーアッセイにより選択したTALEN遺伝子導入クローンを、ゲノム塩基配列決定アッセイに使用する。チャイニーズハムスターのFUT8ゲノム遺伝子座は文献(NW_003613860)に報告されており、各細胞株クローンにおける遺伝子組み換え型を理解する野生型配列として用いられる。本実施例の目的は、TALEN遺伝子導入CHOK1 FUT8ノックアウト細胞株から得られたゲノムDNA塩基配列決定結果を分析することである。ここで報告されるすべての細胞株はクローン細胞株であり、LCA培養液選択アッセイおよびLCA-FITCフローサイトメトリーアッセイから選択される。
全ゲノム塩基配列決定手順は、以下の4つのプロセスに分けられる。
A)選択したクローンからのゲノムDNA単離
B)各細胞株について特異的ゲノム遺伝子座を増幅するためのPCR戦略
C)配列決定ベクターにおけるPCR産物のクローニング
D)配列データ解析とINDELの同定
クローンCHOK1細胞株は、10%ウシ胎児血清、4 mMグルタミン、100ユニット/mLペニシリンおよび100 μg/mLストレプトマイシンを含む改良DMEM培養液を用い、制御されたインキュベーター中でT175フラスコ中、37℃、5%CO2および75%相対湿度の存在下で増殖させる。細胞増殖は毎日観察し、生存率を監視する。細胞は、80%の培養密度と95%を超える生存率のときに、トリプシン処理により回収する。単離する日に培養液を除去し、トリプシン処理のために先ず接着細胞を10 mLのDPBSで洗浄し、次に4 mLの0.05%トリプシンEDTA溶液を添加する。細胞は37℃で2〜3分間インキュベートし、回収する。次に、細胞を10 mLのDPBSと混合し、1500 rpmで5分間遠心分離する。使用済みの培養液を除去し、細胞ペレットを10 mLのDPBS中に再懸濁する。細胞は、1500 rpmで5分間の遠心分離により再洗浄する。DPBSは吸引により完全に除去する。最終的な細胞ペレットは、ゲノムDNA単離に用いられる。
チャイニーズハムスターのゲノムDNA塩基配列は、一般公開されているデータベース配列NW_003613860から分析される。エクソン9および10のDNA塩基配列ならびに部分的イントロン塩基配列(配列ID No. 40)が、FUT8標的遺伝子座を増幅するためのPCR戦略の設計に使用される。プライマーは、プライマー長、PCR産物長、GC含量、融解温度ならびにホモ二本鎖およびヘテロ二本鎖形成の可能性に基づいて設計される。プライマーは、以下に提供されるFUT8標的遺伝子座に隣接して設計される。増幅されたPCR産物は、TALEN介在性DSBとそれに続くDNA修復に起因する突然変異の解析を目的とする。以下のヌクレオチド配列は、プライマー配列を持つ対象領域を太文字で表している。
gacctgtactattcaacattcagctatgttaaagtatttgtgaagtgttttgaaatgattttatattttctaaggtgagaataaatgagaaaatgttttaatatgtctccagtgcccccatgactagggatactaattgagtaccagtacattatcagtgtgctctccacttctccccagAGTCCATGTCAGACGCACTGACAAAGTGGGAACAGAAGCAGCCTTCCATCCCATTGAGGAATACATGGTACACGTTGAAGAACATTTTCAGCTTCTCGAACGCAGAATGAAAGTGGATAAAAAAAGAGTGTATCTGGCCACTGATGACCCTTCTTTGTTAAAGGAGGCAAAGACAAAgtaagttagaccaacaagtggttctgtatgggattatctc
Exon 9 is represented from base 181 to base 357 in upper case letters. The primer binding sites of Left and Right are underlined.
エキソン9は、ベース181から大文字で357の基礎を形成すると述べられる。左翼のプライマー結合部位、そして、ちょうど下線を引く。
ゲノムPCRは、表11に記載の以下のプライマーを用い、キアゲン ゲノムDNA単離キットを使用して実行される。
実験は、PCR条件を標準化するように設計される。試されるパラメータには、ゲノムDNA濃度(100 ng〜1000ng)、プライマー濃度(2 nmole〜20 nmole)、PCRアニーリング温度(55.8℃〜62.9℃)および時間(20秒〜50秒)、PCR産物伸張時間(30秒〜60秒)が含まれ、PCRサイクル数は30サイクルに設定される。到達した最適化条件は以下のセクションに記載される。PCR反応は、PCR介在性突然変異が制限されることを確実にするため、プルーフリーディングポリメラーゼであるPhusionポリメラーゼを用いて実施される。PCR増幅サイクル後に、テーリングのためにTaqポリメラーゼ酵素が混合物の中に添加される。テーリングステップは、PCR産物に付け足される追加の塩基が、次のセクションで記載される配列決定ベクターにおける直接クローニングを可能にするので重要である。TAクローニングベクターにおけるクローニングのためにPCR産物にdATPオーバーハングを付け足す目的で、Phusionポリメラーゼ増幅産物は、Taq DNAポリメラーゼとともに72℃で15分間インキュベートされる。
ゲノムDNAのPCR産物はアガロースゲル電気泳動法で分析され、PCR産物長は分子量標準を用いて確認される。明確な増幅特性を持つPCRサンプルは、次の処理ステップに用いられる。
増幅されたPCR産物は新たに調製された1%アガロースに添加し、100Vで1時間の電気泳動にかけ、使われないプライマーや増幅過程で生成したその他の二量体から増幅PCR産物を分離する。増幅産物はゲルから切除し、市販のキアゲン・ゲル溶出キットを用いて溶出させる。DNAは、高純度分子生物グレード水により溶出させる。
次に、アガロースゲルで精製されたPCR増幅産物は、DNA連結プロセスによって市販のpTZ57R/Tベクターでクローニングするために使用する。DNA連結の条件は、予め標準化されている。
連結されたDNAは、市販のE. coli DH10Bコンピテント細胞で形質転換させる。高レベルの形質転換効率を達成するために、製造業者により解説される形質転換手順が続いて行われる。形質転換後、E. coli細胞は、形質転換コロニーの増殖のためアンピシリン抗生物質の存在下で増殖させる。
分離された各コロニーを、5 mLの培養液量のLB+アンピシリン培地に接種し、プラスミドDNA単離のために一晩増殖させる。
一晩増殖させた培養物4.5 mLを、市販のキアゲン・プラスミドDNA単離キットを用い、製造業者の手順に従ったプラスミドDNA単離に用いた。プラスミドDNAは、高純度分子生物グレード水により溶出させる。
各プラスミド調製物は、適切な制限酵素消化を用いて挿入物の存在を検査され、アガロース電気泳動が続く。挿入物のサイズは、適切な分子量標準と比較される。
(配列決定)確認されたプラスミドは、次に、pTZ57R/Tベクター骨格に存在する特異的塩基配列決定プライマーで配列決定される。配列データは、適切な手順に従って自動化DNA塩基配列決定装置で作成される。塩基配列決定は、正確な配列情報を確実にするため、順方向プライマーと逆方向プライマーを用いて行われる。
すべてのプラスミドからのDNA塩基配列決定データが解析される。CHOK1対照細胞株および種々のTALEN介在性FUT8ノックアウトCHOK1クローン細胞株に由来するプラスミドDNAからのDNA塩基配列が比較され、DNA塩基配列の差異が特定される。各CHOK1細胞株クローンからPCR産物が作成され、E. coliでクローン化される。複数のE. coliクローンが、標的ゲノム遺伝子座でのヌクレオチド配列変更を確認するため配列決定される。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、DNA増幅に対して強力で、感度が高い技術である。PCRは、3ステッププロセスの複数のサイクルを用いることにより、指数的に特異的DNA配列を増幅する。最初に、二本鎖DNA鋳型は、94℃の高温で変性される。次に、表11に挙げられる配列特異的プライマーを、標的配列に隣接する部位にアニール(60.4℃)させる。耐熱性DNAポリメラーゼ(Phusionポリメラーゼ)はアニールされたプライマーを伸長させ、それによって、最初のDNA配列の量を2倍にする。その次に、この新しく合成された産物は、以降の増幅サイクルの追加的な鋳型になる。この3つのステップは30サイクル繰り返され、目的DNA濃度が109倍増加する結果となる。TAクローニングベクターにおけるクローニングのためにPCR産物にdATPオーバーハングを付け足す目的で、PCR Phusionポリメラーゼ増幅産物は、Taq DNAポリメラーゼとともに72℃で15分間インキュベートされる。
PCR増幅されゲル溶出された産物は、市販のpTZ57R/Tベクターで連結される。連結手順は以下に記載される。
上記の連結混合液は4℃で一晩インキュベートし、連結混合液の50%が、熱ショック法によってDH5αまたはDH10B E. coliコンピテント細胞に形質転換される。
細菌細胞を形質転換する目的は、プラスミドDNAをクローン化し、増殖させることである。コンピテントE. coli細胞(DH5αまたはDH10B)の一定分量20 μLを、−80℃冷凍庫から取り出し、氷上で5分間解凍する。50%の連結サンプル(pTZ57R/T+TAL(PCR))をコンピテント細胞に添加し、穏やかに撹拌して、氷上で20分間インキュベートする。混合物を含むチューブを水槽/空気槽に42℃で50秒間置く。チューブは、氷上に2分間置き戻す。37℃に温めたLB培地(アンピシリン抗生物質不含)0.950 mLを、振盪機で37℃、220 rpmで1時間インキュベートした。得られた培養物の100 μLを、温められたLB+アンピシリン培養プレートに広げる。プレートは、37℃インキュベーターで一晩インキュベートする。
この手順の目的は、次の実験に使用する特異的DNAプラスミドを含む細菌を増殖/培養することである。LB+アンピシリン培地の5 mLを加圧滅菌されたチューブに加え、単離された細菌コロニーを、培養プレートからLB培地+アンピシリン培養チューブに接種する。チューブは、37℃、220 rpmで一晩インキュベートする(細菌の増殖によって約16〜18時間)。一晩培養した4.5 mLを、13 rpmで1分間遠心分離する。プラスミドDNAは、市販のキアゲン・プラスミド単離キットを用いて単離する。プラスミドDNAは高純度分子生物グレード水で溶出し、さらに使用するまで−20℃冷凍庫で保存する。
PCR増幅断片の場合、このように単離されたプラスミドDNAは、挿入の存在を検査される。pTZ57R/Tベクターは、クローン化されたPCR産物に隣接する複数の制限酵素部位を含む。制限酵素部位のEcoRIとHindIIIは、下表に示されるように、制限消化に対してCHOK1senである。反応は、プラスミドDNAを完全に消化するため、37℃で2時間行われる。制限消化後、混合物は、1%アガロースゲルで1時間電気泳動にかけられる。PCR産物挿入物は、もし存在すれば、pTZ57R/Tベクター骨格と分離し、確立された細菌クローンがDNA塩基配列決定に用いられる。
選択された細菌プラスミドDNAのDNA塩基配列決定は、pTZ57R/Tベクター骨格に位置する上流および下流の塩基配列決定プライマーを用いて実行される。塩基配列決定データは両方のプライマーを用いて集められ、正確なDNA配列情報のために分析される。複数の細菌プラスミドは、TALEN 構築物により得られたCHOK1対照細胞およびクローンCHOK1 FUT8ノックアウト細胞株に関して、FUT8標的遺伝子座での複合DNA配列情報を作成するために配列決定される。
CHOK1対照細胞株(野生型)− エクソン9の配列は大文字である。イントロン配列は小文字であり、下線が引かれている。
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TAL R4 #013a -
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TAL R4 #013b -
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TAL R4 #023a -
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TAL R4 # 024b -
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TAL R4 #111b -
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TAL R5 #007 a -
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TAL R5 #047 a -
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TAL R5#095 b -
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CHOK1対照細胞株およびCHOK1 FUT8ノックアウト細胞株のFUT8ゲノムDNA配列は、DNA配列INDEL がFUT8タンパク質状態に与える影響を理解するため、さらに分析される。標的となったFUT8遺伝子座でのDNA配列は、脊椎動物のコドンバイアスを用いてアミノ酸配列に翻訳される。エクソン9領域のアミノ酸配列は詳しく研究され、結果は図12にまとめられる。CHOK1対照細胞株と比較する場合、FUT8ノックアウト細胞株では、小さくは3個のアミノ酸(TAL -R4 # 111)から大きくは10個のアミノ酸(TAL R4 #003)までが、FUT8ノックアウト細胞株において取り除かれる欠失を含む改変が示される。
実施例7
フコースノックアウトCHOK1細胞発現プラットフォームは、非フコシル化抗体、特に非フコシル化モノクローナル抗体の発現のために用いられる。モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする抗体遺伝子は、適切な遺伝子発現プラスミドでクローン化され、上述の実施例で記載されたフコースノックアウトCHOK1細胞プラットフォームに遺伝子導入される。このプラットフォーム/方法を用いて産生されるモノクローナル抗体は、非フコシル化抗体として発現される。産生物は、治療用途のためのバイオ後続薬モノクローナル抗体産生物を開発するための確立された手順およびガイドラインに従って精製される。このプラットフォームを使用して産生された非フコシル化バイオ後続薬抗体は、高レベルのADCCをもたらし、その結果、優れた治療結果が得られる。
Claims (33)
- 転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼタンパク質のDNA結合ドメインであって、該DNA結合ドメインが、SEQ ID No. 6、SEQ ID No.8、SEQ ID No. 11、SEQ ID No.14、SEQ ID No. 17、SEQ ID No.20、SEQ ID No. 23、SEQ ID No.26、SEQ ID No. 29、SEQ ID No.32、SEQ ID No. 35、SEQ ID No.38およびこれらの組み合わせから成る群より選ばれるアミノ酸配列を含むDNA結合ドメイン。
- SEQ ID No. 6が、Fut8遺伝子配列のSEQ ID No. 4に結合する、請求項1に記載のDNA結合ドメイン。
- SEQ ID No.8が、Fut8遺伝子配列のSEQ ID No. 5に結合する、請求項1に記載のDNA結合ドメイン。
- SEQ ID No. 11が、Fut8遺伝子配列のSEQ ID No. 10に結合する、請求項1に記載のDNA結合ドメイン。
- SEQ ID No.14が、Fut8遺伝子配列のSEQ ID No. 13に結合する、請求項1に記載のDNA結合ドメイン。
- SEQ ID No. 17が、Fut8遺伝子配列のSEQ ID No. 16に結合する、請求項1に記載のDNA結合ドメイン。
- SEQ ID No.20が、Fut8遺伝子配列のSEQ ID No. 19に結合する、請求項1に記載のDNA結合ドメイン。
- SEQ ID No. 23が、Fut8遺伝子配列のSEQ ID No. 22に結合する、請求項1に記載のDNA結合ドメイン。
- SEQ ID No.26が、Fut8遺伝子配列のSEQ ID No. 25に結合する、請求項1に記載のDNA結合ドメイン。
- SEQ ID No. 29が、Fut8遺伝子配列のSEQ ID No. 28に結合する、請求項1に記載のDNA結合ドメイン。
- SEQ ID No.32が、Fut8遺伝子配列のSEQ ID No. 31に結合する、請求項1に記載のDNA結合ドメイン。
- SEQ ID No.35が、Fut8遺伝子配列のSEQ ID No. 34に結合する、請求項1に記載のDNA結合ドメイン。
- SEQ ID No.38が、Fut8遺伝子配列のSEQ ID No. 37に結合する、請求項1に記載のDNA結合ドメイン。
- 請求項1に記載のDNA結合ドメインをコードするポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが、SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 12、SEQ ID No. 15、SEQ ID No. 18、SEQ ID No. 21、SEQ ID No. 24、SEQ ID No. 27、SEQ ID No. 30、SEQ ID No. 33、SEQ ID No. 36、SEQ ID No. 39およびこれらの組み合わせから成る群より選ばれるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
- 請求項1に記載のDNA結合ドメインおよびヌクレアーゼを含む、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼタンパク質。
- ヌクレアーゼがFok1エンドヌクレアーゼである、請求項15に記載の転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼタンパク質。
- 請求項14に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項17に記載のベクターを含む細胞。
- 細胞が哺乳類細胞である、請求項18に記載の細胞。
- フコシル化活性を持たない細胞を取得する方法であって、該方法が:
a)転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ構築物を取得するステップ;および、
b)ステップa)の構築物を細胞に遺伝子導入し、フコシル化活性を持たない細胞を取得するステップ
を含む方法。 - 非フコシル化タンパク質を取得する方法であって、該方法が:
a)転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ構築物を取得するステップ;
b)ステップa)の構築物を細胞に遺伝子導入し、フコシル化活性を持たない細胞を取得するステップ;および、
c)ステップb)の細胞により発現された非フコシル化タンパク質を取得するステップ
を含む方法。 - 非フコシル化タンパク質が、非フコシル化抗体である、請求項21に記載の方法。
- 非フコシル化抗体が、非フコシル化モノクローナル抗体である、請求項22に記載の方法。
- 転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼが、請求項15に記載のヌクレアーゼタンパク質であり;このヌクレアーゼタンパク質が、Fut8遺伝子配列を切断する、請求項20または21に記載の方法。
- α-1,6-フコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするFut8遺伝子配列が、エクソン9で切断される、請求項24に記載の方法。
- フコシルトランスフェラーゼ酵素が、Arg-365、Arg-366、Asp-368、Lys-369、Glu-373、Tyr-382、Asp-409、Asp-410、Asp-453、Ser-469およびこれらの組み合わせから成る群より選ばれるアミノ酸位置で突然変異する、請求項25に記載の方法。
- 細胞が哺乳類細胞である、請求項20または21に記載の方法。
- 細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項27に記載の方法。
- 細胞が内在性の非フコシル化タンパク質を産生する、請求項21に記載の方法。
- さらに、タンパク質をコードする遺伝子を細胞に導入し、非フコシル化タンパク質を取得するステップを含む、請求項21に記載の方法。
- 請求項21に記載の方法により取得された非フコシル化タンパク質。
- タンパク質が非フコシル化抗体である、請求項31に記載の非フコシル化タンパク質。
- 請求項31に記載の非フコシル化タンパク質を、任意に薬学的に許容される賦形剤とともに含有する組成物。
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