JP2015516162A - 導入遺伝子のヌクレアーゼ媒介標的化組み込みのための方法および組成物 - Google Patents
導入遺伝子のヌクレアーゼ媒介標的化組み込みのための方法および組成物 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2015516162A JP2015516162A JP2015511632A JP2015511632A JP2015516162A JP 2015516162 A JP2015516162 A JP 2015516162A JP 2015511632 A JP2015511632 A JP 2015511632A JP 2015511632 A JP2015511632 A JP 2015511632A JP 2015516162 A JP2015516162 A JP 2015516162A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- donor
- dna
- sequence
- gene
- cleavage
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 title claims abstract description 156
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 114
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 title claims description 134
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title abstract description 39
- 230000010354 integration Effects 0.000 title description 119
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 title description 75
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims abstract description 84
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 65
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 65
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 65
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 40
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 236
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 130
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 79
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 79
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 68
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 68
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 24
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 24
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims description 21
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 20
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 17
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 claims description 11
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 claims description 5
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 abstract description 52
- 230000037431 insertion Effects 0.000 abstract description 52
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 225
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 209
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 209
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 208
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 195
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 138
- 101710103719 Acetolactate synthase large subunit Proteins 0.000 description 121
- 101710182467 Acetolactate synthase large subunit IlvB1 Proteins 0.000 description 121
- 101710171176 Acetolactate synthase large subunit IlvG Proteins 0.000 description 121
- 101710176702 Acetolactate synthase small subunit Proteins 0.000 description 121
- 101710095712 Acetolactate synthase, mitochondrial Proteins 0.000 description 121
- 101710196435 Probable acetolactate synthase large subunit Proteins 0.000 description 121
- 101710181764 Probable acetolactate synthase small subunit Proteins 0.000 description 121
- 101710104000 Putative acetolactate synthase small subunit Proteins 0.000 description 121
- 101710147947 Acetolactate synthase small subunit 1, chloroplastic Proteins 0.000 description 120
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 109
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 88
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 87
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 79
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 75
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 74
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 65
- 102100027328 2-hydroxyacyl-CoA lyase 2 Human genes 0.000 description 63
- 101001000998 Homo sapiens Protein phosphatase 1 regulatory subunit 12C Proteins 0.000 description 58
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 57
- 102100035620 Protein phosphatase 1 regulatory subunit 12C Human genes 0.000 description 56
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 56
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 54
- 102000005396 glutamine synthetase Human genes 0.000 description 52
- 108020002326 glutamine synthetase Proteins 0.000 description 52
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 51
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 48
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 48
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 44
- 102100021266 Alpha-(1,6)-fucosyltransferase Human genes 0.000 description 38
- 101000819490 Homo sapiens Alpha-(1,6)-fucosyltransferase Proteins 0.000 description 35
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 35
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 35
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 35
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 35
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 35
- 238000013461 design Methods 0.000 description 34
- 101710185494 Zinc finger protein Proteins 0.000 description 33
- 102100023597 Zinc finger protein 816 Human genes 0.000 description 33
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 32
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 31
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 31
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 31
- 230000006780 non-homologous end joining Effects 0.000 description 30
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 30
- NUPJIGQFXCQJBK-UHFFFAOYSA-N 2-(4-isopropyl-4-methyl-5-oxo-4,5-dihydro-1H-imidazol-2-yl)-5-(methoxymethyl)nicotinic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(COC)=CN=C1C1=NC(C)(C(C)C)C(=O)N1 NUPJIGQFXCQJBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 239000005566 Imazamox Substances 0.000 description 27
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 27
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 26
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 25
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 24
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 24
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 23
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 23
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 23
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 23
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 22
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 22
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 22
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 22
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 22
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 21
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 21
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 21
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 21
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 20
- 239000000047 product Substances 0.000 description 20
- 108091079001 CRISPR RNA Proteins 0.000 description 19
- 241000287937 Colinus Species 0.000 description 19
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 19
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 19
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 19
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 18
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 18
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 17
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 17
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 17
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 17
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 17
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 17
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 17
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 16
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 16
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 16
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 16
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 16
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 16
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 15
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 15
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 15
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 15
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 15
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 15
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 15
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 15
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 14
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 14
- 102100035875 C-C chemokine receptor type 5 Human genes 0.000 description 13
- 101710149870 C-C chemokine receptor type 5 Proteins 0.000 description 13
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 13
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 13
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 13
- 239000000463 material Substances 0.000 description 13
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 12
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 12
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 12
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 12
- 230000006870 function Effects 0.000 description 12
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 12
- 230000008569 process Effects 0.000 description 12
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 11
- 108010073062 Transcription Activator-Like Effectors Proteins 0.000 description 11
- 230000034431 double-strand break repair via homologous recombination Effects 0.000 description 11
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 11
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 11
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 11
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 11
- -1 polymerase Proteins 0.000 description 11
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 10
- 108091028113 Trans-activating crRNA Proteins 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 10
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 10
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 10
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 10
- 230000004044 response Effects 0.000 description 10
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical group [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 10
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 10
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108091008109 Pseudogenes Proteins 0.000 description 9
- 102000057361 Pseudogenes Human genes 0.000 description 9
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 9
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 9
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 9
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 9
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 8
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 8
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 8
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 8
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 8
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 8
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 8
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 8
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 8
- 230000000408 embryogenic effect Effects 0.000 description 8
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 8
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 8
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 8
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 8
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 8
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 8
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 7
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 7
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 7
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 7
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 7
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 7
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 7
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 7
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 6
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 6
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 6
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 6
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 6
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 6
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 6
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 6
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 6
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 6
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 6
- 238000013515 script Methods 0.000 description 6
- 230000003007 single stranded DNA break Effects 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 6
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 6
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 6
- CAAMSDWKXXPUJR-UHFFFAOYSA-N 3,5-dihydro-4H-imidazol-4-one Chemical class O=C1CNC=N1 CAAMSDWKXXPUJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108700020911 DNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 5
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 5
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 5
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 5
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 5
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 5
- 235000007244 Zea mays Nutrition 0.000 description 5
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 5
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 5
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 5
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 5
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 5
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 5
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 5
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 5
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 5
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 5
- 108010020183 3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase Proteins 0.000 description 4
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 description 4
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 4
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 4
- IMQLKJBTEOYOSI-GPIVLXJGSA-N Inositol-hexakisphosphate Chemical compound OP(O)(=O)O[C@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H]1OP(O)(O)=O IMQLKJBTEOYOSI-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 4
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 4
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 4
- 241000589634 Xanthomonas Species 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 4
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 4
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 4
- 101150095418 crop gene Proteins 0.000 description 4
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 4
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 4
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 4
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 4
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 4
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000002949 phytic acid Nutrition 0.000 description 4
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 4
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SXERGJJQSKIUIC-UHFFFAOYSA-N 2-Phenoxypropionic acid Chemical compound OC(=O)C(C)OC1=CC=CC=C1 SXERGJJQSKIUIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-[hydroxy(methyl)phosphoryl]butanoic acid Chemical compound CP(O)(=O)CCC(N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710146120 Alpha-(1,6)-fucosyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 3
- 208000037088 Chromosome Breakage Diseases 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 3
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 3
- 101710096438 DNA-binding protein Proteins 0.000 description 3
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 description 3
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 description 3
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 3
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 3
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 3
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 3
- 208000002678 Mucopolysaccharidoses Diseases 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 3
- 108010047956 Nucleosomes Proteins 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 3
- 102100029856 Steroidogenic factor 1 Human genes 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 3
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 3
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 3
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 3
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 3
- 101150037081 aroA gene Proteins 0.000 description 3
- JFDZBHWFFUWGJE-UHFFFAOYSA-N benzonitrile Chemical compound N#CC1=CC=CC=C1 JFDZBHWFFUWGJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 3
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 3
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 3
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 3
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 3
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 3
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 3
- 206010028093 mucopolysaccharidosis Diseases 0.000 description 3
- 210000001623 nucleosome Anatomy 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 3
- 230000003032 phytopathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 3
- 230000037039 plant physiology Effects 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 238000012552 review Methods 0.000 description 3
- 239000012882 rooting medium Substances 0.000 description 3
- YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N salicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1O YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000007056 sickle cell anemia Diseases 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- 239000005631 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Substances 0.000 description 2
- QUTYKIXIUDQOLK-PRJMDXOYSA-N 5-O-(1-carboxyvinyl)-3-phosphoshikimic acid Chemical compound O[C@H]1[C@H](OC(=C)C(O)=O)CC(C(O)=O)=C[C@H]1OP(O)(O)=O QUTYKIXIUDQOLK-PRJMDXOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 2
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 2
- 102100022548 Beta-hexosaminidase subunit alpha Human genes 0.000 description 2
- 101150017501 CCR5 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000000584 Calmodulin Human genes 0.000 description 2
- 108010041952 Calmodulin Proteins 0.000 description 2
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 2
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 2
- 108010022172 Chitinases Proteins 0.000 description 2
- 102000012286 Chitinases Human genes 0.000 description 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- 230000008265 DNA repair mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 101100364969 Dictyostelium discoideum scai gene Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000889905 Enterobacteria phage RB3 Intron-associated endonuclease 3 Proteins 0.000 description 2
- 101000889904 Enterobacteria phage T4 Defective intron-associated endonuclease 3 Proteins 0.000 description 2
- 101000889900 Enterobacteria phage T4 Intron-associated endonuclease 1 Proteins 0.000 description 2
- 108091060211 Expressed sequence tag Proteins 0.000 description 2
- 208000015872 Gaucher disease Diseases 0.000 description 2
- 239000005561 Glufosinate Substances 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 description 2
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 2
- 101000687346 Homo sapiens PR domain zinc finger protein 2 Proteins 0.000 description 2
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 2
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 2
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 2
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 2
- 102000006830 Luminescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010047357 Luminescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 2
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 2
- 206010056886 Mucopolysaccharidosis I Diseases 0.000 description 2
- 241000714177 Murine leukemia virus Species 0.000 description 2
- 101100364971 Mus musculus Scai gene Proteins 0.000 description 2
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 2
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 2
- 108010033272 Nitrilase Proteins 0.000 description 2
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 description 2
- 102100024885 PR domain zinc finger protein 2 Human genes 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 2
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 2
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 2
- 108010059820 Polygalacturonase Proteins 0.000 description 2
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- 101100087805 Ralstonia solanacearum rip19 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 2
- 101000757182 Saccharomyces cerevisiae Glucoamylase S2 Proteins 0.000 description 2
- 241000235343 Saccharomycetales Species 0.000 description 2
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 2
- 241000713311 Simian immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 2
- 241000187191 Streptomyces viridochromogenes Species 0.000 description 2
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 description 2
- 208000022292 Tay-Sachs disease Diseases 0.000 description 2
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 2
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 description 2
- 208000026487 Triploidy Diseases 0.000 description 2
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 2
- 206010068348 X-linked lymphoproliferative syndrome Diseases 0.000 description 2
- 108020002494 acetyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 102000005421 acetyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 201000006288 alpha thalassemia Diseases 0.000 description 2
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 239000003392 amylase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 208000005980 beta thalassemia Diseases 0.000 description 2
- 210000003445 biliary tract Anatomy 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 101150049515 bla gene Proteins 0.000 description 2
- 239000007844 bleaching agent Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 2
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 2
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 2
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 101150023212 fut8 gene Proteins 0.000 description 2
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 2
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 2
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 108010072285 growth inhibitory proteins Proteins 0.000 description 2
- 210000002767 hepatic artery Anatomy 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 2
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 239000012212 insulator Substances 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 229930014550 juvenile hormone Natural products 0.000 description 2
- 239000002949 juvenile hormone Substances 0.000 description 2
- 150000003633 juvenile hormone derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 2
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 2
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 2
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 2
- 238000011017 operating method Methods 0.000 description 2
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 2
- 108010082527 phosphinothricin N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 2
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 2
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 230000029279 positive regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 2
- 102000021127 protein binding proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091011138 protein binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 2
- 101150075980 psbA gene Proteins 0.000 description 2
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 2
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 2
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 230000005783 single-strand break Effects 0.000 description 2
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- 238000010396 two-hybrid screening Methods 0.000 description 2
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 2
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 2
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 2
- OPCHFPHZPIURNA-MFERNQICSA-N (2s)-2,5-bis(3-aminopropylamino)-n-[2-(dioctadecylamino)acetyl]pentanamide Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCN(CC(=O)NC(=O)[C@H](CCCNCCCN)NCCCN)CCCCCCCCCCCCCCCCCC OPCHFPHZPIURNA-MFERNQICSA-N 0.000 description 1
- GUAHPAJOXVYFON-ZETCQYMHSA-N (8S)-8-amino-7-oxononanoic acid zwitterion Chemical compound C[C@H](N)C(=O)CCCCCC(O)=O GUAHPAJOXVYFON-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- FYADHXFMURLYQI-UHFFFAOYSA-N 1,2,4-triazine Chemical compound C1=CN=NC=N1 FYADHXFMURLYQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NEAQRZUHTPSBBM-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-3,3-dimethyl-7-nitro-4h-isoquinolin-1-one Chemical class C1=C([N+]([O-])=O)C=C2C(=O)N(O)C(C)(C)CC2=C1 NEAQRZUHTPSBBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 108010011619 6-Phytase Proteins 0.000 description 1
- GSDSWSVVBLHKDQ-UHFFFAOYSA-N 9-fluoro-3-methyl-10-(4-methylpiperazin-1-yl)-7-oxo-2,3-dihydro-7H-[1,4]oxazino[2,3,4-ij]quinoline-6-carboxylic acid Chemical compound FC1=CC(C(C(C(O)=O)=C2)=O)=C3N2C(C)COC3=C1N1CCN(C)CC1 GSDSWSVVBLHKDQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005730 ADP ribosylation Effects 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 102100024643 ATP-binding cassette sub-family D member 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010013043 Acetylesterase Proteins 0.000 description 1
- 101710159080 Aconitate hydratase A Proteins 0.000 description 1
- 101710159078 Aconitate hydratase B Proteins 0.000 description 1
- 101710197633 Actin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 241001655883 Adeno-associated virus - 1 Species 0.000 description 1
- 241000702423 Adeno-associated virus - 2 Species 0.000 description 1
- 241000202702 Adeno-associated virus - 3 Species 0.000 description 1
- 241000580270 Adeno-associated virus - 4 Species 0.000 description 1
- 241001634120 Adeno-associated virus - 5 Species 0.000 description 1
- 241000972680 Adeno-associated virus - 6 Species 0.000 description 1
- 241001164823 Adeno-associated virus - 7 Species 0.000 description 1
- 241001164825 Adeno-associated virus - 8 Species 0.000 description 1
- 201000011452 Adrenoleukodystrophy Diseases 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 101710171801 Alpha-amylase inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 102000044503 Antimicrobial Peptides Human genes 0.000 description 1
- 108700042778 Antimicrobial Peptides Proteins 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 1
- 101100478623 Arabidopsis thaliana S-ACP-DES1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100438066 Arabidopsis thaliana ZFN3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 1
- 201000006058 Arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy Diseases 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 206010003591 Ataxia Diseases 0.000 description 1
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 1
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 1
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 1
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 description 1
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- 208000019838 Blood disease Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000219198 Brassica Species 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000022526 Canavan disease Diseases 0.000 description 1
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000020313 Cell-Penetrating Peptides Human genes 0.000 description 1
- 108010051109 Cell-Penetrating Peptides Proteins 0.000 description 1
- 108091092236 Chimeric RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000195585 Chlamydomonas Species 0.000 description 1
- 101100148125 Chlamydomonas reinhardtii RSP2 gene Proteins 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000755729 Clivia Species 0.000 description 1
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 1
- 208000006992 Color Vision Defects Diseases 0.000 description 1
- 206010010099 Combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010053138 Congenital aplastic anaemia Diseases 0.000 description 1
- 102000012437 Copper-Transporting ATPases Human genes 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 101710095468 Cyclase Proteins 0.000 description 1
- 206010011732 Cyst Diseases 0.000 description 1
- 102100028007 Cystatin-SA Human genes 0.000 description 1
- 101710144510 Cysteine proteinase inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 230000007035 DNA breakage Effects 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 1
- 101710173731 Diuretic hormone receptor Proteins 0.000 description 1
- 206010058314 Dysplasia Diseases 0.000 description 1
- 101000889899 Enterobacteria phage T4 Intron-associated endonuclease 2 Proteins 0.000 description 1
- 101800001467 Envelope glycoprotein E2 Proteins 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 1
- 235000004692 Eucalyptus globulus Nutrition 0.000 description 1
- 240000007002 Eucalyptus tereticornis Species 0.000 description 1
- 235000019134 Eucalyptus tereticornis Nutrition 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 208000024720 Fabry Disease Diseases 0.000 description 1
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 201000004939 Fanconi anemia Diseases 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 241000724791 Filamentous phage Species 0.000 description 1
- 208000001914 Fragile X syndrome Diseases 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 230000010337 G2 phase Effects 0.000 description 1
- 101150062467 GAT gene Proteins 0.000 description 1
- 101150066002 GFP gene Proteins 0.000 description 1
- 101150074355 GS gene Proteins 0.000 description 1
- 241001123946 Gaga Species 0.000 description 1
- 102000048120 Galactokinases Human genes 0.000 description 1
- 108700023157 Galactokinases Proteins 0.000 description 1
- 208000027472 Galactosemias Diseases 0.000 description 1
- 208000009796 Gangliosidoses Diseases 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 241000713813 Gibbon ape leukemia virus Species 0.000 description 1
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 1
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 206010053185 Glycogen storage disease type II Diseases 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 244000299507 Gossypium hirsutum Species 0.000 description 1
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 1
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 1
- 208000018565 Hemochromatosis Diseases 0.000 description 1
- 108010085686 Hemoglobin C Proteins 0.000 description 1
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 1
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 208000002972 Hepatolenticular Degeneration Diseases 0.000 description 1
- 241000498254 Heterodera glycines Species 0.000 description 1
- 108091027305 Heteroduplex Proteins 0.000 description 1
- 102100039869 Histone H2B type F-S Human genes 0.000 description 1
- 101000851181 Homo sapiens Epidermal growth factor receptor Proteins 0.000 description 1
- 101001035372 Homo sapiens Histone H2B type F-S Proteins 0.000 description 1
- 101000615488 Homo sapiens Methyl-CpG-binding domain protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101001109800 Homo sapiens Pro-neuregulin-1, membrane-bound isoform Proteins 0.000 description 1
- 108700025438 Hordeum vulgare ribosome-inactivating Proteins 0.000 description 1
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 description 1
- 208000025500 Hutchinson-Gilford progeria syndrome Diseases 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 241000257303 Hymenoptera Species 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 208000028547 Inborn Urea Cycle disease Diseases 0.000 description 1
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 description 1
- 108010042889 Inulosucrase Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 108010036940 Levansucrase Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108091036060 Linker DNA Proteins 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- 208000030289 Lymphoproliferative disease Diseases 0.000 description 1
- 208000015439 Lysosomal storage disease Diseases 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 208000001826 Marfan syndrome Diseases 0.000 description 1
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 description 1
- 235000017587 Medicago sativa ssp. sativa Nutrition 0.000 description 1
- 206010027145 Melanocytic naevus Diseases 0.000 description 1
- 108010049137 Member 1 Subfamily D ATP Binding Cassette Transporter Proteins 0.000 description 1
- 102000003939 Membrane transport proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000301 Membrane transport proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100021299 Methyl-CpG-binding domain protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 108010059724 Micrococcal Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 description 1
- 201000002983 Mobius syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000034167 Moebius syndrome Diseases 0.000 description 1
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 108010086093 Mung Bean Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- 108700019961 Neoplasm Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000048850 Neoplasm Genes Human genes 0.000 description 1
- 201000005118 Nephrogenic diabetes insipidus Diseases 0.000 description 1
- 208000009905 Neurofibromatoses Diseases 0.000 description 1
- 108090000189 Neuropeptides Proteins 0.000 description 1
- 208000007256 Nevus Diseases 0.000 description 1
- 208000014060 Niemann-Pick disease Diseases 0.000 description 1
- 108010008964 Non-Histone Chromosomal Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000006570 Non-Histone Chromosomal Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091007494 Nucleic acid- binding domains Proteins 0.000 description 1
- 206010031243 Osteogenesis imperfecta Diseases 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 1
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 1
- 241000222291 Passalora fulva Species 0.000 description 1
- 101710132602 Peroxidase 5 Proteins 0.000 description 1
- 240000009164 Petroselinum crispum Species 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 102000009097 Phosphorylases Human genes 0.000 description 1
- 108010073135 Phosphorylases Proteins 0.000 description 1
- IMQLKJBTEOYOSI-UHFFFAOYSA-N Phytic acid Natural products OP(O)(=O)OC1C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C1OP(O)(O)=O IMQLKJBTEOYOSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001030 Polyethylene Glycol 4000 Polymers 0.000 description 1
- 108010068086 Polyubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 241000097929 Porphyria Species 0.000 description 1
- 208000010642 Porphyrias Diseases 0.000 description 1
- 208000007932 Progeria Diseases 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108700040121 Protein Methyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 102000055027 Protein Methyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 208000007531 Proteus syndrome Diseases 0.000 description 1
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 1
- 241000589615 Pseudomonas syringae Species 0.000 description 1
- 238000012181 QIAquick gel extraction kit Methods 0.000 description 1
- 102000044126 RNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 1
- 101710105008 RNA-binding protein Proteins 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 1
- 241000589771 Ralstonia solanacearum Species 0.000 description 1
- 101100272715 Ralstonia solanacearum (strain GMI1000) brg11 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 201000000582 Retinoblastoma Diseases 0.000 description 1
- 208000006289 Rett Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 101001025539 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) Homothallic switching endonuclease Proteins 0.000 description 1
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 1
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 1
- 241000239226 Scorpiones Species 0.000 description 1
- 241000270295 Serpentes Species 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 201000001388 Smith-Magenis syndrome Diseases 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 101001044900 Solanum tuberosum Proteinase inhibitor 1 Proteins 0.000 description 1
- 240000003829 Sorghum propinquum Species 0.000 description 1
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 208000027077 Stickler syndrome Diseases 0.000 description 1
- 241001137869 Streptomyces nitrosporeus Species 0.000 description 1
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 description 1
- 229940100389 Sulfonylurea Drugs 0.000 description 1
- 101800001271 Surface protein Proteins 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 206010043189 Telangiectasia Diseases 0.000 description 1
- 241001420369 Thosea Species 0.000 description 1
- 101710183280 Topoisomerase Proteins 0.000 description 1
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 description 1
- 102000003929 Transaminases Human genes 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 208000037280 Trisomy Diseases 0.000 description 1
- 208000026911 Tuberous sclerosis complex Diseases 0.000 description 1
- 208000026928 Turner syndrome Diseases 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010049644 Williams syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000018839 Wilson disease Diseases 0.000 description 1
- 241000589636 Xanthomonas campestris Species 0.000 description 1
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N Zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000033289 adaptive immune response Effects 0.000 description 1
- 201000009628 adenosine deaminase deficiency Diseases 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 208000006682 alpha 1-Antitrypsin Deficiency Diseases 0.000 description 1
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 1
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 1
- 239000003098 androgen Substances 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 229940019748 antifibrinolytic proteinase inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 101150059062 apln gene Proteins 0.000 description 1
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 1
- 208000036556 autosomal recessive T cell-negative B cell-negative NK cell-negative due to adenosine deaminase deficiency severe combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 229940097012 bacillus thuringiensis Drugs 0.000 description 1
- 210000003578 bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 101150103518 bar gene Proteins 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 1
- GINJFDRNADDBIN-FXQIFTODSA-N bilanafos Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCP(C)(O)=O GINJFDRNADDBIN-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 210000000013 bile duct Anatomy 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 230000009920 chelation Effects 0.000 description 1
- 230000007073 chemical hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 1
- 238000000749 co-immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 201000007254 color blindness Diseases 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 description 1
- 239000002852 cysteine proteinase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 108010081495 driselase Proteins 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 150000002061 ecdysteroids Chemical class 0.000 description 1
- 208000002169 ectodermal dysplasia Diseases 0.000 description 1
- 208000031068 ectodermal dysplasia syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000002337 electrophoretic mobility shift assay Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 108010050663 endodeoxyribonuclease CreI Proteins 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 230000001036 exonucleolytic effect Effects 0.000 description 1
- 108010093305 exopolygalacturonase Proteins 0.000 description 1
- 238000001400 expression cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- 230000004129 fatty acid metabolism Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 239000004459 forage Substances 0.000 description 1
- 244000000004 fungal plant pathogen Species 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 201000006440 gangliosidosis Diseases 0.000 description 1
- IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N glufosinate-P Chemical compound CP(O)(=O)CC[C@H](N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 201000004502 glycogen storage disease II Diseases 0.000 description 1
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 1
- 208000018706 hematopoietic system disease Diseases 0.000 description 1
- 210000005161 hepatic lobe Anatomy 0.000 description 1
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 1
- 102000055650 human NRG1 Human genes 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000608 immunotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 229940051026 immunotoxin Drugs 0.000 description 1
- 230000002637 immunotoxin Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 108010080576 juvenile hormone esterase Proteins 0.000 description 1
- 229930191400 juvenile hormones Natural products 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 108010034897 lentil lectin Proteins 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000002366 lipolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229930003658 monoterpene Natural products 0.000 description 1
- 150000002773 monoterpene derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000002577 monoterpenes Nutrition 0.000 description 1
- 238000002887 multiple sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000002539 nanocarrier Substances 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 210000001178 neural stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000004931 neurofibromatosis Diseases 0.000 description 1
- 239000002581 neurotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000618 neurotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000030648 nucleus localization Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009401 outcrossing Methods 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 239000006179 pH buffering agent Substances 0.000 description 1
- 230000001769 paralizing effect Effects 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 101150113864 pat gene Proteins 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 235000011197 perejil Nutrition 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002995 phenylpropanoid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000003016 pheromone Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 125000001476 phosphono group Chemical group [H]OP(*)(=O)O[H] 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000029553 photosynthesis Effects 0.000 description 1
- 238000010672 photosynthesis Methods 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000000467 phytic acid Substances 0.000 description 1
- 229940068041 phytic acid Drugs 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 210000003240 portal vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000001536 pro-arrhythmogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 229930004725 sesquiterpene Natural products 0.000 description 1
- 150000004354 sesquiterpene derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 1
- HBMJWWWQQXIZIP-UHFFFAOYSA-N silicon carbide Chemical compound [Si+]#[C-] HBMJWWWQQXIZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910010271 silicon carbide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 244000000000 soil microbiome Species 0.000 description 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 108010031092 starch-branching enzyme II Proteins 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 230000007863 steatosis Effects 0.000 description 1
- 231100000240 steatosis hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 208000009056 telangiectasis Diseases 0.000 description 1
- 230000003582 thrombocytopenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 108091006106 transcriptional activators Proteins 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000009999 tuberous sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 238000003160 two-hybrid assay Methods 0.000 description 1
- 238000010798 ubiquitination Methods 0.000 description 1
- 230000034512 ubiquitination Effects 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 208000030954 urea cycle disease Diseases 0.000 description 1
- 229910052720 vanadium Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000005166 vasculature Anatomy 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 239000000277 virosome Substances 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 102000028728 vitamin binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091009357 vitamin binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000006542 von Hippel-Lindau disease Diseases 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 210000004885 white matter Anatomy 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8209—Selection, visualisation of transformants, reporter constructs, e.g. antibiotic resistance markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8213—Targeted insertion of genes into the plant genome by homologous recombination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
- C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
- C12N15/8278—Sulfonylurea
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
- C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Insects & Arthropods (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Description
本出願は、2012年5月7日に出願された米国仮特許出願第61/643,812号の利益を主張し、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
該当なし
本明細書に開示される方法の実践ならびに組成物の調製および使用は、別途指定されない限り、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算化学、細胞培養、組換えDNA、ならびに当該分野の技術の範囲内である関連分野における従来の技術を用いる。これらの技術は、文献に完全に説明されている。例えば、Sambrook et al. MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,Second edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989および第3版2001、Ausubel et al.,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John Wiley&Sons,New York,1987および定期改訂版、METHODS IN ENZYMOLOGYシリーズ、Academic Press,San Diego、Wolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION,Third edition,Academic Press,San Diego,1998、METHODS IN ENZYMOLOGY,Vol.304,“Chromatin”(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe,eds.),Academic Press,San Diego,1999、ならびにMETHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,Vol.119,“Chromatin Protocols”(P.B.Becker,ed.)Humana Press,Totowa,1999を参照されたい。
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、同義に使用され、線状または環状構造であり、かつ一本鎖または2本鎖形態のいずれかである、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的のために、これらの用語は、ポリマーの長さに関して限定的であると解釈されるべきではない。この用語は、天然ヌクレオチドの既知の類似体、ならびに塩基部分、糖部分および/またはリン酸部分において修飾されるヌクレオチド(例えば、ホスホロチオエート骨格)を包含することができる。一般に、特定のヌクレオチドの類似体は、同じ塩基対形成特異性を有し、すなわち、Aの類似体は、Tと塩基対形成する。
導入遺伝子を有するドナー分子のインビボ切断に有用な組成物、特にヌクレアーゼ、および、導入遺伝子が標的化された様式でゲノム内に組み込まれるような細胞のゲノムの切断のためのヌクレアーゼが記載される。ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼの1つ以上は、天然型である。他の実施形態において、ヌクレアーゼの1つ以上は、非天然型である、すなわち、DNA結合ドメインおよび/または切断ドメインにおいて操作されている。例えば、天然型ヌクレアーゼのDNA結合ドメインは、選択された標的部位(例えば、同族の結合部位とは異なる部位に結合するように操作されたメガヌクレアーゼ)に結合するように改変され得る。他の実施形態において、ヌクレアーゼは、異種のDNA結合ドメインおよび切断ドメイン(例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、TAL−エフェクタードメインDNA結合タンパク質、異種の切断ドメインを有するメガヌクレアーゼDNA結合ドメイン)を含む。
ある特定の実施形態において、本明細書に記載の組成物および方法は、ドナー分子への結合および/または細胞のゲノム内の目的領域への結合に、メガヌクレアーゼ(ホーミングエンドヌクレアーゼ)DNA結合ドメインを使用する。天然型メガヌクレアーゼは、15〜40個塩基対の切断部位を認識し、一般的に、LAGLIDADGファミリー、GIY−YIGファミリー、His−Cystボックスファミリー、およびHNHファミリーの4つのファミリーに分類される。例となるホーミングエンドヌクレアーゼには、I−SceI、I−CeuI、PI−PspI、PI−Sce、I−SceIV、I−CsmI、I−PanI、I−SceII、I−PpoI、I−SceIII、I−CreI、I−TevI、I−TevII、およびI−TevIIIが含まれる。これらの認識配列は既知である。また、米国特許第5,420,032号、米国特許第6,833,252号、Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res.25:3379−3388、Dujon et al. (1989) Gene 82:115−118、Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res.22, 1125−1127、Jasin (1996) Trends Genet.12:224−228、Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163−180、Argast et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345−353、およびNew England Biolabsカタログを参照されたい。
任意の好適な切断ドメインをDNA結合ドメインに作動可能に連結して、ヌクレアーゼを形成することができる。例えば、ZFP DNA結合ドメインをヌクレアーゼドメインに融合してZFNが作製されており、これは、その操作された(ZFP)DNA結合ドメインを通じてその意図される核酸標的を認識し、ヌクレアーゼ活性を介してZFP結合部位付近でのDNAの切断を引き起こすことが可能である、機能的実体である。例えば、Kim et al.(1996)Proc Natl Acad Sci USA 93(3):1156−1160を参照されたい。より最近では、多様な生物におけるゲノム修飾のためにZFNが使用されている。例えば、米国特許公開第20030232410号、同第20050208489号、同第20050026157号、同第20050064474号、同第20060188987号、同第20060063231号、および国際公開第WO07/014275号を参照されたい。同様に、TALE DNA結合ドメインをヌクレアーゼドメインに融合して、TALENが作製されている。例えば、米国特許公開第20110301073号を参照されたい。
上で詳述されるように、DNAドメインは、選択される任意の配列に結合するように操作され得る。操作されたDNA結合ドメインは、天然型DNA結合ドメインと比較して新規の結合特異性を有することができる。操作方法は、合理的設計および種々の種類の選択を含むが、これらに限定されない。合理的設計は、例えば、トリプレット(またはカドラプレット)のヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを使用することを含み、各トリプレットまたはカドラプレットのヌクレオチド配列は、特定のトリプレットまたはカドラプレットの配列に結合するジンクフィンガーの1つ以上のアミノ酸配列と会合している。例えば、譲受人共通の米国特許第6,453,242号および同第6,534,261号を参照されたく、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。TALエフェクタードメインの合理的設計もまた行うことができる。例えば、米国特許公開第20110301073号を参照されたい。
選択された場所内への挿入のための、任意のポリヌクレオチドの標的化挿入の方法が、本明細書に開示される。挿入のためのポリヌクレオチドはまた、「外因性」ポリヌクレオチド、「ドナー」ポリヌクレオチドもしくは分子または「導入遺伝子」と呼ぶこともできる。
本明細書において開示されるドナー分子は、標的化された相同性非依存的方法を介して細胞のゲノム内に組み込まれる。そのような標的化組み込みのために、ゲノムは、ヌクレアーゼを使用して、所望の場所(複数可)で、例えばDNA結合ドメイン(例えば、ジンクフィンガー結合ドメインまたはTALエフェクタードメインは、所定の切断部位の、またはその近くの部位に結合するように操作される)とヌクレアーゼドメイン(例えば、切断ドメインまたは切断ハーフドメイン)との間の融合部において切断される。ある特定の実施形態において、それぞれDNA結合ドメインおよび切断ハーフドメインを含む2つの融合タンパク質が細胞内に発現され、機能性切断ドメインが再構成されてDNAが標的部位(複数可)近傍で切断されるように並置される部位に結合する。一実施形態において、切断は、2つのDNA結合ドメインの結合部位の間に生じる。DNA結合ドメインの1つまたは両方が操作され得る。米国特許第7,888,121号、米国特許公開第20050064474号、ならびに国際特許公開第WO05/084190号、同第WO05/014791号および同第WO03/080809号もまた参照されたい。
ヌクレアーゼ、これらのヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチド、ならびに本明細書に記載のタンパク質および/またはポリヌクレオチドを含む組成物は、任意の好適な手段によってインビボまたはエクスビボで任意の細胞型に送達され得る。
細胞成長、トランスフェクション、およびZFN/TALENアッセイ。
K562(ATCC CCL−243)のトランスフェクションは、Amaxa Solution VおよびプログラムT−016; CHO−K1(ATCC CCl−61)、Amaxa Solution TおよびプログラムU−023を使用した。全てのトランスフェクションは、106細胞および以下のプラスミドを含有した:AAVS1、3μgの2A−連結ZFNおよびドナー;IL2Rγ およびCCR5、2μgの各非連結ZFN プラスミドおよび10μgのドナープラスミド; GS、FUT8、3μgの2A−連結ZFNおよび10μgのドナープラスミド。ZFN設計を含むさらなる詳細については、米国特許第8,110,379号および米国特許公開第20100129869号および同20090042250号、ならびにDeKelver et al. (2010) Genome Res. 20(8):1133−1142、Liu et al. (2009) Biotechnol.Bioeng. 106(1):97−105、Malphettes et al. (2010) Biotechnology and Bioengineering 106(5):774−83、Perez et al. (2008) Nature Biotech. 26(7):808−816、Urnov et al. (2005) Nature 435(7042):646−651を参照されたい。
AAVS1(5’−tgt ccc ctc cAC CCC ACA GTG Ggg cca cTA GGG ACA GGA Ttg gtg aca ga−3’、配列番号:3)、離間−反転AAVS1(5’−tgt ccc ctc cAC CCC ACA GTG Ggt ggc cTA GGG ACA GGA Ttg gtg aca ga−3’、配列番号:541)、GS(5’−gac cCC AAG CCC ATT CCT GGG Aac tgg aAT GGT GCA GGC Tgc cat acc aa−3’、配列番号:4)、およびIL2Rγ(5’−gtt tcg tgt tCG GAG CCG CTT Taa ccc ACT CTG TGG AAG tgc tca gca tt−3’、配列番号:5)ZFN対に対するZFN標的部位を含有するオリゴを、50mM NaCl、10 mM Tris pH7.5、および1mM EDTA中でそれらの逆相補配列にアニールした。米国特許公開第20100129869号、ならびに米国特許第7,951,925号および同第8,110,379号も参照されたい。大文字は、ZFN結合部位を指し、一方小文字は、隣接およびスペーサー配列を指す。
全てのPCR反応は、Accuprime HiFi(商標)ポリメラーゼ(Invitrogen)を使用し、100ngのゲノムDNAをテンプレートとして用いて行った。ゲノムDNAは、Masterpure(登録商標)キット(Epicentre)で精製した。
A.AAVS1
ゲノム標的部位を切断する同じZFNを使用した導入遺伝子のインビボ切断が、ドナーおよび染色体切断を同期化し、分解に対する導入遺伝子の脆弱性を最小化させるかどうかを試験するために、K562細胞を、AAVS1標的化ZFNおよびドナープラスミドのインビボ切断のためのAAVS1 ZFN標的部位を含むドナープラスミドでトランスフェクトした。簡潔に説明すると、実施例1に記載のように、十分特性決定されきわめて活性なAAVS1 ZFNの認識部位を、自立的GFP発現カセットを含有するがAAVS1遺伝子座に対する相同性を有さないドナープラスミドにクローニングした。米国特許第8,110,379号およびDeKelver et al. (2010) Genome Res. 20(8):1133−1142を参照されたい。ドナープラスミド(ZFN標的部位を有する、または有さない)を、AAVS1 ZFNをコードする第2のプラスミドと共に、K562細胞に共トランスフェクトした。
切断されたドナーの捕捉が、K562細胞におけるAAVS1内への組み込みに制限されないことを実証するために、K562およびCHO細胞における3つの他の遺伝子座(IL2Rγ、CCR およびGS)において類似の実験を行った。成功した標的化組み込みを、上述のように各方向(ABおよびBA)に対して、1つの染色体−ドナー接合点において監視した。
標的化遺伝子挿入の観察されたレベルを支持するにはインビボ切断が必要であることを確認するために、実施例1に記載のように、インビボ切断ドナー、およびEcoRVを使用してインビトロで切断されたドナーを使用して、標的化組み込みの直接比較を行った。
CHO細胞における標的化組み込みは、バイオテクノロジーにおいて特に重要な用途を有するが、CHO細胞は、数キロベースの導入遺伝子のHDRベース標的化組み込みを極めて不十分にしか行わない。この点を強調するために、本質的にMoehle et al. (2007) Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 104(9):3055−3060)に記載されるように、プロモーターを含まないGFP遺伝子をプロモーター含有アクセプター遺伝子座内に送達するように設計された系を使用しして、HEK−293細胞およびCHO−K1細胞両方におけるHDR媒介標的化組み込みを比較した。標的化組み込みは、GFPの発現をもたらし、フローサイトメトリーによる定量化を可能にする。
導入遺伝子を慣習的にCHO細胞ゲノム内に挿入し、生物薬剤タンパク質、特に抗体を生成する。FUT8遺伝子の欠失を有するCHO細胞は、100倍高い抗体依存性細胞傷害性を有するフコシル化抗体を生成する(Malphettes et al. (2010) Biotechnology and Bioengineering 106(5):774−83;Yamane−Ohnuki et al. (2004) Biotech.Bioeng. 87(5):614−22)。さらに、FUT8発現のノックアウトを選択することができ、したがって、標的化組み込みをこの選択可能な形質と結合させることができる。したがって我々は、インビボ切断抗体生成カセットの挿入により、FUT8遺伝子を妨害するために、前述のFUT8特異的ZFNを使用した(Moehle et al. (2007) Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 104(9):3055−3060)。さらに、我々は、インビボ切断ドナーの捕捉が、FUT8に特異的なTALEヌクレアーゼ(TALEN)により生成された2本鎖切断で生じ得るかどうかを決定することを望んだ。
AHASゲノム標的配列の特性決定および同定
参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許番号第61/809,097号に記載のように、3つの同祖AHAS遺伝子の転写された領域を同定および決定し、ジンクフィンガーヌクレアーゼを、ドナー配列のNHEJ媒介標的化のための部位を結合および切断するように設計した。これらの新規配列は、配列番号:116、配列番号:117、および配列番号:118として列挙される。以前の配列決定研究において、コムギ(Triticum aestivum)からのAHAS遺伝子の同祖コピーが同定され、染色体6A、6Bおよび6Dの長腕に遺伝子的にマッピングされた(Anderson et al., (2004) Weed Science 52:83−90;およびLi et al., (2008) Molecular Breeding 22:217−225)。発現配列タグ(EST)の配列分析およびGenbankにおいて利用可能なゲノム配列(Accession Number:AY210405.1、AY210407.1、AY210406.1、AY210408.1、FJ997628.1、FJ997629.1、FJ997631.1、FJ997630.1、FJ997627.1、およびAY273827.1)を使用して、AHAS遺伝子(配列番号:116〜118)の同祖コピーの転写された領域を決定した。
コムギ(Triticum aestivum)品種Bobwhite MPB26RHからAHAS遺伝子の同祖コピーをクローニングおよび配列決定して、高度の特異性で配列に結合することができる特異的ジンクフィンガータンパク質を設計するために好適なヌクレオチド配列を得た。コムギ(Triticum aestivum)品種Bobwhite MPB26RHから得られたAHASヌクレオチド配列の配列分析は、Genbank内に存在するヌクレオチドの注釈およびROCHE 454(商標)AHAS遺伝子配列を確認するために、ならびに品種Bobwhite MPB26RHと、GenbankおよびROCHE 454(商標)配列が得られる他の小麦品種との間の対立遺伝子変異に起因して必要であった。
AHAS遺伝子の同祖コピーの同定されたDNA配列に対して指向性であるジンクフィンガータンパク質を、前述のように設計した。例えば、Urnov et al., (2005) Nature 435:646−551を参照されたい。例となる標的配列および認識へリックスを、表2(認識へリックス領域設計)および表3(標的部位)に示す。表3において、ZFP認識へリックスに接触する標的部位におけるヌクレオチドは大文字で示され、接触していないヌクレオチドは小文字で示されている。ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)標的部位は、セリン653アミノ酸残基 から約500bp上流側の領域、セリン653アミノ酸残基に隣接する(30bp以内)上流側領域、セリン653アミノ酸残基に隣接する(80bp以内)下流側領域、およびセリン653アミノ酸残基から約400bp下流側の領域の、AHAS遺伝子の4つの領域に対して設計された。様々なZFP設計を開発および試験して、参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許番号第61809097号に記載のように小麦において同定された、22の異なるAHAS標的部位と最も高いレベルの効率で結合したフィンガーを同定した。最も高いレベルの効率でジンクフィンガー認識配列に結合した特異的ZFP認識へリックス(表2)を、NHEJ媒介標的化および小麦ゲノムのAHAS遺伝子座内のドナー配列の組み込み(相同性非依存性標的化組み込み)に使用した。
ZFN構築物アセンブリ:前述のように酵母アッセイを使用して同定されたZFN遺伝子発現構築物を含有するプラスミドベクターを設計し、当該技術分野において一般的に知られている技術および技法を使用して完成させた。(例えば、AusubelまたはManiatisを参照されたい)。各ZFNコード化配列を、ジンクフィンガーヌクレアーゼの上流側に位置するopaque−2核局在化シグナルをコードする配列に融合させた(Maddaloni et al., (1989) Nuc.Acids Res.17:7532)。
コムギ(Triticum aestivum)プロトプラストへの送達の前に、供給業者の説明に従い、PURE YIELD PLASMID MAXIPREP SYSTEM(登録商標)(Promega Corporation、Madison、WI)またはPLASMID MAXI KIT(登録商標)(Qiagen、Valencia、CA)を使用して、各ZFN構築物のためのプラスミドDNAを大腸菌の培養物から調製した。
コムギ系統品種Bobwhite MPB26RHからの葉肉プロトプラストを、ポリエチレングリコール(PEG)媒介DNA送達を使用したトランスフェクションのために以下のように調製した。
約106の葉肉 プロトプラストを、12mLの丸底管に加え、70gでの遠心分離によりペレット化してから上澄みを除去した。70μgのプラスミドDNAを含有する600μl洗浄緩衝液中に、プロトプラストを穏やかに再懸濁させた。プラスミドDNAは、上述のジンクフィンガーヌクレアーゼ構築物からなっていた。次に、等体積の40%PEG溶液(40%w/v PEG4,000、0.8Mマンニトール、1M Ca(NO3)2、pH5.6)を、管の穏やかな回転による混合と同時にプロトプラスト懸濁液にゆっくりと添加した。プロトプラスト懸濁液を、一切撹拌せずに室温で15分間インキュベートした。
トランスフェクトされたプロトプラストを、3cm PETRI(商標)皿から2mL 微量遠心管に移した。細胞を70gでの遠心分離によりペレット化し、上澄みを除去した。トランスフェクトされたプロトプラストの回収を最大化するために、PETRI(商標)皿を1mLの洗浄緩衝液で3回濯いだ。各濯ぎは、洗浄緩衝液をPETRI(商標)皿内で1分間旋回撹拌し、続いて液体を同じ2mlの微量遠心管に移すことにより行った。各濯ぎの最後に、細胞を70gでの遠心分離によりペレット化し、上澄みを除去した。ペレット化されたプロトプラストを液体窒素中で急速凍結してから、LABCONCO FREEZONE 4.5(登録商標)(Labconco、Kansas City、MO)内で−40℃および133×10−3mBarの圧力で24時間フリーズドライした。凍結乾燥された細胞を、製造者の説明に従いDNEASY(登録商標)PLANT DNA EXTRACTION MINIキット(Qiagen)を使用してDNA抽出に供し(但し組織破壊は必要ではない)、プロトプラスト細胞を溶解緩衝液に直接添加した。
AHAS遺伝子座用に設計されたZFNの切断有効性および標的部位特異性の調査を可能とするために、1つ以上のZFN標的部位が捕捉される300bp断片まで増幅するようにPCRプライマーを設計した。プライマーの1つは、捕捉されたZFN標的部位(複数可)の100bpウィンドウ以内となるように設計された。この設計戦略により、Illuminaショートリード技術を使用して、トランスフェクトされたプロトプラストにおける標的ZFN部位の完全性を評価することができた。さらに、PCRプライマーは、Illumina配列リードが、それらが由来する小麦部分ゲノムに明白に帰属され得るように、AHAS遺伝子の3つの同祖コピーを増幅し、同祖体間を区別するヌクレオチド配列変異を捕捉するように設計された。
トランスフェクトされた葉肉プロトプラストのために調製された試料ライブラリのためのIlluminaショートリード配列データの生成後、バイオインフォマティクス分析を行って、標的ZFN部位における欠失したヌクレオチドを同定した。そのような欠失は、非相同末端結合(NHEJ)DNA修復から得られる植物体内ZFN活性の指標であることが知られている。
小麦における内因性AHAS遺伝子座でのZFN媒介ゲノム編集を調査するために、一連の実験を行って、非相同末端結合 (NHEJ)指向性DNA修復の効率に対するドナーデザインの効果を評価した。これらの実験は、小麦における内因性AHAS遺伝子座においてイミダゾリノンクラス除草剤(Li et al., (2008) Molecular Breeding 22:217−225)に対する耐性を付与する前述のS653N変異のZFN媒介付加、または代替として、標的化ZFN切断により内因性AHAS遺伝子において形成された2本鎖DNA切断における、EcoRI制限エンドヌクレアーゼ配列部位のZFN媒介導入の効率を監視するために、トランジェントアッセイを使用した。
2種類のドナーDNA設計を、NHEJ指向性DNA修復に使用した。
当業者により一般的に知られている標準的クローニング方法を使用して、プラスミドベクターを構築した。コムギ(Triticum aestivum)への送達の前に、各ドナー構築物のためのプラスミドDNAを、供給業者の説明に従い、PURE YIELD PLASMID MAXIPREP SYSTEM(登録商標)(Promega Corporation、Madison、WI)またはPLASMID MAXI KIT(登録商標)(Qiagen、Valencia、CA)を使用して、大腸菌の培養物から調製した。
ドナー小麦系統品種Bobwhite MPB26RHからの体細胞胚発生カルス (SEC)に由来するプロトプラストを、ポリエチレングリコール(PEG)媒介DNA送達を使用したトランスフェクションのために以下のように調製した。
約200万のSECプロトプラストを、12mLの丸底管に加え、70gでの遠心分離によりペレット化してから上澄みを除去した。70gのDNAを含有する480μl SEC洗浄緩衝液中に、プロトプラストを穏やかに再懸濁させた。DNAは、上述のジンクフィンガーヌクレアーゼおよびドナーDNA構築物からなり、各構築物は、行われている実験に必要なモル比で存在した。次に、720μlの50%PEG溶液(50%w/v PEG4000、0.8Mマンニトール、1M Ca(NO3)2、pH5.6)を、管の穏やかな回転による混合と同時にプロトプラスト懸濁液にゆっくりと添加した。プロトプラスト懸濁液を、一切撹拌せずに室温で15分間インキュベートした。
ドナー小麦系統品種Bobwhite MPB26RHからの未熟接合小麦胚の胚盤を、バイオリスティック媒介DNA送達を使用したトランスフェクションのために以下のように調製した。
40mgの0.6ミクロンコロイド金粒子(BioRad)を1.5mL微細管内の1mLの滅菌水に添加することにより、バイオリスティック媒介DNA送達のための金粒子を調製した。5分間ボルテックスすることにより、金粒子を再懸濁させた。10回の照射に十分な材料を調製するために、金粒子懸濁液の50μLのアリコートを、5μLの滅菌水中に再懸濁された5μgのDNAを含有する1.5mL微細管に移した。ボルテックスによる完全な混合の後、50μLの2.5M CaCl2および20μLの0.1Mスペルミジンを微細管に添加し、各試薬の添加後に完全に混合した。DNA被覆金微粒子を、卓上型微量遠心分離機内で、最大速度で1分間の遠心分離によりペレット化した。上澄みを除去し、1mLの100%エタノールを添加して、金粒子を洗浄および再懸濁させた。金粒子を上述のように遠心分離によりペレット化し、上澄みを廃棄した。DNA被覆金粒子を、110μLの100%エタノール中に再懸濁させ、氷上に維持した。簡単なボルテックスの後、10μLの金粒子溶液を、マイクロキャリア膜の中央に置き、空気乾燥させた。
葉肉プロトプラストに関して前述した手順を使用して、ゲノムDNAをSECプロトプラストから抽出した。トランスフェクションに使用したドナーDNAの存在を低減するために、追加の精製ステップを行った。これは、トランスフェクションに使用したドナーDNAからのSECプロトプラストからゲノムDNAを分離するためのゲル電気泳動を使用して達成された。抽出されたDNAは、0.5X TBEを使用して、0.5%アガロースゲル中で3時間電気泳動された。DNAは、SYBR(登録商標)SAFE染色により可視化し、SECプロトプラストからのゲノムDNAに対応するバンドを離断した。製造者の説明に従い、QIAQUICK DNA PURIFICATION KIT(商標)(Qiagen)を使用してゲノムDNAをアガロースゲルから精製したが、但しQIAQUICK(商標)DNA精製カラムを、DNEASY PLANT DNA EXTRACTION MINI KIT(商標)(Qiagen)製のDNA結合カラムと置き換えた。
各バイオリスティック媒介DNA送達のためにトランスフェクトされた未熟接合小麦胚の20の胚盤を、15ml管に移し、液体窒素中で急速凍結してから、LABCONCO FREEZONE 4.5(登録商標)(Labconco、Kansas City、MO)内で、−40℃および133×10−3mBarの圧力で24時間フリーズドライした。凍結乾燥されたカルスを、製造者の説明に従いDNEASY(登録商標)PLANT DNA EXTRACTION MAXI(商標)キット(Qiagen)を使用してDNA抽出に供した。
NHEJ指向性DNA修復を使用した小麦における内因性AHAS遺伝子におけるZFN媒介ゲノム編集を調査するために、および各DNA修復経路の有効性に対するドナーDNA設計の効果を評価するために、PCRアッセイを使用して、トランスフェクトされた小麦細胞のゲノムDNAからの標的AHAS領域を増幅した。前述のようにPCR分析を行って、Illuminaベースの合成による配列決定(sequencing−by−synthesis)技術のための正しい形式で必要な遺伝子座特異的DNA分子を生成した。各アッセイは、AHAS遺伝子の3つの同祖コピーのそれぞれに対し、ZFN29732および29730(プラスミドpDAB109350上にコードされている)ならびにZFN30012および30018(プラスミドpDAB109360上にコードされている)により標的化された領域を増幅するように設計された、前述のプライマー対(配列番号:160および配列番号:170)を使用して行った。コムギ(Triticum aestivum)ゲノムの十分なコピーがZFN媒介遺伝子編集の信頼性のある評価のために分析されることを確実とするために、トランスフェクトされた試料当たり複数の反応を行った。トランスフェクトされたSECプロトプラストに対して、トランスフェクトされた試料当たり、個々のプロトプラストから採取された200,000コピーのコムギ(Triticum aestivum)ゲノムに相当する16までのPCRアッセイを行った。未熟接合胚のトランスフェクトされた胚盤に対して、トランスフェクトされた試料当たり、個々のプロトプラストから採取された600,000コピーのコムギ(Triticum aestivum)ゲノムに相当する約48のPCRアッセイを行った。CBOT CLUSTER GENERATION KIT(商標)(Illumina)を使用して、それぞれのトランスフェクトされた試料を配列決定のために調製し、前述のように、ILLUMINA GAIIX(商標)またはHISEQ2000(商標)機器(Illumina)上で配列決定して、100bpの対末端配列リードを生成した。
トランスフェクトされたSECプロトプラストおよび未熟接合小麦胚の胚盤のために調製された試料ライブラリのためのIlluminaショートリード配列データの生成後、標的ZFN部位におけるZFN媒介NHEJ指向性編集の分子的な証拠を特定するために分析を行った。
小麦における内因性AHAS遺伝子座は、ZFN媒介遺伝子編集により誘導される正確なゲノム修飾を有する植物を生成するための形質転換系を開発するためのモデル遺伝子座として選択された。内因性AHAS遺伝子は、選択可能な表現型(すなわち、グループB除草剤−ALS阻害剤への耐性)を生成するその能力、部分ゲノム特異的遺伝子コード化配列の前提条件情報の知識、および、AHAS遺伝子における化学的に誘導された変異を有する小麦の特性決定からのグループB除草剤に耐性を付与する特定の変異の知識により、モデル遺伝子座として選択された。イミダゾリノンクラスの除草剤に対する耐性を付与するS653N変異は、正確に編集されたイベントを強化する化学的選択系を開発するための陽性対照として使用され得るS653N変異を有する、市販の小麦種の利用可能性に起因して、ZFN媒介遺伝子編集の標的として選択された。
D−ゲノムにS653N変異を有する市販のパン用小麦種であるコムギ(Triticum aestivum)品種 Clearfield Janzは、ZFN媒介遺伝子編集により生成されるAHAS編集小麦植物を強化する化学的選択戦略を開発するための陽性対照としての使用に選択された。純粋な遺伝子種ストックを生成するために、Multiplex−Ready PCR技術(Hayden et al., (2008) BMC Genomics 9;80)を使用して、48の実生を96マイクロサテライト(SSR)マーカーでスクリーニングした。同一のSSRハプロタイプを有する実生を使用して、後の実験において使用される種を生成した。
AHAS編集小麦植物を再生するための最適選択条件を決定するために、一連の実験を行った。これらの実験は、確立された小麦形質転換系のカルス誘導、植物再生および発根段階における、ドナー小麦系統品種Bobwhite MPB26RH(S653/S653遺伝子型)のIMAZAMOX(商標)に対する基本的耐性の試験に基づいた。異なる量のS653N変異を有する品種Clearfield Janz遺伝子型、すなわちN653/N653およびS653/S653遺伝子型を有する植物の基本的耐性および抵抗性を決定するために、同様の実験を行った。
ドナーDNA分子を、小麦における内因性AHAS遺伝子での正確なZFN媒介NHEJ指向性遺伝子編集を促進するように設計した。ドナー設計により、イミダゾリノンクラス除草剤(Li et al., (2008) Molecular Breeding 22:217−225)に対する耐性を付与することが知られているS653N変異の導入が可能となった。
バイナリベクターpDAS000143(配列番号:185)(図15)の構築において、標準的クローニング方法を使用した。AHAS(S653N)遺伝子発現カセットは、トウモロコシ(Zea mays)由来ユビキチン(Ubi)遺伝子からのプロモーター、5’非翻訳領域およびイントロン(Toki et al., (1992) Plant Physiology 100; 1503−07)に続く、アミノ酸残基653におけるセリン(S)からアスパラギン(N)へのアミノ酸変化を誘導するためにCGからATに変異した塩基対1880および1181を有するコムギ(T. aestivum)からのAHAS遺伝子のコード化配列(1935bp)からなる。AHAS発現カセットは、A.ツメファシエンスpTi15955からのノパリンシンターゼ遺伝子(nos)の3’非翻訳領域(UTR)を含んでいた。(Fraley et al.,(1983) Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 80(15);4803−4807)。選択カセットは、アジアイネ(Oryza sativa)由来アクチン1(Act1)遺伝子からのプロモーター、5’非翻訳領域およびイントロン (McElroy et al., (1990) The Plant Cell 2(2); 163−171)に続く、ホスフィノトリシン、グルホシネート、およびビアラホスを含むグルタミン合成酵素の阻害剤に対する抵抗性を付与するタンパク質をコードする、ストレプトミセス・ビリドクロモゲネスから単離されたホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ(PAT)遺伝子の合成植物最適化型を含んでいた(Wohlleben et al., (1988) Gene 70(1); 25−37)。このカセットは、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)の35S遺伝子からの3’UTRで終端された(Chenault et al., (1993) Plant Physiology 101 (4); 1395−1396)。
ドナー小麦系統品種Bobwhite MPB26RHからの未熟接合胚の約23,000の胚盤を、前述のようにバイオリスティック媒介DNA送達のために調製した。DNA被覆金粒子を、以下の製剤を使用して、上述のように調製した。pDAS000267を使用して行われるトランスフェクションにおいては、ドナーDNAをpDAB109350(ZFN29732および29730をコードする)に対するプラスミドDNAと5:1モル比で混合した。pDAS000268を使用して行われるトランスフェクションにおいては、ドナーDNAをDAB109350(ZFN29732および29730をコードする)ならびにpDAB109360(ZFN30012および30018をコードする)に対するプラスミドDNAと10:1:1モル比で混合した。pDAS000143を使用して行われるトランスフェクションは、pDAS000143に対するプラスミドDNAのみで被覆された金粒子を使用して行われた。
S653N変異をコードするドナーポリヌクレオチドによる照射から得られた小麦植物を得、ゲノム2本鎖切断部位におけるドナー組み込みの結果生じたS653N変異の組み込みを含む小麦部分ゲノムを同定するために分子的に特性決定した。2つのシリーズの照射を完了した。第1のセットの実験は、pDAS000143を用いて完了し、第2のセットの実験は、pDAS000267およびpDAS000268を用いて完了した。両方のセットの実験から個々の小麦植物を得、S653N変異をコードするAHASドナーポリヌクレオチドの組み込まれたコピーを含有する植物を同定するための分子的方法により分析した。
ゲノムDNAを、再生されたそれぞれの小麦植物から収集されたフリーズドライ葉組織から抽出した。新しく収集された葉組織を液体窒素中で急速凍結し、LABCONCO FREEZONE 4.5(登録商標)(Labconco、Kansas City、MO)内で−40℃および133×10−3mBarの圧力で24時間フリーズドライした。凍結乾燥された材料を、製造者の説明に従いDNEASY(登録商標)PLANT DNA EXTRACTION MINI KIT(商標)(Qiagen)を使用してDNA抽出に供した。
pDAS000143を用いて行われた照射からの再生された小麦植物が、S653N変異をコードするAHASドナーポリヌクレオチドの少なくとも1つの無作為に組み込まれたコピーを有することを確認するために、二重加水分解プローブqPCRアッセイ(TAQMAN(登録商標)に類似)を使用して、内因性単一コピー遺伝子、6倍体小麦のDゲノムからのプロインドリン−b(Pinb)(Gautier et al., (2000) Plant Science 153, 81−91;順方向および逆方向プライマーならびにプローブ配列に対してそれぞれ配列番号:186、配列番号:187および配列番号:188)、およびpDAS000143上に存在するアクチン(Act1)プロモーターの領域(順方向および逆方向プライマーならびにプローブ配列に対してそれぞれ配列番号:189、配列番号:190および配列番号:191)を増幅した。加水分解プローブqPCRアッセイは、4つの化学的選択戦略のそれぞれから回収された24の無作為に選択された小麦植物に対して行った。pDAS00143の存在およびその推定コピー数の評価は、Livak and Schmittgen (2001) Methods 25(4):402−8に記載の方法に従って行った。
回収された小麦植物における部分ゲノム位置およびZFN媒介NHEJ指向性遺伝子編集の結果を特性決定するために、プライマーAHAS_3F1およびAHAS_3R1(配列番号:192および配列番号:193)を用いたPCRを使用して、AHAS遺伝子の同祖コピーからの標的領域を増幅した。得られたPCR産物は、プラスミドベクターにクローニングし、ABI3730XL(登録商標)自動化キャピラリー電気泳動プラットフォーム上で、BIGDYE(登録商標)v3.1化学(Applied Biosystems)を使用してサンガー配列決定を行った。内因性AHAS同祖体における各対立遺伝子が配列決定されることを確実とするために、120までの独立したプラスミドクローンのサンガー配列決定を行った。SEQUENCHER SOFTWARE(商標)を使用して行われる配列分析を使用して、回収された小麦植物のそれぞれにおけるAHAS遺伝子の3つの同祖コピーの各対立遺伝子のコンセンサス配列を生成し、それぞれの編集された対立遺伝子の部分ゲノムの起源および配列を決定した。
AHAS遺伝子の同祖コピーのDNA配列に指向性のジンクフィンガータンパク質を、前述のように設計した。例となる標的配列および認識へリックスを、表12(認識へリックス領域設計)および表13(標的部位)に示す。表13において、ZFP認識へリックスに接触する標的部位におけるヌクレオチドは大文字で示され、接触していないヌクレオチドは小文字で示されている。ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)標的部位は、プロリン197(P197)アミノ酸残基をコードするAHAS遺伝子における領域の上流側(2〜510ヌクレオチド上流側)に設計された。
ZFN構築物アセンブリ;前述のように、酵母系を使用して切断活性が検証されたZFN発現構築物を含有するプラスミドベクターが、設計および完成された。得られたプラスミド構築物;pDAB111855(ZFN34470−2A−34471)、pDAB111856(ZFN34472−2A−34473)、およびpDAB111857(ZFN34474−2A−34475)は、制限酵素消化およびDNA配列決定により確認された。
コムギ(Triticum aestivum)プロトプラストへの送達の前に、各ZFN構築物のためのプラスミドDNAを、供給業者の説明に従い、PURE YIELD PLASMID MAXIPREP SYSTEM(登録商標)(Promega Corporation、Madison、WI)またはPLASMID MAXI KIT(登録商標)(Qiagen、Valencia、CA)を使用して、大腸菌の培養物から調製した。
ドナー小麦系統品種Bobwhite MPB26RHからの葉肉プロトプラストを、前述のようにポリエチレングリコール(PEG)媒介DNA送達を使用して調製およびトランスフェクトした。
トランスフェクトされたプロトプラストからゲノムDNAを単離し、前述のように、P197をコードするAHAS遺伝子の領域に対して設計されたZFNの切断効率および標的部位特異性を評価するためのPCRアッセイに使用した。アスタリスク(*)で示されるホスホロチオエート連結を含有する5セットのPCRプライマーを使用して、ZFN標的部位遺伝子座を増幅した(表14)。各プライマーセットは、前述の基準に従い設計された。
トランスフェクトされた葉肉プロトプラストのために調製された試料ライブラリのためのIlluminaショートリード配列データの生成後、バイオインフォマティクス分析(前述の通り)を行って、標的ZFN部位における欠失したヌクレオチドを同定した。そのような欠失は、非相同末端結合(NHEJ)DNA修復から得られる植物体内ZFN活性の指標であることが知られている。
相同性指向性DNA修復によるコムギ(Triticum aestivum)細胞のゲノム内の内因性AHAS遺伝子座におけるZFN媒介逐次的外因性マーカー不含導入遺伝子スタッキングの、トランジェントアッセイを使用した分子的な証拠の生成が、以下のように達成された。
小麦における内因性AHAS遺伝子は、1つ以上の導入遺伝子が同じゲノム位置に正確に位置した植物を生成するための、ZFN媒介外因性マーカー不含形質転換系を開発するためのモデル遺伝子座として選択された。形質転換系は、グループB除草剤に対する耐性を付与するAHAS遺伝子における既知の変異を利用することにより、複数の部分ゲノムにわたる複数の対立遺伝子での同時並行または逐次的スタッキングを含む、正確に同じゲノム位置での並行的(1つ以上の導入遺伝子の同時組み込み)または逐次的スタッキング(1つ以上の導入遺伝子の連続的組み込み)を可能とする。ドナーDNAの野生型(除草剤感受性)AHAS遺伝子座へのZFN媒介組み込みを使用して、イミダゾリノンに対する耐性を付与する内因性AHAS遺伝子に、導入遺伝子(複数可)および変異が導入され、そのようにして、イミダゾリノン選択試薬を使用した正しく標的化された植物の再生が可能となる。AHAS遺伝子座における第2の導入遺伝子(複数可)のスタッキングは、1つ以上の追加の導入遺伝子を導入し、イミダゾリノンに対する感受性を付与するがスルホニル尿素には耐性を付与するドナーDNAの組み込みにより達成され、そのようにして、スルホニル尿素選択試薬を使用した正しく標的化された植物の再生が可能となる。第3の導入遺伝子のスタッキングは、さらなる導入遺伝子(複数可)を導入し、スルホニル尿素に対する感受性およびイミダゾリノンに対する耐性を付与するドナー分子の組み込みにより達成することができ、そのようにして、イミダゾリノン選択試薬を使用した正しく標的化された植物の再生が可能となる。したがって、イミダゾリノンおよびスルホニル尿素選択試薬の間の異なるサイクルで内因性AHAS遺伝子において導入遺伝子(複数可)および変異を導入するドナーDNAの使用により、逐次的導入遺伝子スタッキングの継続的ラウンドが可能である。導入遺伝子は、AHAS遺伝子内に組み込み、NHEJ経路を介してスタックすることができる。NHEJ修復および組み換え経路は、ドナー導入遺伝子の設計により決定され得る。一実施形態において、AHAS遺伝子内に組み込まれスタックされる導入遺伝子は、ペイロード(例えば、AHAS変異および目的遺伝子)に隣接する単一または二重切断ZFN部位を含有するように設計される。したがって、そのような設計は、染色体内へのドナーポリヌクレオチドの組み込みおよびスタッキングのために、NHEJ経路を使用する。
AHAS(P197S)発現およびPAT選択カセットを含有するバイナリベクターpDAS000164(配列番号:326、図16)を設計し、当該技術分野において一般的に知られている技術および技法を使用してアセンブルした。AHAS(P197S)発現カセットは、トウモロコシ(Zea mays)由来ユビキチン(Ubi)遺伝子からのプロモーター、5’非翻訳領域およびイントロン(Toki et al., (1992) Plant Physiology, 100; 1503−07)に続く、プロリン(P)からセリン(S)へのアミノ酸変化を誘導するためにCからTに変異したヌクレオチド511を有するコムギ(T. aestivum)品種Bobwhite MPB26RHからのAHAS遺伝子のコード化配列(1935bp)からなる。AHAS発現カセットは、A.ツメファシエンスpTi15955からのノパリンシンターゼ遺伝子(nos)を含む3’非翻訳領域(UTR)を含んでいた(Fraley et al., (1983) Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 80(15): 4803−4807)。選択カセットは、アジアイネ(Oryza sativa)由来アクチン1(Act1)遺伝子からのプロモーター、5’非翻訳領域およびイントロン(McElroy et al., (1990) The Plant Cell 2(2): 163−171)に続く、ホスフィノトリシン、グルホシネート、およびビアラホスを含むグルタミン合成酵素の阻害剤に対する抵抗性を付与するタンパク質をコードする、ストレプトミセス・ビリドクロモゲネスから単離されたホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ(PAT)遺伝子の合成植物最適化型を含んでいた(Wohlleben et al., (1988) Gene 70(1): 25−37)。このカセットは、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)の35S遺伝子からの3’UTRで終端された(Chenault et al., (1993) Plant Physiology 101 (4); 1395−1396)。
スルホニル尿素クラス除草剤に対する耐性を付与するAHAS(P197S)変異を発現する小麦植物を再生するための最適な選択条件を決定するために、一連の実験を行った。これらの実験は、確立された小麦形質転換系のカルス誘導、植物再生および発根段階における、野生型ドナー小麦系統品種Bobwhite MPB26RH(スルホニル尿素に対する感受性を付与するP197/P197遺伝子型)の基本的耐性の試験に基づいた。スルホニル尿素選択試薬に対する耐性を付与するAHAS(P197)変異を発現するT−DNAが無作為に組み込まれたトランスジェニック品種Bobwhite MPB26RHイベントの基本的耐性を決定するために、同様の実験を行った。
第1ラウンドの導入遺伝子スタッキングのためのドナーDNAは、ZFN媒介NHEJ指向性修復による内因性AHAS遺伝子座における正確なドナー組み込みを促進するように設計される。設計は、ZFN29732および29730(プラスミドpDAB109350上にコードされている)による内因性AHAS遺伝子の同祖コピーの切断により形成された2本鎖DNA切断の位置における、2本鎖ドナー分子の組み込みに基づく。ドナー分子(pDAS000433;配列番号:333、図17)は、ポリヌクレオチド配列のいくつかの部分を含む。5’末端は、標的ZFN切断部位から開始してAHAS停止コドンで終了する、D−ゲノム内にコードされた内因性AHAS遺伝子とほぼ同一の配列を含有する。7つの意図的変異をこの配列に導入するが、2つの変異は、S653N変異およびZFN29732の結合部位にわたって位置する5つのコドン最適化同義変異をコードし、組み込まれたドナーの再切断を防止する。停止コドンの後に、AHAS同祖体にわたる保存された3’非翻訳領域(3’UTR)に対応する316bpの非コード化配列がある。3’UTR配列の後に、ZFN34480および34481(プラスミドpDAB111860上にコードされている)ならびにZFN34482および34483(プラスミドpDAB111861上にコードされている)に対するジンクフィンガー結合部位がある。これらのジンクフィンガー結合部位は、次のラウンドの導入遺伝子スタッキング中に内因性遺伝子座において組み込まれたドナー由来AHAS(コード化および3’UTR)配列の自己離断を可能にする。自己離断ジンクフィンガー結合部位の後に、2つの固有の制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接し、ドナー分子への導入遺伝子発現カセット(例えば、前述のようなPAT発現カセット)の挿入を可能にする、いくつかの追加的なジンクフィンガー結合部位(そのそれぞれは100bpの無作為配列により隔てられている)がある。追加的なジンクフィンガー結合部位は、逐次的マーカー不含導入遺伝子スタッキングにより、または交互スタッキング方法を使用した同じゲノム位置における継続的な逐次的導入遺伝子スタッキングにより、AHAS遺伝子座において組み込まれた導入遺伝子の将来の離断を可能にする。
第2ラウンドの導入遺伝子スタッキングのためのドナーDNAは、ZFN媒介NHEJ指向性修復による第1の導入遺伝子スタックにおいて標的化される同じAHAS遺伝子座における正確なドナー組み込みを促進するように設計される。設計は、ZFN34480および34481(プラスミドpDAB111860上にコードされている)またはZFN34482および34483(プラスミドpDAB111861上にコードされている)による第1のスタックされた導入遺伝子を含有するAHAS遺伝子コピーの切断によって形成された2本鎖DNA切断における、2本鎖ドナー分子の組み込みに基づく。ドナー分子(pDAS000434;配列番号:334、図18)は、ポリヌクレオチド配列のいくつかの部分を含む。5’末端は、標的ZFN切断部位から開始してAHAS停止コドンで終了する、D−ゲノム内にコードされた内因性AHAS遺伝子とほぼ同一の配列を含有する。いくつかの意図的変異、すなわちP197S変異ならびにZFN34481および34483の結合部位にわたって位置するコドン最適化同義変異をこの配列に導入し、組み込まれたドナーの再切断を防止する。停止コドンの後に、AHAS同祖体における保存された3’非翻訳領域(3’UTR)に対応する316bpの非コード化配列がある。3’UTR配列の後に、ZFN34474および34475(プラスミドpDAB111857上にコードされている)ならびにZFN34476および34477(プラスミドpDAB111858上にコードされている)に対するジンクフィンガー結合部位がある。これらのジンクフィンガー結合部位は、次のラウンドの導入遺伝子スタッキングにおいて内因性遺伝子座に組み込まれたドナー由来AHAS(コード化および3’UTR)配列の自己離断を可能にする。自己離断ジンクフィンガー結合部位の後に、固有の制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接し、導入遺伝子発現カセット(例えば、特許出願第13757536号に記載のようなDGT−28発現カセット)の挿入を可能にする、いくつかの追加的なジンクフィンガー結合部位(そのそれぞれは100bpの無作為配列により隔てられている)がある。追加的なジンクフィンガー結合部位は、逐次的マーカー不含導入遺伝子スタッキングにより、または交互スタッキング方法を使用した同じゲノム位置における継続的な逐次的導入遺伝子スタッキングにより、AHAS遺伝子座において組み込まれ得る導入遺伝子の将来の離断を可能にする。ドナーカセットは、商業的遺伝子サービス業者により(例えば、GeneArt、Life Sciences)、内因性AHAS遺伝子座の切断後に、ZFN34474および34475(プラスミドpDAB111857上にコードされている)またはZFN34476および34477(プラスミドpDAB111858上にコードされている)により生成された連結オーバーハングに適合する、突出した5’および3’末端を有するドナー分子の生成を可能とするために、5’および3’末端における短く伸びた追加的な隣接配列を有するように合成される。突出した5’および3’末端を有するドナー分子は、当業者に知られている標準的方法を使用して、ドナー分子を含有するプラスミドDNAを、制限エンドヌクレアーゼBbsIで消化させることにより生成される。
ドナーpDAS000433ならびにZFN29732および29730(プラスミドpDAB109350上にコードされている)を用いた形質転換による外因性マーカー不含逐次的導入遺伝子スタッキングによって、同じ内因性AHAS遺伝子座にスタックされた複数の導入遺伝子によるトランスジェニック小麦イベントが生成される。正確なZFN媒介NHEJ指向性ドナー組み込みにより、第1の導入遺伝子およびイミダゾリノンに対する耐性を付与するS653N変異がAHAS遺伝子座に導入され、そのようにして、前述のようにIMAZAMOX(登録商標)を選択試薬として使用した正しく標的化された植物の再生が可能となる。図19aは、その組み込みを示す。ドナーpDAS000434ならびにZFN34480および34481(プラスミドpDAB111860上にコードされている)を用いた、第1の導入遺伝子のスタックイベントに由来する小麦細胞のその後の形質転換は、P197の上流側に位置するZFN結合部位と、ドナー分子による第1の導入遺伝子スタックの間に組み込まれた自己離断部位との間に位置する内因性クロマチンの置き換えをもたらす。これは、第2の導入遺伝子およびスルホニル尿素に対する耐性を付与するP197S変異の組み込みをもたらし、そのようにして、スルホメツロンメチルを選択試薬として使用した正しく標的化された植物の再生が可能となる。同時に、第2のドナーの組み込みによりS653N変異が除去され、そのようにしてイミダゾリノンに対する感受性が回復する(図19B)。第3の導入遺伝子のスタッキングは、適切なジンクフィンガーヌクレアーゼ、ならびに追加的な導入遺伝子を含有し、スルホニル尿素に対する感受性およびイミダゾリノンに対する耐性を付与するドナーを用いた形質転換により達成することができ、そのようにして、IMAZAMOX(登録商標)を選択試薬として使用した正しく標的化された植物の再生が可能となることが、当業者に理解される。したがって、イミダゾリノンおよびスルホニル尿素選択試薬の間の異なるサイクルで内因性AHAS遺伝子において導入遺伝子および変異を導入するドナーを用いた形質転換により、逐次的導入遺伝子スタッキングの継続的ラウンドが可能である。
第1ラウンドの導入遺伝子スタッキングのためのドナーDNAは、ZFN媒介修復による内因性AHAS遺伝子座における正確なドナー組み込みを促進するように設計される。設計は、ZFN29732および29730(プラスミドpDAB109350上にコードされている)による内因性AHAS遺伝子の同祖コピーの切断により形成された2本鎖DNA切断の位置における、2本鎖ドナー分子の組み込みに基づく。ドナー分子(pDAS000435;配列番号:335、図21)は、配列がpDAS000433(配列番号:333)と同一である。
ドナーpDAS000435ならびにZFN29732および29730(プラスミドpDAB109350上にコードされている)を用いた形質転換による外因性マーカー不含逐次的導入遺伝子スタッキングによって、同じ内因性AHAS遺伝子座にスタックされた複数の導入遺伝子によるトランスジェニック小麦イベントが生成される。正確なZFN媒介HDR指向性ドナー組み込みにより、第1の導入遺伝子およびイミダゾリノンに対する耐性を付与するS653N変異がAHAS遺伝子座に導入され、そのようにして、前述のようにIMAZAMOX(登録商標)を選択試薬として使用した正しく標的化された植物の再生が可能となる。図20aは、その組み込みを示す。ドナーpDAS000436ならびにZFN34480および34481(プラスミドpDAB111860上にコードされている)を用いた、第1の導入遺伝子のスタックイベントに由来する小麦細胞のその後の形質転換は、P197の上流側に位置するZFN結合部位と、ドナー分子による第1の導入遺伝子スタックの間に組み込まれた自己離断部位との間に位置する内因性クロマチンの置き換えをもたらす。これは、第2の導入遺伝子およびスルホニル尿素に対する耐性を付与するP197S変異の組み込みをもたらし、そのようにして、スルホメツロンメチルを選択試薬として使用した正しく標的化された植物の再生が可能となる。同時に、第2のドナーの組み込みによりS653N変異が除去され、そのようにしてイミダゾリノンに対する感受性が回復する(図20b)。当業者には明らかなように、第3の導入遺伝子のスタッキングは、適切なジンクフィンガーヌクレアーゼ、ならびに追加的な導入遺伝子を含有し、スルホニル尿素に対する感受性およびイミダゾリノンに対する耐性を付与するドナーを用いた形質転換により達成することができ、そのようにして、IMAZAMOX(登録商標)を選択試薬として使用した正しく標的化された植物の再生が可能となる。したがって、イミダゾリノンおよびスルホニル尿素選択試薬の間の異なるサイクルで内因性AHAS遺伝子において導入遺伝子および変異を導入するドナーを用いた形質転換により、逐次的導入遺伝子スタッキングの継続的ラウンドが可能である。
ドナーDNAおよびジンクフィンガーヌクレアーゼ構築物を用いた形質転換により生成されるコムギ(Triticum aestivum)イベントは、標的内因性遺伝子座の1つ以上のコピーにおけるドナー分子配列の組み込みをもたらす。以前に示したように、ZFN媒介ゲノム修飾は、複数の部分ゲノムにわたる複数の対立遺伝子の同時編集を含み得る。その後、形質転換イベントの人工交雑が、正確なゲノム修飾の特定の組み合わせを選択するために使用され得る。例えば、S653N変異で正確に修飾されたAHAS遺伝子を有する、生成された形質転換イベントの人工交雑を使用して、特定の部分ゲノム上、複数の部分ゲノム上、または3つ全ての部分ゲノム上にS653N変異を有する小麦植物を生成することができる。その後の形質転換イベントの人工交雑は、正確なゲノム修飾の特定の組み合わせを有する植物の生成を促進する。当業者は、例えば前述のような分子アッセイを展開して、その後の世代における人工交雑の間の特定のゲノム修飾の遺伝を追跡することができる。
Fad3CおよびFad3Aに特異的なジンクフィンガー結合ドメインの選択
同祖Fad3遺伝子の転写された領域を同定および特性決定し、本明細書に記載のドナー配列のNHEJ媒介標的化のためのそれらの部位を結合および切断するように設計されたジンクフィンガーヌクレアーゼを、設計および構築した。参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許番号第61/697,854号を参照されたい。Fad3配列の同祖体からのDNA配列に指向性のジンクフィンガータンパク質(ZFP)を設計し、米国仮特許番号第61/697,854号において以前に説明されたように試験した。的確な活性を示すZFNから、Fad3標的を高効率で切断するジンクフィンガータンパク質を選択した:ZFP28051−2A−28052は、配列番号:336 5’−GCCCAAGGAACCCTTTTCTGGGCCATCTTCGTACTCGGCCACGACTGGTAATTTAAT−3’を認識し、Fad3Cゲノム遺伝子座を特異的に結合および切断することが以前に示された。同様に、ジンクフィンガータンパク質28053−2A−28054は、配列番号:337 5’−AGCGAGAGAAAGCTTATTGCAACTTCAACTACTTGCTGGTCGATCGTGTTGGCCACTC−3’を認識し、Fad3AおよびFad3Cゲノム遺伝子座を特異的に結合および切断することが以前に示された。ZFP認識へリックスに接触する標的部位におけるヌクレオチドを、表16に示す。
Fad3ジンクフィンガー設計は、CCHC構造を有する少なくとも1つのフィンガーを有するタンパク質をコードするジンクフィンガー発現ベクター内に組み込まれた(米国特許公開第2008/0182332号)。具体的には、各タンパク質における最後のフィンガーは、認識へリックスのCCHC骨格を有していた。非正準ジンクフィンガーコード化配列を、IIS型制限酵素FokIのヌクレアーゼドメイン(Wah et al., (1998) Proc. Natl. Acad.Sci. USA 95:10564−10569の配列のうち、アミノ酸384−579)に、4アミノ酸ZCリンカーおよびsop2核局在化シグナルを介して融合させた。Thosea asignaウイルスからのヌクレオチド配列をコードする自己加水分解性2A(Szymczak et al., 2004)を、2つのジンクフィンガーヌクレアーゼ融合タンパク質の間に添加した。ZFNの発現は、キャッサバ葉脈モザイクウイルス(Cassava Vein Mosaic Virus)からの強力な構成的プロモーターおよび5’非翻訳領域(UTR)により主導され(Verdaguer et al, Plant Molecular Biology 1996, 31(6); 1129−1139)、これには、アグロバクテリウム・ツメファシエンスpTi15955のオープンリーディングフレーム23(ORF23)からの3’UTR(転写ターミネーターおよびポリアデニル化部位を含む)が隣接していた(Barker et al., Plant Molecular Biology 1983, 2(6); 335−50)。
Fad3へのDNAの組み込みの2つの戦略、すなわち発現カセットが単一ZFN誘導2本鎖切断内に挿入される遺伝子スプライシング、および遺伝子の一部が2つのZFN誘導2本鎖切断の使用により除去され、ギャップを修復するために発現カセットが挿入される遺伝子編集を行った。
葉肉由来プロトプラストを、セイヨウアブラナ(Brassica napus)(DH10275)の3週齢無菌苗条培養物から単離した。対応する種を本明細書に記載の方法に従い発芽させた。70%エタノールを1分間使用して種を表面殺菌し、穏やかに振とうし、続いて滅菌再蒸留水中で3〜4回濯いだ。その後、20%漂白剤および10μlのTween20を使用して殺菌した。種をさらに卓上振とう機上で約100RPMで15分間漂白剤で処理し、続いて滅菌再蒸留水中で3〜4回濯ぎ、種を滅菌濾紙に慎重に移して過剰の水分を除去し、種発芽培地(1/2強度MS/B5ビタミン+1%スクロース+0.8%寒天、pH5.8)上に播種した。
インビトロ成長DH12075セイヨウアブラナ(Brassica napus)植物を、葉肉プロトプラストを単離するための外植片源として使用した。プロトプラストを単離するために、3〜4週齢の小植物からの第3から第4の上部の完全に開いた葉を、鋭いメスを用いてプロトプラスト単離用の小ストリップ(0.5〜1mm)に切断した。250〜500mgの葉材を、25mlの消化緩衝液(K4培地に溶解した1.2%(w/v)セルラーゼ「ONOZUKA(商標)」R10および0.2%(w/v)MACEROZYME(登録商標)R10(供給元−Duchefa))で処理することにより、酵素消化を行った(Spangenberg et al., 1998)。葉材および消化緩衝液を含有するPETRI(商標)皿を、PARAFILM(商標)で封止し、室温で12〜15時間、暗所でインキュベートした。一晩のインキュベーション後、消化物をBD(登録商標)細胞濾過器(メッシュサイズ70μm)を通して濾過した。14mlの丸底管内に収集されたプロトプラスト懸濁液(5〜6ml)の上に、1mlのW5洗浄緩衝液(154mM NaCl、125mM CaCl2、5mM KClおよび5mMグルコース;pH5.8、Menzel et al. (1981))を重ねた。
プロトプラストの収量を、Sambrook and Russell, (2006)の方法に従い、血球計を使用して評価した。細胞の生存能力を、Huang et al.(1996)により説明されるように、プロトコルにいくつか小さな修正を加えて、0.5Mのマンニトールに溶解した400mg/LのEvansブルー染料を使用して試験した。
セイヨウアブラナ(B. napus)プロトプラストへの送達前に、各ドナーおよびZFN構築物のプラスミドDNAを、大腸菌の培養物から、供給業者の説明に従いPURE YIELD PLASMID MAXIPREP SYSTEM(登録商標)(Promega Corporation、Madison、WI)を使用して調製した。ドナーおよびZFNプラスミドDNAのアリコートは、1:1(30μgの各プラスミド)、5:1(ドナープラスミド対ZFNプラスミド、全部で30μgまでのプラスミドDNA )および10:1(ドナープラスミド対ZFN プラスミド、全部で30μgまでのプラスミドDNA)の3つのモル比で調製した。さらに、ドナーのみ、およびZFNのみのアリコート(30μg)を対照として調製した。PEG4000媒介形質転換によりセイヨウアブラナ(B. napus)プロトプラストに送達されたDNAの量を、表17に要約する。
トランスフェクトされたプロトプラストを埋没させる前に、400RPMで10分間遠心分離し、W5緩衝液を慎重に除去した。次いで、プロトプラストを1.0mlの0.5Mマンニトール中に再懸濁させ、氷上でインキュベートした。これに、等体積の1.0%アルギン酸ナトリウムを添加し、穏やかに混合した。プロトプラスト懸濁液を、埋没するまで氷上でインキュベートした。血清用ピペットを使用して、ビーズ形成溶液(0.4Mマンニトール+50mM CaCl2(pH5.8))を、滅菌6ウェルプレートに移した(ウェル当たり3〜4ml)。1mlピペットを使用して、正確に1.0mlのプロトプラスト懸濁液をビーズ形成溶液に滴下により添加し、ウェル当たりそれぞれのトランスフェクトされた試料(約5×105プロトプラスト)を埋没させた。プロトプラスト懸濁液を室温で1〜2時間インキュベートして、アルギン酸ナトリウムビーズを形成した。インキュベーション期間後、ビーズ形成溶液を慎重に除去し、1.5mg/Lのハイグロマイシンを添加したK3+H:A培地(Spangenberg et al 1998)の1:2混合物4〜5mlと置き換えた。振とう機(50RPM)内で、プロトプラストを22℃で3〜4週間、暗所で培養した。3〜4週間後、解重合緩衝液(0.3Mマンニトール+20mMクエン酸ナトリウム(pH5.8))で処理することにより抵抗性マイクロカルス(0.5〜1.0mm)が放出された。液体培地を除去した後、3〜4mlの解重合緩衝液を、ビーズ型培養物を含有する各ウェルに添加し、室温で2時間インキュベートした。滅菌鉗子を使用してビーズを穏やかに混合し、マイクロカルスの効率的放出を促進した。次に、滅菌1.0mlピペットを使用して、解重合緩衝液中に放出されたゲル化剤を穏やかに混合し、その後除去した。5mlの液体A培地を使用してマイクロカルスを2回洗浄し、十分な量の液体A(1mlの沈殿細胞体積(SCV:これは全ての放出されたマイクロカルスを滅菌50または15mlファルコン管に移し、5分間沈殿させた後に測定された)に対し50mlの液体Aを使用した)にマイクロカルスを再懸濁させた。マイクロカルスを均一に混合した後、液体A培地に懸濁した0.5mlのマイクロカルスをB1培地(MS/MSビタミン+3.5%スクロース+500mg/L MES+BAP(5μm)+NAA(5μm)+2,4−D(5μm)+1.5mg/Lハイグロマイシン+0.7%アガロースI型(pH6.0)100×20mm滅菌PETRI(商標)皿に注いだもの)に移し、1〜2mlの追加の液体A培地を使用して、マイクロカルスをB1培地内に均一に分布させ、過剰の液体A培地を各プレートから慎重に除去した。プレートをマイクロポアテープを使用して封止し、これにより胚成熟が促進された。培養物を16時間/日の光(30μmol m−2 s−1)で22℃で維持した。
2〜3週間のインキュベーション後、ハイグロマイシン抵抗性コロニーをB1培地(SAおよびSP法の両方から得られたマイクロカルス)から採取し、B2培地(MS/MSビタミン+3.0%スクロース+500mg/L MES+500mg/L PVP+5mg/L硝酸銀+5mg/L 2iP+NAA(0.5μm)+GA−3(0.3μm)+1.5mg/Lハイグロマイシン+0.7%アガロースI型(pH5.8)、100×20mm滅菌PETRI(商標)皿に注いだもの)に移した。プレート当たり約25〜30のカルスを置き、PARAFILM(商標)を使用してプレートを封止し、16時間/日の光(30μmol m−2 s−1)で22℃でインキュベートした。その後、2週間間隔の5〜6ラウンドのB2中での二次培養後に、ハイグロマイシン抵抗性コロニーを回収した。プレート当たりのカルスの数は、第3ラウンドの二次培養後に12〜15に低減された。10〜12週間後に現れた苗条原基を残留カルスと共に慎重に回収し、苗条伸長培地(MS/B5ビタミン+2%スクロース+500mg/L MES+BAP(2μm)+GA−3(0.1μm)+300mg/Lチメンチン+1.5mg/Lハイグロマイシン+0.8%寒天(pH5.8)、250mlの培養容器に注いだもの)に移した。2〜3ラウンドのハイグロマイシン選択後に生存した苗条を発根培地(1/2強度MS/B5ビタミン+1%スクロース+500mg/L MES+IBA(2.5μm)+1.5mg/Lハイグロマイシン+0.6%寒天(pH 5.8)、700ml培養容器に注いだもの)に移した。
トランスフェクトされたプロトプラストを、3cm PETRI(商標)皿から2mL微量遠心管に移した。細胞を70gでの遠心分離によりペレット化し、上澄みを除去した。トランスフェクトされたプロトプラストの回収を最大化するために、PETRI(商標)皿を1mLの洗浄緩衝液で3回濯いだ。各濯ぎは、洗浄緩衝液をPETRI(商標)皿内で1分間旋回撹拌し、続いて液体を同じ2mlの微量遠心管に移すことにより行った。各濯ぎの最後に、細胞を70gでの遠心分離によりペレット化し、上澄みを除去した。ペレット化されたプロトプラストを液体窒素中で急速凍結してから、LABCONCO FREEZONE 4.5(登録商標)(Labconco、Kansas City、MO)内で−40℃および133×10−3mBarの圧力で24時間フリーズドライした。凍結乾燥された細胞を、製造者の説明に従いDNEASY(登録商標)PLANT DNA EXTRACTION MINIキット(Qiagen)を使用してDNA抽出に供し(但し組織破壊は必要ではない)、プロトプラスト細胞を溶解緩衝液に直接添加した。
個々のカルスを液体窒素中で急速凍結してから、LABCONCO FREEZONE 4.5(登録商標)(Labconco、Kansas City、MO)内で−40℃および133×10−3mBarの圧力で24時間フリーズドライした。凍結乾燥されたカルスを、製造者の説明に従いDNEASY(登録商標)PLANT DNA EXTRACTION MAXIキット(Qiagen、Hilden、Germany)を使用してDNA抽出に供した。
再生された植物からの30mgの若い葉組織を液体窒素中で急速冷凍してから、LABCONCO FREEZONE 4.5(登録商標)(Labconco、Kansas City、MO)内で−40℃および133×10−3mBarの圧力で24時間フリーズドライした。凍結乾燥されたカルスを、製造者の説明に従いDNEASY(登録商標)PLANT DNA EXTRACTION MAXIキット(Qiagen、Hilden、Germany)を使用してDNA抽出に供した。
セイヨウアブラナ(B. napus)のFad3C遺伝子に対するドナーDNAの組み込みの検出を、一連のPCRにより行ったが、少なくとも1つのプライマーはFad3C遺伝子座に特異的であり(表18)、第2のプライマーはgfpカセットのプロモーターまたはターミネーターのいずれかに特異的であった(表18および図28A)。最後の塩基対が、Fad3Cゲノム配列をFad3遺伝子の他のコピーから差別化するSNPに整列させ、アスタリスク(*)により示されるこの塩基対の前のホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含むオリゴヌクレオチドを設計することにより、特異性が得られた。この設計は、校正活性を有するポリメラーゼと組み合わせて使用すると、各Fad3CまたはFad3A対立遺伝子の特異的増幅を誘導し、述べたような他のFad3コピーを除外した。各プライマーセットは、野生型セイヨウアブラナ(B. napus)から得られたPCR増幅産物のサンガーベースの配列決定により、正しい遺伝子コピーの増幅に関して実験的に試験された。
ゲノムDNAを、機能性tGFPレポーターカセット(pDAS000341もしくはpDAS000343)をコードするドナーDNA、ZFN DNA(pDAB107827もしくはpDAB107828)またはドナーおよびZFN DNAの混合物が24時間前に送達されたプロトプラストプール(プール当たり100万プロトプラスト)から抽出した。形質転換のために送達されたDNAの量は、上述の通りである。PCR産物は、プラスミドベクターにクローニングされた。ゲノム編集は、プラスミドベクターへのクローニングにより、各細胞において独立して生じ、様々な異なる挿入イベントを引き起こし、各ゲノム編集は、明確に配列決定され得る。いくつかのクローンを、ABI3730XL(登録商標)自動化キャピラリー電気泳動プラットフォーム上で配列決定した。遺伝子配列の分析は、SEQUENCHER SOFTWARE V5.0(商標) (GeneCodes、Ann Arbor、MI)を使用して行った。
Fad3C遺伝子座のスプライシングおよび編集のさらなる証拠は、hphカセットをコードするドナーDNA(pDAS000340もしくはpDAS000342)、ZFN DNAのみ(pDAB107827もしくはpDAB107828)またはドナーおよびZFN DNAが送達された(送達されるDNAの量は表17に示される)選択後のプロトプラストから再生された(上述のように1.5mg/Lハイグロマイシン)カルス組織から得られた。プロトプラストトランスフェクションから4週間後に、カルスが生存しなかった編集の1:1:1を除く各比に対して約80のカルスからDNAを抽出した。
プロトプラストから再生された植物からDNAを抽出し、栽培培地に移した(上述の通り)。回収された植物の過半数は、ドナーDNAにコードされたhphカセットのわずか1〜2つのコピーを含有すると推定された。カルス組織について説明したのと同じ一連のアッセイ、およびカセットがアンチセンス方向に挿入された、またはドナーがFad3A遺伝子座で組み込まれたかを決定するためのアッセイにより、植物を分析した。
遺伝子標的化のための内因性ゲノム遺伝子座の特性決定
Corn Event DAS−59132のゲノム遺伝子座は、国際特許出願第WO2009/100188A2号に記載されている。Corn Event DAS−59132は、Cry34Abl、Cry35Abl、およびPAT導入遺伝子発現カセットを含む。これらの導入遺伝子発現カセットは、全長T鎖挿入物として、Hi−IIトウモロコシ生殖質のB73トウモロコシゲノム由来領域の染色体8に組み込まれた(D.D.Songstad, W.L.Petersen, C. L.Armstrong, American Journal of Botany, Vol. 79, pp. 761−764, 1992)。さらに、トランスジェニック遺伝子座の周囲のゲノムDNAは、天然B73配列に比べ任意の大きな欠失を有さず、一般に、単一の小さな反復要素以外の反復要素を含まない。
Corn Event DAS−59132に対するゲノム遺伝子座を含むDNA配列に対して指向性であるジンクフィンガータンパク質(図32を参照されたい)を、前述のように設計した。例えば、Urnov et al. (2005) Nature 435:646−651を参照されたい。例となる標的配列および認識へリックスを、表25A(認識へリックス領域設計)および表25B(標的部位)に示す。表25Bにおいて、ZFP認識へリックスに接触する標的部位におけるヌクレオチドは大文字で示されている。
実施例2に記載のように酵母アッセイを使用して同定された、4つの例となるジンクフィンガーヌクレアーゼのZFN発現構築物を含有するプラスミドベクターを設計し、当該技術分野において一般的に知られている技術および技法を使用して完成させた。各ジンクフィンガーコード化配列を、ジンクフィンガーヌクレアーゼの上流側に位置するopaque−2核局在化シグナルをコードする配列に融合させた(Maddaloni et al. (1989) Nuc.Acids Res.17(18):7532)。
トウモロコシHi−II胚発生培養物を、米国特許第7,179,902号に記載のように生成し、異なるZFNの効率を評価および試験するために使用した。pDAB105901、pDAB105902、pDAB105903、pDAB105904、pDAB105905およびpDAB105906からなるプラスミドDNAを、トウモロコシカルス細胞に一時的に形質転換して、米国特許出願第2011/0119786号に記載のようにトウモロコシゲノム内のイノシトールポリリン酸2−キナーゼ遺伝子座に対して設計された標準的な被試験ZFN、pDAB7430に対する異なるZFNの切断頻度を比較した。
一時的に形質転換されたトウモロコシカルス組織を分析して、ジンクフィンガーヌクレアーゼタンパク質の切断効率を決定した。
ZFN構築物および2つの対照ベクター、pDAB100664およびpDAB100665で一時的に形質転換されたトウモロコシカルス組織を、2mLのEPPENDORF(商標)管に収集し、48時間凍結乾燥した。製造者の仕様書に従い、QIAGEN PLANT DNA EXTRACTION KIT(商標)(Valencia、CA)を使用して、凍結乾燥された組織からゲノムDNA(gDNA)を抽出した。単離されたgDNAを200μlの水に再懸濁し、NANODROP(登録商標) 分光光度計(Invitrogen、Carlsbad、CA)を使用して濃度を決定した。0.8%アガロースE−ゲル(Invitrogen)上で全ての試料を泳動することにより、DNAの完全性を推定した。全てのgDNA試料は、PCR増幅のために正規化し(25ng/μl)、ILLUMINA(商標)配列決定(San Diego、CA)により分析される単位複製配列を生成した。
ZFNを、トランスジェニックCorn Event DAS−59132のゲノム遺伝子座内の特定のDNA配列を認識、結合および修飾するように設計した。4つのZFNがゲノム遺伝子座を切断する効率を分析して、どのZFNが最も効率的に切断したかを決定した。ILLUMINA(商標)配列決定は、Cofactor Genomics(St. Louis、MO)において行われ、配列分析スクリプトを使用して配列が分析された。低品質の配列はフィルタにより除去し、固有DNA配列識別子に従い残った配列を解析した。次いで、固有DNA配列識別子を参照配列と整列させ、挿入/欠失(インデル)についてスコア化した。切断活性のレベルを決定するために、ZFN切断部位の周囲の領域を、INDELから得られた配列改変体の存在についてスコア化した。研究における各ZFNの切断活性は、インデルを有する配列/1M高品質配列の数として、またはインデルを有する高品質配列のパーセントとして計算された。次に、米国特許公開第2011/0119786号に記載のIPP2−K遺伝子に指向されたZFNの活性で切断活性のZFNレベルを正規化することにより、切断効率のレベルが決定された。図36および表27は、試験されたZFNの切断効率を示す。
Corn Event DAS−59132の内因性ゲノム遺伝子座を標的化し、トウモロコシにおけるドナー標的化パラメータを最適化するために、遺伝子標的化のためのシステムを確立した。Corn Event DAS−59132におけるゲノム内に2本鎖切断を形成し、非相同末端結合(NHEJ)または相同性依存的修復(HDR)により修復した。
トウモロコシHi−II胚発生懸濁培養物を得、3.5日維持スケジュールで維持した。50mLの滅菌円錐管内で、10mLの滅菌6%(w/v)セルラーゼ溶液および10mLの滅菌0.6%(w/v)ペクトリアーゼ酵素溶液を、10mLピペットチップを使用して円錐管内に滴下した。次に、消化溶液を含有する50mLの管内に4充填細胞容積(PCV)のHi−II懸濁細胞を添加し、パラフィルムで包装した。管をプラットフォームロッカー上に一晩室温で約16〜18時間置いた。翌朝、管を振とう機から取り出した。滅菌50mL円錐管内で、細胞および酵素溶液を100μm細胞濾過器を通してゆっくりと濾過した。次に、100μm細胞濾過器を使用して、濾過器を通して10mLのW5培地を滴下することにより、細胞を濯いだ。滅菌50mL円錐管内で、細胞および酵素溶液を70μm細胞濾過器を通してゆっくりと濾過した。この濾過ステップに続いて、第2の濾過ステップを行い、40μm細胞濾過器を通して細胞および酵素溶液を50mL円錐管内にゆっくりと濾過した。10mLピペットチップを使用して、40μm細胞濾過器を10mLのW5培地で濯いで40mLの最終体積とし、管を反転させた。非常にゆっくりと、8mLのスクロースクッションをプロトプラスト/酵素溶液の底に添加した。スイングアーム式バケットロータを備える遠心分離機を使用して、管を1500rpmで15分間回転させた。5mLの狭口径ピペットチップを使用して、プロトプラスト細胞を除去した。プロトプラストベーンとして観察されるこれらの細胞(7〜8mL)を非常にゆっくりと除去し、滅菌50mL円錐管内に入れた。次に、25mLのW5培地を使用して、管を洗浄した。W5培地を添加し、管をゆっくりと反転させ、1500rpmで10分間遠心分離した。上澄みを除去し、10mLのMMG溶液を添加し、管をゆっくりと反転させてプロトプラストペレットを再懸濁させた。血球計を使用してプロトプラストの密度を決定し、4PCVで約3000万のプロトプラストが得られた。
MMG溶液を使用してプロトプラスト細胞をml当たり160万のプロトプラストに希釈した。管をゆっくりと反転させることにより、プロトプラストを静かに再懸濁させた。次に、300μLのプロトプラスト(約500kのプロトプラスト)を滅菌2mL管に添加し、管を反転させてプロトプラスト細胞を均一に分布させた。TE緩衝液中に懸濁させた約40〜80μgの濃度のプラスミドDNAを、プロトプラストに添加した。異なる実験条件を、表28に記載する。管をゆっくり回転させてDNAとプロトプラストを懸濁させ、管を室温で5〜10分間インキュベートした。次に、300μLのPEG溶液をプロトプラスト/DNA溶液に添加した。全てのPEG溶液が添加されたら、管を静かに反転させることによりPEG溶液をプロトプラスト溶液と混合した。定期的に管(複数可)を反転させながら、カクテルを室温で15〜20分間インキュベートした。インキュベーション後、1mLのW5溶液を管にゆっくりと添加し、管を静かに反転させた。最後に、溶液を1000rpmで15分間遠心分離した。細胞ペレットを乱さないように、上澄みを慎重に除去した。最後に、1mLの洗浄/インキュベーション溶液を添加した。管を静かに反転させて、細胞ペレットを再懸濁させた。管をアルミニウム箔で覆っていかなる光への曝露も排除し、管の側面を下にしてラック上に置き、一晩インキュベートした。形質転換から24時間後、分子分析のために細胞を採取した。
上述の次世代配列決定プロトコルを使用して、トウモロコシプロトプラストにおけるZFN切断活性の結果を確認した。配列決定されたPCR増幅断片を、インデルから得られた配列改変体の存在に関してスコア化した。Event 32 ZFN6は、トランスジェニックCorn Event DAS−59132のゲノム遺伝子座を、約1.5%のNHEJ/10ngの標的化単位複製配列で切断した。
トランスジェニックイベントを、Corn Event DAS−59132の内因性ゲノム遺伝子座に標的化した。実施例2に記載の構築物は、ドナー配列(pDAB100655)およびEvent 32 ZFN 6(pDAB105906)を含む。
DNA送達から1週間後、選択剤を含有するGN6(1H)選択培地(N6培地、2.0mg/L 2,4−D、30g/Lスクロース、100mg/L myo−イノシトール、2.5g/Lゲルライト、pH5.8)の60×20mmプレートに、濾紙を移した。これらの選択プレートを、28℃で1週間、暗所でインキュベートした。暗所で1週間の選択後、各プレートからの細胞の1/2を、37〜38℃に保持された3.0mLのGN6アガロース培地(N6培地、2.0mg/L 2,4−D、30g/Lスクロース、100mg/L myo−イノシトール、7g/L SEAPLAQUE(登録商標)アガロース、pH5.8、121℃で10分間オートクレーブ処理された)を含む管内にかき出すことにより、組織を新鮮な培地上に埋没させた。
上述のようにWHISKERS(商標)媒介形質転換から回収された24のイベントを、いくつかの異なる分子確認ツールを使用して分析した。分析の結果、Corn Event DAS−59132ゲノム遺伝子座内に組み込まれた1コピーのAAD−1導入遺伝子を含有するイベントが特定された。まず、24の様々なイベントが、1コピーのAAD−1導入遺伝子を含有することを確認し、次に、イベントを、1コピーのAAD−1導入遺伝子を示唆するCorn Event DAS−59132のゲノム遺伝子座がNHEJによりトウモロコシ細胞のゲノム内に組み込まれたかどうかを決定するために分析した。Corn Event DAS−59132のゲノム遺伝子座内に1コピーのAAD−1導入遺伝子を含有することが特定されたイベントを、さらにイン−アウトPCRおよびサザンブロット反応により確認した。これらのアッセイにより、イベントが、NHEJ機構によりCorn Event DAS−59132ゲノム遺伝子座内に組み込まれた1コピーのAAD−1導入遺伝子を含有することが確認された。
Corn Event DAS−59132のゲノム遺伝子座妨害アッセイを、LIGHTCYCLER(登録商標)480システム(Roche Applied Science、Indianapolis、IN)を使用したリアルタイムPCRにより行った。アッセイは、LIGHTCYCLER(登録商標)Probe Design Software 2.0を使用して、Event 32 ZFN6(25716/25717)がCorn Event DAS−59132遺伝子座のゲノム配列、および内部標準遺伝子IVFに結合および切断する特異性を監視するように設計された。増幅のために、LIGHTCYCLER(登録商標)480 Probes Masterミックス(Roche Applied Science、Indianapolis、IN)を、0.4μMの各プライマーおよび0.2μMの各プローブを含有する10μL体積多重反応物中の最終濃度×1で調製した(表30)。蛍光捕捉により、55℃で30秒間の伸長で2段階増幅反応を行った。標的対標準比を使用して、妨害アッセイのための分析を行った(図37)。8つのイベントのうち4つが、Corn Event DAS−59132のゲノム遺伝子座に組み込まれたAAD−1導入遺伝子を含有するものとして特定された。Corn Event DAS−59132のゲノム遺伝子座内のAAD−1導入遺伝子の組み込みを確認するために、Event 100655/105906[1]−001、Event 100655/105906[5]−013、Event 100655/105906[5]−015、およびEvent 100655/105906[3]−018からなるイベントを、さらなる分子分析に進めた。
NHEJによるCorn Event DAS−59132のゲノム遺伝子座内のAAD−1ドナーの挿入は、2つの方向のうちの1つで生じ得る。AAD−1導入遺伝子の組み込みおよびこの組み込みの方向を、イン−アウトPCRアッセイで確認した。イン−アウトPCRアッセイは、Corn Event DAS−59132標的配列のゲノム遺伝子座に結合するように設計された「アウト」プライマーを使用する。さらに、「イン」プライマーは、AAD−1ドナー配列に結合するように設計された。これらのプライマーを使用して完了された増幅反応は、標的部位に挿入されたドナー遺伝子のみを増幅した。得られたPCR単位複製配列は、2つのプライマーから生成され、挿入の接合点にわたる配列からなっていた。各試料に対して、2セットのイン−アウトPCRプライマーが1つの反応に多重化され、2つの異なる方向のうちの1つで生じ得るNHEJ媒介ドナー挿入を検出するために使用された。陽性および陰性対照がアッセイに含まれた。2つの陽性対照プラスミド、pDAB100664およびpDAB100665を構築して、2つの異なる方向のうちの1つでのCorn Event DAS−59132のゲノム遺伝子座におけるドナー挿入をシミュレートした。
ELPゲノム標的配列の特性決定
操作されたランディングパッド(ELP)が組み込まれた遺伝子座を、遺伝子標的化のための内因性ゲノム遺伝子座として選択した。ジンクフィンガーヌクレアーゼタンパク質に加え、ジンクフィンガー結合部位(eZFN1およびeZFN3)、ならびにジンクフィンガー結合部位に隣接する約1.0kbの無作為人工配列を含むELP配列の構築は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際特許出願第WO2011091317号に記載されている。ELP遺伝子座内のNHEJ媒介標的化組み込みを試験するために、2つのドナーDNAを構築し、それらは共に、除草剤ハロキシホップに対する耐性を付与するaad−1 遺伝子を含む5.3kbプラスミド内の2つのeZFN結合部位のうちの1つを含有する。図38は、組み込みの代表的な概略図を示す。
pDAB100640、pDAB100641およびpDAB106685(各ELPに対し2つ)の形質転換から生成された4つのトランスジェニックELPイベントを、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際特許出願第WO2011091317号に記載のように生成した。イベントが得られ、単一コピーであり、ELPを含有する無傷PTUを含有することが確認された。これらのイベントを再生して、標的化のためのドナー材料を生成した。健康な成長組織をまず28(1H)(MS培地(Murashige and Skoog (1962) Physiol Plant 15:473−497)、0.025mg/L 2,4−D、5mg/L BAP、1.0mg/L Herbiace、30g/Lスクロース、2.5g/Lゲルライト、pH5.7)に移し、低光量下(14μE/m2・秒16時間光周期)で7日間、続いて高光量下(89μE/m2・秒16時間光周期)でさらに7日間インキュベートした。緑化構造を、28(1H)からBAPおよび2,4−Dを抜いたものと同じである36(1H)に移し、苗条構造が温室への移植に十分な根を発達させるまで、高光量下(40μE/m2・秒16時間光周期)でインキュベートした。95%METRO−MIX 360(登録商標)および5%クレイ/ローム土のミックスを使用して、植物を温室内で成熟するまで成長させ、植物の健康に依存して受粉させた。活発に成長した植物を自家受粉または同種交配させ(同じイベントからの植物)、より活発でない植物をHi−IIまたはA188と交配させて、ドナー材料の胚発生能を維持した。T1種を4インチの鉢に植え、発芽した実生を接合性についてqPCRによりスクリーニングした。PAT遺伝子に対しホモ接合性であると決定された実生を、5ガロンの鉢に移し、生殖期まで成長させ、Hi−IIに異種交配させ、T2胚をNHEJ媒介組み込みによる標的化に使用した。
トウモロコシ(Zea mays)Hi−IIプロトプラストを入手し、前述のプロトプラスト形質転換プロトコルを使用して形質転換した。pDAB100651のドナープラスミドDNAを、pDAB105941のZFNプラスミド DNAで形質転換した。同様に、pDAB100652のドナープラスミドDNAを、pDAB105943のZFNプラスミドDNAで形質転換した。ドナーDNAを、ジンクフィンガーヌクレアーゼでELPトランスジェニック植物に形質転換した。ドナーDNAおよびeZFNの導入後、ゲノム標的DNA内に組み込まれたドナーDNAおよびELP遺伝子座の両方を切断した。その後、ドナーDNAをゲノム標的に挿入した。ELPゲノム遺伝子座内のドナーDNAの挿入は、いずれの方向においても生じ得る。順方向でのドナーDNAの挿入は、ZFN切断から生成された4bpの1本鎖相補末端の推定されるアニールおよび連結に対応する接合点配列をもたらす。接合点における挿入および欠失(インデル)は一般的である。逆方向でのドナーDNAの挿入は、インデルを含有する両方の接合点部分をもたらす。
DNA抽出:Qiagen BIOSPRINT 96(商標)ロボットを使用して、自動化によりトウモロコシ組織からDNAを抽出し、DNAを200μlの1:1 TE緩衝液/蒸留水中に溶出した。各試料のDNAを、THERMOSCIENTIFIC NANODROP 8000(商標)上で定量し、QIAGEN BIOROBOT 3000(商標)を使用して試料を100ng/μLに正規化した。正規化されたDNAを、さらなる分析まで4℃で保存した。
レポーター遺伝子の高度の再現可能な発現を示す、トウモロコシプロトプラストベースのトランジェントアッセイ系を開発した。DASで発生させたHi−IIトウモロコシ懸濁培養物から、プロトプラストを得た。ELPの挿入物を内包するトウモロコシのトランスジェニック系統(トウモロコシ系統106685[1]−007)を、ドナーDNA配列のNHEJ媒介組み込みに使用した。
マイクロ粒子照射の3日前に、1.5〜2.2mmの胚を表面殺菌された穂から単離し、2.0mg/L 2,4−D、2.8g/Lプロリン、30g/Lスクロース、100mg/Lカゼイン酵素加水分解物、100mg/L myo−イノシトールおよび4.25mg/L硝酸銀を含む、2.5g/L Gelzan(Phytotechnology Laboratories、Shawnee Mission、KS)で固化されたN6基礎培地およびビタミン(Phytotechnology Laboratories、Shawnee Mission、KS)上に(胚盤を上にして)置いた。マイクロ粒子照射の4時間前に、約35〜40の胚を、36.4g/Lソルビトールおよび36.4g/Lマンニトールを添加した同じ培地を含有する100×15mm Petri皿の中央に(胚盤を上にして)置いた。
DNA抽出:Qiagen BIOSPRINT 96(商標)ロボットを使用して、自動化によりトウモロコシ組織からDNAを抽出し、DNAを200μlの1:1 TE緩衝液/蒸留水中に溶出した。各試料の2μLを、THERMOSCIENTIFIC NANODROP 8000(商標)上で定量し、QIAGEN BIOROBOT 3000(商標)を使用して試料を100ng/μLに正規化した。正規化されたDNAを、さらなる分析まで4℃で保存した。
この試験の結果は、標的DNAおよびドナーDNAのインビボ ZFN生成切断後の、NHEJによるドナーDNAプラスミドのトウモロコシにおける正確な挿入を実証する。ドナーDNAの標的化は、2つの異なるドナーDNA(どのeZFN結合配列がELP内に含有されたかにより異なる)、ならびにプロトプラストおよびトウモロコシ胚内の2つの異なるeZFNを使用して生じた。NHEJ修復機構によるELP遺伝子座内の組み込みは、両方の方向で生じた。ドナーDNA挿入物は、試験された試料において、これらの方向の両方で検出された。
配列番号116
TCGCCCAAACCCTCGCCGCCGCCATGGCCGCAGCCACCTCCCCCGCCGTCGCATTCTCGGGCGCCACCGCCGCCGCCATGCCCAAACCCGCCCGCCATCCTCTCCCGCGCCACCAGCCCGTCTCGCGCCGCGCGCTCCCCGCCCGCGTCGTCAGGTGTTGCGCCGCGTCCCCCGCCGCCACCTCCGCCGCGCCTCCCGCAACCGCGCTCCGGCCATGGGGCCCGTCCGAGCCCCGCAAGGGCGCCGACATCCTCGTCGAGGCGCTCGAGCGCTGCGGCATCGTCGACGTCTTCGCCTACCCCGGCGGCGCCTCCATGGAGATCCACCAGGCGCTGACGCGCTCGCCCGTCATCACCAACCACCTCTTCCGCCACGAGCAGGGGGAGGCGTTCGCGGCGTCCGGCTACGCCCGCGCGTCCGGCCGCGTCGGCGTCTGCGTCGCCACCTCCGGCCCGGGGGCCACCAACCTCGTCTCCGCGCTCGCCGACGCCCTCCTCGACTCCATCCCCATGGTCGCCATCACGGGCCAGGTCCCCCGCCGCATGATCGGCACGGACGCGTTCCAGGAGACGCCCATAGTGGAGGTCACGCGCTCCATCACCAAGCACAACTACCTGGTCCTTGACGTGGAGGATATCCCCCGCGTCATCCAGGAAGCCTTCTTCCTTGCATCCTCTGGCCGCCCGGGGCCGGTGCTAGTTGATATCCCCAAGGACATCCAGCAGCAGATGGCTGTGCCCGTCTGGGACACTCCAATGAGTTTGCCAGGGTACATCGCCCGCCTGCCCAAGCCACCATCTACTGAATCGCTTGAGCAGGTCCTGCGTCTGGTTGGCGAGTCACGGCGCCCAATTCTGTATGTTGGTGGTGGCTGCGCTGCGTCTGGCGAGGAGTTGCGCCGCTTTGTTGAGCTTACTGGGATTCCAGTTACAACTACTCTGATGGGCCTTGGCAACTTCCCCAGCGACGACCCACTGTCTCTGCGCATGCTTGGGATGCATGGCACTGTGTATGCAAATTATGCAGTAGATAAGGCTGACCTGTTGCTCGCATTTGGTGTGCGGTTTGATGATCGTGTGACTGGGAAAATCGAGGCTTTTGCAAGCAGGTCCAAGATTGAGCACATTGACATTGACCCAGCTGAGATTGGCAGAACAAGCAGCCACATGTCTCCATTTGTGCAGATGTTAAGCTTGCTTTACAGGGGTTGAATGATCTATTAAATGGGAGCAAAGCACAACAGGGTCTGGATTTTGGTCCATGGCACAAGGAGTTGGATCAGCAGAAGAGGGAGTTTCCTCTAGGATTCAAGACTTTTGGCGAGGCCATCCCGCCGCAATATGCTATCCAGGTACTGGATGAGCTGACAAAAGGGGAGGCGATCATTGCCACTGGTGTTGGGCAGCACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGTGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGCATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCAGCAGTTCGAGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATAGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAGCCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTATTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGTTTTGTAGTCTATGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATGTCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATCAATAATAAGTACTTCCATGNAANAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
TCGCCCAAACCCTCGCCGCCGCCATGGCCGCAGCCACCTCCCCCGCCGTCGCATTCTCGGGCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCATACCCAAACCCGCCCGCCAGCCTCTCCCGCGCCACCAGCCCGCCTCGCGCCGCGCGCTCCCCGCCCGCATCGTCAGGTGCTGCGCCGCGTCCCCCGCCGCCACCTCCGTCGCGCCTCCCGCCACCGCGCTCCGGCCGTGGGGCCCCTCCGAGCCCCGCAAGGGCGCCGACATCCTCGTCGAGGCGCTGGAGCGCTGCGGCATCGTCGACGTCTTCGCCTACCCTGGCGGCGCGTCCATGGAGATCCACCAGGCGCTGACGCGCTCGCCAGTCATCACCAACCACCTCTTCCGCCACGAGCAGGGGGAGGCGTTCGCGGCGTCCGGGTACGCCCGCGCGTCCGGCCGCGTCGGCGTCTGCGTCGCCACCTCCGGCCCGGGGGCCACCAACCTCGTCTCCGCGCTCGCCGACGCTCTCCTCGACTCCATCCCCATGGTCGCCATCACGGGCCAGGTCCCCCGCCGCATGATCGGCACGGATGCGTTCCAGGAGACGCCCATCGTGGAGGTCACGCGCTCCATCACCAAGCACAACTACCTGGTCCTTGACGTGGAGGATATCCCCCGCGTCATCCAGGAAGCCTTCTTCCTCGCATCCTCTGGCCGCCCGGGGCCGGTGCTGGTTGATATCCCCAAGGACATCCAGCAGCAGATGGCTGTGCCTGTCTGGGACACGCCGATGAGTTTGCCAGGGTACATCGCCCGCCTGCCCAAGCCACCATCTACTGAATCGCTTGAGCAGGTCCTGCGTCTGGTTGGCGAGTCACGGCGCCCAATTCTGTATGTTGGTGGTGGCTGCGCTGCATCTGGTGAGGAGTTGCGCCGCTTTGTTGAGCTCACTGGGATTCCAGTTACAACTACTCTTATGGGCCTTGGCAACTTCCCCAGTGACGACCCACTGTCTCTGCGCATGCTGGGGATGCATGGCACTGTGTATGCAAATTATGCAGTAGATAAGGCTGACCTGTTGCTTGCATTTGGTGTGCGGTTTGATGATCGTGTGACCGGGAAAATCGAGGCTTTTGCAAGCAGGTCCAAGATTGAGCACATTGACATTGACCCAGCTGAGATTGGCAGAACAAGCAGCCACATGTCTCCATTTGTGCAGATGTTAAGCTTGCTTTACAGGGGTTGAATGCTCTATTAAATGGGAGCAAAGCACAACAGGGTCTGGATTTTGGTCCATGGCACAAGGAGTTGGATCAGCAGAAGAGGGAGTTTCCTCTAGGATTCAAGACTTTTGGTGAGGCCATCCCGCCGCAATATGCTATCCAGGTACTGGATGAGCTGACAAAAGGGGAGGCGATCATTGCCACCGGTGTTGGGCAGCATCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCATCCGGTTTGGGTGCAATGGGATTTGGGTTGCCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGGGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGTATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAACCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATTGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTTAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATACCTGCGTGTTGTATCAACTACTGGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCGTGTAGTTTTGTAGTCTCTGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATCAATAATAAGCACTTCCATGNAANAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
TCGCCCAAACCCTCGCCGCCGCCATGGCCGCNGCCACCTCCCCCGCCGTCGCATTCTCGGGCGCCNCCGCCGCCGCCATNCCCAAACCCGCCCGCCANCCTCTCCCGCGCCACCAGCCCGNCTCGCGCCGCGCGCTCCCCGCCCGCNTCGTCAGGTGNTGCGCCGCGTCCCCCGCCGCCACCTCCGCCGCGCCCCCCGCCACCGCGCTCCGGCCCTGGGGCCCGTCCGAGCCCCGCAAGGGCGCCGACATCCTCGTCGAGGCGCTCGAGCGCTGCGGCATCGTCGACGTATTCGCCTACCCCGGCGGCGCGTCCATGGAGATCCACCAGGCGCTGACGCGCTCGCCCGTCATCACCAACCACCTCTTCCGCCACGAGCAGGGGGAGGCGTTCGCGGCGTCCGGCTACGCCCGCGCGTCCGGCCGCGTCGGCGTCTGCGTCGCCACCTCCGGCCCGGGGGCCACCAACCTCGTCTCCGCGCTCGCTGACGCCCTCCTCGACTCCATCCCCATGGTCGCCATCACGGGCCAGGTCCCCCGCCGCATGATCGGCACGGACGCGTTCCAGGAGACGCCCATAGTGGAGGTCACGCGCTCCATCACCAAGCACAACTACCTGGTCCTTGACGTGGAGGATATCCCCCGCGTCATCCAGGAAGCCTTCTTCCTCGCGTCCTCTGGCCGCCCGGGGCCGGTGCTGGTTGATATCCCCAAGGATATCCAGCAGCAGATGGCCGTGCCTATCTGGGACACGCCGATGAGTTTGCCAGGGTACATCGCCCGCCTGCCCAAGCCACCATCTACTGAATCGCTTGAGCAGGTCCTGCGTCTGGTTGGCGAGTCACGGCGCCCAATTCTGTATGTTGGTGGTGGCTGCGCTGCATCCGGCGAGGAGTTGCGCCGCTTTGTTGAGCTCACTGGGATTCCGGTTACAACTACTCTGATGGGCCTTGGCAACTTCCCCAGCGACGACCCACTGTCTCTGCGCATGCTTGGGATGCATGGCACTGTGTATGCAAATTATGCAGTCGATAAGGCTGACCTGTTGCTTGCATTTGGTGTGCGGTTTGATGATCGCGTGACTGGGAAAATCGAGGCCTTTGCAAGCAGGTCCAAGATTGAGCACATTGACATTGACCCAGCTGAGATTGGCAGAACAAGCAGCCACATGTCTCCATTTGTGCAGATGTTAAGCTTGCTTTACAGGGGTTGAATGCTCTATTAAATGGGAGCAAAGCACAACAGGGTCTGGATTTTGGTCCATGGCACAAGGAGTTGGATCAGCAGAAGAGGGAGTTTCCTCTAGGATTCAAGACTTTTGGCGAGGCCATCCCGCCGCAATATGCTATCCAGGTACTGGATGAGCTGACAAAAGGGGAGGCGATCATTGCTACTGGTGTTGGGCAGCACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGAGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCATTGATCCGTATTGAGAACCTCCCTGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAATGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATCGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGGTGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGCTTTGTAGTCTATGCTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATCAATAATAAGTACTTCCATGNAANAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
CGTTGTGCCTTGGCAGTCTCAGGTTGAGCCCTCACCATTGAAGTAGCATGGGTCATTGGATTGACCCGATTTGACGGCGGATCTATTGGATCTTCCCTTTGTGTCGTTTTATACTGGTATAGATGTTTAACACATATTTGGAAAATATATTCAAAACATGTTTCTATAAAAAAGTTTAAACTATACATGTATAATGGAAGTCATTTATAAGAAATGTTTTACATGTATAAAAGATGTACATCATATGTGCAAAAGTAGACATGTGTTAGAAAAAATAAACAAACAAATACATAAAAAGAAAATCAAAGAAAAAACAACCCAAAAAACCAAAGAAAATAAAGAAGAAGAAGAAAAAGAGAAAAAACATTGAAAATCAAAGAAGAAAAAAACATAAAGAAAAGAAAACCGAAAAATACTGGCAAAAACACACAAAAAATGAAAAGAAAAAATAAAGAAAACCGGACTTTACCAATCGAACGGAGCGATCGGACACGAATGAGCGAAGGCATGCATCGAGCAACACCGCTAATTGACCGGCCCGTAGTCGTTCGCCCGTAGACCATTCATAAGAATCGGTATCGGAGAGACATAGGGGTTCTTTGGTTTCTAACCATATCTTGTCACACTTTACCATACATCACCTTAGTCAAATCTGATCAAATTAGGTGAGTATTTGGTTCTAGCCACATCTAAGGCAAGATTTGTTTTTCTGAGCAGTGAACCCCATATGTCATAGACAGAAAAATTGTGAAAAGATTCCTTTAGACGGTCAAAGCGTGGTTAACAATTTAATCAACTCAAGTAAGATAAATGCGATAAATGTGACAAAAATAATGTGTTATAGAAGTATGACAAAAATAATCACAATCCAAACAGTCTGATAGCTTGGCGAGTGCAAAATAGATACGAAATCTCTGGTGATATCACACGGGTCCAAAATAATTGCTTGTTTGAGCATCAGCCTTTCTGCACAAAAAAAGCTAGCCCAAACAAACGAGTGGCGTCCCATCTGAACCACACGCTCACCCGCCGCGTGACAGCGCCAAAGACAAAACCATCACCCCTCCCCAATTCCAACCCTCTCTCCGCCTCACAGAAATCTCTCCCCTCGCCCAAACCCTCGCCGCCGCCATGGCCGCCGCCACCTCCCCCGCCGTCGCATTCTCCGGCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCATGCCCAAGCCCGCCCGCCAGCCTCTCCCGCGCCACCAGCCCGCCTCGCGCCGCGCGCTCCCCGCCCGCGTCGTCAGGTGCTGCGCCGCGCCCCCCGCTGCTGCCACCTCCGCCGCGCCCCCCGCCACCGCGCTCCGGCCCTGGGGCCCGTCCGAGCCCCGCAAGGGCGCCGACATCCTCGTCGAGGCGCTCGAGCGCTGCGGCATCGTCGACGTATTCGCCTACCCCGGCGGCGCGTCCATGGAGATCCACCAGGCGCTGACGCGCTCGCCCGTCATCACCAACCACCTCTTCCGCCACGAGCAGGGGGAGGCGTTCGCGGCGTCCGGCTACGCCCGCGCGTCCGGCCGCGTCGGCGTCTGCGTCGCCACCTCCGGCCCGGGGGCCACCAACCTCGTCTCCGCGCTCGCTGACGCCCTCCTCGACTCCATCCCCATGGTCGCCATCACGGGCCAGGTCCCCCGCCGCATGATCGGCACGGACGCGTTCCAGGAGACGCCCATAGTGGAGGTCACGCGCTCCATCACCAAGCACAACTACCTGGTCCTTGACGTGGAGGATATCCCCCGCGTCATCCAGGAAGCCTTCTTCCTCGCGTCCTCTGGCCGCCCGGGGCCGGTGCTGGTTGATATCCCCAAGGATATCCAGCAGCAGATGGCCGTGCCTATCTGGGACACGCCGATGAGTTTGCCAGGGTACATCGTCCCGCCTGCCCAAGCCACCATCTACTGAATCGCTTGAGCAGGTCCTGCGTCTGGTTGGYGAGTCACGGCGCCCAATTCTGTATGTTGGTGGTGGCTGCGCTGCATCCGGCGAGGAGTTGCGCCGCTTTGTTGAGCTCACTGGGATTCCGGTTACAACTACTCTGATGGGCCTTGGCAACTTCCCCAGCGACGACCCACTGTCTCTGCGCATGCTTGGGATGCATGGCACTGTGTATGCAAATTATGCAGTCGATAAGGCTGACCTGTTGCTTGCATTTGGTGTGCGGTTTGATGATCGCGTGACTGGGAAAATCGAGGCCTTTGCAAGCAGGTCCAAGATTGTGCACATTGACATTGACCCAGCTGAGATTGGCAAGAACAAGCAGCCACATGTCTCCATTTGTGCAGATGTTAAGCTTGCTTTACAGGGGTTGAATGCTCTATTAAATGGGAGCAAAGCACAACAGGGTCTGGATTTTGGTCCATGGCACAAGGAGTTGGATCAGCAGAAGAGGGAGTTTCCTCTAGGATTCAAGACTTTTGGCGAGGCCATCCCGCCGCAATATGCTATCCAGGTACTGGATGAGCTGACAAAAGGGGAGGCGATCATTGCTACTGGTGTTGGGCAGCACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGAGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCATTGATCCGTATTGAGAACCTCCCTGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAATGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATCGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGGTGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGCTTTGTAGTCTATGCTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATCAATAATAAGTACTTCCATGGAATAATTCTCAGTTCTGTTTTGAATTTTGCATCTTCTCACAAACAGTGTGCTGGTTCCTTTCTGTTACTTTACATGTCTGCCGTGTCCGGTTATGACATAATGACCGATGGAGGGTGGTCAGCAGGTTTTAGACGGGGAGTTGAAACTTTTTTTTGGGGGGAAGAAATCTGAATACAGTTGGGAGGAAAGATAAAAGCATATACCTTGATTAATTTATTGAGCCCAATATCCAGCCTAATTTATCAAGCAATAGGCAGTGTAGGGTGTTGGCATTCTTCTCTTCCTTGAGATCTGGTGTCGGGACCCCGATTCTAAGTCACACCGATCTAGCATGTAACACCTCATATCACTTTGCGGCCTCACGCACGGTATCCTCACGGGTGTCGCCTTACCATGGCCCGGGACCGTTTGCGCCTTTTGGCTCACGTATATGATGGTGTCGCTAGYATCCATATGACAGAGAACCCGGGCCGACATRGCTAGTCGTGAACCCAAAGCGGCACAGACCTATGGAGACAGGCATACATGAATCACATCGAGCATGTCGGTCAACAGCGTATGAATCCGGGCTGTAGCACTGGGCTAACAGGACTCCGGGGAACCCGGGCTGTAGCAGGCTAGGCAGGACTCCGGAAGTCACCGCGTGACATTTCCCCGAAGGGACAGACATAGGAACGAAGTGGAACACATGCCGGCCAGTCAAGTGTTCTGAGCAGTAGTGCTGGGCTAGCAGGACTCCGGTGAACCGGGCTGTAGCGGACTACTATGGCTCGAGGTAGCACTAGACTACATTTCCCCATAAGAGAGGCTKCCAAGGATAAGCAACTAGATTGTCGGRTCYCRSRYWTTGTCTCCGTGTGTTGTTATTGTTGTCATGCAAGTATGTGTTGTACAACATGGCATCACAACATAACGCAAACTCATATAGATATAGGCTCAGAGAGCCACATAGCATTAATACGAACAGGGTCACATGACCCATCATTCAGAGCATACAGCATGAAGCATCATGTCTGAGTACAGACACTAC
CTGAAAATTCAATATGGCCCTCGGGCACCAATGCTCTTGCTTCCAATTTTCATAATTCCCATTTGTAAAAAACACACCACAAAAATCACACTGTAGTAATCTACATGTTTGTTGAGCCTATAAATCTTCATAAAATAATTGAGATTAATGCGGTTTGTGCAAAAATATGGGGTTGGTCATGTTTCTACATATTTCTATTTGCATTTCGTTAACTGGTGCTTGTTATTTTTGTACATAATGCATATCTCATTGTTATTATTTTTAACCTTTTGAGATGGTAACGAAGATCCAAACATGCATAGATGATTCTCCGGATGATTTTTTGTAGCCTGCACTAGGAACTCCCAAGAGCCAGAAGGTTGGGTTTGTACAAGATAACATTTGTTTGAACACACTCATAACCTGCATGTGACATACATGACGTAACTTATAGTGATGATTCGACAAATGTCTCTTTGTCCAATTTTGTTATATATCCCGTGGCAACGCACGGGCATTCGACTAGTATATGTAAAGATATCAATGTGACGAGTCCCCATGGTCGTTGCGCTTGTCCACTACCGGCTCGCTAGAGGCGACTCTCACCTAGAAGTCGCTACGAGCAATACATAGTCGTTCTGGGCGCAGCTATGTTCTGCCTTTTGCGACGCTCAGGCACGGCTTGCCTACAGCCTGAGGGTCGGGCTAGGAACCACTAATTGTGTCATGCTGATGTCACAATGACATCATGCATATTTTTATTTTCGTTTTTCGCTTTCTCTTTAATTTTATTTGTATTTCAAAATATTTTATATATTTTTTGAATTTTTTCAATGTTGTATTTGAAAAATGTTAAACCTGTATAGAGAAAAATATTTTTGATATATATAAAAGTATATAACATGAATGAAAAATGTATAAATGTTAATTATGTGTACCAAAAATGTTGATAACAATTAGCAGTCTCACATATTTCAAAATAAATGTATGTGGAATTAAAAAATATGTGTATTTAAGTTTAAAAAAAATGTTCATGTAATGTTCGTAAAATGTTTGATACATTCAATAAAAATTATGTCACATTTGAATAATTCTTCTCAAGCTTAACAAATGCGCTCATTATATTATCAAAAATTGTCTGTACAGTGTACACAAATGTTTATGTAGTTCAAAAAAAATGTTTTTTCAGTAAAAATATATTTGATCATGTATTTTATAAAAAACTGTTTAATATATATTTAGAAAATATATTCAAAACATGTTTCTGTAAAAAGTTAAAACTATACATGTATAATGTAAGTCATTTATAATAAATGTTTTACATGTATAAAAAATGTACAACATATGTGCAAAAGTAGACATGTGTTGAAAAAATAAACAAATAACTAAATAAAAAGAAAATCAAAGAAAAACACCAAAAACCAAAGAAATAAATAAAACCAAAGTATAAAGAAGARRAAAGGAGAAAAAACATTGAAAATCAAAGARAAAAACATAAAGAAGAAAAAAACCGAAGAAAACTAGCAAAAAACACACACACAAAAAAGAAAATGAAAAGAAATAATAAAGAAAGCCGGACTGAACCGATCAAACGCAGCGATCGAACATGGATGAGCTAAGGCATGCATCGAACAACACGGCTAATTGGCCGGCCCGTAGTCGTTCGCCCGTAGACCATTCCTACGAATCGGTACCGGAGAGACATAGGGGCTGTATGGTTCCTAACCATACCTTGCCACACTTTGTCACACCTCATCTTAGGCAAATTTAATCAAGTTATGTAGGTGTTTGGTTTTAGCCACATCTAAGGCAAGATTTATTTTCCTGAGCAGTGAACCCCATATGTTATAGACATAAAAAGTGTGGGAAGATTCCCTTTAGTCAAACTGTGGCTAACAATTTATTAAGAATTAACTTAAGTAAGATAGGTGCAACAAATGTAGCAAAAATAATGTGGTATATATAGCAAAGATAGCCACAACCGCGAGTGGAAATACCAGATACGAGATCTCTGGTCATATCACACGAGTCCAAATTAATTGCTTTGTTTGAGGTTCAGCCTTTTGCATAAAAAAGCTAGCCCAAACAAACGAGTGGCGTCCCATCTGAACCACACACTCACCCGCCGCGTGACAGCGCCAAAGACAAAACCATCACCCCTCCCCAATTCCAACCCTCTCTCTGCCTCACAGAAATCTCTCCCTCGCCCAAACCCTCGCCGCCGCCATGGCCGCAGCCACCTCCCCCGCCGTCGCATTCTCGGGCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCATACCCAAACCCGCCCGCCAGCCTCTCCCGCGCCACCAGCCCGCCTCGCGCCGCGCGCTCCCCGCCCGCATCGTCAGGTGCTGCGCCGCGTCCCCCGCCGCCACCTCCGTCGCGCCTCCCGCCACCGCGCTCCGGCCGTGGGGCCCCTCCGAGCCCCGCAAGGGCGCCGACATCCTCGTCGAGGCGCTGGAGCGCTGCGGCATCGTCGACGTCTTCGCCTACCCTGGCGGCGCGTCCATGGAGATCCACCAGGCGCTGACGCGCTCGCCAGTCATCACCAACCACCTCTTCCGCCACGAGCAGGGGGAGGCGTTCGCGGCGTCCGGGTACGCCCGCGCGTCCGGCCGCGTCGGCGTCTGCGTCGCCACCTCCGGCCCGGGGGCCACCAACCTCGTCTCCGCGCTCGCCGACGCTCTCCTCGACTCCATCCCCATGGTCGCCATCACGGGCCAGGTCCCCCGCCGCATGATCGGCACGGATGCGTTCCAGGAGACGCCCATCGTGGAGGTCACGCGCTCCATCACCAAGCACAACTACCTGGTCCTTGACGTGGAGGATATCCCCCGCGTCATCCAGGAAGCCTTCTTCCTCGCATCCTCTGGCCGCCCGGGGCCGGTGCTGGTTGATATCCCCAAGGACATCCAGCAGCAGATGGCTGTGCCTGTCTGGGACACGCCGATGAGTTTGCCAGGGTACATCGCCCGCCTGCCCAAGCCACCATCTACTGAATCGCTTGAGCAGGTCCTGCGTCTGGTTGGCGAGTCACGGCGCCCAATTCTGTATGTTGGTGGTGGCTGCGCTGCATCTGGTGAGGAGTTGCGCCGCTTTGTTGAGCTCACTGGGATTCCAGTTACAACTACTCTTATGGGCCTTGGCAACTTCCCCAGTGACGACCCACTGTCTCTGCGCATGCTGGGGATGCATGGCACTGTGTATGCAAATTATGCAGTAGATAAGGCTGACCTGTTGCTTGCATTTGGTGTGCGGTTTGATGATCGTGTGACCGGGAAAATCGAGGCTTTTGCAAGCAGGTCCAAGATTGTGCACATTGACATTGACCCAGCTGAGATTGGCAAGAACAAGCAGCCACATGTCTCCATTTGTGCAGATGTTAAGCTTGCTTTACAGGGGTTGAATGCTCTATTAAATGGGAGCAAAGCACAACAGGGTCTGGATTTTGGTCCATGGCACAAGGAGTTGGATCAGCAGAAGAGGGAGTTTCCTCTAGGATTCAAGACTTTTGGTGAGGCCATCCCGCCGCAATATGCTATCCAGGTACTGGATGAGCTGACAAAAGGGGAGGCGATCATTGCCACCGGTGTTGGGCAGCATCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCATCCGGTTTGGGTGCAATGGGATTTGGGTTGCCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGGGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGTATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAACCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATTGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTTAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATACCTGCGTGTTGTATCAACTACTGGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCGTGTAGTTTTGTAGTCTCTGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATCAATAATAAGCACTTCCATGGAATAATTCTCAGTTCTGTTTTGAATTTCACATCTTCTCACGAACAGTGTGCTGGTTCCTTTCTGTTACTTTACATGCCTGCCGTGTCAGGTTATGACATAACGACCGATGGAGGATTGGAGGGTGGTCGGCTGGTTTTAGACGGGGAATTGAAACATTTTTCTGGAAGAAATCTGAATACAGTTGGGAGGGGAAATGGAAGCATATATTTATCGAGCCCGCTATCCAGGCTAATTTATCAAGCACTAGACAGTGTAGGGTGTTGGCATTCTTCTCTTCCTTGATATCCGGCTTGAGAGGAGAGATTGAGGCTTCGGCTGTGTTGGTTGCTGATTTCTACAGCATTTTGAGAGAGAGAGAGAGATGTTGCAACTGTGTTTTGTCTTGGTTGCTTGTACAGAGAAAGAGATGACATTTAGAGATATGCAGATCGTTTACCAGTTGTGCTGCGTTTATTCGTACTGATTGTTGTTATTGTTGCTATCATGTGCAAATTGTTGTGATGGAAAATCAACAAAATTTTGATATTTTGCAAAGCGAGTTGGATTGAATGATTTGAGAAATGGTGACTTGTTGAGTGGCCTTGAGAATTGGTGTTTCATAGGTGTGCAGTTGGTAATGAAAGGCGGCGGCTTGAAATTTCCGAAAGGCAGGCAATGATACTTTCTGAAAGTGATGTTTTTTCTTCCAGGTTTCCGGTGGAACAAGTCTACGTTGAGCCAATGT
TTGTCAGCTTATTCTGCTCTTTAGTTTCAGTTGTTTTGTTCACAGATTGCTGGGCAGAGCCCCATGATCGGCTGAGCCTCCAGGAGATCCTTGATTGCTCGACTGCGGATACGTTGAATCCTTTAAAATACTATAAGCTCCCTAGTTTTAGTTTTAGAGAACTGAGAATCAATTGAGGGCAACATTAGTCGATTTTGGCTTCCGATTTTGACTGGGTCGCCTCCCTGGGTCCTCTACAGTTTTGTGGGCCCTATATGTAAGTGCCCCAGTGTTGTGGGCTTTCTGGTCTTTTCTGATGAAAGCGGCGTGGTGGCTGGGGGCTTTAGAATATTTCATTGATTAACTAAAACAAATCAGATCCCTTTTTCCTGCTTCATGTGTGTTTGACCAATCTTTTTTTAAAAATTTCTTTGATTTTATATTTGATGGAGTAAATCTGGCTGTGTCAACGGTAGTCCATTCGAAACCTGGAAATCGAAATCATTGTACTGCAGGTCTGTTGCCTGTTAGTTTGTTCTTATATAAGATCTTTGACAGTTTATGAATTTGTCTTTGGAATTTGTATAAAGTTTCACAGATAGACAGGCCCTGTTGTTAAATACGTTCGTGCAATTAAGTGTAAACATATCTGCCAGTGATTTTTCTCGGCTCGCATTAGTACGCATAAATTTTTAGCACTTCTCTGAATTTTCTCATATGCAGACCACCTATGAAAAAAACGACATGCAAGTAAATAAAACGATTTCAGGTTCATTTAGTAGCAAACCGTTTTTATGTCCTTTAAAAATCAATTAGCAGAGCCACTCCATTCACCGGTCAGCAGAAAAGAAGCATGTGTGTGTTTTTGGGCTATCATAGAGCTAAATAAATTTGATTCCCATCTGTAATGTTCATCGTTGTTTACATCAGTGTTGGCTGTCGTGTGGTCGTGGAGACTAGCCTGTTCAGACAATATGTTTGACAAGAGTGTTGTTTTGTGAGATGCGGATGCGGTGCTTGCATCTGTACTTGTTTTTGTGAATACCAGTTAGATGATCAGTTTTTGTGCACTTCTTGCCATGAATGGCTGTTAAATTGTCACTTTTTAGGAACTTGTTGCCGTAATATCAATTAAATAATCAATTTTTGTGCATGGTATATCAATTAGATGGTCATTTTTTTCTAGTAGAGATGTCTATACATGCCAATGCAATGTTCAGAGTTGTTCAAGGTCTCGACGGCGCGGCAAAGCGCGTCCTATGCTTCTAGTTTAAGATGACAACCAAACACGACCCAAGTGTATGCTATGCTCATCCGGTTGGTCCTTGTTGATGTTCAATGGGCGTGTCTCCATGGGCATCGACGGCGACAATGTTATCTTCTTCAACTGTCTGCTATATGCTCATTGGCATTTTTGAAACTTTGCAAGCAAGGTCGATAACTTGGTCTGGGGATGTTGACGCCCCTATGTATCTAGATTAGGGTGATGCTCCCGCCAGTATTTTTTGGACGATTATCAACATTTGCGGCTGGTATACTATTGTGGCTAATCAACAAGGTTTTTTTGTGTGTGGCTAATCAACAAGGTTTGGCGCTCGATGTTTTTTTAATGTATTTCGATGACTCAATTTCTACGTCTGAACATTTCATTGAGCCAAGAGGCAGAACAACAGGTCACATGTAACCGCCAGTGAAAAAGGTTCAAAGAAGAAAAAGATACGAACGACAGCGAGTTTGTATKKCAGTTTTCGAACTAAGAGTAACACGGAGTRCAGTAGTACGATCCTTGTGTMYTTCTGTATTTGGWTAKTTTTTTTCCGGAGTTGAGTATTWGWAACTTTCTTGTGCTTTTTTTAACATTAGTACAGATGCAAGTGCTCATACATACGCGCTTTTTGATTTGTAACAATATTATGAAAGACGTAGTAATTATGTTTGCAGATCAATAAAGCTAGCCATCGTGTGGTGTTCCCAAGAAAAAGATATTCACTATAGATTCACTACATCTTCTAAAAAAACTACACTGTAGATTCACTACAGACCAACAGAATATTCATGGTCACGTGGATAAAAACTTACTTTTTGAAAGTCTCAAGCATTTGGTTTGATTTTAAGAAAAAATAACTGACTCTATTTTTGTGTACTCCTTGCAACGAACCTGGATAAAGATGGAGCCAGTCCGTTCCTGGTTACTAGGAGTATCCATTTCCTGAAGACCATGGAGCAACCACGGCGGATCGGGCGATCGGCAGCCTCCCAGCCGGCGACCATGGCGGATGCCACGAGCGCAGGAGCGACGCCTCTCCTCCCTGGCCTCCTCGACGACATCGTAATCTGTGAGATCCTTGTCCGCCTCGCCCCCCAAAGCCATCCTCCGCTGCCGCGCCGTCACGCCGTGCCTGGCGCCGCACCACCTCCACCCGCGACTTCCTCCTCGCCCACCACGCCCGCCAGCCCGCCCTCCTCATCACCTCCGGCCACAGTT
AAATTTTTATAATATTGTTTTTCCAAATTTTATGTTTAAACTCATTTTTGTTCAATTTTTTGTGAATATATTTTAATCCATTGATAGATTTTGAAAATATAATAATTTTTCCAAAACATTCTATAATTTCATAAACCTTTTTAACATTTCAAGAATAAGATTAGGAAATTTTGATTCTTAAAATATATTTTTAATCTTGCAACTACATTTTTATATACAATTACATGAGCCAATTTATTTTGGTAGAAATCAACTGAAAAAACAAAAGAAAAAATTGGAATAGCGGGAGTTCTCTGCGCGAACTTGGGGGGGGGGGGCGACAACCCTCTATCAATGAGCTAGGGATTCCTATTACATCTCGCCTACAAGCCGCACTAGTTTTTTYCCCATTTGTTTTATATCGGTTTTTTACTACTTTTGCACCGGTTTTCTTCTGGTATTATTTCATTTTTCTTCTATACTTTCTGTTGTTTTCTTCGTTTCCCCCTCCTGTTTTTTTGTCTTTTTCTACAGTTTCCTTGTTTCTTTCTTTGGTTTTCACCGATTTACTTTGTTTTTCACGTTTTTAAATTTTAATTTTAATCTTCAGATACATAATTAACATTCATTAAATTATATACTTTTATGTCAAGTTTTTTCATACACATTGTGCATTTTATACATATTAGGATTCTTAAATACATGATTAATATTTTATTCAGACATAGAGTACTTGTTTTGAACACTTTTTCAAATACATGTTGAAATAATTTATTTTATGATATGAAATATGTTTTTTTATTATGCAAACATTTTTATACACTTTATGTTTTTTTGAAATATTACAAAATTTTTGCTTGAAACGTGTGAACATTTTTTAAAATGTAACATAATTTTTTGAATGGTATGAAACTTTTTTGAACTGCGCGAACATTATTTTTACATTGTATATTATTTTGATTCATTTTCTGTAAGTTATCGCCTGAATTGCTTGAAAAACGTGATTTTTTTTAAATGCCACATATATTGTTTTTGAATGGTTCATGCATTTTCTGAAAGTTGATCGAACATGTTTTTATATTGCATTTTTAAAATGTAATAACCACTTTTGAAAATTAACTAATGTATTTTCATAATATATGTATTTAATATTATTAAAAATAAAAAAAAGGTAAAAGAAAAAACAGATCAACGCGATGAGACCCCATGGTTGTTGCGCTTGTCCACTACCGGCTCACTGAAGACGTCTCTCACAGTAGGAGTCGCTACGAAGAATACATAGTCGCGCTGGGCGCGGTTATGTTCCGCCTGTTGCGACGCCCAAGCATGGCTTGCCTACAGCTAGAGGGTCGGGCTAGGAACCACTAATTGTGTCATGCTGATGTCACAATGACATCATACATGCTTTTATTTTAATTTTTCGCTTTCTCTTTAAATTTTTTTGTATTTCAAAATATTCTGTTTTTTTAAGAATGCTAGTATTGTATTTGAAAAATGTTAAACCTGTATAGAAAAATATATAACATGAATGAAAAATGTATAGATGTTAATCATGTGTACAAAAAATGATTGTGACAATTAAGAATGTCACATATTTCAAAATAAATGTATGTGGAATTTTGAAAAAATGTGTATATAATTTTTTAATGGTCATGTAATTTTAAAAAAATGTGTGATACATTCAACAAAAAATATTTCACATTTGAATAATTCTTCTTGAGCTTAAGAAATGTGTTCATTATGTTATCAATTTTTTTGTACAGTGTACAAAAATGTTTACATAGTTCAAAAAAATGTTTTTCAGTAAAATTACATTTCATTGTGTATTTAATATTTTAACACACATTTGGAAAATATATTTGAAACATGTTTTTGTAAAAAAAAATTTAAAACTATGCTTGTACTCCCTCCGTCCGAAAAAGGTTTACATGTATAAAAGTTTTTTCGGAGGGAGGGATTATAATGTTAGTCATTTATAAGAAATGTTTTACATGTATGAAAATGTATAGCATATGTGTAAAAGTAGACATGTGTTGAAAAAAAAAAGTAAAACAACCCAAAAAACCAATGAAAATAAAATAAAACCAAAGTACCAAGAAGAAGAAAAGGAGAATAAACCATTGAAAAACAAAGAAAATAAAAAACATAAAGAAGAAAGAAACCCAAAGAAAACTGGCAAAAATTAGACACAGAAAAGAAAAACGAAAAAATATATAATAAARAAAACCGGACTGAACCGATCGGACACGGATGAGCGAAGGCATGCATCGAGCAACACAGCTAATTGGCCGGCCCATAGTCGTTCGCCCGCAGACCATTCATACGAATCGGTACCGGAGAGACATAGGGGCTATTTGGTTTGTAGCCACATTTTGTCATACTTTGTGACACCGCATCTTATGCAAGTTTGACCAAATTAGGTGGATGTTTAGTTCTAACCACATGTAAGGGAAGATTTTTTTTTATGAGCATTGAACCCGTAGACACAAAAAGTGTAGGAAGATTACTTTAAACAAGCTAAAGTGTGGCTAACAATTTAAGCATCTCAGGTAAGATAAGTGCGACAAATATGGCAAAAATAATGTGGTATATATGACAAAGATAGTCACAATCCAAACAGCCCATAGCCTGGCGAGTGCAAATAGATACGAGATCTCTGGTGATATCACAACCGTCCAAATTAATTGCTTGTTTCAGCATCAGCCTTTTTGCATAAAGAAGCTAGCCCAATCTGAACCACACACTCACCCGCCGCGTGACAGCGCCAAAGACAAAAACATCACCCCTCCCCAATTCCAACCCTCTCTCTGCCTCACAGAAATCTCCCCCCTCGCCCAAACCCTCGCCGCCGCCATGGCCGCCGCCACCTCCCCCGCCGTCGCATTCTCGGGCGCCACCGCCGCCGCCATGCCCAAACCCGCCCGCCATCCTCTCCCGCGCCACCAGCCCGTCTCGCGCCGCGCGCTCCCCGCCCGCGTCGTCAGGTGTTGCGCCGCGTCCCCCGCCGCCACCTCCGCCGCGCCTCCCGCAACCGCGCTCCGGCCCTGGGGCCCGTCCGAGCCCCGCAAGGGCGCCGACATCCTCGTCGAGGCGCTCGAGCGCTGCGGCATCGTCGACGTCTTCGCCTACCCCGGCGGCGCCTCCATGGAGATCCACCAGGCGCTGACGCGCTCGCCCGTCATCACCAACCACCTCTTCCGCCACGAGCAGGGGGAGGCGTTCGCGGCGTCCGGCTACGCCCGCGCGTCCGGCCGCGTCGGCGTCTGCGTCGCCACCTCCGGCCCGGGGGCCACCAACCTCGTCTCCGCGCTCGCCGACGCCCTCCTCGACTCCATCCCCATGGTCGCCATCACGGGCCAGGTCCCCCGCCGCATGATCGGCACGGACGCGTTCCAGGAGACGCCCATAGTGGAGGTCACGCGCTCCATCACCAAGCACAACTACCTGGTCCTTGACGTGGAGGATATCCCCCGCGTCATCCAGGAAGCCTTCTTCCTTGCATCCTCTGGCCGCCCGGGGCCGGTGCTAGTTGATATCCCCAAGGACATCCAGCAGCAGATGGCTGTGCCCGTCTGGGACACTCCAATGAGTTTGCCAGGGTACATCGCCCGCCTGCCCAAGCCACCATCTACTGAATCGCTTGAGCAGGTCCTGCGTCTGGTTGGCGAGTCACGGCGCCCAATTCTGTATGTTGGTGGTGGCTGCGCTGCGTCTGGCGAGGAGTTGCGCCGCTTTGTTGAGCTTACTGGGATTCCAGTTACAACTACTCTGATGGGCCTTGGCAACTTCCCCAGCGACGACCCACTGTCTCTGCGCATGCTTGGGATGCATGGCACTGTGTATGCAAATTATGCAGTAGATAAGGCTGACCTGTTGCTCGCATTTGGTGTGCGGTTTGATGATCGTGTGACTGGGAAAATCGAGGCTTTTGCAAGCAGGTCCAAGATTGTGCACATTGACATTGACCCAGCTGAGATTGGCAAGAACAAGCAGCCACATGTCTCCATTTGTGCAGATGTTAAGCTTGCTTTACAGGGGTTGAATGATCTATTAAATGGGAGCAAAGCACAACAGGGTCTGGATTTTGGTCCATGGCACAAGGAGTTGGATCAGCAGAAGAGGGAGTTTCCTCTAGGATTCAAGACTTTTGGCGAGGCCATCCCGCCGCAATATGCTATCCAGGTACTGGATGAGCTGACAAAAGGGGAGGCGATCATTGCCACTGGTGTTGGGCAGCACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGTGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGCATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCAGCAGTTCGAGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATAGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAGCCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTATTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGTTTTGTAGTCTATGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATGTCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATCAATAATAAGTACTTCCATGGAATAATTCTCAGTTCTGTTTTGAATTTTGCATCTTCTCACAAACAGTGTGCTGGTTCCTTTCTGTTACTTTACATGTCTGCTGTGTCAGGTTCTGACATAACGA
CCGATGGAGGGTGGTCGGCAGGTTTTAGAAGGGGAATTGAAACTTTTTTTTGGGAAGAAGTCTGAATACAGTTGGGAGGAAAAATAGAAGTATATACTTCGATTAATTTATCAAGCCCGCTATCCAGTCTAATTTATCAAGCACTAGACAGTGTAGGGTGTTGGCATTCTTCTCTTCCTTGAGATCCGGCTTGAGAGGAGAGACCGAGGCTTCGGCTGTGTTGGTTGCTGATTTCTACAGCTTTTTGAGATAGAGAGAGAGATCCTGCAACTGTGGTTTGTCTTGCTGCTTGTACAGCGAGAGAGACATTGAGAGATATGTAGATCGTTTACCAGTTGTGCTGCTGTTATTCGTACTGGTACTGATTGTTGTTACTGTTGCTATCATGTGCAAATTGTTGTGATGGAAAATCAACAAAATTTTGATATTTTGCAAAGCGAGTTGGATTGAATGATTTGAGAAATGGTGACTGCTTTCCCTCAGACTTGTTGAGTGGCCTTGAGAATTGGTGTTTCATAGGTGGTGTATGCAGTTGCTAATGAAAGGCGACGGCTTGAAATTTCCGAAAGGCAGCCAATGATACTTTCTGAAAGTGATGTTTTTTTCGTCCAGGTTTCCGGTGGAGCAAGTCTAGACACACGTTGAGCCAATGTTTGTCAGCTTATTCTGCTCTTTAGTTTCAGTTTAGGTGCAGTTGTTTTGTTTACAGATTGCTGGGCAGAGCCCCGTGATCGGCTGAGCCTCCAAGAGATCCTTGCTTGCTCGACTGCGGATACGCTGAATCCTTTAAAACGCTCCCTAGTTTTAAGTTTTAGAGAACTGAGAATCAATTGGGGGCAACATTACTGGGTCGCCTCCCTGGGCCTCTACAGTTTTGTGGGCCCTATATGTAAGTGCCCCAGTGTTGTGGGGATTTGCGGCGTGGCGGGCGGCATTTGCGTCCTCTCTTCGGCGGCGCTGTTTCCCCCTCCTTCTTGCTGCTTCTGGAGGAGGTGGTCGGCGGCGGGTGTTGTGGGGGGTCGCATTGGAGCGGCGCGAACGCCGGTCCTGCTGCATCTGCCGCCATTGGTTGTT
CGTTCGCCCGTAGACCATTCATAAGAATCGGTATCGGAGAGACATAGGGGTTCTTTGGTTTCTAACCATATCTTGTCACACTTTACCATACATCACCTTAGTCAAATCTGATCAAATTAGGTGAGTATTTGGTTCTAGCCACATCTAAGGCAAGATTTGTTTTTCTGAGCAGTGAACCCCATATGTCATAGACAGAAAAATTGTGAAAAGATTCCTTTAGACGGTCAAAGCGTGGTTAACAATTTAATCAACTCAAGTAAGATAAATGCGATAAATGTGACAAAAATAATGTGTTATAGAAGTATGACAAAAATAATCACAATCCAAACAGTCTGATAGCTTGGCGAGTGCAAAATAGATACGAAATCTCTGGTGATATCACACGGGTCCAAAATAATTGCTTGTTTGAGCATCAGCCTTTCTGCACAAAAAAAGCTAGCCCAAACAAACGAGTGGCGTCCCATCTGAACCACACGCTCACCCGCCGCGTGACAGCGCCAAAGACAAAACCATCACCCCTCCCCAATTCCAACCCTCTCTCCGCCTCACAGAAATCTCTCCCCTCGCCCAAACCCTCGCCGCCGCCATGGCCGCCGCCACCTCCCCCGCCGTCGCATTCTCCGGCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCATGCCCAAGCCCGCCCGCCAGCCTCTCCCGCGCCACCAGCCCGCCTCGCGCCGCGCGCTCCCCGCCCGCGTCGTCAGGTGCTGCGCCGCGCCCCCCGCTGCTGCCACCTCCGCCGCGCCCCCCGCCACCGCGCTCCGGCCCTCGGGGCCCGTCCGAGCCCCGCAAGGGCGCCGACATCCTCGTCGAGGCGCTCGAGCGCTGCGGCATCGTCGACGTATTCGCCTACCCCGGCGGCGCGTCCATGGAGATCCACCAGGCGCTGACGCGCTCGCCCGTCATCACCAACCACCTCCTTCCGCCACGAGCGAGGGGGAGGCGTTCGCGGCGTCCGGCTACGCCCGCGCGTCCGGCCGCGTCGGCGTCTGCGTCGCCACCTCCGGCCCGGGGGCCACCAACCTCGTCTCCGCGCTCGCTGACGCCCTCCTCGACTCCATCCCCATGGTCGCCATCACGGGCCAGGTCCCCCGCCGCATGATCGGCACGGACGCGTTCCAGGAGACGCCCATAGTGGAGGTCACGCGCTCCATCACCAAGCACAACTACCTGGTCCTTGACGTGGAGGATATCCCCCGCGTCATCCAGGAAGCCTTCTTCCTCGCGTCCTCTGGCCGCCCGGGGCCGGTGCTGGTTGATATCCCCAAGGATATCCAGCAGCAGATGGCCGTGCCTATCTGGGACACGCCGATGAGTTTGCCAGGGTACATCGTCCCGCCTGCCCAAGCCACCATCTACTGAATCGCTTGAGCAGGTCCTGCGTCTGGTTGGCGAGTCACGGCGCCCAATTCTGTATGTTGGTGGTGGCTGCGCTGCATCCGGCGAGGAGTTGCGCCGCTTTGTTGAGCTCACTGGGATTCCGGTTACAACTACTCTGATGGGCCTTGGCAACTTCCCCAGCGACGACCCACTGTCTCTGCGCATGCTTGGGATGCATGGCACTGTGTATGCAAATTATGCAGTCGATAAGGCTGACCTGTTGCTTGCATTTGGTGTGCGGTTTGATGATCGCGTGACTGGGAAAATCGAGGCCTTTGCAAGCAGGTCCAAGATTGTGCACATTGACATTGACCCAGCTGAGATTGGCAAGAACAAGCAGCCACATGTCTCCATTTGTGCAGATGTTAAGCTTGCTTTACAGGGGTTGAATGCTCTATTAAATGGGAGCAAAGCACAACAGGGTCTGGATTTTGGTCCATGGCACAAGGAGTTGGATCAGCAGAAGAGGGAGTTTCCTCTAGGATTCAAGACTTTTGGCGAGGCCATCCCGCCGCAATATGCTATCCAGGTACTGGATGAGCTGACAAAAGGGGAGGCGATCATTGCTACTGGTGTTGGGCAGCACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGAGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCATTGATCCGTATTGAGAACCTCCCTGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAATGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATCGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGGTGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGCTTTGTAGTCTATGCTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATCAATAATAAGTACTTCCATGGAATAATTCTCAGTTCTGTTTTGAATTTTGCATCTTCTCACAAACAGTGTGCTGGTTCCTTTCTGTTACTTTACATGTCTGCCGTGTCCGGTTATGACATAATGACCGATGGAGGGTGGTCAGCAGGTTTTAGACGGGGAGTTGAAACTTTTTTTTGGGGGGAAGAAATCTGAATACAGTTGGGAGGAAAGATAAAAGCATATACCTTGATTAATTTATTGAGCCCAATATCCAGCCTAATTTATCAAGCAATAGGCAGTGTAGGGTGTTG
CGTTCGCCCGTAGACCATTCCTACGAATCGGTACCGGAGAGACATAGGGGCTGTATGGTTCCTAACCATACCTTGCCACACTTTGTCACACCTCATCTTAGGCAAATTTAATCAAGTTATGTAGGTGTTTGGTTTTAGCCACATCTAAGGCAAGATTTATTTTCCTGAGCAGTGAACCCCATATGTTATAGACATAAAAAGTGTGGGAAGATTCCCTTTAGTCAAACTGTGGCTAACAATTTATTAAGAATTAACTTAAGTAAGATAGGTGCAACAAATGTAGCAAAAATAATGTGGTATATATAGCAAAGATAGCCACAACCGCGAGTGGAAATACCAGATACGAGATCTCTGGTCATATCACACGAGTCCAAATTAATTGCTTTGTTTGAGGTTCAGCCTTTTTGCATAAAAAAGCTAGCCCAAACAAACGAGTGGCGTCCCATCTGAACCACACACTCACCCGCCGCGTGACAGCGCCAAAGACAAAACCATCACCCCTCCCCAATTCCAACCCTCTCTCTGCCTCACAGAAATCTCTCCCTCGCCCAAACCCTCGCCGCCGCCATGGCCGCAGCCACCTCCCCCGCCGTCGCATTCTCGGGCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCATACCCAAACCCGCCCGCCAGCCTCTCCCGCGCCACCAGCCCGCCTCGCGCCGCGCGCTCCCCGCCCGCATCGTCAGGTGCTGCGCCGCGTCCCCCGCCGCCACCTCCGTCGCGCCTCCCGCCACCGCGCTCCGGCCGTGGGGCCCCTCCGAGCCCCGCAAGGGCGCCGACATCCTCGTCGAGGCGCTGGAGCGCTGCGGCATCGTCGACGTCTTCGCCTACCCTGGCGGCGCGTCCATGGAGATCCACCAGGCGCTGACGCGCTCGCCAGTCATCACCAACCACCTCTTCCGCCACGAGCAGGGGGAGGCGTTCGCGGCGTCCGGGTACGCCCGCGCGTCCGGCCGCGTCGGCGTCTGCGTCGCCACCTCCGGCCCGGGGGCCACCAACCTCGTCTCCGCGCTCGCCGACGCTCTCCTCGACTCCATCCCCATGGTCGCCATCACGGGCCAGGTCCCCCGCCGCATGATCGGCACGGATGCGTTCCAGGAGACGCCCATCGTGGAGGTCACGCGCTCCATCACCAAGCACAACTACCTGGTCCTTGACGTGGAGGATATCCCCCGCGTCATCCAGGAAGCCTTCTTCCTCGCATCCTCTGGCCGCCCGGGGCCGGTGCTGGTTGATATCCCCAAGGACATCCAGCAGCAGATGGCTGTGCCTGTCTGGGACACGCCGATGAGTTTGCCAGGGTACATCGCCCGCCTGCCCAAGCCACCATCTACTGAATCGCTTGAGCAGGTCCTGCGTCTGGTTGGCGAGTCACGGCGCCCAATTCTGTATGTTGGTGGTGGCTGCGCTGCATCTGGTGAGGAGTTGCGCCGCTTTGTTGAGCTCACTGGGATTCCAGTTACAACTACTCTTATGGGCCTTGGCAACTTCCCCAGTGACGACCCACTGTCTCTGCGCATGCTGGGGATGCATGGCACTGTGTATGCAAATTATGCAGTAGATAAGGCTGACCTGTTGCTTGCATTTGGTGTGCGGTTTGATGATCGTGTGACCGGGAAAATCGAGGCTTTTGCAAGCAGGTCCAAGATTGTGCACATTGACATTGACCCAGCTGAGATTGGCAAGAACAAGCAGCCACATGTCTCCATTTGTGCAGATGTTAAGCTTGCTTTACAGGGGTTGAATGCTCTATTAAATGGGAGCAAAGCACAACAGGGTCTGGATTTTGGTCCATGGCACAAGGAGTTGGATCAGCAGAAGAGGGAGTTTCCTCTAGGATTCAAGACTTTTGGTGAGGCCATCCCGCCGCAATATGCTATCCAGGTACTGGATGAGCTGACAAAAGGGGAGGCGATCATTGCCACCGGTGTTGGGCAGCATCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCATCCGGTTTGGGTGCAATGGGATTTGGGTTGCCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGGGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGTATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAACCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATTGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTTAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATACCTGCGTGTTGTATCAACTACTGGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCGTGTAGTTTTGTAGTCTCTGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATCAATAATAAGCACTTCCATGGAATAATTCTCAGTTCTGTTTTGAATTTCACATCTTCTCACGAACAGTGTGCTGGTTCCTTTCTGTTACTTTACATGCCTGCCGTGTCAGGTTATGACATAACGACCGATGGAGGATTGGAGGGTGGTCGGCTGGTTTTAGACGGGGAATTGAAACATTTTTCTGGAAGAAATCTGAATACAGTTGGGAGGGGAAATGGAAGCATATATTTATCGAGCCCGCTATCCAGGCTAATTTATCAAGCACTAGACAGTGTAGGGTGTTGGCATTCTTCTCTTCCTTGATATCCGGCTTGAGAGGAGAGATTGAGGCTTCGGCTGTGTTGGTTGCTGATTTCTACAGCATTTTGAGAGAGAGAGAGAGATGTTGCAACTGTGTTTTGTCTTGGTTGCTTGTACAGAGAAAGAGATGACATTTAGAGATATGCAGATCGTTTACCAGTTGTGCTGCGTTTATTCGTACTGATTGTTGTTATTGTTGCTATCATGTGCAAATTGTTGTGATGGAAAATCAACAAAATTTTGATATTTTGCAAAGCGAGTTGGATTGAATGATTTGAGAAATGGTGACTTGTTGAGTGGCCTTGAGAATTGGTGTTTCATAGGTGTGCAGTTGGTAATGAAAGGCGGCGGCTTGAAATTTCCGAAAGGCAGGCAATGATACTTTCTGAAAGTGATGTTTTTTCTTCCAGGTTTCCGGTGGAACAAGTCTACGTTGAGCCAATGTTTGTCAGCTTATTCTGCTCTTTAGTTTCAGTTGTTTTGTTCACAGATTGCTGGGCAGAGCCCCATGATCGGCTGAGCCTCCAGGAGATCCTTGATTGCTCGACTGC
CGTTCGCCCGTAGACCATTCATACGAATCGGTACCGGAGAGACATAGGGGCTATTTGGTTTGTAGCCACATTTTGTCATACTTTGTGACACCGCATCTTATGCAAGTTTGATCAAATTAGGTGGATGTTTAGTTCTAACCACATGTAAGGGAAGATTTTTTTTTTTATGAGCATTGAACCCGTAGACACAAAAAGTGTAGGAAGATTACTTTAAACAAGCTAAAGTGTGGCTAACAATTTAAGCATCTCAGGTAAGATAAGTGCGACAAATATGGCAAAAATAATGTGGTATATATGACAAAGATAGTCACAATCCAAACAGCCCATAGCCTGGCGAGTGCAAATAGATACGAGATCTCTGGTGATATCACAACCGTCCAAATTAATTGCTTGTTTCAGCATCAGCCTTTTTGCATAAAGAAGCTAGCCCAATCTGAACCACACACTCACCCGCCGCGTGACAGCGCCAAAGACAAAACCATCACCCCTCCCCAATTCCAACCCTCTCTCTGCCTCACAGAAATCTCCCCCCTCGCCCAAACCCTCGCCGCCGCCATGGCCGCCGCCACCTCCCCCGCCGTCGCATTCTCGGGCGCCACCGCCGCCGCCATGCCCAAACCCGCCCGCCATCCTCTCCCGCGCCACCAGCCCGTCTCGCGCCGCGCGCTCCCCGCCCGCGTCGTCAGGTGTTGCGCCGCGTCCCCCGCCGCCACCTCCGCCGCGCCTCCCGCAACCGCGCTCCGGCCCTGGGGCCCGTCCGAGCCCCGCAAGGGCGCCGACATCCTCGTCGAGGCGCTCGAGCGCTGCGGCATCGTCGACGTCTTCGCCTACCCCGGCGGCGCCTCCATGGAGATCCACCAGGCGCTGACGCGCTCGCCCGTCATCACCAACCACCTCTTCCGCCACGAGCAGGGGGAGGCGTTCGCGGCGTCCGGCTACGCCCGCGCGTCCGGCCGCGTCGGCGTCTGCGTCGCCACCTCCGGCCCGGGGGCCACCAACCTCGTCTCCGCGCTCGCCGACGCCCTCCTCGACTCCATCCCCATGGTCGCCATCACGGGCCAGGTCCCCCGCCGCATGATCGGCACGGACGCGTTCCAGGAGACGCCCATAGTGGAGGTCACGCGCTCCATCACCAAGCACAACTACCTGGTCCTTGACGTGGAGGATATCCCCCGCGTCATCCAGGAAGCCTTCTTCCTTGCATCCTCTGGCCGCCCGGGGCCGGTGCTAGTTGATATCCCCAAGGACATCCAGCAGCAGATGGCTGTGCCCGTCTGGGACACTCCAATGAGTTTGCCAGGGTACATCGCCCGCCTGCCCAAGCCACCATCTACTGAATCGCTTGAGCAGGTCCTGCGTCTGGTTGGCGAGTCACGGCGCCCAATTCTGTATGTTGGTGGTGGCTGCGCTGCGTCTGGCGAGGAGTTGCGCCGCTTTGTTGAGCTTACTGGGATTCCAGTTACAACTACTCTGATGGGCCTTGGCAACTTCCCCAGCGACGACCCACTGTCTCTGCGCATGCTTGGGATGCATGGCACTGTGTATGCAAATTATGCAGTAGATAAGGCTGACCTGTTGCTCGCATTTGGTGTGCGGTTTGATGATCGTGTGACTGGGAAAATCGAGGCTTTTGCAAGCAGGTCCAAGATTGTGCACATTGACATTGACCCAGCTGAGATTGGCAAGAACAAGCAGCCACATGTCTCCATTTGTGCAGATGTTAAGCTTGCTTTACAGGGGTTGAATGATCTATTAAATGGGAGCAAAGCACAACAGGGTCTGGATTTTGGTCCATGGCACAAGGAGTTGGATCAGCAGAAGAGGGAGTTTCCTCTAGGATTCAAGACTTTTGGCGAGGCCATCCCGCCGCAATATGCTATCCAGGTACTGGATGAGCTGACAAAAGGGGAGGCGATCATTGCCACTGGTGTTGGGCAGCACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGTGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGCATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCAGCAGTTCGAGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATAGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAGCCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTATTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGTTTTGTAGTCTATGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATGTCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATCAATAATAAGTACTTCCATGGAATAATTCTCAGTTCTGTTTTGAATTTTGCATCTTCTCACAAACAGTGTGCTGGTTCCTTTCTGTTACTTTACATGTCTGCTGTGTCAGGTTCTGACATAACGACCGATGGAGGGTGGTCGGCAGGTTTTAGAAGGGGAATTGAAACTTTTTTTTGGGAAGAAGTCTGAATACAGTTGGGAGGAAAAATAGAAGTATATACTTCGATTAATTTATCAAGCCCGCTATCCAGTCTAATTTATCAAGCACTAGACAGTGTAGGGTGTTGGCATTCTTCTCTTCCTTGAGATCCGGCTTGAGAGGAGAGACCGAGGCTTCGGCTGTGTTGGTTGCTGATTTCTACAGCTTTTTGAGATAGAGAGAGAGATCCTGCAACTGTGGTTTGTCTTGCTGCTTGTACAGCGAGAGAGACATTGAGAGATATGTAGATCGTTTACCAGTTGTGCTGCTGTTATTCGTACTGGTACTGATTGTTGTTACTGTTGCTATCATGTGCAAATTGTTGTGATGGAAAATCAACAAAATTTTGATATTTTGCAAAGCGAGTTGGATTGAATGATTTGAGAAATGGTGACTGCTTTCCCTCAGACTTGTTGAGTGGCCTTGAGAATTGGTGTTTCATAGGTGGTGTATGCAGTTGCTAATGAAAGGCGACGGCTTGAAATTTCCGAAAGGCAGCCAATGATACTTTCTGAAAGTGATGTTTTTTTCGTCCAGGTTTCCGGTGGAGCAAGTCTAGACACACGTTGAGCCAATGTTTGTCAGCTTATTCTGCTCTTTAGTTTCAGTTTAGGTGCAGTTGTTTTGTTTACAGATTGCTGGGCAGAGCCCCGTGATCGGCTGAGCCTCCAAGAGATCCT
tnantggtta ggtgctggtg gtccgaaggt ccacgccgcc aactacg
CNANTACGTAGTTGGCGGCGTGGACCTTCGGACCACCAGCACCTAAC
TNANTGGTTAGGTGCTGGTGGTCCGAAGGTCCACGCCGCCAACTACG
ANGNGTCGTAGTTGGCGGCGTGGACCTTCGGACCACCAGCACCTAAC
TGGATATCATAGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGGTTAGGTGCTGGTGGTCCGAAGGTCCACGCCGCCAACTACGTGGATATCATAGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGG
CCATGATCATGTCCTTGAAAGCACCACCGCTTGGGATCATAGGCAGCACGTGCTCCTGATGCGGGACTATGATATCCACGTAGTTGGCGGCGTGGACCTTCGGACCACCAGCACCTAACCCATGATCATGTCCTTGAAAGCACCACCGCTTGGGATCATAGGCAGCACGTGCTCCTGATGCGGGACTATGATATCCA
TGGATATCATAGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGGTTAGGTGCTGGTGGTCCGAAGGTCCACGCCGCCAACTACGGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATGCCCGCGT
ACGCGGGCATCATGCTGATTGCGCATGTCACACTTGTAGGTCTTGTAGGTCGAAATTTCAGTACGAGGTCCTGCCATCCGTAGTTGGCGGCGTGGACCTTCGGACCACCAGCACCTAACCCATGATCATGTCCTTGAAAGCACCACCGCTTGGGATCATAGGCAGCACGTGCTCCTGATGCGGGACTATGATATCCA
GGAGTTGGCGTTGATCCGNC
AACTACAGGGTTCGGAACTAAGTAANT
tggcaggatatattgtggtgtaaacaaattgacgcttagacaacttaataacacattgcggacgtttttaatgtactgaattaacgccgaattgaattcgagctcggtaccactggattttggttttaggaattagaaattttattgatagaagtattttacaaatacaaatacatactaagggtttcttatatgctcaacacatgagcgaaaccctataagaaccctaattcccttatctgggaactactcacacattattctggagaaaaatagagagagatagatttgtagagagagactggtgatttttgcggactctattagatctgggtaactggcctaactggccttggaggagctggcaactcaaaatccctttgccaaaaaccaacatcatgccatccaccatgcttgtatccagctgcgcgcaatgtaccccgggctgtgtatcccaaagcctcatgcaacctaacagatggatcgtttggaaggcctataacagcaaccacagacttaaaaccttgcgcctccatagacttaagcaaatgtgtgtacaatgtggatcctaggcccaacctttgatgcctatgtgacacgtaaacagtactctcaactgtccaatcgtaagcgttcctagccttccagggcccagcgtaagcaataccagccacaacaccctcaacctcagcaaccaaccaagggtatctatcttgcaacctctcgagatcatcaatccactcttgtggtgtttgtggctctgtcctaaagttcactgtagacgtctcaatgtaatggttaacgatatcacaaaccgcggccatatcagctgctgtagctggcctaatctcaactggtctcctctccggagacatggcttctacctacaaaaaagctccgcacgaggctgcatttgtcacaaatcatgaaaagaaaaactaccgatgaacaatgctgagggattcaaattctacccacaaaaagaagaaagaaagatctagcacatctaagcctgacgaagcagcagaaatatataaaaatataaaccatagtgcccttttcccctcttcctgatcttgtttagcatggcggaaattttaaaccccccatcatctcccccaacaacggcggatcgcagatctacatccgagagccccattccccgcgagatccgggccggatccacgccggcgagagccccagccgcgagatcccgcccctcccgcgcaccgatctgggcgcgcacgaagccgcctctcgcccacccaaactaccaaggccaaagatcgagaccgagacggaaaaaaaaaacggagaaagaaagaggagaggggcggggtggttaccggcgcggcggcggcggagggggaggggggaggagctcgtcgtccggcagcgaggggggaggaggtggaggtggtggtggtggtggtggtagggttggggggatgggaggagaggggggggtatgtatatagtggcgatggggggcgtttctttggaagcggagggagggccggcctcgtcgctggctcgcgatcctcctcgcgtttccggcccccacgacccggacccacctgctgttttttctttttcttttttttctttctttttttttttttggctgcgagacgtgcggtgcgtgcggacaactcacggtgatagtgggggggtgtggagactattgtccagttggctggactggggtgggttgggttgggttgggttgggctgggcttgctatggatcgtggatagcactttgggctttaggaactttaggggttgtttttgtaaatgttttgagtctaagtttatcttttatttttactagaaaaaatacccatgcgctgcaacgggggaaagctattttaatcttattattgttcattgtgagaattcgcctgaatatatatttttctcaaaaattatgtcaaattagcatatgggtttttttaaagatatttcttatacaaatccctctgtatttacaaaagcaaacgaacttaaaacccgactcaaatacagatatgcatttccaaaagcgaataaacttaaaaaccaattcatacaaaaatgacgtatcaaagtaccgacaaaaacatcctcaatttttataatagtagaaaagagtaaatttcactttgggccaccttttattaccgatattttactttataccaccttttaactgatgttttcacttttgaccaggtaatcttacctttgttttattttggactatcccgactctcttctcaagcatatgaatgacctcgagtatgctagtctagagtcgacctgcagggtgcagcgtgacccggtcgtgcccctctctagagataatgagcattgcatgtctaagttataaaaaattaccacatattttttttgtcacacttgtttgaagtgcagtttatctatctttatacatatatttaaactttactctacgaataatataatctatagtactacaataatatcagtgttttagagaatcatataaatgaacagttagacatggtctaaaggacaattgagtattttgacaacaggactctacagttttatctttttagtgtgcatgtgttctcctttttttttgcaaatagcttcacctatataatacttcatccattttattagtacatccatttagggtttagggttaatggtttttatagactaatttttttagtacatctattttattctattttagcctctaaattaagaaaactaaaactctattttagtttttttatttaataatttagatataaaatagaataaaataaagtgactaaaaattaaacaaataccctttaagaaattaaaaaaactaaggaaacatttttcttgtttcgagtagataatgccagcctgttaaacgccgtcgacgagtctaacggacaccaaccagcgaaccagcagcgtcgcgtcgggccaagcgaagcagacggcacggcatctctgtcgctgcctctggacccctctcgagagttccgctccaccgttggacttgctccgctgtcggcatccagaaattgcgtggcggagcggcagacgtgagccggcacggcaggcggcctcctcctcctctcacggcacggcagctacgggggattcctttcccaccgctccttcgctttcccttcctcgcccgccgtaataaatagacaccccctccacaccctctttccccaacctcgtgttgttcggagcgcacacacacacaaccagatctcccccaaatccacccgtcggcacctccgcttcaaggtacgccgctcgtcctccccccccccccctctctaccttctctagatcggcgttccggtccatggttagggcccggtagttctacttctgttcatgtttgtgttagatccgtgtttgtgttagatccgtgctgctagcgttcgtacacggatgcgacctgtacgtcagacacgttctgattgctaacttgccagtgtttctctttggggaatcctgggatggctctagccgttccgcagacgggatcgatttcatgattttttttgtttcgttgcatagggtttggtttgcccttttcctttatttcaatatatgccgtgcacttgtttgtcgggtcatcttttcatgcttttttttgtcttggttgtgatgatgtggtctggttgggcggtcgttctagatcggagtagaattctgtttcaaactacctggtggatttattaattttggatctgtatgtgtgtgccatacatattcatagttacgaattgaagatgatggatggaaatatcgatctaggataggtatacatgttgatgcgggttttactgatgcatatacagagatgctttttgttcgcttggttgtgatgatgtggtgtggttgggcggtcgttcattcgttctagatcggagtagaatactgtttcaaactacctggtgtatttattaattttggaactgtatgtgtgtgtcatacatcttcatagttacgagtttaagatggatggaaatatcgatctaggataggtatacatgttgatgtgggttttactgatgcatatacatgatggcatatgcagcatctattcatatgctctaaccttgagtacctatctattataataaacaagtatgttttataattattttgatcttgatatacttggatgatggcatatgcagcagctatatgtggatttttttagccctgccttcatacgctatttatttgcttggtactgtttcttttgtcgatgctcaccctgttgtttggtgttacttctgcaggaggatcacaagtttgtacaaaaaagcaggctatggccgccgccacctcccccgccgtcgcattctcgggcgccaccgccgccgccatgcccaaacccgcccgccatcctctcccgcgccaccagcccgtctcgcgccgcgcgctccccgcccgcgtcgtcaggtgttgcgccgcgtcccccgccgccacctccgccgcgcctcccgcaaccgcgctccggccctggggcccgtccgagccccgcaagggcgccgacatcctcgtcgaggcgctcgagcgctgcggcatcgtcgacgtcttcgcctaccccggcggcgcctccatggagatccaccaggcgctgacgcgctcgcccgtcatcaccaaccacctcttccgccacgagcagggggaggcgttcgcggcgtccggctacgcccgcgcgtccggccgcgtcggcgtctgcgtcgccacctccggcccgggggccaccaacctcgtctccgcgctcgccgacgccctcctcgactccatccccatggtcgccatcacgggccaggtcccccgccgcatgatcggcacggacgcgttccaggagacgcccatagtggaggtcacgcgctccatcaccaagcacaactacctggtccttgacgtggaggatatcccccgcgtcatccaggaagccttcttccttgcatcctctggccgcccggggccggtgctagttgatatccccaaggacatccagcagcagatggctgtgcccgtctgggacactccaatgagtttgccagggtacatcgcccgcctgcccaagccaccatctactgaatcgcttgagcag
gtcctgcgtctggttggcgagtcacggcgcccaattctgtatgttggtggtggctgcgctgcgtctggcgaggagttgcgccgctttgttgagcttactgggattccagttacaactactctgatgggccttggcaacttccccagcgacgacccactgtctctgcgcatgcttgggatgcatggcactgtgtatgcaaattatgcagtagataaggctgacctgttgctcgcatttggtgtgcggtttgatgatcgtgtgactgggaaaatcgaggcttttgcaagcaggtccaagattgtgcacattgacattgacccagctgagattggcaagaacaagcagccacatgtctccatttgtgcagatgttaagcttgctttacaggggttgaatgatctattaaatgggagcaaagcacaacagggtctggattttggtccatggcacaaggagttggatcagcagaagagggagtttcctctaggattcaagacttttggcgaggccatcccgccgcaatatgctatccaggtactggatgagctgacaaaaggggaggcgatcattgccactggtgttgggcagcaccagatgtgggcggctcagtattacacttacaagcggccacggcagtggctgtcttcgtctggtttgggggcaatgggatttgggttaccagctgcagctggcgctgctgtggccaacccaggtgttacagttgttgacattgatggtgatggtagtttcctcatgaacattcaggagttggcgttgatccgcattgagaacctcccagtgaaggtgatgatattgaacaaccagcatctgggaatggtggtgcagtgggaggataggttttacaaggccaatcgggcgcacacataccttggcaacccagaaaatgagagtgagatatatccagattttgtgacgattgctaaaggattcaacgttccagcagttcgagtgacgaagaagagcgaagtcactgcagcaatcaagaagatgcttgagaccccagggccatacttgttggatatcatagtcccgcatcaggagcacgtgctgcctatgatcccaaatggtggtgctttcaaggacatgatcatggagggtgatggcaggacctcgtactgatacccagctttcttgtacaaagtggtgatcctactagtagaaggagtgcgtcgaagcagatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatcgaaagcttagcttgagcttggatcagattgtcgtttcccgccttcagtttaaactatcagtgtttgacaggatatattggcgggtaaac
ATTTTCCATTCACTTGGCCC
TGCTATCTGGCTCAGCTGC
ATGGTGGAAGGGCGGTTGTGA
CTCCCGCGCACCGATCTG
CCCGCCCCTCTCCTCTTTC
AAGCCGCCTCTCGCCCACCCA
AYCAGATGTGGGCGGCTCAGTAT
GGGATATGTAGGACAAGAAACTTGCATGA
ACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGAGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCATTGATCCGTATTGAGAACCTCCCTGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAATGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATCGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATtCCcAatGGcGGcGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATGGTCCGAAGGTCCACGCCGCCAACTACGAGTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGGTGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGCTTTGTAGTCTATGCTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGAGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCATTGATCCGTATTGAGAACCTCCCTGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAATGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATCGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTTCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGGTGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGCTTTGTAGTCTATGCTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ATCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCATCCGGTTTGGGTGCAATGGGATTTGGGTTGCCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGGGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGTATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAACCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATTGTCCCGCATCAGGAGCACGTGAatGGcGGcGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATGGTCCGAAGGTCCACGCCGCCAACTACGAGTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTTAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATACCTGCGTGTTGTATCAACTACTGGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCGTGTAGTTTTGTAGTCTCTGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ATCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCATCCGGTTTGGGTGCAATGGGATTTGGGTTGCCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGGGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGTATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAACCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATTGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTTAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATACCTGCGTGTTGTATCAACTACTGGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCGTGTAGTTTTGTAGTCTCTGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGTGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGCATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCAGCAGTTCGAGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATAGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTAatGGcGGcGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATGGTCCGAAGGTCCACGCCGCCAACTACGAGTCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAGCCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTATTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGTTTTGTAGTCTATGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATGTCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGTGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGCATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCAGCAGTTCGAGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATAGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAGCCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTATTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGTTTTGTAGTCTATGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATGTCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGAGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCATTGATCCGTATTGAGAACCTCCCTGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAATGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATCGTCCCGCATCAGGAGCACAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGGTGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGCTTTGTAGTCTATGCTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGAGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCATTGATCCGTATTGAGAACCTCCCTGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAATGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATCGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGGTGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGCTTTGTAGTCTATGCTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ATCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCATCCGGTTTGGGTGCAATGGGATTTGGGTTGCCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGGGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGTATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAACCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATTGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTTAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATACCTGCGTGTTGTATCAACTACTGGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCGTGTAGTTTTGTAGTCTCTGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ATCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCATCCGGTTTGGGTGCAATGGGATTTGGGTTGCCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGGGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGTATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAACCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATTGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTTAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATACCTGCGTGTTGTATCAACTACTGGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCGTGTAGTTTTGTAGTCTCTGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGTGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGCATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCAGCAGTTCGAGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATAGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATtCCcAatGGcGGcGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATGGTCCGAAGGTCCACGCCGCCAACTACGAGTCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAGCCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTATTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGTTTTGTAGTCTATGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATGTCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGTGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGCATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCAGCAGTTCGAGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATAGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAGCCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTATTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGTTTTGTAGTCTATGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATGTCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGAGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCATTGATCCGTATTGAGAACCTCCCTGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAATGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATCGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATtCCcAatGGcGGcGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATGGTCCGAAGGTCCACGCCGCCAACTACGAGTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGGTGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGCTTTGTAGTCTATGCTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGAGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCATTGATCCGTATTGAGAACCTCCCTGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAATGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATCGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGGTGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGCTTTGTAGTCTATGCTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ATCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCATCCGGTTTGGGTGCAATGGGATTTGGGTTGCCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGGGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGTATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAACCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATTGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTTAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATACCTGCGTGTTGTATCAACTACTGGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCGTGTAGTTTTGTAGTCTCTGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ATCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCATCCGGTTTGGGTGCAATGGGATTTGGGTTGCCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGGGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGTATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAACCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATTGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTTAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATACCTGCGTGTTGTATCAACTACTGGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCGTGTAGTTTTGTAGTCTCTGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGTGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGCATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCAGCAGTTCGAGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATAGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAGCCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTATTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGTTTTGTAGTCTATGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATGTCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGTGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGCATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCAGCAGTTCGAGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATAGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAGCCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTATTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGTTTTGTAGTCTATGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATGTCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGAGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCATTGATCCGTATTGAGAACCTCCCTGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAATGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATCGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATtCCcAatGGcGGcGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATGGTCCGAAGGTCCACGCCGCCAACTACGAGTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGGTGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGCTTTGTAGTCTATGCTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGAGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCATTGATCCGTATTGAGAACCTCCCTGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAATGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATCGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGGTGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGCTTTGTAGTCTATGCTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ATCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCATCCGGTTTGGGTGCAATGGGATTTGGGTTGCCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGGGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGTATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAACCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATTGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGTAGTTGGCGGCGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGKCAGGACCTCGTACTGAAATGGTCCGAAGGTCCACGCCTCGTATGAAATGGTCCGAAGGTCCACGCCGCCAACTACGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTATGATTCCCAATGGCGGCTTCCCAATGGCGGCGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATGGTCCGAAGGTCCACGCCGCCAACTACGATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTTAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATACCTGCGTGTTGTATCAACTACTGGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCGTGTAGTTTTGTAGTCTCTGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ATCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCATCCGGTTTGGGTGCAATGGGATTTGGGTTGCCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGGGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGTATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAACCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATTGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTTAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATACCTGCGTGTTGTATCAACTACTGGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCGTGTAGTTTTGTAGTCTCTGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGTGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGCATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCAGCAGTTCGAGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATAGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATtCCcAatGGcGGcGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATGGTCCGAAGGTCCACGCCGCCAACTACGAGTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAGCCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTATTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGTTTTGTAGTCTATGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATGTCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGTGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGCATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCAGCAGTTCGAGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATAGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATTCCCAATGGCGGCGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAAATGGTCCGAAGGTCCACGCCGCCACCTCGTACTGAAATGGTCCRAAGGTCCACGCCGCCAACTACGAGTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGARATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAGCCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTATTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGTTTTGTAGTCTATGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATGTCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGAGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCATTGATCCGTATTGAGAACCTCCCTGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAATGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATCGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATtCCcAatGGcGGcGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATGGTCCGAAGGTCCACGCCGCCAACTACGAGTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGGTGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGCTTTGTAGTCTATGCTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGAGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCATTGATCCGTATTGAGAACCTCCCTGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAATGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATCGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGGTGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGCTTTGTAGTCTATGCTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ATCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCATCCGGTTTGGGTGCAATGGGATTTGGGTTGCCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGGGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGTATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAACCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATTGTCCCGCATGCTTTTAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATACCTGCGTGTTGTATCAACTACTGGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCGTGTAGTTTTGTAGTCTCTGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ATCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCATCCGGTTTGGGTGCAATGGGATTTGGGTTGCCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGGGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGTATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAACCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATTGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTTAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATACCTGCGTGTTGTATCAACTACTGGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCGTGTAGTTTTGTAGTCTCTGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGTGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGCATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCAGCAGTTCGAGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATAGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAGCCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTATTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGTTTTGTAGTCTATGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATGTCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGTGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGCATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCAGCAGTTCGAGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATAGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAGCCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTATTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGTTTTGTAGTCTATGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATGTCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGAGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCATTGATCCGTATTGAGAACCTCCCTGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAATGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATCGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGGTGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGCTTTGTAGTCTATGCTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGAGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCATTGATCCGTATTGAGAACCTCCCTGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAATGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATCGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGGTGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGCTTTGTAGTCTATGCTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ATCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCATCCGGTTTGGGTGCAATGGGATTTGGGTTGCCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGGGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGTATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAACCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATTGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATtCCcAatGGcGGcGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATGGTCCGAAGGTCCACGCCGCCAACTACGAGTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTTAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATACCTGCGTGTTGTATCAACTACTGGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCGTGTAGTTTTGTAGTCTCTGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ATCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCATCCGGTTTGGGTGCAATGGGATTTGGGTTGCCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGGGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGTATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAACCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATTGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTTAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATACCTGCGTGTTGTATCAACTACTGGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCGTGTAGTTTTGTAGTCTCTGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGTGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGCATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCAGCAGTTCGAGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATCGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGGTGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAGCCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTATTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGTTTTGTAGTCTATGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATGTCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGTGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGCATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCAGCAGTTCGAGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATCGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGGTGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAGCCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTATTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGTTTTGTAGTCTATGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATGTCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGAGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCATTGATCCGTATTGAGAACCTCCCTGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAATGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATCGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATtCCcAatGGcGGcGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATGGTCCGAAGGTCCACGCCGCCAACTACGAGTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGGTGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGCTTTGTAGTCTATGCTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGAGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCATTGATCCGTATTGAGAACCTCCCTGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAATGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATCGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGGTGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGCTTTGTAGTCTATGCTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ATCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCATCCGGTTTGGGTGCAATGGGATTTGGGTTGCCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGGGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGTATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAACCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATTGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTTAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATACCTGCGTGTTGTATCAACTACTGGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCGTGTAGTTTTGTAGTCTCTGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ATCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCATCCGGTTTGGGTGCAATGGGATTTGGGTTGCCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGGGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGTATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAACCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATTGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTTAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATACCTGCGTGTTGTATCAACTACTGGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCGTGTAGTTTTGTAGTCTCTGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGTGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGCATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCAGCAGTTCGAGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATAGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAGCCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTATTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGTTTTGTAGTCTATGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATGTCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGTGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGCATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCAGCAGTTCGAGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATAGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAGCCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTATTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGTTTTGTAGTCTATGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATGTCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGAGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCATTGATCCGTATTGAGAACCTCCCTGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAATGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATCGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGGTGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGCTTTGTAGTCTATGCTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGAGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCATTGATCCGTATTGAGAACCTCCCTGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAATGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATCGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGGTGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGCTTTGTAGTCTATGCTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ATCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCATCCGGTTTGGGTGCAATGGGATTTGGGTTGCCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGGGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGTATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAACCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATTGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTTAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATACCTGCGTGTTGTATCAACTACTGGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCGTGTAGTTTTGTAGTCTCTGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ATCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCATCCGGTTTGGGTGCAATGGGATTTGGGTTGCCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGGGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGTATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAACCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATTGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTTAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATACCTGCGTGTTGTATCAACTACTGGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCGTGTAGTTTTGTAGTCTCTGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGTGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGCATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCAGCAGTTCGAGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATAGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAGCCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTATTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGTTTTGTAGTCTATGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATGTCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGTGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGCATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCAGCAGTTCGAGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATAGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAGCCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTATTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGTTTTGTAGTCTATGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATGTCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGAGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCATTGATCCGTATTGAGAACCTCCCTGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAATGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATCGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATtCCcAatGGcGGcGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATGGTCCGAAGGTCCACGCCGCCAACTACGAGTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGGTGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGCTTTGTAGTCTATGCTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGAGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCATTGATCCGTATTGAGAACCTCCCTGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAATGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATCGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATtCCcAatGGcGGcGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATGGTCCGAAGGTCCACGCCGCCAACTACGAGTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGGTGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGCTTTGTAGTCTATGCTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ATCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCATCCGGTTTGGGTGCAATGGGATTTGGGTTGCCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGGGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGTATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAACCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATTGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCtGcGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATGGTCCGAAGGTCCACGCCGCCAACTACGAGTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTTAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATACCTGCGTGTTGTATCAACTACTGGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCGTGTAGTTTTGTAGTCTCTGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ATCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCATCCGGTTTGGGTGCAATGGGATTTGGGTTGCCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGGGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGTATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAACCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATTGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTTAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATACCTGCGTGTTGTATCAACTACTGGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCGTGTAGTTTTGTAGTCTCTGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGTGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGCATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCAGCAGTTCGAGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATAGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAGCCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTATTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGTTTTGTAGTCTATGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATGTCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGTGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGCATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCAGCAGTTCGAGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATAGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAGCCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTATTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGTTTTGTAGTCTATGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATGTCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGAGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCATTGATCCGTATTGAGAACCTCCCTGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAATGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATCGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATtCCcAatGGcGGcGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATGGTCCGAAGGTCCACGCCGCCAACTACGAGTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGGTGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGCTTTGTAGTCTATGCTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGAGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCATTGATCCGTATTGAGAACCTCCCTGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAATGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATCGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGGTGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGCTTTGTAGTCTATGCTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ATCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCATCCGGTTTGGGTGCAATGGGATTTGGGTTGCCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGGGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGTATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAACCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATTGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTTAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATACCTGCGTGTTGTATCAACTACTGGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCGTGTAGTTTTGTAGTCTCTGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ATCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCATCCGGTTTGGGTGCAATGGGATTTGGGTTGCCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGGGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGTATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAACCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATTGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTTAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATACCTGCGTGTTGTATCAACTACTGGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCGTGTAGTTTTGTAGTCTCTGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGTGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGCATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCAGCAGTTCGAGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATAGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAGCCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTATTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGTTTTGTAGTCTATGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATGTCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGTGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGCATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCAGCAGTTCGAGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATAGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAGCCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTATTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGTTTTGTAGTCTATGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATGTCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGAGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCATTGATCCGTATTGAGAACCTCCCTGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAATGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATCGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGGTGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGCTTTGTAGTCTATGCTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGAGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCATTGATCCGTATTGAGAACCTCCCTGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAATGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATCGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGGTGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGCTTTGTAGTCTATGCTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ATCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCATCCGGTTTGGGTGCAATGGGATTTGGGTTGCCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGGGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGTATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAACCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATTGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTTAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATACCTGCGTGTTGTATCAACTACTGGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCGTGTAGTTTTGTAGTCTCTGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ATCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCATCCGGTTTGGGTGCAATGGGATTTGGGTTGCCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGGGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGTATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAACCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATTGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTTAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATACCTGCGTGTTGTATCAACTACTGGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCGTGTAGTTTTGTAGTCTCTGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGTGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGCATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCAGCAGTTCGAGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATAGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATtCCcAatGGcGGcGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATGGTCCGAAGGTCCACGCCGCCAACTACGAGTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAGCCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTATTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGTTTTGTAGTCTATGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATGTCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGTGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGCATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCAGCAGTTCGAGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATAGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAGCCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTATTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGTTTTGTAGTCTATGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATGTCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGAGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCATTGATCCGTATTGAGAACCTCCCTGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAATGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATCGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGGTGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGCTTTGTAGTCTATGCTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGAGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCATTGATCCGTATTGAGAACCTCCCTGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAATGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATCGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGGTGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGCTTTGTAGTCTATGCTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ATCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCATCCGGTTTGGGTGCAATGGGATTTGGGTTGCCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGGGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGTATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAACCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATTGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTTAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATACCTGCGTGTTGTATCAACTACTGGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCGTGTAGTTTTGTAGTCTCTGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ATCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCATCCGGTTTGGGTGCAATGGGATTTGGGTTGCCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGGGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGTATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAACCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATTGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTTAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATACCTGCGTGTTGTATCAACTACTGGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCGTGTAGTTTTGTAGTCTCTGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGTGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGCATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCAGCAGTTCGAGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATAGTCCCGCATCAGGAGCACGTGTCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAGCCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTATTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGTTTTGTAGTCTATGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATGTCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGTGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGCATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCAGCAGTTCGAGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATAGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATtCCcAatGGcGGcGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATGGTCCGAAGGTCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAGCCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTATTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGTTTTGTAGTCTATGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATGTCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGAGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCATTGATCCGTATTGAGAACCTCCCTGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAATGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATCGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATtCCcAatGGcGGcGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTgcAgGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGGTGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGCTTTGTAGTCTATGCTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGAGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCATTGATCCGTATTGAGAACCTCCCTGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAATGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATCGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGGTGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGCTTTGTAGTCTATGCTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ATCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCATCCGGTTTGGGTGCAATGGGATTTGGGTTGCCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGGGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGTATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAACCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATTGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTTAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATACCTGCGTGTTGTATCAACTACTGGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCGTGTAGTTTTGTAGTCTCTGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ATCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCATCCGGTTTGGGTGCAATGGGATTTGGGTTGCCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGGGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGTATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAACCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATTGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTTAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATACCTGCGTGTTGTATCAACTACTGGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCGTGTAGTTTTGTAGTCTCTGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGTGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGCATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCAGCAGTTCGAGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATAGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATtCCcAatGGcGGcGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATggtccgaaggtCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAGCCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTATTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGTTTTGTAGTCTATGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATGTCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGTGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGCATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCAGCAGTTCGAGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATAGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAGCCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTATTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGTTTTGTAGTCTATGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATGTCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGAGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCATTGATCCGTATTGAGAACCTCCCTGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAATGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATCGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATtCCcAatGGcGGcGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTgcAggTACAAGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGGTGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGCTTTGTAGTCTATGCTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGAGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCATTGATCCGTATTGAGAACCTCCCTGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAATGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATCGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGGTGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGCTTTGTAGTCTATGCTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ATCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCATCCGGTTTGGGTGCAATGGGATTTGGGTTGCCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGGGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGTATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAACCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATTGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTTAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATACCTGCGTGTTGTATCAACTACTGGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCGTGTAGTTTTGTAGTCTCTGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ATCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCATCCGGTTTGGGTGCAATGGGATTTGGGTTGCCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGGGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGTATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAACCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCGGCAGTTCGTGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATTGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTTAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATACCTGCGTGTTGTATCAACTACTGGGGGTTCAACTGTGAACCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTGTTACTTAGTTCCGAACCGTGTAGTTTTGTAGTCTCTGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATATCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGTGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGCATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCAGCAGTTCGAGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATAGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAGCCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTATTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGTTTTGTAGTCTATGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATGTCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
ACCAGATGTGGGCGGCTCAGTATTACACTTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGTCTGGTTTGGGGGCAATGGGATTTGGGTTACCAGCTGCAGCTGGCGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTTACAGTTGTTGACATTGATGGTGATGGTAGTTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCGTTGATCCGCATTGAGAACCTCCCAGTGAAGGTGATGATATTGAACAACCAGCATCTGGGAATGGTGGTGCAGTGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCCAATCGGGCGCACACATACCTTGGCAACCCAGAAAATGAGAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGACGATTGCTAAAGGATTCAACGTTCCAGCAGTTCGAGTGACGAAGAAGAGCGAAGTCACTGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATAGTCCCGCATCAGGAGCACGTGCTGCCTATGATCCCAAGCGGTGGTGCTTTCAAGGACATGATCATGGAGGGTGATGGCAGGACCTCGTACTGAAATTTCGACCTACAAGACCTACAAGTGTGACATGCGCAATCAGCATGATGCCCGCGTGTTGTATCAACTACTAGGGGTTCAACTGTGAGCCATGCGTTTTCTAGTTTGCTTGTTTCATTCATATAAGCTTGTATTACTTAGTTCCGAACCCTGTAGTTTTGTAGTCTATGTTCTCTTTTGTAGGGATGTGCTGTCATAAGATGTCATGCAAGTTTCTTGTCCTACATATC
TCCAAGGTTGCGGCCGCGCCCAAGGAACCCTTTTCTGGGCCAT:::::TACTCGGCCACGACTGGTAATTTAATTTTCAATTTATTT
tggcaggatatattgtggtgtaaacaaattgacgcttagacaacttaataacacattgcggacgtttttaatgtactgaattaacgccgaattgaattcgagctcggtaccactggattttggttttaggaattagaaattttattgatagaagtattttacaaatacaaatacatactaagggtttcttatatgctcaacacatgagcgaaaccctataagaaccctaattcccttatctgggaactactcacacattattctggagaaaaatagagagagatagatttgtagagagagactggtgatttttgcggactctattagatctgggtaactggcctaactggccttggaggagctggcaactcaaaatccctttgccaaaaaccaacatcatgccatccaccatgcttgtatccagctgcgcgcaatgtaccccgggctgtgtatcccaaagcctcatgcaacctaacagatggatcgtttggaaggcctataacagcaaccacagacttaaaaccttgcgcctccatagacttaagcaaatgtgtgtacaatgtggatcctaggcccaacctttgatgcctatgtgacacgtaaacagtactctcaactgtccaatcgtaagcgttcctagccttccagggcccagcgtaagcaataccagccacaacaccctcaacctcagcaaccaaccaagggtatctatcttgcaacctctcgagatcatcaatccactcttgtggtgtttgtggctctgtcctaaagttcactgtagacgtctcaatgtaatggttaacgatatcacaaaccgcggccatatcagctgctgtagctggcctaatctcaactggtctcctctccggagacatggcttctacctacaaaaaagctccgcacgaggctgcatttgtcacaaatcatgaaaagaaaaactaccgatgaacaatgctgagggattcaaattctacccacaaaaagaagaaagaaagatctagcacatctaagcctgacgaagcagcagaaatatataaaaatataaaccatagtgcccttttcccctcttcctgatcttgtttagcatggcggaaattttaaaccccccatcatctcccccaacaacggcggatcgcagatctacatccgagagccccattccccgcgagatccgggccggatccacgccggcgagagccccagccgcgagatcccgcccctcccgcgcaccgatctgggcgcgcacgaagccgcctctcgcccacccaaactaccaaggccaaagatcgagaccgagacggaaaaaaaaaacggagaaagaaagaggagaggggcggggtggttaccggcgcggcggcggcggagggggaggggggaggagctcgtcgtccggcagcgaggggggaggaggtggaggtggtggtggtggtggtggtagggttggggggatgggaggagaggggggggtatgtatatagtggcgatggggggcgtttctttggaagcggagggagggccggcctcgtcgctggctcgcgatcctcctcgcgtttccggcccccacgacccggacccacctgctgttttttctttttcttttttttctttctttttttttttttggctgcgagacgtgcggtgcgtgcggacaactcacggtgatagtgggggggtgtggagactattgtccagttggctggactggggtgggttgggttgggttgggttgggctgggcttgctatggatcgtggatagcactttgggctttaggaactttaggggttgtttttgtaaatgttttgagtctaagtttatcttttatttttactagaaaaaatacccatgcgctgcaacgggggaaagctattttaatcttattattgttcattgtgagaattcgcctgaatatatatttttctcaaaaattatgtcaaattagcatatgggtttttttaaagatatttcttatacaaatccctctgtatttacaaaagcaaacgaacttaaaacccgactcaaatacagatatgcatttccaaaagcgaataaacttaaaaaccaattcatacaaaaatgacgtatcaaagtaccgacaaaaacatcctcaatttttataatagtagaaaagagtaaatttcactttgggccaccttttattaccgatattttactttataccaccttttaactgatgttttcacttttgaccaggtaatcttacctttgttttattttggactatcccgactctcttctcaagcatatgaatgacctcgagtatgctagtctagagtcgacctgcagggtgcagcgtgacccggtcgtgcccctctctagagataatgagcattgcatgtctaagttataaaaaattaccacatattttttttgtcacacttgtttgaagtgcagtttatctatctttatacatatatttaaactttactctacgaataatataatctatagtactacaataatatcagtgttttagagaatcatataaatgaacagttagacatggtctaaaggacaattgagtattttgacaacaggactctacagttttatctttttagtgtgcatgtgttctcctttttttttgcaaatagcttcacctatataatacttcatccattttattagtacatccatttagggtttagggttaatggtttttatagactaatttttttagtacatctattttattctattttagcctctaaattaagaaaactaaaactctattttagtttttttatttaataatttagatataaaatagaataaaataaagtgactaaaaattaaacaaataccctttaagaaattaaaaaaactaaggaaacatttttcttgtttcgagtagataatgccagcctgttaaacgccgtcgacgagtctaacggacaccaaccagcgaaccagcagcgtcgcgtcgggccaagcgaagcagacggcacggcatctctgtcgctgcctctggacccctctcgagagttccgctccaccgttggacttgctccgctgtcggcatccagaaattgcgtggcggagcggcagacgtgagccggcacggcaggcggcctcctcctcctctcacggcacggcagctacgggggattcctttcccaccgctccttcgctttcccttcctcgcccgccgtaataaatagacaccccctccacaccctctttccccaacctcgtgttgttcggagcgcacacacacacaaccagatctcccccaaatccacccgtcggcacctccgcttcaaggtacgccgctcgtcctccccccccccccctctctaccttctctagatcggcgttccggtccatggttagggcccggtagttctacttctgttcatgtttgtgttagatccgtgtttgtgttagatccgtgctgctagcgttcgtacacggatgcgacctgtacgtcagacacgttctgattgctaacttgccagtgtttctctttggggaatcctgggatggctctagccgttccgcagacgggatcgatttcatgattttttttgtttcgttgcatagggtttggtttgcccttttcctttatttcaatatatgccgtgcacttgtttgtcgggtcatcttttcatgcttttttttgtcttggttgtgatgatgtggtctggttgggcggtcgttctagatcggagtagaattctgtttcaaactacctggtggatttattaattttggatctgtatgtgtgtgccatacatattcatagttacgaattgaagatgatggatggaaatatcgatctaggataggtatacatgttgatgcgggttttactgatgcatatacagagatgctttttgttcgcttggttgtgatgatgtggtgtggttgggcggtcgttcattcgttctagatcggagtagaatactgtttcaaactacctggtgtatttattaattttggaactgtatgtgtgtgtcatacatcttcatagttacgagtttaagatggatggaaatatcgatctaggataggtatacatgttgatgtgggttttactgatgcatatacatgatggcatatgcagcatctattcatatgctctaaccttgagtacctatctattataataaacaagtatgttttataattattttgatcttgatatacttggatgatggcatatgcagcagctatatgtggatttttttagccctgccttcatacgctatttatttgcttggtactgtttcttttgtcgatgctcaccctgttgtttggtgttacttctgcaggaggatcacaagtttgtacaaaaaagcaggctatggccgccgccacctcccccgccgtcgcattctcgggcgccaccgccgccgccatgcccaaacccgcccgccatcctctcccgcgccaccagcccgtctcgcgccgcgcgctccccgcccgcgtcgtcaggtgttgcgccgcgtcccccgccgccacctccgccgcgcctcccgcaaccgcgctccggccctggggcccgtccgagccccgcaagggcgccgacatcctcgtcgaggcgctcgagcgctgcggcatcgtcgacgtcttcgcctaccccggcggcgcctccatggagatccaccaggcgctgacgcgctcgcccgtcatcaccaaccacctcttccgccacgagcagggggaggcgttcgcggcgtccggctacgcccgcgcgtccggccgcgtcggcgtctgcgtcgccacctccggcccgggggccaccaacctcgtctccgcgctcgccgacgccctcctcgactccatccccatggtcgccatcacgggccaggtctcccgccgcatgatcggcacggacgcgttccaggagacgcccatagtggaggtcacgcgctccatcaccaagcacaactacctggtccttgacgtggaggatatcccccgcgtcatccaggaagccttcttccttgcatcctctggccgcccggggccggtgctagttgatatccccaaggacatccagcagcagatggctgtgcccgtctgggacactccaatgagtttgccagggtacatcgcccgcctgcccaagccaccatctactgaatcgcttgagcag
gtcctgcgtctggttggcgagtcacggcgcccaattctgtatgttggtggtggctgcgctgcgtctggcgaggagttgcgccgctttgttgagcttactgggattccagttacaactactctgatgggccttggcaacttccccagcgacgacccactgtctctgcgcatgcttgggatgcatggcactgtgtatgcaaattatgcagtagataaggctgacctgttgctcgcatttggtgtgcggtttgatgatcgtgtgactgggaaaatcgaggcttttgcaagcaggtccaagattgtgcacattgacattgacccagctgagattggcaagaacaagcagccacatgtctccatttgtgcagatgttaagcttgctttacaggggttgaatgatctattaaatgggagcaaagcacaacagggtctggattttggtccatggcacaaggagttggatcagcagaagagggagtttcctctaggattcaagacttttggcgaggccatcccgccgcaatatgctatccaggtactggatgagctgacaaaaggggaggcgatcattgccactggtgttgggcagcaccagatgtgggcggctcagtattacacttacaagcggccacggcagtggctgtcttcgtctggtttgggggcaatgggatttgggttaccagctgcagctggcgctgctgtggccaacccaggtgttacagttgttgacattgatggtgatggtagtttcctcatgaacattcaggagttggcgttgatccgcattgagaacctcccagtgaaggtgatgatattgaacaaccagcatctgggaatggtggtgcagtgggaggataggttttacaaggccaatcgggcgcacacataccttggcaacccagaaaatgagagtgagatatatccagattttgtgacgattgctaaaggattcaacgttccagcagttcgagtgacgaagaagagcgaagtcactgcagcaatcaagaagatgcttgagaccccagggccatacttgttggatatcatagtcccgcatcaggagcacgtgctgcctatgatcccaagcggtggtgctttcaaggacatgatcatggagggtgatggcaggacctcgtactgatacccagctttcttgtacaaagtggtgatcctactagtagaaggagtgcgtcgaagcagatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatcgaaagcttagcttgagcttggatcagattgtcgtttcccgccttcagtttaaactatcagtgtttgacaggatatattggcgggtaaac
gcgaagatcc aggacaagga
ctgcttaccg gcaaagatga g
ttcccccgga ccagcagcgt
ccgacgagaa agaccagcaa
cttaagttgt cgatcgggac tgt
tgagcctctc gtcgccgatc acat
ccactcttgccctacacgacactgaagaccttatgattccaaacggcggcgccttcaaggacatgatcatggagggtgatggcaggacctcgtactgaaatttcgacctacaagacctacaagtgtgacatgcgcaatcagcatggtgcccgcgtgttgtatcaactactaggggttcaactgtgaaccatgcgttttctagtttgcttgtttcattcatataagcttgtgttacttagttccgaaccctgtagctttgtagtctatgctctcttttgtagggatgtgctgtcataagatatcatgcaagtttcttgtcctacatatcaataataagtacttccatggaataattctcagttctgttttgaattttgcatcttctcacaaacagtgtgctggttcctttctgttcgctgacgccctcctcgactccatccccatggtcgccatcacgggccaggtcccccgccgcatgatcggtagcgacttcgtgggcgaggaaagcctttcgtccaaggtggtccctcctcgcaatcttgttggatggtgaatattataaaagcctgcccttctcgcgggtaagactcccgcccatccaggatgaggatgaccagccttttgcagtttatccactagggacaggattgcatcctgccgaaaccctgccaagcttgaggtagcctccaatttgacggtgccgccagcgacgccgtctggaactgtcctttttgaggaccactccgtttgtctagaggtacctggagatcatgacattaaggatgaccagttcgtaaaggtcctgcggtgtctattgcttttcataggttaataagtgtttgctagactgtggtgaaaggccaagactcccgcccatctctctatgcccgggacaagtgccaccccacagtggggcaggatgaggatgaccaaagactcccgcccatctcactagggacaggattggccttttgcagtttatctctatgcccgggacaagtgtatccgaagtaaataaaaccatcggactctcgtataagactgtcgactcgaccggccgacgcataggttcatttgaagctgctattctatttaaattgaaactcggacggtagcagtgtggtatgaggtcttcagcacactcggtaactccagtcac
ccactcttgccctacacgacactgaagacgtcgccattaccgggcaagtgacccgccgcatgatcggcacggacgcgttccaggagacgcccatagtggaggtcacgcgctccatcaccaagcacaactacctggtccttgacgtggaggatatcccccgcgtcatccaggaagccttcttccttgcatcctctggccgcccggggccggtgctagttgatatccccaaggacatccagcagcagatggctgtgcccgtctgggacactccaatgagtttgccagggtacatcgcccgcctgcccaagccaccatctactgaatcgcttgagcaggtcctgcgtctggttggcgagtcacggcgcccaattctgtatgttggtggtggctgcgctgcgtctggcgaggagttgcgccgctttgttgagcttactgggattccagttacaactactctgatgggccttggcaacttccccagcgacgacccactgtctctgcgcatgcttgggatgcatggcactgtgtatgcaaattatgcagtagataaggctgacctgttgctcgcatttggtgtgcggtttgatgatcgtgtgactgggaaaatcgaggcttttgcaagcaggtccaagattgtgcacattgacattgacccagctgagattggcaagaacaagcagccacatgtctccatttgtgcagatgttaagcttgctttacaggggttgaatgatctattaaatgggagcaaagcacaacagggtctggattttggtccatggcacaaggagttggatcagcagaagagggagtttcctctaggattcaagacttttggcgaggccatcccgccgcaatatgctatccaggtactggatgagctgacaaaaggggaggcgatcattgccactggtgttgggcagcaccagatgtgggcggctcagtattacacttacaagcggccacggcagtggctgtcttcgtctggtttgggggcaatgggatttgggttaccagctgcagctggcgctgctgtggccaacccaggtgttacagttgttgacattgatggtgatggtagtttcctcatgaacattcaggagttggcgttgatccgcattgagaacctcccagtgaaggtgatgatattgaacaaccagcatctgggaatggtggtgcagtgggaggataggttttacaaggccaatcgggcgcacacataccttggcaacccagaaaatgagagtgagatatatccagattttgtgacgattgctaaaggattcaacgttccagcagttcgagtgacgaagaagagcgaagtcactgcagcaatcaagaagatgcttgagaccccagggccatacttgttggatatcatagtcccgcatcaggagcacgtgctgcctatgatcccaagcggtggtgctttcaaggacatgatcatggagggtgatggcaggacctcgtactgaaatttcgacctacaagacctacaagtgtgacatgcgcaatcagcatggtgcccgcgtgttgtatcaactactaggggttcaactgtgaaccatgcgttttctagtttgcttgtttcattcatataagcttgtgttacttagttccgaaccctgtagctttgtagtctatgctctcttttgtagggatgtgctgtcataagatatcatgcaagtttcttgtcctacatatcaataataagtacttccatggaataattctcagttctgttttgaattttgcatcttctcacaaacagtgtgctggttcctttctgttctacgcccgcgcgtccggccgcgtcggcgtctgcgtcgccacctccggcccgggggccaccaacctcgtctccgtagcgacttcgtgggcgaggaaagcctttcgtccaaggtggtccctcctcgcaatcttgttggatggtgaatattataaaagcctgcccttctcgcgggtgagtccatgctcaacaccgtgcactagggacaggattggccttttgcagtttatccactagggacaggattgcatcctgccgaaaccctgccaagcttgaggtagcctccaatttgacggtgccgccagcgacgccgtctggaactgtcctttttgaggaccactccgtttgtctagaggtacctggagatcatgacattaaggatgaccagttcgtaaaggtcctgcggtgtctattgcttttcataggttaataagtgtttgctagactgtggtgaaaggccgccttttgcagtttatctctagaaagactggagttgcagaaagactcccgcccatccaggatgaggatgaccatatccgaagtaaataaaaccatcggactctcgtataagactgtcgactcgaccggccgacgcataggttcatttgaagctgctattctatttaaattgaaactcggacggtagcagtgtggtatgaggtcttcagcacactcggtaactccagtcac
tgagattggcaagaacaagcagccacatgtctccatttgtgcagatgttaagcttgctttacaggggttgaatgatctattaaatgggagcaaagcacaacagggtctggattttggtccatggcacaaggagttggatcagcagaagagggagtttcctctaggattcaagacttttggcgaggccatcccgccgcaatatgctatccaggtactggatgagctgacaaaaggggaggcgatcattgccactggtgttgggcagcaccagatgtgggcggctcagtattacacttacaagcggccacggcagtggctgtcttcgtctggtttgggggcaatgggatttgggttaccagctgcagctggcgctgctgtggccaacccaggtgttacagttgttgacattgatggtgatggtagtttcctcatgaacattcaggagttggcgttgatccgcattgagaacctcccagtgaaggtgatgatattgaacaaccagcatctgggaatggtggtgcagtgggaggataggttttacaaggccaatcgggcgcacacataccttggcaacccagaaaatgagagtgagatatatccagattttgtgacgattgctaaaggattcaacgttccagcagttcgagtgacgaagaagagcgaagtcactgcagcaatcaagaagatgcttgagaccccagggccatacttgttggatatcatagtcccgcatcaggagcacgtgctgcctatgattccaaacggcggcgccttcaaggacatgatcatggagggtgatggcaggacctcgtactgaaatttcgacctacaagacctacaagtgtgacatgcgcaatcagcatggtgcccgcgtgttgtatcaactactaggggttcaactgtgaaccatgcgttttctagtttgcttgtttcattcatataagcttgtgttacttagttccgaaccctgtagctttgtagtctatgctctcttttgtagggatgtgctgtcataagatatcatgcaagtttcttgtcctacatatcaataataagtacttccatggaataattctcagttctgttttgaattttgcatcttctcacaaacagtgtgctggttcctttctgttcgctgacgccctcctcgactccatccccatggtcgccatcacgggccaggtcccccgccgcatgatcggtagcgacttcgtgggcgaggaaagcctttcgtccaaggtggtccctcctcgcaatcttgttggatggtgaatattataaaagcctgcccttctcgcgggtaagactcccgcccatccaggatgaggatgaccagccttttgcagtttatccactagggacaggattgcatcctgccgaaaccctgccaagcttgaggtagcctccaatttgacggtgccgccagcgacgccgtctggaactgtcctttttgaggaccactccgtttgtctagaggtacctggagatcatgacattaaggatgaccagttcgtaaaggtcctgcggtgtctattgcttttcataggttaataagtgtttgctagactgtggtgaaaggccaagactcccgcccatctctctatgcccgggacaagtgccaccccacagtggggcaggatgaggatgaccaaagactcccgcccatctcactagggacaggattggccttttgcagtttatctctatgcccgggacaagtgtatccgaagtaaataaaaccatcggactctcgtataagactgtcgactcgaccggccgacgcataggttcatttgaagctgctattctatttaaattgaaatcccaagcggtggtgctttcaaggacatgatcatggagggtgatggcaggacctcgtactgaaatttcgacctacaagacctacaagtgtgacatgcgcaatcagcatgatgcccgcgtgttgtatcaactactaggggttcaactgtgagccatgcgttttctagtttgcttgtttcattcatataagcttgtattacttagttccgaaccctgtagttttgtagtctatgttctcttttgtagggatgtgctgtcataagatgtcatgcaagtttcttgtcctacatatcaataataagtacttccatggaataattctcagttctgttttgaattttgcatcttctcacaaacagtgtgctggttcctttctgttactttacatgtctgctgtgtcaggttctgacataacgaccgatggagggtggtcggcaggttttagaaggggaattgaaacttttttttgggaagaagtctgaatacagttgggaggaaaaatagaagtatatacttcgattaatttatcaagcccgctatccagtctaatttatcaagcactagacagtgtagggtgttggcattcttctcttccttgagatccggcttgagaggagagaccgaggcttcggctgtgttggttgctgatttctacagctttttgagatagagagagagatcctgcaactgtggtttgtcttgctgcttgtacagcgagagagacattgagagatatgtagatcgtttacc
CCAGAAGGTAATTATCCAAGATGTAGCATCAAGAATCCAATGTTTACGGGAAAAACTATGGAAGTATTATGTAAGCTCAGCAAGAAGCAGATCAATATGCGGCACATATGCAACCTATGTTCAAAAATGAAGAATGTACAGATACAAGATCCTATACTGCCAGAATACGAAGAAGAATACGTAGAAATTGAAAAAGAAGAACCAGGCGAAGAAAAGAATCTTGAAGACGTAAGCACTGACGACAACAATGAAAAGAAGAAGATAAGGTCGGTGATTGTGAAAGAGACATAGAGGACACATGTAAGGTGGAAAATGTAAGGGCGGAAAGTAACCTTATCACAAAGGAATCTTATCCCCCACTACTTATCCTTTTATATTTTTCCGTGTCATTTTTGCCCTTGAGTTTTCCTATATAAGGAACCAAGTTCGGCATTTGTGAAAACAAGAAAAAATTTGGTGTAAGCTATTTTCTTTGAAGTACTGAGGATACAACTTCAGAGAAATTTGTAAGTTTGTAGATCTCCATGGCTCCAAGGAAGAGGAAGGAGTCTAACAGGGAGTCAGCTAGGAGGTCAAGGTACAGGAAGGTGGGTATCCACGGGGTACCCGCCGCTATGGCTGAGAGGCCCTTCCAGTGTCGAATCTGCATGCGTAACTTCAGTCGTAGTGACAACCTGAGCAACCACATCCGCACCCACACAGGCGAGAAGCCTTTTGCCTGTGACATTTGTGGGAGGAAATTTGCCACCAGCAGCAGCCGCATAAACCATACCAAGATACACACGGGCAGCCAAAAGCCCTTCCAGTGTCGAATCTGCATGCGTAACTTCAGTCGTAGTGACAACCTGAGCGAACACATCCGCACCCACACAGGCGAGAAGCCTTTTGCCTGTGACATTTGTGGGAGGAAATTTGCCGCCAGCAAGACCCGCAAAAACCATACCAAGATACACACGGGCGAGAAGCCCTTCCAGTGTCGAATCTGCATGCGTAAGTTTGCCCGCTCCGACGCCCTGACCCAGCATGCCCAGAGATGCGGACTGCGGGGATCCCAACTTGTGAAATCAGAATTGGAAGAGAAAAAGTCTGAGCTTAGACACAAATTGAAGTACGTTCCACATGAATATATCGAACTTATCGAGATTGCTAGGAACTCAACACAGGACAGAATTTTGGAGATGAAGGTTATGGAGTTCTTTATGAAAGTGTACGGATATAGGGGAAAGCACCTTGGTGGTTCTAGGAAACCTGATGGTGCAATCTACACTGTGGGATCACCTATTGACTATGGTGTTATCGTGGATACAAAGGCATACTCTGGTGGATACAATTTGCCAATCGGACAAGCTGACGAAATGCAGAGATATGTTGAAGAGAACCAAACTAGAAACAAACATATTAATCCAAATGAATGGTGGAAGGTGTATCCTTCATCTGTTACAGAGTTCAAATTCCTTTTTGTGTCTGGACACTTTAAGGGTAACTACAAAGCACAGCTTACTAGGTTGAACCATATTACAAATTGCAATGGTGCTGTGTTGTCAGTTGAAGAGCTTTTGATCGGAGGTGAAATGATTAAGGCAGGAACACTTACTTTGGAGGAAGTTAGAAGAAAATTCAACAACGGTGAAATCAATTTTAGATCTGGCGGCGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTAGGATGGCTCCAAGGAAGAGGAAGGAGTCTAACAGGGAGTCAGCTAGGAGGTCAAGGTACAGGAAGGTGGGTATCCACGGGGTACCCGCCGCTATGGCTGAGAGGCCCTTCCAGTGTCGAATCTGCATGCGTAACTTCAGTCGTAGTGACACCCTGAGCACGCACATCCGCACCCACACAGGCGAGAAGCCTTTTGCCTGTGACATTTGTGGGAGGAAATTTGCCGACAGGAGCAGCCGCATAAAGCATACCAAGATACACACGGGATCTCAGAAGCCCTTCCAGTGTCGAATCTGCATGCGTAACTTCAGTCGCTCCGACGACCTGTCCAAGCACATCCGCACCCACACAGGCGAGAAGCCTTTTGCCTGTGACATTTGTGGGAGGAAGTTTGCCGACAACTCCAACCGCATCAAGCATGCCCAGAGATGCGGACTGCGGGGATCCCAACTTGTGAAATCAGAATTGGAAGAGAAAAAGTCTGAGCTTAGACACAAATTGAAGTACGTTCCACATGAATATATCGAACTTATCGAGATTGCTAGGAACTCAACACAGGACAGAATTTTGGAGATGAAGGTTATGGAGTTCTTTATGAAAGTGTACGGATATAGGGGAAAGCACCTTGGTGGTTCTAGGAAACCTGATGGTGCAATCTACACTGTGGGATCACCTATTGACTATGGTGTTATCGTGGATACAAAGGCATACTCTGGTGGATACAATTTGCCAATCGGACAAGCTGACGAAATGCAGAGATATGTTGAAGAGAACCAAACTAGAAACAAACATATTAATCCAAATGAATGGTGGAAGGTGTATCCTTCATCTGTTACAGAGTTCAAATTCCTTTTTGTGTCTGGACACTTTAAGGGTAACTACAAAGCACAGCTTACTAGGTTGAACCATATTACAAATTGCAATGGTGCTGTGTTGTCAGTTGAAGAGCTTTTGATCGGAGGTGAAATGATTAAGGCAGGAACACTTACTTTGGAGGAAGTTAGAAGAAAATTCAACAACGGTGAAATCAATTTTTGATAACTCGAGCTCGGTCACCAGCATAATTTTTATTAATGTACTAAATTACTGTTTTGTTAAATGCAATTTTGCTTTCTCGGGATTTTAATATCAAAATCTATTTAGAAATACACAATATTTTGTTGCAGGCTTGCTGGAGAATCGATCTGCTATCATAAAAATTACAAAAAAATTTTATTTGCCTCAATTATTTTAGGATTGGTATTAAGGACGCTTAAATTATTTGTCGGGTCACTACGCATCATTGTGATTGAGAAGATCAGCGATACGAAATATTCGTAGTACTATCGATAATTTATTTGAAAATTCATAAGAAAAGCAAACGTTACATGAATTGATGAAACAATACAAAGACAGATAAAGCCACGCACATTTAGGATATTGGCCGAGATTACTGAATATTGAGTAAGATCACGGAATTTCTGACAGGAGCATGTCTTCAATTCAGCCCAAATGGCAGTTGAAATACTCAAACCGCCCCATATGCAGGAGCGGATCATTCATTGTTTGTTTGGTTGCCTTTGCCAACATGGGAGTCCAAGGTT
CCAGAAGGTAATTATCCAAGATGTAGCATCAAGAATCCAATGTTTACGGGAAAAACTATGGAAGTATTATGTAAGCTCAGCAAGAAGCAGATCAATATGCGGCACATATGCAACCTATGTTCAAAAATGAAGAATGTACAGATACAAGATCCTATACTGCCAGAATACGAAGAAGAATACGTAGAAATTGAAAAAGAAGAACCAGGCGAAGAAAAGAATCTTGAAGACGTAAGCACTGACGACAACAATGAAAAGAAGAAGATAAGGTCGGTGATTGTGAAAGAGACATAGAGGACACATGTAAGGTGGAAAATGTAAGGGCGGAAAGTAACCTTATCACAAAGGAATCTTATCCCCCACTACTTATCCTTTTATATTTTTCCGTGTCATTTTTGCCCTTGAGTTTTCCTATATAAGGAACCAAGTTCGGCATTTGTGAAAACAAGAAAAAATTTGGTGTAAGCTATTTTCTTTGAAGTACTGAGGATACAACTTCAGAGAAATTTGTAAGTTTGTAGATCTCCATGGCTCCAAGGAAGAGGAAGGAGTCTAACAGGGAGTCAGCTAGGAGGTCAAGGTACAGGAAGGTGGGTATCCACGGGGTACCCGCCGCTATGGCTGAGAGGCCCTTCCAGTGTCGAATCTGCATGCGTAACTTCAGTCAGTCCTCCGACCTGTCCCGCCACATCCGCACCCACACCGGCGAGAAGCCTTTTGCCTGTGACATTTGTGGGAGGAAATTTGCCCAGGCCGGCAACCTGTCCAAGCATACCAAGATACACACGCATCCCAGGGCACCTATTCCCAAGCCCTTCCAGTGTCGAATCTGCATGCGTAAGTTTGCCCAGTCCGGCGACCTGACCCGCCATACCAAGATACACACGGGCGAGAAGCCCTTCCAGTGTCGAATCTGCATGCGTAACTTCAGTACCTCCGGCTCCCTGTCCCGCCACATCCGCACCCACACCGGCGAGAAGCCTTTTGCCTGTGACATTTGTGGGAGGAAATTTGCCCAGTCCGGCAACCTGGCCCGCCATGCCCAGAGATGCGGACTGCGGGGATCCCAACTTGTGAAATCAGAATTGGAAGAGAAAAAGTCTGAGCTTAGACACAAATTGAAGTACGTTCCACATGAATATATCGAACTTATCGAGATTGCTAGGAACTCAACACAGGACAGAATTTTGGAGATGAAGGTTATGGAGTTCTTTATGAAAGTGTACGGATATAGGGGAAAGCACCTTGGTGGTTCTAGGAAACCTGATGGTGCAATCTACACTGTGGGATCACCTATTGACTATGGTGTTATCGTGGATACAAAGGCATACTCTGGTGGATACAATTTGCCAATCGGACAAGCTGACGAAATGCAGAGATATGTTGAAGAGAACCAAACTAGAAACAAACATATTAATCCAAATGAATGGTGGAAGGTGTATCCTTCATCTGTTACAGAGTTCAAATTCCTTTTTGTGTCTGGACACTTTAAGGGTAACTACAAAGCACAGCTTACTAGGTTGAACCATATTACAAATTGCAATGGTGCTGTGTTGTCAGTTGAAGAGCTTTTGATCGGAGGTGAAATGATTAAGGCAGGAACACTTACTTTGGAGGAAGTTAGAAGAAAATTCAACAACGGTGAAATCAATTTTAGATCTGGCGGCGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTAGGATGGCTCCAAGGAAGAGGAAGGAGTCTAACAGGGAGTCAGCTAGGAGGTCAAGGTACAGGAAGGTGGGTATCCACGGGGTACCCGCCGCTATGGCTGAGAGGCCCTTCCAGTGTCGAATCTGCATGCGTAACTTCAGTACCTCCGGCTCCCTGTCCCGCCACATCCGCACCCACACCGGCGAGAAGCCTTTTGCCTGTGACATTTGTGGGAGGAAATTTGCCCTGCGCCAGACCCTGCGCGACCATACCAAGATACACACGGGCAGCCAAAAGCCCTTCCAGTGTCGAATCTGCATGCGTAACTTCAGTACCTCCGGCAACCTGACCCGCCACATCCGCACCCACACCGGCGAGAAGCCTTTTGCCTGTGACATTTGTGGGAGGAAATTTGCCGACCGCTCCGCCCTGGCCCGCCATACCAAGATACACACGGGATCTCAGAAGCCCTTCCAGTGTCGAATCTGCATGCGTAACTTCAGTCGCTCCGACGTGCTGTCCGAGCACATCCGCACCCACACCGGCGAGAAGCCTTTTGCCTGTGACATTTGTGGGAGGAAATTTGCCCGCAACTTCTCCCTGACCATGCATGCCCAGAGATGCGGACTGCGGGGATCCCAACTTGTGAAATCAGAATTGGAAGAGAAAAAGTCTGAGCTTAGACACAAATTGAAGTACGTTCCACATGAATATATCGAACTTATCGAGATTGCTAGGAACTCAACACAGGACAGAATTTTGGAGATGAAGGTTATGGAGTTCTTTATGAAAGTGTACGGATATAGGGGAAAGCACCTTGGTGGTTCTAGGAAACCTGATGGTGCAATCTACACTGTGGGATCACCTATTGACTATGGTGTTATCGTGGATACAAAGGCATACTCTGGTGGATACAATTTGCCAATCGGACAAGCTGACGAAATGCAGAGATATGTTGAAGAGAACCAAACTAGAAACAAACATATTAATCCAAATGAATGGTGGAAGGTGTATCCTTCATCTGTTACAGAGTTCAAATTCCTTTTTGTGTCTGGACACTTTAAGGGTAACTACAAAGCACAGCTTACTAGGTTGAACCATATTACAAATTGCAATGGTGCTGTGTTGTCAGTTGAAGAGCTTTTGATCGGAGGTGAAATGATTAAGGCAGGAACACTTACTTTGGAGGAAGTTAGAAGAAAATTCAACAACGGTGAAATCAATTTTTGATAACTCGAGCTCGGTCACCAGCATAATTTTTATTAATGTACTAAATTACTGTTTTGTTAAATGCAATTTTGCTTTCTCGGGATTTTAATATCAAAATCTATTTAGAAATACACAATATTTTGTTGCAGGCTTGCTGGAGAATCGATCTGCTATCATAAAAATTACAAAAAAATTTTATTTGCCTCAATTATTTTAGGATTGGTATTAAGGACGCTTAAATTATTTGTCGGGTCACTACGCATCATTGTGATTGAGAAGATCAGCGATACGAAATATTCGTAGTACTATCGATAATTTATTTGAAAATTCATAAGAAAAGCAAACGTTACATGAATTGATGAAACAATACAAAGACAGATAAAGCCACGCACATTTAGGATATTGGCCGAGATTACTGAATATTGAGTAAGATCACGGAATTTCTGACAGGAGCATGTCTTCAATTCAGCCCAAATGGCAGTTGAAATACTCAAACCGCCCCATATGCAGGAGCGGATCATTCATTGTTTGTTTGGTTGCCTTTGCCAACATGGGAGTCCAAGGTT
GCCCAAGGAACCCTTTTCTGGGCCATCTTCGTACTCGGCCACGACTGGTAATTTAATGGATCCAACCGACAACCACTTTGCGGACTTCCTTTCAAGAGAATTCAATAAGGTTAATTCCTAATTGAAATCCGAAGATAAGATTCCCACACACTTGTGGCTGATATCAAAAGGCTACTGCCTATTTAAACACATCTCTGGAGACTGAGAAAATCAGACCTCCAAGCATGAAGAAGCCTGAGCTTACTGCTACTTCTGTTGAGAAGTTCCTCATCGAGAAGTTCGATTCTGTGTCTGATCTTATGCAGCTCTCTGAGGGTGAGGAATCAAGAGCTTTCTCTTTCGATGTTGGTGGAAGAGGATACGTTCTCAGAGTTAACTCTTGCGCTGACGGATTCTACAAGGATAGATACGTGTACAGACACTTCGCTTCAGCTGCTCTCCCTATCCCTGAAGTTCTTGATATCGGAGAGTTCTCTGAGTCTCTTACCTACTGTATCTCAAGAAGGGCTCAGGGTGTTACTCTTCAAGATCTTCCTGAGACTGAGCTTCCTGCTGTTCTTCAACCTGTTGCTGAGGCTATGGATGCTATCGCTGCTGCTGATCTTTCTCAAACTTCTGGATTCGGACCTTTCGGTCCTCAGGGAATCGGACAGTACACTACTTGGAGAGATTTCATCTGCGCTATCGCTGATCCTCATGTTTACCATTGGCAGACCGTTATGGATGATACCGTTTCTGCTTCTGTTGCTCAAGCTCTTGATGAGCTTATGCTTTGGGCTGAGGATTGTCCTGAGGTTAGACATCTTGTTCACGCTGATTTCGGATCTAACAACGTTCTCACCGATAACGGAAGAATCACCGCTGTTATCGATTGGTCTGAGGCTATGTTCGGAGATTCTCAATACGAGGTGGCCAACATATTCTTTTGGAGGCCTTGGCTTGCTTGTATGGAACAACAGACTAGATACTTCGAGAGAAGGCATCCTGAGCTTGCTGGATCTCCTAGACTTAGAGCTTACATGCTTAGGATCGGACTTGATCAGCTTTACCAGTCTCTCGTTGATGGAAACTTCGATGATGCTGCTTGGGCTCAGGGAAGATGTGATGCTATCGTTAGATCTGGTGCTGGAACTGTTGGAAGAACTCAAATCGCTAGAAGATCTGCTGCTGTTTGGACTGATGGATGTGTTGAAGTTCTCGCTGATTCTGGAAACAGAAGGCCTTCTACTAGACCTAGAGCCAAGAAGTGAAGATCGGCGGCAATAGCTTCTTAGCGCCATCCCGGGTTGATCCTATCTGTGTTGAAATAGTTGCGGTGGGCAAGGCTCTCTTTCAGAAAGACAGGCGGCCAAAGGAACCCAAGGTGAGGTGGGCTATGGCTCTCAGTTCCTTGTGGAAGCGCTTGGTCTAAGGTGCAGAGGTGTTAGCGGGATGAAGCAAAAGTGTCCGATTGTAACAAGATATGTTGATCCTACGTAAGGATATTAAAGTATGTATTCATCACTAATATAATCAGTGTATTCCAATATGTACTACGATTTCCAATGTCTTTATTGTCGCCGTATGTAATCGGCGTCACAAAATAATCCCCGGTGACTTTCTTTTAATCCAGGATGAAATAATATGTTATTATAATTTTTGCGATTTGGTCCGTTATAGGAATTGAAGTGTGCTTGCGGTCGCCACCACTCCCATTTCATAATTTTACATGTATTTGAAAAATAAAAATTTATGGTATTCAATTTAAACACGTATACTTGTAAAGAATGATATCTTGAAAGAAATATAGTTTAAATATTTATTGATAAAATAACAAGTCAGGTATTATAGTCCAAGCAAAAACATAAATTTATTGATGCAAGTTTAAATTCAGAAATATTTCAATAACTGATTATATCAGCTGGTACATTGCCGTAGATGAAAGACTGAGTGCGATATTATGGTGTAATACATAGCGGCCGCGCCCAAGGAACCCTTTTCTGGGCCATCTTCGTACTCGGCCACGACTGGTAATTTAAT
gcccaaggaacccttttctgggccatcttcgtactcggccacgactggtaatttaatggatccactagtaacggccgccagtgtgctggaattcgcccttcgtcgacctgcaggtcaacggatcaggatattcttgtttaagatgttgaactctatggaggtttgtatgaactgatgatctaggaccggataagttcccttcttcatagcgaacttattcaaagaatgttttgtgtatcattcttgttacattgttattaatgaaaaaatattattggtcattggactgaacacgagtgttaaatatggaccaggccccaaataagatccattgatatatgaattaaataacaagaataaatcgagtcaccaaaccacttgccttttttaacgagacttgttcaccaacttgatacaaaagtcattatcctatgcaaatcaataatcatacaaaaatatccaataacactaaaaaattaaaagaaatggataatttcacaatatgttatacgataaagaagttacttttccaagaaattcactgattttataagcccacttgcattagataaatggcaaaaaaaaacaaaaaggaaaagaaataaagcacgaagaattctagaaaatacgaaatacgcttcaatgcagtgggacccacggttcaattattgccaattttcagctccaccgtatatttaaaaaataaaacgataatgctaaaaaaatataaatcgtaacgatcgttaaatctcaacggctggatcttatgacgaccgttagaaattgtggttgtcgacgagtcagtaataaacggcgtcaaagtggttgcagccggcacacacgagtcgtgtttatcaactcaaagcacaaatacttttcctcaacctaaaaataaggcaattagccaaaaacaactttgcgtgtaaacaacgctcaatacacgtgtcattttattattagctattgcttcaccgccttagctttctcgtgacctagtcgtcctcgtcttttcttcttcttcttctataaaacaatacccaaagagctcttcttcttcacaattcagatttcaatttctcaaaatcttaaaaactttctctcaattctctctaccgtgatcaaggtaaatttctgtgttccttattctctcaaaatcttcgattttgttttcgttcgatcccaatttcgtatatgttctttggtttagattctgttaatcttagatcgaagacgattttctgggtttgatcgttagatatcatcttaattctcgattagggtttcatagatatcatccgatttgttcaaataatttgagttttgtcgaataattactcttcgatttgtgatttctatctagatctggtgttagtttctagtttgtgcgatcgaatttgtcgattaatctgagtttttctgattaacagatgagaggatctggatctgagtctgatgagtctggacttcctgctatggaaatcgagtgtagaatcactggaacccttaacggtgttgagttcgagcttgttggaggtggtgagggaactcctgagcagggaagaatgactaacaagatgaagtctaccaagggtgctcttaccttctctccataccttctttctcacgttatgggatacggattctaccacttcggaacttacccatctggatacgagaaccctttccttcatgctatcaacaacggtggatacaccaacactaggatcgagaagtacgaggatggtggtgttcttcacgttagcttctcttacagatacgaggctggaagagtgatcggagatttcaaggttatgggaactggattccctgaggattctgttatcttcaccgacaagatcatcaggtctaacgctactgttgagcatcttcatcctatgggagataacgatctcgatggatctttcaccagaaccttctcacttagagatggtggttactactcttctgtggtggattctcacatgcacttcaagtctgctatccacccttctatccttcaaaacggtggacctatgttcgctttcagaagagttgaggaagatcactctaacaccgagcttggaatcgttgagtaccaacatgctttcaagacccctgatgctgatgctggtgaggaatgataatatcaaaatctatttagaaatacacaatattttgttgcaggcttgctggagaatcgatctgctatcataaaaattacaaaaaaattttatttgcctcaattattttaggattggtattaaggacgcttaaattatttgtcgggtcactacgcatcattgtgattgagaagatcagcgatacgaaatattcgtagtactatcgataatttatttgaaaattcataagaaaagcaaacgttacatgaattgatgaaacaatacaaagacagataaagccacgcacatttaggatattggccgagattactgaatattgagtaagatcacggaatttctgacaggagcatgtcttcaattcagcccaaatggcagttgaaatactcaaaccgccccatatgcaggagcggatcattcattgtttgtttggttgcctttgccaacatgggagtccaaggttgcggccgcgcccaaggaacccttttctgggccatcttcgtactcggccacgactggtaatttaat
GCCCAAGGAACCCTTTTCTGGGCCATCTTCGTACTCGGCCACGACTGGTAATTTAATGGATCCAACCGACAACCACTTTGCGGACTTCCTTTCAAGAGAATTCAATAAGGTTAATTCCTAATTGAAATCCGAAGATAAGATTCCCACACACTTGTGGCTGATATCAAAAGGCTACTGCCTATTTAAACACATCTCTGGAGACTGAGAAAATCAGACCTCCAAGCATGAAGAAGCCTGAGCTTACTGCTACTTCTGTTGAGAAGTTCCTCATCGAGAAGTTCGATTCTGTGTCTGATCTTATGCAGCTCTCTGAGGGTGAGGAATCAAGAGCTTTCTCTTTCGATGTTGGTGGAAGAGGATACGTTCTCAGAGTTAACTCTTGCGCTGACGGATTCTACAAGGATAGATACGTGTACAGACACTTCGCTTCAGCTGCTCTCCCTATCCCTGAAGTTCTTGATATCGGAGAGTTCTCTGAGTCTCTTACCTACTGTATCTCAAGAAGGGCTCAGGGTGTTACTCTTCAAGATCTTCCTGAGACTGAGCTTCCTGCTGTTCTTCAACCTGTTGCTGAGGCTATGGATGCTATCGCTGCTGCTGATCTTTCTCAAACTTCTGGATTCGGACCTTTCGGTCCTCAGGGAATCGGACAGTACACTACTTGGAGAGATTTCATCTGCGCTATCGCTGATCCTCATGTTTACCATTGGCAGACCGTTATGGATGATACCGTTTCTGCTTCTGTTGCTCAAGCTCTTGATGAGCTTATGCTTTGGGCTGAGGATTGTCCTGAGGTTAGACATCTTGTTCACGCTGATTTCGGATCTAACAACGTTCTCACCGATAACGGAAGAATCACCGCTGTTATCGATTGGTCTGAGGCTATGTTCGGAGATTCTCAATACGAGGTGGCCAACATATTCTTTTGGAGGCCTTGGCTTGCTTGTATGGAACAACAGACTAGATACTTCGAGAGAAGGCATCCTGAGCTTGCTGGATCTCCTAGACTTAGAGCTTACATGCTTAGGATCGGACTTGATCAGCTTTACCAGTCTCTCGTTGATGGAAACTTCGATGATGCTGCTTGGGCTCAGGGAAGATGTGATGCTATCGTTAGATCTGGTGCTGGAACTGTTGGAAGAACTCAAATCGCTAGAAGATCTGCTGCTGTTTGGACTGATGGATGTGTTGAAGTTCTCGCTGATTCTGGAAACAGAAGGCCTTCTACTAGACCTAGAGCCAAGAAGTGAAGATCGGCGGCAATAGCTTCTTAGCGCCATCCCGGGTTGATCCTATCTGTGTTGAAATAGTTGCGGTGGGCAAGGCTCTCTTTCAGAAAGACAGGCGGCCAAAGGAACCCAAGGTGAGGTGGGCTATGGCTCTCAGTTCCTTGTGGAAGCGCTTGGTCTAAGGTGCAGAGGTGTTAGCGGGATGAAGCAAAAGTGTCCGATTGTAACAAGATATGTTGATCCTACGTAAGGATATTAAAGTATGTATTCATCACTAATATAATCAGTGTATTCCAATATGTACTACGATTTCCAATGTCTTTATTGTCGCCGTATGTAATCGGCGTCACAAAATAATCCCCGGTGACTTTCTTTTAATCCAGGATGAAATAATATGTTATTATAATTTTTGCGATTTGGTCCGTTATAGGAATTGAAGTGTGCTTGCGGTCGCCACCACTCCCATTTCATAATTTTACATGTATTTGAAAAATAAAAATTTATGGTATTCAATTTAAACACGTATACTTGTAAAGAATGATATCTTGAAAGAAATATAGTTTAAATATTTATTGATAAAATAACAAGTCAGGTATTATAGTCCAAGCAAAAACATAAATTTATTGATGCAAGTTTAAATTCAGAAATATTTCAATAACTGATTATATCAGCTGGTACATTGCCGTAGATGAAAGACTGAGTGCGATATTATGGTGTAATACATAGCGGCCGCAGCGAGAGAAAGCTTATTGCAACTTCAACTACTTGCTGGTCGATCGTGTTGGCCACTC
GCCCAAGGAACCCTTTTCTGGGCCATCTTCGTACTCGGCCACGACTGGTAATTTAATGGATCCACTAGTAACGGCCGCCAGTGTGCTGGAATTCGCCCTTCGTCGACCTGCAGGTCAACGGATCAGGATATTCTTGTTTAAGATGTTGAACTCTATGGAGGTTTGTATGAACTGATGATCTAGGACCGGATAAGTTCCCTTCTTCATAGCGAACTTATTCAAAGAATGTTTTGTGTATCATTCTTGTTACATTGTTATTAATGAAAAAATATTATTGGTCATTGGACTGAACACGAGTGTTAAATATGGACCAGGCCCCAAATAAGATCCATTGATATATGAATTAAATAACAAGAATAAATCGAGTCACCAAACCACTTGCCTTTTTTAACGAGACTTGTTCACCAACTTGATACAAAAGTCATTATCCTATGCAAATCAATAATCATACAAAAATATCCAATAACACTAAAAAATTAAAAGAAATGGATAATTTCACAATATGTTATACGATAAAGAAGTTACTTTTCCAAGAAATTCACTGATTTTATAAGCCCACTTGCATTAGATAAATGGCAAAAAAAAACAAAAAGGAAAAGAAATAAAGCACGAAGAATTCTAGAAAATACGAAATACGCTTCAATGCAGTGGGACCCACGGTTCAATTATTGCCAATTTTCAGCTCCACCGTATATTTAAAAAATAAAACGATAATGCTAAAAAAATATAAATCGTAACGATCGTTAAATCTCAACGGCTGGATCTTATGACGACCGTTAGAAATTGTGGTTGTCGACGAGTCAGTAATAAACGGCGTCAAAGTGGTTGCAGCCGGCACACACGAGTCGTGTTTATCAACTCAAAGCACAAATACTTTTCCTCAACCTAAAAATAAGGCAATTAGCCAAAAACAACTTTGCGTGTAAACAACGCTCAATACACGTGTCATTTTATTATTAGCTATTGCTTCACCGCCTTAGCTTTCTCGTGACCTAGTCGTCCTCGTCTTTTCTTCTTCTTCTTCTATAAAACAATACCCAAAGAGCTCTTCTTCTTCACAATTCAGATTTCAATTTCTCAAAATCTTAAAAACTTTCTCTCAATTCTCTCTACCGTGATCAAGGTAAATTTCTGTGTTCCTTATTCTCTCAAAATCTTCGATTTTGTTTTCGTTCGATCCCAATTTCGTATATGTTCTTTGGTTTAGATTCTGTTAATCTTAGATCGAAGACGATTTTCTGGGTTTGATCGTTAGATATCATCTTAATTCTCGATTAGGGTTTCATAGATATCATCCGATTTGTTCAAATAATTTGAGTTTTGTCGAATAATTACTCTTCGATTTGTGATTTCTATCTAGATCTGGTGTTAGTTTCTAGTTTGTGCGATCGAATTTGTCGATTAATCTGAGTTTTTCTGATTAACAGATGAGAGGATCTGGATCTGAGTCTGATGAGTCTGGACTTCCTGCTATGGAAATCGAGTGTAGAATCACTGGAACCCTTAACGGTGTTGAGTTCGAGCTTGTTGGAGGTGGTGAGGGAACTCCTGAGCAGGGAAGAATGACTAACAAGATGAAGTCTACCAAGGGTGCTCTTACCTTCTCTCCATACCTTCTTTCTCACGTTATGGGATACGGATTCTACCACTTCGGAACTTACCCATCTGGATACGAGAACCCTTTCCTTCATGCTATCAACAACGGTGGATACACCAACACTAGGATCGAGAAGTACGAGGATGGTGGTGTTCTTCACGTTAGCTTCTCTTACAGATACGAGGCTGGAAGAGTGATCGGAGATTTCAAGGTTATGGGAACTGGATTCCCTGAGGATTCTGTTATCTTCACCGACAAGATCATCAGGTCTAACGCTACTGTTGAGCATCTTCATCCTATGGGAGATAACGATCTCGATGGATCTTTCACCAGAACCTTCTCACTTAGAGATGGTGGTTACTACTCTTCTGTGGTGGATTCTCACATGCACTTCAAGTCTGCTATCCACCCTTCTATCCTTCAAAACGGTGGACCTATGTTCGCTTTCAGAAGAGTTGAGGAAGATCACTCTAACACCGAGCTTGGAATCGTTGAGTACCAACATGCTTTCAAGACCCCTGATGCTGATGCTGGTGAGGAATGATAATATCAAAATCTATTTAGAAATACACAATATTTTGTTGCAGGCTTGCTGGAGAATCGATCTGCTATCATAAAAATTACAAAAAAATTTTATTTGCCTCAATTATTTTAGGATTGGTATTAAGGACGCTTAAATTATTTGTCGGGTCACTACGCATCATTGTGATTGAGAAGATCAGCGATACGAAATATTCGTAGTACTATCGATAATTTATTTGAAAATTCATAAGAAAAGCAAACGTTACATGAATTGATGAAACAATACAAAGACAGATAAAGCCACGCACATTTAGGATATTGGCCGAGATTACTGAATATTGAGTAAGATCACGGAATTTCTGACAGGAGCATGTCTTCAATTCAGCCCAAATGGCAGTTGAAATACTCAAACCGCCCCATATGCAGGAGCGGATCATTCATTGTTTGTTTGGTTGCCTTTGCCAACATGGGAGTCCAAGGTTGCGGCCGCAGCGAGAGAAAGCTTATTGCAACTTCAACTACTTGCTGGTCGATCGTGTTGGCCACTC
TTCTGGCCTCTTTATTGGGCCGCCCAAGGAACCCTTTTCTGGGCCATCTTCGTACTCGGCCACGACTGGTAATTTAATGGATCCACTAGTAA
TTCTGGCCTCTTTATTGGGCCGCCCAAGGAACCCTTTTCTGGGCCATCTTCGTACTCGGCCACGACTGGTAATTTAATGGATCCACTAGTAA
TTCTGGCCTCTTTATTGGGCCGCCCAAGGAACCCTTTTCTGGGCCATC:CAGTCGTGGCCGAGTACGAAGATGGCCCAGA:::TACTCGGCCACGACTGGTAATTTAATGGATCCACTAGTAA
TTCTGGCCTCTTTATTGGGCCGCCCAAGGAACCCTTTTCTGGGCCATC:::GTACTCGGCCACGACTGGTAATTTAATGGATCCACTAGTAA
TTCTGGCCTCTTTATTGGGCCGCCCAAGGAACCCTTTTCTGGGCCA:::::::::::::::::GACTGGTAATTTAATGGATCCACTAGTAA
TCCAAGGTTGCGGCCGCGCCCAAGGAACCCTTTTCTGGGCCATCTTCGTACTCGGCCACGACTGGTAATTTAATTTTCAATTTATTT
TCCAAGGTTGCGGCCGCGCCCAAGGAACCCTTTTCTGGGCCAT:T:::TACTCGGCCACGACTGGTAATTTAATTTTCAATTTATTT
TAGTTTATTTGCCCCAAGCGAGAGAAAGCTTATTGCAACTTCAACTCGTACTCGGCCACGACTGGTAATTTAATGGATCCACTAGTAA
TAGTTTATTTGCCCCAAGCGAGAGAAAGCTTATTGCAACTTCAACT
TAGTTTATTTGCCCCAAGCGAGAGAAAGCTTATTGCAACTTCAACG
TAGTTTATTTGCCCCAAGCGAGAGAAAGCTTATTGCAACTTCAACTTCGTACTCGGCCACGACTGGTAATTTAATGGATCCACTAGTAA
TAGTTTATTTGCCCCAAGCGAGAGAAAGCTTATTGCAACTTCAACTAT::GTACTCGGCCACGACTGGTAATTTAATGGATCCACTAGTAA
TAGTTTATTTGCCCCAAGCGAGAGAAAGCTTATTGCAACTTCA:::::TACTCGGCCACGACTGGTAATTTAATGGATCCACTAGTAA
AGGTAATTTAATGGATCCACTAGTAA
TCCAAGGTTGCGGCCGCAGCGAGAGAAAGCTTATTGCAACTTCAACTACTTGCTGGTCGATCGTGTTG GCCACTCTTGTTTATCTATCA
TCCAAGGTTGCGGCCGCAGCGAGAGAAAGCTTATTGCAACTTCA:::ACTTGCTGGTCGATCGTGTTGGCCACTCTTGTTTATCTATCA
TCCAAGGTTGCGGCCGC:::::::::::::::::::::::::::::GCGCCGACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGGCATTATAAGAAAGCATTGCTTATCAATTTGTTGCAACGAACAGGTCACTATCAGTCAAA:ACTTGCTGGTCGATCGTGTTGGCCACTCTTGTTTATCTATCA
TCCAAGGTTTGCGGCCGCAGCGAGAGAAAGCTTATTGCAA::::::CTTC:ACTTGCTGGTCGATCGTGTTGGCCACTCTTGTTTATCTATCA
TCCAAGGTTGCGGCCGCAGCGAGAGAAAGCTTATTGCAACTTCA::GATAAAAGTTGCTCGCCTGTGTGGGTGTGGATGCT:ACTTGCTGGTCGATCGTGTTGGCCACTCTTGTTTATCTATCA
TCCAAGGTTGCGGCCGCAGCGAGAGAAAGCTTATTGCAACTTCAACTACACTACTTGCTGGTCGATCGTGTTGGCCACTCTTGTTTATCTATCA
TCCAAGGTTGCGGCCGCAGCGAGAGAAAGCTTATTGCAACTTCAACTACTTGCTGGTCGATCGTGTTGGCCACTCTTGTTTATCTATCA
CTTACATGCTTAGGATCGGACTTG
AGTTCCAGCACCAGATCTAACG
CCCTGAGCCCAAGCAGCATCATCG
CGGAGAGGGCGTGGAAGG
TTCGATTTGCTACAGCGTCAAC
AGGCACCATCGCAGGCTTCGCT
TTCTGGCCTCTTTATTGGGCCGCCCAAGGAACCCTTTTCTGGGCCATCTTCGTACTCGGCCACGACTGGTAATTTAATGGATCCAACCGACAACCACTT
TTCTGGCCTCTTTATTGGGCCGCCCAAGGAACCCTTT:::::::::::::::TACTCGGCCACGACTGGTAATTTAATGGATCCAACCGACAACCACTT
TTCTGGCCTCTTTATTGGGCCGCCCAAGGAACCCTTTTCTGG:::::::TCGTACTCGGCCACGACTGGTAATTTAATGGATCCAACCGACAACCACTT
TTCTGGCCTCTTTATTGGGCCGCCCAAGGAACCCTTTTCTGG
TTCTGGCCTCTTTATTGGGCCGCCCAAGGAACCCTTTTCTGGGCCATCT:::::::CGGCCACGACTGGTAATTTAATGGATCCAACCGACAACCACTT
TTCTGGCCTCTTTATTGGGCCGCCCAAGGAACCCTTTTCTGGGCCAT::TCGTACTCGGCCACGACTGGTAATTTAATGGATCCAACCGACAACCACTT
TTCTGGCCTCTTTATTGGGCCGCCCAAGGAACCCTTTTCTGGGCCATCT
GTAATACATAGCGGCCGCGCCCAAGGAACCCTTTTCTGGGCCATCTTCGTACTCGGCCACGACTGGTAATTTAATTTTCAATTTATTTTTTCTTCAACTTCTTA
GTAATACATAGCGGCCGCGCCCAAGGAACCCTTTTCTGGGCCAT:::::::::::GCCACGACTGGTAATTTAATTTTCAATTTATTTTTTCTTCAACTTCTTA
GTAATACATAGCGGCCGCGCCCAAGGAACCCTTTTCTGGGCCATCT::::::::::::::GACTGGTAATTTAATTTTCAATTTATTTTTTCTTCAACTTCTTA
GTAATACATAGCGGCCGCGCCCAAGGAACCCTTTTCTGGGCCATCT::::::::::::::GACTGGTAATTTAATTTTCAATTTATTTTTTCTTCAACTTCTTA
GTAATACATAGCGGCCGCGCCCAAGGAACCCTTTTCTGGGCCAT::::GTACTCGGCCACGACTGGTAATTTAATTTTCAATTTATTTTTTCTTCAACTTCTTA
::GTACTCGGCCACGACTGGTAATTTAATTTT:::::::::::TCTTTCAACTTCTTA
GTAATACATAGCGGCCGCGCCCAA:::::::::::::::::::::::::TACTCGGCCACGACTGGTAATTTAATTTTCAATTTATTTTTTCTTCAACTTCTTA
TGTAATACATAGCGGCCGCGCCCAAGGAACCCTTTACTCGGCCA::::::::::::::::::::::TAATTTAATTTTCAATTTATTTTTTCTTCAACTTCTTA
tnantgattc ccaatggcgg cgctttcaag gacatgatca tggagggtga tggcaggacctcgtactgaa atggtccgaa ggtccacgcc gccaactacg ag
cnantactcg tagttggcgg cgtggacctt cggaccattt cagtacgagg tcctgccatcaccctccatg atcatgtcct tgaaagcgcc gccattggga at
tnantgattc ccaatggcgg cgctttcaag gacatgatca tggagggtga tggcaggacc tcgtactgaa atttgcaggt acaag
angngtcttg tacctgcaaa tttcagtacg aggtcctgcc atcaccctcc atgatcatgtccttgaaagc gccgccattg ggaat
gtttacccgccaatatatcctgtcaaacactgatagtttaaactgaaggcgggaaacgacaatctgatcatgagcggagaattaagggagtcacgttatgacccccgccgatgacgcgggacaagccgttttacgtttggaactgacagaaccgcaacgttgaaggagccactcagcaagcttactagtagcgctgtttaaacgctcttcaactggaagagcggttacccggaccgaagcttgcatgcctgcagtgcagcgtgacccggtcgtgcccctctctagagataatgagcattgcatgtctaagttataaaaaattaccacatattttttttgtcacacttgtttgaagtgcagtttatctatctttatacatatatttaaactttactctacgaataatataatctatagtactacaataatatcagtgttttagagaatcatataaatgaacagttagacatggtctaaaggacaattgagtattttgacaacaggactctacagttttatctttttagtgtgcatgtgttctcctttttttttgcaaatagcttcacctatataatacttcatccattttattagtacatccatttagggtttagggttaatggtttttatagactaatttttttagtacatctattttattctattttagcctctaaattaagaaaactaaaactctattttagtttttttatttaataatttagatataaaatagaataaaataaagtgactaaaaattaaacaaataccctttaagaaattaaaaaaactaaggaaacatttttcttgtttcgagtagataatgccagcctgttaaacgccgtcgacgagtctaacggacaccaaccagcgaaccagcagcgtcgcgtcgggccaagcgaagcagacggcacggcatctctgtcgctgcctctggacccctctcgagagttccgctccaccgttggacttgctccgctgtcggcatccagaaattgcgtggcggagcggcagacgtgagccggcacggcaggcggcctcctcctcctctcacggcaccggcagctacgggggattcctttcccaccgctccttcgctttcccttcctcgcccgccgtaataaatagacaccccctccacaccctctttccccaacctcgtgttgttcggagcgcacacacacacaaccagatctcccccaaatccacccgtcggcacctccgcttcaaggtacgccgctcgtcctccccccccccccctctctaccttctctagatcggcgttccggtccatggttagggcccggtagttctacttctgttcatgtttgtgttagatccgtgtttgtgttagatccgtgctgctagcgttcgtacacggatgcgacctgtacgtcagacacgttctgattgctaacttgccagtgtttctctttggggaatcctgggatggctctagccgttccgcagacgggatcgatttcatgattttttttgtttcgttgcatagggtttggtttgcccttttcctttatttcaatatatgccgtgcacttgtttgtcgggtcatcttttcatgcttttttttgtcttggttgtgatgatgtggtctggttgggcggtcgttctagatcggagtagaattctgtttcaaactacctggtggatttattaattttggatctgtatgtgtgtgccatacatattcatagttacgaattgaagatgatggatggaaatatcgatctaggataggtatacatgttgatgcgggttttactgatgcatatacagagatgctttttgttcgcttggttgtgatgatgtggtgtggttgggcggtcgttcattcgttctagatcggagtagaatactgtttcaaactacctggtgtatttattaattttggaactgtatgtgtgtgtcatacatcttcatagttacgagtttaagatggatggaaatatcgatgtaggataggtatacatgttgatgtgggttttactgatgcatatacatgatggcatatgcagcatctattcatatgctctaaccttgagtacctatctattataataaacaagtatgttttataattattttgatcttgatatacttggatgatggcatatgcagcagctatatgtggatttttttagccctgccttcatacgctatttatttgcttggtactgtttcttttgtcgatgctcaccctgttgtttggtgttacttctgcaggtcgactctagaggatccacacgacaccatgtccgcccgcgaggtgcacatcgacgtgaacaacaagaccggccacaccctccagctggaggacaagaccaagctcgacggcggcaggtggcgcacctccccgaccaacgtggccaacgaccagatcaagaccttcgtggccgaatccaacggcttcatgaccggcaccgagggcaccatctactactcaattaatggcgaggccgagatcagcctctacttcgacaacccgttcgccggctccaacaaatacgacggccactccaacaagtcccagtacgagatcatcacccagggcggctccggcaaccagtcccacgtgacctacaccatccagaccacctcctcccgctacggccacaagtcctgagtcatgagtcatgagtcagttaacctagacttgtccatcttctggattggccaacttaattaatgtatgaaataaaaggatgcacacatagtgacatgctaatcactataatgtgggcatcaaagttgtgtgttatgtgtaattactagttatctgaataaaagagaaagagatcatccatatttcttatcctaaatgaatgtcacgtgtctttataattctttgatgaaccagatgcatttcattaaccaaatccatatacatataaatattaatcatatataattaatatcaattgggttagcaaaacaaatctagtctaggtgtgttttgcgaatgcggccgcggaccgaattggggatctgcatgaaagaaactgtcgcactgctgaaccgcaccttgtcactttcatcgaacacgacctgtgcccaagatgacggtgctgcggtctaagtgaggctgaattgccttggacagaagcggactccctacaattagttaggccaaacggtgcatccatgtgtagctccgggctcgggctgtatcgccatctgcaatagcatccatggagctcgttccatgtagttggagatgaaccaatgatcgggcgtgtggacgtatgttcctgtgtactccgatagtagagtacgtgttagctctttcatggtgcaagtgaaatttgtgttggtttaattacccctacgttagttgcgggacaggagacacatcatgaatttaaaggcgatgatgtcctctcctgtaatgttattcttttgatgtgatgaatcaaaatgtcatataaaacatttgttgctctttagttaggcctgatcgtagaacgaaatgctcgtgtagcggggctacgagcctatgacgcaataacactggtttgccggcccggagtcgcttgacaaaaaaaagcatgttaagtttatttacaattcaaaacctaacatattatattccctcaaagcaggttcacgatcacacctgtacctaaaaaaaacatgaagaatatattactccattattatgagatgaaccacttggcaagagtggtaagctatataaaaaaatgaacattattacgagatgttatatgccattatattgattcgaagatatatgtttctttctcccacgggcacctaacggatacatgataaggccaaggcagatcacgggaaattattcgaatacatgttacgccctattgccggaaaaaaaatgcagggcaggtgttggccgtagcgatttaagcacttaagctggaggttgccacacttggatgcaagcgtctgacccttctaaaaaatcggcggctttgtccgtatccgtatcccctatccaacatctagctggccacacgacggggctgggcagatcgtggatgccgggtcgacgtcgatcgtcagccatcatagaccaatcgaccatctgttatggatgcttgctagctagactagtcagacataaaatttggatactttctcccaactgggagacggggactgatgtgcagctgcacgtgagctaaatttttccctataaatatgcatgaaatactgcattatcttgccacagccactgccacagccagataacaagtgcagctggtagcacgcaacgcatagctctggacttgtagctaggtagccaaccggatccacacgacaccatgctcgacaccaacaaggtgtacgagatcagcaaccacgccaacggcctctacgccgccacctacctctccctcgacgactccggcgtgtccctcatgaacaagaacgacgacgacatcgacgactacaacctcaagtggttcctcttcccgatcgacgacgaccagtacatcatcacctcctacgccgccaacaactgcaaggtgtggaacgtgaacaacgacaagattaatgtgtcaacctactcctccaccaactccatccagaagtggcagatcaaggccaacggctcctcctacgtgatccagtccgacaacggcaaggtgctcaccgccggcaccggccaggccctcggcctcatccgcctcaccgacgagtcctccaacaacccgaaccagcaatggaacctgacgtccgtgcagaccatccagctcccgcagaagccgatcatcgacaccaagctcaaggactacccgaagtactccccgaccggcaacatcgacaacggcacctccccgcagctcatgggctggaccctcgtgccgtgcatcatggtgaacgacccgaacatcgacaagaacacccagatcaagaccaccccgtactacatcctcaagaagtaccagtactggcagagggccgtgggctccaacgtcgcgctccgcccgcacgagaagaagtcctacacctacgagtggggcaccgagatcgaccagaagaccaccatcatcaacaccctcggcttccagatcaacatcgacagcggcatgaagttcgacatcccggaggtgggcggcggta
ccgacgagatcaagacccagctcaacgaggagctcaagatcgagtattcacatgagacgaagatcatggagaagtaccaggagcagtccgagatcgacaacccgaccgaccagtccatgaactccatcggcttcctcaccatcacctccctggagctctaccgctacaacggctccgagatccgcatcatgcagatccagacctccgacaacgacacctacaacgtgacctcctacccgaaccaccagcaggccctgctgctgctgaccaaccactcctacgaggaggtggaggagatcaccaacatcccgaagtccaccctcaagaagctcaagaagtactacttctgagtcatgagtcatgagtcagttaacctagacttgtccatcttctggattggccaacttaattaatgtatgaaataaaaggatgcacacatagtgacatgctaatcactataatgtgggcatcaaagttgtgtgttatgtgtaattactagttatctgaataaaagagaaagagatcatccatatttcttatcctaaatgaatgtcacgtgtctttataattctttgatgaaccagatgcatttcattaaccaaatccatatacatataaatattaatcatatataattaatatcaattgggttagcaaaacaaatctagtctaggtgtgttttgcgaattcccatggagtcaaagattcaaatagaggacctaacagaactcgccgtaaagactggcgaacagttcatacagagtctcttacgactcaatgacaagaagaaaatcttcgtcaacatggtggagcacgacacgcttgtctactccaaaaatatcaaagatacagtctcagaagaccaaagggcaattgagacttttcaacaaagggtaatatccggaaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcactttattgtgaagatagtggaaaaggaaggtggctcctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggccatcgttgaagatgcctctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgatatctccactgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataaggaagttcatttcatttggagaggacagggtacccggggatccaccatgtctccggagaggagaccagttgagattaggccagctacagcagctgatatggccgcggtttgtgatatcgttaaccattacattgagacgtctacagtgaactttaggacagagccacaaacaccacaagagtggattgatgatctagagaggttgcaagatagatacccttggttggttgctgaggttgagggtgttgtggctggtattgcttacgctgggccctggaaggctaggaacgcttacgattggacagttgagagtactgtttacgtgtcacataggcatcaaaggttgggcctaggatccacattgtacacacatttgcttaagtctatggaggcgcaaggttttaagtctgtggttgctgttataggccttccaaacgatccatctgttaggttgcatgaggctttgggatacacagcccggggtacattgcgcgcagctggatacaagcatggtggatggcatgatgttggtttttggcaaagggattttgagttgccagctcctccaaggccagttaggccagttacccagatctgagtcgacctgcaggcatgcccgctgaaatcaccagtctctctctacaaatctatctctctctataataatgtgtgagtagttcccagataagggaattagggttcttatagggtttcgctcatgtgttgagcatataagaaacccttagtatgtatttgtatttgtaaaatacttctatcaataaaatttctaattcctaaaaccaaaatccagggcgagctcggtacccggggatcctctagagtcgacctgcaggcatgcccgcggatatcgatgggccccggccgaagcttcggtccgggccatcgtggcctcttgctcttcaggatgaagagctatgtttaaacgtgcaagcgctcaattcgccctatagtgagtcgtattacaatcgtacgcaattcagtacattaaaaacgtccgcaatgtgttattaagttgtctaagcgtcaatttgtttacaccacaatatatcctgcca
Gaggccgacacggcacacacggcgacattcaccgccggcttcctccgtcgccactcggcacaaggctcatcagtcgccgatgcccgatgcgatcaacggaagcggatggcccgcttctttagaattggcacaggaacactggccactgcccttgatgtgcaattatgcctgcgaaagcctaggcaacacacgcgaataaacgagcgaatgacacggaaagctgatgtggtatgaattatacaacattatgggccaaaatattattctatccaccattgtgtagccacagcatcggtatttgagttgtgcgaggacaaatccctcgtgaggtcaaaaacagcaaataataaacccatctcctgaagacaccaaaaaaaaggagcagctcctcgtgtcaatgaacaagcgtcacaagaaaagggagcacgtaaataacctcttcaattgcttcagcatgaaaagaacgggaagaaatgcaagtctacagaggaaagtgcagctgtttcggctgccatggcaagttcctacatgggcgaggaaaagctgaactggattccagtcttcgcgctgtcatgctcagcttgctttaggatgcggcaatagttcacctggatgaaaaagatacaagttagtcttgaagcagtcgagtggacatccaaagtatcaaaatcgaaagcttgtaaatggggaaggaaatatacctctacccggaaaagtttggtaggcaaaataatcccaacgccagcagagctc
cgtgcaagcgctcaattcgccctatagtgagtcgtattacaatcgtacgcaattcagtacattaaaaacgtccgcaatgtgttattaagttgtctaagcgtcaatttgtttacaccagaggccgacacggcacacacggcgacattcaccgccggcttcctccgtcgccactcggcacaaggctcatcagtcgccgatgcccgatgcgatcaacggaagcggatggcccgcttctttagaattggcacaggaacactggccactgcccttgatgtgcaattatgcctgcgaaagcctaggcaacacacgcgaataaacgagcgaatgacacggaaagctgatgtggtatgaattatacaacattatgggccaaaatattattctatccaccattgtgtagccacagcatcggtatttgagttgtgcgaggacaaatccctcgtgaggtcaaaaacagcaaataataaacccatctcctgaagacaccaaaaaaaaggagcagctcctcgtgtcaatgaacaagcgtcacaagaaaagggagcacgtaaataacctcttcaattgcttcagcatgaaaagaacgggaagaaatgcaagtctacagaggaaagtgcagctgtttcggctgccatggcaagttcctacatgggcgaggaaaagctgaactggattccagtcttcgcgctgtcatgctcagcttgctttaggatgcggcaatagttcacctggatgaaaaagatacaagttagtcttgaagcagtcgagtggacatccaaagtatcaaaatcgaaagcttgtaaatggggaaggaaatatacctctacccggaaaagtttggtaggcaaaataatcccaacgccagcagagctc
agttgggaaggcaaaacgaatataagtgcattcggattactgtttagtcgagtcatatttaaggaattcattgtaaatgttctaacctaacctaagtattaggcagctatggctgatatggatctgattggacttgatttatccatgataagtttaagagcaactcaaagaggttaggtatatatggttttgtaaaggtaaatttagttaatattagaaaaaaaaagtgtatccaataggctctataaacaactcttcaaatttagtggctttctatccatccacctttgctctctatttttggatagcctgatttactctctattcagtccgtaggtttaatgagtctgttggattagcctacactttttctgtaaaatctattttagatagtagctaaatcagtaaatttggctagtatttttagctattctcttggagtttgctataagaccagaacatgtaaattggaagtttgtggacccggacgagaatgcatgacaaatccagagtattgatgatggaattcacctattttacccgactcttccattgtgtccatttctcatcatccccgggcgctttctgcatccggtacagctgacatgacacgttcacgcgttacatggctgatggctcacaagtcacccccacatgtctagtgttcgcccaggcagatcgtcctcggcctgcgctgccgtgctcttgccgccgcttgcttgggccctgctggcgcccgctgccgatcacacggcctacgcggtgcaggcagcgccaccgaacccgcagtcttgttgtgccgataggtggcagtggcagtggcactggcacggcacgcgatcgatcgctccgctcatctgctgacagtggatagagcagcgttggccgttggggccggatctccgtgaagcggtcgtccctgctgtactgtgccgctatggcgtgtcgctttcgccatgttttcttttcttttttttttctttttctttttgctagggcggtttctcgttcgctggtaacagggaccacttcggttgatccgttgaatttactgaaagagatgggaatggtcgctgtgcccgggacattgaatgagatgttgtgtaagtgaatatggctttagccttttgcgagtgggaatggatgctaaacgaacacaaaccgggtttaaaccagaggccgacacggcacacacggcgacattcaccgccggcttcctccgtcgccactcggcacaaggctcatcagtcgccgatgcccgatgcgatcaacggaagcggatggcccgcttctttagaattggcacaggaacactggccactgcccttgatgtgcaattatgcctgcgaaagcctaggcaacacacgcgaataaacgagcgaatgacacggaaagctgatgtggtatgaattatacaacattatgggccaaaatattattctatccaccattgtgtagccacagcatcggtatttgagttgtgcgaggacaaatccctcgtgaggtcaaaaacagcaaataataaacccatctcctgaagacaccaaaaaaaaggagcagctcctcgtgtcaatgaacaagcgtcacaagaaaagggagcacgtaaataacctcttcaattgcttcagcatgaaaagaacgggaagaaatgcaagtctacagaggaaagtgcagctgtttcggctgccatggcaagttcctacatgggcgaggaaaagctgaactggattccagtcttcgcgctgtcatgctcagcttgctttaggatgcggcaatagttcacctggatgaaaaagatacaagttagtcttgaagcagtcgagtggacatccaaagtatcaaaatcgaaagcttgtaaatggggaaggaaatatacctctacccggaaaagtttggtaggcaaaataatcccaacgccagcagagctccggaacgtttgccgaaattcagaagccgaaaagttcttgtactcaccctccgacagtttcgcaaggtttccagcagtaaggaatgcgtggccatggattccagcgtctctgaatatcttgaggggcagatcaaaagaaaggtcagcgaaggcagacacggccagatcacctcccaagtaatcccttccagggtcagccgagccactctccgagttattaaggacatgcctccgcgcctctgttgggccaactccccttaatctgaaacccagcagagatgacggtccgcccaagctgcacactggagaagaattacctccaagataaaacctctctggcactgatgaagtcgaattcatgaatccccctgcaagcggtaaaatgacacccgctcctacaccaacgttgagagcagcactataaaatcccaaaggcacagcaccacgtacatcgaactcctgagagcaaacccaacggcaatattttctaacggacaccaaccagcgaaccagcagcgtcgcgtcgggccaagcgaagcagacggcacggcatctctgtcgctgcctctggacccctctcgagagttccgctccaccgttggacttgctccgctgtcggcatccagaaattgcgtggcggagcggcagacgtgagccggcacggcaggcggcctcctcctcctctcacggcaccggcagctacgggggattcctttcccaccgctccttcgctgtcccttcctcgccc
agttgggaaggcaaaacgaatataagtgcattcggattactgtttagtcgagtcatatttaaggaattcattgtaaatgttctaacctaacctaagtattaggcagctatggctgatatggatctgattggacttgatttatccatgataagtttaagagcaactcaaagaggttaggtatatatggttttgtaaaggtaaatttagttaatattagaaaaaaaaagtgtatccaataggctctataaacaactcttcaaatttagtggctttctatccatccacctttgctctctatttttggatagcctgatttactctctattcagtccgtaggtttaatgagtctgttggattagcctacactttttctgtaaaatctattttagatagtagctaaatcagtaaatttggctagtatttttagctattctcttggagtttgctataagaccagaacatgtaaattggaagtttgtggacccggacgagaatgcatgacaaatccagagtattgatgatggaattcacctattttacccgactcttccattgtgtccatttctcatcatccccgggcgctttctgcatccggtacagctgacatgacacgttcacgcgttacatggctgatggctcacaagtcacccccacatgtctagtgttcgcccaggcagatcgtcctcggcctgcgctgccgtgctcttgccgccgcttgcttgggccctgctggcgcccgctgccgatcacacggcctacgcggtgcaggcagcgccaccgaacccgcagtcttgttgtgccgataggtggcagtggcagtggcactggcacggcacgcgatcgatcgctccgctcatctgctgacagtggatagagcagcgttggccgttggggccggatctccgtgaagcggtcgtccctgctgtactgtgccgctatggcgtgtcgctttcgccatgttttcttttcttttttttttctttttctttttgctagggcggtttctcgttcgctggtaacagggaccacttcggttgatccgttgaatttactgaaagagatgggaatggtcgctgtgcccgggacattgaatgagatgttgtgtaagtgaatatggctttagccttttgcgagtggggcggcaatgcacggcatgaactataatttccggtcaaacttttgtgtggaaatggatgctaaacgaacacaaaccgggtttaaaccagaggccgacacggcacacacggcgacattcaccgccggcttcctccgtcgccactcggcacaaggctcatcagtcgccgatgcccgatgcgatcaacggaagcggatggcccgcttctttagaattggcacaggaacactggccactgcccttgatgtgcaattatgcctgcgaaagcctaggcaacacacgcgaataaacgagcgaatgacacggaaagctgatgtggtatgaattatacaacattatgggccaaaatattattctatccaccattgtgtagccacagcatcggtatttgagttgtgcgaggacaaatccctcgtgaggtcaaaaacagcaaataataaacccatctcctgaagacaccaaaaaaaaggagcagctcctcgtgtcaatgaacaagcgtcacaagaaaagggagcacgtaaataacctcttcaattgcttcagcatgaaaagaacgggaagaaatgcaagtctacagaggaaagtgcagctgtttcggctgccatggcaagttcctacatgggcgaggaaaagctgaactggattccagtcttcgcgctgtcatgctcagcttgctttaggatgcggcaatagttcacctggatgaaaaagatacaagttagtcttgaagcagtcgagtggacatccaaagtatcaaaatcgaaagcttgtaaatggggaaggaaatatacctctacccggaaaagtttggtaggcaaaataatcccaacgccagcagagctccggaacgtttgccgaaattcagaagccgaaaagttcttgtactcaccctccgacagtttcgcaaggtttccagcagtaaggaatgcgtggccatggattccagcgtctctgaatatcttgaggggcagatcaaaagaaaggtcagcgaaggcagacacggccagatcacctcccaagtaatcccttccagggtcagccgagccactctccgagttattaaggacatgcctccgcgcctctgttgggccaactccccttaatctgaaacccagcagagatgacggtccgcccaagctgcacactggagaagaattacctccaagataaaacctctctggcactgatgaagtcgaattcatgaatccccctgcaagcggtaaaatgacacccgctcctacaccaacgttgagagcagcactataaaatcccaaaggcacagcaccacgtacatcgaactcctgagagcaaacccaacggcaatatttttgtaatagtgatggtcagaactgagaagatcagataaaattatacactgatgcaattatttcatagtttcgcccatgaactgtaagggctagacaaagcaaaaagtaagacatgaagggcaagagaataacctgccggaaatatctcaatcctttgctattccatagaccaccaacttgagaagttgactgaaacgcatatcctttcgttggcctaagatgtgaatccctcttatcaatcttgtatgtgtacttcaatgcagaaagaaggttatgccctaactgcctccttatggcctttgatgagacacgtgatggatcagttaaggtacgccacgcaaggttgtatgacaagtcatggttccttgttgacagcaaaccaaatgaaaggccaagtaggcgctccttgtatgatgaaaacttcagccaatcttgtgatgacaaagatgcccgagccatcaatggtgttggtattgatttaaacctcggtaggcagactccaacaccaacctctgttgtttggtcccaaccaaaggatcctgatgcatcccagatgtcaccatagccaaacaagttcttcaacttaagtgacccttccagcgaccaagatcttgcctacaagagtggcaagcacagtca
gtgcattcggattactgtttagtcgagtcatatttaaggaattcattgtaaatgttctaacctaacctaagtattaggcagctatggctgatatggatctgattggacttgatttatccatgataagtttaagagcaactcaaagaggttaggtatatatggttttgtaaaggtaaatttagttaatattagaaaaaaaaagtgtatccaataggctctataaaca
Claims (18)
- 2本鎖ポリヌクレオチドであって、
外因性核酸配列と、
1つ以上のヌクレアーゼに対する1つ以上の標的部位を含む配列とを含み、
前記1つ以上の標的部位は、前記外因性核酸配列内にはなく、さらに、前記2本鎖ポリヌクレオチドは、相同アームを含まない、2本鎖ポリヌクレオチド。 - 前記外因性核酸配列は、少なくとも1kbの長さである、請求項1に記載の2本鎖ポリヌクレオチド。
- 前記外因性核酸配列ポリヌクレオチドは、プラスミドである、請求項1または請求項2に記載の2本鎖ポリヌクレオチド。
- 前記外因性核酸配列は、導入遺伝子を含む、請求項1から3のいずれかに記載の2本鎖ポリヌクレオチド。
- 前記配列は、2つの標的部位、および前記2つの標的部位の間の少なくとも5つのヌクレオチドのスペーサーを含む、請求項1から4のいずれかに記載の2本鎖ポリヌクレオチド。
- 請求項1から5のいずれかに記載の2本鎖ポリヌクレオチドを含む細胞。
- 細胞の内因性遺伝子座内に外因性核酸配列ポリヌクレオチドを組み込む方法であって、
請求項1から5のいずれかに記載の2本鎖ポリヌクレオチドを、前記細胞内に導入する工程と、
1つ以上のヌクレアーゼを前記細胞内に導入する工程とを含み、前記ヌクレアーゼは、前記2本鎖ポリヌクレオチドを切断し、そして前記外因性核酸配列ポリヌクレオチドが前記内因性遺伝子座内に組み込まれるように、前記内因性遺伝子座を切断する、方法。 - 前記外因性核酸配列ポリヌクレオチドは、順方向に組み込まれる、請求項7に記載の方法。
- 前記外因性核酸配列ポリヌクレオチドは、逆方向に組み込まれる、請求項7に記載の方法。
- 同じヌクレアーゼが、前記内因性遺伝子座およびドナーポリヌクレオチドを切断する、請求項7から9のいずれかに記載の方法。
- 異なるヌクレアーゼが、前記内因性遺伝子座およびドナーポリヌクレオチドを切断する、請求項7から9のいずれかに記載の方法。
- 前記外因性核酸配列ポリヌクレオチドは、相同性非依存性の機構を介して前記内因性遺伝子座内に組み込まれる、請求項7から11のいずれかに記載の方法。
- 前記2つの標的部位および前記スペーサーを含む前記核酸は、前記標的部位が前記外因性核酸配列ポリヌクレオチドの組み込み後に再形成されないように、非天然型のものである、請求項7から12のいずれかに記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼは、前記内因性遺伝子座内に欠失を生成し、前記外因性核酸配列ポリヌクレオチドは、前記欠失に組み込まれる、請求項7から13のいずれかに記載の方法。
- 前記細胞は、真核細胞である、請求項7から14のいずれかに記載の方法。
- 前記細胞は、植物細胞または哺乳動物細胞である、請求項15に記載の方法。
- 前記植物細胞は、双子葉植物細胞または単子葉植物細胞である、請求項16に記載の方法。
- 請求項7から17のいずれかに記載の方法に従って組み込まれた外因性核酸配列ポリヌクレオチドを含む、トランスジェニック生物。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201261643812P | 2012-05-07 | 2012-05-07 | |
US61/643,812 | 2012-05-07 | ||
PCT/US2013/039979 WO2013169802A1 (en) | 2012-05-07 | 2013-05-07 | Methods and compositions for nuclease-mediated targeted integration of transgenes |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2019026476A Division JP2019088321A (ja) | 2012-05-07 | 2019-02-18 | 導入遺伝子のヌクレアーゼ媒介標的化組み込みのための方法および組成物 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2015516162A true JP2015516162A (ja) | 2015-06-11 |
JP2015516162A5 JP2015516162A5 (ja) | 2016-05-26 |
JP6559063B2 JP6559063B2 (ja) | 2019-08-14 |
Family
ID=49551220
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015511632A Active JP6559063B2 (ja) | 2012-05-07 | 2013-05-07 | 導入遺伝子のヌクレアーゼ媒介標的化組み込みのための方法および組成物 |
JP2019026476A Pending JP2019088321A (ja) | 2012-05-07 | 2019-02-18 | 導入遺伝子のヌクレアーゼ媒介標的化組み込みのための方法および組成物 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2019026476A Pending JP2019088321A (ja) | 2012-05-07 | 2019-02-18 | 導入遺伝子のヌクレアーゼ媒介標的化組み込みのための方法および組成物 |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10174331B2 (ja) |
EP (1) | EP2847338B1 (ja) |
JP (2) | JP6559063B2 (ja) |
KR (1) | KR102116153B1 (ja) |
CN (1) | CN104471067B (ja) |
AU (1) | AU2013259647B2 (ja) |
BR (1) | BR112014027813A2 (ja) |
CA (1) | CA2871524C (ja) |
HK (1) | HK1208051A1 (ja) |
IL (1) | IL235421B (ja) |
RU (1) | RU2650819C2 (ja) |
WO (1) | WO2013169802A1 (ja) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2015527081A (ja) * | 2012-09-07 | 2015-09-17 | ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー | Fad3性能座および標的化切断を誘導可能である対応する標的部位特異的結合タンパク質 |
JP2016500268A (ja) * | 2012-12-13 | 2016-01-12 | ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー | トウモロコシにおける特定の遺伝子座に対する精密な遺伝子標的化 |
WO2020149395A1 (ja) * | 2019-01-18 | 2020-07-23 | 国立大学法人大阪大学 | 栄養障害型表皮水疱症治療薬 |
JP2020202832A (ja) * | 2020-07-10 | 2020-12-24 | ツムトー バイオロジクス、インコーポレイテッド | 非フコシル化タンパク質および方法 |
JP2021508251A (ja) * | 2017-11-06 | 2021-03-04 | 深▲セン▼市三▲啓▼生物技▲術▼有限公司Shenzhen Cell Inspire Biotechnology Co., Ltd. | アルツハイマー病をモデル化する新しいヒト誘発多能性幹細胞株およびその使用 |
Families Citing this family (171)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9585920B2 (en) | 2011-02-04 | 2017-03-07 | Katherine Rose Kovarik | Method and system for treating cancer cachexia |
US9457077B2 (en) | 2009-11-18 | 2016-10-04 | Katherine Rose Kovarik | Method and system for targeting the microbiome to promote health and treat allergic and inflammatory diseases |
WO2011100505A2 (en) * | 2010-02-11 | 2011-08-18 | Recombinetics, Inc. | Methods and materials for producing transgenic artiodactyls |
US10842834B2 (en) | 2016-01-06 | 2020-11-24 | Joseph E. Kovarik | Method and system for reducing the likelihood of developing liver cancer in an individual diagnosed with non-alcoholic fatty liver disease |
US10940169B2 (en) | 2015-11-30 | 2021-03-09 | Joseph E. Kovarik | Method for reducing the likelihood of developing cancer in an individual human being |
US11419903B2 (en) | 2015-11-30 | 2022-08-23 | Seed Health, Inc. | Method and system for reducing the likelihood of osteoporosis |
US11951140B2 (en) | 2011-02-04 | 2024-04-09 | Seed Health, Inc. | Modulation of an individual's gut microbiome to address osteoporosis and bone disease |
US10512661B2 (en) | 2011-02-04 | 2019-12-24 | Joseph E. Kovarik | Method and system for reducing the likelihood of developing liver cancer in an individual diagnosed with non-alcoholic fatty liver disease |
US11998479B2 (en) | 2011-02-04 | 2024-06-04 | Seed Health, Inc. | Method and system for addressing adverse effects on the oral microbiome and restoring gingival health caused by sodium lauryl sulphate exposure |
US10314865B2 (en) | 2011-02-04 | 2019-06-11 | Katherine Rose Kovarik | Method and system for treating cancer and other age-related diseases by extending the healthspan of a human |
US11951139B2 (en) | 2015-11-30 | 2024-04-09 | Seed Health, Inc. | Method and system for reducing the likelihood of osteoporosis |
US9730967B2 (en) | 2011-02-04 | 2017-08-15 | Katherine Rose Kovarik | Method and system for treating cancer cachexia |
US11191665B2 (en) | 2011-02-04 | 2021-12-07 | Joseph E. Kovarik | Method and system for reducing the likelihood of a porphyromonas gingivalis infection in a human being |
US11844720B2 (en) | 2011-02-04 | 2023-12-19 | Seed Health, Inc. | Method and system to reduce the likelihood of dental caries and halitosis |
US10583033B2 (en) | 2011-02-04 | 2020-03-10 | Katherine Rose Kovarik | Method and system for reducing the likelihood of a porphyromonas gingivalis infection in a human being |
US11273187B2 (en) | 2015-11-30 | 2022-03-15 | Joseph E. Kovarik | Method and system for reducing the likelihood of developing depression in an individual |
US9528124B2 (en) | 2013-08-27 | 2016-12-27 | Recombinetics, Inc. | Efficient non-meiotic allele introgression |
US10920242B2 (en) | 2011-02-25 | 2021-02-16 | Recombinetics, Inc. | Non-meiotic allele introgression |
AU2012333134B2 (en) | 2011-07-22 | 2017-05-25 | John Paul Guilinger | Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity |
GB201122458D0 (en) | 2011-12-30 | 2012-02-08 | Univ Wageningen | Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof |
AU2013251558B2 (en) | 2012-04-25 | 2019-01-03 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Nuclease-mediated targeting with large targeting vectors |
RS64622B1 (sr) | 2012-05-25 | 2023-10-31 | Univ California | Metode i sastavi za modifikaciju ciljane dnk upravljenu pomoću rnk i za modulaciju transkripcije upravljanu rnk |
CA2875618C (en) | 2012-07-11 | 2021-04-27 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for the treatment of lysosomal storage diseases |
JP6329537B2 (ja) | 2012-07-11 | 2018-05-23 | サンガモ セラピューティクス, インコーポレイテッド | 生物学的薬剤の送達のための方法および組成物 |
US10058078B2 (en) | 2012-07-31 | 2018-08-28 | Recombinetics, Inc. | Production of FMDV-resistant livestock by allele substitution |
WO2014033644A2 (en) * | 2012-08-28 | 2014-03-06 | Novartis Ag | Methods of nuclease-based genetic engineering |
CN104704110B (zh) | 2012-08-29 | 2018-06-01 | 桑格摩生物科学股份有限公司 | 用于治疗遗传性病状的方法和组合物 |
UA118090C2 (uk) | 2012-09-07 | 2018-11-26 | ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі | Спосіб інтегрування послідовності нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, у ген fad2 у клітині сої та специфічний для локусу fad2 білок, що зв'язується, здатний індукувати спрямований розрив |
CA2886684C (en) | 2012-10-10 | 2023-09-19 | Sangamo Biosciences, Inc. | T cell modifying compounds and uses thereof |
ES2757808T3 (es) | 2012-12-06 | 2020-04-30 | Sigma Aldrich Co Llc | Modificación y regulación del genoma basada en CRISPR |
CN105980575A (zh) | 2013-03-14 | 2016-09-28 | 卡里布生物科学公司 | 以核酸为靶的核酸的组合物和方法 |
US10760064B2 (en) | 2013-03-15 | 2020-09-01 | The General Hospital Corporation | RNA-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci |
US9957515B2 (en) * | 2013-03-15 | 2018-05-01 | Cibus Us Llc | Methods and compositions for targeted gene modification |
EP3527068B1 (en) | 2013-03-15 | 2022-06-01 | Cibus US LLC | Methods and compositions for increasing efficiency of targeted gene modification using oligonucleotide-mediated gene repair |
DK2970915T3 (da) | 2013-03-15 | 2019-11-11 | Maxcyte Inc | Fremgangsmåder og sammensætninger til generering af stabile transficerede celler |
WO2014204578A1 (en) | 2013-06-21 | 2014-12-24 | The General Hospital Corporation | Using rna-guided foki nucleases (rfns) to increase specificity for rna-guided genome editing |
EP2971041B1 (en) | 2013-03-15 | 2018-11-28 | The General Hospital Corporation | Using rna-guided foki nucleases (rfns) to increase specificity for rna-guided genome editing |
EP2975942B1 (en) | 2013-03-21 | 2018-08-08 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Targeted disruption of t cell receptor genes using engineered zinc finger protein nucleases |
CN111500630A (zh) | 2013-04-16 | 2020-08-07 | 瑞泽恩制药公司 | 大鼠基因组的靶向修饰 |
CA2920253A1 (en) | 2013-08-02 | 2015-02-05 | Enevolv, Inc. | Processes and host cells for genome, pathway, and biomolecular engineering |
US20150044192A1 (en) | 2013-08-09 | 2015-02-12 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease |
US9359599B2 (en) | 2013-08-22 | 2016-06-07 | President And Fellows Of Harvard College | Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof |
RU2668819C2 (ru) * | 2013-09-04 | 2018-10-02 | ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи | Быстрый направленный анализ сельскохозяйственных культур для определения донорной вставки |
US9340800B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-05-17 | President And Fellows Of Harvard College | Extended DNA-sensing GRNAS |
US9322037B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-04-26 | President And Fellows Of Harvard College | Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof |
US9737604B2 (en) | 2013-09-06 | 2017-08-22 | President And Fellows Of Harvard College | Use of cationic lipids to deliver CAS9 |
ES2681622T3 (es) | 2013-09-18 | 2018-09-14 | Kymab Limited | Métodos, células y organismos |
US9957526B2 (en) | 2013-10-17 | 2018-05-01 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering |
AU2014337790B2 (en) | 2013-10-25 | 2019-09-26 | Livestock Improvement Corporation Limited | Genetic markers and uses therefor |
JP5900942B2 (ja) * | 2013-11-06 | 2016-04-06 | 国立大学法人広島大学 | 核酸挿入用ベクター |
CN111218447B (zh) | 2013-11-07 | 2024-10-11 | 爱迪塔斯医药有限公司 | 使用统治型gRNA的CRISPR相关方法和组合物 |
EP3960856A1 (en) | 2013-11-13 | 2022-03-02 | Children's Medical Center Corporation | Nuclease-mediated regulation of gene expression |
US10787684B2 (en) * | 2013-11-19 | 2020-09-29 | President And Fellows Of Harvard College | Large gene excision and insertion |
US9074199B1 (en) * | 2013-11-19 | 2015-07-07 | President And Fellows Of Harvard College | Mutant Cas9 proteins |
DK3080274T3 (da) | 2013-12-09 | 2020-08-31 | Sangamo Therapeutics Inc | Fremgangsmåder og sammensætninger til genom-manipulation |
CN105980568B (zh) | 2013-12-11 | 2019-12-03 | 瑞泽恩制药公司 | 用于靶向修饰基因组的方法和组合物 |
US20150166982A1 (en) | 2013-12-12 | 2015-06-18 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for correcting pi3k point mutations |
US11826388B2 (en) | 2013-12-20 | 2023-11-28 | Seed Health, Inc. | Topical application of Lactobacillus crispatus to ameliorate barrier damage and inflammation |
US11642382B2 (en) | 2013-12-20 | 2023-05-09 | Seed Health, Inc. | Method for treating an individual suffering from bladder cancer |
US11026982B2 (en) | 2015-11-30 | 2021-06-08 | Joseph E. Kovarik | Method for reducing the likelihood of developing bladder or colorectal cancer in an individual human being |
US11969445B2 (en) | 2013-12-20 | 2024-04-30 | Seed Health, Inc. | Probiotic composition and method for controlling excess weight, obesity, NAFLD and NASH |
US11839632B2 (en) | 2013-12-20 | 2023-12-12 | Seed Health, Inc. | Topical application of CRISPR-modified bacteria to treat acne vulgaris |
US11998574B2 (en) | 2013-12-20 | 2024-06-04 | Seed Health, Inc. | Method and system for modulating an individual's skin microbiome |
US12005085B2 (en) | 2013-12-20 | 2024-06-11 | Seed Health, Inc. | Probiotic method and composition for maintaining a healthy vaginal microbiome |
US11833177B2 (en) | 2013-12-20 | 2023-12-05 | Seed Health, Inc. | Probiotic to enhance an individual's skin microbiome |
US11672835B2 (en) | 2013-12-20 | 2023-06-13 | Seed Health, Inc. | Method for treating individuals having cancer and who are receiving cancer immunotherapy |
US11213552B2 (en) | 2015-11-30 | 2022-01-04 | Joseph E. Kovarik | Method for treating an individual suffering from a chronic infectious disease and cancer |
US11529379B2 (en) | 2013-12-20 | 2022-12-20 | Seed Health, Inc. | Method and system for reducing the likelihood of developing colorectal cancer in an individual human being |
US11980643B2 (en) | 2013-12-20 | 2024-05-14 | Seed Health, Inc. | Method and system to modify an individual's gut-brain axis to provide neurocognitive protection |
CN106133141B (zh) | 2014-01-08 | 2021-08-20 | 哈佛学院董事及会员团体 | Rna引导的基因驱动 |
CA2937429A1 (en) * | 2014-01-21 | 2015-07-30 | Caixia Gao | Modified plants |
EP3102673B1 (en) | 2014-02-03 | 2020-04-15 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for treatment of a beta thalessemia |
US10287590B2 (en) | 2014-02-12 | 2019-05-14 | Dna2.0, Inc. | Methods for generating libraries with co-varying regions of polynuleotides for genome modification |
CA2939621C (en) | 2014-02-13 | 2019-10-15 | Takara Bio Usa, Inc. | Methods of depleting a target molecule from an initial collection of nucleic acids, and compositions and kits for practicing the same |
KR20150096064A (ko) * | 2014-02-14 | 2015-08-24 | 서울대학교산학협력단 | Mdck ⅱ 세포의 크로모좀에서 aavs1 위치를 인식하고 이곳에 외래 유전자를 도입하여 안정하게 발현시키는 방법 |
EP3115457B1 (en) * | 2014-03-05 | 2019-10-02 | National University Corporation Kobe University | Genomic sequence modification method for specifically converting nucleic acid bases of targeted dna sequence, and molecular complex for use in same |
ES2962509T3 (es) * | 2014-04-14 | 2024-03-19 | Maxcyte Inc | Métodos y composiciones para modificar ADN genómico |
CA2946987A1 (en) * | 2014-04-28 | 2015-11-05 | Joseph F. Petolino | Haploid maize transformation |
GB201407852D0 (en) | 2014-05-02 | 2014-06-18 | Iontas Ltd | Preparation of libraries od protein variants expressed in eukaryotic cells and use for selecting binding molecules |
WO2015175642A2 (en) | 2014-05-13 | 2015-11-19 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for prevention or treatment of a disease |
KR102374379B1 (ko) | 2014-06-06 | 2022-03-17 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 표적화된 좌를 변형시키는 방법 및 조성물 |
SG10201911411YA (en) | 2014-06-26 | 2020-02-27 | Regeneron Pharma | Methods and compositions for targeted genetic modifications and methods of use |
WO2016016842A1 (en) * | 2014-07-30 | 2016-02-04 | Zumutor Biologics, Inc. | Non-fucosylated protein and methods thereof |
US10077453B2 (en) | 2014-07-30 | 2018-09-18 | President And Fellows Of Harvard College | CAS9 proteins including ligand-dependent inteins |
CN107429241A (zh) | 2014-08-14 | 2017-12-01 | 北京百奥赛图基因生物技术有限公司 | Dna敲入系统 |
RU2017112324A (ru) * | 2014-09-12 | 2018-10-15 | Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. | Создание сайтов сайт-специфической интеграции для сложных локусов признаков в кукурузе и сое, а также способы применения |
PL3194570T3 (pl) * | 2014-09-16 | 2021-12-20 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Sposoby i kompozycje do inżynierii genomowej w której pośredniczy nukleaza i korekty hematopoetycznych komórek macierzystych |
WO2016061374A1 (en) | 2014-10-15 | 2016-04-21 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for generating or maintaining pluripotent cells |
US9816110B2 (en) | 2014-10-23 | 2017-11-14 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | CHO integration sites and uses thereof |
DK3221457T3 (da) | 2014-11-21 | 2019-06-03 | Regeneron Pharma | Fremgangsmåder og sammensætninger til targeteret genomisk modifikation ved anvendelse af parrede førings-rnaer |
EP3230460B2 (en) | 2014-12-12 | 2023-11-29 | James Zhu | Methods and compositions for selectively eliminating cells of interest |
US20190054117A1 (en) | 2014-12-19 | 2019-02-21 | Novartis Ag | Dimerization switches and uses thereof |
EP3232774B1 (en) | 2014-12-19 | 2019-10-09 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for targeted genetic modification through single-step multiple targeting |
CN107109427B (zh) | 2014-12-23 | 2021-06-18 | 先正达参股股份有限公司 | 用于鉴定和富集包含位点特异性基因组修饰的细胞的方法和组合物 |
WO2016118726A2 (en) | 2015-01-21 | 2016-07-28 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for identification of highly specific nucleases |
CA2973903C (en) | 2015-01-27 | 2024-03-12 | Institute Of Genetics And Developmental Biology, Chinese Academy Of Sciences | A method for site-directed modification of whole plant through gene transient expression |
WO2016149547A1 (en) * | 2015-03-17 | 2016-09-22 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Detection of genome editing |
JP6885876B2 (ja) * | 2015-04-13 | 2021-06-16 | マックスサイト インコーポレーティッド | ゲノムdnaを改変するための方法および組成物 |
US10738290B2 (en) | 2015-04-21 | 2020-08-11 | Novartis Ag | RNA-guided gene editing system and uses thereof |
US10179918B2 (en) | 2015-05-07 | 2019-01-15 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for increasing transgene activity |
JP6873917B2 (ja) | 2015-05-12 | 2021-05-19 | サンガモ セラピューティクス, インコーポレイテッド | ヌクレアーゼ介在性遺伝子発現調節 |
EP3294774B1 (en) * | 2015-05-13 | 2024-08-28 | Zumutor Biologics, Inc. | Afucosylated protein, cell expressing said protein and associated methods |
US11535871B2 (en) * | 2015-05-14 | 2022-12-27 | University Of Southern California | Optimized gene editing utilizing a recombinant endonuclease system |
EP3095870A1 (en) | 2015-05-19 | 2016-11-23 | Kws Saat Se | Methods for the in planta transformation of plants and manufacturing processes and products based and obtainable therefrom |
WO2016196887A1 (en) | 2015-06-03 | 2016-12-08 | Board Of Regents Of The University Of Nebraska | Dna editing using single-stranded dna |
EP3322297A4 (en) | 2015-07-13 | 2019-04-17 | Sangamo Therapeutics, Inc. | RELEASE METHOD AND COMPOSITIONS FOR NUCLEASE-DERIVED GENOMINE ENGINEERING |
PL3331355T3 (pl) | 2015-08-06 | 2024-08-05 | The Curators Of The University Of Missouri | Zwierzęta z rodzaju świń odporne na wirusa zespołu rozrodczo- oddechowego świń (prrsv) i komórki mające zmodyfikowane geny cd163 |
WO2017028768A1 (en) * | 2015-08-14 | 2017-02-23 | Institute Of Genetics And Developmental Biology, Chinese Academy Of Sciences | Method for obtaining glyphosate-resistant rice by site-directed nucleotide substitution |
US9926546B2 (en) | 2015-08-28 | 2018-03-27 | The General Hospital Corporation | Engineered CRISPR-Cas9 nucleases |
US9512446B1 (en) | 2015-08-28 | 2016-12-06 | The General Hospital Corporation | Engineered CRISPR-Cas9 nucleases |
DK3348638T3 (da) * | 2015-09-09 | 2023-02-13 | Univ Kobe Nat Univ Corp | Fremgangsmåde til at konvertere genomsekvens fra gram-positiv bakterie ved specifikt at konvertere nukleinsyrebase i tilsigtet dna-sekvens, og molekylkompleks anvendt dertil |
AU2016342380B2 (en) | 2015-10-23 | 2022-04-07 | President And Fellows Of Harvard College | Nucleobase editors and uses thereof |
US11905521B2 (en) | 2015-11-17 | 2024-02-20 | The Chinese University Of Hong Kong | Methods and systems for targeted gene manipulation |
RU2634395C1 (ru) * | 2015-12-01 | 2017-10-26 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Балтийский Федеральный Университет имени Иммануила Канта" (БФУ им. И. Канта) | Генетическая конструкция на основе системы редактирования генома crispr/cas9, кодирующая нуклеазу cas9, специфически импортируемую в митохондрии клеток человека |
US11499158B2 (en) | 2016-05-13 | 2022-11-15 | Kaneka Corporation | Method for modifying plant |
EP3456181A4 (en) | 2016-05-13 | 2019-12-25 | Kaneka Corporation | METHOD FOR PRODUCING A TRANSFORMED PLANT |
WO2017195906A1 (ja) | 2016-05-13 | 2017-11-16 | 株式会社カネカ | 植物のゲノム編集方法 |
LT3604527T (lt) | 2016-06-02 | 2021-06-25 | Sigma-Aldrich Co., Llc | Programuojamų, dnr surišančių baltymų panaudojimas tiksliniam genomo modifikavimui pagerinti |
AU2017306676B2 (en) | 2016-08-03 | 2024-02-22 | President And Fellows Of Harvard College | Adenosine nucleobase editors and uses thereof |
CN109804066A (zh) | 2016-08-09 | 2019-05-24 | 哈佛大学的校长及成员们 | 可编程cas9-重组酶融合蛋白及其用途 |
US11542509B2 (en) | 2016-08-24 | 2023-01-03 | President And Fellows Of Harvard College | Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing |
KR20220145913A (ko) | 2016-08-24 | 2022-10-31 | 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 | 가공된 표적 특이적 뉴클레아제 |
KR102572759B1 (ko) | 2016-08-24 | 2023-08-29 | 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 | 조작된 뉴클레아제를 이용하는 유전자 발현의 조절 |
EP3509645A4 (en) * | 2016-09-07 | 2020-06-17 | Sangamo Therapeutics, Inc. | MODULATION OF LIVER GENES |
KR20240007715A (ko) | 2016-10-14 | 2024-01-16 | 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 | 핵염기 에디터의 aav 전달 |
CN109906030B (zh) | 2016-11-04 | 2022-03-18 | 安健基因公司 | 用于产生仅重链抗体的经基因修饰的非人动物和方法 |
CA3043019A1 (en) * | 2016-11-21 | 2018-05-24 | Dow Agrosciences Llc | Site specific integration of a transgene using intra-genomic recombination via a non-homologous end joining repair pathway |
CA3046929A1 (en) | 2016-12-14 | 2018-06-21 | Dow Agrosciences Llc | Reconstruction of site specific nuclease binding sites |
US10745677B2 (en) | 2016-12-23 | 2020-08-18 | President And Fellows Of Harvard College | Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection |
EP3562515A4 (en) | 2016-12-29 | 2020-11-18 | Applied StemCell, Inc. | GENE EDITING PROCESS USING A VIRUS |
US11859219B1 (en) | 2016-12-30 | 2024-01-02 | Flagship Pioneering Innovations V, Inc. | Methods of altering a target nucleotide sequence with an RNA-guided nuclease and a single guide RNA |
EP3573448A4 (en) | 2017-01-28 | 2020-09-02 | Inari Agriculture, Inc. | NEW PLANT CELLS, PLANTS AND SEEDS |
AU2018225180B2 (en) * | 2017-02-22 | 2024-09-12 | Io Biosciences, Inc. | Nucleic acid constructs comprising gene editing multi-sites and uses thereof |
US11898179B2 (en) | 2017-03-09 | 2024-02-13 | President And Fellows Of Harvard College | Suppression of pain by gene editing |
WO2018165629A1 (en) | 2017-03-10 | 2018-09-13 | President And Fellows Of Harvard College | Cytosine to guanine base editor |
SG11201908658TA (en) | 2017-03-23 | 2019-10-30 | Harvard College | Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable dna binding proteins |
WO2018209320A1 (en) | 2017-05-12 | 2018-11-15 | President And Fellows Of Harvard College | Aptazyme-embedded guide rnas for use with crispr-cas9 in genome editing and transcriptional activation |
EP3652312A1 (en) | 2017-07-14 | 2020-05-20 | Editas Medicine, Inc. | Systems and methods for targeted integration and genome editing and detection thereof using integrated priming sites |
JP2020534795A (ja) | 2017-07-28 | 2020-12-03 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | ファージによって支援される連続的進化(pace)を用いて塩基編集因子を進化させるための方法および組成物 |
CN107881160A (zh) | 2017-08-11 | 2018-04-06 | 百奥泰生物科技(广州)有限公司 | 一种由基因组被编辑的cho宿主细胞产生的具有独特糖谱的重组抗体及其制备方法 |
EP3676376A2 (en) | 2017-08-30 | 2020-07-08 | President and Fellows of Harvard College | High efficiency base editors comprising gam |
US11603536B2 (en) * | 2017-09-29 | 2023-03-14 | Inari Agriculture Technology, Inc. | Methods for efficient maize genome editing |
MA50613A (fr) | 2017-10-03 | 2020-08-12 | Editas Medicine Inc | Molécules de liaison spécifique à l'hpv |
CA3082251A1 (en) | 2017-10-16 | 2019-04-25 | The Broad Institute, Inc. | Uses of adenosine base editors |
US11851679B2 (en) | 2017-11-01 | 2023-12-26 | Juno Therapeutics, Inc. | Method of assessing activity of recombinant antigen receptors |
MX2020006072A (es) | 2017-12-11 | 2020-08-24 | Editas Medicine Inc | Métodos y composiciones relacionados con cpf1 para la edición genica. |
US11926835B1 (en) | 2018-01-29 | 2024-03-12 | Inari Agriculture Technology, Inc. | Methods for efficient tomato genome editing |
US11802288B1 (en) | 2018-01-29 | 2023-10-31 | Inari Agriculture Technology, Inc. | Methods for efficient soybean genome editing |
RU2020136054A (ru) | 2018-04-05 | 2022-05-06 | Джуно Терапьютикс, Инк. | Т-клетки, экспрессирующие рекомбинантный рецептор, соответствующие полинуклеотиды и способы |
JP2021520202A (ja) | 2018-04-05 | 2021-08-19 | ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド | 組換え受容体を発現する細胞の作製方法および関連組成物 |
WO2019204226A1 (en) * | 2018-04-16 | 2019-10-24 | University Of Massachusetts | Compositions and methods for improved gene editing |
US11866719B1 (en) | 2018-06-04 | 2024-01-09 | Inari Agriculture Technology, Inc. | Heterologous integration of regulatory elements to alter gene expression in wheat cells and wheat plants |
RU2706298C1 (ru) * | 2018-09-14 | 2019-11-15 | Закрытое Акционерное Общество "Биокад" | НУКЛЕАЗА PaCas9 |
GB2611929B (en) | 2018-10-16 | 2023-11-22 | Blueallele Corp | Methods for targeted insertion of DNA in genes |
WO2020123871A1 (en) * | 2018-12-12 | 2020-06-18 | The Regents Of The University Of California | Compositions and methods for modifying a target nucleic acid |
CN114729365A (zh) | 2019-03-19 | 2022-07-08 | 布罗德研究所股份有限公司 | 用于编辑核苷酸序列的方法和组合物 |
EP3945800A1 (en) | 2019-04-03 | 2022-02-09 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for insertion of antibody coding sequences into a safe harbor locus |
KR20220016474A (ko) | 2019-05-01 | 2022-02-09 | 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 | 변형된 cd247 유전자 자리로부터 키메라 수용체를 발현하는 세포, 관련 폴리뉴클레오타이드 및 방법 |
BR112021021075A2 (pt) | 2019-05-01 | 2021-12-14 | Editas Medicine Inc | Células que expressam um receptor recombinante de um locus de tgfbr2 modificado, polinucleotídeos relacionados e métodos |
EP3987024A4 (en) | 2019-06-20 | 2023-11-01 | University Of Massachusetts | COMPOSITIONS AND METHODS FOR IMPROVED GENE EDITING |
EP4146804A1 (en) | 2020-05-08 | 2023-03-15 | The Broad Institute Inc. | Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence |
JP2023531531A (ja) | 2020-06-26 | 2023-07-24 | ジュノ セラピューティクス ゲーエムベーハー | 組換え受容体を条件付きで発現する操作されたt細胞、関連ポリヌクレオチド、および方法 |
KR102687692B1 (ko) * | 2020-07-08 | 2024-07-24 | 경상국립대학교산학협력단 | 미세상동성 기반 말단 결합을 통한 유전자 교정에 이용되는 공여자 핵산 및 이의 용도 |
WO2022098787A1 (en) | 2020-11-04 | 2022-05-12 | Juno Therapeutics, Inc. | Cells expressing a chimeric receptor from a modified invariant cd3 immunoglobulin superfamily chain locus and related polynucleotides and methods |
MX2023005665A (es) | 2020-11-16 | 2023-08-01 | Pig Improvement Co Uk Ltd | Animales resistentes a la influenza a que tienen genes de anp32 editados. |
EP4314280A1 (en) | 2021-03-22 | 2024-02-07 | Juno Therapeutics, Inc. | Method to assess potency of viral vector particles |
AU2022369384A1 (en) | 2021-10-19 | 2024-05-02 | Limagrain Europe | Targeted gene integration in plants |
CN114134216A (zh) * | 2021-11-03 | 2022-03-04 | 深圳大学 | 一种基于pcr快速鉴定msc基因修饰的方法与应用 |
WO2023081900A1 (en) | 2021-11-08 | 2023-05-11 | Juno Therapeutics, Inc. | Engineered t cells expressing a recombinant t cell receptor (tcr) and related systems and methods |
WO2024092126A1 (en) | 2022-10-27 | 2024-05-02 | Cargo Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for improved immunotherapies |
WO2024168276A2 (en) | 2023-02-09 | 2024-08-15 | Cargo Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for immunotherapies |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011072246A2 (en) * | 2009-12-10 | 2011-06-16 | Regents Of The University Of Minnesota | Tal effector-mediated dna modification |
US20110207221A1 (en) * | 2010-02-09 | 2011-08-25 | Sangamo Biosciences, Inc. | Targeted genomic modification with partially single-stranded donor molecules |
Family Cites Families (101)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4693977A (en) | 1982-08-23 | 1987-09-15 | Queen's University At Kingston | Enzyme immobilization for producing cephalosporin antibiotics |
US4536475A (en) | 1982-10-05 | 1985-08-20 | Phytogen | Plant vector |
NL8300698A (nl) | 1983-02-24 | 1984-09-17 | Univ Leiden | Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; agrobacterium tumefaciens bacterien en werkwijze voor het produceren daarvan; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten. |
NZ207765A (en) | 1983-04-15 | 1987-03-06 | Lubrizol Genetics Inc | Plant expression of transferred dna(t-dna)from plasmids associated with agrobacterium sp |
US4886937A (en) | 1985-05-20 | 1989-12-12 | North Carolina State University | Method for transforming pine |
EP0270496B1 (de) | 1986-12-05 | 1993-03-17 | Ciba-Geigy Ag | Verbessertes Verfahren zur Transformation von pflanzlichen Protoplasten |
US5015580A (en) | 1987-07-29 | 1991-05-14 | Agracetus | Particle-mediated transformation of soybean plants and lines |
US5416011A (en) | 1988-07-22 | 1995-05-16 | Monsanto Company | Method for soybean transformation and regeneration |
US5302523A (en) | 1989-06-21 | 1994-04-12 | Zeneca Limited | Transformation of plant cells |
US5501967A (en) | 1989-07-26 | 1996-03-26 | Mogen International, N.V./Rijksuniversiteit Te Leiden | Process for the site-directed integration of DNA into the genome of plants |
US7705215B1 (en) | 1990-04-17 | 2010-04-27 | Dekalb Genetics Corporation | Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof |
US5550318A (en) | 1990-04-17 | 1996-08-27 | Dekalb Genetics Corporation | Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof |
WO1991010725A1 (en) | 1990-01-22 | 1991-07-25 | Dekalb Plant Genetics | Fertile transgenic corn plants |
US5484956A (en) | 1990-01-22 | 1996-01-16 | Dekalb Genetics Corporation | Fertile transgenic Zea mays plant comprising heterologous DNA encoding Bacillus thuringiensis endotoxin |
US6403865B1 (en) | 1990-08-24 | 2002-06-11 | Syngenta Investment Corp. | Method of producing transgenic maize using direct transformation of commercially important genotypes |
US5384253A (en) | 1990-12-28 | 1995-01-24 | Dekalb Genetics Corporation | Genetic transformation of maize cells by electroporation of cells pretreated with pectin degrading enzymes |
US5420032A (en) | 1991-12-23 | 1995-05-30 | Universitge Laval | Homing endonuclease which originates from chlamydomonas eugametos and recognizes and cleaves a 15, 17 or 19 degenerate double stranded nucleotide sequence |
US5487994A (en) | 1992-04-03 | 1996-01-30 | The Johns Hopkins University | Insertion and deletion mutants of FokI restriction endonuclease |
US5436150A (en) | 1992-04-03 | 1995-07-25 | The Johns Hopkins University | Functional domains in flavobacterium okeanokoities (foki) restriction endonuclease |
US5356802A (en) | 1992-04-03 | 1994-10-18 | The Johns Hopkins University | Functional domains in flavobacterium okeanokoites (FokI) restriction endonuclease |
US5792632A (en) | 1992-05-05 | 1998-08-11 | Institut Pasteur | Nucleotide sequence encoding the enzyme I-SceI and the uses thereof |
US5591616A (en) | 1992-07-07 | 1997-01-07 | Japan Tobacco, Inc. | Method for transforming monocotyledons |
JP2952041B2 (ja) | 1992-07-27 | 1999-09-20 | パイオニア ハイ−ブレッド インターナショナル,インコーポレイテッド | 培養ダイズ細胞のagrobacterium媒介形質転換の改良法 |
WO1995019431A1 (en) | 1994-01-18 | 1995-07-20 | The Scripps Research Institute | Zinc finger protein derivatives and methods therefor |
US6140466A (en) | 1994-01-18 | 2000-10-31 | The Scripps Research Institute | Zinc finger protein derivatives and methods therefor |
US6242568B1 (en) | 1994-01-18 | 2001-06-05 | The Scripps Research Institute | Zinc finger protein derivatives and methods therefor |
EP2022856B1 (en) | 1994-08-20 | 2011-09-14 | Gendaq Limited | Improvements in or relating to binding proteins for recognition of DNA |
GB9824544D0 (en) | 1998-11-09 | 1999-01-06 | Medical Res Council | Screening system |
US5789538A (en) | 1995-02-03 | 1998-08-04 | Massachusetts Institute Of Technology | Zinc finger proteins with high affinity new DNA binding specificities |
US5693512A (en) | 1996-03-01 | 1997-12-02 | The Ohio State Research Foundation | Method for transforming plant tissue by sonication |
US5925523A (en) | 1996-08-23 | 1999-07-20 | President & Fellows Of Harvard College | Intraction trap assay, reagents and uses thereof |
US5981840A (en) | 1997-01-24 | 1999-11-09 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods for agrobacterium-mediated transformation |
GB2338237B (en) | 1997-02-18 | 2001-02-28 | Actinova Ltd | In vitro peptide or protein expression library |
GB9703369D0 (en) | 1997-02-18 | 1997-04-09 | Lindqvist Bjorn H | Process |
US5830698A (en) * | 1997-03-14 | 1998-11-03 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Method for integrating genes at specific sites in mammalian cells via homologous recombination and vectors for accomplishing the same |
AU737155B2 (en) | 1997-03-14 | 2001-08-09 | Biogen Idec Inc. | Method for integrating genes at specific sites in mammalian cells via homologous recombination and vectors for accomplishing the same |
GB9710809D0 (en) | 1997-05-23 | 1997-07-23 | Medical Res Council | Nucleic acid binding proteins |
GB9710807D0 (en) | 1997-05-23 | 1997-07-23 | Medical Res Council | Nucleic acid binding proteins |
US6410248B1 (en) | 1998-01-30 | 2002-06-25 | Massachusetts Institute Of Technology | General strategy for selecting high-affinity zinc finger proteins for diverse DNA target sites |
AU746454B2 (en) | 1998-03-02 | 2002-05-02 | Massachusetts Institute Of Technology | Poly zinc finger proteins with improved linkers |
US6140081A (en) | 1998-10-16 | 2000-10-31 | The Scripps Research Institute | Zinc finger binding domains for GNN |
JP4463992B2 (ja) | 1998-12-18 | 2010-05-19 | ダウ グローバル テクノロジーズ インコーポレイティド | 防湿性の改良されたポリマーの製造に有用な水性ポリウレタン分散液 |
US7070934B2 (en) | 1999-01-12 | 2006-07-04 | Sangamo Biosciences, Inc. | Ligand-controlled regulation of endogenous gene expression |
US6534261B1 (en) | 1999-01-12 | 2003-03-18 | Sangamo Biosciences, Inc. | Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins |
US7013219B2 (en) | 1999-01-12 | 2006-03-14 | Sangamo Biosciences, Inc. | Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins |
US6453242B1 (en) | 1999-01-12 | 2002-09-17 | Sangamo Biosciences, Inc. | Selection of sites for targeting by zinc finger proteins and methods of designing zinc finger proteins to bind to preselected sites |
US6503717B2 (en) | 1999-12-06 | 2003-01-07 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods of using randomized libraries of zinc finger proteins for the identification of gene function |
US6599692B1 (en) | 1999-09-14 | 2003-07-29 | Sangamo Bioscience, Inc. | Functional genomics using zinc finger proteins |
JP2002534129A (ja) | 1999-01-14 | 2002-10-15 | モンサント テクノロジー エルエルシー | ダイズ形質転換方法 |
US6794136B1 (en) | 2000-11-20 | 2004-09-21 | Sangamo Biosciences, Inc. | Iterative optimization in the design of binding proteins |
US7030215B2 (en) | 1999-03-24 | 2006-04-18 | Sangamo Biosciences, Inc. | Position dependent recognition of GNN nucleotide triplets by zinc fingers |
DE60143192D1 (de) | 2000-02-08 | 2010-11-18 | Sangamo Biosciences Inc | Zellen zur entdeckung von medikamenten |
US20020061512A1 (en) | 2000-02-18 | 2002-05-23 | Kim Jin-Soo | Zinc finger domains and methods of identifying same |
US20030044787A1 (en) | 2000-05-16 | 2003-03-06 | Joung J. Keith | Methods and compositions for interaction trap assays |
JP2002060786A (ja) | 2000-08-23 | 2002-02-26 | Kao Corp | 硬質表面用殺菌防汚剤 |
US7067317B2 (en) | 2000-12-07 | 2006-06-27 | Sangamo Biosciences, Inc. | Regulation of angiogenesis with zinc finger proteins |
GB0108491D0 (en) | 2001-04-04 | 2001-05-23 | Gendaq Ltd | Engineering zinc fingers |
JP2005500061A (ja) | 2001-08-20 | 2005-01-06 | ザ スクリップス リサーチ インスティテュート | Cnnについての亜鉛フィンガー結合ドメイン |
US7262054B2 (en) | 2002-01-22 | 2007-08-28 | Sangamo Biosciences, Inc. | Zinc finger proteins for DNA binding and gene regulation in plants |
AU2003251286B2 (en) | 2002-01-23 | 2007-08-16 | The University Of Utah Research Foundation | Targeted chromosomal mutagenesis using zinc finger nucleases |
EP1504092B2 (en) | 2002-03-21 | 2014-06-25 | Sangamo BioSciences, Inc. | Methods and compositions for using zinc finger endonucleases to enhance homologous recombination |
US7179902B2 (en) | 2002-06-27 | 2007-02-20 | Dow Agrosciences Llc | Use of regulatory sequences in transgenic plants |
US7361635B2 (en) | 2002-08-29 | 2008-04-22 | Sangamo Biosciences, Inc. | Simultaneous modulation of multiple genes |
JP2006502748A (ja) | 2002-09-05 | 2006-01-26 | カリフォルニア インスティテュート オブ テクノロジー | 遺伝子ターゲッティングを誘発するキメラヌクレアーゼの使用方法 |
US7888121B2 (en) | 2003-08-08 | 2011-02-15 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for targeted cleavage and recombination |
US8409861B2 (en) | 2003-08-08 | 2013-04-02 | Sangamo Biosciences, Inc. | Targeted deletion of cellular DNA sequences |
EP1651660B1 (en) * | 2003-08-08 | 2018-01-24 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for targeted cleavage and recombination |
US7972854B2 (en) | 2004-02-05 | 2011-07-05 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for targeted cleavage and recombination |
JP2008506359A (ja) | 2004-04-08 | 2008-03-06 | サンガモ バイオサイエンシズ インコーポレイテッド | ジンクフィンガータンパク質による神経因性疼痛の処置 |
ATE418346T1 (de) | 2004-04-08 | 2009-01-15 | Sangamo Biosciences Inc | Zusammensetzungen zur behandlung von neuropathischen und neurodegenerativen erkrankungen |
EP2319932B2 (en) | 2004-04-30 | 2016-10-19 | Dow AgroSciences LLC | Novel herbicide resistance gene |
AR050866A1 (es) | 2004-09-09 | 2006-11-29 | Dow Agrosciences Llc | Genes de inositol polifosfato 2-quinasa y usos de los mismos |
CA2579677A1 (en) | 2004-09-16 | 2006-03-30 | Sangamo Biosciences, Inc. | Compositions and methods for protein production |
CA2607104A1 (en) | 2005-05-05 | 2006-11-16 | The Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona | Sequence enabled reassembly (seer) - a novel method for visualizing specific dna sequences |
US7580351B2 (en) | 2005-07-12 | 2009-08-25 | Cisco Technology, Inc | Dynamically controlling the rate and internal priority of packets destined for the control plane of a routing device |
SG10201508995QA (en) | 2005-07-26 | 2015-11-27 | Sangamo Biosciences Inc | Targeted integration and expression of exogenous nucleic acid sequences |
JP4670539B2 (ja) | 2005-08-08 | 2011-04-13 | ブラザー工業株式会社 | 画像読取装置 |
EP2628794B1 (en) | 2005-10-18 | 2016-05-04 | Precision Biosciences | Rationally designed meganucleases with altered sequence specificity and DNA-binding affinity |
DE602007005634D1 (de) | 2006-05-25 | 2010-05-12 | Sangamo Biosciences Inc | Variante foki-spaltungshälften-domänen |
ATE536371T1 (de) | 2006-05-25 | 2011-12-15 | Sangamo Biosciences Inc | Verfahren und zusammensetzungen zur gendeaktivierung |
HUE029238T2 (en) * | 2006-12-14 | 2017-02-28 | Dow Agrosciences Llc | Optimized non-canonical zinc finger proteins |
AU2008244473B2 (en) | 2007-04-26 | 2013-06-20 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Targeted integration into the PPP1R12C locus |
WO2008148223A1 (en) | 2007-06-07 | 2008-12-11 | Agriculture And Agri-Food Canada | Nanocarrier based plant transfection and transduction |
KR101510778B1 (ko) | 2007-07-12 | 2015-04-10 | 상가모 바이오사이언스 인코포레이티드 | 알파 1,6 당전이효소(fut8) 유전자 발현을 비활성화시키기 위한 방법 및 조성물 |
EP2188384B1 (en) | 2007-09-27 | 2015-07-15 | Sangamo BioSciences, Inc. | Rapid in vivo identification of biologically active nucleases |
EP2195438B1 (en) | 2007-10-05 | 2013-01-23 | Dow AgroSciences LLC | Methods for transferring molecular substances into plant cells |
AU2008317354B2 (en) | 2007-10-25 | 2014-04-10 | Ospedale San Raffaele S.R.L. | Methods and compositions for targeted integration |
AU2009238629C1 (en) | 2008-04-14 | 2015-04-30 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Linear donor constructs for targeted integration |
WO2010021692A1 (en) | 2008-08-22 | 2010-02-25 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for targeted single-stranded cleavage and targeted integration |
CA2741119C (en) | 2008-10-29 | 2019-02-12 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for inactivating glutamine synthetase gene expression |
JP5681114B2 (ja) | 2008-12-04 | 2015-03-04 | サンガモ バイオサイエンシーズ, インコーポレイテッド | 亜鉛フィンガーヌクレアーゼを使用したラットのゲノム編集 |
WO2010077319A1 (en) | 2008-12-17 | 2010-07-08 | Dow Agrosciences Llc | Targeted integration into the zp15 locus |
EP2206723A1 (en) | 2009-01-12 | 2010-07-14 | Bonas, Ulla | Modular DNA-binding domains |
US20110239315A1 (en) | 2009-01-12 | 2011-09-29 | Ulla Bonas | Modular dna-binding domains and methods of use |
JP2012529287A (ja) | 2009-06-11 | 2012-11-22 | トゥールゲン インコーポレイション | 部位−特異的ヌクレアーゼを用いた標的ゲノムの再配列 |
EP2456877A4 (en) | 2009-07-24 | 2012-05-30 | Sigma Aldrich Co Llc | METHOD OF GENOMIC PROCESSING |
NZ598457A (en) | 2009-08-03 | 2014-06-27 | Recombinetics Inc | Methods and compositions for targeted gene modification |
JP5902631B2 (ja) | 2010-01-22 | 2016-04-13 | ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー | 標的化ゲノム変更 |
US8802921B2 (en) | 2010-01-22 | 2014-08-12 | Dow Agrosciences, Llc. | Engineered landing pads for gene targeting in plants |
EP2534173B1 (en) | 2010-02-08 | 2019-09-11 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Engineered cleavage half-domains |
EP3156062A1 (en) | 2010-05-17 | 2017-04-19 | Sangamo BioSciences, Inc. | Novel dna-binding proteins and uses thereof |
-
2013
- 2013-05-07 AU AU2013259647A patent/AU2013259647B2/en active Active
- 2013-05-07 BR BR112014027813A patent/BR112014027813A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2013-05-07 KR KR1020147034025A patent/KR102116153B1/ko active IP Right Grant
- 2013-05-07 RU RU2014149120A patent/RU2650819C2/ru active
- 2013-05-07 JP JP2015511632A patent/JP6559063B2/ja active Active
- 2013-05-07 CA CA2871524A patent/CA2871524C/en active Active
- 2013-05-07 CN CN201380036204.4A patent/CN104471067B/zh active Active
- 2013-05-07 WO PCT/US2013/039979 patent/WO2013169802A1/en active Application Filing
- 2013-05-07 EP EP13788413.6A patent/EP2847338B1/en active Active
- 2013-05-07 US US13/889,162 patent/US10174331B2/en active Active
-
2014
- 2014-10-30 IL IL235421A patent/IL235421B/en active IP Right Grant
-
2015
- 2015-09-04 HK HK15108628.6A patent/HK1208051A1/xx unknown
-
2019
- 2019-02-18 JP JP2019026476A patent/JP2019088321A/ja active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011072246A2 (en) * | 2009-12-10 | 2011-06-16 | Regents Of The University Of Minnesota | Tal effector-mediated dna modification |
US20110207221A1 (en) * | 2010-02-09 | 2011-08-25 | Sangamo Biosciences, Inc. | Targeted genomic modification with partially single-stranded donor molecules |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 35, no. 15, JPN6017003710, 2007, pages 5192 - 5202, ISSN: 0003493068 * |
PLANT BIOTECHNOLOGY JOURNAL, vol. 10, JPN6017003717, 3 January 2012 (2012-01-03), pages 373 - 389, ISSN: 0003493071 * |
PLANT PHYSIOLOGY, vol. 133, no. 3, JPN6017003711, 2003, pages 1011 - 1023, ISSN: 0003493069 * |
PLANT PHYSIOLOGY, vol. 133, no. 3, JPN6017003713, 2003, pages 956 - 965, ISSN: 0003493070 * |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2015527081A (ja) * | 2012-09-07 | 2015-09-17 | ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー | Fad3性能座および標的化切断を誘導可能である対応する標的部位特異的結合タンパク質 |
JP2016500268A (ja) * | 2012-12-13 | 2016-01-12 | ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー | トウモロコシにおける特定の遺伝子座に対する精密な遺伝子標的化 |
JP2021508251A (ja) * | 2017-11-06 | 2021-03-04 | 深▲セン▼市三▲啓▼生物技▲術▼有限公司Shenzhen Cell Inspire Biotechnology Co., Ltd. | アルツハイマー病をモデル化する新しいヒト誘発多能性幹細胞株およびその使用 |
US11834648B2 (en) | 2017-11-06 | 2023-12-05 | Shenzhen Cell Inspire Biotechnology Co., Ltd. | Human induced pluripotent stem cell lines for modeling Alzheimer's disease and usage thereof |
WO2020149395A1 (ja) * | 2019-01-18 | 2020-07-23 | 国立大学法人大阪大学 | 栄養障害型表皮水疱症治療薬 |
JP2020202832A (ja) * | 2020-07-10 | 2020-12-24 | ツムトー バイオロジクス、インコーポレイテッド | 非フコシル化タンパク質および方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2013259647B2 (en) | 2018-11-08 |
EP2847338A1 (en) | 2015-03-18 |
KR102116153B1 (ko) | 2020-05-27 |
IL235421B (en) | 2020-10-29 |
JP2019088321A (ja) | 2019-06-13 |
US10174331B2 (en) | 2019-01-08 |
CN104471067B (zh) | 2020-08-14 |
US20130326645A1 (en) | 2013-12-05 |
BR112014027813A2 (pt) | 2017-08-08 |
HK1208051A1 (en) | 2016-02-19 |
RU2014149120A (ru) | 2016-06-27 |
EP2847338B1 (en) | 2018-09-19 |
WO2013169802A1 (en) | 2013-11-14 |
EP2847338A4 (en) | 2015-12-09 |
KR20150006469A (ko) | 2015-01-16 |
IL235421A0 (en) | 2014-12-31 |
AU2013259647A1 (en) | 2014-11-13 |
CN104471067A (zh) | 2015-03-25 |
CA2871524C (en) | 2021-07-27 |
JP6559063B2 (ja) | 2019-08-14 |
RU2650819C2 (ru) | 2018-04-17 |
CA2871524A1 (en) | 2013-11-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6559063B2 (ja) | 導入遺伝子のヌクレアーゼ媒介標的化組み込みのための方法および組成物 | |
JP6886433B2 (ja) | 植物のゲノム内に外因性配列を組み込むための方法および組成物 | |
US11198882B2 (en) | Optimal maize loci | |
JP6081963B2 (ja) | 標的組込みのための線形ドナーコンストラクト | |
RU2663354C2 (ru) | Композиции и способы для модификации заданной последовательности нуклеиновой кислоты-мишени | |
JP6491113B2 (ja) | ヌクレアーゼ媒介性遺伝子破壊を増強するための方法および組成物 | |
CA2910427C (en) | Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering | |
JP5902631B2 (ja) | 標的化ゲノム変更 | |
TW202039847A (zh) | 可用於基因編輯之多胜肽及使用方法 | |
BR102013032200A2 (pt) | direcionamento preciso de um gene para um locus específico em milho | |
EP4242330A2 (en) | Generating northern leaf blight resistant maize | |
EA041676B1 (ru) | Создание маиса, устойчивого к северной пятнистости листьев |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160324 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20160324 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20170206 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170508 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20171018 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180207 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20180309 |
|
A912 | Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912 Effective date: 20180518 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190218 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20190716 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6559063 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |