JP5681114B2 - 亜鉛フィンガーヌクレアーゼを使用したラットのゲノム編集 - Google Patents

Description

本開示は、体細胞および遺伝性遺伝子破壊、ゲノム変化、ラット遺伝子の特定の位置におけるランダム変位を持つ対立遺伝子の生成、および相同指向修復の誘導を含む、ラットのゲノム工学の分野に存する。

ラット（ドブネズミ）は、高血圧、心臓血管生理学、糖尿病、代謝障害、行動学的研究、および毒性試験の分野において幅広く使用される動物モデルである。Ｍｉｃｈａｌｋｉｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．（２００７） Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｐｈｙｓ．Ｓｏｃｉｅｔｙ ２９３：Ｈ８８１−Ｈ８９４。これらのモデルシステムの可用性は、ラットゲノム科学およびラットの配列において進歩し、ヒトおよびマウスゲノムは、複雑な病気の遺伝的根拠の発見のための近交系ラットモデルの使用を大きく加速させ、治療薬の発見のために動物モデルを提供している。

しかしながら、ラットゲノムについての情報における進歩は、ゲノム修飾技術における、匹敵する進歩を伴っていない。マウスとは異なり、遺伝子標的のためのラット胚幹細胞クローンは、容易に産生されない。前核注入はまた、困難であることが証明されており、トランスジェニックラットの生成において低い成功率を有する。Ｍｉｃｈａｌｋｉｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．（２００７） Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｐｈｙｓ．Ｓｏｃｉｅｔｙ ２９３：Ｈ８８１−Ｈ８９４は、高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）レポーター遺伝子を発現するレンチウイルスコンストラクトを使用するトランスジェニックラットの生成を報告しており、そこでは、ｅＧＦＰトランス遺伝子が、ゲノム内のランダム部位において組み込まれた、１〜４のコピーにおいて存在することが見出された。

目標とした方法で、ラットのゲノムを修飾する方法に対する必要性が依然として存在する。ゲノム遺伝子座の正確に標的とした部位特異性開裂は、有効な補完および／または従来の相同組換えの代替を提供する。二本鎖切断（ＤＳＢ）の作製は、１０００倍未満の標的遺伝子座における相同組換えの頻度を増大する。簡潔に述べると、非相同末端連結（ＮＨＥＪ）による、部位特異性ＤＳＢの不正確な修復はまた、遺伝子破壊をもたらす可能性がある。２つのそのようなＤＳＢの作製は、任意に大きい領域の欠失をもたらす。亜鉛フィンガータンパク質重視のモジュラーＤＮＡ認識は、部位特異性マルチフィンガＤＮＡ結合タンパク質の合理的設計を可能にする。ＩＩ型制限酵素ＦｏｋＩから部位特異性亜鉛フィンガータンパク質へのヌクレアーゼドメインの融合は、部位特異性ヌクレアーゼの作製を可能にする。例えば、米国特許第２００３０２３２４１０号、同第２００５０２０８４８９号、同第２００５００２６１５７号、同第２００５００６４４７４号、同第２００６０１８８９８７号、同第２００６００６３２３１号、同第２００７０１３４７９６号、同第２００８０１５１６４号、同第２００８０１３１９６２号、同第２００８０１５９９６号、ならびに国際公開第ＷＯ０７／０１４２７５号、およびＷＯ２００８／１３３９３８号を参照されたく、それらのすべては、亜鉛フィンガーヌクレアーゼの使用を説明し、すべての目的のために、参照することによってその全体が組み込まれる。

１つもしくは複数のラット遺伝子において標的変異（挿入、欠失および／または置換変異）をもたらす、生殖細胞系列内へのこれらの標的変異の組み込みを含む、ラットの１つもしくは複数の遺伝子の開裂、非内因性核酸配列の標的導入、ラットの１つもしくは複数の遺伝子の部分的または完全な不活性化を含むが、それらに限定されない、ラットのゲノム編集のための組成物、相同指向修復および／またはラット遺伝子の新規対立形質をコードするランダム変異の生成を誘導する方法を本明細書に開示する。

一態様では、ラットゲノムの対象領域内の標的部位に結合する、亜鉛フィンガータンパク質（ＺＦＰ）を本明細書に説明し、ＺＦＰは、１つもしくは複数の改変亜鉛フィンガー結合ドメインを含む。一実施形態では、ＺＦＰは、ラットの対象領域の標的ゲノム領域を開裂する、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）であり、ＺＦＮは、１つもしくは複数の改変亜鉛フィンガー結合ドメインおよびヌクレアーゼ開裂ドメインまたは開裂ハーフドメインを含む。開裂ドメインおよび開裂ハーフドメインは、例えば、種々の制限エンドヌクレアーゼおよび／またはホーミングエンドヌクレアーゼから取得することができる。一実施形態では、開裂ハーフドメインは、ＩＩＳ型制限ヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）から得られる。ＺＦＮは、１つの特定のラット遺伝子配列を特異的に開裂し得る。代替的には、ＺＦＮは、２つもしくは複数の相同ラット遺伝子配列を開裂し得る。

ＺＦＮは、遺伝子のコード領域、または、例えば、リーダー配列、トレーラー配列またはイントロン等の遺伝子内の、またはそれに隣接する非コード配列内、または、コード領域の上流または下流のいずれかの非転写領域内のラット遺伝子に結合し得る、および／または開裂し得る。ある実施形態では、ＺＦＮは、標的ラット遺伝子のコード配列または制御配列に結合する、および／またはそれを開裂する。

別の態様では、本明細書に説明する１つもしくは複数の亜鉛フィンガーヌクレアーゼを含む組成物を本明細書に説明する。ある実施形態では、組成物は、薬学的に許容される賦形剤と組み合わせる、１つもしくは複数の亜鉛フィンガーヌクレアーゼを含む。

別の態様では、本明細書に説明する、１つもしくは複数のＺＦＮをコードするポリヌクレオチドを本明細書に説明する。ポリヌクレオチドは、例えば、ｍＲＮＡである場合がある。

別の態様では、本明細書に説明する、１つもしくは複数のＺＦＮをコードするポリヌクレオチドを含む、プロモータに動作可能に連結された、ＺＦＮ発現ベクターを本明細書に説明する。

別の態様では、１つもしくは複数のＺＦＮ発現ベクターを含む、ラット宿主細胞を本明細書に説明する。ラット宿主細胞は、１つもしくは複数のＺＦＰ発現ベクターで安定して形質されるか、または一過性にトランスフェクトされるか、またはそれらの組み合わせであり得る。一実施形態では、ラット宿主細胞は、胚幹細胞である。他の実施形態では、１つもしくは複数のＺＦＰ発現ベクターは、ラット宿主細胞内で１つもしくは複数のＺＦＮを発現する。別の実施形態では、ラット宿主細胞はさらに、外因性ポリヌクレオチドドナー配列を含み得る。本明細書に説明する実施形態のうちのいずれかでは、ラット宿主細胞は、胚細胞、例えば、１つもしくは複数の細胞胚を含むことができる。

別の態様では、ラット細胞の１つもしくは複数の遺伝子を開裂する方法を本明細書に説明し、その方法は、（ａ）ＺＦＮが発現し、１つもしくは複数の遺伝子が開裂される条件下で、１つもしくは複数の遺伝子中の標的部位に結合する、１つもしくは複数のＺＦＮをコードする１つもしくは複数のポリヌクレオチドを、ラット細胞内に導入することを含む。

さらに別の態様では、外因性配列をラット細胞のゲノム内に導入する方法を本明細書に説明し、その方法は、（ａ）ＺＦＮが発現し、１つもしくは複数の遺伝子が開裂されるような条件下で、１つもしくは複数の遺伝子内の標的部位に結合する、１つもしくは複数のＺＦＮをコードする１つもしくは複数のポリヌクレオチドを、ラット細胞内に導入するステップと、（ｂ）遺伝子の開裂が、相同組換えによって、ゲノム内への外因性ポリヌクレオチドの組み込みを刺激するように、細胞を外因性ポリヌクレオチドと接触させるステップとを含む。ある実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、ゲノム内に物理的に組み込まれる。別の実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、核酸複製過程（例えば、二本鎖切断の相同指向修復）を介して、宿主細胞ゲノムへの外因性配列のコピーによって、ゲノム内に組み込まれる。さらに他の実施形態では、ゲノム内への組み込みは、非相同依存性標的組み込み（例えば、「末端捕捉」）を介して生じる。ある実施形態では、１つもしくは複数のヌクレアーゼは、ＩＩＳ型制限ヌクレアーゼの開裂ドメインと、改変亜鉛フィンガー結合ドメインとの間の融合である。

別の実施形態では、ラット細胞のゲノム内の１つもしくは複数の遺伝子配列を修飾する方法を本明細書に説明し、その方法は、（ａ）１つもしくは複数の標的遺伝子配列を含む、ラット細胞を提供することと、（ｂ）細胞内で第１および第２の亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を発現させることとを含み、第１のＺＦＮは、第１の開裂部位において開裂し、第２のＺＦＮは、第２の開裂部位において開裂し、遺伝子配列は、第１の開裂部位と第２の開裂部位との間に位置し、第１および第２の開裂部位の開裂は、非相同末端連結による遺伝子配列の修飾をもたらす。ある実施形態では、非相同末端連結は、第１の開裂部位と第２の開裂部位との間に欠失をもたらす。遺伝子配列内の欠失の大きさは、第１の開裂部位と第２の開裂部位との間の距離によって判定される。故に、対象の任意のゲノム領域内の任意の大きさの欠失を取得することができる。２５、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００ヌクレオチド対の欠失、またはこの範囲内のヌクレオチド対の任意の整数値を取得することができる。

加えて、１，０００ヌクレオチド対以上のヌクレオチド対の任意の整数値の配列の欠失は、本明細書に開示する方法および組成物を使用して取得することができる。別の実施形態では、非相同末端連結は、第１の開裂部位と第２の開裂部位との間の挿入をもたらす。本明細書に説明する、ラットのゲノムを修飾する方法は、例えば、遺伝子を（部分的または完全に）不活性化するか、もしくはこれらの遺伝子の新規対立形質を持つトランスジェニックラットの特定または選択を可能にする、遺伝子の所定の位置においてランダム変異を作製することによって、ヒト化ラット遺伝子の挿入（非制限的な例として、薬物代謝を研究するため）によって、または、例えば、そのような変異対立遺伝子の表現型影響を調査するために対象の変異対立遺伝子の挿入によって、動物（例えば、ヒト）の疾患のモデルを作製するために使用することができる。

さらに別の態様では、ラットの１つもしくは複数の標的遺伝子の生殖細胞系列破壊のための方法を本明細書に説明し、その方法は、本明細書に説明する方法のうちのいずれかによって、ラット胚の１つもしくは複数の細胞のゲノム内の１つもしくは複数の遺伝子配列を修飾し、ラット胚を発達させることを含み、修飾された遺伝子配列は、性成熟ラットの配偶子の少なくとも一部分に存在する。

別の態様では、対象のラット遺伝子座内に１つもしくは複数の遺伝性変異対立遺伝子を作製する方法を本明細書に説明し、本明細書に説明する方法のうちのいずれかによって、ラット胚の１つもしくは複数の細胞のゲノム内の１つもしくは複数の遺伝子座を修飾することと、ラット胚を性成熟期に成長させることと、性成熟ラットに子孫を産生させることと、を含み、子孫のうちの少なくともいくつかは、変異対立遺伝子を含む。

本明細書に説明する方法のうちのいずれかでは、亜鉛フィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの組み合わせを含むことができる。ある実施形態では、ポリヌクレオチドは、プラスミドを含む。他の実施形態では、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡを含む。

さらなる態様では、染色体内への核酸配列の部位特異的組み込みの方法を本明細書に提供する。ある実施形態では、方法は、（ａ）（ｉ）少なくとも１つのＤＮＡベクター（ＤＮＡベクターは、組み込まれる核酸配列を隣接する、上流配列および下流配列を含む）、および（ｉｉ）組み込みの染色体部位を認識する亜鉛フィンガーヌクレアーゼをコードする、少なくとも１つのＲＮＡ分子を有する、胚を注入することと、（ｂ）亜鉛フィンガーヌクレアーゼの発現を可能にするように、胚を培養することとを含み、亜鉛フィンガーヌクレアーゼによって組み込み部位内に導入された二本鎖切断は、核酸配列を染色体内に組み込むように、ＤＮＡでの相同組換えを介して修復される。好適な胚は、哺乳類種、鳥類種、爬虫類種、両生類種、および魚類種を含む、種々の異なる脊椎動物種から得られ得る。

一般的に言えば、好適な胚は、亜鉛フィンガーヌクレアーゼの発現を可能にするように、収集、注入、および培養され得る、胚である。いくつかの実施形態では、好適な胚は、げっ歯類、コンパニオンアニマル、家畜、および霊長類からの胚を含み得る。げっ歯類の非制限的な例は、マウス、ネズミ、ハムスター、アレチネズミ、およびモルモットを含み得る。コンパニオンアニマルの非制限的な例は、ネコ、イヌ、ウサギ、ハリネズミ、およびフェレットを含み得る。家畜の非制限的な例は、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ラマ、アルパカ、およびウシを含み得る。霊長類の非制限的な例は、オマキザル属、チンパンジー、キツネザル、アカゲザル、マーモセット、タマリン、クモザル属、リスザル、およびベルベットモンキーを含み得る。他の実施形態では、好適な胚は、魚類、爬虫類、両生類、または鳥類からの胚を含み得る。代替的には、好適な胚は、昆虫胚、例えば、ショウジョウバエ胚または蚊胚であり得る。

ＤＮＡベクターが、組み込まれる核酸配列を隣接する、上流配列および下流配列を含む、少なくとも１つのＤＮＡベクターと、組み込みの染色体部位を認識する亜鉛フィンガーヌクレアーゼをコードする、少なくとも１つのＲＮＡ分子とを含む、胚もまた提供する。本明細書に説明する胚のうちのいずれかから得られる有機体もまた提供する。

ラットＣ６細胞における、ｐ５３特異的ＺＦＮ対のＳｕｒｖｅｙｏｒ（商標）ヌクレアーゼ（「ＣＥＬ−Ｉ」）アッセイ結果を示す。各列で使用されたＺＦＮ対を列の上に示し、Ｓｕｒｖｅｙｏｒミスマッチアッセイによって検出されるＮＨＥＪ活性の割合を下部に示す。

ｅＧＦＰ遺伝子を持つラットＣ６細胞における、ｅＧＦＰ標的ＺＦＮ対１６８３４／１６８３３、１６８５６／１６８５５、および１６８５９／１６８６０のＳｕｒｖｅｙｏｒ（商標）ヌクレアーゼ（「ＣＥＬ−Ｉ」）アッセイ結果を示す。使用したＺＦＮ対を各列の上に示し、必要に応じて、非相同末端連結％（ＮＨＥＪ％）を各列の下に表す。

トランスジェニックＧＥＰラットにおける、ＺＦＮを使用したＧＦＰトランス遺伝子の標的修飾を図示する概略図である。

図４Ａは、トランスジェニックＧＦＰラットから取得した胚へのＧＦＰ標的ＺＦＮの前核注入から誕生した子ラットにおける、ＺＦＮによるＧＦＰの標的破壊を示す。図４Ａは、紫外線下の５匹の子ラットを示し、３匹のＧＦＰ陽性動物、およびＧＦＰを発現しない２匹の動物（ＧＦＰ陰性）を表す。

図４Ｂは、トランスジェニックＧＦＰラットから取得した胚へのＧＦＰ標的ＺＦＮの前核注入から誕生した子ラットにおける、ＺＦＮによるＧＦＰの標的破壊を示す。図４Ｂは、ＧＦＰ＋およびＧＦＰ−の子ラットの尾部の生体検査のＰＣＲ分析の結果を示す。

ＣＭＶプロモータ（ＣＭＶ）またはＣＡＧプロモータから駆動されたＺＦＮ対を使用する、Ｃ６細胞内の内因性ＩｇＭのエクソン１におけるＺＦＮ媒介開裂を図示する。「連結」は、２Ａペプチドによって連結された同一のプラスミド上のＺＦＮ対を指し、「非連結」は、２Ａペプチドによって連結されていないＺＦＮ対を指す。

ＩｇＭ ＺＦＮ注入された単細胞胚の生児出生から生じた、４３匹の尾部から調製された、ゲノムＤＮＡのＳｕｒｖｅｙｏｒ（商標）ヌクレアーゼによる分析を図示する。示すように、ラット＃６、７、８、１９、および４６は、ＩｇＭ遺伝子座における修飾に対して陽性が記録された。白色番号が付いた棒は、個々の（番号付けされた）母親から誕生した子ラットを示す。

ゲノム内へのＺＦＮプラスミドの挿入に対する、ＩｇＭ修飾されたラット（図６において特定される、＃６、７、８、１９、および４６）のＰＣＲ分析の結果を図示する。

図８Ａは、ＣＥＬ−ＩおよびＩｇＭ修飾されたラット＃１９の配列分析を示す。

図８Ｂは、ＣＥＬ−ＩおよびＩｇＭ修飾されたラット＃１９の配列分析を示す。ＷＴ、ラット１９の野生型対立遺伝子、およびラット１９の欠失対立遺伝子配列（パネル８Ｂ）の整合は、ラット１９の欠失対立遺伝子から除去されている配列を表す。

図９Ａは、８つの異なる非標的部位における活性に対する、ＩｇＭ修飾されたラット（図６において特定する、＃６、７、８、１９、および４６）の分析を図示する。非標的部位（部位１、部位２等）は、表９において線引きされているものである。

図９Ｂは、８つの異なる非標的部位における活性に対する、ＩｇＭ修飾されたラット（図６において特定する、＃６、７、８、１９、および４６）の分析を図示する。非標的部位（部位１、部位２等）は、表９において線引きされているものである。

図９Ｃは、８つの異なる非標的部位における活性に対する、ＩｇＭ修飾されたラット（図６において特定する、＃６、７、８、１９、および４６）の分析を図示する。非標的部位（部位１、部位２等）は、表９において線引きされているものである。

Ｒａｂ３８のＺＦＮ媒介修飾の配列分析を図示する。２つの欠失対立遺伝子（Δ６およびΔ４２）との野生型対立遺伝子の整合を、この図に示す。

図１１Ａは、ＺＦＮ−ＩｇＭ修飾されたラットおよび野生型ラットの異種交配から取得した子ラットの分析を図示する。図１１Ａは、ラット＃１９（実施例３）を野生型ラットと異種交配させた、５匹の子ラット（２２４〜２２８で番号付けされる）のＰＣＲおよびＣＥＬ−Ｉ分析を示す。

図１１Ｂは、ＺＦＮ−ＩｇＭ修飾されたラットおよび野生型ラットの異種交配から取得した子ラットの分析を図示する。３匹のＩｇＭ修飾された子ラット（図において特定される、＃２２５、２２７、および２２８）が、ＩｇＭ遺伝子座において、親ラット＃１９と同一の６４の塩基対欠失対立遺伝子を含むという配列分析の裏付けを示す。

図１１Ｃは、ＺＦＮ−ＩｇＭ修飾されたラットおよび野生型ラットの異種交配から取得した子ラットの分析を図示する。ラット＃１９の付加的な子ラット、ならびに、ＩｇＭ修飾されたラット＃４６と＃８の異種交配による子ラットのＰＣＲおよびＣＥＬ−Ｉ分析を示す。ＩｇＭ修飾された親ラットは、上部に「Ｆ０」で示し、子ラットの数は、各列の上に示す。

標的ＺＦＮ誘導の二本鎖切断後の修復結果を図示する概略図である。網掛け棒は、ドナー断片を表し、白色棒は、ＺＦＮ二本鎖切断のための標的部位を示す。

ＲＦＬＰドナープラスミドの構成を図示する、概略図である。プラスミド、および組み込み標的部位に相同的な左右のＰＣＲ増幅断片を示す。クローン作製に使用した制限酵素を表示する。左断片は、ＫｐｎＩおよびＮｏｔＬまたはＰｍｅＩを使用した。右断片は、ＮｏｔＩまたはＰｍｅＩおよびＳａｃＩＩを使用した。

ＧＦＰ発現ドナープラスミドの構成を図示する、概略図である。ＧＦＰカセットは、既存のプラスミドからＰＣＲ増幅され、ＮｏｔＩ部位を使用して、ＮｏｔＩ ＲＦＬＰドナー内に閉鎖された。

図１５Ａは、ＲＦＬＰ組み込みを検出する方法を図示する。図１５Ａは、ＲＦＬＰ組み込み、および制限酵素消化を検出する方法を図示する、概略図である。

図１５Ｂは、ＲＦＬＰ組み込みを検出する方法を図示する。図１５Ａは、ＲＦＬＰ組み込み、および制限酵素消化を検出する方法を図示する、概略図である。図１５Ｂは、ＰＣＲ増幅を使用する、ＧＦＰ発現カセットの組み込みを図示する、概略図である。

アガロースゲル上で分解された、蛍光染色されたＰＣＲ断片の写真画像である。最左列は、ＤＮＡラダーを含む。列１〜６は、全体またはごく一部のマウス胚盤胞から、Ｍｄｒ１ａ特異的プライマーを使用して増幅されたＰＣＲ断片を含む。列１および２は、それぞれ、５／６および１／６の胚盤胞から増幅された。列３は、１つの全胚盤胞から増幅された。列４〜６は、それぞれ、１／２、１／３、および１／６の同一の胚盤胞から増幅された。列７は、抽出されたマウスの足指のＤＮＡから、同一のプライマーを使用して増幅された、陽性対照のＰＣＲ断片を含む。

図１７Ａは、アガロースゲル上で分解された、蛍光染色されたＤＮＡ断片の写真画像を図示する。最左列は、ＤＮＡラダーを含む。図１７Ａの列１〜３９は、ＰＣＲ増幅のための１つの陽性および陰性対照とともに、ＮｏｔＩ部位を有するマウスＭｄｒ１ａおよびＲＦＬＰドナーに対して、ＺＦＮ ＲＮＡで微量注入された後に、インビトロ培養された３７個のマウス胚から、ｍＭｄｒ１ａ特異的プライマーを使用して増幅されたＰＣＲ断片を含む。

図１７Ｂは、アガロースゲル上で分解された、蛍光染色されたＤＮＡ断片の写真画像を図示する。最左列は、ＤＮＡラダーを含む。図１７Ｂの列１〜３９は、Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（商標）変異検出アッセイを実施した後の図１７ＡのＰＣＲ断片を含む。

図１８Ａは、アガロースゲル上で分解された、蛍光染色されたＤＮＡ断片の写真画像である。最左列および最右列は、ＤＮＡラダーを含む。列は、図１７に示す、マウス胚から、ｍＭｄｒ１ａ特異的プライマーを使用して増幅され、ＰＣＲ産物を精製することなく、ＮｏｔＩで消化された、ＰＣＲ断片を含む。

図１８Ｂは、アガロースゲル上で分解された、蛍光染色されたＤＮＡ断片の写真画像である。最左列および最右列は、ＤＮＡラダーを含む。図１８Ｂは、図１８Ａにおける同一のゲルのより長い泳動である。未切断のＰＣＲ産物は、約１．８ｋｂであり、消化された産物は、約９００ｂｐの２つのバンドである。

アガロースゲル上で分解された、蛍光染色されたＤＮＡ断片の写真画像である。最左列は、ＤＮＡラダーを含む。列１〜６は、ＮｏｔＩがその最適な緩衝液内で作用することができるように、ＰＣＲ産物が、カラム精製された後に、ＮｏｔＩで消化された、図１８に示す、ＰＣＲ断片のうちのいくつかを含む。列７および８は、ＮｏｔＩで消化されたサンプルのうちの２つである（図１８と同様）。このゲルは、ＰＣＲ反応物内のＮｏｔＩ消化が完了したことを示す。

アガロースゲル上で分解された、蛍光染色されたＰＣＲ断片の写真画像である。最左列は、ＤＮＡラダーを含む。列１〜５は、１、１／２、１／６、１／１０、１／３０個のラット胚盤胞から、ＰＸＲ特異的プライマーを使用して増幅された、ＰＣＲ断片を含む。列６は、精製されたスプラーグダウリー（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）ゲノムＤＮＡから、同一のプライマーを使用して増幅された、陽性対照である。

図２１Ａは、アガロースゲル上で分解された、蛍光染色されたＤＮＡ断片の写真画像である。最左列および最右列は、ＤＮＡラダーを含む。図２１Ａは、ＰＸＲ特異的プライマーを使用した、ＰＸＲ、ＺＦＮ、ｍＲＮＡ、およびＮｏｔＩ ＲＦＬＰドナーの微量注入後に、インビトロ培養され、ＮｏｔＩで消化された、ラット胚から増幅された、ＰＣＲ断片を示す。

図２１Ｂは、アガロースゲル上で分解された、蛍光染色されたＤＮＡ断片の写真画像である。最左列および最右列は、ＤＮＡラダーを含む。図２１Ｂは、Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（商標）変異検出アッセイを実施した後の、図２１Ａと同一のＰＣＲ断片を示す。

アガロースゲル上で分解された、蛍光染色されたＤＮＡ断片の写真画像である。最初の４つの列は、ＮｏｔＩ ＲＦＬＰドナーを有する、ｍＭｄｒ１ａ ＺＦＮ ｍＲＮＡで注入された胚からの受胎後１２．５日目の４匹の十分に発達した胎児からＰＣＲ増幅される。ＰＣＲは、ＮｏｔＩで消化された。列４は、陽性のものである。列５〜８は、埋込が中断された、４つの脱落膜である。４匹はすべて、陰性であった。

図２３Ａは、アガロースゲル上で分解された、蛍光染色されたＤＮＡ断片の概略図および写真画像である。図２３Ａは、使用したプライマーの位置を示す、概略図である。

図２３Ｂは、アガロースゲル上で分解された、蛍光染色されたＤＮＡ断片の概略図および写真画像である。図２３Ｂおよび２３Ｃは、プライマーＰＦおよびＧＲからの結果を示す。

図２３Ｃは、アガロースゲル上で分解された、蛍光染色されたＤＮＡ断片の概略図および写真画像である。図２３Ｂおよび２３Ｃは、プライマーＰＦおよびＧＲからの結果を示す。

図２３Ｄは、アガロースゲル上で分解された、蛍光染色されたＤＮＡ断片の概略図および写真画像である。図２３Ｄおよび２３Ｅは、プライマーＰＲ＋ＧＦからの結果を示す。予想される断片寸法は、２．４ｋｂである。４０匹の胎児のうちの２匹は、ＧＦＰに対して陽性であった。

図２３Ｅは、アガロースゲル上で分解された、蛍光染色されたＤＮＡ断片の概略図および写真画像である。図２３Ｄおよび２３Ｅは、プライマーＰＲ＋ＧＦからの結果を示す。予想される断片寸法は、２．４ｋｂである。４０匹の胎児のうちの２匹は、ＧＦＰに対して陽性であった。

アガロースゲル上で分解された、ＤＮＡ断片の写真画像である。列８は、ＮｏｔＩ部位に対して陽性である、１３ｄｐｃの胎児を表す。

ラットのゲノム編集（例えば、遺伝子の開裂、例えば、開裂後の外因性配列の挿入（物理的挿入または相同指向修復を介する複製による挿入）および／または開裂後の非相同末端連結（ＮＨＥＪ）による、遺伝子の変化、１つもしくは複数の遺伝子の部分的または完全な不活性化、内因性遺伝子の変化された発現を作製するための、ランダム変異を有する対立遺伝子の生成等）、および生殖細胞系列内に運ばれるラットゲノムの変化のための組成物および方法を本明細書に説明する。例えば、標的ラット細胞内の１つもしくは複数の遺伝子を編集する（変化する）ために、これらの組成物（試薬）を作製し、使用する方法も開示する。したがって、本明細書に説明する方法および組成物は、１つもしくは複数のラット遺伝子の標的遺伝子変異（例えば、ノックイン）および／またはノックアウト（部分的または完全）および／または任意の標的対立遺伝子の配列のランダム変異に対して、非常に有効な方法を提供し、したがって、ヒトの疾患の動物モデルの生成を可能にする。

本明細書に説明する組成物および方法は、労働集約型の選択および／またはスクリーニングの必要性を伴わず、最小限の非標的効果を有する、ラットの内因性遺伝子座の迅速的、完全的、および永久的な標的破壊を提供する。全体の動物遺伝子ノックアウトはまた、ＺＦＮ、ｍＲＮＡ、またはＺＦＮ発現カセットを注入することによって、単一のステップにおいて、容易に生成することができる。

概要
本明細書に開示する、方法の実践、ならびに組成物の調製および使用は、別段の指示がない限り、当該分野の技術範囲内である、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算化学、細胞培養、組換えＤＮＡ、ならびに関連分野における従来の技術を用いる。これらの技術は、文献に完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９ ａｎｄ Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７および定期改訂、ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｗｏｌｆｆｅ，ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮ，Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９８、ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．３０４，「Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ」（Ｐ．Ｍ．Ｗａｓｓａｒｍａｎ ａｎｄ Ａ．Ｐ．Ｗｏｌｆｅｅ，ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９９、およびＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．１１９，「Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」（Ｐ．Ｂ．Ｂｅｃｋｅｒ，ｅｄ）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，１９９９を参照されたい。

定義
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用され、線状または環状配座であり、一本鎖または二本鎖形態のいずれかである、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示については、これらの用語は、ポリマーの長さに関して制限するものとして解釈されるものではない。用語は、天然ヌクレオチドの公知の類似体、ならびに塩基部分、糖部分、および／またはリン酸部分において修飾されるヌクレオチド（例えば、ホスホロチエート骨格）を包含する。一般に、特定ヌクレオチドの類似体は、同一の塩基対合特異性を有する、すなわち、Ａの類似体は、Ｔと塩基対合する。

「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために互換的に使用される。用語はまた、１つもしくは複数のアミノ酸が、天然に存在する対応アミノ酸の化学的類似体、または修飾誘導体である、アミノ酸ポリマーに適用される。

「結合」は、高分子間（例えば、タンパク質と核酸との間）の配列特異的で非共有結合的な相互作用を指す。相互作用が全体として配列特異性である限り、結合相互作用のすべての構成要素が配列特異的である必要はない（例えば、ＤＮＡ主鎖のリン酸残基との接触）。そのような相互作用は、一般に、１０^-6Ｍ^-1またはそれ以下の解離定数（Ｋ_d）を特徴とする。「親和性」は、結合強度を指し、結合親和性の増加は、Ｋ_dの低下と相関する。

「結合タンパク質」は、別の分子に非共有結合的に結合することが可能なタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）、および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合することができる。タンパク質結合タンパク質の場合では、それは、それ自身に結合することができる（ホモ二量体、ホモ三量体等を形成するため）、および／または、それは、１つもしくは複数の分子の異なるタンパク質またはタンパク質群に結合することができる。結合タンパク質は、１種類以上の結合活性を有することができる。例えば、亜鉛フィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合活性、ＲＮＡ結合活性、およびタンパク質結合活性を有する。

「亜鉛フィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、亜鉛イオンの配位を介して安定化される構造を有する結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である、１つもしくは複数の亜鉛フィンガーを介する配列特異的方法でＤＮＡを結合するタンパク質、またはより大きなタンパク質内のドメインである。亜鉛フィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は、しばしば、亜鉛フィンガータンパク質またはＺＦＰとして略記される。

亜鉛フィンガー結合ドメインは、所定のヌクレオチド配列に結合するように、「改変」することができる。亜鉛フィンガータンパク質を改変するための方法の非制限的な例は、設計および選択である。設計された亜鉛フィンガータンパク質は、その設計／組成が、主に、合理的基準によってもたらされる、天然に存在しないタンパク質である。設計のための合理的基準は、置換規則の適用、ならびに既存のＺＦＰ設計および結合データの情報を記憶するデータベース内の情報を処理するためのコンピュータアルゴリズムの適用を含む。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号、同第６，４５３，２４２号、および同第６，５３４，２６１号を参照し、また、国際公開第ＷＯ９８／５３０５８号、同第ＷＯ９８／５３０５９号、同第ＷＯ９８／５３０６０号、同第ＷＯ０２／０１６５３６号、および同第ＷＯ０３／０１６４９６号を参照されたい。

「選択された」亜鉛フィンガータンパク質は、その産生が、主に、ファージ提示法、相互作用トラップ、またはハイブリッド選択等の実験的プロセスからもたらされる、天然には見出されないタンパク質である。例えば、米国特許第５，７８９，５３８号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，２００，７５９号、国際公開第ＷＯ９５／１９４３１号、同第ＷＯ９６／０６１６６号、同第ＷＯ９８／５３０５７号、同第ＷＯ９８／５４３１１号、同第ＷＯ００／２７８７８号、同第ＷＯ０１／６０９７０号、同第ＷＯ０１／８８１９７号、および同第ＷＯ０２／０９９０８４号を参照されたい。

「配列」という用語は、任意の長さのヌクレオチド配列を指し、ＤＮＡまたはＲＮＡである可能性があり、線状、環状、または分岐状である可能性があり、一本鎖または二本鎖のいずれかである可能性がある。「ドナー配列」という用語は、ゲノム内に挿入されるヌクレオチド配列を指す。ドナー配列は、任意の長さ、例えば、２〜１０，０００ヌクレオチド長（または、その間もしくはそれ以上の任意の整数値）、好ましくは、約１００〜１，０００ヌクレオチド長（または、その間の任意の整数）、より好ましくは、約２００〜５００ヌクレオチド長である可能性がある。

「相同非同一配列」は、第２の配列とある程度の配列同一性を共有するが、その配列は、第２の配列と同一ではない、第１の配列を指す。例えば、突然変異遺伝子の野生型配列を含むポリヌクレオチドは、突然変異遺伝子の配列に対して相同的かつ非同一である。ある実施形態では、２つの配列の間の相同性の度合いは、通常の細胞機構を用いて、それらの間で相同組換えを可能にするために十分である。２つの相同非同一配列は、任意の長さである可能性があり、非相同性の度合いは、１ヌクレオチドほど小さいか（例えば、標的相同組換えによるゲノム点突然変異の補正のため）、または１０キロベース以上ほど大きい（例えば、染色体内の所定の異所性部位における遺伝子の挿入のため）可能性がある。相同非同一配列を含む２つのポリヌクレオチドは、同一の長さである必要はない。例えば、２０〜１０，０００ヌクレオチド、またはヌクレオチド対の外因性ポリヌクレオチド（すなわち、ドナーポリヌクレオチド）を使用することができる。

核酸およびアミノ酸配列同一性を判定するための技術は、当該技術分野において公知である。典型的には、そのような技術は、遺伝子のためのｍＲＮＡのヌクレオチド配列を判定すること、および／または、それによってコードされたアミノ酸配列を判定すること、ならびにそれらの配列を、第２のヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較することを含む。ゲノム配列はまた、この方法で、判定し、比較することができる。一般に、同一性は、それぞれ、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に対応する、完全なヌクレオチド対ヌクレオチド、またはアミノ酸対アミノ酸を指す。２つもしくは複数の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、それらの同一性百分率を判定することによって比較することができる。

核酸またはアミノ酸であれ、２つの配列の同一性百分率は、より短い配列の長さで割り、１００を乗じた、２つの整合配列の間の厳密な合致数である。核酸配列の近似配列は、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８９（１９８１）の局所性相同性アルゴリズムによって提供される。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｄ．，５ ｓｕｐｐｌ．３：３５３−３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡ、によって開発され、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５−６７６３（１９８６）によって標準化されたスコアリングマトリックスを使用することによって、アミノ酸配列に適用することができる。

配列の同一性百分率を判定するためのこのアルゴリズムの例示的実施は、「ＢｅｓｔＦｉｔ」実用用途において、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって提供される。この方法のデフォルトパラメータは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８（１９９５）（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手可能）に説明されている。本開示に関連して、同一性百分率を確立する好ましい方法は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈが著作権を有し、Ｊｏｈｎ Ｆ．ＣｏｌｌｉｎｓおよびＳｈａｎｅ Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋによって開発され、ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）から販売される、ＭＰＳＲＣＨプログラムパッケージを使用することである。このパッケージ一式から、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用することができ、デフォルトパラメータは、スコアリング表に使用される（例えば、ギャップオープンペナルティー１２、ギャップエクステンションペナルティー１、およびギャップ６）。

生成されたデータからの「マッチ」値は、配列同一性を反映する。配列の間の同一性百分率または類似性を計算するための他の好適なプログラムは、当該技術分野において一般に公知であり、例えば、別の整合プログラムは、デフォルトパラメータとともに使用されるＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルトパラメータを使用して、使用することができる：遺伝コード＝標準、フィルター＝なし、鎖＝両方、カットオフ＝６０、期待数＝１０、マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２、表示＝５０配列、分類＝高スコア、データベース＝非重複、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ ｔｒａｎｌｓａｔｉｏｎｓ＋Ｓｗｉｓｓ ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレス：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／ｃｇｉ‐ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴで確認することができる。本明細書に説明する配列に関して、望ましい配列同一性の度合いの範囲は、約８０％〜１００％、およびそれらの間の任意の整数値である。典型的には、配列の間の同一性百分率は、少なくとも７０〜７５％、好ましくは、８０〜８２％、より好ましくは、８５〜９０％、さらに好ましくは、９２％、より一層好ましくは、９５％、最も好ましくは、９８％の配列同一性である。

代替的には、ポリヌクレオチドの間の配列類似性の度合いは、相同領域間で安定した二重鎖の形成を可能にする条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション後に、一本鎖特異的ヌクレアーゼでの消化、および消化された断片の寸法決定によって判定することができる。２つの核酸または２つのポリペプチド配列は、配列が、上記の方法を使用して判定されるように、分子の定義された長さにわたって、少なくとも７０％〜７５％、好ましくは、８０％〜８２％、より好ましくは、８５％〜９０％、さらに好ましくは、９２％、より一層好ましくは、９５％、および最も好ましくは、９８％の配列同一性を呈する時に、互いに実質的に相同的である。

本明細書に使用するとき、実質的に相同的はまた、特異的ＤＮＡまたはポリペプチド配列に完全な同一性を示す配列を指す。実質的に相同的であるＤＮＡ配列は、例えば、サザンハイブリダイゼーション実験において、その特定のシステムのために定義される、緊縮条件下で、特定することができる。適切なハイブリダイゼーション条件を定義することは、当該技術分野の技術範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ハイブリダイゼーション：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｅｄｉｔｏｒｓ Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，（１９８５） Ｏｘｆｏｒｄ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）を参照されたい。

２つの核酸断片の選択的ハイブリダイゼーションは、以下のように判定することができる。２つの核酸分子の間の配列同一性の度合いは、そのような分子の間のハイブリダイゼーション事象の効率および強度に影響する。部分的に同一な核酸配列は、完全に同一な配列の標的分子へのハイブリダイゼーションを少なくとも部分的に阻害する。完全に同一な配列のハイブリダイゼーションの阻害は、当該技術分野において周知である、ハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、サザン（ＤＮＡ）ブロット、ノーザン（ＲＮＡ）ブロット、溶液ハイブリダイゼーション、または同等物、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（１９８９） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照）を使用して評価することができる。

そのようなアッセイは、異なる度合いの選択性を使用して、例えば、低ストリンジェンシーから高いストリンジェンシーまで異なる条件を使用して、実施することができる。低ストリンジェンシーの条件を使用する場合では、非特異性結合の不在は、非特異性結合事象の不在下で二次プローブが標的にハイブリダイズしないようにするように、部分的な配列同一性の度合いさえ持たない二次プローブ（例えば、標的分子との配列同一性が約３０％未満であるプローブ）を使用して、評価することができる。

ハイブリダイゼーションベースの検出システムを使用する時、参相補的である核酸プローブが選択され、次いで、適切な条件の選択によって、プローブおよび参照配列が二重鎖分子を形成するように、互いに選択的にハイブリダイズする、または結合する。中等度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、参照配列に選択的にハイブリダイズする能力を有する核酸分子は、典型的には、選択された核酸プローブの配列と少なくとも約７０％の配列同一性を有する、少なくとも約１０〜１４ヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にするような条件下でハイブリダイズする。

ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、典型的には、選択された核酸プローブの配列と少なくとも約９０〜９５％を上回る配列同一性を有する、少なくとも約１０〜１４ヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にする。プローブおよび参照配列が、特異的な配列同一性の度合いを有する、プローブ／参照配列ハイブリダイゼーションに有用なハイブリダイゼーション条件は、当該技術分野において公知のとおり判定することができる（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄａｚａｔｉｏｎ ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｅｄｉｔｏｒｓ Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，（１９８５）Ｏｘｆｏｒｄ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ参照）。

ハイブリダイゼーションの条件は、当業者に周知である。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション条件が、ミスマッチしたヌクレオチドを含むハイブリッドの形成を嫌う度合いを指し、より高いストリンジェンシーは、ミスマッチしたハイブリッドに対する許容性の低さに相関する。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を及ぼす因子は、当業者に周知であり、温度、ｐＨ、イオン強度、および、例えば、ホルムアミドおよびジメチルスルホキシド等の有機溶媒の濃度を含むが、それらに限定されない。当業者に公知のように、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、より高い温度、より低いイオン強度、およびより低い溶媒濃度によって増大する。

ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー条件に関して、数々の等価条件は、例えば、以下の因子：配列の長さおよび性質、種々の配列の塩基組成、塩および他のハイブリダイゼーション溶液成分の濃度、ハイブリダイゼーション溶液中の遮断薬（例えば、硫酸デキストランおよびポリエチレングリコール）の存否、ハイブリダイゼーション反応温度および時間パラメータ、ならびに洗浄条件を変化させることによって、特定のストリンジェンシーを確立するために使用することができることは、当該技術分野において周知である。特定の一連のハイブリダイゼーション条件の選択は、当該技術分野における標準方法に従い選択される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照）。

「組換え」は、２つのポリヌクレオチドの間の遺伝情報の交換のプロセスを指す。この開示に関して、「相同組換え（ＨＲ）」は、例えば、相同指向修復機構を介する細胞内の二本鎖切断の修復中に行われる、そのような交換の特殊な形態を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を経験するもの）のテンプレート修復に「ドナー」分子を使用し、かつ、それがドナーから標的への遺伝子情報の移動をもたらすため、「非交差遺伝子変換」または「ショートトラクト遺伝子変換」としてさまざまな名称で公知である。任意の特定の理論に束縛されるものではないが、そのような移動は、切断された標的とドナーとの間に形成されるヘテロ二重鎖ＤＮＡのミスマッチ修正、および／または、標的の一部になる遺伝子情報を再合成するためにドナーが使用される、「合成依存性鎖アニーリング」、および／または関連プロセスを伴う可能性がある。そのような特殊なＨＲは、しばしば、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部またはすべてが、標的ポリヌクレオチド内に組み込まれるような、標的分子の配列の変化をもたらす。

本開示の方法では、本明細書に説明する、１つもしくは複数の標的ヌクレアーゼは、所定の部位において、標的配列（例えば、細胞クロマチン）内に二本鎖切断を作製し、切断領域内のヌクレオチド配列との相同性を有する、「ドナー」ポリヌクレオチドは、細胞内に導入することができる。二本鎖切断の存在は、ドナー配列の組み込みを促進することが明らかになっている。ドナー配列は、物理的に組み込まれ得るか、または、代替的には、ドナーポリヌクレオチドは、相同組換えを介する切断の修復のためのテンプレートとして使用され、細胞クロマチン内へのドナーに見られるヌクレオチド配列のすべてまたは一部の導入をもたらす。したがって、細胞クロマチン内の第１の配列は、調節することができ、ある実施形態では、ドナーポリヌクレオチド内に存在する配列に変換することができる。したがって、「置換する」または「置換」という用語は、別のヌクレオチド配列での１つのヌクレオチド配列の置換（すなわち、情報的な意味では、配列の置換）を表すことを理解することができ、別のポリヌクレオチドによる、１つのポリヌクレオチドの物理的または化学的置換は、必ずしも必要ではない。

本明細書に説明する方法のうちのいずれかでは、亜鉛フィンガータンパク質の付加的な対は、細胞内の付加的な標的部位の付加的な二本鎖開裂に使用することができる。

細胞クロマチン内の対象領域内の配列の標的組換えおよび／または置換および／または変異のための方法のある実施形態では、染色体配列は、外因性「ドナー」ヌクレオチド配列での相同組換えによって、変化させられる。そのような相同組換えは、切断領域への配列相同性が存在する場合に、細胞クロマチン内の二本鎖切断の存在によって刺激される。

本明細書に説明する方法のうちのいずれかでは、第１のヌクレオチド配列（「ドナー配列」）は、対象領域内のゲノム配列に対して相同的であるが、同一ではない配列を含むことができ、それによって、相同組換えを刺激して、対象領域内の非同一配列を挿入する。したがって、ある実施形態では、対象領域内の配列に相同的である、ドナー配列の部分は、置換されるゲノム配列に対して、約８０〜９９％（または、それらの間の任意の整数）の配列同一性を呈する。別の実施形態では、ドナーおよびゲノム配列の間の相同性は、例えば１つのヌクレオチドが、１００個以上の連続塩基対のうちのドナーおよびゲノム配列との間で異なる場合に、９９％よりも高い。ある場合では、ドナー配列の非相同性部分は、新規配列が、対象領域内に導入されるよう、対象領域内に存在しない配列を含むことができる。これらの例では、非相同性配列は、一般に、対象領域内の配列に相同的または同一である、５０〜１，０００の塩基対（または、それらの間の任意の整数値）、または１，０００以上のうちの任意の数の塩基対によって、隣接される。別の実施形態では、ドナー配列は、第１の配列に非相同的であり、非相同組換え機構によって、ゲノム内に挿入される。

本明細書に説明する方法のうちのいずれかは、対象遺伝子の発現を妨害する、ドナー配列の標的組み込みによる、細胞内の１つもしくは複数の標的配列の部分的または完全な非活性化のために使用することができる。部分的または完全に不活性化された遺伝子を有する細胞株もまた、提供する。

さらに、本明細書に説明する、標的組み込みの方法はまた、１つもしくは複数の外因性配列を組み込むために使用することができる。外因性核酸配列は、例えば、１つもしくは複数の遺伝子もしくはｃＤＮＡ分子、または任意の種類のコードもしくは非コード配列、ならびに、１つもしくは複数の制御要素（例えば、プロモータ）を含むことができる。加えて、外因性核酸配列は、１つもしくは複数のＲＮＡ分子（例えば、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、阻害ＲＮＡ（ＲＮＡｉｓ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）等）を産生し得る。

「開裂」は、ＤＮＡ分子の共有結合主鎖の切断を指す。開裂は、リン酸ジエステル結合の酵素的または化学的加水分解を含むが、それらに限定されない、種々の方法によって開始される可能性がある。一本鎖開裂および二本鎖開裂の両方が考えられ、二本鎖開裂は、２つの異なる一本鎖開裂事象の結果として生じる可能性がある。ＤＮＡ開裂は、平滑末端または互い違いの末端のいずれかの産生をもたらす可能性がある。ある実施形態では、融合ポリペプチドは、標的二本鎖ＤＮＡ開裂に使用される。

「開裂ハーフドメイン」は、第２のポリペプチド（同一または異なる）と共同して、開裂活性（好ましくは、二本鎖開裂活性）を有する複合体を形成するポリペプチド配列である。「第１および第２の開裂ハーフドメイン」、「＋および−開裂ハーフドメイン」、および「右および左開裂ハーフドメイン」という用語は、二量体化する開裂ハーフドメインの対を指すために、互換的に使用される。

「改変開裂ハーフドメイン」は、別の開裂ハーフドメイン（例えば、別の改変開裂ハーフドメイン）を用いて偏性ヘテロ二量体を形成するように、修飾されている開裂ハーフドメインである。米国特許第２００５／００６４４７４号、同第２００７／０２１８５２８号、および同第２００８／０１３１９６２号もまた参照されたく、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。

「クロマチン」は、細胞ゲノムを含む核タンパク質構造である。細胞クロマチンは、核酸、主に、ＤＮＡ、ならびにタンパク質（ヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質を含む）を含む。真核性細胞クロマチンの大半は、ヌクレオソームの形態で存在し、ヌクレオソームコアは、それぞれ２つのヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４を含む八量体と会合した約１５０塩基対のＤＮＡを含み、（有機体によって異なる長さの）リンカーＤＮＡは、ヌクレオソームコアの間に延在する。１分子のヒストンＨ１は、一般に、リンカーＤＮＡと会合している。本開示に関して、「クロマチン」という用語は、すべての種類の細胞核タンパク質、原核および真核の両方を含有することを意味する。細胞クロマチンは、染色体クロマチンおよびエピソームクロマチンの両方を含む。

「染色体」は、細胞のゲノムのすべてまたは一部分を含む、クロマチン複合体である。細胞のゲノムは、しばしば、細胞のゲノムを含む染色体すべての集合であるその核型を特徴とする。細胞のゲノムは、１つもしくは複数の染色体を含むことができる。

「エピソーム」は、細胞の染色体核型の一部ではない核酸を含む、複製する核酸、核タンパク質複合体、または他の構造である。エピソームの例は、プラスミドおよびあるウイルスゲノムを含む。

「標的部位」または「標的配列」は、結合するための十分な条件が存在する時に、結合分子が結合する核酸の一部分を画定する、核酸配列である。例えば、配列５′−ＧＡＡＴＴＣ−３′は、Ｅｃｏ ＲＩ制限ヌクレアーゼの標的部位である。

「外因性」分子は、通常は細胞内に存在しないが、１つもしくは複数の遺伝学的方法、生化学的方法、または他の方法によって、細胞中に導入することができる分子である。「通常は細胞内に存在」は、細胞の特定の発生段階および環境条件に関して判定される。したがって、例えば、筋の胚発生中のみに存在する分子は、成体筋細胞については外因性分子である。同様に、熱ショックによって誘発される分子は、非熱ショック細胞については外因性分子である。外因性分子は、例えば、機能不全型内因性分子の機能型、または正常機能型内因性分子の機能不全型を含むことができる。外因性分子はまた、別の種において通常見られる分子、例えば、ラットゲノム内に導入されたヒト配列である可能性がある。

外因性分子は、とりわけ、コンビナトリアル化学プロセスによって生成されるもの等の小分子か、またはタンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上記の分子の任意の修飾誘導体、または１つもしくは複数の上記の分子を含む任意の複合体等の高分子である可能性がある。核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含み、一本鎖または二本鎖である可能性があり、線状、分岐状、または環状である可能性があり、任意の長さである可能性がある。核酸は、二重鎖を形成することが可能な核酸ならびに三重鎖形成核酸を含む。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号、および同第５，４２２，２５１号を参照されたい。タンパク質は、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチン再構成因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレース、およびヘリカーゼを含むが、それらに限定されない。

外因性分子は、内因性分子と同一の種類、例えば、外因性タンパク質または核酸である可能性がある。例えば、外因性核酸は、感染ウイルスゲノム、細胞内に導入されたプラスミドもしくはエピソーム、または細胞内に通常存在しない染色体を含むことができる。細胞内への外因性分子の導入のための方法は、当業者に公知であり、脂質媒介導入（すなわち、中性および陽イオン性脂肪を含む、リポソーム）、エレクトロポレーション、直接注入、細胞融合、粒子衝撃、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン−媒介導入、およびウイルスベクター媒介導入を含むが、それらに限定されない。

対照的に、「内因性」分子は、特定の環境条件下で、特定の発生段階にある特定の細胞中に通常存在するものである。例えば、内因性核酸は、染色体、ミトコンドリア、クロロプラスト、もしくは他の細胞小器官のゲノム、または天然に存在するエピソーム核酸含むことができる。付加的な内因性分子は、タンパク質、例えば、転写因子および酵素を含むことができる。

「融合」分子は、２つもしくは複数のサブユニット分子が、好ましくは共有結合的に連結された分子である。サブユニット分子は、同一の化学型分子である可能性がある、または異なる化学型分子である可能性がある。第１の種類の融合分子の例は、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインと開裂ドメインとの間の融合物）および融合核酸（例えば、上述の融合タンパク質をコードする核酸）を含むが、それらに限定されない。第２の種類の融合分子の例は、三重鎖形成核酸とポリペプチドとの間の融合物、および副溝統合剤と核酸との間の融合物を含むが、それらに限定されない。

細胞における融合タンパク質の発現は、細胞への融合タンパク質の送達から、または細胞内への融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの送達によって、生じる可能性があり、ポリヌクレオチドは、融合タンパク質を生成するために、転写され、転写物は、翻訳される。トランススプライシングポリペプチド開裂およびポリペプチドライゲーションはまた、細胞内のタンパク質の発現に関与することができる。細胞へのポリヌクレオチドおよびポリペプチド送達の方法については、本開示の他所に提示する。

本開示に関して、「遺伝子」は、そのような調節配列がコード配列および／または転写配列に隣接するか否かに関わらず、遺伝子産物（以下を参照）をコードするＤＮＡ領域、ならびに遺伝子産物の産生を調節するすべてのＤＮＡ領域を含む。故に、遺伝子は、プロモータ配列、ターミネータ、翻訳調節配列（リボソーム結合部位および内部リボソーム侵入部位等）、エンハンサ、サイレンサ、絶縁体、境界要素、複製起点、マトリックス付着部位、および遺伝子座制御領域を含むが、必ずしもそれらに限定されない。

「遺伝子発現」は、遺伝子内に含まれる情報の、遺伝子産物内への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボソーム、構造ＲＮＡ、または任意の他の種類のＲＮＡ）、またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質である可能性がある。遺伝子産物はまた、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、および編集等のプロセスによって修飾されたＲＮＡ、および、例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、ミリスチン化、およびグリコシル化によって修飾されたタンパク質を含む。

遺伝子発現の「調整」は、遺伝子活性の変化を指す。発現の調整は、遺伝子活性化および遺伝子抑制を含むことができるが、それらに限定されない。ゲノム編集（例えば、開裂、変異、不活性化、ランダム変異）は、発現を調整するために使用することができる。遺伝子不活性化は、細胞と比較して、本明細書に説明するＺＦＰを含まない遺伝子発現における任意の還元を指す。したがって、遺伝子不活性化は、部分的または完全であり得る。

「対象領域」は、例えば、その中で外因性分子を結合することが望まれる、遺伝子または遺伝子内の、またはそれに隣接する非コード配列等の細胞クロマチンの任意の領域である。結合の目的は、標的ＤＮＡ開裂および／または標的組換えである。対象領域は、例えば、染色体、エピソーム、細胞小器官ゲノム（例えば、ミトコンドリア、クロロプラスト）、または感染ウイルスゲノム内に存在することができる。対象領域は、遺伝子のコード領域内、例えば、リーダー配列、トレーラー配列、またはイントロン等の転写された非コード領域内、またはコード領域の上流または下流のいずれかの非転写領域内である可能性がある。対象領域は、１ヌクレオチド対ほど小さいか、または最大２，０００ヌクレオチド長、またはヌクレオチド対の任意の整数値である可能性がある。

「動作的に連結」および「動作的に連結」（または「動作可能に連結」という用語は、構成要素が、両方の構成要素が正常に機能し、構成要素のうちの少なくとも１つが他の構成要素のうちの少なくとも１つの上に発揮される機能を媒介することが可能な状態を許すような形で配置される、２つもしくは複数の構成要素（配列要素等）の並列を指し、互換的に使用される。例証として、プロモータ等の転写調節配列は、転写調節配列が、１つもしくは複数の転写調節因子の存在または不在に応じて、コード配列の転写レベルを制御する場合に、コード配列に動作的に連結される。転写調節配列は、一般に、コード配列で、シスに、直接動作的に連結されるが、それに直接隣接している必要はない。例えば、エンハンサは、それらが連続していなくても、コード配列に動作的に連結される転写調節配列である。

融合ポリペプチドに関して言えば、「動作的に連結」という用語は、構成要素のそれぞれが、動作的に連結されていない場合に果たすであろう機能と同一の機能を、他の構成要素に連動して実行するという事実を指すことができる。例えば、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインが開裂ドメインに融合されている融合ポリペプチドに関して言えば、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインおよび開裂ドメインは、融合ポリペプチドにおいて、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメイン部分が、その標的部位および／またはその結合部位に結合することが可能であり、開裂ドメインが、標的部位の近傍でＤＮＡを開裂することが可能である場合に、動作的連結状態にある。

タンパク質、ポリペプチド、または核酸の「機能的断片」は、その配列が、完全長タンパク質、ポリペプチド、または核酸と同一ではないが、完全長タンパク質、ポリペプチド、または核酸と同一の機能を保持するタンパク質、ポリペプチド、または核酸である。機能的断片は、対応する天然分子より多い、少ない、または同数の残基を有することができ、および／または１つもしくは複数のアミノ酸またはヌクレオチド置換を含むことができる。核酸の機能（例えば、コード機能、別の核酸にハイブリダイズする能力）を判定するための方法は、当該技術において周知である。同様に、タンパク質の機能を判定するための方法は、周知である。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能は、例えば、フィルター結合アッセイ、電気泳動移動度のシフトアッセイ、または免疫沈降アッセイによって判定することができる。ＤＮＡ開裂は、ゲル電気泳動によって評価することができる。上記のＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，を参照されたい。別のタンパク質と相互作用するタンパク質の能力は、例えば、免疫共沈降、２ハイブリッドアッセイまたは相補性（遺伝子的または生化学的の両方）によって判定することができる。例えば、Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５〜２４６、米国特許第５，５８５，２４５号、およびＰＣＴ国際公開第ＷＯ９８／４４３５０号を参照されたい。

亜鉛フィンガーヌクレアーゼ
１つもしくは複数のラット遺伝子のゲノム編集（例えば、開裂、変異、不活性化、および／またはランダム変異）のために使用することができる、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を本明細書に説明する。ＺＦＮは、亜鉛フィンガータンパク質（ＺＦＰ）およびヌクレアーゼ（開裂）ドメイン（例えば、開裂ハーフドメイン）を含む。

Ａ．亜鉛フィンガータンパク質
亜鉛フィンガー結合ドメインは、選択される配列に結合するように改変することができる。例えば、Ｂｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５〜１４１、Ｐａｂｏ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３〜３４０、Ｉｓａｌａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６〜６６０、Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２〜６３７、Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１〜４１６を参照されたい。改変された亜鉛フィンガー結合ドメインは、天然に存在する亜鉛フィンガータンパク質と比較して、新規結合特異性を有することができる。改変方法は、合理的設計および種々の種類の選択を含むが、それらに限定されない。合理的設計は、例えば、三重項（または四重項）ヌクレオチド配列、および個々の亜鉛フィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを使用することを含み、各三重項または四重項ヌクレオチド配列は、特定の三重項または四重項配列を結合する、亜鉛フィンガーの１つもしくは複数のアミノ酸配列と会合する。例えば、参照することによってその全体が組み込まれる、共同所有の米国特許第６，４５３，２４２号および６，５３４，２６１号を参照されたい。

ファージ提示法および２ハイブリッドシステムを含む、例示的選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，４１０，２４８号、同第６，１４０，４６６号、同第６，２００，７５９号、および同第６，２４２，５６８号、ならびに、国際公開第ＷＯ９８／３７１８６号、同第ＷＯ９８／５３０５７号、同第ＷＯ００／２７８７８号、同第ＷＯ０１／８８１９７号、および英国特許第２，３３８，２３７号に開示されている。加えて、亜鉛フィンガー結合ドメインに対する結合特異性の向上は、例えば、共同所有の国際公開第０２／０７７２２７号に説明されている。

標的部位の選択；融合タンパク質（およびそれをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のためのＺＦＰおよび方法は、当業者に公知であり、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第２００５００６４４７４号および第２００６０１８８９８７号に詳細に説明されている。

加えて、これらおよび他の参考文献に開示する、亜鉛フィンガードメイン、および／または多フィンガーの亜鉛フィンガータンパク質は、例えば、５または複数のアミノ酸長のリンカー（例えば、ＴＧＥＫＰ（配列番号１）、ＴＧＧＱＲＰ（配列番号２）、ＴＧＱＫＰ（配列番号３）、および／またはＴＧＳＱＫＰ（配列番号４））を含む、任意の好適なリンカー配列を使用して、ともに連結され得る。また、６もしくは複数のアミノ酸長の例示的リンカー配列については、米国特許第６，４７９，６２６号、同第６，９０３，１８５号、および同第７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書に説明するタンパク質は、タンパク質の個々の亜鉛フィンガーの間の好適なリンカーの任意の組み合わせを含み得る。

下記に説明するように、ある実施形態では、４、５、６フィンガー結合ドメインは、例えば、ＦｏｋＩ等のＩＩ型制限エンドヌクレアーゼの開裂ドメイン等の開裂ハーフドメインに融合される。そのような亜鉛フィンガー／ヌクレアーゼハーフドメイン融合の１つもしくは複数の対は、例えば、米国特許公開第２００５００６４４７４号に開示される、標的開裂のために使用される。

標的開裂では、結合部位の近傍端は、５もしくは複数のヌクレオチド対によって分離することができ、融合タンパク質のそれぞれは、ＤＮＡ標的の反対側の鎖に結合することができる。すべての対合組み合わせ１は、ラット遺伝子の標的開裂のために使用することができる。本開示に従い、ＺＦＮは、ラットゲノム内の任意の配列を標的とすることができる。

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、植物病原菌のキサントモナスから得られるＴＡＬエフェクタからの改変ドメインである（Ｂｏｃｈ ｅｔ ａｌ，（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９ Ｏｃｔ ２００９（１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１７８８１）およびＭｏｓｃｏｕ ａｎｄ Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ，（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９ Ｏｃｔ ２００９（１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１７８８１７を参照）。

Ｂ．開裂ドメイン
ＺＦＮはまた、ヌクレアーゼ（開裂ドメイン、開裂ハーフドメイン）を含む。本明細書に開示する、融合タンパク質の開裂ドメイン部分は、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから取得することができる。開裂ドメインがそこから得ることができる例示的エンドヌクレアーゼは、制限エンドヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼを含むが、それらに限定されない。例えば、２００２−２００３ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ、およびＢｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５：３３７９〜３３８８を参照されたい。ＤＮＡを開裂する付加的な酵素は、公知である（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、膵ＤＮａｓｅ Ｉ、ミクロコッカスヌクレアーゼ、酵母菌ＨＯエンドヌクレアーゼ、Ｌｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ）Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９３も参照）。これらの酵素（またはその機能的断片）のうちの１つもしくは複数は、開裂ドメインおよび開裂ハーフドメインの源として使用することができる。

同様に、上記に説明するように、開裂ハーフドメインは、開裂活性のために二量体化を必要とする、任意のヌクレアーゼまたはその部分から得ることができる。一般に、融合タンパク質が開裂ハーフドメインを含む場合には、２つの融合タンパク質が開裂に必要とされる。代替的には、２つの開裂ハーフドメインを含む、単一のタンパク質を使用することができる。２つの開裂ハーフドメインは、同一のエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）から得ることができるか、または各開裂ハーフドメインは、異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）から得ることができる。加えて、２つの融合タンパク質のための標的部位は、それらの各標的部位への２つの融合タンパク質の結合が、互いに対して空間的配向に開裂ハーフドメインを定置し、例えば、二量体化することによって、開裂ハーフドメインに機能的開裂ドメインを形成させるように、互いに対して、好ましくは配置される。したがって、ある実施形態では、標的部位の近傍端は、５〜８個のヌクレオチドによって、または１５〜１８個のヌクレオチドによって分離される。しかしながら、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対は、２つの標的部位（例えば、２〜５０対もしくは複数のヌクレオチド）の間に介入することができる。一般に、開裂部位は、標的部位の間に位置する。

制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種に存在し、（認識部位において）ＤＮＡへの配列特異性結合、および結合部位において、またはその近傍でＤＮＡの開裂が可能である。ある制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から除去された部位でＤＮＡを開裂し、別個の結合および開裂ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素ＦｏｋＩは、一方の鎖上のその認識部位から９番目のヌクレオチド、および他方上のその認識部位から１３番目のヌクレオチドにおいて、ＤＮＡの二本鎖開裂を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号、同第５，４３６，１５０号、および同第５，４８７，９９４号、ならびに、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：４２７５〜４２７９、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：２７６４〜２７６８、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９４ａ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：８８３〜８８７、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９４ｂ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３１，９７８〜３１，９８２を参照されたい。したがって、一実施形態では、融合タンパク質は、改変され得るか、または改変され得ない、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素および１つもしくは複数の亜鉛フィンガー結合ドメインからの開裂ドメイン（または開裂ハーフドメイン）を含む。

その開裂ドメインが結合ドメインから分離される、例示的ＩＩＳ型制限酵素は、ＦｏｋＩである。この特定の酵素は、二量体として活性である（Ｂｉｔｉｎａｉｔｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：１０，５７０〜１０，５７５）。故に、本開示については、開示した融合タンパク質に使用するＦｏｋＩ酵素の部分は、開裂ハーフドメインと見なされる。したがって、亜鉛フィンガーとＦｏｋＩの融合物を使用する細胞配列の標的二本鎖開裂および／または標的置換では、ＦｏｋＩ開裂ハーフドメインをそれぞれ含む２つの融合タンパク質は、触媒的に活性開裂ドメインを再構成するために使用することができる。代替的には、亜鉛フィンガー結合ドメインおよび２つのＦｏｋＩ開裂ハーフドメインを含む、単一のポリペプチド分子もまた、使用することができる。亜鉛フィンガーとＦｏｋＩの融合物を使用する標的開裂および標的配列変異のためのパラメータを、本開示の他所において提供する。

開裂ドメインまたは開裂ハーフドメインは、開裂活性を保持する、または機能的開裂ドメインを形成するために多量体化（例えば、二量体化）する能力を保持するタンパク質の任意の部分である可能性がある。

例示的ＩＩＳ型制限酵素は、その全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ０７／０１４２７５号に説明されている。付加的な制限酵素はまた、分離可能な結合および開裂ドメインを含み、これらは、本開示によって検討される。例えば、Ｒｏｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：４１８〜４２０を参照されたい。

ある実施形態では、開裂ドメインは、例えば、米国特許公開第２００５００６４４７４号、同第２００６０１８８９８７号、および同第２００８０１３１９６２号に説明されるように、ホモ二量体化を最小限化する、または防止する１つもしくは複数の改変開裂ハーフドメイン（二量体ドメイン変異体とも称される）を含み、それらのすべての開示は、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。ＦｏｋＩの４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７、および５３８位におけるアミノ酸残基はすべて、ＦｏｋＩ開裂ハーフドメインの二量体化に影響を及ぼすための標的である。

偏性ヘテロ二量体を形成するＦｏｋＩの例示的改変開裂ハーフドメインは、一対（第１の開裂ハーフドメインが、ＦｏｋＩの４９０および５３８位でアミノ酸残基において突然変異を含み、第２の開裂ハーフドメインが、４８６および４９９位でアミノ酸残基において突然変異を含む）を含む。

したがって、一実施形態では、４９０における突然変異は、Ｇｌｕ（Ｅ）をＬｙｓ（Ｋ）で置換し、５３８における突然変異は、Ｉｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置換し、４８６における突然変異は、Ｇｌｎ（Ｑ）をＧｌｕ（Ｅ）で置換し、４９９位における突然変異は、Ｉｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置換する。具体的には、本明細書に説明する改変開裂ハーフドメインは、「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」指定の改変開裂ハーフドメインを産生するために、１つの開裂ハーフドメイン内の４９０位（Ｅ→Ｋ）および５３８位（Ｉ→Ｋ）を変異させることによって、および「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」指定の改変開裂ハーフドメインを産生するために、別の開裂ハーフドメイン内の４８６位（Ｑ→Ｅ）および４９９位（Ｉ→Ｌ）を変異させることによって調製された。本明細書に説明する改変開裂ハーフドメインは、異常な開裂が最小限化される、または廃止される、偏性へテロ二量体突然変異体である。例えば、米国特許公開第２００８／０１３１９６２号の実施例１を参照されたく、その開示は、すべての目的のために参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。

本明細書に説明する改変開裂ハーフドメインは、任意の好適な方法を使用して、例えば、米国特許公開第２００５００６４４７４号（第１０／９１２，９３２号、実施例５）および米国特許仮出願第６０／７２１，０５４号（実施例３８）に説明する、野生型開裂ハーフドメイン（ＦｏｋＩ）の部位特異的突然変異誘発法によって調製することができる。

Ｃ．ラットの標的開裂のための付加的方法
任意のラット遺伝子内に標的部位を有する任意のヌクレアーゼは、本明細書に開示する方法に使用することができる。例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼは、非常に長い認識配列を有し、そのうちのいくつかは、統計的基礎において、ヒトサイズのゲノム内に一度存在する可能性が高い。ラット遺伝子内に標的部位を有する任意のそのようなヌクレアーゼは、ラット遺伝子内の標的開裂のために、亜鉛フィンガーヌクレアーゼの代わりに、またはそれに加えて、使用することができる。

例示的ホーミングエンドヌクレアーゼは、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、およびＩ−ＴｅｖｅＩＩＩを含む。それらの認識配列は、公知である。また、米国特許第５，４２０，０３２号、米国特許第６，８３３，２５２号、Ｂｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５：３３７９〜３３８８、Ｄｕｊｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｇｅｎｅ ８２：１１５〜１１８、Ｐｅｒｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２２，１１２５〜１１２７、Ｊａｓｉｎ（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１２：２２４〜２２８、Ｇｉｍｂｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：１６３〜１８０、Ａｒｇａｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８０：３４５〜３５３、およびＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓカタログを参照されたい。

ホーミングエンドヌクレアーゼの大半の開裂特異性が、それらの認識部位に関して絶対的ではないが、部位は、哺乳類サイズのゲノム当たりの単一の開裂事象が、その認識部位の単一コピーを含む細胞内にホーミングエンドヌクレアーゼを発現させることによって取得することができる、十分な長さである。ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼの特異性が、天然に存在しない標的部位に結合するように改変することができることが報告されている。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ １０：８９５〜９０５、Ｅｐｉｎａｔ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．３１：２９５２〜２９６２、Ａｓｈｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４４１：６５６〜６５９、Ｐａｑｕｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：４９〜６６を参照されたい。

送達
本明細書に説明するＺＦＮは、例えば、ＺＦＮ ｍＲＮＡの注入を含む、任意の好適な手段によって、標的ラット細胞に送達し得る。Ｈａｍｍｅｒｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５９：８７〜１１５を参照されたい。

亜鉛フィンガーを含む、タンパク質を送達する方法は、米国特許第６，４５３，２４２号、同第６，５０３，７１７号、同第６，５３４，２６１号、同第６，５９９，６９２号、同第６，６０７，８８２号、同第６，６８９，５５８号、同第６，８２４，９７８号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号、および同第７，１６３，８２４号に説明されており、それらのすべての開示は、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。

本明細書に説明するＺＦＮはまた、１つもしくは複数のＺＦＮをコードする配列を含むベクターを使用して送達し得る。プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペルウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクター等を含むが、それらに限定されない、任意のベクターを使用し得る。また、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，５３４，２６１号、同第６，６０７，８８２号、同第６，８２４，９７８号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号、および同第７，１６３，８２４を参照されたい。さらに、これらのベクターのうちのいずれかが、１つもしくは複数のＺＦＮコード配列を含み得ることは、明らかであろう。したがって、１つもしくは複数の対のＺＦＮが細胞内に導入される時、ＺＦＮは、同一のベクター上、または異なるベクター上で移動し得る。複数のベクターが使用される時、各ベクターは、１つまたは複数のＺＦＮをコードする配列を含み得る。

従来のウイルスまたは非ウイルスベースの遺伝子移動方法は、ラット細胞内に改変ＺＦＰをコードする核酸を導入するために使用することができる。そのような方法はまた、ＺＦＰをコードする核酸をラット細胞にインビトロ投与するために使用することができる。ある実施形態では、ＺＦＰをコードする核酸は、インビボまたはエクスビボ使用のために投与される。

非ウイルスベクター送達システムは、エレクトロポレーション、リポフェクション、微量注入、バイオリスティックス、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオンまたは脂質−核酸複合体、ネイキッドＤＮＡ、人工ウイルス粒子、およびＤＮＡの薬剤強化摂取を含む。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ ２０００システム（Ｒｉｃｈ−Ｍａｒ）を使用する、ソノポレーションはまた、核酸の送達のために使用することができる。ウイルスベクター送達システムは、細胞への送達後にエピソームゲノムまたは組み込まれたゲノムのいずれかを有する、ＤＮＡおよびＲＮＡウイルスを含む。付加的な例示的核酸送達システムは、Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）、ＢＴＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ，から提供される核酸送達システムを含む（例えば、米国特許第６００８３３６号を参照）。

リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、米国特許第４，９４６，７８７号、および米国特許第４，８９７，３５５号に説明されており、リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの有効な受容体認識リポフェクションに好適なカチオン性および中性脂肪は、Ｆｅｌｇｎｅｒ、国際公開第ＷＯ９１／１７４２４号、第ＷＯ９１／１６０２４号のものを含む。送達は、細胞（エクスビボ投与）または標的組織（インビボ投与）に行われる可能性がある。免疫脂質複合体等の標的リポソームを含む脂質−核酸複合体の調整は、当業者に周知である（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４〜４１０（１９９５）、Ｂｌａｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２９１〜２９７（１９９５）、Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：３８２〜３８９（１９９４）、Ｒｅｍｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：６４７〜６５４（１９９４）、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０〜７２２（１９９５）、Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：４８１７〜４８２０（１９９２）、米国特許第４，１８６，１８３号、同第４，２１７，３４４号、同第４，２３５，８７１号、同第４，２６１，９７５号、同第４，４８５，０５４号、同第４，５０１，７２８号、同第４，７７４，０８５号、同第４，８３７，０２８号、および同第４，９４６，７８７号を参照）。

上記に記載するように、開示した方法および組成物は、任意の種類のラット細胞において使用することができる。ラット細胞の子孫、変異体、および誘導体もまた、使用することができる。

用途
開示した方法および組成物は、任意のラット遺伝子または複数の遺伝子のゲノム編集のために使用することができる。ある用途では、方法および組成物は、ラットゲノム配列の不活性化のために使用することができる。別の用途では、方法および組成物は、未編集遺伝子またはヒト化ラット遺伝子の組み込みと比較して、異なる発現を有する遺伝子の新規対立形質の生成を含むランダム変異の生成を可能にし、順に、動物モデルの生成を可能にする。他の用途では、方法および組成物は、これらの遺伝子の新規対立形質を持つ動物の特定または選択を可能にする、遺伝子の画定された位置においてランダム変異を作製するために使用することができる。別の用途では、方法および組成物は、ラットゲノムの任意の選択した領域内への外因性（ドナー）配列の標的組み込みを可能にする。調節配列（例えば、プロモータ）は、対象部位において、標的とした方法で組み込むことができる。「組み込み」とは、物理的挿入（宿主細胞のゲノム内）および、加えて、核酸複製過程を介する宿主細胞ゲノム内へのドナー配列のコピーによる組み込みの両方を意味する。ドナー配列はまた、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等の核酸を含むことができる。

これらの小さい核酸ドナーは、ラットゲノム内の対象遺伝子に及ぼすそれらの効果を研究するために使用することができる。ラット遺伝子のゲノム編集（例えば、不活性化、組み込み、および／または標的またはランダム変異）は、例えば、単一開裂事象によって、開裂後の非相同末端連結によって、開裂後の相同指向修復機構によって、開裂後のドナー配列の物理的組み込みによって、２つの開裂部位の間の配列を削除するように、２つの部位における開裂後の連結によって、コード領域内へのミスセンスまたはノンセンスコドンの標的組換えによって、遺伝子または調節領域を妨害するように、遺伝子またはその調整領域内への不適切な配列（すなわち、「スタッファー」配列）の標的組換えによって、または、転写物のミススプライシングをもたらすために、イントロン内へのスプライス受容体配列の標的組換えによって、達成することができる。米国特許第２００３０２３２４１０号、同第２００５０２０８４８９号、同第２００５００２６１５７号、同第２００５００６４４７４号、同第２００６０１８８９８７号、同第２００６００６３２３１号、および国際公開第ＷＯ０７／０１４２７５号を参照されたく、それらの開示は、すべての目的のために参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。

ラットのＺＦＮ媒介ゲノム編集のための種々の用途が存在する。本明細書に説明する方法および組成物は、ヒト疾患のラットモデルの生成を可能にする。例えば、ｐ５３遺伝子の編集は、癌を研究し、癌療法を試験するための動物モデルを提供する、「癌ラット」の生成を可能にする。

実施例
実施例１：ＺＦＮは、ラットＣ６細胞において標的破壊を誘発する
実質的に、Ｕｒｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ４３５（７０４２）：６４６〜６５１に説明するように、ラットｐ５３を標的としたＺＦＮを設計し、プラスミド内に組み込んだ。代表的なラットｐ５３設計のための認識へリックスを下記の表１に示す。これらのＺＦＮのための標的部位を表２に示す。

ＺＦＮコードプラスミドをラットＣ６細胞内にトランスフェクトした。ｐ５３遺伝子座におけるＺＦＮ活性を判定するために、ＣＥＬ−Ｉミスマッチアッセイを、製造者の指示（Ｔｒａｎｇｅｎｏｍｉｃ ＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標））により実質的に実施した。細胞を採取し、製造者（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅの指示（登録商標）に従い、Ｑｕｉｃｋｅｘｔｒａｃｔ（商標）キットを使用して染色体ＤＮＡを調製した。Ａｃｃｕｐｒｉｍｅ（商標）高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ｐ５３遺伝子座の適切な領域をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ反応物を９４℃まで加熱し、室温まで徐々に冷却した。約２００ｎｇのアニールされたＤＮＡを、０．３３μＬのＣＥＬ−Ｉ酵素で混合し、４２℃で２０分間、培養した。１Ｘトリス−ホウ酸塩−ＥＤＴＡ緩衝液中で、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、反応生成物を分析した。

結果を図１に示し、表１および２に説明する種々の対のｐ５３特異性ＺＦＮを組み合わせて試験した。ミスマッチの割合、ＮＨＥＪ活性の測定を、各列の下部に示す。結果は、これらのＺＦＮがこのラットの遺伝子座に対して活性であることを示す。

実質的に、Ｕｒｎｏ ｅｔ ａｌ．（２００５） Ｎａｔｕｒｅ ４３５（７０４２）：６４６〜６５１に説明するように、ＧＦＰを標的としたＺＦＮを設計し、プラスミド内に組み込んだ。ＺＦＮ対を、「Ｒａｐｉｄ ｉｎ ｖｉｖｏ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ａｃｔｉｖｅ Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ」と題する米国特許第１２／２８４，８８７号に説明される、酵母菌ベースの染色体システム内の活性に対してスクリーニングした。簡潔に言うと、ガラクトース誘導可能なＺＦＮを、ＰＧＫプロモータによって駆動されたＭＥＬ１遺伝子の２つの重複する断片の間に挿入された完全なｅＧＦＰ配列から成る、組み込まれた一本鎖アニーリング（ｙＳＳＡ）レポーターを含む、酵母菌株内に形質転換した。ＺＦＮの発現を、６時間、誘発し、次いで、１８時間、抑制し、その時間の後に、上清内のＭＥＬ１タンパク質の量を定量化するために、標準比色アッセイを使用した。
代表的なＧＦＰ亜鉛フィンガー設計のための認識ヘリックスを下記の表３に示す。

ＧＦＰ亜鉛フィンガー設計のための標的部位を下記の表４に示す。ＺＦＰ認識ヘリックスによって接触させられる標的部位内のヌクレオチドを大文字で示し、未接触のヌクレオチドを小文字で示す。

活性ＧＦＰ標的ＺＦＮ発現コンストラクトを、ＧＦＰ発現コンストラクトを含むラットＣ６細胞内にトランスフェクトした。

図２に示すように、試験したすべてのＺＦＮ対は、標的細胞内のＧＦＰ遺伝子を開裂した。

実施例２：ＺＦＮは、トランスジェニックラットにおいて標的破壊を誘発する
実施例１に説明する、ＧＦＰ特異性ＺＦＮをまた、さまざまな濃度で、前核注入（ＰＮＩ）または（ＺＦＮ ｍＲＮＡの）細胞質注入によって、Ｍｉｃｈａｌｋｉｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｐｈｙｓ．Ｓｏｃｉｅｔｙ ２９３：Ｈ８８１−Ｈ８９４に説明される、ＧＦＰを発現するトランスジェニックラットから取得した１つの細胞胚内に導入した（図３を参照）。

注入された胚を、それらが、２〜４細胞段階に到達するまで２〜３日間培養した。次いで、２〜４個の細胞胚のうちのいくつかを、偽妊娠したメスにトランスフェクトした。ＤＮＡを、培養した胚および移動させられた胚の両方から抽出し、ＧＦＰ遺伝子の開裂を評価した。

異なるモードの注入および、ＺＦＮ対１６８５９／１６８６０を使用して注入された胚中に注入されたＺＦＮの濃度の結果を下記の表５に示す。

ＺＦＮ ｍＲＮＡの細胞質注入のＧＦＰ画像は、さらに多くのＺＦＮ含有胚が、未注入胚よりもＧＦＰを発現できなかったことを示し、ＺＦＮが活性であった細胞中に、モザイク現象が存在しなかったことを示唆する。

５匹の子ラットは、偽妊娠したメスへ移動させられた胚中へのＺＦＮの前核注入（ＰＮＩ）から誕生した（表５を参照）。図４Ａに示すように、５匹の子ラットのうちの３匹は、ＧＦＰを発現したが、２匹は、発現しなかった。

ゲノムＤＮＡを、２匹のＧＦＰ陰性動物の尾部から調製し、ＰＣＲを介して修飾をスクリーニングした。野生型ｅＧＦＰ遺伝子座と比較した時、ＺＦＮ５９／６０対によって標的とされた部位を境界する領域は、有意に減少され、両方のＧＦＰ陰性動物において、約１５０ｂｐの欠失を示唆する。再度、野生型ｅＧＦＰバンドの欠如によって示されるように、モザイク現象は、尾部生体検査において認められなかった。次いで、これらの欠失を、配列決定することによって直接分析し、それは、１６２ｎｔおよび１５６ｎｔの欠失を明らかにし、図４Ｂに認められるより小さいバンドをもたらした。さらに、図４Ｂに示すように、モザイク現象は、野生型ｅＧＦＰバンドが検出されなかったため、ＧＦＰ陰性子ラットにおいて認められなかった。

したがって、ＺＦＮは、染色体ＧＦＰトランス遺伝子の修飾に成功した。

実施例３：ＺＦＮは、内因性ラット遺伝子座を開裂する
下記に説明するように、ＺＦＮを、内因性遺伝子座を開裂するように設計した。

Ａ．ＩｇＭ
１つの実験では、上記に説明するように、ＺＦＮを、内因性ラットＩｇＭ遺伝子を開裂するように設計し、ラットＣ６細胞中の開裂活性を試験した。例示的ラットＩｇＭ標的ＺＦＰを下記の表６に示す。

ラットＩｇＭ標的亜鉛フィンガー設計の標的部位を下記の表７に示す。ＺＦＰ認識ヘリックスによって接触させられる標的部位におけるヌクレオチドを大文字で示し、未接触のヌクレオチドを小文字で示す。

すべてのＩｇＭ標的ＺＦＮは、米国特許公開第２００８／０１３１９６２号に説明される、ＥＬ／ＫＫ ＦｏｋＩ突然変異を含んだ。ＺＦＮ発現は、ＣＡＧまたはＣＭＶプロモータのいずれかによって駆動された。ＺＦＮ（各１μｇ）を、溶液ＳＦを使用したＡｍａｘａ ヌクレオフェクション、およびＡｍａｘａ Ｓｈｕｔｔｌｅ９６ウェルヌクレオフェクターを介して、２００，０００個のＣ６細胞中にトランスフェクトした。ＧＪＣ１５３Ｆ（５′−ｇｇａｇｇｃａａｇａａｇａｔｇｇａｔｔｃ−３′）、およびＧＪＣ１５４Ｒ（５′−ｇａａｔｃｇｇｃａｃａｔｇｃａｇａｔｃｔ−３′）を使用して、ＩｇＭ遺伝子座をＰＣＲ増幅し、例えば、米国特許公開第２００８００１５１６４号、同第２００８０１３１９６２号、および同第２００８０１５９９９６号に説明される、Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（商標）ヌクレアーゼでＺＦＮ開裂を分析した。

Ｃ６細胞では、ＺＦＮ対１７７４７／１７７４９は、ＣＭＶプロモータが使用された時に、３％の染色体を開裂し、ＣＡＧプロモータが使用された時に、約１％を開裂した（図４）。このＺＦＮ対は、エクソン１のコード領域内のラットＩｇＭ遺伝子を開裂した。標準技術を使用したＣＡＧプロモータの制御下で、ラットの卵母細胞を、１０ｎｇ／μＬのＺＦＮ対１７７４７／１７７４９をコードするプラスミドを用いて注入した。卵母細胞を受精させ、偽妊娠したメスに移植した。注入され、移植された４３０個の卵母細胞のうち、４３個の生児出生がもたらされた。ゲノムＤＮＡを、これらの４３匹の動物の尾部から調製し、Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（商標）ヌクレアーゼを使用して、修飾をスクリーニングした。

図７に示すように、４３匹の動物のうちの５匹（ラット＃６、７、８、１９、および４６）は、ＩｇＭ遺伝子座における修飾に対して陽性が記録された。Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（商標）ヌクレアーゼ消化のパターンは、野生型ラットゲノムＤＮＡの追加の存在または不在の両方で同一であり、すべてのラットは、ホモ接合変異を有さないことを示唆した。

陽性のラットからのＧＪＣ１５３Ｆ／ＧＪＣ１５４Ｒ ＰＣＲ産物をクローン化し、配列決定した。変異した対立遺伝子の説明を表８に示す。

これらのラットにおけるＩｇＭの配列決定は、Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（商標）ヌクレアーゼアッセイの結果を裏付けた。すべての欠失は、ＺＦＮ結合部位に重複する。ここで見られる小欠失のスペクトルは、ＮＨＥＪ媒介変異の典型である。ラット７および８は、１つ以上の変異対立遺伝子を有し、したがって、ＩｇＭ変異のためのモザイクである。ラット６、１９、および４６の配列決定が、１つの変異対立遺伝子のみを与えたが、それらは、他の組織において、ＩｇＭ修飾のためのモザイクであり得る。

したがって、ＺＦＮは、内因性ラットＩｇＭ遺伝子座の修飾に成功した。

ＺＦＮプラスミド自体がラットゲノム中に組み込まれたか否かを判定するために、ＰＣＲベースのアッセイが、ＺＦＮプラスミド組込みを試験するために開発された。簡潔に言うと、ラットゲノムＤＮＡおよびＺＦＮプラスミドを、ゲノム当たり１回のプラスミド挿入頻度を模倣するように混合した。ＣＡＧプロモータ内の１つのオリゴ（５′−ＧＣＴ ＡＡＣ ＣＡＴ ＧＴＴ ＣＡＴ ＧＣＣ ＴＴＣ−３′）（配列番号４９）、およびプラスミドの２Ａ領域内の別のオリゴ（５′−ＣＡＴ ＣＣＴ ＡＧＧ ＧＣＣ ＧＧＧ ＡＴＴ ＣＴＣ−３′）とのこの混合物の３５サイクルのＰＣＲ増幅を実施することによって、１３３８ｂｐのバンドが与えられた（図７、列３）。野生型および５匹のＺＦＮ修飾ラットからのゲノムＤＮＡが分析された時に、ＰＣＲ産物は、検出可能ではなく、ラットゲノム中へのプラスミドの挿入が、高頻度事象ではないことを示唆した。

加えて、ＩｇＭ修飾ラット＃１９をさらに、ＣＥＬ−Ｉアッセイおよび配列決定によって分析した。図７Ａおよび７Ｂに示すように、ＩｇＭＺＦＮは、ＩｇＭ遺伝子座において、このラットの６４塩基対の欠失を産生した。

最終的に、非対象部位において開裂されたＺＦＮをまた、評価した。非対象部位である可能性が最も高い位置を予測するために、コンピュータアルゴリズムを使用した（Ｄｏｙｏｎ ｅｔ ａｌ（２００８）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６（６）：７０２〜７０８）。非対象部位である可能性が高いものすべてを、上述のＳｕｒｖｅｙｏｒ（商標）ヌクレアーゼアッセイを使用して、ＺＦＮ修飾のために分析した。この分析の結果を表９および図９Ａ〜Ｃに示す。

Ｍｍ：意図した標的部位に対するミスマッチ
断片Ａ、Ｂ：Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（商標）ヌクレアーゼ開裂産物の期待寸法
ヒット：正確なＳｕｒｖｅｙｏｒ（商標）ヌクレアーゼ開裂産物を示すラット

示すように、試験した非対象部位は、修飾の証拠を示さなかった。部位１における、図９に示すＣＥＬ−Ｉ陽性ラット＃１９、および図１１に示すその子孫のうちの５匹の配列決定分析は、ＣＥＬ−Ｉ陽性信号が、潜在的な非対象部位近傍のＳＮＰによるものであったことを明らかにした。ミスマッチは、未治療ラットにおいても見られた（データを示さず）このＳＮＰに対して、ラットがヘテロ接合体であるために生じる。ＣＥＬ−Ｉ陽性動物の５０％の染色体に存在するが、ＳＮＰは、ＣＥＬ−Ｉ酵素によって認識されにくく、予想外に低強度の開裂産物をもたらす。

Ｂ．Ｒａｂ３８
ＺＦＮもまた、ラットの内因性Ｒａｂ３８遺伝子座、特に、ラットＲａｂ３８遺伝子のエクソン１を標的とするように設計した。例示的なＲａｂ３８亜鉛フィンガー設計を下記の表８に示す。

ラットＲａｂ３８標的亜鉛フィンガー設計の標的部位を下記の表１１に示す。ＺＦＰ認識ヘリックスによって接触させられる標的部位におけるヌクレオチドを大文字で示し、未接触のヌクレオチドを小文字で示す。

すべてのＲａｂ３８標的ＺＦＮは、米国特許公開第２００８／０１３１９６２号に説明される、ＥＬ／ＫＫ ＦｏｋＩ変異を含んだ。ＺＦＮ発現を、ＣＡＧまたはＣＭＶプロモータのいずれかによって駆動した。ＺＦＮ（各１μｇ）を、溶液ＳＦを使用したＡｍａｘａヌクレオフェクション、およびＡｍａｘａ Ｓｈｕｔｔｌｅ９６ウェルヌクレオファクターを介して、２００，０００個のＣ６細胞中にトランスフェクトした。例えば、米国特許公開第２００８００１５１６４号、第２００８０１３１９６２号、および第２００８０１５９９９６号に説明される、ＣＥＬ−Ｉ Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（商標）ヌクレアーゼで開裂を分析した。

Ｒａｂ３８ＺＦＮコード発現プラスミドを、ＸｂａＩ、抽出され、沈殿されたフェノールクロロホルムで線状化した。メッセンジャーＲＮＡを、ＭｅｓｓａｇｅＭａｘ（商標）Ｔ７ ＡＲＣＡ−Ｃａｐｐｅｄ Ｍｅｓｓａｇｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、インビトロで転写した。得られた合成を、ＲＮＡｓｅのない０．１Ｘ ＴＥ（１ｍＭ トリス−Ｃｌ ｐＨ８．０、０．１ｍＭのＥＤＴＡ）中で再懸濁する前に、ＭｅｇａＣｌｅａｒ Ｋｉｔ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して精製し、Ｎａｎｏ Ｄｒｏｐ−１０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量化し、使用するまで−８０℃で保管した。Ｒａｂ３８ＺＦＮをコードするメッセンジャーＲＮＡを、０．１Ｘ ＴＥ中で、５ｎｇ／μＬの最終総濃度まで混合した。胚を、一定の時間および圧力（Ｐｉ＝６５、Ｐｃ＝２０、ｔｉ＝１．５秒）下で、Ｒａｂ３８ＺＦＮで、細胞質中に注入し、分子分析のためのＦｉｌｉｐｉａｋ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．１５：６７３〜６８６に先述されるように、一晩、ＫＳＯＭ（ミリポア）中で３７．５℃および５％のＣＯ２で培養した。

注入後４８時間培養された胚から抽出されたＤＮＡの染色体において、Ｒａｂ３８標的エクソンの変異を検出するために、Ｌｌｏｙｄ ｅｔ ａｌ（（２００５）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ１０２：２２３２〜２２３７）に説明される、変異濃縮戦略を使用した。

図１０に示し、上記のＧＦＰおよびＩｇＭ遺伝子座の両方で証明するように、複数の突然変異Ｒａｂ３８対立遺伝子は、１６個の２細胞胚ほど少ないゲノムにおいて検出することが可能であり、配列決定は、標的部位における欠失を明らかにした。

したがって、これらのデータは、複数のゲノム遺伝子座がＺＦＮ媒介ゲノム編集の好適な標的であることを裏付ける。

実施例４：ＺＦＮ媒介生殖細胞系列修飾
実施例３に説明する、ＩｇＭ修飾ラット＃１９、＃４６、および＃８を野生型ラットと交配させ、尾部生体検査を実施し、ゲノムＤＮＡを単離し、次いで、ＣＥＬ−ＩおよびＰＣＲアッセイを、子ラットから精製された核酸上で実施した。

図１１Ａおよび１１Ｃに示すように、ラット＃１９と野生型ラットとの間の異種交配から得られた子ラット（２２５、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３４、および２３５で番号付け）は、ＰＣＲおよびＣＥＬ−Ｉアッセイで判定されるように、ＩｇＭ修飾された親ラット＃１９の６４塩基対欠失を保持していた。加えて、配列決定分析は、ラット＃１９の３匹の子ラット（子ラット＃２２５、２２７、および２２８）が、ＩｇＭ遺伝子座において修飾されたことを裏付けた（図１１Ｂを参照）。さらに、図１１Ｃに示すように、ラット＃４６の野生型ラットとの交配によって得られた子ラットは、親ラット＃４６と同一のＩｇＭ修飾を保持していた（図１１Ｃの子ラット番号２３６を参照）。

これらのデータは、ラット遺伝子座のＺＦＮ媒介破壊が生殖細胞系列において伝播されることを証明する。

実施例５：ラットゲノムのＰＸＲ核酸領域内への標的組込みのための制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）ドナー核酸の構築
標的ＺＦＮ誘発二本鎖切断後の２つのＤＮＡ修復結果の可能性が存在する（図１２）。切断は、塩基欠失または追加を含む、変異につながる、非相同末端連結（ＮＨＥＪ）によって修復され得るか、または、ドナーＤＮＡの存在下で、ドナーＤＮＡは、相同組換え（ＨＲ）による二本鎖切断を修復するためのテンプレートとして使用することができる。ドナーＤＮＡが、特異的配列変化をコードする場合には、これらの故意の変異は、標的部位において、有機体のゲノム中に組み込まれる。

前核注入を使用して、ラットゲノム中の標的組込みを試験するために、コンストラクトを、ラットゲノムのＰＣＲ遺伝子領域中への標的組込みのために設計し、調製した。コンストラクトを、ＮｏｔＩまたはＰｍｅＩ制限断片酵素長多型（ＲＦＬＰ）部位のいずれかをＰＸＲ遺伝子領域内に導入するように組立てた（図１３）。コンストラクトを、導入されるＲＦＬＰ部位に隣接する、ＰＸＲ遺伝子標的部位に対して配列相同性の２００、８００または２０００塩基対のいずれかで設計した。相同性領域の３つの寸法を使用して、有効な標的および相同組換えに必要とされる相同性の寸法を判定した。

クローンを、ＰＣＲ増幅を使用して組立て、クローン化のための適当な制限部位、およびＰＸＲ相同性領域の端部におけるＲＦＬＰ部位を導入した（図１２）。相同ＰＸＲ領域を増幅するために使用したＰＣＲプライマーを表１２に説明する。アキュプライムＨＦ ＤＮＡポリメラーゼをＰＣＲ反応物増幅に使用した。３０秒のエクステンションを２００ｂｐ断片に使用し、１．５分のエクステンションを８００ｂｐ断片に使用し、４分のエクステンションを２Ｋｂｐ断片に使用した。次いで、ＰＣＲ断片を、適切な制限酵素で消化させ、表１３に記載する６つのプラスミドを産生するための３工程の連結反応を使用して、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔへクローン化した。

実施例６：ラットゲノムのｒＲｏｓａ２６核酸領域内への標的組込みのための、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）ドナー核酸の構築
プラスミドもまた、ラットゲノムのｒＲｏｓａ２６核酸領域内へのＮｏｔＩおよびＰｍｅＩ ＲＦＬＰ部位の組込みを標的とするように構築した。プラスミドの設計および構築は、上記の実施例５に説明するとおりであった。相同性ｒＲｏｓａ２６領域を増幅するために使用したＰＣＲプライマー対を表１４に説明する。

実施例７：マウスまたはラットゲノムのＭｄｒ１ａ核酸領域内への標的組込みのための制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）ドナー核酸の構築
プラスミドを、マウスゲノムのｍＭｄｒ１ａ核酸領域、またはラットゲノムのｒＭｄｒ１ａ核酸領域内へのＮｏｔＩおよびＰｍｅＩ ＲＦＬＰ部位の組込みを標的とするために構築した。プラスミドの設計および構築は、上記の実施例５に説明するとおりであった。相同性Ｍｄｒ１ａ領域を増幅するために使用したＰＣＲプライマー対を表１５および１６に説明する。「ｍ」は、マウスを表し、「ｒ」は、ラットを表す。

実施例８：ＧＦＰ発現組込みカセットの構築
ＲＦＬＰよりも大きい核酸断片の標的組込みを試験するために、コンストラクトを、ラットのＰＸＲおよびｒＲｏｓａ２６核酸ゲノム領域、およびマウスのｍＭｄｒ１ａ核酸ゲノム領域内へのＧＦＰ発現カセットの標的組込みのために設計し、調製した。簡潔に言うと、ヒトＰＧＫプロモータ、ＧＦＰオープンリーディングフレーム、およびポリアデニル化信号を含む、ＧＦＰ発現カセットを、以下のプライマー（ＰＧＫＧＦＰ−Ｆ−ＮｏｔＩ（５′−ａａａｇｃｇｇｃｃｇｃｔｔｇｇｇｇｔｔｇｃｇｃｃｔｔｔｔｃｃ）（配列番号１６４）およびＰＧＫＧＦＰ−Ｒ ＮｏｔＩ（５′−ａａａａｇｃｇｇｃｃｇｃｃａｔａｇａｇｃｃｃａｃｃｇｃａｔｃ）（配列番号１６５））を使用して、端部においてＮｏｔＩ制限部位を導入するために（図１４）、ＰＣＲを使用して増幅した。次いで、ＰＣＲ断片を、実施例５〜７において構築したＮｏｔＩ含有プラスミドへクローン化した。

実施例９：標的組込みのための亜鉛フィンガーｍＲＮＡの調製
Ｓｉｇｍａ社のウェブサイトに説明されるように、一対の亜鉛フィンガーヌクレアーゼを各標的組込み部位のために設計し、クローン化した。さらなる情報は、参照することによって本明細書に組み込まれる、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００９）３２５：４３３を参照されたい。次いで、まず、３７℃で２時間の間、１０μＬの緩衝液２（ＮＥＢ、＃Ｂ７００２Ｓ）、１０μＬの１０ＸのＢＳＡ（１００ＸのＢＳＡから希釈、ＮＥＢ、＃Ｂ９００１Ｓ）、８μＬのＸｂａＩ（ＮＥＢ、＃Ｒ０１４５Ｓ）を含む、１００μＬの反応物中の２０μｇの各マキシプレップされたＺＦＮ発現プラスミドＤＮＡを消化させることによって、ＺＦＮ発現ｍＲＮＡをインビトロで産生した。反応物を、１００μＬのフェノール／クロロホルム（Ｓｉｇｍａ、Ｐ２０６９）で抽出し、１０分間、２０，０００Ｘｇにわたって遠心分離した。水性上清を、１０μＬの３Ｍ ＮａＯＡｃ（Ｓｉｇｍａ、Ｓ７８９９）および２５０μＬの１００％エタノールで沈殿させ、２５分間、室温で、最高速度で遠心分離した。得られた沈殿物を、０．０２μＭのフィルターを介してろ過した、３００μＬの７０％エタノールを追加することによって洗浄した。沈殿物を乾燥させ、２０μＬの０．０２μＭでろ過された０．１ｘＴＥ中で再懸濁した。

次いで、説明するように、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＭｅｓｓａｇｅＭａｘ Ｔ７ Ｃａｐｐｅｄ Ｍｅｓｓａｇｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（＃ＭＭＡ６０７１０）を使用したインビトロ転写を使用して、ＺＦＮ転写物を産生するために、精製された消化ＤＮＡを使用した。要するに、キットコンポーネントは、室温に予熱され、２０μＬの反応物のための反応物コンポーネントを、室温で、以下の順序（５μＬの０．０２μｍでろ過されたＲＮａｓｅを含まない水、１μＬの調製されたテンプレート、２μＬのｌｏｘ転写緩衝液、８μＬの２ウェイキャップ／ＮＴＰプリミックス、２μＬの１００ｍＭ ＤＴＴおよび２μＬのＭｅｓｓａｇｅＭａｘ Ｔ７酵素溶液）で混合した。次いで、反応物を、３０分間、３７℃のインキュベータ内で培養した。

次いで、説明するように、キャップＲＮＡを、Ａ−Ｐｌｕｓ Ｐｏｌｙ（Ａ）Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｔａｉｌｉｎｇ ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、＃ＰＡＰ５ １０４Ｈ）を使用して、ポリＡでテールした。反応物構成要素を、室温で、以下の所与の順序（５５．５μＬの０．０２ｕｍでろ過されたＲＮａｓｅを含まない水、１０μＬの１０Ｘ Ａ−Ｐｌｕｓ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ、１０μＬの１０ｍＭのＡＴＰ、２．５μＬのＳｃｒｉｐｔＧｕａｒｄ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（４０ユニット／μＬ）、２０μＬのインビトロ転写キャッピング反応物、２μＬのＡ−ｐｌｕｓ Ｐｏｌｙ ポリＡポリメラーゼ）で混合した。次いで、反応物を、３０分間、３７℃で培養した。得られたキャップポリＡテールされたｍＲＮＡを、２度の等容量の５Ｍ ＮＨ₄Ｏａｃでの沈殿により精製した。次いで、ｍＲＮＡ沈殿物を、空気乾燥させ、３０μＬのろ過された注入緩衝液（１ｍＭのトリス、ｐＨ７．４、０．２５ｍＭのＥＤＴＡ）中で再懸濁し、ナノドロップ分光高度計を使用して、ＲＮＡ濃度を測定した。

実施例１０：胚への標的組込み
ラットまたはマウスゲノム中に核酸を組み込むために、亜鉛フィンガーヌクレアーゼｍＲＮＡを、０．０２ｕｍのフィルターでろ過した、マキシプレップされた標的ＤＮＡで混合した。核酸混合物は、１部のＺＦＮ ｍＲＮＡから一部のドナーＤＮＡを含んだ。次いで、公知の方法を使用して、核酸混合物を単細胞胚前核中に微量注入した。注入された胚を、インビトロで培養するか、または偽母親に移動させた。一回に生産された動物の得られた胚／胎児、または足指／尾を、ＤＮＡ抽出および分析のために採取した。

ＤＮＡを抽出するために、組織を、３０分間、５０℃で、１００μＬのＥｐｉｃｅｎｔｒｅのＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ中で溶解した後、１０分間、６５℃で、および３分間、９８℃度で培養した。標的組込みが生じたか否かを判定するために、適切なプライマーを使用して標的領域を増幅するために、ＰＣＲを使用した。ＲＦＬＰが動物のゲノムに組み込まれた実験では、組込みを検出するために、ＰＣＲ産物を導入したＲＦＬＰ酵素で消化した（図１５Ａ）。加えて、野生型ＰＣＲ断片および注入された胚から得られたＰＣＲ断片を使用する、Ｃｅｌ−Ｉエンドヌクレアーゼアッセイを使用し、独立した標的組込みであるＮＨＥＪを検出することによって、ＺＦＮ ｍＲＮＡが胚中で機能的であったことを示した。ＧＦＰが動物のゲノム中に組み込まれた実験では、ＰＣＲ断片の寸法の変化は、組込みを示す（図１５Ｂ）。代替的には、ドナー配列の組込みを評価するために、１つのプライマーがＧＦＰカセット上のみに着地する、組込みジャンクションの増幅を使用した。

実施例１１：マウスゲノム中のｍＭｄｒ１ａ標的部位のＤＮＡ抽出およびＰＣＲ増幅の試験
組織から抽出された標的核酸を増幅するためのＰＣＲ条件を、実施例１０に説明するように、抽出された１〜６４の細胞を有する胚を使用して試験した。５０μＬの反応物中の最大５μＬのＥｐｉｃｅｎｔｅｒのＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ溶液を含む、反応物中での６０℃で４分間のエクステンションを有する、３６増幅サイクルを使用して、マウスｍＭｄｒ１ａ標的領域を含む、９００ｂｐ断片を増幅した（図１６）。これらの結果は、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔがＰＣＲ増幅に干渉せず、ＤＮＡが １〜１０個の細胞のみから抽出されたサンプルから増幅することができることを示す。感度を向上するために、ＰＣＲサイクルの数を増加し得るか、またはネスト化されたＰＣＲ反応を実施し得る。

実施例１２：ラットＰＸＲゲノム領域へのＮｏｔＩドナーＲＦＬＰの組込み
上述のように、ラットゲノムのＰＸＲ領域内へＮｏｔＩ ＲＦＬＰ部位を組み込むためのドナープラスミド（８００ｂｐのアームを有する）を、ＺＦＮ ｍＲＮＡを有するラット胚中に注入した。多くの胚から抽出されたＤＮＡを使用して、ＰＣＲ後に、ＮｏｔＩ制限酵素分析、およびＣｅｌ−Ｉエンドヌクレアーゼ分析を実施した。ＰＣＲ増幅は、多くの胚で成功し（図１７Ａ）、Ｃｅｌ−Ｉエンドヌクレアーゼ分析は、断片の大半が、所望の標的において核酸配列変化を有したことを明らかにした（図１７Ｂ）。

実施例１３：マウスｍＭｄｒ１ａゲノム領域へのＮｏｔＩドナーＲＦＬＰの組込み
実施例８に説明するように、マウスｍＭｄｒ１ａ領域へのＮｏｔＩ ＲＦＬＰの標的組込みを反復した。ｍＭｄｒ１ａ領域を、ＰＣＲを使用して増幅し、ＮｏｔＩで消化した。ＰＣＲ増幅は、多くの胚で成功し（図１８）、ＮｏｔＩでの消化は、多くの胚が組み込まれたＲＦＬＰ部位を含んだことを明らかにした（例えば、列１３、１７、１９、２０、および２３を参照）。全部で、３２個の胚のうちの７個において標的組込みが発生した。

これらの結果は、ＰＣＲ反応産物をさらに洗浄した後に、ＮｏｔＩ消化反応を反復することによって裏付けられた（図１９）。

実施例１４：ラットゲノム中のＰＸＲ標的部位のＤＮＡ抽出およびＰＣＲ増幅の試験
感度レベルを判定するために、胚盤胞からのＰＸＲ領域のＰＣＲ増幅を試験した。ＰＣＲ反応物は、５０μＬの反応物に対して、５μＬのテンプレート、５μＬのＰＣＲ緩衝液、５μＬの各プライマー、０．５μＬのＴａｑポリメラーゼ酵素、および３３．５μＬの水を含んだ。テンプレートは、ラット胚盤胞から抽出された不希釈ＤＮＡ、または１：２、１：６、１：１０、および１：３０の比率で希釈されたＤＮＡを含んだ（図２０）。

実施例１５：ラットＰＸＲゲノム領域へのＮｏｔＩドナーＲＦＬＰの組込み
上述のように、ラットゲノムのＰＸＲ領域へＮｏｔＩ ＲＦＬＰ部位を組み込むためのドナープラスミド（８００ｂｐの相同性アームを有する）を、ＺＦＮ ｍＲＮＡを有するラット胚中に注入した。合計１２３個の胚を注入し、１０６個が生存した。毒性を試験するために、減少した濃度の核酸を注入した。２日目に、５ｎｇの核酸を注入された５１個の胚のうちの１７個が生存し、２細胞期胚に分割した。２日目に、２ｎｇの核酸を注入された２３個の胚のうちの１４個が生存し、２細胞期胚に分割した。２日目に、１０ｎｇの核酸を注入された２９個の胚のうちの１２個が生存し、２細胞期胚に分割した。２日目に、１０個の未注入の対照胚のうちのすべてが生存し、２細胞期胚に分割した。

ＰＸＲ領域のＰＣＲ増幅の後に、ＮｏｔＩおよびＣｅｌ−Ｉエンドヌクレアーゼ分析を、多くの胚から抽出したＤＮＡを使用して実施した。ＰＣＲ増幅は、多くの胚で成功し、ＮｏｔＩおよびＣｅｌ−Ｉエンドヌクレアーゼ分析は、４７個の胚のうちの１８個が、所望標的において、核酸配列変化を有したことを明らかにした（図２１）。

実施例１６：胎児のマウスゲノムのｍＭｄｒ１ａ標的領域へのＲＦＬＰの標的組込み
上述のように、マウスゲノムのｍＭｄｒ１ａ領域にＮｏｔＩを導入するためのドナープラスミド（８００ｂｐの相同性アームを有する）を、ＺＦＮ ｍＲＮＡを有するマウス胚中に注入した。１２．５ｄｐｃにおいて、４匹の十分に発達した胎児のうちの１匹は、ＮｏｔＩ部位に対して陽性であった。すべての４つの脱落膜は、陰性であった（図２２）。

実施例１７：胎児のｍＭｄｒ１ａ遺伝子座へのＧＦＰの標的組込み
上述のように、マウスゲノムのｍＭｄｒ１ａ領域にＧＦＰカセットを導入するためのドナープラスミド（８００ｂｐの相同性アームを有する）を、ＺＦＮ ｍＲＮＡを有するマウス胚中に注入した。１２．５ｄｐｃにおいて、４０匹の胎児のうちの２匹は、ＧＦＰカセットに対して陽性であった（図２３）。

実施例１８：胎児のラットゲノムのＰＸＲ標的領域へのＲＦＬＰの標的組込み
上述のように、ラットゲノムのＰＸＲ領域にＮｏｔＩを導入するためのドナープラスミド（８００ｂｐの相同性アームを有する）を、ＺＦＮ ｍＲＮＡを有するマウス胚中に注入した。１３ｄｐｃにおいて、８匹の胎児のうちの１匹は、ＮｏｔＩ部位に対して陽性であった（図２４）。

本明細書に言及したすべての特許、特許出願、および刊行物は、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。

より明確な理解を目的として、例証および実施例によって開示を一部詳細に提供するが、本開示の精神または範囲から逸脱することなく、種々の変更および修正を実施することができることは、当業者には明らかであろう。故に、前述の説明および実施例は、制限するものと解釈されてはならない。
明細書の開示の概要
〔項１〕
ラット細胞の１つもしくは複数の内因性細胞遺伝子を修飾するための方法であって、
１つもしくは複数の亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）が発現し、かつ前記１つもしくは複数の内因性細胞遺伝子が開裂し、修飾されるような条件下で、前記１つもしくは複数の遺伝子内の標的部位に結合する、１つもしくは複数のＺＦＮをコードする、１つもしくは複数のポリヌクレオチドを前記ラット細胞内に導入すること、
を含む、方法。
〔項２〕
前記修飾は、前記１つもしくは複数の内因性細胞遺伝子の開裂によって刺激された相同組換えによって、外因性配列をラット細胞のゲノム内に導入することを含む、項１に記載の方法。
〔項３〕
前記外因性配列は、前記ゲノム内に物理的に組み込まれる、項２に記載の方法。
〔項４〕
前記外因性配列は、核酸複製過程を介して、宿主細胞ゲノムへの前記外因性配列のコピーによって、前記ゲノム内に組み込まれる、項２に記載の方法。
〔項５〕
前記核酸複製過程は、二本鎖切断の相同指向修復を含む、項４に記載の方法。
〔項６〕
前記核酸複製過程は、非相同依存性標的組み込みを含む、項４に記載の方法。
〔項７〕
前記修飾は、開裂後の非相同末端連結から生じる、項１に記載の方法。
〔項８〕
第１および第２の亜鉛フィンガーヌクレアーゼは、２つの部位において前記ゲノムを開裂し、さらに、前記非相同末端連結は、前記第１の開裂部位と第２の開裂部位との間に欠失をもたらす、項７に記載の方法。
〔項９〕
前記亜鉛フィンガーヌクレアーゼは、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの開裂ドメインまたは開裂ハーフドメインを含む、項１〜８のうちのいずれか一項に記載の方法。
〔項１０〕
ラットの１つもしくは複数の標的遺伝子の生殖細胞系列の破壊のための方法であって、前記方法は、ラット胚の１つもしくは複数の細胞のゲノム内の１つもしくは複数の遺伝子配列を修飾することを含み、
項１〜９のうちのいずれか一項に記載の方法に従い、ラット胚の１つもしくは複数の細胞内の前記標的遺伝子のうちの１つもしくは複数を修飾することと、
前記ラット胚を発達させることと、を含み、前記修飾された遺伝子配列が、前記性成熟ラットの配偶子の少なくとも一部分内に存在する、
方法。
〔項１１〕
対象のラット遺伝子座に１つもしくは複数の遺伝性変異対立遺伝子を作製する方法であって、
項１〜９のうちのいずれか一項に記載の方法によって、ラット胚の１つもしくは複数の細胞のゲノム内の１つもしくは複数の遺伝子座を修飾することと、
前記ラット胚を性成熟期に成長させることと、
前記性成熟ラットが子孫を産生させることと、を含み、前記子孫のうちの少なくとも数匹は、前記変異対立遺伝子を含む、
方法。
〔項１２〕
項１〜１１のうちのいずれか一項に記載の方法によって産生された、１つもしくは複数の修飾された対立遺伝子を含む、ラット。

Claims (12)

1. ラット細胞の１つもしくは複数の内因性細胞性遺伝子を修飾するための方法であって、
   亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ZFN）が内因性IgM遺伝子を開裂させる条件下で、ラット細胞中に、内因性IgM遺伝子中の標的部位に結合する第１及び第２の亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ZFN）をコードする１又は複数のポリヌクレオチドを導入し、これにより前記内因性IgM遺伝子が修飾され、
   ここで、前記亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ZFN）は開裂ドメイン及び亜鉛フィンガー蛋白質を含んで成り、当該亜鉛フィンガー蛋白質は、４個、５個又は６個の亜鉛フィンガードメインを有し、これ等の亜鉛フィンガードメインは、次の記載の名称を有しそして次の記載の順序で存在し：４個の亜鉛フィンガードメインを有する蛋白質についてはF1〜F4、５個の亜鉛フィンガードメインを有する蛋白質についてはF1〜F5、そして６個の亜鉛フィンガードメインを有する蛋白質についてはF1〜F6であり、ここで各亜鉛フィンガードメインはDNAに結合する認識へリックスを含んで成り、そして前記亜鉛フィンガー蛋白質は、前記亜鉛フィンガー認識へリックス中に下記のアミノ酸配列を含む蛋白質から成る群から選択される：
   (i) F1： DRSHLTR （配列番号：41）；
   F2： RSDALTQ （配列番号：40）；
   F3： DRSDLSR （配列番号：28）；
   F4： RSDALAR （配列番号：39）；
   F5： RSDSLSA （配列番号：38）；及び
   F6： TSSNRKT （配列番号：37）；
   
   (ii) F1： NKVGLIE （配列番号：46）；
   F2： TSSDLSR （配列番号：45）；
   F3： RSDHLSR （配列番号：44）；
   F4： RSDNLSE （配列番号：43）；及び
   F5： QNAHRKT （配列番号：42）；
   
   (iii) F1： DRSALSR （配列番号：51）；
   F2： TSGHLSR （配列番号：52）；
   F3： RSDNLST （配列番号：53）；
   F4： HNATRIN （配列番号：54）；
   F5： DRSALSR （配列番号：51）；及び
   F6： QSGNLAR （配列番号：21）；
   
   (iv) F1： RSANLAR （配列番号：56）；
   F2： RSDNLRE （配列番号：57）；
   F3： TSGSLSR （配列番号：58）；
   F4： QSGSLTR （配列番号：59）；
   F5： RSDVLSE （配列番号：60）；及び
   F6： TSGSLTR （配列番号：25）；
   
   (v) F1： QSSDLSR （配列番号：61）；
   F2： RSDALAR （配列番号：39）；
   F3： TSGHLSR （配列番号：52）；
   F4： RSDALSR （配列番号：39）；及び
   F5： DRSDLSR （配列番号：28）；
   
   (vi) F1： RSDALAR （配列番号：39）；
   F2： RSDHLST （配列番号：62）；
   F3： HSNARKN （配列番号：63）；
   F4： DRSDLSR （配列番号：28）；及び
   F5： TSGHLSR （配列番号：52）；
   
   (vii) F1： RSANLSV （配列番号：30）；
   F2： DRANLSR （配列番号：29）；
   F3： RSDALAR （配列番号：39）；
   F4： DRSDLSR （配列番号：28）；及び
   F5： RSDDLTR （配列番号：16）；或いは
   
   (viii) F1： RSAHLSR （配列番号：5）；
   F2： QSGDLTR （配列番号：64）；
   F3： RSDALAR （配列番号：39）；
   F4： RSDTLSV （配列番号：65）；及び
   F5： DNSTRIK （配列番号：66）；
   ことを特徴とする方法。
2. 前記修飾は、前記１つもしくは複数の内因性細胞遺伝子の開裂によって刺激された相同組換えによって、外因性配列をラット細胞のゲノム内に導入することを含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記外因性配列は、前記ゲノム内に物理的に組み込まれる、請求項２に記載の方法。
4. 前記外因性配列は、核酸複製過程を介して、宿主細胞ゲノムへの前記外因性配列のコピーによって、前記ゲノム内に組み込まれる、請求項２に記載の方法。
5. 前記核酸複製過程は、二本鎖切断の相同指向修復を含む、請求項４に記載の方法。
6. 前記核酸複製過程は、非相同依存性標的組み込みを含む、請求項４に記載の方法。
7. 前記修飾は、開裂後の非相同末端連結から生じる、請求項１に記載の方法。
8. 第１および第２の亜鉛フィンガーヌクレアーゼは、２つの部位において前記ゲノムを開裂し、さらに、前記非相同末端連結は、前記第１の開裂部位と第２の開裂部位との間に欠失をもたらす、請求項７に記載の方法。
9. 前記亜鉛フィンガーヌクレアーゼは、IIS型制限エンドヌクレアーゼの開裂ドメインまたは開裂ハーフドメインを含む、請求項１〜８のうちのいずれか一項に記載の方法。
10. ラットの１つもしくは複数の標的遺伝子の生殖細胞系列の破壊のための方法であって、前記方法は、ラット胚の１つもしくは複数の細胞のゲノム内の１つもしくは複数の遺伝子配列を修飾することを含み、
    請求項１〜９のうちのいずれか一項に記載の方法に従い、ラット胚の１つもしくは複数の細胞内の前記標的遺伝子のうちの１つもしくは複数を修飾することと、
    前記ラット胚を発達させることと、を含み、前記修飾された遺伝子配列が、前記性成熟ラットの配偶子の少なくとも一部分内に存在する、
    方法。
11. 対象のラット遺伝子座に１つもしくは複数の遺伝性変異対立遺伝子を作製する方法であって、
    請求項１〜９のうちのいずれか一項に記載の方法によって、ラット胚の１つもしくは複数の細胞のゲノム内の１つもしくは複数の遺伝子座を修飾することと、
    前記ラット胚を性成熟期に成長させることと、
    前記性成熟ラットが子孫を産生させることと、を含み、前記子孫のうちの少なくとも数匹は、前記変異対立遺伝子を含む、
    方法。
12. 請求項１〜11のうちのいずれか一項に記載の方法によって産生された、１つもしくは複数の修飾された対立遺伝子を含む、ラット。

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