BR122022024742B1 - Proteína de fusão, composição, kit, bem como métodos para clivar in vitro um ou mais genes rosa em uma célula de rato ou camundongo, para introduzir in vitro uma sequência de polinucleotídeo exógena no genoma de uma célula e para modificar in vitro uma sequência de genes rosa no genoma de célula - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a métodos e a composições para edição de genoma de um lócus Rosa, usando proteínas de fusão compreendendo uma proteína dedo de zinco e um domínio de clivagem ou meio-domínio de clivagem. Polinucleotídeos que codificam as referidas proteínas de fusão também são fornecidos, como são células compreendendo os referidos polinucleotídeos e proteínas de fusão.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] O presente pedido reivindica o benefício do pedido provisório US 61/343.287, depositado em 26 de abril de 2010, cuja revelação é aqui incorporada por referência em sua totalidade.

DECLARAÇÃO DE DIREITOS A INVENÇÕES FEITAS SOB PESQUISA PATROCINADA PELO GOVERNO FEDERAL

[002] Não aplicável.

CAMPO TÉCNICO

[003] A presente revelação é nos campos da engenharia de genoma, incluindo inserções/interrupções de genes somáticos e hereditários, alterações genômicas, geração de alelos carregando mutações aleatórias e/ou inserção dos transgenes em um lócus Rosa.

ANTECEDENTES

[004] Produtos do gene Rosa são expressos de forma ubíqua em todas as fases de desenvolvimento. Como tal, esse lócus tem sido amplamente utilizado para expressar sequências endógenas de promotores endógenos ou introduzidos e para criar camundongos transgênicos, por exemplo, de células-tronco embrionárias. Veja, por exemplo, Strathdee et al. (2006) PLoS ONE, Issue 1, e4; Nyabi et al. (2009) Nucl. Acids. Res. 37:e55.

[005] No entanto, os métodos convencionais de inserção alvo podem exigir complicado conjunto de vetores de destino. Assim, ainda há a necessidade de métodos de inserção direcionada em e/ou modificação do gene Rosa em um modo direcionado. Clivagem específica de sítio precisamente direcionada de loci genômicos oferece um suplemento eficiente e/ou alternativa para recombinação homóloga convencional. A criação de uma quebra de fita dupla (DSB) aumenta a frequência de recombinação homóloga no lócus direcionado mais do que 1000 vezes. Mais simplesmente, a reparação imprecisa de um DSB específico de sítio por união de extremidade não homóloga (NHEJ) também pode resultar em rompimento do gene. A criação de duas ditas DSBs resulta em deleção de regiões grandes arbitrariamente. As preferências de reconhecimento de DNA modular da proteína de dedos de zinco permitem o projeto racional de proteínas de ligação ao DNA multi-dedos sítio-específicas. A fusão do domínio de nuclease da enzima de restrição Fok I do Tipo II para proteínas dedo de zinco sítio- específicas permite a criação de nucleases sítio-específicas. Ver, por exemplo, Publicações de patente US 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060188987; 20060063231; 20070134796; 2008015164; 20080131962; 2008015996 e Publicação internacional WOs 07/014275 e 2008/133938, todas descrevendo o uso de nucleases dedos de zinco e que são incorporadas em suas totalidades para todos os propósitos.

SUMÁRIO

[006] São reveladas aqui composições e métodos para inserção de alvo em um lócus de gene Rosa. As composições e os métodos descritos neste documento podem ser usados para edição de genoma, incluindo, entre outros: clivagem de um ou mais genes em uma célula animal, resultando em alteração direcionada (mutações de inserção, deleção e/ou substituição) em um ou mais genes, incluindo a incorporação dessas alterações direcionadas em linhagem germinativa; introdução direcionada de ácidos nucleicos não endógenos, a inativação completa ou parcial de um ou mais genes em um animal; métodos de indução de reparo dirigido por homologia, geração de animais transgênicos (por exemplo, roedores) e/ou geração de mutações aleatórias que codificam novas formas alélicas de genes de animais.

[007] Em um aspecto, é aqui descrita uma proteína dedo de zinco (ZFP) que se liga ao local de destino em um gene Rosa em um genoma (por exemplo, um genoma de roedor), em que a ZFP compreende um ou mais domínios de ligação de dedo de zinco projetados. Em uma modalidade, a ZFP é uma nuclease dedo de zinco (ZFN) que cliva uma região genômica alvo de interesse, em que o ZFN compreende um ou mais domínios projetados de ligação do dedo do zinco e um domínio de clivagem de nuclease ou meio domínio de clivagem. Domínios de clivagem e meios domínios de clivagem podem ser obtidos, por exemplo, várias endonucleases de restrição e/ou alojamento de endonucleases. Em uma modalidade, os meios domínios de clivagem são derivados de uma endonuclease de restrição do tipo IIS (por exemplo, Fok I). Em certas modalidades, o domínio do dedo do zinco reconhece um sítio de destino em um gene Rosa, por exemplo, Rosa26.

[008] A ZFN pode ligar e/ou clivar um gene Rosa dentro da região codificante do gene ou em uma sequência não codificante dentro ou adjacente ao gene, como, por exemplo, uma sequência líder, sequência trailer ou íntron, ou dentro de uma região não transcrita, a montante ou a jusante da região codificante.

[009] Em outro aspecto, são aqui descritas composições compreendendo uma ou mais de nucleases dedos de zinco aqui descritas. Em cercas modalidades, a composição compreende uma ou mais nucleases dedos de zinco em combinação com um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0010] Em outro aspecto, é aqui descrito um polinucleotídeo que codifica uma ou mais ZFNs aqui descritas. O polinucleotídeo pode ser, por exemplo, o mRNA.

[0011] Em outro aspecto, é aqui descrito um vetor de expressão ZFN compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma ou mais ZFNs aqui descritas, operacionalmente ligadas a um promotor.

[0012] Em outro aspecto, é aqui descrita uma célula hospedeira compreendendo um ou mais vetores de expressão de ZFN como descrito aqui. A célula hospedeira pode ser transformada de forma estável ou transitoriamente transfectada ou uma combinação do mesmo com um ou mais vetores de expressão ZFP. Em uma modalidade, a célula hospedeira é uma célula-tronco embrionária. Em outras modalidades, os um ou mais vetores de expressão ZFP expressam uma ou mais ZFNs na célula hospedeira. Em outra modalidade, a célula hospedeira ainda pode incluir uma sequência doadora de polinucleotídeo exógena. Em qualquer uma das modalidades, descritas aqui, a célula hospedeira pode compreender uma célula embrionária, por exemplo, uma ou mais célula embrionária de camundongo, coelho ou outro mamífero.

[0013] Em outro aspecto, é descrito aqui um método para clivar um ou mais genes Rosa em uma célula, o método compreendendo: (a) introduzir, na célula, um ou mais polinucleotídeos que codificam uma ou mais ZFNs que se ligam a um sítio alvo um ou mais genes em condições tais que a(s) ZFN(s) é(são) expressa(s) e o um ou mais genes são clivados.

[0014] Ainda em outro aspecto, é aqui descrito um método para a introdução de uma sequência exógena no genoma de uma célula, o método compreendendo as etapas de: (a) introduzir, na célula, um ou mais polinucleotídeos que codificam uma ou mais ZFNs que se ligam a um sítio alvo em um gene Rosa em condições tais que o ZFN(s) é (são) expresso(s) e um ou mais genes são clivados; e (b) contatar a célula com um polinucleotídeo exógeno; dita clivagem dos genes estimula a integração de polinucleotídeo exógeno no genoma por recombinação homóloga. Em certas modalidades, o polinucleotídeo exógeno é integrado fisicamente no genoma. Em outras modalidades, o polinucleotídeo exógeno é integrado ao genoma copiando da sequência exógena no genoma da célula host através de processos de replicação de ácido nucleico (por exemplo, reparo direcionado por homologia da quebra de fita dupla). Ainda em outras modalidades, a integração no genoma ocorre por meio da integração direcionada dependente de não homologia (por exemplo "captura de extremidade"). Em certas modalidades, as uma ou mais nucleases são fusões entre o domínio de clivagem de uma endonuclease de restrição do tipo IIS e um domínio projetado de ligação do dedo de zinco. Em certas modalidades, a sequência exógena é integrada em gene Rosa de um mamífero pequeno (por exemplo, coelho ou roedor como camundongo, rato, etc.).

[0015] Em outra modalidade, é aqui descrito um método para modificar um ou mais sequências de gene Rosa no genoma da célula, o método compreendendo (a) fornecer uma célula compreendendo uma ou mais sequências Rosa; e (b) expressar primeira e segunda nucleases dedos de zinco (ZFNs) na célula, em que a primeira ZFN cliva em um sítio de clivagem e a segunda ZFN cliva em um segundo sítio de clivagem, em que a sequência do gene está localizada entre o primeiro sítio de clivagem e o segundo local de clivagem, em que a clivagem de primeiro e segundo sítios de clivagem resulta na modificação da sequência do gene por ligação de extremidade não homóloga e/ou reparo direcionado por homologia. Opcionalmente, a clivagem resulta na inserção de uma sequência exógena (transgene) também introduzida na célula. Em outras modalidades, a união de extremidade não homóloga resulta em uma deleção entre os primeiro e segundo sítios de clivagem. O tamanho da deleção da sequência do gene é determinado pela distância entre os primeiro e segundo sítios de clivagem. Nesse sentido, as deleções de qualquer tamanho, em qualquer região genômica de interesse, podem ser obtidas. As deleções de 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000 pares de nucleotídeos, ou qualquer valor integral de pares de nucleotídeos dentro desta faixa, podem ser obtidas. Além disso, deleções de uma sequência de qualquer valor integral de pares de nucleotídeos maiores que 1.000 pares de nucleotídeos podem ser obtidos usando os métodos e as composições revelados aqui.

[0016] Métodos para modificar um gene Rosa endógeno como descrito aqui podem ser usados para criar modelos de doença animal (por exemplo, humano), por exemplo, inativando (parcial ou totalmente) um gene ou criando mutações aleatórias em posições definidas de genes que permitem a identificação ou seleção de animais transgênicos (por exemplo, ratos, coelhos ou camundongos) conduzido novas formas alélicas daqueles genes, por inserção de genes humanizados (para estudar, por meio de exemplo não limitante, metabolismo de fármaco) ou por inserção de alelos mutantes para avaliar, por exemplo, o afeto fenótipo de dito alelo mutante.

[0017] Ainda em outro aspecto, é descrito aqui um método para romper germinativo de um ou mais genes alvos Rosa, o método compreendendo modificar uma ou mais sequências Rosa no genoma de uma ou mais células de um embrião por qualquer um dos métodos descritos aqui e permitindo que o embrião se desenvolva, em que as sequências de gene modificadas estão presentes em pelo menos uma parte de gametas do animal maduro sexualmente. Em certas modalidades, o animal é um mamífero pequeno, como um roedor ou coelho.

[0018] Em outro aspecto, é descrito aqui um método de criar um ou mais alelos mutantes hereditários em pelo menos um lócus Rosa de interesse, o método compreendendo modificar um ou mais loci Rosa no genoma de uma ou mais células de um embrião de animal por qualquer um dos métodos descritos aqui; levando o embrião até a maturidade sexual; e permitindo que o animal sexualmente maduro produza descendentes; em que pelo menos alguns dos descendentes compreendem os alelos mutantes. Em certas modalidades, o animal é um mamífero pequeno, por exemplo um coelho ou roedor como rato, um camundongo, ou uma cobaia.

[0019] Em qualquer um dos métodos descritos neste documento, o polinucleotídeo que codifica a(s) nuclease(s) de dedo do zinco pode compreender DNA, RNA ou suas combinações. Em certas modalidades, o polinucleotídeo compreende um plasmídeo. Em outras modalidades, o polinucleotídeo que codifica a nucleasse compreende mRNA.

[0020] Ainda em outro aspecto, é aqui apresentado um método de integração específica de sítio de uma sequência de ácido nucleico em um lócus Rosa de um cromossoma. Em certas modalidades, o método compreende: (a) injetar um embrião com (i) pelo menos um vetor de DNA, em que o vetor de DNA compreende uma sequência a montante e uma sequência a jusante flanqueando a sequência de ácido nucleico a ser integrada, e (ii) pelo menos uma molécula de RNA que codifica uma nuclease dedo de zinco que reconhece o sítio de integração no lócus Rosa, e (b) cultivar o embrião para permitir a expressão da nuclease dedo de zinco, em que uma quebra de fita dupla introduzida no sítio de integração por nuclease dedo de zinco é reparada, através de recombinação homóloga com o vetor DNA, de modo a integrar a sequência de ácido nucleico no cromossomo.

[0021] Embriões apropriados podem ser derivados de várias espécies de vertebrados, incluindo mamíferos, aves, répteis, anfíbios e espécies de peixes. Em geral, um embrião apropriado é um embrião que pode ser coletado, injetado e cultivado para permitir a expressão de uma nuclease dedo de zinco. Em algumas modalidades, embriões apropriados podem incluir embriões de mamíferos pequenos (por exemplo, roedores, coelhos, etc.), animais de companhia, animais de pecuária e primatas. Exemplos não limitantes de roedores podem incluir camundongos, ratos, hamsters, gerbis e cobaias. Exemplos não limitantes de animais de companhia podem incluir gatos, cães, coelhos, ouriços e furões. Exemplos não limitantes de animais de pecuária podem incluir cavalos, caprinos, ovinos, suínos, lhamas, alpacas e gado. Exemplos não limitantes de primatas podem incluir macacos- prego, os chimpanzés, lêmures, macacos, saguis, micos, macacos- aranha, macacos-esquilo e macacos vervet. Em outras modalidades, embriões apropriados podem incluir embriões de peixes, répteis, anfíbios e aves. Como alternativa, os embriões apropriados podem ser embriões de insetos, por exemplo, um embrião de Drosophila ou um embrião de mosquito.

[0022] Também é fornecido um embrião compreendendo pelo menos um vetor de DNA, em que o vetor do DNA compreende uma sequência a montante e sequência a jusante flanqueando a sequência do ácido nucleico a ser integrada, e pelo menos uma molécula de RNA que codifica uma nuclease dedo de zinco que reconhece o sítio cromossômico de integração. Organismos derivados de qualquer um dos embriões como aqui descritos são também fornecidos.

[0023] Um kit, compreendendo as ZFPs da invenção, também é fornecido. O kit pode compreender ácidos nucleicos que codificam ZFPs, (por exemplo moléculas de RNA ou genes que codifica ZFP contidos em um vetor de expressão apropriado), moléculas doadoras, linhagens de células hospedeiras apropriadas, instruções para a realização de métodos de invenção e semelhantes.

Breve Descrição dos Desenhos

[0024] A figura 1 representa um Southern blot demonstrando os resultados do reparo NHEJ após clivagem do lócus rosa26 de rato como ensaiado pelo ensaio de incompatibilidade SurveyorTM (Transgenomic). "G" indica reações onde as células foram transfectadas com GFP ZFNs, e as pistas numeradas indicam pares específicos de ZFN. As setas indicam pistas onde NHEJ ocorreu.

[0025] A figura 2 representa a inserção de nucleotídeos doadores direcionados a Rosa em DNA genômico de camundongo.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0026] São descritos aqui composições e métodos para edição genômica em (por exemplo, em mamíferos pequenos como camundongos, ratos ou coelhos) (por exemplo, clivagem de genes; alteração de genes, por exemplo por clivagem seguida por inserção (inserção física ou inserção por replicação através de reparo direcionada por homologia) de uma sequência exógena e/ou clivagem seguida por união de extremidade não homóloga (NHEJ); inativação parcial ou completa de um ou mais genes; geração de alelos com mutações aleatórias para criar expressão de genes endógenos; etc.) e alterações do genoma que são conduzidas na linhagem germinativa. São também revelados métodos para produzir e utilizar estas composições (reagentes), por exemplo, para editar (alterar) um ou mais genes em uma célula de animal alvo (por exemplo, pequenos mamíferos). Assim, os métodos e composições aqui descritos fornecem métodos altamente eficientes para a alteração do gene direcionada (por exemplo, knock-in) e/ou knockout (parcial ou completa) de um ou mais genes e/ou por mutação aleatória da sequência de qualquer alvo alelo, e, portanto, permitir a geração de modelos animais de doenças humanas.

[0027] As composições e métodos aqui descritos fornecem rápida, completa e permanente rompimento direcionado de loci endógenos em animais, sem a necessidade de seleção e/ou triagem de trabalho intensivo e com um mínimo de efeitos fora do alvo. Knockouts de genes inteiros de origem animal podem também ser facilmente gerados em uma única etapa por injeção de RNAm ZFN ou cassetes de expressão ZFN.

Geral

[0028] A prática dos métodos, bem como a preparação e utilização das composições aqui reveladas empregam, a menos que indicado em contrário, técnicas convencionais de biologia molecular, bioquímica, a estrutura da cromatina e análise química computacional, cultura de células, DNA recombinante, e campos relacionados como estão dentro da capacidade do especialista na técnica. Estas técnicas são explicadas inteiramente na literatura. Ver, por exemplo, Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 and Third edition, 2001; Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987 and periodic updates; the series METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, "Chromatin" (P.M. Wassarman and A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999; e METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, "Chromatin Protocols" (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999.

Definições

[0029] Os termos "ácido nucleico," "polinucleotídeo," e "oligonucleotídeo" são usados de modo intercambiável e referem-se a um desoxirribonucleotídeo ou polímero ribonucleotídeo, em conformação linear ou circular, e na forma de fita simples ou fita dupla. Para os fins da presente revelação, estes termos não devem ser considerados como limitativos no que diz respeito ao comprimento de um polímero. Os termos podem incluir análogos conhecidos de nucleotídeos naturais, bem como os nucleotídeos que são modificados nas frações de base, açúcar e/ou fosfato (por exemplo, estruturas de fosforotioato). Em geral, um análogo de um nucleotídeo particular tem a mesma especificidade de emparelhamento de bases; ou seja, um análogo de A gerará par de base com T.

[0030] Os termos "polipeptídeo," "peptídeo" e "proteína" são usados de modo intercambiável para referir-se a um polímero de resíduos de aminoácido. O termo também se aplica a polímeros de aminoácidos em que um ou mais aminoácidos são análogos químicos ou derivados modificados de aminoácidos de ocorrência natural correspondente.

[0031] "Ligação" refere-se a uma interação específica de sequência, não covalente entre macromoléculas (por exemplo, entre uma proteína e um ácido nucleico). Nem todos os componentes de uma interação de ligação precisam ser específicos de sequência (por exemplo, os contatos com os resíduos de fosfato de uma estrutura de DNA), desde que a interação como um todo seja específica da sequência. Tais interações são geralmente caracterizados por uma constante de dissociação (Kd) de 10-6 M-1 ou inferior. "Afinidade" refere- se à força de ligação: afinidade de ligação aumentada estando correlacionada com um Kd inferior.

[0032] Uma "proteína de ligação" é uma proteína que é capaz de se ligar não covalentemente a outra molécula. Uma proteína de ligação pode ligar-se a, por exemplo, uma molécula de DNA (uma proteína de ligação ao DNA), uma molécula de RNA (uma proteína de ligação a RNA) e/ou uma molécula de proteína (proteína de ligação a proteínas). No caso de uma proteína de ligação a proteínas, que pode ligar-se a si mesma (para formar homodímeros, homotrímeros, etc.) e/ou pode ligar- se a uma ou mais moléculas de uma proteína ou proteínas diferentes. A proteína de ligação pode ter mais do que um tipo de atividade de ligação. Por exemplo, proteínas dedo de zinco têm atividade de ligação a DNA, ligação a RNA e atividade de ligação à proteína.

[0033] Uma "proteína dedo de zinco de ligação ao DNA" (ou domínio de ligação) é uma proteína dentro de uma proteína maior, que se liga a uma proteína maior, que se liga a DNA em um modo específico de sequência através de um ou mais dedos de zinco, que são regiões de sequência de aminoácido dentro do domínio de ligação cuja estrutura é estabilizada através da coordenação de um íon de zinco. O termo proteína de ligação ao DNA dedo de zinco é frequentemente abreviado como proteína dedo de zinco ou ZFP.

[0034] Domínios de ligação dedo de zinco podem ser "projetados" para ligar uma sequência de nucleotídeo predeterminada. Exemplos não limitantes dos métodos para proteínas dedo de zinco projetadas são projetados e selecionados. Uma proteína dedo de zinco projetada é uma proteína que não ocorre em natureza cujo desenho/composição resulta principalmente de critério racional. Critérios racionais para o projeto incluem a aplicação de regras de substituição e algoritmos computadorizados para processamento de informações em um banco de dados de armazenamento de informações de projetos de ZFP existentes e dados de ligação. Ver, por exemplo, Patentes US 6.140.081; 6.453.242; e 6.534.261; ver ainda WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 e WO 03/016496.

[0035] Uma proteína dedo de zinco "selecionada" é uma proteína em natureza cuja produção resulta principalmente a partir de um processo empírico como display de fago, armadilha de interação ou seleção híbrida. Ver, por exemplo, US 5.789.538; US 5.925.523; US 6.007.988; US 6.013.453; US 6.200.759; WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970 WO 01/88197 e WO 02/099084.

[0036] O termo "sequência" refere-se a uma sequência de nucleotídeo de qualquer comprimento, que pode ser DNA ou RNA; pode ser linear, circular ou ramificado e pode ser fita simples ou fita dupla. O termo "sequência doadora" refere-se a uma sequência de nucleotídeo que é inserido em um genoma. Uma sequência doadora pode ser qualquer comprimento, por exemplo, entre 2 e 10.000 nucleotídeos em comprimento (ou qualquer valor inteiro entre estes ou acima destes), preferencialmente entre 100 e 1.000 nucleotídeos em comprimento (ou qualquer inteiro entre estes), mais preferencialmente entre cerca de 200 e 500 nucleotídeos em comprimento.

[0037] Uma "sequência não idêntica homóloga" refere-se a uma primeira sequência que compartilha um grau de identidade de sequência com uma segunda sequência, mas cuja sequência não é idêntica àquela da segunda sequência. Por exemplo, um polinucleotídeo que compreende a sequência tipo selvagem de um gene mutante é homólogo e não idêntico à sequência do gene mutante. Em certas modalidades, o grau de homologia entre as duas sequências é suficiente para permitir a recombinação homóloga entre as mesmas, utilizando mecanismos celulares normais. Duas sequências homólogas não idênticas podem ser de qualquer comprimento e o seu grau de não homologia pode ser tão pequeno como um único nucleotídeo (por exemplo, para a correção de uma mutação pontual do genoma por recombinação homóloga direcionada) ou tão grande como 10 ou mais quilobases (por exemplo, por inserção de um gene em um local ectópico predeterminado em um cromossomo). Dois polinucleotídeos compreendendo as sequências homólogas não idênticas não precisam ser do mesmo comprimento. Por exemplo, um polinucleotídeo exógeno (ou seja, polinucleotídeo doador) entre 20 e 10.000 nucleotídeos ou pares de nucleotídeos podem ser usados.

[0038] As técnicas para a determinação de ácidos nucleicos e de identidade de sequência de aminoácidos são conhecidas na técnica. Tipicamente, estas técnicas incluem a determinação da sequência de nucleotídeos do mRNA para um gene e/ou determinar a sequência de aminoácidos codificada por esta, e comparando estas sequências a um segundo nucleotídeo ou sequência de aminoácido. As sequências genômicas podem também ser determinadas e comparadas desta maneira. Em geral, a identidade refere-se a uma correspondência exata nucleotídeo-a-nucleotídeo ou aminoácido-a-aminoácido de dois polinucleotídeos ou sequências polipeptídicas, respectivamente. Duas ou mais sequências (polinucleotídeos ou de aminoácido) podem ser comparados ao determinar seu percentual de identidade. O percentual de identidade de duas sequências, sequências de ácidos nucleicos ou aminoácidos, é o número de correspondências exatas entre duas sequências alinhadas dividido pelo comprimento das sequências mais curtas e multiplicado por 100.

[0039] Em alternativa, o grau de similaridade de sequências entre polinucleotídeos pode ser determinada por hibridação de polinucleotídeos, sob condições que permitem a formação de regiões homólogas duplas estáveis, seguido por digestão com nucleases específicas de fita simples e determinação de tamanho dos fragmentos digeridos. Dois ácidos nucleicos, ou duas sequências de polipeptídeos são substancialmente homólogas a cada outra quanto as sequências apresentam pelo menos cerca de 70%-75%, preferencialmente 80%- 82%, mais preferencialmente 85%-90%, ainda mais preferencialmente 92%, ainda mais preferencialmente 95%, e mais preferencialmente 98% identidade de sequência sobre um comprimento definido das moléculas, como determinado usando os métodos acima. Como aqui utilizado, substancialmente homólogas refere-se também às sequências que mostram identidade completa de um DNA ou sequência polipeptídica especificada. As sequências de DNA que são substancialmente homólogas podem ser identificadas em um experimento de hibridação Southern em, por exemplo, condições rigorosas, como definido para esse sistema particular. A definição de condições de hibridação apropriadas está dentro da habilidade da técnica. Ver, por exemplo, Sambrook et al., supra; Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, editors B.D. Hames and S.J. Higgins, (1985) Oxford; Washington, DC; IRL Press).

[0040] Hibridização seletiva de dois fragmentos de ácido nucleico pode ser determinada como se segue. O grau de identidade de sequência entre duas moléculas de ácido nucleico afeta a eficiência e eventos de força de hibridização entre ditas moléculas. Uma sequência de ácido nucleico parcialmente idêntica irá, pelo menos parcialmente inibir a hibridização de uma sequência completamente idênticas para uma molécula alvo. A inibição da hibridização da sequência completamente idêntica pode ser avaliada usando ensaios de hibridização que são bem conhecidos na técnica (por exemplo, Southern (DNA) blot, Northern blot (RNA), hibridização da solução, ou semelhante, ver Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.). Tais ensaios podem ser realizados utilizando vários graus de seletividade, por exemplo, utilizando-se diferentes condições de baixo a elevado rigor. Se as condições de baixo rigor são empregadas, a ausência de ligação não específica pode ser avaliada utilizando uma sonda secundária, que carece ainda de um grau parcial de identidade de sequência (por exemplo, uma sonda contendo menos do que cerca de 30% de identidade de sequência com a molécula alvo), de modo que, na ausência de eventos não específicos de ligação, a sonda secundária não irá hibridar com o alvo.

[0041] Quando se utiliza um sistema de detecção à base de hibridização, uma sonda de ácido nucleico é escolhida que é complementar a uma sequência de ácido nucleico de referência e, em seguida, através da seleção de condições adequadas, a sonda e a sequência de referência hibridizam seletivamente ou se ligam uma à outra para formar uma molécula dupla. Uma molécula de ácido nucleico que é capaz de hibridizar seletivamente com uma sequência de referência, em condições de hibridização moderadamente rigorosas tipicamente hibridiza sob condições que permitem a detecção de uma sequência de ácido nucleico alvo de pelo menos cerca de 10-14 nucleotídeos de comprimento com pelo menos cerca de 70% de identidade sequência com a sequência da sonda de ácido nucleico selecionada. Condições rigorosas de hibridização tipicamente permitem a detecção de sequências de ácido nucleico alvo de pelo menos cerca de 10-14 nucleotídeos em comprimento contendo uma identidade de sequência de mais do que cerca de 90-95% com a sequência da sonda de ácido nucleico selecionada. As condições de hibridização úteis para a sonda /hibridização de sequência de referência, em que a sonda e a sequência de referência têm um grau específico de identidade de sequência, pode ser determinada como é conhecido na técnica (ver, por exemplo, Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, editors B.D. Hames and S.J. Higgins, (1985) Oxford; Washington, DC; IRL Press).

[0042] Condições de hibridização são bem conhecidas dos especialistas na técnica. Rigor de hibridização refere-se ao grau em que as condições de hibridização desfavorecem a formação de híbridos que contêm nucleotídeos incorretos, com maior rigor correlacionado com uma baixa tolerância para os híbridos incorretos. Fatores que afetam o rigor da hibridização são bem conhecidos aos especialistas na técnica e incluem, entre outros, temperatura, pH, força iônica, e concentração de solventes orgânicos como, por exemplo, formamida e dimetil- sulfóxido. Como é conhecido dos especialistas na técnica, rigor de hibridização é aumentado por temperaturas mais altas, menor força iônica e menores concentrações de solventes.

[0043] No que diz respeito às condições de rigor de hibridização, é bem conhecido na técnica que numerosas condições equivalentes podem ser utilizadas para estabelecer um rigor particular, variando, por exemplo, os seguintes fatores: o comprimento e natureza das sequências, a composição de base das várias sequências, as concentrações de sais e outros componentes da solução de hibridização, a presença ou ausência de agentes de bloqueio nas soluções de hibridização (por exemplo, dextrano sulfato, e polietilenoglicol), a temperatura da reação de hibridização e os parâmetros de tempo, bem como, diferentes condições de lavagem. A seleção de um conjunto particular de condições de hibridização é selecionada de acordo com métodos padrões na técnica (ver, por exemplo, Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.).

[0044] "Recombinação" refere-se a um processo de troca de informações genéticas entre dois polinucleotídeos. Para fins desta revelação, "recombinação homóloga (HR)" refere-se à forma especializada de dita troca que ocorre, por exemplo, durante reparo de quebras de dupla fita em células através de mecanismos de reparo direcionados por homologia. Este processo requer homologia de sequência de nucleotídeo, usa uma molécula "doadora" para reparar o molde de uma molécula "alvo" (isto é, a que experimenta a quebra de fita dupla), e é variadamente conhecida como "conversão de gene sem crossover" ou "conversão de gene de traço curto," devido a levar à transferência de informações genéticas a partir do doador ao alvo. Sem querer se ligar a qualquer teoria particular, como transferência pode envolver correção de despareamento de DNA heteroduplo que forma entre o alvo quebrado e o doador, e/ou "anelamento de fita dependente de síntese," em que o doador é usado para ressintetizar informação genética que irá ser parte do alvo, e/ou processos relacionados. Dita HR especializada geralmente resulta em uma alteração da sequência da molécula alvo de modo que parte ou toda a sequência do polinucleotídeo doador é incorporado em polinucleotídeo alvo.

[0045] Nos métodos da presente revelação, uma ou mais nucleases específicas aqui descritas como criar uma quebra de fita dupla na sequência alvo (por exemplo, cromatina celular) em um local predeterminado, e um polinucleotídeo "doador", contendo homologia à sequência de nucleotídeo na região de quebra, pode ser introduzido na célula. A presença da quebra de cadeia dupla foi mostrada para facilitar a integração da sequência do doador. A sequência do doador pode ser fisicamente integrada ou, em alternativa, o polinucleotídeo doador é usado como um modelo para a reparação da quebra através de recombinação homóloga, o que resulta na introdução de toda ou parte da sequência nucleotídica como no doador na cromatina celular. Deste modo, uma primeira sequência de cromatina celular pode ser alterada e, em certas modalidades, pode ser convertida em uma sequência presente em um polinucleotídeo doador. Assim, o uso dos termos "substituir" ou "substituição" pode ser entendido para representar a substituição de uma sequência de nucleotídeo por outra, (isto é, substituição no sentido de informação), e não necessariamente requer substituição física ou química de um polinucleotídeo por outro.

[0046] Em qualquer um dos métodos aqui descritos, pares adicionais de proteínas dedo de zinco podem ser usados para a clivagem de cadeia dupla adicional de sítios alvos adicionais dentro da célula.

[0047] Em certas modalidades de métodos para recombinação direcionada e/ou substituição e/ou alteração de uma sequência em uma região de interesse na cromatina celular, uma sequência cromossômica é alterada por recombinação homóloga com uma sequência de nucleotídeo "doador" exógeno. Dita recombinação homóloga é estimulada pela presença de uma quebra de cadeia dupla na cromatina celular, se as sequências homólogas à região da quebra estão presentes.

[0048] Em qualquer um dos métodos descritos aqui, a primeira sequência de nucleotídeo (a "sequência doadora") pode conter sequências que são homólogas, mas não idênticas, às sequências genômicas na região de interesse, assim estimulando recombinação homóloga para inserir a sequência não idêntica na região de interesse. Assim, em certas modalidades, as porções da sequência doadora que são homólogas às sequências na região de interesse apresentam entre cerca de 80 a 99% (ou qualquer inteiro entre elas) identidade de sequência para a sequência genômica que é substituída. Em outras modalidades, a homologia entre o doador e a sequência genômica é superior a 99%, por exemplo, se apenas um nucleotídeo diferente como entre doador e sequências genômicas de mais de 100 pares de bases contíguos. Em certos casos, uma porção não homóloga da sequência doadora pode conter sequências que não estão presentes na região de interesse, de tal forma que novas sequências são introduzidas na região de interesse. Nestes casos, a sequência não homóloga é geralmente flanqueada por sequências de 50-1000 pares de bases (ou qualquer valor integral entre os mesmos) ou qualquer número de pares de base maiores do que 1000, que são homólogos ou idênticos às sequências da região de interesse. Em outras modalidades, a sequência doadora é não homóloga à primeira sequência, e é inserido dentro do genoma por mecanismos de recombinação não homólogos.

[0049] Qualquer um dos métodos aqui descritos pode ser utilizado para a inativação parcial ou completa de uma ou mais sequências alvo de uma célula por integração direcionada à sequência doadora que rompe a expressão do gene de interesse. Linhagens de células com genes parcialmente ou completamente inativadas também são fornecidas.

[0050] Além disso, os métodos de integração direcionada conforme descrito aqui podem também ser usados para integrar uma ou mais sequências exógenas. A sequência do ácido nucleico exógeno pode compreender, por exemplo, um ou mais genes ou moléculas de cDNA ou qualquer tipo de sequência de codificação ou não codificação, bem como um ou mais elementos de controle (por exemplo, promotores). Além disso, a sequência do ácido nucleico exógeno pode produzir uma ou mais moléculas de RNA (por exemplo, RNAs de pequenos grampos (shRNAs), RNAs inibitórios (RNAis), microRNAs (miRNAs), etc.).

[0051] "Clivagem" refere-se à quebra de estrutura covalente de uma molécula de DNA. Clivagem pode ser iniciada por uma variedade de métodos, incluindo, entre outros, hidrólise enzimática ou química de uma ligação fosfodiéster. Clivagem de fita simples e clivagem de fita dupla são possíveis e a clivagem de fita dupla pode ocorrer como resultado de dois eventos distintos de clivagem de fita simples. Clivagem de DNA pode resultar na produção de extremidades sem corte ou extremidades escalonadas. Em certas modalidades, polipeptídeos de fusão são usados para clivagem de DNA dita dupla direcionada.

[0052] Um "meio-domínio de clivagem" é uma sequência de polipeptídeo que, em conjunto com um segundo polipeptídeo (idêntica ou diferente) forma um complexo contendo atividade de clivagem (preferencialmente atividade de clivagem de fita dupla). Os termos "primeiro e segundo meios domínios de clivagem;" "+ e - meio-domínio de clivagem" e "direta e esquerda meios domínios de clivagem" são usados de modo intercambiável para referir-se aos pares de meios domínios de clivagem que dimeriza.

[0053] Um "meio-domínio de clivagem projetado" é um meio domínio de clivagem que foi modificado de modo a formar heterodímeros obrigatórios com outro meio domínio de clivagem (por exemplo, outro meio domínio de clivagem projetado). Ver, ainda, publicação de patente US. 2005/0064474; 2007/0218528 e 2008/0131962, aqui incorporados por referência em suas totalidades.

[0054] "Cromatina" é uma estrutura de nucleoproteína compreendendo o genoma celular. A cromatina celular é composta por ácido nucleico, principalmente DNA e proteínas, incluindo proteínas cromossômicas histonas e não histonas. A maioria da cromatina celular eucariótica existe sob a forma de nucleossomas, em que um núcleo nucleossoma compreende cerca de 150 pares de bases do DNA associado com um octâmero constituído por duas das histonas H2A, H2B, H3 e H4; e DNA ligante (de comprimento variável, dependendo do organismo) se estende entre núcleos nucleossoma. Uma molécula de histona H1 é geralmente associada com o ligante DNA. Para as finalidades da presente revelação, o termo "cromatina" pretende incluir todos os tipos de nucleoproteína celular, ambos eucarióticos e procarióticos. A cromatina celular inclui cromatina cromossômica e epissomal.

[0055] Um "cromossomo" é um complexo de cromatina compreendendo todo ou uma porção do genoma de uma célula. O genoma de uma célula é geralmente caracterizado por seu cariótipo, que é a coleção de todos os cromossomos que compõem o genoma da célula. O genoma de uma célula pode abranger um ou mais cromossomos.

[0056] Um "epissoma" é um ácido nucleico de replicação, complexo de nucleoproteína ou outras estruturas compreendendo um ácido nucleico que não é parte do cariótipo cromossômico de uma célula. Exemplos de epissomas incluem plasmídeos e certos genomas virais.

[0057] Um "sítio alvo" ou "sequência alvo" é uma sequência de ácido nucleico que define uma porção de um ácido nucleico ao qual uma molécula de ligação irá se ligar, desde que existam condições suficientes para ligação. Por exemplo, a sequência 5’-GAATTC-3’ é um sítio alvo para a endonuclease de restrição Eco RI.

[0058] Uma molécula "exógena" é uma molécula que não é normalmente presente em uma célula, mas pode ser introduzida em uma célula por um ou mais métodos genéticos, bioquímicos ou outros. "Presença normal na célula" é determinada com relação ao estágio de desenvolvimento particular e condições ambientais da célula. Assim, por exemplo, uma molécula que está presente apenas durante o desenvolvimento embrionário do músculo é uma molécula exógena com relação a uma célula muscular adulta. Da mesma forma, uma molécula induzida por choque térmico é uma molécula exógena com relação a uma célula chocada sem calor. Uma molécula exógena pode incluir, por exemplo, uma versão em funcionamento de uma molécula endógena com mau funcionamento ou versão de mau funcionamento de uma molécula endógena funcionando normalmente. Uma molécula exógena também pode ser uma molécula normalmente encontrada em outra espécie, por exemplo, uma sequência humana introduzida no genoma do animal.

[0059] Uma molécula exógena pode ser, entre outras coisas, uma pequena molécula, como é gerado por um processo de química combinatória, ou uma macromolécula como uma proteína, ácidos nucleicos, carboidratos, lipídios, glicoproteína, lipoproteína, polissacarídeo, qualquer derivado modificado das moléculas acima ou qualquer complexo composto por uma ou mais das moléculas acima. Ácidos nucleicos DNA e RNA, podem ser de fita simples ou dupla; pode ser linear, ramificado ou circular; e pode ser de qualquer comprimento. Ácidos nucleicos incluem aqueles capazes de formar ácidos nucleicos duplos, bem como formando triplo. Veja, por exemplo, patente US 5.176.996 e 5.422.251. Proteínas incluem, entre outras, proteínas de ligação a DNA, fatores de transcrição, fatores de remodelação de cromatina, proteínas de ligação a DNA metiladas, polimerases, metilases, demetilases, acetilases, deacetilases, quinases, fosfatases, integrases, recombinases, ligases, topoisomerases, girases e helicases.

[0060] Uma molécula exógena pode ser o mesmo tipo de molécula como uma molécula endógena, por exemplo, uma proteína exógena ou ácido nucleico. Por exemplo, ácido nucleico exógeno pode compreender um genoma viral infectante, um plasmídeo ou epissoma introduzido em uma célula ou um cromossomo que não está normalmente presente na célula. Métodos para a introdução de moléculas exógenas nas células são conhecidos por especialistas na técnica e incluem, entre outros, transferência mediada por lipídios (ou seja, lipossomas, incluindo lipídios catiônicos e neutros), eletroporação, injeção direta, fusão celular, bombardeio de partículas, coprecipitação de fosfato de cálcio, transferência mediada por DEAE-dextrano e transferência mediada por vetor viral.

[0061] Por outro lado, uma molécula "endógena" é aquela que é normalmente presente em uma célula particular em estágio de desenvolvimento sob condições ambientais particulares. Por exemplo, um ácido nucleico endógeno pode compreender um cromossomo, o genoma de uma mitocôndria, cloroplasto ou outra organela ou ácidos nucleicos epissomais de ocorrência natural. Moléculas endógenas adicionais podem incluir proteínas, por exemplo, enzimas e fatores de transcrição.

[0062] Uma molécula de "fusão" é uma molécula em que duas ou mais moléculas de subunidade são ligadas, preferencialmente, covalentemente. As moléculas de subunidade podem ser o mesmo tipo de químico da molécula, ou podem ser diferentes tipos químicos de moléculas. Exemplos do primeiro tipo de molécula de fusão incluem, entre outros, proteínas de fusão (por exemplo, uma fusão entre um domínio de ligação a ZFP DNA e um domínio de clivagem) e ácidos nucleicos de fusão (por exemplo, um ácido nucleico que codifica a proteína de fusão descrita supra). Exemplos do segundo tipo de molécula de fusão incluem, entre outros, uma fusão entre ácidos nucleicos de formação tripla e um polipeptídeo e uma fusão entre um fichário de sulco menor e um ácido nucleico.

[0063] A expressão de uma proteína de fusão em uma célula pode resultar de liberação da proteína de fusão para a célula ou pela liberação de um polinucleotídeo que codifica a proteína de fusão para uma célula, onde o polinucleotídeo é transcrito e a transcrição é traduzida, para gerar a proteína de fusão. Trans-processamento, clivagem de polipeptídeo e ligação de polipeptídeo podem estar envolvidas na expressão de uma proteína em uma célula. Métodos para a liberação de polinucleotídeo e polipeptídeo às células são apresentados em outro lugar desta revelação.

[0064] Um "gene," para os fins da presente revelação, inclui uma região de DNA que codifica um produto do gene (ver infra), bem como todas as regiões de DNA que regulam a produção de um produto do gene, seja ou não ditas sequências regulatórias são adjacentes às sequências de codificação e/ou transcritas. Assim, um gene inclui, mas não é necessariamente limitado a sequências de promotor, terminadores, sequências reguladoras de tradução, como sítios de ligação do ribossomo e sítios de entrada interno de ribossomo, melhoradores, silenciadores, isoladores, elementos isolantes, origens de replicação, sítios de ligação à matriz e regiões de controle do lócus.

[0065] "Expressão de gene" refere-se à conversão da informação, contida em um gene, em um produto de gene. Um produto de gene pode ser o produto direto transcricional de um gene (por exemplo, mRNA, tRNA, rRNA, RNA antissenso, ribozima, RNA estrutural ou qualquer outro tipo de RNA) ou uma proteína produzida pela tradução de um mRNA. Produtos do gene também incluem RNAs que são modificados, por processos como capeamento, poliadenilação, metilação e edição e proteínas modificadas, por exemplo, metilação, acetilação, fosforilação, ubiquitinação, ADP-ribosilação, miristilação e glicosilação.

[0066] "Modulação" de expressão de gene refere-se à alteração na atividade de um gene. A modulação da expressão pode incluir, entre outras, ativação do gene e a repressão do gene. Edição de genoma (por exemplo, clivagem, alteração, inativação, mutação aleatória) pode ser usado para modular a expressão. Inativação do gene refere-se a qualquer redução na expressão gênica em comparação a uma célula que não inclua um ZFP conforme descrito aqui. Assim, a inativação do gene pode ser parcial ou total.

[0067] Uma "região de interesse" é qualquer região de cromatina celular, como, por exemplo, um gene ou sequência não codificadora dentro ou adjacente a um gene, em que é desejável ligar uma molécula exógena. A ligação pode ser para fins de clivagem de DNA alvo e/ou de recombinação direcionada. Uma região de interesse pode estar presente em um cromossomo, um epissoma, um genoma de uma organela (por exemplo, mitocondrial, cloroplasto) ou um genoma viral infectante, por exemplo. Uma região de interesse pode ser dentro da região codificadora de um gene, dentro das regiões não codificantes transcritas como, por exemplo, sequências líder, sequências trailer ou íntrons, ou regiões não transcritas, a montante ou a jusante da região codificante. Uma região de interesse pode ser tão pequena como um par de nucleotídeos únicos, ou até 2000 pares de nucleotídeos em comprimento, ou qualquer valor integral de pares de nucleotídeos.

[0068] Os termos "ligação operativa" e "operacionalmente ligada" (ou "operacionalmente ligado") são usadas de modo intercambiável com referência a uma justaposição de dois ou mais componentes (como elementos de sequência), em que os componentes são arranjados de modo que ambos os componentes funcionam normalmente e permitem a possibilidade que pelo menos um dos componentes podem mediar uma função que é exercida em pelo menos um de outros componentes. A título de ilustração, uma sequência reguladora de transcrição, como um promotor, operativamente está ligada a uma sequência de codificação se a sequência reguladora de transcrição controla o nível de transcrição da sequência de codificação em resposta à presença ou ausência de um ou mais fatores de regulação de transcrição. Uma sequência de regulação de transcrição é geralmente operativamente ligada em cis com uma sequência de codificação, mas não precisa ser diretamente adjacente a ele. Por exemplo, um melhorador é uma sequência reguladora de transcrição que operativamente está ligada a uma sequência de codificação, mesmo que não sejam contíguos.

[0069] Com relação aos polipeptídeos de fusão, o termo "operativamente ligado" pode referir-se ao fato de que cada um dos componentes realiza a mesma função em ligação a outro componente conforme este poderia seria se não estivesse ligado. Por exemplo, com relação a um polipeptídeo de fusão em que um domínio de ligação ZFP DNA é fundido a um domínio de clivagem, o domínio de ligação a ZFP DNA e o domínio de clivagem estão em ligação operativa se, no polipeptídeo de fusão, a porção de domínio de ligação a ZFP DNA é capaz de se ligar a seu sítio alvo e/ou seu sítio de ligação, enquanto o domínio de clivagem é capaz de clivar DNA na vizinhança do sítio alvo.

[0070] Um "fragmento funcional" de uma proteína, polipeptídeo ou ácido nucleico é uma proteína, polipeptídeo ou ácido nucleico não é idêntico à proteína de comprimento total, polipeptídeo ou ácido nucleico, ainda retém a mesma função como a proteína de comprimento total, polipeptídeo ou ácido nucleico. Um fragmento funcional pode possuir mais, menos, ou o mesmo número de resíduos como a molécula nativa correspondente, e/ou pode conter um ou mais aminoácidos ou substituições de nucleotídeos. Métodos para determinação da função de um ácido nucleico (por exemplo, função codificadora, capacidade em hibridizar a outro ácido nucleico) são bem conhecidos na técnica. De modo semelhante, os métodos para determinar a função da proteína são bem conhecidos. Por exemplo, a função de ligação a DNA de um polipeptídeo pode ser determinada, por exemplo, pela mudança de mobilidade eletroforética, filtro a ligação, ou ensaios de imunoprecipitação. Clivagem de DNA pode ser analisada por eletroforese em gel. Ver Ausubel et al., supra. A capacidade de uma proteína para interagir com outra proteína pode ser determinada, por exemplo, por coprecipitação, ensaios de dois híbridos ou complementação, ambos genético e bioquímico. Ver, por exemplo, Fields et al. (1989) Nature 340:245-246; patente US 5.585.245 e PCT WO 98/44350.

Nucleases dedo de zinco

[0071] São aqui descritas nucleases dedos de zinco (ZFNs) que podem ser usadas para edição genômica (por exemplo, clivagem, alteração, inativação e/ou mutação aleatória) de um ou mais genes Rosa. ZFNs compreende uma proteína dedo do zinco (ZFP) e um domínio de nuclease (clivagem) (por exemplo, meio domínio de clivagem).

A. Proteínas dedo de zinco

[0072] Domínios de ligação dedo do zinco podem ser projetados para ligar a uma sequência de escolha. Ver, por exemplo, Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:656660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416. Um domínio de ligação dedo de zinco projetado pode ter uma nova especificidade de ligação, comparada a uma proteína dedo de zinco de ocorrência natural. Métodos de engenharia incluem, entre outros, projeto racional e vários tipos de seleção. O projeto racional inclui, por exemplo, usando bancos de dados compreendendo sequências de nucleotídeos tripletos (ou quádruplo) e sequências de aminoácidos individuais dedo de zinco, em que cada sequência de nucleotídeos tripleto ou quádruplo é associada com uma ou mais sequências de aminoácidos dedos de zinco que se ligam a determinada sequência tripleto ou quádruplo. Ver, por exemplo, patentes de copropriedade US 6.453.242 e 6.534.261, incorporados por referência aqui em suas totalidades.

[0073] Métodos de seleção de exemplares, incluindo apresentação de fago e sistemas dois híbridos, são revelados nas Patentes US 5.789.538; 5.925.523; 6.007.988; 6.013.453; 6.410.248; 6.140.466; 6.200.759; e 6.242.568; bem como WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197 e GB 2.338.237. Além disso, a melhorada de especificidade de ligação para domínios de ligação dedo do zinco foi descrita, por exemplo, no WO 02/077227 de copropriedade.

[0074] Seleção de sítios alvo; ZFPs e métodos para projeção e construção de proteínas de fusão (e polinucleotídeos codificando o mesmo) são conhecidos por especialistas na técnica e descritos em detalhes em publicação de pedido de patente US 20050064474 e 20060188987, incorporado por referência em suas totalidades aqui.

[0075] Além disso, como revelado nestas e outras referências, domínios dedos de zinco e/ou proteínas dedo de zinco de vários dedos podem ser ligados juntos usando sequências ligantes apropriadas, incluindo, por exemplo, ligantes de 5 ou mais aminoácidos em comprimento (por exemplo, TGEKP (SEQ ID NO: 1), TGGQRP (SEQ ID NO: 2), TGQKP (SEQ ID NO: 3), e/ou TGSQKP (SEQ ID NO: 4)). Ver, ainda, patente US 6.479.626; 6.903.185; e 7.153.949 para sequências ligantes exemplares 6 ou mais aminoácidos em comprimento. As proteínas descritas aqui podem incluir qualquer combinação de ligantes apropriados entre os dedos de zinco individuais da proteína.

[0076] Como descrito abaixo, em certas modalidades, um domínio de ligação de quatro, cinco ou seis dedos é fundido a um meio domínio de clivagem, como, por exemplo, o domínio de clivagem de uma endonuclease de restrição do tipo IIs como Fok I. Um ou mais pares de fusões de meio domínio de dedo de zinco/nuclease são usados para clivagem direcionada, como revelado, por exemplo, na publicação de patente US 20050064474.

[0077] Para a clivagem direcionada, as bordas perto dos locais de ligação podem separados por 5 ou mais pares de nucleotídeos e cada uma das proteínas de fusão podem ligar a uma fita oposta de DNA alvo. Todas as combinações emparelhadas 1 podem ser usadas para clivagem direcionada de um gene Rosa. Após a revelação presente, ZFNs podem ser direcionadas para qualquer sequência no genoma do animal.

[0078] Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao DNA é um domínio projetado de um efetor TAL derivado de um patógeno de planta Xanthomonas (ver Boch et al, (2009) Science 326: 1509-1512 e Moscou and Bogdanove, (2009) Science326: 1501).

B. Domínios de Clivagem

[0079] Os ZFNs também compõem uma nuclease (domínio de clivagem, meio domínio de clivagem). A parte de domínio de clivagem das proteínas de fusão reveladas aqui pode ser obtida de qualquer endonuclease ou exonuclease. Endonucleases exemplares do que um domínio de clivagem pode ser derivado incluem, entre outros, as endonucleases de restrição e endonucleases homing. Ver, por exemplo, 2002-2003 Catalogue, New England Biolabs, Beverly, MA; and Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388. Enzimas adicionais que clivam DNA são conhecidas (por exemplo, S1 Nuclease; nuclease de feijão mung; DNase pancreática I; nuclease microcócica; endonuclease HO de levedura; Ver também Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press,1993). Uma ou mais destas enzimas (ou fragmentos funcionais das mesmas) podem ser usadas como uma fonte de domínios de clivagem e meios domínios de clivagem.

[0080] De modo semelhante, um meio domínio de clivagem pode ser derivado de qualquer nuclease ou parte desta, conforme definido acima, que requer a dimerização para atividade de clivagem. Em geral, duas proteínas de fusão são necessárias para a clivagem se as proteínas de fusão compreendem meios domínios de clivagem. Alternativamente, pode ser usada uma única proteína compreendendo dois meios domínios de clivagem. Os dois meios domínios de clivagem podem ser derivados a partida da mesma endonuclease (ou fragmentos funcionais da mesma), ou cada meio domínio de clivagem pode ser derivada de uma endonuclease diferente (ou fragmentos funcionais da mesma). Além disso, os sítios alvo para as duas proteínas de fusão são preferencialmente dispostas, com relação a cada outro, de modo que a ligação de duas proteínas de fusão a seus respectivos sítios alvo dos meios domínios de clivagem em uma orientação espacial a cada outro que permite os meios domínios de clivagem para formar um domínio de clivagem funcional, por exemplo, por dimerização. Assim, em certas modalidades, as bordas próximas dos sítios alvo são separados por 58 nucleotídeos ou 15-18 nucleotídeos. No entanto, qualquer número inteiro de pares de nucleotídeos ou nucleotídeos pode intervir entre dois sítios alvo (por exemplo, de 2 a 50 pares de nucleotídeos ou mais). Em geral, o sítio de clivagem situa-se entre os sítios alvo.

[0081] Endonucleases de restrição (enzimas de restrição) estão presentes em muitas espécies e são capazes de ligação específica de sequência ao DNA (em um sítio de reconhecimento), e clivagem de DNA em ou próximo ao sítio de ligação. Certas enzimas de restrição (por exemplo, tipo IIS) clivam DNA em sítios removidos do sítio de reconhecimento e têm domínios separáveis e domínios de ligação. Por exemplo, a enzima tipo IIS Fok I, que catalisa a clivagem de fita dupla do DNA, em 9 nucleotídeos de seu sítio de reconhecimento em uma fita e 13 nucleotídeos do seu sítio de reconhecimento do outro. Ver, por exemplo, Patentes US 5.356.802; 5.436.150 e 5.487.994; bem como Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31, 978-31,982. Assim, em uma modalidade, as proteínas de fusão compreendem o domínio de clivagem (ou meio domínio de clivagem) a partir de pelo menos uma enzima de restrição Tipo IIS e um ou mais domínios de ligação dedo de zinco, que pode ser ou não projetado.

[0082] Uma enzima de restrição tipo IIS exemplar, cujo domínio de clivagem é separável do domínio de ligação, é Fok I. Esta enzima particular é ativa como um dímero. Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10,570-10,575. Assim, para efeitos da presente revelação, a parte da enzima Fok I usada em proteínas de fusão reveladas é considerada um meio domínio de clivagem. Assim, para clivagem de fita dupla direcionada e/ou substituição direcionada de sequências celulares usando fusões zinco-dedo-Fok I, duas proteínas de fusão, cada um compreendendo um meio domínio de clivagem Fok I, podem ser usados para reconstituir um domínio de clivagem cataliticamente ativo. Como alternativa, uma molécula única de polipeptídeo contendo um domínio de ligação dedo de zinco e dois meios domínios de clivagem Fok I também pode ser usados. Parâmetros clivagem direcionada e alteração de sequência direcionada usando fusões dedo de zinco Fok I são fornecidas em outros lugares na revelação.

[0083] Um domínio de clivagem ou meio domínio de clivagem podem ser qualquer parte de uma proteína que retém a atividade de clivagem ou que retêm a capacidade de multimerizar (por exemplo, dimerizar) para formar um domínio de clivagem funcional.

[0084] Enzimas de restrição tipo IIS são descritos na Publicação Internacional WO 07/014275, incorporada aqui em sua totalidade. Enzimas de restrição adicionais ainda contêm ligação separável e domínios de clivagem, e estes são contemplados pela presente revelação. Ver, por exemplo, Roberts et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:418-420.

[0085] Em certas modalidades, o domínio de clivagem compreende um ou mais meio domínio de clivagem projetados (ainda referenciados como mutantes de domínio de dimerização) que minimizam ou impedem a homodimerização, como descrito, por exemplo na publicação de patente US 20050064474; 20060188987 e 20080131962, as revelações de todos os quais são incorporados por referência em suas totalidades aqui. Resíduos de aminoácidos nas posições 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537 e 538 de Fok I são todos alvos para influenciar dimerização de meios domínios de clivagem Fok I.

[0086] Meio-domínios de clivagem projetados exemplares de Fok I que formam heterodímeros obrigatórios incluem um par em que um primeiro meio domínio de clivagem inclui mutações em resíduos de aminoácidos nas posições 490 e 538 de Fok I e um segundo meio domínio de clivagem inclui mutações em resíduos de aminoácido 486 e 499.

[0087] Assim, em uma modalidade, uma mutação em 490 substitui Glu (E) com Lys (K); a mutação em 538 substitui Iso (I) com Lys (K); a mutação em 486 substitui Gln (Q) com Glu (E); e a mutação na posição 499 substitui Iso (I) com Lys (K). Especificamente, os meios domínios de clivagem projetados descritos aqui foram preparados por posições mutantes 490 (E^K) e 538 (I^K) em um meio domínio de clivagem para produzir um meio domínio de clivagem projetado designado "E490K:I538K" e por posições mutantes 486 (Q^E) e 499 (I^L) em outro meio domínio de clivagem para produzir um meio domínio de clivagem projetado designado "Q486E:I499L". Os meios domínios de clivagem projetados descritos aqui são mutantes heterodímeros obrigatórios em que a clivagem anormal é minimizada ou abolida. Ver, por exemplo, Exemplo 1 de WO 07/139898. Em certas modalidades, o meio domínio de clivagem projetado compreende mutações nas posições 486, 499 e 496 (numerada em relação ao tipo selvagem Fok I), por exemplo, mutações que substitua o resíduo de Gln (Q) tipo selvagem na posição 486 com um resíduo Glu (E), o resíduo de Iso (I) tipo selvagem na posição 499 com um resíduo de Leu (L) e o resíduo de Asn (N) do tipo selvagem na posição 496 com um Asp (D) ou resíduo Glu (E) (ainda referenciado como domínios "ELD" e "ELE", respectivamente). Em outras modalidades, o meio domínio de clivagem projetado compreende mutações nas posições 490, 538 e 537 (numerada em relação ao Fok I tipo selvagem), por exemplo, mutações que substituem o resíduo tipo selvagem de Glu (E) na posição 490 com um resíduo Lys (K), o resíduo tipo selvagem Iso (I) na posição 538 com um resíduo Lys (K), e o resíduo tipo selvagem His (H) na posição 537 com um resíduo Lys (K) ou um resíduo Arg (R) (ainda referenciado como domínios "KKK" e "KKR", respectivamente). Em outras modalidades, o meio domínio de clivagem projetado compreende as mutações nas posições 490 e 537 (numeradas em relação ao tipo selvagem Fok I), por exemplo, mutações que substituem o resíduo tipo selvagem Glu (E) na posição 490 com um resíduo de Lys (K) e o resíduo tipo selvagem His (H) na posição 537 com um resíduo Lys (K) ou um resíduo Arg (também chamado de domínios "KIK" e "KIR", respectivamente). (Ver pedido US 12/931.660).

[0088] Meio-domínios de clivagem projetados descritos aqui podem ser incorporados usando qualquer método apropriado, por exemplo, por mutagênese direcionada ao sítio de meios domínios de clivagem tipo selvagem (Fok I) como descrito na publicação de patente US 20050064474.

C. Métodos Adicionais para Clivagem Direcionada

[0089] Qualquer nuclease contendo um sítio alvo em qualquer gene Rosa pode ser usado nos métodos revelados aqui. Por exemplo, as endonucleases homing e meganucleases têm sequências de reconhecimento muito longas, algumas das quais são susceptíveis de estarem presentes, em uma base estatística, uma vez em um genoma de tamanho humano. Qualquer dita nuclease contendo um sítio alvo em um gene Rosa pode ser usado em vez de, ou além, uma nuclease dedo de zinco, para clivagem direcionada.

[0090] Endonucleases homing exemplares incluem I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII e I-TevIII. Suas sequências de reconhecimento são conhecidas. Ver ainda patente U.S. No. 5.420.032; patente U.S. No. 6.833.252; Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388; Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118; Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353 e o catálogo New England Biolabs.

[0091] Embora a especificidade da clivagem da maioria dos endonucleases homing não seja absoluta em relação aos seus sítios de reconhecimento, os sítios são de comprimento suficiente que um evento de clivagem único por genoma de tamanho de mamíferos pode ser obtido expressando uma endonuclease homing em uma célula contendo uma cópia única de seu sítio de reconhecimento. Foi ainda reportado que a especificidade de endonucleases homing e meganucleases podem ser projetada para ligar sítios alvo não naturais. Ver, por exemplo, Chevalier et al. (2002) Molec. Cell 10:895-905; Epinat et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:2952-2962; Ashworth et al. (2006) Nature 441:656-659; Paques et al. (2007) Current Gene Therapy 7:4966.

Liberação

[0092] ZFNs aqui descritos podem ser liberados a uma célula alvo por quaisquer meios adequados, incluindo, por exemplo, por injeção de mRNA ZFN. Ver, Hammerschmidt et al. (1999) Methods Cell Biol. 59:87115.

[0093] Métodos de liberação de proteínas compreendendo dedos de zinco são descritos, por exemplo, em patentes US 6.453.242; 6.503.717; 6.534.261; 6.599.692; 6.607.882; 6.689.558; 6.824.978; 6.933.113; 6.979.539; 7.013.219; e 7.163.824, as revelações de todos os que são incorporadas por referência aqui em suas totalidades.

[0094] ZFNs como descrito aqui podem ainda ser liberadas usando vetores contendo sequências que codificam um ou mais de ZFNs. Qualquer sistema de vetor pode ser utilizado incluindo, entre outros, vetores do plasmídeo, vetores retrovirais, vetores de Lentivírus, vetores de adenovírus, vetores de poxvírus; vetores de Herpesvírus e vetores de vírus adenoassociados, etc. Ver, também, patente US 6.534.261; 6.607.882; 6.824.978; 6.933.113; 6.979.539; 7.013.219; e 7.163.824, incorporado por referência aqui em suas totalidades. Além disso, é evidente que qualquer um destes vetores pode incluir uma ou mais sequências de codificação ZFN. Assim, quando um ou mais pares de ZFNs são introduzidos na célula, as ZFNs podem ser conduzidas no mesmo vetor em vetores diferentes. Quando são usados vários vetores, cada vetor pode incluir uma sequência de codificação de um ou vários ZFNs.

[0095] Métodos de transferência de gene de base de viral e não viral convencionais podem ser usados para introduzir ácidos nucleicos que codificam ZFPs projetados nas células. Ditos método podem ainda ser usados para administrar ácidos nucleicos que codificam ZFPs às células in vitro. Em certas modalidades, ácidos nucleicos que codificam ZFPs são administrados para usos in vivo ou ex vivo.

[0096] Sistemas de distribuição de vetores não virais incluem eletroporação, lipofecção, microinjeção, biolística, virossomas, lipossomas, imunolipossomas, policátion ou conjugados lipídeos:ácido nucleico, DNA nu, vírions artificiais, e absorção projetada por agente de DNA. Sonoporação, usando, por exemplo, o sistema de 2000 Sonitron (Rich-Mar) também pode ser usado para a liberação dos ácidos nucleicos. Sistemas de liberação de vetor viral incluem vírus DNA e RNA, que têm genomas epissomais ou integrados após a liberação para a célula. Sistemas de liberação de ácido nucleico exemplares adicionais incluem aqueles fornecidos por Amaxa Biosystems (Cologne, Germany), Maxcyte, Inc. (Rockville, Maryland), BTX Molecular Delivery Systems (Holliston, MA) e Copernicus Therapeutics Inc, (ver, por exemplo, US 6008336). Lipofecção é descrito por exemplo, US 5.049.386, US 4.946.787; e US 4.897.355) e reagentes de lipofecção são vendidos comercialmente (por exemplo, Transfectam™ e Lipofectin™). Lipídeos catiônicos e neutros que são apropriados para lipofecção de reconhecimento de receptor de polinucleotídeos incluem aqueles de Felgner, WO 91/17424, WO 91/16024. A liberação pode ser às células (administração ex vivo) ou tecidos alvos (administração in vivo). A preparação de complexos lipídeos:ácido nucleico, incluindo lipossomas direcionadas como complexos de imunolipídeo, é bem conhecido à um especialista na técnica (ver, por exemplo, Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817-4820 (1992); Patente US 4.186.183, 4.217.344, 4.235.871, 4.261.975, 4.485.054, 4.501.728, 4.774.085, 4.837.028, e 4.946.787).

[0097] Métodos adicionais de liberação incluem o uso de empacotamento de ácidos nucleicos para ser liberados em veículos de liberação EnGeneIC (EDVs). Estes EDVs especificamente são liberados aos tecidos alvos utilizando anticorpos biespecíficos onde um braço do anticorpo tem especificidade para o tecido alvo e outro tem especificidade para o EDV. O anticorpo traz os EDVs à superfície da célula alvo e, em seguida, o EDV é trazido para dentro da célula por endocitose. Uma vez na célula, os conteúdos são liberados (ver MacDiarmid et al (2009) Nature Biotechnology vol. 27(7), p. 643).

[0098] Como mencionado acima, os métodos revelados e composições podem ser usadas em qualquer tipo de célula. Descendência, variantes e derivados de células animais também podem ser usados.

Aplicações

[0099] Os métodos revelados e composições podem ser usados para edição genômica de qualquer gene ou genes Rosa. Em certas aplicações, os métodos e as composições podem ser usados para a inativação de sequências genômicas Rosa. Em outras aplicações, os métodos e as composições permitem geração de mutações aleatórias, incluindo a geração de novas formas alélicas de genes com expressão diferente em comparação com genes inéditos ou integração de genes humanizados, que permite a geração de modelos animais. Em outras aplicações, os métodos e as composições podem ser usados para a criação de mutações aleatórias em posições definidas de genes, o que permitem a identificação ou seleção de animais conduzindo novas formas alélicas daqueles genes. Em outras aplicações, os métodos e as composições permitem integração direcionada de uma sequência exógena (doadora) em qualquer área selecionada do genoma, por exemplo, um gene Rosa de camundongo ou rato. Sequências reguladoras (por exemplo, promotores) poderiam ser integradas de forma direcionada em um sítio de interesse. Por "integração" entende- se tanto a inserção física (por exemplo, no genoma de uma célula hospedeira) quando, além disso, integração por cópia de sequência doadora no genoma da célula hospedeira através de processos de replicação de ácido nucleico. Sequências doadoras também podem incluir ácidos nucleicos como shRNAs, miRNAs etc. Esses doadores de ácido nucleico pequeno podem ser usados para estudar seus efeitos sobre os genes de interesse dentro do genoma. Sequências adicionais doadoras de interesse podem ser genes humanos que codificam proteínas relevantes aos modelos de doença. Exemplos não limitantes de ditos genes incluem Fator humano VIII e Fator humano IX. Assim, inserção destes genes no lócus Rosa pode permitir que o investigador para investigar estas proteínas em maior detalhe in vivo. A edição genômica (por exemplo, inativação, integração e/ou mutação direcionada ou aleatória) de um gene animal pode ser conseguida, por exemplo, por um evento de clivagem simples, por clivagem seguida por união de extremidade não homóloga, por clivagem seguida por mecanismos de reparo direcionado por homologia, por clivagem seguida por integração física de uma sequência doadora, por clivagem em dois sítios por união assim como para apagar a sequência entre os dois sítios de clivagem, por recombinação direcionada de uma região de códon de sentido incorreto ou sem sentido, por recombinação direcionada de uma sequência irrelevante (isto é, uma sequência "stuffer") no gene ou sua região regulatória, de modo a romper o gene ou região regulatória, ou por recombinação direcionada de uma sequência aceptora de splice em um íntron para gerar mis-splicing do transcrito. Ver, publicação de patente US 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060188987; 20060063231; e Publicação internacional WO 07/014275, as revelações das quais são incorporadas por referência em suas totalidades para todos os propósitos.

[00100] Há uma variedade de aplicações para edição genômica mediada por ZFN de um gene Rosa. Os métodos e as composições aqui descritas permitem a geração de modelos de doenças humanas. Por exemplo, edição do gene p53 permite a geração de um "câncer de rato" que fornece um modelo animal para estudar o câncer e testar terapias de câncer.

EXEMPLOS Exemplo 1: Construção de ácido nucleico doador de polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP) para integração direcionada em região de ácido nucleico de rRosa26 do genoma do rato.

[00101] Os plasmídeos foram ainda construídos para integração de sítios NotI e PmeI RFLP na região rRosa26 do genoma do rato. O projeto e construção do plasmídeo foi como acima descrito. Os pares de iniciador de PCR usados para amplificar a região rRosa26 de homologia são descritos na tabela 1.

[00102] Projetos de dedo de zinco direcionados para os sítios alvo em Rosa26 são mostrados nas tabelas 2 e 3. Nucleotídeos no sítio de destino são contatados por hélices de reconhecimento de ZFP são indicados em letras maiúsculas; nucleotídeos não contatados indicado em letras minúsculas. Tabela 2: Projetos de dedo em rosa26 de rato Tabela 3: Sítios alvo rosa26 de rato

[00103] Células C6 de ratos foram transfectadas com controle GFP ou cada um dos 8 pares de ZFNs. DNA foi preparada a partir de células um dia após a transfecção. Clivagem de ZFN foi analisada com a nuclease SurveyorTM conforme descrito, por exemplo, em publicação de patente US Nos. 20080015164; 20080131962 e 20080159996, usando os produtos amplificados com respectivos iniciadores. Os resultados são apresentados na figura 1. As setas indicam que a clivagem foi encontrada apenas em amostras contendo pares ZFN, mas não foi encontrada em amostras de controle em que as células foram transfectadas com ZFNs específicas de GFP.

Exemplo 2: Nucleases dedo de zinco específicas para lócus Rosa26 de camundongo

[00104] Projetos de dedo de zinco direcionados para os sítios alvo em Rosa26 de camundongo são mostrados nas tabelas 4 e 5. Nucleotídeos no sítio de destino são contatados por hélices de reconhecimento ZFP são indicados em letras maiúsculas; nucleotídeos não contatados indicado em letras minúsculas. Tabela 4: Projetos de dedo de zinco de Rosa26 de camundongo Tabela 5: Sítios alvo Rosa26 de camundongo

[00105] Análise de Cel-I foi conduzida conforme descrito acima para pares ZFN 18473/18477 e 18473/25096 e o percentual NHEJ foi observado como a seguir: 26,5% NHEJ usando par ZFN 18477/18473 e 35,70% NHEJ com par ZFN 18473/25096.

Exemplo 3: Integração direcionada de um polinucleotídeo doador em lócus Rosa26 do genoma do camundongo

[00106] Doadores Rosa foram construídos por clonagem de produtos PCR usando oligonucleotídeos a seguir: para braços 527 pb, os oligonucleotídeos usados para PCR foram 5’-ggc tcg agt gag tca tca gac ttc taa gat cag g-3’ (SEQ ID NO: 31); para doadores de braço esquerdo 413 pb, 5’-ggc tcg agt ttt gat aag gct gca gaa g-3’ (SEQ ID NO: 32) em conjunto com o iniciador reverso 5’-ctg aat tcg aat ggg cgg gag tct tct ggg ca-3’ (SEQ ID NO: 33).

[00107] Para braços da direita 640 pb, os oligonucleotídeos usados para PCR foram 5’-cca agc ttg gag gta ggt ggg gtg agg-3’ (SEQ ID NO: 34); para braços 200 pb, 5’-cca agc tta gtc gct ctg agt tgt tat c-3’ (SEQ ID NO: 35); para braços 100 pb, 5'-cca agc ttt ctg gga gtt ctc tgc tgc c-3' (SEQ ID NO: 36) em conjunto com o iniciador reverso 5’-cat tcg aat tca gaa aga ctg gag ttg cag atc-3’ (SEQ ID NO: 37). Amplicons de braço individual foram unidos através da fusão do PCR e clonados para produzir doadores com diferentes braços de homologia. Células Neuro2a (200.000) foram cotransfectadas com 400 ng cada de SBS 18473 e 18477 juntamente com 2 μg do doador indicado na solução SF usando o protocolo de alta eficiência Amaxa-Shuttle Neuro2a.

[00108] O DNA genômico foi coletado 72 horas após transfecção e 100 ng usado para PCR com 5’-cccagctacagcctcgattt-3’, 5’- cacaaatggcgtgttttggt-3’ e 5 μCi de ambos 32P-dATP e 32P-dCTP por amostra em uma temperatura de anelamento de 68°C com uma extensão de dois minutos a 72°C por 28 ciclos. Após a purificação de coluna G-50, 10 μL de cada 50 μL de reação foi digerida com a 37°C por duas horas e carregado em um gelo de 10% poliacrilamida.

[00109] Como mostrado na figura 2, os nucleotídeos doadores foram inseridos no lócus Rosa com a frequência indicada.

[00110] Todas as patentes, patentes e publicações aqui mencionadas aqui são incorporadas por referência na sua totalidade.

[00111] Apesar de revelação ter sido fornecida em alguns detalhes a título de ilustração e exemplo para fins de clareza de entendimento, será evidente para aqueles especialistas na técnica que várias alterações e modificações podem ser praticadas sem se afastar do espírito e do escopo da revelação. Assim, as descrições e exemplos precedentes não devem ser interpretados como limitantes.

Claims (11)

1. Proteína de fusão isolada que compreende um domínio de clivagem de endonuclease de restrição Tipo IIS ou meio-domínio de clivagem e um domínio de ligação ao DNA de dedo do zinco projetado, caracterizada pelo fato de que o domínio de ligação ao DNA de dedo do zinco projetado se liga a um sítio alvo especificado em qualquer uma de SEQ ID NOs: 28-30, em que o domínio de ligação ao DNA de dedo de zinco projetado compreende quatro, cinco ou seis regiões de reconhecimento de DNA de dedo de zinco designadas e ordenadas F1 a F4, F1 a F5 ou F1 a F6 do N-terminal ao C-terminal, e ainda em que os domínios de ligação ao DNA de dedo de zinco projetados compreendem as regiões de reconhecimento de DNA de dedo de zinco selecionadas do grupo que consiste em: (i) F1: QSGDLTR (SEQ ID NO: 17); F2: TSGSLTR (SEQ ID NO: 18); F3: QSGHLAR (SEQ ID NO: 19); F4: QSSDLTR (SEQ ID NO: 20); F5: RSDNLSE (SEQ ID NO: 21); e F6: QNAHRKT (SEQ ID NO: 22); (ii) F1: DRSARTR (SEQ ID NO: 23); F2: QSGHLSR (SEQ ID NO: 24); F3: RSDDLSK (SEQ ID NO: 25); e F4: RNDHRKN (SEQ ID NO: 26); (iii) F1: DTTSLDR (SEQ ID NO: 27); F2: TSGSLTR (SEQ ID NO: 18); F3: QSGHLAR (SEQ ID NO: 19); F4: QSSDLTR (SEQ ID NO: 20); F5: RSDNLSE (SEQ ID NO: 21); e F6: QNAHRKT (SEQ ID NO: 22).

2. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma proteína de fusão como definida na reivindicação 1, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

3. Método para clivar in vitro um ou mais genes Rosa em uma célula de rato ou camundongo, o método caracterizado pelo fato de que compreende: introduzir na célula uma ou mais proteínas de fusão como definida na reivindicação 1, na célula, de modo que o um ou mais genes Rosa sejam clivados, em que o um ou mais genes Rosa compreende um lócus Rosa26.

4. Método para introduzir in vitro uma sequência de polinucleotídeo exógena no genoma de uma célula de rato ou camundongo, o método caracterizado pelo fato de que compreende: clivar um ou mais genes Rosa como definidos pelo método da reivindicação 3; e contatar a célula com uma sequência de polinucleotídeo exógena; em que a clivagem de um ou mais genes estimula integração da sequência de polinucleotídeo exógena no genoma por recombinação homóloga.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a sequência de polinucleotídeo exógena é integrada ao genoma por meio de processos de replicação de ácido nucleico.

6. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a sequência de polinucleotídeo exógena é integrada ao genoma por meio de integração direcionada dependente de não homologia.

7. Método para modificar in vitro uma sequência de genes Rosa no genoma de célula de rato ou camundongo, o método que compreende clivar um ou mais genes Rosa como definidos pelo método da reivindicação 3, em que (i) uma primeira nuclease de dedo de zinco (ZFN) cliva em um primeiro sítio de clivagem e uma segunda ZFN cliva em um segundo sítio de clivagem; (ii) a sequência de genes Rosa está localizada entre o primeiro sítio de clivagem e o segundo sítio de clivagem; (iii) clivagem do primeiro e do segundo sítios de clivagem resulta em uma modificação da sequência de genes por união de extremidade não homóloga ou reparo direcionado por homologia.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a modificação compreende uma deleção.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a modificação compreende inserção de uma sequência de polinucleotídeo exógena.

10. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende uma proteína de fusão como definida na reivindicação 1.

11. Kit, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que compreende ainda componentes adicionais selecionados do grupo que consiste em uma ou mais sequências de polinucleotídeos exógenas, instruções para utilização e combinações das mesmas.