KR20110101175A - 징크 핑거 뉴클레아제를 이용한 랫트의 유전체 편집 - Google Patents

징크 핑거 뉴클레아제를 이용한 랫트의 유전체 편집 Download PDF

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KR20110101175A
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상가모 바이오사이언스 인코포레이티드
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Abstract

징크 핑거 단백질과 절단 도메인 또는 절단 절반-도메인을 포함하는 융합 단백질을 사용하여, 랫트에서 하나 이상의 유전자 자리의 유전체 편집을 위한 방법과 조성물이 본원에 개시된다. 또한, 상기 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 제공되며, 상기 폴리뉴클레오타이드 및 융합 단백질을 포함하는 세포도 제공된다.

Description

징크 핑거 뉴클레아제를 이용한 랫트의 유전체 편집{GENOME EDITING IN RATS USING ZINC-FINGER NUCLEASES}
관련 출원의 인용
본 출원은 미국 가출원 번호 제61/200,985호 (2008년 12월 4일 출원됨); 제61/205,970호 (2009년 1월 26일 출원됨) 및 제61/263,904호 (2009년 11월 24일 출원됨)의 이익을 주장하며, 이들의 개시 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
연방 정부 후원에 의해 이루어진 발명의 권리에 대한 진술
해당 사항 없음.
기술분야
본원의 개시 내용은 체세포성 유전자 붕괴 및 유전성 유전자 붕괴, 유전체 변형, 랫트 유전자의 특정 위치에 무작위 돌연변이를 수반하는 대립 형질의 생성 및 상동성 지향 복구(homology-directed repair)의 유도를 포함하는 랫트의 유전체 조작 분야에 속하는 것이다.
랫트 (Rattus norvegicus: 시궁쥐)는 고혈압, 심혈관 생리학, 당뇨병, 대사 장애, 행태 연구 및 독성 시험 분야에서 널리 사용되는 동물 모델이다. 문헌 [Michalkiewicz et al ., (2007) J. Amer . Phys . Society 293:H881-H894]을 참조한다. 랫트 유전체학과 랫트, 인간 및 마우스 유전체 서열에서 진전된 이러한 모델 시스템의 유용성은, 복합 질환의 유전적 기반을 알아내기 위한 근친 교배 랫트 모델의 사용을 급격히 가속화시켜, 치료 약물의 발굴을 위한 동물 모델을 제공하게 되었다.
그러나, 랫트 유전체에 대한 정보의 진전에도 불구하고, 유전체 변형 기술은 이와 동시에 진척되지 않았다. 마우스와는 달리, 유전자 표적화를 위한 랫트 배아 줄기 세포의 클론은 순조롭게 생성되지 않는다. 전핵 주입법도 용이하지 않은 것으로 밝혀져, 유전자 이식 랫트를 제조하는데 있어서 그 성공률이 좋지 않았다. 문헌 [Michalkiewicz et al ., (2007) J. Amer . Phys . Society 293:H881-H894]은 강화된 녹색 형광 단백질 (eGFP) 리포터 유전자를 발현하는 렌티바이러스 구축물을 이용한 유전자 이식 랫트의 제조에 대해 보고하였는데, 여기에서 eGFP 이식 유전자는 유전체 내의 임의 부위에 무작위적으로 통합된 1-4개의 카피(복제물)로 존재하는 것으로 밝혀졌다.
표적화 방식으로 랫트의 유전체를 변형시키는 방법에 대한 필요성이 대두되고 있다. 유전자 자리를 정확하게 표적으로 겨냥하여 부위 특이적으로 절단하게 되면, 기존의 상동성 재조합 방식에 대해서 유효한 보완책 및/또는 대안책을 제공할 수 있다. 이중 가닥 절단 (DSB)의 발생은 그 표적 자리에서 상동성 재조합의 빈도를 1000배 이상 증가시킨다. 더 간단히 말하면, 비상동성 말단 봉합 (NHEJ)에 의한 부위 특이적 DSB의 부정확한 복구로 유전자가 파괴될 수도 있다. 이러한 두 DSB가 발생하게 되면 이는 뜻하지 아니하게 넓은 영역이 결실되는 결과로 이어진다. 징크 핑거 단백질이 모듈 방식의 DNA 인식을 선호하는 것은 부위 특이적 멀티 핑거 DNA 결합 단백질의 합리적인 설계를 가능케 한다. IIS형 제한 효소인 FokI의 뉴클레아제 도메인에 부위 특이적 징크 핑거 단백질을 융합시키면, 부위 특이적 뉴클레아제의 생성이 가능하다. 예를 들어, 미국특허공보 제20030232410호; 제20050208489호; 제20050026157호; 제20050064474호; 제20060188987호; 제20060063231호; 제20070134796호; 제2008015164호; 제20080131962호; 제2008015996호 및 국제특허공보 WO 07/014275 및 WO 2008/133938 (이들은 모두 징크 핑거 뉴클레아제의 사용을 기술하고 있으며, 상기 문헌들은 그 내용 전체가 여하의 목적 하에 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다.
발명의 개요
본원에서는, 랫트의 유전체 편집, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 하나 이상의 랫트 유전자에서 표적화 변형 (삽입, 결실 및/또는 치환 돌연변이)을 유도하는, 랫트에 있어서 하나 이상의 유전자를 절단하는 단계, 예컨대 이러한 표적화 변형물을 생식 세포 내로 도입하는 단계; 비내인성 핵산 서열의 표적화 도입, 랫트에서 하나 이상의 유전자의 부분 또는 완전 비활성화; 상동성 지향 복구 유도 방법 및/또는 랫트 유전자의 신규한 대립 형질을 암호화하는 무작위 돌연변이 생성 방법을 위한 조성물이 개시된다.
한 측면에서, 랫트 유전체의 관심 영역 내의 표적 부위에 결합하는 징크 핑거 단백질 (ZFP)이 본원에 개시되는데, 여기에서, ZFP는 하나 이상의 조작된 징크 핑거 결합 도메인을 포함한다. 한 실시 양태에서, ZFP는 랫트에서 관심 대상인 표적 유전체 영역을 절단하는 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN)이며, 여기에서 ZFN은 하나 이상의 조작된 징크 핑거 결합 도메인과 뉴클레아제 절단 도메인 또는 절단 절반-도메인을 포함한다. 절단 도메인과 절단 절반-도메인은, 예를 들어, 다양한 제한 엔도뉴클레아제 및/또는 귀소성(homing) 엔도뉴클레아제로부터 수득될 수 있다. 한 실시 양태에서, 상기 절단 절반-도메인은 IIS형 제한 엔도뉴클레아제 (예를 들어, FokI)로부터 유래된다. ZFN은 하나의 특정한 랫트 유전자 서열을 특이적으로 절단할 수 있다. 다르게는, ZFN은 2개 이상의 상동성인 랫트 유전자 서열을 절단할 수 있다.
ZFN은 유전자의 암호화 영역 내, 또는 유전자 내부 혹은 유전자에 인접한 비암호화 영역, 예컨대, 리더(leader) 서열, 트레일러(trailer) 서열 또는 인트론 내, 또는 암호화 영역의 상류 또는 하류의 비전사 영역 내의 랫트 유전자에 결합하고/하거나 이를 절단할 수 있다. 특정 실시 양태에서, ZFN은 표적 랫트 유전자의 암호화 서열 또는 조절 서열에 결합하고/하거나 이를 절단한다.
다른 측면에서, 본원에 기술된 하나 이상의 징크 핑거 뉴클레아제를 포함하는 조성물이 본원에 기술된다. 특정 실시 양태에서, 상기 조성물은 하나 이상의 징크 핑거 뉴클레아제를 약학적으로 허용가능한 부형제와 함께 포함한다.
다른 측면에서, 본원에 기술된 하나 이상의 ZFN을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 본원에 기술된다. 상기 폴리뉴클레오타이드는, 예를 들어, mRNA일 수 있다.
다른 측면에서, 프로모터에 작동가능하게 연결된 것으로서, 본원에 기술된 하나 이상의 ZFN을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 ZFN 발현 벡터가 본원에 기술된다.
다른 측면에서, 하나 이상의 ZFN 발현 벡터를 포함하는 랫트 숙주 세포가 본원에 기술된다. 상기 랫트 숙주 세포는 하나 이상의 ZFP 발현 벡터를 사용하여 안정하게 형질전환되거나, 또는 일시적으로 형질감염되거나, 또는 이들을 조합하여 처리할 수 있다. 한 실시 양태에서, 상기 랫트 숙주 세포는 배아 줄기 세포이다. 다른 실시 양태에서, 상기 하나 이상의 ZFP 발현 벡터는 상기 랫트 숙주 세포에서 하나 이상의 ZFN을 발현한다. 다른 실시 양태에서, 상기 랫트 숙주 세포는 외인성 폴리뉴클레오타이드 공여자 서열을 더 포함할 수 있다. 임의의 실시 양태에서, 본원에 기술된, 상기 랫트 숙주 세포는 배아 세포, 예를 들어 하나 이상의 배아 세포를 포함할 수 있다.
다른 측면에서, 랫트 세포 내에서 하나 이상의 유전자를 절단하는 방법이 본원에 기술되는데, 상기 방법은 (a) ZFN(들)이 발현되고 상기 하나 이상의 유전자가 절단되도록 하는 조건 하에서, 상기 하나 이상의 유전자 내의 표적 부위에 결합하는, 하나 이상의 ZFN을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 랫트 세포 내에 도입하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 랫트 세포의 유전체 내에 외인성 서열을 도입하는 방법이 본원에 기술되는데, 상기 방법은 (a) ZFN(들)이 발현되고 상기 하나 이상의 유전자가 절단되도록 하는 조건 하에서, 상기 하나 이상의 유전자 내의 표적 부위에 결합하는, 하나 이상의 ZFN을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 랫트 세포 내에 도입하는 단계; 및 (b) 상기 세포를 외인성 폴리뉴클레오타이드와 접촉시키는 단계를 포함하여, 상기 유전자(들)의 절단은 상동성 재조합에 의해 외인성 폴리뉴클레오타이드를 유전체 내로 통합되는 과정을 촉진한다. 특정 실시 양태에서, 상기 외인성 폴리뉴클레오타이드는 유전체 내에 물리적으로 통합된다. 다른 실시 양태에서, 상기 외인성 폴리뉴클레오타이드는, 핵산 복제 과정 (예를 들어, 이중 가닥 절단의 상동성 지향 복구)을 통해 숙주 세포 유전체 내로 외인성 서열을 복제하여 넣음으로써 유전체 내에 통합된다. 다른 실시 양태에서, 유전체 내 통합은 비상동성 의존형 표적화 통합 (예를 들어 "말단-포획)을 통해 일어난다. 특정 실시 양태에서, 상기 하나 이상의 뉴클레아제는 IIS형 제한 엔도뉴클레아제의 절단 도메인과 조작된 징크 핑거 결합 도메인의 융합체이다.
다른 실시 양태에서, 랫트 세포의 유전체 내의 하나 이상의 유전자 서열을 변형시키는 방법이 본원에 기술되는데, 상기 방법은 (a) 하나 이상의 표적 유전자 서열을 포함하는 랫트 세포를 제공하는 단계; 및 (b) 상기 세포 내에서 제1 및 제2 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN)를 발현시키는 단계를 포함하며, 여기에서 상기 제1 ZFN은 제1 절단 부위에서 절단하고, 제2 ZFN은 제2 절단 부위에서 절단하며, 상기 유전자 서열은 상기 제1 절단 부위와 제2 절단 부위 사이에 위치하고, 제1 및 제2 절단 부위의 절단은 비상동성 말단 봉합에 의해 상기 유전자 서열의 변형을 초래한다. 특정 실시 양태에서, 비상동성 말단 봉합은 제1 및 제2 절단 부위 간의 결실을 초래한다. 상기 유전자 서열에서의 결실 크기는 제1 및 제2 절단 부위 간의 거리에 의해 결정된다. 따라서, 관심 대상인 임의의 유전자 영역에서 임의 크기의 결실이 수득될 수 있다. 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000개의 뉴클레오타이드 쌍의 결실, 또는 이 범위 내 임의의 정수값의 뉴클레오타이드 쌍이 얻어질 수 있다. 임의의 정수값의 뉴클레오타이드 쌍을 갖는 서열의 결실 이외에도, 본원에 개시된 방법과 조성물을 이용하여 1,000개 이상의 뉴클레오타이드 쌍도 얻어질 수 있다. 다른 실시 양태에서, 비상동성 말단 봉합은 제1 및 제2 절단 부위 간에 삽입을 초래한다. 본원에 기술된 랫트의 유전체를 변형시키는 방법은, 예를 들어 유전자를 (부분적으로 혹은 전체적으로) 비활성화시킴으로써, 또는 유전자의 신규한 대립 형질을 수반하는 유전자 이식 랫트의 동정 또는 선별이 가능하도록 유전자의 정해진 위치에 무작위 돌연변이를 생성시킴으로써, 또는 (비제한적인 예로서, 약물 대사를 연구하기 위한) 인간화 랫트 유전자를 삽입함으로써, 또는 예를 들어, 돌연변이 대립 형질의 표현형 효과를 확인하기 위해 관심 대상인 돌연변이 대립 형질을 삽입함으로써, 동물 (예를 들어, 인간) 질병 모델을 창출하는데 사용될 수 있다.
또 다른 측면에서, 랫트에서 하나 이상의 표적 유전자의 생식 세포를 붕괴시키는 방법이 본원에 기술되는데, 상기 방법은 본원에 기술된 임의의 방법을 사용하여 랫트 배아의 하나 이상의 세포의 유전체 내에서 하나 이상의 유전자 서열을 변형시키는 단계; 및 상기 랫트 배아를 성장시키는 단계를 포함하며, 여기에서 상기 변형된 유전자 서열은 성적으로 성숙한 랫트의 적어도 일부의 생식 세포 내에 존재한다.
다른 측면에서, 관심 대상인 랫트 유전자 자리에 하나 이상의 유전성 돌연변이 대립 형질을 생성시키는 방법이 본원에 기술되는데, 상기 방법은 본원에 기술된 임의의 방법을 사용하여 랫트 배아의 하나 이상의 세포의 유전체 내에서 하나 이상의 유전자 자리를 변형시키는 단계; 상기 랫트 배아를 성적으로 성숙되도록 성장시키는 단계; 및 상기 성적으로 성숙한 랫트가 자손을 번식하도록 하는 단계를 포함하며, 여기에서 적어도 일부의 자손은 상기 돌연변이 대립 형질을 포함한다.
본원에 기술된 임의의 방법에 있어서, 징크 핑거 뉴클레아제(들)을 암호화하는 상기 폴리뉴클레오타이드는 DNA, RNA 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있다. 특정 실시 양태에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 플라스미드를 포함한다. 다른 실시 양태에서, 뉴클레아제를 암호화하는 상기 폴리뉴클레오타이드는 mRNA를 포함한다.
또 다른 추가의 측면에서, 염색체 내에 핵산 서열을 부위 특이적으로 통합하는 방법이 본원에 기술된다. 특정 실시 양태에서, 상기 방법은 (a) (i) 하나 이상의 DNA 벡터 (여기에서, 상기 DNA 벡터는 통합될 핵산 서열에 측접하는 상류 서열 및 하류 서열을 포함함)와 (ii) 통합 염색체 부위를 인식하는 징크 핑거 뉴클레아제를 암호화하는 하나 이상의 RNA 분자를 배아에 주입하는 단계; 및 (b) 상기 배아를 배양하여 징크 핑거 뉴클레아제를 발현토록 하는 단계를 포함하며, 여기에서 염색체 내로 상기 핵산 서열을 통합시키기 위해, 징크 핑거 뉴클레아제에 의해 통합 부위 내로 도입된 이중 가닥 절단은, DNA 벡터를 사용한 상동성 재조합을 통해 복구된다. 적절한 배아는 여러 가지 다른 척추동물 종, 예컨대 포유동물, 조류, 파충류, 양서류 및 어류 종에서 유래할 수 있다. 대체로, 적절한 배아는 징크 핑거 뉴클레아제의 발현이 가능하도록 수집, 주입 및 배양될 수 있는 배아이다. 일부 실시 양태에서, 적절한 배아로서는 설치류, 애완 동물, 가축 및 영장류를 포함할 수 있다. 설치류의 비제한적인 예로서는, 마우스, 랫트, 햄스터, 게르빌루스쥐 및 기니아 피그를 포함할 수 있다. 애완 동물의 비제한적인 예로서는, 고양이, 개, 토끼, 고슴도치 및 흰족제비를 포함할 수 있다. 가축의 비제한적인 예로서는, 말, 염소, 양, 돼지, 라마, 알파카 및 소를 포함할 수 있다. 영장류의 비제한적인 예로서는, 흰목꼬리감기 원숭이, 침팬지, 여우원숭이, 마카크, 마모셋, 타마린, 거미원숭이, 다람쥐원숭이 및 긴꼬리원숭이를 포함할 수 있다. 다른 실시 양태에서, 적절한 배아로서는 어류, 파충류, 양서류, 또는 조류의 배아를 포함할 수 있다. 다르게는, 적절한 배아는 곤충 배아, 예컨대 초파리 배아 또는 모기 배아일 수 있다.
또한, 하나 이상의 DNA 벡터 (여기에서, 상기 DNA 벡터는 통합될 핵산 서열에 측접하는 상류 서열 및 하류 서열을 포함함), 및 통합 염색체 부위를 인식하는 징크 핑거 뉴클레아제를 암호화하는 하나 이상의 RNA 분자를 포함하는 배아가 제공된다. 또한, 본원에 기술된 임의의 배아로부터 유래한 유기체도 제공된다.
도 1은 랫트 C6 세포에서의 p53-특이적 ZFN 쌍의 Surveyor™ 뉴클레아제 ("CEL-I") 분석 결과를 나타낸 것이다. 각 레인에서 사용된 ZFN 쌍은 레인 위에 나타내었고, Surveyor 미스매치(mismatch) 분석으로 측정한 % NHEJ 활성은 맨 아래에 나타냈다.
도 2는 eGFP 유전자를 수반하는 랫트 C6 세포에서 eGFP-표적화 ZFN 쌍 16834/16833, 16856/16855 및 16859/16860의 Surveyor™ 뉴클레아제 ("CEL-I") 분석 결과를 나타낸 것이다. 사용된 ZFN 쌍은 각 레인의 위에 나타내었고, % 비상동성 말단 봉합 (%NHEJ)은 각 레인 아래에 적절히 표시하였다.
도 3은 유전자 이식 GFP 랫트에서 ZFN을 사용한 GFP 이식 유전자의 표적화 변형을 도해로 나타낸 것이다.
도 4의 패널 A와 B는 유전자 이식 GFP 랫트에서 얻은 배아 내로 GFP-표적화 ZFN을 전핵 주입하여 태어난 랫트 새끼에 있어서, ZFN에 의한 GFP의 표적화 붕괴를 나타낸 것이다. 도 4A는 자외선 아래의 5마리의 새끼를 나타낸 것인데, 3마리는 GFP 양성인 동물로 드러났으며, 2마리는 GFP를 발현하지 않는 것 (GFP-음성)으로 드러났다. 도 4B는 GFP+와 GFP-인 새끼의 꼬리 조직 검사의 PCR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 CMV 프로모터 (CMV) 또는 CAG 프로모터 (CAG)에 의해 유도된 ZFN 쌍을 사용한, C6 세포에서의 외인성 IgM 엑손 1의 ZFN-매개성 절단을 나타내고 있다. "결합된"이라는 말은 동일한 플라스미드 상에 2A 펩타이드에 의해 결합된 ZFN 쌍을 지칭하는 반면, "결합되지 않은"이라는 말은 2A 펩타이드에 의해 결합되지 않은 ZFN 쌍을 가리킨다.
도 6은 IgM ZFN-주입된 단세포 배아가 정상적으로 출생하여 성장한 43마리의 꼬리에서 유래한 유전체 DNA를 Surveyor™ 뉴클레아제에 의해 분석한 것을 나타낸 것이다. 표시되어 있는 바와 같이, 랫트 #6, 7, 8, 19 및 46은 IgM 유전자 자리에서의 변형에 대해 양성으로 스코어링되었다. 흰색 숫자와 함께 막대로 표시된 부분은 개별 (번호가 매겨진) 어미로부터 태어난 새끼를 가리킨다.
도 7은 유전체 내에 ZFN 플라스미드 삽입을 위해 IgM 변형된 랫트 (도 6에서 확인된 #6, 7, 8, 19 및 46)의 PCR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 8의 패널 A와 B는 IgM 변형된 랫트 #19의 CEL-I 및 시퀀싱 분석을 나타낸 것이다. WT, 랫트 19 야생형 대립 형질 및 랫트 19 결실형 대립 형질 서열들의 정렬 (패널 8B)은 랫트 19 결실형 대립 형질에서 서열들이 결실되었음을 보여주고 있다.
도 9의 패널 A-C는 서로 다른 8개의 비표적 부위에서의 활성에 대하여 IgM 변형된 랫트 (도 6에서 확인된 #6, 7, 8, 19 및 46)를 분석한 것을 나타낸 것이다. 비표적 부위 (부위 1, 부위 2 등)는 표 9에 기술된 바와 같다.
도 10은 Rab38의 ZFN 매개성 변형에 대한 서열 분석을 나타낸 것이다. 본 도면에서는 2개의 결실형 대립 형질 (Δ6 및 Δ42)을 갖는 야생형 대립 형질의 배열이 나타나 있다.
도 11의 패널 A-C는 ZFN-IgM 변형된 랫트와 야생형 랫트를 교배하여 얻어진 새끼를 분석한 것을 나타낸 것이다. 도 11A는 랫트 #19 (실시예 3)와 야생형 랫트를 교배하여 나온 5마리의 새끼 (번호 224-228)의 PCR 및 CEL-I 분석을 나타낸 것이다. 도 11B는 3마리의 IgM 변형된 새끼 (도면에서 확인된 # 225, 227 및 228)가 IgM 유전자 자리에서 부모 랫트 #19와 동일한 64개 염기쌍의 결실형 대립 형질을 포함하고 있다는 사실이 시퀀싱 분석을 통해 확인되었음을 보여주고 있다. 도 11C는 랫트 #19의 새로 추가된 새끼뿐만 아니라 IgM 변형된 랫트 #46과 #8을 교배하여 나온 새끼에 대한 PCR 및 CEL-I 추가 분석을 나타낸 것이다. IgM-변형된 부모 랫트는 맨 위에 "F0" 자리에 나타냈으며, 새끼들의 수는 각 레인 위에 나타냈다.
도 12는 표적화 ZFN으로 유도된 이중 가닥 절단 이후에 복구 결과를 개략적으로 나타낸 그림이다. 음영으로 처리된 막대는 공여자 단편을 나타내며, 흰색 막대는 ZFN 이중 가닥 절단을 위한 표적 부위를 나타낸다.
도 13은 RFLP 공여자 플라스미드의 구축을 개략적으로 표현한 그림이다. 플라스미드 및 통합 표적 부위에 상동성인 PCR-증폭 단편 (좌, 우)이 나타나 있다. 클로닝에 사용된 제한 효소를 표시하였다. 좌측 단편은 KpnI과 NotI 또는 PmeI를 사용하였다. 우측 단편은 NotI 또는 PmeI와 SacII를 사용하였다.
도 14는 GFP를 발현하는 공여자 플라스미드의 구축을 개략적으로 표현한 그림이다. GFP 카세트는 기존의 플라스미드에서 PCR 증폭되어 NotI 부위를 사용해 NotI RFLP 공여자 내로 클로닝되었다.
도 15의 패널 A와 B는 RFLP 통합을 검출하는 방법을 나타낸 것이다. 도 15A는 RFLP 통합과 제한 효소의 소화 분해를 검출하는 방법을 개략적으로 나타낸 그림이다. 도 15B는 PCR 증폭을 사용한 GFP 발현 카세트의 통합을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 16은 아가로스 겔 상에 용해된 형광 염색 PCR 단편들의 사진 이미지이다. 맨 좌측 레인은 DNA 사다리 (ladder)를 포함한다. 레인 1-6은 마우스 배반포 전체 혹은 일부 분획에서 유래한 마우스 Mdr1a-특이적 프라이머를 사용해 증폭된 PCR 단편들을 포함한다. 레인 1과 2는 각각 5/6 및 1/6의 배반포로부터 증폭되었다. 레인 3은 하나의 전체 배반포로부터 유래하였다. 레인 4-6은 각각 1/2, 1/3 및 1/6의 동일한 배반포로부터 유래하였다. 레인 7은 추출된 마우스 발가락 DNA와 동일한 프라이머를 사용해 증폭된 양성 대조군 PCR 단편을 포함한다.
도 17의 패널 A와 B는 아가로스 겔 상에 용해된 형광 염색 PCR 단편들의 사진 이미지이다. 맨 좌측 레인은 DNA 사다리를 포함한다. 도 17A의 레인 1-39는, PCR 증폭을 위한 하나의 양성 및 음성 대조군과 함께, NotI 부위를 갖는 마우스 Mdr1a 및 RFLP 공여자에 대해 ZFN RNA를 미량 주입한 후, 시험관 내에서 배양된 37마리의 마우스 배아에서 유래한 mMdr1a-특이적 프라이머를 사용해 증폭된 PCR 단편들을 포함한다. 도 17B의 레인 1-39는 Surveyor™ 돌연변이 검출 분석법을 수행한 이후 도 17A의 PCR 단편들을 포함한다.
도 18의 패널 A와 B는 아가로스 겔 상에 용해된 형광 염색 PCR 단편들의 사진 이미지이다. 맨 좌측과 맨 우측 레인은 DNA 사다리를 포함한다. 이 레인들은 도 17에 나타난 마우스 배아의 mMdr1a-특이적 프라이머를 사용해 증폭된 후, PCR 생성물 정제없이 NotI로 소화 분해된 PCR 단편들을 포함한다. 도 18B는 도 18A와 동일한 겔을 더 장시간 가동시킨 것이다. 절단되지 않은 PCR 생성물들은 1.8 kb 근방이며, 소화 분해된 생성물들은 900 bp 근방의 2개의 밴드이다.
도 19는 아가로스 겔 상에 용해된 형광 염색 PCR 단편들의 사진 이미지이다. 맨 좌측 레인은 DNA 사다리를 포함한다. 레인 1-6은, NotI가 그 최적의 버퍼 중에서 작용하도록 PCR 생성물을 컬럼 정제한 후 NotI로 소화 분해된 도 18에 보이는 일부 PCR 단편들을 포함한다. 레인 7과 8은 NotI로 소화 분해된 2개의 샘플 (도 18)이다. 이 겔은 PCR 반응에서 NotI 소화 분해가 완벽했음을 보여준다.
도 20은 아가로스 겔 상에 용해된 형광 염색 PCR 단편들의 사진 이미지이다. 맨 좌측 레인은 DNA 사다리를 포함한다. 레인 1-5는 1, 1/2, 1/6, 1/10, 1/30의 랫트 배반포 유래의 PXR-특이적 프라이머를 사용해 증폭된 PCR 단편들을 포함한다. 레인 6은 정제된 스프래그 다우리 (Sprague Dawley) 유전체 DNA와 동일한 프라이머를 사용해 증폭된 양성 대조군이다.
도 21의 패널 A와 B는 아가로스 겔 상에 용해된 형광 염색 PCR 단편들의 사진 이미지이다. 맨 좌측과 맨 우측 레인은 DNA 사다리를 포함한다. 도 21A는 PXR ZFN mRNA와 NotI RFLP 공여자를 미세 주입한 후 시험관 내에서 배양된 랫트 배아로부터 PXR-특이적 프라이머를 사용하여 증폭된 후 NotI로 소화 분해된 PCR 단편들을 나타내고 있다. 도 21B는 Surveyor™ 돌연변이 검출 분석법을 수행한 후 도 21A에서와 동일한 PCR 단편들을 나타내고 있다.
도 22는 아가로스 겔 상에 용해된 형광 염색 PCR 단편들의 사진 이미지이다. 상기 첫 4개의 레인들은 mMdr1a ZFN mRNA 및 NotI RFLP 공여자를 주입한 배아에서 수태 후 12.5일 되는 시점에 건강하게 성장한 4마리의 태아로부터 증폭된 PCR이다. 상기 PCR은 NotI로 소화 분해되었다. 레인 4는 양성이다. 레인 5-8은 4개의 유산된 착상인 탈락막이다. 4개 모두 음성이었다.
도 23의 패널 A-E는 아가로스 겔 상에 용해된 형광 염색 PCR 단편들의 개략적인 그림과 사진 이미지이다. 도 23A는 사용된 프라이머의 위치를 보여주는 개략적인 그림이다. 도 23B과 23C는 프라이머 PF와 GR의 결과를 나타낸다. 도 23D와 23E는 프라이머 PR + GF의 결과를 나타낸다. 예측된 단편의 크기는 2.4 kb이다. 40마리의 태아들 중에서 2마리가 GFP에 대해 양성이었다.
도 24는 아가로스 겔 상에 용해된 DNA 단편들의 사진 이미지이다. 레인 8은 NotI 부위에 대해 양성인 13 dpc 태아를 나타낸다.
상세한 설명
랫트의 유전체 편집 [예를 들어, 유전자의 절단; 유전자의 변형 예컨대, 절단 후 외인성 서열의 삽입 (물리적 삽입 또는 상동성 지향 복구를 통한 복제에 의한 삽입) 및/또는 절단 후 비상동성 말단 봉합 (NHEJ)에 의한 유전자의 변형; 하나 이상의 유전자의 부분 비활성화 또는 완전 비활성화; 외인성 유전자의 변형된 발현을 유발시키기 위한 무작위 돌연변이를 갖는 대립 형질의 제조 등] 및 생식 세포 내로 이동된 랫트 유전체의 변형을 위한 조성물 및 방법이 본원에 개시된다. 또한, 예를 들어, 표적 랫트 세포에서 하나 이상의 유전자를 편집 (변형)하기 위한 이러한 조성물 (시약)의 제조 및 사용 방법도 개시된다. 따라서, 본원에 기술된 상기 방법과 조성물은, 하나 이상의 랫트 유전자의 표적화 유전자 변형 [예를 들어, 녹인 (knock-in) 및/또는 녹아웃(knockout) (부분 또는 완전)] 및/또는 임의의 표적 대립 형질 서열의 무작위 돌연변이 유발을 위한 매우 효율적인 방법을 제공하기 때문에, 인간 질병의 동물 모델을 창출할 수가 있다.
본원에 기술된 상기 조성물과 방법은, 노동 집약적인 선별 및/또는 스크리닝이 필요하지 않으면서도 비표적 부위에 대한 영향을 최소로 할 수 있는, 랫트에 있어서 신속하고, 완벽하며, 영구적인 내인성 유전자 자리의 표적화 붕괴 과정을 제공한다. 또한, 동물 유전자 전체의 녹아웃도 ZFN mRNA 또는 ZFN 발현 카세트를 주입하여 한 번의 과정으로 쉽게 달성될 수 있다.
일반론
방법의 실시, 그리고 본 발명에 개시된 조성물의 제조와 사용에 있어서는, 달리 언급되지 않는 한, 분자생물학, 생화학, 염색질 구조 및 분석, 컴퓨터 계산 화학, 세포 배양, 재조합 DNA 및 해당 업계 종사자의 통상적인 기술에 속하는 관련 분야의 종래 기법들이 활용된다. 이러한 기법들은 기존의 문헌에 상세하게 설명되어 있다. 예컨대, 문헌 [Sambrook et al ., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 and Third edition, 2001]; [Ausubel et al ., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987] 및 정례 업데이트물; 연속 간행물 [METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego]; [Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998]; [METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol.304, "Chromatin" (P.M. Wassarman and A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999]; [METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, "Chromatin Protocols" (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999]를 참조한다.
정의
"핵산", "폴리뉴클레오타이드" 및 "올리고뉴클레오타이드"는 동의어로서 사용되어, 선형 또는 고리형 구조, 그리고 단일- 또는 이중-가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 중합체를 지칭한다. 본 발명의 개시 내용의 목적상, 이러한 용어는 중합체의 길이를 한정하는 것으로 해석되어서는 않는다. 상기 용어는 천연 뉴클레오타이드의 공지된 유사체뿐만 아니라, 염기, 당 및/또는 인산염 부분 (예를 들어, 포스포로티오에이트 백본)이 변형된 뉴클레오타이드를 포괄할 수 있다. 일반적으로, 특정 뉴클레오타이드의 유사체는 동일한 염기쌍 특이성을 가진다; 다시 말해서, A의 유사체는 T와 염기쌍을 형성할 것이다.
용어 "폴리펩타이드", "펩타이드", 및 "단백질"은 동의어로서 사용되어, 아미노산 잔기의 중합체를 지칭한다. 상기 용어는 하나 이상의 아미노산이 상응하는 자연-발생 아미노산의 화학적 유사체 또는 변형된 유도체인 아미노산 중합체에도 적용된다.
"결합"은 거대분자 사이 (예를 들어, 단백질과 핵산 사이)의 서열 특이적인 비공유성 상호작용을 지칭한다. 이러한 상호작용이 전체적으로 서열 특이적이기만 하면, 결합 상호작용의 모든 성분들이 서열 특이적일 필요는 없다 (예를 들어, DNA 백본의 인산염 잔기와의 접촉). 일반적으로, 이런 상호작용은 10-6 M-1 또는 그 이하의 해리 상수 (Kd)를 특징으로 한다. "친화도"라는 것은 결합 강도를 의미하는데, 결합 친화도의 증가는 더 낮은 Kd와 상관 관계가 있다.
"결합 단백질"은 다른 분자와 비공유적으로 결합할 수 있는 단백질이다. 결합 단백질은, 예를 들어, DNA 분자 (DNA-결합 단백질), RNA 분자 (RNA-결합 단백질) 및/또는 단백질 분자 (단백질-결합 단백질)와 결합할 수 있다. 단백질-결합 단백질의 경우에, 이것은 자기 자신과 결합할 수 있고 (동종이합체, 동종삼합체 등을 형성)/있거나, 서로 다른 단백질 또는 단백질들의 하나 이상의 분자와 결합할 수 있다. 결합 단백질은 한 가지 이상의 유형의 결합 활성을 보유할 수 있다. 예를 들어, 징크 핑거 단백질은 DNA-결합 활성, RNA-결합 활성 및 단백질-결합 활성을 보유한다.
"징크 핑거 DNA 결합 단백질" (또는 결합 도메인)은 하나 이상의 징크 핑거 (아연 이온의 배위 결합을 통하여 구조가 안정화되는 결합 도메인 내의 아미노산 서열의 영역)를 통하여 서열 특이적인 방식으로 DNA와 결합하는 단백질 또는 보다 큰 단백질 내의 도메인이다. 징크 핑거 DNA 결합 단백질이라는 용어는 흔히 징크 핑거 단백질 또는 ZFP로 약칭된다.
징크 핑거 결합 도메인은 미리 결정해 놓은 뉴클레오타이드 서열과 결합하도록 "조작"될 수 있다. 징크 핑거 단백질을 조작하는 방법의 비제한적인 예로서 설계 및 선별을 들 수 있다. 설계된 징크 핑거 단백질은 그 설계/조성이 주로 합리적인 기준으로부터 정해지는 것으로 자연에서 발생하지 않는 단백질이다. 설계를 위한 합리적인 기준에는 치환 규칙 및 기존의 ZFP 설계와 결합 데이터의 정보를 저장하고 있는 데이터베이스 정보 처리를 위한 컴퓨터를 이용한 알고리즘의 적용이 포함된다. 예를 들어, 미국등록특허 제6,140,081호; 제6,453,242호; 제6,534,261호; 및 WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 및 WO 03/016496을 참조한다.
"선별된" 징크 핑거 단백질은 파지 디스플레이, 상호작용 트랩 또는 하이브리드 선별과 같이 주로 실험적 과정의 결과로서 생산되는 것으로 자연에서 발견되지 않는 단백질이다. 예를 들어, 미국등록특허 제5,789,538호; 제5,925,523호; 제6,007,988호; 제6,013,453호; 제6,200,759호; WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970; WO 01/88197 및 WO 02/099084를 참조한다.
용어 "서열"은 임의의 길이의 뉴클레오타이드 서열을 지칭하는데, 이는 DNA 또는 RNA일 수 있고, 선형, 고리형 또는 분지형일 수 있으며, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. "공여자 서열"이라는 용어는 유전체 내로 삽입되는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 공여자 서열은 임의의 길이, 예를 들어, 2개 내지 10,000개의 뉴클레오타이드 길이 (또는 상기 범위 사이 또는 상기 범위를 초과하는 임의의 정수 값), 바람직하게는, 약 100개 내지 1,000개의 뉴클레오타이드 (또는 상기 범위 사이의 임의의 정수), 더욱 바람직하게는, 약 200개 내지 500개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다.
"상동성 비동일 서열"은 제2 서열과 어느 정도의 서열 동일성을 공유하지만, 서열 자체는 제2 서열과 동일하지는 않은 제1 서열을 지칭한다. 예를 들어, 돌연변이 유전자의 야생형 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 상기 돌연변이 유전자의 서열과 상동성이긴 하지만 동일하지는 않다. 특정 실시 양태에서, 2개 서열 간의 상동성 정도는, 정상적인 세포 기작을 이용해 이들 사이에 상동성 재조합이 일어나도록 하는데 충분하다. 2개의 상동성 비동일 서열은 임의의 길이일 수 있으며, 이들의 비상동성 정도는 단일 뉴클레오타이드만큼 작거나 (예를 들어, 표적화 상동성 재조합에 의한 유전체 점 돌연변이를 보정하는 경우), 또는 10 kb 이상만큼 클 수 있다 [예를 들어, 염색체 내의 미리 정해 놓은 이소성 부위 (ectopic site)에 유전자를 삽입하는 경우]. 상동성 비동일 서열을 포함하는 2개의 폴리뉴클레오타이드는 길이가 동일할 필요는 없다. 예를 들어, 20개 내지 10,000개의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 쌍의 외인성 폴리뉴클레오타이드 (즉, 공여자 폴리뉴클레오타이드)가 이용될 수 있다.
핵산 및 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 기법은 해당 업계에 공지되어 있다. 보통, 이러한 기법들은 유전자에 대한 mRNA의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 단계 및/또는 이로 인해 암호화되는 아미노산 서열을 결정하는 단계, 그리고 이러한 서열을 제2 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열과 비교하는 단계를 포함한다. 유전체 서열 역시 이러한 방식으로 결정되어 비교될 수 있다. 일반적으로, 동일성은 2개의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열 각각의 정확한 뉴클레오타이드-대-뉴클레오타이드 또는 아미노산-대-아미노산 대응을 말한다. 2개 이상의 서열 (폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산)은 그들의 동일성 %를 측정함으로써 비교할 수 있다. 핵산 서열이든 아미노산 서열이든 간에 2개 서열의 동일성 %는, 2개의 배열된 서열 간에 정확하게 일치(match)되는 수를 이들 중 짧은 서열의 길이로 나눈 후 여기에 100을 곱한 것이다. 핵산 서열에 대한 근사적 정렬은 문헌 [Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)]의 국소 상동성 알고리즘에 의해 제공된다. 상기 알고리즘은 데이호프 (Dayhoff) (문헌 [Atlas of Protein Sequences and Structure. M.O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington D.C. USA])에 의해 개발되고, 그립스코브 (Gribskov) (문헌 [Nucl . Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986)])에 의해 표준화된 스코어링 매트릭스(scoring matrix)를 이용하여 아미노산 서열에 적용할 수 있다. 서열의 동일성 %를 결정하기 위한 이러한 알고리즘의 예시적 수행은 제네틱스 컴퓨터 그룹 (Genetics Computer Group, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)에 의해 "BestFit" 유틸리티 응용 프로그램으로 제공된다. 상기 방법을 위한 디폴트 매개변수들은 위스콘신 서열 분석 패키지 프로그램 매뉴얼 (Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual, Ver.8, 1995) (미국 위스콘신주 매디슨 소재의 제네틱스 컴퓨터 그룹에서 이용가능)에 기술되어 있다. 본 발명의 개시 내용과 관련해 동일성 %를 수립하는 바람직한 방법은 MPSRCH 패키지 프로그램 [저작권: 에든버러 대학 (University of Edinburgh), 개발자: 존 에프. 콜린스 (John F. Collins) 및 세인 에스. 스터록 (Shane S. Sturrok), 판매: 인텔리제네틱스 인코포레이티드 (IntelliGenetics, Inc.) (미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재)]을 사용하는 것이다. 상기 패키지 묶음에서, 스미스-워터맨 (Smith-Waterman) 알고리즘은 스코어링 표에 디폴트 매개변수가 사용되는 곳에서 사용될 수 있다 (예를 들어, 12의 갭 개방 벌점, 1의 갭 확장 벌점 및 6의 갭). 생성된 데이터에서 "일치" 값은 서열 동일성을 반영하는 것이다. 서열 간의 동일성 또는 유사성 %를 계산하는데 적합한 다른 프로그램도 해당 업계에 일반적으로 공지되어 있는데, 예를 들어, 다른 정렬 프로그램은 디폴트 매개변수로 사용되는 BLAST이다. 예를 들어, 하기의 디폴트 매개변수를 이용한 BLASTN 및 BLASTP가 이용될 수 있다: 유전자 코드 = 표준; 필터 = 없음; 가닥 = 양쪽; 컷오프 = 60; 예상 = 10; 매트릭스 = BLOSUM62; 설명 = 50개 서열; 분류 방식 = HIGH SCORE; 데이터베이스 = 비중복성, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS 번역 + Swiss 단백질 + Spupdate + PIR. 이러한 프로그램에 관한 상세한 사항은 하기 인터넷 주소에서 확인할 수 있다: http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST. 본원에서 설명된 서열과 관련하여, 원하는 서열 동일성 정도의 범위는 대략 80% 내지 100% 및 이 범위 사이에 임의의 정수 값이다. 보통, 서열 간의 동일성 %는 적어도 70-75%, 바람직하게는 80-82%, 더욱 바람직하게는 85-90%, 이보다 더 바람직하게는 92%, 훨씬 더 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 98%이다.
다르게는, 폴리뉴클레오타이드 간의 서열 유사성 정도는, 상동성 영역 간 안정한 이중 가닥 (duplex)의 형성을 가능하게 하는 조건 하에서 폴리뉴클레오타이드를 하이브리드화한 후, 단일 가닥 특이적 뉴클레아제(들)로 소화 분해하여 상기 소화 분해된 단편의 크기를 측정함으로써 결정할 수 있다. 2개의 핵산, 또는 2개의 폴리펩타이드 서열은, 이들 서열에 대해 상기 방법을 이용하여 측정했을 때 분자의 정해진 길이에 대하여 적어도 대략 70%-75%, 바람직하게는 80%-82%, 더욱 바람직하게는 85%-90%, 이보다 더욱 바람직하게는 92%, 훨씬 더 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 98%의 서열 동일성을 나타내는 경우에, 서로에 대하여 실질적으로 상동성이다. 본 명세서에서, 실질적으로 상동성이라는 것은 또한 명시된 DNA 또는 폴리펩타이드 서열과 완전한 동일성을 나타내는 서열을 말한다. 실질적으로 상동성인 DNA 서열은, 예를 들어, 특정 시스템에 대해 정의되는 바와 같은 엄중 조건 하에서의 서던 하이브리드화 실험으로 확인될 수 있다. 적합한 하이브리드화 조건을 규정하는 것은 해당 업계의 통상적인 기술에 속한다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., 상기와 동일]; [Nucleic Acid Hybridization : A Practical Approach, editors B.D. Hames and S.J. Higgins, (1985) Oxford; Washington, DC; IRL Press]를 참조한다.
2개의 핵산 단편의 선택적인 하이브리드화는 하기와 같이 결정할 수 있다. 2개의 핵산 분자 간의 서열 동일성 정도는 이들 분자 간의 하이브리드화 현상의 효율과 강도에 영향을 준다. 부분적으로 동일한 핵산 서열은 표적 분자와 완전하게 동일한 서열의 하이브리드화를 적어도 부분적으로는 억제할 것이다. 완전하게 동일한 서열의 하이브리드화의 억제는 해당 업계에 널리 공지된 하이브리드화 분석법(예를 들어, 서던(DNA) 블롯, 노던(RNA) 블롯, 용액 하이브리드화 등; 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.] 참조)을 사용하여 평가할 수 있다. 다양한 정도의 선택성, 예를 들어, 낮은 엄격성 내지 높은 엄격성에 이르는 다양한 조건을 이용하여 이러한 분석을 수행할 수 있다. 낮은 엄격성의 조건이 사용되는 경우, 비특이적인 결합의 부재는, 부분적인 정도의 서열 동일성조차도 결여된 2차 프로브 (예를 들어, 표적 분자와 대략 30% 미만의 서열 동일성을 갖는 프로브)를 이용하여 평가할 수 있으며, 이로써 비특이적인 결합 현상의 부재 하에서 2차 프로브는 표적과 하이브리드화하지 않을 것이다.
하이브리드화를 기반으로 한 검출 시스템을 이용하는 경우에, 기준 핵산 서열에 상보적인 핵산 프로브를 선택한 후, 적절한 조건을 선택하여 상기 프로브와 상기 기준 서열을 서로 선택적으로 하이브리드화하거나 결합시켜 이중 가닥의 분자를 형성한다. 중간 정도의 엄격성을 갖는 하이브리드화 조건 하에 기준 서열에 선택적으로 하이브리드화할 수 있는 핵산 분자는, 보통 선택된 핵산 프로브의 서열과 적어도 약 70% 서열 동일성을 갖는 약 10-14개 이상인 뉴클레오타이드 길이의 표적 핵산 서열의 검출이 가능한 조건 하에서 하이브리드화한다. 보통, 엄격한 하이브리드화 조건은 선택된 핵산 프로브의 서열과 약 90-95% 이상의 서열 동일성을 갖는 약 10-14개 이상인 뉴클레오타이드 길이의 표적 핵산 서열의 검출을 가능하게 한다. 프로브 및 기준 서열이 특정한 정도의 서열 동일성을 갖는 경우, 프로브/기준 서열 하이브리드화에 유용한 하이브리드화 조건은 해당 업계에 공지된 바와 같이 결정될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Nucleic Acid Hybridization : A Practical Approach, editors B.D. Hames and S.J. Higgins, (1985) Oxford; Washington, DC; IRL Press] 참조).
하이브리드화 조건은 해당 업계 종사자에게 널리 공지되어 있다. 하이브리드화 엄격성은, 하이브리드화 조건이 미스매치된 뉴클레오타이드를 함유하는 하이브리드의 형성을 꺼리는 정도를 말하며, 엄격성이 높을수록 미스매치 하이브리드에 대해 용인하는 정도(tolerance)가 낮은 상관 관계가 있다. 하이브리드화의 엄격성에 영향을 미치는 요인들은 해당 업계 종사자에게 널리 공지되어 있으며, 이에 제한되지는 않지만, 온도, pH, 이온 강도 및 유기 용매 (예컨대, 포름아미드 및 디메틸설폭사이드)의 농도를 포함한다. 해당 업계 종사자에게 공지된 바와 같이, 하이브리드화 엄격성은 온도가 높을수록, 이온 강도가 낮을수록 그리고 용매 농도가 낮을수록 증강된다.
하이브리드화를 위한 엄격성 조건에 대해, 특정한 엄격성을 수립하기 위해 예를 들어 하기의 요인들 [서열의 길이와 특성, 다양한 서열의 염기 조성, 염과 다른 하이브리드화 용액 성분의 농도, 하이브리드화 용액 중 차단제 (예를 들어, 덱스트란 술페이트 및 폴리에틸렌 글리콜)의 존재 또는 부재, 하이브리드화 반응 온도 및 시간 매개변수, 그리고 세척 조건]을 변화시킴으로써 수많은 균등 조건을 이용할 수 있다는 것이 해당 업계에 공지되어 있다. 특정 세트의 하이브리드화 조건의 선택은 해당 업계의 표준 방법을 따라 행한다 (예를 들어, 문헌 [Sambrook, et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual. Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.] 참조).
"재조합"은 두 폴리뉴클레오타이드 간에 유전 정보가 교환되는 과정을 지칭한다. 본 개시 내용의 목적상, "상동성 재조합 (HR)"이라는 것은 예를 들어, 상동성 지향 복구 기작을 통해 세포 내에서 이중 가닥 절단을 복구하는 동안 발생하는 이러한 교환의 특수한 형태를 지칭한다. 이러한 과정은 뉴클레오타이드 서열 상동성이 필요하고, "표적" 분자 (즉, 이중 가닥 절단을 거친 분자)의 주형 복구에 "공여자" 분자를 이용하며, "비교차성 (non-crossover) 유전자 전환" 또는 "숏 트랙 유전자 전환"으로서 다양하게 알려져 있는데, 그 이유는 이러한 과정에 의해 공여자로부터 표적으로의 유전 정보의 전달이 야기되기 때문이다. 이것을 어떤 특정한 이론으로 묶으려는 것은 아니지만, 이러한 전달은, 파괴된 표적과 공여자 간에 형성되는 이형성 이중 가닥 (heteroduplex) DNA의 미스매치 보정, 및/또는 공여자를 이용하여 표적의 일부가 될 유전자 정보를 재합성하는 "합성 의존성 가닥 어닐링 (synthesis-dependent strand annealing)", 및/또는 관련 공정들을 수반할 수 있다. 이런 특수화된 HR은 흔히 표적 분자 서열의 변형을 유발함으로써 공여자 폴리뉴클레오타이드 서열의 일부 또는 전체가 표적 폴리뉴클레오타이드 내로 도입된다.
본 발명의 방법에서, 본원에 기술된 하나 이상의 표적화 뉴클레아제는 표적 서열 (예를 들어, 세포 염색질) 내의 미리 결정해 놓은 부위에서 이중 가닥 절단을 유발시키며, 이 절단 영역 내의 뉴클레오타이드 서열과 상동성을 보유하는 "공여자" 폴리뉴클레오타이드를 세포 내로 도입할 수 있다. 이중 가닥 절단의 존재는 공여자 서열의 통합을 촉진하는 것으로 밝혀졌다. 공여자 서열은 물리적으로 통합될 수 있거나, 다르게는, 공여자 폴리뉴클레오타이드는 상동성 재조합을 통해 절단 복구를 위한 주형으로 사용되어, 공여자 내의 뉴클레오타이드 서열 모두 혹은 그 일부를 세포 염색질 내로 도입시키게 된다. 이렇게 하여, 세포 염색질 내의 제1 서열이 변형될 수 있으며, 특정 실시 양태에서는, 공여자 폴리뉴클레오타이드 내에 존재하는 서열로 전환될 수 있다. 따라서, "대체(치환)하다" 또는 "대체(치환)"이라는 용어의 사용은, 하나의 뉴클레오타이드 서열을 다른 뉴클레오타이드 서열로 대체(치환) (즉, 정보 측면에서의 서열의 치환) 하는 것을 나타내는 것으로 이해될 수 있으며, 하나의 폴리뉴클레오타이드를 다른 폴리뉴클레오타이드로 대체하는데 있어서 반드시 물리적 또는 화학적인 치환이 필요한 것은 아니다.
본원에 기술된 임의의 방법에서, 세포 내에서 추가의 표적 부위에 대한 추가적인 이중 가닥 절단을 위해서, 추가의 징크 핑거 단백질 쌍을 사용할 수 있다.
세포 염색질 내의 관심 대상의 영역에 있는 서열의 표적화 재조합 및/또는 치환 및/또는 변형을 위한 방법에 대한 특정 실시 양태에서, 염색체 서열은 외인성 "공여자" 뉴클레오타이드 서열을 사용한 상동성 재조합에 의해 변형된다. 이러한 상동성 재조합은, 절단 영역에 상동성인 서열이 존재하는 경우, 세포 염색질 내에 이중 가닥 절단의 존재에 의해 촉발된다.
본원에 기술된 임의의 방법에서, 상기 제1 뉴클레오타이드 서열 ("공여자 서열")은 관심 대상 영역 내의 유전체 서열과 상동성이지만 동일하지는 않은 서열을 포함하여, 이로써 상동성 재조합을 촉진시켜 관심 대상 영역 내에 비동일 서열을 삽입할 수 있다. 이에 따라, 특정 실시 양태에서, 관심 대상 영역 내의 서열과 상동성인 공여자 서열은 치환된 유전체 서열과 약 80 내지 99% (또는 이 범위 내의 임의의 정수값)의 서열 동일성을 나타낸다. 다른 실시 양태에서, 공여자 서열과 유전체 서열 간의 상동성은 99%를 초과 (예를 들어, 100개 이상의 인접한 염기쌍의 공여자 서열과 유전체 서열 간에 있어서, 단 1개의 뉴클레오타이드만이 상이함) 한다. 어떤 경우에는, 공여자 서열의 비상동성 부분은 관심 대상 영역 내에 존재하지 않는 서열을 포함할 수 있어, 새로운 서열이 해당 영역 내로 도입되게 된다. 이러한 경우, 상기 비상동성 서열은 일반적으로 관심 대상 영역 내의 서열과 상동성이거나 동일한, 50-1,000개의 염기쌍 (또는 이 범위 내의 임의의 정수값) 또는 1,000개를 넘는 임의 수의 염기쌍의 서열에 의해 측접된다. 다른 실시 양태에서, 공여자 서열은 상기 제1 서열에 대해 비상동성이며, 비상동성 재조합 기작에 의해 유전체 내로 삽입된다.
본원에 기술된 어떤 방법이라도, 관심 대상 유전자(들)의 발현을 방해하는 공여자 서열의 표적화 통합에 의해, 세포 내 하나 이상의 표적 서열의 부분 또는 완전 비활성화를 위해 사용될 수 있다. 부분 또는 완전 비활성화된 유전자를 갖는 세포주도 제공된다.
이에 더하여, 본원에 기술된 바와 같은 표적화 통합 방법은 하나 이상의 외인성 서열을 통합하는데에도 사용될 수 있다. 외인성 핵산 서열은, 예를 들어, 하나 이상의 유전자 혹은 cDNA 분자, 또는 임의 유형의 암호화 또는 비암호화 서열, 그리고 하나 이상의 조절 성분 (예를 들어, 프로모터)을 포함할 수 있다. 또한, 외인성 핵산 서열은 하나 이상의 RNA 분자 (예를 들어, 작은 헤어핀 RNA (shRNA), 억제성 RNA (RNAi), 마이크로RNA (miRNA) 등)를 생성할 수 있다.
"절단"이라는 말은 DNA 분자의 공유 백본이 붕괴되는 것을 지칭한다. 절단은, 다양한 방법, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 포스포디에스테르 결합의 효소적 또는 화학적 가수분해에 의해 개시될 수 있다. 단일 가닥 절단과 이중 가닥 절단이 모두 가능하고, 이중 가닥 절단은 2가지 서로 다른 단일 가닥 절단 현상의 결과로써 발생할 수 있다. DNA 절단의 결과로 블런트(blunt) 말단 또는 엇갈린(staggered) 말단이 생성될 수 있다. 특정 실시 양태에서, 융합 폴리펩타이드가 표적화 이중 가닥 DNA 절단에 사용된다.
"절단 절반-도메인"은 제2 폴리펩타이드 (동일하거나 상이함)와 함께 절단 활성 (바람직하게 이중 가닥 절단 활성)을 갖는 복합체를 형성하는 폴리펩타이드 서열이다. "제1 및 제2 절단 절반-도메인", "+ 및 - 절단 절반-도메인" 및 "우측 및 좌측 절단 절반-도메인"이라는 용어는 이합체화되는 절단 절반-도메인 쌍을 지칭하는 것으로, 서로 동의어로서 사용된다.
"조작된 절단 절반-도메인"은 다른 절단 절반-도메인 (예를 들어, 조작된 다른 절단 절반-도메인)과 절대 이종이합체를 형성하도록 변형된 절단 절반-도메인이다. 미국특허공보 제2005/0064474호; 제2007/0218528호 및 제2008/0131962호 (이들은 그 내용 전체가 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다.
"염색질"은 세포 유전체를 포함하는 핵단백질 구조물이다. 세포 염색질은 핵산, 주로 DNA, 그리고 단백질, 예컨대 히스톤과 비-히스톤 염색체 단백질을 포함한다. 대부분의 진핵 세포 염색질은 뉴클레오솜의 형태로 존재하는데, 여기에서 뉴클레오솜 코어는 히스톤 H2A, H2B, H3 및 H4를 각각 2개씩 포함하는 옥타머와 결합된 약 150개인 염기쌍의 DNA를 포함하며, 링커 DNA (유기체에 따라 길이가 다름)는 뉴클레오솜 코어 간에 연장된다. 일반적으로, 히스톤 H1의 분자가 링커 DNA에 결합된다. 본 개시 내용의 목적상, "염색질"이라는 용어는 모든 유형의 세포성 핵단백질 (원핵생물과 진핵생물 모두)을 망라한다. 세포 염색질은 염색체 염색질과 에피솜 염색질을 모두 포함한다.
"염색체"는 세포 유전체의 전체 또는 일부를 포함하는 염색질 복합체이다. 세포의 유전체는 흔히 세포의 유전체를 포함하는 모든 염색체의 집합인 그 핵형에 의해서 특정된다. 세포의 유전체는 하나 이상의 염색체를 포함할 수 있다.
"에피솜"은 세포의 염색체 핵형의 일부분이 아닌 핵산을 포함하는 복제성 핵산, 핵단백질 복합체 또는 기타 구조물이다. 에피솜의 예로서는 플라스미드 및 특정 바이러스 유전체가 포함된다.
"표적 부위" 또는 "표적 서열"은 결합 분자가 결합하게 될 (단, 결합을 위한 충분 조건이 존재해야 함) 핵산 부분을 나타내는 핵산 서열이다. 예를 들어, 서열 5'-GAATTC-3'은 EcoRI 제한 엔도뉴클레아제에 대한 표적 부위이다.
"외인성" 분자는 보통은 세포에 존재하지 않지만 하나 이상의 유전학적, 생화학적 또는 기타 방법에 의해 세포 내로 도입될 수 있는 분자이다. "보통 (정상적으로) 세포 내에 존재한다"라는 판단은 세포의 특정 성장 단계 및 환경 조건과 관련하여 결정된다. 따라서, 예를 들어, 근육의 배아 발생 동안에만 존재하는 분자는 성체 근육 세포에 대해서는 외인성 분자이다. 이와 유사하게, 열 충격에 의해 유도된 분자는 열 충격을 받지 않은 세포에 대해서는 외인성 분자이다. 외인성 분자는 예를 들어, 기능 부전 내인성 분자의 기능성 형태 또는 정상적으로 기능하는 내인성 분자의 기능 부전성 형태를 포함할 수 있다. 또한, 외인성 분자는 다른 종에서 통상적으로 발견되는 분자, 예를 들어, 랫트 유전체 내에 도입된 인간 서열일 수 있다.
특히, 외인성 분자는 소분자, 예컨대, 조합 화학 공정에 의해 생성된 소분자, 또는 거대 분자, 예컨대, 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질, 당단백질, 지단백질, 다당류, 상기 분자들의 임의 변형 유도체, 또는 상기 분자들 중 하나 이상을 포함하는 임의의 복합체일 수 있다. 핵산은 DNA 및 RNA를 포함하며, 이는 단일- 또는 이중 가닥일 수 있고, 선형, 분지형 또는 고리형일 수 있으며, 임의의 길이를 가질 수 있다. 핵산에는 이중 가닥을 형성할 수 있는 것뿐만 아니라 삼중 가닥을 형성하는 핵산도 포함된다. 예를 들어, 미국등록특허 제5,176,996호 및 제5,422,251호를 참조한다. 단백질에는, 이에 제한되지는 않으나, DNA-결합 단백질, 전사 인자, 염색질 리모델링 인자, 메틸화 DNA 결합 단백질, 폴리머라아제, 메틸라아제, 데메틸라아제, 아세틸라아제, 데아세틸라아제, 키나아제, 포스파타아제, 인테그라아제, 리콤비나아제, 리가아제, 토포이소머라아제, 자이라아제 및 헬리카아제를 포함한다.
외인성 분자는 내인성 분자와 동일한 유형의 분자, 예를 들어, 외인성 단백질 또는 핵산일 수 있다. 예를 들어, 외인성 핵산은 감염성 바이러스 유전체, 세포 내로 도입된 플라스미드 또는 에피솜, 또는 세포 내에 보통은 존재하지 않는 염색체를 포함할 수 있다. 외인성 분자를 세포 내로 도입하는 방법은 해당 업계 종사자에게 공지되어 있는데, 이에 제한되지는 않지만, 여기에는 지질 매개형 전달 (즉, 중성 및 양이온성 지질을 비롯한 리포솜), 전기천공, 직접 주입, 세포 융합, 유전자총 (particle bombardment), 인산칼슘 동시침전, DEAE-덱스트란 매개형 전달 및 바이러스 벡터 매개형 전달을 포함한다.
이와는 대조적으로, "내인성" 분자는 특정 환경 조건 하의 특정 성장 단계에서 특정 세포 내에 정상적으로 존재하는 분자이다. 예를 들어, 내인성 핵산은 염색체, 미토콘드리아, 엽록체 또는 다른 세포 소기관의 유전체, 또는 자연-발생 에피솜 핵산을 포함할 수 있다. 추가의 내인성 분자에는 단백질, 예를 들어, 전사 인자와 효소가 포함될 수 있다.
"융합" 분자는 2개 이상의 소단위 분자가 결합 (바람직하게는 공유 결합)된 분자이다. 이들 소단위 분자는 동일한 화학적 유형의 분자이거나, 또는 상이한 화학적 유형의 분자일 수 있다. 첫 번째 유형의 융합 분자의 예로서는, 이에 제한되지는 않지만, 융합 단백질 (예를 들어, ZFP DNA-결합 도메인과 절단 도메인 간의 융합체) 및 융합 핵산 (예를 들어, 상기에서 기술된 융합 단백질을 암호화하는 핵산)을 포함한다. 두 번째 유형의 융합 분자의 예로서는, 이에 제한되지는 않지만, 삼중 가닥을 형성하는 핵산과 폴리펩타이드 간의 융합체, 그리고 좁은 그루브 (minor groove) 결합제와 핵산 간의 융합체를 포함한다.
세포 내에서 융합 단백질의 발현은, 이러한 융합 단백질을 세포에 전달함으로써, 또는 이러한 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 세포에 전달함으로써 유도될 수 있는데, 이로써 세포 내에서 상기 폴리뉴클레오타이드가 전사되고 전사체가 번역되어 융합 단백질이 생성되는 것이다. 트랜스-스플라이싱 (trans-splicing), 폴리펩타이드 절단 및 폴리펩타이드 결찰 역시 세포 내에서 단백질의 발현에 관련될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드를 세포에 전달하는 방법은 본 명세서의 다른 곳에서 제시된다.
본 명세서에서, "유전자"는 유전자 산물 (하기 참조)을 암호화하는 DNA 영역뿐만 아니라, 이러한 유전자 산물의 생산을 조절하는 모든 DNA 영역 (이러한 조절 서열이 암호화 서열 및/또는 전사된 서열에 인접하는지 여부에 상관없음)을 포함한다. 따라서, 유전자에는, 이에 반드시 제한되는 것은 아니지만, 프로모터 서열, 종결자, 번역 조절 서열, 예컨대, 리보솜 결합 부위 및 내부 리보솜 도입 부위, 인핸서, 사일런서(silencer), 격리자(insulator), 경계 성분, 복제 원점, 매트릭스 부착 부위 및 유전자 자리 제어 영역이 포함된다.
"유전자 발현"은 유전자에 포함된 정보가 유전자 산물로 전환되는 것을 지칭한다. 유전자 산물은 유전자의 직접 전사 산물 (예를 들어, mRNA, tRNA, rRNA, 안티센스 RNA, 리보자임, 구조 RNA 또는 다른 임의 유형의 RNA), 또는 mRNA의 번역에 의해 생산된 단백질일 수 있다. 유전자 산물에는 캡핑, 폴리아데닐화, 메틸화 및 편집과 같은 과정에 의해 변형된 RNA, 그리고 예를 들어, 메틸화, 아세틸화, 인산화, 유비퀴틴화, ADP-리보실화, 미리스틸화 및 글리코실화에 의해 변형된 단백질 역시 포함된다.
유전자 발현의 "조절"은 유전자 활성의 변화를 지칭한다. 발현의 조절에는, 이에 제한되지는 않지만, 유전자 활성화 및 유전자 억제를 포함할 수 있다. 유전체 편집 (예를 들어, 절단, 변형, 비활성화, 무작위 돌연변이 유발)이 발현을 조절하는데 사용될 수 있다. 유전자 비활성화는 본 발명에서 기술된 것과 같은 ZFP를 포함하지 않는 세포에 비하여 유전자 발현이 조금이라도 감소된 것을 지칭한다. 따라서, 유전자 비활성화는 부분 비활성화 또는 전체 비활성화일 수 있다.
"관심 (대상) 영역"은 외인성 분자에 결합하는 것이 바람직한 세포 염색질의 임의의 영역, 예를 들어, 유전자 또는 유전자 내부 혹은 유전자에 인접한 비암호화 서열이다. 결합은 표적화 DNA 절단 및/또는 표적화 재조합을 목적으로 할 수 있다. 관심 대상 영역은, 예를 들어, 염색체, 에피솜, 세포 소기관 유전체 (예를 들어, 미토콘드리아, 엽록체), 또는 감염성 바이러스 유전체 내에 존재할 수 있다. 관심 대상 영역은 유전자의 암호화 영역 내에, 전사된 비암호화 영역, 예를 들면, 리더 서열, 트레일러 서열 또는 인트론 내에, 또는 암호화 영역의 상류 또는 하류의 비전사 영역 내에 존재할 수 있다. 관심 대상 영역은 그 길이가 단일 뉴클레오타이드 쌍만큼 짧거나, 또는 최대 2,000개의 뉴클레오타이드 쌍이거나, 또는 임의 정수 값의 뉴클레오타이드 쌍일 수 있다.
"작동가능한 연결" 및 "작동가능하게 연결된" (또는 "작동할 수 있도록 연결된")이라는 용어는 2개 이상의 성분 (예를 들어, 서열 성분)의 병치와 관련하여 동의어로서 사용되는데, 여기에서 이들 성분은 양 성분이 정상적으로 작용하여, 이들 성분 중에서 적어도 하나의 성분이 적어도 하나의 다른 성분에 의해 발휘되는 기능을 매개할 수 있도록 정렬된다. 예로써, 이러한 전사 조절 서열이 하나 이상의 전사 조절 인자의 존재 또는 부재에 대해 반응하여 암호화 서열의 전사 수준을 제어하는 경우라 한다면, 프로모터와 같은 전사 조절 서열은 암호화 서열에 작동가능하게(유효하게) 연결된 것이다. 일반적으로, 전사 조절 서열은 암호화 서열과 시스(cis) 형태로 작동가능하게 연결되지만, 상기 서열에 직접적으로 인접할 필요는 없다. 예를 들어, 인핸서는 암호화 서열과 근접하지 않는 경우에도, 암호화 서열에 작동가능하게 연결되는 전사 조절 서열이다.
융합 폴리펩타이드와 관련하여, "작동가능하게 연결된"이라는 용어는, 연결된 각 성분이 서로 다른 성분에 연결된 상태에서 이렇게 연결되지 않았다면 수행할 기능과 동일한 기능을 수행한다는 사실을 의미할 수 있다. 예를 들어, ZFP DNA-결합 도메인이 절단 도메인에 융합된 융합 폴리펩타이드와 관련하여 보면, 상기 융합 폴리펩타이드 내에서 ZFP DNA-결합 도메인 부분이 이의 표적 부위 및/또는 이의 결합 부위에 결합할 수 있으며, 절단 도메인은 표적 부위의 부근에서 DNA를 절단할 수 있다고 한다면, ZFP DNA-결합 도메인과 절단 도메인은 작동가능하게 연결되어 있는 것이다.
단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산의 "기능성 단편"이라는 것은, 서열이 전장 단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산과 동일하지는 않지만 전장 단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산과 동일한 기능을 보유하는 단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산을 말한다. 기능성 단편은 그에 상응하는 천연 분자보다 많거나, 적거나 또는 그와 동일한 수의 잔기를 보유할 수 있고/있거나 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오타이드 치환을 내포할 수 있다. 핵산의 기능 (예를 들어, 암호화 기능, 다른 핵산에 하이브리드화하는 능력)을 측정하는 방법은 해당 업계에 공지되어 있다. 이와 유사하게, 단백질의 기능을 측정하는 방법도 잘 알려져 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드의 DNA-결합 기능은 예컨대, 필터-결합, 전기영동 이동도-변화, 또는 면역침전 분석법에 의해 측정할 수 있다. DNA 절단은 젤 전기영동으로 분석할 수 있다. 문헌 [Ausubel et al., 상기와 동일]을 참조한다. 다른 단백질과 상호작용하는 한 단백질의 능력은 예를 들어, 공동-면역침전, 2-하이브리드 분석법 또는 상보성 분석법 (유전학적 및 생화학적 방법 모두 가능)으로 측정할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Fields et al., (1989) Nature 340:245-246]; 미국등록특허 제5,585,245호와 PCT WO 98/44350을 참조한다.
징크 핑거 뉴클레아제
본 발명에서는 하나 이상의 랫트 유전체 편집 (예를 들어, 절단, 변형, 비활성화 및/또는 무작위 돌연변이 유발)에 이용될 수 있는 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN)가 기술된다. ZFN은 징크 핑거 단백질 (ZFP)과 뉴클레아제 (절단) 도메인 (예를 들어, 절단 절반-도메인)을 포함한다.
A. 징크 핑거 단백질
징크 핑거 결합 도메인은 선택한 서열에 결합하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Beerli et al ., (2002) Nature Biotechnol . 20:135-141]; [Pabo et al., (2001) Ann . Rev . Biochem . 70:313-340]; [Isalan et al ., (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660]; [Segal et al ., (2001) Curr . Opin . Biotechnol . 12:632-637]; [Choo et al ., (2000) Curr . Opin . Struct . Biol . 10:411-416]을 참조한다. 조작된 징크 핑거 결합 도메인은 자연-발생 징크 핑거 단백질에 비해 신규한 결합 특이성을 가질 수 있다. 조작 방법에는, 이에 제한되지는 않지만, 합리적 설계법과 다양한 유형의 선별법이 포함된다. 합리적 설계는 예를 들어, 삼중(또는 사중) 뉴클레오타이드 서열과 각 개별 징크 핑거 아미노산 서열을 포함하는 데이터베이스를 이용하는 방법을 포함하는데, 여기에서 각각의 삼중 또는 사중 뉴클레오타이드 서열은 특정한 삼중 또는 사중 서열에 결합하는 징크 핑거의 하나 이상의 아미노산 서열과 관련이 있다. 예를 들어, 미국등록특허 제6,453,242호 및 제6,534,261호 (이들은 공동 소유이며, 내용 전체가 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다.
파지 디스플레이 및 2-하이브리드 시스템을 비롯한 대표적인 선별 방법은 미국등록특허 제5,789,538호; 제5,925,523호; 제6,007,988호; 제6,013,453호; 제6,410,248호; 제6,140,466호; 제6,200,759호; 및 제6,242,568호; 그리고 WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197; 및 GB 2,338,237에 기술된다. 또한, 징크 핑거 결합 도메인에 대한 결합 특이성의 강화에 대해서는, 예를 들어, WO 02/077227 (공동 소유)에 기술된 바 있다.
표적 부위의 선별; ZFP 및 융합 단백질 (및 이들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드)의 설계와 구축을 위한 방법은 해당 업계 종사자에게 공지되어 있고, 미국특허공보 제20050064474호 및 제20060188987호 (이들 출원의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함됨)에 상세하게 기술되어 있다.
또한, 이러한 참고문헌에서 기술된 바와 같이, 징크 핑거 도메인 및/또는 멀티-핑거화 징크 핑거 단백질은, 예를 들어, 5개 이상의 아미노산 길이를 갖는 링커 [예를 들어, TGEKP (서열번호 1), TGGQRP (서열번호 2), TGQKP (서열번호 3) 및/또는 TGSQKP (서열번호 4)]를 비롯한 임의의 적절한 링커 서열을 사용하여 서로 연결될 수 있다. 6개 이상의 아미노산 길이를 갖는 예시적인 링커 서열은 미국등록특허 제6,479,626호; 제6,903,185호 및 제7,153,949호를 참조한다. 본 발명에 기술된 단백질은 단백질의 개별 징크 핑거들 간에 적절한 링커의 임의 조합을 포함할 수도 있다.
하기에 기술된 바와 같이, 특정 실시 양태에서, 4개, 5개 또는 6개의 핑거 결합 도메인은 절단 절반-도메인, 예컨대, FokI와 같은 IIS형 제한 엔도뉴클레아제의 절단 도메인에 융합된다. 이러한 징크 핑거/뉴클레아제 절반-도메인 융합체의 하나 이상의 쌍은, 예컨대 미국특허공보 제20050064474호에 개시된 바와 같은 표적화 절단에 사용된다.
표적화 절단에 있어서, 결합 부위의 인접 가장자리는 5개 이상의 뉴클레오타이드 쌍에 의해 분리될 수 있고, 각 융합 단백질은 DNA 표적의 맞은편 가닥에 결합할 수 있다. 모든 쌍별 조합이 랫트 유전자의 표적화 절단에 이용될 수 있다. 본 발명의 개시 내용에 따르면, ZFN은 랫트 유전체 내의 임의의 서열에 표적화될 수 있다.
일부 실시 양태에서, DNA 결합 도메인은 식물 병원체인 산토모나스 속 (Xanthomonas)에서 유래한 TAL 효과기의 조작된 도메인이다 (문헌 [Boch et al ., (2009) Science 29 Oct 2009 (10.1126/science.117881)] 및 [Moscou and Bogdanove, (2009) Science 29 Oct 2009 (10.1126/science.1178817)] 참조).
B. 절단 도메인
ZFN은 또한 뉴클레아제 (절단 도메인, 절단 절반-도메인)를 포함한다. 본 발명에 개시된 융합 단백질의 절단 도메인 부분은 임의의 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제로부터 수득될 수 있다. 절단 도메인이 유래될 수 있는 예시적인 엔도뉴클레아제에로는, 이에 제한되지는 않지만, 제한 엔도뉴클레아제 및 귀소성 엔도뉴클레아제를 포함한다. 예를 들어, 뉴 잉글랜드 바이오랩스 (New England Biolabs, 미국 메사추세츠주 베벌리 소재)의 2002-2003 카탈로그; 문헌 [Belfort et al ., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388]을 참조한다. DNA를 절단하는 추가의 효소는 공지되어 있다 (예를 들어, S1 뉴클레아제; 녹두 뉴클레아제; 췌장 DNase I; 마이크로코커스 뉴클레아제; 효모 HO 엔도뉴클레아제; 문헌 [Linn et al., (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993]을 또한 참조한다). 이러한 효소들 (또는 이들의 기능성 단편들) 중에서 하나 이상의 효소들을 절단 도메인과 절단 절반-도메인의 공급원으로서 이용할 수 있다.
이와 유사하게, 절단 절반-도메인은 절단 활성을 위해 이합체화를 필요로 하는 임의의 뉴클레아제 또는 이의 일부분 (상기 열거된 바와 같음)으로부터 유래할 수 있다. 일반적으로, 융합 단백질이 절단 절반-도메인을 포함하는 경우에는, 절단을 위하여 2개의 융합 단백질이 필요하다. 다르게는, 2개의 절단 절반-도메인을 포함하는 단일 단백질이 이용될 수 있다. 이들 2개의 절단 절반-도메인은 동일한 엔도뉴클레아제 (또는 이의 기능성 단편)로부터 유래할 수 있거나, 또는 각각의 절단 절반-도메인은 다른 엔도뉴클레아제 (또는 이의 기능성 단편)로부터 유래할 수 있다. 또한, 두 융합 단백질에 대한 표적 부위는, 바람직하게는 서로에 대해, 두 융합 단백질의 각 표적 부위에 대한 결합이, 절단 절반-도메인 상호 간에 예컨대 이합체화에 의해 기능성 절단 도메인을 형성할 수 있는 공간 배향을 설정할 수 있게끔 배치된다. 따라서, 특정 실시 양태에서, 표적 부위의 인접 가장자리는 5-8개 뉴클레오타이드 또는 15-18개 뉴클레오타이드에 의해서 분리된다. 하지만, 임의 정수 값의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 쌍 (예를 들어, 2개 내지 50개의 뉴클레오타이드 또는 그 이상)이 두 표적 부위 사이에 개입할 수 있다. 일반적으로, 절단 부위는 표적 부위 사이에 놓이게 된다.
제한 엔도뉴클레아제 (제한 효소)는 다수의 종에 존재하며, DNA에 (인식 부위에서) 서열 특이적으로 결합할 수 있고, 결합 부위에서 또는 결합 부위 인근에서 DNA를 절단할 수 있다. 특정 제한 효소 (예를 들어, IIS형)는 인식 부위로부터 떨어진 부위에서 DNA를 절단하며, 분리가능한 결합 도메인과 절단 도메인을 보유한다. 예를 들어, IIS형 효소 FokI는 한쪽 가닥에서 인식 부위로부터 9개 뉴클레오타이드, 그리고 나머지 한 가닥에서 인식 부위로부터 13개 뉴클레오타이드로 DNA의 이중 가닥 절단을 촉진시킨다. 예를 들어, 미국등록특허 제5,356,802호; 제5,436,150호 및 제5,487,994호; 그리고 문헌 [Li et al ., (1992) Proc . Natl . Acad. Sci. USA 89:4275-4279]; [Li et al., (1993) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90:2764-2768]; [Kim et al ., (1994a) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 91:883-887]; [Kim et al., (1994b) J. Biol . Chem. 269:31,978-31,982]를 참조한다. 따라서, 한 실시 양태에서, 융합 단백질은 적어도 하나의 IIS형 제한 효소의 절단 도메인 (또는 절단 절반-도메인) 및 조작 혹은 비조작된 하나 이상의 징크 핑거 결합 도메인을 포함한다.
절단 도메인을 결합 도메인으로부터 분리가능한 예시적인 IIS형 제한 효소는 FokI이다. 이러한 특정 효소는 이량체로서 활성을 나타낸다. 문헌 [Bitinaite et al., (1998) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 95:10,570-10,575]를 참조한다. 따라서, 본 발명의 개시 내용의 목적상, 개시된 융합 단백질에 사용된 FokI 효소의 일부분은 절단 절반-도메인으로 간주된다. 이에 따라, 징크 핑거-FokI 융합체를 이용한 표적화 이중 가닥 절단 및/또는 세포 서열의 표적화 치환에 있어서, 각각 FokI 절단 절반-도메인을 포함하는 두 융합 단백질을 사용하여 촉매적 활성 절단 도메인을 재구축할 수 있다. 다르게는, 징크 핑거 결합 도메인과 2개의 FokI 절단 절반-도메인을 포함하는 단일 폴리펩타이드 분자도 이용될 수 있다. 징크 핑거-FokI 융합체를 이용한 표적화 절단과 표적화 서열 변경을 위한 매개변수는 본 명세서의 다른 곳에서 제공된다.
절단 도메인 또는 절단 절반-도메인은, 절단 활성을 보유하거나, 또는 기능성 절단 도메인을 형성하기 위해 다합체화 (예를 들어, 이합체화)하는 능력을 보유하는 단백질의 임의의 일부분일 수 있다.
예시적인 IIS형 제한 효소에 대해서는 국제특허공보 WO 07/014275 (이 내용 전체가 본원에 포함됨)에 기술되어 있다. 추가적인 제한 효소 역시 분리가능한 결합 도메인과 절단 도메인을 포함하며, 이들은 본 발명에 고려하는 사항이기도 하다. 예를 들어, 문헌 [Roberts et al ., (2003) Nucleic Acids Res . 31:418-420]을 참조한다.
특정 실시 양태에서, 절단 도메인에는, 예컨대, 미국특허공보 제20050064474호; 제20060188987호 및 제20080131962호 (상기 문헌의 개시 내용은 모두 그 내용 전체가 본원에 참조로 포함됨)에 기술된 바와 같이, 동종 이합체화를 최소화시키거나 방지하는 하나 이상의 조작된 절단 절반-도메인 (이합체화 도메인 돌연변이체로도 지칭함)이 포함된다. FokI의 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537 및 538번 위치의 아미노산 잔기는 FokI 절단 절반-도메인의 이합체화에 영향을 주기 위한 표적이다.
절대 이종이합체를 형성하는 FokI의 조작된 절단 절반-도메인의 예로서는, 첫 번째 절단 절반-도메인이 FokI의 490번과 538번 위치의 아미노산 잔기에서 돌연변이를 포함하고, 두 번째 절단 절반-도메인이 486번과 499번 위치의 아미노산 잔기에서 돌연변이를 포함하는 한 쌍을 포함한다.
따라서, 한 실시 양태에서, 490번 위치의 돌연변이에서는 Glu(E)를 Lys(K)로 치환하고; 538번 위치의 돌연변이에서는 Iso(I)를 Lys(K)로 치환하며; 486번 위치의 돌연변이에서는 Gln(Q)를 Glu(E)로 치환하고; 499번 위치의 돌연변이에서는 Iso(I)를 Lys(K)로 치환한다. 구체적으로, 본 발명에 기술된 조작된 절단 절반-도메인은, 한쪽의 절단 절반-도메인에서는 490번 (E→K)과 538번 (I→K) 위치에 돌연변이를 유발시켜 "E490K:I538K"로 명명된 조작된 절단 절반-도메인을 생성하고, 다른 한쪽의 절단 절반-도메인에서는 위치 486번 (Q→E)과 499번 (I→L) 위치에 돌연변이를 유발시켜 "Q486E:I499L"로 명명된 조작된 절단 절반-도메인을 생성시켜 제조하였다. 본 발명에 기술된 조작된 절단 절반-도메인은 비정상적인 절단이 최소화되거나 제거되는 절대 이종이합체 돌연변이체이다. 예를 들어, 미국특허공보 제2008/0131962호 (본 출원의 개시 내용은 그 내용 전체가 여하의 목적 하에 본원에 참조로 포함됨)의 실시예 1을 참조한다.
본 발명에 개시된 조작된 절단 절반-도메인은 임의의 적절한 방법, 예를 들어, 미국특허공보 제20050064474호 (일련번호 제10/912,932호, 실시예 5) 및 미국 가출원 일련번호 제60/721,054호 (실시예 38)에 기술된 바와 같이 야생형 절단 절반-도메인 (FokI)의 특정 부위 돌연변이 유발법을 사용하여 제조될 수 있다.
C. 랫트에서 표적화 절단을 위한 추가 방법
임의의 랫트 유전자 내에 표적 부위를 갖는 뉴클레아제라면 어떤 것이라도 본 발명에 개시된 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 귀소성 엔도뉴클레아제와 메가뉴클레아제는 매우 긴 인식 서열을 가지는데, 이들 중 일부는 통계를 기초로 할 때 인간형 크기의 유전체 내에 한번 존재하는 것으로 보인다. 랫트 유전자 내에 표적 부위를 보유하는 임의의 이러한 뉴클레아제는, 랫트 유전자 내에서 표적화 절단을 위해서, 징크 핑거 뉴클레아제 대신에, 또는 징크 핑거 뉴클레아제에 추가하여 사용될 수 있다.
예시적인 귀소성 엔도뉴클레아제로서는 I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII 및 I-TevIII을 포함한다. 이들의 인식 서열은 공지되어 있다. 또한, 미국등록특허 제5,420,032호; 제6,833,252호; 문헌 [Belfort et al ., (1997) Nucleic Acids Res . 25:3379-3388]; [Dujon et al ., (1989) Gene 82:115-118]; [Perler et al ., (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127]; [Jasin (1996) Trends Genet . 12:224-228]; [Gimble et al., (1996) J. Mol . Biol . 263:163-180]; [Argast et al ., (1998) J. Mol. Biol . 280:345-353] 및 뉴 잉글랜드 바이오랩스 카탈로그도 참조한다.
비록 대부분의 귀소성 엔도뉴클레아제의 절단 특이성이 그들의 인식 부위에 대해서 절대적이진 않지만, 이들 부위는 인식 부위의 단일 카피를 포함하는 세포 내에서 귀소성 엔도뉴클레아제를 발현시켜 포유동물형 크기의 유전체에 대한 단회의 절단 현상이 달성될 수 있을 만큼의 충분한 길이를 갖는다. 또한, 귀소성 엔도뉴클레아제와 메가뉴클레아제의 특이성은 비천연 표적 부위에 결합하도록 조작될 수 있는 것으로 보고된 바 있다. 예를 들어, 문헌 [Chevalier et al ., (2002) Molec. Cell 10:895-905]; [Epinat et al ., (2003) Nucleic Acids Res . 31:2952-2962]; [Ashworth et al ., (2006) Nature 441:656-659]; [Paques et al ., (2007) Current Gene Therapy 7:49-66]을 참조한다.
전달
본 발명에 기술된 ZFN은 임의의 적절한 수단, 예를 들어 ZFN mRNA의 주입에 의해 표적 세포로 전달될 수 있다. 문헌 [Hammerschmidt et al., (1999) Methods Cell Biol. 59:87-115]을 참조한다.
징크 핑거를 포함하는 단백질을 전달하는 방법은, 예를 들어, 미국등록특허 제6,453,242호; 제6,503,717호; 제6,534,261호; 제6,599,692호; 제6,607,882호; 제6,689,558호; 제6,824,978호; 제6,933,113호; 제6,979,539호; 제7,013,219호 및 제7,163,824호 (모든 문헌의 개시 내용 전체는 본원에 참조로 포함됨)에 기술되어 있다.
본 발명에 기술된 ZFN은 하나 이상의 ZFN을 암호화하는 서열을 함유하는 벡터를 이용하여 전달될 수도 있다. 임의의 벡터 시스템, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 플라스미드 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터; 헤르페스바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터 등이 사용될 수 있다. 또한, 미국등록특허 제6,534,261호; 제6,607,882호; 제 6,824,978호; 제6,933,113호; 제6,979,539호; 제7,013,219호 및 제7,163,824호 (이들은 그 내용 전체가 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 또한, 이들 벡터가 하나 이상의 ZFN 암호화 서열을 포함할 수 있다는 점도 명백할 것이다. 따라서, ZFN의 하나 이상의 쌍이 세포 내로 도입되는 경우, ZFN은 동일한 벡터 또는 다른 벡터에 실려 운반될 수 있다. 복수의 벡터가 이용되는 경우, 각 벡터는 하나 또는 복수의 ZFN을 암호화하는 서열을 포함할 수 있다.
종래의 바이러스 및 비-바이러스를 기반으로 한 유전자 전달 방법은 조작된 ZFP를 암호화하는 핵산을 랫트 세포 내로 도입하는데 사용될 수 있다. 또한, 이러한 방법은 ZFP를 암호화하는 핵산을 시험관 내의 랫트 세포에 투여하는 데에도 이용될 수 있다. 특정 실시 양태에서, ZFP를 암호화하는 핵산은 생체 내 또는 생체 외 용도를 위해 투여된다.
비-바이러스 벡터 전달 시스템으로서는, 전기천공, 리포펙션, 미량주입, 바이오리스틱스(biolistics), 비로솜, 리포솜, 면역리포솜, 다가양이온 또는 지질:핵산 접합체, 네이키드 DNA, 인조 비리온 및 제제로 강화된 DNA의 흡수가 포함된다. 예를 들어, 소니트론 (Sonitron) 2000 시스템 (Rich-Mar)을 이용한 음향천공 (sonoporation) 역시 핵산의 전달에 이용될 수 있다. 바이러스 벡터 전달 시스템에는 세포로의 전달 후에 에피솜 유전체 또는 통합된 유전체를 가지는 DNA 및 RNA 바이러스가 포함된다. 추가의 예시적인 핵산 전달 시스템은 아막사 바이오시스템즈 (Amaxa Biosystems, 독일 쾰른 소재), 맥스사이트 인코포레이티드 (Maxcyte, Inc., 미국 메릴랜드주 락빌 소재), BTX 몰레큘라 딜리버리 시스템즈 (Molecular Delivery Systems, 미국 메사추세츠주 홀리스튼 소재) 및 코페르니쿠스 쎄러퓨틱스 인코포레이티드 (Copernicus Therapeutics Inc.)에 의해 제공된 것들을 포함한다 (예를 들어, 미국등록특허 제6,008,336호 참조). 리포펙션은 예를 들어, 미국등록특허 제5,049,386호, 제4,946,787호 및 제4,897,355호에 기술되어 있으며, 리포펙션 시약은 시판된다 (예를 들어, Transfectam™ 및 Lipofectin™). 폴리뉴클레오타이드의 효율적인 수용체 인식 리포펙션에 적합한 양이온성 및 중성 지질에는 펠크너 (Felgner)의 WO 91/17424, WO 91/16024에 기술된 것들이 포함된다. 전달은 세포 (체외 투여)로 또는 표적 조직 (생체 내 투여)으로 수행될 수 있다. 면역지질 복합체와 같은 표적화 리포좀을 비롯한 지질:핵산 복합체의 제조는 해당 업계 종사자에게 잘 알려져 있다 (예를 들어, 문헌 [Crystal, Science 270:404-410 (1995)]; [Blaese et al ., Cancer Gene Ther . 2:291-297 (1995)]; [Behr et al ., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994)]; [Remy et al ., Bioconjugate Chem . 5:647-654 (1994)]; [Gao et al ., Gene Therapy 2:710-722 (1995)]; [Ahmad et al ., Cancer Res . 52:4817-4820 (1992)]; 미국등록특허 제4,186,183호, 제4,217,344호, 제4,235,871호, 제4,261,975호, 제4,485,054호, 제4,501,728호, 제4,774,085호, 제4,837,028호 및 제4,946,787호 참조).
상기에서 언급한 대로, 여기에 개시된 방법과 조성물은 임의 유형의 랫트 세포에 사용될 수 있다. 랫트의 자손, 변이체 및 파생 세포도 역시 사용될 수 있다.
적용
상기 개시된 방법과 조성물은 임의의 랫트 유전자 또는 유전자들의 유전체 편집에 사용될 수 있다. 특정 적용 양태에서, 상기 방법과 조성물은 랫트 유전체 서열의 비활성화를 위해 사용될 수 있다. 다른 적용 양태에서, 상기 방법과 조성물은 무작위 돌연변이를 생성 (예컨대 편집되지 않은 유전자 또는 인간화 랫트 유전자의 통합과는 다른 발현을 하는 유전자의 신규한 대립 형질 형태의 생성)할 수 있는데, 이로써 결과적으로 동물 모델을 생성할 수 있게 된다. 다른 적용 양태에서, 상기 방법과 조성물은 유전자의 신규한 대립 형질 형태를 수반하는 동물의 동정 및 선별을 가능하게 하는, 정해진 유전자의 위치에서 무작위 돌연변이를 생성하는데 사용될 수 있다. 다른 적용 양태에서, 상기 방법과 조성물은 랫트 유전체의 임의의 선택된 영역 내로 외인성 (공여자) 서열을 표적화 통합할 수 있도록 해준다. 조절 서열 (예를 들어 프로모터)은 관심 대상 부위에 표적화 방식으로 통합될 수 있다. "통합"이라는 말은 물리적 삽입 (예를 들어, 숙주 세포의 유전체 내로 삽입)과, 또한, 핵산 복제 과정을 통해 숙주 세포 유전체 내로 공여자 서열을 카피(복제)하여 통합시키는 것 모두를 의미한다. 공여자 서열은 또한 shRNA, miRNA 등과 같은 핵산을 포함할 수 있다. 이러한 작은 핵산 공여자는 랫트 유전체 내의 관심 유전자에 대한 그 영향을 연구하는데 사용될 수 있다. 랫트 유전자의 유전체 편집 (예를 들어, 비활성화, 통합 및/또는 표적화 또는 무작위 돌연변이)은, 예를 들어 단일 절단 이벤트에 의해, 절단 후 비상동성 말단 봉합에 의해, 절단 후 상동성 지향 복구 기작에 의해, 절단 후 공여자 서열의 물리적 통합에 의해, 2개 부위에서의 절단 후 상기 두 절단 부위 사이의 서열을 결실시키기 위한 접합에 의해, 암호화 영역 내 미스센스 또는 넌센스 코돈의 표적화 재조합에 의해, 유전자 또는 조절 영역을 방해하기 위한 유전자 또는 그 조절 영역 내에 관련이 없는 서열 (즉, "스터퍼 (stuffer)" 서열)의 표적화 재조합에 의해, 또는 전사체의 미스-스플라이싱을 유도하기 위한 인트론 내 스플라이스 수용체 서열의 표적화 재조합에 의해, 달성될 수 있다. 미국특허공보 제20030232410호; 제20050208489호; 제20050026157호; 제20050064474호; 제20060188987호; 제20060063231호; 및 국제특허공보 WO 07/014275 (이들 문헌의 개시 내용은 그 내용 전체가 여하의 목적 하에 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다.
랫트에서 ZFN을 매개로 한 유전체 편집에 있어서는 여러 가지로 응용하여 적용할 수 있다. 본원에 기술된 상기 방법과 조성물으로 인간 질병의 랫트 모델의 창출이 가능하다. 예를 들어, p53 유전자의 편집으로 암 연구 및 암 요법 시험을 위한 동물 모델을 제공하는 "암 랫트"의 창출이 가능하다.
실시예
실시예 1: ZFN 은 랫트 C6 세포 내에서 표적화 붕괴를 유도한다
기본적으로 문헌 [Urnov et al., (2005) Nature 435(7042):646-651]에 기술된 바와 같이, 랫트의 p53에 대해 표적화된 ZFN을 설계하여 플라스미드 내로 도입하였다. 예시적인 랫트 p53 설계를 위한 인식 나선을 하기 표 1에 나타내었다. 이러한 ZFN에 대한 표적 부위들을 표 2에 나타내었다.
Figure pct00001
Figure pct00002
ZFN을 암호화하는 플라스미드를 랫트 C6 세포 내로 형질감염시켰다. p53 유전자 자리에서 ZFN의 활성을 측정하기 위해, 기본적으로 제조업자의 지침 (Trangenomic SURVEYOR™)에 따라 CEL-I 미스매치 분석법을 수행하였다. 세포를 수거하고, 제조업자의 지침 (Epicentre®)에 따라 Quickextract™ 키트를 사용하여 염색체 DNA를 준비하였다. p53 유전자 자리의 적절한 영역을 Accuprime™ 고정확도 DNA 폴리머라아제 (인비트로겐)를 사용하여 PCR 증폭시켰다. PCR 반응을 94℃까지 가열하고, 실온으로 서서히 냉각시켰다. 약 200ng의 상기 어닐링된 DNA를 0.33㎕의 CEL-I 효소와 혼합시켜, 42℃에서 20분간 배양하였다. 반응 생성물을 1X Tris-보레이트-EDTA 버퍼 중에서 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분석하였다.
이에 대한 결과를 도 1에 나타내었는데, 여기에서는 표 1과 2에 기술되어 있는 p53-특이적 ZFN의 다양한 쌍을 조합하여 실험하였다. 미스매치 %, NHEJ 활성의 측정은 각 레인의 아래에 나타내었다. 그 결과는 이들 ZFN들이 그 랫트 유전자 자리에 대해 활성이라는 점을 시사하고 있다.
GFP에 대해 표적화된 ZFN을, 기본적으로 문헌 [Urnov et al., (2005) Nature 435(7042):646-651]에 기술된 바와 같이 설계하여, 플라스미드 내로 도입하였다. ZFN 쌍을, 미국특허출원 일련번호 제12/284,887호 [발명의 명칭: 생물학적 활성 뉴클레아제의 신속한 생체 내 동정 ("Rapid in vivo Identification of Biologically Active Nucleases")]에 기술된 바와 같이 효모 기반의 염색체 시스템에서의 활성에 대해 스크리닝하였다. 약술하면, 갈락토스 유도성 ZFN을 통합된 단일 가닥 어닐링 (ySSA) 리포터 (이는 PGK 프로모터에 의해 유도된 MEL1 유전자의 두 중첩 분절 간에 삽입된 전체 eGFP 서열로 이루어짐)를 함유하는 효모 균주 내로 형질전환시켰다. ZFN의 발현을 6시간 동안 유도시킨 후, 이를 18시간 동안 억제시켜, 이후에는 표준 비색계 분석법을 사용하여 상청액 중의 MEL1 단백질의 양을 정량하였다.
예시적인 GFP 징크 핑거 설계를 위한 인식 나선을 하기 표 3에 나타내었다.
Figure pct00003
GFP 징크 핑거 설계의 표적 부위를 하기 표 4에 나타내었다. ZFP 인식 나선에 의해 접촉되는 표적 부위 내의 뉴클레오타이드는 대문자로 표시했고, 접촉되지 않는 뉴클레오타이드는 소문자로 표시하였다.
Figure pct00004
활성인 GFP-표적화 ZFN 발현 구축물을, GFP 발현 구축물을 함유하는 랫트 C6 세포 내에 형질감염시켰다.
도 2에 나타난 바와 같이, 시험한 모든 ZFN 쌍들은 표적 세포 내의 GFP 유전자를 절단하였다.
실시예 2: ZFN 은 유전자 이식 랫트 내에서 표적화 붕괴를 유도한다
실시예 1에 기술된 GFP-특이적 ZFN 역시 전핵 주입 (PNI) 또는 세포질 주입 (ZFN mRNA 주입)에 의해 다양한 농도로 하여, 문헌 [Michalkiewicz et al., (2007) J. Amer . Phys . Society 293:H881-H894]에 기술된 GFP를 발현하는 유전자 이식 랫트에서 수득한 단세포 배아 내로 도입시켰다. 도 3을 참조한다.
상기 주입된 배아를 2-4 세포 단계에 도달할 때까지 2-3일간 배양하였다. 다음으로, 상기 2-4 세포 배아 중 일부를 위임신 암컷으로 이동시켰다. 상기에서 배양된 배아와 이동시킨 배아에서 DNA를 추출하여, GFP 유전자의 절단에 대해 평가하였다.
ZFN 쌍 16859/16860을 사용하여 주입한 배아에 있어서, 다른 주입 방식 및 주입한 ZFN의 농도에 대한 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
Figure pct00005
ZFN mRNA의 세포질 주입에 대한 GFP 사진은, ZFN을 더 많이 함유하는 배아가 이를 주입하지 않은 배아에 비하여 GFP를 발현하지 못했음을 보여주고 있는데, 이는 ZFN이 활성인 세포 내에 모자이크 현상이 일어나지 않는다는 사실을 시사하는 것이다.
위임신 암컷으로 이동시킨 배아 내에 ZFN을 전핵 주입 (PNI)하여 5마리의 새끼가 출생하였다. 표 5를 참조한다. 도 4A에서 볼 수 있는 것과 같이, 5마리의 새끼 중 3마리는 GFP를 발현하였던 반면, 2마리의 새끼는 그렇지 않았다.
GFP-음성인 2마리의 동물 꼬리로부터 유전체 DNA를 채취하여 PCR을 통해 그 변형물에 대해 스크리닝하였다. 야생형 eGFP 유전자 자리와 비교했을 때, ZFN 59/60 쌍에 의해 표적화된 부위를 접하는 영역들이 현저히 감소했는데, 이는 GFP-음성인 두 동물 모두에 있어서 약 150 bp의 결실이 있었다는 것을 의미하는 것이다. 또한, 야생형 eGFP 밴드가 없는 것으로 볼 때, 꼬리 조직 검사에서도 모자이크 현상은 분명 나타나지 않았다. 다음으로는, 이러한 결실들에 대해 직접 시퀀싱 분석을 하였는데, 그 결과 162 nt와 156 nt가 결실되었음을 알 수 있었고, 이는 도 4B에 더 작은 밴드들로 분명히 확인되었다. 이에 더하여, 도 4B에서 볼 수 있는 것과 같이, 야생형 eGFP 밴드가 검출되지 않았으므로, GFP 음성인 새끼들에서도 모자이크 현상이 분명 나타나지 않았다.
따라서, ZFN은 염색체 GFP 이식 유전자를 성공적으로 변형시켰다.
실시예 3: ZFN 은 내인성 랫트 유전자 자리를 절단한다
하기 기술된 바와 같이, 내인성 유전자 자리를 절단하도록 ZFN을 설계하였다.
A. IgM
한 실험에서, 상기 기술된 것과 같이 내인성 랫트 IgM 유전자를 절단하도록 ZFN을 설계하고, 랫트 C6 세포 내에서의 절단 활성에 대해 시험하였다. 예시적인 랫트 IgM-표적화 ZFP들을 하기 표 6에 나타내었다.
Figure pct00006
랫트의 IgM -표적화된 징크 핑거 설계의 표적 부위를 하기 표 7에 나타내었다. ZFP 인식 나선에 의해 접촉되는 표적 부위 내의 뉴클레오타이드는 대문자로 표시했고, 접촉되지 않는 뉴클레오타이드는 소문자로 표시하였다.
Figure pct00007
모든 IgM-표적화 ZFN은 미국특허공보 제2008/0131962호에 기술된 바와 같이 EL/KK FokI 돌연변이를 포함하였다. ZFN 발현은 CAG 또는 CMV 프로모터에 의해 주도된다. 용액 SF를 이용하는 아막사 뉴클레오펙션과 아막사 셔틀 96-웰 뉴클레오펙터를 통해 200,000개의 C6 세포에 ZFN (각 1㎍)을 형질감염시켰다. IgM 유전자 자리를 GJC153F (5'-ggaggcaagaagatggattc-3') 및 GJC154R (5'-gaatcggcacatgcagatct-3')를 이용하여 PCR 증폭시키고, 예를 들어, 미국특허공보 제20080015164호; 제20080131962호 및 제20080159996호에 기술된 것과 같이 Surveyor™ 뉴클레아제를 사용하여 ZFN 절단에 대해 분석하였다.
C6 세포에 있어서, ZFN 쌍 17747/17749는 CMV 프로모터가 사용될 경우에는 3%의 염색체를 절단하였고, CAG 프로모터가 사용될 경우에는 약 1%를 절단하였다 (도 4). 이러한 ZFN 쌍은 엑손 1의 암호화 영역 내의 랫트 IgM 유전자를 절단하였다. 표준 기법을 사용하여, CAG 프로모터의 제어 하에 ZFN 쌍 17747/17749를 암호화하는 10 ng/㎕의 플라스미드를 랫트 난모 세포에 주입하였다. 난모 세포를 수정시키고 위임신 암컷 내에 이식하였다. 상기 주입하고 이식한 430개의 난모 세포 중에서, 43마리가 정상적으로 출생하였다. 이 43마리의 동물의 꼬리에서 유전체 DNA를 채취하고, Surveyor™ 뉴클레아제를 사용하여 변형에 대해 스크리닝하였다.
도 7에 나타나 바와 같이, 43마리의 동물 중 5마리 (랫트 #6, 7, 8, 19 및 46)는 IgM 유전자 자리에서의 변형에 대해 양성인 것으로 스코어링 되었다. Surveyor™ 뉴클레아제 소화 분해의 패턴들은 야생형 랫트 유전체 DNA를 첨가한 것과 첨가하지 않은 것 모두에 있어서 동일하였는데, 이는 랫트 중 그 어느 것도 동형 접합성 돌연변이를 가지고 있지 않다는 것을 시사하는 것이다.
상기 양성 랫트의 GJC153F/GJC154R PCR 생성물을 클로닝하여 시퀀싱하였다. 돌연변이화된 대립 형질에 대한 설명이 표 8에 나타나 있다.
Figure pct00008
상기 랫트 내에서 IgM 유전자 자리를 시퀀싱하여 Surveyor™ 뉴클레아제 분석의 결과를 확인하였다. 모든 결실 부분은 ZFN 결합 부위와 중첩되었다. 여기에 나타난 작은 결실들의 스펙트럼은 NHEJ 매개성 돌연변이에 있어서는 전형적인 것들이다. 랫트 7과 8은 하나 이상의 돌연변이화된 대립 형질을 보유하였기 때문에, IgM 돌연변이에 대한 모자이크들이다. 랫트 6, 19 및 46의 시퀀싱으로 단 하나의 돌연변이화된 대립 형질을 확인하였으나, 이들은 다른 조직에서는 IgM 변형에 대한 모자이크일 수 있다.
따라서, ZFN은 내인성 랫트의 IgM 유전자 자리를 성공적으로 변형시켰다.
ZFN 플라스미드 자체가 랫트 유전체 내에 통합되었는지의 여부를 알아보기 위해, PCR을 기반으로 한 분석법을 개발하여 ZFN 플라스미드 통합에 대해 시험하였다. 약술하면, 유전체마다 한 번의 플라스미드 삽입 빈도수를 모방하기 위해 랫트 유전체 DNA와 ZFN 플라스미드를 혼합하였다. 상기 혼합물에 대하여, CAG 프로모터 내의 하나의 올리고 (5'-GCT AAC CAT GTT CAT GCC TTC-3') (서열번호 49)와 플라스미드의 2A 영역 내의 또 다른 올리고 (5'-CAT CCT AGG GCC GGG ATT CTC-3') (서열번호 50)를 이용한 35 사이클의 PCR 증폭을 수행하여, 1338 bp의 밴드가 생성되었다 (도 7, 레인 3). 야생형 유전체 DNA와 5마리의 ZFN-변형된 랫트를 분석한 결과, PCR 생성물이 검출되지 않았는데, 이는 랫트 유전체 내에 플라스미드 삽입이 높은 빈도수로 나타나는 현상이 아니라는 것을 의미하는 것이다.
또한, CEL-I 분석과 시퀀싱을 이용하여 IgM 변형된 랫트 #19를 추가로 분석하였다. 도 7A와 7B에서 볼 수 있는 바와 같이, IgM-ZFN은 상기 랫트의 IgM 유전자 자리에서 64개의 염기쌍 결실을 나타내었다.
마지막으로, 비표적 부위에서의 ZFN 절단도 평가하였다. 컴퓨터를 이용한 알고리즘을 사용하여 비표적 부위가 될 만한 위치를 예측하였다 (문헌 [Doyon et al., (2008) Nature Biotechnology 26(6):702-708]). 비표적 부위가 될 만한 모든 부위에 대해 상기 기술된 것과 같이 Surveyor™ 뉴클레아제 분석법을 사용하여 ZFN 변형에 대해 분석하였다. 본 분석의 결과를 표 9와 도 9A-C에 나타내었다.
Figure pct00009
여기에서 볼 수 있는 바와 같이, 시험한 비표적 부위들 중 그 어느 것도 변형이 되었다는 흔적을 나타내지 않았다. 도 9A에 나타낸 CEL-I 양성 랫트 #19와 부위 1에 있어서 도 11에 나타난 그 5마리의 새끼의 시퀀싱 분석을 통해, CEL-I 양성 신호가 잠재적인 비표적 부위 부근의 SNP에 기인하는 것을 알 수 있었다. 이러한 미스매치는 랫트가 상기 SNP (이는 비처리된 랫트에서도 발견됨 (데이터는 나타내지 않음))에 대해 이형 접합성이기 때문에 발생한다. 상기 SNP는 CEL-I 양성인 동물에 있어서 50%의 염색체 내에 존재하는데도 불구하고, CEL-I 효소에 의해 잘 인식되지 않아 예상외로 더 낮은 밀도의 절단 생성물을 만들게 된다.
B. Rab38
또한, 랫트 내의 내인성 Rab38 유전자 자리, 특히 랫트 Rab38 유전자의 엑손 1를 표적으로 삼도록 ZFN을 설계하였다. 예시적인 Rab38 징크 핑거 설계를 하기 표 10에 나타내었다.
Figure pct00010
Rab38-표적화 징크 핑거 설계의 표적 부위를 하기 표 11에 나타내었다. ZFP 인식 나선에 의해 접촉되는 표적 부위 내의 뉴클레오타이드는 대문자로 표시했고, 접촉되지 않는 뉴클레오타이드는 소문자로 표시하였다.
Figure pct00011
모든 Rab38-표적화 ZFN은 미국특허공보 제2008/0131962호에 기술된 바와 같이 EL/KK FokI 돌연변이를 포함하였다. ZFN 발현은 CAG 또는 CMV 프로모터에 의해 주도되었다. 용액 SF를 이용하는 아막사 뉴클레오펙션과 아막사 셔틀 96-웰 뉴클레오펙터를 통해 200,000개의 C6 세포에 ZFN (각 1㎍)을 형질감염시켰다. 예를 들어, 미국특허공보 제20080015164호; 제20080131962호 및 제20080159996호에 기술된 것과 같이 CEL-I Surveyor™ 뉴클레아제를 사용하여 절단을 분석하였다.
Rab38 ZFN을 암호화하는 발현 플라스미드를 XbaI를 사용해 선형으로 만들고, 페놀 클로로포름으로 추출하여 침전시켰다. MessageMax™ T7 ARCA-캡핑된 메시지 전사 (Message Transcription) 키트 [에피센터 바이오테크놀로지스 (Epicentre Biotechnologies)]를 이용하여 mRNA를 시험관 내에서 전사시켰다. 생성된 합성물을 RNAse가 첨가되지 않은 0.1X TE (1mM Tris-Cl pH 8.0, 0.1mM EDTA) 중에 재현탁하기 전에 MegaClear Kit™ [앰비온 (Ambion)]를 사용하여 정제하고, NanoDrop-1000 [써모 사이언티픽(Thermo Scientific)]을 이용하여 정량한 후, 사용할 때까지 -80℃에서 저장하였다. Rab38 ZFN을 암호화하는 mRNA를 0.1X TE 중에 5 ng/㎕의 최종 총 농도로 혼합하였다. 일정한 시간과 압력 하 (Pi= 65, Pc= 20, ti=1.5s)에, 배아 세포질 내에 Rab38 ZFN을 주입하여, 분자 기반 분석에 대해서 문헌 [Filipiak et al., (2006) Transgenic Res 15:673-686]에 앞서 기술된 바와 같이, 37.5℃, 5% CO2 환경의 KSOM [밀리포어 (Millipore)] 중에서 밤새 배양하였다.
주입 후 48시간 동안 배양한 배아에서 추출한 DNA의 염색체 내 Rab38 표적 엑손의 변형을 확인하기 위해, 문헌 [Lloyd et al., (2005) Proc Natl Acad Sci USA 102:2232-2237]에 기술된 돌연변이-강화 전략을 사용하였다.
도 10에 나타난 것이나, 상기 GFP 및 IgM 유전자 자리 양자에 대해 입증된 바와 같이, 다수의 돌연변이 Rab38 대립 형질은 단지 16개의 2-세포 배아의 유전체 내에서만 확인할 수 있었으며, 시퀀싱을 이용해 표적 부위에서 결실이 있음을 알 수 있었다.
따라서, 이러한 데이터들은 복수 개의 유전체의 유전자 자리가 ZFN-매개성 유전체 편집에 적합한 표적이라는 것을 확인시켜 주는 것이다.
실시예 4: ZFN 매개성 생식 세포 변형
실시예 3에 기술된 IgM-변형된 랫트 #19, #46 및 #8을 야생형 랫트와 교미시켜, 꼬리의 생체 조직을 취하여 유전체 DNA를 분리시킨 후, 새끼로부터 정제된 핵산에 대하여 CEL-I 및 PCR 분석을 수행하였다.
도 11A와 11C에서 볼 수 있는 바와 같이, 랫트 #19와 야생형 랫트 간의 교배로 출생한 새끼들 (번호: 225, 227, 228, 229, 230, 231, 234 및 235)은 PCR 및 CEL-I 분석법으로 측정시 IgM 변형된 부모 랫트 #19의 64개의 염기쌍 결실을 수반하고 있었다. 또한, 시퀀싱 분석으로 랫트 #19의 3마리의 새끼 (새끼번호 #225, 227 및 228)들이 IgM 유전자 자리에서 변형되었음을 확인하였다. 도 11B를 참조한다. 이에 더하여, 도 11C에 나타난 바와 같이, 랫트 #46과 야생형 랫트를 교배하여 나온 새끼들은 부모 랫트 #46와 동일한 IgM 변형을 수반하였다 (도 11C의 새끼 번호 236 참조).
이러한 데이터들은 랫트 유전자 자리의 ZFN-매개성 붕괴가 생식 세포 내로 이동하였음을 입증하는 것이다.
실시예 5: 랫트 유전체의 PXR 핵산 영역 내 표적화 통합을 위한 제한효소 단편 길이 다형성 ( RFLP ) 공여자 핵산의 구축
표적화 ZFN-유도성 이중 가닥 절단 후, 두 가지 경우의 DNA 복구 결과가 가능하다 (도 12). 상기 절단은 염기 결실 또는 첨가를 함유하는 돌연변이를 초래하는 비상동성 말단 봉합 (NHEJ)에 의해 복구될 수 있거나, 또는 공여자 DNA의 존재 하에, 상기 공여자 DNA를 주형으로 사용하여 상동성 재조합 (HR)에 의해 상기 이중 가닥 절단을 복구할 수 있다. 상기 공여자 DNA가 특정 서열 변화를 암호화하는 경우, 이러한 의도적인 돌연변이를 유기체의 유전체 내에 표적 부위에 도입할 수 있다.
전핵 주입법을 이용한 랫트 유전체 내의 표적화 통합을 시험하기 위해서, 랫트 유전체의 PXR 유전자 영역 내로 표적화 통합을 위한 구축물을 설계하여 제조하였다. 구축물을 조립하여 NotI 또는 PmeI 제한효소 단편 길이 다형성 (RFLP) 부위를 상기 PXR 유전자 영역 내로 도입하였다 (도 13). 상기 구축물은, 도입될 RFLP 부위에 측접하는 PXR 유전자 표적 부위와 200개, 800개 또는 2000개의 염기쌍 서열 상동성을 가지도록 설계하였다. 상기 세 가지 크기의 상동성 영역을 사용하여 효율적인 표적화 및 상동성 재조합에 필요한 상동성 크기를 측정하였다.
PXR 상동성 영역의 맨 끝에 클로닝 하기에 편리한 제한 부위와 RFLP 부위를 도입하기 위해 PCR 증폭을 사용하여 클론들을 조립하였다 (도 12). PXR 상동성 영역을 증폭하는데 사용된 PCR 프라이머는 표 12에 기술되어 있다. PCR 반응 증폭을 위해 Accuprime HF DNA 폴리머라아제를 사용하였다. 200 bp 단편에 대해서는 30초 신장을 이용하였고, 800 bp 단편에 대해서는 1.5분 신장을 이용하였으며, 2 Kbp 단편에 대해서는 4분 신장을 이용하였다. 이후, PCR 단편들을 적절한 제한 효소를 사용하여 소화 분해하고, 3-방향 결찰을 사용해 pBluescript 내로 클로닝하여 표 13에 열거된 6개의 플라스미드를 생성시켰다.
Figure pct00012
Figure pct00013
실시예 6: 랫트 유전체의 rRosa26 핵산 영역 내 표적화 통합을 위한 제한효소 단편 길이 다형성 ( RFLP ) 공여자 핵산의 구축
랫트 유전체의 rRosa26 핵산 영역 내에 NotI 및 PmeI RFLP 부위의 통합을 표적화하기 위한 플라스미드 역시 구축하였다. 플라스미드의 설계와 구축은 상기 실시예 5에 기술한 바와 같다. rRosa26 상동성 영역을 증폭하는데 사용된 PCR 프라이머 쌍은 표 14에 기술되어 있다.
Figure pct00014
실시예 7: 마우스 또는 랫트 유전체의 Mdr1a 핵산 영역 내 표적화 통합을 위한 제한효소 단편 길이 다형성 ( RFLP ) 공여자 핵산의 구축
마우스 유전체의 mMdr1a 핵산 영역 또는 랫트 유전체의 rMdr1a 핵산 영역 내에 NotI 및 PmeI RFLP 부위의 통합을 표적화하기 위해 플라스미드를 구축하였다. 플라스미드의 설계와 구축은 상기 실시예 5에 기술한 바와 같다. Mdr1a 상동성 영역을 증폭하는데 사용된 PCR 프라이머 쌍은 표 15와 16에 기술되어 있다. "m"은 마우스를 의미하고, "r"은 랫트를 의미한다.
Figure pct00015
Figure pct00016
실시예 8: GFP 발현 통합 카세트의 구축
RFLP 보다 큰 핵산 단편의 표적화 통합을 시험하기 위해, 랫트의 PXR 및 rRosa26 핵산 유전체 영역과 마우스의 mMdr1a 핵산 유전체 영역 내 GFP 발현 카세트의 표적화 통합을 위한 구축물을 설계하여 제조하였다. 약술하면, 인간 PGK 프로모터를 포함하는 GFP 발현 카세트, GFP 오픈 리딩 프레임 및 폴리아데닐화 신호를 PCR을 이용해 증폭한 후, 하기 프라이머들을 사용하여 NotI 제한 부위를 말단에 도입하였다: PGKGFP-F NotI (5'-aaagcggccgcttggggttgcgccttttcc) (서열번호 164) 및 PGKGFP-R NotI (5'-aaaagcggccgccatagagcccaccgcatc) (서열번호 165). 이후, 상기 PCR 단편을 실시예 5-7에서 구축한 NotI를 함유하는 플라스미드 내로 클로닝하였다.
실시예 9: 표적화 통합을 위한 징크 핑거 mRNA 의 제조
시그마 (Sigma) 웹 사이트 상에 기술된 바와 같이, 각 표적화 통합 부위에 대해 한 쌍의 징크 핑거 뉴클레아제를 설계하여 클로닝하였다. 보다 상세한 정보를 원한다면, 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Science (2009) 325:433]을 참조한다. 이후, 먼저 10㎕의 버퍼 2 (NEB, #B7002S), 10㎕의 10x BSA (100x BSA를 희석한 것, NEB, #B9001S), 8㎕의 XbaI (NEB, #R0145S)를 함유하는 100㎕의 반응물 중에서, 20 ㎍의 각 맥시프렙된(maxiprepped) ZFN 발현 플라스미드 DNA를 37℃에서 2시간 동안 소화 분해시켜, ZFN을 발현하는 mRNA를 시험관 내에서 생성하였다. 상기 반응물을 100㎕의 페놀/클로로포름 (시그마, P2069)으로 추출하여, 20,000xg 이상으로 10분간 원심분리하였다. 수용성인 상청액을 10㎕의 3M NaOAc (시그마, S7899) 및 250㎕의 100% 에탄올로 침전시키고, 실온에서 가장 빠른 속도로 25분간 원심분리하였다. 생성된 펠렛을 300㎕의 70% 에탄올을 첨가하여 세척한 후, 0.02μM 필터를 통해 여과시켰다. 상기 펠렛을 통풍 건조시킨 후 0.02μM 필터로 여과된 20㎕의 0.1xTE 중에 재현탁시켰다.
다음으로, 상기 기술된 에피센터 바이오테크놀로지스의 MessageMax T7 캡핑된 메시지 전사 키트 (#MMA60710)를 활용한 시험관 내 전사를 사용하여, 상기 정제된 소화 분해 DNA를 ZFN 전사체를 생성하는데 이용하였다. 약술하면, 키트 성분들을 미리 실온으로 가온시키고, 20㎕의 반응물에 있어서 반응 성분들을 하기 순서대로 실온에서 혼합하였다: 0.02㎛ 필터로 여과된 5㎕의 RNase-무첨가수, 1㎕의 제조된 주형, 2㎕의 10x 전사 버퍼, 8㎕의 2-방향 Cap/NTP 예비 배합물, 2㎕의 100 mM DTT 및 2㎕의 MessageMax T7 효소 용액. 이후, 상기 반응을 37℃ 인큐베이터 중에서 30분간 배양하였다.
이후, 기술된 대로 A-플러스 폴리 (A) 폴리머라아제 테일링 키트 (에피센터, #PAP5 104H)를 사용하여 상기 캡핑된 RNA에 폴리 A 꼬리를 달았다. 반응 성분들을 하기의 순서로 실온에서 배합하였다: 0.02㎛ 필터로 여과된 55.5㎕의 RNase-무첨가수, 10㎕의 10x A-플러스 반응 버퍼, 10㎕의 10 mM ATP, 2.5㎕의 ScriptGuard RNase 억제제 (40 유닛/㎕), 20㎕의 시험관 내 전사 캡핑 반응물, 2㎕의 A-플러스 폴리 A 폴리머라아제. 다음으로, 상기 반응물을 37℃에서 30분간 배양하였다. 생성된 캡핑 폴리 A-꼬리 mRNA를 동일 부피의 5M NH4Oac로 침전시켜 2회 정제하였다. 상기 mRNA 펠렛을 이후 통풍 건조시키고, 30㎕의 여과된 주입 버퍼 (1 mM Tris, pH 7.4, 0.25 mM EDTA) 중에 재현탁시킨 후, Nanodrop 분광 광도계를 사용하여 RNA 농도를 측정하였다.
실시예 10: 배아 내 표적화 통합
랫트 또는 마우스 유전체 내로 핵산을 통합시키기 위해, 징크 핑거 뉴클레아제 mRNA를 0.02㎛ 필터로 여과된 맥시프렙 표적 DNA와 혼합하였다. 상기 핵산 혼합물은 1부의 ZFN mRNA 대 1부의 공여자 DNA로 이루어졌다. 이후, 상기 핵산 혼합물을 공지된 방법을 사용하여 단세포 배아의 전핵 내에 미량 주입하였다. 상기 주입된 배아를 시험관 내 배양하거나, 위어미 (pseudo mom)로 이동시켰다. 상기 생성된 배아/태아, 또는 정상 출생한 동물의 발가락/꼬리 클립을 수거하여 DNA를 추출하고 이를 분석하였다.
DNA를 추출하기 위해, 100㎕의 에피센터 QuickExtract 중에서 조직을 50℃로 30분간 용해시킨 후, 65℃에서 10분간, 그리고 98℃에서 3분간 배양하였다. 표적화 통합이 발생하는 지의 여부를 알아보기 위해, PCR을 사용하여 적절한 프라이머로 표적 영역을 증폭시켰다. RFLP가 동물의 유전체 내로 통합되는 실험에 있어서는, PCR 생성물은 그 통합을 확인하기 위하여 상기 도입된 RFLP 효소로 소화 분해시켰다 (도 15A). 또한, 야생형 PCR 단편들과 주입된 배아에서 유래한 PCR 단편들을 이용하는 CEL-I 엔도뉴클레아제 분석법을 이용해, 표적화 통합과는 독립적인 NHEJ를 확인함으로써 ZFN mRNA가 배아 내에서 기능성이라는 사실을 입증하였다. GFP가 동물의 유전체 내에 통합되는 실험에 있어서는, PCR 단편 크기의 변화가 통합 사실을 보여주는 것이다 (도 15B). 다르게는, 하나의 프라이머가 GFP 카세트에만 안착되는 통합 연결 지점의 증폭을 이용해 공여자 핵산의 통합을 평가하였다.
실시예 11: 마우스 유전체 내 mMdr1a 표적 부위의 DNA 추출 및 PCR 증폭에 대한 시험
실시예 10에 기술한 대로 추출한 1-64개의 세포를 보유한 배아를 사용해, 조직에서 추출한 표적 핵산을 증폭하기 위한 PCR 조건을 시험하였다. 50㎕의 반응물 중 5㎕까지 에피센터의 QuickExtract 용액을 포함하는 반응에서, 60℃로 4분의 신장을 하는 36회의 증폭 사이클을 사용하여, 마우스 mMdr1a 표적 영역을 포함하는 900 bp 단편을 증폭하였다 (도 16). 이러한 결과들은 QuickExtract가 PCR 증폭을 방해하지 않으며, DNA가 단 1-10개의 세포에서 추출한 샘플로부터 증폭될 수 있음을 보여주는 것이다. 민감도를 향상시키기 위해, PCR 사이클의 수를 증가시키거나, 또는 이중 PCR 반응을 수행할 수 있다.
실시예 12: 랫트 PXR 유전체 영역 내 NotI 공여자 RFLP 의 통합
랫트 유전체의 PXR 영역 내로 NotI RFLP 부위를 통합하기 위한 공여자 플라스미드 (800 bp의 암(arm) 보유)를, 상기 기술한 바와 같이 ZFN mRNA를 보유한 랫트 배아에 주입하였다. 다수의 배아에서 추출한 DNA를 이용하여, PCR 후 NotI 제한 효소 분석 및 CEL-I 엔도뉴클레아제 분석을 수행하였다. PCR 증폭은 다수의 배아에 있어서 성공적이었으며 (도 17A), CEL-I 엔도뉴클레아제 분석으로 대부분의 단편들이 목적하는 표적에서 핵산 서열 변화를 보이는 것으로 드러났다 (도 17B).
실시예 13: 마우스 mMdr1a 유전체 영역 내 NotI 공여자 RFLP 의 통합
마우스 mMdr1a 영역 내의 NotI RFLP의 표적화 통합을 실시예 8에 기술된 바와 같이 반복하였다. mMdr1a 영역을 PCR을 이용해 증폭시키고 NotI로 소화 분해하였다. 다수의 배아에 있어서 PCR 증폭은 성공적이었으며 (도 18), NotI를 이용한 소화 분해로 인해 다수의 배아들이 통합된 RFLP 부위 (예를 들어, 레인 13, 17, 19, 20 및 23 참조)를 포함하고 있음을 알 수 있었다. 종합하면, 생성된 데이터로 보아 32개의 배아 중 7개의 배아에서 표적화 통합이 발생하였다.
이러한 결과들은 PCR 반응 생성물을 추가로 세정한 후에 NotI 소화 분해 반응을 반복함으로써 확인되었다 (도 19).
실시예 14: 랫트 유전체 내 PXR 표적 부위의 DNA 추출 및 PCR 증폭에 대한 시험
민감도 수준을 측정하기 위하여, 배반포 PXR 영역의 PCR 증폭에 대해 시험하였다. PCR 반응은 50㎕의 반응물에 5㎕의 주형, 5㎕의 PCR 버퍼, 5㎕의 각 프라이머, 0.5㎕의 Taq 폴리머라아제 효소 및 33.5㎕의 물을 포함하였다. 상기 주형은 랫트 배반포에서 추출한 희석하지 않은 DNA, 또는 1:2, 1:6, 1:10 및 1:30의 비율로 희석한 DNA로 이루어졌다 (도 20).
실시예 15: 랫트 PXR 유전체 영역 내 NotI 공여자 RFLP 의 통합
랫트 유전체의 PXR 영역 내로 NotI RFLP 부위를 통합하기 위한 공여자 플라스미드 (800 bp의 상동성 암을 보유)를 상기 기술된 바와 같이 ZFN mRNA를 가진 랫트 배아 내로 주입하였다. 총 123개의 배아에 주입하여, 106개가 생존하였다. 독성 시험을 위하여 핵산 농도를 감소시켜 주입하였다. 5ng의 핵산을 주입한 51개의 배아 중에서, 17개가 생존하여 2일째에 2개의 배아 세포로 분열되었다. 2ng의 핵산을 주입한 23개의 배아 중에서는, 14개가 생존하여 2일째에 2개의 배아 세포로 분열되었다. 10ng의 핵산을 주입한 29개의 배아 중에서, 12개가 생존하여 2일째에 2개의 배아 세포로 분열되었다. 아무것도 주입하지 않은 대조군 배아들은 모두 생존하여 2일째에 2개의 배아 세포로 분열되었다.
PXR 영역의 PCR 증폭 후, 다수의 배아에서 추출한 DNA를 이용해 NotI 및 CEL-I 엔도뉴클레아제 분석을 수행하였다. PCR 증폭은 다수의 배아에 있어서 성공적이었으며, NotI 및 CEL-I 엔도뉴클레아제 분석을 통해 47개의 배아 중 18개가 목적하는 표적에서 핵산 서열의 변화가 있었음을 알 수 있었다 (도 21).
실시예 16: 태아에 있어서 마우스 유전체의 mMdr1a 표적 영역 내 RFLP 의 표적화 통합
마우스 유전체의 mMdr1a 영역 내로 NotI를 도입하기 위한 공여자 플라스미드 (800 bp의 상동성 암 보유)를 상기 기술된 바와 같이 ZFN mRNA를 가진 마우스 배아 내로 주입하였다. 12.5 dpc에 4마리의 건강하게 성장한 마우스 태아 중 1마리가 NotI 부위에 대해 양성이었다. 4개의 탈락막 모두 음성이었다 (도 22).
실시예 17: 태아의 mMdr1a 유전자 자리 내 GFP 의 표적화 통합
마우스 유전체의 mMdr1a 영역 내로 GFP 카세트를 도입하기 위한 공여자 플라스미드 (800 bp의 상동성 암 보유)를 상기 기술된 바와 같이 ZFN mRNA를 가진 마우스 배아 내로 주입하였다. 12.5 dpc에 40마리의 태아 중 2마리가 GFP 카세트에 대해 양성이었다 (도 23).
실시예 18. 태아에 있어서 랫트 유전체의 PXR 표적 영역 내 RFLP 의 표적화 통합
랫트 유전체의 PXR 영역 내로 NotI를 도입하기 위한 공여자 플라스미드 (800 bp의 상동성 암 보유)를 상기 기술된 바와 같이 ZFN mRNA를 가진 마우스 배아 내로 주입하였다. 13 dpc에 8마리의 태아 중 1마리가 NotI 부위에 대해 양성이었다 (도 24).
본 명세서에서 언급한 모든 특허, 특허 출원 및 간행물은 그 내용 전체가 본원에 참조로 포함된다.
명확한 이해를 목적으로 예시와 실례의 방식으로 명세서의 내용을 일부에 있어 다소 상세히 제공했으나, 본 발명에 개시된 내용의 개념이나 범주를 벗어나지 않는 한 이에 대해 다양한 변화를 주거나 변형을 가해 본 발명을 실시할 수 있다는 점은 당업자에게 명백할 것이다. 따라서 상기 상세한 설명과 실시예는 그것에 한정되는 것으로 해석해서는 안된다.
SEQUENCE LISTING <110> SANGAMO BIOSCIENCES, INC. SIGMA ALDRICH COMPANY <120> GENOME EDITING IN RATS USING ZINC-FINGER NUCLEASES <130> 8325-0068.40 <140> PCT/US2009/006365 <141> 2009-12-03 <150> US 61/200,985 <151> 2008-12-04 <150> US 61/205,970 <151> 2009-01-26 <150> US 61/263,904 <151> 2009-11-24 <160> 179 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic linker sequence <400> 1 Thr Gly Glu Lys Pro 1 5 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic linker sequence <400> 2 Thr Gly Gly Gln Arg Pro 1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic linker sequence <400> 3 Thr Gly Gln Lys Pro 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic linker sequence <400> 4 Thr Gly Ser Gln Lys Pro 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger targeted to rat IgM and GFP <400> 5 Arg Ser Ala His Leu Ser Arg 1 5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized GFP zinc finger <400> 26 Asp Ser Ser Ala Arg Lys Lys 1 5 <210> 27 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized GFP zinc finger <400> 27 Arg Ser Asp Ser Leu Ser Val 1 5 <210> 28 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger targeted to rat Rab38, IgM and GFP <400> 28 Asp Arg Ser Asp Leu Ser Arg 1 5 <210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger targeted to rat IgM and GFP <400> 29 Asp Arg Ala Asn Leu Ser Arg 1 5 <210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger targeted to rat IgM and GFP <400> 30 Arg Ser Ala Asn Leu Ser Val 1 5 <210> 31 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized target site of GFP zinc finger <400> 31 gaccaggatg gg 12 <210> 32 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized target site of GFP zinc finger <400> 32 gacggcgacg taaacg 16 <210> 33 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized target site of GFP zinc finger <400> 33 gatgcggttc accagg 16 <210> 34 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized target site of GFP zinc finger <400> 34 gaagggcatc gacttcaag 19 <210> 35 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized target site of GFP zinc finger <400> 35 gttgtggctg ttgtagtt 18 <210> 36 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized target site of GFP zinc finger <400> 36 atcatggccg acaag 15 <210> 37 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger protein targeted to rat IgM <400> 37 Thr Ser Ser Asn Arg Lys Thr 1 5 <210> 38 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger targeted to rat Rab38 and IgM gene <400> 38 Arg Ser Asp Ser Leu Ser Ala 1 5 <210> 39 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger protein targeted to rat IgM <400> 39 Arg Ser Asp Ala Leu Ala Arg 1 5 <210> 40 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger protein targeted to rat IgM <400> 40 Arg Ser Asp Ala Leu Thr Gln 1 5 <210> 41 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger protein targeted to rat IgM <400> 41 Asp Arg Ser His Leu Thr Arg 1 5 <210> 42 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger protein targeted to rat IgM <400> 42 Gln Asn Ala His Arg Lys Thr 1 5 <210> 43 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger targeted to rat p53 and IgM <400> 43 Arg Ser Asp Asn Leu Ser Glu 1 5 <210> 44 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger targeted to rat IgM and p53 <400> 44 Arg Ser Asp His Leu Ser Arg 1 5 <210> 45 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger protein targeted to rat IgM <400> 45 Thr Ser Ser Asp Leu Ser Arg 1 5 <210> 46 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger protein targeted to rat IgM <400> 46 Asn Lys Val Gly Leu Ile Glu 1 5 <210> 47 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized target site of IgM zinc finger <400> 47 aatttggtgg ccatgggc 18 <210> 48 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized target site of IgM zinc finger <400> 48 agacaggggg ctctc 15 <210> 49 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 49 gctaaccatg ttcatgcctt c 21 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 50 catcctaggg ccgggattct c 21 <210> 51 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger protein targeted to rat IgM <400> 51 Asp Arg Ser Ala Leu Ser Arg 1 5 <210> 52 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger targeted to rat IgM and Rab38 <400> 52 Thr Ser Gly His Leu Ser Arg 1 5 <210> 53 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger protein targeted to rat IgM <400> 53 Arg Ser Asp Asn Leu Ser Thr 1 5 <210> 54 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger protein targeted to rat IgM <400> 54 His Asn Ala Thr Arg Ile Asn 1 5 <210> 55 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger targeted to rat p53 <400> 55 Asp Asn Pro Asn Leu Asn Arg 1 5 <210> 56 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger protein targeted to rat IgM <400> 56 Arg Ser Ala Asn Leu Ala Arg 1 5 <210> 57 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger protein targeted to rat IgM <400> 57 Arg Ser Asp Asn Leu Arg Glu 1 5 <210> 58 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger protein targeted to rat IgM <400> 58 Thr Ser Gly Ser Leu Ser Arg 1 5 <210> 59 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger protein targeted to rat IgM <400> 59 Gln Ser Gly Ser Leu Thr Arg 1 5 <210> 60 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger protein targeted to rat IgM <400> 60 Arg Ser Asp Val Leu Ser Glu 1 5 <210> 61 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger protein targeted to rat IgM <400> 61 Gln Ser Ser Asp Leu Ser Arg 1 5 <210> 62 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger protein targeted to rat IgM <400> 62 Arg Ser Asp His Leu Ser Thr 1 5 <210> 63 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger protein targeted to rat IgM <400> 63 His Ser Asn Ala Arg Lys Asn 1 5 <210> 64 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger protein targeted to rat IgM <400> 64 Gln Ser Gly Asp Leu Thr Arg 1 5 <210> 65 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger protein targeted to rat IgM <400> 65 Arg Ser Asp Thr Leu Ser Val 1 5 <210> 66 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger protein targeted to rat IgM <400> 66 Asp Asn Ser Thr Arg Ile Lys 1 5 <210> 67 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized target site of IgM zinc finger <400> 67 ctgaagtcat gcagggtgtc agaacctt 28 <210> 68 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized target site of IgM zinc finger <400> 68 ttgttctggt agttccagga gaaggaaa 28 <210> 69 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized target site of IgM zinc finger <400> 69 gtgctgtggg tgtggctagt gtttgtat 28 <210> 70 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized target site of IgM zinc finger <400> 70 aaggtgccat tggggtgact ttccatga 28 <210> 71 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized target site of IgM zinc finger <400> 71 gagaggaccg tggacaagtc cactggta 28 <210> 72 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized target site of IgM zinc finger <400> 72 tcaccatgtg tggcagggcc tcgtggcc 28 <210> 73 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 73 agtcagcttc ctgtctagaa gagaactggg tgtctatggg cc 42 <210> 74 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 74 caaatgccac ctgtctgaat ggtttatgct ggcaatgggc t 41 <210> 75 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 75 ggtgagaccc ctgtcttaac aaaagatggg ggggttggga a 41 <210> 76 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 76 gatccaaggc caccaactgg agtttaagac aaagggctct gc 42 <210> 77 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 77 tgtccatggc ctcctcctct ttgctagagc ggtggctctc a 41 <210> 78 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 78 ggattgcccc ctgtcagtca cagcatatgg tggccataga tg 42 <210> 79 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 79 ggagaagccc atgtgtactc tttagttggt ggctctggga g 41 <210> 80 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 80 gcccataggc caacaactct caggctagac aacgggctct ca 42 <210> 81 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger targeted to rat Rab38 gene <400> 81 Asp Arg Ser Asn Leu Ser Ser 1 5 <210> 82 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger targeted to rat Rab38 gene <400> 82 Arg Ser His Ser Leu Leu Arg 1 5 <210> 83 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger targeted to rat Rab38 gene <400> 83 Gln Ser Gly His Leu Ser Arg 1 5 <210> 84 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger targeted to rat Rab38 gene <400> 84 His Lys Trp Gln Arg Asn Lys 1 5 <210> 85 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger targeted to rat Rab38 gene <400> 85 Asp Arg Ser Val Leu Arg Arg 1 5 <210> 86 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger targeted to rat Rab38 gene <400> 86 Asp Ser Ser Thr Arg Lys Lys 1 5 <210> 87 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger targeted to rat Rab38 and p53 <400> 87 Arg Ser Asp His Leu Ser Glu 1 5 <210> 88 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger targeted to rat Rab38 gene <400> 88 Asp Lys Ser Asn Arg Lys Lys 1 5 <210> 89 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger targeted to rat Rab38 gene <400> 89 Arg Ser Asp Thr Leu Ser Glu 1 5 <210> 90 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger targeted to rat Rab38 gene <400> 90 Gln Lys Arg Asn Arg Thr Lys 1 5 <210> 91 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger targeted to rat Rab38 gene <400> 91 Arg Ser Asp His Leu Ser Lys 1 5 <210> 92 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger targeted to rat Rab38 gene <400> 92 His Asn Asp Ser Arg Thr Asn 1 5 <210> 93 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger targeted to rat Rab38 gene <400> 93 Arg Ser Asp Tyr Leu Pro Arg 1 5 <210> 94 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger targeted to rat Rab38 gene <400> 94 Gln Ser Asn Asp Leu Asn Ser 1 5 <210> 95 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger targeted to rat Rab38 gene <400> 95 Gln Arg Val Thr Arg Asp Ala 1 5 <210> 96 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger targeted to rat Rab38 gene <400> 96 His Ser Asn Ala Arg Lys Thr 1 5 <210> 97 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger targeted to rat Rab38 gene <400> 97 Ala Ser Lys Thr Arg Thr Asn 1 5 <210> 98 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized target site of rat Rab38 zinc finger <400> 98 gaggagaagt tttggtgcac gtagcgct 28 <210> 99 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized target site of rat Rab38 zinc finger <400> 99 actaccgggc caccattggt gtggactt 28 <210> 100 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger targeted to rat p53 <400> 100 Arg Ser Asp Asp Leu Ser Arg 1 5 <210> 101 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger targeted to rat p53 <400> 101 Asn Ser Gln His Leu Thr Glu 1 5 <210> 102 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger targeted to rat p53 <400> 102 Gln Ser Ser His Leu Ser Arg 1 5 <210> 103 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger targeted to rat p53 <400> 103 Arg Ser Asp Asn Leu Ala Arg 1 5 <210> 104 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger targeted to rat p53 <400> 104 Arg Ser Asp His Leu Thr Thr 1 5 <210> 105 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger targeted to rat p53 <400> 105 Arg Ser Asp Asn Leu Ser Gln 1 5 <210> 106 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger targeted to rat p53 <400> 106 Ala Ser Asn Asp Arg Lys Lys 1 5 <210> 107 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger targeted to rat p53 <400> 107 Arg Ser Ala Ala Leu Ala Arg 1 5 <210> 108 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger targeted to rat p53 <400> 108 Arg Asn Gln His Arg Ile Thr 1 5 <210> 109 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger targeted to rat p53 <400> 109 Asp Ser Arg Ser Arg Ile Asn 1 5 <210> 110 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger targeted to rat p53 <400> 110 Asp Arg Ser His Leu Ser Arg 1 5 <210> 111 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger targeted to rat p53 <400> 111 aagcggaagg ggcgggccat agcccggg 28 <210> 112 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger targeted to rat p53 <400> 112 caggacgtgc ggaatgcgtt aagggaat 28 <210> 113 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger targeted to rat p53 <400> 113 cttcccagtg ggaggtgaca gaaccctg 28 <210> 114 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger targeted to rat p53 <400> 114 accggcgggt gcgggcggac tgcactta 28 <210> 115 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger targeted to rat p53 <400> 115 ccggcgggtg cgggcggact gcacttag 28 <210> 116 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: PXR 200 bp F Kpnl <400> 116 aaaaggtacc tctgtgtttt tccgttctag tccag 35 <210> 117 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: PXR 200 bp R Sacll <400> 117 aaaaccgcgg ctgaagtata cgtggctctc ttgga 35 <210> 118 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: PXR target F Notl <400> 118 gtgtagcggc cgcgacaagg ccaatggcta tcac 34 <210> 119 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: PXR target F Pmel <400> 119 gtgtagttta aacgacaagg ccaatggcta tcac 34 <210> 120 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: PXR target R Notl <400> 120 ttgtcgcggc cgctacacgg cagatttgaa gacctc 36 <210> 121 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: PXR target R Pmel <400> 121 ttgtcgttta aactacacgg cagatttgaa gacctc 36 <210> 122 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: PXR 800 bp F Kpnl <400> 122 aaaaggtacc tcagactggt ccagatttta gamaagggg 39 <210> 123 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: PXR 800 bp R Sacll <400> 123 aaaaccgcgg ataaatctac tggttcgcca agctag 36 <210> 124 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: PXR 2Kb F Kpnl <400> 124 aaaaggtacc gaggtagtag gaaatgcact tc 32 <210> 125 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: PXR 2Kb R Sacll <400> 125 aaaaccgcgg gaagagaatt attgctgaca gtc 33 <210> 126 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: PXR 50 bp F <400> 126 gagcctatca acgtagatga gg 22 <210> 127 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: PXR 50 bp R <400> 127 cttacatcct tcacaggtca tgac 24 <210> 128 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: rRosa26 200 bp F Kpnl <400> 128 aaaaggtacc gggagtggat gaaggagttg 30 <210> 129 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: rRosa26 200 bp R Sacll <400> 129 aaaaccgcgg cggatcacaa gcaataat 28 <210> 130 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: rRose26 target F Notl <400> 130 cttcgcggcc gcgatctgca actggagtct ttc 33 <210> 131 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: rRosa26 target F Pmel <400> 131 cttcgtttaa acgatctgca actggagtct ttc 33 <210> 132 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: rRosa26 target F Notl <400> 132 gatcgcggcc gcgaagaagg gggaagggaa tc 32 <210> 133 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: rRosa26 target R Pmel <400> 133 gatcgtttaa acgaagaagg gggaagggaa tc 32 <210> 134 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: rRosa26 800 bp F Kpnl <400> 134 aaaaggtacc gcgtgtgaaa acacaaatgg 30 <210> 135 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: rRosa26 800 bp R Sacll <400> 135 aaaaccgcgg aaggaaagag gcattcatgg 30 <210> 136 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: rRosa26 2Kb F Kpnl <400> 136 aaaaggtacc attatggagg ggaggactgg 30 <210> 137 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: rRosa26 2Kb R Sacll <400> 137 aaaaccgcgg acatgtggca aacaggaga 29 <210> 138 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: rRosa26 50 bp F <400> 138 tgtcttctga ggaccgccc 19 <210> 139 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: rRosa26 50 bp R <400> 139 ctgcccagaa gactcccgc 19 <210> 140 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: mMdr1a 200 bp F Kpnl <400> 140 aaaaggracc aacaacacta ggctcaggag 30 <210> 141 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: mMdr1a 200 bp R Sacll <400> 141 aaaaccgcgg cacatggcta agcacagcat g 31 <210> 142 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: mMdr1a target F Notl <400> 142 cctgcggccg cggactgtca gctggtattt g 31 <210> 143 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: mMdr1a target F Pmel <400> 143 cctgtttaaa cggactgtca gctggtattt g 31 <210> 144 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: mMdr1a target R Notl <400> 144 gtccgcggcc gcagggctga tggccaaaat c 31 <210> 145 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: mMdr1a target R Pmel <400> 145 gtccgtttaa acagggctga tggccaaaat c 31 <210> 146 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: mMdr1a 800 bp F Kpnl <400> 146 aaaaggtacc atgctgtgaa gcagatacc 29 <210> 147 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: mMdr1a 800 bp R Sacll <400> 147 aaaaccgcgg ctgaaaactg aatgagacat ttgc 34 <210> 148 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: mMdr1a 2KB F Kpnl <400> 148 aaaaggtacc gtaatgttcc aattgcatct tcc 33 <210> 149 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: mMdr1a 2KB R Sacll <400> 149 aaaaccgcgg ctctcagttc tctgctgttg 30 <210> 150 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: mMdr1a 50 bp F <400> 150 gatttacccg tggctggaag 20 <210> 151 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: mMdr1a 50 bp R <400> 151 ctggactcat ggacttcacc 20 <210> 152 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: rMdr1a 200 bp F Kpnl <400> 152 aaaaggtacc tggctcagga gaaaaattgt g 31 <210> 153 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: rMdr1a 200 bp R Sacll <400> 153 aaaaccgcgg cacggctaaa gacagcatga 30 <210> 154 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: rMdr1a target F Notl <400> 154 ccctgcggcc gcggactgtc agctggtatt tg 32 <210> 155 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: rMdr1a target F Pmel <400> 155 ccctgtttaa acggactgtc agctggtatt tg 32 <210> 156 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: rMdr1a target R Notl <400> 156 gtccgcggcc gcagggctga tggccaaaat c 31 <210> 157 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: rMdr1a target R Pmel <400> 157 gtccgtttaa acagggctga tggccaaaat c 31 <210> 158 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: rMdr1a 800 bp F Kpnl <400> 158 aaaaggtacc ggagataggc tggtttgacg 30 <210> 159 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: rMdr1a 700 bp R Sacll <400> 159 aaaaccgcgg atggtggtag ttcggatgg 29 <210> 160 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: rMdr1a 2Kb F Kpnl <400> 160 aaaaaggtac caggttgttc ttggagatgt gc 32 <210> 161 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: rMdr1a 2Kb T Sacll <400> 161 aaaaccgcgg tcctcttggc tggtgagttt 30 <210> 162 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: rMdr1a 50 bp F <400> 162 gatttactcg cggctggaag 20 <210> 163 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: rMdr1a 50 bp R <400> 163 ctggactcac gggcttcac 19 <210> 164 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: PGKGFP-F NotI <400> 164 aaagcggccg cttggggttg cgccttttcc 30 <210> 165 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: PGKGFP-R NotI <400> 165 aaaagcggcc gccatagagc ccaccgcatc 30 <210> 166 <211> 111 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 166 cctgcgagag ccccctgtct gatgagaatt tggtggccat gggctgcctg gcccgggact 60 tcctgcccag ctccatttcc ttctcctgga actaccagaa caacactgaa g 111 <210> 167 <211> 111 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 167 cctgcgagag ccccctgtct gatgagaatt tggtggccat gggctgcctg gcccgggact 60 tcctgcccag ctccatttcc ttctcctgga actaccagaa caacactgaa g 111 <210> 168 <211> 47 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 168 cctgcgagag ccccctgtct cctggaacta ccagaacaac actgaag 47 <210> 169 <211> 75 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 169 atcatcaagc gctacgtgca ccaaaacttc tcctcccact accgggccac cattggtgtg 60 gacttcgcgc tgaag 75 <210> 170 <211> 69 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 170 atcatcaagc gctacgtgca ccaaaacttc tcctaccggg ccaccattgg tgtggacttc 60 gcgctgaag 69 <210> 171 <211> 33 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 171 atcatcaagc gctacgtgga cttcgcgctg aag 33 <210> 172 <211> 42 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 172 ctgcgagagc cccctgtctc ctggaactac cagaacaaca ct 42 <210> 173 <211> 106 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 173 ctgcgagagc cccctgtctg atgagaattt ggtggccatg ggctgcctgg cccgggactt 60 cctgcccagc tccatttcct tctcctggaa ctaccagaac aacact 106 <210> 174 <211> 106 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 174 ctgcgagagc cccctgtctg atgagaattt ggtggccatg ggctgcctgg cccgggactt 60 cctgcccagc tccatttcct tctcctggaa ctaccagaac aacact 106 <210> 175 <211> 42 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 175 ctgcgagagc cccctgtctc ctggaactac cagaacaaca ct 42 <210> 176 <211> 106 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 176 ctgcgagagc cccctgtctg atgagaattt ggtggccatg ggctgcctgg cccgggactt 60 cctgcccagc tccatttcct tctcctggaa ctaccagaac aacact 106 <210> 177 <211> 42 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 177 ctgcgagagc cccctgtctc ctggaactac cagaacaaca ct 42 <210> 178 <211> 106 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 178 ctgcgagagc cccctgtctg atgagaattt ggtggccatg ggctgcctgg cccgggactt 60 cctgcccagc tccatttcct tctcctggaa ctaccagaac aacact 106 <210> 179 <211> 42 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 179 ctgcgagagc cccctgtctc ctggaactac cagaacaaca ct 42

Claims (12)

  1. 랫트 세포 내에서 하나 이상의 내인성 세포 유전자를 변형시키는 방법으로서, 상기 방법은, ZFN(들)이 발현되어 상기 하나 이상의 내인성 세포 유전자가 절단되어 변형되도록 하는 조건 하에, 상기 하나 이상의 유전자 내의 표적 부위에 결합하는 하나 이상의 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN)를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 랫트 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 변형은, 상기 하나 이상의 내인성 세포 유전자의 절단으로 촉발되는 상동성 재조합에 의해, 랫트 세포의 유전체 내에 외인성 서열을 도입하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 외인성 서열은 상기 유전체 내에 물리적으로 통합되는 것인 방법.
  4. 청구항 2에 있어서, 상기 외인성 서열은, 핵산 복제 과정을 통해 숙주 세포 유전체 내로 상기 외인성 서열을 복제하여 넣음으로써, 상기 유전체 내에 통합되는 것인 방법.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 핵산 복제 과정은 이중 가닥 절단의 상동성 지향 복구 단계를 포함하는 것인 방법.
  6. 청구항 4에 있어서, 상기 핵산 복제 과정은 비상동성 의존형 표적화 통합 단계를 포함하는 것인 방법.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 변형은 절단 후 비상동성 말단 봉합으로부터 초래되는 것인 방법.
  8. 청구항 7에 있어서, 제1 및 제2 징크 핑거 뉴클레아제는 2개의 부위에서 유전체를 절단하고, 상기 비상동성 말단 봉합은 상기 제1 절단 부위와 제2 절단 부위 사이의 결실을 초래하는 것인 방법.
  9. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 징크 핑거 뉴클레아제는 IIS형 제한 엔도뉴클레아제의 절단 도메인 또는 절단 절반-도메인을 포함하는 것인 방법.
  10. 랫트 배아의 하나 이상의 세포의 유전체 내에서 하나 이상의 유전자 서열을 변형시키는 단계를 포함하는, 랫트 내에서 하나 이상의 표적 유전자의 생식 세포를 붕괴시키는 방법으로서, 상기 방법은
    청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항의 방법에 따라 랫트 배아의 하나 이상의 세포 내에서 하나 이상의 표적 유전자를 변형시키는 단계; 및
    상기 랫트 배아를 성장시키는 단계
    를 포함하며, 상기 변형된 유전자 서열은 성적으로 성숙한 랫트의 적어도 일부의 생식 세포 내에 존재하는 것인 방법.
  11. 관심 대상인 랫트 유전자 자리에 하나 이상의 유전성 돌연변이 대립 형질을 생성시키는 방법으로서, 상기 방법은
    청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항의 방법에 의해, 랫트 배아에 있어서 하나 이상의 세포의 유전체 내에서 하나 이상의 유전자 자리를 변형시키는 단계;
    상기 랫트 배아를 성적으로 성숙되도록 성장시키는 단계; 및
    상기 성적으로 성숙한 랫트가 자손을 번식하도록 하는 단계
    를 포함하며, 상기 자손의 적어도 일부는 상기 돌연변이 대립 형질을 포함하는 것인 방법.
  12. 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 하나 이상의 변형된 대립 형질을 포함하는 랫트.
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