CN102625655A - 使用锌指核酸酶在大鼠中进行基因组编辑 - Google Patents

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Abstract

本文公开了用于大鼠中一个或多个基因座的基因组编辑的方法和组合物，该方法和组合物使用包含锌指蛋白和裂解域或裂解半域的融合蛋白。还提供了编码所述融合蛋白的多核苷酸，以及包含所述多核苷酸和融合蛋白的细胞。

Description

使用锌指核酸酶在大鼠中进行基因组编辑
相关申请的交叉引用
本申请要求2008年12月4日提交的美国临时申请No.61/200,985、2009年1月26日提交的美国临时申请No.61/205,970和2009年11月24日提交的美国临时申请No.61/263,904的权益，这些申请的公开内容以引用方式全文并入本文。
关于在联邦政府资助研究下完成的发明的权利声明
不适用。
技术领域
本公开属于大鼠基因组工程领域，包括体细胞的和可遗传的基因中断、基因组改变、在大鼠基因特定位置上产生携带随机突变的等位基因以及诱导同源定向修复。
背景技术
大鼠(Rattus norvegicus)是在高血压、心血管生理学、糖尿病、代谢紊乱、行为研究以及毒性测试领域中广泛使用的动物模型。Michalkiewicz等人(2007)J.Amer.Phys.Society 293：H881-H894。这些模型系统的可用性，以及在大鼠基因组学和大鼠、人类和小鼠基因组序列中的进展大大加速了用于发现复杂疾病遗传基础的近交系大鼠模型的使用，并且提供了用于治疗性药物发现的动物模型。
然而，有关大鼠基因组信息的进步并未伴随有基因组修饰技术的平行发展。与小鼠不同，用于基因靶向的大鼠胚胎干细胞克隆并不容易产生。前核注射经证实也较为困难，并且在产生转基因大鼠时成功率较低。Michalkiewicz等人(2007)J.Amer.Phys.Society293：H881-H894报道了使用表达增强型绿色荧光蛋白质(eGFP)报告基因的慢病毒构建体来产生转基因大鼠，其中eGFP转基因经发现存在于整合在基因组内随机位点上的1-4个拷贝中。
仍然需要以靶向方式修饰大鼠基因组的方法。基因组基因座的精确靶向位点特异性裂解对常规的同源重组提供了有效补充和/或替代方案。双链断裂(DSB)的产生使得在靶向基因座上的同源重组频率增加了1000倍多。更简单来说，通过非同源端连接(NHEJ)对位点特异性DSB的不精确修复也可能产生基因中断。产生两种此类DSB会导致缺失任意的大区。锌指蛋白的模块化DNA识别偏好使得可以合理设计位点特异性多指DNA结合蛋白。核酸酶域从II型限制性酶Fok I融合到位点特异性锌指蛋白使得可以产生位点特异性核酸酶。参见(例如)美国专利公布：20030232410、20050208489、20050026157、20050064474、20060188987、20060063231、20070134796、2008015164、20080131962、2008015996以及国际公布WO 07/014275和WO2008/133938，这些均描述了锌指核酸酶的使用，并且为了所有目的而将它们以引用方式全文并入。
发明概述
本文公开了用于在大鼠中进行基因组编辑的组合物，该基因组编辑包括但不限于：裂解大鼠中的一种或多种基因，导致一种或多种大鼠基因中的靶向改变(插入、缺失和/或置换突变)，包括将这些靶向改变掺入胚系中；靶向引入非内源性核酸序列，使大鼠中的一种或多种基因部分或完全失活；还公开了诱导同源定向修复和/或产生编码大鼠基因的新型等位基因形式的随机突变的方法。
在一个方面，本文描述了一种结合到大鼠基因组内所关注区域中的靶位点上的锌指蛋白(ZFP)，其中所述ZFP包含一个或多个改造的锌指结合域。在一个实施方案中，ZFP是一种裂解大鼠内所关注的靶基因组区域的锌指核酸酶(ZFN)，其中所述ZFN包含一个或多个改造的锌指结合域和核酸酶裂解域或裂解半域。裂解域和裂解半域可以(例如)由各种限制性核酸内切酶和/或归巢核酸内切酶获得。在一个实施方案中，裂解半域是源自IIS型限制性核酸内切酶(例如FokI)。具体地说，ZFN可以裂解一种特定的大鼠基因序列。或者，ZFN可以裂解两种或两种以上同源大鼠基因序列。
ZFN可以结合和/或裂解大鼠基因，该大鼠基因位于基因的编码区内，或者位于在基因内的或邻近于基因的非编码序列中(如前导序列、尾随序列或内含子)，或者位于编码区上游或下游的非转录区内。在某些实施方案中，ZFN结合和/或裂解靶大鼠基因的编码序列或调控序列。
在另一方面，本文描述了包含一种或多种本文所述锌指核酸酶的组合物。在某些实施方案中，该组合物包含一种或多种锌指核酸酶与药学上可接受的赋形剂的组合。
在另一方面，本文描述了编码一种或多种本文所述的ZFN的多核苷酸。该多核苷酸可以是(例如)mRNA。
在另一方面，本文描述了包含多核苷酸的ZFN表达载体，该多核苷酸编码一种或多种本文所述的ZFN，并且可经操作连接到启动子上。
在另一方面，本文描述了包含一种或多种ZFN表达载体的大鼠宿主细胞。大鼠宿主细胞可以是稳定转化的或瞬时转染的，或者是其与一种或多种ZFP表达载体的组合。在一个实施方案中，大鼠宿主细胞是胚胎干细胞。在其它实施方案中，一种或多种ZFP表达载体表达大鼠宿主细胞中的一种或多种ZFN。在另一实施方案中，大鼠宿主细胞可以还包含外源多核苷酸供体序列。在本文所述的任何实施方案中，大鼠宿主细胞可以包含胚细胞，例如一种或多种细胞胚胎。
在另一方面，本文描述了一种裂解大鼠细胞中的一种或多种基因的方法，该方法包括：(a)把编码一种或多种ZFN的一种或多种多核苷酸引入大鼠细胞，该ZFN在使得ZFN被表达并且一种或多种基因被裂解的条件下结合到一种或多种基因中的靶位点上。
在又一方面，本文描述了把外源序列引入大鼠细胞基因组中的方法，该方法包括以下步骤：(a)把编码一种或多种ZFN的一种或多种多核苷酸引入大鼠细胞，该ZFN在使得ZFN被表达并且一种或多种基因被裂解的条件下结合到一种或多种基因中的靶位点上；和(b)使细胞接触外源多核苷酸，以使得基因的裂解刺激外源多核苷酸通过同源重组整合到基因组中。在某些实施方案中，外源多核苷酸被物理性整合到基因组中。在其它实施方案中，外源多核苷酸是通过核酸复制程序(例如，双链断裂的同源定向修复)把外源序列拷贝到宿主细胞基因组中而整合到基因组中的。还在其它实施方案中，整合到基因组中是通过非同源依赖性靶向整合(例如，“末端捕获”)来进行的。在某些实施方案中，一种或多种核酸酶是IIS型限制性核酸内切酶的裂解域与改造的锌指结合域之间的融合体。
在另一实施方案中，本文描述了修饰大鼠细胞的基因组中的一种或多种基因序列的方法，该方法包括：(a)提供包含一种或多种靶基因序列的大鼠细胞；和(b)表达细胞中的第一和第二锌指核酸酶(ZFN)，其中第一ZFN在第一裂解位点进行裂解，第二ZFN在第二裂解位点进行裂解，其中该基因序列位于第一裂解位点与第二裂解位点之间。其中第一和第二裂解位点的裂解导致通过非同源端连接来修饰基因序列。在某些实施方案中，非同源端连接导致第一裂解位点与第二裂解位点之间的缺失。基因序列中缺失的大小是由第一裂解位点与第二裂解位点之间的距离决定的。因此，在所关注的任何基因组区域中，可以获得任意大小的缺失。可以获得25个、50个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1,000个核苷酸对或此范围内任意整数值个数的核苷酸对的缺失。此外，可以用本文公开的方法和组合物来获得大于1,000个核苷酸对的一系列任意整数值个数的核苷酸对的缺失。在其它实施方案中，非同源端连接在第一裂解位点与第二裂解位点之间产生插入物。修饰如本文所述大鼠的基因组的方法可用于产生动物(例如人类)疾病的模型，例如通过以下方式：使基因(部分或完全地)失活或者在允许鉴定或选择携带那些基因的新型等位基因形式的转基因大鼠的基因的确定位置上形成随机突变，插入人化的大鼠基因(以非限制性例子的方式，用于研究药物代谢)或者插入所关注的突变体等位基因来检验(例如)这种突变体等位基因的表型效应。
在又一方面，本文描述了胚系中断大鼠中的一种或多种靶基因的方法，该方法包括：通过本文所述的任何方法，修饰在大鼠胚胎的一个或多个细胞的基因组中的一种或多种基因序列；以及使大鼠胚胎发育，其中修饰的基因序列存在于性成熟大鼠的至少一部分配子中。
在另一方面，本文描述了一种在所关注的大鼠基因座中产生一种或多种可遗传突变体等位基因的方法，该方法包括：通过本文所述的任何方法，修饰在大鼠胚胎的一个或多个细胞的基因组中的一个或多个基因座；饲养大鼠胚胎直到性成熟；和使性成熟的大鼠产生后代；其中后代中的至少一些包含突变体等位基因。
在本文所述的任何方法中，编码锌指核酸酶的多核苷酸可以包含DNA、RNA或它们的组合。在某些实施方案中，多核苷酸包含质粒。在其它实施方案中，编码核酸酶的多核苷酸包含mRNA。
还在其它方面，本文提供将核酸序列位点特异性整合到染色体中的方法。在某些实施方案中，该方法包括：(a)注入胚胎，该胚胎具有(i)至少一种DNA载体，其中该DNA载体包含在待整合核酸序列侧翼的上游序列和下游序列，和(ii)编码识别染色体整合位点的锌指核酸酶的至少一种RNA分子；以及(b)培养该胚胎以使表达锌指核酸酶，其中由锌指核酸酶引入到整合位点中的双链断裂通过用DNA载体来同源重组而修复，以便将核酸序列整合到染色体中。合适的胚胎可来自若干不同的有脊椎物种，包括哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物和鱼类。一般而言，合适的胚胎是可以被收集、注射并且培养来表达锌指核酸酶的胚胎。在一些实施方案中，合适的胚胎可以包括来自啮齿动物、宠物、牲畜和灵长类的胚胎。啮齿动物的非限制性例子可以包括小鼠、大鼠、仓鼠、沙鼠和豚鼠。宠物的非限制性例子可以包括猫、狗、兔、刺猬和雪貂。牲畜的非限制性例子可以包括马、山羊、绵羊、猪、骆马、羊驼和牛。灵长类的非限制性例子可以包括僧帽猴、黑猩猩、狐猴、猕猴、绒猴、绢毛猴、蛛猴、松鼠猴和长尾猴。在其它实施方案中，合适的胚胎可以包括来自鱼类、爬行动物、两栖动物或鸟类的胚胎。或者，合适的胚胎可以是昆虫胚胎，例如，果蝇胚胎或蚊子胚胎。
还提供了包含至少一种DNA载体的胚胎，其中该DNA载体包含在待整合核酸序列侧翼的上游序列和下游序列，以及编码识别染色体整合位点的锌指核酸酶的至少一种RNA分子。还提供了来自本文所述的任何胚胎的生物体。
附图说明
图1示出对大鼠C6细胞中p53特异性ZFN对的SurveyorTM核酸酶(″CEL-I″)测定结果。各泳道中的所用ZFN对在泳道上方示出，通过Surveyor错配试验检测的NHEJ活性百分比在底部示出。
图2示出在携带eGFP基因的大鼠C6细胞中的eGFP靶向ZFN对16834/16833、16856/16855和16859/16860的SurveyorTM核酸酶(“CEL-I”)测定结果。所用ZFN对在各泳道上方示出，并且非同源端连接百分比(％NHEJ)在适当时于各泳道下方显示。
图3是示出使用转基因GFP大鼠中ZFN的GFP转基因的靶向修饰的示意图。
图4(图A和B)示出通过大鼠幼仔中的ZFN进行的GFP靶向中断，所述大鼠幼仔是通过将GFP靶向ZFN前核注射到得自转基因GFP大鼠的胚胎中而产生的。图4A示出了紫外光下的5个幼仔，显示出3个GFP阳性动物和2个未表达GFP(GFP阴性)的动物。图4B示出GFP+和GFP-幼仔的尾部活组织检查的PCR分析结果。
图5示出使用由CMV启动子(CMV)或CAG启动子驱动的ZFN在C6细胞中的内源IgM的外显子1中进行的ZFN介导的裂解。“连接的”是指在由2A肽连接的相同质粒上的ZFN对，而“未连接的”是指未由2A肽连接的ZFN对。
图6示出由SurveyorTM核酸酶进行的基因组DNA分析，该基因组DNA是通过IgM ZFN注射的单细胞胚胎的活产所得到的43个动物的尾部来制备的。如所示，大鼠6#、7#、8#、19#和46#针对在IgM基因座上的修饰被记为阳性。具有白色数字的条指示产生自单独(编号的)母体的幼仔。
图7示出针对ZFN质粒插入基因组而言对IgM修饰的大鼠(如图6中标识的6#、7#、8#、19#和46#)的PCR分析结果。
图8(图A和B)示出IgM修饰的大鼠19#的CEL-I和序列分析。WT、大鼠19野生型等位基因和大鼠19缺失等位基因的序列比对(图8B)显示了已从大鼠19缺失等位基因中删除的序列。
图9(图A至C)示出针对在8个不同脱靶位点上的活性对Igm修饰的大鼠(如图6中标识的6#、7#、8#、19#和46#)的分析。脱靶位点(位点1、位点2等)如表9中所描述。
图10示出Rab38的ZFN介导修饰的序列分析。此图中所示的是具有两个缺失等位基因(Δ6和Δ42)的野生型等位基因比对。
图11(图A至C)示出对得自杂交ZFN-IgM修饰的大鼠和野生型大鼠的幼仔的分析。图11A示出了来自杂交大鼠19#(实施例3)的5个幼仔(编号224到228)与野生型大鼠的PCR和CEL-I分析。图11B示出序列分析确认，即3个IgM修饰的幼仔(如图中标识的225#、227#和228#)具有与亲代大鼠19#相同的IgM上的64个碱基对缺失等位基因。图11C示出对大鼠19#的增加幼仔以及来自IgM修饰的大鼠46#和8#的杂交幼仔的PCR和CEL-I分析。IgM修饰的亲代大鼠在顶部以“F0”指示，而幼仔编号在各泳道上方指示。
图12是示出靶向ZFN诱导的双链断裂之后修复结果的示意图。阴影条代表供体片段，而白色条示出ZFN双链断裂的靶位点。
图13是示出RFLP供体质粒构造的示意图。示出的是该质粒，以及与整合靶位点同源的左右PCR-扩增片段。指示了用于克隆的限制性酶。左方片段使用KpnI和NotI或PmeI。右方片段使用NotI或PmeI和SacII。
图14是示出GFP-表达供体质粒构造的示意图。GFP盒是从现有质粒中PCR扩增并使用NotI位点被封闭到NotI RFLP供体中的。
图15(图A和B)示出检测RFLP整合的方法。图15A是示出检测RFLP整合和限制性酶消化的方法的示意图。图15B是示出使用PCR扩增进行GFP表达盒整合的示意图。
图16是在琼脂糖凝胶上解析的荧光染色PCR片段的摄影图像。最左方泳道含DNA梯。泳道1至6含使用小鼠Mdr1a特异性引物从整个或一部分小鼠胚泡中扩增的PCR片段。泳道1和2是分别从5/6和1/6个胚泡中扩增的。泳道3来自整个胚泡。泳道4至6分别来自1/2、1/3和1/6个相同胚泡。泳道7含使用相同引物从提取的小鼠趾DNA中扩增的阳性对照PCR片段。
图17(图A和B)示出在琼脂糖凝胶上解析的荧光染色DNA片段的摄影图像。最左方泳道含DNA梯。图17A的泳道1至39含使用mMdr1a特异性引物从37个小鼠胚胎中扩增的PCR片段以及用于PCR扩增的一个阳性和阴性对照物，所述小鼠胚胎是在相对于含有NotI位点的小鼠Mdr1a和RFLP供体用ZFN RNA显微注射之后，在活体外培养的。图17B的泳道1至39含在进行SurveyorTM突变检测测定之后图17A的PCR片段。
图18(图A和B)是在琼脂糖凝胶上解析的荧光染色DNA片段的摄影图像。最左方和最右方的泳道含DNA梯。泳道含使用mMdr1a特异性引物从图17中所示小鼠胚胎中扩增的以及在未纯化PCR产物的情况下用NotI消化的PCR片段。图18B是图18A中相同凝胶上更持久的电泳扩增。未切PCR产物为约1.8kb，并且消化产物是约900bp的两个条带。
图19是在琼脂糖凝胶上解析的荧光染色DNA片段的摄影图像。最左方泳道含DNA梯。泳道1到6含一些如图18中所示的PCR片段，所述PCR片段是在PCR产物被柱纯化以便NotI可以在其最佳缓冲液中工作之后，经NotI消化的。线7和线8是用NotI消化的样本中的两个(如图18中)。该凝胶显示PCR反应中的NotI消化已完全。
图20是在琼脂糖凝胶上解析的荧光染色PCR片段的摄影图像。最左方泳道含DNA梯。泳道1到5含使用PXR特异性引物从1、1/2、1/6、1/10、1/30个大鼠胚泡中扩增的PCR片段。泳道6是使用相同引物从纯化的Sprague Dawley基因组DNA中扩增的阳性对照物。
图21(图A和B)是在琼脂糖凝胶上解析的荧光染色DNA片段的摄影图像。最左方和最右方的泳道含DNA梯。图21A显示使用PXR特异性引物从大鼠胚胎中扩增并用NotI消化的PCR片段，所述大鼠胚胎是在显微注射PXR ZFN mRNA和NotI RFLP供体之后在活体外培养的，图21B显示在进行SurveyorTM突变检测测定之后与图21A中所示相同的PCR片段。
图22是在琼脂糖凝胶上解析的荧光染色DNA片段的摄影图像。头4个泳道是从胚胎受孕后12.5天的4个良好发育胎鼠中PCR扩增的，该胚胎注射了具有NotI RFLP供体的mMdr1a ZFN mRNA。PCR用NotI消化。泳道4是阳性的。泳道5-8是4个蜕膜的失效植入。所有四个泳道均为阴性。
图23(图A至E)是在琼脂糖凝胶上解析的荧光染色DNA片段的示意图和摄影图像。图23A是示出所用引物的位置的示意图。图23B和图23C示出引物PF和GR的结果。图23D和图23E示出引物PR+GF的结果。期望的片段大小为2.4kb。40个胎鼠中有两个为GFP阳性。
图24是在琼脂糖凝胶上解析的DNA片段的摄影图像。泳道8代表NotI位点阳性的13dpc胎鼠。
具体实施方式
本文描述了用于在大鼠中进行基因组编辑(例如，裂解基因；改变基因，例如通过裂解然后插入(物理插入或经由同源定向修复的复制来插入)外源序列和/或裂解然后进行非同源端连接(NHEJ)；使一个或多个基因部分或完全地失活；用随机突变产生等位基因以产生内源基因的改变表达；等等)以及改变被携带入胚系中的大鼠基因组的组合物和方法。还公开了制备和使用这些组合物(试剂)以(例如)编辑(改变)靶大鼠细胞中的一种或多种基因的方法。因此，本文所述的方法和组合物提供了用于靶向基因改变(例如敲入)和/或(部分或完全)敲除一种或多种大鼠基因和/或用于使任意靶等位基因的序列随机性突变的高效方法，因此，可以产生人类疾病的动物模型。
本文所述的组合物和方法提供了在不需要劳动密集型选择和/或筛选的情况下，以最小的脱靶效应对大鼠中内源基因座进行快速、完全和永久的靶向中断。整个动物基因的敲除也可以通过注入ZFNmRNA或ZFN表达盒来容易地以单个步骤进行。
概述
本文所公开的实施方法以及组合物的制备和使用采用了(除非另外指明)在分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、计算化学、细胞培养、重组DNA和如本领域技术人员所知范围内的相关领域中的常规技术。这些技术在文献中有全面解释。参见(例如)，Sambrook等人，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory出版社，1989年和第三版，2001年；Ausubel等人，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987年和周期性更新；METHODS INENZYMOLOGY系列丛书，Academic出版社，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，第三版，Academic出版社，San Diego，1998年；METHODS IN ENZYMOLOGY，第304卷，“Chromatin”(P.M.Wassarman和A.P.Wolffe编)，Academic出版社，San Diego，1999年；以及METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，第119卷，“Chromatin Protocols”(P.B.Becker编)Humana出版社，Totowa，1999年。
定义
术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡聚核苷酸”可互换地使用，并且是指线状或环状构象的以及呈单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的聚合物。就本公开的目的而言，这些术语不应解释为对聚合物长度的限制。这些术语可以涵盖天然核苷酸的已知类似物，以及在碱基、糖和/或磷酸酯部分(例如硫代磷酸酯主链)上被修饰的核苷酸。通常，具体核苷酸的类似物具有相同的碱基配对特异性；即，A的类似物能与T碱基配对。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”可互换地使用，用于指氨基酸残基的聚合物。这些术语还适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸是相应天然氨基酸的化学类似物或经修饰的衍生物。
“结合”是指大分子之间(例如在蛋白与核酸之间)的序列特异性、非共价相互作用。并非所有结合相互作用的部件都必需为序列特异性的(例如与DNA主链中的磷酸酯残基接触)，只要相互作用总体上为序列特异性即可。这种相互作用一般而言特征为10-6M-1或更低的离解常数(Kd)。“亲和力”是指结合强度：高结合亲和力与较低Kd相关。
“结合蛋白”是能够非共价性结合到另一分子的蛋白。结合蛋白可以结合到(例如)DNA分子(DNA结合蛋白)、RNA分子(RNA结合蛋白)和/或蛋白分子(蛋白结合蛋白)。就蛋白结合蛋白来说，其可以结合到其自身(以形成同型二聚体、同型三聚体等)和/或其可以结合不同蛋白的一个或多个分子。结合蛋白可以具有一种以上类型的结合活性。例如，锌指蛋白具有DNA结合、RNA结合和蛋白结合活性。
“锌指DNA结合蛋白”(或结合域)是以序列特异性方式通过一个或多个锌指结合DNA的蛋白或较大蛋白内的域，所述锌指是通过锌离子配位稳定结构的结合域内的氨基酸序列区。术语锌指DNA结合蛋白通常简称为锌指蛋白或ZFP。
锌指结合域可以被“改造”以结合到预定核苷酸序列。改造锌指蛋白的方法的非限制性例子是设计和选择。设计的锌指蛋白是天然不存在的蛋白，其设计/组成主要来自合理性准则。设计的合理性准则包括应用取代法则和计算机化算法，用于处理在储存现有ZFP设计和结合数据信息的数据库中的信息。参见(例如)，美国专利6,140,081；6,453,242和6,534,261；还参见WO 98/53058；WO 98/53059；WO98/53060；WO 02/016536和WO 03/016496。
“选择的”锌指蛋白是天然未发现的蛋白，其产生主要是来自经验过程，诸如噬菌体展示、相互作用陷阱或杂交体选择。参见(例如)US 5,789,538；US 5,925,523；US 6,007,988；US 6,013,453；US6,200,759；WO 95/19431；WO 96/06166；WO 98/53057；WO 98/54311；WO 00/27878；WO 01/60970；WO 01/88197和WO 02/099084。
术语“序列”是指任意长度的核苷酸序列，其可以是DNA或RNA；可以是线状、环状或分支状，而且可以是单链或者双链。术语“供体序列”是指被插入基因组中的核苷酸序列。供体序列可以为任意长度，例如长度在2个与10,000个核苷酸之间(或它们之间或之上的任意整数值)，优选长度在约100个与1,000个核苷酸之间(或它们之间的任意整数值)，更优选长度在约200个与500个核苷酸之间。
“同源但不相同序列”是指与第二序列存在一定程度的序列相同性的第一序列，但其序列不同于第二序列。例如，包含野生型序列的突变基因的多核苷酸与突变基因序列同源但不相同。在某些实施方案中，这两个序列间的同源性程度足以使它们之间利用正常细胞机制发生同源重组。两种同源非相同序列可以是任意长度的，它们的非同源性程度可以小到单个核苷酸(例如，通过靶向同源重组来校正基因组的点突变)或者可大到10万或更多个碱基(例如，在染色体的预定异位位点上插入基因)。包含同源但不相同序列的两种多核苷酸不必等长。例如，可以使用20个与10,000个之间的核苷酸或核苷酸对的外源多核苷酸(即供体多核苷酸)。
测定核酸和氨基酸序列相同性的技术是本领域已知的。此类技术一般包括测定基因mRNA的核苷酸序列和/或测定其编码的氨基酸序列，并将这些序列与另一核苷酸或氨基酸序列作比较。以此方式还可以测定和比较基因组序列。通常，相同性分别指两种多核苷酸或多肽序列中的核苷酸-核苷酸或氨基酸-氨基酸正确对应。通过测定序列相同性百分比可以比较两个或多个(多核苷酸或氨基酸)序列。将两个比对序列(无论是核酸或是氨基酸序列)之间正确匹配的数目除以较短序列长度再乘以100得到两个序列的相同性百分比。Smith和Waterman，Advances in Applied Mathematics 2：482-489(1981)的局部同源性算法提供了核酸序列的近似比对。利用Dayhoff，Atlas of ProteinSequences and Structure，M.O.Dayhoff编，5增刊，3：353-358，国家生物医学研究基金会(National Biomedical Research Foundation)(Washington，D.C.，美国)开发和Gribskov，Nucl.Acids Res.14(6)：6745-6763(1986)标准化的评分矩阵，可将此算法应用于氨基酸序列。Genetics Computer Group(Madison，WI)在“最佳拟合(BestFit)”实际应用中示范了该算法的执行以测定序列相同性百分比。Wisconsin序列分析软件包程序手册第8版(1995)(可购自Genetics Computer Group，Madison，WI)描述了该方法的默认参数。本公开内容中确立相同性百分比的优选方法是使用爱丁堡大学(University of Edinburgh)版权所有的、John F.Collins和Shane S.Sturrok开发的、IntelliGenetics公司(Mountain View，CA)发行的MPSRCH软件包。可以使用该软件包的Smith-Waterman算法，其中默认参数用于评分表(例如，缺口开放罚12分，缺口延伸罚1分和缺口罚6分)。所生成数据中“匹配”值反映序列相同性。本领域通常已知计算序列间相同性或相似性百分比的其它合适程序，例如另一比对程序是BLAST(使用默认参数)。例如，可以采用基于BLASTN和BLASTP确立相同性百分比的优选方法，使用以下默认参数：遗传密码＝标准；过滤＝无；链＝双链；截止值＝60；期望值＝10；矩阵＝BLOSUM62；说明＝50个序列；分选＝HIGH SCORE；数据库＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDStranslations+Swiss protein+Spupdate+PIR。可以在以下网址上找到这些程序的详情：http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST。至于本文所述的序列，序列相同性的程度的所需范围是大约80％到100％和二者之间的任意整数值。序列之间相同性百分比通常为至少70-75％、优选80-82％、更优选85-90％、甚至更优选92％、还更优选95％和最优选98％的序列相同性。
或者，可以通过多核苷酸杂化来测定多核苷酸间的序列相似性程度，杂交条件应能使同源区之间形成稳定的双链体，随后用单链特异性核酸酶消化，并测定消化片段的大小。当使用上述方法测定，两个核酸或两个多肽序列在确定的分子长度上显示至少约70％-75％、优选80％-82％、更优选85％-90％、甚至更优选92％、还更优选95％、最优选98％的序列相同性时，则它们彼此是基本同源的。如本文所用，基本同源还指与特定DNA或多肽序列完全相同的序列。在例如该具体系统规定的严格条件下的Southern杂交实验中，可以鉴定基本同源的DNA序列。本领域技术人员能确定合适的杂交条件。参见(例如)Sambrook等人，同上；Nucleic Acid Hybridization：A Practical  Approach，B.D.Hames和S.J.Higgins编(1985)Oxford；Washington，DC；IRL出版社。
可以用下述方法测定两个核酸片段的选择性杂交。两个核酸分子间的序列相同性程度影响这两个分子间的杂交效率和强度。部分相同的核酸序列能至少部分地抑制与靶分子完全相同序列的杂交。可以使用本领域熟知的杂交试验评估完全相同序列的杂交抑制(例如，Southern(DNA)印迹，Northern(RNA)印迹，溶液杂交等，参见Sambrook，等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，(1989)，Cold Spring Harbor，N.Y.)。此类试验可以使用不同程度的选择性来进行，例如使用从低到高的不同严格性的条件。如果使用低严格性条件，则可以使用缺乏甚至部分序列相同度的辅探针(例如，与靶分子的序列相同性小于约30％的探针)来评估不存在非特异性结合，以使得在不存在非特异性结合时，辅探针不会与靶杂交。
当利用基于杂交的检测系统时，应选择与参考核酸序列互补的核酸探针，然后选择合适条件使探针与参考序列彼此选择性杂交或结合来形成双链体分子。能够在中等严格杂交条件下与参考序列选择性杂交的核酸分子通常在以下条件下杂交，该条件能检测至少长约10-14个核苷酸的靶核酸序列且至少约70％序列与所选核酸探针相同的靶核酸序列。严格杂交条件通常能检测与所选核酸探针的序列的相同性大于约90-95％的至少约10-14个核苷酸的靶核酸序列。当探针与参考序列具有特定程度的序列相同性时，可用于探针/参考序列杂交的杂交条件可以按本领域已知那样来确定(参见(例如)，Nucleic Acid  Hybridization：A Practical Approach，B.D.Hames和S.J.Higgins编，(1985)Oxford；Washington，DC；IRL出版社)。
杂交条件为本领域技术人员所熟知。杂交严格性是指杂交条件不利于包含错配核苷酸的杂交体形成的程度，较高的严格性与对错配杂交体的较低容忍度有关。影响杂交严格性的因素为本领域技术人员所熟知，包括但不限于：温度、pH、离子强度和有机溶剂(如甲酰胺和二甲基亚砜)的浓度。如本领域技术人员所知，较高温度、较低离子强度和较低溶剂浓度可提高杂交严格性。
至于杂交的严格性条件，本领域熟知的可以使用许多等效条件通过改变(例如)以下因素来建立特定的严格性：序列长度和性质、各种序列的碱基组成、盐和其它杂交溶液组分的浓度、杂交溶液中存在或不存在阻断剂(例如硫酸右旋糖酐和聚乙二醇)、杂交反应温度和时间参数以及变化的洗涤条件。按照本领域标准方法(参见(例如)，Sambrook，等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，(1989)Cold Spring Harbor，N.Y.)来选择杂交条件的具体设定。
“重组”是指两个多核苷酸之间交换遗传信息的过程。就本公开而言，“同源重组(HR)”是指(例如)在通过同源定向修复机制修复细胞内双链断裂期间所发生的此类交换的特殊形式。这一过程需要核苷酸序列同源，使用“供体”分子为模板来修复“靶”分子(即发生双链断裂的分子)，分别称为“非交换型基因转换”或“短段基因转换”，因为其导致遗传信息从供体转移到靶上。不希望受限于任何特定理论，此类转移可涉及对断裂靶与供体间形成的异源双链体DNA进行错配校正，和/或“合成依赖性链退火”，其中使用供体再次合成遗传信息(该信息将成为靶的一部分)，和/或相关过程。此类特殊HR常常导致靶分子序列的改变，以使得供体多核苷酸部分或全部并到靶多核苷酸中。
在本公开的方法中，一种或多种本文所述的靶向核酸酶在靶序列(例如细胞染色质)中预定位点上产生双链断裂，并且可以将与断裂区中的核苷酸序列具有同源性的“供体”多核苷酸引入细胞中。双链断裂的存在已表明有助于供体序列的整合。供体序列可以被物理整合，或者，供体多核苷酸可用作通过同源重组来修复断裂的模板，导致将例如供体中的核苷酸序列的全部或一部分引入细胞染色质。因此，细胞染色质中的第一序列可以改变，并且在某些实施方案中，可以转化为供体多核苷酸中存在的序列。因此，术语“替换(replace)”或“替换(replacement)”的使用可以理解为表示用一个核苷酸序列替换另一个核苷酸序列(即，具有信息性含义的序列替换)，并且不必需要用一个多核苷酸来物理或化学地替换另一个多核苷酸。
在本文所述的任何方法中，另外的锌指蛋白可用于细胞内的另外靶位点的另外的双链裂解。
在用于对细胞染色质中所关注的区域内的序列进行靶向重组和/或替换和/或改变的方法的某些实施方案中，通过与外源“供体”核苷酸序列的同源重组来改变染色体序列。如果存在与断裂区域同源的序列，则细胞染色质中双链断裂的存在会刺激此类同源重组。
在本文所述的任何方法中，第一核苷酸序列(“供体序列”)可以含与所关注的区域中的基因组序列同源但不相同的序列，从而刺激同源重组以在所关注的区域中插入不相同序列。因此，在某些实施方案中，与所关注的区域中序列同源的供体序列的某些部分显示出与被替换基因组序列约80％至99％(或其间任意整数)的序列相同性。在其它实施方案中，例如，如果在100个毗连碱基对上仅有1个核苷酸不同，则供体与基因组序列间的同源性高于99％。在某些情况下，供体序列的非同源部分可含有所关注区域中不存在的序列，从而使得新的序列引入所关注区域中。在这些情况下，非同源序列一般具有50-1,000个碱基对(或它们间任意整数值)或大于1,000的任意数量碱基对的侧翼，这些侧翼碱基对与所关注区域中的序列同源或相同。在其它实施方案中，供体序列与第一序列不同源，并且通过非同源重组机制被插入基因组中。
可以用本文所述的任何方法，通过靶向整合中断所关注的基因表达的供体序列，使细胞内的一个或多个靶序列部分或完全失活。还提供了具有部分或完全失活基因的细胞系。
此外，如本文所述的靶向整合的方法还可用于整合一个或多个外源序列。外源核酸序列可以包含(例如)一个或多个基因或cDNA分子，或任何类型的编码或非编码序列，以及一个或多个控制元件(例如启动子)。另外，外源核酸序列可以产生一个或多个RNA分子(例如，小发夹RNA(shRNA)、抑制性RNA(RNAi)、微RNA(miRNA)等)。
“裂解”是指使DNA分子的共价主链的断裂。裂解可以通过各种方法引发，包括但不限于磷酸二酯键的酶或化学水解。单链裂解和双链裂解都可以，并且双链裂解可以作为两个不同的单链裂解的结果而发生。DNA裂解可以导致产生平端或交错端。在某些实施方案中，使用融合多肽来进行靶向双链DNA裂解。
“裂解半域”是与第二多肽(相同或不同)一起形成具有裂解活性(优选双链裂解活性)的复合物的多肽序列。术语“第一和第二裂解半域”；“+和-裂解半域”和“右和左裂解半域”可互换使用来指能二聚的裂解半域对。
“改造的裂解半域”是经修饰以便与另一裂解半域(如另一改造的裂解半域)形成专性异型二聚体的裂解半域。还参见美国专利公布No.2005/0064474、2007/0218528和2008/0131962，它们的全文以引用方式并入本文。
“染色质”是包含细胞基因组的核蛋白结构。细胞染色质包含核酸(主要是DNA)和蛋白质，蛋白质包括组蛋白和非组蛋白染色体蛋白。大多数真核细胞染色质以核小体形式存在，其中核小体核心包含约150个碱基对的DNA，与包含组蛋白H2A、H2B、H3和H4各一对的八聚物缔合；并且接头DNA(各生物体长度可不同)在核小体核心间延伸。组蛋白H1分子通常与接头DNA缔合。就本公开而言，术语“染色质”意味着涵盖所有类型细胞(原核和真核)的核蛋白。细胞染色质包括染色体和附加体染色质。
“染色体”是包含全部细胞基因组或其一部分的染色质复合物。细胞基因组的特征常常是其核型，它是包含细胞基因组的所有染色体的集合。细胞基因组可以包含一个或多个染色体。
“附加体”是复制性核酸、核蛋白复合物或包含不是细胞染色体核型的一部分的核酸的其它结构。附加体的例子包括质粒和某些病毒基因组。
“靶位点”或“靶序列”是限定核酸的一部分的核酸序列，在存在足以结合的条件下，结合分子与该部分核酸结合。例如，序列5’-GAATTC-3’是Eco RI限制性核酸内切酶的靶位点。
“外源”分子是通常不存在于细胞中、但可通过一种或多种遗传学、生化或其它方法引入细胞中的分子。“通常存在于细胞中”是根据细胞的具体发育阶段和环境条件来确定的。因此，例如仅在肌肉的胚胎发育期间存在的分子对成人肌肉细胞而言是外源分子。类似地，热休克诱导的分子对非热休克细胞而言是外源分子。外源分子可包括(例如)功能失常内源分子的有功能型或功能正常的内源分子的功能失常型。外源分子还可以是通常发现于另一物种中的分子，例如，引入大鼠基因组的人类序列。
除了别的方面外，外源分子可以是小分子或大分子，小分子如组合化学方法产生的分子，大分子如蛋白质、核酸、糖、脂质、糖蛋白、脂蛋白、多糖、上述分子的修饰衍生物，或包含一种或多种上述分子的任意复合物。核酸包括DNA和RNA，可以是单链或双链的；可以是直链、支链或环形的；并且可以具有任意长度。核酸包括能形成双链体的核酸，以及形成三联体的核酸。参见(例如)，美国专利No.5,176,996和5,422,251。蛋白质包括但不限于：DNA结合蛋白、转录因子、染色质重塑因子、甲基化DNA结合蛋白、聚合酶、甲基化酶、去甲基化酶、乙酰基转移酶、去乙酰基酶、激酶、磷酸酶、整合酶、重组酶、连接酶、拓扑异构酶、促旋酶和解旋酶。
外源分子可以是与内源分子类型相同的分子，例如外源蛋白质或核酸。例如，外源核酸可以包括感染性病毒基因组、引入细胞的质粒或附加体或通常不存在于细胞中的染色体。将外源分子引入细胞的方法是本领域技术人员已知的，包括但不限于：脂质介导的转移(即脂质体，包括中性和阳离子脂质)、电穿孔、直接注射、细胞融合、粒子轰击、磷酸钙共沉淀、DEAE-右旋糖酐介导的转移和病毒载体介导的转移。
相反，“内源”分子是在特定环境条件下的特定发育阶段的特定细胞中通常存在的分子。例如，内源核酸可以包括染色体，线粒体、叶绿体或其它细胞器的基因组，或天然的附加体核酸。其它内源分子可以包括蛋白质，例如转录因子和酶。
“融合”分子是两个或多个亚基分子连接(优选共价连接)的分子。亚基分子可以是相同化学类型的分子，或可以是不同化学类型的分子。第一类型的融合分子的例子包括但不限于：融合蛋白(例如，ZFP DNA结合域和裂解域之间的融合体)和融合核酸(例如，编码上述融合蛋白的核酸)。第二类型的融合分子的例子包括但不限于：形成三联体的核酸与多肽之间的融合体以及小沟结合物与核酸之间的融合体。
可以将融合蛋白递送到细胞中或将编码融合蛋白的多核苷酸递送到细胞中使融合蛋白在细胞中表达，在细胞中多核苷酸被转录，转录物被翻译，以产生融合蛋白。在细胞中表达蛋白质还可涉及反式剪接、多肽裂解和多肽连接。本公开其它地方给出将多核苷酸和多肽递送到细胞中的方法。
就本公开而言，“基因”包括编码基因产物的DNA区(见下)，以及调节基因产物产生的所有DNA区，不论这种调控序列是否邻近于编码和/或转录的序列。因此，基因包括但不必限于：启动子序列、终止子、翻译调控序列(如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点)、增强子、沉默子、绝缘子、边界元件、复制起点、基质附着位点和基因座控制区。
“基因表达”是指将基因所含信息转化为基因产物。基因产物可以是基因的直接转录产物(例如mRNA、tRNA、rRNA、反义RNA、核酶、结构RNA或任何其它类型的RNA)或mRNA翻译产生的蛋白质。基因产物还包括通过诸如加帽、聚腺苷酸化、甲基化和编辑修饰的RNA，以及通过(例如)甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、ADP-核糖基化、十四烷基化和糖基化修饰的蛋白质。
基因表达的“调控”是指改变基因活性。表达调控可以包括但不限于：基因活化和基因阻抑。可以用基因组编辑(例如，裂解、改变、失活、随机突变)来调控表达。基因失活是指相对于不具有本文所述ZFP的细胞而言基因表达的任何降低。因此，基因失活可以是部分的或完全的。
“所关注区域”是细胞染色质的任何区域(如基因或基因内或邻近于基因的非编码序列)，其中期望结合外源分子。结合的目的可以是为了靶向DNA裂解和/或靶向重组。所关注区域可存在于(例如)染色体、附加体、细胞器基因组(例如线粒体、叶绿体)或感染性病毒基因组中。所关注区域可以位于基因的编码区内，转录的非编码区(如前导序列、尾随序列或内含子)内，或位于编码区上游或下游的非转录区内。所关注区域可以短到单个核苷酸对或长达2,000个核苷酸对，或任何整数值的核苷酸对。
术语“操作性连接”和“操作性连接的”(或“可操作连接的”)可互换使用，指并列的两个或多个部件(如序列元件)，其中各部件的布置使其发挥正常功能，并使至少一个部件能调节对至少一个其它部件施加的作用。例如，如果转录调控序列在对一种或多种转录调控因子的存在与否的反应中能控制编码序列的转录水平，则该转录调控序列(如启动子)操作性连接到编码序列。转录调控序列通常与编码序列顺式操作性连接，但不一定直接与其邻接。例如，增强子是操作性连接到编码序列的转录调控序列，即使它们不毗连。
对融合多肽而言，术语“操作性连接的”可以指这样的事实，即各部件在连接其它部件时可执行与不如此连接时相同的功能。例如，对ZFP DNA结合域融合到裂解域的融合多肽而言，如果在该融合多肽中ZFP DNA结合域部分能够结合其靶位点和/或其结合位点，而裂解域能够裂解靶位点附近的DNA，则ZFP DNA结合域和裂解域是操作性连接的。
蛋白质、多肽或核酸的“功能片段”是序列与全长蛋白质、多肽或核酸不同，但保留与全长蛋白质、多肽或核酸相同功能的蛋白质、多肽或核酸。功能片段可以具有比对应的天然分子更多、更少或与其相同数目的残基，和/或功能片段可以含有一个或多个氨基酸或核苷酸取代。测定核酸功能(例如编码功能、与另一核酸杂交的能力)的方法是本领域熟知的。类似地，测定蛋白质功能的方法是熟知的。例如，可以通过(例如)滤膜结合、电泳迁移率变动或免疫沉淀试验来测定多肽的DNA结合功能。可以通过凝胶电泳来测定DNA裂解。参见Ausubel等人，同上。可以通过(例如)免疫共沉淀、双杂交试验或互补(遗传和生化)测定蛋白质与另一种蛋白质相互作用的能力。参见(例如)，Fields等人(1989)Nature 340：245-246；美国专利No.5,585,245和PCT WO 98/44350。
锌指核酸酶
本文描述了可用于一种或多种大鼠基因的基因组编辑(例如裂解、改变、失活和/或随机突变)的锌指核酸酶(ZFN)。ZFN包含锌指蛋白(ZFP)和核酸酶(裂解)域(例如裂解半域)。
A.锌指蛋白
可以改造锌指结合域以结合到选择的序列。参见(例如)，Beerli等人(2002)Nature Biotechnol.20：135-141；Pabo等人(2001)Ann.Rev.Biochem.70：313-340；Isalan等人(2001)Nature Biotechnol.19：656-660；Segal等人(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12：632-637；Choo等人(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10：411-416。与天然的锌指蛋白相比，改造的锌指结合域可具有新颖的结合特异性，改造方法包括但不限于：合理设计和各种类型的选择。合理设计包括(例如)使用含有三联体(或四联体)核苷酸序列和单独锌指氨基酸序列的数据库，其中各三连体或四连体核苷酸序列与结合特定三连体或四连体序列的一种或多种锌指氨基酸序列相关。参见(例如)，共同拥有的美国专利6,453,242和6,534,261，它们的全文以引用方式并入本文。
示例性选择方法(包括噬菌体展示和双杂交系统)描述在以下专利中：美国专利5,789,538、5,925,523、6,007,988、6,013,453、6,410,248、6,140,466、6,200,759和6,242,568；以及WO 98/37186、WO 98/53057、WO 00/27878、WO 01/88197和GB 2,338,237。另外，在(例如)共同拥有的WO 02/077227中已描述了增强锌指结合域的结合特异性的方法。
靶位点选择、ZFP和用于设计和构造融合蛋白(和编码该融合蛋白的多核苷酸)的方法对本领域技术人员来说是已知的，并且详细描述于美国专利申请公布No.20050064474和20060188987中，它们的全文以引用方式并入本文。
另外，如在这些和其它参考文献中公开的，锌指结构域和/或多指锌指蛋白可使用任何合适的接头序列(包括例如长度为5个或更多氨基酸的接头，如TGEKP(SEQ ID NO：1)、TGGQRP(SEQ ID NO：2)、TGQKP(SEQ ID NO：3)和/或TGSQKP(SEQ ID NO：4))来连接在一起。对于长度为6个或更多氨基酸的示例性接头序列来说，另参见美国专利No.6,479,626、6,903,185和7,153,949。本文所述的蛋白质可以包括蛋白质的单独锌指间的合适接头的任意组合。
如下文所述，在某些实施方案中，四指、五指或六指结合域融合到裂解半域，例如II型限制性核酸内切酶(如FokI)的裂解域。一对或多对此类锌指/核酸酶半域融合体可用于靶向裂解，如在(例如)美国专利公布No.20050064474中所描述。
对于靶向裂解，结合位点的近边缘可以间隔有5个或更多核苷酸对，并且各融合蛋白均可结合到DNA靶的相对链。所有成对组合均可用于大鼠基因的靶向裂解。按照本发明来说，ZFN可靶向到大鼠基因组中的任意序列。
在一些实施方案中，DNA结合域是由源自植物病原黄单胞菌的TAL效应子改造的结构域(参见Boch等人，(2009)Science 29 Oct 2009(10.1126/science.117881)和Moscou and Bogdanove，(2009)Science 29Oct 2009(10.1126/science.1178817)。
B.裂解域
ZFN还包含核酸酶(裂解域、裂解半域)。本文公开的融合蛋白的裂解域部分可得自任何核酸内切酶或核酸外切酶。可获得裂解域的示例性核酸内切酶包括但不限于限制性核酸内切酶和归巢核酸内切酶。参见(例如)，2002-2003 Catalogue，New England Biolabs，Beverly，MA；和Belfort等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3379-3388。裂解DNA的其它酶是已知的(例如S1核酸酶；绿豆核酸酶；胰DNase I；微球菌核酸酶；酵母HO核酸内切酶；还参见Linn等人(编)Nucleases，ColdSpring Harbor Laboratory出版社，1993)。这些酶(或其功能片段)中的一种或多种可用作裂解域和裂解半域的来源。
类似地，如上所述，裂解半域可来自需要针对裂解活性二聚化的任何核酸酶或其部分。通常，如果融合蛋白包含裂解半域，则裂解需要两种融合蛋白。或者，可使用含有两个裂解半域的单一蛋白质。两个裂解半域可来自相同的核酸内切酶(或其功能片段)，或者每个裂解半域可来自不同的核酸内切酶(或其功能片段)。另外，优选彼此相对地设置两种融合蛋白的靶位点，以使得两种融合蛋白与其各自靶位点的结合而将这些裂解半域定位于使这些裂解半域形成功能性裂解域(例如通过二聚化)的空间取向上。因此，在某些实施方案中，靶位点的近边缘间隔有5-8个核苷酸或15-18个核苷酸。然而，可将任何整数量的核苷酸或核苷酸对插入两个靶位点之间(例如2至50个核苷酸对或更多)。通常，裂解位点位于靶位点之间。
许多物种中存在限制性核酸内切酶(限制性酶)，它们能够序列特异性地结合DNA(在识别位点处)，并且在结合位点或结合位点附近裂解DNA。某些限制性酶(例如IIS型)在远离识别位点的位点上裂解DNA，并且具有可分离的结合域和裂解域。例如，IIS型酶FokI能在在一条链上距离识别位点9个核苷酸处和另一条链上距离识别位点13个核苷酸处催化DNA双链裂解。参见(例如)，美国专利5,356,802；5,436,150和5,487,994；以及Li等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4275-4279；Li等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：2764-2768；Kim等人(1994a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：883-887；Kim等人(1994b)J.Biol.Chem.269：31，978-31，982。因此，在一个实施方案中，融合蛋白包含至少一种IIS型限制性酶的裂解域(或裂解半域)以及一个或多个锌指结合域，该锌指结合域可经过或未经过改造。
裂解域可与结合域分离的示例性IIS型限制性酶是Fok I。这种特定酶的二聚体具有活性。Bitinaite等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：10，570-10，575。因此，为了本公开的目的而言，认为用于所公开融合蛋白的Fok I酶的一部分是裂解半域。因此，为了用锌指-Fok I融合体来靶向双链裂解和/或靶向替换细胞序列，可使用各自含有Fok I裂解半域的两种融合蛋白来重建有催化活性的裂解域。或者，也可使用含有锌指结合域和两个Fok I裂解半域的单一多肽分子。在本公开其它地方提供了用锌指-Fok I融合体进行靶向裂解和靶向序列改变的参数。
裂解域或裂解半域可以是保留裂解活性或保留多聚化(例如二聚化)以形成功能性裂解域的能力的蛋白质的任何部分。。
示例性IIS型限制性酶在国际公布WO 07/014275中有所描述，该公布全文并入本文。其它限制性酶也含有可分离的结合域和裂解域，本公开也设想了这些限制性酶。参见(例如)，Roberts等人(2003)Nucleic Acids Res.31：418-420。
在某些实施方案中，裂解域包含最小化或防止均二聚的一个或多个改造的裂解半域(也称为二聚化域突变体)，例如在美国专利公布No.20050064474、20060188987和20080131962中所述，所有这些专利公布的公开内容以引用方式全文并入本文。在Fok I的446、447、479、483、484、486、487、490、491、496、498、499、500、531、534、537和538位置上的氨基酸残基全部都是影响Fok I裂解半域二聚化的靶。
形成专性异质二聚体的Fok I的示例性改造裂解半域包括这样的对，其中第一裂解半域在Fok I的490和538位置上的氨基酸残基处具有突变，而第二裂解半域在486和499氨基酸残基处具有突变。
因此，在一个实施方案中，490上的突变用Lys(K)替换Glu(E)；538上的突变用Lys(K)替换Iso(I)；486上的突变用Glu(E)替换Gln(Q)；499上的突变用Lys(K)替换Iso(I)。具体来说，本文所述改造的裂解半域是通过以下方式制备：在一个裂解半域中使位置490突变(E→K)和使538突变(I→K)以制备称为“E490K:I538K”的改造裂解半域，以及在另一裂解半域中使位置486突变(Q→E)和使位置499突变(I→L)以制备称为“Q486E:I499L”的改造裂解半域。本文所述的改造裂解半域是专性异质二聚体突变体，其中异常裂解被最小化或消除。参见(例如)美国专利公布No.2008/0131962的实施例1，其公开内容出于所有目的以引用方式全文并入本文。
本文所述的改造裂解半域可以通过任何合适的方法来制备，例如，通过野生型裂解半域(Fok I)的位点定向诱变，如在美国专利公布No.20050064474(No.10/912,932，实施例5)和美国专利临时申请No.60/721,054实施例38)中所述。
C.在大鼠中靶向裂解的其它方法
本文公开的方法中可以使用在任何大鼠基因中具有靶位点的任何核酸酶。例如，归巢核酸内切酶和巨核酸酶具有十分长的识别序列，其中一些在统计上在人类基因组中可能仅出现一次。不使用锌指核酸酶，或除了使用锌指核酸酶之外，可以使用任何在大鼠基因中具有靶位点的此类核酸酶来在大鼠基因中靶向裂解。
示例性归巢核酸内切酶包括I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII和I-TevIII。它们的识别序列是已知的。还参见美国专利No.5,420,032；美国专利No.6,833,252；Belfort等人(1997)Nucleic AcidsRes.25：3379-3388；Dujon等人(1989)Gene 82：115-118；Perler等人(1994)Nucleic Acids Res.22，1125-1127；Jasin(1996)Trends Genet.12：224-228；Gimble等人(1996)J.Mol.Biol.263：163-180；Argast等人(1998)J.Mol.Biol.280：345-353以及新英格兰生物实验室公司(New England Biolabs)目录。
虽然就识别位点而言，大多数归巢核酸内切酶的裂解特异性并不是绝对的，但这些位点足够长，使得通过在含有其识别位点的单个拷贝的细胞中表达归巢核酸内切酶可以获得每个哺乳动物大小的基因组的单裂解事件。此外有报道，归巢核酸内切酶和巨核酸酶的特异性可以被改造成结合非天然靶位点。参见(例如)，Chevalier等人(2002)Molec.Cell 10：895-905；Epinat等人(2003)Nucleic Acids Res.31：2952-2962；Ashworth等人(2006)Nature 441：656-659；Paques等人(2007)Current Gene Therapy 7：49-66。
递送
本文所述的ZFN可以通过任何合适的方式(包括例如通过ZFNmRNA注射)递送到靶大鼠细胞。参见Hammerschmidt等人(1999)Methods Cell Biol.59：87-115。
递送包含锌指的蛋白质的方法在以下文献中有所描述：美国专利No.6,453,242、6,503,717、6,534,261、6,599,692、6,607,882、6,689,558、6,824,978、6,933,113、6,979,539、7,013,219和7,163,824，所有这些专利的公开内容以引用方式全文并入本文。
本文所述的ZFN还可用含有编码一种或多种ZFN的序列的载体来递送。可以使用任何系统，包括但不限于：质粒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、痘病毒载体、疱疹病毒载体和腺相关病毒载体等。还可参见美国专利No.6,534,261、6,607,882、6,824,978、6,933,113、6,979,539、7,013,219和7,163,824，它们的全文以引用方式并入本文。此外，显而易见的是，任何这些载体可以包含一种或多种ZFN编码序列。因此，当把一对或多对ZFN引入细胞时，ZFN可以携带在相同载体或在不同载体上。当使用多种载体时，各载体可包含编码一种或多种ZFN的序列。
可以使用基于常规病毒和非病毒的基因转移方法来在大鼠细胞中引入编码经改造的ZFP的核酸。这种方法还可用于对大鼠细胞离体施用编码ZFP的核酸。在某些实施方案中，施加编码ZFP的核酸用于活体内或活体外的用途。
非病毒载体递送系统包括电穿孔、脂质转染、显微注射、生物弹道术、病毒小体、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质：核酸共轭物、裸露DNA、人造病毒粒子以及药剂增强摄取的DNA。使用(例如)Sonitron 2000系统(Rich-Mar)的声穿孔也可用于递送核酸。病毒载体递送系统包括DNA病毒和RNA病毒，它们在递送到细胞之后具有附加体或整合基因组。其它示例性核酸递送系统包括以下公司提供那些：Amaxa Biosystems(Cologne，Germany)、Maxcyte公司(Rockville，Maryland)、BTX Molecular Delivery Systems(Holliston，MA)和Copernicus Therapeutics公司(参见如US6008336)。脂质转染在(例如)US 5,049,386、US 4,946,787和US 4,897,355中有所描述，脂质转染试剂是市售的(例如TransfectamTM和LipofectinTM)。适于多核苷酸的有效受体识别脂质转染的阳离子脂质和中性脂质包括Felgner在WO 91/17424、WO 91/16024中所描述的那些。可递送到细胞(活体外施用)或靶组织(活体内施用)。脂质：核酸复合物(包括诸如免疫脂质复合物之类的靶向脂质体)的制备为本领域技术人员所熟知(参见(例如)Crystal，Science 270：404-410(1995)；Blaese等人，CancerGene Ther.2：291-297(1995)；Behr等人，Bioconjugate Chem.5：382-389(1994)；Remy等人，Bioconjugate Chem.5：647-654(1994)；Gao等人，Gene Therapy 2：710-722(1995)；Ahmad等人，Cancer Res.52：4817-4820(1992)；美国专利No.4,186,183、4,217,344、4,235,871、4,261,975、4,485,054、4,501,728、4,774,085、4,837,028和4,946,787)。
如上所示，所公开方法和组合物可用于任何类型的大鼠细胞。也可以使用大鼠细胞的子代、变体和衍生物。
应用
所公开方法和组合物可用于任何大鼠基因的基因组编辑。在某些应用中，所述方法和组合物可用于大鼠基因组序列的失活。在其它应用中，所述方法和组合物使得可以产生随机突变，包括产生基因的新型等位基因形式(其与未编辑的基因相比具有不同的表达)或人化大鼠基因的整合，从而又使得可以产生动物模型。在其它应用中，所述方法和组合物可用于在基因的确定位置上产生随机突变，该随机突变使得可以识别或选择携带了那些基因的新型等位基因形式的动物。在其它应用中，所述方法和组合物使得可以将外源(供体)序列靶向整合到大鼠基因组的任何所选区域中。调控序列(例如启动子)可在所关注位点上以靶向方式整合。“整合”意味着物理插入(例如插入到宿主细胞基因组中)，也意味着通过核酸复制程序将供体序列拷贝到宿主细胞基因组中来进行的整合。供体序列也可以包含核苷酸，如shRNA、miRNA等等。这些小核酸供体可用于研究它们对大鼠基因组内所关注基因的作用。大鼠基因的基因组编辑(例如失活、整合和/或靶向突变或随机突变)可以通过(例如)以下方式实现：单裂解事件；非同源端连接后裂解；同源定向修复机制后裂解；物理整合供体序列后裂解；连接后在两个位点上的裂解，以便删除该两个裂解位点间的序列；将错义或无义密码子靶向重组到编码区中；将无关序列(即，“填充片段”序列)靶向重组到基因或其调控区中，以便中断该基因或调控区；或者将剪接受体序列靶向重组到内含子中以导致转录物错剪接。参见美国专利公布No.20030232410、20050208489、20050026157、20050064474、20060188987、20060063231以及国际公布WO 07/014275，这些申请的公开内容出于所有目的以引用方式全文并入本文。
大鼠ZFN介导的基因组编辑有许多应用。本文所述的方法和组合物使得可以产生人类疾病的大鼠模型。例如，编辑p53基因使得可以产生“肿瘤大鼠”，为研究肿瘤和测试肿瘤疗法提供动物模型。
实施例
实施例1：ZFN诱导大鼠C6细胞中的靶向中断
设计了靶向大鼠p53的ZFN，并将其并到质粒中，基本上如在Urnov等人(2005)Nature 435(7042)：646-651中所述。代表性大鼠p53设计的识别螺旋示于下表1中。这些ZFN的靶位点示于表2中。
表1：大鼠p53特异性ZFN设计
Figure BPA00001406294800301
Figure BPA00001406294800311
表2：大鼠p53特异性ZFN靶
Figure BPA00001406294800312
Figure BPA00001406294800321
ZFN编码质粒被转染到大鼠C6细胞中。为测定在p53基因座上的ZFN活性，基本上按照生产商的说明书(Trangenomic SURVEYORTM)来进行CEL-I错配试验。收获细胞，并且根据生产商说明书使用QuickextractTM试剂盒(Epicentre)制备染色体DNA。使用AccuprimeTM高保真DNA聚合酶(Invitrogen)对p53基因座的合适区域进行PCR扩增。PCR反应物经加热至94℃，然后逐渐冷却至室温。将约200ng退火DNA与0.33μL CEL-I酶混合，然后在42℃下培育20分钟。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，在1XTBE(Tris-borate-EDTA)缓冲液中分析反应产物。
结果示于图1中，其中以组合方式测试了表1和表2中所述的各对p53特异性ZFN。错配百分比、NHEJ活性测量示于各泳道底部。结果表明这些ZFN对该大鼠基因座具有活性。
设计了靶向GFP的ZFN，并将其并到质粒中，基本上如在Urnov等人(2005)Nature 435(7042)：646-651中所述。针对在基于酵母的染色体系统中的活性筛选ZFN对，如在标题为“Rapid in vivo Identificationof Biologically Active Nucleases”的U.S No.12/284,887中所述。简单地说，将半乳糖可诱导的ZFN转化到含有整合的单链退火(ySSA)报告基因的酵母菌株中，报告基因由插入在PGK启动子驱动的MEL1基因的两个重叠节段之间的完整eGFP序列组成。诱导ZFN表达6小时，然后抑制18小时，此后，采用标准比色测定来确定上清液中MEL1蛋白质的量。
代表性GFP锌指设计的识别螺旋示于下表3中。
表3：GFP锌指设计
Figure BPA00001406294800331
GFP锌指设计的靶位点示于下表4中。在靶位点处被ZFP识别螺旋接触的核苷酸以大写字母指示；未接触的核苷酸以小写字母指示。
表4：GFP锌指的靶位点
  ZFN名称   靶位点(5’至3’)
  16833   GACCAGGATGGG(SEQ ID NO：31)
  16834   GACGGCGACgTAAACG(SEQ ID NO：32)
  16855   GATGCGGTTcACCAGG(SEQ ID NO：33)
  16856   GAAGGGCATCGAcTTCAAG(SEQ ID NO：34)
  16859   GTTGTGGCTGTTGTAGTT(SEQ ID NO：35)
  16860   ATCATGGCCGACAAG(SEQ ID NO：36)
活性GFP靶向ZFN表达构建体被转染到含有GFP表达构建体的大鼠C6细胞中。
如图2所示，测试的所有ZFN对均在靶细胞内裂解GFP基因。
实施例2：ZFN诱导转基因大鼠中的靶向中断
还通过不同浓度的前核注射(PNI)或胞质注射(ZFN mRNA的胞质注射)，将如实施例1所述的GFP特异性ZFN引入到由表达GFP的转基因大鼠获得的单细胞胚胎中，如在Michalkiewicz等人(2007)J.Amer.Phys.Society 293：H881-H894中所述。参见图3。
注射的胚胎培养2-3天，直到它们达到2-4细胞期为止。2-4细胞胚胎中的一些随后被转移到假妊娠的雌性动物中。从培养胚胎和转移胚胎中提取DNA，并且评估了GFP基因的裂解。
下表5示出了使用ZFN对16859/16860注射到胚胎中的ZFN在不同注射模式和浓度下的结果。
表5
Figure BPA00001406294800351
ZFN mRNA胞质注射的GFP成像表明许多含有ZFN的胚胎未能比未注射胚胎表达更多GFP，从而表明ZFN活性的细胞中不存在嵌合。
将ZFN前核注射(PNI)到转移至假妊娠雌性动物中的胚胎内，产生了5个幼仔。参见表5。如图4A所示，5个幼仔中的3个表达了GFP，而2个幼仔未表达。
用两个GFP阴性动物的尾部制备基因组DNA，并通过PCR针对修饰进行筛选。当与野生型eGFP基因座比较时，由ZFN 59/60对所靶向的位点边缘的区域显著缩小，从而表明两种GFP阴性动物均缺失约150bp。此外，尾部活检中显然不存在嵌合，如缺失野生型eGFP条带所示。随后直接通过测序分析这些缺失，显示缺失162nt和156nt，导致图4B中明显较小的条带。此外，如图4B所示，GFP阴性幼仔中显然不存在嵌合，因为未检测到野生型eGFP条带。
因此，ZFN成功修饰了染色体GFP转基因。
实施例3：ZFN裂解内源性大鼠基因座
设计ZFN以裂解如下文所述的内源基因座。
A.IgM
在一个实验中，设计ZFN以裂解内源性大鼠IgM基因，如上所述，并且在大鼠C6细胞中测试其裂解活性。示例性大鼠IgM靶向ZFP示于下表6中。
表6：IgM锌指设计
Figure BPA00001406294800361
大鼠IgM靶向锌指设计的靶位点示于下表7中。在靶位点处被ZFP识别螺旋接触的核苷酸以大写字母指示；未接触的核苷酸以小写字母指示。
表7：IgM锌指的靶位点
 ZFN名称   靶位点(5’至3’)
 17747   AATTTGGTGGCCATGGGC(SEQ ID NO：47)
 17749   AGACAGGGGGCTCTC(SEQ ID NO：48)
 17759   ctGAAGTCATGCAGGGTGTCagaacctt(SEQ ID NO：67)
 17756   ttGTTCTGGTAGTTcCAGGAGaaggaaa(SEQ ID NO：68)
 17767   gtGCTGTGGGTGTGGCTagtgtttgtat(SEQ ID NO：69)
 17764   aaGGTGCCATTGGGGTGactttccatga(SEQ ID NO：70)
 17782   gaGAGGACcGTGGACAAGtccactggta(SEQ ID NO：71)
 17778   tcACCATGtGTGGCAGGGcctcgtggcc(SEQ ID NO：72)
所有IgM靶向ZFN含有如美国专利公布No.2008/0131962中所述的EL/KK Fok I突变。ZFN表达是通过CAG或CMV启动子来驱动的。通过Amaxa核转染，使用SF溶液和Amaxa Shuttle 96孔细胞核转染仪，将ZFN(各1μg)转染到200,000个C6细胞中。使用GJC153F(5’-ggaggcaagaagatggattc-3’)和GJC154R(5’-gaatcggcacatgcagatct-3’)对IgM基因座进行PCR扩增，并且用SurveyorTM核酸酶测定ZFN裂解，例如在美国专利公布No.20080015164、20080131962和20080159996中所述。
在C6细胞中，当使用CMV启动子时，ZFN对17747/17749裂解3％的染色体，而当使用CAG启动子时，其裂解约1％的染色体。该ZFN对裂解外显子1编码区中的大鼠IgM基因。使用标准技术在CAG启动子控制下，对大鼠卵母细胞注射10ng/ul的编码ZFN对17747/17749的质粒。使卵母细胞受精并注入到假妊娠的雌性动物中。注射和植入的430个卵母细胞，结果其中43个活产。基因组DNA由该43个动物的尾部制备，并且使用SurveyorTM核酸酶针对修饰进行筛选。
如图7所示，43个动物中的5个(大鼠6#、7#、8#、19#和46#)针对在IgM基因座上的修饰被记为阳性。在添加或不添加野生型大鼠基因组DNA的情况下，SurveyorTM核酸酶消化的方式是相同的，这表明没有大鼠具有纯合突变。
克隆来自阳性大鼠的GJC153F/GJC154R PCR产物并测序。表8中描述了突变等位基因。
表8
Figure BPA00001406294800381
计数指具体序列分离的次数。
NHEJ％是尾部DNA中修饰的染色体的大致百分比。
对这些大鼠中IgM基因座的测序确认了SurveyorTM核酸酶测定的结果。所有缺失均重叠ZFN结合位点。此处所见的小缺失谱是典型的NHEJ介导的突变。大鼠7和大鼠8具有一个以上的突变等位基因，因此是IgM突变的嵌合体。虽然对大鼠6、19和46的测序仅仅得到一个突变等位基因，但它们可以是针对其它组织中IgM修饰的嵌合体。
因此，ZFN成功修饰了内源性大鼠IgM基因座。
为确定ZFN质粒其自身是否整合到了大鼠基因组中，开发基于PCR的试验来针对ZFN质粒整合进行测试。简单地说，混合大鼠基因组DNA和ZFN质粒，以便模拟每个基因组一次的质粒插入频率。用CAG启动子中的一个寡核苷酸(5’-GCT AAC CAT GTT CAT GCCTTC-3’)(SEQ ID NO：49)和质粒2A区域中的另一寡核苷酸(5’-CATCCT AGG GCC GGG ATT CTC-3’)(SEQ ID NO：50)执行该混合物的35个循环的PCR扩增，得到1338bp的条带(图7，泳道3)。当分析野生型和五只ZFN修饰大鼠的基因组DNA时，未探测到PCR产物；表明将质粒插入到大鼠基因组中并不是高频率事件。
另外，通过CEL-I试验和测序来进一步分析IgM修饰的大鼠19#。如图7A和7B所示，IgM-ZFN在大鼠中IgM基因座上产生64个碱基对缺失。
最后，还评估了在脱靶位点上的ZFN裂解。使用计算机算法来预测最可能是脱靶位点的位置(Doyon等人(2008)NatureBiotechnology 26(6)：702-708)。使用如上所述的SurveyorTM核酸酶测定来针对ZFN修饰测定所有可能的脱靶位点。分析结果示于表9和图9A-C中。
Figure BPA00001406294800401
表9
Mm：与预期靶位点错配
片段A、B：SurveyorTM核酸酶裂解产物的期望尺寸
命中：显示正确的SurveyorTM核酸酶裂解产物的大鼠数
如所示，测试的脱靶位点未显示修饰的迹象。如所示，测试的脱靶位点未显示修饰的迹象。示于图9A中的CEL-I阳性大鼠19#及其示于图11中位点1处的5个后代的序列分析表明，CEL-I阳性信号由潜在性脱靶位点附近的SNP造成。发生了错配，因为该大鼠对此SNP是杂合的，此SNP也在未处理大鼠中发现(数据未示出)。虽然存在于CEL-I阳性动物的50％的染色体中，但SNP通过CEL-I酶较难识别，导致意外的较低强度的裂解产物。
B.Rab38
ZFN还被设计为靶向大鼠中的内源性Rab38基因座，尤其是靶向大鼠Rab38基因的外显子1。示例性Rab38锌指设计示于下表8中。
表10：Rab38锌指设计
Figure BPA00001406294800411
Figure BPA00001406294800421
大鼠Rab38靶向锌指设计的靶位点示于下表11中。在靶位点处被ZFP识别螺旋接触的核苷酸以大写字母指示；未接触的核苷酸以小写字母指示。
表11：Rab38锌指靶位点
  ZFN名称   靶位点(5’至3’)
  18161   gaGGAGAAGTTTTGGTGCACgtagcgct  (SEQ ID NO：98)
  18181   acTACCGGGCCACCATTGGTgtggactt(SEQ ID NO：99)
  16897   gaGGAGAAGTTTTGgTGCACGtagcgct  (SEQ ID NO：98)
  16898   acTACCGGGCCacCATTGGtgtggactt  (SEQ ID NO：99)
  18173   acTACCGGGCCaCCATTGgtgtggactt  (SEQ ID NO：99)
  18174   acTACCGGGCCaCCATTGgtgtggactt  (SEQ ID NO：99)
  18175   acTACCGGGCCACCATTggtgtggactt  (SEQ ID NO：99)
  18160   gaGGAGAAGTTTTGGTGcacgtagcgct(SEQ ID NO：98)
  18183   acTACCGGGCCACCaTTGGTGtggactt(SEQ ID NO：99)
所有Rab38靶向ZFN含有如美国专利公布No.2008/0131962中所述的EL/KK Fok I突变。ZFN表达是通过CAG或CMV启动子来驱动的。通过Amaxa核转染，使用SF溶液和Amaxa Shuttle 96孔细胞核转染仪，将ZFN(各1μg)转染到200,000个C6细胞中。用SurveyorTM核酸酶测定ZFN裂解，例如在美国专利公布No.20080015164、20080131962和20080159996中所述。
Rab38 ZFN编码表达质粒用XbaI线性化，用苯酚氯仿提取，并沉淀。使用MessageMaxTM T7 ARCA加帽的信息转录试剂盒(Epicentre Biotechnologies)离体转录信使RNA。所得合成物在不含RNAse的0.1X TE(1mM Tris Cl pH 8.0，0.1mM EDTA)中再悬浮之前使用MegaClear试剂盒TM(Ambion)来纯化，使用NanoDrop-1000(Thermo Scientific)定量，并在-80℃下储存直到使用。将编码Rab38ZFN的信使RNA混合至0.1X TE中5ng/μL的最终总浓度。以恒定时间和压力(Pi＝65，Pc＝20，ti＝1.5s)将具有Rab38ZFN的胚胎注射到细胞质中，并且在37.5℃和5％CO2于KSOM(Millipore)下过夜培育，如先前在Filipiak等人(2006)用于分子分析的Transgenic Res15：673-686中所述。
突变富集策略，如在Lloyd等人(2005)Proc Natl Acad Sci USA102：2232-2237中所述，用于检测DNA染色体中Rab38靶向外显子的改变，该DNA提取自注射后培养48小时的胚胎。
如图10所示，并且如上文对GFP和IgM基因座的说明，在少到16个2细胞胚胎的基因组中能检测到多种突变体Rab38等位基因，测序显示靶位点上的缺失。
因此，这些数据确认多种基因组基因座是ZFN介导的基因组编辑的合适靶标。
实施例4：ZFN介导的胚系修饰
使实施例3中所述的IgM修饰的大鼠19#、46#和8#交配野生型大鼠，进行尾部活检，分离基因组DNA，然后对自幼仔纯化的核酸进行CEL-I和PCR测定。
如图11A和11C所示，大鼠19#和野生型大鼠之间杂交产生的幼仔(编号225、227、228、229、230、231、234和235)携带了IgM修饰的亲代大鼠19#的64个碱基对缺失，如通过PCR和CEL-I测定所确定。另外，序列分析确认大鼠19#的3个幼仔(幼仔225#、227#和228#)在IgM基因座上存在修饰。参见图11B。此外，如图11C所示，由大鼠46#交配野生型大鼠产生的幼仔携带与亲代大鼠46#(参见图11C编号236的幼仔)相同的IgM修饰。
这些数据显示大鼠基因座的ZFN介导的中断在胚系中传播。
实施例5：用于靶向整合到大鼠基因组的PXR核酸区中的限制性片段长度多态性(RFLP)供体核酸的构造
在靶向的ZFN诱导双链断裂之后存在两个可能的DNA修复结果(图12)。该断裂可以通过非同源端连接(NHEJ)修复，导致含有碱基缺失或增加的突变，或者在供体DNA存在下，可以使用供体DNA为模板，通过同源重组(HR)修复双链断裂。如果供体DNA编码特异性序列变化，则这些刻意突变将在靶位点并到生物体基因组当中。
为使用前核注射测试大鼠基因组中的靶向整合，设计构建体并准备靶向整合到大鼠基因组的PXR基因区中。装配构建体以将NotI或PmeI限制性片段长度多态性(RFLP)位点引入PXR基因区中(图13)。构建体被设计成具有与待引入的RFLP位点侧翼的PXR基因靶位点同源的200个、800个或2000个碱基对序列。使用三种大小的同源区来确定有效靶向和同源重组所需要的同源性大小。
使用PCR扩增来装配克隆，以引入方便的克隆用限制性位点，以及在PXR同源区的末端引入RFLP位点(图12)。表12中描述了用于扩增同源性PXR区的PCR引物。将Accuprime HF DNA聚合酶用于PCR反应物扩增。30秒延时用于200bp片段，1.5分钟延时用于800bp片段，4分钟延时用于2Kbp片段。然后用合适的限制性酶消化PCR片段，并使用三元连接克隆到pBluescript中以产生表13所列的6个质粒。
Figure BPA00001406294800451
Figure BPA00001406294800461
实施例6：用于靶向整合到大鼠基因组的rRosa26核酸区中的限制性片段长度多态性(RFLP)供体核酸的构造
还构建了质粒，以将NotI和PmeI RFLP位点靶向整合到大鼠基因组的rRosa26核酸区中。质粒的设计和构造如上实施例5所述。表14中描述了用于扩增rRosa26同源区的PCR引物对。
Figure BPA00001406294800462
Figure BPA00001406294800471
实施例7：用于靶向整合到小鼠或大鼠基因组的Mdr1a核酸区中的限制性片段长度多态性(RFLP)供体核酸的构造
还构建了质粒，以将NotI和PmeI RFLP位点靶向整合到小鼠基因组的mMdr1a核酸区中或大鼠基因组的rMdr1a核酸区中。质粒的设计和构造如上实施例5所述。表15和表16中描述了用于扩增Mdr1a同源区的PCR引物对。″m″代表小鼠，“r”代表大鼠。
Figure BPA00001406294800472
Figure BPA00001406294800481
Figure BPA00001406294800491
实施例8：GFP表达整合盒的构造。
为测试大于RFLP的核酸片段的靶向整合，设计构建体并准备将GFP表达盒靶向整合到大鼠的PXR和rRosa26核酸基因组区中以及小鼠的mMdr1a核酸基因组区中。简单地说，通过PCR来扩增含有人类PGK启动子、GFP开放阅读框和聚腺苷酸化信号的GFP表达盒，以使用以下引物来在末端引入NotI限制性位点(图14)：PGKGFP-FNotI(5’-aaagcggccgcttggggttgcgccttttcc)(SEQ ID NO：164)和PGKGFP-R NotI(5’-aaaagcggccgccatagagcccaccgcatc)(SEQ IDNO：165)。然后，将PCR片段克隆到实施例5-7中构建的含有NotI的质粒中。
实施例9：制备用于靶向整合的锌指mRNA
设计一对锌指核酸酶用于各靶向整合位点，并且如Sigma网址上所述进行克隆。更多信息请参见Science(2009)325：433，其以引用方式并入本文。然后，通过以下方式来离体产生ZFN表达mRNA：首先在37℃下，在100μl反应物中经2小时消化20μg各种大量制备的ZFN表达质粒DNA，该反应物含有10μl缓冲液2(NEB，#B7002S)、10μl 10X BSA(稀释自100X BSA、NEB、#B9001S)、8μl XbaI(NEB，#R0145S)。反应物用100μl苯酚/氯仿(Sigma，P2069)提取，在高于20,000x g下离心10分钟。含水上清液用10μl 3M NaOAc(Sigma，S7899)和250μl 100％乙醇沉淀，并且在室温下以最高速度离心25分钟。添加通过0.02μM过滤器过滤的300μl 70％乙醇来洗涤所得颗粒。空气干燥颗粒并再悬浮于20μl的0.02μM过滤的0.1X TE中。
然后，使用纯化的被消化DNA来产生ZFN转录物，使用得自所述Epicentre Biotechnologies的MessageMax T7加帽的信息转录试剂盒(#MMA60710)进行离体转录。简单地说，将试剂盒组分预热至室温，并且20μl反应物的反应组分在室温下按以下顺序合并：5μl的0.02um过滤的无RNase水、1μl制备的模板、2μl lox转录缓冲液、8μl的2元Cap/NTP预混物、2μl 100mMDTT和2μl MessageMax T7酶溶液。然后将反应物在37℃培育器中培育30分钟。
然后，使用如所述的A-Plus Poly(A)聚合酶加尾试剂盒(Epicentre，#PAP5 104H)对加帽RNA加上聚腺苷酸(polyA)尾部。反应组分在室温下按以下给定顺序合并：55.5μl 0.02um过滤的无RNase水、10μl 10X A-Plus反应缓冲液、10ul 10mM ATP、2.5μl ScriptGuardRNase抑制剂(40单位/μl)、20μl离体转录加帽反应物、2μl A-pluspolyA聚合酶。然后将反应物在37℃下培育30分钟。通过用等体积的5M NH4Oac沉淀两次来纯化所得的加帽聚腺苷酸加尾的mRNA。然后，空气干燥mRNA颗粒，并且再悬浮于30μl过滤的注射缓冲液中(1mM Tris，pH7.4，0.25mM EDTA)，并且使用Nanodrop分光光度计测量RNA浓度。
实施例10：靶向整合到胚胎中
为将核苷酸整合到大鼠或小鼠基因组中，使锌指核酸酶mRNA与0.02um过滤器过滤的大量制备的靶DNA混合。核酸混合物由一份ZFN mRNA至一份供体DNA组成。然后，使用已知方法将核酸混合物显微注射到单细胞胚胎的前核中。离体培育注射胚胎，或者转移至假单胞菌中。收获所得胚胎/胎鼠或修剪的活产动物的趾/尾用于DNA提取和分析。
为提取DNA，在50℃下将组织经30分钟溶解于100μl Epicentre′sQuickExtract中，随后在65℃下培育10分钟，以及98℃下培育3分钟。为确定是否发生靶向整合，通过合适引物使用PCR来扩增靶区域。对于将RFLP整合到动物基因组中的实验，用引入的RFLP酶消化PCR产物以检测整合(图15A)。另外，使用野生型PCR片段和来自注射胚胎的PCR片段进行的CEL-I核酸内切酶测定通过检测不依赖靶向整合的NHEJ表明ZFN mRNA在胚胎中具有功能性。对于将GFP整合到动物基因组中的实验，PCR片段大小的变动指示存在整合(图15B)。或者，使用整合连接的扩增(其中一种引物仅位于GFP盒上)来评估供体核酸的整合。
实施例11：测试小鼠基因组中mMdr1a靶位点的DNA提取和PCR扩增
使用具有如实施例10中所述提取的1-64个细胞的胚胎测试扩增提取自组织的靶核酸的PCR条件。使用36个扩增循环以4分钟的延时在60℃下，在于50μl反应物中含有最多5μl Epicentre′s QuickExtract溶液的反应物中，扩增含有小鼠mMdr1a靶区域的900bp片段(图16)。结果显示QuickExtract未干扰PCR扩增，并且DNA可以由提取自仅仅1-10个细胞的样本中扩增。为增强灵敏度，可以增加PCR循环数，或可以进行巢式PCR反应。
实施例12：将NotI供体RFLP整合到大鼠PXR基因组区中
将用于把NotI RFLP位点整合到大鼠基因组PXR区中的供体质粒(具有800bp臂)注射到如上所述具有ZFN mRNAs的大鼠胚胎中。使用提取自若干胚胎的DNA进行PCR，然后进行NotI限制性酶分析和CEL-I核酸内切酶分析。用若干胚胎进行的PCR扩增是成功的，CEL-I核酸内切酶分析显示绝大多数片段在所需靶上具有核酸序列变化(图17B)。
实施例13：将NotI供体RFLP整合到小鼠mMdr1a基因组区中
如实施例8中所述，重复将NotI RFLP靶向整合到小鼠mMdr1a区中。采用PCR扩增mMdr1a区并用NotI消化。用若干胚胎进行的PCR扩增是成功的(图18)，经NotI消化显示若干胚胎包含整合的RFLP位点(参见，例如泳道13、17、19、20和23)。总的说来，产生的数据表明32个胚胎中有7个发生靶向整合。
通过进一步清洗PCR反应产物之后重复NotI消化反应，确认了这些结果(图19)。
实施例14：测试大鼠基因组中PXR靶位点的DNA提取和PCR扩增
测试胚泡的PXR区的PCR扩增以确定灵敏度水平。就50μl反应物来说，PCR反应物包含5μl模板、5μl PCR缓冲液、5μl各种引物、0.5μl Taq聚合酶和33.5μl水。模板由提取自大鼠胚泡的未稀释DNA或以1∶2、1∶6、1∶10和1∶30的比率稀释的DNA组成(图20)。
实施例15：将NotI供体RFLP整合到大鼠PXR基因组区中
将用于把NotI RFLP位点整合到大鼠基因组PXR区中的供体质粒(具有800bp同源臂)注射到如上所述的具有ZFN mRNAs的大鼠胚胎中。总共注射了123个胚胎，并且106个存活。减少注射核酸的浓度以测试毒性。在注射5ng核酸的51个胚胎中，有17个存活并在第二天分裂为2细胞胚胎。在注射2ng核酸的23个胚胎中，有14个存活并在第二天分裂为2细胞胚胎。在注射10ng核酸的29个胚胎中，有12个存活并在第二天分裂为2细胞胚胎。在10个未注射的对照胚胎中，全部存活并在第二天分裂成2细胞胚胎。
使用提取自若干胚胎的DNA进行PXR区的PCR扩增，然后进行NotI和CEL-I核酸内切酶分析。用若干胚胎进行的PCR扩增是成功的，NotI和CEL-I核酸内切酶分析显示47个胚胎中的18个在所需靶上具有核酸序列变化(图21)。
实施例16：将RFLP靶向整合到胎鼠内小鼠基因组的mMdr1a靶区域中。
将用于把NotI引入小鼠基因组mMdr1a区中的供体质粒(具有800bp同源臂)注射到如上所述具有ZFN mRNAs的小鼠胚胎中。4个良好发育的12.5dpc胎鼠中的一个为NotI位点阳性的。所有4个蜕膜为阴性的(图22)。
实施例17：将GFP靶向整合到胎鼠mMdr1a基因座中
将用于把GFP盒引入小鼠基因组mMdr1a区中的供体质粒(具有800bp同源臂)注射到如上所述具有ZFN mRNAs的小鼠胚胎中。40个12.5dpc胎鼠中的2个为GFP盒阳性的(图23)。
实施例18：：将RFLP靶向整合到胎鼠内大鼠基因组的PXR靶区域中。
将用于把NotI引入大鼠基因组PXR区中的供体质粒(具有800同源臂)注射到如上所述的具有ZFN mRNAs小鼠胚胎中。8个13dpc胎鼠中的1个为NotI位点阳性的(图24)。
将本文提及的所有专利、专利申请和出版物以引用方式全文并入本文。
虽然为了便于理解以说明和举例的方式详细提供了公开内容，但本领域技术人员应了解，可以在不脱离本发明精神或范围的情况下实施各种改变和修改。因此，上述说明和实施例不应该视为限制。

Claims (12)

1.一种修饰大鼠细胞中的一种或多种内源细胞基因的方法，所述方法包括：
把编码一种或多种锌指核酸酶(ZFN)的一种或多种多核苷酸引入所述大鼠细胞，所述锌指核酸酶(ZFN)在使得所述ZFN被表达并且所述一种或多种内源细胞基因被裂解和修饰的条件下，结合到所述一种或多种基因中的靶位点上。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述修饰包括：通过由裂解所述一种或多种内源细胞基因所刺激的同源重组来将外源序列引入到大鼠细胞的所述基因组中。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述外源序列被物理性整合到所述基因组中。
4.根据权利要求2所述的方法，其中通过核酸复制程序将所述外源序列拷贝到所述宿主细胞基因组中来使所述外源序列整合到所述基因组中。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述核酸复制程序包括同源定向修复双链断裂。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述核酸复制程序包括非同源依赖性靶向整合。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述修饰是在裂解之后非同源端连接的结果。
8.根据权利要求7所述的方法，其中第一和第二锌指核酸酶在两个位点上裂解所述基因组，而且其中所述非同源端连接导致在所述第一裂解位点与所述第二裂解位点之间的缺失。
9.根据权利要求1到8中任一项所述的方法，其中所述锌指核酸酶包含IIS型限制性核酸内切酶的裂解域或裂解半域。
10.一种胚系中断大鼠中一种或多种靶基因的方法，所述方法包括修饰在大鼠胚胎的一个或多个细胞的所述基因组中的一种或多种基因序列，所述方法包括：
根据权利要求1到9中任一项所述的方法，修饰大鼠胚胎的一个或多个细胞中的一种或多种所述靶基因；和
使所述大鼠胚胎发育，其中修饰的基因序列存在于性成熟大鼠的至少一部分配子中。
11.一种在所关注的大鼠基因座中产生一种或多种可遗传突变体等位基因的方法，所述方法包括：
通过权利要求1到9中任一项所述的方法，修饰大鼠胚胎的一个或多个细胞的所述基因组中的一个或多个基因座；和
将所述大鼠胚胎饲养至性成熟；和
使所述性成熟大鼠产生后代；其中所述后代中的至少一些包含所述突变体等位基因。
12.一种包含一种或多种修饰的等位基因的大鼠，其是通过权利要求1至11中任一项所述的方法来产生的。
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US20098508P 2008-12-04 2008-12-04
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US20597009P 2009-01-26 2009-01-26
US61/205,970 2009-01-26
US26390409P 2009-11-24 2009-11-24
US61/263,904 2009-11-24
PCT/US2009/006365 WO2010065123A1 (en) 2008-12-04 2009-12-03 Genome editing in rats using zinc-finger nucleases

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CN102625655A true CN102625655A (zh) 2012-08-01
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CN200980154833.0A Active CN102625655B (zh) 2008-12-04 2009-12-03 使用锌指核酸酶在大鼠中进行基因组编辑

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US (2) US9206404B2 (zh)
EP (2) EP3156494B8 (zh)
JP (1) JP5681114B2 (zh)
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ES (1) ES2627552T3 (zh)
SG (1) SG172760A1 (zh)
WO (1) WO2010065123A1 (zh)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104450785A (zh) * 2014-12-08 2015-03-25 复旦大学 使用编码靶向核酸内切酶附着体载体的基因组编辑方法及试剂盒
CN105308184A (zh) * 2013-04-16 2016-02-03 瑞泽恩制药公司 大鼠基因组的靶向修饰
CN107109434A (zh) * 2014-10-23 2017-08-29 瑞泽恩制药公司 新颖cho整合位点和其用途
CN107406842A (zh) * 2015-01-09 2017-11-28 生物辐射实验室股份有限公司 检测基因组编辑
CN107429241A (zh) * 2014-08-14 2017-12-01 北京百奥赛图基因生物技术有限公司 Dna敲入系统
CN114891772A (zh) * 2022-05-27 2022-08-12 湖南福来格生物技术有限公司 一种去乙酰基酶突变体及其应用
WO2024094084A1 (en) * 2022-11-01 2024-05-10 Huidagene Therapeutics Co., Ltd. Iscb polypeptides and uses thereof

Families Citing this family (178)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120196370A1 (en) * 2010-12-03 2012-08-02 Fyodor Urnov Methods and compositions for targeted genomic deletion
US20110023146A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Genomic editing of genes involved in secretase-associated disorders
US20110023149A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Genomic editing of genes involved in tumor suppression in animals
US20110016546A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-20 Sigma-Aldrich Co. Porcine genome editing with zinc finger nucleases
US20110023156A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Feline genome editing with zinc finger nucleases
US20110023143A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Genomic editing of neurodevelopmental genes in animals
US20110016539A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-20 Sigma-Aldrich Co. Genome editing of neurotransmission-related genes in animals
US20110030072A1 (en) * 2008-12-04 2011-02-03 Sigma-Aldrich Co. Genome editing of immunodeficiency genes in animals
US20110023147A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Genomic editing of prion disorder-related genes in animals
US20110023152A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Genome editing of cognition related genes in animals
US20110023154A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Silkworm genome editing with zinc finger nucleases
US20110023158A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Bovine genome editing with zinc finger nucleases
EP3156494B8 (en) * 2008-12-04 2018-09-19 Sangamo Therapeutics, Inc. Genome editing in rats using zinc-finger nucleases
US20110023141A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Genomic editing of genes involved with parkinson's disease
US20110023151A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Genome editing of abc transporters
US20110016541A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-20 Sigma-Aldrich Co. Genome editing of sensory-related genes in animals
US20110016540A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-20 Sigma-Aldrich Co. Genome editing of genes associated with trinucleotide repeat expansion disorders in animals
US20110023145A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Genomic editing of genes involved in autism spectrum disorders
US20110023144A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Genomic editing of genes involved in amyotrophyic lateral sclerosis disease
US20110023148A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Genome editing of addiction-related genes in animals
US20110023139A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Genomic editing of genes involved in cardiovascular disease
US20110023153A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Genomic editing of genes involved in alzheimer's disease
US20110016543A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-20 Sigma-Aldrich Co. Genomic editing of genes involved in inflammation
US20110023150A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Genome editing of genes associated with schizophrenia in animals
US20110023140A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Rabbit genome editing with zinc finger nucleases
EP2206723A1 (en) 2009-01-12 2010-07-14 Bonas, Ulla Modular DNA-binding domains
US20110239315A1 (en) 2009-01-12 2011-09-29 Ulla Bonas Modular dna-binding domains and methods of use
US9314005B2 (en) 2009-07-01 2016-04-19 Transposagen Biopharmaceuticals, Inc. Genetically modified rat models for severe combined immunodeficiency (SCID)
CA2779337A1 (en) 2009-10-28 2011-05-05 Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum Fuer Gesundheit U Nd Umwelt (Gmbh) Homologous recombination in the oocyte
EP2580331A4 (en) * 2010-06-14 2013-11-27 Univ Iowa State Res Found Inc NUCLEASE ACTIVITY OF THE TAL EFFECTOR AND FUSION PROTEIN FOKI
JP6018069B2 (ja) 2010-10-12 2016-11-02 ザ・チルドレンズ・ホスピタル・オブ・フィラデルフィアＴｈｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’Ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｏｆ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ 血友病ｂを治療する方法及び組成物
WO2012082509A2 (en) * 2010-12-15 2012-06-21 Sigma-Aldrich Co. Llc Biomarkers for enhanced protein production
EP2659404B1 (en) 2010-12-29 2018-08-08 Sigma-Aldrich Co., LLC Cells having disrupted expression of proteins involved in adme and toxicology processes
CN102559652A (zh) * 2010-12-31 2012-07-11 中国人民解放军第三军医大学 整合缺陷型慢病毒在制备锌指核酸酶于动物早期胚胎表达的介导剂中的应用及方法
JP6158170B2 (ja) 2011-04-27 2017-07-12 アミリス， インコーポレイテッド ゲノム修飾のための方法
KR102061557B1 (ko) 2011-09-21 2020-01-03 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 이식 유전자 발현의 조절을 위한 방법 및 조성물
CA2852955C (en) 2011-10-27 2021-02-16 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for modification of the hprt locus
MX354995B (es) * 2011-12-05 2018-03-27 Factor Bioscience Inc Metodos y productos para transfeccion de celulas.
US20130216579A1 (en) * 2012-01-23 2013-08-22 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods and compostitions for gene editing of a pathogen
US9834786B2 (en) 2012-04-25 2017-12-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nuclease-mediated targeting with large targeting vectors
BR112014027813A2 (pt) 2012-05-07 2017-08-08 Dow Agrosciences Llc métodos e composições para integração de transgenes direcionada mediada por nuclease
EP3444342B1 (en) 2012-07-11 2020-05-27 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for the treatment of lysosomal storage diseases
US10883119B2 (en) 2012-07-11 2021-01-05 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for delivery of biologics
US10648001B2 (en) 2012-07-11 2020-05-12 Sangamo Therapeutics, Inc. Method of treating mucopolysaccharidosis type I or II
UA118957C2 (uk) 2012-08-29 2019-04-10 Сангамо Біосайєнсиз, Інк. Спосіб і композиція для лікування генетичного захворювання
CA2886684C (en) 2012-10-10 2023-09-19 Sangamo Biosciences, Inc. T cell modifying compounds and uses thereof
US9255250B2 (en) 2012-12-05 2016-02-09 Sangamo Bioscience, Inc. Isolated mouse or human cell having an exogenous transgene in an endogenous albumin gene
CN113528577A (zh) * 2012-12-12 2021-10-22 布罗德研究所有限公司 用于序列操纵的系统、方法和优化的指导组合物的工程化
US8697359B1 (en) * 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
EP3434776A1 (en) 2012-12-12 2019-01-30 The Broad Institute, Inc. Methods, models, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
US20140189896A1 (en) * 2012-12-12 2014-07-03 Feng Zhang Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation
EP2931897B1 (en) * 2012-12-12 2017-11-01 The Broad Institute, Inc. Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications
SG11201505968WA (en) 2013-02-20 2015-08-28 Regeneron Pharma Genetic modification of rats
WO2014130955A1 (en) 2013-02-25 2014-08-28 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for enhancing nuclease-mediated gene disruption
US9937207B2 (en) 2013-03-21 2018-04-10 Sangamo Therapeutics, Inc. Targeted disruption of T cell receptor genes using talens
WO2014172470A2 (en) * 2013-04-16 2014-10-23 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods of mutating, modifying or modulating nucleic acid in a cell or nonhuman mammal
CA2910427C (en) 2013-05-10 2024-02-20 Sangamo Biosciences, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering
US9873894B2 (en) 2013-05-15 2018-01-23 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for treatment of a genetic condition
CN106062197A (zh) 2013-06-17 2016-10-26 布罗德研究所有限公司 用于序列操纵的串联指导系统、方法和组合物的递送、工程化和优化
KR20160056869A (ko) * 2013-06-17 2016-05-20 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 바이러스 구성성분을 사용하여 장애 및 질환을 표적화하기 위한 crispr-cas 시스템 및 조성물의 전달, 용도 및 치료 적용
EP3725885A1 (en) 2013-06-17 2020-10-21 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions methods, screens and applications thereof
CN107995927B (zh) 2013-06-17 2021-07-30 布罗德研究所有限公司 用于肝靶向和治疗的crispr-cas系统、载体和组合物的递送与用途
AU2014281027A1 (en) 2013-06-17 2016-01-28 Massachusetts Institute Of Technology Optimized CRISPR-Cas double nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation
AU2014312295C1 (en) 2013-08-28 2020-08-13 Sangamo Therapeutics, Inc. Compositions for linking DNA-binding domains and cleavage domains
CA2926078C (en) 2013-10-17 2021-11-16 Sangamo Biosciences, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering in hematopoietic stem cells
DK3441468T3 (da) 2013-10-17 2021-07-26 Sangamo Therapeutics Inc Afgivelsesfremgangsmåder og sammensætninger til nukleasemedieret genom-manipulation
CN105934524A (zh) 2013-11-11 2016-09-07 桑格摩生物科学股份有限公司 用于治疗亨廷顿氏病的方法和组合物
EP3492593B1 (en) 2013-11-13 2021-08-18 Children's Medical Center Corporation Nuclease-mediated regulation of gene expression
CA2931637C (en) 2013-12-09 2023-10-10 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for treating hemophilia
CN105980568B (zh) 2013-12-11 2019-12-03 瑞泽恩制药公司 用于靶向修饰基因组的方法和组合物
MX2016007325A (es) 2013-12-12 2017-07-19 Broad Inst Inc Composiciones y metodos de uso de sistemas crispr-cas en desordenes debidos a repeticion de nucleotidos.
EP3080271B1 (en) 2013-12-12 2020-02-12 The Broad Institute, Inc. Systems, methods and compositions for sequence manipulation with optimized functional crispr-cas systems
WO2015089364A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Crystal structure of a crispr-cas system, and uses thereof
CA2932478A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 Massachusetts Institute Of Technology Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for genome editing
PT3083958T (pt) 2013-12-19 2019-06-27 Amyris Inc Métodos de integração genómica
HUE051232T2 (hu) 2014-02-03 2021-03-01 Sangamo Therapeutics Inc Béta-talasszémia kezelésére szolgáló eljárások és készítmények
AU2015218576B2 (en) 2014-02-24 2020-02-27 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for nuclease-mediated targeted integration
CA2942762C (en) 2014-03-18 2023-10-17 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for regulation of zinc finger protein expression
WO2015164748A1 (en) 2014-04-24 2015-10-29 Sangamo Biosciences, Inc. Engineered transcription activator like effector (tale) proteins
BR112016024632A2 (pt) 2014-04-25 2018-01-30 Shire Human Genetic Therapies métodos de purificação de rna mensageiro
AP2016009588A0 (en) * 2014-04-28 2016-11-30 Recombinetics Inc Multiplex gene editing in swine
RU2691102C2 (ru) 2014-05-08 2019-06-11 Сангамо Байосайенсиз, Инк. Способы и композиции для лечения болезни хантингтона
WO2015175642A2 (en) 2014-05-13 2015-11-19 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for prevention or treatment of a disease
EP3152319A4 (en) 2014-06-05 2017-12-27 Sangamo BioSciences, Inc. Methods and compositions for nuclease design
CA2950173C (en) 2014-06-06 2023-10-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for modifying a targeted locus
RU2771532C2 (ru) 2014-06-26 2022-05-05 Регенерон Фармасьютикалз, Инк. Способы и композиции для нацеленных генетических модификаций и способы их применения
WO2016014837A1 (en) 2014-07-25 2016-01-28 Sangamo Biosciences, Inc. Gene editing for hiv gene therapy
WO2016014794A1 (en) 2014-07-25 2016-01-28 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for modulating nuclease-mediated genome engineering in hematopoietic stem cells
US9616090B2 (en) 2014-07-30 2017-04-11 Sangamo Biosciences, Inc. Gene correction of SCID-related genes in hematopoietic stem and progenitor cells
HUE055583T2 (hu) 2014-09-16 2021-12-28 Sangamo Therapeutics Inc Eljárások és készítmények nukleáz által közvetített genommódosításhoz és -javításhoz hematopoetikus õssejtekben
CN107002098A (zh) * 2014-09-29 2017-08-01 杰克逊实验室 通过电穿孔高效率、高通量产生遗传修饰哺乳动物
CN113444747A (zh) 2014-11-21 2021-09-28 瑞泽恩制药公司 使用成对向导rna进行靶向遗传修饰的方法和组合物
EP3985115A1 (en) 2014-12-12 2022-04-20 The Broad Institute, Inc. Protected guide rnas (pgrnas)
US10889834B2 (en) 2014-12-15 2021-01-12 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for enhancing targeted transgene integration
CN107208113A (zh) 2014-12-19 2017-09-26 瑞泽恩制药公司 用于通过单步多重靶向进行靶向遗传修饰的方法和组合物
US20180002379A1 (en) 2015-01-21 2018-01-04 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for identification of highly specific nucleases
US20180022781A1 (en) 2015-02-13 2018-01-25 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Polypeptides for engineering integrase chimeric proteins and their use in gene therapy
US10179918B2 (en) 2015-05-07 2019-01-15 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for increasing transgene activity
WO2016183298A2 (en) 2015-05-12 2016-11-17 Sangamo Biosciences, Inc. Nuclease-mediated regulation of gene expression
TWI813532B (zh) 2015-06-18 2023-09-01 美商博得學院股份有限公司 降低脱靶效應的ｃｒｉｓｐｒ酶突變
WO2016205759A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Engineering and optimization of systems, methods, enzymes and guide scaffolds of cas9 orthologs and variants for sequence manipulation
US9957501B2 (en) 2015-06-18 2018-05-01 Sangamo Therapeutics, Inc. Nuclease-mediated regulation of gene expression
US10450585B2 (en) 2015-07-13 2019-10-22 Sangamo Therapeutics, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering
US10435441B2 (en) 2015-09-23 2019-10-08 Sangamo Therapeutics, Inc. HTT repressors and uses thereof
AU2016343887B2 (en) 2015-10-28 2023-04-06 Sangamo Therapeutics, Inc. Liver-specific constructs, factor VIII expression cassettes and methods of use thereof
AU2016361350B2 (en) 2015-11-23 2023-04-06 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for engineering immunity
IL297018A (en) 2015-12-18 2022-12-01 Sangamo Therapeutics Inc Directed cleavage of cell mhc receptor
AU2016369490C1 (en) 2015-12-18 2021-12-23 Sangamo Therapeutics, Inc. Targeted disruption of the T cell receptor
CA3010738A1 (en) 2016-01-15 2017-07-20 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for the treatment of neurologic disease
AU2016391970B2 (en) 2016-02-02 2024-02-22 Sangamo Therapeutics, Inc. Compositions for linking DNA-binding domains and cleavage domains
EP3417061B1 (en) 2016-02-18 2022-10-26 The Regents of the University of California Methods and compositions for gene editing in stem cells
JP2019515654A (ja) 2016-03-16 2019-06-13 ザ ジェイ． デヴィッド グラッドストーン インスティテューツ 肥満及び／又は糖尿病を処置するための方法及び組成物、並びに候補処置薬剤を識別するための方法及び組成物
WO2017165655A1 (en) * 2016-03-23 2017-09-28 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods for enhancing the efficiency of gene editing
EP3443075B1 (en) 2016-04-15 2022-09-28 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Transgenic t cell and chimeric antigen receptor t cell compositions and related methods
EP4219731A3 (en) 2016-05-18 2023-08-09 Amyris, Inc. Compositions and methods for genomic integration of nucleic acids into exogenous landing pads
SG10201913948PA (en) 2016-08-24 2020-03-30 Sangamo Therapeutics Inc Engineered target specific nucleases
MY193234A (en) 2016-08-24 2022-09-27 Sangamo Therapeutics Inc Regulation of gene expression using engineered nucleases
US10960085B2 (en) * 2016-09-07 2021-03-30 Sangamo Therapeutics, Inc. Modulation of liver genes
EP3528852A4 (en) 2016-10-20 2020-06-03 Sangamo Therapeutics, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF FABRY'S DISEASE
WO2018081775A1 (en) 2016-10-31 2018-05-03 Sangamo Therapeutics, Inc. Gene correction of scid-related genes in hematopoietic stem and progenitor cells
WO2018112282A1 (en) 2016-12-14 2018-06-21 Ligandal, Inc. Compositions and methods for nucleic acid and/or protein payload delivery
AU2018256877B2 (en) 2017-04-28 2022-06-02 Acuitas Therapeutics, Inc. Novel carbonyl lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids
CA3059793A1 (en) 2017-05-03 2018-11-08 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for modification of a cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (cftr) gene
US11512287B2 (en) 2017-06-16 2022-11-29 Sangamo Therapeutics, Inc. Targeted disruption of T cell and/or HLA receptors
KR20200079539A (ko) 2017-11-09 2020-07-03 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 시토카인 유도성 sh2-함유 단백질 (cish) 유전자의 유전자 변형
CN111954540A (zh) 2018-02-08 2020-11-17 桑格摩生物治疗股份有限公司 工程化靶标特异性核酸酶
SG11202007697VA (en) 2018-02-15 2020-09-29 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Foxp3 targeting agent compositions and methods of use for adoptive cell therapy
CN111885915B (zh) 2018-03-19 2023-04-28 瑞泽恩制药公司 使用crispr/cas系统对动物进行转录调制
SG11202009313VA (en) 2018-04-05 2020-10-29 Juno Therapeutics Inc Methods of producing cells expressing a recombinant receptor and related compositions
SG11202009446TA (en) 2018-04-05 2020-10-29 Juno Therapeutics Inc T cells expressing a recombinant receptor, related polynucleotides and methods
EP3781677A4 (en) 2018-04-16 2022-01-19 University of Massachusetts COMPOSITIONS AND METHODS FOR IMPROVED GENE EDITTING
JP7332622B2 (ja) 2018-04-18 2023-08-23 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド ハンチンチン（ｈｔｔ）の調節のためのジンクフィンガータンパク質組成物
US11690921B2 (en) 2018-05-18 2023-07-04 Sangamo Therapeutics, Inc. Delivery of target specific nucleases
JP2021536229A (ja) 2018-08-23 2021-12-27 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド 操作された標的特異的な塩基エディター
US20220098613A1 (en) 2018-09-12 2022-03-31 Fred Hutchinson Cancer Research Center Reducing cd33 expression to selectively protect therapeutic cells
CN113015741A (zh) 2018-09-18 2021-06-22 桑格摩生物治疗股份有限公司 程序性细胞死亡1(pd1)特异性核酸酶
WO2020069029A1 (en) 2018-09-26 2020-04-02 Emendobio Inc. Novel crispr nucleases
US20200268906A1 (en) 2018-10-18 2020-08-27 Intellia Therapeutics, Inc. Nucleic acid constructs and methods of use
EP3886869A4 (en) 2018-11-28 2022-07-06 Forty Seven, Inc. GENETICALLY MODIFIED CSPH RESISTANT TO ABLATIVE TREATMENT
CN113474328A (zh) 2019-01-11 2021-10-01 爱康泰生治疗公司 用于脂质纳米颗粒递送活性剂的脂质
WO2020163379A1 (en) 2019-02-05 2020-08-13 Emendobio Inc. Crispr compositions and methods for promoting gene editing of ribosomal protein s19 (rps19) gene
US20220154157A1 (en) 2019-02-06 2022-05-19 Emendobio Inc. New engineered high fidelity cas9
US20220145330A1 (en) 2019-02-10 2022-05-12 The J. David Gladstone Institutes, a testamentary trust established under the Will of J. David Glads Modified mitochondrion and methods of use thereof
KR20210148154A (ko) 2019-04-03 2021-12-07 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 세이프 하버 좌위 내로의 항체 코딩 서열의 삽입을 위한 방법 및 조성물
BR112021021075A2 (pt) 2019-05-01 2021-12-14 Editas Medicine Inc Células que expressam um receptor recombinante de um locus de tgfbr2 modificado, polinucleotídeos relacionados e métodos
MX2021013223A (es) 2019-05-01 2022-02-17 Juno Therapeutics Inc Celulas que expresan un receptor quimerico de un locus cd247 modificado, polinucleotidos relacionados y metodos.
EP3987024A4 (en) 2019-06-20 2023-11-01 University Of Massachusetts COMPOSITIONS AND METHODS FOR IMPROVED GENE EDITING
CN114729383A (zh) 2019-07-02 2022-07-08 弗莱德哈钦森癌症研究中心 重组ad35载体及相关基因疗法改进
WO2021072115A1 (en) 2019-10-08 2021-04-15 Regents Of The University Of Minnesota Crispr-mediated human genome editing with vectors
EP4054651A1 (en) 2019-11-08 2022-09-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr and aav strategies for x-linked juvenile retinoschisis therapy
US20230102342A1 (en) 2020-03-23 2023-03-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized ttr locus comprising a v30m mutation and methods of use
EP4150057A2 (en) 2020-05-13 2023-03-22 Juno Therapeutics, Inc. Process for producing donor-batched cells expressing a recombinant receptor
EP4153739A1 (en) 2020-05-21 2023-03-29 Oxford Genetics Limited Hdr enhancers
EP4153741A1 (en) 2020-05-21 2023-03-29 Oxford Genetics Limited Hdr enhancers
GB202007578D0 (en) 2020-05-21 2020-07-08 Univ Oxford Innovation Ltd Hdr enhancers
GB202007577D0 (en) 2020-05-21 2020-07-08 Oxford Genetics Ltd Hdr enhancers
EP4171616A1 (en) 2020-06-26 2023-05-03 Juno Therapeutics GmbH Engineered t cells conditionally expressing a recombinant receptor, related polynucleotides and methods
US20230374483A1 (en) 2020-07-08 2023-11-23 Regents Of The University Of Minnesota Modified hexosaminidase and uses thereof
EP4182297A1 (en) 2020-07-16 2023-05-24 Acuitas Therapeutics, Inc. Cationic lipids for use in lipid nanoparticles
KR20230090367A (ko) 2020-11-04 2023-06-21 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 변형된 불변 cd3 이뮤노글로불린 슈퍼패밀리 쇄 유전자좌로부터 키메라 수용체를 발현하는 세포 및 관련 폴리뉴클레오티드 및 방법
WO2022190058A1 (en) 2021-03-12 2022-09-15 Dcprime B.V. Methods of vaccination and use of cd47 blockade
TW202305118A (zh) 2021-03-23 2023-02-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 腫瘤浸潤淋巴球之ｃｉｓｈ基因編輯及其在免疫療法中之用途
WO2023081756A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone Precise genome editing using retrons
WO2023081900A1 (en) 2021-11-08 2023-05-11 Juno Therapeutics, Inc. Engineered t cells expressing a recombinant t cell receptor (tcr) and related systems and methods
WO2023141602A2 (en) 2022-01-21 2023-07-27 Renagade Therapeutics Management Inc. Engineered retrons and methods of use
WO2023150620A1 (en) 2022-02-02 2023-08-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr-mediated transgene insertion in neonatal cells
WO2023150798A1 (en) 2022-02-07 2023-08-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for defining optimal treatment timeframes in lysosomal disease
WO2023150393A2 (en) 2022-02-07 2023-08-10 Ensoma, Inc. Inhibitor-resistant mgmt modifications and modification of mgmt-encoding nucleic acids
US20230257432A1 (en) 2022-02-11 2023-08-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for screening 4r tau targeting agents
WO2023220040A1 (en) 2022-05-09 2023-11-16 Synteny Therapeutics, Inc. Erythroparvovirus with a modified capsid for gene therapy
WO2023220043A1 (en) 2022-05-09 2023-11-16 Synteny Therapeutics, Inc. Erythroparvovirus with a modified genome for gene therapy
WO2023220035A1 (en) 2022-05-09 2023-11-16 Synteny Therapeutics, Inc. Erythroparvovirus compositions and methods for gene therapy
WO2024026474A1 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for transferrin receptor (tfr)-mediated delivery to the brain and muscle
WO2024044723A1 (en) 2022-08-25 2024-02-29 Renagade Therapeutics Management Inc. Engineered retrons and methods of use
WO2024073606A1 (en) 2022-09-28 2024-04-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Antibody resistant modified receptors to enhance cell-based therapies
US20240182561A1 (en) 2022-11-04 2024-06-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Calcium voltage-gated channel auxiliary subunit gamma 1 (cacng1) binding proteins and cacng1-mediated delivery to skeletal muscle
WO2024100604A1 (en) 2022-11-09 2024-05-16 Juno Therapeutics Gmbh Methods for manufacturing engineered immune cells
WO2024107765A2 (en) 2022-11-14 2024-05-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for fibroblast growth factor receptor 3-mediated delivery to astrocytes

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1348335A1 (en) * 2002-03-28 2003-10-01 Boehringer Ingelheim International GmbH Non-human transgenic mammals and their use as a disease model
CN1622993A (zh) * 2002-01-23 2005-06-01 犹他大学研究基金会 使用锌指核酸酶的定向染色体诱变

Family Cites Families (67)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4217344A (en) 1976-06-23 1980-08-12 L'oreal Compositions containing aqueous dispersions of lipid spheres
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4186183A (en) 1978-03-29 1980-01-29 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Liposome carriers in chemotherapy of leishmaniasis
US4261975A (en) 1979-09-19 1981-04-14 Merck & Co., Inc. Viral liposome particle
US4485054A (en) 1982-10-04 1984-11-27 Lipoderm Pharmaceuticals Limited Method of encapsulating biologically active materials in multilamellar lipid vesicles (MLV)
US4501728A (en) 1983-01-06 1985-02-26 Technology Unlimited, Inc. Masking of liposomes from RES recognition
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4946787A (en) 1985-01-07 1990-08-07 Syntex (U.S.A.) Inc. N-(ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US5049386A (en) 1985-01-07 1991-09-17 Syntex (U.S.A.) Inc. N-ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)Alk-1-YL-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4774085A (en) 1985-07-09 1988-09-27 501 Board of Regents, Univ. of Texas Pharmaceutical administration systems containing a mixture of immunomodulators
US5422251A (en) 1986-11-26 1995-06-06 Princeton University Triple-stranded nucleic acids
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5176996A (en) 1988-12-20 1993-01-05 Baylor College Of Medicine Method for making synthetic oligonucleotides which bind specifically to target sites on duplex DNA molecules, by forming a colinear triplex, the synthetic oligonucleotides and methods of use
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
WO1991017424A1 (en) 1990-05-03 1991-11-14 Vical, Inc. Intracellular delivery of biologically active substances by means of self-assembling lipid complexes
US5420032A (en) 1991-12-23 1995-05-30 Universitge Laval Homing endonuclease which originates from chlamydomonas eugametos and recognizes and cleaves a 15, 17 or 19 degenerate double stranded nucleotide sequence
US5487994A (en) 1992-04-03 1996-01-30 The Johns Hopkins University Insertion and deletion mutants of FokI restriction endonuclease
US5356802A (en) 1992-04-03 1994-10-18 The Johns Hopkins University Functional domains in flavobacterium okeanokoites (FokI) restriction endonuclease
US5436150A (en) 1992-04-03 1995-07-25 The Johns Hopkins University Functional domains in flavobacterium okeanokoities (foki) restriction endonuclease
US5792632A (en) 1992-05-05 1998-08-11 Institut Pasteur Nucleotide sequence encoding the enzyme I-SceI and the uses thereof
US6140466A (en) 1994-01-18 2000-10-31 The Scripps Research Institute Zinc finger protein derivatives and methods therefor
ATE310812T1 (de) 1994-01-18 2005-12-15 Scripps Research Inst Derivate von zinkfingerproteinen und methoden
US6242568B1 (en) 1994-01-18 2001-06-05 The Scripps Research Institute Zinc finger protein derivatives and methods therefor
ATE410518T1 (de) 1994-03-23 2008-10-15 Univ Ohio Kompaktnukleinsäure und ihre verabreichung in zellen
US5585245A (en) 1994-04-22 1996-12-17 California Institute Of Technology Ubiquitin-based split protein sensor
ATE407205T1 (de) 1994-08-20 2008-09-15 Gendaq Ltd Verbesserung in bezug auf bindungsproteine bei der erkennung von dna
GB9824544D0 (en) 1998-11-09 1999-01-06 Medical Res Council Screening system
US5789538A (en) 1995-02-03 1998-08-04 Massachusetts Institute Of Technology Zinc finger proteins with high affinity new DNA binding specificities
US5925523A (en) 1996-08-23 1999-07-20 President & Fellows Of Harvard College Intraction trap assay, reagents and uses thereof
GB2338237B (en) 1997-02-18 2001-02-28 Actinova Ltd In vitro peptide or protein expression library
GB9703369D0 (en) 1997-02-18 1997-04-09 Lindqvist Bjorn H Process
US6342345B1 (en) 1997-04-02 2002-01-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Detection of molecular interactions by reporter subunit complementation
GB9710809D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
GB9710807D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
US6410248B1 (en) 1998-01-30 2002-06-25 Massachusetts Institute Of Technology General strategy for selecting high-affinity zinc finger proteins for diverse DNA target sites
AU746454B2 (en) 1998-03-02 2002-05-02 Massachusetts Institute Of Technology Poly zinc finger proteins with improved linkers
US6140081A (en) 1998-10-16 2000-10-31 The Scripps Research Institute Zinc finger binding domains for GNN
US6534261B1 (en) 1999-01-12 2003-03-18 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US7013219B2 (en) 1999-01-12 2006-03-14 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US6453242B1 (en) 1999-01-12 2002-09-17 Sangamo Biosciences, Inc. Selection of sites for targeting by zinc finger proteins and methods of designing zinc finger proteins to bind to preselected sites
US6599692B1 (en) 1999-09-14 2003-07-29 Sangamo Bioscience, Inc. Functional genomics using zinc finger proteins
EP1147209A2 (en) * 1999-02-03 2001-10-24 The Children's Medical Center Corporation Gene repair involving the induction of double-stranded dna cleavage at a chromosomal target site
US6794136B1 (en) 2000-11-20 2004-09-21 Sangamo Biosciences, Inc. Iterative optimization in the design of binding proteins
US7257541B1 (en) 1999-10-08 2007-08-14 I2 Technologies Us, Inc. System and method for performing a business process in a multi-enterprise, collaborating network
CA2394850C (en) 1999-12-06 2012-02-07 Sangamo Biosciences, Inc. Methods of using randomized libraries of zinc finger proteins for the identification of gene function
DE60143192D1 (de) 2000-02-08 2010-11-18 Sangamo Biosciences Inc Zellen zur entdeckung von medikamenten
US20020061512A1 (en) 2000-02-18 2002-05-23 Kim Jin-Soo Zinc finger domains and methods of identifying same
WO2001088197A2 (en) 2000-05-16 2001-11-22 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for interaction trap assays
JP2002060786A (ja) 2000-08-23 2002-02-26 Kao Corp 硬質表面用殺菌防汚剤
GB0108491D0 (en) 2001-04-04 2001-05-23 Gendaq Ltd Engineering zinc fingers
JP2005500061A (ja) 2001-08-20 2005-01-06 ザ スクリップス リサーチ インスティテュート Ｃｎｎについての亜鉛フィンガー結合ドメイン
US20030232410A1 (en) * 2002-03-21 2003-12-18 Monika Liljedahl Methods and compositions for using zinc finger endonucleases to enhance homologous recombination
US6793480B2 (en) * 2002-07-01 2004-09-21 John Dominka Shutoff valve assembly
AU2003298574B2 (en) 2002-09-05 2008-04-24 California Institute Of Technology Use of chimeric nucleases to stimulate gene targeting
US7888121B2 (en) 2003-08-08 2011-02-15 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
US8409861B2 (en) 2003-08-08 2013-04-02 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted deletion of cellular DNA sequences
US7972854B2 (en) 2004-02-05 2011-07-05 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
CA2579677A1 (en) 2004-09-16 2006-03-30 Sangamo Biosciences, Inc. Compositions and methods for protein production
EP1913149A4 (en) 2005-07-26 2009-08-05 Sangamo Biosciences Inc TARGETED INTEGRATION AND EXPRESSION OF EXOGENOUS NUCLEIC ACID SEQUENCES
CA2650414A1 (en) 2006-05-19 2007-11-29 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for inactivation of dihydrofolate reductase
ES2378333T3 (es) 2006-05-25 2012-04-11 Sangamo Biosciences, Inc. Métodos y composiciones para la inactivación de genes
WO2007139898A2 (en) 2006-05-25 2007-12-06 Sangamo Biosciences, Inc. Variant foki cleavage half-domains
ATE489465T1 (de) 2007-04-26 2010-12-15 Sangamo Biosciences Inc Gezielte integration in die ppp1r12c-position
DK2602323T3 (en) * 2007-06-01 2018-04-16 Open Monoclonal Tech Inc Compositions and Methods for Inhibiting Endogenous Immunoglobin Genes and Producing Transgenic Human Idiotypic Antibodies
WO2009042164A1 (en) * 2007-09-27 2009-04-02 Dow Agrosciences Llc Engineered zinc finger proteins targeting 5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase genes
AU2008305567B2 (en) 2007-09-27 2014-04-10 Sangamo Therapeutics, Inc. Rapid in vivo identification of biologically active nucleases
EP3156494B8 (en) * 2008-12-04 2018-09-19 Sangamo Therapeutics, Inc. Genome editing in rats using zinc-finger nucleases

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1622993A (zh) * 2002-01-23 2005-06-01 犹他大学研究基金会 使用锌指核酸酶的定向染色体诱变
EP1348335A1 (en) * 2002-03-28 2003-10-01 Boehringer Ingelheim International GmbH Non-human transgenic mammals and their use as a disease model

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DOYON Y ，ET AL: "Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zinc-finger nucleases", 《NATURE BIOTECHNOLOGY,NATURE PUBLISHING GROUP,NEW YORK,NY,US》 *
FYODOR D.URNOV 等: "Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases", 《NATURE》 *
张余洋 等: "利用人工锌指蛋白核酸酶进行植物基因定点突变和置换", 《中国生物工程杂志》 *

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105308184A (zh) * 2013-04-16 2016-02-03 瑞泽恩制药公司 大鼠基因组的靶向修饰
CN107429241A (zh) * 2014-08-14 2017-12-01 北京百奥赛图基因生物技术有限公司 Dna敲入系统
US11071289B2 (en) 2014-08-14 2021-07-27 Biocytogen Boston Corp DNA knock-in system
CN107109434A (zh) * 2014-10-23 2017-08-29 瑞泽恩制药公司 新颖cho整合位点和其用途
US11268109B2 (en) 2014-10-23 2022-03-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. CHO integration sites and uses thereof
US11788102B2 (en) 2014-10-23 2023-10-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. CHO integration sites and uses thereof
CN104450785A (zh) * 2014-12-08 2015-03-25 复旦大学 使用编码靶向核酸内切酶附着体载体的基因组编辑方法及试剂盒
CN107406842A (zh) * 2015-01-09 2017-11-28 生物辐射实验室股份有限公司 检测基因组编辑
CN107406842B (zh) * 2015-01-09 2021-05-11 生物辐射实验室股份有限公司 检测基因组编辑
CN114891772A (zh) * 2022-05-27 2022-08-12 湖南福来格生物技术有限公司 一种去乙酰基酶突变体及其应用
CN114891772B (zh) * 2022-05-27 2023-07-14 湖南福来格生物技术有限公司 一种去乙酰基酶突变体及其应用
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