CN116083487A - 用于治疗遗传病状的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

提供用于细胞的遗传改变的方法和组合物。

Description

用于治疗遗传病状的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年5月15日提交的美国临时申请号61/823,689的权益，所述美国临时申请的公开内容据此以引用的方式整体并入本文。
技术领域
本公开属于基因组工程领域。
背景
基因疗法对于实现人类医学的新纪元来说持有巨大潜力。这些方法将允许治疗迄今为止尚未可通过标准医学实践解决的病状。尤其有前途的一个领域是能够遗传工程改造细胞以使该细胞表达先前尚未在该细胞中产生的产物。使用这个技术的实例包括插入编码新型治疗性蛋白质的转基因、插入编码在细胞中或在个体中缺乏的蛋白质的编码序列、在含有突变基因序列的细胞中插入野生型基因、以及插入编码结构核酸(如微小RNA或siRNA)的序列。
为迎接对粮食产量的全球性需求日益增加的挑战，许多有效用以改进农业生产率(例如增强产率或工程改造害虫抗性)的方法依赖于突变育种或通过转化将新型基因引入作物物种的基因组中。两种方法均固有地是非特异性的以及相对低效的。举例来说，常规植物转化方法递送外源性DNA，其在随机位置处整合至基因组中。这些方法的随机性质使得必需产生以及筛选每个构建体的数百个独特随机整合事件以鉴定和分离具有合乎需要属性的转基因株系。此外，常规转化方法产生关于转基因评估的若干挑战，包括：(a)难以预测是否已发生归因于非故意基因组破坏的多效性效应；以及(b)难以比较不同调控元件和转基因设计在单一转基因候选物内的影响，因为此类比较因随机整合至基因组中而复杂。因此，常规植物性状工程改造是艰巨且成本密集性过程，具有低成功概率。
精确基因修饰克服在植物系统中进行常规实践的逻辑挑战，并且因此已成为基础植物生物学研究与农业生物技术两者中的长期但难以捉摸的目标。然而，除通过在稻中阳性-阴性药物选择或使用预先工程改造的限制位点进行的“基因靶向”之外，在所有植物物种(模型与作物两者)中的靶向基因组修饰直到最近都已被证明极其困难。Terada等(2002)Nat Biotechnol 20(10):1030；Terada等(2007)Plant Physiol 144(2):846；D'Halluin等(2008)Plant Biotechnology J.6(1):93。
转基因(或性状)堆积对于产生植物来说具有极大潜力，但已被证明是困难的。参见例如Halpin(2005)Plant Biotechnology Journal3:141-155。此外，多倍性(其中生物体具有两组或更多组复制(同源倍体)或相关(异源倍体)的成对染色体组)在植物物种中比在动物中更常存在。举例来说，小麦具有是二倍体(两组染色体)、四倍体(四组染色体)和六倍体(六组染色体)的株系。此外，芸苔属(Brassica)的许多在农业上重要的植株也是异源四倍体。
转基因可通过多种方式递送至细胞中，以使转基因变为整合至细胞的自身基因组中，并且得以在其中维持。近年来，已开发一种用于转基因整合的策略，其使用用位点特异性核酸酶进行的裂解以靶向插入所选基因组基因座中(参见例如共同拥有的美国专利7,888,121)。可利用对靶向基因具有特异性的核酸酶以使通过同源性定向修复(HDR)或通过在非同源末端连接(NHEJ)驱动过程期间的末端捕获来插入转基因构建体。靶向基因座包括“安全港(safe harbor)”基因座，如人细胞中的AAVS1、HPRT和CCR5基因以及鼠类细胞中的Rosa26(参见例如美国专利号7,888,121；7,972,854；7,914,796；7,951,925；8,110,379；8,409,861；8,586,526；美国专利公布20030232410；20050208489；20050026157；20060063231；20080159996；201000218264；20120017290；20110265198；20130137104；20130122591；20130177983和20130177960)和植物中的Zp15基因座(参见美国专利U.S.8,329,986)。相较于依赖于转基因的随机整合的经典整合方法，核酸酶介导的整合提供转基因表达改进、安全性和表达耐久性增加的前景，因为它允许精确转基因定位以使基因沉默或邻近致癌基因活化的风险最小。
除上述插入方法之外，基因组工程改造也可包括基因敲除。在不存在供体核酸下，基因组被裂解的细胞将借助易出错的NHEJ路径来愈合断裂。这个过程常在修复过程期间添加或缺失核苷酸(“插入缺失”)，此可导致在靶位点处引入错义或无义突变。举例来说，CCR5特异性锌指核酸酶正用于I/II期试验中以产生非功能性CCR5受体，并且因此预防HIV感染(参见美国专利7,951,925)。
可通过使用工程改造的核酸酶在所需位置处获得靶向核酸酶介导的基因组裂解。举例来说，可通过位点特异性核酸酶，如锌指核酸酶(ZFN)或TAL效应物结构域核酸酶(TALEN)来产生双链断裂(DSB)。参见例如Urnov等(2010)Nature 435(7042):646-51；美国专利号8,586,526；6,534,261；6,599,692；6,503,717；6,689,558；7,067,317；7,262,054，其公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
另一核酸酶系统涉及使用见于细菌和古细菌中的称为CRISPR/Cas系统的所谓获得性免疫系统。CRISPR/Cas系统见于40％的细菌和90％的古细菌中，并且在它们的系统的复杂性方面有差异。参见例如美国专利号8,697,359。CRISPR基因座(clustered regularlyinterspaced short palindromic repeat(成簇规律间隔的短回文重复序列))是生物体的基因组内的区域，其中可将外来DNA的短区段整合在短重复回文序列之间。这些基因座被转录，并且RNA转录物(“前crRNA”)被加工成短CRISPR RNA(crRNA)。存在三种类型的CRISPR/Cas系统，其全都包含这些RNA和称为“Cas”蛋白(CRISPR associated(CRISPR相关))的蛋白质。I型与III型两者均具有加工前crRNA的Cas核酸内切酶，所述前crRNA在被完全加工成crRNA时装配能够裂解与crRNA互补的核酸的多Cas蛋白质复合物。
在II型系统中，使用不同机制产生crRNA，其中与前crRNA中的重复序列互补的反式活化RNA(tracrRNA)触发由双链特异性RNA酶III在Cas9蛋白存在下进行加工。Cas9接着能够裂解与成熟crRNA互补的靶DNA，然而，由Cas 9进行的裂解依赖于crRNA与靶DNA之间的碱基配对以及crRNA中存在被称为PAM序列(protospacer adjacent motif(前间区序列邻近基序))的短基序两者(参见Qi等(2013)Cell 152:1173)。此外，tracrRNA也必须存在，因为它与crRNA在它的3’末端进行碱基配对，并且这个缔合触发Cas9活性。
Cas9蛋白具有至少两个核酸酶结构域：一个核酸酶结构域类似于HNH核酸内切酶，而另一个类似于Ruv核酸内切酶结构域。HNH型结构域似乎负责裂解与crRNA互补的DNA链，而Ruv结构域裂解非互补链。
可通过使用包含通常通过使crRNA和tracrRNA退火形成的发夹的工程改造的“单导向(single-guide)RNA”(sgRNA)来避免对crRNA-tracrRNA复合物的需要(参见Jinek等(2012)Science 337:816以及Cong等(2013)Sciencexpress/10.1126/science.1231143)。在化脓性链球菌(S.pyrogenes)中，当在Cas相关RNA与靶DNA之间形成双链RNA:DNA异二聚体时，工程改造的tracrRNA:crRNA融合物或sgRNA引导Cas9裂解靶DNA。包含Cas9蛋白和含有PAM序列的工程改造的sgRNA的这个系统已用于RNA引导的基因组编辑(参见Ramalingam(同上))，并且已适用于斑马鱼体内胚胎基因组编辑(参见Hwang等(2013)NatureBiotechnology 31(3):227)，其中编辑效率类似于ZFN和TALEN。
因此，仍然需要用于基因组编辑，包括用于治疗和/或预防疾病以及用于农业用途的系统。
概述
本文公开用于遗传修饰，例如用于治疗疾病或用于产生遗传修饰植物的方法和组合物。基因组编辑用于修正异常基因，插入野生型基因，或改变内源性基因的表达。可靶向一种或多种内源性基因用于基因组编辑，包括任何哺乳动物或植物基因。非限制性地举例来说，可将编码β球蛋白的野生型基因插入细胞的基因组中以治疗由缺陷型β球蛋白引起的血红蛋白病。在一些情况下，可将野生型基因插入安全港基因座中或已知在目标组织中高度表达的基因座(如红系细胞中的β球蛋白基因座)处。此处公开的另一方法涉及使用基因修正，其中靶向缺陷型内源性基因，并且使用工程改造的供体替换突变序列(例如用功能性序列替换突变体)。或者，可改变另一基因的调节中涉及的一种或多种调控基因，例如可改变或敲除基因的阻抑中涉及的调控基因以使通常受阻抑的基因现在被表达或不被表达，或改变基因的上游或基因座的其它区域中的调控结合位点以使调控子不能与基因座处的DNA适当相互作用，并且调控基因表达。另一方法还涉及使用修饰的干细胞(例如造血干细胞或红血细胞(RBC)前体)，其可接着用于移植到患者中以治疗血红蛋白病或其它疾病(例如遗传疾病)。
在一个方面，本文描述一种结合基因组中的内源性基因(例如内源性或安全港基因、或调控基因或它的DNA靶标)中的目标区域中的靶位点的CRISPR/Cas系统，其中所述CRISPR/Cas系统包含一种或多种识别靶基因和功能性结构域(例如转录调控结构域和/或核酸酶结构域)的工程改造的单导向RNA。
如本文所述的CRISPR/Cas系统可结合和/或裂解基因内或邻近于基因的编码或非编码区中的目标区域，例如像前导序列，尾随序列或内含子，或在编码区的上游或下游的非转录区域内。在某些实施方案中，CRISPR/Cas结合和/或裂解基因。在其它实施方案中，CRISPR/Cas结合和/或裂解安全港基因，例如哺乳动物细胞中的CCR5基因、PPP1R12C(也称为AAVS1)基因或Rosa基因以及植物中的Zp15基因座。PPP1R12C在它的编码序列中具有22个外显子，并且尤其优选的靶向位置在内含子1内(即在chr19：55624164-55624759处或附近)，使得能够插入无启动子转基因。此外，为有助于在哺乳动物系统中进行选择，可使用HPRT基因座(参见美国申请号13/660,821和13/660,843)。在一些实施方案中，CRISPR/Cas在调控元件处结合和裂解。在另一方面，本文描述包含一种或多种如本文所述的CRISPR/Cas核酸酶的组合物。
在一个方面，如所述的CRISPR/Cas系统可结合目标基因和/或调节目标基因的表达。在一个实施方案中，CRISPR/Cas系统结合DNA序列，并且阻止其它调控因子的结合。在另一实施方案中，CRISPR/Cas系统融合蛋白的结合可调节(即诱导或阻抑)靶DNA的表达。
在另一方面，描述一种编码一种或多种本文所述的CRISPR/Cas系统的多核苷酸。多核苷酸可为例如mRNA。在一些方面，mRNA可被化学修饰(参见例如Kormann等,(2011)Nature Biotechnology29(2):154-157)。
在另一方面，描述一种CRISPR/Cas系统表达载体，其包含可操作地连接于启动子的编码一种或多种本文所述的CRISPR/Cas组分的多核苷酸。在一个实施方案中，表达载体是病毒载体。在另一实施方案中，表达载体是DNA小环。
在一个方面，本文描述一种用于裂解靶DNA的Cas蛋白。
在另一方面，本文描述一种修饰内源性基因(例如调节所述内源性基因的表达)的方法，所述方法包括向细胞施用包含识别所述内源性基因中的靶位点的单导向RNA的第一核酸分子和编码功能性结构域的第二核酸分子，其中所述功能性结构域与所述靶位点上的所述单导向RNA缔合，由此修饰所述内源性基因。第一核酸和第二核酸可在同一或不同载体上。在某些实施方案中，内源性基因选自由以下组成的组：哺乳动物β球蛋白基因(HBB)、γ球蛋白基因(HBG1)、B细胞淋巴瘤/白血病11A(BCL11A)基因、Kruppel样因子1(KLF1)基因、CCR5基因、CXCR4基因、PPP1R12C(AAVS1)基因、次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)基因、白蛋白基因、因子VIII基因、因子IX基因、富含亮氨酸的重复序列激酶2(LRRK2)基因、亨廷顿蛋白(Hungtingin，Htt)基因、视紫红质(RHO)基因、囊性纤维化跨膜传导调控子(CFTR)基因、表面活性蛋白B基因(SFTPB)、T细胞受体α(TRAC)基因、T细胞受体β(TRBC)基因、程序性细胞死亡1(PD1)基因、细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)基因、人白细胞抗原(HLA)A基因、HLA B基因、HLA C基因、HLA-DPA基因、HLA-DQ基因、HLA-DRA基因、LMP7基因、与抗原加工相关的转运体(TAP)1基因、TAP2基因、TAP相关蛋白基因(TAPBP)、II类主要组织相容性复合物反式活化子(CIITA)基因、肌营养不良蛋白(dystrophin)基因(DMD)、糖皮质素受体基因(GR)、IL2RG基因、RFX5基因、FAD2基因、FAD3基因、ZP15基因、KASII基因、MDH基因和/或EPSPS基因。
在任何本文所述的方法和组合物中，细胞可为任何真核细胞，例如植物细胞或哺乳动物细胞或细胞系(包括COS、CHO(例如CHO-S、CHO-K1、CHO-DG44、CHO-DUXB11、CHO-DUKX、CHOK1SV)、VERO、MDCK、WI38、V79、B14AF28-G3、BHK、HaK、NS0、SP2/0-Ag14、HeLa、HEK293(例如，HEK293-F、HEK293-H、HEK293-T)和perC6细胞)以及昆虫细胞(如草地夜蛾(Spodopterafugiperda，Sf))或真菌细胞(如酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)和裂殖酵母属(Schizosaccharomyces))。在某些实施方案中，细胞系是CHO、MDCK或HEK293细胞系。也可如本文所述编辑原代细胞，包括但不限于成纤维细胞、血细胞(例如红血细胞、白血细胞)、肝细胞、肾细胞、神经细胞等。合适的细胞也包括干细胞，如(举例来说)胚胎干细胞、诱导多能干细胞(iPSC)、造血干细胞、神经元干细胞和间质干细胞。在其它方面，遗传修饰的血细胞前体(称为“HSC”的造血干细胞)被供给于骨髓移植物中，并且HSC在体内分化以及成熟。
在其它方面，遗传修饰的RBC前体和/或造血干细胞(HSC)被供给于骨髓移植物中，并且RBC在体内分化以及成熟。在一些实施方案中，在G-CSF诱导的动员之后，从外周血液分离HSC，而在其它实施方案中，从人骨髓或脐带血分离细胞。在一些方面，通过用被设计以敲除特定基因或调控序列的核酸酶处理来编辑HSC。在其它方面，HSC用工程改造的核酸酶和供体核酸修饰以使野生型基因得以插入和表达和/或内源性异常基因得以修正。在一些实施方案中，插入和表达工程改造的基因。在一些实施方案中，在轻度清髓性预调节之后向患者施用修饰的HSC。在其它方面，在完全清髓之后施用HSC以使在移入之后，大多数造血细胞源于新移植的修饰的HSC群体。
在一个方面，本发明包括突变的Cas核酸酶。在一些实施方案中，突变体Cas核酸酶是Cas9核酸酶，并且具有改变的功能性。在一些实施方案中，使Cas9蛋白在HNH结构域中突变，从而致使它不能裂解与crRNA互补的DNA链。在其它实施方案中，使Cas9在Rvu结构域中突变，从而使得它不能裂解非互补DNA链。这些突变可导致产生Cas9切口酶。在一些实施方案中，两种Cas切口酶与两种单独crRNA一起用于靶向DNA，此在靶DNA中产生相隔指定距离的两个切口。在其它实施方案中，HNH与Rvu核酸内切酶结构域两者均被改变以致使Cas9蛋白不能裂解靶DNA。
在另一方面，本发明的方法和组合物包括Cas9蛋白的截短形式。在一个实施方案中，将Cas9蛋白截短以使一个或多个Cas9功能性结构域被移除。在一个实施方案中，移除核酸酶结构域中的部分或一个致使Cas核酸酶成为切口酶。在一个实施方案中，Cas9仅包含负责与crRNA或sgRNA和靶DNA相互作用的结构域。
在其它方面，本发明的方法和组合物也包括其中Cas9蛋白或其截短形式融合于功能性结构域的融合蛋白。在一些方面，功能性结构域是活化或阻抑结构域。在其它方面，功能性结构域是核酸酶结构域。在一些实施方案中，核酸酶结构域是FokI核酸内切酶结构域(例如Tsai(2014)Nature Biotech doi:10.1038/nbt.2908)。在一些实施方案中，FokI结构域在二聚化结构域中包含突变。
在另一方面，本文描述一种用于将序列插入细胞(例如干细胞)中的内源性基因(例如安全港基因)中的方法，所述方法包括使用一种或多种核酸酶裂解所述内源性基因，以及将序列插入裂解位点中。在某些实施方案中，例如使用如本文所述的CRISPR/Cas系统(或编码所述CRIPSR/Cas系统的载体)和在靶向裂解之后插入基因中的“供体”序列(也称为“转基因”)来替换任何靶基因中的基因组序列。供体序列可存在于CRISPR/Cas载体中，存在于单独载体(例如Ad、AAV、DNA小环或LV载体)中，或替代地，可使用不同核酸递送机制引入细胞中。举例来说，可通过电穿孔将编码Cas核酸酶蛋白的mRNA与所需sgRNA一起引入细胞中。供体核苷酸序列向靶基因座(例如安全港基因)中的此类插入导致转基因在靶基因座的遗传控制元件的控制下表达。在一些实施方案中，转基因编码非编码RNA(例如shRNA)。在干细胞分化之前表达转基因将产生含有目标非编码RNA的衍生细胞。
在一些实施方案中，本发明的方法和组合物在植物细胞中执行和/或包括植物细胞。在一些方面，植物细胞是分生细胞。在一些实施方案中，植物细胞包含本发明的核酸酶。在其它实施方案中，植物细胞另外包含转基因。在另一方面，本文描述一种用于将一个或多个外源性序列引入植物细胞的基因组中的方法，所述方法包括以下步骤：(a)使所述细胞与所述一个或多个外源性序列(供体载体、转基因或GOI)接触；以及(b)在所述细胞中表达一种或多种如本文所述的核酸酶(例如CRISPR/Cas系统)，其中所述一种或多种核酸酶裂解染色体DNA；以使步骤(b)中对染色体DNA的裂解刺激供体载体通过同源重组并入基因组中。多个转基因可被同时(并行)整合，或可重复步骤以依序添加转基因(转基因堆积)。
在其它实施方案中，转基因包括功能性蛋白质，例如球蛋白(例如野生型β和/或野生型γ)。在其它实施方案中，转基因编码用于产生具有合乎需要的性质的新型蛋白质的工程改造的基因。在一些实施方案中，向内源性基因中插入目标转基因导致表达完整外源性蛋白质序列，并且缺乏由内源性基因编码的任何序列。在其它实施方案中，表达的外源性蛋白质是融合蛋白，并且包含由转基因以及由内源性基因(例如来自内源性靶基因座)编码的氨基酸。当存在时，内源性序列可存在于外源性蛋白质的氨基(N)末端部分和/或外源性蛋白质的羧基(C)末端部分上。在一些方面，安全港选自AAVS1、Rosa、HPRT、Zp15或CCR5基因座(参见美国专利公布号20080299580；20080159996；和201000218264以及美国申请号13/660,821和13/660,843以及美国专利8,329,986)。
在另一方面，本文提供基因组修饰的细胞系和/或转基因生物体，如动物模型(系统)。在一些实施方案中，转基因细胞和/或生物体(例如动物)包括编码人基因的转基因。在一些情况下，转基因动物在对应于外源性转基因的内源性基因座处包含敲除，由此允许开发其中人蛋白质可被单独研究的体内系统。此类转基因模型可出于筛选目的用于鉴定可与目标人蛋白质相互作用或修饰目标人蛋白质的小分子或大生物分子或其它实体。在一些实施方案中，本发明的细胞系用于药物开发中针对活性筛选的基于细胞的测定中，而在其它实施方案中，细胞系用于诊断测定中。在一些方面，可将转基因整合至通过任何本文所述的方法获得的干细胞(例如胚胎干细胞、诱导多能干细胞、造血干细胞等)或动物胚胎中的所选基因座(例如安全港)中，接着植入胚胎以使活动物出生。接着饲养动物直至性成熟，并且使其产生后代，其中至少一些后代包含编辑的内源性基因序列或整合的转基因。
在另一方面，也提供根据任何本文所述的方法获得的细胞(例如植物或哺乳动物细胞)。
在另一方面，本文提供一种包含如本文所述的细胞(例如植物或动物)的生物体(例如植物或动物)。
在另一方面，本文提供一种来自包含如本文所述获得的植物细胞的植物的种子。
在另一方面，本文提供从包含如本文所述获得的植物细胞的植物获得的果实。
在任何本文所述的组合物(细胞或植物)或方法中，植物细胞可包括单子叶或双子叶植物细胞。在某些实施方案中，植物细胞是作物植株，例如小麦、番茄(或其它果实作物)、马铃薯、玉米、大豆、苜蓿等。
在另一方面，本文提供一种用于使核酸序列位点特异性整合至染色体的内源性基因座(例如安全港基因)中(例如整合至胚胎的染色体中)的方法。在某些实施方案中，该方法包括：(a)用(i)至少一种DNA载体，其中所述DNA载体包含侧接待整合的核酸序列的上游序列和下游序列，和(ii)至少一种编码识别靶基因座(例如球蛋白或安全港基因座)中的整合位点的CRISPR/Cas系统核酸酶的RNA分子注射胚胎，以及(b)培养所述胚胎以允许表达所述CRISPR/Cas系统核酸酶，其中由所述CRISPR/Cas系统核酸酶引入整合位点中的双链断裂通过与所述DNA载体的同源重组被修复以便使核酸序列整合至染色体中。
在任何本文所述的方法中，编码CRISPR/Cas系统的多核苷酸可包括DNA、RNA或其组合。在某些实施方案中，多核苷酸包括质粒。在其它实施方案中，编码核酸酶的多核苷酸包括mRNA。
也提供一种包括本发明的CRISPR/Cas系统的试剂盒。试剂盒可包括编码CRISPR/Cas系统的核酸(例如含于合适的表达载体中的RNA分子或CRISPR/Cas系统编码基因)、或核酸酶蛋白质的等分试样、供体分子、合适的宿主细胞系、用于执行本发明方法的说明书等。
这些和其它方面将易于为熟练技术人员鉴于整体公开内容显而易见。
详细描述
本文公开用于基因组工程改造，包括用以研究和治疗疾病或用于产生具有合乎需要的性状的植物的基因组工程改造的方法和组合物。本发明描述对任何靶细胞的基因组编辑以使在一种或多种基因的表达方面存在有利变化，此转而导致对有需要的受试者的疾病的治疗或产生合乎需要的植物。疾病的非限制性实例包括遗传疾病(例如血红蛋白病、血友病、溶酶体贮积病、囊性纤维化等)、感染性疾病(例如HIV)、神经疾病(例如PD、HD等)、癌症等。另外，在移植物中递送被改变以表达所需蛋白质产物的改变的干细胞可在疾病中类似有利。也描述基因表达改变的细胞系和生物体(例如植物或动物)。以下描述待由使用本发明的sgRNA的CRISPR/Cas系统靶向的基因。如所述的哺乳动物基因位置是相对于由加利福尼亚大学圣克鲁斯分校的基因组生物信息学小组(Genome Bioinformatics Group of UCSanta Cruz)创建的UCSC基因组浏览器，软件版权属于加利福尼亚大学董事会(Regents ofthe University of California)。人基因组坐标提供在人基因组的GRCh37/hg19汇编中，并且对应于双链DNA上的数字。因此，通过基因组坐标描述的任何位置都对应于(+)或沃森(Watson)链，或可指定它的相应(-)或克里克(Crick)链。
示例性靶标包括血红蛋白病中涉及的基因。血红蛋白是包含两个α样球蛋白链和两个β样球蛋白链以及4个血红素基团的异四聚体。在成人中，α2β2四聚体被称为血红蛋白A(HbA)或成人血红蛋白。通常，α球蛋白链和β球蛋白链以近似1:1比率合成，并且这个比率在血红蛋白和RBC稳定化方面似乎是关键的。实际上，在其中一种类型的球蛋白基因表达不充分(参见下文)的一些情况下，降低另一类型的球蛋白的表达(例如使用特定siRNA)从而恢复这个1:1比率会缓和突变体细胞表型的一些方面(参见Voon等(2008)Haematologica 93(8):1288)。在发育中的胎儿中，产生不同形式的血红蛋白，即胎儿血红蛋白(HbF)，其比血红蛋白A对氧具有更高结合亲和力以使氧可通过母体的血流递送至婴儿的系统中。胎儿血红蛋白也含有两条α球蛋白链，但替代成人β球蛋白链，它具有两条胎儿γ球蛋白链(α2γ2)。在妊娠约30周时，γ球蛋白在胎儿中的合成开始下降，同时β球蛋白的产生增加。截至约10个月龄，新生儿的血红蛋白几乎全都是α2β2，但一些HbF持续至成年期(总血红蛋白的约1-3％)。对从产生γ切换至产生β的调控十分复杂，并且主要涉及使γ球蛋白表达下调，同时使β球蛋白表达上调。
编码血红蛋白链的序列的遗传缺陷可导致称为血红蛋白病的许多疾病，包括镰状细胞贫血和地中海贫血。在大多数血红蛋白病患者中，编码γ球蛋白的基因仍然存在，但由于如上所述在大约分娩时发生的正常基因阻抑而表达相对较低。
据估计在美国在5000人中有1人患有镰状细胞病(SCD)，大部分在具有撒哈拉以南非洲血统的人员中。对于抵抗疟疾，似乎存在镰状细胞杂合性的益处，所以这个性状可能已随时间被选择，以致据估计在撒哈拉以南非洲，三分之一的人口具有镰状细胞性状。镰状细胞病由β球蛋白基因中的突变引起，其中在氨基酸#6处缬氨酸被取代成谷氨酸(在DNA水平上GAG变为GTG)，其中所得血红蛋白被称为“血红蛋白S”或“HbS”。在低氧条件下，脱氧形式的HbS暴露蛋白质上在E螺旋与F螺旋之间的疏水性片块(hydrophobic patch)。在血红蛋白中β链的位置6处的缬氨酸的疏水性残基能够与疏水性片块缔合，从而导致HbS分子聚集并形成纤维性沉淀。这些聚集体转而导致RBC异常或‘镰状化’，从而导致细胞的柔韧性丧失。镰状化RBC不再能够挤压至毛细管床中，并且可导致镰状细胞患者的血管阻塞危机。此外，镰状RBC比正常RBC更脆弱，并且倾向于溶血，最终导致患者的贫血。
地中海贫血也是与血红蛋白相关的疾病，并且通常涉及球蛋白链的表达降低。这可通过基因的调控区中的突变或由于球蛋白编码序列中导致表达降低的突变来发生。α地中海贫血与具有西非和南亚血统的人员相关，并且可赋予疟疾抗性。β地中海贫血与通常来自希腊以及土尔其和意大利的沿海地区的具有地中海血统的人员相关。治疗地中海贫血通常涉及输血和铁螯合疗法。如果可鉴定适当供体，那么骨髓移植物也用于治疗患有重度地中海贫血的人员，但这个方法可具有重大风险。
可用本发明的CRISPR/Cas系统实现对编码β球蛋白的人HBB基因的修正。优选的裂解位置包括靶向HBB基因序列(即在chr11：5246696-5248301处或附近)。尤其优选的是靶向HBS等位基因中的HBB的区域以实现镰状等位基因的基因修正。尤其优选供化脓性链球菌Cas9系统使用的是其中PAM位点在染色体11上的位置：5248110、5248106、5248100、5248090、5248122、5248112处或附近以修正镰状等位基因的靶向序列。对于与β地中海贫血相关的β球蛋白等位基因的基因修正，存在许多潜在靶标。一个与β地中海贫血相关的熟知突变是所谓IVS1.1突变，其中优选的靶向区域将在HBB基因序列的核苷酸1093-1192附近。最优选的是其中PAM位点在染色体11上的位置：5248170-5248171、5248168-5248169、5248167-5248168、5248164-5248165、5248163-5248164、5248155-5248156和5248147-5248148处或附近的靶向序列。
一种已被提出的用于治疗SCD与β地中海贫血两者的方法在于增加γ球蛋白的表达以旨在使HbF在功能上替代异常成人血红蛋白。如上所提及，用羟基脲治疗SCD患者被认为是成功的，部分地归因于它对增加γ球蛋白表达的作用。被发现会影响HbF再活化活性的第一组化合物是细胞毒性药物。最初使用5-氮杂胞苷在实验动物中显示能够通过药理学操作来导致γ球蛋白重新合成(DeSimone(1982)Proc Natl Acad Sci USA 79(14):4428-31)。后续研究确认5-氮杂胞苷能够增加患有β地中海贫血和镰状细胞病的患者中的HbF(Ley等(1982)N.Engl.J.Medicine,307:1469-1475以及Ley等,(1983)Blood 62:370-380)。此外，短链脂肪酸(例如丁酸和衍生物)已在实验系统中显示会增加HbF(Constantoulakis等(1988)Blood72(6):1961-1967)。有一部分人群患有称为‘遗传性胎儿血红蛋白持续存在症’(HPFH)的病状，其中升高量的HbF在成年期持续(HPFH杂合子中10-40％(参见Thein等(2009)Hum.Mol.Genet 18(R2):R216-R223))。这是一种罕见病状，但在不存在任何相关β球蛋白异常下，不伴有任何显著临床表现，即使当100％的个体的血红蛋白是HbF时。当患有β地中海贫血的个体也患有共发性HPFH时，HbF的表达可减轻疾病的严重性。此外，镰状细胞病的天然过程的严重性在患者与患者之间可显著变化，并且这种可变性部分地可追溯至一些患有较轻度疾病的个体表达较高水平的HbF的事实。
一种用以增加HbF的表达的方法涉及鉴定其产物在对γ球蛋白表达的调控中起作用的基因。一种所述基因是BCL11A，其最初由于它在淋巴细胞发育中的作用而被鉴定。BCL11A编码被认为涉及对γ球蛋白表达的阶段特异性调控中的锌指蛋白。BCL11A在成人红系前体细胞中表达，并且下调它的表达导致γ球蛋白表达增加。参见Sankaran等(2008)Science 322第1839页。所述蛋白质似乎与β球蛋白基因座相互作用以改变它的构型以及因此它在不同发育阶段的表达。此外，另一调控蛋白KLF1(在chr19：12995237-12998017处编码)似乎涉及对γ球蛋白表达的调控。已发现KLF1水平与BCL11A水平成正比，并且在携带KLF1基因的杂合性突变的持续表达HbF的马耳他人家族中，两者均与γ球蛋白水平成反比(Borg等,(2011)Haematologica 96(5):635-638)。KLF1基因产物似乎在体内直接结合BCL11A基因，并且因此可导致它的上调(参见Borg等(2010)Nat Genet 42(9):801-805；Bieker(2010)Nat Genet 42(9):733-734；Zhou等(2010)Nat Genet 42(9):742-744)。因此，如果KLF1刺激BCL11A表达，那么BCL11A的作用将导致γ球蛋白和HbF产生受遏制。已提出使用抑制性RNA靶向BCL11A基因(参见例如美国专利公布号20110182867)，但这个技术具有若干潜在缺点，也就是可能不实现完全敲低，递送所述RNA可成问题，以及RNA必须连续存在，从而要求终身多重治疗。因此，本发明的方法和组合物可用于用CRISPR/Cas系统治疗SCD和血红蛋白病，其中单导向RNA包含用以靶向KLF1或BCL11a基因的序列。通过双链裂解敲除KLF1基因可通过本发明的CRIPSR/Cas系统来实现。优选的靶向位点在外显子1、外显子2和外显子3中以产生基因的所需敲除。尤其优选的是染色体19上在12994239-12999017、12997868-12998017和12996131-12996956处或附近的区域。尤其优选的是靶向染色体19的在12997877-12997912处或附近的区域。适于靶向的序列的非限制性实例显示于表1中。
通过双链裂解敲除BCL11A基因可使用本发明的CRISPR/Cas系统和sgRNA来实现。优选的是靶向BCL11A基因(chr2：60684329-60780633)。也优选的是在外显子序列(例如在染色体2：60780351-60780633(外显子1)、60773106-60773435、尤其60773362-60773400(外显子2)、60695867-60695968(外显子3)、60687817-60689559(外显子4)、60678302-60679801(外显子5)处或附近)中裂解BCL11A基因。尤其优选的是靶向BCL11A基因中的增强子序列(参见Bauer等(2013),Science 342(6155):253-7)。因此，靶向在染色体260725317-60725682、60722125-60722677和60718031-60718382处或附近的序列是尤其优选的。
用以改变γ球蛋白的表达的另一方法在于靶向编码γ球蛋白的基因(HBG1，位于染色体11：5268501-5272087上)上的调控位点。优选的是靶向在染色体11：5271086-5271087处或附近的转录起始位点，尤其优选的是靶向由于患有遗传性胎儿血红蛋白持续存在症的患者而已知的所谓“HPFH”区域(参见Thein等(2009)Hum.Mol.Genet 18(R2):R216-R223)。因此，靶向在染色体11：5272286-5272290、5272263-5272263和5272198-5272205处或附近的序列是尤其优选的。
α地中海贫血在人群中，尤其在亚洲也是流行的，并且某一类型的α球蛋白异常被认为是人类中最常见的遗传病症。在世界的热带和亚热带区域，α球蛋白病症见于80-90％的人群中(参见Harteveld和Higgs(2010)Orphanet Journal of Rare Diseases 5:13)。
人在染色体16上串联携带2个α球蛋白基因拷贝(α1和α2)，如此在正常二倍体细胞中，总共存在4个拷贝。α2基因对应的α球蛋白mRNA通常比α1基因多2-3倍。这两个基因的串联组构可与α地中海贫血患者中α球蛋白基因中的大片段缺失的高发相关，其中通常非功能性α球蛋白基因的数目与任何α地中海贫血的严重性直接相关(参见Chui等(2003)Blood101(3):791)。缺失一个拷贝似乎十分常见(30％的非洲裔美国人以及60-80％的生活在沙特阿拉伯、印度和泰国的人员)，并且除非进行遗传测试，否则在个体中通常不明显。缺失两个拷贝，无论在同一染色体上(顺式)或来自各染色体的一个(反式)都可导致受折磨的人士患有轻度贫血。当缺失三个α球蛋白基因以致个体仅具有一个功能性α球蛋白基因时，查觉到中度贫血，但更重要的是，关键性α球蛋白与β球蛋白比率被破坏。常在仅具有一个功能性α球蛋白基因(一种称为HbH的病状)的患者中观察到包含四个β球蛋白链的β4四聚体。β4四聚体能够结合氧，但不将它释放至外周中，从而导致称为HbH疾病的疾病。患有HbH疾病的个体具有半衰期缩短，并且易于经受溶血，从而导致贫血增加的RBC。丧失全部四个α球蛋白基因通常在子宫内是致命的。因此，本发明的方法和组合物可用于用CRISPR/Cas系统治疗地中海贫血，其中单导向RNA包含用以靶向α球蛋白基因的调控区的序列。适于靶向的序列的非限制性实例显示于表1中。
其它示例性靶标包括编码受体(例如病毒受体)的基因。当HIV感染人T细胞时，它依赖于与T细胞受体CD4以及两种共受体中的一种(趋化因子受体CCR5或CXCR4)缔合以获得进入细胞中。在似乎对HIV感染具有抗性，尤其呈纯合状态的人群中鉴定出天然CCR5变体(“CCR5-δ32”)。因此，为防止HIV感染T细胞以及最终导致HIV感染的患者中的T细胞死亡和免疫功能降低，可实现破坏共受体中的一个或两个以致使细胞对病毒具有抗性(参见美国专利号7,951,925)。当前临床试验正在进行，其中在CCR5基因座处离体编辑HIV患者T细胞以敲除CCR5基因。这些细胞接着被再引入患者中以处理HIV。因此，本发明的方法和组合物可用于用CRISPR/Cas系统破坏CCR5等位基因，其中单导向RNA包含用以靶向人CCR5基因(chr3：46411633-46417697)，尤其在外显子区域(chr3：46414394-46415452)处或附近靶向的序列。一个尤其优选用于靶向CCR5基因用于敲除的区域是在δ-32突变区域附近的区域(在chr3：46414923-46415020处或附近)。另一尤其优选的区域在编码CCR5蛋白的第二细胞外环的一部分的chr3：46414522-46414643附近。在ATG蛋白翻译起始位点处或附近的区域(在chr3：46414347-46414466处或附近)也尤其优选用于基因组修饰，如通过靶向整合来使C34肽融合于CCR5的N末端用于抗HIV疗法。在CXCR4依赖性HIV的动物模型中的类似研究在进展中，其中CXCR4被选择性破坏，或与CCR5串联一起被破坏以防止HIV感染T细胞(参见美国专利公布号20100291048)。因此，本发明的方法和组合物可用于用CRISPR/Cas系统破坏CXCR4等位基因，其中单导向RNA包含用以靶向人CXCR4基因(chr2：136871919-136875725)，尤其在外显子2区域(chr2：136872439-136873482)和围绕小外显子1(chr2：136875616-136875630)的区域处或附近靶向的序列。一个优选用于靶向CXCR4基因用于敲除的区域是在chr2：136872863-136872982处或附近的作为CCR5基因中的δ-32突变区域的类似物的区域。在靠近外显子1的ATG蛋白翻译起始位点在chr2：136875540-136875687处或附近的区域是尤其优选的，并且在靠近外显子2的剪接位点在chr2：136873389-136873558处或附近的区域尤其优选用于基因修饰，如通过靶向整合来使C34肽融合于CXCR4的N末端用于抗HIV疗法。因此，sgRNA可被设计以结合CCR5或CXCR4基因座中任何地方的序列，包括但不限于这些优选靶向区域中的一个或多个中的序列。
另一目标受体是糖皮质素受体(参见美国专利公布US20080188000)。在特定治疗性治疗中敲除这个受体允许使用通常被糖皮质素受体占据的类固醇。因此，受体可通过用以在染色体5：142646254-142783254处或附近靶向的使用本发明的sgRNA的CRISPR/Cas系统来靶向。尤其优选的是靶向外显子序列，例如在染色体5 142646255-142783254(外显子1)、142782776-142783254(外显子2)、142779221-142780417、以及尤其适用142657496-142658976(外显子3)、142693567-142693733(外显子4)、142689662-142689778(外显子5)、142680050-142680328(外显子6)、142678233-142678377(外显子7)、142675025-142675155(外显子8)、142662133-142662290(外显子9)处或附近。
特定核酸酶也可被工程改造以在HIV受体上插入肽融合抑制剂以防止HIV感染T细胞(参见共同拥有的美国专利公布号20120093787)，其中所述肽融合抑制剂的实例是C34或恩夫韦地(fuzeon)。类似地，HIV可通过使用用以在细胞内的安全港基因座中插入抗HIV转基因以抗击病毒的工程改造的核酸酶来处理。此类抗HIV基因的实例可选自由以下组成的组：编码阻抑HIV多聚蛋白的锌指转录因子的序列、编码阻抑HIV受体的表达的锌指转录因子的序列、CCR5核酶、靶向HIV多聚蛋白的siRNA序列、编码Trim5α(Trim5α)限制因子的序列、编码APOBEC3G限制因子的序列、编码RevM10蛋白的序列、编码C46的序列、其它抗HIV基因、自杀盒及其组合。因此，本发明的方法和组合物可用于用CRISPR/Cas系统处理和预防HIV，其中单导向RNA包含用以靶向CCR5或CXCR4基因以整合合适的抗HIV转基因的序列。适于靶向的序列的其它非限制性实例显示于表1中。
可对任何内源性靶标进行如本文所述的基因组编辑。在某些实施方案中，基因组修饰(例如转基因整合)是在“安全港”基因处。基因组中特定“安全港”位置可用于转基因整合，所述整合可利用见于该安全港基因座处的启动子，或允许由在插入之前融合于转基因的外源性启动子对转基因进行表达调控。已描述若干所述“安全港”基因座，包括人细胞中的AAVS1(也称为PPP1R12C)和CCR5基因、Rosa26和白蛋白(参见共同拥有的美国专利公布号20080299580、20080159996和201000218264以及美国申请号13/624,193和13/624,217)、以及植物中的Zp15(参见美国专利8,329,986)。外源性核酸或转基因序列可包括例如一种或多种基因或cDNA分子、或任何类型的编码或非编码序列、以及一种或多种控制元件(例如启动子)。此外，外源性核酸序列可产生一种或多种RNA分子(例如小发夹RNA(shRNA)、抑制性RNA(RNAi)、微小RNA(miRNA)等)。将外源性核酸序列引入细胞中以将它整合至细胞的基因组(例如PPP1R12C基因，其位于染色体19，即chr19：55602840-55624858上)中。整合外源性序列可通过同源性依赖性机制与同源性非依赖性机制两者来进行。因此，本发明的方法和组合物可用于用CRISPR/Cas系统将转基因插入安全港基因座中，其中单导向RNA包含用以靶向所述安全港基因的序列。适于靶向的序列的非限制性实例显示于表1中。
如上所述，可利用对安全港具有特异性的核酸酶(例如CRISPR/Cas)以使转基因构建体通过HDR或NHEJ驱动的过程来插入。次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)是嘌呤代谢中涉及的由HPRT1基因(chrX：133594175-133634698)编码的酶。HPRT1位于X染色体上，并且因此在男性中以单拷贝存在。HPRT1编码通过将5-磷酸核糖基从5-磷酸核糖基1-焦磷酸酯转移至嘌呤来催化次黄嘌呤转化成单磷酸肌苷以及鸟嘌呤转化成单磷酸鸟苷的转移酶。所述酶主要起从降解的DNA补救嘌呤以用于重新开始的嘌呤合成的作用。在6-TG存在下，HPRT是负责使6-TG整合至细胞中的DNA和RNA中，从而导致阻断适当多核苷酸合成和代谢的酶。因此，6-TG可用作选择剂以杀灭具有功能性HPRT酶的细胞，并且此外，6-TG可被供给以导致有需要的受试者的轻度免疫净化(immunoablation)。在接受干细胞移植物(例如造血干细胞或祖细胞干细胞)的患者中，可将目标转基因整合至HPRT基因座中，从而敲除HPRT1基因。所述细胞群体将对6-TG毒性具有抗性。因此，当转基因(+)/HPRT1(-)细胞输注至患者中时，轻度6-TG过程可增加细胞的移入，并且移入的那些细胞将具有更大转基因整合百分比。
HPRT已在传统上作为安全港被靶向用于转基因整合(参见例如Jasin等(1996)Proc Natl Acad Sci USA 93,第8804页)。它在低水平下组成型表达，并且在体外以及在体内均可使用6-TG对HPRT基因的破坏进行选择。然而，通过随机整合来整合至HPRT基因座中可为困难的，并且仅在低频率下发生。使用特定核酸酶将允许对HPRT基因座的靶向得以改进。因此，本发明的方法和组合物可用于用CRISPR/Cas系统将转基因插入HPRT基因座中，其中本发明的单导向RNA包含用以靶向安全港基因的序列。优选的是靶向HPRT基因(chrX：133594175-133634698)。尤其优选的是靶向内含子1中的序列(在染色体X：133597660-133597662、133603544-133603546和133604282-133604284处或附近)。也优选的是在外显子3中裂解，尤其在染色体x：133609240-133609242处或附近。另一优选位置在染色体X：133627552-133627554处或附近于酶的活性结构域中。因此，sgRNA可被设计以结合HPRT基因座中任何地方的序列，包括但不限于这些优选靶向区域中的一个或多个中的序列。适于靶向的序列的其它非限制性实例显示于表1中。
另一适用于用本发明的方法和组合物靶向的基因是IL2受体共同γ链(由IL2RG基因编码，在chrX：70327254-70331481处或附近)。IL2RG蛋白是若干细胞因子受体中的共同受体链，并且这个基因中的突变与X连锁的重度联合免疫缺陷(“X-SCID”)相关。因此，用本发明的CRISPR/Cas系统和sgRNA靶向这个基因以有助于基因修正将有益于X-SCID患者。优选的是在外显子1的末端附近(在Chr x：70331274-70331276处或附近)进行靶向。尤其优选的是在染色体x：70331196-70331198处或附近靶向内含子1，或在染色体x：70329158-70329160处或附近于外显子5中进行靶向。
白蛋白基因在肝中高度表达。因此，使用特定核酸酶将转基因插入内源性白蛋白基因座中导致由该转基因编码的蛋白质或基因产物高水平表达，所述蛋白质或基因产物也可分泌至血流中。转基因可编码任何蛋白质或肽，包括提供治疗益处的那些。举例来说，转基因可编码血液病症(例如凝血病症)和多种其它单基因疾病中涉及的蛋白质。可将转基因插入内源性白蛋白基因座中以使转基因的表达受白蛋白表达控制元件控制，从而导致转基因编码的蛋白质在高浓度下的肝特异性表达。可被表达的蛋白质可包括凝血因子(如因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XIII、vWF等)、抗体、与溶酶体贮积相关的蛋白质、胰岛素、α1-抗胰蛋白酶、以及实际上当如此表达时提供益处的任何肽或蛋白质。因此，本发明的方法和组合物可用于用CRISPR/Cas系统将转基因插入白蛋白基因中，其中单导向RNA包含用以靶向白蛋白基因的序列(在chr4：74269972-74287129处或附近)。优选的靶标是外显子序列中的那些，例如在chr:474270073-74270883(外显子1，尤其优选，最优选在染色体4：74270385-74270485处)、74270840-74272396(外显子2，尤其优选在染色体4：74270840-74272396处或附近)、74272428-74274361(外显子3)、74274472-74275122(外显子4)、74275154-74276079(外显子5)、74276076-74277763(外显子6)、74277792-74279187(外显子7)、74279301-74280802(外显子8)、74280834-74282023(外显子9)、74282020-74283298(外显子10)、74283336-74283855(外显子11)、74283978-74285274(外显子12，尤其优选)、74285306-74286021(外显子13，尤其优选)和74285988-74286859(外显子14，尤其优选)处或附近。因此，sgRNA可被设计以结合白蛋白基因座中任何地方的序列，包括但不限于这些优选靶向区域中的一个或多个中的序列。适于靶向的序列的其它非限制性实例显示于表1中。
溶酶体贮积病(LSD)是一组罕见代谢单基因疾病，其特征在于缺乏通常涉及分解废弃脂质、糖蛋白和粘多糖的功能性个别溶酶体蛋白质。这些疾病的特征在于这些化合物在细胞中累积，因为由于特定酶错误起作用而不能处理它们用于再循环。最常见的实例是高歇氏病(Gaucher’s disease)(葡糖脑苷脂酶缺乏症-基因名称：GBA)、法布里氏病(Fabry’s disease)(α半乳糖苷酶缺乏症-GLA)、亨特氏病(Hunter’sdisease)(艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶缺乏症-IDS)、胡尔勒氏病(Hurler’sdisease)(α-L艾杜糖醛酸酶缺乏症-IDUA)和尼曼-皮克氏病(Niemann-Pick’sdisease)(神经鞘磷脂磷酸二酯酶1缺乏症-SMPD1)。当群聚在一起时，LSD在群体中具有7000例分娩中约1例的发病率。这些疾病对受它们折磨的那些人具有毁灭性影响。它们通常最初在可具有特征性面部和身体成长模式，以及可具有中度至重度精神迟缓的婴儿中被诊断。治疗选择包括酶替代疗法(ERT)，其中通常通过大剂量静脉内注射向患者供给丢失酶。此类治疗仅治疗症状而非治愈性的，因此患者必须持续他们的余生被供给这些蛋白质的重复给药，并且潜在地可产生针对注射蛋白质的中和抗体。这些蛋白质常具有短的血清半衰期，并且因此患者必须也忍受频繁输注蛋白质。举例来说，接受
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产品(伊米苷酶(imiglucerase))的高歇氏病患者必须每周进行三次输注。酶的生产和纯化也成问题，并且因此治疗是极其昂贵的(每名患者每年>$100,000)。因此，本发明的特定核酸酶可用于将编码溶酶体贮积病中涉及的蛋白质的丢失野生型形式的基因插入安全港基因座(如白蛋白)中用于表达和对LSD的治疗。
乙型血友病是凝血系统的一种遗传病症，其特征在于血流入关节和软组织中以及血过度流入经历创伤或经受手术的任何部位中。尽管乙型血友病在临床上不可与甲型血友病区分，但因子VIII(FVIII)在甲型血友病中缺乏或不存在，而因子IX(FIX或F.IX)在患有乙型血友病的患者中缺乏或不存在。因子IX编码涉及凝血系统的一种丝氨酸蛋白酶，并且已显示即使恢复野生型因子IX蛋白的正常循环水平的3％也可防止自发性流血。
涉及引入编码功能性FIX蛋白的质粒和其它载体(例如AAV)的基因疗法(包括肝定向基因疗法方案和直接肌肉内注射)已被描述用于治疗乙型血友病。参见例如美国专利号6,936,243；Lee等(2004)Pharni.Res.7:1229-1232；Graham等(2008)Genet VaccinesTher.3:6-9。然而，在这些方案中，形成抑制性抗因子IX(抗FIX)抗体和针对递送媒介物的抗体仍然是针对乙型血友病的基于FIX蛋白补充的治疗的主要复杂因素。因此，使用设计的核酸酶和相关技术来修正内源性因子VIII或因子IX基因或在安全港基因座中引入野生型基因拷贝可恢复治疗的患者中的凝血活性。因子VIII基因的一优选靶向区域在位于chrX：154064064-154250998处的基因序列处或附近。尤其优选用于靶向因子VIII基因的是内含子22的区域，其是作为重度甲型血友病患者中多达50％的FVIII突变的原因的常见倒位事件的位点，位于chrX：154091503-154124351处或附近。对于因子IX(F.IX)基因，优选用于靶向的是位于chrX：138,612,895-138,645,617处或附近的基因序列。尤其优选的是内含子1中的区域中的靶标，例如在chrX：138613760-138613816、chrX：138618832-138618887和/或chrX：138613815-138613872处或附近。因此，sgRNA可被设计以结合因子VIII或因子IX基因座中任何地方的序列，包括但不限于这些优选靶向区域中的一个或多个中的序列。
帕金森氏病(Parkinson’s disease,PD)是一种折磨全世界约400-600万人的神经变性疾病。在美国，每100,000人中有约100至200人患有PD。PD的发病率在年长群体中增加，其中年龄超过80的人中有约4％罹患这种疾病(Davie(2008)Brit Med Bull 86(1)第109页)，但10％的患者不到40岁(Kumari(2009)FEBS J.276(22)第6455页)。
似乎许多因素可在PD的疾病发作和/或进展中起作用。举例来说，富含亮氨酸的重复序列激酶2基因(LRRK2，也称为PARK8)中的遗传突变已被鉴定涉及PD的家族性形式与偶发性形式两者中。实际上，研究表明LRRK2突变可导致5％与13％之间的家族性PD以及1％至5％的偶发性PD。所述蛋白质自身是一种含有以下已知结构域的大型(>280kD)多结构域蛋白质：犰狳蛋白(ARM)、锚蛋白(ankryn)(ANK)、LRR、复合蛋白质的Ras(ROC)、ROC的C末端(COR)、有丝分裂原活化的蛋白质激酶激酶激酶和WD40。因此，LRRK2含有若干蛋白质-蛋白质相互作用结构域(ARM/ANK、LRR和WD40)，从而表明LRRK2在蛋白质复合物形成中起作用(Kumari(同上))。已鉴定横跨基因长度的若干簇突变，其中大多数病理性突变群集在蛋白质的酶结构域中。
具体来说，LRRK2突变G2019S已被表明在一些种族划分中在PD中起重要作用。突变是常染色体显性的，并且突变的终生外显率已被估计处于31.8％。在人基因组中，导致患者中的这个错义突变的SNP被注解为rs34637584，并且在基因组水平上是G至A取代(6055G>A)。这个LRRK2突变可被称为G2019S或6055G>A，并且见于chr12:40734202处或附近。G2019S突变已显示会增加LRRK2激酶活性，并且见于蛋白质的活化结构域或蛋白质激酶样结构域内(Luzon-Toro(2007)Hum Mol Genet 16(17)第2031页)。因此，特定核酸酶可用于修正LRRK2基因中的突变以治疗PD。因此，本发明的方法和组合物可用于用CRISPR/Cas系统修正LRRK2基因，其中单导向RNA包含用以靶向LRRK2基因的序列。尤其优选的是被设计以在chr12：40734202-40734202处或附近进行靶向的sgRNA。适于靶向的序列的非限制性实例显示于表1中。
三核苷酸重复序列扩增病症最初在1990年代早期被表征(参见Di Prospero和Fischbeck,(2005)Nature Reviews Genetics第6卷:756-765)。这些病症涉及多组三核苷酸的不稳定重复序列的定位扩增，并且可导致重复序列驻留于其中的基因的功能丧失；获得毒性功能；或两者。三核苷酸重复序列可位于基因的任何部分，包括非编码基因区域和编码基因区域中。位于编码区内的重复序列通常涉及重复谷氨酰胺编码三联体(CAG)或丙氨酸编码三联体(CGA)。非编码序列内扩增的重复序列区域可导致基因表达异常，而编码区内扩增的重复序列(也称为密码子反复病症)可导致错误折叠和蛋白质聚集。
亨廷顿氏病(Huntington’s Disease，HD)，也称为亨廷顿氏舞蹈病，是一种进行性运动、认知和精神病学紊乱病症。这个疾病的平均发作年龄是年龄35-44岁，但在约10％的病例中，发作发生在年龄21之前，并且疾病诊断后的平均寿命是15-18年。发病率是在100,000个具有西欧血统的人之中约3至7人。该疾病与内源性亨廷顿蛋白基因(Htt，chr4：3076237-3245687)中的CAG重复序列区域的扩增相关。正常Htt等位基因含有15-20个CAG重复序列，而含有35个或大于35个重复序列的等位基因可被视为潜在致HD等位基因，并且赋予显现疾病的风险。含有36-39个重复序列的等位基因被视为不完全外显，并且具有那些等位基因的那些个体可或可不显现疾病(或可在生命后期显现症状)，而含有40个重复序列或大于40个重复序列的等位基因被视为完全外显，并且尚未报道含有具有此许多重复序列的HD等位基因的无症状人士。患有青少年发作型HD的那些个体(<21岁)常被发现具有60个或大于60个CAG重复序列。因此，本发明的方法和组合物可用于用CRISPR/Cas系统破坏Htt等位基因，其中单导向RNA包含用以靶向扩增的Htt基因的序列。尤其优选的是在3071604-3081660处或附近靶向染色体4。本发明的方法和组合物也可用于使用包含阻抑结构域的CRISPR/Cas系统融合蛋白来选择性阻抑突变Htt等位基因。适于靶向的序列的非限制性实例显示于表1中。
视网膜色素变性(RP)是指一组影响全世界200万人的导致不可治愈性失明的不同遗传性疾病。RP是遗传视网膜变性的一种最常见形式，并且存在其突变可导致RP的多种基因。迄今为止已鉴定在杆状光受体中表达的44种基因中超过100个突变，占所有类型的视网膜变性的15％，其中大多数是错义突变，并且通常是常染色体显性的。
视紫红质是涉及光感知中的第一事件中的视网膜的色素。它由共价连接于视网膜辅因子的蛋白质部分视蛋白组成。视紫红质由RHO基因(chr3：129247482-129254187)编码，并且蛋白质具有约40kD的分子量，且跨越视杆细胞的膜。视网膜辅因子当它进入视网膜中时吸收光并变为光激发的，从而导致它经受分子构型变化，并且从视蛋白解离。这个变化引发最终导致电脉冲沿视神经传送至脑中的过程。关于RP，已在视紫红质基因中鉴定超过80个突变，占人类中所有常染色体显性视网膜色素变性(ADRP)的30％(Dryja等(2000)InvestOpthalmol Vis Sci 41:3124-3127)。已知人视紫红质基因中的三个点突变(导致蛋白质序列中P23H、Q64X和Q344X)会导致人ADRP。参见例如Olsson等(1992)Neuron 9(5):815-30。在美国，P23H突变是最常见的视紫红质突变。由于关于蛋白质折叠的问题，P23H视紫红质在体外用视黄醛仅部分重构(Liu等(1996)Proc Nat’I Acad Sci93:4554-4559)，并且在转基因体中表达的突变视紫红质导致视网膜变性(Goto等(1995)Invest Opthalmol Vis Sci 36:62-71)。因此，本发明的方法和组合物可用于用CRISPR/Cas系统破坏RHO等位基因，其中单导向RNA包含用以靶向人RHO基因的序列(在chr3：129247482-129254187处或附近)。在特定位置处靶向RHO适用于促进基因修正。优选的靶位置包括外显子1(在chr3：129247577-129247937处或附近以修正与P23H或Q64X突变相关的序列)和外显子5(在chr3：129251376-129251615处或附近)。适于靶向的序列的非限制性实例显示于表1中。
肺病，包括如囊性纤维化(CF)和表面活性蛋白B(SP-B)缺乏症的遗传病症，仍然是儿科群体中的问题。SP-B缺乏症是一种罕见肺病，其中蛋白质和脂肪分子在肺的远端部分中积累，并且影响呼吸。该疾病由主要由于SFTPB基因(位于chr2：85884440-85895374处或附近)中的缺陷而缺乏肺表面活性蛋白B引起，SFTPB基因编码肺相关表面活性B蛋白(SPB)，即一种为出生之后肺功能和体内平衡所必需的两亲性表面活性蛋白。SP-B缺乏症中最常见的突变是指定为“121ins2”的突变，其导致mRNA中在位置131处的核苷酸“C”转化成“GAA”。(在基因组序列中，这对应于375C-GAA，并且位于外显子4中)。因此，本发明的方法和组合物可用于使用本发明的sgRNA使CRISPR/Cas系统在chr2：85884440-85895374处或附近靶向SFTPB基因，并且最优选地靶向外显子4(在chr2：85893740-85893865处或附近)。
CF是一种影响1500至4000例成活分娩中的1例的常染色体隐性病症，并且是最常见的遗传儿科病症之一。CF中的主要缺陷在调控通过由囊性纤维化跨膜传导调控子(CFTR)基因(位于chr7：117120017-117308718)编码的氯离子通道蛋白进行上皮氯离子转运方面。参见例如Kerem等(1989)Science 245:1073-1080；Kreda等(2005)MolBiol Cell 16:2154-2167。在CF患者中观察的约70％的突变由以下所致：CFTR的核苷酸序列中缺失三个碱基对，从而导致位于蛋白质中位置508处的氨基酸苯丙氨酸丧失(突变被称为ΔF508)(位于外显子11中)。在野生型基因组中，氨基酸507是异亮氨酸，并且由密码子TAG编码，其中G是基因中的核苷酸1652。氨基酸508是由AAA编码的苯丙氨酸。在Δ508突变中，来自507密码子的G连同508密码子的前两个A一起缺失，以致突变在缺失的507-508编码位置处具有序列TAA。TAA也编码异亮氨酸，但在野生型位置508处的苯丙氨酸丢失。对于ΔI507缺失，在位置506或507处的异亮氨酸缺失。对于这个突变，在1648-1650或1651-1653处的核苷酸或其某一组合丢失以在所得蛋白质中仅产生一个异亮氨酸。复合(杂合性)突变(ΔF508和ΔI507)也已被文献记载。参见例如Orozco等(1994)Am JMed Genet.51(2):137-9。CF患者(复合杂合性ΔI507/ΔF508或纯合性ΔF508/ΔF508)未能表达完全糖基化的CFTR蛋白，并且未如为CFTR功能所需在细胞表面上表达部分糖基化蛋白(参见例如Kreda等(2005)Mol Biol Cell16:2154-2167；Cheng等(1990)Cell 63:827-834)。仅在一个等位基因处携带ΔI507或ΔF508 CFTR突变的个体(即wt/ΔI507或wt/ΔF508)是CF携带者，并且在肺细胞功能方面不展现缺陷。参见例如Kerem等(1990)Proc Natl Acad Sci USA87:8447-8451。因此，本发明的方法和组合物可用于用CRISPR/Cas系统破坏或修正CFTR等位基因，其中单导向RNA包含用以靶向人CFTR基因的序列。尤其优选用于靶向的在chr7：117227793-117227887处或附近。适于靶向的序列的非限制性实例显示于表1中。
肌营养不良是特征在于肌肉群进行性变性和弱化的疾病。一种熟知的肌营养不良是杜兴氏肌营养不良(Duchenne’s muscular dystrophy)，其是折磨每3500个男孩中的1个的X连锁疾病。它由个体肌肉细胞中缺乏蛋白质肌营养不良蛋白引起，并且症状最初在儿童约3岁时出现，且视疾病的严重性而定，可在患者处于二十几岁时发生死亡。编码肌营养不良蛋白的基因DMD(位于chrX：31137345-33229673处或附近)极其巨大，并且涵盖240万个碱基的DNA，其包含编码14kb mRNA的79个外显子。在缺乏功能性肌营养不良蛋白的患者中，约40％具有导致编码序列中框移以致在翻译期间遭遇过早终止，从而导致产生截短或非功能性蛋白质的点突变。其它60％具有大片段插入或缺失，其也导致框改变，并且类似地导致产生非功能性蛋白质(Nowak和Davies(2004)EMBO Reports 5(9):872-876)。具有非功能性肌营养不良蛋白的患者患有最重度疾病，其也称为杜兴氏肌营养不良(DMD)。其突变的特征在于编码肌营养不良蛋白的内部部分的区域的基因缺失，从而导致相较于野生型，肌营养不良蛋白功能性较小的其它患者可患有不太严重的疾病，其称为贝克尔肌营养不良(BeckerMuscular Dystrophy，BMD)。已知BMD患者存活至他们的50多岁。靶向DMD基因可适用于对点突变进行基因修正或改变mRNA转录物的剪接样式，从而允许细胞产生功能性肌营养不良蛋白。因此，sgRNA可被设计以在chrX：31137345-33229673处或附近结合DMD基因座中任何地方的序列。过继性免疫疗法是以下实践：实现对具有肿瘤抗原的高亲合力TCR的某一CTL子群体的高度特异性T细胞刺激，离体刺激并扩增它们，接着将它们引入患者中。如果在输注肿瘤特异性细胞之前从患者移除天然淋巴细胞，那么过继性免疫疗法是特别有效的。这个类型的疗法背后的理念是如果引入的高亲合力CTL是成功的，那么一旦肿瘤已被清除，则这些细胞中的一些将保持为记忆T细胞，并且在癌症再出现的情况下将存留在患者中。然而，将任何TCR转基因转移至宿主T细胞中本身携有与大多数基因转移方法相关的警告：也就是TCR转基因表达盒向基因组中的插入不受调控且不可预测，常处于低水平下。所需转基因的此类不良控制插入可导致转基因对周围基因有影响，以及由于来自相邻基因的影响而使转基因沉默。此外，在用引入的TCR转基因工程改造的T细胞中共表达的内源性TCR基因可导致由被内源性TCR识别的抗原对T细胞的非所需刺激，由于TCR转基因与内源性TCR亚单位的错误配对，从而产生具有新型识别性质的新型TCR复合物而由非意图抗原对T细胞的非所需刺激，或因由于转基因编码的TCR亚单位与内源性TCR蛋白的异二聚化而产生非活性TCR而可导致针对目标抗原的次优刺激。实际上，由因内源性链和外源性链的错误配对而形成自身反应性TCR所致的重度自体免疫毒性的风险近来已在鼠类模型中(Bendle等(2010)NatureMedicine 16:565-570)以及在人细胞中(van Loenen等(2010)Proc Natl Acad Sci USA107:10972-7)被强调。另外，由于与内源性和错误配对TCR竞争为在细胞表面上表达复合物所需的CD3分子，肿瘤特异性TCR可在次优水平下在细胞表面上表达。低TCR表达影响转基因T细胞的亲合力和功效。供引入T细胞中的可用于针对高亲和力TCR的靶标的实例是WT1和NYEso。因此，本发明的方法和组合物可用于用CRISPR/Cas系统破坏或修正内源性TCR基因，其中单导向RNA包含用以靶向人TCRα(TRAC或TCRA，位于chr6：42883727-42893575处或附近)或TCRβ(TRBC或TCRB，位于chr7：142197572-142198055处或附近)基因的序列。适于靶向的序列的非限制性实例显示于表1中。
已显示程序性死亡受体(PD1或PD-1，也称为PDCD1)涉及应答于慢性抗原来调控T细胞活化与T细胞耐受性之间的平衡。在T细胞活化后，PD1表达在T细胞中被诱导。PD1受体的配体是PD1配体(PDL1，也称为B7-H1和CD272)和PDL2(也称为B7-DC和CD273)，并且通常在抗原递呈细胞中以及在外周中表达。PD1-PDL(PD1配体)偶联导致T细胞失活，并且涉及诱导T细胞耐受性(参见Pardoll(2012)Nat Rev 12:252)。在HIV1感染期间，已发现PD1在CD4+T细胞中的表达增加，并且PDL1在抗原递呈细胞(APC)上的表达增加，从而使T细胞抑制与T细胞刺激之间的平衡向T细胞抑制倾斜(参见Freeman等(2006)J Exp Med 203(10):2223-2227)。当在慢性抗原暴露存在下观察到T细胞功能障碍(在HIV感染中就是这样)时，据认为PD1上调以某种方式与T细胞耗竭(定义为关键效应物功能进行性丧失)相关联。PD1上调也可与在慢性病毒性感染期间这些相同组细胞的凋亡增加相关联(参见Petrovas等,(2009)JImmunol.183(2):1120-32)。PD1也可在肿瘤特异性逃脱免疫监视中起作用。已证明在慢性骨髓性白血病(CML)与急性骨髓性白血病(AML)两者中，PD1均在肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)中高度表达。PD1在黑素瘤浸润T淋巴细胞(TIL)中也被上调(参见Dotti(2009)Blood 114(8):1457-58)。已发现肿瘤表达PD1配体PD-L1，或更罕见地，表达PD1配体PDL2，此在与PD1在CTL中上调组合时可为T细胞功能性丧失以及CTL不能介导有效抗肿瘤应答的作用因素。研究者已显示在被淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)慢性感染的小鼠中，施用抗PD1抗体阻断PD1-PDL相互作用，并且能够恢复一定T细胞功能性(增殖和细胞因子分泌)，从而导致病毒载量降低(Barber等(2006)Nature 439(9):682-687)。另外，已在临床上在肿瘤学环境中对于具有多种疾病背景(晚期黑素瘤、肾细胞癌、非小细胞肺癌、结肠直肠癌或前列腺癌)的患者测试完全人PD-1特异性IgG4单克隆抗体。在黑素瘤、肾细胞癌和非小细胞肺癌患者中观察到临床活性，并且初步数据表明在与临床结果相关的治疗之前检测到由肿瘤表达PD1配体(参见Wolfe(2012)Oncology Business Review,7月；以及Pardoll(同上))。因此，本发明的方法和组合物可用于用CRISPR/Cas系统破坏PD1等位基因，其中单导向RNA包含用以靶向人PD1基因(chr2：242792033-242801058)的序列。一个优选用于靶向PD1基因用于敲除的区域在靠近该ATG蛋白翻译起始位点的区域处或附近。这对应于PD1基因的核苷酸chr2：242800981-242800982。尤其优选的是PD1基因的其中化脓性链球菌Cas9的PAM位置位于染色体2处或附近，在位置242800980-242800981、242800975-242800976、242800971-242800972、242800970-242800971、242800967-242800968和242800965-242800966处的靶位点。另一尤其优选的靶向位置在靠近PD-1配体结合结构域的区域附近(染色体2，核苷酸242794834-242794835和242794828-242794829)。另一优选用于靶向的区域在靠近基于免疫受体酪氨酸的切换基序的区域处或附近(例如染色体2 242793349-242793350、242793338-242793339、242793330-242793331或242793327-242793328)。这个区域中的突变使PD1功能失能。尤其优选的是化脓性链球菌Cas9蛋白在染色体2：242800953-242800979、242794976-242795005、242794416-242794444和242793405-242793433处或附近的位置处的靶位点。因子VIII基因的优选靶向区域在位于chrX：154064064-154250998处的基因序列处或附近。尤其优选用于靶向因子VIII基因的是内含子22的区域，其是作为重度甲型血友病患者中多达50％的FVIII突变的原因的常见倒位事件的位点，位于chrX：154091503-154124351处或附近。对于因子IX(F.IX)基因，优选用于靶向的是位于chrX：138,612,895-138,645,617处或附近的基因序列。尤其优选的是内含子1中的区域中的靶标，例如在chrX：138613760-138613816、chrX：138618832-138618887和/或chrX：138613815-138613872处或附近。因此，sgRNA可被设计以结合PD1基因座中任何地方的序列，包括但不限于这些优选靶向区域中的一个或多个中的序列。适于靶向的序列的非限制性实例显示于表1中。
T细胞活性的另一调节子是CTLA-4受体。类似于T细胞受体CD28，CTLA-4与抗原递呈细胞上的CD80和CD86配体相互作用。然而尽管这些抗原与CD28相互作用会导致T细胞活化，但CD80或CD86与CTLA-4相互作用会通过干扰IL-2分泌和IL-2受体表达，以及通过抑制关键细胞周期组分的表达来拮抗T细胞活化。CTLA-4未见于大多数静息T细胞的表面上，但在T细胞活化之后被瞬时上调。因此，CTLA-4也涉及活化T细胞活性和抑制T细胞活性的平衡(参见Attia等(2005)J ClinOncol.23(25):6043-6053)。在患有转移性黑素瘤的受试者中进行的涉及使用CTLA 4抗体的初始临床研究发现疾病消退(Attia(同上))，但稍后研究发现用抗体治疗的受试者展现似乎与自身耐受性破坏相关的疗法副作用(免疫相关不利事件：皮疹、结肠炎、肝炎等)。对这个数据的分析表明由抗CTLA4抗体所致的较大肿瘤消退与免疫相关不利事件的较大严重性直接相关(Weber(2007)Oncologist 12(7):864-872)。因此，本发明的方法和组合物可用于用CRISPR/Cas系统破坏CTLA-4基因，其中单导向RNA包含用以靶向位于chr2：204732511-204738683处或附近的人CTLA-4基因的序列。适于靶向的序列的非限制性实例显示于表1中。
嵌合抗原受体(CAR)是被设计以使免疫细胞靶向在细胞表面上表达的特定分子靶标的分子。在呈它们的最基本形式时，它们是引入细胞中的使在细胞外部表达的特异性结构域与在细胞内部的信号传导路径偶联的受体，以致当特异性结构域与它的靶标相互作用时，细胞变为被活化。CAR常由T细胞受体(TCR)的变体制得，其中特异性结构域(如scFv或某一类型的受体)被融合于TCR的信号传导结构域。接着将这些构建体引入T细胞中，从而允许T细胞在表达靶抗原的细胞存在下变为被活化，从而导致由活化的T细胞以非MHC依赖性方式对靶向细胞进行攻击(参见Chicaybam等(2011)Int Rev Immunol30:294-311)。当前，靶向多种肿瘤抗原的肿瘤特异性CAR正在临床上被测试用于治疗多种不同癌症。这些癌症和它们的正被靶向的抗原的实例包括滤泡性淋巴瘤(CD20或GD2)、成神经细胞瘤(CD171)、非霍奇金淋巴瘤(CD20)、淋巴瘤(CD19)、成胶质细胞瘤(IL13Rα2)、慢性淋巴细胞性白血病或CLL和急性淋巴细胞性白血病或ALL(均是CD19)。也已开发病毒特异性CAR来攻击具有如HIV的病毒的细胞。举例来说，使用对Gp100具有特异性的CAR来启动临床试验以治疗HIV(Chicaybam(同上))。
尽管开发将导致T细胞将它的注意力重新引导向如癌细胞的特定细胞的技术是适用的，但仍然有这些靶细胞常表达PD-1配体的问题。因此，PD1-PD-L1/PD-L2相互作用通过使T细胞失活以及增加凋亡和细胞耗竭来使得肿瘤能够逃脱CAR靶向T细胞的作用。另外，PD1-PDL相互作用也涉及T细胞对HIV的应答的阻抑，其中PD1与PDL两者的表达增加导致T细胞耗竭。诱导CTLA-4在活化的T细胞上表达也是用以阻抑免疫应答的最初步骤中的一个，并且因此装备有CAR的T细胞可能由于被设计以使T细胞活化与T细胞抑制平衡的这个系统的参与而变为非活性的。因此，本发明的CRISPR/Cas系统可与上述本发明的sgRNA一起用于敲除包含CAR的T细胞中的CTLA-4和/或PD1。
MHC抗原最初被表征为在移植反应中起主要作用的蛋白质。排斥由T细胞与植入的组织的表面上的组织相容性抗原起反应介导，并且这些抗原的最大组是主要组织相容性抗原(MHC)。MHC蛋白具有两个类别，即类别I和类别II。I类MHC蛋白是两种蛋白质的异二聚体，所述两种蛋白质是作为由MHC1基因编码的跨膜蛋白的α链和作为由不位于MHC基因簇内的基因编码的小的细胞外蛋白质的β2微球蛋白链。α链折叠成三个球形结构域，并且当β2微球蛋白链缔合时，球形结构复合物类似于抗体复合物。外来肽存在于两个最N末端，也是最可变的结构域上。II类MHC蛋白也是异二聚体，但异二聚体包含两个由MHC复合物内的基因编码的跨膜蛋白质。I类MHC：抗原复合物与细胞毒性T细胞相互作用，而II类MHC向辅助T细胞递呈抗原。此外，I类MHC蛋白倾向于在几乎所有有核细胞和血小板(以及小鼠中的红血细胞)中表达，而II类MHC蛋白更具选择性地表达。通常，II类MHC蛋白在B细胞、一些巨噬细胞和单核细胞、郎格罕氏细胞(Langerhans cell)和树突细胞上表达。
人中的I类HLA基因簇包含三个主要基因座B、C和A以及若干次要基因座。HLA-A、H:A-B和HLA-C是I类HLA重链旁系同源物。I类分子是由MHCα重链(HLA-A、HLA-B或HLA-C)和轻链(β-2微球蛋白)组成的异二聚体。重链锚定在膜中。I类分子通过递呈源于内质网腔的肽来在免疫系统中起主要作用。重链是约45kDa，并且它的基因含有8个外显子。外显子1编码前导肽，外显子2和3编码α1和α2结构域，其两者均结合肽，外显子4编码α3结构域，外显子5编码跨膜区域，并且外显子6和7编码细胞质尾部。外显子2和外显子3内的多态性导致每一类分子的肽结合特异性。HLA-A、HLA-B或HLA-C中的优选用于靶向sgRNA的区域在基因序列内(例如chr6：29910247-29912868(针对HLA-A)、chr6：31236526-31239913(针对HLA-B)、和chr6：31236526-31239125(针对HLA-C))。尤其优选的是靶向前导序列(例如在chr6：31324936-31324989(针对HLA-B)处或附近)、α1和α2结构域(例如在chr6：31324863-31324935和chr6：31324735-31324862(分别针对HLA-B)处或附近)以及α3结构域(例如在chr6：31324465-31324734(针对HLA-B)处或附近)内的序列。
II类HLA簇也包含三个主要基因座DP、DQ和DR，并且I类基因簇与II类基因簇两者均是多态性的，因为在群体内存在I类基因与II类基因两者的若干不同等位基因。HLA-DPA1、HLA-DQA1和HLA-DRA属于II类HLAα链旁系同源物。这个II类分子是由α(DPA)和β(DPB)链(两者均锚定在膜中)组成的异二聚体。它们通过递呈源于细胞外蛋白质的肽来在免疫系统中起主要作用。II类分子在抗原递呈细胞(APC：B淋巴细胞、树突细胞、巨噬细胞)中表达。α链是约33-35kDa，并且它们的基因(chr6_ssto_hap7：3,754,283-3,759,493(针对HLA-DRA)、chr6：32605183-32611429(针对HLA-DQ)和chr6：33032346-33048555(针对HLA-DPA))含有5个外显子。外显子1(例如在chr6：33041248-33041347(针对HLA-DPA1)处或附近)编码前导肽，外显子2和3(例如在chr6：33037418-33037663和chr6：33036796-33037077(针对HLA-DPA1)处或附近)编码两个细胞外结构域，外显子4(例如在hr6：33036427-33036581(针对HLA-DPA1)处或附近)编码跨膜结构域和细胞质尾部。因此，尤其优选用以用本发明的CRIPSR-Cas系统靶向的区域在外显子1、2和3内。在DP分子内，α链与β链两者均含有指定肽结合特异性的多态性，从而产生多达4种不同分子。因此，sgRNA可被设计以结合HLA-DPA1、HLA-DQ1或HLA-DRA基因座中任何地方的序列，包括但不限于这些优选靶向区域中的一个或多个中的序列。
也存在若干也在HLA发挥功能方面起作用的辅助蛋白质。Tap1(在chr6：32812986-32821748处编码)和Tap2(在chr6：32793187-32806547处编码)亚单位是在将肽抗原装载于I类HLA复合物上方面所必需的TAP转运体复合物的部分，并且LMP2和LMP7蛋白体亚单位在使抗原蛋白水解降解成肽以在HLA上展示中起作用。已显示降低LMP7(chr6_dbb_hap3：4089872-4093057)会降低细胞表面处I类MHC的量，也许是由于缺乏稳定化(参见Fehling等(1999)Science 265:1234-1237)。除TAP和LMP之外，也存在TAP相关蛋白基因(chr6：33271410-33282164)，其产物在TAP复合物与I类HLA链之间形成桥连，并且增强肽装载量。降低TAP相关蛋白导致细胞的I类MHC装配受损，I类MHC的细胞表面表达降低，以及免疫应答受损(参见Grandea等(2000)Immunity13:213-222以及Garbi等(2000)Nat Immunol 1:234-238)。调控II类MHC表达取决于MHCII增强体复合物的活性。增强体组分(增强体复合物的一个最高度研究的组分是RFX5基因产物(参见Villard等(2000)MCB 20(10):3364-3376))几乎普遍表达，并且这些组分的表达似乎不控制II类MHC基因的组织特异性表达或它们的IFN-γ诱导上调。反倒是，似乎称为CIITA(II类反式活化子)的作为非DNA结合蛋白的蛋白质充当MCHII表达的主控制因子。与其它增强体成员形成对照，CIITA确实展现组织特异性表达，由IFN-γ上调，并且已显示受若干可导致II类MHC表达下调的细菌和病毒抑制(被认为是细菌试图逃避免疫监视的一部分(参见Leibund Gut-Landmann等(2004)Eur.J.Immunol34:1513-1525))。因此，本发明的方法和组合物可用于用CRISPR/Cas系统破坏HLA基因或HLA调控基因，其中单导向RNA包含用以靶向人HLA基因或HLA调控基因的序列。sgRNA可被设计以结合HLA基因座中任何地方的序列，包括但不限于编码HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DPA、HLA-DQ或HLA-DRA的基因序列，以及以上讨论的这些基因内的优选靶向区域。另外，sgRNA可被设计以结合其产物与MHC蛋白(包括TAP1、TAP2、LMP2、LMP7和TAP相关蛋白)相互作用的基因中的序列，或其产物调控这些基因的表达的基因(包括MHCII增强体复合物中的那些(RFX5(chr1：151313116-151319769))和CIITA(chr16：10971055-11002744))中的序列。适于靶向的序列的非限制性实例显示于表1中。
本文公开适用于调节植物中的基因的表达以及靶向裂解和改变所述基因的组合物和方法，所述基因特别是植物中的旁系同源基因。可例如通过使用工程改造的转录因子或修饰基因调控区来调节对旁系同源基因的调控。可例如通过以下方式来改变基因：靶向裂解，继之以染色体内同源重组；或靶向裂解，继之以外源性多核苷酸(包含一个或多个与基因核苷酸序列具有同源性的区域)与基因组序列之间的同源重组。植物中的旁系同源基因的非限制性实例是EPSPS基因。因此，本发明的方法和组合物可用于用CRISPR/Cas系统破坏EPSPS基因，其中单导向RNA包含用以靶向植物EPSPS基因的序列。
本公开提供用于表达已整合至植物细胞中的Zp15基因中的外源性核酸序列的一种或多种产物(即蛋白质或RNA分子)的方法和组合物。如共同拥有的美国专利号8,329,986中所示，在Zp15基因座处或附近整合一个或多个外源性序列似乎不损害宿主植物再生、开花或产生种子的能力，并且任选地，允许外源性序列历经世代可遗传传递。外源性核酸序列可包括例如一种或多种基因或cDNA分子、或任何类型的编码或非编码序列、以及一种或多种控制元件(例如启动子)。举例来说，可将除草剂耐受性基因整合至这个基因座中以产生具有所需除草剂抗性的作物植物。在Zp15基因座处或附近含有外源性核酸的细胞也可促成配子体(种系)，并且因此传递至后代中的子代中。因此，本发明的方法和组合物可用于用CRISPR/Cas系统破坏Zp15基因，其中单导向RNA包含用以靶向植物ZP15基因的序列。
本公开提供用于调节完整植物或植物细胞中涉及脂肪酸生物合成中的一种或多种植物基因的表达以及用于靶向改变所述基因，由此改变完整植物或植物细胞中的脂肪酸组成的组合物和方法。完整植物或植物细胞可来自单子叶(单子叶植物)或双子叶(双子叶植物)植物物种，在一些特定实施方案中包括产油植物，并且也包括培养的细胞、处于任何发育阶段的植物中的细胞、以及已从完整植物移除的植物细胞，并且所述细胞(或它们的后代)将被再生成植物。植物细胞可含有一个或多个同源或旁系同源基因序列，其中任何数目或其全部可通过本文公开的方法来靶向用于修饰。
在一个方面，本文描述特异性结合植物脂肪酸生物合成路径中涉及的基因的DNA结合结构域(例如Cas蛋白)。在一些实施方案中，基因是芜菁甘蓝(Brassica napus)基因。在一些特定实施方案中，芜菁甘蓝基因可编码乙酰辅酶A羧化酶(ACC酶)、β-酮酰基-ACP合成酶(KAS，例如KASI-KAS IV)、脂肪酸硫酯酶B(FATB，例如FATB1-FATB5或其它质体硫酯酶)、脂肪酸合成酶(FAS)、脂肪酸延长酶(FAE，例如FAE1)、脂肪酸硫酯酶A(FatA)、脂肪酸去饱和酶(Fad2、Fad3)、质体G-3-P脱氢酶(GPDH)、甘油激酶(GK)、硬脂酰基-酰基载体蛋白去饱和酶(S-ACP-DES)和油酰基-ACP水解酶。在一些特定实施方案中，基因可为这些基因在其它产油植物物种中的直系同源物或同源物。因此，本发明的方法和组合物可用于用CRISPR/Cas系统破坏涉及脂肪酸生物合成的基因，其中单导向RNA包含用以靶向脂肪酸合成基因的序列。
苹果酸脱氢酶(MDH)在植物与哺乳动物两者中催化中心代谢和细胞器区室之间的氧化还原体内平衡中涉及的可逆NAD+依赖性脱氢酶反应。植物组织含有苹果酸脱氢酶(l-苹果酸-NAD-氧化还原酶[MDH]；EC 1.1.1.37)的多个亚型，其催化与NAD池的还原或氧化偶联的苹果酸和草酰乙酸(OAA)相互转化。值得注意的是，OAA易于转运至以及转运出分离的植物线粒体，这不同于基本上不可为这个有机酸所渗透的哺乳动物线粒体。MDH突变植物不展现明显表型或展现较缓慢生长速率和改变的光呼吸特征。参见例如Tomaz等(2010)PlantPhysiol.154(3):1143-1157；Goodman,M.M.,Newton K.J.和Stuber,C.W.(1981)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 78:1783-1785或Imsande,J.等(2001)J.Heredity 92:333-338，并且美国专利公布号20090123626描述使用MDH反义序列降低天冬酰胺水平，此举转而降低在对植物和植物产物的加工相关加热后积累的丙烯酰胺的水平。因此，本发明的方法和组合物可用于用CRISPR/Cas系统破坏苹果酸脱氢酶(MDH)，其中单导向RNA包含用以靶向MDH基因的序列。
CRISPR/Cas系统包含工程改造的sgRNA(或它的等效物)以靶向基因组中的所需位置。仅这个向导RNA的12个碱基对以及PAM序列的2个碱基对(总计14个碱基对)似乎对CRISPR/Cas活性至关重要。假定CRISPR/Cas构建体对这14个碱基对具有绝对特异性，我们将预期所述构建体在人基因组中裂解约20次，因为给定的14个核苷酸的序列将每268,435,456(414)个核苷酸出现约一次，单倍体人基因组含有约3,000,000,000个核苷酸，并且14个核苷酸的序列可在基因组的两条链中的任一条上。这个数字也要求绝对识别特异性。因此，脱靶裂解位点的实际数目可能更高。本发明提供用以增加CRISPR/Cas系统的靶标大小以增加它的特异性的方法和组合物。Cas核酸酶包含分别用于裂解靶DNA的正义链和反义链的两个核酸酶结构域，即HNH结构域和RuvC样结构域。因此，可工程改造Cas核酸酶以使仅一个核酸酶结构域具有功能性，由此产生Cas切口酶(参见Jinek等(同上))。可通过酶的催化结构域中的氨基酸的特异性突变，或通过截短结构域的一部分或全部以使它不再具有功能性来产生切口酶。因为Cas包含两个核酸酶结构域，所以可对任一结构域采用这个方法。可通过使用两种此类Cas切口酶在靶DNA中实现双链断裂。切口酶将各自裂解DNA的一条链，并且使用两种切口酶将产生双链断裂。因此，通过使用两种Cas切口酶蛋白，系统的特异性得以极大增加，因为靶标长度从12-14个核苷酸增加至24-28个核苷酸(不包括在两个子靶标之间的间隔区)。使用这个方法，人基因组中完全匹配脱靶位点的预期数目下降某一因数或414，从约20(如上所述)至约<10-7(假定CRISPR/Cas切口酶二聚体识别28个碱基对的DNA)。
总则
除非另外指示，否则方法的实践以及制备和使用本文公开的组合物采用如属于本领域的技能内的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、计算化学、细胞培养、重组DNA和相关领域中的常规技术。这些技术在文献中被充分说明。参见例如Sambrook等MOLECULARCLONING:A LABORATORY MANUAL,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989和第3版,2001；Ausubel等,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John Wiley&Sons,New York,1987和定期更新；丛书METHODS IN ENZYMOLOGY,Academic Press,San Diego；Wolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION,第3版,Academic Press,San Diego,1998；METHODS IN ENZYMOLOGY,第304卷,“Chromatin”(P.M.Wassarman和A.P.Wolffe编),Academic Press,San Diego,1999；以及METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,第119卷,“Chromatin Protocols”(P.B.Becker编)Humana Press,Totowa,1999。
定义
术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用，并且是指呈线性或环状构象以及呈单链形式或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物。出于本公开的目的，这些术语不应被解释为限制聚合物的长度。术语可涵盖天然核苷酸的已知类似物，以及在碱基、糖和/或磷酸部分(例如硫代磷酸酯骨架)中被修饰的核苷酸。一般来说，特定核苷酸的类似物具有相同的碱基配对特异性；即A的类似物将与T碱基配对。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换用于指代氨基酸残基的聚合物。该术语也适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸是相应天然存在的氨基酸的化学类似物或修饰的衍生物。
“结合”是指大分子之间(例如蛋白质与核酸之间或两个核酸之间)的序列特异性非共价相互作用。并非所有具有结合相互作用的组分都需要是序列特异性的(例如与DNA骨架中的磷酸残基接触)，只要相互作用整体是序列特异性的即可。此类相互作用的特征通常在于解离常数(Kd)是10-6M-1或低于10-6M-1。“亲和力”是指结合强度：结合亲和力增加与Kd较低相关。
术语“嵌合RNA”、“嵌合向导RNA”、“向导RNA”、“单导向RNA”和“合成向导RNA”可互换使用，并且是指包含向导序列、tracr序列和tracr配合序列的多核苷酸序列。术语“向导序列”是指向导RNA内指定靶位点并且可与术语“向导”或“间隔区”互换使用的约10-30(10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30)个碱基对的序列。术语“tracr配合序列”也可与术语“同向重复序列”互换使用。
“互补性”是指核酸通过传统的沃森-克里克类型或其它非传统类型与另一核酸序列形成氢键的能力。互补性百分比指示核酸分子中可与第二核酸序列形成氢键(例如沃森-克里克碱基配对)的残基的百分比(例如10个中有5、6、7、8、9、10个是50％、60％、70％、80％、90％和100％互补的)。“完全互补”意指核酸序列的所有连续残基都将与第二核酸序列中相同数目的连续残基进行氢键结。如本文所用的“基本上互补”是指在具有8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50或大于50个核苷酸的区域上，至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的互补性程度，或是指两个核酸在严格条件下杂交。“结合蛋白”是能够结合另一分子的蛋白质。结合蛋白可结合例如DNA分子(DNA结合蛋白)、RNA分子(RNA结合蛋白)和/或蛋白质分子(蛋白质结合蛋白)。在蛋白质结合蛋白的情况下，它可结合自身(以形成同二聚体、同三聚体等)和/或它可结合一种或多种不同蛋白质的一种或多种分子。结合蛋白可具有超过一种类型的结合活性。举例来说，锌指蛋白具有DNA结合、RNA结合和蛋白质结合活性。
“锌指DNA结合蛋白(或结合结构域)”是通过一个或多个锌指以序列特异性方式结合DNA的蛋白质或较大蛋白质内的结构域，所述锌指是结合结构域内的氨基酸序列区域，其结构通过锌离子配位加以稳定化。术语锌指DNA结合蛋白常缩写为锌指蛋白或ZFP。
“TALE DNA结合结构域”或“TALE”是包含一个或多个TALE重复结构域/单元的多肽。重复结构域涉及TALE与它的同源靶DNA序列的结合。单一“重复单元”(也被称为“重复序列”)的长度通常是33-35个氨基酸，并且展现与天然存在的TALE蛋白内的其它TALE重复序列的至少一定序列同源性。
可例如通过工程改造天然存在的锌指或TALE蛋白的识别螺旋区域(改变一个或多个氨基酸)来“工程改造”锌指和TALE结合结构域以结合预定核苷酸序列。因此，工程改造的DNA结合蛋白(锌指或TALE)是非天然存在的蛋白质。用于工程改造DNA结合蛋白的方法的非限制性实例是设计和选择。设计的DNA结合蛋白是不存在于自然界中的蛋白质，其设计/组成主要来自于合理的准则。合理的设计准则包括应用取代规则和计算机化算法以处理存储现存ZFP和/或TALE设计和结合数据的信息的数据库中的信息。参见例如美国专利号8,586,526；6,140,081；6,453,242；和6,534,261；也参见WO 98/53058；WO 98/53059；WO 98/53060；WO 02/016536和WO 03/016496。
“所选”锌指蛋白或TALE是未见于自然界中的蛋白质，其产生主要由经验过程，如噬菌体展示、相互作用捕获或杂交物选择所致。参见例如美国专利号8,586,526；5,789,538；5,925,523；6,007,988；6,013,453；6,200,759；以及WO 95/19431；WO 96/06166；WO98/53057；WO 98/54311；WO 00/27878；WO 01/60970WO 01/88197；WO 02/099084。
“重组"是指在两个多核苷酸之间交换遗传信息的过程。出于本公开的目的，“同源重组(HR)”是指例如在修复细胞中的双链断裂期间通过同源性定向修复机制发生的此类交换的特殊形式。这个过程需要核苷酸序列同源性，使用“供体”分子来为修复“靶标”分子(即经受双链断裂的分子)提供模板，并且以不同名称称为“非交叉基因转换”或“短序列基因转换(short tract gene conversion)”，因为它导致遗传信息从供体转移至靶标。在不希望受任何特定理论束缚下，此类转移可涉及对在断裂的靶标与供体之间形成的异源双链DNA的错配修正，和/或“合成依赖性链退火”，其中供体用于再合成将成为靶标的一部分的遗传信息，和/或相关过程。所述特殊化HR常导致靶分子的序列改变，以使供体多核苷酸的部分或全部序列被并入靶多核苷酸中。
在本公开的方法中，一种或多种如本文所述的靶向核酸酶(例如CRISPR/Cas)在靶序列(例如细胞染色质)中在预定位点处产生双链断裂，并且与断裂的区域中的核苷酸序列具有同源性的“供体”多核苷酸可被引入细胞中。已显示存在双链断裂会促进供体序列的整合。供体序列可被物理整合，或替代地，供体多核苷酸用作通过同源重组修复断裂的模板，从而导致将如于供体中的全部或部分核苷酸序列引入细胞染色质中。因此，细胞染色质中的第一序列可被改变，并且在某些实施方案中，可被转换成供体多核苷酸中存在的序列。因此，使用术语“替换(replace/replacement)”可被理解成代表一个核苷酸序列被另一核苷酸序列替换(即在信息意义上替换序列)，并且未必需要一个多核苷酸被另一多核苷酸物理或化学替换。
在任何本文所述的方法中，其它CRISPR/Cas核酸酶和/或其它对锌指或TALEN蛋白可用于对细胞内其它靶位点进行其它双链裂解。
在用于细胞染色质中的目标区域中的序列的靶向重组和/或替换和/或改变的方法的某些实施方案中，通过与外源性“供体”核苷酸序列同源重组来改变染色体序列。如果存在与断裂的区域同源的序列，那么通过使在细胞染色质中存在双链断裂来刺激此类同源重组。
在任何本文所述的方法中，外源性核苷酸序列(“供体序列”或“转基因”)可含有与目标区域中的基因组序列同源但不同一的序列，由此刺激同源重组以将非同一序列插入目标区域中。因此，在某些实施方案中，供体序列与目标区域中的序列同源的部分展现在约80％至99％(或介于其之间的任何整数)之间的与被替换的基因组序列的序列同一性。在其它实施方案中，例如如果如在具有超过100个连续碱基对的供体序列与基因组序列之间，仅1个核苷酸不同，那么供体与基因组序列之间的同源性高于99％。在某些情况下，供体序列的非同源部分可含有不存在于目标区域中的序列，以使新序列被引入目标区域中。在这些情况下，非同源序列通常由具有50-1,000个碱基对(或介于其之间的任何整数值)或大于1,000的任何数目的碱基对的与目标区域中的序列同源或同一的序列侧接。在其它实施方案中，供体序列与第一序列是非同源的，并且通过非同源重组机制插入基因组中。
任何本文所述的方法都可用于通过靶向整合破坏目标基因的表达的供体序列来使细胞中的一个或多个靶序列部分或完全失活。也提供具有部分或完全失活基因的细胞系。
此外，如本文所述的靶向整合的方法也可用于整合一个或多个外源性序列。外源性核酸序列可包括例如一种或多种基因或cDNA分子、或任何类型的编码或非编码序列、以及一种或多种控制元件(例如启动子)。此外，外源性核酸序列可产生一种或多种RNA分子(例如小发夹RNA(shRNA)、抑制性RNA(RNAi)、微小RNA(miRNA)等)。
“裂解”是指使DNA分子的共价骨架断裂。裂解可通过多种方法来引发，包括但不限于酶促或化学水解磷酸二酯键。单链裂解与双链裂解两者均是可能的，并且双链裂解可由于两个不同单链裂解事件而发生。DNA裂解可导致产生钝末端或交错末端。在某些实施方案中，融合多肽用于靶向双链DNA裂解。
“裂解半结构域(half-domain)”是连同第二多肽(相同或不同)一起形成具有裂解活性(优选是双链裂解活性)的复合物的多肽序列。术语“第一和第二裂解半结构域”、“+和-裂解半结构域”和“右侧和左侧裂解半结构域”可互换用于指代进行二聚化的裂解半结构域对。
“工程改造的裂解半结构域”是已被修饰以便与另一裂解半结构域(例如另一工程改造的裂解半结构域)形成专性异二聚体的裂解半结构域。也参见美国专利公布号2005/0064474、2007/0218528、2008/0131962和2011/0201055，其以引用的方式整体并入本文。
术语“序列”是指具有任何长度的核苷酸序列，其可为DNA或RNA；可为线性、环状或分支的，并且可为单链或双链。术语“供体序列”是指插入基因组中的核苷酸序列。供体序列可具有任何长度，例如长度在2与10,000个核苷酸之间(或介于其之间或高于其的任何整数值)，长度优选在约100与1,000个核苷酸之间(或介于其之间的任何整数)，长度更优选在约200与500个核苷酸之间。
“同源非同一序列”是指第一序列，其与第二序列共有一定程度的序列同一性，但其序列不与所述第二序列的序列是同一的。举例来说，包含突变基因的野生型序列的多核苷酸与所述突变基因的序列是同源以及非同一的。在某些实施方案中，两个序列之间的同源性程度足以允许利用正常细胞机制进行其之间的同源重组。两个同源非同一序列可为任何长度，并且它们的非同源性程度可小至单一核苷酸(例如对于通过靶向同源重组来修正基因组点突变)或大至10千碱基或大于10千碱基(例如对于在染色体中的预定异位位点处插入基因)。包含同源非同一序列的两个多核苷酸无需是相同长度。举例来说，可使用核苷酸或核苷酸对在20与10,000之间的外源性多核苷酸(即供体多核苷酸)。
用于确定核酸和氨基酸序列同一性的技术在本领域中是已知的。通常，此类技术包括测定基因的mRNA的核苷酸序列和/或测定由其编码的氨基酸序列，以及将这些序列与第二核苷酸或氨基酸序列进行比较。也可以这个方式测定以及比较基因组序列。一般来说，同一性是指两个多核苷酸或多肽序列的分别核苷酸对核苷酸或氨基酸对氨基酸的精确对应。两个或更多个序列(多核苷酸或氨基酸)可通过确定它们的同一性百分比来进行比较。两个序列(无论核酸或氨基酸序列)的同一性百分比是两个比对序列之间的精确匹配的数目除以较短序列的长度，并且乘以100。核酸序列的近似比对由Smith和Waterman,Advancesin Applied Mathematics 2:482-489(1981)的局部同源性算法提供。通过使用由Dayhoff(Atlas of Protein Sequences and Structure.M.O.Dayhoff编,5增刊3:353-358,National Biomedical Research Foundation,Washington,D.C.,USA)开发，并且由Gribskov(Nucl.Acids Res.14(6):6745-6763(1986))加以标准化的评分矩阵，这个算法可应用于氨基酸序列。用以确定序列同一性百分比的这个算法的示例性执行程序由GeneticsComputer Group(Madison WI)在“BestFit”实用程序中提供。适用于计算序列之间的同一性或类似性百分比的程序通常在本领域中是已知的，例如另一比对程序是以默认参数加以使用的BLAST。举例来说，BLASTN和BLASTP可使用以下默认参数来加以使用：遗传密码＝标准；过滤器＝无；链＝两者；截断＝60；预期＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50个序列；排序依据＝高分；数据库＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+Swiss蛋白+Spupdate+PIR。这些程序的细节可见于因特网上。关于本文所述的序列，所需序列同一性程度的范围是约80％至100％以及介于其之间的任何整数值。通常，序列之间的同一性百分比是至少70-75％，优选80-82％，更优选85-90％，甚至更优选92％，仍更优选95％，以及最优选98％序列同一性。
或者，多核苷酸之间的序列类似性程度可通过以下方式来确定：在允许在同源区域之间形成稳定双链体的条件下使多核苷酸杂交，随后用单链特异性核酸酶消化，并且测定消化的片段的大小。如使用以上方法所确定，当在分子的确定长度上，序列展现至少约70％-75％，优选80％-82％，更优选85％-90％，甚至更优选92％，仍更优选95％，以及最优选98％序列同一性时，两个核酸或两个多肽序列是彼此基本上同源的。如本文所用，基本上同源也指序列显示与指定DNA或多肽序列的完全同一性。可在DNA印迹(Southern)杂交实验中在例如如对于该特定系统确定的严格条件下鉴定基本上同源的DNA序列。确定适当杂交条件为本领域技术人员所知。参见例如Sambrook等(上文)；Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach.B.D.Hames和S.J.Higgins编,(1985)Oxford；Washington,DC；IRLPress)。
可如下测定两个核酸片段的选择性杂交。两个核酸分子之间的序列同一性程度影响此类分子之间的杂交事件的效率和强度。部分同一的核酸序列将至少部分抑制完全同一序列与靶分子杂交。可使用本领域中熟知的杂交测定(例如Southern(DNA)印迹、Northern(RNA)印迹、溶液杂交等，参见Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,(1989)Cold Spring Harbor,N.Y.)来评估对完全同一序列的杂交的抑制。可使用不同选择性程度，例如使用从低严格性变化至高严格性的条件来进行此类测定。如果采用低严格性条件，那么可使用二级探针来评估不存在非特异性结合，所述二级探针缺乏甚至部分序列同一性程度(例如与靶分子具有小于约30％序列同一性的探针)，以致在不存在非特异性结合事件下，二级探针将不与靶标杂交。
当利用基于杂交的检测系统时，选择与参照核酸序列互补的核酸探针，接着通过选择适当条件，探针和参照序列彼此选择性杂交或结合以形成双链体分子。能够在中等严格杂交条件下与参照序列选择性杂交的核酸分子通常在允许检测长度是至少约10-14个核苷酸，与所选核酸探针的序列具有至少约70％序列同一性的靶核酸序列的条件下杂交。严格杂交条件通常允许检测长度是至少约10-14个核苷酸，与所选核酸探针的序列具有大于约90-95％的序列同一性的靶核酸序列。可如本领域中所知来确定适用于探针/参照序列杂交的杂交条件，其中探针和参照序列具有特定序列同一性程度(参见例如Nucleic AcidHybridization:A PracticalApproach,B.D.Hames和S.J.Higgins编,(1985)Oxford；Washington,DC；IRL Press)。
杂交条件为本领域技术人员所熟知。杂交严格性是指杂交条件不利于形成含有错配核苷酸的杂交物的程度，其中较高严格性与错配杂交物的较低容许性相关。影响杂交严格性的因素为本领域技术人员所熟知，并且包括但不限于温度、pH、离子强度以及例如像甲酰胺和二甲亚砜的有机溶剂的浓度。如为本领域技术人员所知，通过升高温度、降低离子强度以及降低溶剂浓度来增加杂交严格性。
关于杂交严格性条件，本领域中熟知的是通过例如改变以下因素，众多等效条件可用于建立特定严格性：探针序列的长度和性质、各种序列的碱基组成、盐和其它杂交溶液组分的浓度、在杂交溶液中存在或不存在阻断剂(例如硫酸葡聚糖和聚乙二醇)、杂交反应温度和时间参数以及不同洗涤条件。遵循本领域中的标准方法选择对一组特定杂交条件的选择(参见例如Sambrook等,Molecular Cloning:ALaboratoryManual.第2版,(1989)ColdSpring Harbor,N.Y.)。
“染色质”是包含细胞基因组的核蛋白结构。细胞染色质包含主要是DNA的核酸以及蛋白质，包括组蛋白和非组蛋白染色体蛋白质。大多数真核细胞染色质以核小体形式存在，其中核小体核心包含约150个碱基对的DNA，所述DNA与包含组蛋白H2A、H2B、H3和H4中的各两个的八聚体缔合；并且连接体DNA(视生物体而定具有可变长度)在核小体核心之间延伸。组蛋白H1的分子通常与连接体DNA缔合。出于本公开的目的，术语“染色质”意图涵盖所有类型的原核细胞核蛋白与真核细胞核蛋白两者。细胞染色质包括染色体染色质与附加型染色质两者。
“染色体”是构成细胞的全部或一部分基因组的染色质复合物。细胞的基因组常通过它的核型来表征，所述核型是构成细胞的基因组的所有染色体的集合。细胞的基因组可包含一个或多个染色体。
“附加体”是包含不是细胞的染色体核型的一部分的核酸的复制性核酸、核蛋白复合物或其它结构。附加体的实例包括质粒和某些病毒基因组。
“可及区域”是细胞染色质中的位点，其中存在于核酸中的靶位点可由识别所述靶位点的外源性分子结合。在不希望受任何特定理论束缚下，据信可及区域是不包装成核小体结构的区域。可及区域的不同结构可常通过它对化学和酶探针(例如核酸酶)的敏感性来检测。
“靶位点”或“靶序列”是限定核酸的将为结合分子所结合(条件是存在足以用于结合的条件)的部分的核酸序列。
“外源性”分子是通常不存在于细胞中，但可通过一种或多种遗传、生物化学或其它方法引入细胞中的分子。相对于细胞的特定发育阶段和环境条件来确定“在细胞中的正常存在性”。因此，举例来说，仅在肌肉的胚胎发育期间存在的分子相对于成人肌肉细胞是外源性分子。类似地，通过热激诱导的分子相对于非热激细胞是外源性分子。外源性分子可包括例如功能失常内源性分子的功能性形式或正常发挥功能的内源性分子的功能失常形式。
外源性分子可尤其为小分子，如通过组合化学方法产生的小分子；或大分子，如蛋白质、核酸、碳水化合物、脂质、糖蛋白、脂蛋白、多糖、以上分子的任何修饰衍生物、或包含一种或多种以上分子的任何复合物。核酸包括DNA和RNA，可为单链或双链；可为线性、分支或环状的；并且可具有任何长度。核酸包括能够形成双链体的那些以及形成三链体的核酸。参见例如美国专利号5,176,996和5,422,251。蛋白质包括但不限于DNA结合蛋白、转录因子、染色质重塑因子、甲基化DNA结合蛋白、聚合酶、甲基化酶、脱甲基酶、乙酰化酶、脱乙酰基酶、激酶、磷酸酶、整合酶、重组酶、连接酶、拓扑异构酶、促旋酶和解旋酶。因此，所述术语包括作为引入细胞中的外源性序列的“转基因”或“目标基因”。
外源性分子与内源性分子可为相同类型的分子，例如外源性蛋白质或核酸。举例来说，外源性核酸可包括感染性病毒基因组、引入细胞中的质粒或附加体、或通常不存在于细胞中的染色体。用于将外源性分子引入细胞中的方法为本领域技术人员所知，并且包括但不限于脂质介导的转移(即脂质体，包括中性和阳离子脂质)、电穿孔、直接注射、细胞融合、粒子轰击、磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转移和病毒载体介导的转移。外源性分子与内源性分子也可为相同类型的分子，但源于与获得细胞的物种不同的物种。举例来说，人核酸序列可被引入最初源于小鼠或仓鼠的细胞系中。用于将外源性分子引入植物细胞中的方法为本领域技术人员所知，并且包括但不限于原生质体转化、碳化硅(例如WHISKERSTM)、土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化、脂质介导的转移(即脂质体，包括中性和阳离子脂质)、电穿孔、直接注射、细胞融合、粒子轰击(例如使用“基因枪”)、磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转移和病毒载体介导的转移。
相比来说，“内源性”分子是通常在特定发育阶段在特定环境条件下存在于特定细胞中的分子。举例来说，内源性核酸可包括染色体；线粒体、叶绿体或其它细胞器的基因组；或天然存在的附加型核酸。其它内源性分子可包括蛋白质，例如转录因子和酶。
如本文所用，术语“外源性核酸的产物”包括多核苷酸产物与多肽产物两者，例如转录产物(多核苷酸，如RNA)和翻译产物(多肽)。
“融合”分子是其中两个或更多个亚单位分子优选被共价连接的分子。亚单位分子可为相同化学类型的分子，或可为不同化学类型的分子。第一类型的融合分子的实例包括但不限于融合蛋白(例如ZFP或TALE DNA结合结构域与一个或多个活化结构域之间的融合物)和融合核酸(例如编码上文所述融合蛋白的核酸)。第二类型的融合分子的实例包括但不限于形成三链体的核酸与多肽之间的融合物、以及小沟结合剂与核酸之间的融合物。“融合多肽”是包含融合或键结于异源性多肽的多肽或其部分(例如一个或多个结构域)的多肽。融合多肽的实例包括免疫粘附素，其组合Cas蛋白的一部分与免疫球蛋白序列；以及表位标记的多肽，其可包含融合于“标签多肽”的Cas蛋白(例如)或其部分。标签多肽具有足以提供可制备针对其的抗体的表位的残基，但足够短以使它不干扰Cas的核酸酶活性。合适的标签多肽通常具有至少6个氨基酸残基，并且通常在约6-60个氨基酸残基之间。
在细胞中表达融合蛋白可由向细胞中递送融合蛋白所致，或通过向细胞中递送编码融合蛋白的多核苷酸来达成，其中所述多核苷酸被转录，并且转录物被翻译以产生融合蛋白。反式剪接、多肽裂解和多肽连接也可涉及在细胞中表达蛋白质。用于向细胞中递送多核苷酸和多肽的方法呈现在本公开中其它地方。
出于本公开的目的，“基因”包括编码基因产物的DNA区域(参见下文)以及调控基因产物的产生的所有DNA区域，无论此类调控序列是否邻近于编码和/或转录序列。因此，基因包括但未必限于启动子序列、终止子、翻译调控序列(如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点)、增强子、沉默子、绝缘子、边界元件、复制起点、基质附着位点和基因座控制区域。“工程改造的基因”是指已以某一方式被改变以使它与野生型基因不相同的基因。改变可呈靶向缺失、插入和截短形式。工程改造的基因可包含来自两种异源性基因的编码序列，或可包含合成的基因序列。工程改造的基因也可包含在蛋白质序列中沉默的编码序列变化(例如密码子优化)。工程改造的基因也可包括具有改变的调控序列的基因。
“基因表达”是指使基因中含有的信息转化成基因产物。基因产物可为基因的直接转录产物(例如mRNA、tRNA、rRNA、反义RNA、核酶、结构RNA或任何其它类型的RNA)或通过翻译mRNA产生的蛋白质。基因产物也包括通过如加帽、聚腺苷酸化、甲基化和编辑的过程修饰的RNA和通过例如甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、ADP核糖基化、肉豆蔻酰化和糖基化修饰的蛋白质。
“调节”基因表达是指基因的活性变化。调节表达可包括但不限于基因活化和基因阻抑。基因组编辑(例如裂解、改变、失活、随机突变)可用于调节表达。基因失活是指相较于不包括如本文所述的CRISPR/Cas系统的细胞，基因表达的任何降低。因此，基因失活可为部分或完全失活。
“植物”细胞包括但不限于单子叶(单子叶植物)或双子叶(双子叶植物)植物的细胞。单子叶植物的非限制性实例包括谷类植物，如玉米、稻、大麦、燕麦、小麦、高粱、黑麦、甘蔗、菠萝、洋葱、香蕉和椰子。双子叶植物的非限制性实例包括烟草、番茄、向日葵、棉花、糖用甜菜、马铃薯、莴苣、甜瓜、大豆、加拿大油菜(油菜籽)和苜蓿。植物细胞可来自植物的任何部分和/或来自植物发育的任何阶段。
“目标区域”是细胞染色质的其中合乎需要的是结合外源性分子的任何区域，例如像基因或基因内或邻近于基因的非编码序列。结合可出于靶向DNA裂解和/或靶向重组的目的。目标区域可存在于例如染色体、附加体、细胞器基因组(例如线粒体、叶绿体)或感染性病毒基因组中。目标区域可在基因的编码区内、转录的非编码区(例如像前导序列、尾随序列或内含子)内、或在编码区的上游或下游的非转录区域内。目标区域在长度方面可小至单一核苷酸对或多达2,000个核苷酸对，或任何整数值的核苷酸对。
“真核”细胞包括但不限于真菌细胞(如酵母)、植物细胞、动物细胞、哺乳动物细胞和人细胞(例如T细胞)。
“红血细胞”(RBC)或红细胞是源于造血干细胞的终末分化细胞。它们缺乏核酸酶和大多数细胞器。RBC含有用以将来自肺的氧携带至外周组织的血红蛋白。实际上，个别RBC的33％是血红蛋白。它们也将由细胞在代谢期间产生的CO2携带出组织以及携带回肺以在呼出期间释放。RBC是应答于血液缺氧而在骨髓中产生的，此通过由肾释放红血球生成素(EPO)来介导。EPO导致前成红细胞的数目增加，并且缩短为完全RBC成熟所需的时间。在约120天之后，因为RBC不含有核或任何其它再生能力，细胞通过肝、脾和淋巴结中巨噬细胞的吞噬细胞活性(约90％)或通过血浆中的溶血作用(约10％)而从循环移除。在巨噬细胞吞噬之后，由于溶酶体酶的作用，RBC的化学组分在巨噬细胞的液泡内被分解。
“分泌组织”是动物中的使产物分泌出个别细胞而进入某一类型的管腔中，通常源于上皮的那些组织。定位于胃肠道的分泌组织的实例包括内衬于肠道、胰腺和胆囊的细胞。其它分泌组织包括肝、与眼相关的组织以及粘膜，如唾液腺、乳腺、前列腺、垂体腺和内分泌系统的其它成员。另外，分泌组织包括某一组织类型的能够分泌的个别细胞。
术语“操作性连接”和“操作性地连接”(或“可操作地连接”)关于两个或更多个组分(如序列元件)的毗连可互换使用，其中排列各组分以使两种组分正常起作用，并且使得有可能至少一种组分可介导对至少一种其它组分施加的功能。以说明方式来说，如果转录调控序列应答于存在或不存在一种或多种转录调控因子来控制编码序列的转录水平，那么所述转录调控序列(如启动子)操作性地连接于所述编码序列。转录调控序列通常以顺式与编码序列操作性地连接，但无需直接邻近于它。举例来说，增强子是操作性地连接于编码序列的转录调控序列，即使它们不是邻接的。
关于融合多肽，术语“操作性地连接”可指以下事实：各组分在与其它组分连接下执行与它将如果不被如此连接所执行的功能相同的功能。举例来说，关于其中Cas DNA结合结构域融合于活化结构域的融合多肽，如果在所述融合多肽中，所述Cas DNA结合结构域部分能够结合它的靶位点和/或它的结合位点，同时所述活化结构域能够上调基因表达，那么所述Cas DNA结合结构域和所述活化结构域呈操作性连接。当融合多肽中Cas DNA结合结构域融合于裂解结构域时，如果在所述融合多肽中，所述Cas DNA结合结构域部分能够结合它的靶位点和/或它的结合位点，同时所述裂解结构域能够裂解在靶位点附近的DNA，那么所述Cas DNA结合结构域和所述裂解结构域呈操作性连接。
蛋白质、多肽或核酸的“功能性片段”是其序列不与全长蛋白质、多肽或核酸相同，但保留与全长蛋白质、多肽或核酸相同的功能的蛋白质、多肽或核酸。功能性片段可具有多于、少于或相同于相应天然分子的残基数目，和/或可含有一个或多个氨基酸或核苷酸取代。用于测定核酸的功能(例如编码功能、与另一核酸杂交的能力)的方法在本领域中是熟知的。类似地，用于测定蛋白质功能的方法是熟知的。举例来说，多肽的DNA结合功能可例如通过滤膜结合测定、电泳迁移率变动测定或免疫沉淀测定来测定。DNA裂解可通过凝胶电泳来测定。参见Ausubel等(上文)。可例如通过共免疫沉淀、双杂交测定、或遗传互补与生物化学互补两者来测定某一蛋白质与另一蛋白质相互作用的能力。参见例如Fields等(1989)Nature340:245-246；美国专利号5,585,245和PCT WO 98/44350。
“载体”能够将基因序列转移至靶细胞中。通常，“载体构建体”、“表达载体”和“基因转移载体”意指能够指导目标基因表达，并且可将基因序列转移至靶细胞中的任何核酸构建体。因此，所述术语包括克隆和表达媒介物以及整合载体。
“报道体基因”或“报道体序列”是指产生优选但未必在常规测定中易于测量的蛋白质产物的任何序列。合适的报道体基因包括但不限于编码介导抗生素抗性(例如氨苄西林抗性、新霉素抗性、G418抗性、嘌呤霉素抗性)的蛋白质的序列、编码显色或荧光或发光蛋白质(例如绿色荧光蛋白、增强的绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、荧光素酶)和介导增强的细胞生长和/或基因扩增的蛋白质(例如二氢叶酸还原酶)的序列。表位标签包括例如一个或多个拷贝的FLAG、His、myc、Tap、HA或任何可检测氨基酸序列。“表达标签”包括编码报道体的序列，其可被可操作地连接于所需基因序列以监测目标基因的表达。
术语“受试者”和“患者”可互换使用，并且是指如人患者和非人灵长类动物的哺乳动物、以及如兔、狗、猫、大鼠、小鼠和其它动物的实验动物。因此，如本文所用的术语“受试者”或“患者”意指可向其施用本发明的干细胞的任何哺乳动物患者或受试者。本发明的受试者包括已暴露于一种或多种化学毒素，包括例如神经毒素的那些。
CRISPR/Cas系统
近来已出现强力证据表明在古细菌和许多细菌中存在RNA介导的基因组防御路径，其已被假设类似于真核RNAi路径(对于综述，参见Godde和Bickerton,2006.J.Mol.Evol.62:718-729；Lillestol等,2006.Archaea 2:59-72；Makarova等,2006.Biol.Direct 1:7.；Sorek等,2008.Nat.Rev.Microbiol.6:181-186)。称为CRISPR-Cas系统或原核RNAi(pRNAi)，所述路径被提出是由两个在进化上以及常常在物理上连锁的基因座引起：CRISPR(成簇规律间隔的短回文重复序列)基因座，其编码系统的RNA组分；和cas(CRISPR相关)基因座，其编码蛋白质(Jansen等,2002.Mol.Microbiol.43:1565-1575；Makarova等,2002.Nucleic Acids Res.30:482-496；Makarova等,2006.Biol.Direct 1:7；Haft等,2005.PLoS Comput.Biol.1:e60)。微生物宿主中的CRISPR基因座含有CRISPR相关(Cas)基因以及能够使CRISPR介导的核酸裂解的特异性程序化的非编码RNA元件的组合。个别Cas蛋白不与真核RNAi机构的蛋白质组分共有显著序列类似性，但具有类似预测功能(例如RNA结合、核酸酶、解旋酶等)(Makarova等,2006.Biol.Direct 1:7)。CRISPR相关(cas)基因常与CRISPR重复序列-间隔区阵列相关。已描述超过40个不同Cas蛋白家族。在这些蛋白质家族中，Cas1似乎普遍存在于不同CRISPR/Cas系统之中。cas基因和重复序列结构的特定组合已用于定义8个CRISPR亚型(Ecoli、Ypest、Nmeni、Dvulg、Tneap、Hmari、Apem和Mtube)，其中一些与编码重复序列相关的神秘蛋白(RAMP)的另一基因模块相关。超过一个CRISPR亚型可存在于单一基因组中。CRISPR/Cas亚型的不规则分布表明系统在微生物进化期间经受水平基因转移。
最初于化脓性链球菌中描述的II型CRISPR是一个最充分表征的系统，并且在四个连续步骤中进行靶向DNA双链断裂。首先，两个非编码RNA，即前crRNA阵列和tracrRNA从CRISPR基因座被转录。其次，tracrRNA与前crRNA的重复序列区域杂交，并且介导将前crRNA加工成含有个别间隔区序列的成熟crRNA，其中加工通过双链特异性RNA酶III在Cas9蛋白存在下而发生。第三，成熟crRNA:tracrRNA复合物通过crRNA上的间隔区与靶DNA上紧接于前间区序列邻近基序(PAM)的原型间隔区之间的沃森-克里克碱基配对来将Cas9引导至靶DNA，所述前间区序列邻近基序是达成靶标识别的另一要求。此外，tracrRNA也必须存在，因为它与crRNA在它的3’末端进行碱基配对，并且这个缔合触发Cas9活性。最后，Cas9介导靶DNA的裂解以在原型间隔区内产生双链断裂。CRISPR/Cas系统的活性包括三步：(i)在称为‘适应(adaptation)’的过程中将外来DNA序列插入CRISPR阵列中以防止未来攻击，(ii)表达相关蛋白质以及表达和加工阵列，继之以(iii)RNA介导的干扰外来核酸。因此，在细菌细胞中，若干所谓‘Cas’蛋白涉及CRISPR/Cas系统的天然功能。
II型CRISPR系统已见于许多不同细菌中。由Fonfara等((2013)Nuc Acid Res 42(4):2377-2590)对公开可用的基因组进行BLAST搜索在347个细菌物种中发现Cas9直系同源物。另外，这个小组证明使用来自化脓性链球菌(S.pyogenes)、变形链球菌(S.mutans)、嗜热链球菌(S.therophilus)、空肠弯曲菌(C.jejuni)、脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitides)、多杀性巴氏杆菌(P.multocida)和新凶手弗朗西斯菌(F.novicida)的Cas9直系同源物进行的体外CRISPR/Cas裂解DNA靶标。因此，术语“Cas9”是指包含DNA结合结构域和两个核酸酶结构域的RNA引导的DNA核酸酶，其中编码Cas9的基因可源于任何合适的细菌。
Cas9蛋白具有至少两个核酸酶结构域：一个核酸酶结构域类似于HNH核酸内切酶，而另一核酸酶结构域类似于Ruv核酸内切酶结构域。HNH型结构域似乎负责裂解与crRNA互补的DNA链，而Ruv结构域裂解非互补链。可工程改造Cas 9核酸酶以使仅一个核酸酶结构域具有功能性，由此产生Cas切口酶(参见Jinek等(同上)。可通过酶的催化结构域中的氨基酸的特异性突变，或通过截短结构域的一部分或全部以使它不再具有功能性来产生切口酶。因为Cas 9包含两个核酸酶结构域，所以可对任一结构域采用这个方法。可通过使用两种此类Cas 9切口酶在靶DNA中实现双链断裂。切口酶将各自裂解DNA的一条链，并且使用两种切口酶将产生双链断裂。
CRISPR基因座的主要产物似乎是含有侵入靶向序列，并且基于它们在路径中的假设作用称为向导RNA或原核沉默RNA(psiRNA)的短RNA(Makarova等,2006.Biol.Direct 1:7；Hale等,2008.RN A,14:2572-2579)。RNA分析指示CRISPR基因座转录物在重复序列内被裂解以释放含有个别侵入靶向序列和侧接重复序列片段的约60-70nt RNA中间体(Tang等2002.Proc.Natl.Acad.Sci.99:7536-7541；Tang等,2005.Mol.Microbiol.55:469-481；Lillestol等2006.Archaea 2:59-72；Brouns等2008.Science 321:960-964；Hale等,2008.RNA,14:2572-2579)。在古细菌激烈火球菌(Pyrococcus furio sus)中，这些中间体RNA被进一步加工成充足、稳定的约35至45nt成熟psiRNA(Hale等2008.RNA,14:2572-2579)。可通过使用包含通常通过使crRNA和tracrRNA退火形成的发夹的工程改造的“单导向RNA”(sgRNA)来避免对crRNA-tracrRNA复合物的需要(参见Ji nek等(2012)Science337:816以及Cong等(2013)Sciencexpress/10.1126/science.1231143)。在化脓性链球菌中，当在Cas相关RNA与靶DNA之间形成双链RNA:DNA异二聚体时，工程改造的tracrRNA:crRNA融合物或sgRNA引导Cas9裂解靶DNA。包含Cas9蛋白和含有PAM序列的工程改造的sgRNA的这个系统已用于RNA引导的基因组编辑(参见Ramalingam(同上))，并且已适用于斑马鱼体内胚胎基因组编辑(参见Hwang等(2013)Nature Biotechnology 31(3):227)，其中编辑效率类似于ZFN和TALEN。
其它Cas蛋白
“Cas1”多肽是指CRISPR相关(Cas)蛋白1。Cas1(直系同源组蛋白质簇分类系统中的COG1518)是CRISPR相关系统(CASS)的最佳标志物。基于系统发生比较，已鉴定七种不同形式的CRISPR相关免疫系统(CASS1-7)。
用于本文所述的方法中的Cas1多肽可为存在于任何原核生物中的任何Cas1多肽。在某些实施方案中，Cas1多肽是古细菌微生物的Cas1多肽。在某些实施方案中，Cas1多肽是广古菌门(Euryarchaeota)微生物的Cas1多肽。在某些实施方案中，Cas1多肽是泉古菌门(Crenarchaeota)微生物的Cas1多肽。在某些实施方案中，Cas1多肽是细菌的Cas1多肽。在某些实施方案中，Cas1多肽是革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌的Cas1多肽。在某些实施方案中，Cas1多肽是绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的Cas1多肽。在某些实施方案中，Cas1多肽是超嗜热菌(Aquifex aeolicus)的Cas1多肽。在某些实施方案中，Cas1多肽是作为CASS1-7中的一个的成员的Cas1多肽。在某些实施方案中，Cas1多肽是作为CASS3的成员的Cas1多肽。在某些实施方案中，Cas1多肽是作为CASS7的成员的Cas1多肽。在某些实施方案中，Cas1多肽是作为CASS3或CASS7的成员的Cas1多肽。
在一些实施方案中，Cas1多肽由以例如GeneID号：2781520、1006874、9001811、947228、3169280、2650014、1175302、3993120、4380485、906625、3165126、905808、1454460、1445886、1485099、4274010、888506、3169526、997745、897836或1193018提供在GenBank中的核苷酸序列编码，和/或是展现与由这些多核苷酸编码的氨基酸的同源性(例如大于80％、90至99％，包括91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的氨基酸序列，并且所述多肽充当Cas1多肽。
Cas6是另一Cas多肽，并且核糖核酸内切酶活性在本文中被称为Cas6核糖核酸内切酶活性。合适的Cas6多肽的非限制性实例以Genbank登记号AAL81255描绘。Cas6多肽可从具有CRISPR基因座和cas(CRISPR相关)基因座的微生物(如但不限于激烈火球菌)富集、分离或纯化，或可使用重组技术产生，或使用常规方法化学或酶促合成。在一些方面，Cas6多肽可从不具有CRISPR基因座的微生物富集、分离或纯化。Cas6多肽可在C末端附近包括GhGxxxxxGhG(SEQ ID NO:216)基序(其中“h”指示疏水性氨基酸)。Arg或Lys可见于并且常见于5个氨基酸的中心链段内。Cas6多肽含有至少一个可在催化中起作用的残基或其保守性取代。Cas6多肽可含有也可在催化中起作用的其它残基或其保守性取代。预期在催化中起作用的残基可位于富含G的环的附近，所述环在蛋白质的3D结构中含有Cas6特征基序。Cas6多肽可包括以登记号TIGR01877和PF01881存在于TIGRFAM数据库中的结构域。TIGRFAM数据库包括其功能是保守的多肽的家族(Haft等,Nucl.Acids Res.,2003,31:371-373；Bateman和Haft,2002,Briefings Bioinformatics,3:236-245；以及Haft等,2005,PLoSComputational Biol.,1(6):e60)。
本文提供的Cas6多肽的其它实例包括存在于具有CRISPR基因座和cas基因座的原核微生物中的那些。可易于鉴定包括CRISPR基因座的任何微生物中的Cas6多肽。编码Cas6多肽的编码区通常在紧密邻近于CRISPR基因座定位的cas基因座中。Haft等(2005,PLoSComputational Biol.,1(6):e60)综述Cas蛋白家族，并且创建用于鉴定CRISPR/Cas系统的特定亚型的规则。Haft等将编码Cas6多肽的编码区描述为与至少四个单独CRISPR/Cas亚型(Tneap、Hmari、Apem和Mtube)关联所见，并且通常是位于CRISPR基因座最远端的cas编码区。可使用可在JCVI综合微生物资源(Comprehensive Microbial Resource)处获得的资源来鉴定Cas6多肽。因此，适用于本文所述的方法中的Cas6多肽可由熟练人士使用常规方法鉴定。
具有含有预期编码Cas6多肽的编码区的已知完整基因组序列的原核微生物的实例包括海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8、胎儿弯曲杆菌(Campylobacter fetus)亚种fetus 82-40、核粒梭形杆菌(Fu sobacterium nucleatum)ATCC 25586、嗜热链球菌(Streptococcus ther mophilus)LMG 18311、腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobactertengcon gensis)MB4(T)、热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)ATCC 39073、哈夫尼脱亚硫酸菌(Desulfitobacterium hafniense)Y51、破伤风梭菌(Cl ostridium tetani)E88、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)SM101、艰难梭菌(Clostridium difficile)QCD-32g58、霍尔A桑格尔肉毒梭菌(Clostridium botulinum Hall A Sanger)、朗厄兰肉毒梭菌F(Clostridium botulinum F Langeland)、肉毒梭菌B1菌株Okra、肉毒梭菌A3菌株Loch Maree、霍尔肉毒梭菌A(Clostridium botulinum AHall)、肉毒梭菌AATCC 19397、生氢一氧化碳嗜热菌(Carboxydothermus hydro genoformans)Z-2901、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)RP62A、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)HB8、嗜热栖热菌HB27、念珠藻属种PCC 7120(Nostoc sp.PCC 7120)、多变鱼腥藻(Anabaenavariabilis)ATCC 29413、聚球藻属种主要B型OS(Synechococccus sp.OS Type B prime)、聚球藻属种A型OS、牙龈卟啉单胞菌(Porphy romonas gingivalis)W83、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)YCH46、脆弱拟杆菌NCTC9343、超嗜热菌VF5、嗜木聚糖红色杆菌(Rubrobact er xylanophilus)DSM 9941、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculos is)H37Rv(实验室菌株)、结核分枝杆菌CDC1551、牛分枝杆菌(Myco bacterium bovis)亚种bovis AF2122/97、桤木弗兰克氏菌(Frankia al ni)ACN14a、火山热原体(Thermoplasmavolcanium)GSS1、干热嗜酸菌(Picrophilus torridus)DSM 9790、鹿儿岛高温球菌(Thermococcus kodakarensis)KOD1、掘越氏火球菌(Pyrococcus horikoshii shinkaj)OT3、激烈火球菌DSM 3638、深海火球菌(Pyrococcus abyssi)GE5、巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri fusaro)、嗜乙酸甲烷八叠球菌(Methanosarcinaacetivorans)C2A、布氏拟甲烷球菌(Methanococcoi des burtonii)DSM 6242、詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)DS M2661、嗜热自养甲烷杆菌(Methanobacteriumthermoautotrophicum)δH、死海盐盒菌(Haloarcula marismortui)ATCC 43049、闪烁古球状菌(Archaeoglobus fulgidus)DSM4304、喜气火棒菌(Pyrobaculum aerophi lum)1M2、头寇岱硫化叶菌(Sulfolobus tokodaii)菌株7、硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobussolfataricus)P2、嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocalda rius)DSM 639、敏捷气热菌(Aeropyrum pernix)K1。Cas6多肽的其它实例为熟练人士所知，参见例如COG 1583组多肽的成员(可通过国立生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)因特网站点在直系同源组蛋白质簇(COG)网页处获得，也参见Tatuso v等,(1997),Science,278:631-637；以及Tatusov等(2003),BMC Bioinformatics,4(1):41)，具有登记号IPRO10156的InterPro家族的成员，Makarova等,(2002),Nuc.Acids Res.,30:482-496以及Haft等(2005),PLoS Comput.Biol.,1(6):e60,474-483)。
在某些实施方案中，Cas蛋白可为天然存在的Cas蛋白的“功能性衍生物”。天然序列多肽的“功能性衍生物”是与天然序列多肽具有共同定性生物性质的化合物。“功能性衍生物”包括但不限于天然序列的片段以及天然序列多肽和它的片段的衍生物，条件是它们与相应的天然序列多肽具有共同生物活性。本文涵盖的生物活性是功能性衍生物将DNA底物水解成片段的能力。术语“衍生物”涵盖多肽的氨基酸序列变体、共价修饰及其融合物。在一些方面，功能性衍生物可包含天然存在的Cas蛋白的单一生物性质。在其它方面，功能衍生物可包含天然存在的Cas蛋白的一子组生物性质。
“Cas1多肽”涵盖全长Cas多肽、Cas多肽的酶活性片段、以及Cas多肽或其片段的酶活性衍生物。Cas多肽或其片段的合适的衍生物包括但不限于Cas蛋白或其片段的突变体、融合物、共价修饰。包括Cas蛋白或其片段以及Cas蛋白或其片段的衍生物的Cas蛋白可从细胞获得，或以化学方式合成，或通过这两种方法的组合获得。细胞可为天然产生Cas蛋白的细胞，或天然产生Cas蛋白，并且被遗传工程改造以在较高表达水平下产生内源性Cas蛋白或由外源引入的核酸产生Cas蛋白的细胞，所述核酸编码与内源性Cas相同或不同的Cas。在某一情况下，细胞不天然产生Cas蛋白，并且被遗传工程改造以产生Cas蛋白。
CRISPR/Cas系统也可用于抑制基因表达。Lei等(参见(2013)Cell,152,(5):1173-1183)已显示缺乏核酸内切酶活性的催化死亡的Cas9在与向导RNA共表达时产生可特异性干扰转录延伸、RNA聚合酶结合或转录因子结合的DNA识别复合物。这个系统(称为CRISPR干扰(CRISPRi))可高效阻抑靶向基因的表达。
可使本发明的Cas蛋白突变以改变功能性。包括噬菌体展示和双杂交系统的示例性选择方法公开于美国专利5,789,538；5,925,523；6,007,988；6,013,453；6,410,248；6,140,466；6,200,759；和6,242,568；以及WO 98/37186；WO 98/53057；WO 00/27878；WO 01/88197和GB 2,338,237中。此外，已例如在共同拥有的WO 02/077227中描述锌指结合结构域的结合特异性的增强。
选择靶位点；DNA结合结构域以及用于设计和构建融合蛋白(和编码其的多核苷酸)的方法为本领域技术人员所知，并且详细描述于美国专利号8,586,526；6,140,081；5,789,538；6,453,242；6,534,261；5,925,523；6,007,988；6,013,453；6,200,759；WO 95/19431；WO96/06166；WO 98/53057；WO 98/54311；WO 00/27878；WO 01/60970WO 01/88197；WO 02/099084；WO 98/53058；WO 98/53059；WO98/53060；WO 02/016536和WO 03/016496中。
B.功能性结构域
本文所述的系统可包括与单导向RNA缔合以作用于靶基因的任何合适的功能性结构域。功能性结构域的非限制性实例包括转录活化结构域、转录阻抑结构域和/或核酸酶结构域。参见例如美国专利号6,534,261；和8,409,861。
在某些实施方案中，功能性结构域包括一个或多个裂解结构域。功能性结构域(例如裂解结构域)可与DNA结合结构域异源，例如与CRISPR/Cas系统的单导向RNA异源的功能性结构域。异源性裂解结构域可从任何核酸内切酶或核酸外切酶获得。可从其获得裂解结构域的示例性核酸内切酶包括但不限于限制性核酸内切酶和归巢核酸内切酶。参见例如2002-2003Catalogue,New England Biolabs,Beverl y,MA；以及Belfort等(1997)NucleicAcids Res.25:3379-3388。裂解DNA的其它酶是已知的(例如S1核酸酶；绿豆核酸酶；胰腺DNA酶I；微球菌核酸酶；酵母HO核酸内切酶；也参见Linn等(编)Nu cleases,Cold SpringHarbor Laboratory Press,1993)。这些酶(或其功能性片段)中的一个或多个可用作裂解结构域和裂解半结构域的来源。在一些实施方案中，Cas蛋白可连接于异源性核酸酶结构域。在一些方面，Cas蛋白是缺乏核酸酶活性的Cas9蛋白，其连接于FokI核酸酶结构域以使双链裂解取决于FokI核酸酶结构域的二聚化。
类似地，裂解半结构域可源于如上所述的需要二聚化以达成裂解活性的任何核酸酶或其部分。一般来说，如果融合蛋白包含裂解半结构域，那么裂解需要两种融合蛋白。或者，可使用包含两个裂解半结构域的单一蛋白质。两个裂解半结构域可源于相同核酸内切酶(或其功能性片段)，或每个裂解半结构域可源于不同核酸内切酶(或其功能性片段)。此外，两种融合蛋白的靶位点优选相对于彼此配置以使两种融合蛋白与它们的各自靶位点的结合以允许裂解半结构域例如通过二聚化来形成功能性裂解结构域的彼此空间定向放置裂解半结构域。因此，在某些实施方案中，接近靶位点的边缘由5-8个核苷酸或由15-18个核苷酸分隔。然而，任何整数个核苷酸或核苷酸对都可插入两个靶位点之间(例如2至50个核苷酸对或大于50个核苷酸对)。一般来说，裂解位点位于靶位点之间。
限制性核酸内切酶(限制酶)存在于许多物种中，并且能够以序列特异性方式结合DNA(在识别位点处)，以及在结合位点处或附近裂解DNA。某些限制酶(例如IIS型)在远离识别位点的位点处裂解DNA，并且具有可分开的结合结构域和裂解结构域。举例来说，IIS型酶Fok I在距一条链上的其识别位点9个核苷酸以及距另一条链上的其识别位点13个核苷酸处催化DNA的双链裂解。参见例如美国专利5,356,802；5,436,150和5,487,994；以及Li等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4275-4279；Li等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:2764-2768；Kim等(1994a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:883-887；Kim等(1994b)J.Biol.Cheni.269:31,978-31,982。因此，在一个实施方案中，融合蛋白包含来自至少一种IIS型限制酶的裂解结构域(或裂解半结构域)以及一个或多个可以或不可以被工程改造的锌指结合结构域。
其裂解结构域与结合结构域分开的示例性IIS型限制酶是Fok I。这个特定酶以二聚体形式具有活性。Bitinaite等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:10,570-10,575。因此，出于本公开的目的，用于公开的融合蛋白中的Fok I酶的部分被视为裂解半结构域。因此，对于使用锌指-Fok I融合物靶向双链裂解和/或靶向替换细胞序列，两种各自包含FokI裂解半结构域的融合蛋白可用于重构催化活性裂解结构域。或者，也可使用含有DNA结合结构域和两个Fok I裂解半结构域的单一多肽分子。
裂解结构域或裂解半结构域可为保留裂解活性，或保留多聚化(例如二聚化)以形成功能性裂解结构域的能力的蛋白质的任何部分。
示例性IIS型限制酶描述于整体并入本文的国际公布WO07/014275中。其它限制酶也含有可分开的结合结构域和裂解结构域，并且这些酶也由本公开涵盖。参见例如Roberts等(2003)Nucleic Acids Res.31:418-420。
在某些实施方案中，裂解结构域包含一个或多个使同二聚化最小或防止同二聚化的工程改造的裂解半结构域(也被称为二聚化结构域突变体)，如例如美国专利号7,914,796；8,034,598；和8,623,618中所述，所述专利的全部公开内容以引用的方式整体并入本文。在Fok I的位置446、447、479、483、484、486、487、490、491、496、498、499、500、531、534、537和538处的氨基酸残基都是用于影响Fok I裂解半结构域的二聚化的靶标。
Fok I的形成专性异二聚体的示例性工程改造的裂解半结构域包括以下结构域对：其中第一裂解半结构域在Fok I的位置490和538处的氨基酸残基处包括突变，并且第二裂解半结构域在氨基酸残基486和499处包括突变。
因此，在一个实施方案中，在490处的突变用Lys(K)替换Glu(E)；在538处的突变用Lys(K)替换Iso(I)；在486处的突变用Glu(E)替换Gln(Q)；并且在位置499处的突变用Lys(K)替换Iso(I)。具体来说，通过在一个裂解半结构域中使位置490(E→K)和538(I→K)突变以产生指定为“E490K:I538K”的工程改造的裂解半结构域，以及通过在另一裂解半结构域中使位置486(Q→E)和499(I→L)突变以产生指定为“Q486E:I499L”的工程改造的裂解半结构域来制备本文所述的工程改造的裂解半结构域。本文所述的工程改造的裂解半结构域是其中异常裂解得以最小化或消除的专性异二聚体突变体。在某些实施方案中，工程改造的裂解半结构域包含在位置486、499和496(相对于野生型FokI编号)处的突变，例如用Glu(E)残基替换位置486处的野生型Gln(Q)残基，用Leu(L)残基替换位置499处的野生型Iso(I)残基，以及用Asp(D)或Glu(E)残基替换位置496处的野生型Asn(N)残基的突变(也分别被称为“ELD”和“ELE”结构域)。在其它实施方案中，工程改造的裂解半结构域包含在位置490、538和537(相对于野生型FokI编号)处的突变，例如用Lys(K)残基替换位置490处的野生型Glu(E)残基，用Lys(K)残基替换位置538处的野生型Iso(I)残基，以及用Lys(K)残基或Arg(R)残基替换位置537处的野生型His(H)残基的突变(也分别被称为“KKK”和“KKR”结构域)。在其它实施方案中，工程改造的裂解半结构域包含在位置490和537(相对于野生型FokI编号)处的突变，例如用Lys(K)残基替换位置490处的野生型Glu(E)残基，以及用Lys(K)残基或Arg(R)残基替换位置537处的野生型His(H)残基的突变(也分别被称为“KIK”和“KIR”结构域)。(参见美国专利公布号20110201055，其以引用的方式并入本文)。本文所述的工程改造的裂解半结构域可使用任何合适的方法，例如通过野生型裂解半结构域(Fok I)的定点诱变来制备。
或者，核酸酶可使用所谓“分割酶(split-enzyme)”技术在核酸靶位点处体内装配(参见例如美国专利公布号20090068164)。此类分割酶的组分可在单独表达构建体上表达，或可连接在一个开放阅读框中，其中个别组分例如由自身裂解性2A肽或IRES序列分隔。组分可为个别锌指结合结构域或大范围核酸酶(meganuclease)核酸结合结构域的结构域。
可在例如于如美国专利号8,563,314中所述的基于酵母的染色体系统中使用之前筛选具有活性的核酸酶。使用本领域中已知的方法，可易于设计核酸酶表达构建体。核酸酶的表达可受控于组成型启动子或诱导型启动子，例如在棉子糖和/或半乳糖存在下被活化(去阻抑)，并且在葡萄糖存在下被阻抑的半乳糖激酶启动子。
CRISPR/Cas的RNA组分
Cas9相关CRISPR/Cas系统包含两种RNA非编码组分：tracrRNA和含有由相同的同向重复序列(DR)间隔的核酸酶向导序列(间隔区)的前crRNA阵列。为使用CRISPR/Cas系统实现基因组工程改造，必须存在这些RNA的两种功能(参见Cong等,(2013)Sciencexpress1/10.1126/science 1231143)。在一些实施方案中，tracrRNA和前crRNA通过单独表达构建体或以单独RNA形式提供。在其它实施方案中，构建嵌合RNA，其中使工程改造的成熟crRNA(赋予靶标特异性)融合于tracrRNA(提供与Cas9相互作用)以产生嵌合crRNA-tracrRNA杂交物(也称为单导向RNA)。(参见Jinek(同上)以及Cong(同上))。
嵌合物或sgRNA可被工程改造以包含与任何所需靶标互补的序列。RNA包含22个与靶标具有互补性，而且具有形式：G[n19]继之以具有形式NGG的前间区序列邻近基序(PAM)的碱基。因此，在一种方法中，sgRNA可通过以下方式利用目标基因中的已知ZFN靶标来设计：(i)比对ZFN异二聚体的识别序列与相关基因组(人、小鼠或特定植物物种)的参照序列；(ii)鉴定ZFN半位点(half-site)之间的间隔区区域；(iii)鉴定最靠近间隔区区域的基序G[N20]GG的位置(当超过一个此类基序重叠于间隔区时，选择相对于间隔区处于中心的基序)；(iv)使用该基序作为sgRNA的核心。这个方法有利地依赖于被证明的核酸酶靶标。或者，可仅通过鉴定符合G[n20]GG式的合适的靶序列来设计sgRNA以靶向任何目标区域。连同互补性区域一起，sgRNA可包含用以延伸至sgRNA的tracrRNA部分的尾部区域的其它核苷酸(参见Hsu等(2013)Nature Biotech doi:10.1038/nbt.2647)。尾部可具有+67至+85个核苷酸，或介于其之间的任何数目，其中优选长度是+85个核苷酸。也可使用截短的sgRNA(“tru-gRNA”)(参见Fu等,(2014)Nature Biotech 32(3):279)。在tru-gRNA中，互补性区域的长度减少至17或18个核苷酸。
此外，使用化脓性链球菌Cas9，也可利用替代性PAM序列，其中PAM序列可为作为NGG的替代物的NAG(Hsu 2014(同上))。其它PAM序列也可包括缺乏初始G的那些(Sander和Joung(2014)Nature Biotech 32(4):347)。除化脓性链球菌编码的Cas9 PAM序列之外，可使用来自其它细菌来源的对Cas9蛋白特异性的其它PAM序列。举例来说，以下显示的PAM序列(根据Sander和Joung(同上)以及Esvelt等,(2013)Nat Meth 10(11):1116改编)是这些Cas9蛋白特异性的：
Figure BDA0004012523450000671
因此，可根据以下指导方针选择适于与化脓性链球菌CRISPR/Cas系统一起使用的靶序列：[n17,n18,n19或n20](G/A)G。或者，PAM序列可遵循指导方针G[n17,n18,n19,n20](G/A)G。对于源于非化脓性链球菌细菌的Cas9蛋白，可使用相同指导方针，其中替代性PAM替代化脓性链球菌PAM序列。
最优选的是选择避免潜在脱靶序列的具有最高特异性可能性的靶序列。这些非所需脱靶序列可通过考虑以下属性来鉴定：i)继之以已知与所用Cas9蛋白一起起作用的PAM序列的靶序列的类似性；ii)与所需靶序列的错配少于三个的类似靶序列；iii)如ii)中的类似靶序列，其中错配都位于PAM远端区域而非PAM近端区域中(存在一定证据表明紧密邻近或近接于PAM的核苷酸1-5，有时被称为‘种子’区域(Wu等(2014)Nature Biotech doi:10.1038/nbt2889)，对于识别最为关键，因此错配位于种子区域中的推定脱靶位点由sgRNA识别的可能性最小)；以及iv)类似靶序列，其中错配不连续间隔或间隔开大于四个核苷酸(Hsu 2014(同上))。因此，通过使用以上这些准则来对基因组中就所采用的任何一个CRIPSR/Cas系统而言的潜在脱靶位点的数目进行分析，可鉴定适于sgRNA的靶序列。
供体
如上所指示，插入外源性序列(也称为“供体序列”或“供体”或“转基因”)例如以修正突变基因或增加野生型基因的表达。将显而易见的是供体序列通常不与它被放置所处的基因组序列相同。供体序列可含有由两个具有同源性的区域侧接以允许在目标位置处进行高效HDR的非同源序列。或者，供体可不具有与DNA中的靶向位置具有同源性的区域，并且可在于靶位点处裂解之后通过NHEJ依赖性末端连接来整合。另外，供体序列可包括含有不与细胞染色质中的目标区域同源的序列的载体分子。供体分子可含有与细胞染色质具有同源性的若干不连续区域。举例来说，对于靶向插入通常不存在于目标区域中的序列，所述序列可存在于供体核酸分子中，并且由与目标区域中的序列具有同源性的区域侧接。
供体多核苷酸可为单链和/或双链DNA或RNA，并且可以线性或环状形式引入细胞中。参见例如美国专利公布号20100047805和20110207221。如果以线性形式引入，那么可通过为本领域技术人员所知的方法来保护供体序列的末端(例如以免遭核酸外切降解)。举例来说，添加一个或多个双脱氧核苷酸残基至线性分子的3’末端中，和/或使自身互补的寡核苷酸连接于一个或两个末端。参见例如Chang等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:4959-4963；Nehls等(1996)Science272:886-889。用于保护外源性多核苷酸免遭降解的其它方法包括但不限于添加末端氨基以及使用修饰的核苷酸间键联，例如像硫代磷酸酯、氨基磷酸酯和O-甲基核糖或脱氧核糖残基。
多核苷酸可作为具有例如像复制起点、启动子和编码抗生素抗性的基因的其它序列的载体分子的一部分引入细胞中。此外，供体多核苷酸可以裸露核酸形式，以与如脂质体或泊洛沙姆(poloxamer)的试剂复合的核酸形式引入，或可通过病毒(例如腺病毒、AAV、疱疹病毒、逆转录病毒、慢病毒和整合酶缺陷型慢病毒(IDLV))来递送。
通常插入供体以使它的表达由在整合位点处的内源性启动子，也就是驱动向其中插入供体的内源性基因(例如球蛋白、AAVS1等)的表达的启动子驱动。然而，将明显的是供体可包含启动子和/或增强子，例如组成型启动子或诱导型或组织特异性启动子。
可将供体分子插入内源性基因中以使全部、一些或无内源性基因被表达。在其它实施方案中，可将转基因(例如具有或不具有球蛋白编码序列)整合至任何内源性基因座，例如安全港基因座中。参见例如美国专利公布20080299580；20080159996和201000218264。
此外，尽管不为表达所需，但外源性序列也可包括转录或翻译调控序列，例如启动子、增强子、绝缘子、内部核糖体进入位点、编码2A肽的序列和/或聚腺苷酸化信号。
递送
核酸酶、编码这些核酸酶的多核苷酸、供体多核苷酸和包含本文所述的蛋白质和/或多核苷酸的组合物可通过任何合适的手段体内或离体递送。
递送如本文所述的核酸酶的方法例如描述于美国专利号6,453,242；6,503,717；6,534,261；6,599,692；6,607,882；6,689,558；6,824,978；6,933,113；6,979,539；7,013,219；和7,163,824中，所述专利全部公开内容以引用的方式整体并入本文。
如本文所述的核酸酶和/或供体构建体也可使用含有编码一种或多种CRISPR/Cas系统的序列的载体来递送。可使用任何载体系统，包括但不限于质粒载体、DNA小环、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、痘病毒载体；疱疹病毒载体和腺相关病毒载体等及其组合。也参见美国专利号6,534,261；6,607,882；6,824,978；6,933,113；6,979,539；7,013,219；和7,163,824以及美国专利申请号14/271,008，其以引用的方式整体并入本文。此外，将明显的是这些载体中的任一个都可包含一个或多个为治疗所需的序列。因此，当将一种或多种核酸酶和供体构建体引入细胞中时，核酸酶和/或供体多核苷酸可被携带在同一载体上或不同载体上。当使用多种载体时，每种载体可包含编码一种或多种核酸酶和/或供体构建体的序列。
常规病毒和基于非病毒的基因转移方法可用于在细胞(例如哺乳动物细胞)和靶组织中引入编码核酸酶和供体构建体的核酸。非病毒载体递送系统包括DNA质粒、DNA小环、裸露核酸和与如脂质体或泊洛沙姆的递送媒介物复合的核酸。病毒载体递送系统包括DNA和RNA病毒，在递送至细胞中之后，其具有附加型或整合的基因组。对于基因疗法方法的综述，参见Anderson,Science 256:808-813(1992)；Nabel和Feigner,TIBTECH 11:211-217(1993)；Mitani和Caskey,TIBTECH 11:162-166(1993)；Dillon,TIBTECH 11:167-175(1993)；Miller,Nature 357:455-460(1992)；Van Brunt,Biotechnology 6(10):1149-1154(1988)；Vigne,Restorative Neurology and Neuroscience8:35-36(1995)；Kremer和Perricaudet,British Medical Bulletin51(1):31-44(1995)；Haddada等,CurrentTopics in Microbiology and Immunology Doerfler和
Figure BDA0004012523450000711
(编)(1995)；以及Yu等,GeneTherapy1:13-26(1994)。
非病毒递送核酸的方法包括电穿孔、脂质体转染、显微注射、基因枪、病毒体、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质：核酸缀合物、裸露DNA、裸露RNA、加帽的RNA、人工病毒粒子和试剂增强的DNA摄取。使用例如Sonitron 2000系统(Rich-Mar)进行的声致穿孔也可用于递送核酸。
其它示例性核酸递送系统包括由Amaxa Biosystems(Cologne,Germany)、Maxcyte,Inc.(Rockville,Maryland)、BTX Molecular Delivery Systems(Holliston,MA)和Copernicus Therapeutics Inc提供的那些(参见例如美国专利号6,008,336)。脂质体转染描述于例如美国专利号5,049,386；4,946,787；和4,897,355中，并且脂质体转染试剂在商业上有售(例如TransfectamTM和LipofectinTM)。适于高效受体识别脂质体转染多核苷酸的阳离子性和中性脂质包括Felgner,WO 91/17424、WO 91/16024的那些。
制备脂质：核酸复合物(包括靶向脂质体，如免疫脂质复合物)为本领域技术人员所熟知(参见例如Crystal,Science 270:404-410(1995)；Blaese等,Cancer Gene Ther.2:291-297(1995)；Behr等,Bioco njugate Chern.5:382-389(1994)；Remy等,BioconjugateChern.5:647-654(1994)；Gao等,Gene Therapy 2:710-722(1995)；Ahmad等,CancerRes.52:4817-4820(1992)；美国专利号4,186,183、4,217,344、4,235,871、4,261,975、4,485,054、4,501,728、4,774,085、4,837,028和4,946,787)。
其它递送方法包括使用将待递送的核酸包装至EnGeneIC递送媒介物(EDV)中的方法。使用双特异性抗体将这些EDV特异性递送至靶组织中，其中抗体的一个臂对靶组织具有特异性，并且另一臂对EDV具有特异性。抗体将EDV带至靶细胞表面，接着EDV通过胞吞作用被带入细胞中。一旦在细胞中，内含物即被释放(参见MacDiarmid等(2009)NatureBiotechnology 27(7):643)。
使用基于RNA或DNA病毒的系统递送编码工程改造的CRISPR/Cas系统的核酸利用用于使病毒靶向体内特定细胞，以及使病毒有效载荷迁移至核中的高度进展方法。病毒载体可向受试者直接施用(体内)，或它们可用于在体外处理细胞，并且向受试者施用修饰的细胞(离体)。用于递送CRISPR/Cas系统的常规基于病毒的系统包括但不限于用于基因转移的逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、牛痘和单纯疱疹病毒载体。用逆转录病毒、慢病毒和腺相关病毒基因转移方法有可能达成整合在宿主基因组中，从而常导致长期表达插入的转基因。另外，已在许多不同细胞类型和靶组织中观察到高转导效率。
逆转录病毒的趋性可通过并入外来包膜蛋白，从而扩大靶细胞的潜在靶标群体来改变。慢病毒载体是能够转导或感染非分裂细胞，并且通常产生高病毒滴度的逆转录病毒载体。对逆转录病毒基因转移系统的选择取决于靶组织。逆转录病毒载体包含顺式作用长末端重复序列，具有包装多达6-10kb外来序列的能力。最小顺式作用LTR足以达成载体的复制和包装，所述载体接着用于使治疗性基因整合至靶细胞中以提供持久转基因表达。广泛使用的逆转录病毒载体包括基于鼠类白血病病毒(MuLV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猿免疫缺陷病毒(SIV)、人免疫缺陷病毒(HIV)及其组合的那些(参见例如Buchscher等,J.Virol.66:2731-2739(1992)；Johann等,J.Virol.66:1635-1640(1992)；Sommerfelt等,Virol.176:58-59(1990)；Wilson等,J.Virol.63:2374-2378(1989)；Miller等,J.Virol.65:2220-2224(1991)；PCT/US94/05700)。
在其中瞬时表达是优选的应用中，可使用基于腺病毒的系统。基于腺病毒的载体能够在许多细胞类型中具有极高转导效率，并且不需要细胞分裂。用此类载体已获得高滴度和高表达水平。这个载体可在相对简单系统中大量产生。腺相关病毒(“AAV”)载体也例如在体外核酸和肽产生中用于用靶核酸转导细胞，以及用于体内和离体基因疗法方法(参见例如West等,Virology 160:38-47(1987)；美国专利号4,797,368；WO 93/24641；Kotin,Human Gene Therapy 5:793-801(1994)；Muzyczka,J.Clin.Invest.94:1351(1994))。构建重组AAV载体描述于许多出版物中，包括美国专利号5,173,414；Tratschin等,Mol.Cell.Biol.5:3251-3260(1985)；Tratschin等,Mol.Cell.Biol.4:2072-2081(1984)；Hermonat和Muzyczka,PNAS 81:6466-6470(1984)；以及Samulski等,J.Virol.63:03822-3828(1989)。
至少六种病毒载体方法当前可在临床试验中用于基因转移，其利用涉及通过插入辅助细胞系中以产生转导剂的基因来补助缺陷型载体的方法。
pLASN和MFG-S是已用于临床试验中的逆转录病毒载体的实例(Dunbar等,Blood85:3048-305(1995)；Kohn等,Nat.Med.1:1017-102(1995)；Malech等,PNAS 94:22 12133-12138(1997))。PA317/pLASN是用于基因疗法试验中的首个治疗性载体。(Blaese等,Science270:475-480(1995))。已观察到MFG-S包装载体的转导效率是50％或大于50％。(Ellem等,Immunol Immunother.44(1):10-20(1997)；Dranoff等,Hum.Gene Ther.1:111-2(1997)。
重组腺相关病毒载体(rAAV)是一种基于缺陷型和非病原性细小病毒腺相关2型病毒的有前途的替代性基因递送系统。所有载体都源于仅保留侧接转基因表达盒的AAV 145个碱基对(bp)反向末端重复序列的质粒。归因于整合至转导的细胞的基因组中的高效基因转移和稳定转基因递送是这个载体系统的关键特征。(Wagner等,Lancet351:9117 1702-3(1998)；Kearns等,Gene Ther.9:748-55(1996))。其它AAV血清型，包括AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9和AAVrh10及其所有变体也可根据本发明来使用。
复制缺陷型重组腺病毒载体(Ad)可在高滴度下产生，并且易于感染许多不同细胞类型。大多数腺病毒载体被工程改造以使转基因替换Ad E1a、E1b和/或E3基因；随后使复制缺陷型载体在反式提供缺失的基因功能的人293细胞中增殖。Ad载体可在体内转导多种类型的组织，包括非分裂分化细胞，如见于肝、肾和肌肉中的那些。常规Ad载体具有大的携带能力。在临床试验中使用Ad载体的实例涉及用于用肌肉内注射进行抗肿瘤免疫的多核苷酸疗法(Sterman等,Hum.Gene Ther.7:1083-9(1998))。在临床试验中使用腺病毒载体进行基因转移的其它实例包括Rosenecker等,Infection 24:1 5-10(1996)；Sterman等,Hum.GeneTher.9:7 1083-1089(1998)；Welsh等,Hum.Gene Ther.2:205-18(1995)；Alvarez等,Hum.Gene Ther.5:597-613(1997)；Topf等,Gene Ther.5:507-513(1998)；Sterman等,Hum.Gene Ther.7:1083-1089(1998)。
包装细胞用于形成能够感染宿主细胞的病毒粒子。此类细胞包括包装腺病毒的293细胞以及包装逆转录病毒的ψ细胞或PA317细胞。通常通过将核酸载体包装至病毒粒子中的生产者细胞系来产生用于基因疗法中的病毒载体。载体通常含有为包装以及后续整合至宿主中(如果适用)所需的最小病毒序列，其它病毒序列被编码待表达的蛋白质的表达盒替换。丢失的病毒功能由包装细胞系反式提供。举例来说，用于基因疗法中的AAV载体通常仅具有来自AAV基因组的为包装以及整合至宿主基因组中所需的反向末端重复(ITR)序列。病毒DNA在含有编码其它AAV基因(也就是rep和cap)，但缺乏ITR序列的辅助质粒的细胞系中包装。细胞系也用作为辅助物的腺病毒感染。辅助病毒促进AAV载体复制以及AAV基因从辅助质粒表达。由于缺乏ITR序列，辅助质粒不大量包装。可通过例如腺病毒比AAV对其更敏感的热处理来降低腺病毒污染。
在许多基因疗法应用中，合乎需要的是基因疗法载体以高度特异性递送至特定组织类型中。因此，病毒载体可被修饰以通过在病毒外表面上以与病毒外壳蛋白的融合蛋白形式表达配体来对给定细胞类型具有特异性。选择配体以对已知存在于目标细胞类型上的受体具有亲和力。举例来说，Han等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:9747-9751(1995)报道莫洛尼(Moloney)鼠类白血病病毒可被修饰以表达融合于gp70的人调蛋白(heregulin)，并且重组病毒感染某些表达人表皮生长因子受体的人乳腺癌细胞。这个原理可延伸至其它病毒-靶细胞对，其中靶细胞表达受体，并且病毒表达包含细胞表面受体的配体的融合蛋白。举例来说，丝状噬菌体可被工程改造以展示对实际上任何所选细胞受体具有特异性结合亲和力的抗体片段(例如FAB或Fv)。尽管以上描述主要适用于病毒载体，但相同原理可应用于非病毒载体。此类载体可被工程改造以含有有利于由特定靶细胞摄取的特定摄取序列。
基因疗法载体可如下所述通常通过全身性施用(例如静脉内、腹膜内、肌肉内、真皮下或颅内输注)或局部施用向个别受试者施用来体内递送。或者，载体可离体递送至细胞(如从个别患者外植的细胞(例如淋巴细胞、骨髓吸出物、组织活检体)或通用供体造血干细胞)中，随后通常在选择已并有载体的细胞之后，将细胞再植入患者中。
含有核酸酶和/或供体构建体的载体(例如逆转录病毒、腺病毒、脂质体等)也可向生物体直接施用以在体内转导细胞。或者，可施用裸露DNA。施用通过通常用于将分子引入以最终与血液或组织细胞接触的任何途径来达成，包括但不限于注射、输注、局部施用和电穿孔。施用此类核酸的合适的方法是可用的，并为本领域技术人员所熟知，并且尽管一种以上途径可用于施用特定组合物，但特定途径可常提供比另一途径更即刻以及更有效的反应。
适于引入本文所述的多核苷酸的载体包括非整合慢病毒载体(ID LV)。参见例如Ory等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:11382-11388；Dull等(1998)J.Virol.72:8463-8471；Zuffery等(1998)J.Vi rol.72:9873-9880；Follenzi等(2000)Nature Genetics25:217-222；美国专利公布号2009/054985。
药学上可接受的载体部分地由所施用的特定组合物决定，而且由用于施用该组合物的特定方法决定。因此，如下所述，存在可用的药物组合物的广泛多种合适的制剂(参见例如Remington’sPharmaceutical Sciences,第17版,1989)。
将明显的是核酸酶编码序列和供体构建体可使用相同或不同系统来递送。举例来说，供体多核苷酸可由质粒携带，而一种或多种核酸酶可由AAV载体携带。此外，不同载体可通过相同或不同途径(肌肉内注射、尾部静脉注射、其它静脉内注射、腹膜内施用和/或肌肉内注射)来施用。载体可同时或以任何依序顺序递送。
用于离体施用与体内施用两者的制剂包括呈液体或乳化液体形式的混悬液。常使活性成分与药学上可接受以及可与活性成分相容的赋形剂混合。合适的赋形剂包括例如水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇等及其组合。此外，组合物可含有少量辅助物质，如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂或增强药物组合物的有效性的其它试剂。
植物递送
如上所指示，DNA和/或RNA可通过多种常规技术引入所需植物宿主中(例如所需植物宿主的基因组中)。对于此类技术的综述，参见例如Weissbach和Weissbach Methods forPlant Molecular Biology(1988,Academic Press,N.Y.)章节VIII,第421-463页；以及Grierson和Corey,Plant Molecular Biology(1988,第2版),Blackie,London,第7-9章。也参见美国专利公布号20090205083；20100199389；20110167521和20110189775，其以引用的方式整体并入本文。
举例来说，可使用如电穿孔和显微注射植物细胞原生质体的技术将多核苷酸直接引入植物细胞的基因组DNA中，或可使用如DNA粒子轰击的基因枪方法将多核苷酸直接引入植物组织中(参见例如Klein等(1987)Nature 327:70-73)。或者，多核苷酸可通过纳米粒子转化引入植物细胞中(参见例如美国专利公布号20090104700，其以引用的方式整体并入本文)。或者，DNA/RNA构建体可与合适的T-DNA边缘/侧接区域组合，并且引入常规根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)宿主载体中。根癌土壤杆菌介导的转化技术(包括解除致癌基因以及开发和使用二元载体)充分描述于科学文献中。参见例如Horsch等(1984)Science233:496-498以及Fraley等(1983)Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA80:4803。
此外，可使用非土壤杆菌属细菌或病毒实现基因转移，所述细菌或病毒如根瘤菌属(Rhizobium)NGR234、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizoboium meliloti)、百脉根根瘤菌(Mesorhizobium loti)、马铃薯X病毒(potato virus X)、花椰菜花叶病毒(cauliflowermosaic virus)和木薯叶脉花叶病毒(cassava vein mosaic virus)和/或烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus)，参见例如Chung等(2006)Trends Plant Sci.11(1):1-4。
当使用二元T-DNA载体(Bevan(1984)Nuc.Acid Res.12:8711-8721)或共培养方法(Horsch等(1985)Science227:1229-1231)使细胞被细菌感染时，根癌土壤杆菌宿主的毒性功能将引导含有构建体和邻近标志物的T链插入植物细胞DNA中。通常，土壤杆菌转化系统用于工程改造双子叶植物(Bevan等(1982)Ann.Rev.Gene16:357-384；Rogers等(1986)Methods Enzymol.118:627-641)。土壤杆菌转化系统也可用于将多核苷酸转化以及转移至单子叶植物和植物细胞中。参见美国专利号5,591,616；Hemalsteen等(1984)EMBO J3:3039-3041；Hooykass-Van Slogteren等(1984)Nature311:763-764；Grimsley等(1987)Nature 325:1677-179；Boulton等(1989)Plant Mol.Biol.12:31-40；以及Gould等(1991)Plant Physiol.95:426-434。
替代性基因转移和转化方法包括但不限于通过钙、聚乙二醇(PEG)或电穿孔介导的裸露DNA/RNA摄取进行原生质体转化(参见Paszkowski等(1984)EMBO J3:2717-2722；Potrykus等(1985)Molec.Gen.Genet.199:169-177；Fromm等(1985)Proc.Nat.Acad.Sci.USA82:5824-5828；以及Shimamoto(1989)Nature338:274-276)以及电穿孔植物组织(D'Halluin等(1992)Plant Cell4:1495-1505)。用于植物细胞转化的其它方法包括显微注射、碳化硅(例如WHISKERSTM)介导的DNA摄取(Kaeppler等(1990)Plant CellReporter9:415-418)以及微粒轰击(参见Klein等(1988)Proc.Nat.Acad.Sci.USA85:4305-4309；以及Gordon-Kamm等(1990)Plant Cell2:603-618)。
可培养通过任何以上转化技术产生的转化植物细胞以再生具有转化的基因型以及因此所需表型的完整植物。此类再生技术依赖于操纵组织培养生长培养基中的某些植物激素，通常依赖于已连同所需核苷酸序列一起引入的灭菌剂和/或除草剂标志物。从培养的原生质体的植物再生描述于Evans等,"Protoplasts Isolation and Culture",Handbookof Plant Cell Culture,第124-176页,Macmillian Publishing Company,New York,1983；以及Binding,Regeneration of Plants,Plant Protoplasts,第21-73页,CRCPress,Boca Raton,1985中。再生也可从植物愈伤组织、外植体、器官、花粉、胚胎或其部分获得。此类再生技术一般地描述于Klee等(1987)Ann.Rev.of Plant Phys.38:467-486中。
引入植物细胞中的核酸可用于对基本上任何植物赋予所需性状。可使用本公开的核酸构建体和以上提及的各种转化方法来工程改造广泛多种植物和植物细胞系统以获得本文所述的所需生理和农艺学特征。在优选实施方案中，供工程改造的靶标植物和植物细胞包括但不限于那些单子叶和双子叶植物，如作物，包括谷类作物(例如小麦、玉米、稻、粟、大麦)、果实作物(例如番茄、苹果、梨、草莓、橙)、饲料作物(例如苜蓿)、块根蔬菜作物(例如胡萝卜、马铃薯、糖用甜菜、薯蓣)、叶用蔬菜作物(例如莴苣、菠菜)；开花植物(例如矮牵牛、玫瑰、菊花)、针叶树和松树(例如松杉、云杉)；用于植物修复中的植物(例如重金属积累植物)；油料作物(例如向日葵、油菜籽)和用于实验目的的植物(例如拟南芥(Arabidopsis))。因此，公开的方法和组合物在广泛范围的植物中具有用途，所述植物包括但不限于来自以下属的物种：天门冬属、燕麦属、芸苔属、柑橘属、西瓜属、辣椒属、南瓜属、胡萝卜属、飞蓬属、大豆属、棉属、大麦属、莴苣属、黑麦草属、番茄属、苹果属、木薯属、烟草属、诸葛菜属、稻属、鳄梨属、菜豆属、豌豆属、梨属、李属、萝卜属、黑麦属、茄属、高粱属、小麦属、葡萄属、豇豆属和玉蜀黍属。
引入植物细胞中的核酸的引入可用于对基本上任何植物赋予所需性状。在某些实施方案中，植物细胞中改变的MDH表达/功能导致植物具有增加量的果实产率、增加的植物生物质(或植物果实)、较高含量的果肉、密集的座果率(fruit set)、较大植物、增加的鲜重、增加的干重、增加的固体含量、在收获时较高的总重量、增强的作物色泽亮度和/或均一性、改变的化学(例如油、脂肪酸、碳水化合物、蛋白质)特征等。
本领域技术人员将认识到外源性序列可被瞬时并入植物细胞中。外源性多核苷酸序列的引入可利用其中已引入序列的植物细胞的细胞机构。可通过分析靶序列的基因组DNA以鉴定和确定任何插入缺失、倒位或插入来测定瞬时并入植物细胞中的包含ZFN的外源性多核苷酸序列的表达。这些类型的重排由裂解基因组DNA序列内的靶位点以及后续DNA修复所致。此外，可使用为本领域普通技术人员所知的允许测试标志物基因表达的方法测定外源性多核苷酸序列的表达。已报道使用多种植物、组织和DNA递送系统进行标志物基因的瞬时表达。瞬时分析系统包括但不限于使用任何目标植物物种在任何瞬时植物测定中通过对组织电穿孔或粒子轰击进行的直接基因递送。此类瞬时系统将包括但不限于对来自多种组织来源的原生质体电穿孔或对特定目标组织粒子轰击。本公开涵盖使用任何瞬时表达系统来评估位点特异性核酸内切酶(例如ZFN)以及在MDH靶基因内引入突变。设想通过适当递送系统瞬态测试的植物组织的实例将包括但不限于叶基组织、愈伤组织、子叶、根、内胚乳、胚胎、花组织、花粉和表皮组织。
本领域技术人员将认识到外源性多核苷酸序列可被稳定并入转基因植物中。一旦确认外源性多核苷酸序列是可操作的，它即可通过有性杂交引入其它植物中。视待杂交的物种而定，可使用许多标准育种技术中的任一个。
可通过选择或筛选具有由存在于转化DNA上的标志物基因编码的性状的工程改造的植物材料来鉴定和分离转化的植物细胞、愈伤组织、组织或植物。举例来说，可通过使工程改造的植物材料在含有抑制量的由转化基因构建体赋予抗性所针对的抗生素或除草剂的培养基上生长来进行选择。此外，也可通过针对可存在于重组核酸构建体上的任何可见标志物基因(例如β-葡萄糖醛酸酶、荧光素酶、B或C1基因)的活性进行筛选来鉴定转化的植物和植物细胞。此类选择和筛选方法为本领域技术人员所熟知。
物理和生物化学方法也可用于鉴定含有稳定插入的基因构建体的植物或植物细胞转化体，或含有由瞬时表达位点特异性核酸内切酶(例如ZFN)所致的靶基因改变的基因组DNA的植物细胞。这些方法包括但不限于：1)用于检测和确定重组DNA插入物的结构的DNA印迹分析或PCR扩增；2)用于检测和检查基因构建体的RNA转录物的RNA印迹、S1 RNA酶保护、引物延伸或逆转录酶PCR扩增；3)用于检测酶或核酶活性的酶测定，其中此类基因产物由基因构建体编码；4)蛋白凝胶电泳、蛋白质印迹(Western)技术、免疫沉淀或酶联免疫测定(ELISA)，其中基因构建体产物是蛋白质。如原位杂交、酶染色和免疫染色的其它技术也可用于检测重组构建体在特定植物器官和组织中的存在或表达。用于进行所有这些测定的方法为本领域技术人员所熟知。
可通过例如从目标组织分离的RNA(例如mRNA)的RNA印迹来观察使用本文公开的方法进行基因操纵的作用。通常，如果mRNA存在或mRNA的量已增加，那么可假定相应转基因正被表达。可使用测量基因和/或编码的多肽活性的其它方法。视所用底物和检测反应产物或副产物的增加或降低的方法而定，可使用不同类型的酶测定。此外，表达的多肽的水平可以免疫化学方式测量，即ELISA、RIA、EIA和为本领域技术人员所熟知的其它基于抗体的测定，如通过电泳检测测定(染色或蛋白质印迹)。作为一个非限制性实例，使用ELISA测定检测AAD-1和PAT蛋白描述于美国专利公布号20090093366中，所述参考文献据此以引用的方式整体并入本文。转基因可在植物的一些组织中或在一些发育阶段时选择性表达，或转基因可在基本上所有植物组织中，基本上沿它的整个生命周期表达。然而，任何组合表达模式也是可适用的。
本公开也涵盖上述转基因植物的种子，其中种子具有转基因或基因构建体。本公开还涵盖上述转基因植物的子代、克隆、细胞系或细胞，其中所述子代、克隆、细胞系或细胞具有转基因或基因构建体。
融合蛋白(例如ZFN)和编码融合蛋白的表达载体可向植物直接施用用于基因调控、靶向裂解和/或重组。在某些实施方案中，植物含有多种旁系同源MDH靶基因。因此，一种或多种不同融合蛋白或编码融合蛋白的表达载体可向植物施用以靶向植物中的这些旁系同源基因中的一个或多个。
有效量的施用通过通常用于将融合蛋白引入以最终与待处理的植物细胞接触的任何途径来达成。以任何合适的方式，优选与可接受的载体一起施用ZFP。施用此类调节剂的合适的方法是可用的，并为本领域技术人员所熟知，并且尽管一种以上途径可用于施用特定组合物，但特定途径可常提供比另一途径更即刻以及更有效的反应。
载体也可被使用，并且部分地由所施用的特定组合物决定，而且由用于施用组合物的特定方法决定。因此，存在可用载体的广泛多种合适的制剂。
实施例
实施例1：设计sgRNA
通过以下方式来鉴定用于给定ZFN指定基因座的基因组编辑的向导RNA(sgRNA或gRNA)的序列：(i)比对ZFN异二聚体的识别序列与相关基因组(人、小鼠或特定植物物种)的参照序列；(ii)鉴定ZFN半位点之间的间隔区区域；(iii)鉴定最靠近间隔区区域的基序G[N20]GG的位置(当超过一个此类基序重叠于间隔区时，选择相对于间隔区处于中心的基序)；(iv)使用该基序作为gRNA的核心。表1显示一系列供与CRISPR/Cas系统一起使用的sgRNA。使目标细胞与表1中的sgRNA接触，并且加以工程改造。
表1：被设计以靶向ZFN靶序列的sgRNA
Figure BDA0004012523450000831
Figure BDA0004012523450000841
Figure BDA0004012523450000851
Figure BDA0004012523450000861
Figure BDA0004012523450000871
实施例2：针对目标基因的sgRNA和tru-RNA。
如实施例1中所述，通过多种考虑实现sgRNA的设计：(i)比对ZFN异二聚体的识别序列与相关基因组(人、小鼠或特定植物物种)的参照序列；(ii)鉴定ZFN半位点之间的间隔区区域；(iii)鉴定最靠近间隔区区域的与所用Cas9蛋白相关的PAM基序(例如：当使用化脓性链球菌Cas9时的G[N17-20](G/A)G)的位置(当超过一个此类基序重叠于间隔区时，选择相对于间隔区处于中心的基序)；(iv)使用该基序作为sgRNA的核心。
以下在表2中显示的是供用本发明的CRISPR/Cas系统和sgRNA靶向的示例性基因。也指示的是与这些基因相关的cDNA的代表性实例的登记号。
表2：供用CRISPR/Cas系统靶向的示例性基因
Figure BDA0004012523450000872
Figure BDA0004012523450000881
单导向RNA接着连同编码一个或多个功能性结构域以及任选供体序列的多核苷酸一起被引入细胞中以修饰靶基因。
本文提及的所有专利、专利申请和出版物都据此以引用的方式整体并入本文。
尽管本公开已出于理解明晰性的目的通过说明和举例方式较详细地加以提供，但将对本领域技术人员明显的是可在不脱离本公开的精神或范围下实施各种变化和修改。因此，先前描述和实施例不应解释为具有限制性。

Claims (15)

1.一种修改细胞中的内源性基因的表达的方法，所述方法包括以下步骤：向所述细胞施用包含识别所述内源性基因中的靶位点的单导向RNA的第一核酸分子和编码功能性结构域的第二核酸分子，其中所述功能性结构域与所述靶位点上的所述单导向RNA缔合，由此修改所述内源性基因的表达。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述功能性结构域选自由以下组成的组：转录活化结构域、转录阻抑结构域和核酸酶结构域。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述功能性结构域是IIS型限制酶核酸酶结构域或Cas蛋白。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述功能性结构域是转录活化结构域，并且所述内源性基因的表达得以增加。
5.如权利要求2所述的方法，其中所述功能性结构域是转录阻抑结构域，并且所述内源性基因的表达受抑制。
6.如权利要求2所述的方法，其中所述功能性结构域是核酸酶，并且所述内源性基因被裂解。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述核酸酶结构域被所述Cas蛋白包含。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述Cas蛋白包含一个多个核酸酶裂解结构域。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物或植物细胞。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是干细胞。
11.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述内源性基因选自由以下组成的组：哺乳动物β球蛋白基因(HBB)、γ球蛋白基因(HBG1)、B细胞淋巴瘤/白血病11A(BCL11A)基因、Kruppel样因子1(KLF1)基因、CCR5基因、CXCR4基因、PPP1R12C(AAVS1)基因、次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)基因、白蛋白基因、因子VIII基因、因子IX基因、富含亮氨酸的重复序列激酶2(LRRK2)基因、亨廷顿蛋白(Htt)基因、视紫红质(RHO)基因、囊性纤维化跨膜传导调控子(CFTR)基因、表面活性蛋白B基因(SFTPB)、T细胞受体α(TRAC)基因、T细胞受体β(TRBC)基因、程序性细胞死亡1(PD1)基因、细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)基因、人白细胞抗原(HLA)A基因、HLAB基因、HLA C基因、HLA-DPA基因、HLA-DQ基因、HLA-DRA基因、LMP7基因、与抗原加工相关的转运体(TAP)1基因、TAP2基因、TAP相关蛋白基因(TAPBP)、II类主要组织相容性复合物反式活化子(CIITA)基因、肌营养不良蛋白基因(DMD)、糖皮质素受体基因(GR)、IL2RG基因和RFX5基因。
12.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述内源性基因选自由以下组成的组：植物FAD2基因、植物FAD3基因、植物ZP15基因、植物KASII基因、植物MDH基因和植物EPSPS基因。
13.一种单导向RNA，其结合选自由以下组成的组的内源性基因：哺乳动物β球蛋白基因(HBB)、γ球蛋白基因(HBG1)、B细胞淋巴瘤/白血病11A(BCL11A)基因、Kruppel样因子1(KLF1)基因、CCR5基因、CXCR4基因、PPP1R12C(AAVS1)基因、次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)基因、白蛋白基因、因子VIII基因、因子IX基因、富含亮氨酸的重复序列激酶2(LRRK2)基因、亨廷顿蛋白(Htt)基因、视紫红质(RHO)基因、囊性纤维化跨膜传导调控子(CFTR)基因、表面活性蛋白B基因(SFTPB)、T细胞受体α(TRAC)基因、T细胞受体β(TRBC)基因、程序性细胞死亡1(PD1)基因、细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)基因、人白细胞抗原(HLA)A基因、HLA B基因、HLA C基因、HLA-DPA基因、HLA-DQ基因、HLA-DRA基因、LMP7基因、与抗原加工相关的转运体(TAP)1基因、TAP2基因、TAP相关蛋白基因(TAPBP)、II类主要组织相容性复合物反式活化子(CIITA)基因、肌营养不良蛋白基因(DMD)、糖皮质素受体基因(GR)、IL2RG基因和RFX5基因。
14.一种单导向RNA，其结合选自由以下组成的组的内源性基因：植物FAD2基因、植物FAD3基因、植物ZP15基因、植物KASII基因、植物MDH基因和植物EPSPS基因。
15.如权利要求13或14所述的单导向RNA，其选自由SEQ IDNO:149-215组成的组。
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