KR102594051B1 - 단일 가이드 RNA, CRISPR/Cas9 시스템, 및 이의 사용방법 - Google Patents
단일 가이드 RNA, CRISPR/Cas9 시스템, 및 이의 사용방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 단일 가이드 RNA(sgRNA), 일정한 간격을 두고 주기적으로 분포하는 짧은 회문 반복서열(CRISPR)/CRISPR 결합 단백질 9(Cas9) 시스템, 및 각막 이상증을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 이들의 사용방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 단일 가이드 RNA(sgRNA), 일정한 간격을 두고 주기적으로 분포하는 짧은 회문 반복서열(CRISPR)/CRISPR 결합 단백질 9(Cas9) 시스템, 및 각막 이상증을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 이들의 사용방법에 관한 것이다.
대부분의 각막 이상증은 우성-음성 병리메커니즘을 갖는 상염색체 우성 방식으로 유전된다. 일부 유전자, 예를 들면 TGFBI 및 KRT12의 경우, 이들은 반수충분성(haplosufficient)인 것으로 나타났으며; 이것은 유전자의 하나의 기능적 복제물로도 정상 기능을 유지하기에 충분함을 의미한다. 돌연변이 대립유전자를 특이적으로 표적화(targeting)하는 siRNA를 사용함으로써, 돌연변이 단백질의 우성-음성 작용을 극복하고 시험관내 세포에 정상 기능을 회복하는 것이 가능하다. siRNA의 작용은 일시적이지만 siRNA가 충분히 높은 농도로 세포에 존재하는 한 지속된다; CRISPR/Cas9 유전자 편집은 돌연변이 대립유전자를 영구히 변형시키는 기회를 제공한다.
이중-가닥 DNA를 촉매적으로 절단하기 위한 단순 내인성 세균계의 발견은 치료학적 유전자 편집 분야에 혁신을 일으켰다. 타입 II 일정한 간격을 두고 주기적으로 분포하는 짧은 회문 반복서열(CRISPR)/CRISPR 결합 단백질 9(Cas9)는 프로그래밍 가능한 RNA 가이드된 엔도뉴클레아제이며, 이것은 최근에 포유류 세포에서 유전자 편집에 효과적인 것으로 나타났다(문헌 [Hsu PD, Lander ES, Zhang F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell 2014; 157: 1262-1278]). 이러한 매우 특이적이고 효율적인 RNA-가이드된 DNA 엔도뉴클레아제는 다양한 유전 질환에서 치료상 중요할 수 있다. CRISPR/Cas9 시스템은 2개 RNA 분자; tracrRNA 및 crRNA에 의해 특정 DNA 서열로 가이드되는 단일 촉매적 단백질, Cas9에 의존한다(문헌 [Hsu PD, Lander ES, Zhang F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell 2014; 157: 1262-1278]). 단일 가이드 RNA 분자(sgRNA)로의 tracrRNA/crRNA의 조합(문헌 [Shalem O, Sanjana NE, Hartenian E, Shi X, Scott DA, Mikkelsen TS et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science 2014; 343: 84-87]; [Wang T, Wei JJ, Sabatini DM, Lander ES. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science 2014; 343: 80-84])은 게놈 내의 임의의 표적에 대해 잠재적으로 특이적인 유전자 편집 도구의 신속한 개발을 가져왔다. 선택된 표적에 상보적인 것으로 sgRNA 내의 뉴클레오티드 서열의 치환을 통해, 매우 특이적인 시스템이 며칠 안에 생성될 수 있다. 이러한 시스템의 한 가지 경고는 엔도뉴클레아제가 sgRNA 결합 부위의 3' 말단에 바로 위치한 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)를 필요로 한다는 것이다. 이러한 PAM 서열은 DNA 표적의 불변 부분이지만 sgRNA에는 존재하지 않는 반면, 게놈 표적 서열의 3' 말단에서의 이의 부재는 Cas9가 DNA 표적을 절단하지 못하게 한다(문헌 [Westra ER, Semenova E, Datsenko KA, Jackson RN, Wiedenheft B, Severinov K et al. Type I-E CRISPR-cas discriminate target from non-target DNA through base pairing-independent PAM recognition. PLoS Genet 2013; 9: e1003742]).
하나의 측면에서, 본 발명은, 예를 들면, 미즈만 상피 각막 이상증(MECD; OMIM:122100)을 초래하는 KRT12(암호화 케라틴 12, K12), Leu132Pro(c. 395 T>C)에 있어서의 우성-음성 돌연변이에 대한 각막 이상증을 위한 대립유전자-특이 CRISPR/Cas9 시스템의 가능성을 기술한다(문헌 [Liao H, Irvine AD, Macewen CJ, Weed KH, Porter L, Corden LD et al. Development of allele-specific therapeutic siRNA in Meesmann epithelial corneal dystrophy. PLoS One 2011; 6: e28582]). 흥미롭게도, 본원에 나타낸 바와 같이, 이러한 돌연변이는 야생형 대립유전자에는 존재하지 않는 신규한 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) PAM의 발현을 초래한다. 몇몇 양태에서, 본 발명은 돌연변이 대립유전자의 대립유전자-특이 절단이 이러한 신규한 PAM의 5' 말단의 뉴클레오티드를 sgRNA에 삽입함으로써 유도될 수 있음을 보여준다. 이형접합성 세포에서, 이러한 이중-가닥 분해는 비-상동 말단 접합(NHEJ)을 야기할 수 있으며, 이것이 프레임시프트 및 조발성 종결 코돈의 발현, 또는 야생형 대립유전자와의 재조합이 돌연변이 서열의 수선(repair)을 지시하는 상동성-직접 수선을 초래할 수 있다. KRT12의 경우에, 예를 들면, 두 가지 결과 모두는 치료적 성공으로 간주될 수 있다; 우성-음성 돌연변이 K12 단백질의 발현이 NHEJ에 의해 폐지되며, 이것은 KRT12가 반수기능부전(haploinsufficiency)을 증명하는 것으로 나타나지 않았고(문헌 [Kao WW, Liu CY, Converse RL, Shiraishi A, Kao CW, Ishizaki M et al. Keratin 12-deficient mice have fragile corneal epithelia. Invest Ophthalmol Vis Sci 1996; 37: 2572-2584]), 또한 돌연변이 대립유전자가 상동성-직접 수선에 의해 수선되어, K12-Leu132Pro 대립유전자의 수선을 초래하기 때문에 용인된다.
하나의 측면에서, 본 발명은 단일 가이드 RNA(sgRNA)에 관한 것이다. 몇몇 양태에서, sgRNA는 (i) CRISPR 표적화 RNA(crRNA) 서열 및 (ii) 트랜스-활성화(trans-activating) crRNA(tracrRNA) 서열을 포함한다. 몇몇 양태에서, crRNA 서열 및 tracrRNA 서열은 자연적으로 함께 발생하지 않는다. 몇몇 양태에서, crRNA 서열은 서열 번호 (10+4n)(여기서, n은 0 내지 221의 정수이다)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 80, 85, 90, 95 또는 100% 서열 동일성(sequence identity)을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 추가의 양태에서, tracrRNA 서열은 서열 번호 2 또는 6의 서열과 적어도 약 80, 85, 90, 95 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 CRISPR/Cas9 시스템을 위해 설계된 sgRNA 쌍(pair)에 관한 것이며, 상기 sgRNA 쌍은 (i) (a) 시스(cis)에서 질환-유발 돌연변이 또는 단일-뉴클레오티드 다형태(SNP: single-nucleotide polymorphism)의 3'-말단 측에 제1 프로토스페이서 인접 모티프(PAM: protospacer adjacent motif)를 생성하는 돌연변이 또는 SNP에 대한 제1 crRNA 서열, 및 (b) tracrRNA 서열을 포함하는 제1 sgRNA(여기서, 제1 crRNA 서열 및 tracrRNA 서열은 자연적으로 함께 발생하지 않는다); (ii) (a) 시스에서 질환-유발 돌연변이 또는 SNP의 5'-말단 측에 제2 PAM을 생성하는 돌연변이 또는 SNP에 대한 제2 crRNA 가이드 서열; (b) tracrRNA 서열을 포함하는 제2 sgRNA(여기서, 제2 crRNA 서열 및 tracrRNA 서열은 자연적으로 함께 발생하지 않는다)를 포함한다. 몇몇 양태에서, CRISPR/Cas9 시스템은 각막 이상증을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 것이다. 몇몇 양태에서, PAM을 생성하는 돌연변이 또는 SNP는 TGFBI 유전자에 위치한다. 추가의 양태에서, PAM을 생성하는 돌연변이 또는 SNP는 TGFBI 유전자의 인트론(intron)에 존재한다. 예를 들면, PAM을 생성하는 돌연변이 또는 SNP는 TGFBI 유전자의 인접 인트론에 존재하며, 질환-유발 돌연변이 또는 SNP는 도 16에 나타낸 바와 같이 인접 인트론들 사이의 엑손에 존재할 수 있다. 추가의 양태에서, 제1 및 제2 crRNA 서열 중의 적어도 하나는 도 19 내지 35에 열거된 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하고/하거나; 제1 및 제2 crRNA 서열 중의 적어도 하나는 표 2에 열거된 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 Cas9 뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 분자 및 본원에 기술된 sgRNA를 포함하는 적어도 한 개 또는 두 개의 벡터, 또는 Cas9 뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 분자 및 본원에 기술된 sgRNA 쌍을 포함하는 적어도 한 개, 두 개, 또는 세 개의 상이한 벡터를 포함하는 조작된 일정한 간격을 두고 주기적으로 분포하는 짧은 회문 반복서열(CRISPR)/CRISPR 결합 단백질 9(Cas9) 시스템에 관한 것이다. 몇몇 양태에서, Cas9 뉴클레아제 및 sgRNA는 자연적으로 함께 발생하지 않는다. 몇몇 양태에서, 본원에 기술된 Cas9 뉴클레아제는 문헌[Slaymaker et al., 2016 Science, 351(6268), 84-88]에 기술된 강화된 Cas9 뉴클레아제일 수 있다. 추가의 양태에서, Cas9 뉴클레아제는 스트렙토코커스(Streptococcus)로부터의 것이다. 아직 추가의 양태에서, Cas9 뉴클레아제는 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)(Spy), 스트렙토코커스 디스갈락티에(Streptococcus dysgalactiae), 스트렙토코커스 카니스(Streptococcus canis), 스트렙토코커스 이콰이(Streptococcus equi), 스트렙토코커스 이니에(Streptococcus iniae), 스트렙토코커스 포카에(Streptococcus phocae), 스트렙토코커스 슈도포르시누스(Streptococcus pseudoporcinus), 스트렙토코커스 오랄리스(Streptococcus oralis), 스트렙토코커스 슈도포르시누스(Streptococcus pseudoporcinus), 스트렙토코커스 인판타리우스(Streptococcus infantarius), 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코커스 아갈락티에(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코커스 카발리(Streptococcus caballi), 스트렙토코커스 이콰이누스(Streptococcus equinus), 스트렙토코커스 경구 탁손(Streptococcus sp. oral taxon), 스트렙토코커스 미티스(Streptococcus mitis), 스트렙토코커스 갈롤리티쿠스(Streptococcus gallolyticus), 스트렙토코커스 고르도니이(Streptococcus gordonii), 스트렙토코커스 파스퇴리아누스(Streptococcus pasteurianus), 또는 이의 변이체로부터의 것이다. 추가의 양태에서, Cas9 뉴클레아제는 스타필로코커스(Staphylococcus)로부터의 것이다. 추가의 양태에서, Cas9 뉴클레아제는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 시미에(S. simiae), 스타필로코커스 아우리쿨라리스(S. auricularis), 스타필로코커스 카르노수스(S. carnosus), 스타필로코커스 콘디멘티(S. condimenti), 스타필로코커스 마실리엔시스(S. massiliensis), 스타필로코커스 피시페르멘탄스(S. piscifermentans), 스타필로코커스 시물란스(S. simulans), 스타필로코커스 카피티스(S. capitis), 스타필로코커스 카프라에(S. caprae), 스타필로코커스 에피데르미디스(S. epidermidis), 스타필로코커스 사카롤리티쿠스(S. saccharolyticus), 스타필로코커스 데브리에세이(S. devriesei), 스타필로코커스 헤몰리티쿠스(S. haemolyticus), 스타필로코커스 호미니스(S. hominis), 스타필로코커스 아그네티스(S. agnetis), 스타필로코커스 크로모게네스(S. chromogenes), 스타필로코커스 펠리스(S. felis), 스타필로코커스 델피니(S. delphini), 스타필로코커스 히쿠스(S. hyicus), 스타필로코커스 인터메디우스(S. intermedius), 스타필로코커스 루트라에(S. lutrae), 스타필로코커스 미크로티(S. microti), 스타필로코커스 무스카에(S. muscae), 스타필로코커스 슈드인터메디우스(S. pseudintermedius), 스타필로코커스 로스트리(S. rostri), 스타필로코커스 슐레이페리(S. schleiferi), 스타필로코커스 루그두넨시스(S. lugdunensis), 스타필로코커스 아를레타에(S. arlettae), 스타필로코커스 코흐니이(S. cohnii), 스타필로코커스 에쿠오룸(S. equorum), 스타필로코커스 갈리나룸(S. gallinarum), 스타필로코커스 클루시이(S. kloosii), 스타필로코커스 레에이(S. leei), 스타필로코커스 네팔렌시스(S. nepalensis), 스타필로코커스 사프로피티쿠스(S. saprophyticus), 스타필로코커스 수시누스(S. succinus), 스타필로코커스 크실로수스(S. xylosus), 스타필로코커스 플레우레티이(S. fleurettii), 스타필로코커스 렌투스(S. lentus), 스타필로코커스 스시우리(S. sciuri), 스타필로코커스 스테파노비시이(S. stepanovicii), 스타필로코커스 비툴리누스(S. vitulinus), 스타필로코커스 시물란스(S. simulans), 스타필로코커스 파스퇴리(S. pasteuri), 스타필로코커스 와르네리(S. warneri), 또는 이의 변이체로부터의 것이다. 추가의 양태에서, Cas9 뉴클레아제는 서열 번호 4 또는 8로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 60% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 추가의 양태에서, Cas9 뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 분자는 서열 번호 3 또는 7로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 60% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 몇몇 양태에서, 본원에 기술된 CRISPR/Cas9 시스템 또는 벡터는 수선 뉴클레오티드 분자 및/또는 적어도 하나의 핵 국재화 신호(NLS)를 배제하거나 추가로 포함한다. 추가의 양태에서, sgRNA 및 Cas9 뉴클레아제는 동일한 벡터 상에 또는 상이한 벡터 상에 포함된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 조작된 CRISPR/Cas9 시스템을 표적 서열을 갖고 유전자 산물을 암호화하는 DNA 분자를 함유하고 발현하는 세포에 도입함을 포함하여 적어도 하나의 유전자 산물의 발현을 변경시키는 방법에 관한 것이다. 몇몇 양태에서, 조작된 CRISPR/Cas9 시스템은 (a) 표적 서열과 혼성화되는 sgRNA에 작동적으로 연결된 제1 조절 요소, 및 (b) Cas9 뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 분자에 작동적으로 연결된 제2 조절 요소를 포함하며, 여기서 성분 (a) 및 (b)는 시스템의 동일한 벡터 또는 상이한 벡터 상에 위치하고, sgRNA는 표적 서열을 표적화하며, Cas9 뉴클레아제는 DNA 분자를 절단한다. 표적 서열은 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)의 5'-말단에 인접한 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 추가의 양태에서, 세포는 진핵 세포, 또는 포유류 또는 인간 세포이다. 몇몇 양태에서, sgRNA는 Cas9 뉴클레아제에 의해 인식되는 PAM의 5' 말단에 인접한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 추가의 양태에서, sgRNA는 16 내지 25개 뉴클레오티드 서열 길이, 또는 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개 뉴클레오티드 길이를 갖는다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같이 대상체의 유전자 산물의 발현을 변경시킴을 포함하여, 대상체에서 단일-뉴클레오티드 다형태(SNP)와 관련된 질환을 예방, 개선, 또는 치료하는 방법에 관한 것이며, 여기서, DNA 분자는 돌연변이 서열을 포함한다. 몇몇 양태에서, DNA 분자는 적어도 하나, 둘, 셋, 넷 또는 그 이상의 SNP 또는 돌연변이 부위를 포함할 수 있고, 본원에 기술된 방법은 적어도 하나, 둘, 셋, 넷 또는 그 이상의 SNP 또는 돌연변이 부위와 관련된 유전자 산물의 발현을 변경시킨다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (i) 본원에 기술된 Cas9 뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 분자, 및 (ii) 본원에 기술된 sgRNA를 포함하는 적어도 하나 또는 두 개의 벡터를 포함하는 조작된 CRISPR/Cas9 시스템을 대상체에게 투여함을 포함하여, 대상체에서 유전자 돌연변이 또는 SNP와 관련된 각막 이상증을 예방, 개선, 또는 치료하는 방법에 관한 것이며, 여기서 sgRNA는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 부위의 5'-말단에 인접한 표적 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열에 혼성화되거나 이를 포함하고, 표적 서열 또는 PAM는 돌연변이 또는 SNP 부위를 포함한다. 몇몇 양태에서, sgRNA는 표적 서열과 적어도 약 75, 80, 85, 90, 95 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 몇몇 양태에서, Cas9 뉴클레아제 및 sgRNA는 자연적으로 함께 발생하지 않는다. 추가의 양태에서, PAM는 돌연변이 또는 SNP 부위를 포함한다.
몇몇 양태에서, 질환-유발 유전자 돌연변이 또는 SNP를 포함하는 돌연변이 서열은 (i) Leu509Arg, Arg666Ser, Gly623Asp, Arg555Gln, Arg124Cys, Val505Asp, Ile522Asn, Leu569Arg, His572Arg, Arg496Trp, Pro501Thr, Arg514Pro, Phe515Leu, Leu518Pro, Leu518Arg, Leu527Arg, Thr538Pro, Thr538Arg, Val539Asp, Phe540del, Phe540Ser, Asn544Ser, Ala546Thr, Ala546Asp, Phe547Ser, Pro551Gln, Leu558Pro, His572del, Gly594Val, Val613del, Val613Gly, Met619Lys, Ala620Asp, Asn622His, Asn622Lys, Asn622Lys, Gly623Arg, Gly623Asp, Val624_Val625del, Val624Met, Val625Asp, His626Arg, His626Pro, Val627SerfsX44, Thr629_Asn630insAsnValPro, Val631Asp, Arg666Ser, Arg555Trp, Arg124Ser, Asp123delins, Arg124His, Arg124Leu, Leu509Pro, Leu103_Ser104del, Val113Ile, Asp123His, Arg124Leu, 및/또는 Thr125_Glu126del를 포함하는 돌연변이 TGFBI 단백질; (ii) Glu498Val, Arg503Pro, 및/또는 Glu509Lys를 갖는 돌연변이 KRT3 단백질; (iii) Met129Thr, Met129Val, Gln130Pro, Leu132Pro, Leu132Va, Leu132His, Asn133Lys, Arg135Gly, Arg135Ile, Arg135Thr, Arg135Ser, Ala137Pro, Leu140Arg, Val143Leu, Val143Leu, Lle391_Leu399dup, Ile 426Val, Ile 426Ser, Tyr429Asp, Tyr429Cys, Arg430Pro, 및/또는 Leu433Arg를 갖는 돌연변이 KRT12 단백질; (iv) Asp214Tyr를 갖는 돌연변이 GSN 단백질; 및 (v) Ala97Thr, Gly98Ser, Asn102Ser, Asp112Asn, Asp112Gly, Asp118Gly, Arg119Gly, Leu121Val, Leu121Phe, Val122Glu, Val122Gly, Ser171Pro, Tyr174Cys, Thr175Ile, Gly177Arg, Lys181Arg, Gly186Arg, Leu188His, Asn232Ser, Asn233His, Asp236Glu, 및/또는 Asp240Asn를 갖는 돌연변이 UBIAD1 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 돌연변이 단백질을 암호화한다. 추가의 양태에서, 청구항 14-25 중의 어느 한 항에 따르는 방법에서 대상체는 인간, 동물 또는 포유류이다.
몇몇 양태에서, SNP 부위를 포함하는 돌연변이 서열은 Arg514Pro를 포함하는 돌연변이 TGFBI 단백질을 암호화하고, 조작된 CRISPR/Cas9 시스템은 GAACTAATTACCATGCTAAA(서열 번호 897)를 포함하는 sgRNA를 포함한다. 몇몇 양태에서, SNP 부위를 포함하는 돌연변이 서열은 Leu518Arg을 포함하는 돌연변이 TGFBI 단백질을 암호화하고, 조작된 CRISPR/Cas9 시스템은 GAGACAATCGCTTTAGCATG(서열 번호 898)를 포함하는 sgRNA를 포함한다. 몇몇 양태에서, SNP 부위를 포함하는 돌연변이 서열은 Leu509Arg를 포함하는 돌연변이 TGFBI 단백질을 암호화하고, 조작된 CRISPR/Cas9 시스템은 서열 번호 186을 포함하는 sgRNA를 포함한다. 몇몇 양태에서, SNP 부위를 포함하는 돌연변이 서열은 Leu527Arg를 포함하는 돌연변이 TGFBI 단백질을 암호화하고, 조작된 CRISPR/Cas9 시스템은 서열 번호 474를 포함하는 sgRNA를 포함한다. 몇몇 양태에서, SNP 부위를 포함하는 돌연변이 서열는 Arg124Cys를 포함하는 돌연변이 TGFBI 단백질을 암호화하고, 조작된 CRISPR/Cas9 시스템은 서열 번호 58, 54, 50 및 42 중의 어느 뉴클레오티드 서열을 포함하는 sgRNA를 포함한다. 몇몇 양태에서, SNP 부위를 포함하는 돌연변이 서열은 Arg124His를 포함하는 돌연변이 TGFBI 단백질을 암호화하고, 조작된 CRISPR/Cas9 시스템은 서열 번호 94, 90, 86, 82, 78, 74 및 70 중의 어느 뉴클레오티드 서열을 포함하는 sgRNA를 포함한다. 몇몇 양태에서, SNP 부위를 포함하는 돌연변이 서열은 Arg124His를 포함하는 돌연변이 TGFBI 단백질을 암호화하고, 조작된 CRISPR/Cas9 시스템은 서열 번호 86 또는 94를 포함하는 sgRNA를 포함한다. 몇몇 양태에서, SNP 부위를 포함하는 돌연변이 서열은 Arg124Leu를 포함하는 돌연변이 TGFBI 단백질을 암호화하고, 조작된 CRISPR/Cas9 시스템은 서열 번호 114, 110, 106 및 98 중의 어느 뉴클레오티드 서열을 포함하는 sgRNA를 포함한다. 몇몇 양태에서, SNP 부위를 포함하는 돌연변이 서열은 Arg555Gln을 포함하는 돌연변이 TGFBI 단백질을 암호화하고, 조작된 CRISPR/Cas9 시스템은 서열 번호 178, 174, 170, 166, 162 및 158 중의 어느 뉴클레오티드 서열을 포함하는 sgRNA를 포함한다. 몇몇 양태에서, SNP 부위를 포함하는 돌연변이 서열은 Arg555Trp를 포함하는 돌연변이 TGFBI 단백질을 암호화하고, 조작된 CRISPR/Cas9 시스템은 서열 번호 146, 142, 138, 134, 130 및 126 중의 어느 뉴클레오티드 서열을 포함하는 sgRNA를 포함한다. 몇몇 양태에서, SNP 부위를 포함하는 돌연변이 서열은 Leu527Arg를 포함하는 돌연변이 TGFBI 단백질을 암호화하고, 조작된 CRISPR/Cas9 시스템은 서열 번호 146, 142, 138, 134, 130 및 126 중의 어느 뉴클레오티드 서열을 포함하는 sgRNA를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (i) 본원에 기술된 Cas9 뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 분자, 및 (ii) 본원에 기술된 sgRNA를 포함하는 적어도 하나 또는 두 개의 벡터를 포함하는 조작된 CRISPR/Cas9 시스템을 대상체에게 투여함을 포함하여, 대상체에서 유전자 돌연변이 또는 SNP와 관련된 각막 이상증을 예방, 개선, 또는 치료하는 방법에 관한 것이며, 여기서 sgRNA는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 부위의 5'-말단에 인접한 제2 표적 서열에 상보적인 제1 표적 서열에 혼성화되고, 제1 표적 서열 또는 PAM은 돌연변이 또는 SNP 부위를 포함한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 (i) Cas9 뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 분자; (ii) 제1 표적 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열에 혼성화된 제1 CRISPR 표적화 RNA(crRNA) 서열(제1 표적 서열은 시스에서 질환-유발 돌연변이 또는 SNP의 3'-말단 측의 제1 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)의 5'-말단에 인접하며, 여기서 제1 표적 서열 또는 제1 PAM은 제1 선조 돌연변이(ancestral mutation) 또는 SNP 부위를 포함한다), (iii) 제2 표적 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열에 혼성화된 제2 crRNA 서열(제2 표적 서열은 시스에서 질환-유발 돌연변이 또는 SNP의 5'-말단 측의 제2 PAM의 5'-말단에 인접하며, 여기서 제2 표적 서열 또는 제2 PAM은 제2 선조 돌연변이 또는 SNP 부위를 포함하고, 여기서 적어도 하나의 벡터는 함께 자연적으로 발생하는 Cas9 뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 분자 및 crRNA 서열을 갖지 않는다)을 포함하는 적어도 하나 또는 두 개의 벡터를 포함하는 조작된 CRISPR/Cas9 시스템을 대상체에게 투여함을 포함하여, 대상체에서 유전자 돌연변이 또는 SNP와 관련된 각막 이상증을 예방, 개선, 또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 몇몇 양태에서, PAM을 생성하는 돌연변이 또는 SNP는 TGFBI 유전자에, 예를 들면, TGFBI 유전자의 인트론에 존재한다. 추가의 양태에서, 제1 및 제2 crRNA 서열 중의 적어도 하나는 도 19 내지 35에 열거된 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하고/하거나; 제1 및 제2 crRNA 서열 중의 적어도 하나는 표 2에 열거된 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 추가의 양태에서, 제1 PAM가 제1 돌연변이 또는 SNP 부위를 포함하고/하거나 제2 PAM가 제2 돌연변이 또는 SNP 부위를 포함한다. 추가의 양태에서, 제1 crRNA 서열은 제1 표적 서열을 포함하고/하거나, 제2 crRNA 서열은 제2 표적 서열을 포함한다. 추가의 양태에서, crRNA는 17 내지 24개 뉴클레오티드 길이이다. 몇몇 양태에서, 제1 및 제2 PAM은 둘 다 스트렙토코커스 또는 스타필로코커스로부터의 것이다. 추가의 양태에서, 질환-유발 돌연변이 또는 SNP를 포함하는 돌연변이 서열은 Leu509Arg, Arg666Ser, Gly623Asp, Arg555Gln, Arg124Cys, Val505Asp, Ile522Asn, Leu569Arg, His572Arg, Arg496Trp, Pro501Thr, Arg514Pro, Phe515Leu, Leu518Pro, Leu518Arg, Leu527Arg, Thr538Pro, Thr538Arg, Val539Asp, Phe540del, Phe540Ser, Asn544Ser, Ala546Thr, Ala546Asp, Phe547Ser, Pro551Gln, Leu558Pro, His572del, Gly594Val, Val613del, Val613Gly, Met619Lys, Ala620Asp, Asn622His, Asn622Lys, Asn622Lys, Gly623Arg, Gly623Asp, Val624_Val625del, Val624Met, Val625Asp, His626Arg, His626Pro, Val627SerfsX44, Thr629_Asn630insAsnValPro, Val631Asp, Arg666Ser, Arg555Trp, Arg124Ser, Asp123delins, Arg124His, Arg124Leu, Leu509Pro, Leu103_Ser104del, Val113Ile, Asp123His, Arg124Leu, 및/또는 Thr125_Glu126del를 포함하는 돌연변이 TGFBI 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 돌연변이 단백질을 암호화한다.
추가의 양태에서, PAM은 NGG 및 NNGRRT로 이루어진 그룹으로부터 선택된 PAM으로 이루어지며, 여기서 N은 A, T, G, 및 C 중의 어느 것이고, R은 A 또는 G이다. 추가의 양태에서, 투여는, 예를 들면, 조작된 CRISPR/Cas9 시스템을 대상체의 각막(예를 들어, 각막 기질)에 주사함으로써 및/또는 조작된 CRISPR/Cas9 시스템을 표적 서열을 갖는 DNA 분자를 함유하고 발현하는 세포에 도입함으로써 조작된 CRISPR/Cas9 시스템을 대상체의 각막(예를 들어, 각막 기질)에 도입함을 포함한다.
몇몇 양태에서, 각막 이상증은 상피세포 기저막 이상증(EBMD: Epithelial basement membrane dystrophy), 미즈만 각막 이상증(MECD: Meesmann corneal dystrophy), 티엘-벵케 각막 이상증(TBCD: Thiel-Behnke corneal dystrophy), 격자 각막 이상증(LCD: Lattice corneal dystrophy), 과립 각막 이상증(GCD: Granular corneal dystrophy), 및 슈나이더 각막 이상증(SCD: Schnyder corneal dystrophy)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 추가의 양태에서, SNP 부위는 TGFBI, KRT3, KRT12, GSN, 및 UBIAD1 프레닐전달효소 도메인 함유 1(UBIAD1)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 유전자에 위치한다.
몇몇 양태에서, 본원에 기술된 CRISPR/Cas9 시스템 및 이를 사용하는 방법은 다수의 SNP 부위 또는 선조 SNP에서 돌연변이 서열을 변경시킬 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 대상체로부터 각막 이상증 표적 핵산에 핵산 돌연변이를 포함하는 다수의 줄기 세포를 수득하는 단계; (b) 다수의 줄기 세포 중의 하나 이상의 줄기 세포에서 핵산 돌연변이를 조작하여 핵산 돌연변이를 교정함으로써, 하나 이상의 조작된 줄기 세포(manipulated stem cell)를 형성하는 단계; (c) 하나 이상의 조작된 줄기 세포를 단리하는 단계; 및 (d) 하나 이상의 조작된 줄기 세포를 대상체에 이식하는 단계를 포함하여, 이를 필요로 하는 대상체에서 각막 이상증을 치료하는 방법에 관한 것이며, 여기서 다수의 줄기 세포 중의 하나 이상의 줄기 세포에서 핵산 돌연변이를 조작하는 단계는 유전자 산물의 발현을 변경시키는 방법 또는 본원에 기술된 바와 같이 대상체에서 돌연변이 또는 SNP와 관련된 질환을 예방, 개선, 또는 치료하는 방법 중의 어느 하나를 수행함을 포함한다.
도 1은 야생형 및 돌연변이 케라틴 12(K12) 대립유전자를 표적화하기 위한 sgRNA의 예시적인 설계를 열거한다. K12-L132P 대립유전자 상에서 발견된 SNP-유래 PAM을 사용한 sgRNA가 설계되었다(적색). 이러한 PAM은 야생형 대립유전자가 부재한다. 야생형 및 돌연변이 K12 대립유전자 둘 다를 표적화하는 제2 sgRNA(녹색)가 또한 설계되었으며 양성 대조군으로서 사용되었다.
도 2는 외인성 발현 작제물을 사용한 sgK12LP의 대립유전자 특이성 및 효능의 평가를 예시한다. 야생형 및 돌연변이 K12에 대한 외인성 발현 작제물을 sgK12LP의 대립유전자-특이성 및 효능을 시험하는데 사용하였다. (a) 이중 루시퍼라제 검정은 sgK12LP 플라스미드의 대립유전자-특이성을 입증한 반면, 효능은 sgK12 작제물의 효능에 필적하는 것으로 나타났다. N=8 (b) 웨스턴 블롯팅은 처리되었지만 K12 야생형 단백질을 발현하는 세포와 비교하여 sgK12LP로 처리된 세포에서 K12-L132P 단백질의 현저한 감소를 갖는 이러한 속성을 추가로 입증하였다. β-액틴이 부하 대조군(loading control)으로서 사용되었다. (c) 야생형 및 돌연변이 대립유전자 둘 다를 발현하는 세포에서 전체 K12에 대한 정량적 역전사효소-PCR은 mRNA 발현의 녹다운을 입증하였다. N=4 (d) 이러한 mRNA 녹다운의 대립유전자 비율을 그후 파이로시퀀싱(pyrosequencing)에 의해 정량하여, KRT12 대립유전자 둘 다를 공동-발현하고 sgK12LP로 처리된 세포에서 돌연변이 대립유전자의 대립유전자 녹다운을 확인하였다. N=4, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.
도 3은 생체내 sgK12LP-유도된 NHEJ를 예시한다. GFP 발현이 기질내 주사한지 24h 후 마우스의 각막 상피에서 관찰되었으며, 이는 각막 상피를 형질감염시키기 위한 기질내 플라스미드 주사의 효능을 입증한다(a; N=2). 주사한지 48h 후에는 GFP 발현이 관찰되지 않았다. sgK12LP 작제물을 주사한 인간 K12-L132P 이형접합성 마우스로부터의 gDNA의 서열분석은 KRT12-L132P 대립유전자의 절단으로 인해 NHEJ의 유도 및 큰 결실을 입증하였다. 서열분석한 13개 클론 중에서, 5개는 NHEJ를 겪는 것으로 밝혀졌다(b).
도 4는 TGFBI 돌연변이 R514P(A), L518R(B), L509R(C), L527R(D)에 대해 설계된 SNP 유도된 PAM 가이드 RNA를 사용한 결과를 보여주며 루시퍼라제 발현이 야생형 및 돌연변이 대립유전자 발현을 평가하는데 사용되었다. 양성 대조군(sgWT) 가이드는 야생형(WT, 청색 막대) 및 돌연변이형(MUT, 적색 막대) 대립유전자 둘 다를 절단하도록 설계되었으며 상기 나타낸 바와 같이 예상대로 대립유전자 둘 다를 절단한다. L518R에 사용되는 가이드(sgMut)는 최고의 대립유전자 특이성과 WT 대립유전자의 최소 절단(청색 막대)을 보인다. 예상대로 음성 대조군 가이드(sgNSC)는 WT와 MUT DNA 중 어느 것도 절단시키지 못했다.
도 5에서, 항목 A-E는 R124 및 R555 TGFBI 돌연변이에 대해 설계된 돌연변이 대립유전자 특이 가이드 RNA를 사용한 결과를 보여주며 루시퍼라제 발현이 야생형 및 돌연변이 대립유전자 발현을 평가하는데 사용되었다. 검정은 16 mer 내지 22 mer에 이르는 상이한 길이의 가이드로 수행하였다. 가이드 길이 이외에, 특이성을 개선시키는데 도움을 주기 위해 가이드의 5' 말단에의 이중 구아닌의 첨가를 또한 평가하였다. 청색 막대는 WT TGFBI 서열을 나타내고, 주황색 막대는 돌연변이 TGFBI 서열을 가리킨다. 돌연변이 가이드는 가이드의 길이에 기초하여 다양한 효율로 절단한다(도 5, 항목 A-E). R124(도 5, 항목 A, B 및 C)에 대해, 검정은 돌연변이 가이드가 돌연변이 서열을 우선적으로 표적화한다는 대립유전자-특이 동향을 보여준다(주황색 막대는 청색 막대에 비해 더 줄었다).
도 5에서, 항목 F는 R124H 돌연변이 20 mer 가이드가 비-표적 결합을 감소시키도록 조작된 강화된 Cas9 뉴클레아제로 시험되는 경우의 개선된 특이성을 보여준다.
도 5에서, 항목 G는 DNA가 절단되었음을 확인하기 위한 Cas9로의 시험관내 절단으로부터의 단편 분석을 보여준다. 절단 주형(cleavage template)을 6개의 공통 TGFBI 돌연변이(예를 들어, R124C, R124H, R124L, R555Q, R555W, 및 L527R)의 각각에 대한 야생형 및 돌연변이 서열에 대해 제조하였다. 야생형 및 돌연변이 서열을 함유하는 가이드 RNA 분자(20개 및 18개 뉴클레오티드)를 설계하고 합성하였다. 그후, 절단 주형을 Cas9-sgRNA 복합체로 시험관내에서 소화시키고 단편 분석을 아가로스 겔 상에서 수행하였다(도 5, 항목 G, (a)-(f)). R124C 절단 반응의 단편 분석(도 5, 항목 G, (a))은 이중 루시퍼라제 검정의 결과(도 5, 항목 A)에 필적하는 결과를 보여준다. R124H 및 R124L 둘 다에 대한 절단 반응의 분석(도 5, 항목 G, (b) 및 (c))은 이중 루시퍼라제 검정의 조사결과와 유사한 조사결과(도 5, 항목 B 및 C)를 다시금 보여주며 결과는 두 가지 매우 상이한 검정 사이에 의견 일치를 보인다. R555Q 및 R555W 절단 반응의 실험(도 5, 항목 G, (d) 및 (e))은 이중 루시퍼라제 검정에의 비교가능성을 다시금 나타낸다(도 5, 항목 D 및 E). L527R에 대한 절단 반응의 분석(도 5, 항목 G, (f))은 가이드의 길이에 기초한 다양한 절단 효율을 보여준다.
도 6에서, (A)는 Luc2에 대해 특이적이고 Luc2 유전자의 5' 영역을 표적화하도록 설계된 예시적인 단일 가이드 RNA(sgRNA) 표적 서열(자주색으로 강조표시되어 나타냄)을 보여준다. 가이드를 Luc2 유전자의 5' 영역에 결합하도록 설계하는 것은 표적화된 DNA에 조발성 종결 코돈을 생성함으로써 프레임-시프팅 결실 및 녹아웃 루시퍼라제(Luc2) 활성을 유도할 가능성을 증가시켰다. (B)는 이러한 Luc2 표적화 가이드를 루시퍼라제를 발현하는 세포에 가하고 루시퍼라제 발현에 기초하여 유전자 편집을 측정한 후 수득된 결과를 보여준다. 일부 세포는 비처리하였고(unT) 나머지 세포는 세포에서 DNA에 결합하지 않는 비-특이 음성 대조군 가이드 RNA(sgNSC) 및 또한 sgLuc2P인 Luc2에 대한 시험 가이드로 처리하였다.
도 7은 CRISPR Cas9 유전자 편집이 표적 유전자를 절단하고 이의 발현을 낮출 수 있으며 이것이 그 유전자로부터 단백질이 덜 발현되게 한다는 것을 생체내에서 마우스 각막 상피에서 입증한다. 루시퍼라제의 히트 맵(heat map)은 단백질 발현 수준을 나타내며, 여기서 Luc2 단백질에 대해 흑색은 발현 없음을 반영하고, 청색은 저 발현을 반영하며, 적색은 고 발현을 반영한다.
도 8은 문헌[F. Ran et al., Nat. Protoc. 2013, 8(11) 2281-2308]에 기술된 CRISPR/Cas9 시스템을 예시한다. S. 피오게네스로부터의 Cas9 뉴클레아제(황색으로)는 20-nt 가이드 서열(청색) 및 스캐폴드(적색)로 이루어진 sgRNA에 의해 게놈 DNA(예를 들면 인간 EMX1 유전자좌에 대해 도시됨)에 표적화된다. 가이드 서열은 필요한 5'-NGG 인접 모티프(PAM; 분홍색)의 바로 업스트림에서 DNA 표적(상부 가닥의 청색 막대)과 쌍을 이룬다. Cas9는 PAM의 업스트림에서 DSB ∼3 bp를 매개한다(적색 삼각형).
도 9는 여덟 개 박테리아 종으로부터의 타입 II CRISPR-Cas 유전자좌 및 sgRNA의 도식을 포함하여, 문헌[F. Ran et al., Nature 2015, 520(7546):186-91]에 기술된 CRISPR/Cas9 시스템을 예시한다. 스페이서 또는 "가이드" 서열은 청색으로 나타내어져 있고 직접 반복체(회색)가 뒤따른다. 예측되는 tracrRNA가 적색으로 나타내어져 있으며, Constraint Generation RNA 폴딩 모델에 기초하여 접힌다.
도 10은 또한 문헌[F. Ran et al., Nature 2015, 520(7546):186-91]에 기술된 CRISPR/Cas9 시스템을 예시한다. 도면은 포유류 세포에서 SaCas9 sgRNA 스캐폴드의 최적화를 보여준다. a, 스타필로코커스 아우레우스 아종 아우레우스 CRISPR 유전자좌의 개략도. b, 21-nt 가이드, crRNA 반복체(회색), 테트라루프(흑색) 및 tracrRNA(적색)을 갖는 SaCas9 sgRNA의 개략도. crRNA 반복체 대 tracrRNA 항-반복체 염기-대합의 수는 회색 박스 위에 나타내어져 있다. SaCas9는 c, HEK 293FT 및 d, Hepa1-6 세포주에서 다양한 반복체: 항-반복체 길이로 표적을 절단한다. (n=3, 오차 막대는 S.E.M.을 보여준다)
도 11은 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 뉴클레아제를 사용한 pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)를 포함하는, CRISPR/Cas9 시스템을 위한 예시적인 벡터를 예시한다.
도 12는 스타필로코커스 아우레우스를 사용한 CRISPR/Cas9 시스템을 위한 예시적인 벡터, pX601-AAV-CM::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA;U6::Bsal-sgRNA를 예시한다.
도 13은 스트렙토코커스 피오게네스(Spy) 및 스타필로코커스 아우레우스(Sau)로부터의 Cas9 뉴클레아제의 예시적인 sgRNA 서열, 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 예시한다.
도 14는 한 쌍의 sgRNA와 빽빽히 군집화되어 Cas9 절단을 지시하는 미즈만 각막 이상증(MECD)-관련 KRT12 돌연변이의 HDR-매개된 수선을 위한 예시적인 설계를 예시한다. 도 14에 도시된 수선 올리고(repair oligo)(ssODN)는 L132P에 대한 것이지만, 클러스터에서 다른 돌연변이에 대해서도 작동한다. 돌연변이 및 수선의 부위는 별표로 나타내어져 있다. 두 개의 화살촉은 PAM 부위를 기록함에 따라 Cas9에 의한 추가의 절단을 방지하는 유사한 변화들을 수선된 대립유전자에 도입하는 수선 올리고에서의 뉴클레오티드 변화를 보여준다.
도 15는 신규한 PAM을 생성하는 >10%의 MAF를 갖는 TGFBI에서의 모든 SNP를 예시한다. 번호가 붙은 박스는 TGFBI 내의 액손을 나타낸다. 다중 질환-유발 돌연변이가 발견되는 TGFBI의 핫 스팟은 적색 박스로 나타내어진다. 청색 화살표는 신규한 PAM을 생성하는 SNP의 위치를 나타낸다. 신규한 PAM이 각 화살표에 대해 나타내어져 있으며, 필요한 변이체는 적색으로 강조 표시되어 있다.
도 16은 측면 SNP 신규 PAM을 사용한 sgRNA가 제1 인트론에 설계되어 있는 예시적인 양태를 예시한다. 추가로, 야생형 및 돌연변이 대립유전자 둘 다에 공통인 sgRNA는 제2 인트론에 설계된다. 야생형 대립유전자에서 단일 sgRNA가 제2 인트론에서 NHEJ를 야기하며, 이것은 기능적 효과를 갖지 않는다. 그러나, 돌연변이 대립유전자에서, 측면 SNP 유도된 PAM을 사용하는 sgRNA 및 공통 sgRNA는 돌연변이 대립유전자의 녹아웃을 야기하는 큰 결실을 초래한다.
도 17은 CRISPR/Cas9로 뉴클레오펙션된 R124H Avellino 각막 이상증 돌연변이를 갖는 환자로부터 유도된 예시적인 림프구 세포주를 사용한 실험 결과를 도시한다. 가이드는 rs3805700 SNP에 의해 생성된 신규한 PAM을 사용하였다. 이러한 PAM은 환자 R124H 돌연변이와 동일한 염색체 상에 존재하지만 야생형 염색체 상에는 존재하지 않는다. 세포 분류 후, 인델(indel)이 일어나는지를 알아보기 위해 단일 클론을 단리하였다. 단일 클론 중의 여섯 개는 비편집된 야생형 염색체를 가졌으며, 이는 이러한 가이드의 엄중한 대립유전자-특이성을 나타낸다. 단리된 클론 중의 네 개는 돌연변이 염색체를 가졌으며, 이들 중의 세 개는 돌연변이 염색체의 75% 편집 효율을 보이는 편집을 나타내었다. 세 개의 클론 중의 두 개는 프레임-시프트하는 인델을 나타낸다. 따라서, 편집의 적어도 66.66%는 유전자 파괴를 유도하였다.
도 18은 예시적인 표적 부위, 가이드 서열 및 이들의 상보적 서열을 예시한다.
도 19는 각막 이상증과 관련된 SNP 부위를 포함하는 예시적인 표적 서열을 예시한다.
도 20 내지 35는 TGFBI 유전자의 인트론 영역에서의 예시적인 공통 가이드를 예시한다.
도 2는 외인성 발현 작제물을 사용한 sgK12LP의 대립유전자 특이성 및 효능의 평가를 예시한다. 야생형 및 돌연변이 K12에 대한 외인성 발현 작제물을 sgK12LP의 대립유전자-특이성 및 효능을 시험하는데 사용하였다. (a) 이중 루시퍼라제 검정은 sgK12LP 플라스미드의 대립유전자-특이성을 입증한 반면, 효능은 sgK12 작제물의 효능에 필적하는 것으로 나타났다. N=8 (b) 웨스턴 블롯팅은 처리되었지만 K12 야생형 단백질을 발현하는 세포와 비교하여 sgK12LP로 처리된 세포에서 K12-L132P 단백질의 현저한 감소를 갖는 이러한 속성을 추가로 입증하였다. β-액틴이 부하 대조군(loading control)으로서 사용되었다. (c) 야생형 및 돌연변이 대립유전자 둘 다를 발현하는 세포에서 전체 K12에 대한 정량적 역전사효소-PCR은 mRNA 발현의 녹다운을 입증하였다. N=4 (d) 이러한 mRNA 녹다운의 대립유전자 비율을 그후 파이로시퀀싱(pyrosequencing)에 의해 정량하여, KRT12 대립유전자 둘 다를 공동-발현하고 sgK12LP로 처리된 세포에서 돌연변이 대립유전자의 대립유전자 녹다운을 확인하였다. N=4, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.
도 3은 생체내 sgK12LP-유도된 NHEJ를 예시한다. GFP 발현이 기질내 주사한지 24h 후 마우스의 각막 상피에서 관찰되었으며, 이는 각막 상피를 형질감염시키기 위한 기질내 플라스미드 주사의 효능을 입증한다(a; N=2). 주사한지 48h 후에는 GFP 발현이 관찰되지 않았다. sgK12LP 작제물을 주사한 인간 K12-L132P 이형접합성 마우스로부터의 gDNA의 서열분석은 KRT12-L132P 대립유전자의 절단으로 인해 NHEJ의 유도 및 큰 결실을 입증하였다. 서열분석한 13개 클론 중에서, 5개는 NHEJ를 겪는 것으로 밝혀졌다(b).
도 4는 TGFBI 돌연변이 R514P(A), L518R(B), L509R(C), L527R(D)에 대해 설계된 SNP 유도된 PAM 가이드 RNA를 사용한 결과를 보여주며 루시퍼라제 발현이 야생형 및 돌연변이 대립유전자 발현을 평가하는데 사용되었다. 양성 대조군(sgWT) 가이드는 야생형(WT, 청색 막대) 및 돌연변이형(MUT, 적색 막대) 대립유전자 둘 다를 절단하도록 설계되었으며 상기 나타낸 바와 같이 예상대로 대립유전자 둘 다를 절단한다. L518R에 사용되는 가이드(sgMut)는 최고의 대립유전자 특이성과 WT 대립유전자의 최소 절단(청색 막대)을 보인다. 예상대로 음성 대조군 가이드(sgNSC)는 WT와 MUT DNA 중 어느 것도 절단시키지 못했다.
도 5에서, 항목 A-E는 R124 및 R555 TGFBI 돌연변이에 대해 설계된 돌연변이 대립유전자 특이 가이드 RNA를 사용한 결과를 보여주며 루시퍼라제 발현이 야생형 및 돌연변이 대립유전자 발현을 평가하는데 사용되었다. 검정은 16 mer 내지 22 mer에 이르는 상이한 길이의 가이드로 수행하였다. 가이드 길이 이외에, 특이성을 개선시키는데 도움을 주기 위해 가이드의 5' 말단에의 이중 구아닌의 첨가를 또한 평가하였다. 청색 막대는 WT TGFBI 서열을 나타내고, 주황색 막대는 돌연변이 TGFBI 서열을 가리킨다. 돌연변이 가이드는 가이드의 길이에 기초하여 다양한 효율로 절단한다(도 5, 항목 A-E). R124(도 5, 항목 A, B 및 C)에 대해, 검정은 돌연변이 가이드가 돌연변이 서열을 우선적으로 표적화한다는 대립유전자-특이 동향을 보여준다(주황색 막대는 청색 막대에 비해 더 줄었다).
도 5에서, 항목 F는 R124H 돌연변이 20 mer 가이드가 비-표적 결합을 감소시키도록 조작된 강화된 Cas9 뉴클레아제로 시험되는 경우의 개선된 특이성을 보여준다.
도 5에서, 항목 G는 DNA가 절단되었음을 확인하기 위한 Cas9로의 시험관내 절단으로부터의 단편 분석을 보여준다. 절단 주형(cleavage template)을 6개의 공통 TGFBI 돌연변이(예를 들어, R124C, R124H, R124L, R555Q, R555W, 및 L527R)의 각각에 대한 야생형 및 돌연변이 서열에 대해 제조하였다. 야생형 및 돌연변이 서열을 함유하는 가이드 RNA 분자(20개 및 18개 뉴클레오티드)를 설계하고 합성하였다. 그후, 절단 주형을 Cas9-sgRNA 복합체로 시험관내에서 소화시키고 단편 분석을 아가로스 겔 상에서 수행하였다(도 5, 항목 G, (a)-(f)). R124C 절단 반응의 단편 분석(도 5, 항목 G, (a))은 이중 루시퍼라제 검정의 결과(도 5, 항목 A)에 필적하는 결과를 보여준다. R124H 및 R124L 둘 다에 대한 절단 반응의 분석(도 5, 항목 G, (b) 및 (c))은 이중 루시퍼라제 검정의 조사결과와 유사한 조사결과(도 5, 항목 B 및 C)를 다시금 보여주며 결과는 두 가지 매우 상이한 검정 사이에 의견 일치를 보인다. R555Q 및 R555W 절단 반응의 실험(도 5, 항목 G, (d) 및 (e))은 이중 루시퍼라제 검정에의 비교가능성을 다시금 나타낸다(도 5, 항목 D 및 E). L527R에 대한 절단 반응의 분석(도 5, 항목 G, (f))은 가이드의 길이에 기초한 다양한 절단 효율을 보여준다.
도 6에서, (A)는 Luc2에 대해 특이적이고 Luc2 유전자의 5' 영역을 표적화하도록 설계된 예시적인 단일 가이드 RNA(sgRNA) 표적 서열(자주색으로 강조표시되어 나타냄)을 보여준다. 가이드를 Luc2 유전자의 5' 영역에 결합하도록 설계하는 것은 표적화된 DNA에 조발성 종결 코돈을 생성함으로써 프레임-시프팅 결실 및 녹아웃 루시퍼라제(Luc2) 활성을 유도할 가능성을 증가시켰다. (B)는 이러한 Luc2 표적화 가이드를 루시퍼라제를 발현하는 세포에 가하고 루시퍼라제 발현에 기초하여 유전자 편집을 측정한 후 수득된 결과를 보여준다. 일부 세포는 비처리하였고(unT) 나머지 세포는 세포에서 DNA에 결합하지 않는 비-특이 음성 대조군 가이드 RNA(sgNSC) 및 또한 sgLuc2P인 Luc2에 대한 시험 가이드로 처리하였다.
도 7은 CRISPR Cas9 유전자 편집이 표적 유전자를 절단하고 이의 발현을 낮출 수 있으며 이것이 그 유전자로부터 단백질이 덜 발현되게 한다는 것을 생체내에서 마우스 각막 상피에서 입증한다. 루시퍼라제의 히트 맵(heat map)은 단백질 발현 수준을 나타내며, 여기서 Luc2 단백질에 대해 흑색은 발현 없음을 반영하고, 청색은 저 발현을 반영하며, 적색은 고 발현을 반영한다.
도 8은 문헌[F. Ran et al., Nat. Protoc. 2013, 8(11) 2281-2308]에 기술된 CRISPR/Cas9 시스템을 예시한다. S. 피오게네스로부터의 Cas9 뉴클레아제(황색으로)는 20-nt 가이드 서열(청색) 및 스캐폴드(적색)로 이루어진 sgRNA에 의해 게놈 DNA(예를 들면 인간 EMX1 유전자좌에 대해 도시됨)에 표적화된다. 가이드 서열은 필요한 5'-NGG 인접 모티프(PAM; 분홍색)의 바로 업스트림에서 DNA 표적(상부 가닥의 청색 막대)과 쌍을 이룬다. Cas9는 PAM의 업스트림에서 DSB ∼3 bp를 매개한다(적색 삼각형).
도 9는 여덟 개 박테리아 종으로부터의 타입 II CRISPR-Cas 유전자좌 및 sgRNA의 도식을 포함하여, 문헌[F. Ran et al., Nature 2015, 520(7546):186-91]에 기술된 CRISPR/Cas9 시스템을 예시한다. 스페이서 또는 "가이드" 서열은 청색으로 나타내어져 있고 직접 반복체(회색)가 뒤따른다. 예측되는 tracrRNA가 적색으로 나타내어져 있으며, Constraint Generation RNA 폴딩 모델에 기초하여 접힌다.
도 10은 또한 문헌[F. Ran et al., Nature 2015, 520(7546):186-91]에 기술된 CRISPR/Cas9 시스템을 예시한다. 도면은 포유류 세포에서 SaCas9 sgRNA 스캐폴드의 최적화를 보여준다. a, 스타필로코커스 아우레우스 아종 아우레우스 CRISPR 유전자좌의 개략도. b, 21-nt 가이드, crRNA 반복체(회색), 테트라루프(흑색) 및 tracrRNA(적색)을 갖는 SaCas9 sgRNA의 개략도. crRNA 반복체 대 tracrRNA 항-반복체 염기-대합의 수는 회색 박스 위에 나타내어져 있다. SaCas9는 c, HEK 293FT 및 d, Hepa1-6 세포주에서 다양한 반복체: 항-반복체 길이로 표적을 절단한다. (n=3, 오차 막대는 S.E.M.을 보여준다)
도 11은 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 뉴클레아제를 사용한 pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)를 포함하는, CRISPR/Cas9 시스템을 위한 예시적인 벡터를 예시한다.
도 12는 스타필로코커스 아우레우스를 사용한 CRISPR/Cas9 시스템을 위한 예시적인 벡터, pX601-AAV-CM::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA;U6::Bsal-sgRNA를 예시한다.
도 13은 스트렙토코커스 피오게네스(Spy) 및 스타필로코커스 아우레우스(Sau)로부터의 Cas9 뉴클레아제의 예시적인 sgRNA 서열, 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 예시한다.
도 14는 한 쌍의 sgRNA와 빽빽히 군집화되어 Cas9 절단을 지시하는 미즈만 각막 이상증(MECD)-관련 KRT12 돌연변이의 HDR-매개된 수선을 위한 예시적인 설계를 예시한다. 도 14에 도시된 수선 올리고(repair oligo)(ssODN)는 L132P에 대한 것이지만, 클러스터에서 다른 돌연변이에 대해서도 작동한다. 돌연변이 및 수선의 부위는 별표로 나타내어져 있다. 두 개의 화살촉은 PAM 부위를 기록함에 따라 Cas9에 의한 추가의 절단을 방지하는 유사한 변화들을 수선된 대립유전자에 도입하는 수선 올리고에서의 뉴클레오티드 변화를 보여준다.
도 15는 신규한 PAM을 생성하는 >10%의 MAF를 갖는 TGFBI에서의 모든 SNP를 예시한다. 번호가 붙은 박스는 TGFBI 내의 액손을 나타낸다. 다중 질환-유발 돌연변이가 발견되는 TGFBI의 핫 스팟은 적색 박스로 나타내어진다. 청색 화살표는 신규한 PAM을 생성하는 SNP의 위치를 나타낸다. 신규한 PAM이 각 화살표에 대해 나타내어져 있으며, 필요한 변이체는 적색으로 강조 표시되어 있다.
도 16은 측면 SNP 신규 PAM을 사용한 sgRNA가 제1 인트론에 설계되어 있는 예시적인 양태를 예시한다. 추가로, 야생형 및 돌연변이 대립유전자 둘 다에 공통인 sgRNA는 제2 인트론에 설계된다. 야생형 대립유전자에서 단일 sgRNA가 제2 인트론에서 NHEJ를 야기하며, 이것은 기능적 효과를 갖지 않는다. 그러나, 돌연변이 대립유전자에서, 측면 SNP 유도된 PAM을 사용하는 sgRNA 및 공통 sgRNA는 돌연변이 대립유전자의 녹아웃을 야기하는 큰 결실을 초래한다.
도 17은 CRISPR/Cas9로 뉴클레오펙션된 R124H Avellino 각막 이상증 돌연변이를 갖는 환자로부터 유도된 예시적인 림프구 세포주를 사용한 실험 결과를 도시한다. 가이드는 rs3805700 SNP에 의해 생성된 신규한 PAM을 사용하였다. 이러한 PAM은 환자 R124H 돌연변이와 동일한 염색체 상에 존재하지만 야생형 염색체 상에는 존재하지 않는다. 세포 분류 후, 인델(indel)이 일어나는지를 알아보기 위해 단일 클론을 단리하였다. 단일 클론 중의 여섯 개는 비편집된 야생형 염색체를 가졌으며, 이는 이러한 가이드의 엄중한 대립유전자-특이성을 나타낸다. 단리된 클론 중의 네 개는 돌연변이 염색체를 가졌으며, 이들 중의 세 개는 돌연변이 염색체의 75% 편집 효율을 보이는 편집을 나타내었다. 세 개의 클론 중의 두 개는 프레임-시프트하는 인델을 나타낸다. 따라서, 편집의 적어도 66.66%는 유전자 파괴를 유도하였다.
도 18은 예시적인 표적 부위, 가이드 서열 및 이들의 상보적 서열을 예시한다.
도 19는 각막 이상증과 관련된 SNP 부위를 포함하는 예시적인 표적 서열을 예시한다.
도 20 내지 35는 TGFBI 유전자의 인트론 영역에서의 예시적인 공통 가이드를 예시한다.
전반에 걸쳐 사용되는 바와 같이, 범위는 범위 내에 있는 각각의 값 및 모든 값을 서술하기 위해 속기로서 사용된다. 범위 내의 임의의 값은 범위의 종점으로서 선택될 수 있다. 또한, 본원에 인용된 모든 참고문헌은 모든 목적을 위해 전문이 본원에 참고로 포함된다. 본 발명의 정의와 인용된 참고문헌의 정의의 충돌시, 본 발명의 기재내용이 통제한다.
하나의 측면에서, 본 발명은 예를 들면, 각막 이상증을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 CRISPR/Cas9 시스템을 위해 설계된 단일 가이드 RNA(sgRNA)를 포함한 sgRNA에 관한 것이다. sgRNA는 인공, 인조, 합성, 및/또는 비-자연 발생적일 수 있다. 몇몇 양태에서, sgRNA는 (i) CRISPR 표적화 RNA(crRNA) 서열 및 (ii) "sgRNA 스캐폴드"라고도 불릴 수 있는 전사-활성화 crRNA(tracrRNA) 서열을 포함한다. 몇몇 양태에서, crRNA 서열 및 tracrRNA 서열은 자연적으로 함께 발생하지 않는다. 본원에서 사용되는 용어 "sgRNA"는 (i) 가이드 서열(crRNA 서열) 및 (ii) Cas9 뉴클레아제-모집 서열(tracrRNA)을 함유하는 단일 가이드 RNA를 가리킬 수 있다. 예시적인 가이드 서열은 도 18-19에 개시된 것들을 포함한다. crRNA 서열은 당신의 관심 유전자의 영역에 상동성인 서열일 수 있으며 Cas9 뉴클레아제 활성을 지시할 수 있다. crRNA 서열 및 tracrRNA 서열은 자연적으로 함께 발생하지 않는다. sgRNA는 RNA로서 또는 프로모터 하에서 sgRNA-암호화 서열을 갖는 플라스미드(sgRNA 유전자)로 형질전환함으로써 전달될 수 있다.
몇몇 양태에서, sgRNA 또는 crRNA는 표적 서열(예를 들어, 표적 게놈 서열)의 적어도 일부에 혼성화되며, crRNA는 표적 서열에 상보적인 서열을 가질 수 있다. 몇몇 양태에서, 본원의 표적 서열은 본원에 기술된 PAM 부위에 인접한 제2 표적 서열에 혼성화된 제1 표적 서열이다. 몇몇 양태에서, sgRNA 또는 crRNA는 제1 표적 서열 또는 제2 표적 서열을 포함할 수 있다. "상보성"은 핵산이 전통적인 왓슨 크릭(Watson-Crick) 또는 다른 비-전통적인 타입에 의해 다른 핵산 서열과 수소 결합(들)을 형성하는 능력을 가리킨다. 상보성 퍼센트는 제2 핵산 서열과 수소 결합(예를 들어, 왓슨 크릭 염기 대합)을 형성할 수 있는 핵산 분자의 잔기의 백분율을 가리킨다(예를 들어, 10 중의 5, 6, 7, 8, 9, 10은 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 및 100% 상보적이다). "완전히 상보적인(perfectly complementary)"은 핵산 서열의 모든 인접 잔기가 동일한 수의 제2 핵산 서열의 인접 잔기와 수소 결합할 것임을 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같이 "실질적으로 상보적인(substantially complementary)"은 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50개, 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 영역에 걸쳐 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%. 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 상보성의 정도를 가리키거나, 엄격한 조건하에서 혼성화하는 두 개의 핵산을 가리킨다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 혼성화를 위한 "엄격한 조건"은 표적 서열에 대해 상보성을 갖는 핵산이 대개 표적 서열과 혼성화되고, 실질적으로 비-표적 서열에는 혼성화되지 않는 조건을 가리킨다. 엄격한 조건은 일반적으로 서열-의존적이며, 여러 인자들에 따라 변한다. 일반적으로, 서열이 길수록, 서열이 특이적으로 이의 표적 서열에 혼성화되는 온도가 높아진다. 엄격한 조건의 비제한적인 예는 문헌[Tijssen (1993), Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes Part 1, Second Chapter "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay", Elsevier, N.Y.]에 상세하게 기술되어 있다. "혼성화"는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 반응하여 뉴클레오티드 잔기의 염기들 간에 수소 결합을 통해 안정화된 복합체를 형성하는 반응을 가리킨다. 수소 결합은 왓슨 크릭 염기 대합, Hoogstein 결합, 또는 임의의 다른 서열 특이적인 방식에 의해 일어날 수 있다. 복합체는 이중 구조를 형성하는 두 개의 가닥, 다중 가닥 복합체를 형성하는 세 개 이상의 가닥, 단일 자가-혼성화 가닥, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 혼성화 반응은 PCR의 개시, 또는 효소에 의한 폴리뉴클레오티드의 절단과 같은 보다 광범위한 과정에서 단계를 구성할 수 있다. 주어진 서열과 혼성화할 수 있는 서열을 주어진 서열의 "보체"라고 한다. 몇몇 양태에서, crRNA 서열은 서열 번호 (10+4n)(여기서, n은 0 내지 221의 정수이다)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 80, 85, 90, 95 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약"은 명시된 기준 값과 유사한 값의 범위를 가리킬 수 있다. 특정 양태에서, 용어 "약"은 명시된 기준 값의 15, 10, 9, 8,7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 퍼센트 또는 그 미만 내에 드는 값의 범위를 가리킨다. 몇몇 양태에서, crRNA 서열은 서열 번호 (10+4n)(여기서, n은 0 내지 221의 정수이다)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열로부터의 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 뉴클레오티드 부가, 결실 및/또는 치환을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 이러한 부가, 결실 및/또는 치환은 뉴클레오티드 서열의 3'-말단 또는 5'-말단에 있을 수 있다. 추가의 양태에서, crRNA 또는 가이드 서열은 약 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개 뉴클레오티드 길이이다. 추가의 양태에서, crRNA는 서열 번호 10의 뉴클레오티드 서열을 갖는 crRNA 서열을 배제한다. 추가의 양태에서, crRNA는 케라틴 12 단백질에 L132P 돌연변이를 초래하는 SNP를 포함하는 뉴클레오티드 서열에 혼성화하는 crRNA 서열을 배제한다. 추가의 양태에서, crRNA는 케라틴 12 단백질에 돌연변이를 초래하는 SNP를 포함하는 뉴클레오티드 서열에 혼성화하는 crRNA 서열을 배제한다.
몇몇 양태에서, tracrRNA는 crRNA 서열의 결합을 위해 dsDNA를 개방하기 위해 Cas9를 활성화시키는 헤어핀 구조를 제공한다. tracrRNA는 회문 반복체에 상보적인 서열을 가질 수 있다. tracrRNA가 짧은 회문 반복체에 혼성화되는 경우, 이것은 박테리아 이중-가닥 RNA-특이 리보뉴클레아제, RNase III에 의해 프로세싱을 촉발시킬 수 있다. 추가의 양태에서, tracrRNA는 SPIDR(스페이서 산재 직접 반복부: SPacer Interspersed Direct Repeats)을 가질 수 있으며, 통상적으로 특정 박테리아 종에 특이적인 DNA 유전자좌의 패밀리를 구성한다. CRISPR 유전자좌는 이. 콜라이(문헌 [Ishino et al., J. Bacteriol., 169:5429-5433 [1987]]; 및 [Nakata et al., J. Bacteriol., 171:3553-3556 [1989]]), 및 관련 유전자에서 인식되었던 다른 종류의 산재성 짧은 서열 반복체(SSR)를 포함한다. 유사한 산재성 SSR이 할로페락스 메디테라네이(Haloferax mediterranei), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 아나베나(Anabaena), 및 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)에서 확인되었다(참조; 문헌 [Groenen et al., Mol. Microbiol., 10:1057-1065 [1993]]; [Hoe et al., Emerg. Infect. Dis., 5:254-263 [1999]]; [Masepohl et al., Biochim. Biophys. Acta 1307:26-30 [1996]]; 및 [Mojica et al., Mol. Microbiol., 17:85-93 [1995]]). CRISPR 유전자좌는 반복체의 구조에 의해 다른 SSR과는 다를 수 있으며, 이것을 일정한 간격을 두고 주기적으로 분포하는 짧은 반복서열(SRSR)이라고 부를 수 있다(문헌 [Janssen et al., OMICS J. Integ. Biol., 6:23-33 [2002]]; 및 [Mojica et al., Mol. Microbiol., 36:244-246 [2000]]). 특정 양태에서, 반복체는 실질적으로 일정한 길이를 갖는 독특한 개재 서열에 의해 일정한 간격을 두고 주기적으로 분포하는 클러스터에서 발생하는 짧은 요소이다(문헌 [Mojica et al., [2000]], 상기). 반복 서열이 균주 간에 매우 보존적이기는 하지만, 산재성 반복체의 수 및 스페이서 영역의 서열은 전형적으로 균주마다 상이하다(문헌 [van Embden et al., J. Bacteriol., 182:2393-2401 [2000]]). tracrRNA 서열은 당업계에 알려진 CRISPR/Cas9 시스템을 위한 tracrRNA에 대한 임의의 서열일 수 있다. 추가의 양태에서, tracrRNA는 서열 번호 2 및 6의 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. tracrRNA 서열은 당업계에 알려진 CRISPR/Cas9 시스템을 위한 tracrRNA에 대한 임의의 서열일 수 있다. 예시적인 CRISPR/Cas9 시스템, sgRNA, crRNA 및 tracrRNA, 및 이들의 제조방법 및 사용은 미국 특허 제8697359호, 미국 특허 출원 공보 제20150232882호, 제20150203872호, 제20150184139호, 제20150079681호, 제20150073041호, 제20150056705호, 제20150031134호, 제20150020223호, 제20140357530호, 제20140335620호, 제20140310830호, 제20140273234호, 제20140273232호, 제20140273231호, 제20140256046호, 제20140248702호, 제20140242700호, 제20140242699호, 제20140242664호, 제20140234972호, 제20140227787호, 제20140189896호, 제20140186958호, 제20140186919호, 제20140186843호, 제20140179770호, 제20140179006호, 제20140170753호, 제20140093913호, 제20140080216호, 및 제WO2016049024호에 개시되어 있으며, 이들 모두는 전문이 본원에 포함된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 CRISPR/Cas9 시스템을 위한 벡터에 삽입되는 올리고뉴클레오티드 쌍에 관한 것이며, 여기서 올리고뉴클레오티드 쌍은 본원에 기술된 crRNA 서열을 포함하는 프라이머를 포함한다. 프라이머는 crRNA 서열에 인접한 2, 3, 4, 5 또는 6개 뉴클레오티드의 로케이터 서열(locator sequence)을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 로케이터 서열은 crRNA 서열에 인접하여 자연적으로 발생하지 않는다. 몇몇 양태에서, 본 발명은 pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459) 및 pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA;U6::Bsal-sgRNA와 같은 CRISPR/Cas9 시스템을 위한 crRNA를 암호화하기 위해 벡터에 삽입되는 올리고뉴클레오티드 쌍에 관한 것이며, 여기서 올리고뉴클레오티드 쌍은 서열 번호 (10+4n)(여기서, n은 0 내지 221의 정수이다)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머를 포함한다. 추가의 양태에서, 올리고뉴클레오티드 쌍은 서열 번호 X의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머, 및 서열 번호 Y의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하고, 여기서, X는 11+4n이고, Y는 12+4n이며, n은 1 내지 221의 정수이다. 몇몇 양태에서, crRNA는 서열 번호 58, 54, 50, 42, 94, 90, 86, 82, 78, 74, 70, 114, 100, 106, 98, 178, 174, 170, 166, 162, 158, 146, 142, 138, 134, 130 및 126으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 Cas9 뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 분자 및 본원에 기술된 sgRNA를 포함하는 적어도 하나의 벡터를 포함하는 조작된 일정한 간격을 두고 주기적으로 분포하는 짧은 회문 반복서열(CRISPR)/CRISPR 관련 단백질 9(Cas9) 시스템에 관한 것이다. 용어 "비-자연 발생적(non-naturally occurring)" 또는 "조작된(engineered)"은 상호교환 가능하게 사용되며 인간의 손의 개입을 나타낸다. 용어는, 핵산 분자 또는 폴리펩타이드를 가리키는 경우, 핵산 분자 또는 폴리펩타이드가 이들이 자연에서 및 자연에서 발견되는 대로 자연적으로 관련되는 적어도 하나의 다른 성분을 적어도 실질적으로 함유하지 않음을 의미한다. 몇몇 양태에서, Cas9 뉴클레아제 및 sgRNA는 자연적으로 함께 발생하지 않는다.
일반적으로 "CRISPR 시스템"은 Cas 유전자를 암호화하는 서열, tracr(전사-활성화 CRISPR) 서열(예를 들어, tracrRNA 또는 활성 부분 tracrRNA), tracr-메이트 서열(내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 "직접 반복체" 및 tracrRNA-프로세싱된 부분 직접 반복체"를 포함함), 가이드 서열(내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 본원에서 "crRNA", 또는 "스페이서"라고도 함), 및/또는 CRISPR 유전자좌로부터의 다른 서열 및 전사체를 포함한, CRISPR-관련("Cas") 유전자의 활성을 발현하거나 지시하는데 관여하는 전사체 및 다른 요소를 통틀어 가리킨다. 상기한 바와 같이, sgRNA는 적어도 tracrRNA 및 crRNA의 조합이다. 몇몇 양태에서, CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소는 타입 II CRISPR 시스템으로부터 유도된다. 몇몇 양태에서, CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소는 스트렙토코커스 피오게네스 또는 스타필로코커스 아우레우스와 같은 내인성 CRISPR 시스템을 포함하는 특정 유기체로부터 유도된다. 일반적으로, CRISPR 시스템은 표적 서열의 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 촉진시키는 요소(내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 프로토스페이서라고도 함)를 특징으로 한다. CRISPR 복합체의 형성의 맥락에서, "표적 서열"은 표적 서열과 가이드 서열 간의 혼성화가 CRISPR 복합체의 형성을 촉진시키는 경우 가이드 서열이 상보성을 갖도록 설계된 서열을 가리킬 수 있거나, 도 8에 도시된 바와 같이, "표적 서열"은 가이드 서열이 포함하는 PAM 부위에 인접한 서열을 가리킬 수 있다. 완전 상보성은 혼성화를 야기하고 CRISPR 복합체의 형성을 촉진시키기에 충분한 상보성이 있는 한 필드시 필요한 것이 아니다. 이러한 기재내용에서, "표적 부위"는, 예를 들면, 이중 가닥 뉴클레오티드에서 표적 서열 및 이의 상보적 서열 둘 다를 포함하는 표적 서열의 부위를 가리킨다. 몇몇 양태에서, 본원에 기술된 표적 부위는 CRISPR/Cas9 시스템의 sgRNA 또는 crRNA에 혼성화되는 제1 표적 서열, 및/또는 PAM의 5'-말단에 인접한 제2 표적 서열을 의미할 수 있다. 표적 서열은 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드와 같은 임의의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 표적 서열은 세포의 핵 또는 세포질에 위치한다. 몇몇 양태에서, 표적 서열은 진핵 세포의 세포소기관, 예를 들면, 미토콘드리아 또는 엽록체 내에 있을 수 있다.
몇몇 양태에서, 본원에 기술된 Cas9 뉴클레아제는 공지되어 있다; 예를 들면, S. 피오게네스 Cas9 단백질의 아미노산 서열은 수탁 번호 Q99ZW2 하에 SwissProt 데이터베이스에서 찾아볼 수 있다. Cas9 뉴클레아제는 Cas9 호모로그(homolog) 또는 오르소로그(ortholog)일 수 있다. 개선된 특이성을 나타내는 돌연변이 Cas9 뉴클레아제가 또한 사용될 수 있다(예를 들어 문헌 참조; [Ann Ran et al. Cell 154(6) 1380-89 (2013)], 이것은 모든 목적을 위해 및 특히 표적 핵산에 대해 개선된 특이성을 갖는 돌연변이 Cas9 뉴클레아제에 관한 모든 교시사항에 대해 전문이 본원에 참고로 포함됨). 핵산 조작 시약(nucleic acid manipulation reagent)은 또한 불활성화된 Cas9 뉴클레아제(dCas9)를 포함할 수 있다. 핵산 요소에만 결합하는 불활성화된 Cas9는 RNA 폴리머라제 기전을 입체적으로 방해함으로써 전사를 억제할 수 있다. 게다가, 불활성화된 Cas는 표적 핵산에 비가역적인 돌연변이를 도입하지 않으면서 표적 부위에서 유전자 발현에 영향을 미치는 다른 단백질(예를 들어, 전사 억제자, 활성인자 및 모집 도메인)을 위한 자동유도장치(homing device)로서 사용될 수 있다. 예를 들면, dCas9는 KRAB 또는 SID 효과기와 같은 전사 억제자 도메인에 융합하여 표적 부위에서 후생학적 침묵(epigenetic silencing)을 촉진시킬 수 있다. Cas9는 또한 VP16/VP64 또는 p64 활성화 도메인에의 융합에 의해 합성 전사 활성인자로 전환될 수 있다. 일부 경우에, 강화된 Cas9(eCa9) 뉴클레아제라고 하는 돌연변이 타입 II 뉴클레아제가 야생형 Cas9 뉴클레아제 대신에 사용된다. 강화된 Cas9는 비-표적 결합을 약화시킴으로써 특이성을 개선시키도록 합리적으로 조작되었다. 이것은 비-표적 가닥 홈 내에 양으로 하전된 잔기를 중화시킴으로써 달성되었다(문헌 [Slaymaker et al., 2016]).
몇몇 양태에서, Cas9 뉴클레아제는 표적 서열 내 및/또는 표적 서열의 보체 내와 같은 표적 서열의 위치에서 가닥 중의 하나 또는 둘 다의 절단을 지시한다. 몇몇 양태에서, Cas9 뉴클레아제는 표적 서열의 제1 또는 마지막 뉴클레오티드로부터 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500개, 또는 그 이상의 염기 쌍 내에 가닥 중의 하나 또는 둘 다의 절단을 지시한다.
Cas9 뉴클레아제에 의한 지시된 DNA 절단 후, 세포에 이용 가능한 DNA 수선에는 두 가지 모드가 있다: 상동성 직접 수선(HDR) 및 비-상동 말단 접합(NHEJ). 돌연변이 부위에 가까운 Cas9 절단 후 HDR에 의한 돌연변이의 솔기없는 교정(seamless correction)이 매력적이지만, 이 방법의 효율은 이것이 단지 수선이 일어난 세포를 선택하고 이들 변형된 세포만을 정제하는 추가의 단계로 줄기 세포 또는 유도 다능성 줄기 세포(iPSC)의 시험관내 / 생체외 변형에 사용될 수 있음을 의미한다. HDR은 세포에서 높은 빈도로 발생하지 않는다. 다행스럽게도 NHEJ는 훨씬 더 높은 효율로 발생하며 다수의 각막 이상증에 대해 기술된 우성-음성 돌연변이에 적합할 수 있다. 추가의 양태에서, Cas9 뉴클레아제는 스트렙토코커스로부터의 것이다. 추가의 양태에서, Cas9 뉴클레아제는 스트렙토코커스 피오게네스 , 스트렙토코커스 디스갈락티에 , 스트렙토코커스 카니스 , 스트렙토코커스 이콰이 , 스트렙토코커스 이니에 , 스트렙토코커스 포카에 , 스트렙토코커스 슈도포르시누스 , 스트렙토코커스 오랄리스 , 스트렙토코커스 슈도포르시누스 , 스트렙토코커스 인판타리우 스, 스트렙토코커스 뮤탄스 , 스트렙토코커스 아갈락티에 , 스트렙토코커스 카발리 , 스트렙토코커스 이콰이누스 , 스트렙토코커스 종 경구 탁손 , 스트렙토코커스 미티스 , 스트렙토코커스 갈롤리티쿠스 , 스트렙토코커스 고르도니이 , 또는 스트렙토코커스 파스퇴리아누스, 또는 이의 변이체로부터의 것이다. 이러한 변이체는 D10A Nickase, 문헌[Kleinstiver et al, 2016 Nature, 529, 490-495]에 기술된 바와 같은 Spy Cas9-HF1, 또는 문헌[Slaymaker et al., 2016 Science, 351(6268), 84-88]에 기술된 바와 같은 Spy eCas9를 포함할 수 있다. 추가의 양태에서, Cas9 뉴클레아제는 스타필로코커스로부터의 것이다. 추가의 양태에서, Cas9 뉴클레아제는 스 타필로코커스 아우레우스 , 스타필로코커스 시미에 , 스타필로코커스 아우리쿨라리스 , 스타필로코커스 카르노수스 , 스타필로코커스 콘디멘티 , 스타필로코커스 마실리엔시스 , 스타필로코커스 피시페르멘탄스 , 스타필로코커스 시물란스 , 스타필로코커스 카피티스 , 스타필로코커스 카프라에, 스타필로코커스 에피데르미디스 , 스타필로코커스 사카롤리티쿠스 , 스타필로코커스 데브리에세이 , 스타필로코커스 헤몰리티쿠스 , 스타필로코커스 호미니스 , 스타필로코커스 아그네티스 , 스타필로코커스 크로모게네스 , 스타필로코커스 펠리스 , 스타필로코커스 델피니 , 스타필로코커스 히쿠스 , 스타필로코커스 인터메디우스 , 스타필로코커스 루트라에 , 스타필로코커스 미크로티 , 스타필로코커스 무스카에 , 스타필로코커스 슈드인터메디우스 , 스타필로코커스 로스트리 , 스타필로코커스 슐레이페리, 스타필로코커스 루그두넨시스 , 스타필로코커스 아를레타에 , 스타필로코커스 코흐이 , 스타필로코커스 에쿠오룸 , 스타필로코커스 갈리나룸 , 스타필로코커스 클루시이 , 스타필로코커스 레에이 , 스타필로코커스 네팔렌시스 , 스타필로코커스 사프로피티쿠스, 스타필로코커스 수시누스 , 스타필로코커스 크실로수스 , 스타필로코커스 플레우레티이 , 스타필로코커스 렌투스 , 스타필로코커스 시스우리 , 스타필로코커스 스테파노비시이 , 스타필로코커스 비툴리누스 , 스타필로코커스 시물란스 , 스타필로코커스 파스퇴리 , 스타필로코커스 와르네리, 또는 이의 변이체로부터의 것이다.
추가의 양태에서, Cas9 뉴클레아제는 스트렙토코커스 피오게네스로부터의 Cas9 뉴클레아제를 배제한다.
추가의 양태에서, Cas9 뉴클레아제는 서열 번호 4 또는 8로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 60, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 추가의 양태에서, Cas9 뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 분자는 서열 번호 3 또는 7로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 60, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
몇몇 양태에서, Cas9 뉴클레아제는 Cas9 뉴클레아제의 특이성을 개선시키는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 강화된 Cas9 뉴클레아제이다. 추가의 양태에서, 강화된 Cas9 뉴클레아제는 Cas9 뉴클레아제에서 HNH, RuvC, 및 PAM-상호작용 도메인 사이에 위치한 양으로 하전된 홈을 중화시키는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 스트렙토코커스 피오게네스로부터의 Cas9 뉴클레아제이다. 추가의 양태에서, Cas9 뉴클레아제는 (i) K855A, (ii) K810A, K1003A 및 R1060A, 및 (iii) K848A, K1003A 및 R1060A로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 스트렙토코커스 피오게네스(예를 들어, 서열 번호 4)로부터의 Cas9 뉴클레아제의 돌연변이 아미노산 서열과 적어도 약 60, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 추가의 양태에서, Cas9 뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 분자는 돌연변이 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 60, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
몇몇 양태에서, 본원에 기술된 CRISPR/Cas9 시스템 및 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하는 방법은 NHEJ에 의해 DNA 서열을 변경시킨다. 추가의 양태에서, 본원에 기술된 CRISPR/Cas9 시스템 또는 벡터는 수선 뉴클레오티드 분자를 포함하지 않는다.
몇몇 양태에서, 본원에 기술된 방법은, 예를 들면, 도 14에 도시된 바와 같이 HDR에 의해 DNA 서열을 변경시킨다. 추가의 양태에서, 이러한 HDR 접근법은 MECD에서 유전자 요법에 대한 생체외 접근법으로 사용될 수 있다. 추가의 양태에서, 이러한 접근법은 대립유전자 특이적이지 않을 수 있으며 KRT12 코돈 129, 130, 132, 133 및 135에서 돌연변이를 수선하는데 사용될 수 있다.
몇몇 양태에서, 본원에 기술된 CRISPR/Cas9 시스템 또는 벡터는 수선 뉴클레오티드 분자를 추가로 포함할 수 있다. Cas9 뉴클레아제에 의해 절단된 표적 폴리뉴클레오티드는 외인성 주형 폴리뉴클레오티드인 수선 뉴클레오티드 분자와의 상동 재조합에 의해 수선될 수 있다. 이러한 수선은 상기 표적 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실, 또는 치환을 포함한 돌연변이를 초래할 수 있다. 수선 뉴클레오티드 분자는 HDR 경로를 통해 타입 II 뉴클레아제 유도된 DSB의 수선시 특이 대립유전자(예를 들어, 야생형 대립유전자)를 다수의 줄기 세포 중의 하나 이상의 세포의 게놈에 도입한다. 몇몇 양태에서, 수선 뉴클레오티드 분자는 단일 가닥 DNA(ssDNA)이다. 또 다른 양태에서, 수선 뉴클레오티드 분자는 플라스미드 벡터로서 세포에 도입된다. 몇몇 양태에서, 수선 뉴클레오티드 분자는 20 내지 25, 25 내지 30, 30 내지 35, 35 내지 40, 40 내지 45, 45 내지 50, 50 내지 55, 55 내지 60, 60 내지 65, 65 내지 70, 70 내지 75, 75 내지 80, 80 내지 85, 85 내지 90, 90 내지 95, 95 내지 100, 100 내지 105, 105 내지 110, 110 내지 115, 115 내지 120, 120 내지 125, 125 내지 130, 130 내지 135, 135 내지 140, 140 내지 145, 145 내지 150, 150 내지 155, 155 내지 160, 160 내지 165, 165 내지 170, 170 내지 175, 175 내지 180, 180 내지 185, 185 내지 190, 190 내지 195, 또는 195 내지 200개 뉴클레오티드 길이이다. 몇몇 양태에서, 수선 뉴클레오티드 분자는 200 내지 300, 300, 내지 400, 400 내지 500, 500 내지 600, 600 내지 700, 700 내지 800, 800 내지 900, 900 내지 1,000개 뉴클레오티드 길이이다. 또 다른 양태에서, 수선 뉴클레오티드 분자는 1,000 내지 2,000, 2,000 내지 3,000, 3,000 내지 4,000, 4,000 내지 5,000, 5,000 내지 6,000, 6,000 내지 7,000, 7,000 내지 8,000, 8,000 내지 9,000, 또는 9,000 내지 10,000개 뉴클레오티드 길이이다. 몇몇 양태에서, 수선 뉴클레오티드 분자는 본원에 기술된 바와 같은 각막 이상증과 관련된 돌연변이를 포함하는 줄기 세포 게놈의 영역에서 HDR 경로에 의해 상동 재조합을 겪을 수 있다(즉, "각막 이상증 표적 핵산"). 특정 양태에서, 수선 핵산은 TGFBI, KRT3 , KRT12 , GSN, 및 UBIAD1 유전자 내에 표적 핵산과 상동 재조합할 수 있다. 특정 양태에서, 수선 뉴클레오티드 분자는 본원에 기술된 돌연변이 아미노산(예를 들어, Leu132Pro)을 암호화하는 KRT12 유전자의 핵산과 상동 재조합할 수 있다. 몇몇 양태에서, 벡터는 다수의 수선 뉴클레오티드 분자를 포함한다.
수선 뉴클레오티드 분자는 특이 돌연변이를 함유하는 본원에 기술된 세포의 동정 및 분류를 위한 표지를 추가로 포함할 수 있다. 수선 뉴클레오티드 분자에 포함될 수 있는 예시적인 표지는 형광 표지 및 길이 또는 서열에 의해 동정 가능한 핵산 바코드를 포함한다.
추가의 양태에서, 본원에 기술된 CRISPR/Cas9 시스템 또는 벡터는 적어도 하나의 핵 국재화 신호(NLS)를 포함할 수 있다. 추가의 양태에서, sgRNA 및 Cas9 뉴클레아제는 동일한 벡터 상에 또는 상이한 벡터 상에 포함된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 조작된 CRISPR/Cas9 시스템을 표적 서열을 갖고 유전자 산물을 암호화하는 DNA 분자를 함유하고 발현하는 세포에 도입함을 포함하여 적어도 하나의 유전자 산물의 발현을 변경시키는 방법에 관한 것이다. 조작된 CRISPR/Cas9 시스템은 임의의 적합한 방법을 사용하여 세포에 도입될 수 있다. 몇몇 양태에서, 도입은 배양액에서, 또는 숙주 유기체에서 세포에 본원에 기술된 조작된 CRISPR/Cas9 시스템을 투여함을 포함할 수 있다.
조작된 CRISPR/Cas9 시스템을 도입하기 위한 예시적인 방법은 형질감염, 전기천공 및 바이러스-기반 방법을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 몇몇 경우에, 하나 이상의 세포 흡수 시약(cell uptake reagent)은 형질감염 시약이다. 형질감염 시약은, 예를 들면, 중합체 기반(예를 들어, DEAE 덱스트란) 형질감염 시약 및 양이온성 리포솜-매개된 형질감염 시약을 포함한다. 전기천공 방법이 또한 핵산 조작 시약의 흡수를 촉진시키기 위해 사용될 수 있다. 외부 장(external field)을 인가함으로써, 세포에서 변경된 막 전위가 도입되며, 막 전위 순 값(인가 전위 및 정지 전위 차의 합계)이 역치보다 큰 경우, 일시적인 침투 구조가 막에 생성되고 전기천공이 달성된다. 예를 들어, 문헌[Gehl et al., Acta Physiol . Scand. 177:437-447 (2003)]을 참조한다. 조작된 CRISPR/Cas9 시스템은 또한 바이러스 형질도입을 통해 세포로 전달될 수 있다. 적합한 바이러스 전달 시스템은 아데노-관련 바이러스(AAV), 레트로바이러스 및 렌티바이러스 전달 시스템을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 바이러스 전달 시스템은 세포가 형질감염에 내성인 경우에 유용하다. 바이러스-매개된 전달 시스템을 사용하는 방법은 핵산 조작 시약을 암호화하는 바이러스 벡터를 제조하고 벡터를 바이러스 입자에 패키징하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 핵산 시약의 또 다른 전달 방법은 리포펙션, 뉴클레오펙션, 현미주입, 유전자총(biolistics), 비로좀(virosome), 리포솜, 면역리포솜, 다가양이온 또는 지질:핵산 접합체, 네이키드 DNA(naked DNA), 인공 비리온, 및 헥산의 시약-강화된 흡수를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 또한, 문헌[Neiwoehner et al., Nucleic Acids Res. 42:1341-1353 (2014), 및 미국 특허 제5,049,386호, 제4,946,787호; 및 제4,897,355호, 이들은 모든 목적을 위해, 및 특히 시약 전달 시스템에 관한 모든 교시사항에 대해 전문이 본원에 참고로 포함된다]을 참조한다. 몇몇 양태에서, 도입은 DNA 플라스미드, RNA(예를 들어, 본원에 기술된 벡터의 전사체), 네이키드 핵산, 및 리포솜과 같은 전달 비히클과 착화된 핵산을 포함하는 비-바이러스 벡터 전달 시스템에 의해 수행된다. 전달은 세포(예를 들어, 시험관내 또는 생체외 투여) 또는 표적 조직(예를 들어, 생체내 투여)에 이루어질 수 있다.
핵산 변경 이벤트를 겪은 세포(즉, "변경된" 세포)는 임의의 적합한 방법을 사용하여 단리될 수 있다. 몇몇 양태에서, 수선 뉴클레오티드 분자는 선별 마커(selectable marker)를 암호화하는 핵산을 추가로 포함한다. 이러한 양태에서, 수선 뉴클레오티드 분자 숙주 줄기 세포 게놈의 성공적인 상동 재조합은 선별 마커의 통합을 또한 동반한다. 따라서, 이러한 양태에서, 양성 마커가 변경된 세포를 선별하는데 사용된다. 몇몇 양태에서, 선별 마커는 변경된 세포가 세포를 달리 사멸시키는 약물의 존재하에서 생존할 수 있게 한다. 이러한 선별 마커는 네오마이신, 퓨로마이신 또는 히그로마이신 B에 대한 내성을 부여하는 양성 선별 마커를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 또한, 선별 마커는 동일한 타입의 세포의 집단 중에서 변경된 세포를 시각적으로 확인할 수 있게 하는 산물일 수 있으며, 세포의 집단 중 일부는 선별 마커를 함유하지 않는다. 이러한 선별 마커의 예는 형광에 의해 시각화될 수 있는 녹색 형광 단백질(GFP); 이의 기질 발광소에 노출되는 경우, 이의 발광에 의해 시각화될 수 있는 루시퍼라제 유전자; 및 이의 기질과 접촉되는 경우, 특징적인 색을 생산하는 β-갈락토시다제(β-gal)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 선별 마커는 당업계에 널리 공지되어 있으며 이들 마커를 암호화하는 핵산 서열은 상업적으로 이용 가능하다(예를 들면, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989] 참조). 형광에 의해 시각화될 수 있는 선별 마커를 사용하는 방법은 형광 활성화 세포 분류(FACS) 기법을 사용하여 추가로 분류될 수 있다. 단리된 조작된 세포가 이식을 위한 세포주를 확립하는데 사용될 수 있다. 단리된 변경된 세포는 안정한 세포주를 생산하기 위해 임의의 적합한 방법을 사용하여 배양할 수 있다.
몇몇 양태에서, 조작된 CRISPR/Cas9 시스템은 (a) 본원에 기술된 표적 서열과 혼성화되는 sgRNA에 작동적으로 연결된 제1 조절 요소, 및 (b) Cas9 뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 분자에 작동적으로 연결된 제2 조절 요소를 포함하며, 여기서 성분 (a) 및 (b)는 시스템의 동일 벡터 또는 상이한 벡터 상에 위치하고, sgRNA는 표적 서열을 표적화하며, Cas9 뉴클레아제는 DNA 분자를 절단한다. 표적 서열은 PAM의 5' 말단에 인접한 16 내지 25개 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 본원에서 "인접한(adjacent)"이란, 바로 인접한 뉴클레오티드 서열들 사이에 개재 뉴클레오티드가 없고 바로 인접한 뉴클레오티드 서열들이 서로 1개 뉴클레오티드 내에 있음을 의미하는 "바로 인접한"을 포함하여, 기준 위치의 2 또는 3개 뉴클레오티드 내에 있음을 의미한다. 추가의 양태에서, 세포는 진핵 세포, 또는 포유류 또는 인간 세포이고, 조절 요소는 진핵 조절인자(eukaryotic regulator)이다. 추가의 양태에서, 세포는 본원에 기술된 줄기 세포이다. 몇몇 양태에서, Cas9 뉴클레아제는 진핵 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다.
몇몇 양태에서, 제1 조절 요소는 폴리머라제 III 프로모터이다. 몇몇 양태에서, 제2 조절 요소는 폴리머라제 II 프로모터이다. 용어 "조절 요소"는 프로모터, 인핸서, 내부 리포솜 유입 부위(IRES), 및 기타 발현 제어 요소(예를 들어, 전사 종결 신호, 예를 들어 폴리아데닐화 신호 및 폴리-U 서열)를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 조절 요소는, 예를 들면, 문헌[참조; Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)]에 기술되어 있다. 조절 요소는 여러 타입의 숙주 세포에서 뉴클레오티드 서열의 구성적 발현을 지시하는 것들 및 특정 숙주 세포에서만 뉴클레오티드 서열의 발현을 지시하는 것들(예를 들어, 조직-특이 조절 서열)을 포함한다. 조직-특이 프로모터는 근육, 뉴런, 뼈, 피부, 혈액, 특정 기관(예를 들어, 간, 췌장), 또는 특정 세포 타입(예를 들어, 림프구)과 같은 목적하는 관심 조직에서 주로 발현을 지시할 수 있다. 조절 요소는 또한 측두-의존적(temporal-dependent) 방식으로, 예를 들어 세포-주기 의존적 또는 발달 단계-의존적 방식으로 발현을 지시할 수 있으며, 이것은 조직 또는 세포-타입 특이적일 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 몇몇 양태에서, 벡터는 하나 이상의 pol III 프로모터(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개, 또는 그 이상의 pol I 프로모터), 하나 이상의 pol II 프로모터(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개, 또는 그 이상의 pol II 프로모터), 하나 이상의 pol I 프로모터(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개, 또는 그 이상의 pol I 프로모터), 또는 이들의 조합을 포함한다. pol III 프로모터의 예는 U6 및 H1 프로모터를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. pol II 프로모터의 예는 레트로바이러스성 라우스 육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터(임의로 RSV 인핸서를 가짐), 시토메갈로바이러스(CMV) 프로모터(임의로 CMV 인핸서를 가짐)[예를 들어, 문헌 참조; Boshart et al, Cell, 41:521-530 (1985)], SV40 프로모터, 디하이드로엽산 환원효소 프로모터, β-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나제(PGK) 프로모터, 및 EF1α 프로모터를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. WPRE; CMV 인핸서; HTLV-I의 LTR에서의 R-U5' 단편(문헌 [Mol. Cell. Biol., Vol. 8(1), p. 466-472, 1988)]; SV40 인핸서; 및 토끼 β-글로빈의 엑손 2 및 3 사이의 인트론 서열(문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol. 78(3), p. 1527-31, 1981])과 같은 인핸서 요소가 또한 용어 "조절 요소"에 포함된다.
몇몇 양태에서, 본원에 제공된 Cas9 뉴클레아제는 측두 또는 세포-타입 의존적 방식으로 발현을 위해 최적화된 유도성 Cas9 뉴클레아제일 수 있다. 제1 조절 요소는 테트라사이클린-유도성 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터; 테트라사이클린-유도성 프로모터, 메티오닌-유도성 프로모터(예를 들어, MET25, MET3 프로모터); 및 갈락토스-유도성 프로모터(GAL1, GAL7 및 GAL10 프로모터)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 Cas9 뉴클레아제에 연결될 수 있는 유도성 프로모터일 수 있다. 다른 적합한 프로모터는 ADH1 및 ADH2 알콜 탈수소효소 프로모터(글루코스에서 억제됨, 글루코스가 고갈되고 에탄올이 만들어지는 경우 유도됨), CUP1 메탈로티오네인 프로모터(Cu2 +, Zn2 +의 존재하에서 유도됨), PHO5 프로모터, CYC1 프로모터, HIS3 프로모터, PGK 프로모터, GAPDH 프로모터, ADC1 프로모터, TRP1 프로모터, URA3 프로모터, LEU2 프로모터, ENO 프로모터, TP1 프로모터, 및 AOX1 프로모터를 포함한다.
발현 벡터의 설계는 형질전환시키고자 하는 숙주 세포의 선택, 목적하는 발현 수준 등과 같은 인자들에 따라 좌우될 수 있음을 당업계의 숙련가들은 인지할 것이다. 벡터는 숙주 세포에 도입되어, 본원에 기술된 바와 같이 핵산에 의해 암호화된, 융합 단백질 또는 펩타이드를 포함한 전사체, 단백질, 또는 펩타이드를 생산한다(예를 들어, 일정한 간격을 두고 주기적으로 분포하는 짧은 회문 반복서열(CRISPR) 전사체, 단백질, 효소, 이의 돌연변이 형태, 이의 융합 단백질 등).
용어 "벡터"는 이것이 연결되는 또 다른 핵산을 운반시킬 수 있는 핵산 분자를 가리킨다. 벡터는 단일-가닥, 이중-가닥, 또는 부분 이중-가닥인 핵산 분자; 하나 이상의 자유 말단을 포함하거나 자유 말단을 포함하지 않는(예를 들어, 원형) 핵산 분자; DNA, RNA, 또는 이들 둘 다를 포함하는 핵산 분자; 및 당업계에 공지된 폴리뉴클레오티드의 다른 변종을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 벡터의 한 가지 타입은 "플라스미드"이며, 이것은 표준 분자 클로닝 기법에 의해서와 같이 추가의 DNA 단편이 삽입될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 가리킨다. 또 다른 타입의 벡터는 바이러스 벡터이며, 여기서 바이러스-유래 DNA 또는 RNA 서열은 바이러스(예를 들어, 레트로바이러스, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스, 복제 결함 아데노바이러스, 및 아데노-관련 바이러스)에 패키징하기 위해 벡터에 존재한다. 바이러스 벡터는 또한 숙주 세포로 형질감염을 위해 바이러스에 의해 운반되는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 벡터는 이들이 도입되는 숙주 세포에서 자율 증식할 수 있다(예를 들어, 세균성 복제 기점을 갖는 바이러스 벡터 및 에피솜 포유류 벡터). 다른 벡터들(예를 들어, 비-에피솜 포유류 벡터)은 숙주 세포에 도입시 숙주 세포의 게놈에 통합되며, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 더욱이, 특정 벡터는 이들이 작동적으로-연결되는 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터를 본원에서는 "발현 벡터"라고 한다. 재조합 DNA 기술에서 유용한 공통 발현 벡터는 종종 플라스미드 형태이다. 재조합 발현 벡터는 본 발명의 핵산을 숙주 세포에서 핵산의 발현을 위해 적합한 형태로 포함할 수 있으며, 이것은 재조합 발현 벡터가, 발현을 위해 사용되는 숙주 세포에 기초하여 선택될 수 있고 발현시키고자 하는 핵산 서열에 작동적으로-연결되는 하나 이상의 조절 요소를 포함함을 의미한다. 재조합 발현 벡터 내에서, "작동적으로 연결된"은 관심 뉴클레오티드 서열이 뉴클레오티드 서열의 발현을 가능하게 하는 방식으로 조절 요소(들)에 연결됨을 의미하는 것으로 의도된다(예를 들어, 시험관내 전사/번역 시스템에서 또는 벡터가 숙주 세포에 도입되는 경우 숙주 세포에서). 유리한 벡터는 렌티바이러스 및 아데노-관련 바이러스를 포함하며, 이러한 벡터의 타입들이 또한 특정 타입의 세포를 표적화하기 위해 선택될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기한 방법에 의해 대상체의 유전자 산물의 발현을 변경시킴을 포함하여 대상체에서 유전자 돌연변이 또는 단일-뉴클레오티드 다형태(SNP)와 관련된 질환을 예방, 개선, 또는 치료하는 방법에 관한 것이며, 여기서 DNA 분자는 돌연변이 또는 SNP 돌연변이 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에서 유전자 돌연변이 또는 SNP와 관련된 각막 이상증을 예방, 개선, 또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법으로 치료될 수 있는 대상체는 마우스, 랫트, 개, 개코원숭이, 돼지 또는 인간과 같은 포유류 대상체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 몇몇 양태에서, 대상체는 인간이다. 상기 방법은 적어도 1세, 2세, 3세, 5세, 10세, 15세, 20세, 25세, 30세, 35세, 40세, 45세, 50세, 55세, 60세, 65세, 70세, 75세, 80세, 85세, 90세, 95세 또는 100세 대상체를 치료하는데 사용될 수 있다. 몇몇 양태에서, 대상체는 적어도 하나, 둘, 셋, 또는 네 가지 각막 이상증이 치료된다. 예를 들면, 단일 또는 다중 crRNA 또는 sgRNA는 단일 또는 다중 각막 이상증과 관련된 다수의 돌연변이 또는 SNP 부위에서 또는 선조 돌연변이 또는 SNP 부위에서 뉴클레오티드를 변경시키도록 설계될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "각막 이상증"은 눈의 외부층(각막)에서의 유전 질환군 중의 어느 하나를 가리킨다. 예를 들면, 각막 이상증은 각막에서 성분의 쌍방 비정상적인 침착을 특징으로 할 수 있다. 각막 이상증은 다음의 네 가지 IC3D 카테고리의 각막 이상증을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다(예를 들어 문헌 참조; Weiss et al., Cornea 34(2): 117-59 (2015)): 상피 및 상피하 이상증, 상피-기질 TGFβI 이상증, 기질 이상증 및 내피 이상증. 몇몇 양태에서, 각막 이상증은 상피세포 기저막 이상증(EBMD), 미즈만 각막 이상증(MECD), 티엘-벵케 각막 이상증(TBCD), 격자 각막 이상증(LCD), 과립 각막 이상증(GCD), 및 슈나이더 각막 이상증(SCD)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 추가의 양태에서, 본원에서 각막 이상증은 MECD를 배제한다.
추가의 양태에서, 각막 이상증은 베타-유도된 형질전환 성장 인자(TGFBI), 케라틴 3(KRT3), 케라틴 12(KRT12), GSN, 및 UbiA 프레닐전달효소 도메인 함유 1(UBIAD1)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 유전자에 위치하는, SNP를 포함한 하나 이상의 돌연변이에 의해 유발된다. 추가의 양태에서, 돌연변이 또는 SNP 부위는 본원에 나타낸 바와 같이 돌연변이 단백질에서 돌연변이 아미노산을 암호화함을 야기한다. 추가의 양태에서, 돌연변이 또는 SNP 부위를 포함하는 돌연변이 서열은 (i) 예를 들면, 단백질 수탁 번호 Q15582의 TGFBI에서 Leu509Arg, Arg666Ser, Gly623Asp, Arg555Gln, Arg124Cys, Val505Asp, Ile522Asn, Leu569Arg, His572Arg, Arg496Trp, Pro501Thr, Arg514Pro, Phe515Leu, Leu518Pro, Leu518Arg, Leu527Arg, Thr538Pro, Thr538Arg, Val539Asp, Phe540del, Phe540Ser, Asn544Ser, Ala546Thr, Ala546Asp, Phe547Ser, Pro551Gln, Leu558Pro, His572del, Gly594Val, Val613del, Val613Gly, Met619Lys, Ala620Asp, Asn622His, Asn622Lys, Asn622Lys, Gly623Arg, Gly623Asp, Val624_Val625del, Val624Met, Val625Asp, His626Arg, His626Pro, Val627SerfsX44, Thr629_Asn630insAsnValPro, Val631Asp, Arg666Ser, Arg555Trp, Arg124Ser, Asp123delins, Arg124His, Arg124Leu, Leu509Pro, Leu103_Ser104del, Val113Ile, Asp123His, Arg124Leu, 및/또는 Thr125_Glu126del에 상응하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이 TGFBI 단백질; (ii) 예를 들면, 단백질 수탁 번호 P12035 또는 NP_476429.2의 케라틴 3 단백질에서 Glu498Val, Arg503Pro, 및/또는 Glu509Lys에 상응하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이 KRT3 단백질; (iii) 예를 들면, 단백질 수탁 번호 Q99456.1 또는 NP_000214.1의 KRT12에서 Met129Thr, Met129Val, Gln130Pro, Leu132Pro, Leu132Va, Leu132His, Asn133Lys, Arg135Gly, Arg135Ile, Arg135Thr, Arg135Ser, Ala137Pro, Leu140Arg, Val143Leu, Val143Leu, Lle391_Leu399dup, Ile 426Val, Ile 426Ser, Tyr429Asp, Tyr429Cys, Arg430Pro, 및/또는 Leu433Arg를 갖는 돌연변이 KRT12 단백질; (iv) 예를 들면, 단백질 수탁 번호 P06396의 GSN에서 Asp214Tyr을 갖는 돌연변이 GSN 단백질; 및 (v) 예를 들면, 단백질 수탁 번호 Q9Y5Z9의 UBIAD1에서 Ala97Thr, Gly98Ser, Asn102Ser, Asp112Asn, Asp112Gly, Asp118Gly, Arg119Gly, Leu121Val, Leu121Phe, Val122Glu, Val122Gly, Ser171Pro, Tyr174Cys, Thr175Ile, Gly177Arg, Lys181Arg, Gly186Arg, Leu188His, Asn232Ser, Asn233His, Asp236Glu, 및/또는 Asp240Asn에 상응하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이 UBIAD1 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 돌연변이 단백질을 암호화한다. 예를 들면, 돌연변이 또는 SNP 부위를 포함하는 돌연변이 서열은 단백질 수탁 번호 Q15582의 아미노산 위치 509에 상응하는 아미노산 위치에서 Leu를 Arg로 대체함으로써 돌연변이된 돌연변이 TGFBI 단백질의 적어도 일부를 암호화한다. 이러한 경우에, 돌연변이 또는 SNP 부위에서의 돌연변이가 단백질 수탁 번호 Q15582의 아미노산 위치 509에 상응하는 아미노산 위치에서 돌연변이 아미노산을 암호화할 책임이 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 인간 단백질에서 특정 돌연변이"에 상응하는" 돌연변이는 인간 단백질의 특정 돌연변이의 상응하는 부위에서 발생하는 상이한 종에서의 돌연변이를 포함할 수 있다. 또한 본원에서 사용되는 바와 같이, 돌연변이 단백질이, 예를 들면, Leu509Arg의 특정 돌연변이체를 포함하는 것으로 기술된 경우, 이러한 돌연변이 단백질은 관련 인간 단백질에서, 예를 들면, 본원에 기술된 바와 같이 단백질 수탁 번호 Q15582의 TGFBI 단백질에서 특정 돌연변이체에 상응하는 돌연변이체 부위에서 발생하는 임의의 돌연변이를 포함할 수 있다.
몇몇 양태에서, 본원에 기술된 돌연변이체는 KRT12 단백질에서의 임의의 돌연변이체를 배제한다. 몇몇 양태에서, 본원에 기술된 돌연변이체는 예를 들면, 단백질 수탁 번호 Q99456.1의 KRT12에서 Leu132Pro에 상응하는 돌연변이를 배제한다. 추가의 양태에서, 본원에 기술된 돌연변이 또는 SNP는 KRT12 유전자에서 발생하는 임의의 SNP를 배제한다. 추가의 양태에서, 본원에 기술된 돌연변이 또는 SNP는 KRT12 단백질에서 Leu132Pro 돌연변이를 야기하는 임의의 SNP를 배제한다. 돌연변이 또는 SNP는 KRT12 단백질에서 Leu132Pro 돌연변이를 야기하는 PAM 부위(AAG>AGG)에서의 SNP를 추가로 배제할 수 있다.
몇몇 양태에서, 본원에 기술된 CRISPR/Cas9 시스템 및 이를 사용하는 방법은 다수의 SNP 부위 또는 선조 SNP에서 돌연변이 서열을 변경시킬 수 있다. 이러한 방법은 도 15-16에 나타낸 바와 같이 측면 PAM을 사용할 것이다. 추가의 양태에서, 본원에 기술된 돌연변이 서열은 적어도 하나, 둘, 셋, 넷 또는 그 이상의 SNP 부위를 포함할 수 있으며, 본원에 기술된 방법은 SNP 부위 중의 적어도 하나, 둘, 셋, 넷 또는 그 이상과 관련된 유전자 산물의 발현을 변경시킨다. 예를 들면, 본원에 기술된 방법은 R514P 및 L518R 둘 다에서 돌연변이 TGFBI 단백질, 또는 R135T 및 L132P 둘 다에서 KRT12 단백질의 발현을 변경시킬 수 있다. 몇몇 양태에서, sgRNA는 돌연변이 대립유전자에 특이적인 PAM 부위에 인접한 sgRNA와 협력하여 야생형 및 돌연변이 대립유전자 둘 다에 공통인 측면 인트론에 위치하는 PAM 부위에 인접한 표적 서열을 포함할 수 있다.
인간 게놈은 본래 이배체이며; 남성에서 X 및 Y 염색체를 제외한 모든 염색체는 한 쌍으로 유전되며, 하나는 남성으로부터 오고 다른 하나는 여성으로부터 온다. 수 천 개의 염기 쌍보다 큰 인접 DNA 서열의 스트레치를 추구하는 경우, 유전의 결정은 DNA의 이러한 블럭이 어느 부모로부터 비롯되는지를 이해하는데 중요하다. 게다가, 대부분의 SNP는 이형접합성으로, 즉, 남성 또는 여성 중의 어느 하나로부터 물려받은 인간 게놈 내에 존재한다. 단상형-분해된 게놈 서열을 생산하려는 시도로 보다 긴 리드 염기분석 기술, 즉, 단상형 페이싱(haplotype phasing)이 사용되었다. 따라서, 50 kbs보다 긴 DNA의 특정 스트레치의 게놈 서열을 조사할 때, 단상형 페이싱된 서열 분석이 쌍을 이루는 염색체 중의 어떤 것이 관심 서열을 지니는지를 결정하는데 사용될 수 있다. 보다 긴 페이싱된 서열분석 리드(Longer phased sequencing read)가, 관심 SNP가 본원에 기술된 CRISPR/Cas9 유전자 편집 시스템을 위한 표적으로서 적합한지를 결정하는데 사용될 수 있다.
하나의 측면에서, 본원에 기술된 방법은 질환-유발 돌연변이 또는 SNP를 침묵시키는 것으로 확인된 질환-유발 돌연변이 또는 SNP 중의 어느 한 면에서 표적화 가능한 돌연변이 또는 SNP를 확인함을 포함한다. 몇몇 양태에서, DNA의 블럭은 페이싱된 서열분석 실험에서 확인된다. 몇몇 양태에서, 관심 돌연변이 또는 SNP는 CRISPR/Cas9 시스템에 적합한 기질이 아니며, CRISPR/Cas9 절단에 적합한 질환-유발 돌연변이 또는 SNP의 양 측에서의 돌연변이 또는 SNP를 확인하는 것은 질환-유발 돌연변이 또는 SNP를 포함하는 DNA의 단편을 제거할 수 있게 한다. 몇몇 양태에서, 리드 길이는 문헌[Weisenfeld NI, Kumar V, Shah P, Church DM, Jaffe DB. Direct determination of diploid genome sequences. Genome research. 2017; 27(5):757-767, 이것은 전문이 본원에 참고로 포함된다]에 기재된 기술을 사용함으로써 보다 긴 인접 리드 및 단상형 페이싱된 게놈을 수득하도록 증가될 수 있다.
본원에 제공된 방법의 몇몇 양태에서, 치료법을 사용하여 질환 또는 병태(예를 들어, 각막 이상증)에 대해 양성 치료 반응을 제공한다. "양성 치료 반응"이란 질환 또는 병태의 개선, 및/또는 질환 또는 병태와 관련된 증상의 개선으로 의도된다. 당해 치료방법의 치료학적 효과는 임의의 적합한 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 몇몇 양태에서, 각막에 단백질 침착을 수반하는 각막 이상증의 경우에, 치료는 대조군(예를 들어, 치료 전 단백질 침착의 양)에 비해 치료 후 대상체의 각막에서의 단백질 침착의 감소에 의해 평가된다. 특정 양태에서, 당해 방법은 치료를 받기 전 각막에 비해 대상체에서 각막 단백질 침착의 양을 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%까지 감소시킨다. 각막 혼탁이 또한 당해 방법을 사용하여 치료학적 효과를 평가하는데 사용될 수 있다. 게다가, 몇몇 양태에서, 치료는 시각 기능에 의해 평가된다. 대상체에서 시각 기능의 평가는 비교정 시력(UCVA), 최대 교정 시력(BCVA) 및 명도 시력 검사(BAT)의 평가를 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 적합한 검사를 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Awaad et al., Am J Ophthalmol. 145(4): 656-661 (2008)] 및 [Sharhan et al., Br J Ophthalmol 84:837-841 (2000)]을 참조하며, 이것은 모든 목적을 위해, 및 특히 시력을 평가하기 위한 표준과 관련된 모든 교시사항에 대해 전문이 참고로 포함된다. 특정 양태에서, 대상체의 시력은 치료를 받기 전과 비교하여 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%까지 개선된다.
몇몇 양태에서, 대상체에서 SNP와 관련된 각막 이상증을 예방, 개선, 또는 치료하는 방법은 대상체에게 유효량의 본원에 기술된 조작된 CRISPR/Cas9 시스템을 투여함을 포함할 수 있다. 용어 "유효량" 또는 "치료학적 유효량"은 유리하거나 목적하는 결과를 가져오기에 충분한 제제의 양을 가리킨다. 치료학적 유효량은 다음 중의 하나 이상에 따라 달라질 수 있다: 대상체 및 치료되는 질환 상태, 대상체의 체중 및 연령, 질환 상태의 중증도, 투여 방식 등, 이것은 당업계의 통상의 숙련가에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 용어는 또한 본원에 기술된 이미징 방법 중의 어느 하나에 의한 검출을 위해 이미지를 제공하는 용량에도 적용된다. 구체적인 용량은 다음 중의 하나 이상에 따라 달라질 수 있다: 선택된 특정 제제, 뒤따르는 복용 섭생, 다른 화합물과 병용하여 투여되는지의 여부, 투여 시기, 이미지화시키고자 하는 조직, 및 이것이 운반되는 물리적 전달 시스템.
본원에 기술된 조작된 CRISPR/Cas9 시스템은 (i) 본원에 기술된 Cas9 뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 분자, 및 (ii) 본원에 기술된 sgRNA를 포함하는 적어도 하나의 벡터를 포함할 수 있다. sgRNA는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)의 5'-말단에 인접한 표적 서열을 포함할 수 있고/있거나, PAM의 5' 말단에 인접한 제2 표적 서열에 상보적인 제1 표적 서열에 혼성화될 수 있다. 몇몇 양태에서, 표적 서열 또는 PAM은 SNP 부위를 포함한다. 몇몇 양태에서, Cas9 뉴클레아제 및 sgRNA는 자연적으로 함께 발생하지 않는다. 몇몇 양태에서, Cas9 뉴클레아제에 의한 DNA 절단은, 가이드 RNA 분자와 표적 DNA 간의 서열-특이적 어닐링 이외에, 가이드 RNA 결합 부위의 3'에 바로 있는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)의 존재를 필요로 한다. 이러한 PAM 부위의 서열은 사용되는 Cas9 뉴클레아제에 특이적이다. 추가의 양태에서, PAM은 SNP 부위를 포함한다. 추가의 양태에서, PAM은 NGG 및 NNGRRT로 이루어진 그룹으로부터 선택된 PAM으로 이루어지며, 여기서 N은 A, T, G, 및 C 중의 어느 하나이고, R은 A 또는 G이다. 추가의 양태에서, 투여는, 예를 들면, 조작된 CRISPR/Cas9 시스템을 대상체의 각막(예를 들어, 각막 기질)에 주사함으로써 및/또는 조작된 CRISPR/Cas9 시스템을 표적 서열을 갖는 DNA 분자를 함유하고 발현하는 세포에 도입함으로써 조작된 CRISPR/Cas9 시스템을 대상체의 각막(예를 들어, 각막 기질)에 도입함을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 대상체로부터 각막 이상증 표적 핵산에 핵산 돌연변이를 포함하는 다수의 줄기 세포를 수득하는 단계; (b) 다수의 줄기 세포 중의 하나 이상의 줄기 세포에서 핵산 돌연변이를 조작하여 핵산 돌연변이를 교정함으로써, 하나 이상의 조작된 줄기 세포를 형성하는 단계; (c) 하나 이상의 조작된 줄기 세포를 단리하는 단계; 및 (d) 하나 이상의 조작된 줄기 세포를 대상체에 이식하는 단계를 포함하여, 이를 필요로 하는 대상체에서 각막 이상증을 치료하는 방법에 관한 것이며, 여기서 다수의 줄기 세포 중의 하나 이상의 줄기 세포에서 핵산 돌연변이를 조작하는 단계는 본원에 기술된 바와 같이 유전자 산물의 발현을 변경시키거나 대상체에서 SNP와 관련된 질환을 예방, 개선, 또는 치료하는 방법 중의 어느 하나를 수행함을 포함한다.
당해 방법은 다수의 줄기 세포를 수득함을 포함할 수 있다. 임의의 적합한 줄기 세포가 치료하고자 하는 각막 이상증의 타입에 따라 당해 방법을 위해 사용될 수 있다. 특정 양태에서, 줄기 세포는 이종 공여자로부터 수득된다. 이러한 양태에서, 이종 공여자 및 치료하고자 하는 대상체의 줄기 세포는 공여자-수용자 조직적합성이다. 특정 양태에서, 자가조직 줄기 세포는 각막 이상증의 치료를 필요로 하는 대상체로부터 수득된다. 수득된 줄기 세포는 치료하고자 하는 특정 각막 이상증과 관련된 유전자에 돌연변이를 지닌다(예를 들어, 상기 논의된 바와 같이, 상피-기질 이상증을 갖는 대상체의 TGFBI에 돌연변이를 갖는 줄기 세포). 적합한 줄기 세포는 치수(dental pulp) 줄기 세포, 모낭 줄기 세포, 간엽 줄기 세포, 탯줄 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 경구 점막 상피 줄기 세포 및 변연 상피 줄기 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
몇몇 양태에서, 다수의 줄기 세포는 변연 상피 줄기 세포를 포함한다. 변연 상피 줄기 세포(LESC)는 각막의 변연부에 위치하며 각막 표면의 유지 및 보수를 책임진다. 특정 작동 이론에 결부됨이 없이, LESC는 줄기 세포 혼주물(pool), 및 딸 조기 일과성 증폭 세포(eTAC)를 재증식시키기 위해 줄기 세포 니치(niche)에 남아있는 줄기 세포를 생산하는 비대칭 세포 분열을 겪는 것으로 믿어진다. 이러한 보다 분화된 eTAC는 줄기 세포 니치로부터 제거되며 분열하여 일과성 증폭 세포(TAC)를 추가로 생산하여, 결국 최종 분화된 세포(DC)를 야기한다. LESC는, 예를 들면, 대상체 눈으로부터 생검을 채취함으로써 수득될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Pellegrini et al., Lancet 349: 990-993 (1997)]을 참조한다. 번역 생검으로부터 수득된 LESC는 형광 활성화 세포 분류(FACS) 및 원심분리 기술을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 적합한 기술을 사용하여 당해 방법에서 사용하기 위해 단리되고 분류될 수 있다. LESC는 줄기 세포 관련 마커의 양성 발현 및 및 분화 마커의 음성 발현을 사용하여 생검으로부터 분류될 수 있다. 양성 줄기 세포 마커는 전사 인자 p63, ABCG2, C/EBPδ 및 Bmi-1을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 음성 각막 특이 마커는 시토케라틴 3(CK3), 시토케라틴 12(CK12), 코넥신 43, 및 인볼루크린을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 몇몇 양태에서, 다수의 줄기 세포는 p63, ABCG2 또는 이의 조합의 발현에 대해 양성이다. 특정 양태에서, 다수의 줄기 세포 중의 적어도 65%, 70%, 75%, 80%. 85%, 86%. 88%. 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 세포가 p63, ABCG2, C/EBPδ 및 Bmi-1 또는 이들의 조합을 발현한다. 몇몇 양태에서, 다수의 줄기 세포는 CK3, CK12, 코넥신 43, 인볼루크린 또는 이들의 조합의 발현에 대해 음성이다. 특정 양태에서, 다수의 줄기 세포 중의 적어도 65%, 70%, 75%, 80%. 85%, 86%. 88%. 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 세포가 CK12, 코넥신 43, 인볼루크린 또는 이들의 조합을 발현하지 않는다. LESC를 위해 유용한 또 다른 마커는, 예를 들면, 문헌[Takacs et al., Cytometry A 75: 54-66 (2009)]에 기술되어 있으며, 상기 문헌은 모든 목적을 위해, 및 특히 LESC 마커에 관한 모든 교시사항에 대해 전문이 참고로 포함된다. 세포 크기 및 높은 핵 대 세포질 비와 같은 줄기 세포 특징이 또한 LESC의 동정을 돕기 위해 사용될 수 있다.
LESC 이외에, 대상체의 각막으로부터 단리된 또 다른 줄기 세포가 또한 당해 방법에 사용될 수 있다. 예시적인 각막 줄기 세포는 기질 줄기 세포, 기질 섬유아세포-유사 세포, 기질 간엽 세포, 신경관 유래 각막 줄기 세포, 및 추정 내피 줄기 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
몇몇 양태에서, 당해 방법에서 사용되는 세포는 대상체의 각막으로부터 단리된 기질 줄기 세포이다. 기질 줄기 세포는 문헌[Funderburgh et al., FASEB J 19: 1371-1373 (2005)]; [Yoshida et al., Invest Ophtalmol Vis Sci 46: 1653-1658 (2005)]; [Du et al. Stem Cells 1266-1275 (2005)]; [Dravida et al., Brain Res Dev Brain Res 160:239-251 (2005)]; 및 [Polisetty et al. Mol Vis 14: 431-442 (2008)]에 기술된 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 적합한 방법을 사용하여 단리될 수 있으며, 상기 문헌은 모든 목적을 위해, 및 특히 다양한 기질 줄기 세포의 단리 및 배양에 관한 모든 교시사항에 대해 전문이 참고로 포함된다.
이러한 기질 줄기 세포를 특징지우는 마커는 Bmi-1, Kit, Notch-1, Six2, Pax6, ABCG2, Spag10, 및 p62/OSIL을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 몇몇 양태에서, 다수의 줄기 세포 중의 적어도 65%, 70%, 75%, 80%. 85%, 86%. 88%. 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 세포가 Bmi-1, Kit, Notch-1, Six2, Pax6, ABCG2, Spag10, 또는 p62/OSIL 또는 이들의 조합을 발현한다. 특정 양태에서, 기질 줄기 세포는 CD31, SSEA-4, CD73, CD105에 대해 양성이고 CD34, CD45, CD123, CD133, CD14, CD106 및 HLA-DR에 대해 음성이다. 특정 양태에서, 다수의 줄기 세포 중의 적어도 65%, 70%, 75%, 80%. 85%, 86%. 88%. 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 세포가 CD31, SSEA-4, CD73, CD105에 대해 양성이고 CD34, CD45, CD123, CD133, CD14, CD106 및 HLA-DR에 대해 음성이다. 또 다른 양태에서, 기질 줄기 세포는 CD105, CD106, CD54, CD166, CD90, CD29, CD71, Pax6에 대해 양성이고 SSEA-1, Tra1-81, Tra1-61, CD31, CD45, CD11a, CD11c, CD14, CD138, Flk1, Flt1, 및 VE-카데린에 대해 음성이다. 특정 양태에서, 다수의 줄기 세포 중의 적어도 65%, 70%, 75%, 80%. 85%, 86%. 88%. 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 세포는 CD105, CD106, CD54, CD166, CD90, CD29, CD71, Pax6에 대해 양성이고 SSEA-1, Tra1-81, Tra1-61, CD31, CD45, CD11a, CD11c, CD14, CD138, Flk1, Flt1, 및 VE-카데린에 대해 음성이다.
특정 양태에서, 당해 방법에 사용되는 세포는 대상체의 각막으로부터 단리된 내피 줄기 세포이다. 이러한 줄기 세포를 단리하는 방법은, 예를 들어, 문헌[Engelmann et al., Invest Ophthalmol Vis Sci 29: 1656-1662 (1988)]에 기술되어 있으며, 상기 문헌은 모든 목적을 위해, 및 특히 각막 내피 줄기 세포의 단리와 배양에 관한 모든 교시사항에 대해 전문이 참고로 포함된다.
단리 후, 다수의 줄기 세포(예를 들어, LESC)는 안정한 세포주를 생산하기 위해 임의의 적합한 방법을 사용하여 배양될 수 있다. 예를 들면, 배양물은 배양보조 세포(feeder cell)로서의 섬유아세포(예를 들어, 3T3)의 존재 또는 부재하에서 유지될 수 있다. 또 다른 경우에, 인간 양막 상피 세포 또는 인간 배야 섬유아세포가 배양물을 위한 배양보조 층으로서 사용된다. LESC의 배양을 위해 적합한 기술은 문헌[Takacs et al. Cytometry A 75: 54-66 (2009)], [Shortt et al., Surv Opthalmol Vis Sci 52: 483-502 (2007)]; 및 [Cauchi et al. Am J Ophthalmol 146: 251-259 (2008)]에 추가로 기술되어 있으며, 상기 문헌은 모든 목적을 위해, 및 특히 LESC의 배양에 관한 모든 교시사항에 대해 전문이 참고로 포함된다.
다수의 줄기 세포의 단리 후, 다수의 줄기 세포 중의 하나 이상의 줄기 세포에서의 핵산 돌연변이를 본원에 기술된 방법에 의해 조작 또는 변경시켜 각막 이상증 표적 핵산에서 핵산 돌연변이를 교정한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "각막 이상증 표적 핵산"은 본원에 기술된 각막 이상증 중의 하나 이상과 관련된 돌연변이를 포함하는 핵산을 가리킨다.
조작되는 줄기 세포는 개별 단리된 줄기 세포 또는 단리된 줄기 세포로부터 확립된 줄기 세포주로부터의 줄기 세포를 포함한다. 임의의 적합한 유전자 조작 방법이 줄기 세포에서 핵산 돌연변이를 교정하는데 사용될 수 있다.
또 다른 측면에서, 각막 이상증의 치료를 위한 CRISPR/Cas9 시스템을 포함하는 키트가 본원에 제공된다. 몇몇 양태에서, 키트는 본원에 기술된 하나 이상의 sgRNA, Cas9 뉴클레아제 및 본원에 기술된 바와 같이 수선하고자 하는 돌연변이의 야생형 대립유전자를 포함하는 수선 뉴클레오티드 분자를 포함한다. 몇몇 양태에서, 키트는 또한 세포에 의한 핵산 조작의 활용을 촉진시키는 제제, 예를 들면, 형질감염제 또는 전기천공 버퍼를 포함한다. 몇몇 양태에서, 본원에 제공된 본 발명의 키트는 줄기 세포의 검출 또는 단리를 위한 하나 이상의 시약, 예를 들면, FACS와 함께 사용될 수 있는 하나 이상의 양성 줄기 세포 마커에 대한 표지된 항체를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 예를 들면, 각막 이상증을 예방, 개선 또는 치료하기 위한, 질환-유발 돌연변이 또는 SNP를 침묵시키기 위해 CRISPR/Cas9 시스템을 위한 적어도 두 개의 sgRNA를 포함하는 sgRNA 쌍, 및 sgRNA 쌍을 포함하는 키트에 관한 것이다. 몇몇 양태에서, sgRNA 쌍은 TGFBI 유전자에서 질환-유발 돌연변이 또는 SNP를 침묵시키기 위한 것이다. sgRNA 쌍은 TGFBI 유전자에서, 예를 들면, 질환-유발 돌연변이 또는 SNP와 시스에서의 인트론에서 선조 돌연변이 또는 SNP를 생성하는 PAM에 대한 가이드 서열을 포함하는 sgRNA를 포함한다. 추가의 양태에서, sgRNA 쌍은 TGFBI 유전자의 인트론 영역에 선조 SNP를 생성하는 PAM를 위한 공통 가이드 서열을 포함하는 sgRNA를 포함한다.
몇몇 양태에서, 본 발명은 CRISPR/Cas9 시스템을 위해 설계된 sgRNA 쌍에 관한 것이며, sgRNA 쌍은 (i) (a) 시스에서 질환-유발 돌연변이 또는 SNP의 3'-말단 측에 제1 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)를 생성하는 돌연변이 또는 단일-뉴클레오티드 다형태(SNP)를 위한 제1 crRNA 서열, 및 (b) tracrRNA 서열을 포함하는 제1 sgRNA(여기서 제1 crRNA 서열 및 tracrRNA 서열은 자연적으로 함께 발생하지 않는다); (ii) (a) 시스에서 질환-유발 돌연변이 또는 SNP의 5'-말단 측에 제2 PAM을 생성하는 돌연변이 또는 SNP를 위한 제2 crRNA 가이드 서열, (b) tracrRNA 서열을 포함하는 제2 sgRNA(여기서, 제2 crRNA 서열 및 tracrRNA 서열은 자연적으로 함께 발생하지 않는다)를 포함한다.
추가의 양태에서, CRISPR/Cas9 시스템은 각막 이상증을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 것이다. PAM을 생성하는 돌연변이 또는 SNP는 TGFBI 유전자에 존재할 수 있다. 추가의 양태에서, PAM을 생성하는 돌연변이 또는 SNP는 PAM은 TGFBI 유전자의 인트론에 존재한다. 추가의 양태에서, 제1 및 제2 crRNA 서열 중의 적어도 하나는 도 19 내지 35에 열거된 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하고/하거나; 제1 및 제2 crRNA 서열 중의 적어도 하나는 표 2에 열거된 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
실시예 하기 실시예는 본 발명의 다양한 양태를 예시하기 위해 제시된다. 이러한 실시예는 독점적인 양태들을 나타내지 않으며 나타내고자 의도되지 않는 것으로 이해된다; 이러한 실시예는 단지 본 발명의 실행을 예시하기 위한 것이다.
돌연변이 분석: 다양한 각막 이상증과 관련된 돌연변이를 어느 것이 단지 미스센스 돌연변이 또는 인-프레임 인델(in-frame indel)인지를 알아내기 위해 분석하였다. 이러한 분석은 대다수의 K12 및 TGFBI 질환에 대해, 넌센스 또는 프레임시프팅 인델 돌연변이는 질환과 관련되지 않음을 나타낸다. 게다가, 진유전체 변이체 데이터베이스의 분석은 이러한 유전자에서 발견되는 어떠한 자연 발생적 넌센스, 프레임시프팅 인델 또는 스플라이스 부위도 이들 개체에서 질환과 관련되는 것으로 보고되지 않았음을 확인시켜 주었다.
돌연변이 분석에서 하기 각막-이상증 유전자가 표적화된 뉴클레아제 유전자 요법에 적합한 것으로 드러났다(표 1).
[표 1] CRISPR/Cas9 매개된 접근법에 적합한 유전자 및 이들의 관련 각막 이상증.
적합한 각막 이상증 유전자의 조사는 PAM-특이 접근법 또는 가이드 대립유전자-특이 접근법에 의해 표적화 가능한 돌연변이의 수를 알아내기 위해 이러한 보고에 대해 수행되었다. PAM-특이 접근법은 신규한 PAM를 생성하기 위해 질환 유발 SNP를 필요로 하는 반면, 대립유전자 특이 접근법은 질환 유발 SNP를 함유하는 가이드의 설계를 수반한다. >10%의 작은 대립유전자 빈도(MAF)로 신규한 PAM을 생성하는 TGFBI에서의 모든 비-질환 유발 SNP를 Benchlign의 온라인 게놈-편집 설계 도구에 의해 동정하고 분석하였다. >10%의 MAF를 갖는 SNP의 선택은 신규한 PAM을 야기하는 SNP가 질환 유발 돌연변이와 시스에서 발견될 합리적인 기회를 제공할 수 있다. 질환 유발 돌연변이와 "시스에" 있다는 것은 질환-유발 돌연변이와 동일한 DNA 또는 염색체 분자 상에 있음을 가리킨다. 신규한 PAM을 야기하는 SNP는, 예를 들면, 질환-유발 돌연변이와 시스에서 TGFBI 유전자의 인트론 또는 엑손에서 발견될 수 있다. TGFBI 내의 모든 변이체를 신규한 PAM이 생성되는지를 알아내기 위해 분석하였다(표 2).
[표 2] >10%의 MAF를 갖는 신규한 PAM을 야기하는 TGFBI 내의 변이체. 신규한 PAM은 필요한 변이체를 적색으로 표시하여 나타내어져 있다.
도 15에 나타낸 바와 같이, 변이체의 위치는 TGFBI 내에 있으며, SNP의 대부분은 인트론에 모여있다. 따라서, 엑손 11, 12 및 14의 핫스팟에 위치한 다중 TGFBI 돌연변이는 이러한 접근법을 사용하여 동시에 표적화될 수 있다. 따라서, CRISPR Cas9 시스템은 돌연변이를 갖는 하나 이상의 환자 또는 한 가족을 표적화할 수 있다. 이러한 방식으로 설계된 한 가지 CRISPR/Cas9 시스템이 광범위한 TGFBI 돌연변이를 치료하는데 사용될 수 있다. CRISPR/Cas9 시스템은 돌연변이 대립유전자에 특이적인 PAM 부위에 인접한 sgRNA와 협력하여 야생형 및 돌연변이 대립유전자 둘 다에 공통인 측면 인트론에 위치한 PAM 부위에 인접한 sgRNA를 사용할 수 있다(도 16). 이것은 작용 효과를 갖지 않아야 하는 야생형 대립유전자의 인트론에서 NHEJ를 야기하는 반면, 돌연변이 대립유전자에서는 두 개의 절단 부위 사이에 DNA를 포함하는 결실을 야기한다. 이러한 기술은 적합한 SNP 프로파일을 갖는 환자로부터 단리된 백혈구에서 입증된다.
작제물 : Cas9 및 sgRNA를 발현하는 세 가지 플라스미드가 사용되었다. 사용되는 비-표적화 플라스미드는 pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)(Broad Institute, MIT; Addgene plasmid 48139; 도 7)이었다. 공개된 프로토콜(문헌 [Ran FA, et al., Nat Protoc 2013; 8: 2281-2308])에 따라, K12-L132P 대립유전자에 특이적인 sgRNA를 함유하는 플라스미드는 다음의 2가지 프라이머(Life Technologies, Paisley, UK): 5'-CACCGTAGGAAGCTAATCTATCATT-3' 및 5'-AAACAATGATAGATTAGCTTCCTAC-3'를 pSpCas9(BB)-2A-Puro에 어닐링 및 클로닝함으로써 설계되었다. 이러한 sgRNA는 이하에서 sgK12LP라고 불리는 K12-L132P 대립유전자 상에서 발견되는 대립유전자-특이 PAM의 바로 3'에 있는 20개 뉴클레오티드에 상응한다(도 1, 적색). 야생형 및 돌연변이 K12 서열 둘 다를 표적화하는 Cas9/sgRNA 플라스미드가 작제되었으며(Sigma, Gillingham, UK) 양성 대조군으로서 사용되었다(도 1, 녹색).
앞서 기술된 추가의 K12 발현 작제물이 대립유전자 특이성 및 효능을 평가하기 위해 사용되었다. 이하에서 각각 K12WT-Luc 및 K12LP-Luc라고 불리는, 종결 코돈의 3'에 삽입된 K12-WT 또는 K12-L132P에 대한 완전 mRNA 서열을 갖는 파이어플라이(Firefly) 루시퍼라제 플라스미드(문헌 [Liao H, et al. PLoS One 2011; 6: e28582.)], 및 이하에서 각각 K12WT-HA 및 K12LP-HA로서 공지된 플라스미드를 갖는 성숙한 적혈구응집소(HA)-태그된 K12-WT 및 K12-L132P 단백질에 대한 발현 플라스미드(문헌 [Courtney DG, et al. Invest Ophthalmol Vis Sci 2014; 55: 3352-3360.])가 사용되었다. 레닐라 루시퍼라제(pRL-CMV, Promega, Southampton, UK)에 대한 발현 작제물이 형질감염 효율을 정규화하기 위해 이중-루시퍼라제 검정에 사용되었다.
이중- 루시퍼라제 검정: 이중-루시퍼라제 검정은 상기한 바와 같이 적응된 방법을 사용하여, 외인성 작제물에서 세 가지 시험 sgRNA의 효능 및 대립유전자-특이성을 정량하는데 사용되었다(문헌 [pCourtney DG, et al. Invest Ophthalmol Vis Sci 2014; 55: 977-985]; [Allen EHA, et al. Invest Ophthalmol Vis Sci 2013; 54: 494-502]; [Atkinson SD, et al. J Invest Dermatol 2011; 131: 2079-2086]). 요컨대, HEK AD293 세포(Life Technologies)를 1:4의 비의 K12WT-Luc 또는 K12LP-Luc 발현 작제물 및 sgNSC, sgK12 또는 sgK12LP 작제물 둘 다로 리포펙타민 2000(Life Technologies)을 사용하여 형질감염시켰다. 세포를 용해되기 전 72h 동안 배양하고 파이어플라이 및 레닐라 루시퍼라제 둘 다의 활성을 정량하였다. 모두 합쳐, 8개의 복제물을 각각의 형질감염 조건에 대해 수행하였다.
웨스턴 블롯팅 : HA-태그된 야생형(K12WT-HA) 및 돌연변이(K12LP-HA) 발현 작제물(문헌 [Liao H, et al. PLoS One 2011; 6: e28582.])을 상기한 바와 유사한 방법을 사용하여, 리포펙타민 2000(Invitrogen)을 사용하여 이중으로 HEK AD293 세포에 1:4의 비로 각각의 sgRNA로 일시적으로 공동-형질감염시켰다(문헌 [Courtney DG, et al. Invest Ophthalmol Vis Sci 2014; 55: 977-985]; [Allen EHA, et al. Invest Ophthalmol Vis Sci 2013; 54: 494-502]). 형질감염된 세포를 72h 동안 배양하였다. HA-태그된 K12 및 β-액틴의 발현을 표준 방법을 사용하여 HA에 대한 토끼 다클론 항체(Abcam, Cambridge, UK; ab9110, 1:2000) 및 인간 β-액틴에 대한 마우스 단클론 항체(Sigma, 1:15000)를 사용하여 분석하였다(문헌 [Courtney DG, et al. Invest Ophthalmol Vis Sci 2014; 55: 977-985]; [Allen EHA, et al. Invest Ophthalmol Vis Sci 2013; 54: 494-502]). 막을 각각 이차 호스래디쉬 퍼옥사이드-접합된 다클론 돼지 항-토끼 항체(DakoCytomation, Ely, UK) 또는 호스래디쉬 퍼옥사이드-접합된 염소 항-마우스 항체(DakoCytomation)와 배양하였다. 단백질 결합은 표준 화학발광(Life Technologies)에 의해 검출하였다. 밀도계측은 HA-태그된 K12(n=4)의 밴드 강도를 정량하기 위해 ImageJ(문헌 [Schneider CA, Rasband WS, Eliceiri KW. Nat Methods 2012; 9: 671-675])를 사용하여 수행하였다. 이것을 β-액틴의 밴드 강도에 대해 정규화하였다.
정량적 실시간 PCR : 형질감염은 웨스턴 블롯팅에 대해 기술된 바와 동일한 방식으로 수행하였다; 그러나, K12WT-HA 및 K12LP-HA 둘 다를 동시에 세포에 형질감염시켰다. 모든 형질감염은 삼중으로 수행하였다. 형질감염 후, 세포를 48h 동안 배양하고 RNAeasy Plus 키트(Qiagen, Venlo, The Netherlands)를 사용하여 RNA를 추출하였다. 500ng의 RNA(Life Technologies)의 cDNA 전환 후 정량적 실시간 PCR을 수행하여 KRT12 mRNA의 수준을 정량하였다. KRT12 검정(assay Id 140679; Roche, West Sussex, UK)이 HPRT 검정(assay ID 102079; Roche) 및 GAPDH 검정(assay ID 141139; Roche)과 함께 사용되었다. 각 샘플을 각 검정에 대해 삼중으로 실시하고 상대적 유전자 발현을 △△CT 방법을 사용하여 계산하였다(문헌 [Livak KJ, Schmittgen TD. Methods 2001; 25: 402-408]). KRT12 발현 수준을 HPRT 및 GAPDH에 대해 정규화하였으며, 여기서 기준 유전자 둘 다의 발현은, BestKeeper 소프트웨어 도구를 사용하여, 처리군에 걸쳐 "안정한" 것으로 여겨졌다(문헌 [Pfaffl MW, Tichopad A, Prgomet C, Neuvians TP. Biotechnol Lett 2004; 26: 509-515)].
파이로시퀀싱 : 정량적 역전사효소-PCR에 의해 평가된 동일한 cDNA 샘플을 사용하여, 정확히 상기에 기술된 바와 같이, 남은 K12-L132P mRNA 대 K12-WT mRNA의 비를 알아내기 위해 파이로시쿼싱을 수행하였다(문헌 [Courtney DG, et al. Invest Ophthalmol Vis Sci 2014; 55: 3352-3360]).
KRT12 유전자이식 마우스: 내인성 마우스 Krt12 암호화 서열을 대체하기 위해 녹인된(knocked in) 인간 K12-L132P 대립유전자를 갖는 C57 마우스 모델을 입수하였다. 이것은 대립유전자-특이 sgRNA 및 Cas9에 의한 KRT12-L132P의 생체내 표적화를 가능하게 한다. 24주령의 암컷 이형접합성 마우스를 사용하였으며, 여기에는 인간 K12-L132P 대립유전자의 하나의 카피 및 뮤린 Krt12의 하나의 카피가 존재하였다. 표준 PCR 및 Sanger 디데옥시뉴클레오티드 서열분석이, 마우스를 유전자형 분석하고 K12-L132P 대립유전자의 이형접합성을 확인하는데 사용되었다. 이 연구는 하나의 각막에 대한 치료 효과를 조사하는 것이기 때문에 동물의 무작위화는 필요하지 않은 반면, 동일 동물의 다른 하나의 각막은 음성 대조군으로서 사용되었다. 조사원은 이 연구에서 블라인드되지 않았다. 모든 실험은 윤리적 규제를 준수하며 지방 윤리 위원회에 의해 승인되었다.
생체내 기질내 안구 주사: 대립유전자-특이 sgRNA 및 Cas9의 일과성 발현을 달성하기 위해, 상기한 프로토콜(문헌 [Moore JE, McMullen CBT, Mahon G, Adamis AP. DNA Cell Biol 21: 443-451])에 따라, sgK12LP 플라스미드를 기질내 안구 주사에 의해 이형접합성 녹-인 마우스의 각막 기질에 도입하였다. 이러한 전달 방법을 평가하기 위해, 야생형 마우스에 먼저 4㎍의 Cas9-GFP 플라스미드(pCas9D10A_GFP)(Addgene 플라스미드 44720)를 주사하였다. 마우스를 24, 48 및 72h에 도태시키고, 각막을 4% 파라포름알데히드에 고정시키고 표준 조직학적 과정을 사용하여 가공하였다. 5 마이크로미터 두께의 절편을 잘라내어 재수화시키고 형광 현미경에 의해 이미지화하였다. 마우스에게 전신 마취제와 국소 마취제를 각막에 투여하였다. 자격이 있는 안과 의사가 총 3㎕ 인산염-완충 염수에 희석시킨 4㎍의 sgK12LP 또는 sgNSC 플라스미드를 각각 네 마리 마우스의 우측 눈과 좌측 눈의 각막에 주사하였다. 마우스를 처리한지 48h 후에 도태시켰다.
서열분석 및 NHEJ의 결정: 일단 마우스가 도태되면, 눈을 적출하여 각막을 절개하였다. gDNA를 DNA 추출 키트(Qiagen)를 사용하여 추출하고 샘플을 두 개의 처리군으로 모았다: sgK12LP 및 sgNSC. 샘플을 다음의 두 가지 프라이머를 사용하여 PCR 증폭에 적용시켜 K12-L132P 돌연변이 주위 영역을 증폭시켰다: 5'-ACACCCATCTTGCAGCCTAT-3' 및 5'-AAAATTCCCAAAGCGCCTC-3'. PCR 산물을 겔 정제하고 CloneJet 클로닝 벡터(Life Technologies)에 결찰시키고 DH5α 적격 세포(Life Technologies)를 형질전환시키는데 사용하였다. 총 13개 클론을 선택하고 플라스미드 DNA를 제조자의 과정에 따라 miniprep 키트(Qiagen)를 사용하여 제조하였다. 그후, 13개 클론으로부터의 DNA를 CloneJet 벡터가 제공된 시퀀싱 프라이머를 사용하여 서열분석하였다(Department of Zoology, University of Oxford). Zhang Lab 온라인 도구(crispr .mit. edu)에 의해 예측되는 바와 같이, 마우스 게놈에서 sgK12LP에 대해 가장 가능성있는 두 가지 엑손 오프-타겟 부위를 동일한 방식으로 평가하였으며, 여기서 10개의 콜로니를 각각의 예측된 오프 타겟에 대한 분석을 위해 선택하였다. 예측된 오프-타겟 부위는 5'-TAAGTAGCTGATCTATCAGTGGG-3'(Gon4l) 및 5'-TGGGAAGCATATCTGTCATTTGG-3'(Asphd1)이었다. >0.1의 계산된 오프-타겟 점수를 갖는 것이 이들 두 개의 부위 뿐이기 때문에, 이러한 두 개의 부위만을 선택하였다.
통계: 모든 오차 막대는 달리 명시하지 않는 한 s.e.m.을 나타낸다. 모든 샘플은 동일한 분포를 입증하였기 때문에, 유의도는 비쌍체 t-검정을 사용하여 계산하였다. 통계적 유의도는 0.05%로 설정하였다. 분산을 그룹 간에 계산하였으며 유사한 것으로 간주되었다.
KRT12 -특이 sgRNA의 작제 : MECD-유발 KRT12 미스센스 돌연변이로부터 야기되는 서열 변화의 분석으로, 심각한 형태의 MECD를 유발하는 L132P 돌연변이가 동시적으로 신규한 PAM 부위의 생성을 야기하는 것으로 드러났다(AAG>AGG). KRT12 L132P 돌연변이에 의해 생성된 신규한 PAM 부위의 5' 말단에 인접한 서열 20개 뉴클레오티드에 상보적인 sgRNA(sgK12LP)를 Zhang lab, MIT 2013에 의해 온라인에 제공된 '최적화된 CRISPR 설계 도구'를 사용하여 설계하고 가능성있는 오프 타겟에 대해 평가하였다(도 1, 적색). sgRNA는 이러한 시스템을 사용하여 66%의 점수를 갖는 것으로 계산되었으며, 여기서 >50%의 점수는 제한된 수의 예측된 가능한 오프 티켓을 갖는 고 품질인 것으로 간주된다.
시험관내 sgK12LP 대립유전자 특이성 및 효능의 평가: sgK12LP의 대립유전자-특이성 및 효능을 야생형 및 돌연변이 K12에 대한 외인성 발현 작제물을 사용하여 HEK AD293 세포에서 시험관내 평가하였다. 대립유전자 특이성을 먼저 이중-루시퍼라제 리포터 검정을 사용하여 결정하였다(도 2a). 파이어플라이 루시퍼라제 활성은 K12WT-Luc 또는 K12LP-Luc를 발현하고 sgK12로 처리된 세포에서 유의적으로 감소된 것으로 밝혀졌다. 파이어플라이 루시퍼라제 활성의 강력하고 대립유전자-특이적인 감소가 sgK12LP로 처리된 세포에서 관찰되었다. K12LP-Luc를 발현하는 세포에서, 73.4±2.7%(P<0.001)의 감소가 관찰되었다(도 2a). 이러한 대립유전자-특이적이고 강력한 녹다운은 K12WT-HA 또는 K12LP-HA를 발현하는 세포에서 웨스턴 블롯팅에 의해 관찰되었으며(도 2b; 네 개의 블롯을 나타내는 이미지), 밀도계측에 의한 정량에서는 K12WT-HA 단백질에 비해 sgK12LP에 의한 K12LP-HA 단백질에 있어서의 32%의 유의적인 감소가 밝혀졌다(P<0.05). sgK12로 처리된 세포에서, 야생형 및 돌연변이 K12 단백질 둘 다는 감소된 것으로 밝혀진 반면, sgK12LP로 처리된 세포에서는 야생형 단백질의 발현에 대해서는 효과가 없지만 돌연변이 K12 단백질의 유의적인 녹다운이 있는 것으로 보였다(도 2b).
단백질 수준에서 관찰된 이러한 데이터를 뒷받침하기 위해, 정량적 역전사효소-PCR 및 파이로시퀀싱을 실시하여 mRNA 수준에서 대립유전자 특이성 및 효능을 알아보았다. 야생형 및 돌연변이 K12를 동시에 (1:1 발현 비로) 발현하고 세 가지 시험 Cas9/sgRNA 발현 작제물(NSC, K12 및 K12LP) 각각으로 처리된 세포에서, 정량적 역전사효소-PCR을 사용하여 총 K12 mRNA의 녹다운을 알아보았다(도 2c). 총 K12 mRNA의 73.1±4.2%(P<0.001)의 강력한 감소가 sgK12-처리된 세포에서 관찰되었으며, sgK12LP-처리된 세포에서는 52.6±7.0%(P<0.01)의 더 적은 감소가 측정되었다(도 2c). 파이로시퀀싱을 사용하여 이들 sgRNA로 처리 후 남은 성숙 mRNA 종의 세포내 비율을 구하였다(도 2d). mRNA의 비율을 'K12-L132P의 퍼센트'/K12-WT의 퍼센트'로서 계산하였다. 돌연변이 및 야생형 K12 mRNA 간의 비를 1:1로 가정하여, sgNSC로 처리한 세포를 1로 정규화하였다. sgK12로 처리된 세포에서, 0.89±0.03의 K12 돌연변이 mRNA 비율이 관찰되었지만, NSC 대조군과의 차이는 유의적이지 않았다(P<0.14). sgK12LP로 처리된 이들 세포에서, 0.28±0.02의 K12 돌연변이 mRNA 비율이 검출되었으며 sgNSC-처리된 세포에 비해 유의적으로 변하였다(P<0.001)(도 2d).
생체내에서 sgRNA - K12LP의 효능의 결정: Cas9-GFP 작제물의 기질내 주사는 주사한지 24h 후에 각막 상피에서 녹색 형광 단백질(GFP)의 존재를 야기하였다(도 3a). GFP의 일과성 발현이 주사한지 48h 후까지 나타났다. K12-L132P 인간화 이형접합성 마우스에의 sgK12LP 또는 sgNSC 발현 작제물의 기질내 주사 및 48h의 배양 기간 후, 마우스를 안락사시키고 각막으로부터 게놈 DNA(gDNA)를 제조하였다. 네 마리의 sgK12LP- 또는 sgNSC-처리된 동물의 각막으로부터의 gDNA를 모으고 인간화 K12- L132P 유전자의 엑손 1의 PCR 증폭, 클로닝 및 서열분석을 수행하였다. sgNSC로 처리된 눈의 gDNA로부터 확립된 10개 클론 중에서, K12-L132P 서열은 모두 온전하게 남아있었다. sgK12LP-처리된 눈으로부터의 13개의 개별 클론을 서열분석하였다; 8개는 비변경된 KRT12 L132P 인간 서열을 함유하는 것으로 밝혀진 반면, 5개 클론은 Cas9/sgK12LP 복합체의 예측된 절단 부위 주위에 NHEJ를 입증하였다(도 3b). 하나의 클론에서(1), 1개 뉴클레오티드의 삽입이 발견되었으며, 32개 뉴클레오티드는 결실되었다. 53개 이하의 뉴클레오티드의 큰 결실이 생체내에서 관찰되었다(클론 5). 이러한 5개 클론 중에서, 4개는 조기 종결 코돈의 발생을 야기하는 프레임시프트를 초래할 것으로 예측되는 결실(클론 1 및 3-5)을 함유하였다. 마우스에서 sgK12LP의 상부 2개의 예측된 엑손 오프-타겟 부위를 또한 이 방법을 사용하여 평가하였다. 10개 클론을 각 표적에 대해 서열분석하였으며 어느 것도 비특이 절단을 겪지 않는 것으로 밝혀졌다.
R514P , L518R , L509R 및 L527R에서 돌연변이에 의해 생성된 PAM 부위와 관련된 TGFBI 돌연변이: 단일 가이드 RNA를 이들 돌연변이 각각을 표적화하도록 설계하고 sgRNA/Cas9 발현 플라스미드에 클로닝하였다. 또한, 자연-발생적 근접 PAM를 사용하는 양성 대조군 가이드 RNA를 각 돌연변이에 대해 설계하였다. 야생형 및 돌연변이 표적 서열을 루시퍼라제 리포터 플라스미드에 클로닝하여 WT의 발현 및 MUT 발현에 대한 유전자 편집의 효과를 모니터링할 수 있도록 하였다. 플라스미드 둘 다를 AD293 세포를 형질감염시키는데 사용하였으며 루시퍼라제 발현은 우리의 고속 처리 리포터 유전자 검정을 사용하여 CRISPR Cas9 처리 후 72 hr에 측정하여 세포에 존재하는 MUT 및 WT DNA의 양의 측정치를 제공하였다.
아래 도 4는 SNP 유래 PAM 접근법을 사용하여 평가된 이러한 2가지 TGFBI 돌연변이(R514P, L518R, L509R 및 L527R) 각각에 대해 유의적인 대립유전자-특이성이 달성되었으며, 돌연변이 대립유전자가 CRISPR Cas9 시스템에 의해 절단되고 WT DNA가 가이드의 일부에 대해 어느 정도로 절단됨을 보여준다.
PAM 부위에 인접한 표적 영역 내에 있는 SNP 돌연변이와 관련된 TGFBI 돌연변이: 단일 가이드 RNA를 이들 돌연변이를 표적화하도록 설계하고 sgRNA/Cas9 발현 플라스미드에 클로닝하였다. 야생형 및 돌연변이 표적 서열을 루시퍼라제 리포터 플라스미드에 클로닝하고 우리의 고속 처리 리포터 유전자 검정으로 평가하였다. 플라스미드 둘 다를 AD293 세포를 형질감염시키는데 사용하였으며 루시퍼라제 발현은 3일 후에 측정하였다.
길이가 16 mer 내지 22 mer에 이르는 가이드를 특이성을 개선시키기 위해 어떠한 길이가 최대 대립유전자-특이성을 달성하는지를 알아보기 위해 평가하였다. 가이드 길이 이외에, 가이드의 5' 말단에 이중 구아닌을 첨가하는 것이 특이성을 개선시키는데 도움이 되는지를 또한 평가하였다. 가이드 서열은 가이드 길이에 기초하여 상이한 절단 효율을 보였으며, 이중 구아닌의 첨가는 일반적으로 절단 효율을 개선시키지 못했다(도 5, 항목 A-E).
대립유전자-특이성을 개선시키기 위해, R124H를 표적화하는 20 mer 가이드를 강화된 Cas9 플라스미드에 클로닝시켰다. 강화된 Cas9를 비-표적 절단을 방지하도록 합리적으로 조작하였다. 야생형 서열 절단의 현저한 감소 및 대립유전자 특이성의 증가(예를 들어, 야생형 서열에 대한 절단 효율과 돌연변이 서열에 대한 절단 효율 간의 차이)가 이중 루시퍼라제 검정을 통해 관찰되었다(도 5, 항목 F).
DNA 절단을 확인하기 위해, 야생형 TGFBI 서열 또는 돌연변이 TGFBI 서열을 함유하는 이중-가닥 DNA 주형을 제조하였다. 주형을 37℃에서 1시간 동안 시험관내에서 합성 가이드 및 Cas9 단백질과 배양하였다. 절단 능력을 알아보기 위해 단편 분석을 아가로스 겔 상에서 수행하였다(도 5, 항목 G).
추가의
생체내
연구
라이브 동물 이미징 : 라이브 이미징에 사용되는 모든 마우스는 12 내지 25주령이었다. 이미징을 위해, 마우스를 ~1.5 l/min의 산소 흐름에서 1.5-2% 이소플루란(Abbott Laboratories Ltd., Berkshire, UK)을 사용하여 마취시켰다. Viscotears 겔(Novartis, Camberley, UK)과 1:1 w/v로 혼합된 루시페린 기질(30 mg/ml D-루시페린 칼륨 염; Gold Biotechnology, St. Louis, USA)의 혼합물을 이미징 직전에 이형접합성 Krt12+/luc2 유전자이식 마우스의 눈에 떨어뜨렸다. Xenogen IVIS Lumina(Perkin Elmer, Cambridge, UK)를 사용하여 발광을 정량하였다. 크기와 형태가 전반에 걸쳐 일정하게 유지되는 마우스 눈을 감싸고 있는 관심 영역을 상기한 바와 같은 프로토콜을 사용하여 정량을 위해 선택하였다. 형광을 또한 Cy3-표지된 siRNA를 주사한 마우스에서 Xenogen IVIS Lumina를 사용하여 시각화하였다.
기질내 주사: Cas9/sgRNA 작제물을 기질내 주사에 의해 마우스 각막에 전달하였다. 이것은 상기한 바와 같이 훈련된 안과 전문의(J.E.M.)에 의해 실시되었다. 각막 내의 핵산의 분포를 평가하기 위해, 2㎕의 150pmol/㎕ Cy3-표지된 액셀-변형된 siRNA를 WT C57BL/6J 마우스의 우측 눈에 기질내 주사하였다. Cy3-표지된 siRNA의 지속성(persistence)을 평가하기 위해, 동물은 주사한지 0, 6, 24, 48 및 72시간 후에 Xenogen IVIS Lumina 시스템 상에서 라이브 이미징을 겪었다(n=3). 또한, 마우스를 주사한지 0, 6 및 12시간에 희생시키고(n=3), 안구 조직을 제거하고 -80℃에서 동결시켰다. 조직을 OCT에 고정시키고 형광 현미경검사를 위해 동결절편화(cryosection)하였다.
Cas9 / sgRNA 발현 작제물의 생성: Cas9 및 sgRNA 둘 다를 발현하는 플라스미드, pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)를 Professor Feng Zhang(Broad Institute, MIT; Addgene 플라스미드 #48139)으로부터 선물로 입수하였다. luc2를 표적화하는 sgRNA를 Zhang Lab CRISPR 설계 도구 www.crispr.mit.edu)의 도움으로 61bp의 개시 코돈 내에 설계하였다. luc2-특이 sgRNA는 먼저 올리고뉴클레오티드 5' CAC CGT TTG TGC AGC TGC TCG CCG G 3' 및 5' AAA CCC GGC GAG CAG CTG CAC AAA C 3'를 어닐링시킨 다음 BbsI-소화된 pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459)에 결찰시킴으로써 작제하였으며; 이 플라스미드를 sgLuc2로 명명하였다. 원래의 pSpCas9(BB)-2A-Puro 플라스미드를 sgNSC라고 명명하고 비-표적화 음성 대조군으로 사용하였다. sgLuc2 플라스미드의 활성은 Cas9/sgRNA 효능을 평가하기 위해 이전에 기술된 것과 유사한 이중 루시퍼라제 방법을 사용하여 평가하였다. 간략하게, luc2 작제물(pGL4.17, Promega)을 레닐라 루시퍼라제 발현 작제물과 1:4의 몰 비로 둘 다 Cas9/sgRNA 발현 작제물인 sgLuc2 또는 sgNSC로 공동-형질감염시켰다. 세포를 형질감염 후 루시퍼라제 정량 전에 48시간 동안 상기한 바와 같이 배양하였다.
CRISPR / Cas9의 생체내 평가: Cas9/sgLuc2 플라스미드의 효능은 siRNA 유전자 침묵의 평가에 사용되는 프로토콜을 수정한 프로토콜을 사용하여 K12-luc2 유전자이식 마우스에서 생체내 평가하였다. sgLuc2(우측 눈) 및 sgNSC(좌측 눈) 둘 다를 500ng/㎕의 농도로 4㎕의 PBS의 총 용적으로 기질내 주사하였다. 마우스(n=4)의 라이브 이미지를 7일 동안 24시간 마다 촬영한 다음 그후 총 6주 동안(42일) 매주 1회 촬영하였다. 루시퍼라제 억제의 정량은 우측/좌측 비를 계산함으로써 구하였으며, 값들은 0일째 값으로 정규화시켰다(100%로서).
각막 상피 세포에서 Luc2를 독점적으로 발현하는 이러한 실험 유전자이식 마우스 모델에서, CRISPR Cas9 가이드를 luc2 발현을 보임으로써 각막 상피에서 성공적인 유전자 편집을 시각적으로 볼 수 있게 함으로써 아래 나타낸 바와 같이 Luc2 유전자를 표적화하게 만들었다(sgRNA). 그래서 본질적으로 이것은 마찬가지로 각막 상피에서 독점적으로 발현되기 때문에 Krt12 발현을 모방한다. 이러한 시험관내 이중-루시퍼라제 검정은 비처리 세포로 정규화되는 경우(비처리 대조군에 대해 정규화된 데이터 = 100%) 루시퍼라제 활성의 유의적인 감소(*는 p<0.05를 나타냄)에 의해 나타내어지는 바와 같이 sgLuc2P 작제물에 의한 Luc2의 성공적인 표적화를 입증하였다(도 6). CRISPR Cas9 sgLuc2 가이드를 각막에서 Luc2를 발현하는 유전자이식 마우스에서 시험하였다. 유전자이식 마우스를 K12 발현을 모방하게 만들었으며, 여기서 도 7에서 밝은 녹색은 많은 Krt12 발현이 있다는 것이고, 청색은 더 적은 Krt12 발현을 나타내며, 흑색은 Krt12 발현이 전혀 없음을 의미한다. 우측에 있는 눈에는 시험 sgLuc2를 주사하고 좌측에 있는 눈에는 비-표적화 비-특이 대조 가이드 및 CRISPR을 주사하였다.
도 7의 그래프에 나타낸 바와 같이, Luc2 발현의 양을 측정하였다. 처리 후, 각 마우스의 각막 루시퍼라제 활성을 7일 동안 매일, 그후 총 6주 동안 7일마다 Xenogen IVIS 라이브 동물 이미지기를 사용하여 정량하였다. 각 처리군에 대한 루시퍼라제 활성은 대조군의 퍼센트로서 표현하였다(R/L 비 %).
대립유전자-특이
인델
확인
림프구의 EBV 형질전환: 전혈 5ml의 샘플을 채취하고 멸균 50ml Falcon 관에 두었다. 20% 송아지 태아 혈청을 함유하는 등용적의 RPMI 배지를 전혈에 가하고 - 관을 부드럽게 뒤집어 혼합한다. 6.25ml의 Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare cat no. 17-1440-02)를 별도의 멸균 50ml Falcon 관에 두었다. 10ml의 혈액/배지 혼합물을 Ficoll-Paque에 가하였다. 관을 실온에서 2000rpm에서 20 min 동안 회전시켰다. 적혈구가 관의 바닥에 형성되며 그 위에 Ficoll 층이 있었다. 림프구는 Ficoll 층의 상부에 층을 형성한 반면, 상부 층은 배지였다. 깨끗한 멸균 Pastette을 삽입하여 림프구를 빼내고, 이것을 멸균 15ml Falcon 관에 두었다. 림프구를 원심분리하고 세척하였다. EBV 분취량을 해동시키고 재현탁된 림프구에 가하였으며, 혼합물을 37도에서 1시간 동안 배양하였다(감염 기간). RPMI, 20% FCS 배지 및 1mg/ml 피토헤마글루티닌을 EBV 처리된 림프구에 가하고, 림프구를 24-웰 플레이트 상에 두었다.
EBV 형질전환된 림프구( LCL )의 전기천공: CRISPR 작제물(GFP 또는 mCherry 공동-발현됨)을 현탁된 EBV 형질전환된 림프구 세포에 가하고, 혼합물을 전기천공 큐벳으로 옮겼다. 전기천공을 실시하였고, 10% FBS를 함유하는 500㎕ 예비-가온된 RPMI 1640 배지를 큐벳에 가하였다. 큐벳의 내용물을 예비-가온된 배지의 나머지를 함유하는 12개 웰 플레이트로 옮기고, 뉴클레오펙션한지 6시간 후에, 1ml의 배지를 제거하고 신선한 배지로 교체하였다.
GFP + 및/또는 mCherry + 생 세포의 세포 분류: 뉴클레오펙션한지 24시간 후, 1ml의 배지를 제거하고 세포를 함유하는 남은 배지를 1.5ml Eppendorf에 수집하였다. 세포를 원심분리하고 200ul PBS 및 50ul eFlouro 780 생존능 균주(viability stain) 중에 1:1000 희석도로 재현탁시켰다. 또 다른 원심분리 후, 세포를 1x HBSS (Ca/Mg++ free), 5mM EDTA, 25mM HEPES pH 7.0, 5% FCS/FBS(열-불활성화됨) 및 10units/mL DNase II를 함유하는 필터 멸균 FACS 완충액에 현탁시켰다. 세포를 분류하여 살아있는 GFP+ 및/또는 mCherry+ 세포를 단리하고 RPMI + 20% FBS에 수집하였다. 세포를 확대시키고, DNA를 세포로부터 추출하였다.
서열분석을 위한 단일 대립유전자의 단리: QIAmp DNA Mini 키트(Qiagen)를 사용하여 DNA를 단리하고, PCR를 CRISPR/Cas9에 의해 표적화된 영역에 걸쳐 사용하였다. 특이적 증폭을 겔 전기영동에 의해 확인하고, PCR 산물을 정제하였다. PCR 산물을 둔단(blunt end)시키고 Clonejet 키트(Thermo Scientific)로부터의 pJET1.2/블런트 플라스미드에 결찰시켰다. 결찰 혼합물을 적격 DH5α 세포로 형질전환시켰다. 단일 콜로니를 고르고, Sanger 서열분석을 수행하여 편집을 확인하였다. 수득된 결과는 도 17에 나타내어져 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> Avellino Lab USA, Inc.
<120> SINGLE GUIDE RNA, CRISPR/CAS9 SYSTEMS, AND METHODS OF USE THEREOF
<130> IPA190317-US
<150> US 62/377,586
<151> 2016-08-20
<150> US 62/462,808
<151> 2017-02-23
<150> US 62/501,750
<151> 2017-05-05
<160> 898
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 102
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Spy Cas9 sgRNA sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> n is a, c, g, or u
<400> 1
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 2
<211> 82
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Spy Cas9 sgRNA sequence
<400> 2
guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60
ggcaccgagu cggugcuuuu uu 82
<210> 3
<211> 3974
<212> DNA
<213> Streptococcus pyogenes
<400> 3
atggactata aggaccacga cggagactac aaggatcatg atattgatta caaagacgat 60
gacgataaga tggccccaaa gaagaagcgg aaggtcggta tccacggagt cccagcagcc 120
gacaagaagt acagcatcgg cctggacatc ggcaccaact ctgtgggctg ggccgtgatc 180
accgacgagt acaaggtgcc cagcaagaaa ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac 240
agcatcaaga agaacctgat cggagccctg ctgttcgaca gcggcgaaac agccgaggcc 300
acccggctga agagaaccgc cagaagaaga tacaccagac ggaagaaccg gatctgctat 360
ctgcaagaga tcttcagcaa cgagatggcc aaggtggacg acagcttctt ccacagactg 420
gaagagtcct tcctggtgga agaggataag aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac 480
atcgtggacg aggtggccta ccacgagaag taccccacca tctaccacct gagaaagaaa 540
ctggtggaca gcaccgacaa ggccgacctg cggctgatct atctggccct ggcccacatg 600
atcaagttcc ggggccactt cctgatcgag ggcgacctga accccgacaa cagcgacgtg 660
gacaagctgt tcatccagct ggtgcagacc tacaaccagc tgttcgagga aaaccccatc 720
aacgccagcg gcgtggacgc caaggccatc ctgtctgcca gactgagcaa gagcagacgg 780
ctggaaaatc tgatcgccca gctgcccggc gagaagaaga atggcctgtt cggaaacctg 840
attgccctga gcctgggcct gacccccaac ttcaagagca acttcgacct ggccgaggat 900
gccaaactgc agctgagcaa ggacacctac gacgacgacc tggacaacct gctggcccag 960
atcggcgacc agtacgccga cctgtttctg gccgccaaga acctgtccga cgccatcctg 1020
ctgagcgaca tcctgagagt gaacaccgag atcaccaagg cccccctgag cgcctctatg 1080
atcaagagat acgacgagca ccaccaggac ctgaccctgc tgaaagctct cgtgcggcag 1140
cagctgcctg agaagtacaa agagattttc ttcgaccaga gcaagaacgg ctacgccggc 1200
tacattgacg gcggagccag ccaggaagag ttctacaagt tcatcaagcc catcctggaa 1260
aagatggacg gcaccgagga actgctcgtg aagctgaaca gagaggacct gctgcggaag 1320
cagcggacct tcgacaacgg cagcatcccc caccagatcc acctgggaga gctgcacgcc 1380
attctgcggc ggcaggaaga tttttaccca ttcctgaagg acaaccggga aaagatcgag 1440
aagatcctga ccttccgcat cccctactac gtgggccctc tggccagggg aaacagcaga 1500
ttcgcctgga tgaccagaaa gagcgaggaa accatcaccc cctggaactt cgaggaagtg 1560
gtggacaagg gcgcttccgc ccagagcttc atcgagcgga tgaccaactt cgataagaac 1620
ctgcccaacg agaaggtgct gcccaagcac agcctgctgt acgagtactt caccgtgtat 1680
aacgagctga ccaaagtgaa atacgtgacc gagggaatga gaaagcccgc cttcctgagc 1740
ggcgagcaga aaaaggccat cgtggacctg ctgttcaaga ccaaccggaa agtgaccgtg 1800
aagcagctga aagaggacta cttcaagaaa atcgagtgct tcgactccgt ggaaatctcc 1860
ggcgtggaag atcggttcaa cgcctccctg ggcacatacc acgatctgct gaaaattatc 1920
aaggacaagg acttcctgga caatgaggaa aacgaggaca ttctggaaga tatcgtgctg 1980
accctgacac tgtttgagga cagagagatg atcgaggaac ggctgaaaac ctatgcccac 2040
ctgttcgacg acaaagtgat gaagcagctg aagcggcgga gatacaccgg ctggggcagg 2100
ctgagccgga agctgatcaa cggcatccgg gacaagcagt ccggcaagac aatcctggat 2160
ttcctgaagt ccgacggctt cgccaacaga aacttcatgc agctgatcca cgacgacagc 2220
ctgaccttta aagaggacat ccagaaagcc caggtgtccg gccagggcga tagcctgcac 2280
gagcacattg ccaatctggc cggcagcccc gccattaaga agggcatcct gcagacagtg 2340
aaggtggtgg acgagctcgt gaaagtgatg ggccggcaca agcccgagaa catcgtgatc 2400
gaaatggcca gagagaacca gaccacccag aagggacaga agaacagccg cgagagaatg 2460
aagcggatcg aagagggcat caaagagctg ggcagccaga tcctgaaaga acaccccgtg 2520
gaaaacaccc agctgcagaa cgagaagctg tacctgtact acctgcagaa tgggcgggat 2580
atgtacgtgg accaggaact ggacatcaac cggctgtccg actacgatgt ggaccatatc 2640
gtgcctcaga gctttctgaa ggacgactcc atcgacaaca aggtgctgac cagaagcgac 2700
aagaaccggg gcaagagcga caacgtgccc tccgaagagg tcgtgaagaa gatgaagaac 2760
tactggcggc agctgctgaa cgccaagctg attacccaga gaaagttcga caatctgacc 2820
aaggccgaga gaggcggcct gagcgaactg gataaggccg gcttcatcaa gagacagctg 2880
gtggaaaccc ggcagatcac aaagcacgtg gcacagatcc tggactcccg gatgaacact 2940
aagtacgacg agaatgacaa gctgatccgg gaagtgaaag tgatcaccct gaagtccaag 3000
ctggtgtccg atttccggaa ggatttccag ttttacaaag tgcgcgagat caacaactac 3060
caccacgccc acgacgccta cctgaacgcc gtcgtgggaa ccgccctgat caaaaagtac 3120
cctaagctgg aaagcgagtt cgtgtacggc gactacaagg tgtacgacgt gcggaagatg 3180
atcgccaaga gcgagcagga aatcggcaag gctaccgcca agtacttctt ctacagcaac 3240
atcatgaact ttttcaagac cgagattacc ctggccaacg gcgagatccg gaagcggcct 3300
ctgatcgaga caaacggcga aaccggggag atcgtgtggg ataagggccg ggattttgcc 3360
accgtgcgga aagtgctgag catgccccaa gtgaatatcg tgaaaaagac cgaggtgcag 3420
acaggcggct tcagcaaaga gtctatcctg cccaagagga acagcgataa gctgatcgcc 3480
agaaagaagg actgggaccc taagaagtac ggcggcttcg acagccccac cgtggcctat 3540
tctgtgctgg tggtggccaa agtggaaaag ggcaagtcca agaaactgaa gagtgtgaaa 3600
gagctgctgg ggatcaccat catggaaaga agcagcttcg agaagaatcc catcgacttt 3660
ctggaagcca agggctacaa agaagtgaaa aaggacctga tcatcaagct gcctaagtac 3720
tccctgttcg agctggaaaa cggccggaag agaatgctgg cctctgccgg cgaactgcag 3780
aagggaaacg aactggccct gccctccaaa tatgtgaact tcctgtacct ggccagccac 3840
tatgagaagc tgaagggctc ccccgaggat aatgagcaga aacagctgtt tgtggaacag 3900
cacaagcact acctggacga gatcatcgag cagatcagcg agttctccaa gagagtgatc 3960
ctggccgacg ctaa 3974
<210> 4
<211> 1423
<212> PRT
<213> Streptococcus pyogenes
<400> 4
Met Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp
1 5 10 15
Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
20 25 30
Gly Ile His Gly Val Pro Ala Ala Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu
35 40 45
Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr
50 55 60
Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His
65 70 75 80
Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu
85 90 95
Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr
100 105 110
Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu
115 120 125
Met Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe
130 135 140
Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn
145 150 155 160
Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His
165 170 175
Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu
180 185 190
Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu
195 200 205
Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe
210 215 220
Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile
225 230 235 240
Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser
245 250 255
Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys
260 265 270
Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr
275 280 285
Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln
290 295 300
Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln
305 310 315 320
Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser
325 330 335
Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr
340 345 350
Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His
355 360 365
Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu
370 375 380
Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly
385 390 395 400
Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys
405 410 415
Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu
420 425 430
Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser
435 440 445
Ile Pro His Gln Ile His Leu Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg
450 455 460
Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu
465 470 475 480
Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg
485 490 495
Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile
500 505 510
Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln
515 520 525
Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu
530 535 540
Lys Val Leu Pro Lys His Ser Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr
545 550 555 560
Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro
565 570 575
Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe
580 585 590
Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe
595 600 605
Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp
610 615 620
Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile
625 630 635 640
Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu
645 650 655
Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu
660 665 670
Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys
675 680 685
Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys
690 695 700
Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp
705 710 715 720
Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile
725 730 735
His Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val
740 745 750
Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly
755 760 765
Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp
770 775 780
Glu Leu Val Lys Val Met Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile
785 790 795 800
Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser
805 810 815
Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser
820 825 830
Gln Ile Leu Lys Glu His Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu
835 840 845
Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp
850 855 860
Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile
865 870 875 880
Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu
885 890 895
Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu
900 905 910
Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala
915 920 925
Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg
930 935 940
Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu
945 950 955 960
Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser
965 970 975
Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val
980 985 990
Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp
995 1000 1005
Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala
1010 1015 1020
His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys
1025 1030 1035
Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys
1040 1045 1050
Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys Ser Glu Gln Glu Ile
1055 1060 1065
Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn
1070 1075 1080
Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys
1085 1090 1095
Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp
1100 1105 1110
Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser Met
1115 1120 1125
Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly
1130 1135 1140
Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu
1145 1150 1155
Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe
1160 1165 1170
Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val
1175 1180 1185
Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu
1190 1195 1200
Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile
1205 1210 1215
Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu
1220 1225 1230
Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly
1235 1240 1245
Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn
1250 1255 1260
Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala
1265 1270 1275
Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln
1280 1285 1290
Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His Tyr Leu Asp Glu Ile
1295 1300 1305
Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp
1310 1315 1320
Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp
1325 1330 1335
Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu Phe Thr
1340 1345 1350
Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr
1355 1360 1365
Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp
1370 1375 1380
Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg
1385 1390 1395
Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp Lys Arg Pro Ala Ala Thr
1400 1405 1410
Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys
1415 1420
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<211> 105
<212> RNA
<213> Staphylococcus aureus
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(22)
<223> n is a, c, g, or u
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gnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnguuuuagu acucuggaaa cagaaucuac uaaaacaagg 60
caaaugccgu guuuaucucg ucaacuuguu ggcgaagauu uuuuu 105
<210> 6
<211> 83
<212> RNA
<213> Staphylococcus aureus
<400> 6
guuuuaguac ucuggaaaca gaaucuacua aaacaaggca aaugccgugu uuaucucguc 60
aacuuguugg cgaagauuuu uuu 83
<210> 7
<211> 3345
<212> DNA
<213> Staphylococcus aureus
<400> 7
atggccccaa agaagaagcg gaaggtcggt atccacggag tcccagcagc caagcggaac 60
tacatcctgg gcctggacat cggcatcacc agcgtgggct acggcatcat cgactacgag 120
acacgggacg tgatcgatgc cggcgtgcgg ctgttcaaag aggccaacgt ggaaaacaac 180
gagggcaggc ggagcaagag aggcgccaga aggctgaagc ggcggaggcg gcatagaatc 240
cagagagtga agaagctgct gttcgactac aacctgctga ccgaccacag cgagctgagc 300
ggcatcaacc cctacgaggc cagagtgaag ggcctgagcc agaagctgag cgaggaagag 360
ttctctgccg ccctgctgca cctggccaag agaagaggcg tgcacaacgt gaacgaggtg 420
gaagaggaca ccggcaacga gctgtccacc aaagagcaga tcagccggaa cagcaaggcc 480
ctggaagaga aatacgtggc cgaactgcag ctggaacggc tgaagaaaga cggcgaagtg 540
cggggcagca tcaacagatt caagaccagc gactacgtga aagaagccaa acagctgctg 600
aaggtgcaga aggcctacca ccagctggac cagagcttca tcgacaccta catcgacctg 660
ctggaaaccc ggcggaccta ctatgaggga cctggcgagg gcagcccctt cggctggaag 720
gacatcaaag aatggtacga gatgctgatg ggccactgca cctacttccc cgaggaactg 780
cggagcgtga agtacgccta caacgccgac ctgtacaacg ccctgaacga cctgaacaat 840
ctcgtgatca ccagggacga gaacgagaag ctggaatatt acgagaagtt ccagatcatc 900
gagaacgtgt tcaagcagaa gaagaagccc accctgaagc agatcgccaa agaaatcctc 960
gtgaacgaag aggatattaa gggctacaga gtgaccagca ccggcaagcc cgagttcacc 1020
aacctgaagg tgtaccacga catcaaggac attaccgccc ggaaagagat tattgagaac 1080
gccgagctgc tggatcagat tgccaagatc ctgaccatct accagagcag cgaggacatc 1140
caggaagaac tgaccaatct gaactccgag ctgacccagg aagagatcga gcagatctct 1200
aatctgaagg gctataccgg cacccacaac ctgagcctga aggccatcaa cctgatcctg 1260
gacgagctgt ggcacaccaa cgacaaccag atcgctatct tcaaccggct gaagctggtg 1320
cccaagaagg tggacctgtc ccagcagaaa gagatcccca ccaccctggt ggacgacttc 1380
atcctgagcc ccgtcgtgaa gagaagcttc atccagagca tcaaagtgat caacgccatc 1440
atcaagaagt acggcctgcc caacgacatc attatcgagc tggcccgcga gaagaactcc 1500
aaggacgccc agaaaatgat caacgagatg cagaagcgga accggcagac caacgagcgg 1560
atcgaggaaa tcatccggac caccggcaaa gagaacgcca agtacctgat cgagaagatc 1620
aagctgcacg acatgcagga aggcaagtgc ctgtacagcc tggaagccat ccctctggaa 1680
gatctgctga acaacccctt caactatgag gtggaccaca tcatccccag aagcgtgtcc 1740
ttcgacaaca gcttcaacaa caaggtgctc gtgaagcagg aagaaaacag caagaagggc 1800
aaccggaccc cattccagta cctgagcagc agcgacagca agatcagcta cgaaaccttc 1860
aagaagcaca tcctgaatct ggccaagggc aagggcagaa tcagcaagac caagaaagag 1920
tatctgctgg aagaacggga catcaacagg ttctccgtgc agaaagactt catcaaccgg 1980
aacctggtgg ataccagata cgccaccaga ggcctgatga acctgctgcg gagctacttc 2040
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gccctgatca ttgccaacgc cgatttcatc ttcaaagagt ggaagaaact ggacaaggcc 2220
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gaaaccgagc aggagtacaa agagatcttc atcacccccc accagatcaa gcacattaag 2340
gacttcaagg actacaagta cagccaccgg gtggacaaga agcctaatag agagctgatt 2400
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gaacagtacg gcgacgagaa gaatcccctg tacaagtact acgaggaaac cgggaactac 2640
ctgaccaagt actccaaaaa ggacaacggc cccgtgatca agaagattaa gtattacggc 2700
aacaaactga acgcccatct ggacatcacc gacgactacc ccaacagcag aaacaaggtc 2760
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aagtgctatg aggaagctaa gaagctgaag aagatcagca accaggccga gtttatcgcc 2940
tccttctaca acaacgatct gatcaagatc aacggcgagc tgtatagagt gatcggcgtg 3000
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gcaaaaaaga aaaagggatc ctacccatac gatgttccag attacgctta cccatacgat 3300
gttccagatt acgcttaccc atacgatgtt ccagattacg cttaa 3345
<210> 8
<211> 1114
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
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Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Ile His Gly Val Pro Ala
1 5 10 15
Ala Lys Arg Asn Tyr Ile Leu Gly Leu Asp Ile Gly Ile Thr Ser Val
20 25 30
Gly Tyr Gly Ile Ile Asp Tyr Glu Thr Arg Asp Val Ile Asp Ala Gly
35 40 45
Val Arg Leu Phe Lys Glu Ala Asn Val Glu Asn Asn Glu Gly Arg Arg
50 55 60
Ser Lys Arg Gly Ala Arg Arg Leu Lys Arg Arg Arg Arg His Arg Ile
65 70 75 80
Gln Arg Val Lys Lys Leu Leu Phe Asp Tyr Asn Leu Leu Thr Asp His
85 90 95
Ser Glu Leu Ser Gly Ile Asn Pro Tyr Glu Ala Arg Val Lys Gly Leu
100 105 110
Ser Gln Lys Leu Ser Glu Glu Glu Phe Ser Ala Ala Leu Leu His Leu
115 120 125
Ala Lys Arg Arg Gly Val His Asn Val Asn Glu Val Glu Glu Asp Thr
130 135 140
Gly Asn Glu Leu Ser Thr Lys Glu Gln Ile Ser Arg Asn Ser Lys Ala
145 150 155 160
Leu Glu Glu Lys Tyr Val Ala Glu Leu Gln Leu Glu Arg Leu Lys Lys
165 170 175
Asp Gly Glu Val Arg Gly Ser Ile Asn Arg Phe Lys Thr Ser Asp Tyr
180 185 190
Val Lys Glu Ala Lys Gln Leu Leu Lys Val Gln Lys Ala Tyr His Gln
195 200 205
Leu Asp Gln Ser Phe Ile Asp Thr Tyr Ile Asp Leu Leu Glu Thr Arg
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Arg Thr Tyr Tyr Glu Gly Pro Gly Glu Gly Ser Pro Phe Gly Trp Lys
225 230 235 240
Asp Ile Lys Glu Trp Tyr Glu Met Leu Met Gly His Cys Thr Tyr Phe
245 250 255
Pro Glu Glu Leu Arg Ser Val Lys Tyr Ala Tyr Asn Ala Asp Leu Tyr
260 265 270
Asn Ala Leu Asn Asp Leu Asn Asn Leu Val Ile Thr Arg Asp Glu Asn
275 280 285
Glu Lys Leu Glu Tyr Tyr Glu Lys Phe Gln Ile Ile Glu Asn Val Phe
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Lys Gln Lys Lys Lys Pro Thr Leu Lys Gln Ile Ala Lys Glu Ile Leu
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Val Asn Glu Glu Asp Ile Lys Gly Tyr Arg Val Thr Ser Thr Gly Lys
325 330 335
Pro Glu Phe Thr Asn Leu Lys Val Tyr His Asp Ile Lys Asp Ile Thr
340 345 350
Ala Arg Lys Glu Ile Ile Glu Asn Ala Glu Leu Leu Asp Gln Ile Ala
355 360 365
Lys Ile Leu Thr Ile Tyr Gln Ser Ser Glu Asp Ile Gln Glu Glu Leu
370 375 380
Thr Asn Leu Asn Ser Glu Leu Thr Gln Glu Glu Ile Glu Gln Ile Ser
385 390 395 400
Asn Leu Lys Gly Tyr Thr Gly Thr His Asn Leu Ser Leu Lys Ala Ile
405 410 415
Asn Leu Ile Leu Asp Glu Leu Trp His Thr Asn Asp Asn Gln Ile Ala
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Ile Phe Asn Arg Leu Lys Leu Val Pro Lys Lys Val Asp Leu Ser Gln
435 440 445
Gln Lys Glu Ile Pro Thr Thr Leu Val Asp Asp Phe Ile Leu Ser Pro
450 455 460
Val Val Lys Arg Ser Phe Ile Gln Ser Ile Lys Val Ile Asn Ala Ile
465 470 475 480
Ile Lys Lys Tyr Gly Leu Pro Asn Asp Ile Ile Ile Glu Leu Ala Arg
485 490 495
Glu Lys Asn Ser Lys Asp Ala Gln Lys Met Ile Asn Glu Met Gln Lys
500 505 510
Arg Asn Arg Gln Thr Asn Glu Arg Ile Glu Glu Ile Ile Arg Thr Thr
515 520 525
Gly Lys Glu Asn Ala Lys Tyr Leu Ile Glu Lys Ile Lys Leu His Asp
530 535 540
Met Gln Glu Gly Lys Cys Leu Tyr Ser Leu Glu Ala Ile Pro Leu Glu
545 550 555 560
Asp Leu Leu Asn Asn Pro Phe Asn Tyr Glu Val Asp His Ile Ile Pro
565 570 575
Arg Ser Val Ser Phe Asp Asn Ser Phe Asn Asn Lys Val Leu Val Lys
580 585 590
Gln Glu Glu Asn Ser Lys Lys Gly Asn Arg Thr Pro Phe Gln Tyr Leu
595 600 605
Ser Ser Ser Asp Ser Lys Ile Ser Tyr Glu Thr Phe Lys Lys His Ile
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Leu Asn Leu Ala Lys Gly Lys Gly Arg Ile Ser Lys Thr Lys Lys Glu
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Tyr Leu Leu Glu Glu Arg Asp Ile Asn Arg Phe Ser Val Gln Lys Asp
645 650 655
Phe Ile Asn Arg Asn Leu Val Asp Thr Arg Tyr Ala Thr Arg Gly Leu
660 665 670
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675 680 685
Val Lys Ser Ile Asn Gly Gly Phe Thr Ser Phe Leu Arg Arg Lys Trp
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Lys Phe Lys Lys Glu Arg Asn Lys Gly Tyr Lys His His Ala Glu Asp
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Ala Leu Ile Ile Ala Asn Ala Asp Phe Ile Phe Lys Glu Trp Lys Lys
725 730 735
Leu Asp Lys Ala Lys Lys Val Met Glu Asn Gln Met Phe Glu Glu Lys
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Gln Ala Glu Ser Met Pro Glu Ile Glu Thr Glu Gln Glu Tyr Lys Glu
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Ile Phe Ile Thr Pro His Gln Ile Lys His Ile Lys Asp Phe Lys Asp
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Asn Asp Thr Leu Tyr Ser Thr Arg Lys Asp Asp Lys Gly Asn Thr Leu
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Ile Val Asn Asn Leu Asn Gly Leu Tyr Asp Lys Asp Asn Asp Lys Leu
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Lys Lys Leu Ile Asn Lys Ser Pro Glu Lys Leu Leu Met Tyr His His
835 840 845
Asp Pro Gln Thr Tyr Gln Lys Leu Lys Leu Ile Met Glu Gln Tyr Gly
850 855 860
Asp Glu Lys Asn Pro Leu Tyr Lys Tyr Tyr Glu Glu Thr Gly Asn Tyr
865 870 875 880
Leu Thr Lys Tyr Ser Lys Lys Asp Asn Gly Pro Val Ile Lys Lys Ile
885 890 895
Lys Tyr Tyr Gly Asn Lys Leu Asn Ala His Leu Asp Ile Thr Asp Asp
900 905 910
Tyr Pro Asn Ser Arg Asn Lys Val Val Lys Leu Ser Leu Lys Pro Tyr
915 920 925
Arg Phe Asp Val Tyr Leu Asp Asn Gly Val Tyr Lys Phe Val Thr Val
930 935 940
Lys Asn Leu Asp Val Ile Lys Lys Glu Asn Tyr Tyr Glu Val Asn Ser
945 950 955 960
Lys Cys Tyr Glu Glu Ala Lys Lys Leu Lys Lys Ile Ser Asn Gln Ala
965 970 975
Glu Phe Ile Ala Ser Phe Tyr Asn Asn Asp Leu Ile Lys Ile Asn Gly
980 985 990
Glu Leu Tyr Arg Val Ile Gly Val Asn Asn Asp Leu Leu Asn Arg Ile
995 1000 1005
Glu Val Asn Met Ile Asp Ile Thr Tyr Arg Glu Tyr Leu Glu Asn
1010 1015 1020
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Lys Thr Gln Ser Ile Lys Lys Tyr Ser Thr Asp Ile Leu Gly Asn
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Leu Tyr Glu Val Lys Ser Lys Lys His Pro Gln Ile Ile Lys Lys
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Gly Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys
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Lys Lys Gly Ser Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Tyr Pro
1085 1090 1095
Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr
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Ala
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16nt guide using novel PAM
<400> 37
gatagattag cttcct 16
<210> 38
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16nt guide using novel PAM
<400> 38
aggaagctaa tctatc 16
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16nt guide using novel PAM
<400> 39
caccgaggaa gctaatctat c 21
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16nt guide using novel PAM
<400> 40
caaagataga ttagcttcct c 21
<210> 41
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 22nt guide, mutation at position 4 in seed region
<400> 41
actcagctgt acacggactg ca 22
<210> 42
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 22nt guide, mutation at position 4 in seed region
<400> 42
actcagctgt acacggactg ca 22
<210> 43
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 22nt guide, mutation at position 4 in seed region
<400> 43
caccgactca gctgtacacg gactgca 27
<210> 44
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 22nt guide, mutation at position 4 in seed region
<400> 44
caaatgcagt ccgtgtacag ctgagtc 27
<210> 45
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 21nt guide, mutation at position 4 in seed region
<400> 45
ctcagctgta cacggactgc a 21
<210> 46
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 21nt guide, mutation at position 4 in seed region
<400> 46
ctcagctgta cacggactgc a 21
<210> 47
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 21nt guide, mutation at position 4 in seed region
<400> 47
caccgctcag ctgtacacgg actgca 26
<210> 48
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 21nt guide, mutation at position 4 in seed region
<400> 48
caaatgcagt ccgtgtacag ctgagc 26
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 20nt guide, mutation at position 4 in seed region22nt guide,
mutation at position 4 in seed region
<400> 49
tcagctgtac acggactgca 20
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 20nt guide, mutation at position 4 in seed region22nt guide,
mutation at position 4 in seed region
<400> 50
tcagctgtac acggactgca 20
<210> 51
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 20nt guide, mutation at position 4 in seed region22nt guide,
mutation at position 4 in seed region
<400> 51
caccgtcagc tgtacacgga ctgca 25
<210> 52
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 20nt guide, mutation at position 4 in seed region22nt guide,
mutation at position 4 in seed region
<400> 52
caaatgcagt ccgtgtacag ctgac 25
<210> 53
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 19nt guide, mutation at position 4 in seed region
<400> 53
cagctgtaca cggactgca 19
<210> 54
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 19nt guide, mutation at position 4 in seed region
<400> 54
cagctgtaca cggactgca 19
<210> 55
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 19nt guide, mutation at position 4 in seed region
<400> 55
caccgcagct gtacacggac tgca 24
<210> 56
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 19nt guide, mutation at position 4 in seed region
<400> 56
caaatgcagt ccgtgtacag ctgc 24
<210> 57
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18nt guide, mutation at position 4 in seed region
<400> 57
agctgtacac ggactgca 18
<210> 58
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18nt guide, mutation at position 4 in seed region
<400> 58
agctgtacac ggactgca 18
<210> 59
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18nt guide, mutation at position 4 in seed region
<400> 59
caccgagctg tacacggact gca 23
<210> 60
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18nt guide, mutation at position 4 in seed region
<400> 60
caaatgcagt ccgtgtacag ctc 23
<210> 61
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 17nt guide, mutation at position 4 in seed region
<400> 61
gctgtacacg gactgca 17
<210> 62
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 17nt guide, mutation at position 4 in seed region
<400> 62
gctgtacacg gactgca 17
<210> 63
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 17nt guide, mutation at position 4 in seed region
<400> 63
caccggctgt acacggactg ca 22
<210> 64
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 17nt guide, mutation at position 4 in seed region
<400> 64
caaatgcagt ccgtgtacag cc 22
<210> 65
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16nt guide, mutation at position 4 in seed region
<400> 65
ctgtacacgg actgca 16
<210> 66
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16nt guide, mutation at position 4 in seed region
<400> 66
ctgtacacgg actgca 16
<210> 67
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16nt guide, mutation at position 4 in seed region
<400> 67
caccgctgta cacggactgc a 21
<210> 68
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16nt guide, mutation at position 4 in seed region
<400> 68
caaatgcagt ccgtgtacag c 21
<210> 69
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 24nt guide, mutation at position 3 in seed region
<400> 69
ccactcagct gtacacggac caca 24
<210> 70
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 24nt guide, mutation at position 3 in seed region
<400> 70
ccactcagct gtacacggac caca 24
<210> 71
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 24nt guide, mutation at position 3 in seed region
<400> 71
caccgccact cagctgtaca cggaccaca 29
<210> 72
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 24nt guide, mutation at position 3 in seed region
<400> 72
caaatgtggt ccgtgtacag ctgagtggc 29
<210> 73
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 23nt guide, mutation at position 3 in seed region
<400> 73
cactcagctg tacacggacc aca 23
<210> 74
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 23nt guide, mutation at position 3 in seed region
<400> 74
cactcagctg tacacggacc aca 23
<210> 75
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 23nt guide, mutation at position 3 in seed region
<400> 75
caccgcactc agctgtacac ggaccaca 28
<210> 76
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 23nt guide, mutation at position 3 in seed region
<400> 76
caaatgtggt ccgtgtacag ctgagtgc 28
<210> 77
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 22nt guide, mutation at position 3 in seed region
<400> 77
actcagctgt acacggacca ca 22
<210> 78
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 22nt guide, mutation at position 3 in seed region
<400> 78
actcagctgt acacggacca ca 22
<210> 79
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 22nt guide, mutation at position 3 in seed region
<400> 79
caccgactca gctgtacacg gaccaca 27
<210> 80
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 22nt guide, mutation at position 3 in seed region
<400> 80
caaatgtggt ccgtgtacag ctgagtc 27
<210> 81
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 21nt guide, mutation at position 3 in seed region
<400> 81
ctcagctgta cacggaccac a 21
<210> 82
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 21nt guide, mutation at position 3 in seed region
<400> 82
ctcagctgta cacggaccac a 21
<210> 83
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 21nt guide, mutation at position 3 in seed region
<400> 83
caccgctcag ctgtacacgg accaca 26
<210> 84
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 21nt guide, mutation at position 3 in seed region
<400> 84
caaatgtggt ccgtgtacag ctgagc 26
<210> 85
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 20nt guide, mutation at position 3 in seed region
<400> 85
tcagctgtac acggaccaca 20
<210> 86
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 20nt guide, mutation at position 3 in seed region
<400> 86
tcagctgtac acggaccaca 20
<210> 87
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 20nt guide, mutation at position 3 in seed region
<400> 87
caccgtcagc tgtacacgga ccaca 25
<210> 88
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 20nt guide, mutation at position 3 in seed region
<400> 88
caaatgtggt ccgtgtacag ctgac 25
<210> 89
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 19nt guide, mutation at position 3 in seed region
<400> 89
cagctgtaca cggaccaca 19
<210> 90
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 19nt guide, mutation at position 3 in seed region
<400> 90
cagctgtaca cggaccaca 19
<210> 91
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 19nt guide, mutation at position 3 in seed region
<400> 91
caccgcagct gtacacggac caca 24
<210> 92
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 19nt guide, mutation at position 3 in seed region
<400> 92
caaatgtggt ccgtgtacag ctgc 24
<210> 93
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18nt guide, mutation at position 3 in seed region
<400> 93
agctgtacac ggaccaca 18
<210> 94
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18nt guide, mutation at position 3 in seed region
<400> 94
agctgtacac ggaccaca 18
<210> 95
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18nt guide, mutation at position 3 in seed region
<400> 95
caccgagctg tacacggacc aca 23
<210> 96
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> 18nt guide, mutation at position 3 in seed region
<400> 96
caaatgtggt ccgtgtacag ctc 23
<210> 97
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 22nt guide, mutation at position 3 of seed region
<400> 97
actcagctgt acacggacct ca 22
<210> 98
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 22nt guide, mutation at position 3 of seed region
<400> 98
actcagctgt acacggacct ca 22
<210> 99
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 22nt guide, mutation at position 3 of seed region
<400> 99
caccgactca gctgtacacg gacctca 27
<210> 100
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 22nt guide, mutation at position 3 of seed region
<400> 100
caaatgaggt ccgtgtacag ctgagtc 27
<210> 101
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 21nt guide, mutation at position 3 of seed region
<400> 101
ctcagctgta cacggacctc a 21
<210> 102
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 21nt guide, mutation at position 3 of seed region
<400> 102
ctcagctgta cacggacctc a 21
<210> 103
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 21nt guide, mutation at position 3 of seed region
<400> 103
caccgctcag ctgtacacgg acctca 26
<210> 104
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 21nt guide, mutation at position 3 of seed region
<400> 104
caaatgaggt ccgtgtacag ctgagc 26
<210> 105
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 20nt guide, mutation at position 3 of seed region
<400> 105
tcagctgtac acggacctca 20
<210> 106
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 20nt guide, mutation at position 3 of seed region
<400> 106
tcagctgtac acggacctca 20
<210> 107
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 20nt guide, mutation at position 3 of seed region
<400> 107
caccgtcagc tgtacacgga cctca 25
<210> 108
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 20nt guide, mutation at position 3 of seed region
<400> 108
caaatgaggt ccgtgtacag ctgac 25
<210> 109
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 19nt guide, mutation at position 3 of seed region
<400> 109
cagctgtaca cggacctca 19
<210> 110
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 19nt guide, mutation at position 3 of seed region
<400> 110
cagctgtaca cggacctca 19
<210> 111
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 19nt guide, mutation at position 3 of seed region
<400> 111
caccgcagct gtacacggac ctca 24
<210> 112
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 19nt guide, mutation at position 3 of seed region
<400> 112
caaatgaggt ccgtgtacag ctgc 24
<210> 113
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18nt guide, mutation at position 3 of seed region
<400> 113
agctgtacac ggacctca 18
<210> 114
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18nt guide, mutation at position 3 of seed region
<400> 114
agctgtacac ggacctca 18
<210> 115
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18nt guide, mutation at position 3 of seed region
<400> 115
caccgagctg tacacggacc tca 23
<210> 116
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18nt guide, mutation at position 3 of seed region
<400> 116
caaatgaggt ccgtgtacag ctc 23
<210> 117
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 17nt guide, mutation at position 3 of seed region
<400> 117
gctgtacacg gacctca 17
<210> 118
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 17nt guide, mutation at position 3 of seed region
<400> 118
gctgtacacg gacctca 17
<210> 119
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 17nt guide, mutation at position 3 of seed region
<400> 119
caccggctgt acacggacct ca 22
<210> 120
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 17nt guide, mutation at position 3 of seed region
<400> 120
caaatgaggt ccgtgtacag cc 22
<210> 121
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16nt guide, mutation at position 3 of seed region
<400> 121
ctgtacacgg acctca 16
<210> 122
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16nt guide, mutation at position 3 of seed region
<400> 122
ctgtacacgg acctca 16
<210> 123
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16nt guide, mutation at position 3 of seed region
<400> 123
caccgctgta cacggacctc a 21
<210> 124
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16nt guide, mutation at position 3 of seed region
<400> 124
caaatgaggt ccgtgtacag c 21
<210> 125
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 22nt guide, mutation at position 7 in seed region
<400> 125
agagaatgga gcagactctt gg 22
<210> 126
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 22nt guide, mutation at position 7 in seed region
<400> 126
ccaagagtct gctccattct ct 22
<210> 127
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 22nt guide, mutation at position 7 in seed region
<400> 127
caccgccaag agtctgctcc attctct 27
<210> 128
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 22nt guide, mutation at position 7 in seed region
<400> 128
caaaagagaa tggagcagac tcttggc 27
<210> 129
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 21nt guide, mutation at position 7 in seed region
<400> 129
agagaatgga gcagactctt g 21
<210> 130
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 21nt guide, mutation at position 7 in seed region
<400> 130
caagagtctg ctccattctc t 21
<210> 131
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 21nt guide, mutation at position 7 in seed region
<400> 131
caccgcaaga gtctgctcca ttctct 26
<210> 132
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 21nt guide, mutation at position 7 in seed region
<400> 132
caaaagagaa tggagcagac tcttgc 26
<210> 133
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 20nt guide, mutation at position 7 in seed region
<400> 133
agagaatgga gcagactctt 20
<210> 134
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 20nt guide, mutation at position 7 in seed region
<400> 134
aagagtctgc tccattctct 20
<210> 135
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 20nt guide, mutation at position 7 in seed region
<400> 135
caccgaagag tctgctccat tctct 25
<210> 136
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 20nt guide, mutation at position 7 in seed region
<400> 136
caaaagagaa tggagcagac tcttc 25
<210> 137
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 19nt guide, mutation at position 7 in seed region
<400> 137
agagaatgga gcagactct 19
<210> 138
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 19nt guide, mutation at position 7 in seed region
<400> 138
agagtctgct ccattctct 19
<210> 139
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 19nt guide, mutation at position 7 in seed region
<400> 139
caccgagagt ctgctccatt ctct 24
<210> 140
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 19nt guide, mutation at position 7 in seed region
<400> 140
caaaagagaa tggagcagac tctc 24
<210> 141
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18nt guide, mutation at position 7 in seed region
<400> 141
agagaatgga gcagactc 18
<210> 142
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18nt guide, mutation at position 7 in seed region
<400> 142
gagtctgctc cattctct 18
<210> 143
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18nt guide, mutation at position 7 in seed region
<400> 143
caccggagtc tgctccattc tct 23
<210> 144
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18nt guide, mutation at position 7 in seed region
<400> 144
caaaagagaa tggagcagac tcc 23
<210> 145
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 17nt guide, mutation at position 7 in seed region
<400> 145
agagaatgga gcagact 17
<210> 146
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 17nt guide, mutation at position 7 in seed region
<400> 146
agtctgctcc attctct 17
<210> 147
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 17nt guide, mutation at position 7 in seed region
<400> 147
caccgagtct gctccattct ct 22
<210> 148
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 17nt guide, mutation at position 7 in seed region
<400> 148
caaaagagaa tggagcagac tc 22
<210> 149
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16nt guide, mutation at position 7 in seed region
<400> 149
agagaatgga gcagac 16
<210> 150
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16nt guide, mutation at position 7 in seed region
<400> 150
gtctgctcca ttctct 16
<210> 151
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16nt guide, mutation at position 7 in seed region
<400> 151
caccggtctg ctccattctc t 21
<210> 152
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16nt guide, mutation at position 7 in seed region
<400> 152
caaaagagaa tggagcagac c 21
<210> 153
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 22nt guide, mutation at position 8 of seed region
<400> 153
agagaacaga gcagactctt gg 22
<210> 154
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 22nt guide, mutation at position 8 of seed region
<400> 154
ccaagagtct gctctgttct ct 22
<210> 155
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 22nt guide, mutation at position 8 of seed region
<400> 155
caccgccaag agtctgctct gttctct 27
<210> 156
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 22nt guide, mutation at position 8 of seed region
<400> 156
caaaagagaa cagagcagac tcttggc 27
<210> 157
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 21nt guide, mutation at position 8 of seed region
<400> 157
agagaacaga gcagactctt g 21
<210> 158
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 21nt guide, mutation at position 8 of seed region
<400> 158
caagagtctg ctctgttctc t 21
<210> 159
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 21nt guide, mutation at position 8 of seed region
<400> 159
caccgcaaga gtctgctctg ttctct 26
<210> 160
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 21nt guide, mutation at position 8 of seed region
<400> 160
caaaagagaa cagagcagac tcttgc 26
<210> 161
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 20nt guide, mutation at position 8 of seed region
<400> 161
agagaacaga gcagactctt 20
<210> 162
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 20nt guide, mutation at position 8 of seed region
<400> 162
aagagtctgc tctgttctct 20
<210> 163
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 20nt guide, mutation at position 8 of seed region
<400> 163
caccgaagag tctgctctgt tctct 25
<210> 164
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 20nt guide, mutation at position 8 of seed region
<400> 164
caaaagagaa cagagcagac tcttc 25
<210> 165
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 19nt guide, mutation at position 8 of seed region
<400> 165
agagaacaga gcagactct 19
<210> 166
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 19nt guide, mutation at position 8 of seed region
<400> 166
agagtctgct ctgttctct 19
<210> 167
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 19nt guide, mutation at position 8 of seed region
<400> 167
caccgagagt ctgctctgtt ctct 24
<210> 168
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 19nt guide, mutation at position 8 of seed region
<400> 168
caaaagagaa cagagcagac tctc 24
<210> 169
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18nt guide, mutation at position 8 of seed region
<400> 169
agagaacaga gcagactc 18
<210> 170
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18nt guide, mutation at position 8 of seed region
<400> 170
gagtctgctc tgttctct 18
<210> 171
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18nt guide, mutation at position 8 of seed region
<400> 171
caccggagtc tgctctgttc tct 23
<210> 172
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18nt guide, mutation at position 8 of seed region
<400> 172
caaaagagaa cagagcagac tcc 23
<210> 173
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 17nt guide, mutation at position 8 of seed region
<400> 173
agagaacaga gcagact 17
<210> 174
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 17nt guide, mutation at position 8 of seed region
<400> 174
agtctgctct gttctct 17
<210> 175
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 17nt guide, mutation at position 8 of seed region
<400> 175
caccgagtct gctctgttct ct 22
<210> 176
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 17nt guide, mutation at position 8 of seed region
<400> 176
caaaagagaa cagagcagac tc 22
<210> 177
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16nt guide, mutation at position 8 of seed region
<400> 177
agagaacaga gcagac 16
<210> 178
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16nt guide, mutation at position 8 of seed region
<400> 178
gtctgctctg ttctct 16
<210> 179
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16nt guide, mutation at position 8 of seed region
<400> 179
caccggtctg ctctgttctc t 21
<210> 180
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16nt guide, mutation at position 8 of seed region
<400> 180
caaaagagaa cagagcagac c 21
<210> 181
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu509Arg
<400> 181
gactgtcatg gatgtccgga 20
<210> 182
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu509Arg
<400> 182
gactgtcatg gatgtccgga 20
<210> 183
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu509Arg
<400> 183
caccggactg tcatggatgt ccgga 25
<210> 184
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu509Arg
<400> 184
caaatccgga catccatgac agtcc 25
<210> 185
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu509Arg
<400> 185
tggggactgt catggatgtc 20
<210> 186
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu509Arg
<400> 186
tggggactgt catggatgtc 20
<210> 187
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu509Arg
<400> 187
caccgtgggg actgtcatgg atgtc 25
<210> 188
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu509Arg
<400> 188
caaagacatc catgacagtc cccac 25
<210> 189
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg666Ser
<400> 189
gagctctgtg cgactaggtg 20
<210> 190
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg666Ser
<400> 190
cacctagtcg cacagagctc 20
<210> 191
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg666Ser
<400> 191
caccgcacct agtcgcacag agctc 25
<210> 192
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg666Ser
<400> 192
caaagagctc tgtgcgacta ggtgc 25
<210> 193
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg666Ser
<400> 193
ctagtcgcac agagctctgg 20
<210> 194
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg666Ser
<400> 194
ccagagctct gtgcgactag 20
<210> 195
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg666Ser
<400> 195
caccgccaga gctctgtgcg actag 25
<210> 196
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg666Ser
<400> 196
caaactagtc gcacagagct ctggc 25
<210> 197
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gly623Asp
<400> 197
cctgacatca tgaccacaaa 20
<210> 198
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gly623Asp
<400> 198
cctgacatca tgaccacaaa 20
<210> 199
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gly623Asp
<400> 199
caccgcctga catcatgacc acaaa 25
<210> 200
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gly623Asp
<400> 200
caaatttgtg gtcatgatgt caggc 25
<210> 201
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Glu498Val
<400> 201
ggacgtggtg atcgccacct 20
<210> 202
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Glu498Val
<400> 202
aggtggcgat caccacgtcc 20
<210> 203
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Glu498Val
<400> 203
caccgaggtg gcgatcacca cgtcc 25
<210> 204
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Glu498Val
<400> 204
caaaggacgt ggtgatcgcc accctc 26
<210> 205
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg503Pro
<400> 205
agctgctgga gggcgaggag 20
<210> 206
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg503Pro
<400> 206
ctcctcgccc tccagcagct 20
<210> 207
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg503Pro
<400> 207
caccgctcct cgccctccag cagct 25
<210> 208
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg503Pro
<400> 208
caaaagctgc tggagggcga ggagc 25
<210> 209
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg503Pro
<400> 209
agctgctgga gggcgaggag 20
<210> 210
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg503Pro
<400> 210
ctcctcgccc tccagcagct 20
<210> 211
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg503Pro
<400> 211
caccgctcct cgccctccag cagct 25
<210> 212
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg503Pro
<400> 212
caaaagctgc tggagggcga ggagc 25
<210> 213
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg503Pro
<400> 213
accccaagct gctggagggc 20
<210> 214
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg503Pro
<400> 214
gccctccagc agcttggggt 20
<210> 215
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg503Pro
<400> 215
caccggccct ccagcagctt ggggt 25
<210> 216
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg503Pro
<400> 216
caaaacccca agctgctgga gggcc 25
<210> 217
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg503Pro
<400> 217
taccccaagc tgctggaggg c 21
<210> 218
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg503Pro
<400> 218
taccccaagc tgctggaggg c 21
<210> 219
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg503Pro
<400> 219
caccgtaccc caagctgctg gagggc 26
<210> 220
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg503Pro
<400> 220
caaagccctc cagcagcttg gggtac 26
<210> 221
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Glu509Lys
<400> 221
ccgcaagctg ctggagggca 20
<210> 222
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Glu509Lys
<400> 222
ccgcaagctg ctggagggcc 20
<210> 223
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Glu509Lys
<400> 223
caccgccgca agctgctgga gggcc 25
<210> 224
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Glu509Lys
<400> 224
caaaggccct ccagcagctt gcggc 25
<210> 225
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Glu509Lys
<400> 225
ggccctccag cagcttgcgg 20
<210> 226
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Glu509Lys
<400> 226
ccgcaagctg ctggagggcc 20
<210> 227
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Glu509Lys
<400> 227
caccgccgca agctgctgga gggcc 25
<210> 228
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Glu509Lys
<400> 228
caaaggccct ccagcagctt gcggc 25
<210> 229
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gln130Pro
<400> 229
aatcttaatg atagattagc 20
<210> 230
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gln130Pro
<400> 230
gctaatctat cattaagatt 20
<210> 231
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gln130Pro
<400> 231
caccggctaa tctatcatta agatt 25
<210> 232
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gln130Pro
<400> 232
caaaaatctt aatgatagat tagcc 25
<210> 233
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu132Pro
<400> 233
atgatagatt agcttcctac 20
<210> 234
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu132Pro
<400> 234
gtaggaagct aatctatcat 20
<210> 235
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu132Pro
<400> 235
caccggtagg aagctaatct atcat 25
<210> 236
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu132Pro
<400> 236
caaaatgata gattagcttc ctacc 25
<210> 237
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu132Pro
<400> 237
atgatagatt agcttcctac 20
<210> 238
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu132Pro
<400> 238
gtaggaagct aatctatcat 20
<210> 239
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu132Pro
<400> 239
caccggtagg aagctaatct atcat 25
<210> 240
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu132Pro
<400> 240
caaaatgata gattagcttc ctacc 25
<210> 241
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu132Pro
<400> 241
aatgatagat tagcttccta 20
<210> 242
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu132Pro
<400> 242
taggaagcta atctatcatt 20
<210> 243
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu132Pro
<400> 243
caccgtagga agctaatcta tcatt 25
<210> 244
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu132Pro
<400> 244
caaaaatgat agattagctt cctac 25
<210> 245
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asn133Lys
<400> 245
aagaaactat gcaaaatctt 20
<210> 246
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asn133Lys
<400> 246
aagaaactat gcaaaatctt 20
<210> 247
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asn133Lys
<400> 247
caccgaagaa actatgcaaa atctt 25
<210> 248
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asn133Lys
<400> 248
caaaaagatt ttgcatagtt tcttc 25
<210> 249
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asn133Lys
<400> 249
aagaaactat gcaaaatctt 20
<210> 250
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asn133Lys
<400> 250
aagaaactat gcaaaatctt 20
<210> 251
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asn133Lys
<400> 251
caccgaagaa actatgcaaa atctt 25
<210> 252
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asn133Lys
<400> 252
caaaaagatt ttgcatagtt tcttc 25
<210> 253
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asn133Lys
<400> 253
agaaactatg caaaatctta 20
<210> 254
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asn133Lys
<400> 254
agaaactatg caaaatctta 20
<210> 255
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asn133Lys
<400> 255
caccgagaaa ctatgcaaaa tctta 25
<210> 256
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asn133Lys
<400> 256
caaataagat tttgcatagt ttctc 25
<210> 257
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asn133Lys
<400> 257
ggatagatta gcttcctacc 20
<210> 258
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asn133Lys
<400> 258
ggatagatta gcttcctacc 20
<210> 259
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asn133Lys
<400> 259
caccgggata gattagcttc ctacc 25
<210> 260
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asn133Lys
<400> 260
caaaggtagg aagctaatct atccc 25
<210> 261
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asn133Lys
<400> 261
aaggatagat tagcttccta c 21
<210> 262
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asn133Lys
<400> 262
aaggatagat tagcttccta c 21
<210> 263
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asn133Lys
<400> 263
caccgaagga tagattagct tcctac 26
<210> 264
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asn133Lys
<400> 264
caaagtagga agctaatcta tccttc 26
<210> 265
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg135Gly
<400> 265
aactatgcaa aatcttaatg 20
<210> 266
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg135Gly
<400> 266
aactatgcaa aatcttaatg 20
<210> 267
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg135Gly
<400> 267
caccgaacta tgcaaaatct taatg 25
<210> 268
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg135Gly
<400> 268
caaacattaa gattttgcat agttc 25
<210> 269
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg135Gly
<400> 269
actatgcaaa atcttaatga 20
<210> 270
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg135Gly
<400> 270
actatgcaaa atcttaatga 20
<210> 271
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg135Gly
<400> 271
caccgactat gcaaaatctt aatga 25
<210> 272
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg135Gly
<400> 272
caaatcatta agattttgca tagtc 25
<210> 273
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg135Gly
<400> 273
ggtaggaagc taatccatca 20
<210> 274
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg135Gly
<400> 274
tgatggatta gcttcctacc 20
<210> 275
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg135Gly
<400> 275
caccgtgatg gattagcttc ctacc 25
<210> 276
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg135Gly
<400> 276
caaaggtagg aagctaatcc atcac 25
<210> 277
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg135Gly
<400> 277
aatgatggat tagcttccta c 21
<210> 278
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg135Gly
<400> 278
aatgatggat tagcttccta c 21
<210> 279
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg135Gly
<400> 279
caccgaatga tggattagct tcctac 26
<210> 280
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg135Gly
<400> 280
caaagtagga agctaatcca tcattc 26
<210> 281
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg135Ile
<400> 281
tgatatatta gcttcctacc 20
<210> 282
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg135Ile
<400> 282
tgatatatta gcttcctacc 20
<210> 283
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg135Ile
<400> 283
caccgtgata tattagcttc ctacc 25
<210> 284
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg135Ile
<400> 284
caaaggtagg aagctaatat atcac 25
<210> 285
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg135Ile
<400> 285
aatgatatat tagcttccta c 21
<210> 286
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg135Ile
<400> 286
aatgatatat tagcttccta c 21
<210> 287
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg135Ile
<400> 287
caccgaatga tatattagct tcctac 26
<210> 288
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg135Ile
<400> 288
caaagtagga agctaatata tcattc 26
<210> 289
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg135Thr
<400> 289
tgatacatta gcttcctacc 20
<210> 290
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg135Thr
<400> 290
tgatacatta gcttcctacc 20
<210> 291
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg135Thr
<400> 291
caccgtgata cattagcttc ctacc 25
<210> 292
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg135Thr
<400> 292
caaaggtagg aagctaatgt atcac 25
<210> 293
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg135Thr
<400> 293
aatgatacat tagcttccta c 21
<210> 294
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg135Thr
<400> 294
aatgatacat tagcttccta c 21
<210> 295
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg135Thr
<400> 295
caccgaatga tacattagct tcctac 26
<210> 296
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg135Thr
<400> 296
caaagtagga agctaatgta tcattc 26
<210> 297
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg135Ser
<400> 297
tgatagctta gcttcctacc 20
<210> 298
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg135Ser
<400> 298
tgatagctta gcttcctacc 20
<210> 299
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg135Ser
<400> 299
caccgtgata gcttagcttc ctacc 25
<210> 300
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg135Ser
<400> 300
caaaggtagg aagctaagct atcac 25
<210> 301
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg135Ser
<400> 301
atgatagctt agcttcctac 20
<210> 302
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg135Ser
<400> 302
atgatagctt agcttcctac 20
<210> 303
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg135Ser
<400> 303
caccgatgat agcttagctt cctac 25
<210> 304
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg135Ser
<400> 304
caaagtagga agctaagcta tcatc 25
<210> 305
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ala137Pro
<400> 305
tcctacctgg ataaggtgcg 20
<210> 306
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ala137Pro
<400> 306
cgcaccttat ccaggtagga 20
<210> 307
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ala137Pro
<400> 307
caccgcgcac cttatccagg tagga 25
<210> 308
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ala137Pro
<400> 308
caaatcctac ctggataagg tgcgc 25
<210> 309
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ala137Pro
<400> 309
tgatagatta ccttcctacc 20
<210> 310
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ala137Pro
<400> 310
tgatagatta ccttcctacc 20
<210> 311
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ala137Pro
<400> 311
caccgtgata gattaccttc ctacc 25
<210> 312
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ala137Pro
<400> 312
caaaggtagg aaggtaatct atcac 25
<210> 313
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ala137Pro
<400> 313
aatgatagat taccttccta c 21
<210> 314
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ala137Pro
<400> 314
aatgatagat taccttccta c 21
<210> 315
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ala137Pro
<400> 315
caccgaatga tagattacct tcctac 26
<210> 316
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ala137Pro
<400> 316
caaagtagga aggtaatcta tcattc 26
<210> 317
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu140Arg
<400> 317
atgatagatt agcttcctac 20
<210> 318
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu140Arg
<400> 318
atgatagatt agcttcctac 20
<210> 319
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu140Arg
<400> 319
caccgatgat agattagctt cctac 25
<210> 320
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu140Arg
<400> 320
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<210> 321
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu140Arg
<400> 321
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<210> 322
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu140Arg
<400> 322
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<210> 323
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu140Arg
<400> 323
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<210> 324
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu140Arg
<400> 324
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<210> 325
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val143Leu
<400> 325
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<210> 326
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val143Leu
<400> 326
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val143Leu
<400> 327
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val143Leu
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val143Leu
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val143Leu
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Lle391_Leu399dup
<400> 334
gcacagctgc atcagcaacc 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Lle391_Leu399dup
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Lle391_Leu399dup
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> Ile 426Val
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ile 426Val
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ile 426Val
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ile 426Val
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Ile 426Val
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ile 426Val
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ile 426Val
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ile 426Ser
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ile 426Ser
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Ile 426Ser
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ile 426Ser
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ile 426Ser
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ile 426Ser
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ile 426Ser
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ile 426Ser
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caaaggagct ggaggttgag acctc 25
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Tyr429Asp
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cggtctcaat ctccagctcc 20
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Tyr429Asp
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caccgcggtc tcaatctcca gctcc 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Tyr429Asp
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Tyr429Cys
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Tyr429Cys
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Tyr429Cys
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Tyr429Cys
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg430Pro
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg430Pro
<400> 362
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg430Pro
<400> 363
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<210> 364
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg430Pro
<400> 364
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg430Pro
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gcctgctgga cggggaggcc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg430Pro
<400> 366
ggcctccccg tccagcaggc 20
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg430Pro
<400> 367
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg430Pro
<400> 368
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg430Pro
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<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg430Pro
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg430Pro
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<210> 372
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg430Pro
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg430Pro
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acccccgcct gctggacggg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg430Pro
<400> 374
cccgtccagc aggcgggggt 20
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg430Pro
<400> 375
caccgcccgt ccagcaggcg ggggt 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg430Pro
<400> 376
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu433Arg
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu433Arg
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ttgagaccta ccgccgcctg 20
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu433Arg
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu433Arg
<400> 380
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu433Arg
<400> 381
gcgggacggg gaggcccaag 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu433Arg
<400> 382
cttgggcctc cccgtcccgc 20
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu433Arg
<400> 383
caccgcttgg gcctccccgt cccgc 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu433Arg
<400> 384
caaagcggga cggggaggcc caagc 25
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu433Arg
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gcctgcggga cggggaggcc c 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu433Arg
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gcctgcggga cggggaggcc c 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu433Arg
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caccggcctg cgggacgggg aggccc 26
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<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu433Arg
<400> 388
caaagggcct ccccgtcccg caggcc 26
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg555Gln
<400> 389
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg555Gln
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg555Gln
<400> 391
caccgaagag tctgctctgt tctct 25
<210> 392
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg555Gln
<400> 392
caaaagagaa cagagcagac tcttc 25
<210> 393
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg555Gln
<400> 393
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<210> 394
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg555Gln
<400> 394
ccaagagaac agagcagact c 21
<210> 395
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg555Gln
<400> 395
caccgccaag agaacagagc agactc 26
<210> 396
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg555Gln
<400> 396
caaagagtct gctctgttct cttggc 26
<210> 397
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg124Cys
<400> 397
tcagctgtac acggactgca 20
<210> 398
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg124Cys
<400> 398
tcagctgtac acggactgca 20
<210> 399
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg124Cys
<400> 399
caccgtcagc tgtacacgga ctgca 25
<210> 400
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg124Cys
<400> 400
caaatgcagt ccgtgtacag ctgac 25
<210> 401
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg124Cys
<400> 401
ctgtacacgg actgcacgga ga 22
<210> 402
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg124Cys
<400> 402
tctccgtgca gtccgtgtac ag 22
<210> 403
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg124Cys
<400> 403
caccgtctcc gtgcagtccg tgtacag 27
<210> 404
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg124Cys
<400> 404
caaactgtac acggactgca cggagac 27
<210> 405
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val505Asp
<400> 405
ccccccaatg gggactgaca 20
<210> 406
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val505Asp
<400> 406
ccccccaatg gggactgaca 20
<210> 407
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val505Asp
<400> 407
caccgccccc caatggggac tgaca 25
<210> 408
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val505Asp
<400> 408
caaatgtcag tccccattgg ggggc 25
<210> 409
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val505Asp
<400> 409
cccccccaat ggggactgac 20
<210> 410
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val505Asp
<400> 410
cccccccaat ggggactgac 20
<210> 411
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val505Asp
<400> 411
caccgccccc ccaatgggga ctgac 25
<210> 412
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val505Asp
<400> 412
caaagtcagt ccccattggg ggggc 25
<210> 413
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ile522Asn
<400> 413
accagtctgc aggactgacg 20
<210> 414
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ile522Asn
<400> 414
cgtcagtcct gcagactggt 20
<210> 415
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ile522Asn
<400> 415
caccgcgtca gtcctgcaga ctggt 25
<210> 416
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ile522Asn
<400> 416
caaaaccagt ctgcaggact gacgc 25
<210> 417
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu569Arg
<400> 417
ccaaggaact tgccaacatc 20
<210> 418
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu569Arg
<400> 418
ccaaggaact tgccaacatc 20
<210> 419
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu569Arg
<400> 419
caccgccaag gaacttgcca acatc 25
<210> 420
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu569Arg
<400> 420
caaagatgtt ggcaagttcc ttggc 25
<210> 421
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu569Arg
<400> 421
acatccggaa ataccacatt 20
<210> 422
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu569Arg
<400> 422
aatgtggtat ttccggatgt 20
<210> 423
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu569Arg
<400> 423
caccgaatgt ggtatttccg gatgt 25
<210> 424
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu569Arg
<400> 424
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<210> 425
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> His572Arg
<400> 425
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<210> 426
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> His572Arg
<400> 426
aacatcctga aataccgcat 20
<210> 427
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> His572Arg
<400> 427
caccgaacat cctgaaatac cgcat 25
<210> 428
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> His572Arg
<400> 428
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<210> 429
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> His572Arg
<400> 429
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<210> 430
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> His572Arg
<400> 430
ttcatcacca atgcggtatt t 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> His572Arg
<400> 431
caccgttcat caccaatgcg gtattt 26
<210> 432
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> His572Arg
<400> 432
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<210> 433
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp214Tyr
<400> 433
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<210> 434
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp214Tyr
<400> 434
caatggcaac tgcttcatcc 20
<210> 435
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp214Tyr
<400> 435
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<210> 436
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp214Tyr
<400> 436
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<210> 437
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp214Tyr
<400> 437
caatggctac tgcttcatcc 20
<210> 438
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp214Tyr
<400> 438
caatggctac tgcttcatcc 20
<210> 439
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp214Tyr
<400> 439
caccgcaatg gctactgctt catcc 25
<210> 440
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp214Tyr
<400> 440
caaaggatga agcagtagcc attgc 25
<210> 441
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg496Trp
<400> 441
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<210> 442
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg496Trp
<400> 442
gaccctgttc acgatggact 20
<210> 443
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg496Trp
<400> 443
caccggaccc tgttcacgat ggact 25
<210> 444
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg496Trp
<400> 444
caaaagtcca tcgtgaacag ggtcc 25
<210> 445
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Pro501Thr
<400> 445
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<210> 446
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Pro501Thr
<400> 446
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Pro501Thr
<400> 447
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<210> 448
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Pro501Thr
<400> 448
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<210> 449
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg514Pro
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<210> 450
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg514Pro
<400> 450
gatggaacta attacctaaa 20
<210> 451
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg514Pro
<400> 451
caccggatgg aactaattac ctaaa 25
<210> 452
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg514Pro
<400> 452
caaatttagg taattagttc catcc 25
<210> 453
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg514Pro
<400> 453
tgaagggaga caatcccttt 20
<210> 454
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg514Pro
<400> 454
tgaagggaga caatcccttt 20
<210> 455
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg514Pro
<400> 455
caccgtgaag ggagacaatc ccttt 25
<210> 456
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg514Pro
<400> 456
caaaaaaggg attgtctccc ttcac 25
<210> 457
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Phe515Leu
<400> 457
tgaagggaga caatcgctta 20
<210> 458
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Phe515Leu
<400> 458
tgaagggaga caatcgctta 20
<210> 459
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Phe515Leu
<400> 459
caccgtgaag ggagacaatc gctta 25
<210> 460
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Phe515Leu
<400> 460
caaataagcg attgtctccc ttcac 25
<210> 461
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Phe515Leu
<400> 461
ttaaggtaat tagttccatc c 21
<210> 462
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Phe515Leu
<400> 462
ttaaggtaat tagttccatc c 21
<210> 463
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Phe515Leu
<400> 463
caccgttaag gtaattagtt ccatcc 26
<210> 464
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Phe515Leu
<400> 464
caaaggatgg aactaattac cttaac 26
<210> 465
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu518Pro
<400> 465
gtagctgcca tccagtctgc 20
<210> 466
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu518Pro
<400> 466
gcagactgga tggcagctac 20
<210> 467
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu518Pro
<400> 467
caccggcaga ctggatggca gctac 25
<210> 468
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu518Pro
<400> 468
caaagtagct gccatccagt ctgcc 25
<210> 469
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu518Arg
<400> 469
tgtgtgtgta tctacagcat 20
<210> 470
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu518Arg
<400> 470
tgtgtgtgta tctacagcat 20
<210> 471
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu518Arg
<400> 471
caccgtgtgt gtgtatctac agcat 25
<210> 472
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu518Arg
<400> 472
caaaatgctg tagatacaca cacac 25
<210> 473
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu527Arg
<400> 473
ctgccatcca gtctgcagga 20
<210> 474
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu527Arg
<400> 474
ctgccatcca gtctgcagga 20
<210> 475
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu527Arg
<400> 475
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<210> 476
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu527Arg
<400> 476
caaatcctgc agactggatg gcagc 25
<210> 477
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu527Arg
<400> 477
catccagtct gcaggacgga 20
<210> 478
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu527Arg
<400> 478
catccagtct gcaggacgga 20
<210> 479
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu527Arg
<400> 479
caccgcatcc agtctgcagg acgga 25
<210> 480
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu527Arg
<400> 480
caaatccgtc ctgcagactg gatgc 25
<210> 481
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu527Arg
<400> 481
tctgcaggac ggacggagac c 21
<210> 482
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu527Arg
<400> 482
ggtctccgtc cgtcctgcag a 21
<210> 483
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu527Arg
<400> 483
caccgggtct ccgtccgtcc tgcaga 26
<210> 484
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu527Arg
<400> 484
caaatctgca ggacggacgg agaccc 26
<210> 485
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thr538Pro
<400> 485
agtctttgct cccacaaatg 20
<210> 486
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thr538Pro
<400> 486
catttgtggg agcaaagact 20
<210> 487
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thr538Pro
<400> 487
caccgcattt gtgggagcaa agact 25
<210> 488
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thr538Pro
<400> 488
caaaagtctt tgctcccaca aatgc 25
<210> 489
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thr538Pro
<400> 489
ggaaggagtc tacccagtct 20
<210> 490
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thr538Pro
<400> 490
agactgggta gactccttcc 20
<210> 491
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thr538Pro
<400> 491
caccgagact gggtagactc cttcc 25
<210> 492
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thr538Pro
<400> 492
caaaggaagg agtctaccca gtctc 25
<210> 493
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thr538Pro
<400> 493
aaccgggaag gagtctaccc a 21
<210> 494
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thr538Pro
<400> 494
tgggtagact ccttcccggt t 21
<210> 495
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thr538Pro
<400> 495
caccgtgggt agactccttc ccggtt 26
<210> 496
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thr538Pro
<400> 496
caaaaaccgg gaaggagtct acccac 26
<210> 497
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thr538Arg
<400> 497
ctttgctccc acaaatgaag 20
<210> 498
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thr538Arg
<400> 498
cttcatttgt gggagcaaag 20
<210> 499
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thr538Arg
<400> 499
caccgcttca tttgtgggag caaag 25
<210> 500
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thr538Arg
<400> 500
caaactttgc tcccacaaat gaagc 25
<210> 501
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thr538Arg
<400> 501
ggaaggagtc tacagagtct 20
<210> 502
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thr538Arg
<400> 502
agactctgta gactccttcc 20
<210> 503
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thr538Arg
<400> 503
caccgagact ctgtagactc cttcc 25
<210> 504
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thr538Arg
<400> 504
caaaggaagg agtctacaga gtctc 25
<210> 505
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thr538Arg
<400> 505
aaccgggaag gagtctacag a 21
<210> 506
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thr538Arg
<400> 506
tctgtagact ccttcccggt t 21
<210> 507
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thr538Arg
<400> 507
caccgtctgt agactccttc ccggtt 26
<210> 508
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thr538Arg
<400> 508
caaaaaccgg gaaggagtct acagac 26
<210> 509
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val539Asp
<400> 509
ggaaggagtc tacacagact 20
<210> 510
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val539Asp
<400> 510
agtctgtgta gactccttcc 20
<210> 511
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val539Asp
<400> 511
caccgagtct gtgtagactc cttcc 25
<210> 512
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val539Asp
<400> 512
caaaggaagg agtctacaca gactc 25
<210> 513
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Phe540del
<400> 513
ggaaggagtc tacacagtcg 20
<210> 514
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Phe540del
<400> 514
cgactgtgta gactccttcc 20
<210> 515
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Phe540del
<400> 515
caccgcgact gtgtagactc cttcc 25
<210> 516
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Phe540del
<400> 516
caaaggaagg agtctacaca gtcgc 25
<210> 517
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asn544Ser
<400> 517
caagtgaagc cttccgagcc 20
<210> 518
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asn544Ser
<400> 518
ggctcggaag gcttcacttg 20
<210> 519
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asn544Ser
<400> 519
caccgggctc ggaaggcttc acttg 25
<210> 520
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asn544Ser
<400> 520
caaacaagtg aagccttccg agccc 25
<210> 521
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ala546Thr
<400> 521
caaatgaaac cttccgagcc 20
<210> 522
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ala546Thr
<400> 522
ggctcggaag gtttcatttg 20
<210> 523
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ala546Thr
<400> 523
caccgggctc ggaaggtttc atttg 25
<210> 524
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ala546Thr
<400> 524
caaacaaatg aaaccttccg agccc 25
<210> 525
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ala546Asp
<400> 525
caaatgaaga cttccgagcc 20
<210> 526
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ala546Asp
<400> 526
ggctcggaag tcttcatttg 20
<210> 527
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ala546Asp
<400> 527
caccgggctc ggaagtcttc atttg 25
<210> 528
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ala546Asp
<400> 528
caaacaaatg aagacttccg agccc 25
<210> 529
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Phe547Ser
<400> 529
gagccctgcc accaagagaa 20
<210> 530
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Phe547Ser
<400> 530
ttctcttggt ggcagggctc 20
<210> 531
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Phe547Ser
<400> 531
caccgttctc ttggtggcag ggctc 25
<210> 532
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Phe547Ser
<400> 532
caaagagccc tgccaccaag agaac 25
<210> 533
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Phe547Ser
<400> 533
cgagccctgc caccaagaga 20
<210> 534
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Phe547Ser
<400> 534
tctcttggtg gcagggctcg 20
<210> 535
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Phe547Ser
<400> 535
caccgtctct tggtggcagg gctcg 25
<210> 536
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Phe547Ser
<400> 536
caaacgagcc ctgccaccaa gagac 25
<210> 537
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Pro551Gln
<400> 537
gcaaccaaga gaacggagca 20
<210> 538
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Pro551Gln
<400> 538
tgctccgttc tcttggttgc 20
<210> 539
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Pro551Gln
<400> 539
caccgtgctc cgttctcttg gttgc 25
<210> 540
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Pro551Gln
<400> 540
caaagcaacc aagagaacgg agcac 25
<210> 541
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu558Pro
<400> 541
ttgggtaaag accaacttaa 20
<210> 542
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu558Pro
<400> 542
ttaagttggt ctttacccaa 20
<210> 543
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu558Pro
<400> 543
caccgttaag ttggtcttta cccaa 25
<210> 544
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu558Pro
<400> 544
caaattgggt aaagaccaac ttaac 25
<210> 545
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu558Pro
<400> 545
tacttaagtt ggtctttacc c 21
<210> 546
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu558Pro
<400> 546
gggtaaagac caacttaagt a 21
<210> 547
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu558Pro
<400> 547
caccggggta aagaccaact taagta 26
<210> 548
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu558Pro
<400> 548
caaatactta agttggtctt tacccc 26
<210> 549
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu558Pro
<400> 549
aagagaacgg agcagaccct 20
<210> 550
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu558Pro
<400> 550
aagagaacgg agcagaccct 20
<210> 551
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu558Pro
<400> 551
caccgaagag aacggagcag accct 25
<210> 552
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu558Pro
<400> 552
caaaagggtc tgctccgttc tcttc 25
<210> 553
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu558Pro
<400> 553
ccaagagaac ggagcagacc c 21
<210> 554
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu558Pro
<400> 554
ccaagagaac ggagcagacc c 21
<210> 555
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu558Pro
<400> 555
caccgccaag agaacggagc agaccc 26
<210> 556
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu558Pro
<400> 556
caaagggtct gctccgttct cttggc 26
<210> 557
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> His572del
<400> 557
gccaacatcc tgaaatacat 20
<210> 558
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> His572del
<400> 558
gccaacatcc tgaaatacat 20
<210> 559
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> His572del
<400> 559
caccggccaa catcctgaaa tacat 25
<210> 560
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> His572del
<400> 560
caaaatgtat ttcaggatgt tggcc 25
<210> 561
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> His572del
<400> 561
aaatacattg gtgatgaaa 19
<210> 562
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> His572del
<400> 562
tttcatcacc aatgtattt 19
<210> 563
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> His572del
<400> 563
caccgtttca tcaccaatgt attt 24
<210> 564
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> His572del
<400> 564
caaaaaatac attggtgatg aaac 24
<210> 565
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gly594Val
<400> 565
agttgacaag ctggaagtca 20
<210> 566
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gly594Val
<400> 566
tgacttccag cttgtcaact 20
<210> 567
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gly594Val
<400> 567
caccgtgact tccagcttgt caact 25
<210> 568
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gly594Val
<400> 568
caaaagttga caagctggaa gtcac 25
<210> 569
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val613del
<400> 569
gacatcatgg ccacaaaatg 20
<210> 570
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val613del
<400> 570
cattttgtgg ccatgatgtc 20
<210> 571
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val613del
<400> 571
caccgcattt tgtggccatg atgtc 25
<210> 572
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val613del
<400> 572
caaagacatc atggccacaa aatgc 25
<210> 573
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val613Gly
<400> 573
ggtgccgagc ctgacatcat 20
<210> 574
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val613Gly
<400> 574
atgatgtcag gctcggcacc 20
<210> 575
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val613Gly
<400> 575
caccgatgat gtcaggctcg gcacc 25
<210> 576
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val613Gly
<400> 576
caaaggtgcc gagcctgaca tcatc 25
<210> 577
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val613Gly
<400> 577
gtgagtgtca acaaggagcc 20
<210> 578
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val613Gly
<400> 578
gtgagtgtca acaaggagcc 20
<210> 579
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val613Gly
<400> 579
caccggtgag tgtcaacaag gagcc 25
<210> 580
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val613Gly
<400> 580
caaaggctcc ttgttgacac tcacc 25
<210> 581
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Met619Lys
<400> 581
gacatcaagg ccacaaatgg 20
<210> 582
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Met619Lys
<400> 582
ccatttgtgg ccttgatgtc 20
<210> 583
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Met619Lys
<400> 583
caccgccatt tgtggccttg atgtc 25
<210> 584
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Met619Lys
<400> 584
caaagacatc aaggccacaa atggc 25
<210> 585
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ala620Asp
<400> 585
cctgacatca tggacacaaa 20
<210> 586
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ala620Asp
<400> 586
cctgacatca tggacacaaa 20
<210> 587
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ala620Asp
<400> 587
caccgcctga catcatggac acaaa 25
<210> 588
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ala620Asp
<400> 588
caaatttgtg tccatgatgt caggc 25
<210> 589
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asn622His
<400> 589
cctgacatca tggccacaca 20
<210> 590
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asn622His
<400> 590
cctgacatca tggccacaca 20
<210> 591
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asn622His
<400> 591
caccgcctga catcatggcc acaca 25
<210> 592
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asn622His
<400> 592
caaatgtgtg gccatgatgt caggc 25
<210> 593
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asn622Lys
<400> 593
catcatggcc acaaaaggcg 20
<210> 594
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asn622Lys
<400> 594
catcatggcc acaaaaggcg 20
<210> 595
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asn622Lys
<400> 595
caccgcatca tggccacaaa aggcg 25
<210> 596
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asn622Lys
<400> 596
caaacgcctt ttgtggccat gatgc 25
<210> 597
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asn622Lys
<400> 597
ccctgacatc atggccacaa 20
<210> 598
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asn622Lys
<400> 598
ccctgacatc atggccacaa 20
<210> 599
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asn622Lys
<400> 599
caccgccctg acatcatggc cacaa 25
<210> 600
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asn622Lys
<400> 600
caaattgtgg ccatgatgtc agggc 25
<210> 601
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asn622Lys
<400> 601
catcatggcc acaaagggcg 20
<210> 602
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asn622Lys
<400> 602
catcatggcc acaaagggcg 20
<210> 603
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asn622Lys
<400> 603
caccgcatca tggccacaaa gggcg 25
<210> 604
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asn622Lys
<400> 604
caaacgccct ttgtggccat gatgc 25
<210> 605
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gly623Arg
<400> 605
catcatggcc acaaatcgcg 20
<210> 606
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gly623Arg
<400> 606
catcatggcc acaaatcgcg 20
<210> 607
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gly623Arg
<400> 607
caccgcatca tggccacaaa tcgcg 25
<210> 608
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gly623Arg
<400> 608
caaacgcgat ttgtggccat gatgc 25
<210> 609
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gly623Asp
<400> 609
catcatggcc acaaatgacg 20
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<211> 20
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> Arg124Ser
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Arg124Ser
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp123delins
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Arg124His
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Arg124His
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Arg124His
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg124His
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg124Leu
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tcagctgtac acggacctca 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg124Leu
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tcagctgtac acggacctca 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg124Leu
<400> 687
caccgtcagc tgtacacgga cctca 25
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg124Leu
<400> 688
caaatgaggt ccgtgtacag ctgac 25
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg124Leu
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg124Leu
<400> 690
tctccgtgag gtccgtgtac ag 22
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<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg124Leu
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caccgtctcc gtgaggtccg tgtacag 27
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu509Pro
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aagggagaca atcgctttag 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu509Pro
<400> 694
ctaaagcgat tgtctccctt 20
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu509Pro
<400> 695
caccgctaaa gcgattgtct ccctt 25
<210> 696
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu509Pro
<400> 696
caaaaaggga gacaatcgct ttagc 25
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu509Pro
<400> 697
gactgtcatg gatgtcccga 20
<210> 698
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu509Pro
<400> 698
gactgtcatg gatgtcccga 20
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu509Pro
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caccggactg tcatggatgt cccga 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu509Pro
<400> 700
caaatcggga catccatgac agtcc 25
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu103_Ser104del
<400> 702
tcccagggtc tcgtaaaggt 20
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu103_Ser104del
<400> 703
caccgtccca gggtctcgta aaggt 25
<210> 704
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu103_Ser104del
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caaaaccttt acgagaccct gggac 25
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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ctcaaacctt tacgagaccc 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu103_Ser104del
<400> 706
gggtctcgta aaggtttgag 20
<210> 707
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu103_Ser104del
<400> 707
caccggggtc tcgtaaaggt ttgag 25
<210> 708
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu103_Ser104del
<400> 708
caaactcaaa cctttacgag acccc 25
<210> 709
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val113Ile
<400> 709
tacgagaccc tgggagtcat 20
<210> 710
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val113Ile
<400> 710
tacgagaccc tgggagtcat 20
<210> 711
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val113Ile
<400> 711
caccgtacga gaccctggga gtcat 25
<210> 712
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val113Ile
<400> 712
caaaatgact cccagggtct cgtac 25
<210> 713
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val113Ile
<400> 713
ttacgagacc ctgggagtca 20
<210> 714
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val113Ile
<400> 714
ttacgagacc ctgggagtca 20
<210> 715
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val113Ile
<400> 715
caccgttacg agaccctggg agtca 25
<210> 716
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val113Ile
<400> 716
caaatgactc ccagggtctc gtaac 25
<210> 717
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp123His
<400> 717
tcagctgtac acgcaccgca 20
<210> 718
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp123His
<400> 718
tcagctgtac acgcaccgca 20
<210> 719
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp123His
<400> 719
caccgtcagc tgtacacgca ccgca 25
<210> 720
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp123His
<400> 720
caaatgcggt gcgtgtacag ctgac 25
<210> 721
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp123His
<400> 721
ctgtacacgc accgcacgga g 21
<210> 722
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp123His
<400> 722
ctccgtgcgg tgcgtgtaca g 21
<210> 723
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp123His
<400> 723
caccgctccg tgcggtgcgt gtacag 26
<210> 724
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp123His
<400> 724
caaactgtac acgcaccgca cggagc 26
<210> 725
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg124Leu
<400> 725
tcagctgtac acggacctca 20
<210> 726
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg124Leu
<400> 726
tcagctgtac acggacctca 20
<210> 727
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg124Leu
<400> 727
caccgtcagc tgtacacgga cctca 25
<210> 728
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg124Leu
<400> 728
caaatgaggt ccgtgtacag ctgac 25
<210> 729
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thr125_Glu126del
<400> 729
caagctgagg cctgagatgg 20
<210> 730
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thr125_Glu126del
<400> 730
ccatctcagg cctcagcttg 20
<210> 731
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thr125_Glu126del
<400> 731
caccgccatc tcaggcctca gcttg 25
<210> 732
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thr125_Glu126del
<400> 732
caaacaagct gaggcctgag atggc 25
<210> 733
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thr125_Glu126del
<400> 733
ctgtacacgg accgcaagct g 21
<210> 734
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thr125_Glu126del
<400> 734
cagcttgcgg tccgtgtaca g 21
<210> 735
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thr125_Glu126del
<400> 735
caccgcagct tgcggtccgt gtacag 26
<210> 736
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thr125_Glu126del
<400> 736
caaactgtac acggaccgca agctgc 26
<210> 737
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ala97Thr
<400> 737
gtcctggctg tgcacgggac 20
<210> 738
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ala97Thr
<400> 738
gtcctggctg tgcacgggac 20
<210> 739
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ala97Thr
<400> 739
caccggtcct ggctgtgcac gggac 25
<210> 740
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ala97Thr
<400> 740
caaagtcccg tgcacagcca ggacc 25
<210> 741
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gly98Ser
<400> 741
tgtgcacggg gccagtaatt 20
<210> 742
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gly98Ser
<400> 742
tgtgcacggg gccagtaatt 20
<210> 743
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gly98Ser
<400> 743
caccgtgtgc acggggccag taatt 25
<210> 744
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gly98Ser
<400> 744
caaaaattac tggccccgtg cacac 25
<210> 745
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asn102Ser
<400> 745
gtaatttggt cagcacttac 20
<210> 746
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asn102Ser
<400> 746
gtaagtgctg accaaattac 20
<210> 747
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asn102Ser
<400> 747
caccggtaag tgctgaccaa attac 25
<210> 748
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asn102Ser
<400> 748
caaagtaatt tggtcagcac ttacc 25
<210> 749
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp112Asn
<400> 749
tccaagggca ttaaccacaa a 21
<210> 750
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp112Asn
<400> 750
tccaagggca ttaaccacaa a 21
<210> 751
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp112Asn
<400> 751
caccgtccaa gggcattaac cacaaa 26
<210> 752
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp112Asn
<400> 752
caaatttgtg gttaatgccc ttggac 26
<210> 753
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp112Asn
<400> 753
agggcattaa ccacaaaaag 20
<210> 754
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp112Asn
<400> 754
ctttttgtgg ttaatgccct 20
<210> 755
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp112Asn
<400> 755
caccgctttt tgtggttaat gccct 25
<210> 756
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp112Asn
<400> 756
caaaagggca ttaaccacaa aaagc 25
<210> 757
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp112Gly
<400> 757
tatgactttt ccaagggcat 20
<210> 758
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp112Gly
<400> 758
tatgactttt ccaagggcat 20
<210> 759
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp112Gly
<400> 759
caccgtatga cttttccaag ggcat 25
<210> 760
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp112Gly
<400> 760
caaaatgccc ttggaaaagt catac 25
<210> 761
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp112Gly
<400> 761
agggcattgg ccacaaaaag 20
<210> 762
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp112Gly
<400> 762
ctttttgtgg ccaatgccct 20
<210> 763
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp112Gly
<400> 763
caccgctttt tgtggccaat gccct 25
<210> 764
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp112Gly
<400> 764
caaaagggca ttggccacaa aaagc 25
<210> 765
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp112Gly
<400> 765
tccaagggca ttggccacaa a 21
<210> 766
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp112Gly
<400> 766
tccaagggca ttggccacaa a 21
<210> 767
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp112Gly
<400> 767
caccgtccaa gggcattggc cacaaa 26
<210> 768
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp112Gly
<400> 768
caaatttgtg gccaatgccc ttggac 26
<210> 769
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp118Gly
<400> 769
attgaccaca aaaagagtga 20
<210> 770
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp118Gly
<400> 770
attgaccaca aaaagagtga 20
<210> 771
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp118Gly
<400> 771
caccgattga ccacaaaaag agtga 25
<210> 772
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp118Gly
<400> 772
caaatcactc tttttgtggt caatc 25
<210> 773
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp118Gly
<400> 773
gagtgatggc aggacacttg 20
<210> 774
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp118Gly
<400> 774
gagtgatggc aggacacttg 20
<210> 775
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp118Gly
<400> 775
caccggagtg atggcaggac acttg 25
<210> 776
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp118Gly
<400> 776
caaacaagtg tcctgccatc actcc 25
<210> 777
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp118Gly
<400> 777
tgatggcagg acacttgtgg a 21
<210> 778
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp118Gly
<400> 778
tgatggcagg acacttgtgg a 21
<210> 779
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp118Gly
<400> 779
caccgtgatg gcaggacact tgtgga 26
<210> 780
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp118Gly
<400> 780
caaatccaca agtgtcctgc catcac 26
<210> 781
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg119Gly
<400> 781
gaccacaaaa agagtgatga 20
<210> 782
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg119Gly
<400> 782
gaccacaaaa agagtgatga 20
<210> 783
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg119Gly
<400> 783
caccggacca caaaaagagt gatga 25
<210> 784
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg119Gly
<400> 784
caaatcatca ctctttttgt ggtcc 25
<210> 785
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg119Gly
<400> 785
gagtgatgac gggacacttg 20
<210> 786
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg119Gly
<400> 786
gagtgatgac gggacacttg 20
<210> 787
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg119Gly
<400> 787
caccggagtg atgacgggac acttg 25
<210> 788
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg119Gly
<400> 788
caaacaagtg tcccgtcatc actcc 25
<210> 789
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg119Gly
<400> 789
gatgacggga cacttgtgga 20
<210> 790
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg119Gly
<400> 790
gatgacggga cacttgtgga 20
<210> 791
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg119Gly
<400> 791
caccggatga cgggacactt gtgga 25
<210> 792
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arg119Gly
<400> 792
caaatccaca agtgtcccgt catcc 25
<210> 793
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu121Val
<400> 793
gagtgatgac aggacagttg 20
<210> 794
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu121Val
<400> 794
gagtgatgac aggacagttg 20
<210> 795
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu121Val
<400> 795
caccggagtg atgacaggac agttg 25
<210> 796
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu121Val
<400> 796
caaacaactg tcctgtcatc actcc 25
<210> 797
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu121Val
<400> 797
tgatgacagg acagttgtgg a 21
<210> 798
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu121Val
<400> 798
tgatgacagg acagttgtgg a 21
<210> 799
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu121Val
<400> 799
caccgtgatg acaggacagt tgtgga 26
<210> 800
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu121Val
<400> 800
caaatccaca actgtcctgt catcac 26
<210> 801
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu121Phe
<400> 801
gagtgatgac aggacatttg 20
<210> 802
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu121Phe
<400> 802
gagtgatgac aggacatttg 20
<210> 803
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu121Phe
<400> 803
caccggagtg atgacaggac atttg 25
<210> 804
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu121Phe
<400> 804
caaacaaatg tcctgtcatc actcc 25
<210> 805
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu121Phe
<400> 805
tgatgacagg acatttgtgg a 21
<210> 806
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu121Phe
<400> 806
tgatgacagg acatttgtgg a 21
<210> 807
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu121Phe
<400> 807
caccgtgatg acaggacatt tgtgga 26
<210> 808
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu121Phe
<400> 808
caaatccaca aatgtcctgt catcac 26
<210> 809
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val122Glu
<400> 809
gatgacagga cacttgagga 20
<210> 810
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val122Glu
<400> 810
gacacttgag gaccgaatct 20
<210> 811
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val122Glu
<400> 811
caccggacac ttgaggaccg aatct 25
<210> 812
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val122Glu
<400> 812
caaaagattc ggtcctcaag tgtcc 25
<210> 813
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val122Glu
<400> 813
gatgacagga cacttgagga 20
<210> 814
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val122Glu
<400> 814
gatgacagga cacttgagga 20
<210> 815
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val122Glu
<400> 815
caccggatga caggacactt gagga 25
<210> 816
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val122Glu
<400> 816
caaatcctca agtgtcctgt catcc 25
<210> 817
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val122Gly
<400> 817
aagagtgatg acaggacact 20
<210> 818
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val122Gly
<400> 818
aagagtgatg acaggacact 20
<210> 819
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val122Gly
<400> 819
caccgaagag tgatgacagg acact 25
<210> 820
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val122Gly
<400> 820
caaaagtgtc ctgtcatcac tcttc 25
<210> 821
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val122Gly
<400> 821
aagtgtcctg tcatcactct 20
<210> 822
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val122Gly
<400> 822
agagtgatga caggacactt 20
<210> 823
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val122Gly
<400> 823
caccgagagt gatgacagga cactt 25
<210> 824
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val122Gly
<400> 824
caaaaagtgt cctgtcatca ctctc 25
<210> 825
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val122Gly
<400> 825
gacacttggg gaccgaatct 20
<210> 826
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val122Gly
<400> 826
gacacttggg gaccgaatct 20
<210> 827
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val122Gly
<400> 827
caccggacac ttggggaccg aatct 25
<210> 828
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val122Gly
<400> 828
caaaagattc ggtccccaag tgtcc 25
<210> 829
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val122Gly
<400> 829
gatgacagga cacttgggga 20
<210> 830
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val122Gly
<400> 830
gatgacagga cacttgggga 20
<210> 831
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val122Gly
<400> 831
caccggatga caggacactt gggga 25
<210> 832
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Val122Gly
<400> 832
caaatcccca agtgtcctgt catcc 25
<210> 833
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ser171Pro
<400> 833
tttctctaca caggaggtaa 20
<210> 834
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ser171Pro
<400> 834
ttacctcctg tgtagagaaa 20
<210> 835
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ser171Pro
<400> 835
caccgttacc tcctgtgtag agaaa 25
<210> 836
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ser171Pro
<400> 836
caaatttctc tacacaggag gtaac 25
<210> 837
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ser171Pro
<400> 837
gtctggcccc tttctctaca 20
<210> 838
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ser171Pro
<400> 838
tgtagagaaa ggggccagac 20
<210> 839
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ser171Pro
<400> 839
caccgtgtag agaaaggggc cagac 25
<210> 840
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ser171Pro
<400> 840
caaagtctgg cccctttctc tacac 25
<210> 841
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Tyr174Cys
<400> 841
ttctctgcac aggaggtaag 20
<210> 842
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Tyr174Cys
<400> 842
cttacctcct gtgcagagaa 20
<210> 843
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Tyr174Cys
<400> 843
caccgcttac ctcctgtgca gagaa 25
<210> 844
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Tyr174Cys
<400> 844
caaattctct gcacaggagg taagc 25
<210> 845
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thr175Ile
<400> 845
tctggctcct ttctctacat 20
<210> 846
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thr175Ile
<400> 846
tctggctcct ttctctacat 20
<210> 847
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thr175Ile
<400> 847
caccgtctgg ctcctttctc tacat 25
<210> 848
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thr175Ile
<400> 848
caaaatgtag agaaaggagc cagac 25
<210> 849
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gly177Arg
<400> 849
tctacacagg acgtaagatt 20
<210> 850
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gly177Arg
<400> 850
tctacacagg acgtaagatt 20
<210> 851
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gly177Arg
<400> 851
caccgtctac acaggacgta agatt 25
<210> 852
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gly177Arg
<400> 852
caaaaatctt acgtcctgtg tagac 25
<210> 853
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gly177Arg
<400> 853
tctacacagg aagtaagatt 20
<210> 854
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gly177Arg
<400> 854
tctacacagg aagtaagatt 20
<210> 855
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gly177Arg
<400> 855
caccgtctac acaggaagta agatt 25
<210> 856
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gly177Arg
<400> 856
caaaaatctt acttcctgtg tagac 25
<210> 857
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Lys181Arg
<400> 857
tggccgcagg aattggattc 20
<210> 858
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Lys181Arg
<400> 858
tggccgcagg aattggattc 20
<210> 859
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Lys181Arg
<400> 859
caccgtggcc gcaggaattg gattc 25
<210> 860
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Lys181Arg
<400> 860
caaagaatcc aattcctgcg gccac 25
<210> 861
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Lys181Arg
<400> 861
aggaattgga ttcaggtacg 20
<210> 862
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Lys181Arg
<400> 862
aggaattgga ttcaggtacg 20
<210> 863
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Lys181Arg
<400> 863
caccgaggaa ttggattcag gtacg 25
<210> 864
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Lys181Arg
<400> 864
caaacgtacc tgaatccaat tcctc 25
<210> 865
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu188His
<400> 865
cacatcatcc tcatcacttt 20
<210> 866
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu188His
<400> 866
cacatcatcc tcatcacttt 20
<210> 867
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu188His
<400> 867
caccgcacat catcctcatc acttt 25
<210> 868
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leu188His
<400> 868
caaaaaagtg atgaggatga tgtgc 25
<210> 869
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asn232Ser
<400> 869
gcaacaccag ggacatggag 20
<210> 870
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asn232Ser
<400> 870
ctccatgtcc ctggtgttgc 20
<210> 871
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asn232Ser
<400> 871
caccgctcca tgtccctggt gttgc 25
<210> 872
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asn232Ser
<400> 872
caaagcaaca ccagggacat ggagc 25
<210> 873
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asn233His
<400> 873
caacaccagg gacatggagt 20
<210> 874
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asn233His
<400> 874
actccatgtc cctggtgttg 20
<210> 875
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asn233His
<400> 875
caccgactcc atgtccctgg tgttg 25
<210> 876
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asn233His
<400> 876
caaacaacac cagggacatg gagtc 25
<210> 877
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asn233His
<400> 877
ttcccacaac accagggaca 20
<210> 878
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asn233His
<400> 878
tgtccctggt gttgtgggaa 20
<210> 879
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asn233His
<400> 879
caccgtgtcc ctggtgttgt gggaa 25
<210> 880
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asn233His
<400> 880
caaattccca caacaccagg gacac 25
<210> 881
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asn233His
<400> 881
cattcccaca acaccaggga c 21
<210> 882
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asn233His
<400> 882
gtccctggtg ttgtgggaat g 21
<210> 883
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asn233His
<400> 883
caccggtccc tggtgttgtg ggaatg 26
<210> 884
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asn233His
<400> 884
caaacattcc cacaacacca gggacc 26
<210> 885
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp236Glu
<400> 885
tccaacaaca ccagggaga 19
<210> 886
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp236Glu
<400> 886
tccaacaaca ccagggaga 19
<210> 887
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp236Glu
<400> 887
caccgtccaa caacaccagg gaga 24
<210> 888
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp236Glu
<400> 888
caaatctccc tggtgttgtt ggac 24
<210> 889
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp236Glu
<400> 889
tccaacaaca ccagggaga 19
<210> 890
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp236Glu
<400> 890
tccaacaaca ccagggaga 19
<210> 891
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp236Glu
<400> 891
caccgtccaa caacaccagg gaga 24
<210> 892
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp236Glu
<400> 892
caaatctccc tggtgttgtt ggac 24
<210> 893
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp240Asn
<400> 893
ccagggacat ggagtccaac 20
<210> 894
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp240Asn
<400> 894
ccagggacat ggagtccaac 20
<210> 895
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp240Asn
<400> 895
caccgccagg gacatggagt ccaac 25
<210> 896
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Asp240Asn
<400> 896
caaagttgga ctccatgtcc ctggc 25
<210> 897
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> guide sequence
<400> 897
gaactaatta ccatgctaaa 20
<210> 898
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> guide sequence
<400> 898
gagacaatcg ctttagcatg 20
Claims (56)
- 각막 이상증(corneal dystrophy)을 예방, 개선 또는 치료하는 데 사용하기 위한 CRISPR/Cas9 조성물을 위해 설계된 sgRNA 쌍(single guide RNA pair)으로서,
(i) (a) 시스(cis)에서 질환-유발 돌연변이 또는 단일-뉴클레오티드 다형태(SNP)의 3'-말단 측에, 제1 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)를 생성하는 돌연변이 또는 SNP에 대한 제1 crRNA 서열, 및
(b) tracrRNA 서열
을 포함하는 제1 sgRNA(여기서, 제1 crRNA 서열 및 tracrRNA 서열은 자연적으로 함께 발생하지 않는다); 및
(ii) (a) 시스(cis)에서 상기 질환-유발 돌연변이 또는 SNP의 5'-말단 측에, 제2 PAM을 생성하는 돌연변이 또는 SNP에 대한 제2 crRNA 서열, 및
(b) tracrRNA 서열
을 포함하는 제2 sgRNA(여기서, 제2 crRNA 서열 및 tracrRNA 서열은 자연적으로 함께 발생하지 않는다)를 포함하고,
제1 및 제2 crRNA 서열 중의 적어도 하나가 표 2에 열거된 서열들로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는, sgRNA 쌍. - 제1항에 있어서, 상기 PAM을 생성하는 돌연변이 또는 SNP가 TGFBI 유전자에 존재하는 sgRNA 쌍.
- 제1항에 있어서, 상기 PAM을 생성하는 돌연변이 또는 SNP가 TGFBI 유전자의 인트론(intron)에 존재하는 sgRNA 쌍.
- (i) Cas9 뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 분자 및 제1항의 sgRNA 쌍을 포함하는 적어도 하나의 벡터를 포함하고, 여기서 벡터에서 상기 Cas9 뉴클레아제 및 상기 sgRNA 쌍이 자연적으로 함께 발생하지 않는, 조작된 일정한 간격을 두고 주기적으로 분포하는 짧은 회문 반복서열(CRISPR)/CRISPR 결합 단백질 9(Cas9) 조성물.
- 제4항에 있어서, Cas9 뉴클레아제가 스트렙토코커스, 스타필로코커스, 또는 이들의 변이체로부터의 것인 조작된 CRISPR/Cas9 조성물.
- 제4항에 있어서, Cas9 뉴클레아제가 서열 번호 4 또는 8의 아미노산 서열을 포함하는 조작된 CRISPR/Cas9 조성물.
- 제4항에 있어서, Cas9 뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 분자가 서열 번호 3 또는 7의 뉴클레오티드 서열을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 조작된 CRISPR/Cas9 조성물.
- 제4항에 있어서, 수선(repair) 뉴클레오티드 분자를 추가로 포함하는 조작된 CRISPR/Cas9 조성물.
- 제4항에 있어서, 하나 이상의 핵 국재화 신호(NLS)를 추가로 포함하는 조작된 CRISPR/Cas9 조성물.
- 제4항에 있어서, sgRNA 및 Cas9 뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 분자가 동일한 벡터 상에 포함되는 조작된 CRISPR/Cas9 조성물.
- 제4항에 있어서, 조작된 CRISPR/Cas9 조성물을 표적 서열을 갖고 유전자 산물을 암호화하는 DNA 분자를 함유하고 발현하는 세포에 도입하는 것을 포함하는, 유전자 산물의 발현을 변경시키는 in vitro 방법에 사용하기 위한, 조작된 CRISPR/Cas9 조성물.
- 제11항에 있어서, 조작된 CRISPR/Cas9 조성물이
(a) 표적 서열과 혼성화되는 sgRNA에 작동적으로 연결된 제1 조절 요소, 및
(b) Cas9 뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 분자에 작동적으로 연결된 제2 조절 요소를 포함하고,
여기서 sgRNA가 표적 서열을 표적화하고, Cas9 뉴클레아제가 DNA 분자를 절단하는 조작된 CRISPR/Cas9 조성물. - 제11항에 있어서, 세포가 진핵 세포인 조작된 CRISPR/Cas9 조성물.
- 제11항에 있어서, 세포가 포유류 또는 인간 세포인 조작된 CRISPR/Cas9 조성물.
- 제11항에 있어서, 대상체에서 돌연변이 또는 단일-뉴클레오티드 다형태(SNP)와 관련된 질환을 예방, 개선 또는 치료하는 데 사용하기 위한 것으로서, 여기서 DNA 분자가 돌연변이 서열을 포함하는 것인, 조작된 CRISPR/Cas9 조성물.
- 제15항에 있어서,
(ii) 표적 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열에 혼성화되는 CRISPR 표적화 RNA(crRNA) 서열(여기서, 표적 서열은 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)의 5'-말단에 인접하며, 표적 서열 또는 PAM은 각막 이상증을 유발하는 돌연변이 또는 SNP를 포함한다)을 추가로 포함하며,
여기서 Cas9 뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 분자 및 crRNA 서열은 자연적으로 함께 발생하지 않는, 조작된 CRISPR/Cas9 조성물. - 제16항에 있어서, PAM이 돌연변이 또는 SNP를 포함하는 조작된 CRISPR/Cas9 조성물.
- 제16항에 있어서, crRNA 서열이 표적 서열을 포함하고, crRNA 서열이 17 내지 24개 뉴클레오티드 길이인 조작된 CRISPR/Cas9 조성물.
- 제16항에 있어서, crRNA 요소 (ii)가,
제1 표적 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열에 혼성화되는 제1 CRISPR 표적화 RNA(crRNA) 서열(제1 표적 서열은 시스에서 질환-유발 돌연변이 또는 SNP의 3'-말단 측에 제1 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)의 5'-말단에 인접하고, 여기서, 제1 표적 서열 또는 제1 PAM은 제1 선조(ancestral) 돌연변이 또는 SNP 부위를 포함한다), 및
제2 표적 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열에 혼성화되는 제2 crRNA 서열(제2 표적 서열은 시스에서 질환-유발 돌연변이 또는 SNP의 5'-말단 측에 제2 PAM의 5'-말단에 인접하고, 여기서, 제2 표적 서열 또는 제2 PAM은 제2 선조 돌연변이 또는 SNP 부위를 포함한다)
을 포함하고,
여기서 적어도 하나의 벡터가, 자연적으로 함께 발생하지 않는, Cas9 뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 crRNA 서열을 포함하는, 조작된 CRISPR/Cas9 조성물. - 제16항에 있어서, PAM 및 Cas9 뉴클레아제가 스트렙토코커스(Streptococcus) 또는 스타필로코커스(Staphylococcus)로부터의 것인 조작된 CRISPR/Cas9 조성물.
- 제16항에 있어서, PAM이 NGG 또는 NNGRRT로 이루어지고, 여기서, N이 A, T, G, 및 C 중의 어느 하나이고, R이 A 또는 G인 조작된 CRISPR/Cas9 조성물.
- 제16항에 있어서, 조작된 CRISPR/Cas9 조성물을 대상체의 각막에 도입하기 위한, 조작된 CRISPR/Cas9 조성물.
- 제16항에 있어서, 조작된 CRISPR/Cas9 조성물을 대상체의 각막에 주사하기 위한, 조작된 CRISPR/Cas9 조성물.
- 제16항에 있어서, 조작된 CRISPR/Cas9 조성물을 표적 서열을 갖는 DNA 분자를 함유하고 발현하는 대상체의 세포에 도입하기 위한, 조작된 CRISPR/Cas9 조성물.
- 제16항에 있어서, 각막 이상증이 상피세포 기저막 이상증(EBMD: Epithelial basement membrane dystrophy), 미즈만 각막 이상증(MECD: Meesmann corneal dystrophy), 티엘-벵케 각막 이상증(TBCD: Thiel-Behnke corneal dystrophy), 격자 각막 이상증(LCD: Lattice corneal dystrophy), 과립 각막 이상증(GCD: Granular corneal dystrophy), 및 슈나이더 각막 이상증(SCD: Schnyder corneal dystrophy)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 조작된 CRISPR/Cas9 조성물.
- 제16항에 있어서, SNP가 TGFBI, KRT3, KRT12, GSN, 및 UBIAD1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 유전자에 위치하는 조작된 CRISPR/Cas9 조성물.
- 제16항에 있어서, 유전자 돌연변이 또는 SNP를 포함하는 돌연변이 서열이
(i) Leu509Arg, Arg666Ser, Gly623Asp, Arg555Gln, Arg124Cys, Val505Asp, Ile522Asn, Leu569Arg, His572Arg, Arg496Trp, Pro501Thr, Arg514Pro, Phe515Leu, Leu518Pro, Leu518Arg, Leu527Arg, Thr538Pro, Thr538Arg, Val539Asp, Phe540del, Phe540Ser, Asn544Ser, Ala546Thr, Ala546Asp, Phe547Ser, Pro551Gln, Leu558Pro, His572del, Gly594Val, Val613del, Val613Gly, Met619Lys, Ala620Asp, Asn622His, Asn622Lys, Asn622Lys, Gly623Arg, Gly623Asp, Val624_Val625del, Val624Met, Val625Asp, His626Arg, His626Pro, Val627SerfsX44, Thr629_Asn630insAsnValPro, Val631Asp, Arg666Ser, Arg555Trp, Arg124Ser, Asp123delins, Arg124His, Arg124Leu, Leu509Pro, Leu103_Ser104del, Val113Ile, Asp123His, Arg124Leu, 및/또는 Thr125_Glu126del을 포함하는 돌연변이 TGFBI 단백질;
(ii) Glu498Val, Arg503Pro, 및/또는 Glu509Lys를 갖는 돌연변이 KRT3 단백질;
(iii) Met129Thr, Met129Val, Gln130Pro, Leu132Pro, Leu132Va, Leu132His, Asn133Lys, Arg135Gly, Arg135Ile, Arg135Thr, Arg135Ser, Ala137Pro, Leu140Arg, Val143Leu, Val143Leu, Lle391_Leu399dup, Ile 426Val, Ile 426Ser, Tyr429Asp, Tyr429Cys, Arg430Pro, 및/또는 Leu433Arg를 갖는 돌연변이 KRT12 단백질;
(iv) Asp214Tyr를 갖는 돌연변이 GSN 단백질; 및
(v) Ala97Thr, Gly98Ser, Asn102Ser, Asp112Asn, Asp112Gly, Asp118Gly, Arg119Gly, Leu121Val, Leu121Phe, Val122Glu, Val122Gly, Ser171Pro, Tyr174Cys, Thr175Ile, Gly177Arg, Lys181Arg, Gly186Arg, Leu188His, Asn232Ser, Asn233His, Asp236Glu, 및/또는 Asp240Asn을 갖는 돌연변이 UBIAD1 단백질
로 이루어진 그룹으로부터 선택된 돌연변이 단백질을 암호화하는 조작된 CRISPR/Cas9 조성물. - 제16항에 있어서,
(i) 유전자 돌연변이 또는 SNP를 포함하는 돌연변이 서열이 Arg124Cys를 포함하는 돌연변이 TGFBI 단백질을 암호화하고, crRNA 서열이 서열 번호 58, 54, 50 또는 42를 포함하고/하거나;
(ii) 유전자 돌연변이 또는 SNP를 포함하는 돌연변이 서열이 Arg124His를 포함하는 돌연변이 TGFBI 단백질을 암호화하고, crRNA 서열이 서열 번호 94, 90, 86, 82, 78, 74 또는 70을 포함하고/하거나;
(iii) 유전자 돌연변이 또는 SNP를 포함하는 돌연변이 서열이 Arg124Leu을 포함하는 돌연변이 TGFBI 단백질을 암호화하고, crRNA 서열이 서열 번호 114, 110, 106 또는 98을 포함하고/하거나;
(iv) 유전자 돌연변이 또는 SNP를 포함하는 돌연변이 서열이 Arg555Gln을 포함하는 돌연변이 TGFBI 단백질을 암호화하고; crRNA 서열이 서열 번호 178, 174, 170, 166, 162 또는 158을 포함하고/하거나;
(v) 유전자 돌연변이 또는 SNP를 포함하는 돌연변이 서열이 Arg555Trp를 포함하는 돌연변이 TGFBI 단백질을 암호화하고, crRNA 서열이 서열 번호 146, 142, 138, 134, 130 또는 126을 포함하고/하거나;
(vi) 유전자 돌연변이 또는 SNP를 포함하는 돌연변이 서열이 Leu527Arg를 포함하는 돌연변이 TGFBI 단백질을 암호화하고, crRNA 서열이 서열 번호 474, 478, 482 또는 486을 포함하는 조작된 CRISPR/Cas9 조성물. - 제16항에 있어서, 유전자 돌연변이 또는 SNP를 포함하는 돌연변이 서열이 Arg124His를 포함하는 돌연변이 TGFBI 단백질을 암호화하고, crRNA가 서열 번호 86 또는 94를 포함하는 조작된 CRISPR/Cas9 조성물.
- 제16항에 있어서, 각막 이상증이 SNP와 관련되고, 표적 서열 또는 PAM이 각막 이상증을 유발하는 SNP 부위를 포함하는 조작된 CRISPR/Cas9 조성물.
- 제16항에 있어서, 표적 서열 또는 PAM이 다수의 SNP 부위를 포함하는 조작된 CRISPR/Cas9 조성물.
- 제16항에 있어서, 대상체가 인간인 조작된 CRISPR/Cas9 조성물.
- 조작된 CRISPR/Cas9 조성물을 포함하는, 대상체에서 유전자 돌연변이 또는 단일-뉴클레오티드 다형태(SNP)와 관련된 각막 이상증의 예방, 개선, 또는 치료에 사용하기 위한 조성물로서, 상기 조작된 CRISPR/Cas9 조성물이
(i) Cas9 뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 분자;
(ii) 제1 표적 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열에 혼성화되는 제1 CRISPR 표적화 RNA(crRNA) 서열(제1 표적 서열은 시스에서 질환-유발 돌연변이 또는 SNP의 3'-말단 측에 제1 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)의 5'-말단에 인접하고, 여기서, 제1 표적 서열 또는 제1 PAM은 제1 선조 돌연변이 또는 SNP 부위를 포함한다); 및
(iii) 제2 표적 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열에 혼성화되는 제2 crRNA 서열(제2 표적 서열은 시스에서 질환-유발 돌연변이 또는 SNP의 5'-말단 측에 제2 PAM의 5'-말단에 인접하고, 여기서, 제2 표적 서열 또는 제2 PAM은 제2 선조 돌연변이 또는 SNP 부위를 포함한다)
을 포함하는 적어도 하나의 벡터를 포함하고,
여기서, 적어도 하나의 벡터는, 자연적으로 함께 발생하는, Cas9 뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 분자 및 crRNA 서열을 갖지 않으며,
상기 CRISPR/Cas9 조성물은 배아, 난자, 정자, 및 태아에게 적용되지 않으며,
제1 및 제2 crRNA 서열 중의 적어도 하나가 표 2에 열거된 서열들로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 조성물. - 제33항에 있어서, 상기 선조 돌연변이 또는 SNP가 TGFBI 유전자에 존재하는, 조성물.
- 제33항에 있어서, 상기 선조 돌연변이 또는 SNP가 TGFBI 유전자의 인트론에 존재하는, 조성물.
- 제33항에 있어서, 제1 PAM이 제1 돌연변이 또는 SNP 부위를 포함하고/하거나 제2 PAM이 제2 돌연변이 또는 SNP 부위를 포함하는 조성물.
- 제33항에 있어서,
제1 crRNA 서열이 제1 표적 서열을 포함하고/하거나;
제2 crRNA 서열이 제2 표적 서열을 포함하고/하거나;
제1 crRNA 서열이 17 내지 24개 뉴클레오티드 길이이고/이거나;
제2 crRNA 서열이 17 내지 24개 뉴클레오티드 길이인 조성물. - 제33항에 있어서, 제1 및/또는 제2 PAM 및 Cas9 뉴클레아제가 스트렙토코커스 또는 스타필로코커스로부터의 것인 조성물.
- 제33항에 있어서, 제1 및 제2 PAM이 둘 다 스트렙토코커스 또는 스타필로코커스로부터의 것인 조성물.
- 제33항에 있어서, PAM이 NGG 또는 NNGRRT로 이루어지고, 여기서, N이 A, T, G, 및 C 중의 어느 하나이고, R이 A 또는 G인 조성물.
- 제33항에 있어서, 조작된 CRISPR/Cas9 조성물을 대상체의 각막에 도입하기 위한 조성물.
- 제33항에 있어서, 조작된 CRISPR/Cas9 조성물을 대상체의 각막에 주사하기 위한 조성물.
- 제33항에 있어서, 조작된 CRISPR/Cas9 조성물을 표적 서열을 갖는 DNA 분자를 함유하고 발현하는 대상체의 세포에 도입하기 위한 조성물.
- 제33항에 있어서, 각막 이상증이 상피세포 기저막 이상증(EBMD), 미즈만 각막 이상증(MECD), 티엘-벵케 각막 이상증(TBCD), 격자 각막 이상증(LCD), 과립 각막 이상증(GCD), 및 슈나이더 각막 이상증(SCD)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 조성물.
- 제33항에 있어서, 질환-유발 돌연변이 또는 SNP를 포함하는 돌연변이 서열이 Leu509Arg, Arg666Ser, Gly623Asp, Arg555Gln, Arg124Cys, Val505Asp, Ile522Asn, Leu569Arg, His572Arg, Arg496Trp, Pro501Thr, Arg514Pro, Phe515Leu, Leu518Pro, Leu518Arg, Leu527Arg, Thr538Pro, Thr538Arg, Val539Asp, Phe540del, Phe540Ser, Asn544Ser, Ala546Thr, Ala546Asp, Phe547Ser, Pro551Gln, Leu558Pro, His572del, Gly594Val, Val613del, Val613Gly, Met619Lys, Ala620Asp, Asn622His, Asn622Lys, Asn622Lys, Gly623Arg, Gly623Asp, Val624_Val625del, Val624Met, Val625Asp, His626Arg, His626Pro, Val627SerfsX44, Thr629_Asn630insAsnValPro, Val631Asp, Arg666Ser, Arg555Trp, Arg124Ser, Asp123delins, Arg124His, Arg124Leu, Leu509Pro, Leu103_Ser104del, Val113Ile, Asp123His, Arg124Leu, 및/또는 Thr125_Glu126del을 포함하는 돌연변이 TGFBI 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 돌연변이 단백질을 암호화하는 조성물.
- 제33항에 있어서,
각막 이상증이 SNP와 관련되고/되거나;
제1 표적 서열 또는 제1 PAM이 제1 선조 SNP 부위를 포함하고/하거나,
제2 표적 서열 또는 제2 PAM이 제2 선조 SNP 부위를 포함하는 조성물. - 제33항에 있어서, 질환-유발 돌연변이 또는 SNP를 포함하는 돌연변이 서열이 Arg124His를 포함하는 돌연변이 TGFBI 단백질을 암호화하는 조성물.
- 제33항에 있어서, 표적 서열 또는 PAM이 다수의 돌연변이 또는 SNP 부위를 포함하는 조성물.
- 제33항에 있어서, 대상체가 인간인 조성물.
- 하나 이상의 복수의 줄기세포를 포함하는, 대상체에서 각막 이상증을 치료하기 위한 약제학적 조성물로서, 상기 하나 이상의 복수의 줄기세포가,
(a) 대상체로부터 수득된 각막 이상증 표적 핵산에 핵산 돌연변이를 포함하는 다수의 줄기 세포를 제공하는 단계;
(b) 다수의 줄기 세포 중의 하나 이상의 줄기 세포에서 핵산 돌연변이를 조작하여 핵산 돌연변이를 교정함으로써, 하나 이상의 조작된 줄기 세포(manipulated stem cell)를 형성하는 단계; 및
(c) 하나 이상의 조작된 줄기 세포를 단리하는 단계를 포함하는, 방법에 의해 수득되고,
여기서 다수의 줄기 세포 중의 하나 이상의 줄기 세포에서 핵산 돌연변이를 조작하는 것이 제4항 내지 제32항 중 어느 한 항의 조작된 CRISPR/Cas9 조성물 또는 제33항 내지 제49항 중 어느 한 항의 조성물을 하나 이상의 줄기 세포에 도입하는 것을 포함하고,
여기서 상기 CRISPR/Cas9 조성물은 배아, 난자, 정자, 및 태아에게 적용되지 않는, 약제학적 조성물. - (a) 대상체로부터 수득된 각막 이상증 표적 핵산에 핵산 돌연변이를 포함하는 다수의 줄기 세포를 제공하는 단계;
(b) 다수의 줄기 세포 중의 하나 이상의 줄기 세포에서 핵산 돌연변이를 조작하여 핵산 돌연변이를 교정함으로써, 하나 이상의 조작된 줄기 세포(manipulated stem cell)를 형성하는 단계; 및
(c) 하나 이상의 조작된 줄기 세포를 단리하는 단계를 포함하는,
대상체에서 각막 이상증을 치료하는 데 사용하기 위한 하나 이상의 복수의 줄기 세포를 수득하는, in vitro 방법으로서,
다수의 줄기 세포 중의 하나 이상의 줄기 세포에서 핵산 돌연변이를 조작하는 것이 제4항 내지 제32항 중 어느 한 항의 조작된 CRISPR/Cas9 조성물 또는 제33항 내지 제49항 중 어느 한 항의 조성물을 하나 이상의 줄기 세포에 도입하는 것을 포함하는, 방법. - 삭제
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