CN109963945A - 单一向导rna、crispr/cas9系统及其使用方法 - Google Patents

单一向导rna、crispr/cas9系统及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本公开内容涉及单一向导RNA(sgRNA)，规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)系统，及其用于预防、改善或治疗角膜营养不良的方法。

Description

单一向导RNA、CRISPR/CAS9系统及其使用方法
技术领域
本公开内容涉及单一向导RNA(sgRNA)，规律成簇的间隔短回文重复 序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)系统，及其用于预防、改善或 治疗角膜营养不良的方法。
背景技术
大多数角膜营养不良以常染色体显性方式遗传，具有显性-负性病理机 制。对于某些基因，例如TGFBI和KRT12，已经表明它们是单倍体足够 (haplosufficient)的；意味着基因的一个功能性拷贝足以维持正常功能。通 过使用特异性靶向突变等位基因的siRNA，可以克服突变蛋白的显性负性作 用并且在体外恢复细胞的正常功能。尽管siRNA的作用是短暂的，但只要 siRNA在细胞中以足够高的浓度存在就会持续；CRISPR/Cas9基因编辑提供了永久修饰突变等位基因的机会。
用于催化切割双链DNA的简单内源性细菌系统的发现彻底改变了治疗 性基因编辑领域。II型规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR 相关蛋白9(Cas9)是一种可设计的RNA引导内切核酸酶，最近已被证明可 有效用于哺乳动物细胞的基因编辑(HsuPD，Lander ES，Zhang F.Development and applications of CRISPR-Cas9 for genomeengineering.Cell 2014；157： 1262-1278)。这种高度特异性且高效的RNA指导的DNA核酸内切酶可能在 遗传疾病中具有治疗重要性。CRISPR/Cas9系统依赖于单一催化蛋白Cas9，其被2个RNA分子引导至特定DNA序列；tracrRNA和crRNA(Hsu PD，Lander ES.ZhangF.Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.Cell2014；157：1262-1278)。将tracrRNA/crRNA组合成单一向导 RNA分子(sgRNA)(Shalem O，Sanjana NE，Hartenian E，Shi X，Scott DA， Mikkelsen TS等Genome-scale CRISPR-Cas9knockout screening in human cells. Science 2014；343：84-87；Wang T，Wei JJ，Sabatini DM，Lander ES.Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9system.Science 2014；343： 80-84)导致可能对基因组内的任何靶标特异性的基因编辑工具的快速发展。
在一个方面，本公开内容描述了角膜营养不良的等位基因特异性 CRISPR/Cas9系统在例如KRT12(编码角蛋白12、K12)的显性负性突变 (Leu132Pro(c.395，T＞C)上的潜力，该突变导致Meesmann上皮角膜营养 不良(MECD；OMIM：122100)(Liao H，Irvine AD，Macewen CJ，Weed KH， Porter L，Corden LD等Development of allele-specifictherapeutic siRNA in Meesmann epithelial corneal dystrophy.PLoS One 2011；6：e28582)。有趣的是， 如本文所示，该突变导致新的酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)PAM(其 不存在于野生型等位基因中)的表现。在一些实施方案中，本公开内容显示 突变等位基因的等位基因特异性切割可以通过将该新的PAM的5’-端的核苷 酸并入sgRNA中来诱导。在杂合细胞中，该双链断裂可能导致非同源末端连 接(NHEJ)，这可能导致移码和过早终止密码子的表现，或者同源定向修复， 其中与野生型等位基因的重组指导突变序列的修复。例如，在KRT12的情况 下，两种结果都可以被视为治疗成功；由于KRT12已显示不能证明单倍体不 足，因此显性负性突变K12蛋白的表达被NHEJ消除(Kao WW，Liu CY， ConverseRL，Shiraishi A，Kao CW，Ishizaki M等Keratin 12-deficient mice have fragilecorneal epithelia.Invest Ophthalmol Vis Sci 1996；37：2572-2584)，或通 过同源定向修复修复突变等位基因，导致K12-Leu132Pro等位基因的修复。
发明内容
在一个方面，本公开内容涉及单一向导RNA(sgRNA)。在一些实施方 案中，sgRNA包含(i)CRISPR靶向RNA(crRNA)序列和(ii)反式激活 crRNA(tracrRNA)序列。在一些实施方案中，crRNA序列和tracrRNA序列 不是天然一起出现的。在一些实施方案中，crRNA序列具有与选自SEQ ID NO：的核苷酸序列具有至少约80％、85％、90％、95％或100％序列同一 性的核苷酸序列，其中n为0至221的整数。在另一些实施方案中，tracrRNA 序列包含与SEQ IDNO：2或6的序列具有至少约80％、85％、90％、95％或 100％序列同一性的核苷酸序列。
在另一个方面，本公开内容涉及设计用于CRISPR/Cas9系统的sgRNA对， 该sgRNA对包含(i)第一sgRNA，其包含(a)顺式在引起疾病的突变或SNP 的3’-端侧的产生第一原型间隔区相邻基序(PAM)的突变或单核苷酸多态性 (SNP)的第一crRNA序列，和(b)tracrRNA序列，其中第一crRNA序列 和tracrRNA序列不是天然一起出现的；(ii)第二sgRNA，其包含(a)顺式 在引起疾病的突变或SNP的5’-端侧的产生第二PAM的突变或SNP的第二 crRNA向导序列；(b)tracrRNA序列，其中第二crRNA序列和tracrRNA序 列不是天然一起出现的。在一些实施方案中，CRISPR/Cas9系统用于预防、 改善或治疗角膜营养不良。在一些实施方案中，产生PAM的突变或SNP位 于TGFBI基因中。在又一些实施方案中，产生PAM的突变或SNP位于TGFBI 基因的内含子中。例如，产生PAM的突变或SNP位于TGFBI基因的相邻内 含子中，引起疾病的突变或SNP可以位于相邻内含子之间的外显子中，如图 16所示。在又一些实施方案中，第一和第二crRNA序列中的至少一种包含选 自图19至图35所列序列的核苷酸序列；和/或第一和第二crRNA序列中的至 少一种包含选自表2所列序列的核苷酸序列。
在另一个方面，本公开内容涉及工程化的规律成簇的间隔短回文重复序 列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)系统，其包含至少一种或两种载体， 所述载体包含编码Cas9核酸酶的核苷酸分子和本文所述的sgRNA，或者包含 至少一种、两种或三种不同载体，所述载体包含编码Cas9核酸酶的核苷酸分 子和本文所述的sgRNA对。在一些实施方案中，Cas9核酸酶和sgRNA不是 天然地一起出现的。在一些实施方案中，本文所述的Cas9核酸酶可以为 Slaymaker等，2016Science，351(6268)，84-88中描述的增强的Cas9核酸酶。在 另一些实施方案中，Cas9核酸酶来自链球菌(Streptococcus)。在另一些实施 方案中，Cas9核酸酶来自酿脓链球菌(Spy)、停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)、犬链球菌(Streptococcus canis)、马链球菌(Streptococcus equi)、 海豚链球菌(Streptococcusiniae)、海豹链球菌(Streptococcus phocae)、假链 球菌(Streptococcuspseudoporcinus)、口腔链球菌(Streptococcus oralis)、假
在另一个方面，本公开内容涉及用于改变至少一种基因产物表达的方法， 包括将本文所述的工程化CRISPR/Cas9系统引入含有并表达具有靶序列和编 码该基因产物的DNA分子的细胞中。在一些实施方案中，工程化CRISPR/Cas9 系统包含(a)与靶序列杂交的sgRNA可操作连接的第一调节元件，和(b) 与编码Cas9核酸酶的核苷酸分子可操作连接的第二调节元件，其中组分(a) 和(b)位于系统的同一载体或不同载体上，sgRNA靶向靶序列，Cas9核酸 酶切割DNA分子。靶序列可以为与原型间隔区相邻基序(PAM)的5’-端相 邻的核苷酸序列互补的核苷酸序列。在另一些实施方案中，细胞为真核细胞、 或者哺乳动物或人细胞。在一些实施方案中，sgRNA包含与Cas9核酸酶识别 的PAM的5’-端相邻的核苷酸序列。在另一些实施方案中，sgRNA的序列长 度为16至25个核苷酸，或16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个 核苷酸。
在另一个方面，本公开内容涉及用于在受试者中预防、改善或治疗与单 核苷酸多态性(SNP)相关的疾病的方法，包括改变如本文所述的受试者的 基因产物的表达，其中该DNA分子包含突变序列。在一些实施方案中，DNA 分子可以包含至少一个、两个、三个、四个或更多个SNP或突变位点，本文 所述的方法改变与至少一个、两个、三个、四个或更多个SNP或突变位点相 关的基因产物的表达。
在另一个方面，本公开内容涉及用于在受试者中预防、改善或治疗与基 因突变或SNP相关的角膜营养不良的方法，包括向受试者施用包含至少一种 或两种载体的工程化CRISPR/Cas9系统，该载体包含(i)编码本文所述的 Cas9核酸酶的核苷酸分子，和(ii)本文所述的sgRNA，其中sgRNA与原型 间隔区相邻基序(PAM)位点5’-端相邻的靶序列互补或包含其的核苷酸序列 杂交，靶序列或PAM包含突变或SNP位点。在一些实施方案中，sgRNA包含与靶序列具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或100％序列同一性 的核苷酸序列。在一些实施方案中，Cas9核酸酶和sgRNA不是天然地一起出 现的。在另一些实施方案中，PAM包含突变或SNP位点。
在一些实施方案中，包含引起疾病的基因突变或SNP的突变序列编码选 自以下的突变蛋白：(i)包含Leu509Arg、Arg666Ser、Gly623Asp、Arg555Gln、 Arg124Cys、Val505Asp、Ile522Asn、Leu569Arg、His572Arg、Arg496Trp、、Arg514Pro、Phe515Leu、Leu518Pro、Leu518Arg、Leu527Arg、 Thr538Pro、Thr538Arg、Val539Asp、Phe540del、Phe540Ser、Asn544Ser、 Ala546Thr、Ala546Asp、Phe547Ser、Pro551Gln、Leu558PrO、His572del、Gly594Val、Va1613del、Val613Gly、Met619Lys、Ala620Asp、Asn622His、 Asn622Lys、Asn622Lys、Gly623Arg、Gly623Asp、Val624_Va1625del、Val624Met、 Val625Asp、His626Arg、His626Pro、Val627SerfsX44、 Thr629_Asn630insAsnValPro、Val631Asp、Arg666Ser、Arg555Trp、Arg124Ser、 Asp123delins、Arg124His、Arg124Leu、Leu509Pro、Leu103_Ser104del、 Val113Ile、Asp123His、Arg124Leu、和/或Thr125Glu126del的突变TGFBI 蛋白l；(ii)具有Glu498Val、Arg503Pro和/或Glu509Lys的突变KRT3蛋白； (iii)具有Met129Thr、Met129Val、Gln130Pro、Leu132Pro、Leu132Va、 Leu132His、Asn133Lys、Arg135Gly、Arg135Ile、Arg135Thr、Arg135Ser、 Ala137Pro、Leu140Arg、Val143Leu、Val143Leu、L1e391_Leu399dup、Ile 426Val、 Ile 426Ser、Tyr429Asp、Tyr429Cys、Arg430Pro和/或Leu433Arg的突变KRT12 蛋白；(iv)具有Asp214Tyr的突变GSN蛋白；(v)具有Ala97Thr、Gly98Ser、 Asn102Ser、Asp112Asn、Asp112Gly、Asp118Gly、Arg119Gly、Leu121Val、 Leu121Phe、Val122Glu、Vall22Gly、Ser171Pro、Tyr174Cys、Thr175Ile、Gly177Arg、Lys181Arg、Gly186Arg、Leu188His、Asn232Ser、Asn233His、 Asp236Glu和/或Asp240Asn的突变UBIAD1蛋白。在另一些实施方案中，根 据权利要求14至25中任一项的方法，其中受试者是人、动物或哺乳动物。
在一些实施方案中，包含SNP位点的突变序列编码包含Arg514Pro的突 变TGFBI蛋白，工程化CRISPR/Cas9系统包含含有 GAACTAATTACCATGCTAAA(SEQ ID NO：897)的sgRNA。在一些实施方 案中，包含SNP位点的突变序列编码包含Leu518Arg的突变TGFBI蛋白，工 程化CRISPR/Cas9系统包含含有GAGACAATCGCTTTAGCATG(SEQ ID NO：898)的sgRNA。在一些实施方案中，包含SNP位点的突变序列编码包含 Leu509Arg的突变TGFBI蛋白，工程化CRISPR/Cas9系统包含含有SEQ ID NO： 186的sgRNA。在一些实施方案中，包含SNP位点的突变序列编码包含 Leu527Arg的突变TGFBI蛋白，工程化CRISPR/Cas9系统包含含有SEQ ID NO： 474的sgRNA。在一些实施方案中，包含SNP位点的突变序列编码包含 Arg124Cys的突变TGFBI蛋白，工程化CRISPR/Cas9系统包含含有SEQ ID NO：58、54、50和42中的任何核苷酸序列的sgRNA。在一些实施方案中，包含 SNP位点的突变序列编码包含Arg124His的突变TGFBI蛋白，工程化 CRISPR/Cas9系统包含含有SEQ ID NO：94、90、86、82、78、74和70中的 任何核苷酸序列的sgRNA。在一些实施方案中，包含SNP位点的突变序列编 码包含Arg124His的突变TGFBI蛋白，工程化CRISPR/Cas9系统包含含有SEQ ID NO：86或94的sgRNA。在一些实施方案中，包含SNP位点的突变序列编 码包含Arg124Leu的突变TGFBI蛋白，工程化CRISPR/Cas9系统包含含有 SEQ ID NO：114、110、106和98中的任何核苷酸序列的sgRNA。在一些实 施方案中，包含SNP位点的突变序列编码包含Arg555Gln的突变TGFBI蛋白， 工程化CRISPR/Cas9系统包含含有SEQ ID NO：178、174、170、166、162和 158在的任何核苷酸序列的sgRNA。在一些实施方案中，包含SNP位点的突 变序列编码包含Arg555Trp的突变TGFBI蛋白，工程化CRISPR/Cas9系统包 含含有SEQ ID NO：146、142、138、134、130和126中的任何核苷酸序列的 sgRNA。在一些实施方案中，包含SNP位点的突变序列编码包含Leu527Arg 的突变TGFBI蛋白，工程化的CRISPR/Cas9系统包含含有SEQ ID NO：146、 142、138、134、130和126中的任何核苷酸序列的sgRNA。
在另一个方面，本公开内容涉及用于在受试者中预防、改善或治疗与基 因突变或SNP相关的角膜营养不良的方法，包括向受试者施用包含至少一种 或两种载体的工程化CRISPR/Cas9系统，该载体包含(i)编码本文所述的 Cas9核酸酶的核苷酸分子，和(ii)本文所述的sgRNA，其中sgRNA与第一 靶序列杂交，所述第一靶序列与原型间隔区相邻基序(PAM)的5’-端相邻的 第二靶序列互补，第一靶序列或PAM包含突变或SNP位点。在另一个方面， 本发明涉及用于在受试者中预防、改善或治疗与基因突变或单核苷酸多态性 (SNP)相关的角膜营养不良的方法，包括向受试者施用包含至少一种载体 的工程化CRISPR/Cas9系统，该载体其包含(i)编码Cas9核酸酶的核苷酸 分子；(ii)第一CRISPR靶向RNA(crRNA)序列，其与第一靶序列互补的 核苷酸序列杂交，第一靶序列与顺式在引起疾病的突变或SNP的3’-端侧的第 一原型间隔区相邻基序(PAM)的5’-端相邻，其中第一靶序列或第一PAM 包含第一祖先突变或SNP位点，(iii)与第二靶序列互补的核苷酸序列杂交的 第二crRNA序列，第二靶序列与顺式在引起疾病的突变或SNP的5’-端侧的 第二PAM的5’-端相邻，其中第二靶序列或第二PAM包含第二祖先突变或SNP。其中至少一种载体不具有编码Cas9核酸酶的核苷酸分子和天然一起出 现的crRNA序列。在一些实施方案中，产生PAM的突变或SNP位于TGFBI 基因中，例如，位于TGFBI基因的内含子中。在另一些实施方案中，第一和 第二crRNA序列中的至少一种包含选自图19至图35所列序列的核苷酸序列； 和/或第一和第二crRNA序列中的至少一种包含选自表2所列序列的核苷酸序 列。在又一些实施方案中，其中第一PAM包含第一突变或SNP位点和/或第 二PAM包含第二突变或SNP位点。在又一些实施方案中，第一crRNA序列 包含第一靶序列，和/或第二crRNA序列包含第二靶序列。在又一些实施方案 中，crRNA的长度为17至24个核苷酸。在一些实施方案中，第一和第二PAM 均来自链球菌或葡萄球菌。在另一些实施方案中，包含引起疾病的突变或SNP 的突变序列编码选自以下的突变蛋白：包含Leu509Arg、Arg666Ser、 Gly623Asp、Arg555Gln、Arg124Cys、Val505Asp、Ile522Asn、Leu569Arg、 His572Arg、Arg496Trp、Pro501Thr、Arg514Pro、Phe515Leu、Leu518Pro、 Leu518Arg、Leu527Arg、Thr538Pro、Thr538Arg、Val539Asp、Phe540del、 Phe540Ser、Asn544Ser、Ala546Thr、Ala546Asp、Phe547Ser、Pro551Gln、Leu558Pro、His572del、Gly594Val、Val613del、Val613Gly、Met619Lys、 Ala620Asp、Asn622His、Asn622Lys、Asn622Lys、Gly623Arg、Gly623Asp、 Va1624_Val625del、Val624Met、Val625Asp、His626Arg、His626Pro、 Val627SerfsX44、Thr629_Asn630insAsnValPro、Val631Asp、Arg666Ser、 Arg555Trp、Arg124Ser、Asp123delins、Arg124His、Arg124Leu、Leu509Pro、 Leu103_Ser104del、Val113Ile、Asp123His、Arg124Leu和/或Thr125_Glu126del 的突变TGFBI蛋白。
在另一些实施方案中，PAM由选自NGG和NNGRRT的PAM组成，其 中N为A、T、G和C中的任一个，并且R为A或G。在又一些实施方案中， 施用包括将工程化CRISPR/Cas9系统引入受试者的角膜(例如，角膜基质) 中，例如，通过将工程化CRISPR/Cas9系统注射到受试者的角膜(例如，角 膜基质)中和/或通过将工程化CRISPR/Cas9系统引入含有并表达具有靶序列的DNA分子的细胞中。
在一些实施方案中，角膜营养不良选自上皮基底膜营养不良(EBMD)、 Meesmann角膜营养不良(MECD)、Thiel-Behnke角膜营养不良(TBCD)、 网格状角膜营养不良(LCD)、颗粒状角膜营养不良(GCD)和Schnyder角 膜营养不良(SCD)。在另一些实施方案中，SNP位点位于选自TGFBI、KRT3、 KRTl2、GSN和UBIAD1异戊二烯基转移酶结构域1(UBIAD1)的基因中。
在一些实施方案中，本文所述的CRISPR/Cas9系统和使用其的方法可以 在多个SNP位点或祖先SNP处改变突变序列。
在另一个方面，本公开内容涉及用于在有需要的受试者中治疗角膜营养 不良的方法，包括：(a)从受试者中获得包含角膜营养不良靶核酸的核酸突 变的多种干细胞；(b)在多种干细胞的一种或更多种干细胞中操作核酸突变 以校正核酸突变，从而形成一种或更多种经操作的干细胞；(c)分离一种或 更多种经操作的干细胞；(d)将一种或更多种经操作的干细胞移植到受试者 中，其中在多种干细胞中的一种或更多种干细胞中操作核酸突变包括进行本 文所述的改变基因产物表达的任何方法或用于在受试者中预防、改善或治疗 与突变或SNP相关的疾病的任何方法。
附图说明
图1示出了用于靶向野生型和突变体角蛋白12(K12)等位基因的sgRNA 的示例性设计。设计了使用K12-L132P等位基因上发现的SNP衍生PAM的 sgRNA(红色)。该PAM不存在于野生型等位基因中。还设计了靶向野生型 和突变体K12等位基因(绿色)二者的第二sgRNA并用作阳性对照。
图2示出了使用外源表达构建体评估sgK12LP的等位基因特异性和效 力。使用野生型和突变体K12的外源表达构建体来测试sgK12LP的等位基因 特异性和效力。(a)双荧光素酶测定证明了sgK12LP质粒的等位基因特异性， 而效力显示与sgK12构建体的效力相当。N＝8。(b)Western印迹进一步证 明了这些特性，与经处理但表达K12野生型蛋白的细胞相比，经sgK12LP处 理的细胞中K12-L132P蛋白显著减少。β-肌动蛋白用作上样对照。(c)表达野生型和突变体等位基因的细胞中总K12的定量逆转录酶-PCR证明mRNA 表达的敲低。N＝4。(d)然后通过焦磷酸测序对该mRNA敲低的等位基因比 例进行定量，证实共表达KRT12等位基因并经sgK12LP处理的细胞中突变等 位基因的等位基因敲低。N＝4，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
图3示出了体内sgK12LP诱导的NHEJ。在基质内注射后24小时，在小 鼠的角膜上皮中观察到GFP表达，证明了用于转染角膜上皮的基质内质粒注 射的效力(a；N＝2)。注射后48小时未观察到GFP表达。来自注射sgK12LP 构建体的人K12-L132P杂合小鼠的gDNA的测序证明由于KRT12-L132P等位 基因的切割而导致的大量缺失和诱导NHEJ。在测序的13个克隆中，发现5 个经历了NHEJ(b)。
图4示出了使用针对TGFBI突变设计的SNP衍生的PAM向导RNA的 结果(R514P(A)、L51 8R(B)、L509R(C)和L527R(D))，荧光素酶表 达用于评估野生型和突变体等位基因表达。设计阳性对照(sgWT)向导以切 割野生型(WT，蓝色条)和突变体(MUT，红色条)等位基因，并如上所示 切割两种等位基因，如预期的。用于L518R(sgMut)的向导显示最大的等位基因特异性，具有最小的WT等位基因切割(蓝色条)。如预期的，阴性对照 向导(sgNSC)未切割WT或MUT DNA。
在图5中，A-E图示出了使用针对R124和R555TGFBI突变设计的突 变等位基因特异性向导RNA的结果，使用荧光素酶以评估野生型和突变体等 位基因表达。使用不同长度的向导进行测定，长度为16聚体至22聚体。除 向导长度外，还评估了向向导的5’-端添加双鸟嘌呤以帮助提高特异性。蓝色 条代表WT TGFBI序列，橙色条代表突变TGFBI序列。根据向导的长度，突 变向导以不同的效率切割(图5，A至E图)。对于R124(图5，A、B和C 图)，测定示出了等位基因特异性趋势，突变向导优先靶向突变序列(橙色条 与蓝色条相比进一步降低)。
在图5中，F图示出了当用经改造以降低非靶标结合的增强Cas9核酸酶 测试R124H突变20聚体向导时的改进特异性。
在图5中，G图示出了用Cas9体外切割的片段分析，以证实DNA已被 切割。针对6种常见TGFBI突变(例如，R124C、R124H、R124L、R555Q、 R555W和L527R)中的每一种制备野生型和突变体序列的切割模板，设计并 合成了含有野生型和突变体序列的向导RNA分子(20和18个核苷酸)。然 后用Cas9-sgRNA复合物体外消化切割模板，并在琼脂糖凝胶上进行片段分 析(图5，G，(a)-(f)图)。R124C切割反应的片段分析(图5，G，(a) 图)显示与双荧光素酶测定的结果相当的结果(图5，A图)。分析R124H和 R124L的切割反应(图5，G，(b)和(c)图)再次显示与双荧光素酶测定 相似的结果(图5，B和C图)，两种非常不同的检测方法的结果一致。检查 R555Q和R555W切割反应(图5，G、(d)和(e)图)再次表明与双荧光素 酶测定的相当(图5，D和E图)。对L527R的切割反应的分析(图5，G，(f)图)显示了依赖于向导长度的不同切割效率。
在图6中，(A)示出了对Luc2特异并设计成靶向Luc2基因5′区域的示 例性单一向导RNA(sgRNA)靶序列(以紫色突出显示)。设计结合于Luc2 基因的5′区域的向导增加了通过在靶DNA中产生过早终止密码子来诱导移码 缺失和敲除荧光素酶(Luc2)活性的可能性。(B)示出了在将该Luc2靶向向 导添加至表达荧光素酶的细胞并基于荧光素酶表达测量基因编辑之后获得的 结果。一些细胞未经处理(unT)，其他细胞用非特异性阴性对照向导RNA(sgNSC)(该向导RNA不会与细胞的DNA结合)处理和用于针对Luc2的 测试向导(即sgLuc2P)处理。
图7在小鼠角膜上皮中体内证明CRISPR Cas9基因编辑可以切割和降低 靶基因的表达，并且这导致从该基因表达的蛋白质更少。荧光素酶的热量图 表示蛋白质表达水平，其中黑色反映不表达，蓝色反映低表达，红色反映Luc2 蛋白质的高表达。
图8示出了F.Ran等，Nat.Protoc.2013，8(11)2281-2308中描述的 CRISPR/Cas9系统。来自酿脓链球菌的Cas9核酸酶(黄色)通过由20-nt向 导序列(蓝色)和支架(红色)组成的sgRNA靶向基因组DNA(示出的， 例如人EMX1基因座)。向导序列与DNA靶标(顶部链上的蓝色条带)配对， 直接位于必需的5′-NGG相邻基序(PAM；粉红色)的上游。Cas9介导PAM 上游约3bp的DSB(红色三角形)。
图9示出了F.Ran等，Nature 2015，520(7546)：186-91中描述的 CRISPR/Cas9系统，包括来自8种细菌物种的II型CRISPR-Cas基因座和 sgRNA的示意图。间隔区或“向导”序列以蓝色显示，后接同向重复(灰色)。 预测的tracrRNA以红色显示，并基于约束生成RNA折叠模型折叠。
图10还示出了F.Ran等，Nature 2015，520(7546)：186-91中描述的 CRISPR/Cas9系统。该图示出了哺乳动物细胞中SaCas9sgRNA支架的优化。 a，金黄色葡萄球菌亚种金黄色CRISPR基因座的示意图。b，具有21-nt向导 的SaCas9sgRNA、crRNA重复(灰色)、四环(黑色)和tracrRNA(红色) 的示意图。在灰色框上方显示crRNA重复至tracrRNA抗重复碱基对的数目。 SaCas9切割具有不同重复的靶标：c，HEK 293FT和d，Hepa1-6细胞系中的 抗重复长度。(n＝3，误差条表示S.E.M.)。
图11示出了CRISPR/Cas9系统的示例性载体，包括使用酿脓链球菌Cas9 核酸酶的pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)。
图12示出了CRISPR/Cas9系统的示例性载体， pX601-AAV-CMV：：NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA；U6：：Bsal-sgRNA，使用金 黄色葡萄球菌的。
图13示出了来自酿脓链球菌(Spy)和金黄色葡萄球菌(Sau)的Cas9 核酸酶的示例性sgRNA序列、核苷酸和氨基酸序列。
图14示出了Meesmann角膜营养不良(MECD)相关的KRT12突变的 HDR介导修复的示例性设计，其与一对sgRNA紧密成簇以指导Cas9切割。 图14中示出的修复寡核苷酸(ssODN)用于L132P，但也适用于簇集中的其 他突变。突变和修复的位点用星号显示。两个箭头显示修复寡核苷酸中的核 苷酸变化，其在修复的等位基因中引入同义变化，阻止Cas9的进一步切割， 因为它们重新编码PAM位点。
图15示出了TGFBI中MAF＞10％的产生新的PAM的所有SNP。编号框 表示TGFBI内的外显子。TGFBI中的热点由红色框显示，在其中发现多种引 起疾病的突变。蓝色箭头表示产生新型PAM的SNP的位置。每个箭头显示 新的PAM，所需的变体以红色突出显示。
图16示出了示例性实施方案，其中在第一内含子中设计利用侧翼SNP 新PAM的sgRNA。另外，在第二个内含子中设计了野生型和突变体等位基 因共有的sgRNA。在野生型等位基因中，单链sgRNA在第二个内含子中引起 NHEJ，其没有功能效应。然而，在突变等位基因中，利用侧翼SNP衍生的 PAM的sgRNA和常见sgRNA导致大的缺失，导致突变等位基因的敲除。
图17描绘了使用衍生自R124H Avellino角膜营养不良突变的患者的经 CRISPR/Cas9核转染的示例性淋巴细胞细胞系的实验结果。该向导使用了由 rs3805700SNP产成的新PAM。该PAM与患者R124H突变存在于同一染色 体上，但在野生型染色体上不存在。细胞分选后，分离单个克隆以确定是否 已发生插入/缺失。六个单克隆具有未编辑的野生型染色体，表明该向导的严 格等位基因特异性。四个经分离的克隆具有突变染色体，其中三个显示编辑， 表明突变染色体的编辑效率为75％。三个克隆中的两个显示了移位的插入/ 缺失。因此，至少66.66％的编辑诱导基因破坏。
图18示出了示例性靶位点、向导序列及其互补序列。
图19示出了包括与角膜营养不良相关的SNP位点的示例性靶序列。
图20至图35示出了TGFBI基因的内含子区域中的示例性常见向导。
发明详述
贯穿全文，如本文所用，范围用作描述该范围内的每个值的简写。可以 选择范围内的任何值作为范围的终点。此外，为了所有目的，本文引用的所 有参考文献都通过引用整体并入本文。如果本公开内容中的定义与引用的参 考文献中的定义发生冲突，则以本公开内容为准。
在一个方面，本公开内容涉及单一向导RNA(sgRNA)，例如，包括设 计用于CRISPR/Cas9系统的sgRNA，CRISPR/Cas9系统用于预防、改善或治 疗角膜营养不良。sgRNA可以是人造的、人制的、合成的和/或非天然存在 的。在一些实施方案中，sgRNA包含(i)CRISPR靶向RNA(crRNA)序列 和(ii)反式激活crRNA(tracrRNA)序列，其也可以称为“sgRNA支架”。 在一些实施方案中，crRNA序列和tracrRNA序列不天然地一起出现。如本文 所用，术语“sgRNA”可以是指含有(i)向导序列(crRNA序列)和(ii) Cas9核酸酶-募集序列(tracrRNA)的单一向导RNA。示例性向导序列包括 图18至图19中公开的那些。crRNA序列可以是与目的基因中的区域同源的 序列，并且可以指导Cas9核酸酶活性。crRNA序列和tracrRNA序列不天然 一起出现。sgRNA可以作为RNA或通过在启动子下用具有sgRNA编码序列 (sgRNA基因)的质粒转化来递送。
在一些实施方案中，sgRNA或crRNA与靶序列的至少一部分(例如，靶 基因组序列)杂交，并且crRNA可以具有与靶序列互补的序列。在一些实施 方案中，本文的靶序列是与邻近本文所述的PAM位点的第二靶序列杂交的第 一靶序列。在一些实施方案中，sgRNA或crRNA可以包含第一靶序列或第二 靶序列。“互补性”是指核酸通过传统的Watson-Crick或其他非传统类型与另 一种核酸序列形成氢键的能力。百分比互补性表示核酸分子中可以与第二核 酸序列形成氢键(例如，Watson-Crick碱基配对)的残基的百分比(例如，10 个中的5、6、7、8、9、10为50％、60％、70％、80％、90％和100％互补)。 “完全互补”是指核酸序列的所有连续残基与第二核酸序列中相同数量的连 续残基氢键结合。如本文所用，“基本上互补”是指在8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50 或更多核苷酸的区域内互补程度为至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％.97％、98％、99％或100％，或是指在严格条件下杂交的两种核酸。 如本文所用，杂交的“严格条件”是指与靶序列具有互补性的核酸主要与靶 序列杂交并且基本上不与非靶序列杂交的条件。严格条件通常是序列依赖性 的，并且根据许多因素而变化。通常，序列越长，序列与其靶序列特异性杂 交的温度越高。Tijssen(1993)，Laboratory Techniques InBiochemistryAnd Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes Part1，Second Chapter“Overview of principles of hybridization and the strategy ofnucleic acid probe assay”，Elsevier，N.Y中详细描述了严格条件的非限制性实例。“杂交” 是指一种或更多种多核苷酸反应形成复合物的反应，该复合物通过核苷酸残 基的碱基之间的氢键稳定。氢键可以通过Watson Crick碱基配对、Hoogstein 结合或以任何其他序列特异性的方式发生。复合物可以包含形成双链结构的 两条链、形成多链复合物的三条或更多条链、单一自杂交链或其任意组合。 杂交反应可以构成更广泛过程中的步骤，例如PCR的启动或对多核苷酸的酶 切割。能够与给定序列杂交的序列称为给定序列的“互补序列”。在一些实施 方案中，crRNA序列具有与选自SEQ ID NO：(10+4n)的核苷酸序列具有至少 约80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的核苷酸序列，其中n为0 至221的整数。如本文所用，术语“约”可以是指与所述参考值类似的一系 列值。在某些实施方案中，术语“约”是指落在所述参考值的15％、10％、 9％、8，7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少的值范围内。在一些实施方 案中，crRNA序列具有从选自SEQ ID NO：(10+4n)的核苷酸序列中的一个、 两个、三个、四个或五个核苷酸添加、缺失和/或取代的核苷酸序列，其中n 为0至221的整数。这种添加、缺失和/或取代可以在核苷酸序列的3’-端或5′- 端。在另一些实施方案中，crRNA或向导序列长度为约17、18、19、20、21、 22、23或24个核苷酸。在另一些实施方案中，crRNA不包括具有SEQ ID NO： 10的核苷酸序列的crRNA序列。在另一些实施方案中，crRNA不包括与包含 SNP(导致角蛋白12蛋白的L132P突变)的核苷酸序列杂交的crRNA序列。 在又一些实施方案中，crRNA不包括与包含SNP(导致角蛋白12蛋白质的突 变)的核苷酸序列杂交的crRNA序列。
在一些实施方案中，tracrRNA提供发夹结构，其激活Cas9以打开dsDNA 以结合crRNA序列。tracrRNA可以具有与回文重复序列互补的序列。当 tracrRNA与短回文重复序列杂交时，它可能触发细菌双链RNA特异性核糖核 酸酶RNase III的加工。在另一些实施方案中，tracrRNA可以具有SPIDR (SPacer Interspersed Direct Repeats)，构成通常对特定细菌物种特异的DNA 基因座家族。CRISPR基因座包含在大肠杆菌中识别的不同类型的散布短序列 重复序列(SSR)(Ishino等，J.Bacteriol.，169：5429-5433[1987]；和Nakata等，J. Bacteriol.，171：3553-3556[1989])和相关基因。已经在地中海Haloferax、酿脓 链球菌(Streptococcus pyogenes)、鱼腥藻和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)中鉴定出类似的散布SSR(参见，Groenen等，Mol.Microbiol.， 10：1057-1065[1993]；Hoe等，Emerg.Infect.Dis.，5：254-263[1999]；Masepohl等， Biochim.Biophys.Acta 1307：26-30[1996]；和Mojica等，Mol.Microbiol.， 17：85-93[1995])。CRISPR基因座可能与其他SSR的不同之处在于重复的结 构，其被称为短规则间隔重复序列(SRSR)(Janssen等，OMICSJ.Integ.Biol.， 6：23-33[2002]；和Mojica等，Mol.Microbiol.，36：244-246[2000])。在某些实施 方案中，重复序列是以簇形式出现的短元件，该簇由具有基本恒定长度的独 特插入序列规则地间隔开(Mojica等，[2000]，同上)。尽管重复序列在菌株之 间是高度保守的，但散布的重复序列的数量和间隔区的序列通常因菌株而异 (van Embden等，J.Bacteriol.，182：2393-2401[2000])。tracrRNA序列可以是本 领域已知的CRISPR/Cas9系统的tracrRNA的任何序列。在另一些实施方案中， tracrRNA包含与SEQ ID NO：2和6的核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、 85％、90％、95％或00％序列同一性的核苷酸序列。tracrRNA序列可以本领域 已知的CRISPR/Cas9系统的tracrRNA的任何序列。示例性CRISPR/Cas9系 统、sgRNA、crRNA和tracrRNA及其制造方法和使用在美国专利号8697359，美国专利申请公开号20150232882、20150203872、20150184139、20150079681、20150073041、20150056705、20150031134、20150020223、20140357530、 20140335620、20140310830、20140273234、20140273232、20140273231、 20140256046、20140248702、20140242700、20140242699、20140242664、 20140234972、20140227787、20140189896、20140186958、20140186919、 20140186843、20140179770、20140179006、20140170753、20140093913、 20140080216和WO2016049024中公开，所有参考文献整体并入本文。
在另一个方面，本公开内容涉及待插入CRISPR/Cas9系统的载体中的寡 核苷酸对，其中寡核苷酸对包含含有本文所述crRNA序列的引物。引物还可 以包含与crRNA序列相邻的2、3、4、5或6个核苷酸的定位序列，其中定 位序列与crRNA序列不天然相邻。在一些实施方案中，本公开内容涉及并入 CRISPR/Cas9系统的用于编码crRNA的载体中的寡核苷酸对，例如 pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)和pX601-AAV-CMV：： NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA；U6：：Bsal-sgRNA，其中寡核苷酸对包含含 有SEQ ID NO：(10+4n)的核苷酸序列的引物，其中n为0至221的整数。在 另一些实施方案中，寡核苷酸对包含具有SEQ ID NO：X的核苷酸序列的第一 引物，和具有SEQ ID NO：Y的核苷酸序列的第二引物，其中X为11+4n， Y为12+4n，以及n为1至221的整数。在一些实施方案中，crRNA包含选 自SEQ ID NO：58、54、50、42、94、90、86、82、78、74、70、114、100、 106、98、178、174、170、166、162、158、146、142、138、134、130和126 的核苷酸序列。
在另一个方面，本公开内容涉及工程化的规律成簇的间隔短回文重复序 列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)系统，其包含至少一种载体，该载 体包含编码Cas9核酸酶的核苷酸分子和本文所述的sgRNA。术语“非天然存 在的”或“工程化的”可以互换使用并表示人工参与。当提及核酸分子或多 肽时，术语是指核酸分子或多肽至少基本上不含至少一种与天然存在的天然 相关的其他组分。在一些实施方案中，Cas9核酸酶和sgRNA不天然一起出现。
通常，“CRISPR系统”统称为涉及表达CRISPR相关(“Cas”)基因或指 导其活性的转录物和其他元件，包括编码Cas基因的序列、tracr(反式激活)。 CRISPR)序列(例如，tracrRNA或活性部分tracrRNA)、tracr-mate序列(包 括内源CRISPR系统的背景下的“直接重复”和经tracrRNA处理的部分直接 重复)、向导序列(本文中也称为“crRNA”，或在内源CRISPR系统的背景 下的“间隔区”，和/或来自CRISPR基因座的其他序列和转录物。如上所述， sgRNA是至少tracrRNA和crRNA的组合。在一些实施方案中，CRISPR系统 的一种或更多种元件来自II型CRISPR系统。在一些实施方案中，CRISPR 系统的一种或更多种元件来自包含内源CRISPR系统的特定生物体，例如酿 脓链球菌或金黄色葡萄球菌。通常，CRISPR系统的特征在于促进靶序列位点 处的CRISPR复合物形成的元件(在内源CRISPR系统的背景下也称为原型 间隔区)。在形成CRISPR复合物的背景下，“靶序列”可以是指向导序列被 设计为具有互补性的序列，其中靶序列和向导序列之间的杂交促进CRISPR 复合物的形成，或者如图8所示，“靶序列”可以是指与PAM位点相邻的序 列，向导序列包括该序列。如果存在足够的互补性以引起杂交并促进CRISPR 复合物的形成，则不一定需要完全互补。在本公开内容中，“靶位点”是指靶 序列的位点，包括靶序列和其互补序列，例如，在双链核苷酸中。在一些实 施方案中，本文所述的靶位点可以意指与CRISPR/Cas9系统的sgRNA或 crRNA杂交的第一靶序列，和/或与PAM的5’-端相邻的第二靶序列。靶序列 可以包含任何多核苷酸，例如DNA或RNA多核苷酸。在一些实施方案中， 靶序列位于细胞的细胞核或细胞质中。在一些实施方案中，靶序列可以位于 真核细胞的细胞器内，例如，线粒体或叶绿体。
在一些实施方案中，本文所述的Cas9核酸酶是已知的；例如，酿脓链球 菌Cas9蛋白的氨基酸序列可以在SwissProt数据库中在登录号Q99ZW2下找 到。Cas9核酸酶可以是Cas9同源物或直系同源物。也可以使用表现出改善特 异性的突变Cas9核酸酶(参见，例如，Ann Ran等Cell 154(6)1380-89(2013)， 为了所有目的，其通过引用整体并入本文，特别是用于与对靶核酸具有改善 特异性的突变Cas9核酸酶有关的所有教导)。核酸操作试剂还可以包括失活 的Cas9核酸酶(dCas9)。单独与核酸元件结合的失活Cas9可以通过空间阻 碍RNA聚合酶机制来抑制转录。此外，失活的Cas可以用作其他蛋白质(例 如，转录抑制因子、激活剂和募集结构域)的导航装置，其影响靶位点处的 基因表达而不会向靶核酸引入不可逆突变。例如，dCas9可以与转录抑制因子 结构域如KRAB或SID效应子融合，以促进靶位点的表观遗传沉默。Cas9 还可以通过与VP16/VP64或p64激活结构域融合而转化为合成的转录激活 因子。在一些情况下，使用称为增强Cas9(eCa9)核酸酶的突变体II型核酸 酶代替野生型Cas9核酸酶。增强Cas9经过合理设计，以通过减弱非靶标结 合来提高特异性。这是通过中和非靶链条槽内的带正电荷的残基来实现的 (Slaymaker等，2016)。
在一些实施方案中，Cas9核酸酶指导靶序列位置处的一条或两条链的切 割，例如在靶序列内和/或靶序列的互补序列内。在一些实施方案中，Cas9核 酸酶在来自靶序列的第一个或最后一个核苷酸的约1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、15、20、25、50、100、200、500或更多碱基对内指导一条或两条链 的切割。
在通过Cas9核酸酶进行定向DNA切割后，存在两种可用于细胞的DNA 修复模式：同源定向修复(HDR)和非同源末端连接(NHEJ)。虽然通过在 接近突变位点的Cas9切割之后HDR无缝校正突变是有吸引力的，但该方法 的效率意味着它只能用于干细胞或诱导多能干细胞(iPSC)的体外/离体修饰， 需要额外的步骤，以选择那些已进行修复并仅纯化那些经修饰的细胞。HDR 不会在细胞中高频发生。幸运的是，NHEJ以更高的效率发生，并且可意适用 于许多角膜营养不良所描述的显性负性突变。在另一些实施方案中，Cas9核 酸酶来自链球菌。在另一些实施方案中，Cas9核酸酶来自酿脓链球菌(Spy)、 停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)、犬链球菌(Streptococcus canis)、马 链球菌(Streptococcus equi)、海豚链球菌(Streptococcus iniae)、海豹链球菌(Streptococcus phocae)、假链球菌(Streptococcus pseudoporcinus)、口腔链球 菌(Streptococcus oralis)、假链球菌(Streptococcus pseudoporcinus)、婴儿链 球菌(Streptococcus infantarius)、变形链球菌(Streptococcus mutans)、无乳 链球菌(Streptococcus agalactiae)、卡氏链球菌(Streptococcus caballi)、马肠 链球菌(Streptococcus equinus)、链球菌口腔分类群(Streptococcus sp.oral taxon)、轻型链球菌(Streptococcus mitis)、解没食子酸链球菌(Streptococcus gallolyticus)、戈登链球菌(Streptococcus gordonii)、巴氏链球菌(Streptococcus pasteurianus)或其变体。这些变体可以包括D10A Nickase、在Kleinstiver等， 2016Nature，529，490-495中描述的Spy Cas9-HF1或者在Slaymaker等，2016 Science，35l(6268)，84-88中描述的Spy eCas9。在另一些实施方案中，Cas9核 酸酶来自葡萄球菌(Staphylococcus)。在另一些实施方案中，Cas9核酸酶来 自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、猴葡萄球菌(S.simiae)、耳葡萄 球菌(S.auricularis)、肉葡萄球菌(S.carnosus)、调料葡萄球菌(S.condimenti)、(S.massiliensis)、鱼发酵葡萄球菌(S.piscifermentans)、模仿葡萄球菌 (S.simulans)、头部葡萄球菌(S.capitis)、山羊葡萄球菌(S.caprae)、S表皮 葡萄球菌(S.epidermidis)、解糖葡萄球菌(S.saccharolyticus)、德氏葡萄球菌 (S.devriesei)，溶血葡萄球菌(S.haemolyticus)、人葡萄球菌(S.hominis)、阿 尼蒂斯葡萄球菌(S.agnetis)、产色葡萄球菌(S.chromogenes)、猫葡萄球菌 (S.felis)、海豚葡萄球菌(S.delphini)、猪葡萄球菌(S.hyicus)、中间葡萄球 菌(S.intermedius)、水獭葡萄球菌(S.lutrae)、田鼠葡萄球菌(S.microti)、 蝇葡萄球菌(S.muscae)、假中间葡萄球菌(S.pseudintermedius)、喙葡萄球菌(S.rostri)、施氏葡萄球菌(S.schleiferi)、路邓葡萄球菌(S.lugdunensis)、 阿尔莱特葡萄球菌(S.arlettae)、孔氏葡萄球菌(S.cohnii)、马胃葡萄球菌(S. equorum)、鸡葡萄球菌(S.gallinarum)、克氏葡萄球菌(S.kloosii)、S.leei、 尼泊尔葡萄球菌(S.nepalensis)、腐生葡萄球菌(S.saprophyticus)、琥珀葡萄 球菌(S.succinus)、木糖葡萄球菌(S.xylosus)、鸡葡萄球菌(S.fleurettii)、 缓慢葡萄球菌(S.lentus)、松鼠葡萄球菌(S.sciuri)、S.stepanovicii、小牛葡 萄球菌(S.vitulinus)、模拟葡萄球菌(S.simulans)、巴氏葡萄球菌(S.pasteuri)、 沃氏葡萄球菌(S.warneri)或其变体。
在另一些实施方案中，Cas9核酸酶不包括来自酿脓链球菌的Cas9核酸 酶。
在另一些实施方案中，Cas9核酸酶包含与选自SEQ ID NO：4或8的氨基 酸序列具有至少约60％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、 71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、 83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在又一些实 施方案中，编码Cas9核酸酶的核苷酸分子包含选自SEQ ID NO：3或7的核苷酸序列具有至少约60％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、 71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、 83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，Cas9核酸酶为增强Cas9核酸酶，其具有改善Cas9 核酸酶的特异性的一个或更多个突变。在另一些实施方案中，增强Cas9核酸 酶来自酿脓链球菌的Cas9核酸酶，其具有中和带正电荷的凹槽的一个或更多 个突变，位于Cas9核酸酶中的HNH、RuvC和PAM相互作用结构域之间。 在另一些实施方案中，Cas9核酸酶包含与来自酿脓链球菌的Cas9核酸酶的突 变氨基酸序列((例如，SEQ ID NO：4))具有至少约60％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、 78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列 同一性的氨基酸序列，其中具有选自(i)K855A，(ii)K810A、K1003A和 R1060A和(iii)K848A、K1003A和R1060A的一种或更多种突变。在另一 些实施方案中，编码Cas9核酸酶的核苷酸分子包含与编码突变氨基酸序列具 有至少约60％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、 85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，CRISPR/Cas9系统和使用本文所述的CRISPR/Cas9 系统的方法通过NHEJ改变DNA序列。在另一些实施方案中，本文所述的 CRISPR/Cas9系统或载体不包括修复核苷酸分子。
在一些实施方案中，本文所述的方法通过HDR改变DNA序列，例如图 14中所示。在另一些实施方案中，该HDR方法可以用于MECD的基因治疗 的离体方法。在另一些实施方案中，该方法可以不是等位基因特异性的，并 且可以用于修复KRT12密码子129、130、132、133和135中的突变。
在一些实施方案中，本文所述的CRISPR/Cas9系统或载体还可以包含修 复核苷酸分子。由Cas9核酸酶切割的靶多核苷酸可以通过与修复核苷酸分子 的同源重组来修复，其是外源模板多核苷酸。该修复可以导致突变，包括所 述靶多核苷酸的一个或更多个核苷酸的插入、缺失或取代。在通过HDR途径 修复II型核酸酶诱导的DSB时，修复核苷酸分子将特定等位基因(例如，野 生型等位基因)引入多种干细胞的一种或更多种细胞的基因组中。在一些实 施方案中，修复核苷酸分子为单链DNA(ssDNA)。在另一些实施方案中， 将修复核苷酸分子作为质粒载体引入细胞中。在一些实施方案中，修复核苷 酸分子的长度为20至25、25至30、30至35、35至40、40至45、45至50、 50至55、55至60、60至65、65至70、70至75、75至80、80至85、85 至90、90至95、95至100、100至105、105至1l0、110至115、115至120、 120至125、125至130、130至135、135至140、140至145、145至150、 150至155、155至160、160至165、165至170、170至175、175至180、 180至185、185至190、190至195或195至200个核苷酸。在一些实施方案 中，修复核苷酸分子的长度为200至300、300、to 400、400至500、500至 600、600至700、700至800、800至900、900至1,000个核苷酸。在另一些 实施方案中，修复核苷酸分子的长度为1,000至2,000、2,000至3,000、3,000 至4,000、4,000至5,000、5,000至6,000、6,000至7,000、7,000至8,000、8,000 至9,000或9,000至10,000个核苷酸。在一些实施方案中，修复核苷酸分子能 够通过HDR途径在干细胞基因组的区域进行同源重组，干细胞基因组的区域 包括与本文所述的角膜营养不良相关的突变(即，“角膜营养不良靶核酸”)。在某些实施方案中，修复核酸能够与TGFBI、KRT3、KRT12、GSN和UBIAD1 基因内的靶核酸同源重组。在一些具体实施方案中，修复核苷酸分子能够与 编码本文所述突变氨基酸的KRT12基因(例如Leu132Pro)中的核酸同源重 组。在一些实施方案中，载体包括多种修复核苷酸分子。
修复核苷酸分子还可以包括用于鉴定和分选含有特定突变的本文所述细 胞的标记物。可以与修复核苷酸分子一起包括的示例性标记物包括可以通过 长度或序列鉴定的荧光标记物和核酸条形码。
在另一些实施方案中，本文所述的CRISPR/Cas9系统或载体可以包括至 少一种核定位信号(NLS)。在另一些实施方案中，sgRNA和Cas9核酸酶包 括在同一载体上或不同载体上。
在另一个方面，本公开内容涉及用于改变至少一种基因产物表达的方法， 包括将本文所述的工程化CRISPR/Cas9系统引入含有并表达具有靶序列和编 码该基因产物的DNA分子的细胞中。可以使用任何合适的方法将工程化 CRISPR/Cas9系统引入细胞中。在一些实施方案中，引入可以包括将本文所 述的工程化CRISPR/Cas9系统施用于培养基中或宿主生物中的细胞。
用于引入工程化CRISPR/Cas9系统的示例性方法包括但不限于转染、电 穿孔和基于病毒的方法。在一些情况下，一种或更多种细胞摄取试剂为转染 试剂。转染试剂包括，例如，基于聚合物的(例如DEAE葡聚糖)转染试剂 和阳离子脂质体介导的转染试剂。电穿孔方法也可以用于促进核酸操作试剂 的摄取。通过施加外部场，诱导细胞中的跨膜电位改变，并且当跨膜电位净 值(施加的和静息的电位差之和)大于阈值时，在膜中产生瞬时渗透结构， 实现了电穿孔。参见，例如Gehl等，Acta Physiol.Scand.177：437-447(2003)。 工程化CRISPR/Cas9系统也可以通过病毒转导递送到细胞。合适的病毒递送 系统包括但不限于腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒和慢病毒递送系统。这种 病毒递送系统在细胞对转染具有抗性的情况下是有用的。使用病毒介导的递 送系统的方法还可以包括制备编码核酸操作试剂的病毒载体和将载体包装到 病毒颗粒中的步骤。其他递送核酸试剂的方法包括但不限于脂转染、核转染、 显微注射、生物射弹、病毒体、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质：核酸 缀合物、裸DNA、人工病毒粒子和核酸摄取增强试剂。参见eiwoehner等， NucleicAcidsRes.42：1341-1353(2014)，和美国专利号5,049,386，4,946,787和 4,897,355，为了所有目的，其全部内容通过引用并入本文，特别是与试剂递 送系统相关的所有教导。在一些实施方案中，通过非病毒载体递送系统进行 引入，所述非病毒载体递送系统包括DNA质粒、RNA(例如，本文所述载体 的转录物)、裸核酸和与递送载体(例如脂质体)复合的核酸。递送可以为细 胞(例如，体外或离体施用)或靶组织(例如，体内施用)。
可以使用任何合适的方法分离已经历核酸改变事件的细胞(即，“经改变 的”细胞)。在一些实施方案中，修复核苷酸分子还包含编码选择标记物的核 酸。在这些实施方案中，修复核苷酸分子与宿主干细胞基因组的成功同源重 组也伴随着选择标记物的整合。因此，在这些实施方案中，阳性标记物用于 选择经改变的细胞。在一些实施方案中，选择标记物允许经改变的细胞在药 物存在下存活，否则该药物将杀死细胞。这些选择标记物包括但不限于赋予 对新霉素、嘌呤霉素或潮霉素B的抗性的阳性选择标记物。此外，选择标记 物可以是允许在同类型的细胞群中可视地鉴定经改变的细胞的产物，其中一 些不包含选择标记物。这种选择标记物的实例包括但不限于绿色荧光蛋白 (GFP)，其可以通过其荧光显现；荧光素酶基因，当暴露于其底物荧光素时， 可以通过其发光显现；和β-半乳糖苷酶(β-gal)，当与其底物接触时产生特 征颜色。这些选择标记物是本领域熟知的，编码这些标记物的核酸序列是可 商购的(参见，例如，Sambrook等，Molecular Cloning：A LaboratoryManual (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989))。使用可通过荧光可视化的选择标 记物的方法还使用荧光激活细胞分选(FACS)技术对其进行分类。可以使用 经分离的操作细胞建立用于移植的细胞系。可以使用任何合适的方法培养分 离出的经改变的细胞以产生稳定的细胞系。
在一些实施方案中，工程化CRISPR/Cas9系统包含(a)与本文所述的靶 序列杂交的sgRNA可操作连接的第一调节元件，和(b)与编码Cas9核酸酶 的核苷酸分子可操作连接的第二调节元件，其中组分(a)和(b)位于系统 的同一载体或不同载体上，sgRNA靶向靶序列，并且Cas9核酸酶切割DNA 分子。靶序列可以为与PAM的5’-端相邻的16至25个核苷酸互补的核苷酸 序列。在本文中“相邻”意指在参考位点的2或3个核苷酸内，包括“紧邻”， 这意味着在紧邻的核苷酸序列之间没有间插核苷酸，并且紧邻的核苷酸序列 在彼此的1个核苷酸内。在另一些实施方案中，细胞为真核细胞、或哺乳动 物或人细胞，并且调节元件为真核调节剂。在另一些实施方案中，细胞为本 文所述的干细胞。在一些实施方案中，Cas9核酸酶经密码子优化以在真核细 胞中表达。
在一些实施方案中，第一调节元件为聚合酶III启动子。在一些实施方案 中，第二调节元件为聚合酶II启动子。术语“调节元件”旨在包括启动子、 增强子、内部核糖体进入位点(IRES)和其他表达控制元件(例如转录终止 信号，例如多腺苷酸化信号和多U序列)。这种调节元件在例如Goeddel，GENE EXPRESSION TECHNOLOGY：METHODS IN ENZYMOLOGY185，Academic Press，San Diego，Calif.(1990)中被描述。调节元件包括在许多类型的宿主细胞 中指导核苷酸序列组成型表达的那些和仅在某些宿主细胞中指导核苷酸序列 表达的那些(例如，组织特异性调节序列)。组织特异性启动子可以主要在期 望的目标组织中指导表达，例如肌肉、神经元、骨、皮肤、血液、特定器官 (例如肝脏、胰腺)或特定细胞类型(例如淋巴细胞)。调节元件还可以以时 间依赖性方式指导表达，例如以细胞周期依赖性或发育阶段依赖性方式，其 可以是或可以不是对组织或细胞类型特异性的。在一些实施方案中，载体包 含一种或更多种pol III启动子(例如，1、2、3、4、5或更多种pol I启动子)、 一种或更多种pol II启动子(例如，1、2、3、4、5或更多种pol II启动子)、 一种或更多种pol I启动子(例如，1、2、3、4、5或更多种pol I启动子)或 其组合。pol III启动子的实例包括但不限于U6和H1启动子。pol II启动子 的实例包括但不限于逆转录病毒Rous肉瘤病毒(RSV)LTR启动子(任选地 具有RSV增强子)、巨细胞病毒(CMV)启动子(任选地具有CMV增强子)[参见例如Boshart等，Cell，41：521-530(1985)]、SV40启动子、二氢叶酸还原 酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子和EF1 α启动 子。术语“调节元件”还包括增强子元件，例如WPRE；CMV增强子；HTLV-1 的LTR中的R-U5’片段(Mol.Cell.Biol.，Vol.8(1)，p.466-472，1988)；SV40增 强子；和兔β-珠蛋白的外显子2和3之间的内含子序列(Proc.Natl.Acad.Sci. USA.，Vol.78(3)，p.1527-31，1981)。
在一些实施方案中，本文提供的Cas9核酸酶可以为诱导型Cas9核酸酶， 其被优化用于以时间或细胞类型依赖性方式表达。第一调节元件可以为可与 Cas9核酸酶连接的诱导型启动子，包括但不限于四环素诱导型启动子、金属 硫蛋白启动子、四环素诱导型启动子、甲硫氨酸诱导型启动子(例如MET25、 MET3启动子)以及半乳糖诱导型启动子(GAL1、GAL7和GAL10启动子)。 其他合适的启动子包括ADH1和ADH2醇脱氢酶启动子(在葡萄糖中抑制， 当葡萄糖耗尽并产生乙醇时诱导)、CUP1金属硫蛋白启动子(在Cu2+、Zn2+存在下诱导)、PHO5启动子、CYC1启动子、HIS3启动子、PGK启动子、 GAPDH启动子、ADC1启动子、TRP1启动子、URA3启动子、LEU2启动子、 ENO启动子、TP1启动子和AOX1启动子。
本领域技术人员应理解，表达载体的设计可以取决于如下因素，例如待 转化宿主细胞的选择、期望的表达水平。可以将载体引入宿主细胞中由此产 生转录物、蛋白质或肽，包括由本文所述的核酸编码的融合蛋白或肽(例如， 规则成簇的散布的短回文重复序列(CRISPR)转录物、蛋白质、酶、其突变 体形式、其融合蛋白等)。
术语“载体”是指能够转运与其连接的另一种核酸的核酸分子。载体包 括但不限于单链、双链或部分双链的核酸分子；核酸分子包含一个或更多个 游离末端，或没有游离末端(例如，环状)；包含DNA、RNA或两者的核酸 分子；以及本领域已知的其他多核苷酸种类。一种类型的载体为“质粒”，其 是指环状双链DNA环，其中可以插入另外的DNA片段，例如通过标准分子 克隆技术。另一种类型的载体为病毒载体，其中病毒衍生的DNA或RNA序 列存在于载体中以包装成病毒(例如逆转录病毒、复制缺陷型逆转录病毒、 腺病毒、复制缺陷型腺病毒和腺相关病毒)。病毒载体还包括由病毒携带的用 于转染到宿主细胞中的多核苷酸。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自 主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他 载体(例如，非附加型哺乳动物载体)在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的 基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们可操 作地连接的基因的表达。这种载体在本文中称为“表达载体”。在重组DNA 技术中有用的常见表达载体通常是质粒的形式。重组表达载体可以包含适于 在宿主细胞中表达核酸的形式的本发明的核酸，这意味着重组表达载体包含 一种或更多种调节元件，其可以根据用于表达的宿主细胞进行选择，其与待 表达的核酸序列可操作连接。在重组表达载体内，“可操作连接”旨在意指目 标核苷酸序列以允许核苷酸序列表达的方式与调节元件连接(例如，在体外 转录/翻译系统或当载体被引入宿主细胞时在宿主细胞中)。有利的载体包括慢 病毒和腺相关病毒，并且还可以选择这些载体的类型用于靶向特定类型的细 胞。
在另一个方面，本公开内容涉及用于在受试者中预防、改善或治疗与基 因突变或单核苷酸多态性(SNP)相关的疾病的方法，包括通过本文所述的 方法改变受试者的基因产物表达，其中DNA分子包含突变体或SNP突变序 列。
在另一个方面，本公开内容涉及用于在受试者中预防、改善或治疗与基 因突变或SNP相关的角膜营养不良的方法。可以使用该方法治疗的受试者包 括但不限于哺乳动物受试者，例如小鼠、大鼠、狗、狒狒、猪或人。在一些 实施方案中，受试者是人。该方法可以用于治疗至少1年、2年、3年、5年、 10年、15年、20年、25年、30年、35年、40年、45年、50年、55年、60年、65年、70年、75年、80年、85年、90年、95年或100年的受试者。在 一些实施方案中，治疗受试者的至少一种、两种、三种或四种角膜营养不良。 例如，可以设计单一或多种crRNA或sgRNA以改变与单一或多种角膜营养 不良相关的多个突变或SNP位点或祖先突变或SNP位点处的核苷酸。
如本文所用，“角膜营养不良”是指眼外层(角膜)中的一组遗传性疾病 中的任一种。例如，角膜营养不良的特征在于角膜中物质的双侧异常沉积。 角膜营养不良包括但不限于以下四种IC3D类别的角膜营养不良(参见，例如， Weiss，Cornea 34(2)：117-59(2015))：上皮和上皮下营养不良、上皮-间质TGF βI营养不良、间质营养不良和内皮营养不良。在一些实施方案中，角膜营养 不良选自上皮基底膜营养不良(EBMD)、Meesmann角膜营养不良(MECD)、 Thiel-Behnke角膜营养不良(TBCD)、网格状角膜营养不良(LCD)、颗粒状角膜营养不良(GCD)和Schnyder角膜营养不良(SCD)。在另一些实施方 案中，本文的角膜营养不良不包括MECD。
在另一些实施方案中，角膜营养不良是由一种或更多种突变引起的，包 括SNP，位于选自转化生长因子、β诱导的(TGFBI)、角蛋白3(KRT3)、 角蛋白12(KRT12)、GSN和UBIA异戊二烯基转移酶结构域1(UBIAD1) 的基因中。在另一些实施方案中，突变或SNP位点导致在如本文所示的突变 蛋白中编码突变氨基酸。在另一些实施方案中，包含突变或SNP位点的突变 序列编码选自以下的突变蛋白：(i)TGFBI(例如蛋白质登录号Q15582)中 包含对应于Leu509Arg、Arg666Ser、Gly623Asp、Arg555Gln、Arg124Cys、 Val505Asp、Ile522Asn、Leu569Arg、His572Arg、Arg496Trp、Pro501 Thr、 Arg514Pro、Phe515Leu、Leu518Pro、Leu518Arg、Leu527Arg、Thr538Pro、 Thr538Arg、Val539Asp、Phe540del、Phe540Ser、Asn544Ser、Ala546Thr、Ala546Asp、Phe547Ser、Pro551Gln、Leu558Pro、His572del、Gly594Val、 Val613del、Va1613Gly、Met619Lys、Ala620Asp、Asn622His、Asn622Lys、Asn622Lys、Gly623Arg、Gly623Asp、Val624_Va1625del、Val624Met、Val625Asp、His626Arg、His626Pro、Val627SerfsX44、Thr629_Asn630insAsnValPro、 Val631Asp、Arg666Ser、Arg555Trp、Arg124Ser、Asp123delins、Arg124His、 Arg124Leu、Leu509Pro、Leu103_Ser104del、Val113Ile、Asp123His、Arg124Leu 和/或Thr125_Glu126del突变的突变TGFBI蛋白；(ii)角蛋白3蛋白(例如 蛋白质登录号P12035或NP_476429.2)中包含对应于Glu498Val、Arg503Pro 和/或Glu509Lys突变的突变KRT3蛋白；(iii)KRT12(例如蛋白质登录号 Q99456.1或NP_000214.1)中具有Met129Thr、Met129Val、Gln130Pro、 Leu132Pro、Leu132Va、Leu132His、Asn133Iys、Arg135Gly、Arg135Ile、 Arg135Thr、Arg135Ser、Ala137Pro、Leu140Arg、Val143Leu、Val143Leu、 Lle391_Leu399dup、Ile 426Val、Ile426Ser、Tyr429Asp、Tyr429Cys、Arg430Pro 和/或Leu433Arg的突变KRT12蛋白；(iv)GSN(例如蛋白质登录号P06396) 中具有Asp214Tyr的突变GSN蛋白；(v)UBIAD1(例如蛋白质登录号Q9Y5Z9) 中包含突变对应于Ala97Thr、Gly98Ser、Asn102Ser、Asp1l2Asn、Asp112Gly、Asp118Gly、Arg119Gly、Leu121Val、Leu121Phe、Val122Glu、Val122Gly、 Ser171Pro、Tyr174Cys、Thr175Ile、Gly177Arg、Lys181Arg、Gly186Arg、 Leu188His、Asn232Ser、Asn233His、Asp236Glu和/或Asp240Asn突变的突变 UBIAD1蛋白。例如，包含突变或SNP位点的突变序列编码突变TGFB1蛋白 的至少一部分，其通过在对应于蛋白质登录号Q15582的氨基酸位置509的氨 基酸位置用Arg替换Leu而突变。在这种情况下，突变或SNP位点处的突变可能负责编码对应于蛋白质登录号Q15582的氨基酸位置509的氨基酸位置处 的突变氨基酸。如本文所用，“对应于”人蛋白质中的特定突变的突变可以包 括在人蛋白质的特定突变的相应位点处发生的不同物种中的突变。同样如本 文所用，当突变蛋白被描述为包括特定突变体，例如Leu509Arg时，这种突 变蛋白可以包含发生在对应于相关人蛋白中的特定突变体的突变位点的任何 突变，例如，如本文所述的蛋白质登录号Q15582的TGFBI蛋白质。
在一些实施方案中，本文所述的突变体排除KRT12蛋白中的任何突变。 在一些实施方案中，本文所述的突变体排除了对应于KRT12(例如蛋白质登 录号Q99456.1)中Leu132Pro的突变。在另一些实施方案中，本文所述的突 变或SNP排除了KRT12基因中发生的任何SNP。在另一些实施方案中，本文 所述的突变或SNP排除导致KRT12蛋白中的Leu132Pro突变的任何SNP。突 变或SNP还可以排除PAM位点(AAG＞AGG)处的SNP，其导致KRT12蛋 白中的Leu132Pro突变。
在一些实施方案中，本文所述的CRISPR/Cas9系统和使用其的方法可以 改变多个SNP位点或祖先SNP处的突变序列。这种方法将利用侧翼PAM， 如图15至图16所示。在另一些实施方案中，本文所述的突变序列可以包含 至少一个、两个、三个、四个或更多个SNP位点，并且本文所述的方法改变 与至少一个、两个、三个、四个或更多个SNP位点相关的基因产物的表达。 例如，本文所述的方法可以改变R154P和L518R处的突变TGFB1蛋白或 R135T和L132P处的KRTl2蛋白的表达。在一些实施方案中，sgRNA可以包 含与位于侧翼内含子中的PAM位点相邻的靶序列，野生型和突变体等位基因 共有的，其与对突变等位基因特异的PAM位点相邻的sgRNA串联。
人基因组本质上是二倍体；除雄性X染色体和Y染色体外，每条染色体 都是一对遗传，一个来自雄性，一个来自雌性。当寻找大于几千个碱基对的 连续DNA序列延伸时，确定遗传对于理解这些DNA的起源是哪个亲本是至 关重要的。此外，大多数SNP在人基因组内作为杂合子存在，即从雄性或雌 性遗传。已经使用更长的读取测序技术来试图产生单倍型分辨的基因组序列， 即单倍型定相。因此，当研究长于50kbs的特定DNA片段的基因组序列时，可以利用单倍型定相序列分析来确定哪个配对染色体携带目标序列。可以采 用更长的定相测序读取来确定目标SNP是否适合作为本文所述的 CRISPR/Cas9基因编辑系统的靶标。
在一个方面，本文所述的包括鉴定引起疾病的突变或SNP的任一侧上的 可靶向突变或SNP的方法被确定用来使引起疾病的突变或SNP沉默。在一些 实施方案中，在分阶段测序实验中鉴定DNA块。在一些实施方案中，目标突 变或SNP不是CRISPR/Cas9系统的合适底物，并且鉴定适合于CRISPR/Cas9 切割的引起疾病的突变或SNP两侧的突变或SNP允许去除引起疾病的突变或 SNP的DNA片段。在一些实施方案中，可以通过使用Weisenfeld NI，Kumar V， Shah P，Church DM，Jaffe DB.Direct determination of diploid genomesequences. Genome research.2017；27(5)：757-767中描述的技术增加读取长度以获得更长 的连续读取和单倍型定相基因组。直接确定二倍体基因组序列，其全部内容 通过引用并入本文。
在本文提供的方法的一些实施方案中，治疗用于提供关于疾病或病症(例 如，角膜营养不良)的阳性治疗反应。“阳性治疗反应”旨在改善疾病或病症， 和/或改善与疾病或病症相关的症状。可以使用任何合适的方法评估本发明治 疗方法的治疗效果。在一些实施方案中，在涉及角膜上蛋白质沉积的角膜营 养不良的情况下，通过治疗后与对照(例如，治疗之前蛋白质沉积的量)相 比，受试者角膜上蛋白质沉积的减少来评估治疗。在某些实施方案中，与进 行治疗前的角膜相比，本发明方法将受试者中角膜蛋白沉积的量减少至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、 65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。角膜混浊也可以用于使 用本文方法来评估治疗效果。此外，在一些实施方案中，通过视觉功能评估 治疗。可以使用本领域已知的任何合适的测试来进行受试者中视觉功能的评 估，包括但不限于未矫正视力(UCVA)、最佳矫正视力(BCVA)和亮度敏 锐度测试(BAT)的评估。参见，例如，Awaad等，Am J Ophthalmol.145(4)： 656-661(2008)and Sharhan等，BrJ Ophthalmol 84：837-841(2000)，为了所有 目的，其通过引用整体并入本文中，特别是与评估视力的标准相关的所有教 导。在某些实施方案中，与进行治疗前的角膜相比，受试者的视敏度提高至 少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、 65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
在一些实施方案中，用于在受试者中预防、改善或治疗与SNP相关的角 膜营养不良的方法可以包括向受试者施用有效量的本文所述的工程化
CRISPR/Cas9系统。术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以产生有益或 期望结果的药剂的量。治疗有效量可以根据以下一个或更多个而变化：待治 疗的受试者和疾病状况、受试者的体重和年龄、疾病状况的严重程度、施用 方式等，本领域普通技术人员可以容易地确定。该术语还适用于通过本文所 述的任一种成像方法检测的图像来提供的剂量。具体剂量可以根据以下一个 或更多个因素而变化：所选择的特定药剂、要遵循的给药方案、是否与其他 化合物联合给药、给药时间、待成像组织和携带其的物理递送系统。
本文所述的工程化CRISPR/Cas9系统可以包含至少一种载体，其包含(i) 编码本文所述的Cas9核酸酶的核苷酸分子，和(ii)本文所述的sgRNA。sgRNA 可以包含与原型间隔区相邻基序(PAM)的5’-末端相邻的靶序列，和/或与与PAM的5’末端相邻的第二靶序列互补的第一靶序列杂交。在一些实施方案中， 靶序列或PAM包含SNP位点。在一些实施方案中，Cas9核酸酶和sgRNA不 天然一起出现。在一些实施方案中，除了向导RNA分子和靶DNA之间的序 列特异性退火之外，Cas9核酸酶的DNA切割还需要存在与向导RNA结合位 点的3’端相邻的原型间隔区相邻基序(PAM)。该PAM位点的序列特异于所 使用的Cas9核酸酶。在另一些实施方案中，PAM包含SNP位点。在又一些 实施方案中，PAM由选自NGG和NNGRRT的PAM组成，其中N为A、T、 G和C中的任一个，并且R为A或G。在又一些实施方案中，施用包括将工 程化CRISPR/Cas9系统引入受试者的角膜(例如，角膜基质)，例如，通过将 工程化CRISPR/Cas9系统注射到受试者的角膜(例如，角膜基质)中和/或通 过将工程化CRISPR/Cas9系统引入含有并表达具有靶序列的DNA分子的细 胞。
在另一个方面，本公开内容涉及用于在有需要的受试者中治疗角膜营养 不良的方法，其包括：(a)从受试者中获得多种干细胞，该干细胞包含角膜 营养不良靶核酸中的核酸突变；(b)操作多种干细胞中的一种或更多种干细 胞的核酸突变以校正核酸突变，从而形成一种或更多种经操作的干细胞；(c) 分离一种或更多种经操作的干细胞；(d)将一种或更多种经操作的干细胞移 植到受试者体内，其中操作多种干细胞中的一种或更多种干细胞的核酸突变 包括进行如本文所述的改变基因产物或基因产物表达的任何方法，或者用于 在受试者中预防、改善或治疗与SNP相关的疾病的任何方法。
本文的方法可以包括获得多种干细胞。根据待治疗的角膜营养不良的类 型，可以使用任何合适的干细胞用于本发明方法。在某些实施方案中，干细 胞获自异源供体。在这些实施方案中，异源供体和待治疗的受试者的干细胞 是供体-受体组织相容的。在某些实施方案中，从需要治疗角膜营养不良的受 试者获得自体干细胞。获得的干细胞在与待治疗的特定角膜营养不良相关的 基因中携带突变(例如，如上所述，在具有上皮-基质营养不良的受试者的TGF β1中具有突变的干细胞)。合适的干细胞包括但不限于牙髓干细胞、毛囊干细胞，间充质干细胞、脐带衬里干细胞、胚胎干细胞、口腔粘膜上皮干细胞 和角膜缘上皮干细胞。
在一些实施方案中，多种干细胞包括角膜缘上皮干细胞。角膜缘上皮干 细胞(LESC)位于角膜的角膜缘区域，负责维持和修复角膜表面。不受任何 特定操作理论的束缚，据信LESC经历不对称细胞分裂，产生保留在干细胞 生态位中的干细胞以重新填充干细胞库，以及子代早期瞬时扩增细胞 (eTAC)。这种更分化的eTAC从干细胞生态位中移除，并且能够分裂以进一 步产生瞬时扩增细胞(TAC)，最终产生终末分化细胞(DC)。例如，可以通过从受试者的眼睛进行活组织检查来获得LESC。参见，例如Pellegrini等， Lancet 349：990-993(1997)。可以使用任何合适的技术分离和分选从角膜缘活 组织检查获得的LESC以用于本文的方法，这些技术包括但不限于荧光激活 细胞分选(FACS)和离心技术。可以使用干细胞相关标志物的阳性表达和分 化标志物的阴性表达从活组织检查中分选LESC。阳性干细胞标志物包括但不 限于转录因子p63、ABCG2、C/EBP δ和Bmi-1。阴性角膜特异性标志物包括 但不限于细胞角蛋白3(CK3)、细胞角蛋白12(CK12)、连接蛋白43和外皮 蛋白。在一些实施方案中，多种干细胞对p63、ABCG2或其组合的表达呈阳 性。在某些实施方案中，多种干细胞中的至少65％、70％、75％、80％.85％、 86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％ 或99％的细胞表达p63、ABCG2、C/EBP δ和Bmi-1或其组合。在一些实施 方案中，多种干细胞对CK3、CK12、连接蛋白43、外皮蛋白或其组合的表达 是阴性的。在某些实施方案中，多种干细胞中的至少65％、70％、75％、80％. 85％、86％、88％.89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％或99％的细胞不表达CK12、连接蛋白43、外皮蛋白或其组合。用于LESC 的其他标记物在例如Takacs等，Cytometry A 75：54-66(2009)中被描述，为了所 有目的，其通过引用整体并入，特别是与LESC标记物有关的所有教导。干 细胞特征(例如细胞大小和高核与细胞质比例)也可以用于帮助鉴定LESC。
除了LESC之外，从受试者的角膜分离的其他干细胞也可以与本文的方 法一起使用。示例性角膜干细胞包括但不限于基质干细胞、基质成纤维细胞 样细胞、基质间充质细胞、神经嵴衍生的角膜干细胞和假定的内皮干细胞。
在一些实施方案中，与本文的方法一起使用的细胞为从受试者角膜分离 的基质干细胞。可以使用任何合适的方法分离基质干细胞，包括但不限于 Funderburgh等，FASEBJ 19：1371-1373(2005)；Yoshida等，Invest Ophtalmol Vis Sci 46：1653-1658(2005)；Du等Stem Cells 1266-1275(2005)；Dravida等.，Brain Res Dev Brain Res 160：239-251(2005)；和Polisetty等Mol Vis 14：431-442 (2008)中描述的那些，为了所有目的，其全部内容通过引用并入本文，特别是 涉及各种基质干细胞的分离和培养的所有教导。
作为这些基质干细胞特征的标记物包括但不限于Bmi-1、Kit、Notch-1、 Six2、Pax6、ABCG2、Spag10和p62/OSIL。在一些实施方案中，多种干细胞 中的至少65％、70％、75％、80％、85％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的细胞表达Bmi-1、Kit、Notch-1、 Six2、Pax6、ABCG2、Spag10或p62/OSIL或其组合。在某些实施方案中， 基质干细胞对CD31、SSEA-4、CD73、CD105呈阳性，对CD34、CD45、CD123、CD133、CD14、CD106和HLA-DR呈阴性。在某些实施方案中，多种干细胞 中的至少65％、70％、75％、80％、85％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的细胞对CD31、SSEA-4、CD73 呈阳性、CD105和CD34、CD45、CD123、CD133、CD14、CDl06和HLA-DR 呈阴性。在另一些实施方案中，基质干细胞对CD105、CD106、CD54、CD166、 CD90、CD29、CD71、Pax6呈阳性，对SSEA-1、Tra1-81、Tra1-61、CD31、 CD45、CD11a、CD11c、CD14、CD138、Flk1、Flt1和VE-钙粘蛋白呈阴性。 在某些实施方案中，多种干细胞中的至少65％、70％、75％、80％、85％、86％. 88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％or 99％ 的细胞对CD105、CD106、CD54、CD166、CD90、CD29、CD71、Pax6呈阳 性，对SSEA-1、Tra1-81、Tra1-61、CD31、CD45、CD11a、CD11c、CD14、 CD138、Flk1、Flt1和VE-钙粘蛋白呈阴性。
在某些实施方案中，与本文所述的方法一起使用的细胞是从受试者角膜 分离的内皮干细胞。例如，分离这种干细胞的方法在Engelmann等，Invest Ophthalmol Vis Sci29：1656-1662(1988)中被描述，为了所有目的，其通过引用 整体并入，特别是与角膜内皮干细胞的分离和培养相关的所有教导。
在分离后，可以使用任何合适的方法培养多种干细胞(例如LESC)以产 生稳定的细胞系。例如，培养物可以在成纤维细胞(例如3T3)存在或不存 在下作为饲养细胞维持。在其他情况下，人羊膜上皮细胞或人胚胎成纤维细 胞用作培养物的饲养层。用于培养LESC的合适技术在Takacs等Cytometry A 75：54-66(2009)，Shortt等，Surv Opthalmol Vis Sci52：483-502(2007)；和 Cauchi等Am J Ophthalmol 146：251-259(2008)中被描述，为了所有目的，其 通过引用整体并入，特别是与LESC的培养相关的所有教导。
在分离多种干细胞之后，通过本文所述的方法操作或改变多种干细胞中 的一种或更多种干细胞的核酸突变，以校正角膜营养不良靶核酸中的核酸突 变。如本文所用，“角膜营养不良靶核酸”是指包含与本文所述的一种或更多 种角膜营养不良相关的突变体的核酸。
待操作的干细胞包括来自从分离的干细胞建立的干细胞系个体分离的干 细胞或干细胞。可以使用任何合适的遗传操作方法来校正干细胞中的核酸突 变。
在另一个方面，本文提供了包含用于治疗角膜营养不良的CRISPR/Cas9 系统的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包括本文所述的一种或更多种 sgRNA、Cas9核酸酶和修复核苷酸分子，包括如本文所述的待修复的突变的 野生型等位基因。在一些实施方案中，试剂盒还包括促进细胞对核酸操作的 摄取的试剂，例如转染剂或电穿孔缓冲液。在一些实施方案中，本文提供的 该试剂盒包括一种或更多种用于检测或分离干细胞的试剂，例如，可以与 FACS结合使用的一种或更多种阳性干细胞标记物的标记抗体。
在另一个方面，本公开内容涉及sgRNA对和包含sgRNA对的试剂盒， 该sgRNA对包含CRISPR/Cas9系统的至少两种sgRNA以使引起疾病的突变 或SNP沉默，例如用于预防、改善或治疗角膜营养不良。在一些实施方案中， sgRNA对用于使TGFBI基因中的引起疾病的突变或SNP沉默。sgRNA对包 含sgRNA，其包含在TGFBI基因中的产生PAM的祖先突变或SNP(例如， 顺式在具有引起疾病的突变或SNP的内含子中)的向导序列。在另一些实施 方案中，sgRNA对包含sgRNA，其包含在TGFBI基因的内含子区域中产生 PAM的祖先SNP的共同向导序列。
在一些实施方案中，本公开内容涉及设计用于CRISPR/Cas9系统的 sgRNA对，该sgRNA对包含(i)第一sgRNA，其包含(a)顺式在引起疾病 的突变或SNP的3’-端的产生第一原型间隔区相邻基序(PAM)的突变或单核 苷酸多态性(SNP)的第一crRNA序列，和(b)tracrRNA序列，其中第一 crRNA序列和tracrRNA序列不是天然一起出现的；(ii)第二sgRNA，其包 含(a)顺式在引起疾病的突变或SNP的5’-端的产生第二PAM的突变或单核 苷酸多态性(SNP)的第二crRNA向导序列；(b)tracrRNA序列，其中第二 crRNA序列和tracrRNA序列不是天然一起出现的。
在另一些实施方案中，CRISPR/Cas9系统用于预防、改善或治疗角膜营 养不良。产生PAM的突变或SNP可以位于TGFBI基因中。在另一些实施方 案中，产生PAM的突变或SNP位于TGFBI基因的内含子中。在另一些实施 方案中，第一和第二crRNA序列中的至少一种包含选自图19至图35所列序 列的核苷酸序列；和/或第一和第二crRNA序列中的至少一种包含选自表2所 列序列的核苷酸序列。
实施例 提供以下实施例以说明本发明的各种实施方案。应理解，这些实 施例不代表也不旨在表示排他性实施方案；这些实施例仅用于说明本发明的 实施。
突变分析：分析与多种角膜营养不良相关的突变以确定哪些仅是错义突 变或框内插入/缺失。该分析表明，对于大多数K12和TGFBI疾病，无义或 移码的插入/缺失突变与疾病无关。此外，对外显子组变体数据库的分析证实， 在这些基因中发现的任何天然存在的无义、移码插入/缺失或剪接位点突变未 显示与这些个体的疾病相关。
突变分析揭示了以下角膜营养不良基因适合于靶向核酸酶基因治疗(表 1)。
表1：适合于CRISPR/Cas9介导的方法的基因及其相关的角膜营养不良
对该报道进行了合适的角膜营养不良基因研究，以确定可以通过PAM特 异性方法或指导等位基因特异性方法靶向的突变数量。PAM特异性方法需要 引起疾病的SNP以产生新的PAM，而等位基因特异性方法涉及设计包含引起 疾病的SNP的向导。通过Benchlign’s在线基因组编辑设计工具鉴定和分析TGFBI中产生具有＞10％的次要等位基因频率(MAF)的新PAM的所有非引 起疾病的SNP。MAF＞10％的SNP的选择可以提供合理的机会，即与引起疾 病的突变顺式发现导致新PAM的SNP。与引起疾病的突变呈“顺式”是指与 引起疾病的突变在同一分子的DNA或染色体上。发现产生新PAM的SNP可 以在例如TGFBI基因的内含子或外显子中与引起疾病的突变顺式。分析 TGFBI内的所有变体以确定是否创建了新的PAM(表2)。
如图15所示，变体在TGFBI内的位置，其中大多数SNP聚集在内含子 中。因此，使用该方法可以同时靶向位于外显子11、12和14的热点中的多 个TGFBI突变。因此，CRISPRCas9系统可以针对多于一个具有突变的患者 或家族。以这种方式设计的一个CRISPR/Cas9系统可以用于治疗一系列 TGFBI突变。CRISPR/Cas9系统可以使用与位于侧翼内含子中的PAM位点相 邻的sgRNA，其是野生型和突变体等位基因共有的，与PAM位点相邻的 sgRNA串联，该位点特异于突变等位基因(图16)。这在野生型等位基因的 内含子中导致不应具有功能效应的NHEJ，而在突变体等位基因中导致包含两 个切割位点之间的DNA的缺失。在从具有合适SNP谱的患者分离的白细胞 中证明了该技术。
构建体：使用表达Cas9和sgRNA的三种质粒。所用的非靶向质粒为 pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)(Broad Institute，MIT；Addgene质粒48139； 图7)。根据公布的方案(RanFA等，Nat Protoc 2013；8：2281-2308)，通过退 火和克隆以下2种引物(LifeTechnologies，Paisley，UK)来设计含有对 K12-L132P等位基因特异的sgRNA的质粒：pSpCas9(BB)-2A-Puro中的 5′-CACCGTAGGAAGCTAATCTATCATT-3’和 5′-AAACAATGATAGATTAGCTTCCTAC-3’。该sgRNA对应于在K12-L132P 等位基因上发现的等位基因特异性PAM的3′端的20个核苷酸(图1，红色)， 下文称为sgK12LP。构建靶向野生型和突变体K12序列的Cas9/sgRNA质粒 (Sigma，Gillingham，UK)，用作阳性对照(图1，绿色)。
先前描述的另外的K12表达构建体用于评估等位基因特异性和效力。使 用具有插入有终止密码子3’的K12-WT或K12-L132P的完整mRNA序列的萤 火虫荧光素酶质粒，下文分别称为K12WT-Luc和K12LP-Luc(Liao H，等 PLoS One 2011；6：e28582.)和用于成熟血细胞凝集素(HA)标记的K12-WT 和K12-L132P蛋白的表达质粒(Courtney DG，等InvestOphthalmol Vis Sci 2014；55：3352-3360.)，下文称为K12WT-HA和K12LP-HA。Renilla萤光素 酶(pRL-CMV，Promega，Southampton，UK)的表达构建体用于双荧光素酶测 定以使转染效率归一化。
双荧光素酶测定：使用双荧光素酶测定法对外源构建体中的三个测试 sgRNA的效力和等位基因特异性进行定量，使用如前所述的方法(Courtney DG，等Invest OphthalmolVis Sci 2014；55：977-985；Allen EHA，等Invest Ophthalmol Vis Sci 2013；54：494-502；Atkinson SD，等J Invest Dermatol 2011； 131：2079-2086)。简而言之，使用Lipofectamine 2000(Life Technologies)用 以1∶4比例的K12WT-Luc或K12LP-Luc表达构建体和sgNSC、sgK12或 sgK12LP构建体转染HEKAD293细胞(Life Technologies)。将细胞孵育72 小时，然后裂解，并对萤火虫和海肾荧光素酶的活性进行定量分析。总之， 对于每种转染条件进行8次重复。
Western印迹：采用如前所述的方法，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen) 将sgRNAHA标记的野生型(K12WT-HA)和突变体(K12LP-HA)表达构建 体(Liao H，等PLoS One2011；6：e28582.)在与sgRNA呈1∶4的比例下瞬时 共转染到每个重复中的HEK AD293细胞中(Courtney DG，等Invest Ophthalmol Vis Sci 2014；55：977-985；Allen EHA，等InvestOphthalmol Vis Sci 2013；54： 494-502)。将经转染的细胞孵育72小时。采用标准方法使用针对HA的兔多 克隆抗体(Abcam，Cambridge，UK；ab9110，1∶2000)和针对人β-肌动蛋白的小鼠单克隆抗体(Sigma，1∶15000)分析HA标记的K12和β-肌动蛋白的表 达(Courtney DG，等Invest Ophthalmol Vis Sci 2014；55：977-985；Allen EHA， 等Invest OphthalmolVis Sci 2013；54：494-502)。将膜与次级辣根过氧化物缀 合的多克隆猪抗兔抗体(DakoCytomation，Ely，UK)或辣根过氧化物缀合的山 羊抗小鼠抗体(DakoCytomation)一起孵育。通过标准化学发光(Life Technologies)检测蛋白质结合。使用ImageJ(SchneiderCA，Rasband WS， Eliceiri KW.Nat Methods 2012；9：671-675)进行光密度测定，以对HA标记的 K12(n＝4)的条带强度进行定量。将其归一化为β-肌动蛋白的条带强度。
定量实时PCR：以与蛋白质印迹描述相同的方式进行转染；然而，将 K12WT-HA和K12LP-HA同时转柒到细胞中。所有转染均一式三份进行。转 柒后，将细胞孵育48小时，并使用RNAeasy Plus试剂盒(Qiagen，Venlo，The Netherlands)提取RNA。在转化500ng RNA(Life Technologies)的cDNA转 化后，进行定量实时PCR以对KRT12 mRNA的水平进行定量。使用KRT12 测定法(测定Id 140679；Roche，West Sussex，UK)以及HPRT测定法(测定 ID102079；Roche)和GAPDH测定法(测定ID 141139；Roche)。对于每种测 定，每个样品一式三份进行，并使用ΔΔCT方法(Livak KJ，Schmittgen TD. Methods 2001；25：402-408)计算相对基因表达。使用BestKeeper软件工具将 KRT12表达水平相对于HPRT和GAPDH归一化，其中两个参照基因的表达 在治疗组中被认为是“稳定的”。(Pfaffl MW，TichopadA，PrgometC，Neuvians TP.Biotechnol Lett 2004；26：509-515)。
焦磷酸测序：使用通过定量逆转录酶-PCR评估的相同cDNA样品，进行 焦磷酸测序以确定剩余K12-L132P mRNA与K12-WT mRNA之比，如先前所 述(Courtney DG等InvestOphthalmol Vis Sci 2014；55：3352-3360)。
KRT12转基因小鼠：获得C57小鼠模型，敲入人K12-L132P等位基因以 替换内源小鼠KRT12编码序列。这允许通过等位基因特异性sgRNA和Cas9 对KRT12-L132P进行体内靶向。使用24周龄的雌性杂交小鼠，其中存在一 个拷贝的人K12-L132P等位基因和一个拷贝的鼠KRT12。使用标准PCR和 Sanger双脱氧核苷酸测序对小鼠进行基因分型并确认K12-L132P等位基因的 杂合性。不需要动物随机化，因为该研究调查了治疗对一个角膜的影响，而 同一动物的另一个角膜用作阴性对照。调查人员在这项研究中没有盲目。所 有实验均符合道德规范，并经当地伦理委员会批准。
体内基质内眼注射：为了实现等位基因特异性sgRNA和Cas9的瞬时表 达，按照先前描述的方案，通过基质内眼注射将sgK12LP质粒引入杂合敲入 小鼠的角膜基质中((Moore JE，McMullen CBT，Mahon G，Adamis AP.DNA Cell Biol 21：443-451)。为了评估该递送方法，首先向野生型小鼠注射4μg的 Cas9-GFP质粒(pCas9D10A_GFP)(Addgene质粒44720)。在24小时、48 小时和72小时宰杀小鼠，并将角膜固定在4％多聚甲醛中并使用标准组织学 方法处理。切割5微米厚的切片，再水化并通过荧光显微镜成像。给小鼠施 用全身麻醉剂和角膜局部麻醉剂。合格的眼科医生将分别在总共3μl磷酸盐 缓冲盐水中稀释的4μg sgK12LP或sgNSC质粒注射到四只小鼠的右眼和左眼 的角膜中。处理后48小时宰杀小鼠。
NHEJ的测序和测定：一旦小鼠被宰杀，将眼摘出并解剖角膜。使用DNA 提取试剂盒(Qiagen)提取gDNA，并将样品合并为两个处理组：sgK12LP 和sgNSC。使用以下两种引物对样品进行PCR扩增以扩增K12-L132P突变周 围的区域：5′-ACACCCATCTTGCAGCCTAT-3’和5′-AAAATTCCCAAAGCGCCTC-3’。将PCR产物凝胶纯化并连接到CloneJet 克隆载体(LifeTechnologies)中用于转化DH5α感受态细胞(Life Technologies)。选择总共13个克隆，并按照制造商的程序使用小量制备试剂 盒(Qiagen)制备质粒DNA。然后使用CloneJet载体提供的测序引物对来自13个克隆的DNA进行测序(Department of Zoology,University ofOxford)。正 如Zhang Lab在线工具(crispr,mit.edu)预测的，小鼠基因组中sgK12LP的两个最可能的外显子脱靶位点以相同的方式进行评估，其中选择10个菌落用于 每个预测的脱靶分析。预测的脱靶位点是 5′-TAAGTAGCTGATCTATCAGTGGG-3’(Gon41)和 5′-TGGGAAGCATATCTGTCATTTGG-3’(Asphd1)。仅选择了这两个站点，因 为它们是唯一两个计算的脱靶得分＞0.1的位点。
统计：除非另有说明，所有误差条代表标准差。使用非配对t检验计算 显著性，因为所有样品显示相同的分布。统计显著性设定为0.05％。在组间 计算差异并认为是相似的。
KRT12特异性sgRNA的构建：对引起MECD的KRT12错义突变导致的 序列变化的分析揭示了导致严重形式的MECD的L132P突变巧合地导致产生 新的PAM位点(AAG＞AGG)。针对可能的脱靶，使用由Zhang lab，MIT 2013 在线提供的“Optimized CRISPR Design Tool”设计并评估与由KRT12 L132P 突变产生的新PAM位点的5’-端相邻的20个核苷酸序列互补的sgRNA (sgK12LP)(图1，红色)。使用该系统计算sgRNA，得分66％，其中得分＞ 50％被认为具有高质量的，具有有限数量的预测可能脱靶。
体外sgK12LP等位基因特异性和效力的评估：使用野生型和突变体K12 的外源表达构建体，在HEKAD293细胞中体外评估sgK12LP的等位基因特 异性和效力。首先使用双荧光素酶报道基因测定确定等位基因特异性(图2a)。 发现萤火虫荧光素酶活性在表达K12WT-Luc或K12LP-Luc并用sgK12处理 的细胞中显著降低。在用sgK12LP处理的细胞中，观察到萤火虫荧光素酶活 性的效力和等位基因特异性降低。在表达K12LP-Luc的细胞中，观察到降低 73.4±2.7％(P＜0.001)(图2a)。通过western印迹，在表达K12WT-HA或 K12LP-HA的细胞中观察到该等位基因特异性和有效的敲低(图2b；代表四 个印迹的图像)，并且与K12WT-HA蛋白相比，通过光密度测定法的定量揭 示通过sgK12LP导致K12LP-HA蛋白显著降低32％(P＜0.05)。在用sgK12 处理的细胞中，发现野生型和突变体K12蛋白均已减少，而在用sgK12LP处 理的细胞中，似乎对野生型蛋白的表达没有影响，但对突变体K12蛋白的显著敲低(图2b)。
为了支持在蛋白质水平观察到的数据，对逆转录酶-PCR和焦磷酸测序进 行定量以确定mRNA水平的等位基因特异性和效力。在同时表达野生型和突 变体K12(以1∶1表达比率)并用三种测试Cas9/sgRNA表达构建体(NSC、 K12和K12LP)处理的细胞中，使用定量逆转录酶-PCR来确定总K12mRNA 敲低(图2c)。在经sgK12处理的细胞中观察到总K12mRNA的效力降低73.1 ±4.2％(P＜0.001)，在经sgK12LP处理的细胞中测量的降低了52.6±7.0％ (P＜0.01)(图2c)。使用焦磷酸测序确定用这些sgRNA处理后剩余的成熟 mRNA种类的细胞内比例(图2d)。mRNA的比例计算为“K12-L132P的百 分比”/K12-WT的百分比。将经sgNSC处理的细胞归一化为1，假设突变体 和野生型K12mRNA之间的比例为1∶1。在用sgK12测试的细胞中，观察到 K12突变体mRNA比例为0.89±0.03，但与NSC对照的差异不显著(P＜0.14)。 与经sgNSC处理的细胞相比，在经sgK12LP处理的那些细胞中，检测到K12 突变体mRNA比例为0.28±0.02，并且改变显著(P＜0.001)(图2d)。
体内sgRNA-K12LP功效的确定：Cas9-GFP构建体的基质内注射在注射 后24小时导致角膜上皮中存在绿色荧光蛋白(GFP)蛋白(图3a)。在注射 后48小时发现GFP的瞬时表达。在将sgK12LP或sgNSC表达构建体基质内 注射到K12-L132P人源化杂交小鼠中并孵育48小时后，对小鼠实施安乐死并 从角膜制备基因组DNA(gDNA)。合并来自四只经sgK12LP-或sgNSC处理 的动物角膜的gDNA，并进行人源化K12-L132P基因的外显子1的PCR扩增、 克隆和测序。在来自经sgNSC处理的眼的gDNA建立的10个克隆中， K12-L132P序列总体上保持完整。对来自经sgK12LP处理的眼的13个单克隆 进行测序；发现8个含有未改变的KRT12L132P人序列，而5个克隆在Cas9 /sgK12LP复合物的预测切割位点周围显示NHEJ(图3b)。在一个克隆(1) 中，发现1个核苷酸的插入及32个核苷酸的缺失。在体内观察到多达53个 核苷酸的大量缺失(克隆5)。在这5个克隆中，4个含有缺失(克隆1和3 至5)预计会导致移码，导致早期终止密码子的出现。使用该方法还评估了小 鼠中前2个预测的sgK12LP的外显子脱靶位点。对每个靶标测序10个克隆， 未发现任何克隆经历非特异性切割。
与通过R514P、L518R、L509R和L527R的突变产生的PAM位点相关 的TGFBI突变：设计单一向导RNA以靶向这些突变中的每一个并克隆到 sgRNA/Cas9表达质粒中。此外，针对每个突变设计了利用天然存在的近邻 PAM的阳性对照向导RNA。将野生型和突变体靶序列克隆到荧光素酶报道质 粒中，以允许我们监测基因编辑对WT和MUT表达的表达影响。使用两种质 粒转染AD293细胞，并且使用我们的高通量报道基因测定法在CRISPR Cas9 处理后72小时测量荧光素酶表达，以测量细胞中存在的MUT和WT DNA的 量。
所附图4显示对于使用SNP衍生的PAM方法评估的这些TGFBI突变 (R514P、L518R、L509R和L527R)中的每一个，实现了显著的等位基因特 异性，其中突变等位基因被CRISPRCas9系统切割并且在某种程度上WT DNA切割了一些向导。
与位于与PAM位点相邻的靶区域内的SNP突变相关的TGFBI突变：设 计单一向导RNA以靶向这些突变并克隆到sgRNA/Cas9表达质粒中。将野生 型和突变体靶序列克隆到荧光素酶报道质粒中，并在我们的高通量报道基因 测定中进行评估。使用两种质粒转染AD293细胞，并在三天后测量荧光素酶 表达。
评估长度为16聚体至22聚体的向导以确定哪个长度达到最大等位基因 特异性以改善特异性。除了向导长度外，还评估了是否在向导的5’-端添加双 鸟嘌呤有助于提高特异性。向导序列显示基于向导序列的不同切割效率，并 且添加双鸟嘌呤通常不会提高切割效率(图5，A至E图)。
为了改善等位基因特异性，将靶向R124H的20聚体向导克隆到增强Cas9 质粒中。增强Cas9经过合理设计以防止非靶标切割。通过双荧光素酶测定法 观察到野生型序列切割的明显减少和等位基因特异性的增加(例如，野生型 序列的切割效率与突变序列的切割效率之间的差异)(图5，F图)。
为了确认DNA切割，制备含有野生型TGFBI序列或突变体TGFBI序列 的双链DNA模板。将模板与合成向导和Cas9蛋白在37℃下在体外孵育1小 时。在琼脂糖凝胶上进行片段分析以确定切割能力(图5，G图)。
其他体内研究
活动物成像：用于活体成像的所有小鼠在12至25周龄之间。为了成像， 使用1.5％至2％异氟烷(Abbott Laboratories Ltd.，Berkshire，UK)以约1.5升/ 分钟的氧气流麻醉小鼠。将1∶1w/v与Viscotears凝胶(Novartis，Camberley， UK)混合的荧光素底物(30mg/mlD-荧光素钾盐；Gold Biotechnology，St. Louis，USA)混合物滴到杂合KRT12+/luc2转基因小鼠的眼睛上，立即成像。 使用Xenogen IVIS Lumina(Perkin Elmer，Cambridge，UK)量化发光。使用如 前所述的方案，选择环绕小鼠眼的目标区域用于定量其大小，形状始终保持恒定。使用Xenogen IVIS Lumina在注射Cy3标记的siRNA的小鼠中也观察 到荧光。
基质内注射：如前所述，通过基质内注射将Cas9/sgRNA构建体递送至 小鼠角膜。这由训练有素的眼科医生(J.E.M.)进行。为了评估角膜内核酸的 分布，将2μl的150pmol/μl Cy3标记的Accell修饰的siRNA进行胚内注射到 WT C57BL/6J小鼠的右眼中。为了评估Cy3标记的siRNA的持久性，在注射 后0、6、24、48和72小时，在Xenogen IVIS Lumina系统上对动物进行活体 成像(n＝3)。另外，在注射后0、6和12小时处死小鼠(n＝3)，取出眼组 织并在-80℃冷冻。将组织固定在OCT中并冷冻切片用于荧光显微镜检查。
Cas9/sgRNA表达构建体的产生：获得表达Cas9和sgRNA的质粒 (pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459))，来自Feng Zhang教授的礼物(Broad Institute，MIT；Addgene plasmid#48139)。在Zhang Lab CRISPR设计工具 www.crispr.mit.edu的帮助下，在起始密码子的6Ibp内设计靶向luc2的 sgRNA。通过首先将寡核苷酸5′CAC CGT TTG TGC AGC TGC TCGCCG G 3’ 和5′AAA CCC GGC CAG CTG CAC AAA C 3’退火，然后连接到BbsI消化的pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)中来构建luc2特异性sgRNA，该质粒命名为 sgLuc2。将原始pSpCas9(BB)-2A-Puro质粒用作非靶向阴性对照，命名为 sgNSC。使用与之前描述的相似的双荧光素酶方法评估sgLuc2质粒的活性以 评估Cas9/sgRNA功效。简而言之，将luc2构建体(pGL4.17，Promega)与sgLuc2 或sgNSC(两种Cas9/sgRNA表达构建体，以1∶4的摩尔比)与Renilla荧光 素酶表达构建体共转染。如前所述，在荧光素酶定量之前，将细胞在转染后孵育48小时。
CRISPR/Cas9的体内评估：使用用于评估siRNA基因沉默的修改方案， 在K12-luc2转基因小鼠体内评估Cas9/sgLuc2质粒的效力。将sgLuc2(右眼) 和sgNSC(左眼)均以4μlPBS的总体积(浓度为500ng/μl)注射。每24小 时拍摄小鼠的实时图像(n＝4)，持续7天，然后每周一次，共6周(42天)。 通过计算右/左比例来确定荧光素酶抑制的定量，其值相对于第0天的值(作 为100％)归一化。
在该实验中，在角膜上皮细胞中专门表达Luc2的转基因小鼠模型中，使 用CRISPRCas9向导靶向Luc2基因，如下所示(sgRNA)，通过观察luc2表 达能够在视觉上显示角膜上皮中成功的基因编辑。因此，实质上这模拟KRT12 表达，因为它同样仅在角膜上皮中表达。该体外双荧光素酶测定证明sgLuc2P 构建体成功靶向Luc2，如当相对于未经处理的细胞归一化时荧光素酶活性的 显著降低所示(*显示代表p＜0.05)(未处理对照的归一化数据＝100％))(图 6)。在我们的角膜中表达Luc2的转基因小鼠中测试CRISPR Cas9sgLuc2向 导。使转基因小鼠模拟K12表达，因此在存在亮绿色的情况下存在大量KRT12 表达，在图7中，蓝色表示较少的KRT12表达，黑色表示根本没有表达KRT12。 右侧的眼睛注射测试sgLuc2，左侧的眼睛注射非靶向非特异性对照向导和 CRISPR。
如图7的表格所示，测量了Luc2表达的量。处理后，每天使用Xenogen IVIS活体动物成像仪对每只小鼠的角膜荧光素酶活性进行定量7天，然后每 7天进行定量，总共6周。每个处理组的荧光素酶活性表示为对照的百分比 (R/L比率％)。
确认等位基因特异性插入/缺失
淋巴细胞的EBV转化：取5ml全血样品并置于无菌50ml Falcon管中。 将含有20％胎牛血清的等体积RPMI培养基添加到全血中——通过轻轻倒置 管混合。将6.25mlFicoll-Paque PLUS(GE Healthcare目录号17-1440-02)置 于单独的无菌50ml Falcon管中。向Ficoll-Paque中添加10ml血液/培养基混 合物。将管在室温下以2000rpm旋转20分钟。在管底部形成的红血细胞是 Ficoll层。淋巴细胞在Ficoll层的顶部形成一层，而顶层是培养基。插入干净 的无菌Pastette以抽出淋巴细胞，将其置于无菌的15ml Falcon管中。将淋巴 细胞离心并洗涤。将EBV等分试样解冻并加入重悬的淋巴细胞中，并将混合 物在37℃(感染期)孵育1小时。将RPMI、20％FCS培养基和1mg/ml植 物血凝素加入到经EBV处理的淋巴细胞中，并将淋巴细胞置于24孔板上。
EBV转化的淋巴细胞(LCL)的电穿孔：将CRISPR构建体(具有共表 达的GFP或mCherry)添加到悬浮的EBV转化的淋巴细胞中，并将混合物转 移到电穿孔杯中。进行电穿孔，并将含有10％FBS的500μl预热的RPMI 1640 培养基加入到比色杯中。将比色杯的内容物转移到含有剩余的预热培养基的 12孔板中，并在核转柒后6小时，取出1ml培养基并用新鲜培养基替换。
GFP+和/或mCherry+活细胞的细胞分选：核转染后24小时，除去1ml 培养基，并将剩余的含有细胞的培养基收集在1.5ml Eppendorf中。将细胞离 心并以1∶1000稀释度重悬于添加有50ul eFlouro 780活力染色的200μl PBS中。 在又一次离心后，将细胞重悬于含有1x HBSS(不含Ca/Mg++)、5mM EDTA、 25mM HEPES pH7.0、5％FCS/FBS(热灭活)和10单位/mL DNA酶II的过 滤无菌FACS缓冲液中。分选细胞以分离活GFP+和/或mCherry+细胞，并收集在RPMI+20％FBS中。扩增细胞并从细胞中提取DNA。
用于测序的单个等位基因的分离：使用QIAmp DNA Mini Kit(Qiagen) 分离DNA，在整个CRISPR/Cas9靶向的区域中使用PCR。通过凝胶电泳确认 特异性扩增，并纯化PCR产物。将PCR产物平端化并连接到来自Clonejet 试剂盒(Thermo Scientific)的pJET1.2/blunt质粒中。将连接混合物转化到 感受态DH5α细胞中。挑取单菌落，并进行Sanger测序以确认编辑。结果数 据示于图17中。
序列表
<110> Avellino Lab USA, Inc.
<120> SINGLE向导 RNA, CRISPR/CAS9 SYSTEMS, AND METHODS OF USE THEREOF
<130> 070335-5010-WO
<150> 62/377,586
<151> 2016-08-20
<150> 62/462,808
<151> 2017-02-23
<150> 62/501,750
<151> 2017-05-05
<160> 898
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Spy Cas9 sgRNA序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> n is a, c, g, or u
<400> 1
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 2
<211> 82
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Spy Cas9 sgRNA序列
<400> 2
guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60
ggcaccgagu cggugcuuuu uu 82
<210> 3
<211> 3974
<212> DNA
<213> Streptococcus pyogenes
<400> 3
atggactata aggaccacga cggagactac aaggatcatg atattgatta caaagacgat 60
gacgataaga tggccccaaa gaagaagcgg aaggtcggta tccacggagt cccagcagcc 120
gacaagaagt acagcatcgg cctggacatc ggcaccaact ctgtgggctg ggccgtgatc 180
accgacgagt acaaggtgcc cagcaagaaa ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac 240
agcatcaaga agaacctgat cggagccctg ctgttcgaca gcggcgaaac agccgaggcc 300
acccggctga agagaaccgc cagaagaaga tacaccagac ggaagaaccg gatctgctat 360
ctgcaagaga tcttcagcaa cgagatggcc aaggtggacg acagcttctt ccacagactg 420
gaagagtcct tcctggtgga agaggataag aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac 480
atcgtggacg aggtggccta ccacgagaag taccccacca tctaccacct gagaaagaaa 540
ctggtggaca gcaccgacaa ggccgacctg cggctgatct atctggccct ggcccacatg 600
atcaagttcc ggggccactt cctgatcgag ggcgacctga accccgacaa cagcgacgtg 660
gacaagctgt tcatccagct ggtgcagacc tacaaccagc tgttcgagga aaaccccatc 720
aacgccagcg gcgtggacgc caaggccatc ctgtctgcca gactgagcaa gagcagacgg 780
ctggaaaatc tgatcgccca gctgcccggc gagaagaaga atggcctgtt cggaaacctg 840
attgccctga gcctgggcct gacccccaac ttcaagagca acttcgacct ggccgaggat 900
gccaaactgc agctgagcaa ggacacctac gacgacgacc tggacaacct gctggcccag 960
atcggcgacc agtacgccga cctgtttctg gccgccaaga acctgtccga cgccatcctg 1020
ctgagcgaca tcctgagagt gaacaccgag atcaccaagg cccccctgag cgcctctatg 1080
atcaagagat acgacgagca ccaccaggac ctgaccctgc tgaaagctct cgtgcggcag 1140
cagctgcctg agaagtacaa agagattttc ttcgaccaga gcaagaacgg ctacgccggc 1200
tacattgacg gcggagccag ccaggaagag ttctacaagt tcatcaagcc catcctggaa 1260
aagatggacg gcaccgagga actgctcgtg aagctgaaca gagaggacct gctgcggaag 1320
cagcggacct tcgacaacgg cagcatcccc caccagatcc acctgggaga gctgcacgcc 1380
attctgcggc ggcaggaaga tttttaccca ttcctgaagg acaaccggga aaagatcgag 1440
aagatcctga ccttccgcat cccctactac gtgggccctc tggccagggg aaacagcaga 1500
ttcgcctgga tgaccagaaa gagcgaggaa accatcaccc cctggaactt cgaggaagtg 1560
gtggacaagg gcgcttccgc ccagagcttc atcgagcgga tgaccaactt cgataagaac 1620
ctgcccaacg agaaggtgct gcccaagcac agcctgctgt acgagtactt caccgtgtat 1680
aacgagctga ccaaagtgaa atacgtgacc gagggaatga gaaagcccgc cttcctgagc 1740
ggcgagcaga aaaaggccat cgtggacctg ctgttcaaga ccaaccggaa agtgaccgtg 1800
aagcagctga aagaggacta cttcaagaaa atcgagtgct tcgactccgt ggaaatctcc 1860
ggcgtggaag atcggttcaa cgcctccctg ggcacatacc acgatctgct gaaaattatc 1920
aaggacaagg acttcctgga caatgaggaa aacgaggaca ttctggaaga tatcgtgctg 1980
accctgacac tgtttgagga cagagagatg atcgaggaac ggctgaaaac ctatgcccac 2040
ctgttcgacg acaaagtgat gaagcagctg aagcggcgga gatacaccgg ctggggcagg 2100
ctgagccgga agctgatcaa cggcatccgg gacaagcagt ccggcaagac aatcctggat 2160
ttcctgaagt ccgacggctt cgccaacaga aacttcatgc agctgatcca cgacgacagc 2220
ctgaccttta aagaggacat ccagaaagcc caggtgtccg gccagggcga tagcctgcac 2280
gagcacattg ccaatctggc cggcagcccc gccattaaga agggcatcct gcagacagtg 2340
aaggtggtgg acgagctcgt gaaagtgatg ggccggcaca agcccgagaa catcgtgatc 2400
gaaatggcca gagagaacca gaccacccag aagggacaga agaacagccg cgagagaatg 2460
aagcggatcg aagagggcat caaagagctg ggcagccaga tcctgaaaga acaccccgtg 2520
gaaaacaccc agctgcagaa cgagaagctg tacctgtact acctgcagaa tgggcgggat 2580
atgtacgtgg accaggaact ggacatcaac cggctgtccg actacgatgt ggaccatatc 2640
gtgcctcaga gctttctgaa ggacgactcc atcgacaaca aggtgctgac cagaagcgac 2700
aagaaccggg gcaagagcga caacgtgccc tccgaagagg tcgtgaagaa gatgaagaac 2760
tactggcggc agctgctgaa cgccaagctg attacccaga gaaagttcga caatctgacc 2820
aaggccgaga gaggcggcct gagcgaactg gataaggccg gcttcatcaa gagacagctg 2880
gtggaaaccc ggcagatcac aaagcacgtg gcacagatcc tggactcccg gatgaacact 2940
aagtacgacg agaatgacaa gctgatccgg gaagtgaaag tgatcaccct gaagtccaag 3000
ctggtgtccg atttccggaa ggatttccag ttttacaaag tgcgcgagat caacaactac 3060
caccacgccc acgacgccta cctgaacgcc gtcgtgggaa ccgccctgat caaaaagtac 3120
cctaagctgg aaagcgagtt cgtgtacggc gactacaagg tgtacgacgt gcggaagatg 3180
atcgccaaga gcgagcagga aatcggcaag gctaccgcca agtacttctt ctacagcaac 3240
atcatgaact ttttcaagac cgagattacc ctggccaacg gcgagatccg gaagcggcct 3300
ctgatcgaga caaacggcga aaccggggag atcgtgtggg ataagggccg ggattttgcc 3360
accgtgcgga aagtgctgag catgccccaa gtgaatatcg tgaaaaagac cgaggtgcag 3420
acaggcggct tcagcaaaga gtctatcctg cccaagagga acagcgataa gctgatcgcc 3480
agaaagaagg actgggaccc taagaagtac ggcggcttcg acagccccac cgtggcctat 3540
tctgtgctgg tggtggccaa agtggaaaag ggcaagtcca agaaactgaa gagtgtgaaa 3600
gagctgctgg ggatcaccat catggaaaga agcagcttcg agaagaatcc catcgacttt 3660
ctggaagcca agggctacaa agaagtgaaa aaggacctga tcatcaagct gcctaagtac 3720
tccctgttcg agctggaaaa cggccggaag agaatgctgg cctctgccgg cgaactgcag 3780
aagggaaacg aactggccct gccctccaaa tatgtgaact tcctgtacct ggccagccac 3840
tatgagaagc tgaagggctc ccccgaggat aatgagcaga aacagctgtt tgtggaacag 3900
cacaagcact acctggacga gatcatcgag cagatcagcg agttctccaa gagagtgatc 3960
ctggccgacg ctaa 3974
<210> 4
<211> 1423
<212> PRT
<213> Streptococcus pyogenes
<400> 4
Met Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp
1 5 10 15
Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
20 25 30
Gly Ile His Gly Val Pro Ala Ala Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu
35 40 45
Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr
50 55 60
Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His
65 70 75 80
Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu
85 90 95
Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr
100 105 110
Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu
115 120 125
Met Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe
130 135 140
Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn
145 150 155 160
Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His
165 170 175
Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu
180 185 190
Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu
195 200 205
Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe
210 215 220
Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile
225 230 235 240
Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser
245 250 255
Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys
260 265 270
Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr
275 280 285
Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln
290 295 300
Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln
305 310 315 320
Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser
325 330 335
Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr
340 345 350
Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His
355 360 365
Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu
370 375 380
Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly
385 390 395 400
Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys
405 410 415
Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu
420 425 430
Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser
435 440 445
Ile Pro His Gln Ile His Leu Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg
450 455 460
Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu
465 470 475 480
Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg
485 490 495
Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile
500 505 510
Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln
515 520 525
Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu
530 535 540
Lys Val Leu Pro Lys His Ser Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr
545 550 555 560
Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro
565 570 575
Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe
580 585 590
Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe
595 600 605
Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp
610 615 620
Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile
625 630 635 640
Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu
645 650 655
Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu
660 665 670
Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys
675 680 685
Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys
690 695 700
Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp
705 710 715 720
Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile
725 730 735
His Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val
740 745 750
Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly
755 760 765
Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp
770 775 780
Glu Leu Val Lys Val Met Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile
785 790 795 800
Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser
805 810 815
Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser
820 825 830
Gln Ile Leu Lys Glu His Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu
835 840 845
Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp
850 855 860
Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile
865 870 875 880
Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu
885 890 895
Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu
900 905 910
Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala
915 920 925
Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg
930 935 940
Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu
945 950 955 960
Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser
965 970 975
Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val
980 985 990
Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp
995 1000 1005
Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala
1010 1015 1020
His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys
1025 1030 1035
Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys
1040 1045 1050
Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys Ser Glu Gln Glu Ile
1055 1060 1065
Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn
1070 1075 1080
Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys
1085 1090 1095
Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp
1100 1105 1110
Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser Met
1115 1120 1125
Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly
1130 1135 1140
Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu
1145 1150 1155
Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe
1160 1165 1170
Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val
1175 1180 1185
Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu
1190 1195 1200
Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile
1205 1210 1215
Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu
1220 1225 1230
Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly
1235 1240 1245
Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn
1250 1255 1260
Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala
1265 1270 1275
Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln
1280 1285 1290
Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His Tyr Leu Asp Glu Ile
1295 1300 1305
Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp
1310 1315 1320
Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp
1325 1330 1335
Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu Phe Thr
1340 1345 1350
Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr
1355 1360 1365
Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp
1370 1375 1380
Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg
1385 1390 1395
Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp Lys Arg Pro Ala Ala Thr
1400 1405 1410
Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys
1415 1420
<210> 5
<211> 105
<212> RNA
<213> Staphylococcus aureus
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(22)
<223> n is a, c, g, or u
<400> 5
gnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnguuuuagu acucuggaaa cagaaucuac uaaaacaagg 60
caaaugccgu guuuaucucg ucaacuuguu ggcgaagauu uuuuu 105
<210> 6
<211> 83
<212> RNA
<213> Staphylococcus aureus
<400> 6
guuuuaguac ucuggaaaca gaaucuacua aaacaaggca aaugccgugu uuaucucguc 60
aacuuguugg cgaagauuuu uuu 83
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<211> 3345
<212> DNA
<213> Staphylococcus aureus
<400> 7
atggccccaa agaagaagcg gaaggtcggt atccacggag tcccagcagc caagcggaac 60
tacatcctgg gcctggacat cggcatcacc agcgtgggct acggcatcat cgactacgag 120
acacgggacg tgatcgatgc cggcgtgcgg ctgttcaaag aggccaacgt ggaaaacaac 180
gagggcaggc ggagcaagag aggcgccaga aggctgaagc ggcggaggcg gcatagaatc 240
cagagagtga agaagctgct gttcgactac aacctgctga ccgaccacag cgagctgagc 300
ggcatcaacc cctacgaggc cagagtgaag ggcctgagcc agaagctgag cgaggaagag 360
ttctctgccg ccctgctgca cctggccaag agaagaggcg tgcacaacgt gaacgaggtg 420
gaagaggaca ccggcaacga gctgtccacc aaagagcaga tcagccggaa cagcaaggcc 480
ctggaagaga aatacgtggc cgaactgcag ctggaacggc tgaagaaaga cggcgaagtg 540
cggggcagca tcaacagatt caagaccagc gactacgtga aagaagccaa acagctgctg 600
aaggtgcaga aggcctacca ccagctggac cagagcttca tcgacaccta catcgacctg 660
ctggaaaccc ggcggaccta ctatgaggga cctggcgagg gcagcccctt cggctggaag 720
gacatcaaag aatggtacga gatgctgatg ggccactgca cctacttccc cgaggaactg 780
cggagcgtga agtacgccta caacgccgac ctgtacaacg ccctgaacga cctgaacaat 840
ctcgtgatca ccagggacga gaacgagaag ctggaatatt acgagaagtt ccagatcatc 900
gagaacgtgt tcaagcagaa gaagaagccc accctgaagc agatcgccaa agaaatcctc 960
gtgaacgaag aggatattaa gggctacaga gtgaccagca ccggcaagcc cgagttcacc 1020
aacctgaagg tgtaccacga catcaaggac attaccgccc ggaaagagat tattgagaac 1080
gccgagctgc tggatcagat tgccaagatc ctgaccatct accagagcag cgaggacatc 1140
caggaagaac tgaccaatct gaactccgag ctgacccagg aagagatcga gcagatctct 1200
aatctgaagg gctataccgg cacccacaac ctgagcctga aggccatcaa cctgatcctg 1260
gacgagctgt ggcacaccaa cgacaaccag atcgctatct tcaaccggct gaagctggtg 1320
cccaagaagg tggacctgtc ccagcagaaa gagatcccca ccaccctggt ggacgacttc 1380
atcctgagcc ccgtcgtgaa gagaagcttc atccagagca tcaaagtgat caacgccatc 1440
atcaagaagt acggcctgcc caacgacatc attatcgagc tggcccgcga gaagaactcc 1500
aaggacgccc agaaaatgat caacgagatg cagaagcgga accggcagac caacgagcgg 1560
atcgaggaaa tcatccggac caccggcaaa gagaacgcca agtacctgat cgagaagatc 1620
aagctgcacg acatgcagga aggcaagtgc ctgtacagcc tggaagccat ccctctggaa 1680
gatctgctga acaacccctt caactatgag gtggaccaca tcatccccag aagcgtgtcc 1740
ttcgacaaca gcttcaacaa caaggtgctc gtgaagcagg aagaaaacag caagaagggc 1800
aaccggaccc cattccagta cctgagcagc agcgacagca agatcagcta cgaaaccttc 1860
aagaagcaca tcctgaatct ggccaagggc aagggcagaa tcagcaagac caagaaagag 1920
tatctgctgg aagaacggga catcaacagg ttctccgtgc agaaagactt catcaaccgg 1980
aacctggtgg ataccagata cgccaccaga ggcctgatga acctgctgcg gagctacttc 2040
agagtgaaca acctggacgt gaaagtgaag tccatcaatg gcggcttcac cagctttctg 2100
cggcggaagt ggaagtttaa gaaagagcgg aacaaggggt acaagcacca cgccgaggac 2160
gccctgatca ttgccaacgc cgatttcatc ttcaaagagt ggaagaaact ggacaaggcc 2220
aaaaaagtga tggaaaacca gatgttcgag gaaaagcagg ccgagagcat gcccgagatc 2280
gaaaccgagc aggagtacaa agagatcttc atcacccccc accagatcaa gcacattaag 2340
gacttcaagg actacaagta cagccaccgg gtggacaaga agcctaatag agagctgatt 2400
aacgacaccc tgtactccac ccggaaggac gacaagggca acaccctgat cgtgaacaat 2460
ctgaacggcc tgtacgacaa ggacaatgac aagctgaaaa agctgatcaa caagagcccc 2520
gaaaagctgc tgatgtacca ccacgacccc cagacctacc agaaactgaa gctgattatg 2580
gaacagtacg gcgacgagaa gaatcccctg tacaagtact acgaggaaac cgggaactac 2640
ctgaccaagt actccaaaaa ggacaacggc cccgtgatca agaagattaa gtattacggc 2700
aacaaactga acgcccatct ggacatcacc gacgactacc ccaacagcag aaacaaggtc 2760
gtgaagctgt ccctgaagcc ctacagattc gacgtgtacc tggacaatgg cgtgtacaag 2820
ttcgtgaccg tgaagaatct ggatgtgatc aaaaaagaaa actactacga agtgaatagc 2880
aagtgctatg aggaagctaa gaagctgaag aagatcagca accaggccga gtttatcgcc 2940
tccttctaca acaacgatct gatcaagatc aacggcgagc tgtatagagt gatcggcgtg 3000
aacaacgacc tgctgaaccg gatcgaagtg aacatgatcg acatcaccta ccgcgagtac 3060
ctggaaaaca tgaacgacaa gaggcccccc aggatcatta agacaatcgc ctccaagacc 3120
cagagcatta agaagtacag cacagacatt ctgggcaacc tgtatgaagt gaaatctaag 3180
aagcaccctc agatcatcaa aaagggcaaa aggccggcgg ccacgaaaaa ggccggccag 3240
gcaaaaaaga aaaagggatc ctacccatac gatgttccag attacgctta cccatacgat 3300
gttccagatt acgcttaccc atacgatgtt ccagattacg cttaa 3345
<210> 8
<211> 1114
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 8
Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Ile His Gly Val Pro Ala
1 5 10 15
Ala Lys Arg Asn Tyr Ile Leu Gly Leu Asp Ile Gly Ile Thr Ser Val
20 25 30
Gly Tyr Gly Ile Ile Asp Tyr Glu Thr Arg Asp Val Ile Asp Ala Gly
35 40 45
Val Arg Leu Phe Lys Glu Ala Asn Val Glu Asn Asn Glu Gly Arg Arg
50 55 60
Ser Lys Arg Gly Ala Arg Arg Leu Lys Arg Arg Arg Arg His Arg Ile
65 70 75 80
Gln Arg Val Lys Lys Leu Leu Phe Asp Tyr Asn Leu Leu Thr Asp His
85 90 95
Ser Glu Leu Ser Gly Ile Asn Pro Tyr Glu Ala Arg Val Lys Gly Leu
100 105 110
Ser Gln Lys Leu Ser Glu Glu Glu Phe Ser Ala Ala Leu Leu His Leu
115 120 125
Ala Lys Arg Arg Gly Val His Asn Val Asn Glu Val Glu Glu Asp Thr
130 135 140
Gly Asn Glu Leu Ser Thr Lys Glu Gln Ile Ser Arg Asn Ser Lys Ala
145 150 155 160
Leu Glu Glu Lys Tyr Val Ala Glu Leu Gln Leu Glu Arg Leu Lys Lys
165 170 175
Asp Gly Glu Val Arg Gly Ser Ile Asn Arg Phe Lys Thr Ser Asp Tyr
180 185 190
Val Lys Glu Ala Lys Gln Leu Leu Lys Val Gln Lys Ala Tyr His Gln
195 200 205
Leu Asp Gln Ser Phe Ile Asp Thr Tyr Ile Asp Leu Leu Glu Thr Arg
210 215 220
Arg Thr Tyr Tyr Glu Gly Pro Gly Glu Gly Ser Pro Phe Gly Trp Lys
225 230 235 240
Asp Ile Lys Glu Trp Tyr Glu Met Leu Met Gly His Cys Thr Tyr Phe
245 250 255
Pro Glu Glu Leu Arg Ser Val Lys Tyr Ala Tyr Asn Ala Asp Leu Tyr
260 265 270
Asn Ala Leu Asn Asp Leu Asn Asn Leu Val Ile Thr Arg Asp Glu Asn
275 280 285
Glu Lys Leu Glu Tyr Tyr Glu Lys Phe Gln Ile Ile Glu Asn Val Phe
290 295 300
Lys Gln Lys Lys Lys Pro Thr Leu Lys Gln Ile Ala Lys Glu Ile Leu
305 310 315 320
Val Asn Glu Glu Asp Ile Lys Gly Tyr Arg Val Thr Ser Thr Gly Lys
325 330 335
Pro Glu Phe Thr Asn Leu Lys Val Tyr His Asp Ile Lys Asp Ile Thr
340 345 350
Ala Arg Lys Glu Ile Ile Glu Asn Ala Glu Leu Leu Asp Gln Ile Ala
355 360 365
Lys Ile Leu Thr Ile Tyr Gln Ser Ser Glu Asp Ile Gln Glu Glu Leu
370 375 380
Thr Asn Leu Asn Ser Glu Leu Thr Gln Glu Glu Ile Glu Gln Ile Ser
385 390 395 400
Asn Leu Lys Gly Tyr Thr Gly Thr His Asn Leu Ser Leu Lys Ala Ile
405 410 415
Asn Leu Ile Leu Asp Glu Leu Trp His Thr Asn Asp Asn Gln Ile Ala
420 425 430
Ile Phe Asn Arg Leu Lys Leu Val Pro Lys Lys Val Asp Leu Ser Gln
435 440 445
Gln Lys Glu Ile Pro Thr Thr Leu Val Asp Asp Phe Ile Leu Ser Pro
450 455 460
Val Val Lys Arg Ser Phe Ile Gln Ser Ile Lys Val Ile Asn Ala Ile
465 470 475 480
Ile Lys Lys Tyr Gly Leu Pro Asn Asp Ile Ile Ile Glu Leu Ala Arg
485 490 495
Glu Lys Asn Ser Lys Asp Ala Gln Lys Met Ile Asn Glu Met Gln Lys
500 505 510
Arg Asn Arg Gln Thr Asn Glu Arg Ile Glu Glu Ile Ile Arg Thr Thr
515 520 525
Gly Lys Glu Asn Ala Lys Tyr Leu Ile Glu Lys Ile Lys Leu His Asp
530 535 540
Met Gln Glu Gly Lys Cys Leu Tyr Ser Leu Glu Ala Ile Pro Leu Glu
545 550 555 560
Asp Leu Leu Asn Asn Pro Phe Asn Tyr Glu Val Asp His Ile Ile Pro
565 570 575
Arg Ser Val Ser Phe Asp Asn Ser Phe Asn Asn Lys Val Leu Val Lys
580 585 590
Gln Glu Glu Asn Ser Lys Lys Gly Asn Arg Thr Pro Phe Gln Tyr Leu
595 600 605
Ser Ser Ser Asp Ser Lys Ile Ser Tyr Glu Thr Phe Lys Lys His Ile
610 615 620
Leu Asn Leu Ala Lys Gly Lys Gly Arg Ile Ser Lys Thr Lys Lys Glu
625 630 635 640
Tyr Leu Leu Glu Glu Arg Asp Ile Asn Arg Phe Ser Val Gln Lys Asp
645 650 655
Phe Ile Asn Arg Asn Leu Val Asp Thr Arg Tyr Ala Thr Arg Gly Leu
660 665 670
Met Asn Leu Leu Arg Ser Tyr Phe Arg Val Asn Asn Leu Asp Val Lys
675 680 685
Val Lys Ser Ile Asn Gly Gly Phe Thr Ser Phe Leu Arg Arg Lys Trp
690 695 700
Lys Phe Lys Lys Glu Arg Asn Lys Gly Tyr Lys His His Ala Glu Asp
705 710 715 720
Ala Leu Ile Ile Ala Asn Ala Asp Phe Ile Phe Lys Glu Trp Lys Lys
725 730 735
Leu Asp Lys Ala Lys Lys Val Met Glu Asn Gln Met Phe Glu Glu Lys
740 745 750
Gln Ala Glu Ser Met Pro Glu Ile Glu Thr Glu Gln Glu Tyr Lys Glu
755 760 765
Ile Phe Ile Thr Pro His Gln Ile Lys His Ile Lys Asp Phe Lys Asp
770 775 780
Tyr Lys Tyr Ser His Arg Val Asp Lys Lys Pro Asn Arg Glu Leu Ile
785 790 795 800
Asn Asp Thr Leu Tyr Ser Thr Arg Lys Asp Asp Lys Gly Asn Thr Leu
805 810 815
Ile Val Asn Asn Leu Asn Gly Leu Tyr Asp Lys Asp Asn Asp Lys Leu
820 825 830
Lys Lys Leu Ile Asn Lys Ser Pro Glu Lys Leu Leu Met Tyr His His
835 840 845
Asp Pro Gln Thr Tyr Gln Lys Leu Lys Leu Ile Met Glu Gln Tyr Gly
850 855 860
Asp Glu Lys Asn Pro Leu Tyr Lys Tyr Tyr Glu Glu Thr Gly Asn Tyr
865 870 875 880
Leu Thr Lys Tyr Ser Lys Lys Asp Asn Gly Pro Val Ile Lys Lys Ile
885 890 895
Lys Tyr Tyr Gly Asn Lys Leu Asn Ala His Leu Asp Ile Thr Asp Asp
900 905 910
Tyr Pro Asn Ser Arg Asn Lys Val Val Lys Leu Ser Leu Lys Pro Tyr
915 920 925
Arg Phe Asp Val Tyr Leu Asp Asn Gly Val Tyr Lys Phe Val Thr Val
930 935 940
Lys Asn Leu Asp Val Ile Lys Lys Glu Asn Tyr Tyr Glu Val Asn Ser
945 950 955 960
Lys Cys Tyr Glu Glu Ala Lys Lys Leu Lys Lys Ile Ser Asn Gln Ala
965 970 975
Glu Phe Ile Ala Ser Phe Tyr Asn Asn Asp Leu Ile Lys Ile Asn Gly
980 985 990
Glu Leu Tyr Arg Val Ile Gly Val Asn Asn Asp Leu Leu Asn Arg Ile
995 1000 1005
Glu Val Asn Met Ile Asp Ile Thr Tyr Arg Glu Tyr Leu Glu Asn
1010 1015 1020
Met Asn Asp Lys Arg Pro Pro Arg Ile Ile Lys Thr Ile Ala Ser
1025 1030 1035
Lys Thr Gln Ser Ile Lys Lys Tyr Ser Thr Asp Ile Leu Gly Asn
1040 1045 1050
Leu Tyr Glu Val Lys Ser Lys Lys His Pro Gln Ile Ile Lys Lys
1055 1060 1065
Gly Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys
1070 1075 1080
Lys Lys Gly Ser Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Tyr Pro
1085 1090 1095
Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr
1100 1105 1110
Ala
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用新PAM的20nt向导
<400> 9
aatgatagat tagcttccta 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用新PAM的20nt向导
<400> 10
taggaagcta atctatcatt 20
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用新PAM的20nt向导
<400> 11
caccgtagga agctaatcta tcatt 25
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用新PAM的20nt向导
<400> 12
caaaaatgat agattagctt cctac 25
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用新PAM的22nt向导
<400> 13
taatgataga ttagcttcct ac 22
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用新PAM的22nt向导
<400> 14
gtaggaagct aatctatcat ta 22
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用新PAM的22nt向导
<400> 15
caccggtagg aagctaatct atcatta 27
<210> 16
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用新PAM的22nt向导
<400> 16
caaataatga tagattagct tcctacc 27
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用新PAM的21nt向导
<400> 17
taatgataga ttagcttcct a 21
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用新PAM的21nt向导
<400> 18
taggaagcta atctatcatt a 21
<210> 19
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用新PAM的21nt向导
<400> 19
caccgtagga agctaatcta tcatta 26
<210> 20
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用新PAM的21nt向导
<400> 20
caaataatga tagattagct tcctac 26
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用新PAM的20nt向导
<400> 21
taatgataga ttagcttcct 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用新PAM的20nt向导
<400> 22
aggaagctaa tctatcatta 20
<210> 23
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用新PAM的20nt向导
<400> 23
caccgaggaa gctaatctat catta 25
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用新PAM的20nt向导
<400> 24
caaataatga tagattagct tcctc 25
<210> 25
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用新PAM的19nt向导
<400> 25
aatgatagat tagcttcct 19
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用新PAM的19nt向导
<400> 26
aggaagctaa tctatcatt 19
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用新PAM的19nt向导
<400> 27
caccgaggaa gctaatctat catt 24
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用新PAM的19nt向导
<400> 28
caaaaatgat agattagctt cctc 24
<210> 29
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用新PAM的18nt向导
<400> 29
atgatagatt agcttcct 18
<210> 30
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用新PAM的18nt向导
<400> 30
aggaagctaa tctatcat 18
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用新PAM的18nt向导
<400> 31
caccgaggaa gctaatctat cat 23
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用新PAM的18nt向导
<400> 32
caaaatgata gattagcttc ctc 23
<210> 33
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用新PAM的17nt向导
<400> 33
tgatagatta gcttcct 17
<210> 34
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用新PAM的17nt向导
<400> 34
aggaagctaa tctatca 17
<210> 35
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用新PAM的17nt向导
<400> 35
caccgaggaa gctaatctat ca 22
<210> 36
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用新PAM的17nt向导
<400> 36
caaatgatag attagcttcc tc 22
<210> 37
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用新PAM的16nt向导
<400> 37
gatagattag cttcct 16
<210> 38
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用新PAM的16nt向导
<400> 38
aggaagctaa tctatc 16
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用新PAM的16nt向导
<400> 39
caccgaggaa gctaatctat c 21
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 使用新PAM的16nt向导
<400> 40
caaagataga ttagcttcct c 21
<210> 41
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 22nt向导, 在种子区域的位点4突变
<400> 41
actcagctgt acacggactg ca 22
<210> 42
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 22nt向导, 在种子区域的位点4突变
<400> 42
actcagctgt acacggactg ca 22
<210> 43
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 22nt向导, 在种子区域的位点4突变
<400> 43
caccgactca gctgtacacg gactgca 27
<210> 44
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 22nt向导, 在种子区域的位点4突变
<400> 44
caaatgcagt ccgtgtacag ctgagtc 27
<210> 45
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 21nt向导, 在种子区域的位点4突变
<400> 45
ctcagctgta cacggactgc a 21
<210> 46
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 21nt向导, 在种子区域的位点4突变
<400> 46
ctcagctgta cacggactgc a 21
<210> 47
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 21nt向导, 在种子区域的位点4突变
<400> 47
caccgctcag ctgtacacgg actgca 26
<210> 48
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 21nt向导, 在种子区域的位点4突变
<400> 48
caaatgcagt ccgtgtacag ctgagc 26
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 20nt向导, 在种子区域的位点4突变22nt向导,
在种子区域的位点4突变
<400> 49
tcagctgtac acggactgca 20
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 20nt向导, 在种子区域的位点4突变22nt向导,
在种子区域的位点4突变
<400> 50
tcagctgtac acggactgca 20
<210> 51
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 20nt向导, 在种子区域的位点4突变22nt向导,
在种子区域的位点4突变
<400> 51
caccgtcagc tgtacacgga ctgca 25
<210> 52
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 20nt向导, 在种子区域的位点4突变22nt向导,
在种子区域的位点4突变
<400> 52
caaatgcagt ccgtgtacag ctgac 25
<210> 53
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 19nt向导, 在种子区域的位点4突变
<400> 53
cagctgtaca cggactgca 19
<210> 54
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 19nt向导, 在种子区域的位点4突变
<400> 54
cagctgtaca cggactgca 19
<210> 55
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 19nt向导, 在种子区域的位点4突变
<400> 55
caccgcagct gtacacggac tgca 24
<210> 56
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 19nt向导, 在种子区域的位点4突变
<400> 56
caaatgcagt ccgtgtacag ctgc 24
<210> 57
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 18nt向导, 在种子区域的位点4突变
<400> 57
agctgtacac ggactgca 18
<210> 58
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 18nt向导, 在种子区域的位点4突变
<400> 58
agctgtacac ggactgca 18
<210> 59
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 18nt向导, 在种子区域的位点4突变
<400> 59
caccgagctg tacacggact gca 23
<210> 60
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 18nt向导, 在种子区域的位点4突变
<400> 60
caaatgcagt ccgtgtacag ctc 23
<210> 61
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 17nt向导, 在种子区域的位点4突变
<400> 61
gctgtacacg gactgca 17
<210> 62
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 17nt向导, 在种子区域的位点4突变
<400> 62
gctgtacacg gactgca 17
<210> 63
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 17nt向导, 在种子区域的位点4突变
<400> 63
caccggctgt acacggactg ca 22
<210> 64
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 17nt向导, 在种子区域的位点4突变
<400> 64
caaatgcagt ccgtgtacag cc 22
<210> 65
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 16nt向导, 在种子区域的位点4突变
<400> 65
ctgtacacgg actgca 16
<210> 66
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 16nt向导, 在种子区域的位点4突变
<400> 66
ctgtacacgg actgca 16
<210> 67
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 16nt向导, 在种子区域的位点4突变
<400> 67
caccgctgta cacggactgc a 21
<210> 68
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 16nt向导, 在种子区域的位点4突变
<400> 68
caaatgcagt ccgtgtacag c 21
<210> 69
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 24nt向导, 在种子区域的位点3突变
<400> 69
ccactcagct gtacacggac caca 24
<210> 70
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 24nt向导, 在种子区域的位点3突变
<400> 70
ccactcagct gtacacggac caca 24
<210> 71
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 24nt向导, 在种子区域的位点3突变
<400> 71
caccgccact cagctgtaca cggaccaca 29
<210> 72
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 24nt向导, 在种子区域的位点3突变
<400> 72
caaatgtggt ccgtgtacag ctgagtggc 29
<210> 73
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 23nt向导, 在种子区域的位点3突变
<400> 73
cactcagctg tacacggacc aca 23
<210> 74
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 23nt向导, 在种子区域的位点3突变
<400> 74
cactcagctg tacacggacc aca 23
<210> 75
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 23nt向导, 在种子区域的位点3突变
<400> 75
caccgcactc agctgtacac ggaccaca 28
<210> 76
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 23nt向导, 在种子区域的位点3突变
<400> 76
caaatgtggt ccgtgtacag ctgagtgc 28
<210> 77
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 22nt向导, 在种子区域的位点3突变
<400> 77
actcagctgt acacggacca ca 22
<210> 78
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 22nt向导, 在种子区域的位点3突变
<400> 78
actcagctgt acacggacca ca 22
<210> 79
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 22nt向导, 在种子区域的位点3突变
<400> 79
caccgactca gctgtacacg gaccaca 27
<210> 80
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 22nt向导, 在种子区域的位点3突变
<400> 80
caaatgtggt ccgtgtacag ctgagtc 27
<210> 81
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 21nt向导, 在种子区域的位点3突变
<400> 81
ctcagctgta cacggaccac a 21
<210> 82
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 21nt向导, 在种子区域的位点3突变
<400> 82
ctcagctgta cacggaccac a 21
<210> 83
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 21nt向导, 在种子区域的位点3突变
<400> 83
caccgctcag ctgtacacgg accaca 26
<210> 84
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 21nt向导, 在种子区域的位点3突变
<400> 84
caaatgtggt ccgtgtacag ctgagc 26
<210> 85
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 20nt向导, 在种子区域的位点3突变
<400> 85
tcagctgtac acggaccaca 20
<210> 86
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 20nt向导, 在种子区域的位点3突变
<400> 86
tcagctgtac acggaccaca 20
<210> 87
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 20nt向导, 在种子区域的位点3突变
<400> 87
caccgtcagc tgtacacgga ccaca 25
<210> 88
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 20nt向导, 在种子区域的位点3突变
<400> 88
caaatgtggt ccgtgtacag ctgac 25
<210> 89
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 19nt向导, 在种子区域的位点3突变
<400> 89
cagctgtaca cggaccaca 19
<210> 90
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 19nt向导, 在种子区域的位点3突变
<400> 90
cagctgtaca cggaccaca 19
<210> 91
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 19nt向导, 在种子区域的位点3突变
<400> 91
caccgcagct gtacacggac caca 24
<210> 92
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 19nt向导, 在种子区域的位点3突变
<400> 92
caaatgtggt ccgtgtacag ctgc 24
<210> 93
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 18nt向导, 在种子区域的位点3突变
<400> 93
agctgtacac ggaccaca 18
<210> 94
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 18nt向导, 在种子区域的位点3突变
<400> 94
agctgtacac ggaccaca 18
<210> 95
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 18nt向导, 在种子区域的位点3突变
<400> 95
caccgagctg tacacggacc aca 23
<210> 96
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 18nt向导, 在种子区域的位点3突变
<400> 96
caaatgtggt ccgtgtacag ctc 23
<210> 97
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 22nt向导, 在种子区域的位点3突变
<400> 97
actcagctgt acacggacct ca 22
<210> 98
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 22nt向导, 在种子区域的位点3突变
<400> 98
actcagctgt acacggacct ca 22
<210> 99
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 22nt向导, 在种子区域的位点3突变
<400> 99
caccgactca gctgtacacg gacctca 27
<210> 100
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 22nt向导, 在种子区域的位点3突变
<400> 100
caaatgaggt ccgtgtacag ctgagtc 27
<210> 101
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 21nt向导, 在种子区域的位点3突变
<400> 101
ctcagctgta cacggacctc a 21
<210> 102
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 21nt向导, 在种子区域的位点3突变
<400> 102
ctcagctgta cacggacctc a 21
<210> 103
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 21nt向导, 在种子区域的位点3突变
<400> 103
caccgctcag ctgtacacgg acctca 26
<210> 104
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 21nt向导, 在种子区域的位点3突变
<400> 104
caaatgaggt ccgtgtacag ctgagc 26
<210> 105
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 20nt向导, 在种子区域的位点3突变
<400> 105
tcagctgtac acggacctca 20
<210> 106
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 20nt向导, 在种子区域的位点3突变
<400> 106
tcagctgtac acggacctca 20
<210> 107
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 20nt向导, 在种子区域的位点3突变
<400> 107
caccgtcagc tgtacacgga cctca 25
<210> 108
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 20nt向导, 在种子区域的位点3突变
<400> 108
caaatgaggt ccgtgtacag ctgac 25
<210> 109
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 19nt向导, 在种子区域的位点3突变
<400> 109
cagctgtaca cggacctca 19
<210> 110
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 19nt向导, 在种子区域的位点3突变
<400> 110
cagctgtaca cggacctca 19
<210> 111
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 19nt向导, 在种子区域的位点3突变
<400> 111
caccgcagct gtacacggac ctca 24
<210> 112
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 19nt向导, 在种子区域的位点3突变
<400> 112
caaatgaggt ccgtgtacag ctgc 24
<210> 113
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 18nt向导, 在种子区域的位点3突变
<400> 113
agctgtacac ggacctca 18
<210> 114
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 18nt向导, 在种子区域的位点3突变
<400> 114
agctgtacac ggacctca 18
<210> 115
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 18nt向导, 在种子区域的位点3突变
<400> 115
caccgagctg tacacggacc tca 23
<210> 116
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 18nt向导, 在种子区域的位点3突变
<400> 116
caaatgaggt ccgtgtacag ctc 23
<210> 117
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 17nt向导, 在种子区域的位点3突变
<400> 117
gctgtacacg gacctca 17
<210> 118
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 17nt向导, 在种子区域的位点3突变
<400> 118
gctgtacacg gacctca 17
<210> 119
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 17nt向导, 在种子区域的位点3突变
<400> 119
caccggctgt acacggacct ca 22
<210> 120
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 17nt向导, 在种子区域的位点3突变
<400> 120
caaatgaggt ccgtgtacag cc 22
<210> 121
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 16nt向导, 在种子区域的位点3突变
<400> 121
ctgtacacgg acctca 16
<210> 122
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 16nt向导, 在种子区域的位点3突变
<400> 122
ctgtacacgg acctca 16
<210> 123
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 16nt向导, 在种子区域的位点3突变
<400> 123
caccgctgta cacggacctc a 21
<210> 124
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 16nt向导, 在种子区域的位点3突变
<400> 124
caaatgaggt ccgtgtacag c 21
<210> 125
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 22nt向导, 在种子区域的位点7突变
<400> 125
agagaatgga gcagactctt gg 22
<210> 126
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 22nt向导, 在种子区域的位点7突变
<400> 126
ccaagagtct gctccattct ct 22
<210> 127
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 22nt向导, 在种子区域的位点7突变
<400> 127
caccgccaag agtctgctcc attctct 27
<210> 128
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 22nt向导, 在种子区域的位点7突变
<400> 128
caaaagagaa tggagcagac tcttggc 27
<210> 129
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 21nt向导, 在种子区域的位点7突变
<400> 129
agagaatgga gcagactctt g 21
<210> 130
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 21nt向导, 在种子区域的位点7突变
<400> 130
caagagtctg ctccattctc t 21
<210> 131
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 21nt向导, 在种子区域的位点7突变
<400> 131
caccgcaaga gtctgctcca ttctct 26
<210> 132
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 21nt向导, 在种子区域的位点7突变
<400> 132
caaaagagaa tggagcagac tcttgc 26
<210> 133
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 20nt向导, 在种子区域的位点7突变
<400> 133
agagaatgga gcagactctt 20
<210> 134
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 20nt向导, 在种子区域的位点7突变
<400> 134
aagagtctgc tccattctct 20
<210> 135
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 20nt向导, 在种子区域的位点7突变
<400> 135
caccgaagag tctgctccat tctct 25
<210> 136
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 20nt向导, 在种子区域的位点7突变
<400> 136
caaaagagaa tggagcagac tcttc 25
<210> 137
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 19nt向导, 在种子区域的位点7突变
<400> 137
agagaatgga gcagactct 19
<210> 138
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 19nt向导, 在种子区域的位点7突变
<400> 138
agagtctgct ccattctct 19
<210> 139
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 19nt向导, 在种子区域的位点7突变
<400> 139
caccgagagt ctgctccatt ctct 24
<210> 140
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 19nt向导, 在种子区域的位点7突变
<400> 140
caaaagagaa tggagcagac tctc 24
<210> 141
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 18nt向导, 在种子区域的位点7突变
<400> 141
agagaatgga gcagactc 18
<210> 142
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 18nt向导, 在种子区域的位点7突变
<400> 142
gagtctgctc cattctct 18
<210> 143
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 18nt向导, 在种子区域的位点7突变
<400> 143
caccggagtc tgctccattc tct 23
<210> 144
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 18nt向导, 在种子区域的位点7突变
<400> 144
caaaagagaa tggagcagac tcc 23
<210> 145
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 17nt向导, 在种子区域的位点7突变
<400> 145
agagaatgga gcagact 17
<210> 146
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 17nt向导, 在种子区域的位点7突变
<400> 146
agtctgctcc attctct 17
<210> 147
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 17nt向导, 在种子区域的位点7突变
<400> 147
caccgagtct gctccattct ct 22
<210> 148
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 17nt向导, 在种子区域的位点7突变
<400> 148
caaaagagaa tggagcagac tc 22
<210> 149
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 16nt向导, 在种子区域的位点7突变
<400> 149
agagaatgga gcagac 16
<210> 150
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 16nt向导, 在种子区域的位点7突变
<400> 150
gtctgctcca ttctct 16
<210> 151
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 16nt向导, 在种子区域的位点7突变
<400> 151
caccggtctg ctccattctc t 21
<210> 152
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 16nt向导, 在种子区域的位点7突变
<400> 152
caaaagagaa tggagcagac c 21
<210> 153
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 22nt向导, 在种子区域的位点8突变
<400> 153
agagaacaga gcagactctt gg 22
<210> 154
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 22nt向导, 在种子区域的位点8突变
<400> 154
ccaagagtct gctctgttct ct 22
<210> 155
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 22nt向导, 在种子区域的位点8突变
<400> 155
caccgccaag agtctgctct gttctct 27
<210> 156
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 22nt向导, 在种子区域的位点8突变
<400> 156
caaaagagaa cagagcagac tcttggc 27
<210> 157
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 21nt向导, 在种子区域的位点8突变
<400> 157
agagaacaga gcagactctt g 21
<210> 158
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 21nt向导, 在种子区域的位点8突变
<400> 158
caagagtctg ctctgttctc t 21
<210> 159
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 21nt向导, 在种子区域的位点8突变
<400> 159
caccgcaaga gtctgctctg ttctct 26
<210> 160
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 21nt向导, 在种子区域的位点8突变
<400> 160
caaaagagaa cagagcagac tcttgc 26
<210> 161
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 20nt向导, 在种子区域的位点8突变
<400> 161
agagaacaga gcagactctt 20
<210> 162
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 20nt向导, 在种子区域的位点8突变
<400> 162
aagagtctgc tctgttctct 20
<210> 163
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 20nt向导, 在种子区域的位点8突变
<400> 163
caccgaagag tctgctctgt tctct 25
<210> 164
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 20nt向导, 在种子区域的位点8突变
<400> 164
caaaagagaa cagagcagac tcttc 25
<210> 165
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 19nt向导, 在种子区域的位点8突变
<400> 165
agagaacaga gcagactct 19
<210> 166
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 19nt向导, 在种子区域的位点8突变
<400> 166
agagtctgct ctgttctct 19
<210> 167
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 19nt向导, 在种子区域的位点8突变
<400> 167
caccgagagt ctgctctgtt ctct 24
<210> 168
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 19nt向导, 在种子区域的位点8突变
<400> 168
caaaagagaa cagagcagac tctc 24
<210> 169
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 18nt向导, 在种子区域的位点8突变
<400> 169
agagaacaga gcagactc 18
<210> 170
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 18nt向导, 在种子区域的位点8突变
<400> 170
gagtctgctc tgttctct 18
<210> 171
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 18nt向导, 在种子区域的位点8突变
<400> 171
caccggagtc tgctctgttc tct 23
<210> 172
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 18nt向导, 在种子区域的位点8突变
<400> 172
caaaagagaa cagagcagac tcc 23
<210> 173
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 17nt向导, 在种子区域的位点8突变
<400> 173
agagaacaga gcagact 17
<210> 174
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 17nt向导, 在种子区域的位点8突变
<400> 174
agtctgctct gttctct 17
<210> 175
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 17nt向导, 在种子区域的位点8突变
<400> 175
caccgagtct gctctgttct ct 22
<210> 176
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 17nt向导, 在种子区域的位点8突变
<400> 176
caaaagagaa cagagcagac tc 22
<210> 177
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 16nt向导, 在种子区域的位点8突变
<400> 177
agagaacaga gcagac 16
<210> 178
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 16nt向导, 在种子区域的位点8突变
<400> 178
gtctgctctg ttctct 16
<210> 179
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 16nt向导, 在种子区域的位点8突变
<400> 179
caccggtctg ctctgttctc t 21
<210> 180
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 16nt向导, 在种子区域的位点8突变
<400> 180
caaaagagaa cagagcagac c 21
<210> 181
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu509Arg
<400> 181
gactgtcatg gatgtccgga 20
<210> 182
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu509Arg
<400> 182
gactgtcatg gatgtccgga 20
<210> 183
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu509Arg
<400> 183
caccggactg tcatggatgt ccgga 25
<210> 184
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu509Arg
<400> 184
caaatccgga catccatgac agtcc 25
<210> 185
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu509Arg
<400> 185
tggggactgt catggatgtc 20
<210> 186
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu509Arg
<400> 186
tggggactgt catggatgtc 20
<210> 187
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu509Arg
<400> 187
caccgtgggg actgtcatgg atgtc 25
<210> 188
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu509Arg
<400> 188
caaagacatc catgacagtc cccac 25
<210> 189
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg666Ser
<400> 189
gagctctgtg cgactaggtg 20
<210> 190
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg666Ser
<400> 190
cacctagtcg cacagagctc 20
<210> 191
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg666Ser
<400> 191
caccgcacct agtcgcacag agctc 25
<210> 192
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg666Ser
<400> 192
caaagagctc tgtgcgacta ggtgc 25
<210> 193
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg666Ser
<400> 193
ctagtcgcac agagctctgg 20
<210> 194
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg666Ser
<400> 194
ccagagctct gtgcgactag 20
<210> 195
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg666Ser
<400> 195
caccgccaga gctctgtgcg actag 25
<210> 196
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg666Ser
<400> 196
caaactagtc gcacagagct ctggc 25
<210> 197
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Gly623Asp
<400> 197
cctgacatca tgaccacaaa 20
<210> 198
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Gly623Asp
<400> 198
cctgacatca tgaccacaaa 20
<210> 199
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Gly623Asp
<400> 199
caccgcctga catcatgacc acaaa 25
<210> 200
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Gly623Asp
<400> 200
caaatttgtg gtcatgatgt caggc 25
<210> 201
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Glu498Val
<400> 201
ggacgtggtg atcgccacct 20
<210> 202
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Glu498Val
<400> 202
aggtggcgat caccacgtcc 20
<210> 203
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Glu498Val
<400> 203
caccgaggtg gcgatcacca cgtcc 25
<210> 204
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Glu498Val
<400> 204
caaaggacgt ggtgatcgcc accctc 26
<210> 205
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg503Pro
<400> 205
agctgctgga gggcgaggag 20
<210> 206
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg503Pro
<400> 206
ctcctcgccc tccagcagct 20
<210> 207
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg503Pro
<400> 207
caccgctcct cgccctccag cagct 25
<210> 208
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg503Pro
<400> 208
caaaagctgc tggagggcga ggagc 25
<210> 209
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg503Pro
<400> 209
agctgctgga gggcgaggag 20
<210> 210
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg503Pro
<400> 210
ctcctcgccc tccagcagct 20
<210> 211
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg503Pro
<400> 211
caccgctcct cgccctccag cagct 25
<210> 212
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg503Pro
<400> 212
caaaagctgc tggagggcga ggagc 25
<210> 213
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg503Pro
<400> 213
accccaagct gctggagggc 20
<210> 214
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg503Pro
<400> 214
gccctccagc agcttggggt 20
<210> 215
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg503Pro
<400> 215
caccggccct ccagcagctt ggggt 25
<210> 216
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg503Pro
<400> 216
caaaacccca agctgctgga gggcc 25
<210> 217
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg503Pro
<400> 217
taccccaagc tgctggaggg c 21
<210> 218
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg503Pro
<400> 218
taccccaagc tgctggaggg c 21
<210> 219
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg503Pro
<400> 219
caccgtaccc caagctgctg gagggc 26
<210> 220
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg503Pro
<400> 220
caaagccctc cagcagcttg gggtac 26
<210> 221
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Glu509Lys
<400> 221
ccgcaagctg ctggagggca 20
<210> 222
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Glu509Lys
<400> 222
ccgcaagctg ctggagggcc 20
<210> 223
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Glu509Lys
<400> 223
caccgccgca agctgctgga gggcc 25
<210> 224
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Glu509Lys
<400> 224
caaaggccct ccagcagctt gcggc 25
<210> 225
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Glu509Lys
<400> 225
ggccctccag cagcttgcgg 20
<210> 226
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Glu509Lys
<400> 226
ccgcaagctg ctggagggcc 20
<210> 227
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Glu509Lys
<400> 227
caccgccgca agctgctgga gggcc 25
<210> 228
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Glu509Lys
<400> 228
caaaggccct ccagcagctt gcggc 25
<210> 229
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Gln130Pro
<400> 229
aatcttaatg atagattagc 20
<210> 230
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Gln130Pro
<400> 230
gctaatctat cattaagatt 20
<210> 231
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Gln130Pro
<400> 231
caccggctaa tctatcatta agatt 25
<210> 232
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Gln130Pro
<400> 232
caaaaatctt aatgatagat tagcc 25
<210> 233
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu132Pro
<400> 233
atgatagatt agcttcctac 20
<210> 234
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu132Pro
<400> 234
gtaggaagct aatctatcat 20
<210> 235
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu132Pro
<400> 235
caccggtagg aagctaatct atcat 25
<210> 236
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu132Pro
<400> 236
caaaatgata gattagcttc ctacc 25
<210> 237
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu132Pro
<400> 237
atgatagatt agcttcctac 20
<210> 238
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu132Pro
<400> 238
gtaggaagct aatctatcat 20
<210> 239
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu132Pro
<400> 239
caccggtagg aagctaatct atcat 25
<210> 240
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu132Pro
<400> 240
caaaatgata gattagcttc ctacc 25
<210> 241
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu132Pro
<400> 241
aatgatagat tagcttccta 20
<210> 242
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu132Pro
<400> 242
taggaagcta atctatcatt 20
<210> 243
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu132Pro
<400> 243
caccgtagga agctaatcta tcatt 25
<210> 244
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu132Pro
<400> 244
caaaaatgat agattagctt cctac 25
<210> 245
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asn133Lys
<400> 245
aagaaactat gcaaaatctt 20
<210> 246
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asn133Lys
<400> 246
aagaaactat gcaaaatctt 20
<210> 247
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asn133Lys
<400> 247
caccgaagaa actatgcaaa atctt 25
<210> 248
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asn133Lys
<400> 248
caaaaagatt ttgcatagtt tcttc 25
<210> 249
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asn133Lys
<400> 249
aagaaactat gcaaaatctt 20
<210> 250
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asn133Lys
<400> 250
aagaaactat gcaaaatctt 20
<210> 251
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asn133Lys
<400> 251
caccgaagaa actatgcaaa atctt 25
<210> 252
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asn133Lys
<400> 252
caaaaagatt ttgcatagtt tcttc 25
<210> 253
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asn133Lys
<400> 253
agaaactatg caaaatctta 20
<210> 254
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asn133Lys
<400> 254
agaaactatg caaaatctta 20
<210> 255
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asn133Lys
<400> 255
caccgagaaa ctatgcaaaa tctta 25
<210> 256
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asn133Lys
<400> 256
caaataagat tttgcatagt ttctc 25
<210> 257
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asn133Lys
<400> 257
ggatagatta gcttcctacc 20
<210> 258
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asn133Lys
<400> 258
ggatagatta gcttcctacc 20
<210> 259
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asn133Lys
<400> 259
caccgggata gattagcttc ctacc 25
<210> 260
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asn133Lys
<400> 260
caaaggtagg aagctaatct atccc 25
<210> 261
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asn133Lys
<400> 261
aaggatagat tagcttccta c 21
<210> 262
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asn133Lys
<400> 262
aaggatagat tagcttccta c 21
<210> 263
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asn133Lys
<400> 263
caccgaagga tagattagct tcctac 26
<210> 264
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asn133Lys
<400> 264
caaagtagga agctaatcta tccttc 26
<210> 265
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg135Gly
<400> 265
aactatgcaa aatcttaatg 20
<210> 266
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg135Gly
<400> 266
aactatgcaa aatcttaatg 20
<210> 267
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg135Gly
<400> 267
caccgaacta tgcaaaatct taatg 25
<210> 268
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg135Gly
<400> 268
caaacattaa gattttgcat agttc 25
<210> 269
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg135Gly
<400> 269
actatgcaaa atcttaatga 20
<210> 270
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg135Gly
<400> 270
actatgcaaa atcttaatga 20
<210> 271
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg135Gly
<400> 271
caccgactat gcaaaatctt aatga 25
<210> 272
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg135Gly
<400> 272
caaatcatta agattttgca tagtc 25
<210> 273
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg135Gly
<400> 273
ggtaggaagc taatccatca 20
<210> 274
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg135Gly
<400> 274
tgatggatta gcttcctacc 20
<210> 275
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg135Gly
<400> 275
caccgtgatg gattagcttc ctacc 25
<210> 276
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg135Gly
<400> 276
caaaggtagg aagctaatcc atcac 25
<210> 277
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg135Gly
<400> 277
aatgatggat tagcttccta c 21
<210> 278
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg135Gly
<400> 278
aatgatggat tagcttccta c 21
<210> 279
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg135Gly
<400> 279
caccgaatga tggattagct tcctac 26
<210> 280
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg135Gly
<400> 280
caaagtagga agctaatcca tcattc 26
<210> 281
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg135Ile
<400> 281
tgatatatta gcttcctacc 20
<210> 282
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg135Ile
<400> 282
tgatatatta gcttcctacc 20
<210> 283
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg135Ile
<400> 283
caccgtgata tattagcttc ctacc 25
<210> 284
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg135Ile
<400> 284
caaaggtagg aagctaatat atcac 25
<210> 285
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg135Ile
<400> 285
aatgatatat tagcttccta c 21
<210> 286
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg135Ile
<400> 286
aatgatatat tagcttccta c 21
<210> 287
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg135Ile
<400> 287
caccgaatga tatattagct tcctac 26
<210> 288
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg135Ile
<400> 288
caaagtagga agctaatata tcattc 26
<210> 289
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg135Thr
<400> 289
tgatacatta gcttcctacc 20
<210> 290
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg135Thr
<400> 290
tgatacatta gcttcctacc 20
<210> 291
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg135Thr
<400> 291
caccgtgata cattagcttc ctacc 25
<210> 292
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg135Thr
<400> 292
caaaggtagg aagctaatgt atcac 25
<210> 293
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg135Thr
<400> 293
aatgatacat tagcttccta c 21
<210> 294
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg135Thr
<400> 294
aatgatacat tagcttccta c 21
<210> 295
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg135Thr
<400> 295
caccgaatga tacattagct tcctac 26
<210> 296
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg135Thr
<400> 296
caaagtagga agctaatgta tcattc 26
<210> 297
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg135Ser
<400> 297
tgatagctta gcttcctacc 20
<210> 298
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg135Ser
<400> 298
tgatagctta gcttcctacc 20
<210> 299
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg135Ser
<400> 299
caccgtgata gcttagcttc ctacc 25
<210> 300
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg135Ser
<400> 300
caaaggtagg aagctaagct atcac 25
<210> 301
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg135Ser
<400> 301
atgatagctt agcttcctac 20
<210> 302
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg135Ser
<400> 302
atgatagctt agcttcctac 20
<210> 303
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg135Ser
<400> 303
caccgatgat agcttagctt cctac 25
<210> 304
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg135Ser
<400> 304
caaagtagga agctaagcta tcatc 25
<210> 305
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ala137Pro
<400> 305
tcctacctgg ataaggtgcg 20
<210> 306
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ala137Pro
<400> 306
cgcaccttat ccaggtagga 20
<210> 307
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ala137Pro
<400> 307
caccgcgcac cttatccagg tagga 25
<210> 308
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ala137Pro
<400> 308
caaatcctac ctggataagg tgcgc 25
<210> 309
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ala137Pro
<400> 309
tgatagatta ccttcctacc 20
<210> 310
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ala137Pro
<400> 310
tgatagatta ccttcctacc 20
<210> 311
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ala137Pro
<400> 311
caccgtgata gattaccttc ctacc 25
<210> 312
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ala137Pro
<400> 312
caaaggtagg aaggtaatct atcac 25
<210> 313
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ala137Pro
<400> 313
aatgatagat taccttccta c 21
<210> 314
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ala137Pro
<400> 314
aatgatagat taccttccta c 21
<210> 315
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ala137Pro
<400> 315
caccgaatga tagattacct tcctac 26
<210> 316
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ala137Pro
<400> 316
caaagtagga aggtaatcta tcattc 26
<210> 317
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu140Arg
<400> 317
atgatagatt agcttcctac 20
<210> 318
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu140Arg
<400> 318
atgatagatt agcttcctac 20
<210> 319
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu140Arg
<400> 319
caccgatgat agattagctt cctac 25
<210> 320
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu140Arg
<400> 320
caaaatgata gattagcttc ctacc 25
<210> 321
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu140Arg
<400> 321
agctcgcacc ttatcccggt 20
<210> 322
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu140Arg
<400> 322
agctcgcacc ttatcccggt 20
<210> 323
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu140Arg
<400> 323
caccgagctc gcaccttatc ccggt 25
<210> 324
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu140Arg
<400> 324
caaaaccggg ataaggtgcg agctc 25
<210> 325
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val143Leu
<400> 325
ggataagttg cgagctctag 20
<210> 326
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val143Leu
<400> 326
ctagagctcg caacttatcc 20
<210> 327
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val143Leu
<400> 327
caccgctaga gctcgcaact tatcc 25
<210> 328
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val143Leu
<400> 328
caaaggataa gttgcgagct ctagc 25
<210> 329
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val143Leu
<400> 329
ggataagctg cgagctctag 20
<210> 330
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val143Leu
<400> 330
ctagagctcg cagcttatcc 20
<210> 331
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val143Leu
<400> 331
caccgctaga gctcgcagct tatcc 25
<210> 332
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val143Leu
<400> 332
caaaggataa gctgcgagct ctagc 25
<210> 333
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Lle391_Leu399dup
<400> 333
gcacagctgc atcagcaacc 20
<210> 334
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Lle391_Leu399dup
<400> 334
gcacagctgc atcagcaacc 20
<210> 335
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Lle391_Leu399dup
<400> 335
caccggcaca gctgcatcag caacc 25
<210> 336
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Lle391_Leu399dup
<400> 336
caaaggttgc tgatgcagct gtgcc 25
<210> 337
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ile 426Val
<400> 337
ggagctggag agtgagacct 20
<210> 338
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ile 426Val
<400> 338
aggtctcact ctccagctcc 20
<210> 339
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ile 426Val
<400> 339
caccgaggtc tcactctcca gctcc 25
<210> 340
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ile 426Val
<400> 340
caaaggagct ggagagtgag acctc 25
<210> 341
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ile 426Val
<400> 341
tcaaggcccg cctggagctg 20
<210> 342
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ile 426Val
<400> 342
tcaaggcccg cctggagctg 20
<210> 343
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ile 426Val
<400> 343
caccgtcaag gcccgcctgg agctg 25
<210> 344
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ile 426Val
<400> 344
caaacagctc caggcgggcc ttgac 25
<210> 345
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ile 426Ser
<400> 345
caaggcccgc ctggagctgg 20
<210> 346
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ile 426Ser
<400> 346
caaggcccgc ctggagctgg 20
<210> 347
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ile 426Ser
<400> 347
caccgcaagg cccgcctgga gctgg 25
<210> 348
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ile 426Ser
<400> 348
caaaccagct ccaggcgggc cttgc 25
<210> 349
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ile 426Ser
<400> 349
ggagctggag gttgagacct 20
<210> 350
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ile 426Ser
<400> 350
aggtctcaac ctccagctcc 20
<210> 351
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ile 426Ser
<400> 351
caccgaggtc tcaacctcca gctcc 25
<210> 352
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ile 426Ser
<400> 352
caaaggagct ggaggttgag acctc 25
<210> 353
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Tyr429Asp
<400> 353
ggagctggag attgagaccg 20
<210> 354
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Tyr429Asp
<400> 354
cggtctcaat ctccagctcc 20
<210> 355
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Tyr429Asp
<400> 355
caccgcggtc tcaatctcca gctcc 25
<210> 356
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Tyr429Asp
<400> 356
caaaggagct ggagattgag accgc 25
<210> 357
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Tyr429Cys
<400> 357
gccgccgcct gctggacggg 20
<210> 358
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Tyr429Cys
<400> 358
cccgtccagc aggcggcggc 20
<210> 359
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Tyr429Cys
<400> 359
caccgcccgt ccagcaggcg gcggc 25
<210> 360
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Tyr429Cys
<400> 360
caaagccgcc gcctgctgga cgggc 25
<210> 361
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg430Pro
<400> 361
gcctgctgga cggggaggcc 20
<210> 362
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg430Pro
<400> 362
ggcctccccg tccagcaggc 20
<210> 363
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg430Pro
<400> 363
caccgggcct ccccgtccag caggc 25
<210> 364
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg430Pro
<400> 364
caaagcctgc tggacgggga ggccc 25
<210> 365
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg430Pro
<400> 365
gcctgctgga cggggaggcc 20
<210> 366
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg430Pro
<400> 366
ggcctccccg tccagcaggc 20
<210> 367
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg430Pro
<400> 367
caccgggcct ccccgtccag caggc 25
<210> 368
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg430Pro
<400> 368
caaagcctgc tggacgggga ggccc 25
<210> 369
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg430Pro
<400> 369
cgcctgctgg acggggag 18
<210> 370
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg430Pro
<400> 370
ctccccgtcc agcaggcg 18
<210> 371
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg430Pro
<400> 371
caccgctccc cgtccagcag gcg 23
<210> 372
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg430Pro
<400> 372
caaacgcctg ctggacgggg agc 23
<210> 373
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg430Pro
<400> 373
acccccgcct gctggacggg 20
<210> 374
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg430Pro
<400> 374
cccgtccagc aggcgggggt 20
<210> 375
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg430Pro
<400> 375
caccgcccgt ccagcaggcg ggggt 25
<210> 376
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg430Pro
<400> 376
caaaaccccc gcctgctgga cgggc 25
<210> 377
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu433Arg
<400> 377
ttgagaccta ccgccgcctg 20
<210> 378
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu433Arg
<400> 378
ttgagaccta ccgccgcctg 20
<210> 379
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu433Arg
<400> 379
caccgttgag acctaccgcc gcctg 25
<210> 380
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu433Arg
<400> 380
caaacaggcg gcggtaggtc tcaac 25
<210> 381
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu433Arg
<400> 381
gcgggacggg gaggcccaag 20
<210> 382
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu433Arg
<400> 382
cttgggcctc cccgtcccgc 20
<210> 383
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu433Arg
<400> 383
caccgcttgg gcctccccgt cccgc 25
<210> 384
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu433Arg
<400> 384
caaagcggga cggggaggcc caagc 25
<210> 385
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu433Arg
<400> 385
gcctgcggga cggggaggcc c 21
<210> 386
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu433Arg
<400> 386
gcctgcggga cggggaggcc c 21
<210> 387
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu433Arg
<400> 387
caccggcctg cgggacgggg aggccc 26
<210> 388
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu433Arg
<400> 388
caaagggcct ccccgtcccg caggcc 26
<210> 389
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg555Gln
<400> 389
agagaacaga gcagactctt 20
<210> 390
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg555Gln
<400> 390
aagagtctgc tctgttctct 20
<210> 391
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg555Gln
<400> 391
caccgaagag tctgctctgt tctct 25
<210> 392
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg555Gln
<400> 392
caaaagagaa cagagcagac tcttc 25
<210> 393
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg555Gln
<400> 393
ccaagagaac agagcagact c 21
<210> 394
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg555Gln
<400> 394
ccaagagaac agagcagact c 21
<210> 395
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg555Gln
<400> 395
caccgccaag agaacagagc agactc 26
<210> 396
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg555Gln
<400> 396
caaagagtct gctctgttct cttggc 26
<210> 397
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg124Cys
<400> 397
tcagctgtac acggactgca 20
<210> 398
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg124Cys
<400> 398
tcagctgtac acggactgca 20
<210> 399
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg124Cys
<400> 399
caccgtcagc tgtacacgga ctgca 25
<210> 400
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg124Cys
<400> 400
caaatgcagt ccgtgtacag ctgac 25
<210> 401
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg124Cys
<400> 401
ctgtacacgg actgcacgga ga 22
<210> 402
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg124Cys
<400> 402
tctccgtgca gtccgtgtac ag 22
<210> 403
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg124Cys
<400> 403
caccgtctcc gtgcagtccg tgtacag 27
<210> 404
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg124Cys
<400> 404
caaactgtac acggactgca cggagac 27
<210> 405
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val505Asp
<400> 405
ccccccaatg gggactgaca 20
<210> 406
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val505Asp
<400> 406
ccccccaatg gggactgaca 20
<210> 407
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val505Asp
<400> 407
caccgccccc caatggggac tgaca 25
<210> 408
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val505Asp
<400> 408
caaatgtcag tccccattgg ggggc 25
<210> 409
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val505Asp
<400> 409
cccccccaat ggggactgac 20
<210> 410
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val505Asp
<400> 410
cccccccaat ggggactgac 20
<210> 411
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val505Asp
<400> 411
caccgccccc ccaatgggga ctgac 25
<210> 412
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val505Asp
<400> 412
caaagtcagt ccccattggg ggggc 25
<210> 413
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ile522Asn
<400> 413
accagtctgc aggactgacg 20
<210> 414
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ile522Asn
<400> 414
cgtcagtcct gcagactggt 20
<210> 415
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ile522Asn
<400> 415
caccgcgtca gtcctgcaga ctggt 25
<210> 416
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ile522Asn
<400> 416
caaaaccagt ctgcaggact gacgc 25
<210> 417
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu569Arg
<400> 417
ccaaggaact tgccaacatc 20
<210> 418
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu569Arg
<400> 418
ccaaggaact tgccaacatc 20
<210> 419
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu569Arg
<400> 419
caccgccaag gaacttgcca acatc 25
<210> 420
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu569Arg
<400> 420
caaagatgtt ggcaagttcc ttggc 25
<210> 421
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu569Arg
<400> 421
acatccggaa ataccacatt 20
<210> 422
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu569Arg
<400> 422
aatgtggtat ttccggatgt 20
<210> 423
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu569Arg
<400> 423
caccgaatgt ggtatttccg gatgt 25
<210> 424
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu569Arg
<400> 424
caaaacatcc ggaaatacca cattc 25
<210> 425
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> His572Arg
<400> 425
aacatcctga aataccgcat 20
<210> 426
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> His572Arg
<400> 426
aacatcctga aataccgcat 20
<210> 427
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> His572Arg
<400> 427
caccgaacat cctgaaatac cgcat 25
<210> 428
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> His572Arg
<400> 428
caaaatgcgg tatttcagga tgttc 25
<210> 429
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> His572Arg
<400> 429
aaataccgca ttggtgatga a 21
<210> 430
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> His572Arg
<400> 430
ttcatcacca atgcggtatt t 21
<210> 431
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> His572Arg
<400> 431
caccgttcat caccaatgcg gtattt 26
<210> 432
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> His572Arg
<400> 432
caaaaaatac cgcattggtg atgaac 26
<210> 433
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp214Tyr
<400> 433
caatggcaac tgcttcatcc 20
<210> 434
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp214Tyr
<400> 434
caatggcaac tgcttcatcc 20
<210> 435
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp214Tyr
<400> 435
caccgcaatg gcaactgctt catcc 25
<210> 436
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp214Tyr
<400> 436
caaaggatga agcagttgcc attgc 25
<210> 437
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp214Tyr
<400> 437
caatggctac tgcttcatcc 20
<210> 438
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp214Tyr
<400> 438
caatggctac tgcttcatcc 20
<210> 439
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp214Tyr
<400> 439
caccgcaatg gctactgctt catcc 25
<210> 440
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp214Tyr
<400> 440
caaaggatga agcagtagcc attgc 25
<210> 441
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg496Trp
<400> 441
gaccctgttc acgatggact 20
<210> 442
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg496Trp
<400> 442
gaccctgttc acgatggact 20
<210> 443
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg496Trp
<400> 443
caccggaccc tgttcacgat ggact 25
<210> 444
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg496Trp
<400> 444
caaaagtcca tcgtgaacag ggtcc 25
<210> 445
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Pro501Thr
<400> 445
acaatgggga ctgtcatgga tgt 23
<210> 446
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Pro501Thr
<400> 446
acatccatga cagtccccat tgt 23
<210> 447
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Pro501Thr
<400> 447
caccgacatc catgacagtc cccattgt 28
<210> 448
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Pro501Thr
<400> 448
caaaacaatg gggactgtca tggatgtc 28
<210> 449
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg514Pro
<400> 449
tttaggtaat tagttccatc 20
<210> 450
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg514Pro
<400> 450
gatggaacta attacctaaa 20
<210> 451
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg514Pro
<400> 451
caccggatgg aactaattac ctaaa 25
<210> 452
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg514Pro
<400> 452
caaatttagg taattagttc catcc 25
<210> 453
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg514Pro
<400> 453
tgaagggaga caatcccttt 20
<210> 454
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg514Pro
<400> 454
tgaagggaga caatcccttt 20
<210> 455
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg514Pro
<400> 455
caccgtgaag ggagacaatc ccttt 25
<210> 456
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg514Pro
<400> 456
caaaaaaggg attgtctccc ttcac 25
<210> 457
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Phe515Leu
<400> 457
tgaagggaga caatcgctta 20
<210> 458
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Phe515Leu
<400> 458
tgaagggaga caatcgctta 20
<210> 459
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Phe515Leu
<400> 459
caccgtgaag ggagacaatc gctta 25
<210> 460
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Phe515Leu
<400> 460
caaataagcg attgtctccc ttcac 25
<210> 461
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Phe515Leu
<400> 461
ttaaggtaat tagttccatc c 21
<210> 462
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Phe515Leu
<400> 462
ttaaggtaat tagttccatc c 21
<210> 463
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Phe515Leu
<400> 463
caccgttaag gtaattagtt ccatcc 26
<210> 464
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Phe515Leu
<400> 464
caaaggatgg aactaattac cttaac 26
<210> 465
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu518Pro
<400> 465
gtagctgcca tccagtctgc 20
<210> 466
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu518Pro
<400> 466
gcagactgga tggcagctac 20
<210> 467
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu518Pro
<400> 467
caccggcaga ctggatggca gctac 25
<210> 468
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu518Pro
<400> 468
caaagtagct gccatccagt ctgcc 25
<210> 469
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu518Arg
<400> 469
tgtgtgtgta tctacagcat 20
<210> 470
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu518Arg
<400> 470
tgtgtgtgta tctacagcat 20
<210> 471
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu518Arg
<400> 471
caccgtgtgt gtgtatctac agcat 25
<210> 472
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu518Arg
<400> 472
caaaatgctg tagatacaca cacac 25
<210> 473
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu527Arg
<400> 473
ctgccatcca gtctgcagga 20
<210> 474
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu527Arg
<400> 474
ctgccatcca gtctgcagga 20
<210> 475
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu527Arg
<400> 475
caccgctgcc atccagtctg cagga 25
<210> 476
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu527Arg
<400> 476
caaatcctgc agactggatg gcagc 25
<210> 477
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu527Arg
<400> 477
catccagtct gcaggacgga 20
<210> 478
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu527Arg
<400> 478
catccagtct gcaggacgga 20
<210> 479
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu527Arg
<400> 479
caccgcatcc agtctgcagg acgga 25
<210> 480
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu527Arg
<400> 480
caaatccgtc ctgcagactg gatgc 25
<210> 481
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu527Arg
<400> 481
tctgcaggac ggacggagac c 21
<210> 482
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu527Arg
<400> 482
ggtctccgtc cgtcctgcag a 21
<210> 483
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu527Arg
<400> 483
caccgggtct ccgtccgtcc tgcaga 26
<210> 484
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu527Arg
<400> 484
caaatctgca ggacggacgg agaccc 26
<210> 485
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Thr538Pro
<400> 485
agtctttgct cccacaaatg 20
<210> 486
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Thr538Pro
<400> 486
catttgtggg agcaaagact 20
<210> 487
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Thr538Pro
<400> 487
caccgcattt gtgggagcaa agact 25
<210> 488
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Thr538Pro
<400> 488
caaaagtctt tgctcccaca aatgc 25
<210> 489
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Thr538Pro
<400> 489
ggaaggagtc tacccagtct 20
<210> 490
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Thr538Pro
<400> 490
agactgggta gactccttcc 20
<210> 491
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Thr538Pro
<400> 491
caccgagact gggtagactc cttcc 25
<210> 492
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Thr538Pro
<400> 492
caaaggaagg agtctaccca gtctc 25
<210> 493
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Thr538Pro
<400> 493
aaccgggaag gagtctaccc a 21
<210> 494
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Thr538Pro
<400> 494
tgggtagact ccttcccggt t 21
<210> 495
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Thr538Pro
<400> 495
caccgtgggt agactccttc ccggtt 26
<210> 496
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Thr538Pro
<400> 496
caaaaaccgg gaaggagtct acccac 26
<210> 497
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Thr538Arg
<400> 497
ctttgctccc acaaatgaag 20
<210> 498
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Thr538Arg
<400> 498
cttcatttgt gggagcaaag 20
<210> 499
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Thr538Arg
<400> 499
caccgcttca tttgtgggag caaag 25
<210> 500
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Thr538Arg
<400> 500
caaactttgc tcccacaaat gaagc 25
<210> 501
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Thr538Arg
<400> 501
ggaaggagtc tacagagtct 20
<210> 502
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Thr538Arg
<400> 502
agactctgta gactccttcc 20
<210> 503
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Thr538Arg
<400> 503
caccgagact ctgtagactc cttcc 25
<210> 504
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Thr538Arg
<400> 504
caaaggaagg agtctacaga gtctc 25
<210> 505
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Thr538Arg
<400> 505
aaccgggaag gagtctacag a 21
<210> 506
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Thr538Arg
<400> 506
tctgtagact ccttcccggt t 21
<210> 507
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Thr538Arg
<400> 507
caccgtctgt agactccttc ccggtt 26
<210> 508
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Thr538Arg
<400> 508
caaaaaccgg gaaggagtct acagac 26
<210> 509
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val539Asp
<400> 509
ggaaggagtc tacacagact 20
<210> 510
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val539Asp
<400> 510
agtctgtgta gactccttcc 20
<210> 511
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val539Asp
<400> 511
caccgagtct gtgtagactc cttcc 25
<210> 512
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val539Asp
<400> 512
caaaggaagg agtctacaca gactc 25
<210> 513
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Phe540del
<400> 513
ggaaggagtc tacacagtcg 20
<210> 514
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Phe540del
<400> 514
cgactgtgta gactccttcc 20
<210> 515
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Phe540del
<400> 515
caccgcgact gtgtagactc cttcc 25
<210> 516
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Phe540del
<400> 516
caaaggaagg agtctacaca gtcgc 25
<210> 517
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asn544Ser
<400> 517
caagtgaagc cttccgagcc 20
<210> 518
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asn544Ser
<400> 518
ggctcggaag gcttcacttg 20
<210> 519
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asn544Ser
<400> 519
caccgggctc ggaaggcttc acttg 25
<210> 520
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asn544Ser
<400> 520
caaacaagtg aagccttccg agccc 25
<210> 521
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ala546Thr
<400> 521
caaatgaaac cttccgagcc 20
<210> 522
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ala546Thr
<400> 522
ggctcggaag gtttcatttg 20
<210> 523
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ala546Thr
<400> 523
caccgggctc ggaaggtttc atttg 25
<210> 524
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ala546Thr
<400> 524
caaacaaatg aaaccttccg agccc 25
<210> 525
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ala546Asp
<400> 525
caaatgaaga cttccgagcc 20
<210> 526
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ala546Asp
<400> 526
ggctcggaag tcttcatttg 20
<210> 527
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ala546Asp
<400> 527
caccgggctc ggaagtcttc atttg 25
<210> 528
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ala546Asp
<400> 528
caaacaaatg aagacttccg agccc 25
<210> 529
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Phe547Ser
<400> 529
gagccctgcc accaagagaa 20
<210> 530
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Phe547Ser
<400> 530
ttctcttggt ggcagggctc 20
<210> 531
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Phe547Ser
<400> 531
caccgttctc ttggtggcag ggctc 25
<210> 532
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Phe547Ser
<400> 532
caaagagccc tgccaccaag agaac 25
<210> 533
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Phe547Ser
<400> 533
cgagccctgc caccaagaga 20
<210> 534
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Phe547Ser
<400> 534
tctcttggtg gcagggctcg 20
<210> 535
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Phe547Ser
<400> 535
caccgtctct tggtggcagg gctcg 25
<210> 536
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Phe547Ser
<400> 536
caaacgagcc ctgccaccaa gagac 25
<210> 537
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Pro551Gln
<400> 537
gcaaccaaga gaacggagca 20
<210> 538
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Pro551Gln
<400> 538
tgctccgttc tcttggttgc 20
<210> 539
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Pro551Gln
<400> 539
caccgtgctc cgttctcttg gttgc 25
<210> 540
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Pro551Gln
<400> 540
caaagcaacc aagagaacgg agcac 25
<210> 541
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu558Pro
<400> 541
ttgggtaaag accaacttaa 20
<210> 542
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu558Pro
<400> 542
ttaagttggt ctttacccaa 20
<210> 543
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu558Pro
<400> 543
caccgttaag ttggtcttta cccaa 25
<210> 544
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu558Pro
<400> 544
caaattgggt aaagaccaac ttaac 25
<210> 545
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu558Pro
<400> 545
tacttaagtt ggtctttacc c 21
<210> 546
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu558Pro
<400> 546
gggtaaagac caacttaagt a 21
<210> 547
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu558Pro
<400> 547
caccggggta aagaccaact taagta 26
<210> 548
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu558Pro
<400> 548
caaatactta agttggtctt tacccc 26
<210> 549
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu558Pro
<400> 549
aagagaacgg agcagaccct 20
<210> 550
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu558Pro
<400> 550
aagagaacgg agcagaccct 20
<210> 551
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu558Pro
<400> 551
caccgaagag aacggagcag accct 25
<210> 552
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu558Pro
<400> 552
caaaagggtc tgctccgttc tcttc 25
<210> 553
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu558Pro
<400> 553
ccaagagaac ggagcagacc c 21
<210> 554
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu558Pro
<400> 554
ccaagagaac ggagcagacc c 21
<210> 555
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu558Pro
<400> 555
caccgccaag agaacggagc agaccc 26
<210> 556
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu558Pro
<400> 556
caaagggtct gctccgttct cttggc 26
<210> 557
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> His572del
<400> 557
gccaacatcc tgaaatacat 20
<210> 558
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> His572del
<400> 558
gccaacatcc tgaaatacat 20
<210> 559
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> His572del
<400> 559
caccggccaa catcctgaaa tacat 25
<210> 560
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> His572del
<400> 560
caaaatgtat ttcaggatgt tggcc 25
<210> 561
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> His572del
<400> 561
aaatacattg gtgatgaaa 19
<210> 562
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> His572del
<400> 562
tttcatcacc aatgtattt 19
<210> 563
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> His572del
<400> 563
caccgtttca tcaccaatgt attt 24
<210> 564
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> His572del
<400> 564
caaaaaatac attggtgatg aaac 24
<210> 565
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Gly594Val
<400> 565
agttgacaag ctggaagtca 20
<210> 566
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Gly594Val
<400> 566
tgacttccag cttgtcaact 20
<210> 567
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Gly594Val
<400> 567
caccgtgact tccagcttgt caact 25
<210> 568
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Gly594Val
<400> 568
caaaagttga caagctggaa gtcac 25
<210> 569
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val613del
<400> 569
gacatcatgg ccacaaaatg 20
<210> 570
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val613del
<400> 570
cattttgtgg ccatgatgtc 20
<210> 571
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val613del
<400> 571
caccgcattt tgtggccatg atgtc 25
<210> 572
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val613del
<400> 572
caaagacatc atggccacaa aatgc 25
<210> 573
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val613Gly
<400> 573
ggtgccgagc ctgacatcat 20
<210> 574
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val613Gly
<400> 574
atgatgtcag gctcggcacc 20
<210> 575
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val613Gly
<400> 575
caccgatgat gtcaggctcg gcacc 25
<210> 576
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val613Gly
<400> 576
caaaggtgcc gagcctgaca tcatc 25
<210> 577
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val613Gly
<400> 577
gtgagtgtca acaaggagcc 20
<210> 578
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val613Gly
<400> 578
gtgagtgtca acaaggagcc 20
<210> 579
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val613Gly
<400> 579
caccggtgag tgtcaacaag gagcc 25
<210> 580
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val613Gly
<400> 580
caaaggctcc ttgttgacac tcacc 25
<210> 581
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Met619Lys
<400> 581
gacatcaagg ccacaaatgg 20
<210> 582
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Met619Lys
<400> 582
ccatttgtgg ccttgatgtc 20
<210> 583
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Met619Lys
<400> 583
caccgccatt tgtggccttg atgtc 25
<210> 584
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Met619Lys
<400> 584
caaagacatc aaggccacaa atggc 25
<210> 585
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ala620Asp
<400> 585
cctgacatca tggacacaaa 20
<210> 586
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ala620Asp
<400> 586
cctgacatca tggacacaaa 20
<210> 587
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ala620Asp
<400> 587
caccgcctga catcatggac acaaa 25
<210> 588
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ala620Asp
<400> 588
caaatttgtg tccatgatgt caggc 25
<210> 589
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asn622His
<400> 589
cctgacatca tggccacaca 20
<210> 590
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asn622His
<400> 590
cctgacatca tggccacaca 20
<210> 591
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asn622His
<400> 591
caccgcctga catcatggcc acaca 25
<210> 592
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asn622His
<400> 592
caaatgtgtg gccatgatgt caggc 25
<210> 593
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asn622Lys
<400> 593
catcatggcc acaaaaggcg 20
<210> 594
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asn622Lys
<400> 594
catcatggcc acaaaaggcg 20
<210> 595
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asn622Lys
<400> 595
caccgcatca tggccacaaa aggcg 25
<210> 596
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asn622Lys
<400> 596
caaacgcctt ttgtggccat gatgc 25
<210> 597
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asn622Lys
<400> 597
ccctgacatc atggccacaa 20
<210> 598
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asn622Lys
<400> 598
ccctgacatc atggccacaa 20
<210> 599
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asn622Lys
<400> 599
caccgccctg acatcatggc cacaa 25
<210> 600
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asn622Lys
<400> 600
caaattgtgg ccatgatgtc agggc 25
<210> 601
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asn622Lys
<400> 601
catcatggcc acaaagggcg 20
<210> 602
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asn622Lys
<400> 602
catcatggcc acaaagggcg 20
<210> 603
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asn622Lys
<400> 603
caccgcatca tggccacaaa gggcg 25
<210> 604
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asn622Lys
<400> 604
caaacgccct ttgtggccat gatgc 25
<210> 605
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Gly623Arg
<400> 605
catcatggcc acaaatcgcg 20
<210> 606
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Gly623Arg
<400> 606
catcatggcc acaaatcgcg 20
<210> 607
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Gly623Arg
<400> 607
caccgcatca tggccacaaa tcgcg 25
<210> 608
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Gly623Arg
<400> 608
caaacgcgat ttgtggccat gatgc 25
<210> 609
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Gly623Asp
<400> 609
catcatggcc acaaatgacg 20
<210> 610
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Gly623Asp
<400> 610
catcatggcc acaaatgacg 20
<210> 611
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Gly623Asp
<400> 611
caccgcatca tggccacaaa tgacg 25
<210> 612
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Gly623Asp
<400> 612
caaacgtcat ttgtggccat gatgc 25
<210> 613
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val624_Val625del
<400> 613
caaatggcca tgtcatcacc 20
<210> 614
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val624_Val625del
<400> 614
ggtgatgaca tggccatttg 20
<210> 615
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val624_Val625del
<400> 615
caccgggtga tgacatggcc atttg 25
<210> 616
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val624_Val625del
<400> 616
caaacaaatg gccatgtcat caccc 25
<210> 617
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val624Met
<400> 617
catcatggcc acaaatggca 20
<210> 618
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val624Met
<400> 618
catcatggcc acaaatggca 20
<210> 619
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val624Met
<400> 619
caccgcatca tggccacaaa tggca 25
<210> 620
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val624Met
<400> 620
caaatgccat ttgtggccat gatgc 25
<210> 621
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val625Asp
<400> 621
caaatggcgt gatccatgtc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val625Asp
<400> 622
gacatggatc acgccatttg 20
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val625Asp
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val625Asp
<400> 624
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> His626Arg
<400> 626
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> His626Arg
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> His626Arg
<400> 628
caaacaaatg gcgtggtccg tgtcc 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> His626Pro
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> His626Pro
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tgcagaacat tggtgatgac 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> His626Pro
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> His626Pro
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> His626Pro
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> His626Pro
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> His626Pro
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> His626Pro
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val627SerfsX44
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val627SerfsX44
<400> 639
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<210> 640
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val627SerfsX44
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<211> 20
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<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val627SerfsX44
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<400> 646
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Thr629_Asn630insAsnValPro
<400> 647
caccgcctgg aggctgcaga acatt 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Thr629_Asn630insAsnValPro
<400> 648
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<212> DNA
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val631Asp
<400> 652
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<212> DNA
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg666Ser
<400> 654
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg666Ser
<400> 655
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<210> 656
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg666Ser
<400> 656
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg555Trp
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg555Trp
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ttccgagccc tgccaccaa 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg555Trp
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg555Trp
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg555Trp
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<210> 662
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg555Trp
<400> 662
aagagtctgc tccattctct 20
<210> 663
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg555Trp
<400> 663
caccgaagag tctgctccat tctct 25
<210> 664
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg555Trp
<400> 664
caaaagagaa tggagcagac tcttc 25
<210> 665
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg124Ser
<400> 665
tcagctgtac acggacagca 20
<210> 666
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg124Ser
<400> 666
tcagctgtac acggacagca 20
<210> 667
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg124Ser
<400> 667
caccgtcagc tgtacacgga cagca 25
<210> 668
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg124Ser
<400> 668
caaatgctgt ccgtgtacag ctgac 25
<210> 669
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp123delins
<400> 669
tgtacacgga cctcaagctg 20
<210> 670
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp123delins
<400> 670
tgtacacgga cctcaagctg 20
<210> 671
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp123delins
<400> 671
caccgtgtac acggacctca agctg 25
<210> 672
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp123delins
<400> 672
caaacagctt gaggtccgtg tacac 25
<210> 673
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp123delins
<400> 673
ctgtacacgg acctcaagct g 21
<210> 674
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp123delins
<400> 674
cagcttgagg tccgtgtaca g 21
<210> 675
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp123delins
<400> 675
caccgcagct tgaggtccgt gtacag 26
<210> 676
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp123delins
<400> 676
caaactgtac acggacctca agctgc 26
<210> 677
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg124His
<400> 677
tcagctgtac acggaccaca 20
<210> 678
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg124His
<400> 678
tcagctgtac acggaccaca 20
<210> 679
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg124His
<400> 679
caccgtcagc tgtacacgga ccaca 25
<210> 680
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg124His
<400> 680
caaatgtggt ccgtgtacag ctgac 25
<210> 681
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg124His
<400> 681
ctgtacacgg accacacgga ga 22
<210> 682
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg124His
<400> 682
tctccgtgtg gtccgtgtac ag 22
<210> 683
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg124His
<400> 683
caccgtctcc gtgtggtccg tgtacag 27
<210> 684
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg124His
<400> 684
caaactgtac acggaccaca cggagac 27
<210> 685
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg124Leu
<400> 685
tcagctgtac acggacctca 20
<210> 686
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg124Leu
<400> 686
tcagctgtac acggacctca 20
<210> 687
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg124Leu
<400> 687
caccgtcagc tgtacacgga cctca 25
<210> 688
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg124Leu
<400> 688
caaatgaggt ccgtgtacag ctgac 25
<210> 689
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg124Leu
<400> 689
aagggagaca atcgctttag 20
<210> 690
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg124Leu
<400> 690
tctccgtgag gtccgtgtac ag 22
<210> 691
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg124Leu
<400> 691
caccgtctcc gtgaggtccg tgtacag 27
<210> 692
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg124Leu
<400> 692
caaaaaggga gacaatcgct ttagc 25
<210> 693
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu509Pro
<400> 693
aagggagaca atcgctttag 20
<210> 694
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu509Pro
<400> 694
ctaaagcgat tgtctccctt 20
<210> 695
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu509Pro
<400> 695
caccgctaaa gcgattgtct ccctt 25
<210> 696
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu509Pro
<400> 696
caaaaaggga gacaatcgct ttagc 25
<210> 697
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu509Pro
<400> 697
gactgtcatg gatgtcccga 20
<210> 698
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu509Pro
<400> 698
gactgtcatg gatgtcccga 20
<210> 699
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu509Pro
<400> 699
caccggactg tcatggatgt cccga 25
<210> 700
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu509Pro
<400> 700
caaatcggga catccatgac agtcc 25
<210> 701
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu103_Ser104del
<400> 701
acctttacga gaccctggga 20
<210> 702
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu103_Ser104del
<400> 702
tcccagggtc tcgtaaaggt 20
<210> 703
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu103_Ser104del
<400> 703
caccgtccca gggtctcgta aaggt 25
<210> 704
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu103_Ser104del
<400> 704
caaaaccttt acgagaccct gggac 25
<210> 705
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu103_Ser104del
<400> 705
ctcaaacctt tacgagaccc 20
<210> 706
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu103_Ser104del
<400> 706
gggtctcgta aaggtttgag 20
<210> 707
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu103_Ser104del
<400> 707
caccggggtc tcgtaaaggt ttgag 25
<210> 708
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu103_Ser104del
<400> 708
caaactcaaa cctttacgag acccc 25
<210> 709
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val113Ile
<400> 709
tacgagaccc tgggagtcat 20
<210> 710
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val113Ile
<400> 710
tacgagaccc tgggagtcat 20
<210> 711
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val113Ile
<400> 711
caccgtacga gaccctggga gtcat 25
<210> 712
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val113Ile
<400> 712
caaaatgact cccagggtct cgtac 25
<210> 713
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val113Ile
<400> 713
ttacgagacc ctgggagtca 20
<210> 714
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val113Ile
<400> 714
ttacgagacc ctgggagtca 20
<210> 715
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val113Ile
<400> 715
caccgttacg agaccctggg agtca 25
<210> 716
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val113Ile
<400> 716
caaatgactc ccagggtctc gtaac 25
<210> 717
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp123His
<400> 717
tcagctgtac acgcaccgca 20
<210> 718
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp123His
<400> 718
tcagctgtac acgcaccgca 20
<210> 719
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp123His
<400> 719
caccgtcagc tgtacacgca ccgca 25
<210> 720
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp123His
<400> 720
caaatgcggt gcgtgtacag ctgac 25
<210> 721
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp123His
<400> 721
ctgtacacgc accgcacgga g 21
<210> 722
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp123His
<400> 722
ctccgtgcgg tgcgtgtaca g 21
<210> 723
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp123His
<400> 723
caccgctccg tgcggtgcgt gtacag 26
<210> 724
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp123His
<400> 724
caaactgtac acgcaccgca cggagc 26
<210> 725
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg124Leu
<400> 725
tcagctgtac acggacctca 20
<210> 726
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg124Leu
<400> 726
tcagctgtac acggacctca 20
<210> 727
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg124Leu
<400> 727
caccgtcagc tgtacacgga cctca 25
<210> 728
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg124Leu
<400> 728
caaatgaggt ccgtgtacag ctgac 25
<210> 729
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Thr125_Glu126del
<400> 729
caagctgagg cctgagatgg 20
<210> 730
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Thr125_Glu126del
<400> 730
ccatctcagg cctcagcttg 20
<210> 731
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Thr125_Glu126del
<400> 731
caccgccatc tcaggcctca gcttg 25
<210> 732
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Thr125_Glu126del
<400> 732
caaacaagct gaggcctgag atggc 25
<210> 733
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Thr125_Glu126del
<400> 733
ctgtacacgg accgcaagct g 21
<210> 734
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Thr125_Glu126del
<400> 734
cagcttgcgg tccgtgtaca g 21
<210> 735
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Thr125_Glu126del
<400> 735
caccgcagct tgcggtccgt gtacag 26
<210> 736
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Thr125_Glu126del
<400> 736
caaactgtac acggaccgca agctgc 26
<210> 737
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ala97Thr
<400> 737
gtcctggctg tgcacgggac 20
<210> 738
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ala97Thr
<400> 738
gtcctggctg tgcacgggac 20
<210> 739
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ala97Thr
<400> 739
caccggtcct ggctgtgcac gggac 25
<210> 740
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ala97Thr
<400> 740
caaagtcccg tgcacagcca ggacc 25
<210> 741
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Gly98Ser
<400> 741
tgtgcacggg gccagtaatt 20
<210> 742
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Gly98Ser
<400> 742
tgtgcacggg gccagtaatt 20
<210> 743
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Gly98Ser
<400> 743
caccgtgtgc acggggccag taatt 25
<210> 744
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Gly98Ser
<400> 744
caaaaattac tggccccgtg cacac 25
<210> 745
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asn102Ser
<400> 745
gtaatttggt cagcacttac 20
<210> 746
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asn102Ser
<400> 746
gtaagtgctg accaaattac 20
<210> 747
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asn102Ser
<400> 747
caccggtaag tgctgaccaa attac 25
<210> 748
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asn102Ser
<400> 748
caaagtaatt tggtcagcac ttacc 25
<210> 749
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp112Asn
<400> 749
tccaagggca ttaaccacaa a 21
<210> 750
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp112Asn
<400> 750
tccaagggca ttaaccacaa a 21
<210> 751
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp112Asn
<400> 751
caccgtccaa gggcattaac cacaaa 26
<210> 752
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp112Asn
<400> 752
caaatttgtg gttaatgccc ttggac 26
<210> 753
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp112Asn
<400> 753
agggcattaa ccacaaaaag 20
<210> 754
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp112Asn
<400> 754
ctttttgtgg ttaatgccct 20
<210> 755
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp112Asn
<400> 755
caccgctttt tgtggttaat gccct 25
<210> 756
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp112Asn
<400> 756
caaaagggca ttaaccacaa aaagc 25
<210> 757
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp112Gly
<400> 757
tatgactttt ccaagggcat 20
<210> 758
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp112Gly
<400> 758
tatgactttt ccaagggcat 20
<210> 759
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp112Gly
<400> 759
caccgtatga cttttccaag ggcat 25
<210> 760
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp112Gly
<400> 760
caaaatgccc ttggaaaagt catac 25
<210> 761
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp112Gly
<400> 761
agggcattgg ccacaaaaag 20
<210> 762
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp112Gly
<400> 762
ctttttgtgg ccaatgccct 20
<210> 763
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp112Gly
<400> 763
caccgctttt tgtggccaat gccct 25
<210> 764
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp112Gly
<400> 764
caaaagggca ttggccacaa aaagc 25
<210> 765
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp112Gly
<400> 765
tccaagggca ttggccacaa a 21
<210> 766
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp112Gly
<400> 766
tccaagggca ttggccacaa a 21
<210> 767
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp112Gly
<400> 767
caccgtccaa gggcattggc cacaaa 26
<210> 768
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp112Gly
<400> 768
caaatttgtg gccaatgccc ttggac 26
<210> 769
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp118Gly
<400> 769
attgaccaca aaaagagtga 20
<210> 770
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp118Gly
<400> 770
attgaccaca aaaagagtga 20
<210> 771
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp118Gly
<400> 771
caccgattga ccacaaaaag agtga 25
<210> 772
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp118Gly
<400> 772
caaatcactc tttttgtggt caatc 25
<210> 773
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp118Gly
<400> 773
gagtgatggc aggacacttg 20
<210> 774
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp118Gly
<400> 774
gagtgatggc aggacacttg 20
<210> 775
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp118Gly
<400> 775
caccggagtg atggcaggac acttg 25
<210> 776
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp118Gly
<400> 776
caaacaagtg tcctgccatc actcc 25
<210> 777
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp118Gly
<400> 777
tgatggcagg acacttgtgg a 21
<210> 778
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp118Gly
<400> 778
tgatggcagg acacttgtgg a 21
<210> 779
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp118Gly
<400> 779
caccgtgatg gcaggacact tgtgga 26
<210> 780
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp118Gly
<400> 780
caaatccaca agtgtcctgc catcac 26
<210> 781
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg119Gly
<400> 781
gaccacaaaa agagtgatga 20
<210> 782
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg119Gly
<400> 782
gaccacaaaa agagtgatga 20
<210> 783
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg119Gly
<400> 783
caccggacca caaaaagagt gatga 25
<210> 784
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg119Gly
<400> 784
caaatcatca ctctttttgt ggtcc 25
<210> 785
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg119Gly
<400> 785
gagtgatgac gggacacttg 20
<210> 786
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg119Gly
<400> 786
gagtgatgac gggacacttg 20
<210> 787
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg119Gly
<400> 787
caccggagtg atgacgggac acttg 25
<210> 788
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg119Gly
<400> 788
caaacaagtg tcccgtcatc actcc 25
<210> 789
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg119Gly
<400> 789
gatgacggga cacttgtgga 20
<210> 790
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg119Gly
<400> 790
gatgacggga cacttgtgga 20
<210> 791
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg119Gly
<400> 791
caccggatga cgggacactt gtgga 25
<210> 792
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg119Gly
<400> 792
caaatccaca agtgtcccgt catcc 25
<210> 793
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu121Val
<400> 793
gagtgatgac aggacagttg 20
<210> 794
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu121Val
<400> 794
gagtgatgac aggacagttg 20
<210> 795
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu121Val
<400> 795
caccggagtg atgacaggac agttg 25
<210> 796
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu121Val
<400> 796
caaacaactg tcctgtcatc actcc 25
<210> 797
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu121Val
<400> 797
tgatgacagg acagttgtgg a 21
<210> 798
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu121Val
<400> 798
tgatgacagg acagttgtgg a 21
<210> 799
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu121Val
<400> 799
caccgtgatg acaggacagt tgtgga 26
<210> 800
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu121Val
<400> 800
caaatccaca actgtcctgt catcac 26
<210> 801
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu121Phe
<400> 801
gagtgatgac aggacatttg 20
<210> 802
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu121Phe
<400> 802
gagtgatgac aggacatttg 20
<210> 803
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu121Phe
<400> 803
caccggagtg atgacaggac atttg 25
<210> 804
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu121Phe
<400> 804
caaacaaatg tcctgtcatc actcc 25
<210> 805
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu121Phe
<400> 805
tgatgacagg acatttgtgg a 21
<210> 806
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu121Phe
<400> 806
tgatgacagg acatttgtgg a 21
<210> 807
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu121Phe
<400> 807
caccgtgatg acaggacatt tgtgga 26
<210> 808
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu121Phe
<400> 808
caaatccaca aatgtcctgt catcac 26
<210> 809
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val122Glu
<400> 809
gatgacagga cacttgagga 20
<210> 810
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val122Glu
<400> 810
gacacttgag gaccgaatct 20
<210> 811
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val122Glu
<400> 811
caccggacac ttgaggaccg aatct 25
<210> 812
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val122Glu
<400> 812
caaaagattc ggtcctcaag tgtcc 25
<210> 813
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val122Glu
<400> 813
gatgacagga cacttgagga 20
<210> 814
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val122Glu
<400> 814
gatgacagga cacttgagga 20
<210> 815
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val122Glu
<400> 815
caccggatga caggacactt gagga 25
<210> 816
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val122Glu
<400> 816
caaatcctca agtgtcctgt catcc 25
<210> 817
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val122Gly
<400> 817
aagagtgatg acaggacact 20
<210> 818
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val122Gly
<400> 818
aagagtgatg acaggacact 20
<210> 819
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val122Gly
<400> 819
caccgaagag tgatgacagg acact 25
<210> 820
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val122Gly
<400> 820
caaaagtgtc ctgtcatcac tcttc 25
<210> 821
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val122Gly
<400> 821
aagtgtcctg tcatcactct 20
<210> 822
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val122Gly
<400> 822
agagtgatga caggacactt 20
<210> 823
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val122Gly
<400> 823
caccgagagt gatgacagga cactt 25
<210> 824
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val122Gly
<400> 824
caaaaagtgt cctgtcatca ctctc 25
<210> 825
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val122Gly
<400> 825
gacacttggg gaccgaatct 20
<210> 826
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val122Gly
<400> 826
gacacttggg gaccgaatct 20
<210> 827
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val122Gly
<400> 827
caccggacac ttggggaccg aatct 25
<210> 828
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val122Gly
<400> 828
caaaagattc ggtccccaag tgtcc 25
<210> 829
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val122Gly
<400> 829
gatgacagga cacttgggga 20
<210> 830
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val122Gly
<400> 830
gatgacagga cacttgggga 20
<210> 831
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val122Gly
<400> 831
caccggatga caggacactt gggga 25
<210> 832
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Val122Gly
<400> 832
caaatcccca agtgtcctgt catcc 25
<210> 833
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ser171Pro
<400> 833
tttctctaca caggaggtaa 20
<210> 834
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ser171Pro
<400> 834
ttacctcctg tgtagagaaa 20
<210> 835
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ser171Pro
<400> 835
caccgttacc tcctgtgtag agaaa 25
<210> 836
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ser171Pro
<400> 836
caaatttctc tacacaggag gtaac 25
<210> 837
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ser171Pro
<400> 837
gtctggcccc tttctctaca 20
<210> 838
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ser171Pro
<400> 838
tgtagagaaa ggggccagac 20
<210> 839
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ser171Pro
<400> 839
caccgtgtag agaaaggggc cagac 25
<210> 840
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ser171Pro
<400> 840
caaagtctgg cccctttctc tacac 25
<210> 841
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Tyr174Cys
<400> 841
ttctctgcac aggaggtaag 20
<210> 842
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Tyr174Cys
<400> 842
cttacctcct gtgcagagaa 20
<210> 843
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Tyr174Cys
<400> 843
caccgcttac ctcctgtgca gagaa 25
<210> 844
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Tyr174Cys
<400> 844
caaattctct gcacaggagg taagc 25
<210> 845
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Thr175Ile
<400> 845
tctggctcct ttctctacat 20
<210> 846
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Thr175Ile
<400> 846
tctggctcct ttctctacat 20
<210> 847
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Thr175Ile
<400> 847
caccgtctgg ctcctttctc tacat 25
<210> 848
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Thr175Ile
<400> 848
caaaatgtag agaaaggagc cagac 25
<210> 849
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Gly177Arg
<400> 849
tctacacagg acgtaagatt 20
<210> 850
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Gly177Arg
<400> 850
tctacacagg acgtaagatt 20
<210> 851
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Gly177Arg
<400> 851
caccgtctac acaggacgta agatt 25
<210> 852
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Gly177Arg
<400> 852
caaaaatctt acgtcctgtg tagac 25
<210> 853
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Gly177Arg
<400> 853
tctacacagg aagtaagatt 20
<210> 854
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Gly177Arg
<400> 854
tctacacagg aagtaagatt 20
<210> 855
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Gly177Arg
<400> 855
caccgtctac acaggaagta agatt 25
<210> 856
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Gly177Arg
<400> 856
caaaaatctt acttcctgtg tagac 25
<210> 857
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Lys181Arg
<400> 857
tggccgcagg aattggattc 20
<210> 858
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Lys181Arg
<400> 858
tggccgcagg aattggattc 20
<210> 859
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Lys181Arg
<400> 859
caccgtggcc gcaggaattg gattc 25
<210> 860
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Lys181Arg
<400> 860
caaagaatcc aattcctgcg gccac 25
<210> 861
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Lys181Arg
<400> 861
aggaattgga ttcaggtacg 20
<210> 862
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Lys181Arg
<400> 862
aggaattgga ttcaggtacg 20
<210> 863
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Lys181Arg
<400> 863
caccgaggaa ttggattcag gtacg 25
<210> 864
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Lys181Arg
<400> 864
caaacgtacc tgaatccaat tcctc 25
<210> 865
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu188His
<400> 865
cacatcatcc tcatcacttt 20
<210> 866
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu188His
<400> 866
cacatcatcc tcatcacttt 20
<210> 867
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu188His
<400> 867
caccgcacat catcctcatc acttt 25
<210> 868
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Leu188His
<400> 868
caaaaaagtg atgaggatga tgtgc 25
<210> 869
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asn232Ser
<400> 869
gcaacaccag ggacatggag 20
<210> 870
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asn232Ser
<400> 870
ctccatgtcc ctggtgttgc 20
<210> 871
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asn232Ser
<400> 871
caccgctcca tgtccctggt gttgc 25
<210> 872
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asn232Ser
<400> 872
caaagcaaca ccagggacat ggagc 25
<210> 873
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asn233His
<400> 873
caacaccagg gacatggagt 20
<210> 874
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asn233His
<400> 874
actccatgtc cctggtgttg 20
<210> 875
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asn233His
<400> 875
caccgactcc atgtccctgg tgttg 25
<210> 876
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asn233His
<400> 876
caaacaacac cagggacatg gagtc 25
<210> 877
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asn233His
<400> 877
ttcccacaac accagggaca 20
<210> 878
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asn233His
<400> 878
tgtccctggt gttgtgggaa 20
<210> 879
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asn233His
<400> 879
caccgtgtcc ctggtgttgt gggaa 25
<210> 880
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asn233His
<400> 880
caaattccca caacaccagg gacac 25
<210> 881
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asn233His
<400> 881
cattcccaca acaccaggga c 21
<210> 882
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asn233His
<400> 882
gtccctggtg ttgtgggaat g 21
<210> 883
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asn233His
<400> 883
caccggtccc tggtgttgtg ggaatg 26
<210> 884
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asn233His
<400> 884
caaacattcc cacaacacca gggacc 26
<210> 885
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp236Glu
<400> 885
tccaacaaca ccagggaga 19
<210> 886
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp236Glu
<400> 886
tccaacaaca ccagggaga 19
<210> 887
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp236Glu
<400> 887
caccgtccaa caacaccagg gaga 24
<210> 888
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp236Glu
<400> 888
caaatctccc tggtgttgtt ggac 24
<210> 889
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp236Glu
<400> 889
tccaacaaca ccagggaga 19
<210> 890
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp236Glu
<400> 890
tccaacaaca ccagggaga 19
<210> 891
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp236Glu
<400> 891
caccgtccaa caacaccagg gaga 24
<210> 892
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp236Glu
<400> 892
caaatctccc tggtgttgtt ggac 24
<210> 893
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp240Asn
<400> 893
ccagggacat ggagtccaac 20
<210> 894
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp240Asn
<400> 894
ccagggacat ggagtccaac 20
<210> 895
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp240Asn
<400> 895
caccgccagg gacatggagt ccaac 25
<210> 896
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asp240Asn
<400> 896
caaagttgga ctccatgtcc ctggc 25
<210> 897
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 向导序列
<400> 897
gaactaatta ccatgctaaa 20
<210> 898
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 向导序列
<400> 898
gagacaatcg ctttagcatg 20

Claims (56)

1.一种针对用于预防、改善或治疗角膜营养不良的CRISPR/Cas9系统设计的单一向导RNA(sgRNA)。
2.根据权利要求1所述的sgRNA，包含(i)具有选自SEQ ID NO:(10+4n)或SEQ ID NO:(11+4n)的核苷酸序列的CRISPR靶向RNA(crRNA)序列，其中n为0至221的整数，和(ii)反式激活crRNA(tracrRNA)序列，其中所述crRNA序列和所述tracrRNA序列不是天然一起出现的。
3.根据权利要求2所述的sgRNA，其中所述tracrRNA包含与SEQ ID NO:2或6的核苷酸序列具有至少85％序列同一性的核苷酸序列。
4.一种设计用于CRISPR/Cas9系统的sgRNA对，所述sgRNA对包含：
(i)第一sgRNA，其包含(a)用于顺式位于引起疾病的突变或SNP的3'-端侧的产生第一原型间隔区相邻基序(PAM)的突变或单核苷酸多态性(SNP)的第一crRNA序列，(b)tracrRNA序列，其中所述第一crRNA序列和所述tracrRNA序列不是天然一起出现的；
(ii)第二sgRNA，其包含(a)用于顺式在引起疾病的突变或SNP的5'-端侧的产生第二PAM的突变或SNP的第二crRNA向导序列；(b)tracrRNA序列，其中所述第二crRNA序列和所述tracrRNA序列不是天然一起出现的。
5.根据权利要求4所述的sgRNA对，其中所述CRISPR/Cas9系统用于预防、改善或治疗角膜营养不良。
6.根据权利要求4或5所述的sgRNA对，其中所述产生PAM的突变或SNP位于TGFBI基因中。
7.根据权利要求4至6中任一项所述的sgRNA对，其中所述产生PAM的突变或SNP位于TGFBI基因的内含子中。
8.根据权利要求4至7中任一项所述的sgRNA对，其中所述第一crRNA序列和所述第二crRNA序列中的至少一种包含选自图19至图35所列序列的核苷酸序列；和/或所述第一crRNA序列和所述第二crRNA序列中的至少一种包含选自表2所列序列的核苷酸序列。
9.一种工程化的规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)系统，其包含(i)至少一种载体，其包含编码Cas9核酸酶的核苷酸分子和根据权利要求1至3任一项所述的sgRNA，或者(ii)至少一种载体，其包含编码Cas9核酸酶的核苷酸分子和根据权利要求4至8中任一项所述的sgRNA对，其中所述载体中的Cas9核酸酶和所述sgRNA对不是天然一起出现的。
10.根据权利要求9所述的工程化CRISPR/Cas9系统，其中所述Cas9核酸酶来自链球菌、葡萄球菌或其变体。
11.根据权利要求9至10中任一项所述的工程化CRISPR/Cas9系统，其中所述Cas9核酸酶包含与选自SEQ ID NO:4或8的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
12.根据权利要求9至11中任一项所述的工程化CRISPR/Cas9系统，其中所述编码Cas9核酸酶的核苷酸分子包含与选自SEQ ID NO:3或7的核苷酸序列具有至少85％序列同一性的核苷酸序列。
13.根据权利要求9至12中任一项所述的工程化CRISPR/Cas9系统，其还包含修复核苷酸分子。
14.根据权利要求9至13中任一项所述的工程化CRISPR/Cas9系统，其还包含一种或更多种核定位信号(NLS)。
15.根据权利要求9至14中任一项所述的工程化CRISPR/Cas9系统，其中所述sgRNA和所述Cas9核酸酶包含在同一载体内。
16.改变基因产物表达的方法，包括：
将根据权利要求9至15中任一项所述的工程化CRISPR/Cas9系统引入含有并表达具有靶序列和编码所述基因产物的DNA分子的细胞中。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述工程化CRISPR/Cas9系统包含：
(a)与同所述靶序列杂交的所述sgRNA可操作连接的第一调节元件，和
(b)与编码Cas9核酸酶的核苷酸分子可操作连接的第二调节元件，
其中所述sgRNA靶向所述靶序列，且所述Cas9核酸酶切割所述DNA分子。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述细胞为真核细胞。
19.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述细胞为哺乳动物细胞或人细胞。
20.在受试者中预防、改善或治疗与突变或单核苷酸多态性(SNP)相关的疾病的方法，包括根据权利要求16至19中任一项所述，改变所述受试者的基因产物表达，其中DNA分子包含突变序列。
21.在受试者中预防、改善或治疗与基因突变或单核苷酸多态性(SNP)相关的角膜营养不良的方法，包括：
向所述受试者施用包含至少一种载体的工程化CRISPR/Cas9系统，所述载体包含：
(i)编码Cas9核酸酶的核苷酸分子，和
(ii)CRISPR靶向RNA(crRNA)序列，其与同靶序列互补的核苷酸序列杂交，所述靶序列与原型间隔区相邻基序(PAM)的5'-端相邻，其中所述靶序列或所述PAM包含引起所述角膜营养不良的突变或SNP，
其中所述编码Cas9核酸酶的核苷酸分子和所述crRNA序列不是天然一起出现的。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述PAM包含所述突变或SNP。
23.根据权利要求21至22中任一项所述的方法，所述crRNA序列包含所述靶序列，且所述crRNA序列的长度为17至24个核苷酸。
24.根据权利要求21至23中任一项所述的方法，其中所述crRNA序列由选自SEQ ID NO:(10+4n)的核苷酸序列组成，其中n为0至221的整数。
25.根据权利要求21至24中任一项所述的方法，其中所述PAM和所述Cas9核酸酶来自链球菌或葡萄球菌。
26.根据权利要求21至25中任一项所述的方法，其中所述PAM由NGG或NNGRRT组成，其中N为A、T、G和C中的任一种，且R为A或G。
27.根据权利要求21至26中任一项所述的方法，其中施用包括将所述工程化CRISPR/Cas9系统引入所述受试者的角膜中。
28.根据权利要求21至27中任一项所述的方法，其中施用包括将所述工程化CRISPR/Cas9系统注射到所述受试者的角膜中。
29.根据权利要求21至28中任一项所述的方法，其中施用包括将所述工程化CRISPR/Cas9系统引入含有并表达具有所述靶序列的DNA分子的细胞中。
30.根据权利要求21至29中任一项所述的方法，其中所述角膜营养不良选自上皮基底膜营养不良(EBMD)、Meesmann角膜营养不良(MECD)、Thiel-Behnke角膜营养不良(TBCD)、网格状角膜营养不良(LCD)、颗粒状角膜营养不良(GCD)和Schnyder角膜营养不良(SCD)。
31.根据权利要求21至30中任一项所述的方法，其中所述SNP位于选自TGFBI、KRT3、KRT12、GSN和UBIAD1的基因中。
32.根据权利要求21至31中任一项所述的方法，其中包含所述基因突变或SNP的突变序列编码选自以下的突变蛋白：
(i)包含Leu509Arg、Arg666Ser、Gly623Asp、Arg555Gln、Arg124Cys、Val505Asp、Ile522Asn、Leu569Arg、His572Arg、Arg496Trp、Pro501Thr、Arg514Pro、Phe515Leu、Leu518Pro、Leu518Arg、Leu527Arg、Thr538Pro、Thr538Arg、Val539Asp、Phe540del、Phe540Ser、Asn544Ser、Ala546Thr、Ala546Asp、Phe547Ser、Pro551Gln、Leu558Pro、His572del、Gly594Val、Val613del、Val613Gly、Met619Lys、Ala620Asp、Asn622His、Asn622Lys、Asn622Lys、Gly623Arg、Gly623Asp、Val624_Val625del、Val624Met、Val625Asp、His626Arg、His626Pro、Val627SerfsX44、Thr629_Asn630insAsnValPro、Val631Asp、Arg666Ser、Arg555Trp、Arg124Ser、Asp123delins、Arg124His、Arg124Leu、Leu509Pro、Leu103_Ser104del、Val113Ile、Asp123His、Arg124Leu和/或Thr125_Glu126del的突变TGFBI蛋白；
(ii)具有Glu498Val、Arg503Pro和/或Glu509Lys的突变KRT3蛋白；
(iii)具有Met129Thr、Met129Val、Gln130Pro、Leu132Pro、Leu132Va、Leu132His、Asn133Lys、Arg135Gly、Arg135Ile、Arg135Thr、Arg135Ser、Ala137Pro、Leu140Arg、Val143Leu、Val143Leu、Lle391_Leu399dup、Ile 426Val、Ile 426Ser、Tyr429Asp、Tyr429Cys、Arg430Pro和/或Leu433Arg的突变KRT12蛋白；
(iv)具有Asp214Tyr的突变GSN蛋白；和
(v)具有Ala97Thr、Gly98Ser、Asn102Ser、Asp112Asn、Asp112Gly、Asp118Gly、Arg119Gly、Leu121Val、Leu121Phe、Val122Glu、Val122Gly、Ser171Pro、Tyr174Cys、Thr175Ile、Gly177Arg、Lys181Arg、Gly186Arg、Leu188His、Asn232Ser、Asn233His、Asp236Glu和/或Asp240Asn的突变UBIAD1蛋白。
33.根据权利要求21至32中任一项所述的方法，其中
(i)包含所述基因突变或SNP的突变序列编码包含Arg124Cys的突变TGFBI蛋白，并且所述crRNA序列包含SEQ ID NO:58、54、50或42；
(ii)包含所述基因突变或SNP的突变序列编码包含Arg124His的突变TGFBI蛋白，并且所述crRNA序列包含SEQ ID NO:94、90、86、82、78、74或70；
(iii)包含所述基因突变或SNP的突变序列编码包含Arg124Leu的突变TGFBI蛋白，并且所述crRNA序列包含SEQ ID NO:114、110、106或98；
(iv)包含所述基因突变或SNP的突变序列编码包含Arg555Gln的突变TGFBI蛋白；并且所述crRNA序列包含SEQ ID NO:178、174、170、166、162或158；
(v)包含所述基因突变或SNP的突变序列编码包含Arg555Trp的突变TGFBI蛋白，并且所述crRNA序列包含SEQ ID NO:146、142、138、134、130或126；和/或
(vi)包含所述基因突变或SNP的突变序列编码包含Leu527Arg的突变TGFBI蛋白，并且所述crRNA序列包含SEQ ID NO:474、478、482或486。
34.根据权利要求21至33中任一项所述的方法，其中包含所述基因突变或SNP的突变序列编码包含Arg124His的突变TGFBI蛋白，并且所述crRNA包含SEQ ID NO:86或94。
35.根据权利要求21至34中任一项所述的方法，其中所述角膜营养不良与所述SNP相关；并且所述靶序列或所述PAM包含引起角膜营养不良的SNP位点。
36.根据权利要求21至35中任一项所述的方法，其中所述靶序列或所述PAM包含多个SNP位点。
37.根据权利要求21至36中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
38.在受试者中预防、改善或治疗与基因突变或单核苷酸多态性(SNP)相关的角膜营养不良的方法，包括：
向所述受试者施用包含至少一种载体的工程化CRISPR/Cas9系统，所述载体包含：
(i)编码Cas9核酸酶的核苷酸分子；
(ii)第一CRISPR靶向RNA(crRNA)序列，其与同第一靶序列互补的核苷酸序列杂交，所述第一靶序列与顺式位于引起疾病的突变或SNP的3'-端侧的第一原型间隔区相邻基序(PAM)的5'-端相邻，其中所述第一靶序列或所述第一PAM包含第一祖先突变或SNP位点，
(iii)第二crRNA序列，其与第二靶序列互补的核苷酸序列杂交，所述第二靶序列与顺式位于引起疾病的突变或SNP的5'-端侧的第二PAM的5'-端相邻，其中所述第二靶序列或所述第二PAM包含第二祖先突变或SNP位点，
其中所述至少一种载体不具有天然一起出现的编码Cas9核酸酶的核苷酸分子和crRNA序列。
39.根据权利要求38所述的方法，其中产生PAM的突变或SNP位于TGFBI基因中。
40.根据权利要求38或39所述的方法，其中所述产生PAM的突变或SNP位于TGFBI基因的内含子中。
41.根据权利要求38至40中任一项所述的方法，其中所述第一crRNA序列和所述第二crRNA序列中的至少一种包含选自图19至图35所列序列的核苷酸序列；和/或所述第一crRNA序列和所述第二crRNA序列中的至少一种包含选自表2所列序列的核苷酸序列。
42.根据权利要求38至41中任一项所述的方法，其中所述第一PAM包含所述第一突变或SNP位点和/或所述第二PAM包含所述第二突变或SNP位点。
43.根据权利要求38至42中任一项所述的方法，其中
所述第一crRNA序列包含所述第一靶序列；
所述第二crRNA序列包含所述第二靶序列；
所述第一crRNA序列的长度为17至24个核苷酸；和/或
所述第二crRNA序列的长度为17至24个核苷酸。
44.根据权利要求38至43中任一项所述的方法，其中所述第一和/或第二PAM和所述Cas9核酸酶来自链球菌或葡萄球菌。
45.根据权利要求38至44中任一项所述的方法，其中所述第一PAM和所述第二PAM均来自链球菌或葡萄球菌。
46.根据权利要求38至45中任一项所述的方法，其中所述PAM由NGG或NNGRRT组成，其中N为A、T、G和C中的任一个，R为A或G。
47.根据权利要求38至46中任一项所述的方法，其中施用包括将所述工程化CRISPR/Cas9系统引入所述受试者的角膜中。
48.根据权利要求38至47中任一项所述的方法，其中施用包括将所述工程化CRISPR/Cas9系统注射到所述受试者的角膜中。
49.根据权利要求38至48中任一项所述的方法，其中施用包括将所述工程化CRISPR/Cas9系统引入含有并表达具有所述靶序列的DNA分子的细胞中。
50.根据权利要求38至49中任一项所述的方法，其中所述角膜营养不良选自上皮基底膜营养不良(EBMD)、Meesmann角膜营养不良(MECD)、Thiel-Behnke角膜营养不良(TBCD)、网格状角膜营养不良(LCD)、颗粒状角膜营养不良(GCD)和Schnyder角膜营养不良(SCD)。
51.根据权利要求38至50中任一项所述的方法，其中包含引起疾病的突变或SNP的突变序列编码选自以下的突变蛋白：包含Leu509Arg、Arg666Ser、Gly623Asp、Arg555Gln、Arg124Cys、Val505Asp、Ile522Asn、Leu569Arg、His572Arg、Arg496Trp、Pro501Thr、Arg514Pro、Phe515Leu、Leu518Pro、Leu518Arg、Leu527Arg、Thr538Pro、Thr538Arg、Val539Asp、Phe540del、Phe540Ser、Asn544Ser、Ala546Thr、Ala546Asp、Phe547Ser、Pro551Gln、Leu558Pro、His572del、Gly594Val、Val613del、Val613Gly、Met619Lys、Ala620Asp、Asn622His、Asn622Lys、Asn622Lys、Gly623Arg、Gly623Asp、Val624_Val625del、Val624Met、Val625Asp、His626Arg、His626Pro、Val627SerfsX44、Thr629_Asn630insAsnValPro、Val631Asp、Arg666Ser、Arg555Trp、Arg124Ser、Asp123delins、Arg124His、Arg124Leu、Leu509Pro、Leu103_Ser104del、Val113Ile、Asp123His、Arg124Leu和/或Thr125_Glu126del的突变TGFBI蛋白。
52.根据权利要求38至51中任一项所述的方法，其中，
所述角膜营养不良与所述SNP相关；
所述第一靶序列或所述第一PAM包含所述第一祖先SNP位点；和/或
所述第二靶序列或所述第二PAM包含所述第二祖先SNP位点。
53.根据权利要求38至52中任一项所述的方法，其中包含引起疾病的突变或SNP的突变序列编码包含Arg124His的突变TGFBI蛋白。
54.根据权利要求38至53中任一项所述的方法，其中所述靶序列或所述PAM包含多个突变或SNP位点。
55.根据权利要求38至54中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
56.一种用于在有需要的受试者中治疗角膜营养不良的方法，包括：
(a)从所述受试者中获得包含角膜营养不良靶核酸的核酸突变的多种干细胞；
(b)在所述多种干细胞的一种或更多种干细胞中操作所述核酸突变以校正核酸突变，从而形成一种或更多种经操作的干细胞；
(c)分离所述一种或更多种经操作的干细胞；和
(d)将所述一种或更多种经操作的干细胞移植到所述受试者中，
其中，在所述多种干细胞中的一种或更多种干细胞中操作所述核酸突变包括进行权利要求16至55中任一项的方法。
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