CN105308175B - 人角膜上皮片的制造法 - Google Patents
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Abstract
课题：提供一种用于制造给角膜疾病患者移植用的人角膜上皮片，用于将培养人角膜上皮细胞而得到的来自人角膜上皮的细胞在基质羊膜上培养的方法。解决方法：使用人间充质干细胞作为支持细胞的人角膜上皮细胞的培养法、及使用以各种组合添加了ROCK抑制剂、磷酸二酯酶抑制剂、MAP激酶抑制剂及TGF‑β受体抑制剂的培养基的人角膜上皮细胞的培养法。
Description
技术领域
本发明涉及一种移植用人角膜上皮片，详细地，涉及一种人角膜上皮片的制造法，其使用了将人角膜上皮细胞培养而得到的来自人角膜上皮的细胞。
背景技术
角膜是透明组织，其从外侧向内侧由角膜上皮、前弹力层、角膜基质层、后弹力层、角膜内皮5层细胞层构成，其没有血管但有神经分布。角膜上皮是厚度约50μm的非角化复层扁平上皮，其构成眼表面的一部分，并且限制物质的透过，而且作为防止细菌、真菌等向角膜内部侵入的屏障起作用。对于角膜上皮的屏障功能的维持，在最表层的细胞间存在的紧密连接起着重要的作用。
角膜上皮有再生能力，即使上皮受伤，也能从角膜上皮干细胞供给用于修复损伤的角膜上皮细胞，进一步细胞间的紧密连接也再生，从而恢复并维持屏障功能。
对于角膜上皮的屏障功能受到不可逆地损害的角膜疾病，角膜移植作为有效的治方疗法正在普及。角膜移植主要分为移植角膜全层的全层角膜移植和移植角膜组织的一部分的角膜移植。由于全层角膜移植存在因角膜全层切开而引起的眼球的脆弱性等问题，因此近年来，正在普及移植角膜组织的一部分的方法。作为这种移植角膜组织的一部分的方法，有同时移植角膜基质的一部分和角膜上皮的表层角膜移植、及仅移植及角膜上皮的角膜上皮移植，这些方法以复发性角膜营养不良患者等为对象，已在临床情况中确立。
在角膜缘组织的基底部存在具有分化为角膜上皮细胞的能力的角膜上皮干细胞。因此，若角膜缘组织受到损害，则不能供给用于修复角膜上皮细胞的角膜上皮干细胞。此外，在角膜上皮大范围地受到损害的情况下，直到从角膜上皮干细胞供给用于修复损伤的必要量的角膜上皮细胞为止，需要花费时间。另外在作为角膜上皮细胞的细胞外基质的前弹力膜受到损害的情况下，角膜上皮细胞发生粘着不良，从而不能够给角膜上皮供给足够的细胞。这样，角膜上皮在数周以上的期间内未修复，若其屏障功能受损的状态继续，则眼表面容易被细菌感染。一旦在眼表面发生感染，则结膜上皮随着血管新生会覆盖眼表面，此外，由于免疫细胞的游走，会产生炎症。另外，还有细菌分泌的酶导致角膜组织破坏，从而达到失明的情况。这样，因角膜上皮干细胞的供给的不能或降低而产生的疾病称为角膜上皮干细胞缺陷症。对于因角膜上皮干细胞缺陷症而产生炎症的角膜，角膜上皮移植因排斥反应而成活率低。
此外，角膜上皮移植还存在无法获得满足需要的移植用角膜上皮的捐赠者不足的问题。对于该捐赠者不足，考虑在体外培养角膜上皮细胞，制作细胞片，然后将该片移植到角膜上皮的损伤部位的方法。在这种将人角膜上皮片移植到损伤部位的情况下，移植部位的炎症也成为问题。因此，作为抑制炎症并移植人角膜上皮片的方法，正在尝试使人角膜上皮片在羊膜上形成，从而制作具有羊膜层的人角膜上皮片，然后将其移植的方法。
作为使细胞片在羊膜上形成的方法，报告了在人基质羊膜(剥离除去了羊膜上皮细胞的羊膜)上接种健康正常的白色家兔的角膜上皮缘片，与支持细胞(NIH-3T3细胞)一起培养的方法(非专利文献1)。确认这里所得的人角膜上皮片在形态学上也具有与生物角膜上皮类似的层结构。显示进行用健康正常的人角膜上皮缘片通过同样的方法制作人角膜上皮片，然后将其移植给难治性眼表面疾病患者的临床试验，通过该方法得到的人角膜上皮片的移植作为眼功能恢复手段是有效的(非专利文献2、非专利文献3)。
此外，作为使细胞片在羊膜上形成的方法，报告了将健康正常的白色家兔或人的角膜上皮缘片进行酶处理并使角膜上皮细胞悬浊，将其接种到人基质羊膜(剥离除去了羊膜上皮细胞的羊膜)上，与支持细胞(NIH-3T3细胞)一起培养的方法(专利文献1，非专利文献4)。确认这里所得的人角膜上皮片在形态学上也具有与生物角膜上皮类似的层结构。此外，确认在人角膜上皮片的培养过程中，通过将培养细胞的表面暴露于气相并进行培养(air-lifting)，诱导紧密连接关联蛋白质的表达。
现有技术文献：
专利文献
专利文献1：WO2004/078225
非专利文献
非专利文献1：Koizumi N.et al.，Cornea，19，65-71(2000)
非专利文献2：Koizumi N.et al.，Archives of Ophthalmology，119，298-300(2001)
非专利文献3：Koizumi N.et al.，The American Academy of Ophthalmology，108，1569-74(2001)
非专利文献4：Koizumi N.et al.，Invest Ophthalmol Vis Sci，43，2114-21(2002)
发明内容
发明要解决的课题
在上述背景下，本发明的目的在于，提供一种高效地制造品质稳定的人角膜上皮片的方法。
解决课题的方法
在针对上述目的的研究中，本发明者发现，可用人间充质干细胞作为支持细胞，在将ROCK抑制剂、磷酸二酯酶抑制剂、MAP激酶抑制剂及TGF-β受体抑制剂进行各种组合而添加的培养基中培养来自人角膜上皮细胞的细胞，进一步地，通过将在该培养中所得的人角膜上皮细胞在人羊膜上培养，能够高效地制造人角膜上皮细胞片，从而完成本发明。即，本发明提供以下方案。
(1)一种制造方法，其是来自人角膜上皮细胞的细胞的制造方法，
其包括：在由具有细胞不能通过的微细孔的膜隔成第1室和第2室的培养容器的该第1室中加入支持细胞，在该第2室中加入人角膜上皮细胞，用含有ROCK抑制剂及磷酸二酯酶抑制剂的第1培养基培养该人角膜上皮细胞，接着，用含有磷酸二酯酶抑制剂、MAP激酶抑制剂及TGF-β受体抑制剂的第2培养基培养该人角膜上皮细胞。
(2)上述(1)记载的制造方法，其中，该培养容器由具有该微细孔的膜隔成上下2室，即上侧室和下侧室。
(3)上述(2)记载的制造方法，其中，该下侧室为该第1室，该上侧室为该第2室，并且在具有该微细孔的膜上培养该人角膜上皮细胞。
(4)上述(3)记载的制造方法，其中，使人角膜上皮细胞在具有该细胞不能通过的微细孔并且在该培养容器内被支持的膜上，不与该支持细胞直接接触而进行培养。
(5)上述(1)-(4)中任一项记载的制造方法，其中，在该第1培养基中含有的该ROCK抑制剂为Y27632，在该第1及该第2培养基中含有的该磷酸二酯酶抑制剂为3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，在该第2培养基中含有的MAP激酶抑制剂为选自SB203580、或者SB239063、或其组合的物质，在该第2培养基中含有的TGF-β受体抑制剂为选自SB431542、LY364947、或者A83-01、或其组合的物质。
(6)上述(1)-(4)中任一项记载的制造方法，其中，在该第1培养基中含有的该ROCK抑制剂为Y27632，在该第1及该第2培养基中含有的该磷酸二酯酶抑制剂为3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，在该第2培养基中含有的MAP激酶抑制剂为SB203580，在该第2培养基中含有的TGF-β受体抑制剂为SB431542。
(7)上述(6)记载的制造方法，其中，在该第1培养基中含有的Y27632的浓度为1-20μM，在该第1及该第2培养基中含有的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤的浓度为50-150μM，在该第2培养基中含有的SB203580的浓度为0.2-2μM，SB431542的浓度为0.2-2μM。
(8)上述(6)记载的制造方法，其中，在该第1培养基中含有的Y27632的浓度为约10μM，在该第1及该第2培养基中含有的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤的浓度为约100μM，在该第2培养基中含有的SB203580的浓度为约1μM，SB431542的浓度为约1μM。
(9)上述(1)-(8)中任一项记载的制造方法，其中，该支持细胞为人间充质干细胞。
(10)一种制造方法，其包括使通过上述(1)-(9)中任一项记载的制造方法得到的细胞悬浊于细胞冷冻液中并冷冻，成为冷冻细胞的步骤。
(11)一种细胞，其来自通过上述(1)-(10)中任一项记载的制造方法得到的人角膜上皮细胞。
(12)一种细胞，其来自通过上述(10)记载的制造方法得到的冷冻后的人角膜上皮细胞。
(13)一种制造方法，其是人角膜上皮片的制造方法，
其包括：对于上述(11)记载的来自人角膜上皮细胞的细胞，在其解冻后，将上述(11)或(12)记载的来自人角膜上皮细胞的细胞，在含有支持细胞的培养容器中，在置于具有该支持细胞不能通过的微细孔并且在该培养容器内被支持的膜上的基质羊膜上，使用含有ROCK抑制剂的第3培养基进行培养，接着，使用含有MAP激酶抑制剂及TGF-β受体抑制剂的第4培养基进行培养，在该基质羊膜上形成由来自该人角膜上皮细胞的细胞构成的细胞层的步骤；以及接着，在该细胞层的表面的全部或一部分没有被培养基覆盖的状态下，使用该第4培养基进行培养的步骤。
(14)上述(13)记载的制造方法，其中，该基质羊膜以剥离了羊膜上皮的一侧朝上的方式放置在该培养容器中。
(15)上述(13)或(14)记载的制造方法，其中，在该第3培养基中含有的该ROCK抑制剂为Y27632，在该第4培养基中含有的MAP激酶抑制剂为SB203580，在该第4培养基中含有的TGF-β受体抑制剂为SB431542。
(16)上述(15)记载的制造方法，其中，在该第3培养基中含有的Y27632的浓度为1-20μM，在该第4培养基中含有的SB203580的浓度为0.2-2μM，在该第4培养基中含有的SB431542的浓度为0.2-2μM。
(17)上述(15)记载的制造方法，其中，在该第3培养基中含有的Y27632的浓度为约10μM，在该第4培养基中含有的SB203580的浓度为约1μM，SB431542的浓度为约1μM，。
(18)上述(13)-(17)中任一项记载的制造方法，其中，该支持细胞为人间充质干细胞。
(19)一种人角膜上皮片，其通过上述(13)-(18)中任一项记载的制造方法得到，并包括该基质羊膜和该来自人角膜上皮细胞的细胞。
(20)上述(19)记载的人角膜上皮片，其中，剥离了该基质羊膜的羊膜上皮的一侧的面积的95％以上由通过该来自人角膜上皮细胞的细胞形成的细胞层覆盖。
(21)上述(20)记载的人角膜上皮片，其中，该细胞层的90％以上具有由二层以上细胞层构成的复层结构。
(22)上述(19)-(21)记载的任意一种人角膜上皮片，其中，该来自人角膜上皮细胞的细胞的98％以上为细胞角蛋白AE1/AE3阳性，并且80％以上为细胞角蛋白12阳性。
(23)上述(19)-(21)记载的任意一种人角膜上皮片，其中，该来自人角膜上皮细胞的细胞的99％以上为细胞角蛋白AE1/AE3阳性，85％以上为细胞角蛋白12阳性。
(24)上述(19)-(23)记载的人角膜上皮片，其用于角膜疾病的治疗。
(25)上述(24)记载的人角膜上皮片，其中，该角膜疾病为角膜上皮的屏障功能受到不可逆地损害的疾病。
(26)上述(24)记载的人角膜上皮片，其中，该角膜疾病选自角膜营养不良、Stevens-Johnson综合征、化学外伤及角膜上皮干细胞缺陷症。
(27)一种人角膜上皮片，其中，基质羊膜表面的99.5％以上由通过来自膜上皮细胞的细胞形成的细胞层覆盖，该细胞的98％以上为细胞角蛋白AE1/AE3阳性，该细胞的80％以上为细胞角蛋白12阳性，该细胞层的95％以上具有由四层以上的细胞层构成的复层结构，该细胞层表面的90％以上由扁平的细胞覆盖，该细胞层内的纤维母细胞的比率不足0.1％。
发明的效果
根据本发明，因为能够稳定地供给可给复发性角膜营养不良等角膜疾病的患者移植的、品质稳定的人角膜上皮片，所以可以解决角膜上皮移植的捐赠者不足。
附图说明
图1是示出HE染色后的人角膜上皮片的表面的放大图(观察倍率100倍)。
图2是示出HE染色后的人角膜上皮片的截面的放大图(观察倍率200倍)。A表示表层的扁平的细胞，B表示由来自人角膜上皮细胞的细胞形成的细胞层，C表示基质羊膜。
图3中(1)是示出用FACS检测细胞角蛋白AE1/AE3阳性细胞的图。纵轴表示细胞数，横轴表示来自Alexa Fluor(注册商标)488色素的荧光强度。(A)表示对照，(B)表示用抗细胞角蛋白AE1/AE3抗体染色后的细胞的荧光强度。(2)是示出用FACS检测细胞角蛋白12阳性细胞的图。纵轴表示细胞数，横轴表示来自Alexa Fluor(注册商标)647色素的荧光强度。(C)表示对照，(D)表示用抗细胞角蛋白12抗体染色后的细胞的荧光强度。
图4是示意性地示出实施例的人角膜上皮细胞的原代培养(P0培养)的培养容器的设置(setting)的图。
图5是示出将使用通过其他方法得到的来自人角膜上皮的细胞而制造的人角膜上皮片的表面进行HE染色后的放大图(观察倍率100倍)。
图6是示出将使用通过其他方法得到的来自人角膜上皮的细胞而制造的人角膜上皮片的截面进行HE染色后的放大图(观察倍率200倍)。A表示表层的扁平的细胞，B表示由来自人角膜上皮细胞的细胞形成的细胞层，C表示基质羊膜。
图7是示出在人角膜上皮细胞的培养时，各种MAP激酶抑制剂和TGF-β受体抑制剂的组合的人角膜上皮细胞的增殖促进效果的图。纵轴表示以对照组(NA)的吸光度(OD450)作为100％时的各组的吸光度的相对值(％)。误差线表示标准偏差。
具体实施方式
在本发明的来自人角膜上皮细胞的细胞的制造方法中，用蛋白质分解酶处理人角膜缘或包括人角膜上皮组织及角膜缘的组织切片可得到用于制造该细胞的人角膜上皮细胞。角膜缘是从巩膜向角膜过渡的部分，其包括具有分化为角膜上皮细胞的能力的干细胞。此时所使用的蛋白质分解酶优选为分散酶。就利用蛋白质分解酶的处理而言，优选为，首先用分散酶处理组织切片，使细胞(或细胞块)从组织切片的表面游离，成为悬浊液。此时使用的分散酶溶液是优选含有0.5-2.0U/mL的浓度的分散酶的PBS或后述的原代培养基本培养基。
此外，就用分散酶的处理而言，将细胞在37℃用振荡机缓慢地振荡1小时，或使细胞在4℃静置12-18小时而进行。特别是，在使用含有0.5-2.0U/mL的浓度的分散酶的原代培养基本培养基作为分散酶溶液的情况下，利用分散酶的处理优选使细胞在4℃静置12-18小时后在37℃静置40-80分钟，更优选在4℃静置14-16小时后在37℃静置50-70分钟，进一步优选在4℃静置15-20小时后在37℃静置60分钟而进行。此外，作为此时的原代培养基本培养基，可适当地使用CnT-20(CELLEnTEC公司)。
在本发明中，将通过利用上述蛋白质分解酶的处理得到的角膜上皮细胞，在通过具有使细胞不通过的微细孔的膜(支持膜)分隔为第1室和第2室并在该第1室加入了支持细胞的培养容器的该第2室中，使用含有ROCK抑制剂的第1培养基进行培养，接着，使用含有磷酸二酯酶抑制剂、MAP激酶抑制剂及TGF-β受体抑制剂的第2培养基进行培养。在本发明中，该一系列的培养称为人角膜上皮细胞的原代培养(P0培养)。
在本发明的一实施方案中，就通过利用上述蛋白质分解酶的处理得到的人角膜上皮细胞而言，优选地，在含有支持细胞的培养容器中，在作为具有细胞不能通过的微细孔的膜(支持膜)并且以下侧面不与该支持细胞接触的方式在该培养容器内被支持的膜上，使其不与该支持细胞直接接触，使用含有ROCK抑制剂的第1培养基进行培养，接着，使用含有磷酸二酯酶抑制剂、MAP激酶抑制剂及TGF-β受体抑制剂的第2培养基进行培养。与上述同样地，该一系列的培养称为人角膜上皮细胞的原代培养(P0培养)。
在本发明中，用于培养人角膜上皮细胞及支持细胞的培养容器，只要是能够培养哺乳动物细胞的培养容器即可，不特别限定，优选能够使细胞固定并进行培养的培养容器。培养容器通过后面详述的具有细胞不能通过的微细孔的膜分隔为第1室和第2室。因为该膜使细胞不能通过，所以在培养容器中，人角膜上皮细胞不与支持细胞直接接触，这些细胞不混在一起。就该膜而言，在培养容器的形状为平底的情况下，可以垂直于平底的底面设置，此外，也可以水平地设置。在该膜垂直于平底的底面设置的情况下，将人角膜上皮细胞和支持细胞一起在培养容器的底面上培养。在该膜相对于平底的底面水平地设置的情况下，将人角膜上皮细胞和支持细胞中任意一个在培养容器的底面上，另外一个在该膜上进行培养。
作为培养容器的形状为平底的培养容器，例如，有市售的细胞培养板(24孔板、12孔板、6孔板等)。此外，培养容器底面优选用纤连蛋白、胶原蛋白(胶原蛋白I型、IV型等)、层粘连蛋白等细胞粘着性糖蛋白质、或包括这些细胞粘着性糖蛋白质的细胞粘着活性部位(RGD序列)的肽涂敷，以使细胞容易固定。若将用作支持细胞的NIH3T3细胞或人间充质干细胞在这种培养容器上进行培养，则支持细胞固定在该容器的底面。
如上所述，培养容器的内部安装有具有微细孔并且支持细胞不能通过的膜(支持膜)，并通过该膜分隔为2室。在优选的方案中，就该膜而言，在培养容器的内部，相对于培养容器的底面大致水平地安装，以在其下侧能够确保支持细胞的培养空间并且使其下侧面不与支持细胞接触。作为支持膜的材质，聚对苯二甲酸乙二醇酯及聚碳酸酯是适合的，聚对苯二甲酸乙二醇酯特别适合。该膜具有的微细孔具有能够阻止支持细胞的(及进一步人角膜上皮细胞的)通过而在培养基中作为溶质所含有的液体成分可通过的孔径。微细孔的孔径优选为0.1-1.5μm，更优选为0.2-1.2μm，进一步优选为0.4-1.0μm。由于支持细胞(及还有人角膜上皮细胞)的尺寸远远超过所述孔径，因此即使有浮游的物质，也不能通过支持膜，但培养基、及由支持细胞分泌的生长因子等液体成分能通过支持膜。因此，在培养容器中角膜上皮细胞与支持细胞不直接接触。此外，优选支持膜预先用纤连蛋白、胶原蛋白(胶原蛋白I型、IV型等)、层粘连蛋白等细胞粘着性糖蛋白质、或包括这些细胞粘着性糖蛋白质的细胞粘着活性部位(RGD序列)的肽涂敷。
图4示意性地示出根据实施例，本发明的人角膜上皮细胞的原代培养的培养容器的设置的一例。在图4中，培养容器(6孔配套板(companion plate))通过具有微细孔的膜上下分隔为下侧室(第1室)和上侧室(第2室)。在第1室中加入人间充质干细胞作为支持细胞，在第2室中加入人角膜上皮细胞，将人间充质干细胞在第1室中在培养容器的底面进行培养，将人角膜上皮细胞在第2室中在具有微细孔的膜上进行培养。细胞不能通过具有微细孔的膜，而培养基、及由支持细胞分泌的生长因子等液体成分能够通过微细孔。
在本发明中，支持细胞是指在人角膜上皮细胞(或来自人角膜上皮细胞的细胞)的原代培养或制造角膜上皮片时，为了促进人角膜上皮细胞(或来自人角膜上皮细胞的细胞)的增殖所使用的细胞。支持细胞通过补给培养基中不足的营养成分或特殊的生长因子，具有促进细胞的增殖的功能。作为可用作支持细胞的细胞，只要能够促进人角膜上皮细胞(或来自人角膜上皮细胞的细胞)的增殖即可，没有特别限定，NIH3T3细胞、BALB/3T3细胞、Swiss3T3、间充质干细胞等是适合的，间充质干细胞特别适合。从防止异种蛋白质的混入的观点来看，支持细胞更优选来自人的细胞。
另外，在本发明中，间充质干细胞(MSC)是指来自间充质的干细胞或其前体细胞，其可在未分化的状态下增殖并分化为至少2种细胞。由间充质干细胞分化诱导的细胞为，例如成骨细胞、成软骨细胞、成脂肪细胞。
已知MSC可以从骨髓、脂肪组织、牙髓、脐带血、胎盘、及羊膜等各种组织获取。本发明中使用的MSC与其获取来源的组织无关，全部可以使用，但优选来自骨髓的MSC。此外，本发明中使用的MSC优选为人间充质干细胞(hMSC)。hMSC可以通过各种方法来获得，例如在来自骨髓的hMSC的情况下，可以用专利文献(特表平7-500001)等记载的方法来获取。
本发明中所使用的hMSC可以利用表面抗原的表达规律来进一步指定，在使用特异性抗体进行流式细胞仪分析的情况下，优选地，CD29、CD44及CD105为阳性，CD34及CD45为阴性，更优选地，CD29、CD44、CD73、CD90及CD105为阳性，CD34及CD45为阴性，进一步优选地，CD29、CD44、CD73、CD90、CD105及CD166为阳性，CD34及CD45为阴性，进一步更优选地，CD29、CD44、CD49a、CD49e、CD73、CD90、CD105及CD166为阳性，CD34及CD45为阴性。
就人角膜上皮细胞的原代培养而言，优选地，在支持膜上添加通过利用上述蛋白质分解酶的处理得到的人角膜上皮细胞，在隔着支持膜于上侧存在有人角膜上皮细胞(或来自人角膜上皮细胞的细胞)，下侧存在有支持细胞(但是，与膜不接触)的状态下进行。在培养时，将培养基加入到容器中，以使在支持膜上添加的人角膜上皮细胞完全地被培养基覆盖。在这种情况下，支持细胞在培养容器的底面进行培养，人角膜上皮细胞在具有微细孔的膜(支持膜)上进行培养。此时，有支持细胞的支持膜下侧为培养容器的第1室，有人角膜上皮细胞的上侧为培养容器的第2室。培养中，来自支持细胞的生长因子等成分通过支持膜的微细孔，也被供给至支持膜的上侧。此时，人角膜上皮细胞优选在支持膜上固定在支持膜的表面进行培养。
在本发明中，人角膜上皮细胞的原代培养在隔着支持膜在下侧存在有人角膜上皮细胞(或来自人角膜上皮细胞的细胞)，在上侧存在有支持细胞的状态下进行。在这种情况下，支持细胞在具有微细孔的膜上进行培养，人角膜上皮细胞在培养容器的底面进行培养。此时，人角膜上皮细胞优选固定在培养容器的底面进行培养。另外此时，有支持细胞的支持膜上侧为培养容器的第1室，有人角膜上皮细胞的下侧为培养容器的第2室。
在原代培养(P0培养)的开始时，将人角膜上皮细胞加入至培养容器中，以在培养容器的底面或支持膜上优选为1×104至1×105个/cm2，更优选为4×104至6×104个/cm2，进一步优选为约5×104个/cm2。
在本发明中，仅仅说细胞时，意指广泛地包含全部哺乳动物细胞，特别意指支持细胞及人角膜上皮细胞(或来自人角膜上皮细胞的细胞)二者。
在人角膜上皮细胞的原代培养中，就人角膜上皮细胞而言，用含有ROCK抑制剂的第1培养基进行培养，接着，使用含有磷酸二酯酶抑制剂、MAP激酶抑制剂及TGF-β受体抑制剂的第2培养基进行培养。就原代培养中的第1培养基、第2培养基而言，作为基本的培养基(原代培养基本培养基)，都含有氨基酸、维生素、无机盐类、及其他成分。在原代培养基本培养基中含有的氨基酸的种类及浓度，可从表1中适当地选择。
[表1]
表1 在原代培养用培养基中含有的氨基酸的种类及浓度
| 成分 | mM(范围) |
| 甘氨酸 | 0～12.8 |
| L-丙氨酸 | 0～3.4 |
| L-丙氨酰-L-谷氨酰胺 | 0～1.2 |
| L-谷氨酰胺 | 0～7 |
| L-精氨酸 | 0.48～1.2 |
| L-天冬酰胺 | 0～1.2 |
| L-天冬氨酸 | 0～1.4 |
| L-半胱氨酸 | 0.08～0.7 |
| L-谷氨酸 | 0～0.12 |
| L-组氨酸 | 0.12～1.2 |
| L-异亮氨酸 | 0.028～1.0 |
| L-亮氨酸 | 0.08～1.0 |
| L-赖氨酸 | 0.16～2.0 |
| L-甲硫氨酸 | 0.025～0.4 |
| L-苯丙氨酸 | 0.025～0.5 |
| L-脯氨酸 | 0～4.2 |
| L-丝氨酸 | 0～0.3 |
| L-苏氨酸 | 0.08～0.96 |
| L-色氨酸 | 0.008～0.095 |
| L-酪氨酸 | 0.024～0.48 |
| L-缬氨酸 | 0.08～1.0 |
| L-胱氨酸 | 0.08～0.12 |
在原代培养基本培养基中含有的维生素的种类及浓度，可从表2中适当地选择。
[表2]
表2 在原代培养基本培养基中含有的维生素的种类及浓度
| 成分 | mM(范围) |
| 生物素 | 0～0.001 |
| 氯化胆碱 | 0.0056～0.12 |
| D-泛酸钙 | 0.00032～0.01 |
| 叶酸 | 0.00036～0.011 |
| 烟酰胺 | 0.00023～0.2 |
| 吡哆醇 | 0～0.024 |
| 腐胺 | 0.0001～0.001 |
| 核黄素 | 0～0.0007 |
| 维生素B12 | 0～0.02 |
| 肌醇 | 0.0014～0.12 |
| 抗坏血酸 | 0～0.35 |
| DL-α-生育酚磷酸盐 | 0～0.0018 |
| 4-氨基苯甲酸 | 0～0.018 |
| 硫胺盐酸盐 | 0.0005～0.02 |
在原代培养基本培养基中含有的无机盐类的种类及浓度，可从表3中适当地选择。
[表3]
表3 在原代培养基本培养基中含有的无机盐类的种类及浓度
| 成分 | mM(范围) |
| CaCl2·2H2O | 0～2.2 |
| CuSO4·5H2O | 0～0.000012 |
| FeSO4·7H2O | 0～0.0018 |
| Fe(NO3)3·9H2O | 0～0.00015 |
| MgCl2·6H2O | 0～0.85 |
| MgSO4 | 0～0.98 |
| KCl | 2.4～6.4 |
| KH2PO4 | 0～1.45 |
| NaHCO3 | 1.1～54 |
| NaCl | 70～140 |
| Na2HPO4 | 0～1.2 |
| NaH2PO4 | 0～1.2 |
| ZnSO4·7H2O | 0～0.0036 |
除了表3中示出的物质外，可以在培养基中适当地添加亚硒酸钠、钼酸铵、氯化锰、硫酸镍、氯化锡、硅酸钠等无机盐类。向培养基中添加亚硒酸钠[Na2SeO3]时，其浓度优选为0.003-0.02mg/L，更优选为约0.005mg/L。向培养基中添加钼酸铵[(NH4)6Mo7O24·4H2O]时，其浓度优选为0.0005-0.002mg/L，更优选为约0.001mg/L。向培养基中添加氯化锰[MnCl2·4H2O]时，其浓度优选为0.0001-0.0004mg/L，更优选为约0.0002mg/L。向培养基中添加硫酸镍[NiSO4·6H2O]时，其浓度优选为0.0001-0.0005mg/L，更优选为约0.0003mg/L。向培养基中添加氯化锡[SnCl2·2H2O]时，其浓度优选为0.00005-0.0002mg/L，更优选为约0.0001mg/L。向培养基中添加硅酸钠[Na2SiO3·9H2O]时，其浓度优选为0.0001-0.2mg/L，更优选为约0.14mg/L。
在原代培养基本培养基中含有的其他成分的种类及浓度，可从表4中适当地选择。
[表4]
表4 在原代培养基本培养基中含有的其他成分的种类及浓度
| 成分 | mM(范围) |
| D-葡萄糖 | 4.5～67 |
| 次黄嘌呤 | 0～0.036 |
| 亚油酸 | 0～0.00036 |
| 硫辛酸 | 0～0.0012 |
| 酚红 | 0～0.0035 |
| 胸腺嘧啶 | 0～0.0035 |
| 乳酸钙 | 0～3.1 |
| 乙酸钠 | 0～0.72 |
| HEPES | 0～18 |
可以在原代培养基本培养基中适当地添加一种或两种以上选自上皮增殖因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素、转铁蛋白等生长因子；腺嘌呤；L-乙醇胺；皮质醇；D，L-硫辛酸；丙酮酸钠；磷酰乙醇胺；肝素；肾上腺素等的其他成分。向培养基中添加EGF时，其浓度优选为1-50ng/mL，更优选为5-40ng/mL。向培养基中添加bFGF时，其浓度优选为1-20ng/mL，更优选为3-7ng/mL。向培养基中添加胰岛素时，其浓度优选为1-200μg/mL，更优选为2-100μg/mL。添加转铁蛋白时，其浓度优选为1-200μg/mL，更优选为2-20μg/mL。向培养基中添加腺嘌呤时，其浓度优选为15-35mg/L，更优选为20-30mg/L。向培养基中添加L-乙醇胺时，其浓度优选为2.5-4mg/L，更优选为3-3.5mg/L。向培养基中添加皮质醇时，其浓度优选为0.1-1.0mg/L，更优选为0.3-0.7mg/L。向培养基中添加D，L-硫辛酸时，其浓度优选为20-40mg/L，更优选为25-30mg/L。向培养基中添加丙酮酸钠时，其浓度优选为40-65mg/L，更优选为50-60mg/L。向培养基中添加磷酰乙醇胺时，其浓度优选为0.02-0.12mg/L，更优选为0.05-0.10mg/L。向培养基中添加肝素时，其浓度优选为1-570IU/L，向培养基中添加肾上腺素时，其浓度优选为0.1-2μM。
作为原代培养基本培养基，可适当地使用作为人角膜上皮继代用无血清培养基的CnT-20培养基(CELLEnTEC公司)。此外，原代培养基本培养基可基于特表2000-506374、特表2000-517188等专利文献公开的培养基组成适当地进行制作。
原代培养的第1培养基为在原代培养基本培养基中添加了ROCK抑制剂及磷酸二酯酶抑制剂的培养基。此时不特别限定于可添加至原代培养基本培养基中的ROCK抑制剂，可适当地使用由下述化学式(I)表示的Y27632，其在培养基中的合适的浓度为1-20μM，特别是约10μM。此外，此时不特别限定于可添加至原代培养基本培养基中的磷酸二酯酶抑制剂，可适当地使用3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，其在培养基中的合适的浓度为50-150μM，特别是约100μM。此外，也可以组合使用2种或以上的ROCK抑制剂，也可以组合使用2种或以上的磷酸二酯酶抑制剂。
[化学式1]
原代培养的第2培养基为在原代培养基本培养基中添加了磷酸二酯酶抑制剂、MAP激酶抑制剂及TGF-β受体抑制剂的培养基。此时不特别限定于可添加至原代培养基本培养基中的磷酸二酯酶抑制剂，可适当地使用3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，其在培养基中的合适的浓度为50-150μM，特别是约100μM。此外，也可组合使用2种或以上的磷酸二酯酶抑制剂。
此外，不特别限定于可添加至原代培养基本培养基中的MAP激酶抑制剂，可适当地使用由下述化学式(II)表示的SB203580、或由下述化学式(III)表示的SB239063。在使用SB203580时，其在培养基中的合适的浓度为0.2-2μM，特别是约1.0μM。此外，也可组合使用2种或以上的MAP激酶抑制剂。
[化学式2]
[化学式3]
此外，不特别限定于可添加至原代培养基本培养基中的TGF-β受体抑制剂，可适当地使用由下述化学式(IV)表示的SB431542、由下述化学式(V)表示的LY364947、或由下述化学式(VI)表示的A83-01，特别是适当地使用SB431542或LY364947。在使用SB431542时，其在培养基中的合适的浓度为0.2-2μM，特别是约1.0μM。此外，也可组合使用2种或以上的TGF-β受体抑制剂。
[化学式4]
[化学式5]
[化学式6]
在本发明中，将对人角膜上皮细胞进行培养并使其增殖而得到的细胞称为来自人角膜上皮细胞的细胞(来自人角膜上皮的细胞)，为方便起见，也将其简称为人角膜上皮细胞。进行人角膜上皮细胞的原代培养，直到来自人角膜上皮的细胞优选占据支持膜表面的70％以上，更优选占据85％以上，进一步优选占据90％以上为止。用人角膜上皮细胞的原代培养得到的细胞可以用于人角膜上皮片的制造。
可将通过原代培养得到的来自人角膜上皮的细胞冷冻并保存。进行冷冻时，在培养容器或膜上用PBS洗涤来自人角膜上皮的细胞，接着用蛋白质分解酶进行处理，将细胞从培养容器或膜剥离，使剥离后的细胞悬浊于细胞冷冻保存液，作为细胞悬浊液。将该细胞悬浊液在液氮中在冷冻状态保存。此时可使用的蛋白质分解酶优选为胶原酶A。
在来自人角膜上皮的细胞的冷冻保存中使用的细胞冷冻保存液为含有例如二甲基亚砜(DMSO)、胎牛血清(FCS)、天然高分子化合物或有机合成高分子化合物、单糖或二糖、及缓冲液的水溶液。但是，天然高分子化合物或有机合成高分子化合物为任意的成分，根据细胞的状态适当地添加。在细胞冷冻保存液中含有的DMSO的浓度优选为5-15％(v/v)。在细胞冷冻保存液中含有的胎牛血清的浓度优选为50-90％(v/v)。在细胞冷冻保存液中含有的天然高分子化合物优选为葡聚糖、糖原、甲基纤维素或羧甲基纤维素，其浓度优选为0.1-1.0％(v/v)。在细胞冷冻保存液中含有的有机合成高分子化合物优选为聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮，其浓度优选为1-10％(v/v)。在细胞冷冻保存液中含有的单糖优选为葡萄糖，其浓度优选为1-10％(w/v)。在细胞冷冻保存液中含有的二糖优选为蔗糖，其浓度优选为1-10％(w/v)。作为缓冲液，可适当地使用碳酸缓冲液、磷酸缓冲液、HEPES等。
作为优选的细胞冷冻保存液的组成，例如，可列举含有75％(v/v)胎牛血清、10％(v/v)DMSO、3％(w/v)葡萄糖、0.08％(w/v)碳酸氢钠、0.036％(w/v)HEPES、0.1575％(w/v)RPMI1640粉末培养基(粉末)的水溶液。作为市售的细胞冷冻保存液的Cell Banker(日本全药工业公司)、或CnT-CRYO-50(CELLnTEC公司)可适合用于来自人角膜上皮的细胞的冷冻保存。
此外，来自人角膜上皮的细胞在细胞冷冻液中的浓度优选为0.5×105-1.5×106个/mL，更优选为1×105-1×106个/mL。
在本发明中，冷冻并保存的来自人角膜上皮的细胞可解冻并用于人角膜上皮片的制造。因此，因为通过将来自人角膜上皮的细胞冷冻并大量地保存，在制造人角膜上皮片时，能够根据需要将其解冻并使用，所以可稳定地供给人角膜上皮片。
在本发明中，就人角膜上皮片的制造而言，将用人角膜上皮细胞的原代培养得到的细胞(来自人角膜上皮的细胞)，在含有支持细胞的培养容器中，在置于具有使该支持细胞不能通过的微细孔并且以下侧面不与该支持细胞接触的方式在该培养容器内被支持的膜上的基质羊膜上，使用含有ROCK抑制剂的第3培养基进行培养，接着，使用含有MAP激酶抑制剂及TGF-β受体抑制剂的第4培养基进行培养。
在人角膜上皮片的制造中，就来自人角膜上皮的细胞而言，不仅能够通过上述方法暂时冷冻，然后解冻使用，也能够不进行冷冻而使用。在不将来自人角膜上皮的细胞冷冻而使用时，在原代培养结束后将细胞从支持膜上用蛋白质分解酶进行剥离，将其悬浊于培养基中进行使用。此时可使用的蛋白质分解酶优选为胶原酶A。
在本发明的人角膜上皮片的制造中，来自人角膜上皮的细胞在置于安装于培养容器的内部具有微细孔并且能够阻止支持细胞通过的膜(支持膜)上的基质羊膜上进行培养。此时使用的支持膜在培养容器的内部相对于培养容器的底面大致水平地安装，以在其下侧能够确保支持细胞的培养空间并且使其下侧面不与支持细胞接触。作为支持膜的材质，聚对苯二甲酸乙二醇酯及聚碳酸酯是适合的，聚对苯二甲酸乙二醇酯特别适合。支持膜具有的微细孔具有能够阻止支持细胞的(及进一步人角膜上皮细胞的)通过而在培养基中作为溶质所含有的液体成分能够通过的孔径。微细孔的孔径优选为0.1-1.5μm，更优选为0.2-1.2μm，进一步优选为0.4-1.0μm。由于支持细胞(以及人角膜上皮细胞)的尺寸远远超过所述孔径，因此即使有浮游的物质，也不能通过支持膜，而培养基、及由支持细胞分泌的生长因子等液体成分能通过支持膜。此外，优选支持膜预先用纤连蛋白、胶原蛋白(胶原蛋白I型、IV型等)、层粘连蛋白等涂敷。
此外，此时使用的基质羊膜是指从羊膜将羊膜的上皮剥离后的膜。以将该基质羊膜的上皮剥离后的一侧的面作为上侧，展开以覆盖整个支持膜，干燥后，相对于支持膜进行固定。因此，基质羊膜以将羊膜上皮剥离后的一侧朝上的方式，在支持膜上置于培养容器中。此时使用的羊膜优选为人羊膜。此外，羊膜的干燥可通过风干等方法进行。
在人角膜上皮片的制造中，将来自人角膜上皮的细胞在培养基中悬浊后，接种至固定于支持膜的基质羊膜上，以优选成为1×104至2×104个/cm2的密度。在培养时，将培养基加入到容器中，以使在基质羊膜上添加的人角膜上皮细胞完全地被培养基覆盖。即，在隔着该膜于下侧存在有支持细胞(但是，与膜不接触)，上侧存在有基质羊膜和来自人角膜上皮的细胞的状态下进行培养。培养中，来自支持细胞的生长因子等成分通过膜的微细孔，也被供给至膜的上侧。
在人角膜上皮片的制造中，就接种到基质羊膜上的来自人角膜上皮的细胞的培养而言，用添加了ROCK抑制剂及磷酸二酯酶抑制剂的第3培养基而开始。作为该第3培养基的基本的培养基(人角膜上皮片制造用基本培养基)，含有氨基酸、维生素、无机盐类、及其他成分。在人角膜上皮片制造用基本培养基中含有的氨基酸的种类及浓度，可从表5中适当地选择。
[表5]
表5 在人角膜上皮片制造用基本培养基中含有的氨基酸的种类及浓度
| 成分 | mM(范围) |
| 甘氨酸 | 0～12.8 |
| L-丙氨酸 | 0～3.4 |
| L-丙氨酰-L-谷氨酰胺 | 0～1.2 |
| L-谷氨酰胺 | 0～7 |
| L-精氨酸 | 0.48～1.2 |
| L-天冬酰胺 | 0～1.2 |
| L-天冬氨酸 | 0～1.4 |
| L-半胱氨酸 | 0.08～0.7 |
| L-谷氨酸 | 0～0.12 |
| L-组氨酸 | 0.12～1.2 |
| L-异亮氨酸 | 0.028～1.0 |
| L-亮氨酸 | 0.08～1.0 |
| L-赖氨酸 | 0.16～2.0 |
| L-甲硫氨酸 | 0.025～0.4 |
| L-苯丙氨酸 | 0.025～0.5 |
| L-脯氨酸 | 0～4.2 |
| L-丝氨酸 | 0～0.3 |
| L-苏氨酸 | 0.08～0.96 |
| L-色氨酸 | 0.008～0.095 |
| L-酪氨酸 | 0.024～0.48 |
| L-缬氨酸 | 0.08～1.0 |
| L-胱氨酸 | 0.08～0.12 |
在人角膜上皮片制造用基本培养基中含有的维生素的种类及浓度，可从表6中适当地选择。
[表6]
表6 在人角膜上皮片制造用基本培养基中含有的维生素的种类及浓度
| 成分 | mM(范围) |
| 生物素 | 0～0.001 |
| 氯化胆碱 | 0.0056～0.12 |
| D-泛酸钙 | 0.00032～0.01 |
| 叶酸 | 0.00036～0.011 |
| 烟酰胺 | 0.00023～0.2 |
| 吡哆醇 | 0～0.024 |
| 腐胺 | 0.0001～0.001 |
| 核黄素 | 0～0.0007 |
| 维生素B12 | 0～0.02 |
| 肌醇 | 0.0014～0.12 |
| 抗坏血酸 | 0～0.35 |
| DL-α-生育酚磷酸盐 | 0～0.0018 |
| 4-氨基苯甲酸 | 0～0.018 |
| 硫胺盐酸盐 | 0.0005～0.02 |
在人角膜上皮片制造用基本培养基中含有的无机盐类的种类及浓度，可从表7中适当地选择。
[表7]
表7 在人角膜上皮片制造用基本培养基中含有的无机盐类的种类及浓度
| 成分 | mM(范围) |
| CaCl2·2H2O | 0～2.2 |
| CuSO4·5H2O | 0～0.000012 |
| FeSO4·7H2O | 0～0.0018 |
| Fe(NO3)3·9H2O | 0～0.00015 |
| MgCl2·6H2O | 0～0.85 |
| MgSO4 | 0～0.98 |
| KCl | 2.4～6.4 |
| KH2PO4 | 0～1.45 |
| NaHCO3 | 1.1～54 |
| NaCl | 70～140 |
| Na2HPO4 | 0～1.2 |
| NaH2PO4 | 0～1.2 |
| ZnSO4·7H2O | 0～0.0036 |
除了表7中示出的物质外，可以在培养基中适当地添加亚硒酸钠、钼酸铵、氯化锰、硫酸镍、氯化锡、硅酸钠等无机盐类。向培养基中添加亚硒酸钠[Na2SeO3]时，其浓度优选为0.003-0.02mg/L，更优选为约0.005mg/L。向培养基中添加钼酸铵[(NH4)6Mo7O24·4H2O]时，其浓度优选为0.0005-0.002mg/L，更优选为约0.001mg/L。向培养基中添加氯化锰[MnCl2·4H2O]时，其浓度优选为0.0001-0.0004mg/L，更优选为约0.0002mg/L。向培养基中添加硫酸镍[NiSO4·6H2O]时，其浓度优选为0.0001-0.0005mg/L，更优选为约0.0003mg/L。向培养基中添加氯化锡[SnCl2·2H2O]时，其浓度优选为0.00005-0.0002mg/L，更优选为约0.0001mg/L。向培养基中添加硅酸钠[Na2SiO3·9H2O]时，其浓度优选为0.0001-0.2mg/L，更优选为约0.14mg/L。
在人角膜上皮片制造用基本培养基中含有的其他成分的种类及浓度，可从表8中适当地选择。
[表8]
表8 在人角膜上皮片制造基本用培养基中含有的其他成分的种类及浓度
| 成分 | mM(范围) |
| D-葡萄糖 | 4.5～67 |
| 次黄嘌呤 | 0～0.036 |
| 亚油酸 | 0～0.00036 |
| 硫辛酸 | 0～0.0012 |
| 酚红 | 0～0.0035 |
| 胸腺嘧啶 | 0～0.0035 |
| 乳酸钙 | 0～3.1 |
| 乙酸钠 | 0～0.72 |
| HEPES | 0～18 |
人角膜上皮片制造用基本培养基优选进一步含有转铁蛋白、皮质醇、肾上腺素、胰岛素、上皮增殖因子(EGF)等。培养基含有转铁蛋白时，其浓度优选为1-200μg/mL，更优选为3-5μg/mL。培养基含有皮质醇时，其浓度优选为0.8-1.4mg/L，更优选为1.0-1.2mg/L。培养基含有肾上腺素时，其浓度优选为0.1-2μM，更优选为0.5-0.8μM。培养基含有胰岛素时，其浓度优选为1-200μg/mL，更优选为3-7μg/mL。培养基含有EGF时，其浓度优选为1-50ng/mL，更优选为5-40ng/mL。
可以在人角膜上皮片制造用基本培养基中适当地添加一种或两种以上选自碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等生长因子；腺嘌呤；L-乙醇胺；D，L-硫辛酸；丙酮酸钠；磷酰乙醇胺；肝素等的其他成分。向培养基中添加bFGF时，其浓度优选为1-20ng/mL，更优选为3-7ng/mL。向培养基中添加腺嘌呤时，其浓度优选为15-35mg/L，更优选为20-30mg/L。向培养基中添加L-乙醇胺时，其浓度优选为2.5-4mg/L，更优选为3-3.5mg/L。向培养基中添加D，L-硫辛酸时，其浓度优选为20-40mg/L，更优选为25-30mg/L。向培养基中添加丙酮酸钠时，其浓度优选为40-65mg/L，更优选为50-60mg/L。向培养基中添加磷酰乙醇胺时，其浓度优选为0.02-0.12mg/L，更优选为0.05-0.10mg/L。向培养基中添加肝素时，其浓度优选为1-570IU/L。
作为人角膜上皮片制造用基本培养基，可适当地使用将SHEM培养基和KB培养基以1∶2的比例混合后的培养基。此外，也可以在人角膜上皮片制造用基本培养基中添加胎牛血清(FCS)。向培养基中添加胎牛血清时，其浓度优选为2-10％，更优选为4-6％。
在人角膜上皮片的制造中使用的第3培养基为在人角膜上皮片制造用基本培养基中添加了ROCK抑制剂的培养基。此时不特别限定于可添加至人角膜上皮片制造用基本培养基中的ROCK抑制剂，可适当地使用Y27632，其在培养基中的合适的浓度为1-20μM，特别是约10μM。
在人角膜上皮片的制造中，在使用了第3培养基的培养中的细胞的培养时间优选为2-4天，更优选为2-3天。
继使用了第3培养基的培养后，将来自人角膜上皮的细胞用在人角膜上皮片制造用基本培养基中添加了MAP激酶抑制剂及TGF-β受体抑制剂的第4培养基进行培养。此时不特别限定于可添加至人角膜上皮片制造用基本培养基中的MAP激酶抑制剂，可适当地使用SB203580。使用SB203580时，其在培养基中的合适的浓度为0.2-2μM，特别是约1.0μM。此外，不特别限定于可添加至人角膜上皮片制造用基本培养基中的TGF-β受体抑制剂，可适当地使用SB431542。使用SB431542时，其在培养基中的合适的浓度为0.2-2μM，特别是约1.0μM。
在人角膜上皮片的制造中的使用了第4培养基的培养中，细胞的培养时间优选为7-14天。这期间，优选在培养开始后的4-6天，每2天更换培养基，接着7-14天每1天更换培养基。最后更换了培养基后，测定乳酸浓度，并在乳酸浓度优选为7-11mM，更优选为8-10mM的时候更换培养基。通过使用了第3培养基及第4培养基的培养，在基质羊膜上，细胞增殖，形成由来自人角膜上皮细胞的细胞形成的细胞层。
继使用了第4培养基的培养后，就来自人角膜上皮的细胞而言，在浸泡基质羊膜的底面、然而基质羊膜上形成的由来自人角膜上皮的细胞构成的细胞层的表面全部或一部分不被培养基覆盖的状态(暴露于培养器中的气相的状态)下，进行优选2-5天，更优选3天的培养。这样使培养细胞的表面暴露于气相进行培养的方法一般称为air-lifting培养。可在air-lifting培养中使用的培养基为在人角膜上皮片制造用基本培养基中添加了MAP激酶抑制剂及TGF-β受体抑制剂的培养基，可以适当地使用第4培养基。
在air-lifting培养期间，优选每10-24小时，更优选每12小时更换培养基。这样，可得到由来自人角膜上皮的细胞形成的细胞层在基质羊膜的表面上形成的人角膜上皮片。
在本发明中，人角膜上皮片是指剥离了基质羊膜的羊膜上皮的一侧的面(基质羊膜的表面)由细胞层覆盖的片，其中所述细胞层由来自人角膜上皮的细胞形成。在本发明中，就人角膜上皮片而言，基质羊膜的表面的优选95％以上，更优选98％以上，进一步优选99.5％以上，进一步更优选99.8％以上用由来自人角膜上皮的细胞形成的细胞层覆盖，此外，由来自人角膜上皮的细胞形成的细胞层的优选90％以上、进一步优选98％以上具有由二层以上的细胞构成的复层结构。此外，由来自人角膜上皮的细胞形成的细胞层的优选95％以上具有由三层以上的细胞构成的复层结构。此外，由来自人角膜上皮的细胞形成的细胞层的优选95％以上具有由四层以上的细胞构成的复层结构。
在本发明中，就人角膜上皮片而言，由来自人角膜上皮的细胞形成的细胞层的表面的优选90％以上，更优选98％以上由扁平的细胞覆盖。
在本发明中，在基质羊膜的表面形成的由来自人角膜上皮的细胞形成的细胞层内，纤维母细胞的比率优选为不足0.1％，更优选为不足0.02％。
在本发明中，构成人角膜上皮片的来自人角膜上皮的细胞优选98％以上为细胞角蛋白AE1/AE3阳性，80％以上为细胞角蛋白12阳性，更优选99％以上为细胞角蛋白AE1/AE3阳性，85％以上为细胞角蛋白12阳性。
在本发明中制造的人角膜上皮片，作为角膜疾病的患者的治疗用人角膜上皮片，可代替以往的角膜移植使用。作为利用人角膜上皮片治疗的对象的角膜疾病，不特别限定于屏障功能等角膜上皮的功能损害的疾病，特别是屏障功能等角膜上皮的功能不可逆地损害的疾病、复发性角膜营养不良、Stevens-Johnson综合征、化学外伤及角膜上皮干细胞缺陷症等。
实施例
以下，参照实施例进一步详细地说明本发明，并不意在将本发明限定于实施例。
〔支持细胞的制备〕
将冷冻保存后的人间充质干细胞(hMSC)在37℃恒温槽中快速地解冻，添加DMEM/10％FBS培养基并悬浊后，离心，使细胞沉淀并回收。将回收后的细胞在DMEM/10％FBS培养基中悬浊，测定活细胞数。接种到细胞培养池(cell culture insert)配套板6孔(6孔配套板，BD Biosciences公司)的底孔(bottom well)上，以使密度为15000-25000个/cm2，在DMEM/10％FBS培养基中，在5％CO2存在下，在37℃培养1-3天。在将hMSC用作人角膜上皮细胞的原代培养(P0培养)的支持细胞之前，从底孔去掉DMEM/10％FBS培养基，将1.5mL的将10μM的Y27632(ROCK抑制剂)(Sigma公司)及100μM的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX，磷酸二酯酶抑制剂)(Sigma公司)进一步添加至在角膜上皮细胞培养用培养基(CELLEnTEC公司)中添加了补充剂A、补充剂B、补充剂C及10μg/mL庆大霉素(Invitrogen公司)的培养基(CnT-20培养基)中而成的培养基添加至底孔。将其作为添加有支持细胞的6孔配套板。
〔人角膜上皮细胞的原代培养(P0培养)〕
在体视显微镜下用手术用刀及角膜用剪刀，从研究用人角膜组织(2眼份，SightLife公司制)剪下巩膜、结膜等，切出包括角膜上皮组织及缘的组织切片。在切出的组织切片中添加分散酶溶液(含有1.2U/mL的分散酶(三光纯药)的PBS(Invitrogen公司))，在37℃用振荡机缓慢地振荡1小时。接着，用含有0.02％EDTA的PBS使酶反应停止后，将组织切片移至35mm培养皿(PrimeSurface，住友Bakelite公司)后，在体视显微镜观察下，用无钩镊子将人角膜上皮细胞从组织切片刮下，得到细胞悬浊液。将细胞悬浊液移至离心管(プロテオフリ一，住友Bakelite)后进行离心，在除去上清液后的颗粒中添加CnT-20培养基进行再次离心，回收细胞。使回收后的细胞悬浊于6mL含有10μM的Y27632(ROCK抑制剂)(Sigma公司)及100μM的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX，磷酸二酯酶抑制剂)(Sigma公司)的CnT-20培养基(实施例的第1培养基)中。
将用FNC Coating Mix(AthenaES公司)涂敷后的6孔细胞培养池(孔径0.4μm，聚对苯二甲酸乙二醇酯制，BD Falcon细胞培养池，BD Biosciences公司)作为支持膜静置在上述添加有支持细胞的6孔配套板上，接着，在该6孔细胞培养池的各孔中每个添加0.5mL(由1眼制备的细胞的1/12量)上述回收后的人角膜上皮细胞的悬浊液，开始培养。在培养开始3-5小时后，在6孔细胞培养池上添加0.5mL含有10μM的Y27632(ROCK抑制剂)(Sigma公司)及100μM的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX，磷酸二酯酶抑制剂)(Sigma公司)的CnT-20培养基，进一步培养2-3天。接着，将培养基更换为含有100μM的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX，磷酸二酯酶抑制剂)(Sigma公司)、1μM的SB203580(MAP激酶抑制剂)(Sigma公司)及1μM的SB431542(TGF-β受体抑制剂)(Sigma公司)的CnT-20培养基(实施例的第2培养基)，每2-3天更换培养基，并培养细胞。在这期间，当发现底孔的支持细胞显著地从底孔剥离等变化时，重新准备使支持细胞固定在底孔的底面的6孔配套板，将6孔细胞培养池移至其上，并继续培养。还包括以下的步骤，细胞的培养在5％CO2存在下，在37℃进行。图4示意性地示出人角膜上皮细胞的原代培养的培养容器的设置。在图4中，6孔配套板(培养容器)通过具有微细孔的膜上下分隔为下侧室(第1室)和上侧室(第2室)。在第1室中作为支持细胞加入人间充质干细胞，在第2室加入人角膜上皮细胞。人间充质干细胞在第1室中固定在培养容器的底面，人角膜上皮细胞在第2室中在具有微细孔的膜上进行培养。
〔来自人角膜上皮的细胞的冷冻保存〕
在上述人角膜上皮细胞的原代培养中，在变为细胞占据6孔细胞培养池(支持膜)的表面的90-100％的状态时更换培养基，进一步培养约24小时。接着，弃掉培养基，将加入了庆大霉素(Invitrogen公司)的PBS溶液(G-PBS)添加到6孔细胞培养池上，以成为10μg/mL，将细胞洗涤后，再次添加G-PBS，在37℃静置约15分钟。接着，添加胶原酶A(罗氏公司(ロシユ社)制)，以成为1mg/mL的浓度，在37℃在振荡机上缓慢地振荡1-2小时，使细胞从6孔细胞培养池剥离。接着，用含有0.02％EDTA的PBS使酶反应停止后，将细胞悬浊，将细胞悬浊液移至离心管(ステムフル，住友Bakelite公司)，进行离心使细胞沉淀并回收。使细胞在CnT-20培养基中悬浊，测定活细胞数及生存率后，进行再次离心，使细胞沉淀并回收。接着，添加Cell Banker 1(日业本全药工公司)，以使细胞的浓度成为约1×105个/mL，并使细胞悬浊。将细胞悬浊液分注至低温保存管(WHEATON公司)，每个1mL，将其收纳于预先冷却至4℃的冷冻处理容器(BICELL，Nihon-Freezer公司)后，在-80℃冷库中放置1晚使其冷冻后，移至液氮中。
〔人角膜上皮片的制造中使用的基质羊膜的准备〕
在将DMEM(Gibco公司)和灭菌后的甘油以1∶1混合后的溶液中，加入庆大霉素，以成为10μg/mL，将其作为羊膜保存液。将羊膜(再生医疗支援机构)放置在生物安全柜内的托盘上，并浸泡于G-PBS中，在安装了灭菌手套的状态，用指尖剥离羊膜的绒毛膜，用医疗用刀切开为约2cm×2cm的正方形。将切开为正方形的羊膜放入到羊膜保存液中，在-80℃保存。
将羊膜解冻后，移至10cm培养皿上，用G-PBS洗涤2次除去羊膜保存液后，添加0.02％EDTA/PBS，在37℃进行2小时以上的处理。用G-PBS洗涤2次后，在体视显微镜观察下，用细胞刮棒将羊膜的上皮剥离。将上皮剥离后的羊膜(基质羊膜)浸泡于G-PBS溶液中，在4℃保存。
〔人角膜上皮片的制造〕
将冷冻保存后的人间充质干细胞(hMSC)在37℃恒温槽中快速地解冻，添加DMEM/10％FBS培养基并悬浊后，离心，使细胞沉淀并回收。将回收后的细胞在DMEM/10％FBS培养基中悬浊，测定活细胞数。接种到6孔配套板(Corning公司)的底孔上，以使细胞密度成为1.5×104至2.5×104个/cm2，在DMEM/10％FBS培养基中培养1-3天。在将hMSC用作人角膜上皮片的制造中的支持细胞之前，从DMEM/10％FBS培养基中取出，用PBS洗涤后，加入含有10μM的Y27632(ROCK抑制剂)(Sigma公司)的KB+SHEM培养基。将其作为添加有支持细胞的6孔配套板。KB+SHEM培养基是指将下述示出了制作方法的KB培养基和SHEM培养基以2∶1的比例混合后的培养基。KB培养基为，加入附属于正常人角膜上皮细胞增殖用无血清液体培养基(LIFELINE Cell Technology公司)的7种添加因子中除了牛脑下垂体提取液(BPE)以外的6种添加因子(0.2％(v/v)OcuFactor Lifefactor、5μg/mL转铁蛋白、0.18μg/mL皮质醇、1μM肾上腺素、6mM L-谷氨酰胺、5.0μg/mL重组人胰岛素)，进一步加入庆大霉素，以成为10μg/mL的浓度而制作的培养基。SHEM培养基为在DMEM/F-12(Gibco公司)中加入5μg/mL的重组人胰岛素、10ng/mL的重组人EGF(Gibco公司)、10％的FBS(Hyclone公司)，进一步加入庆大霉素，以成为10μg/mL的浓度而制作的培养基。
将剥离了上皮的羊膜(基质羊膜)移至6孔细胞培养池(Transwell clear TM，孔径3μm，聚酯制，Corning公司)，以使剥离了上皮的一侧为上，在体视显微镜下用无钩镊子展开，以覆盖整个6孔细胞培养池。使基质羊膜风干数分钟后，将O环(杜邦公司(デユポン社))插入至6孔细胞培养池并固定，以使基质羊膜在6孔细胞培养池内不移动，通过体视显微镜确定在培养面没有褶皱、气泡、微孔后，将其静置于添加有支持细胞的6孔配套板(底孔)。
接着，将上述冷冻保存后的来自角膜上皮的细胞在37℃恒温槽中快速地解冻，添加KB+SHEM培养基并悬浊后，离心，使细胞沉淀并回收。将回收后的细胞在含有10μM的Y27632(ROCK抑制剂)( Sigma公司)的KB+SHEM培养基中悬浊，作为细胞悬浊液，测定活细胞数。
添加悬浊的来自角膜上皮的细胞悬浊液，以使活细胞数在置于6孔细胞培养池的基质羊膜上为1×104个/cm2以上，开始培养。此时添加的细胞悬浊液的液量的上限为0.5mL。在培养开始3-5小时后进一步在6孔细胞培养池上添加0.5mL的含有10μM的Y27632的KB+SHEM培养基(实施例的第3培养基)，培养2-3天。
接着，弃掉6孔细胞培养池及底孔的培养基，将培养基更换为含有1μM的SB203580(Sigma公司)及1μM的SB431542(Sigma公司)的KB+SHEM培养基(KB+SHEM培养用培养基，实施例的第4培养基)，每2天更换该培养基(KB+SHEM培养用培养基)，并且将细胞培养4-6天。接着，每天更换该培养基(KB+SHEM培养用培养基)，并且将细胞培养7-14天。在这期间，当发现底孔的支持细胞显著地从底孔剥离等变化时，重新准备使支持细胞固定在底孔的底面的6孔配套板，将6孔细胞培养池移至其上，并继续培养，在基质羊膜上使细胞增殖，从而在基质羊膜上形成由来自人角膜上皮细胞的细胞形成的细胞层。
最后更换培养基后经过24小时后，开始测定培养上清液中的乳酸浓度，将乳酸浓度超过8-10mM的时刻为准，弃掉6孔细胞培养池及底孔的培养基，接着，在底孔中加入1.4mL的培养基(KB+SHEM培养用培养基)，在将置于6孔细胞培养池上的基质羊膜的底面浸泡于培养基中、然而在6孔细胞培养池内的基质羊膜上形成的由来自人角膜上皮细胞的细胞形成细胞层的表面全部或一部分不被培养基覆盖的状态(但是，细胞层的表面为未干燥的状态)、即细胞层的表面的全部或一部分暴露于培养器中的气相的状态下，培养3天。这期间，约每12小时更换培养基，总计5次。这样在细胞层的表面的全部或一部分未被培养基覆盖的状态进行的培养称为air-lifting培养。
培养结束后，将在6孔细胞培养池上形成的、包括基质羊膜和在基质羊膜上形成的来自人角膜上皮的细胞的细胞层的片作为人角膜上皮片，通过HE染色及FACS解析，实施其品质评价。
〔人角膜上皮片的分割〕
将培养结束后的人角膜上皮片在6孔细胞培养池上在KB+SHEM培养用培养基中洗涤3次后，用活组织检查打孔机(生検トレパン)及手术刀分割为1/2片、及2个1/4片。
〔HE染色〕
分割后，将1/2片用快速固定液(superfix)(クラボウ)固定10分钟，接着除去快速固定液，用PBS洗涤3次。然后用Mayer苏木素溶液(和光纯药工业)染色30分钟，除去Mayer苏木素溶液后，用PBS洗涤3次。确认细胞核被Mayer苏木素溶液染色后，以用PBS稀释了5倍的曙红Y溶液(和光纯药工业)染色10秒钟，接着除去曙红Y溶液，用PBS洗涤3次。确认细胞质被曙红Y溶液染色后，在池上将细胞片从支持膜剥离，用PBS制作用盖玻片封入的样品，用其在显微镜下观察人角膜上皮片的表面，在显微镜下观察在基质羊膜表面上形成的来自人角膜上皮的细胞的细胞层(培养细胞层)的范围及纤维母细胞是否存在。
此外，将1个分割后的1/4片包埋在Tissue-Tek(注册商标)O.C.T.Compound(サクラフアインテツクジヤパン)中并切薄片，将切片粘贴在载玻片上。将粘贴有切片的载玻片在加入了快速固定液(クラボウ)的滑动染缸中浸泡10分钟，将细胞固定后，用自来水进行10分钟水洗。然后在加入了Mayer苏木素溶液的滑动染缸中浸泡45秒钟，用自来水进行10分钟水洗。确认细胞核被染色后，以用PBS稀释了5倍的曙红Y溶液(和光纯药工业)染色10秒钟，用自来水进行10分钟水洗。确认细胞质被曙红Y溶液染色后，以70、80、90、95％乙醇的顺序每个在各自的滑动染缸中浸泡1-10秒钟，其后，在加入了二甲苯的染缸中浸泡10分钟。最后，取出载玻片，风干后，用EUKITT(O.Kindler GmbH公司)作成用盖玻片封入的样品，用其在显微镜下观察人角膜上皮片的截面，观察复层化及扁平的细胞的形成的程度。
〔HE染色的结果〕
在显微镜下观察人角膜上皮片的表面的结果是完全没有发现纤维母细胞的存在(图1)。因为在显微镜视野内有至少1000个细胞，所以来自人角膜上皮的细胞中的纤维母细胞的比率不足0.1％。此外，可知，在显微镜视野内，基质羊膜的表面的整个面积的98％以上被培养细胞层覆盖，并且，培养细胞层的90％以上形成有二层以上的复层结构(图1)。
接着，在显微镜下观察人角膜上皮片的截面的结果可知，片截面的95％以上具有培养细胞层，并且培养细胞层的90％以上形成有二层以上的复层结构(B，图2)。此外，复层结构的大部分为3-4层的复层结构。此外，可知，培养细胞层的表面的90％以上由扁平的细胞(A，图2)覆盖。含有该扁平的细胞的培养细胞层的结构表现出与由具有屏障功能的非角化复层扁平上皮构成的角膜上皮组织近似的形态。
〔FACS解析〕
将磷酸缓冲液生理食盐水pH 7.4、contains BSA、powder(Sigma公司)溶解于纯水中，通过0.22μm过滤器，制备2％BSA(含有0.138M氯化钠、0.0027M氯化钾、2％(w/v)牛血清白蛋白的0.01M磷酸缓冲生理食盐水(pH 7.4))。在制备后的2％BSA中加入Triton X-100(和光纯药工业)，以使浓度成为0.1％，将其作为BSA-T。
抗体稀释液如下所述地进行制备。在485μL的BSA-T中加入10μL小鼠IgG抗体溶液(DAKO)和5μL兔IgG抗体溶液(DAKO)，将其作为同型对照用1次抗体稀释液。此外，在486μL的BSA-T中加入10μL小鼠抗细胞角蛋白AE1/AE3抗体溶液(DAKO)，将其作为细胞角蛋白AE1AE3检测用1次抗体稀释液。此外，在486μL的BSA-T中加入4μL兔抗细胞角蛋白12抗体溶液(TransGenic)，将其作为细胞角蛋白AE1AE3检测用1次抗体稀释液。此外，在998μL的BSA-T中加入2μL Alexa Fluor(注册商标)488-标记-羊抗小鼠IgG抗体溶液(Life TechnologiesJapan Ltd.)，作为细胞角蛋白AE1AE3检测用2次抗体稀释液。此外，在998μL的BSA-T中加入2μL Alexa Fluor(注册商标)647-标记-羊抗兔IgG抗体溶液(Life Technologies JapanLtd.)，作为细胞角蛋白12检测用2次抗体稀释液。
从1片通过上述人角膜上皮片的分割得到的1/4片去掉培养池膜(insertmembrane)，将培养细胞层及基质羊膜在0.25％胰蛋白酶溶液(Life Technologies JapanLtd.)中在37℃培养10分钟后，加入培养基(KB+SHEM培养用培养基)，通过移液仅将形成培养细胞层的细胞回收。将回收后的细胞移至离心管中，离心，使细胞沉淀，除去上清液。接着将细胞在冷却至4℃的1mL的甲醇(和光纯药工业)中悬浊，在冷库内(-20℃)固定10分钟。固定后，离心，使细胞沉淀，除去甲醇。接着加入1mL的BSA-T并悬浊后，离心，使细胞沉淀，除去BSA-T。重复2次该洗涤作业。
接着将细胞在4mL的BSA-T中悬浊后，分到4个管中，每个1mL，离心，使细胞沉淀，除去BSA-T。该4个管之中，将2个作为同型对照用管，1个作为细胞角蛋白AE1AE3检测用管，1个作为细胞角蛋白12检测用管，在各管中分别加入同型对照用1次抗体稀释液、细胞角蛋白AE1AE3检测用1次抗体稀释液及细胞角蛋白12检测用1次抗体稀释液，每个500μL，进行悬浊，使其在室温下反应30分钟。1次抗体反应后，离心，使细胞沉淀，除去各1次抗体稀释液。接着，加入1mL的BSA-T使细胞悬浊后，离心，使细胞沉淀，除去BSA-T。重复3次该洗涤作业。接着，分别在细胞角蛋白AE1AE3检测用管中加入500μL细胞角蛋白AE1AE3检测用2次抗体稀释液，在细胞角蛋白12检测用管中加入500μL细胞角蛋白12检测用2次抗体稀释液，进行悬浊，使其在室温反应30分钟(遮光)。此外，在2个各同型对照用管中分别加入细胞角蛋白AE1AE3检测用2次抗体稀释液和细胞角蛋白12检测用2次抗体稀释液，每个500μL，进行悬浊，分别作为细胞角蛋白AE1AE3检测用对照管及细胞角蛋白12检测用对照管，使其在室温反应30分钟(遮光)。2次抗体反应后，离心，使细胞沉淀，除去2次抗体稀释液。接着加入1mL的BSA-T使细胞悬浊后，离心，使细胞沉淀，除去BSA-T。重复3次该洗涤作业。最后在各管中加入500μL将碘化丙啶溶液(Sigma-Aldrich)以BSA-T稀释了500倍的溶液，进行悬浊。
使细胞角蛋白AE1AE3检测用管和细胞角蛋白AE1AE3检测用对照管的细胞悬浊液通过细胞粗滤器，用BD FACS Canto(注册商标)(BD公司)比较两者的来自Alexa Fluor 488色素的荧光强度，由此测定细胞角蛋白AE1AE3阳性细胞的比率。此外，使细胞角蛋白12检测用管和细胞角蛋白12检测用对照管的细胞悬浊液通过细胞粗滤器，用BD FACS Canto(注册商标)(BD公司)比较两者的来自Alexa Fluor647色素的荧光强度，由此计测细胞角蛋白12阳性细胞的比率。
〔FACS解析的结果〕
FACS解析的结果为，可知形成基质羊膜上的培养细胞层的细胞的大致全部(99.99％以上)为细胞角蛋白AE1/AE3阳性(图3-1)，87％以上的细胞为细胞角蛋白12阳性(图3-2)。
〔细胞片的品质评价的结果〕
由HE染色及FACS解析的结果可知，因为通过上述方法制造的人角膜上皮片没有发现纤维母细胞的存在，并且，表现出与由担任屏障功能的非角化复层扁平上皮构成的角膜上皮组织类似的形态，所以作为移植用的角膜上皮片是适合的。
〔人角膜上皮细胞的原代培养(P0培养)的其他方法〕
采用以下的方法(其他方法)代替上述记载的方法，实施人角膜上皮细胞的原代培养(P0培养)。在体视显微镜下用手术用刀及角膜用剪刀，从研究用人角膜组织(2眼份，SightLife公司制，作为组织保存液使用CnT-20培养基)剪下巩膜、结膜等，切出包括角膜上皮组织及缘的组织切片。在切出的组织切片中添加分散酶溶液(含有1.2U/mL的分散酶(三光纯药)的CnT-20培养基(CELLEnTEC公司))，在4℃静置15-20小时。接着，在37℃静置1小时后，用含有0.02％EDTA的PBS使酶反应停止后，将组织切片移至35mm培养皿(PrimeSurface，住友Bakelite公司)后，在体视显微镜观察下，用无钩镊子将人角膜上皮细胞从组织切片刮下，得到细胞悬浊液。将细胞悬浊液移至离心管(プロテオフリ一，住友Bakelite)后进行离心，在除去上清液后的颗粒中添加CnT-20培养基进行再次离心，回收细胞。使回收后的细胞悬浊于1mL含有10μM的Y27632(ROCK抑制剂)(Sigma公司)及100μM的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX，磷酸二酯酶抑制剂)(Sigma公司)的CnT-20培养基(实施例的第1培养基)中。分取细胞悬浊液的一部分，用台盼蓝染色液(Life Technologies公司)稀释10倍并将细胞染色，计量细胞数后，在细胞悬浊液中加入CnT-20培养基，调整至细胞浓度为2×105个/mL。
将用FNC Coating Mix(AthenaES公司)涂敷后的6孔细胞培养板(孔径0.4μm，培养面积约4.2cm2，聚对苯二甲酸乙二醇酯制，BD Falcon细胞培养池，BD Biosciences公司)静置于上述的添加有支持细胞的6孔配套板，接着，在该6孔细胞培养池的各孔中每个添加1.05mL(每个孔2×105个)上述回收后的人角膜上皮细胞的悬浊液，开始培养。在培养开始3-5小时后，在6孔细胞培养池上添加0.5mL含有10μM的Y27632(ROCK抑制剂)(Sigma公司)及100μM的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX，磷酸二酯酶抑制剂)(Sigma公司)的CnT-20培养基，进一步培养2-3天。接着，将培养基更换为含有100μM的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX，磷酸二酯酶抑制剂)(Sigma公司)、1μM的SB203580(MAP激酶抑制剂)(Sigma公司)及1μM的SB431542(TGF-β受体抑制剂)(Sigma公司)的CnT-20培养基(实施例的第2培养基)，每2-3天更换培养基，并培养细胞。在这期间，当发现底孔的支持细胞显著地从底孔剥离等变化时，重新准备使支持细胞固定在底孔的底面的6孔配套板，将6孔细胞培养池移至其上，并继续培养。还包括以下的步骤，细胞的培养在5％CO2存在下，在37℃进行。图4示意性地示出人角膜上皮细胞的原代培养的培养容器的设置。在图4中，6孔配套板(培养容器)通过具有微细孔的膜上下分隔为下侧室(第1室)和上侧室(第2室)。在第1室中作为支持细胞加入人间充质干细胞，在第2室加入人角膜上皮细胞。人间充质干细胞在第1室中固定在培养容器的底面，人角膜上皮细胞在第2室中在具有微细孔的膜上进行培养。
将使用通过上述其他方法得到的来自人角膜上皮的细胞、通过上述方法制造的人角膜上皮片进行HE染色，并在显微镜下观察其表面，结果完全没发现纤维母细胞的存在(图5)。因为在显微镜视野内有至少1000个细胞，所以来自人角膜上皮的细胞中的纤维母细胞的比率不足0.1％。此外，可知，在显微镜视野内，基质羊膜的表面的整个面积的99.5％以上被培养细胞层覆盖，并且，培养细胞层的95％以上形成有四层以上的复层结构(B，图6)。此外，可知，培养细胞层的表面的90％以上由扁平的细胞(A，图6)覆盖。含有该扁平的细胞的培养细胞层的结构表现出与具有屏障功能的非角化复层扁平上皮构成的角膜上皮组织近似的形态。
〔MAP激酶抑制剂和TGF-β受体抑制剂的组合在人角膜上皮细胞的培养时对人角膜上皮细胞的增殖促进效果的研究〕
将上述冷冻保存后的来自角膜上皮的细胞在37℃恒温槽中快速地解冻，添加CnT-20培养基并悬浊后，离心，使细胞沉淀并回收。使回收后的细胞在CnT-20培养基中悬浊，作为细胞悬浊液，测定活细胞数。接着，将悬浊后的来自角膜上皮的细胞悬浊液添加至用FNCCoating Mix(AthenaES公司)涂敷后的96孔板上，使活细胞数为3500个/孔。接着，在这些孔中以表9中示出的(1)-(6)组的组合及浓度，在培养基中添加MAP激酶抑制剂和TGF-β受体抑制剂。即，各组的MAP激酶抑制剂和TGF-β受体抑制剂的组合及培养基中的浓度为：(1)SB203580(1μM)+SB431542(1μM)，(2)SB203580(1μM)+A83-01(10μM)，(3)SB203580(1μM)+LY364947(10μM)，(4)SB239063(10μM)+SB431542(1μM)，(5)SB239063(10μM)+A83-01(10μM)，(6)SB239063(10μM)+LY364947(10μM)。此外，以在培养基中不添加MAP激酶抑制剂和TGF-β受体抑制剂的培养基作为对照(NA)。培养开始5天后，在培养基中添加10μL含有水溶性四唑盐WST-8作为显色试剂的Cell Counting Kit-8(CCK-8)溶液，1小时后用酶标仪测定在波长450nm的吸光度(OD450)。就测定而言，各组合均以4孔实施，以对照的测定值的平均值为100％，通过与对照的比较求出各组的测定值。另外，可知活细胞数与这样求出的吸光度大致存在比例关系。
其结果是，与对照(NA)相比，在(1)-(6)的全部的组中，测定值超过100％，表明通过将MAP激酶抑制剂和TGF-β受体抑制剂组合添加至培养基中，能够促进人角膜上皮细胞的增殖(图7)。此外，在(1)SB203580(1μM)+SB431542(1μM)，(3)SB203580(1μM)+LY364947(10μM)，(4)SB239063(10μM)+SB431542(1μM)，及(6)SB239063(10μM)+LY364947(10μM)的各组中，测定值超过120％，表明这些MAP激酶抑制剂与TGF-β受体抑制剂的组合特别促进人角膜上皮细胞的增殖(图7)。此外，因为在(1)组的SB203580(1μM)+SB431542(1μM)中，测定值为约130％，在(4)组的SB239063(10μM)+SB431542(1μM)中，测定值超过140％，所以表明这些组合进一步特别促进人角膜上皮细胞的增殖(图7)。
[表9]
表9 MAP激酶抑制剂和TGF-β受体抑制剂及浓度
产业上的可利用性
根据本发明，能够稳定地供给可给复发性角膜营养不良等角膜疾病的患者移植的、品质稳定的角膜上皮片。
附图标记说明
1. 6孔细胞培养池
2. 6孔配套板(培养容器)
3.具有微细孔的膜
4.人角膜上皮细胞
5.支持细胞(人间充质干细胞)
6.第1室
7.第2室
8.底孔
Claims (16)
1.一种制造方法，其制造来自人角膜上皮细胞的细胞，
其包括：在由具有细胞不能通过的微细孔的膜分隔为第1室和第2室的培养容器的该第1室中加入支持细胞，在该第2室中加入人角膜上皮细胞，用含有ROCK抑制剂及磷酸二酯酶抑制剂的第1培养基培养该人角膜上皮细胞，接着，用含有磷酸二酯酶抑制剂、MAP激酶抑制剂及TGF-β受体抑制剂的第2培养基培养该人角膜上皮细胞。
2.根据权利要求1所述的制造方法，其中，该培养容器由具有该微细孔的膜分隔为上下2室，即上侧室和下侧室。
3.根据权利要求2所述的制造方法，其中，该下侧室为该第1室，该上侧室为该第2室，并且在具有该微细孔的膜上培养该人角膜上皮细胞。
4.根据权利要求3所述的制造方法，其中，使该人角膜上皮细胞在具有该细胞不能通过的微细孔的膜并且在该培养容器内被支持的膜上，不与该支持细胞直接接触而进行培养。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的制造方法，其中，在该第1培养基中含有的该ROCK抑制剂为Y27632，在该第1及该第2培养基中含有的该磷酸二酯酶抑制剂为3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，在该第2培养基中含有的MAP激酶抑制剂为选自SB203580、或者SB239063、或其组合的物质，在该第2培养基中含有的TGF-β受体抑制剂为选自SB431542、LY364947、或者A83-01、或其组合的物质。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的制造方法，其中，在该第1培养基中含有的该ROCK抑制剂为Y27632，在该第1及该第2培养基中含有的该磷酸二酯酶抑制剂为3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，在该第2培养基中含有的MAP激酶抑制剂为SB203580，在该第2培养基中含有的TGF-β受体抑制剂为SB431542。
7.根据权利要求6所述的制造方法，其中，在该第1培养基中含有的Y27632的浓度为1-20μM，在该第1及该第2培养基中含有的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤的浓度为50-150μM，在该第2培养基中含有的SB203580的浓度为0.2-2μM，SB431542的浓度为0.2-2μM。
8.根据权利要求6所述的制造方法，其中，在该第1培养基中含有的Y27632的浓度为约10μM，在该第1及该第2培养基中含有的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤的浓度为约100μM，在该第2培养基中含有的SB203580的浓度为约1μM，SB431542的浓度为约1μM。
9.根据权利要求1至4中任一项所述的制造方法，其中，该支持细胞为人间充质干细胞。
10.一种制造方法，其制造来自人角膜上皮细胞的冷冻细胞，
其包括：按照权利要求1至9中任一项所述的方法制造来自人角膜上皮细胞的细胞；
然后将所述细胞悬浊于细胞冷冻液中并冷冻。
11.一种制造方法，其制造人角膜上皮片，
其包括：按照权利要求1至10中任一项所述的方法制造来自人角膜上皮细胞的细胞；
如果根据权利要求10所述的方法获得细胞，则在将细胞解冻后，将细胞在含有支持细胞的培养容器中，在置于具有该支持细胞不能通过的微细孔并且在该培养容器内被支持的膜上的基质羊膜上，使用含有ROCK抑制剂的第3培养基进行培养，接着，使用含有MAP激酶抑制剂及TGF-β受体抑制剂的第4培养基进行培养，在该基质羊膜上形成由该来自人角膜上皮细胞的细胞形成的细胞层的步骤；
以及接着，在该细胞层的表面的全部或一部分没有被培养基覆盖的状态下，使用该第4培养基进行培养的步骤。
12.根据权利要求11所述的制造方法，其中，该基质羊膜以剥离了羊膜上皮的一侧朝上的方式放置在该培养容器中。
13.根据权利要求11或12所述的制造方法，其中，在该第3培养基中含有的该ROCK抑制剂为Y27632，在该第4培养基中含有的MAP激酶抑制剂为SB203580，在该第4培养基中含有的TGF-β受体抑制剂为SB431542。
14.根据权利要求13所述的制造方法，其中，在该第3培养基中含有的Y27632的浓度为1-20μM，在该第4培养基中含有的SB203580的浓度为0.2-2μM，在该第4培养基中含有的SB431542的浓度为0.2-2μM。
15.根据权利要求13所述的制造方法，其中，在该第3培养基中含有的Y27632的浓度为约10μM，在该第4培养基中含有的SB203580的浓度为约1μM，SB431542的浓度为约1μM。
16.根据权利要求11所述的制造方法，其中，该支持细胞为人间充质干细胞。
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