KR101994492B1 - 망막 색소 상피 세포 시이트의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 하기의 공정을 포함하는 세포 시이트의 제조 방법 등을 제공한다:
(1) 콜라겐 겔상에 망막 색소 상피 세포를 파종하고 배양하여, 망막 색소 상피 세포로 구성된 세포 시이트를 형성시키는 공정, 및
(2) 콜라겐 겔을 콜라게나아제로 분해하여, 망막 색소 상피 세포로 구성된 세포 시이트를 박리하는 공정.

Description

망막 색소 상피 세포 시이트의 제조 방법 {METHOD OF PRODUCING RETINAL PIGMENT EPITHELIAL CELL SHEET}
본 발명은 콜라겐 겔상에 망막 색소 상피 세포를 파종하는 것을 포함하는 세포 시이트의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 망막 색소 상피 세포로부터 형성된 세포층과 기저막을 포함하는 이식용 세포 시이트에 관한 것이다.
현재, 가령 황반 변성 (AMD) 은 선진국에서의 법적 실명의 주요 원인 질환의 하나이며, 주로 50 세 이상의 고령자에게 보여진다. 가령 황반 변성은 황반의 가령에 수반하는 변화에 의해 일어나며, 크게 삼출형과 위축형으로 구분된다. 삼출형 가령 황반 변성은 고령자의 황반에 맥락막으로부터 신생혈관이 발생하여, 망막 색소 상피 아래 또는 망막 아래에 출혈 및 삼출성 병변을 일으켜, 마침내 반흔 조직을 형성하는 질환이다. 위축형 가령 황반 변성은 황반부의 위축 및 드루젠의 축적을 수반하는 질환이다. 삼출형 및 위축형 가령 황반 변성에 도달하는 전구 병변을 특히 조기 가령 황반 변성이라고 하는 경우가 있으며, 이 병변도 가령 황반 변성의 하나의 병태라고 생각되고 있다.
가령 황반 변성의 치료는, 경도의 삼출형의 경우에는, 광선역학적 요법, 레이저 광응고술, 신생혈관의 발거 등과 같은 외과적 요법, 또는 혈관신생에 관련되는 혈관 내피 증식 인자 (VEGF) 에 대한 저해제의 투여 등과 같은 약물 요법에 의한 신생혈관의 퇴축 및 제거를 목적으로 한 치료 방법을 선택할 수 있다. 그러나, 상기 수단은 망막 색소 상피 (RPE) 의 고도의 위축 또는 결손에 이를 때까지 진행한 삼출형 또는 위축형의 경우, 치료의 유효성을 제공할 수 없다. 이러한 경우, 유효한 치료 방법은 망막 색소 상피 세포 또는 망막 색소 상피를 망막 아래의 결손 부위에 이식하는 것이다.
망막 색소 상피 세포의 이식에 의한 여러가지 치료 방법이 시도되고 있다. 사람 태아로부터 얻은 망막 색소 상피 세포를 세포 부유액 형태로 이식하는 것은, 이식 세포의 생착이 나쁘다는 것이 보고되고 있다. 사체의 눈으로부터 시이트상으로 박리한 브루크막 및 맥락막도 포함한 망막 색소 상피 세포 시이트를 이식한 경우에는, 수술후에 거절반응이 일어나, 충분한 치료 효과를 얻지 못하였다 (비특허 문헌 1). 또한, 사체의 눈을 이용하는 상기 방법은 윤리적인 문제를 포함하는 것이 지적되고 있다. 한편, 가령 황반 변성증 환자 자신의 정상적인 망막 색소 상피 세포 및 맥락막을 채취하여, 황반 아래의 결손 부위에 이식하는 것을 포함하는 방법을 이용하여, 상기 환자의 시력을 향상시키는 경우가 보고되고 있다. 그러나, 이 방법은 환자에게 주는 부담 및 수술의 리스크가 매우 높다. 망막 색소 상피 세포 대신에, 가령 황반 변성증 환자로부터 채취한 환자 자신의 홍채 색소 상피 세포를 이식에 이용하는 시도도 있지만, 최종 시력의 상한이 낮고, 충분한 효과를 얻을 수 없으며, 환자 자신의 세포를 이용하는 것의 부담 및 리스크도 높다 (비특허 문헌 2). 따라서, 사체의 눈으로부터 채취한 세포 또는 환자 자신의 세포를 사용하는 종래의 치료 방법은 윤리면, 안전성, 효과 등의 점에서 실용적이지 않으며, 실제 이식 치료에 사용할 수 있는 망막 색소 상피 세포가 요구되고 있었다.
망막 색소 상피 세포 시이트의 제조 방법의 하나로서는, 세포 배양 기재를 세포외 매트릭스 등으로 피복하고, 그 위의 망막 색소 상피 세포를 배양함으로써 시이트를 형성시키는 것을 포함하는 방법을 들 수 있다. 예를 들어, 피브로넥틴-피복 기재상에서 망막 색소 상피 세포를 배양하여 세포 시이트를 형성시킬 수 있지만, 기저막의 형성은 보고되어 있지 않으며, 시이트를 형성한 용기로부터 시이트를 꺼내는 방법에 대해서는 전혀 기재가 없다 (비특허 문헌 3). 이러한 문제점을 고려하여, 미리 기저막 대신에 인공막을 사용하여 망막 색소 상피 세포 시이트를 형성시키는 방법이 복수의 연구실에서 개발되고 있다. 그러나, 인공막은 이식시의 생착 및 생체에서의 기능 유지에 장애가 되는 것이 염려된다. 생체 반응이 적은 인공막도 개발되고 있지만, 세포 자신이 만들어내는 기저막과는 조성, 성질, 강성 등이 상이하므로, 염증 및 이와 관련된 거절반응을 야기하는 문제가 있어, 이식에 적합하지 않다. 또한, 종래, 극성을 가지는 망막 색소 상피 세포 시이트를 배양하는 방법이 알려져 있다. 그러나, 용기내에서 생체 유래의 망막 색소 상피 세포 및 불사화주를 시이트로 형성하여, 그대로 이용하는 실험 모델 용도에 머물러, 실제로 용기로부터 생체내와 같은 기저막을 구비한 망막 색소 상피 세포 시이트를 회수하기까지는 도달하지 않았다 (비특허 문헌 4). 세포외 매트릭스 등을 이용하지 않고서, 배양 접시상에서 직접 배양된 망막 색소 상피 세포를 박리하여, 망막 색소 상피 세포 시이트를 수득하는 방법이 있다. 이와 같은 박리에 의해 세포를 분리하는 방법은 시이트의 형상과 크기, 기저막 등을 안정화시킬 수 없으며, 박리에 의한 망막 색소 상피 세포에 대한 손상이 크고, 대부분의 경우에는 박리에 의해 시이트의 형상이 붕괴되어 세포가 뿔뿔이 흩어지게 되어, 이식 등에 사용 가능한 세포 시이트를 제공할 수 없다 (비특허 문헌 5). 또한, 세포 배양 기재를 콜라겐으로 피복하여, 세포를 콜라겐상에서 배양하는 것은 보고되고 있지만, 사람 망막 색소 상피 세포를 사용하는 것이 아니다. 또한, 겔 강도를 증가시키기 위해서, 가교제를 별도로 첨가할 필요가 있어, 편리하고 신속한 방법이라고는 할 수 없다 (특허 문헌 1). 이와 같은 현상황으로부터, 가령 황반 변성 등과 같은 망막 질환에 대해 치료상 유효하며, 제조가 편리하고 안정적인 망막 색소 상피 세포 시이트의 제조가 여전히 과제가 되고 있다.
특허 문헌 1: JP-A-2005-261292
비특허 문헌 1: Ophthalmic Surg. 1991 Feb; 22(2): 102-8. 비특허 문헌 2: Tohoku J Exp Med. 1999 Dec; 189(4): 295-305. 비특허 문헌 3: Nat. Protoc., 4(5), 2009, 662-673. 비특허 문헌 4: Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 47, 2006, 3612-3624. 비특허 문헌 5: Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 36(2), 1995, 381-390.
본 발명의 과제는 인공막을 사용하지 않고서, 편리하고 안정적으로 망막 색소 상피 세포 시이트를 제조하는 새로운 방법을 개발하여, 가령 황반 변성 등과 같은 망막 색소 상피의 결손과 관련된 질환의 환자에게 생착율이 높고 기능성이 우수한 이식용 망막 색소 상피 세포 시이트를 제공하는 것이다.
본 발명자들은 세포 배양 기재상에 콜라겐 겔층을 형성시키고, 그 위에 망막 색소 상피 세포를 파종하여 배양함으로써 세포 시이트를 제조하였다. 이러한 방법에 의해 수득되는 세포 시이트는 콜라겐 겔과 망막 색소 상피 세포 시이트 사이에 기저막을 유지하고 있고, 생체내의 망막 색소 상피 세포와 동일한 사이토카인 분비능 및 세포간의 밀착성을 가지며, 콜라게나아제로 콜라겐 겔을 분해함으로써 기저막을 유지한 채로, 망막 색소 상피 세포 시이트를 용이하게 세포 배양 기재로부터 박리할 수가 있었다. 또한, 세포 시이트를 구성하는 세포는 망막 색소 상피 세포 특이적 마커의 발현을 유지하고 있었다. 본 발명자들은 예의 검토한 결과, 이들 발견으로부터 본 발명을 완성시키기에 이르렀다. 따라서, 본 발명은 하기를 제공한다:
[1] 하기의 공정을 포함하는 세포 시이트의 제조 방법:
(1) 콜라겐 겔상에 망막 색소 상피 세포를 파종하고 배양하여, 망막 색소 상피 세포로 구성된 세포 시이트를 형성시키는 공정, 및
(2) 콜라겐 겔을 콜라게나아제로 분해하여, 망막 색소 상피 세포로 구성된 세포 시이트를 박리하는 공정;
[2] 상기 [1] 에 있어서, 망막 색소 상피 세포가 줄기 세포 또는 전구 세포를 분화 유도하여 수득된 세포인 세포 시이트의 제조 방법;
[3] 상기 [2] 에 있어서, 줄기 세포가 ES 세포 또는 iPS 세포인 세포 시이트의 제조 방법;
[4] 상기 [1] 에 있어서, 콜라겐 겔의 콜라겐 농도가 0.1 % - 0.5 % 인 세포 시이트의 제조 방법;
[5] 상기 [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 있어서, 하기의 공정 (3) 을 추가로 포함하는 세포 시이트의 제조 방법:
(3) 박리된 세포 시이트와 콜라겐 겔 사이의 접촉면에 기저막의 유무를 확인하는 공정;
[6] 상기 [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 따른 방법으로 제조된 세포 시이트;
[7] 생체외에서 줄기 세포 또는 전구 세포를 분화 유도하여 수득된 망막 색소 상피 세포로 형성된 세포층과, 상기 세포로부터 분비된 기저막을 포함하는 이식용 세포 시이트; 및
[8] 생체외에서 줄기 세포 또는 전구 세포를 분화 유도하여 수득된 망막 색소 상피 세포로 형성된 세포층과, 상기 세포로부터 분비된 기저막을 포함하는 스크리닝용 세포 시이트.
본 발명에 의하면, 기저막이 표출한 구성을 갖는 망막 색소 상피 세포 시이트를 쉽고 안정적으로 제조할 수 있다. 본 발명의 세포 시이트는 생착율 및 기능성이 우수하고, 이식에 매우 유용하기 때문에, 기저막과 망막 색소 상피 세포로 구성되는 시이트를 제조함으로써, 가령 황반 변성증 환자 등과 같은 안 질환 환자에 이식하여 적용할 수 있다. 특히, 배양에 사용하는 세포를 iPS 세포 유래의 망막 색소 상피 세포로 하는 경우, 환자 자신의 세포를 소스로서 이용함으로써, 이식시의 거절반응을 회피할 수 있다.
도 1 은 망막 색소 상피 세포 시이트의 사이토카인 분비능의 시험 결과를 나타낸다.
이하에서, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 하기의 공정을 포함하는 세포 시이트의 제조 방법을 제공한다:
(1) 콜라겐 겔상에 망막 색소 상피 세포를 파종하고 배양하여, 망막 색소 상피 세포로 구성된 세포 시이트를 형성시키는 공정, 및
(2) 콜라겐 겔을 콜라게나아제로 분해하여, 망막 색소 상피 세포로 구성된 세포 시이트를 박리하는 공정.
공정 (1) 에서 파종되는 망막 색소 상피 세포는 포유동물 (예, 사람, 원숭이, 생쥐, 쥐, 개, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 고양이, 토끼, 햄스터, 기니 피그 등) 유래의 세포이면, 어느 포유동물 유래의 세포여도 되고, 바람직하게는 사람 유래의 세포이다.
파종되는 망막 색소 상피 세포는 안구에서 직접 채취한 초대 세포, 또는 몇 대 계대후의 세포일 수 있다. 초대 망막 색소 상피 세포는 공지의 방법으로 단리할 수 있다. 예를 들어, 안구 유래의 망막 색소 상피 세포의 경우는, 사체의 안구를 적출한 후, 적도부에서 신속하게 분할하고, 유리체와 망막을 제거한 다음, 필요에 따라 콜라게나아제, 히알루로니다아제 등으로 처리하고, 셀 스크레이퍼에 의한 찰과에 의해, 또는 트립신 또는 EDTA 용액에서 처리하여 세포를 브루크 막으로부터 유리시킴으로써 세포를 회수한 후, 배양액중에서 정치시켜 배양 접시에 대한 접착 및 증식을 유도하고, 필요수로 증식시킨 세포를 트립신 처리 등으로 적절히 계대하여 세포수를 확보할 수 있다.
또한, 이들 세포는 배아 줄기 세포 (ES 세포), 유도 만능 줄기 세포 (iPS 세포) 등과 같은 미분화 만능 줄기 세포, 신경 줄기 세포 등과 같은 체 줄기 세포를 포함한 줄기 세포, 또는 신경 전구 세포 및 망막 전구 세포를 포함한 전구 세포를 분화 유도함으로써 수득되는 세포일 수도 있다. ES 세포는 또한 체 세포를 핵 초기화하여 생성된 ES 세포일 수 있다. 또한, 줄기 세포로서는, 최근 보고된 유도 만능 줄기 세포 (iPS 세포) 를 분화 유도함으로써, 목적의 세포를 제조할 수 있다. iPS 세포는 특정의 핵 초기화 물질 (핵산, 단백질, 저분자량 화합물 등) 을 체 세포에 도입함으로써 제조할 수 있는, ES 세포와 동등의 특성을 갖는 체 세포 유래의 유도 줄기 세포이다 [Takahashi, K. and Yamanaka, S., Cell, 126: 663-676 (2006); Takahashi, K. et al., Cell, 131: 861-872 (2007)]. 상기 줄기 세포를 목적의 분화 세포로 분화시키는데 사용되는 조건 및 배지는 종래 공지의 조건 및 배지에 따를 수 있거나, 또는 당업자가 적절히 설정할 수 있다. 본 발명에서는, 세포 시이트에 사용하는 망막 색소 상피 세포로서, 줄기 세포 또는 전구 세포, 바람직하게는 만능 줄기 세포를 분화 유도하여 수득된 세포를 사용하는 것이, 적절한 성숙 단계의 망막 색소 상피 세포를 제조할 수 있기 때문에 바람직하고, 특히 비교적 미숙한 망막 색소 상피 세포를 제조하여, 세포 시이트를 형성할 수 있다는 점에서 유리하다. 또한, 본 발명에 의해 제조되는 세포 시이트를 이식에 사용하는 경우, 이식하는 대상의 체세포를 iPS 세포의 소스로서 사용하여 수득되는 세포 시이트는 대상에 대해 항원성을 갖지 않기 때문에, iPS 세포의 사용은 바람직하다. 줄기 세포를 분화 유도시키는 경우에는, 예를 들어 사람 ES 세포 또는 iPS 세포 등과 같은 만능 줄기 세포를 Dkk-1, CKI-7 등과 같은 Wnt 길항제 및 Lefty A, SB-431542 등과 같은 Nodal 길항제를 첨가한 ES 분화 배지에서 배양한다. 일정 기간 동안 배양했을 때, 망막 전구 세포 마커인 Rx, Pax6 및 Mitf 가 발현되어, 광학 현미경으로 형태 관찰하고, 다각성 형태와 색소를 갖는 세포를 확인함으로써, 사람 망막 색소 상피 세포를 수득할 수 있다 [Neuroscience Letters 2009 Jul 24 458(3) 126-31, Journal of Cell Science 2009 Sep 1 122(Pt 17) 3169-79].
본 발명의 망막 색소 상피 세포는 콜라겐 겔상에 파종됨으로써 배양된다. 콜라겐 겔에 사용되는 콜라겐은 포유동물 (예, 사람, 원숭이, 생쥐, 쥐, 개, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 고양이, 토끼, 햄스터, 기니 피그 등) 유래의 것이면, 어느 것이어도 되고, 예를 들어 사람 또는 돼지 유래의 콜라겐이 사용된다. 콜라겐 유래의 조직의 예는 건, 피부 등을 포함한다. 콜라겐의 종류는 어느 것이어도 되지만, 사람 기저막을 구성하는 콜라겐 이외의 것이 바람직하고, 구체적으로는 IV 형 콜라겐 이외의 것이 바람직하다. 이들 중에서도, I 형 콜라겐을 사용하는 것이 바람직하다. 콜라겐 겔은, 예를 들어 종래 공지의 제조 방법으로 제조할 수 있으나, 본 발명에서는, 후술하는 실시예에 기재된 바와 같이, 콜라겐의 섬유화를 유발시켜, 콜라겐 섬유 네트워크로 구성되는 겔을 제조한다. 섬유화된 콜라겐은 강도 및 유연성을 겸비하기 때문에, 취급이 용이하고, 세포 증식 및 세포 분화의 유지가 양호하며, 본 발명에 사용되는 콜라겐 겔로서 바람직하다. 또한, 본 발명에 사용되는 콜라겐은, 콜라겐 겔상에 파종된 세포가 겔층에 가라않지 않고서, 겔 표면상에 유지되는 것이 필요하다. 따라서, 콜라겐으로서는, 겔이 세포 증식에 필요한 강도를 갖는 것이 바람직하고, 예를 들어 분자간 가교량이 많은 콜라겐이 바람직하다. 이와 같은 콜라겐으로서는, 건 유래의 콜라겐을 들 수 있다.
상기 콜라겐 겔의 콜라겐 농도는, 망막 색소 상피 세포가 정착하여 증식할 수 있는 강도를 가지며, 콜라게나아제로 용이하게 분해할 수 있는 용해성, 취급하기 쉬운 점성 등을 만족하는 겔을 제공할 수 있는 농도이면, 어떠한 범위도 되지만, 바람직하게는 0.1 % (W/V) - 0.5 % (W/V), 보다 바람직하게는 0.2 % (W/V) - 0.3 % (W/V) 이다. 콜라겐 겔의 콜라겐 농도가 0.1 % (W/V) 미만인 경우에는, 콜라겐 겔의 강도가 부족하기 때문에, 망막 색소 상피 세포의 정착율 및 세포 증식 속도가 저하된다. 콜라겐 겔의 콜라겐 농도가 0.5 % (W/V) 를 초과하는 경우에는, 콜라겐 겔을 분해하기 위한 콜라게나아제 처리 시간이 길어져, 세포에 악영향을 주는 것이 염려된다.
상기 콜라겐 겔의 제조에 사용되는 콜라겐 겔 혼합 용액의 용량은 세포 배양에 사용하는 배양용 기재의 배양 면적 및 형상에 따라 다르지만, 단위 면적 (㎠) 당 바람직하게는 약 100 ㎕ - 약 250 ㎕, 보다 바람직하게는 약 150 ㎕ - 약 200 ㎕ 이다. 콜라겐 겔 혼합 용액의 양이 너무 적은 경우에는, 겔 표면에 작용하는 표면 장력의 영향으로 중앙 부분이 얇은 콜라겐 겔층이 형성되고, 망막 색소 상피 세포를 배양할 때 세포가 직접 배양용 기재와 접촉하기 때문에, 세포 시이트의 절단시에 시이트가 손상되는 경향이 있다. 콜라겐 겔 혼합 용액의 양이 과잉인 경우에는, 배양용 기재상에 두꺼운 콜라겐 겔층이 형성되어, 상대적으로 배양액의 양이 감소하기 때문에, 유지 배양을 실시하기 어렵고, 또한 콜라게나아제 처리에 시간이 걸려, 세포 시이트에 대한 손상이 염려된다.
공정 (1) 에 있어서, 상기 망막 색소 상피 세포를 세포 배양 기재의 콜라겐 겔상에 파종하여, 배양함으로써 세포 시이트를 제조할 수 있다. 본 발명에서의 세포 배양 기재는, 세포 배양용이면 특별히 한정되지 않는다. 이의 예는 트랜스웰 등과 같은 다공질 막을 갖는 배양용 용기, 플라스크, 조직 배양용 플라스크, 접시, 페트리 접시, 조직 배양용 접시, 멀티 접시, 마이크로플레이트, 마이크로웰 플레이트, 멀티플레이트, 멀티웰 플레이트, 챔버 슬라이드, 페트리 접시, 튜브, 트레이, 배양 백 및 롤러 보틀을 포함한다. 다공질 막을 갖는 배양용 용기가, 콜라게나아제 처리 및 세포 시이트의 절단 조작을 간편하게 실시하기 때문에 바람직하다. 예를 들어, 시판되고 있는 트랜스웰을 사용하는 것이 바람직하다. 본 명세서에서의 세포 배양 기재의 재질의 예는 금속, 유리, 세라믹, 실리콘 등과 같은 무기 재료, 엘라스토머, 플라스틱 (예, 폴리에스테르 수지, 폴리에틸렌 수지, 폴리프로필렌 수지, ABS 수지, 나일론, 아크릴 수지, 불소 수지, 폴리카보네이트 수지, 폴리우레탄 수지, 메틸펜텐 수지, 페놀 수지, 멜라민 수지, 에폭시 수지, 염화비닐 수지) 으로 대표되는 유기 재료를 포함하지만, 이것으로 한정되지 않는다.
파종되는 망막 색소 상피 세포의 수는, 세포 시이트를 형성시킬 수 있는 세포 밀도이면 어떠한 범위여도 된다. 그러나, 세포 밀도가 너무 낮은 경우에는, 세포의 형상이 나쁘고, 융합 (confluence) 에 이를 때까지의 배양 시간이 길며, 또한 세포의 성숙 및 착색에 필요한 시간이 길어진다. 세포 밀도가 너무 높은 경우에는, 마찬가지로, 세포 증식이 억제되고, 융합에 이를 때까지의 배양 시간이 길어지는 경향이 있으며, 세포가 과밀화되어 사멸할 수 있다. 따라서, 파종되는 세포의 밀도는 바람직하게는 약 4.5×104 세포/㎠ - 약 8.5×105 세포/㎠, 보다 바람직하게는 약 8.5×104 세포/㎠ - 약 8.5×105 세포/㎠, 가장 바람직하게는 약 4.5×105 세포/㎠ 이다.
콜라겐 겔상에 파종한 망막 색소 상피 세포를 배양액중에서 배양함으로써, 상기 망막 색소 상피 세포로 구성된 단층의 세포 집단 (세포 시이트) 을 형성할 수 있다. 배양액은 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 세포 배양용 배지이면, 특별히 제한없이 사용할 수 있다. 예를 들어, F-10 배지, F12 배지, MEM, BME 배지, DMEM, αMEM, IMD 배지, ES 배지, DM-160 배지, Fisher 배지, WE 배지, RPMI1640 배지 등과 같은, Asakura Shoten 발행 "Japan Tissue Culture conference ed., Technique of Tissue Culture 3rd edition" page 581 에 기재되어 있는 기초 배지를 사용할 수 있다. 또한, 기초 배지에 혈청 (소 태아 혈청 등), 각종 증식 인자 (EGF, FGF, HGF, PDGF 등), 항생물질, 아미노산 등을 첨가할 수 있다. 배지의 pH 는 바람직하게는 약 6 - 약 8 이다. 배양에 대해서는, 예를 들어, 통상적으로 약 30 - 약 40 ℃ 에서 약 15 - 약 60 hr 동안, 망막 색소 상피 세포가 융합될 때까지 일차 배양이 실시된다. 그 후, 배지를 교환하면서 약 1 주 - 약 2 개월간 이차 배양을 실시한 후, 필요에 따라 환기 및 교반을 실시하면서, 세포 시이트의 형성까지 배양을 실시한다. 이러한 배양에 의해 수득되는 세포 시이트를 구성하는 세포는 망막 색소 상피 세포로서 유지된다. 세포의 망막 색소 상피 세포로서의 유지는 특이적 분화 마커로서 BEST1, RPE65, MERTK, CRALBP 등을 검출하는 것으로 확인할 수 있다.
공정 (1) 에서 형성된 세포 시이트는 콜라겐 겔에 접착하고 있기 때문에, 예를 들어, 이식 등에 그대로 사용하는 경우, 콜라겐 겔이 피이식자에 대한 정착을 방해하는 것이 염려된다. 콜라겐 겔을 미리 제거할 수가 있으면, 이러한 문제의 해결에 이바지한다. 본 발명의 공정 (2) 에서는, 공정 (1) 에서 형성된 세포 시이트에 접착하고 있는 콜라겐 겔을 콜라게나아제로 분해시킨다. 당업자는 콜라겐 겔의 제조에 사용된 콜라겐의 종류에 따라서, 적절한 콜라게나아제를 선택할 수 있다. 콜라겐 겔의 분해에 사용되는 콜라게나아제는 콜라겐 겔을 소화할 수 있는 활성을 갖는 것이면 특별히 한정되는 것은 아니나, 사람 기저막을 구성하는 콜라겐 (예, IV 형 콜라겐 등) 을 용이하게 분해시키지 않는 것이 바람직하다. 예를 들어, 상업 레벨로 입수 가능하고, 안전하며, 높은 효소 활성을 갖는 클로스트리듐 (클로스트리듐 히스톨리티쿰) 또는 스트렙토마이세스 (스트렙토마이세스 파르부르스) 에서 유도되는 미생물 유래의 콜라게나아제를 사용할 수 있다.
상기 콜라게나아제의 활성으로서는, 콜라게나아제의 단위 중량당 활성 및 콜라게나아제 수용액의 단위 용적당 활성보다 오히려, 콜라겐 겔중의 콜라겐 중량에 대한 비활성 (specific activity) 이 중요하다. 콜라겐 겔을 용해시키는데 사용되는 콜라게나아제의 비활성 (콜라게나아제 활성/콜라겐 중량) 은 바람직하게는 0.1 U/㎎ 이상이다. 콜라게나아제의 비활성이 0.1 U/㎎ 미만인 경우, 콜라겐 겔의 용해에 시간이 너무 걸릴 수 있어 바람직하지 않거나, 또는 상기 겔이 충분히 용해되지 않을 수 있어 바람직하지 않다. 보다 바람직하게는 0.1 - 10,000 U/㎎, 더욱 바람직하게는 1 - 3,000 U/㎎ 의 범위이다.
본 발명의 세포 시이트의 제조 방법에 있어서, 콜라겐 겔에 콜라게나아제를 작용시키는 방법은 특별히 한정되는 것은 아니다. 용매로서 배지 또는 완충능을 갖는 등장액을 사용하여 제조한 콜라게나아제 용액을 배지에 첨가할 수 있거나, 또는 세포 배양 접시에서 박리한 세포-부착 콜라겐 겔을 상기 콜라게나아제 용액에 침지시킬 수 있다. 본 발명에서는 세포 배양 기재로서 트랜스웰을 이용하기 때문에, 인서트를 회수하여 상기 인서트 저면의 막을 제거함으로써 콜라겐 겔층을 노출시킬 수 있으며, 노출된 콜라겐 겔을 직접 상기 콜라게나아제 용액에 침지시키는 것이 바람직하다.
본 발명의 세포 시이트의 제조 방법에 있어서, 콜라게나아제에 의해 콜라겐 겔을 용해시키는 시간은 특별히 한정되지 않는다. 콜라게나아제를 작용시키는 시간이 너무 길면, 접착능, 증식능 등과 같은 세포 기능이 저하될 수 있어 바람직하지 않다. 콜라게나아제에 의한 용해 시간은 콜라게나아제의 비활성, 온도, 콜라겐 겔의 형상, 콜라게나아제 처리 방법 등에 따라 다르며, 통상적으로 15 min - 60 min 이다. 콜라게나아제 처리는 단회 처리일 수 있거나, 또는 복수회 실시할 수 있다.
본 발명의 세포 시이트 제조 방법에서의 콜라게나아제에 의한 콜라겐 겔의 처리시의 온도는, 세포는 일반적으로 생체내 온도의 10 ℃ 이하 (사람에서는 약 30 ℃) 가 되면 세포질의 유동성이 저하되어 대사능이 저하되고, 온도가 42 ℃ 를 초과하면 단백질이 변성되어 세포 기능이 저하되며, 콜라게나아제의 최적 온도는 주로 37 ℃ 이고, 이것 미만의 온도에서는 용해 시간이 길어지기 때문에, 바람직하게는 10 - 42 ℃, 보다 바람직하게는 30 - 40 ℃, 더욱 바람직하게는 36 - 38 ℃ 의 범위에서 설정한다.
본 발명의 세포 시이트의 제조 방법에 있어서, 콜라겐 겔의 용해가 진행되면, 세포 시이트가 겔로부터 서서히 박리되어, 마침내 콜라게나아제 용액중에서 유리된다. 세포 시이트를 회수하기 위해서, 세포 시이트를 잔류 겔로부터 기계적으로 박리할 수 있거나, 또는 겔의 완전한 용해후에 회수할 수 있다. 기계적 박리는 세포 시이트의 회수까지의 시간을 단축시키지만, 세포 시이트가 파괴될 수 있기 때문에, 겔의 완전한 용해후에 회수하는 것이 바람직하다.
상기와 같이 회수된 세포 시이트는 그대로 각종 용도에 사용할 수 있으나, 잔류 콜라게나아제가 세포 시이트간의 밀착성 또는 조직에 대한 접착성을 저해할 수 있기 때문에, 배지 또는 완충능을 갖는 등장액으로 세정하는 것이 바람직하다. 세정시의 온도는 콜라게나아제에 의한 콜라겐 겔 용해 처리에 따라서 설정할 수 있다. 잔류 콜라게나아제를 충분히 제거하기 위해서, 시이트를 배지 또는 완충능을 갖는 등장액으로 1 회 이상 세정하는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법으로 수득되는 세포 시이트에서는, 망막 색소 상피 세포 특유의 사이토카인이 생체내와 동일한 극성을 가지고 분비하고 있으며, 세포간의 밀착 결합의 지표가 되는 경상피 전기 저항 (TER) 이 생체내와 같이 상승한다. 따라서, 이것은 생체내와 동일한 세포층 장벽 기능을 가진다. 본 발명의 방법에 의하면, 생체내와 동일한 기능을 갖는 세포 시이트를 수득할 수 있다.
본 발명의 방법으로 수득되는 세포 시이트에서는, 망막 색소 상피 세포간에 밀착 교차점이 형성되며, 또한 콜라겐 겔과의 접촉면에 기저막이 형성된다. 본 명세서에 있어서, "기저막" 은 망막 색소 상피 세포로부터 생성된 성분으로부터 형성된 막이며, 기저막 성분의 적어도 일부를 함유하는 막 (이하, "망막 색소 상피 세포의 기저막" 이라고 한다) 을 의미한다. 생체내의 망막 색소 상피 세포의 기저막은 망막 색소 상피 세포층과 브루크 막을 구성하는 내부 콜라겐층 사이에 얇은 막으로서 존재하며, IV 형 콜라겐, 라미닌, 헤파란 황산 프로테오글리칸 (퍼레칸), 니도겐 등을 대표적인 성분으로서 가지는 세포외 매트릭스이다. 브루크 막은 망막 색소 상피 세포층과 맥락막 사이에 있는 얇은 막이며, 망막 색소 상피 세포의 기저막, 내부 콜라겐층, 엘라스틴층, 외부 콜라겐층, 및 맥락막의 모세관판의 기저막의 5 층 구조를 가진다. 본 발명의 세포 시이트는 브루크 막의 구조의 일부 (망막 색소 상피 세포의 기저막) 를 함유한다. 밀착 교차점의 형성은 6 각형 모양의 서로 밀착하는 세포 형태, 및 면역염색에 의한 세포간의 오클루딘, ZO-1 등의 발현을 관찰함으로써 확인할 수 있다. 기저막의 형성은 면역염색에 의해 라미닌, 헤파란 황산 프로테오글리칸 (퍼레칸), 니도겐, 또는 IV 형 콜라겐 등과 같은 기저막 마커의 세포 표면에서의 발현을 관찰하거나, 또는 주사형 전자 현미경에 의한 관찰에 의해 확인할 수 있다.
일반적으로, 배양 접시상에서 배양한 망막 색소 상피 세포는 기저막 성분을 생성하지만, 배양 접시로부터 박리한 사용 가능한 망막 색소 상피 세포 시이트의 형태로 세포를 박리하는 것은 매우 어렵다 (Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 36(2), 1995, 381-390). 본 발명의 방법에 의하면, 인공막을 사용하지 않고서, 망막 색소 상피 세포로부터 생성된 기저막을 수반하는 망막 색소 상피 세포를 시이트로서 회수할 수 있다. 망막 색소 상피 세포는 단층 구조를 형성하기 때문에, 이것을 단독으로 취급하는 경우에는, 시이트 구조가 붕괴되어, 세포가 세포 단위로 뿔뿔이 흩어지게 된다. 따라서, 이것을 시이트로서 이식하는 것은 매우 어렵다. 한편, 본 발명의 세포 시이트는 기저막을 수반하여 충분한 강성을 가지기 때문에, 회수시에 쉽게 주름이 가지 않아, 취급이 매우 용이해진다. 그 결과, 세포 이식 장치에 대한 탑재 및 이식 조작을 원활히 실시할 수 있기 때문에, 세포 이식을 최소한의 침습으로 실시할 수 있어, 효과 및 예후가 함께 향상되는 것이 기대된다. 또한, 세포 시이트는 기저막을 수반하기 때문에, 기저막이 동시에 장애를 받고 있는 질환에서의 이식에 매우 유리하다. 예를 들어, 가령 황반 변성은 때때로 브루크 막의 장애를 수반한다. 본 발명의 세포 시이트중의 기저막은 상기 장애 부분을 보충함으로써, 세포 시이트의 생착율을 향상시킬 수 있으며, 이의 치료 효과도 기대할 수 있다. 이 때문에, 본 발명의 세포 시이트는 기저막의 장애를 수반하는 질환을 대상으로 하는 이식용 시이트로서 바람직하며, 특히 가령 황반 변성을 대상으로 하는 이식용 시이트로서 바람직하게 이용할 수 있다.
본 발명의 세포 시이트의 제조 방법은 하기의 공정 (3) 을 추가로 포함할 수 있다:
(3) 박리된 세포 시이트와 콜라겐 겔 사이의 접촉면에 기저막의 유무를 확인하는 공정.
공정 (3) 에 있어서, 세포 시이트의 기저막의 유무를 확인함으로써, 망막 색소 상피 세포로 구성되는 세포층과 기저막을 갖는 세포 시이트의 형성을 판정할 수 있다. 기저막의 유무는, 기저막 마커의 발현, 주사형 전자 현미경에 의한 관찰 등과 같은 상기 서술한 기저막의 형성의 확인과 동일한 방법으로 확인할 수 있다. 기저막의 검출은, 기저막 마커의 발현을 세포의 임의의 지점 (예, 세포질, 세포막, 핵막 등) 에서 확인할 수 있다. 바람직하게는, 콜라겐 겔과의 접촉면에서 발현하고 있는 마커를 대상으로 한다.
본 명세서에서의 기저막 마커는 기저막에서 특이적으로 발현하고 있는 유전자의 전사 산물, 번역 산물 또는 분해 산물을 포함한다. 이러한 유전자의 예는 라미닌, 헤파란 황산 프로테오글리칸 (퍼레칸), 니도겐, IV 형 콜라겐 등을 포함한다. 이들 중에서, 기저막의 주성분인 라미닌, IV 형 콜라겐 등이 바람직하게 사용된다.
"박리된 세포 시이트와 콜라겐 겔 사이의 접촉면에 기저막의 유무의 확인" 에 사용되는 시료는, 공정 (2) 에서 박리된 세포 시이트 (또는 세포) 유래의 기저막 마커 (예, RNA, 단백질, 이의 분해 산물 등) 를 함유하는 것이면 특별히 제한되지 않는다.
상기 시료가 RNA 인 경우의 기저막 마커 유전자의 발현은, 공정 (2) 에서 박리된 세포 시이트의 세포로부터 RNA (예, 전체 RNA, mRNA) 분획을 제조하고, 이 분획에 함유된 마커 유전자의 전사 산물을 검출하거나, 또는 상기 세포로부터 RNA 를 추출하지 않고 직접 세포중의 마커 유전자 산물을 검출함으로써 조사할 수 있다.
세포로부터 RNA (예, 전체 RNA, mRNA) 분획을 제조하는 경우, 구아니딘-CsCl 초원심법, AGPC 법 등과 같은 공지의 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 시판되고 있는 RNA 추출용 키트 (예, RNeasy Mini Kit; QIAGEN 제 등) 를 이용하여, 미량의 시료로부터 신속하고 간편하게 고순도의 전체 RNA 를 제조할 수 있다. RNA 분획중의 기저막 마커 유전자의 전사 산물을 검출하는 방법의 예는 하이브리다이제이션 (노던블롯, 도트 블롯, DNA 칩 해석 등) 을 사용하는 방법, PCR (RT-PCR, 경합 PCR, 리얼 타임 PCR 등) 을 사용하는 방법 등을 포함한다. 미량의 시료로부터 신속하고 간편하게 기저막 마커 유전자의 발현 변동을 검출할 수 있는 점에서, 경합 PCR, 리얼 타임 PCR 등과 같은 정량적 PCR 법이 바람직하고, 또한 복수의 마커 유전자의 발현 변동을 일괄 검출할 수 있으며, 검출 방법의 선택에 의해 정량성도 향상시킬 수 있는 등의 점에서, DNA 칩 해석이 바람직하다.
노던블롯 또는 도트 블롯 하이브리다이제이션을 사용하는 경우, 기저막 마커 유전자는 이 유전자의 전사 산물과 하이브리다이즈할 수 있는 핵산 (프로브) 을 이용하여 검출할 수 있다. 이러한 핵산의 예는 매우 엄격한 조건하에서 기저막 마커 유전자의 전사 산물과 하이브리다이즈할 수 있는 핵산을 포함한다. "매우 엄격한 조건" 의 예는 6×SSC (염화나트륨/시트르산나트륨) 중 45 ℃ 에서의 하이브리다이제이션 반응후, 0.2×SSC/0.1 % SDS 중 65 ℃ 에서의 1 회 이상의 세정 등을 포함한다. 당업자는 하이브리다이제이션 용액의 염 농도, 하이브리다이제이션 반응의 온도, 프로브 농도, 프로브 길이, 미스매치의 수, 하이브리다이제이션 반응 시간, 세정액의 염 농도, 세정 온도 등을 적절히 변경함으로써, 원하는 엄격도로 용이하게 조절할 수 있다. 핵산은 DNA, RNA 또는 DNA/RNA 키메라일 수 있으며, 바람직하게는 DNA 를 들 수 있다.
프로브로서 사용되는 핵산은 2 개 사슬 또는 1 개 사슬일 수 있다. 2 개 사슬인 경우에는, 2 개 사슬 DNA, 2 개 사슬 RNA 또는 DNA:RNA 하이브리드일 수 있다. 1 개 사슬인 경우에는, 안티센스 사슬을 사용할 수 있다. 핵산의 길이는 표적 핵산과 특이적으로 하이브리다이즈할 수 있는 한 특별히 제한은 없고, 예를 들어 약 15 염기 이상, 바람직하게는 약 30 염기 이상이다. 표적 핵산의 검출 및 정량을 가능하게 하기 위해서, 핵산은 표지되고 있는 것이 바람직하다. 표지제의 예는 방사성 동위 원소, 효소, 형광 물질, 발광 물질 등을 포함한다. 방사성 동위 원소의 예는 [32P], [3H], [14C] 등을 포함한다. 효소로서는, 비활성이 큰 안정한 효소, 예를 들어 β-갈락토시다아제, β-글루코시다아제, 알칼리 포스파타아제, 퍼옥시다아제, 말산 탈수소효소 등이 바람직하다. 형광 물질의 예는 플루오레스카민, 플루오레세인 이소티오시아네이트 등을 포함한다. 발광 물질의 예는 루미놀, 루미놀 유도체, 루시페린, 루시게닌 등을 포함한다. 또한, 프로브와 표지제의 결합에 비오틴-(스트렙트)아비딘도 사용할 수 있다.
노던 하이브리다이제이션을 사용하는 경우에는, 상술한 바와 같이 제조한 RNA 분획을 겔 전기영동으로 분리한 후, 니트로셀룰로오스, 나일론, 폴리비닐리덴 디플루오라이드 등의 막에 전사하여, 상술한 바와 같이 제조한 표지 프로브를 함유하는 하이브리다이제이션 완충액중에서 상기 "매우 엄격한 조건" 하에 하이브리다이즈시키고, 상기 막에 결합한 표지량을 적당한 방법으로 밴드마다 측정함으로써, 각 기저막 마커 유전자의 발현량을 측정할 수 있다. 도트 블롯의 경우도, RNA 분획을 스폿한 막을 동일한 하이브리다이제이션 반응에 교부하여 (각 마커 유전자에 대해 각각 실시한다), 스폿의 표지량을 측정함으로써, 각 마커 유전자의 발현량을 측정할 수 있다.
DNA 칩 해석을 사용하는 경우, 예를 들어, 상술한 바와 같이 제조한 RNA 분획으로부터, 역전사 반응에 의해 T7 프로모터 등과 같은 적당한 프로모터를 도입한 cDNA 를 합성하고, RNA 폴리머라아제를 이용하여 cRNA 를 합성한다 (이 경우, 비오틴 등으로 표지한 모노뉴클레오티드를 기질로서 사용함으로써, 표지된 cRNA 가 수득된다). 표지된 cRNA 를 상기 프로브를 고정시킨 칩과 접촉시켜 하이브리다이제이션 반응을 실시하고, 고상 상의 각 프로브에 결합한 표지량을 측정함으로써, 각 기저막 마커 유전자의 발현량을 측정할 수 있다. 이 방법은 검출하는 분화 마커 유전자 (따라서, 고상화되는 프로브) 의 수가 많아질수록, 신속성 및 간편성의 면에서 유리하다.
한편, 세포로부터 RNA 를 추출하지 않고 마커 유전자를 검출하는 경우, 검출 수단으로서 제자리 (in situ) 하이브리다이제이션을 사용할 수 있다. 이 방법에서는, 세포로부터 RNA 를 추출하는 대신에, 세포를 고정제, 바람직하게는 침전 고정제, 예를 들어 아세톤으로 처리하거나, 또는 세포를 완충 포름알데히드 용액중에서 짧은 시간 동안 인큐베이션함으로써 세포를 고정시킨다. 고정화 후, 세포를 파라핀중에 포매하여 블록을 형성시키고, 이로부터 절단한 박편을 시료로서 사용할 수 있다. 양호하게 제조한 파라핀-포매 시료는 실온에서 여러해 동안 보존할 수 있다. 프로브로서 사용되는 핵산으로서는, 상기 예와 동일한 것을 사용할 수 있다. 제자리 하이브리다이제이션은, 세포와 콜라겐 겔 사이의 접촉면에 기저막 마커의 발현을 직접 확인할 수 있기 때문에, 본 발명에 바람직하게 사용된다.
대안적으로는, 공정 (2) 에서의 박리된 세포 시이트중의 기저막 마커의 발현은, 세포 시이트 (또는 세포) 로부터 단백질 분획을 제조하여, 상기 분획에 함유되는 마커 유전자의 번역 산물 (즉, 마커 단백질) 을 검출하거나, 또는 세포 시이트 (또는 세포) 로부터 단백질을 추출하지 않고서, 직접 세포 시이트 (또는 세포) 중의 마커 유전자의 번역 산물을 검출함으로써 확인할 수 있다. 마커 단백질은 각 단백질에 대한 항체를 이용하여 면역학적 측정법 (예, ELISA, FIA, RIA, 웨스턴 블롯 등) 으로 검출할 수 있으며, 효소 등과 같은 측정 가능한 생리 활성을 나타내는 단백질의 경우에서는, 공지의 방법으로 각 마커 단백질의 생리 활성을 측정함으로써 검출할 수 있다. 대안적으로는, 마커 단백질은 또한 MALDI-TOFMS 등과 같은 질량 분석법으로도 검출할 수 있다.
각 마커 단백질에 대한 항체는 통상적으로 사용되는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체 제조 기술에 따라서, 면역 항원으로서 마커 단백질 또는 단백질, 또는 이의 부분 펩티드를 사용하여 수득할 수 있다.
개개의 면역학적 측정법을 본 발명의 검사 방법에 적용하는 경우에는, 특별한 조건, 조작 등의 설정은 필요하지 않다. 각각의 방법에서의 통상적인 조건 및 조작법에 당업자의 통상적인 기술적 배려를 더하여 기저막 마커 단백질의 측정계를 구축할 수 있다. 이들 일반적인 기술 수단의 상세한 내용에 대해서는, 총설, 성서 등을 참조할 수 있다. 예를 들어, Hiroshi Irie 편저 "Radioimmunoassay" (Kodansha, 1974 년 발행), Hiroshi Irie 편저 "cont. Radioimmunoassay" (Kodansha, 1979 년 발행), Eiji Ishikawa 등 편저 "Enzyme Immunoassay" (Igaku-Shoin, 1978 년 발행), Eiji Ishikawa 등 편저 "Enzyme Immunoassay" (제 2 판) (Igaku-Shoin, 1982 년 발행), Eiji Ishikawa 등 편저 "Enzyme Immunoassay" (제 3 판) (Igaku-Shoin, 1987 년 발행), "Methods in ENZYMOLOGY", Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A)), 같은 책, Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B)), 같은 책, Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C)), 같은 책, Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected Immunoassays)), 같은 책, Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)), 같은 책, Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)) (전부 Academic Press 발행) 등을 참조할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 세포 시이트 제조 방법에 따라서 수득되는 세포 시이트, 바람직하게는 생체외에서 분화 유도에 의해 수득된 망막 색소 상피 세포로부터 형성된 세포층, 및 기저막을 포함하는 이식용 세포 시이트에 관한 것이다. 본 발명의 망막 색소 상피 세포 시이트는 안 질환 환자에 대한 망막 치료용 이식 재료로서 바람직하다. 안 질환의 예는 가령 황반 변성 질환, 망막 색소 변성증, 당뇨병성 망막증, 망막 박리 등과 같은 망막 변성 질환을 포함한다. 본 발명의 세포 시이트는 기저막을 함유하기 때문에, 브루크 막도 동시에 장애를 받은 질환에 대해서도 높은 생착율로 이식할 수 있다. 또한, 본 발명의 망막 색소 상피 세포 시이트는 생체와 동일한 성분으로 이루어지는 기저막을 갖기 때문에, 상기 안 질환에 대한 약효 스크리닝, 독성 평가 등과 같은 각종 스크리닝 용도로서도 이용할 수 있다. 상기 안 질환에 대한 약효 스크리닝으로서는, 예를 들어 JP-A-2007-500509 에 기재된 방법에 따라서, 상기 안 질환에 대해 약효를 갖는 물질의 스크리닝에 본 발명의 세포 시이트를 적용할 수 있다. 구체적으로는, 약효를 갖는 후보 물질의 존재 또는 부재하에서, 본 발명의 세포 시이트를 상기 안 질환의 원인이 될 수 있는 스트레스 조건 (예를 들어, 광 (예를 들어, 백색광, 청색광; 광은 망막 세포, 특히 광수용체 세포의 사멸을 유도하며, 황반 변성 유발 인자가 될 수 있다), A2E [레티노이드 N-레티닐리덴-N-레티닐-에탄올아민] (A2E 의 축적은 망막 세포의 가령성 신경변성, 특히 황반 변성의 발현에 기여하는 것으로 생각되고 있다), 담배 연기 응집물 (흡연은 황반 변성의 위험 인자라고 생각되고 있다), 외압 (예를 들어, 정수압; 안압의 상승은 녹내장과의 관련이 의심되고 있다)) 하에서 배양하고, 로돕신을 발현하는 광수용체의 수에 기초하여, 항-카스파제 3 항체를 사용한 면역염색에 의해 평가를 실시할 수 있다. 독성 평가로서는, JP-A-2007-517210 에 기재된 방법에 따라서, 독성 물질의 스크리닝에 본 발명의 세포 시이트를 적용할 수 있다. 구체적으로는, 독성 후보 물질의 존재 또는 부재하에서, 본 발명의 세포 시이트를 JP-A-2007-517210 에 기재된 인테그린 마커 펩티드를 이용하여 배양하고, 488 ㎚ 파장의 레이저로 여기시켜, 520 ㎚ 에서 형광을 검출함으로써 평가한다. 또한, 본 발명의 망막 색소 상피 세포 시이트는 광수용체 외절의 탐식능, 신경보호 작용 등과 같은 시세포의 유지에 관련되는 기능, 펌프 작용, 밀착 교차점과 같은 망막 혈관 장벽 기능 등과 같은 망막 색소 상피 세포의 여러가지 생체내 기능을 평가하기 위한 vitro 모델로서도 이용할 수 있다.
본 발명의 이식용 세포 시이트는 사람 및 사람 이외의 포유동물 (예, 원숭이, 생쥐, 쥐, 개, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 고양이, 토끼, 햄스터, 기니 피그 등) 에서의 상기 질환을 치료하기 위해서 사용할 수 있다.
본 발명의 이식용 세포 시이트를 적용할 수 있는 질환 부위의 범위는 대상 질환, 투여 대상의 동물종, 연령, 성별, 체중 및 증상 등에 의존해서 적절히 결정된다.
본 발명의 이식용 세포 시이트는 한번에 또는 수회로 나누어 이식할 수 있다. 이식의 적용 횟수는 질환 및 가이드라인에 따라서 의료 종사자에 의해 결정된다. 예를 들어, 질환이 가령 황반 변성 질환인 경우에는, 본 발명의 이식용 세포 시이트를 중증도에 의존해서 2 회 이상 이식할 수 있다. 이식을 복수회 실시하는 경우, 간격은 특별히 한정되지 않으며, 수 일 내지 수 주일의 기간을 둘 수 있다.
본 발명의 이식용 세포 시이트는 가이드라인에 따른 적절한 이식 방법에 따라서 의료 종사자에 의해 이식된다. 망막 아래에 본 발명의 이식용 세포 시이트를 이식하는 경우, 시이트를 안구의 망막 아래의 이식 부위까지, 자입한 주사 바늘로부터 수류에 싣는 것을 포함하는 이식 방법을 이용할 수 있거나, 또는 전용의 이식용 치료 기구를 사용할 수도 있다.
실시예
이하에서, 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 이들은 단순한 예시이며, 본 발명의 범위를 어떤 식으로든 한정하는 것은 아니다.
제조예 1. 망막 색소 상피 세포의 제조
하기 실시예 1 의 시이트화에 사용하는 망막 색소 상피 세포로서는, Neuroscience Letters 458 (2009) 126-131 에 기재된 방법에 따라서, iPS 세포의 분화 유도에 의해 수득된 성숙 망막 색소 상피 세포 (253G1, K11PD2, 59M8, 59SV2, 59SV3, 59SV9, 46a, K21EV15, 101EV3, K11EV9, 454E2), 및 ES 세포의 분화 유도에 의해 수득된 망막 색소 상피 세포 (hES, CMK6) 를 사용하였다.
<사람 iPS 유래의 망막 색소 상피 세포>
253G1 은 건강한 사람에서 유래하는 사람 iPS 세포의 분화 유도에 의해 수득된 망막 색소 상피 세포이고, K11PD2 및 59M8 은 서로 상이한 망막 색소 변성증 환자에서 유래하는 사람 iPS 세포를 분화 유도한 망막 색소 상피 세포이다. 상기 iPS 세포는 Cell 131, 861-872, 2007 에 기재된 방법에 따라서, 레트로바이러스를 이용하여 사람 피부 유래의 섬유아세포에 Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 유전자를 도입하는 것을 포함하는 방법으로 수립하였다.
59SV2, 59SV3 및 59SV9 는 동일한 망막 색소 변성증 환자에서 유래하는 사람 iPS 세포의 분화 유도에 의해 수득된 망막 색소 상피 세포이다. 상기 iPS 세포는 Proc. Jpn. Acad., Ser. B 85 (2009) 348-362 에 기재된 방법에 따라서, 센다이 바이러스를 이용하여 사람 피부 유래의 섬유아세포에 Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 를 도입하는 것을 포함하는 방법으로 수립하였다.
K21EV15, 101EV3, K11EV9 및 454E2 는 서로 상이한 망막 색소 변성증 환자에서 유래하는 사람 iPS 세포의 분화 유도에 의해 수득된 망막 색소 상피 세포이다. 상기 iPS 세포는 Nat Methods. 2011 May; 8(5): 409-12 에 기재된 방법에 따라서, 에피솜 벡터를 이용하여 사람 피부 유래의 섬유아세포에 사람 Oct3/4, Sox2, Klf4, L-Myc 및 LIN28 을 도입하는 것을 포함하는 방법으로 수립하였다.
<원숭이 iPS 유래의 망막 색소 상피 세포>
46a 는 Jpn. J. Transplant. 44, 231-235 에 기재된 방법에 따라서, 원숭이 (cynomolgus monkey) iPS 세포의 분화 유도에 의해 수득된 망막 색소 상피 세포이다.
<ES 유래의 망막 색소 상피 세포>
hES 는 사람 ES 세포주 khES-1 의 분화 유도에 의해 수득된 망막 색소 상피 세포이다. CMK6 은 Neuroscience Letters 458 (2009) 126-131 에 기재된 방법에 따라서, 원숭이 ES 세포의 분화 유도에 의해 수득된 망막 색소 상피 세포이다.
실시예 1. 망막 색소 상피 세포 시이트의 제조 방법
<콜라겐 겔 혼합 용액의 제조>
A: 돼지 건 유래의 산 가용성 I 형 콜라겐 Cellmatrix I-A (Nitta Gelatin, 3.0 ㎎/㎖), B: 5 배 농도의 농축 배양액 [DMEM/F12 (Invitrogen, 12500-062, 3 g) 를 MilliQ 수에 용해시켜, 전체 용량 (50 ㎖) 을 필터 처리], 및 C: 재구성용 완충액 [1N NaOH (50 mM, 5 ㎖), NaHCO3 (260 mM, 2.2 g) 및 HEPES (200 mM, 4.77 g) 를 MilliQ 수에 용해시켜, 전체 용량 (100 ㎖) 을 필터 처리] 을 제조하였다. 냉각하에서, B (2 용량) 를 기포를 발생시키지 않으면서 A (7 용량) 와 혼합 (담황색) 하였다. 이어서, C (1 용량) 를 첨가하고, 혼합물을 혼합 (담핑크색) 하여 0.21 % 콜라겐 겔 혼합 용액을 수득하였다.
<망막 색소 상피 세포 시이트의 제조>
0.21 % 콜라겐 겔 혼합 용액 (200 ㎕) 을 12 ㎜ 트랜스웰 인서트 (0.4 ㎛ 기공 폴리에스테르 막; Cornig, 3460) 의 인서트내에 첨가하고, 혼합물을 37 ℃ 에서 30 min 간 인큐베이트하였다. 이어서, F10-10 % FBS [F-10 (Sigma, N6908, 445 ㎖), FBS (50 ㎖), 페니실린-스트렙토마이신 (Invitrogen, 15140-122, 5 ㎖)] 를 인서트의 외부에 1500 ㎕ 및 인서트의 내부에 500 ㎕ 첨가하고, 트랜스웰을 37 ℃ 에서 24 hr 동안 인큐베이트하였다. 그 후, 인서트의 내부 및 외부를 F10-10 % FBS 로 1 회 세정하고, 제조예 1 에서 수득한 각각의 망막 색소 상피 세포를 인서트 내부에 5×105 세포 (F10-10 % FBS, 500 ㎕) 로 파종하고, F10-10 % FBS (1500 ㎕) 를 인서트의 외부에 첨가하였다. 망막 색소 상피 세포를 융합될 때까지 F10-10 % FBS 에서 배양하였다. 융합에 이른 후, 배지를 SFRM-B27 [DMEM (Sigma, D6046, 350 ㎖), F12 HAM (Sigma, N6658, 150 ㎖), B27 (Invitrogen, 17504-044, 10 ㎖), 200 mM L-글루타민 (Sigma, G7513, 5 ㎖), 페니실린-스트렙토마이신 (Invitrogen, 15140-122, 5 ㎖), bFGF (wako, 060-04543, 10 ng/㎖)] 로 교환하고 (인서트의 외부에 1500 ㎕, 인서트의 내부에 500 ㎕, 배지 교환은 3 회/주 임), 망막 색소 상피 세포를 적당한 색 및 형상을 나타낼 때까지 배양하였다.
<절단>
배양 개시부터 6 주간 경과 후, 인서트의 막을 제거하고, 콜라게나아제 L (Nitta Gelatin, PBS(+): Sigma, 2600 U/㎖, 100 ㎕) 을 인서트 아래에 첨가한 다음, 인서트를 37 ℃ 에서 60 min 간 배양하고, PBS(+) 로 3 회 세정하였다. 망막 색소 상피 세포 시이트가 건조되지 않도록 SFRM-B27 을 적하하고, PALM MicroBeam (ZEISS) 으로 원하는 크기로 절단하였다.
실시예 2. 망막 색소 상피 세포 시이트의 제조 방법 (콜라겐의 종류)
실시예 1 의 253G1 (iPS-망막 색소 상피 세포) 을 사용한 세포 시이트의 제조 공정에서, 돼지 건 유래의 산 가용성 I 형 콜라겐 Cellmatrix I-A (Nitta Gelatin, 3 ㎎/㎖) 를 0.21 % 콜라겐 혼합 용액/웰로서 사용하는 대신에, (A) 돼지 가죽 유래의 I 형 콜라겐 TE (특별 주문품: 주로 I 형 콜라겐, 소량의 III 형 콜라겐을 함유한다, Nitta Gelatin, 5 ㎎/㎖) 를 0.35 % 콜라겐 혼합 용액/웰로서 사용하고, (B) 돼지 건 유래의 I 형 콜라겐 T-1002 (특별 주문품: I 형 콜라겐, Nitta Gelatin, 5.1 ㎎/㎖) 를 0.35 % 콜라겐 혼합 용액/웰로서 사용하고, (C) FITC-표지 콜라겐 I (Chondrex, 1 ㎎/㎖) 을 0.07 % 콜라겐 혼합 용액/웰로서 사용하고, (D) FITC-표지 콜라겐 I (특별 주문, Chondrex, 3 ㎎/㎖) 을 0.21 % 콜라겐 혼합 용액/웰로서 사용하고, (E) 아텔로콜라겐 (KOKEN, 3 ㎎/㎖) 을 0.21 % 콜라겐 혼합 용액/웰로서 사용하고, (F) 세포 배양용 투과성 콜라겐 막 (KOKEN) 을 각각 사용한 것 외에는, 실시예 1 과 동일한 방법으로, 세포 시이트를 제조하고, 절단하여 망막 색소 상피 세포 시이트를 수득하였다.
실시예 1 및 상기 각 콜라겐을 사용한 경우의 시험 결과를 4 개의 항목 [1. 겔의 강도; 2. 세포의 접착; 3. 세포의 증식; 4. 안전성] 에서 비교하고 평가하였다. 그 결과, (A) {1. 열등; 2. 동등; 3. 열등; 4. 양호}, (B) {1. 양호 (5.1 ㎎/㎖); 2. 동등; 3. 열등; 4. 양호}, (C) {1. 열등 (1 ㎎/㎖); 2. 열등; 3. 불명; 4. 불명}, (D) {1. 동등 (3 ㎎/㎖); 2. 동등; 3. 열등; 4. 불명}, (E) {1. 동등 (3 ㎎/㎖); 2. 열등; 3. 불명; 4. 양호}, 및 (F) {콜라게나아제에 의해 용해되지 않아 사용할 수 없었다}. 겔의 강도에 관해서, 망막 색소 상피 세포가 증식하기 위해서는 어느 정도의 강도가 요구된다. 이와 같은 관점으로부터는, 특히 바람직한 콜라겐의 종류와 농도는 실시예 1 의 돼지 건 유래의 산 가용성 I 형 콜라겐 Cellmatrix I-A 및 상기 농도로 사용한 (B) 돼지 건 유래의 I 형 콜라겐 T-1002 였다. 기질이 어느 정도의 강도를 갖지 않는 경우, 망막 색소 상피가 증식하지 않아, 본 발명에 사용할 수 없다.
실시예 3. 망막 색소 상피 세포 시이트의 제조 방법 ( 콜라겐 양 )
실시예 1 의 253G1 (iPS-망막 색소 상피 세포) 을 사용한 세포 시이트의 제조 공정에서, 콜라겐 겔 혼합 용액의 사용량을 200 ㎕ 에서 100 ㎕ 또는 300 ㎕ 로 변경한 것 외에는, 실시예 1 과 동일한 방법으로, 세포 시이트를 제조하고, 절단하여 망막 색소 상피 세포 시이트를 회수하였다.
실시예 1 과 비교하여, 콜라겐 겔 혼합 용액의 사용량이 100 ㎕ 인 경우에는, 소량의 콜라겐 겔 혼합 용액으로 인한 표면 장력의 영향으로 중앙 부분에 얇은 콜라겐 겔층이 형성되고, 배양이 진행되면, 파종한 망막 색소 상피 세포가 저부의 막에 직접 접촉하기 쉽고, 시이트의 절단 작업시에 망막 색소 상피 세포 시이트가 파괴된다. 콜라겐 겔 혼합 용액의 사용량이 300 ㎕ 인 경우에는, 콜라겐 겔 혼합 용액의 양이 많아, 두꺼운 콜라겐 겔층이 형성되기 때문에, 인서트내에 유지할 수 있는 배지의 양이 상대적으로 적게 되어, 유지 배양을 실시하기 어렵고, 콜라게나아제 처리에 시간이 가해지며, 세포 시이트에 대한 손상이 커질 우려가 있다. 콜라겐 겔 혼합 용액의 사용량이 100 ㎕ 인 경우, 세포가 직접 막에 접촉하여, 막의 제거시에 당해 지점으로부터 세포 시이트가 파쇄되었다.
실시예 4. 망막 색소 상피 세포 시이트의 제조 방법 ( 콜라게나아제의 양과 처리 시간)
실시예 1 의 253G1 (iPS-망막 색소 상피 세포) 을 사용한 세포 시이트의 제조 공정에서, 1 % 콜라게나아제 L (Nitta Gelatin) 또는 I 형 콜라게나아제 (Roche) 를 30 ㎕ 의 양으로 30 min 간 대신에, 10 ㎕ 의 양으로 10 min, 10 ㎕ 의 양으로 20 min, 10 ㎕ 의 양으로 30 min, 20 ㎕ 의 양으로 20 min, 20 ㎕ 의 양으로 60 min, 및 30 ㎕ 의 양으로 50 min 간 망막 색소 상피 세포 시이트와 접촉시킨 것 외에는, 실시예 1 과 동일한 방법으로, 세포 시이트를 제조하고, 절단하여 망막 색소 상피 세포 시이트를 회수하였다.
그 결과, 콜라게나아제 처리를 10 ㎕ 의 양으로 60 min 또는 20 ㎕ 의 양으로 60 min 간 실시한 경우, 30 ㎕ 로 30 min 간과 동일한 정도의 콜라겐 분해를 관찰하였다.
실시예 5. 망막 색소 상피 세포 시이트의 제조 방법 (파종 세포수 )
실시예 1 의 253G1 (iPS-망막 색소 상피 세포) 을 사용한 세포 시이트의 제조 공정에서, 인서트 내에 파종하는 세포수를 5×105 세포/500 ㎕ 에서 (A) 5×104 세포/500 ㎕, (B) 1×105/500 ㎕ 또는 (C) 1×106/500 ㎕ 로 변경한 것 외에는, 실시예 1 과 동일한 방법으로, 세포 시이트를 제조하고, 절단하여 망막 색소 상피 세포 시이트를 회수하였다.
실시예 1 과 비교하여, (A) 및 (B) 는 적은 세포수로 인해 세포 융합에 이르는데 긴 시간이 필요하였으며, (C) 는 증식이 늦고, 또한 세포 융합에 이르는데 긴 시간이 필요한 경향이 있었다.
실시예 6. 망막 색소 상피 세포 시이트상에 형성된 기저막
실시예 1 의 253G1 (iPS-망막 색소 상피 세포) 로부터 제조한 세포 시이트로부터 cryo section (동결 절편) 을 제조하고, 면역조직화학 염색을 실시하였다. ZO-1 의 발현에 의해 밀착 교차점의 형성을 확인하였으며, 라미닌 및 IV 형 콜라겐의 발현에 의해 기저막의 형성을 확인하였다. 각 단백질의 검출에는, Zymed 제 토끼 항-ZO-1 (1:100 희석), Abcam 제 토끼 라미닌 (1:200 희석), 및 Calbiochem 제 생쥐 항-사람 콜라겐 IV 형 항체 (1:40) 의 각 항체를 사용하였다. 또한, Molecular Probes 제 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI; 1 ㎍/㎖) 을 사용한 핵 염색의 상태로부터, 망막 색소 상피 세포 시이트는 단층 상피 형태를 가지는 것을 확인하였다.
평가 1. 세포 시이트의 망막 색소 상피 특이적 유전자 발현 프로파일
실시예 1 의 59SV3, 59SV9 (iPS-망막 색소 상피 세포) 로부터 세포 시이트를 제조하는 공정에 있어서, 세포 융합후에 배지를 SFRM-B27 로 교환한 날을 0 일로 하여 1 주, 4 주, 2 개월 경과후에, 시이트를 구성하는 세포에서의 BEST1, RPE65, MERTK, CRALBP 의 발현을 RT-PCR 에 의해 확인하였다. 그 결과, 양성 대조군 (사람 망막 색소 상피 세포 전체 RNA (ScienCell 제, Cat NO. 6545)) 과 동일한 정도의 발현이 관찰되었다. 여기에서, BEST1, RPE65, MERTK 는 망막 색소 상피 세포에서 특이적으로 발현하는 유전자이다. CRALBP 는 망막 색소 상피 세포 및 뮐러 세포에서 발현하는 유전자이다.
평가 2. 망막 색소 상피 시이트중의 잔류 콜라겐의 측정
실시예 1 의 253G1 (iPS-망막 색소 상피 세포) 로부터 제조한 각각의 세포 시이트로부터, 콜라게나아제 처리전 및 후에 절단하여 Cryo section (동결 절편) 을 제조하고, 면역조직화학 염색을 실시하였다. 핵을 Molecular Probes 제 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI; 1 ㎍/㎖) 로 염색하고, 콜라겐 1 형을 Calbiochem 제 토끼 항-사람 콜라겐 I 형 항체 (1:40 희석) 로 염색하였다. 그 결과, 콜라게나아제 처리후의 시이트로부터는 콜라겐이 검출되지 않고, 콜라게나아제가 배양 접시상에 코팅된 콜라겐을 제거하였음을 확인하였다. 한편, 콜라게나아제 처리전에 절단한 시이트로부터는 콜라겐이 검출되었다.
평가 3. 망막 색소 상피 세포 시이트의 사이토카인 분비능
실시예 1 의 253G1 (iPS-망막 색소 상피 세포) 및 454E2 (iPS-망막 색소 상피 세포) 로부터 제조한 세포 시이트로부터 망막 색소 상피 세포 시이트를 절단하는 공정전에, 트랜스웰 내의 Apical 측 및 Basal 측의 배양액을 회수하고, Arvydas M, IOVS. 2006; 47: 3612-3624 에 기재된 방법에 따라, ELISA 로 VEGF 및 PEDF 의 생성량을 검출하였다. 그 결과, Arvydas M, IOVS. 2006; 47: 3612-3624 에 보고되고 있는 사람 태아 유래의 망막 색소 상피와 같이, VEGF 는 Basal 측에 주로 분비되고, PEDF 는 Apical 측에 주로 분비되는 것이 확인되었다 (도 1). 본 발명의 세포 시이트는 생체내와 동일한 사이토카인 분비능을 가지며, 기능성이 우수한 것으로 나타났다.
평가 4. 망막 색소 상피 세포 시이트의 경상피 전기 저항
세포층의 장벽 기능과 임피던스, 즉, 경상피/내피 전기 저항 (TER) 에는 강한 상관관계를 볼 수 있다. 실시예 1 의 454E2 (iPS-망막 색소 상피 세포) 로부터 제조한 망막 색소 상피 세포 시이트를 절단하는 공정전에, MILLIPORE 에 기재된 방법 (Millicell ERS-2 를 사용) 에 따라서, 인서트의 내부와 외부의 배지내에 프로브를 넣고, TER 을 전기적으로 측정하였다. 그 결과, TER 은 640 Ω·㎠ 이며, Nature Protocols vol 4, No 5 662-673 (2009), Fig 10 에 보고되고 있는 사람 태아 유래의 망막 색소 상피와 같이, 높은 TER 값을 나타냈다. 본 발명의 세포 시이트는 생체내와 동일한 높은 장벽 기능을 가지는 것으로 나타났다.
평가 5. 원숭이 ES 세포 유래의 망막 색소 상피 세포 시이트의 이식
실시예 1 의 원숭이 ES 세포 유래의 망막 색소 상피 세포, CMK6 으로부터 제조한 원숭이 망막 색소 상피 세포 시이트를 Invest Ophthalmol Vis Sci. 1995 Feb; 36(2): 381-90 에 기재된 방법에 따라서, 원숭이의 한쪽 눈에 이식하였다. 이식전에, 이식 예정의 눈의 망막에 장애를 주기 위해 망막 광응고술을 실시하였다. 망막 광응고 황반을 형성시킨 원숭이의 한쪽 눈에 이식후 28 일 째에, 안저 사진을 촬영하고, OCT (광 간섭 단층계) 를 이용하여 안저 단면의 영상을 조직 절편과 같이 산출하여, 망막의 상태를 확인하였다. 그 결과, 형광 안저 조영검사에 의해 형광의 누출은 발견되지 않았고, 이식편은 생착하고 있으며, 감각 망막의 비박화 등과 같은 장애는 발견되지 않았다.
평가 6. 원숭이 iPS 세포 유래의 망막 색소 상피 세포 시이트의 이식
실시예 1 의 원숭이 iPS 세포 유래의 망막 색소 상피 세포, 46a 로부터 제조한 원숭이 망막 색소 상피 세포 시이트를 Invest Ophthalmol Vis Sci. 1995 Feb; 36(2): 381-90 에 기재된 방법에 따라서, 자가 이식 1 개 눈 및 타가 이식 3 개 눈의 망막 아래에 이식하였다. 이식후 1 년 까지, 안저 사진을 촬영하고, OCT (광 간섭 단층계) 를 이용하여 안저 단면의 영상을 조직 절편과 같이 산출하여, 망막의 상태를 경시적으로 관찰하였다. 타가 이식에서는, 이식편 주위의 섬유성 변화, 형광 안저 조영검사에 의한 형광의 누출, 및 OCT 에 의한 망막 아래의 고휘도 병변과 같은 분명한 거절반응이 발견되었다. 한편, 자가 이식에서는, 이와 같은 분명한 거절반응은 관찰되지 않았으며, 형광 안저 조영검사에 의한 형광의 누출은 발견되지 않았고, 이식편은 생착하고 있으며, 감각 망막의 비박화 등과 같은 장애는 발견되지 않았다.
산업상 이용 가능성
본 발명의 방법을 이용하면, 가령 황반 변성 환자에게 이식 적용하는 망막 색소 상피 세포 시이트를 비교적 간편하게 제조할 수 있다. 특히, 배양에 사용하는 세포가 iPS 세포 유래의 망막 색소 상피 세포인 경우, 환자 자신의 세포를 이용할 수 있어, 이식시의 거절반응을 회피할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법으로 수득되는 세포 시이트는 생체내와 동일한 성분으로 이루어진 기저막을 가지기 때문에, 보다 생체내 상태에 가까운 망막 색소 상피 세포 시이트를 재현할 수 있어, 각종 스크리닝 용도로서 유용하다.
본 출원은 일본에서 출원된 특허 출원 제 2011-040130 호 (출원일: 2011 년 2 월 25 일) 를 기초로 하고 있으며, 그 내용은 모두 본 명세서에 포함된다.

Claims (8)

  1. 하기의 공정을 포함하는, 망막 색소 상피 세포, 망막 색소 상피 세포 간에 형성된 밀착 교차점 및 콜라겐 겔과의 접촉면에 형성된 기저막으로 구성된 세포 시이트의 제조 방법:
    (1) 콜라겐 겔상에 망막 색소 상피 세포를 파종하고 배양하여, 망막 색소 상피 세포, 망막 색소 상피 세포 간에 형성된 밀착 교차점 및 콜라겐 겔과의 접촉면에 형성된 기저막으로 구성된 세포 시이트를 형성시키는 공정, 및
    (2) 콜라겐 겔을 콜라게나아제로 분해하여, 망막 색소 상피 세포, 망막 색소 상피 세포 간에 형성된 밀착 교차점 및 콜라겐 겔과의 접촉면에 형성된 기저막으로 구성된 세포 시이트를 박리하는 공정.
  2. 제 1 항에 있어서, 망막 색소 상피 세포가 줄기 세포 또는 전구 세포를 분화 유도하여 수득된 세포인 세포 시이트의 제조 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 줄기 세포가 ES 세포 또는 iPS 세포인 세포 시이트의 제조 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 콜라겐 겔의 콜라겐 농도가 0.1 % - 0.5 % 인 세포 시이트의 제조 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 하기의 공정 (3) 을 추가로 포함하는 세포 시이트의 제조 방법:
    (3) 박리된 세포 시이트와 콜라겐 겔 사이의 접촉면에 기저막의 유무를 확인하는 공정.
  6. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 제조된, 망막 색소 상피 세포, 망막 색소 상피 세포 간에 형성된 밀착 교차점 및 콜라겐 겔과의 접촉면에 형성된 기저막으로 구성된 세포 시이트.
  7. 삭제
  8. 삭제
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