BR112013021514A2 - método de produção de camada de célula epitelial de pigmento retinal - Google Patents

Abstract

MÉTODO DE PRODUÇÃO DE CAMADA DE CÉLULA EPITELIAL DE PÍGMENTO RETINAL A presente invenção refere-se a um método de produção de uma camada de célula incluindo as seguintes etapas: (1) semeadura e cultivo de células epiteliais de pigmento retinal em um gel de colágeno para formar uma camada de célula composta das células epiteliais de pigmento retinal, e (2) degradação do gel de colágeno com coIagenase para destacar a camada de célula composta das células epiteliais de pigmento retinal, e similares.

Description

e ge o 5%s0“'évP.:--PB"““ "1 aaa Êttttte Z:=0P! ÁA OO PA —M PLZAOO -I.2.” inn —r5—£?.)!AÃAL". ' 1/34 hi Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO DE - PRODUÇÃO DE CAMADA DE CÉLULA EPITELIAL DE PIGMENTO RETI- NAL". 7 Campo Técnico A presente invenção refere-se a um método de produção de uma camada de célula, compreendendo semeadura de células epiteliais de pigmento retinal em um gel de colágeno.

A presente invenção também refe- re-se a uma camada de célula para transplante, compreendendo uma cama- da de célula formada de células epiteliais de pigmento retinal e uma mem- Ú 10 branabase. . Antecedentes da Técnica " No presente, a degeneração macular relacionada à idade (AMD) é uma das maiores doenças que causam cegueira oficialmente registrada em países avançados, e, principalmente, vista em cidadãos de idade avan- çadacom mais de 50 anos de idade.

A degeneração macular relacionada à idade é causada por mudanças relacionadas à idade na mácula, e grande- mente dividida a uma forma exsudativa e uma forma atrófica.

A degeneração macular relacionada à idade exsudativa é uma doença associada com o de- senvolvimento de vasos neovasculares a partir da coróide, na mácula de cidadãos de idade avançada, em seguida hemorragia e lesão exsudativa sob o epitélio de pigmento retinal ou retina, e, finalmente, formação de um tecido de cicatrização.

A degeneração macular relacionada à idade atrófica é uma doença acompanhada por atrofia da área e acúmulo de drusas.

Uma lesão precursora que conduz a degeneração macular relacionada à idade exsuda- tivae atrófica é, às vezes, referida a particularmente como degeneração ma- cular relacionada à idade de idade avançada, e esta lesão é também consi- derada ser uma patologia de degeneração macular relacionada à idade.

Para o tratamento de degeneração macular relacionada à idade quando ela é uma forma exsudativa branda, uma terapia cirúrgica, tal como terapia fotodinâmica, fotocoaguçao a laser, esvaziamento de vaso neovascu- lar, e similares, ou um método de tratamento objetivando na regressão e re- moção de vaso neovascular por uma terapia de fármaco, tal como adminis-

' 2/34 tração de um inibidor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) - envolvido na angiogênese e similares, podem ser selecionadas.

Contudo, os meios antes mencionados não podem proporcionar eficiência terapêutica ' para a forma exsudativa ou atrófica que progrediu para a atrofia avançada oufaltade epitélio de pigmento retinal (RPE). Em tal caso, um método de tratamento efetivo é transplante de células epiteliais de pigmento retinal, ou epitélio de pigmento retinal ao local deficiente sob a retina.

Vários métodos de tratamento pelo transplante de células epite- liais de pigmento retinal foram tentados.

Tem sido reportado que transplante Í 10 de células epiteliais de pigmento retinal obtido de feto humano na forma de ' uma suspensão de célula mostra pobre enxerto das células transplantadas. " Em casos onde uma camada de célula epitelial de pigmento retinal também contendo membrana de Bruch e coróide destacada similar a uma camada de um olho cadavérico foi transplantada, rejeição pós-operatória ocorreu, e um efeito de tratamento suficiente não foi obtido (documento de não patente 1). Em adição, o método utilizando um olho cadavérico foi apontado para incluir um problema ético.

Por outro lado, um caso de visão aperfeiçoada de um paciente com degeneração macular relacionada à idade foi reportado, no qual foi usado um método incluindo coleta das células epiteliais de pigmento retinal normais do próprio paciente e coroide, e transplantando-as ao local deficiente sob a mácula.

Contudo, este método coloca uma carga extrema- mente alta nos pacientes, e um risco extremamente alto de cirurgia.

Enquan- to que uma tentativa tem sido feita em utilizar as células epiteliais de pig- mento de íris do próprio paciente coletadas a partir do paciente com degene- ração macular relacionada à idade para o transplante, ao invés de células epiteliais de pigmento retinal, o limite superior da visão final é baixo, e um efeito suficiente não foi obtido, e, além disso, a carga e risco de utilização da própria célula do paciente são altos (documento de não patente 2). Desse modo, métodos de tratamento convencionais usando células coletadas de um olho cadavérico ou das próprias células do paciente, não são práticos em termos de éticas, segurança, efeito, e similares, e uma célula epitelial de pigmento retinal verdadeiramente utilizável para um tratamento de transplan-

.

te, tem sido desejada. - Como um dos métodos de produção de uma camada de célula epitelial de pigmento retinal, um método incluindo revestimento de um subs- ' trato de cultura de célula com uma matriz extracelular e similares, e cultura de células epiteliais de pigmento retinal nesta, para formar uma camada, pode ser mencionado. Por exemplo, uma camada de célula pode ser forma- da por cultura de células epiteliais de pigmento retinal em um material reves- tido com fibronectin, mas formação de uma membrana base não é reporta- da, e um método de retirar uma camada de um recipiente em que a camada Í 10 foiformada, não é descrito no todo (documento de não patente 3). Em con- ' sideração de tais problemas, um método de formação, em avanço, uma ca- ' mada de célula epitelial de pigmento retinal pelo uso de uma membrana arti- ficial no lugar de uma membrana base, foi desenvolvida por muitos laborató- rios. Contudo, uma membrana artificial é temida ser um distúrbio para enxer- to no transplante e manutenção funcional do corpo. Enquanto que uma membrana artificial com uma resposta menos biológica foi também desen- volvida, ela não é adequada para transplante, visto que ela induz problema- ticamente inflamação e rejeição associadas com esta, que são causadas pelas diferenças da membrana base produzidas pela própria célula na com- posição, propriedades, rigidez e similares. Convencionalmente, além disso, um método de cultura de uma camada de célula epitelial de pigmento retinal tendo polaridade, é conhecido. Contudo, ele é somente para uso de modelo experimental no qual células epiteliais de pigmento retinal e linha imortaliza- da derivada de um organismo vivo são/é produzida(s) em uma camada em um recipiente, e diretamente utilizadas, e não capacitaram ainda recupera- ção real de uma camada de célula epitelial de pigmento retinal provida com uma membrana base como em organismos vivos de um recipiente (docu- mento de não patente 4). Existe um método de obtenção de uma camada de célula epitelial de pigmento retinal por esfoliação de células epiteliais de pigmento retinal diretamente cultivadas em um prato de cultura, sem usar uma matriz extracelular, e similares. Tal método de destacamento de células por esfoliação não pode estabilizar a forma e tamanho da camada, membra-

. | na base, e similares, causando muito dano nas células epiteliais de pigmento . retinal por esfoliação, e causando, em muitos casos, desintegração da forma da camada e células difundidas devido a esfoliação, falhando, desse modo, " em proporcionar uma camada de célula utilizável para transplante e simila- res (documento de não patente 5). Em adição, enquanto que revestimento de um substrato de cultura de célula com colágeno e cultura de células no colágeno tenham sido reportados, células epiteliais de pigmento retinal hu- manas não são usadas. Além disso, para aumentar a resistência do gel, um agente de reticulação necessita ser adicionado separadamente, que torna o ' 10 método conveniente e rápido (documento de patente 1). Conforme a situa- BR ção se apresenta, a produção de uma camada de célula epitelial de pigmen- : to retinal, que é terapeuticamente efetiva para doenças retinais, tal como degeneração macular relacionada à idade, e similares, e conveniente e es- tável para preparar, tem sido ainda um problema. Lista de Documentos (Documento de Patente) Documento de Patente 1: JP-A-2005-261292 (Documento de Não patentes) Documento de não patente 1: Ophthalmic Surg. 1991 Feb; 22(2):

102. Documento de não patente 2: Tohoku J Exp Med. 1999 Dec; 189(4): 295-305. Documento de não patente 3: Nat. Protoc., 4(5), 2009, 662-673. Documento de não patente 4: Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 47, 2006,3612-3624. Documento de não patente 5: Invest. Ophthalmol. Vis. Sci, 36(2), 1995, 381-390. Sumário da Invenção Problemas a serem Solucionados pela Invenção . O problema da presente invenção é desenvolver um novo méto- do de produção de uma camada de célula epitelial de pigmento retinal con- venientemente e estavelmente sem uso de uma membrana artificial, e pro-

. porcionar pacientes com uma doença associada com a falta de epitélio de . pigmento retinal, tal como degeneração macular relacionada à idade e simi- lares, com uma camada de célula epitelial de pigmento retinal para trans- Í plante, que mostra alta taxa de enxerto e é superior em função. Meios de Solucionar os Problemas Os presentes inventores produziram uma camada de célula por formação de uma camada de gel de colágeno em um substrato de cultura de célula, e semeadura e cultivo de células epiteliais de pigmento retinal nesta. Uma camada de célula obtida por tal método mantém uma membrana base " 10 entreodgelde colágeno e a camada de célula epitelial de pigmento retinal, ' tem capacidade de secreção de citocina e adesividade entre células simila- ' res àquelas de células epiteliais de pigmento retinal in vivo, e permite fácil destacamento da camada de célula epitelial de pigmento retinal a partir do substrato de cultura de célula, enquanto que mantém a membrana base por decomposição do gel de colágeno com colagenase. Em adição, as células que constituem a camada de célula mantêm a expressão de um marcador específico de célula epitelial de pigmento retinal. Os presentes inventores conduziram estudos intensivos e completam a presente invenção a partir destas descobertas. Consequentemente, a presente invenção proporciona:

[1] um método de produção de uma camada de célula compre- endendo as seguintes etapas (1) semeadura e cultivo de células epiteliais de pigmento retinal em um gel de colágeno para formar uma camada de célula composta das células epiteliais de pigmento retinal, e (2) degradação do gel de colágeno com colagenase para desta- car a camada de célula composta das células epiteliais de pigmento retinal;

[2] o método de produção da camada de célula do acima men- cionado [1], no qual as células epiteliais de pigmento retinal são células obti- das por indução de diferenciação das células-tronco ou células progenitoras;

[3] o método de produção da camada de célula do acima men- cionado [2], no qual as células-tronco são células ES ou células iPS;

[4] o método de produção da camada de célula do acima men-

" " | 6/34 cionado [1], no qual a concentração de colágeno no gel de colágeno é 0,1% - - 0,5%;

[5] o método de produção da camada de célula de qualquer um ' do acima mencionado [1] a [4], compreendendo adicionalmente a seguinte etapa(3) (3) confirmação da presença ou ausência de uma membrana base na superfície de contato entre a camada de célula destacada e o gel de colágeno;

[6] uma camada de célula produzida pelo método de qualquer ' 10 umdo acima mencionado [1] a [5]; : [7] uma camada de célula para transplante, compreendendo : uma camada de célula formada com células epiteliais de pigmento retinal : obtidas por indução de diferenciação de células-tronco ou células progenito- ras ex vivo, e uma membrana base secretada de referidas células; e

[8] uma camada de célula para classificação, compreendendo uma camada de célula formada com células epiteliais de pigmento retinal obtidas por indução de diferenciação de células-tronco ou células progenito- ras ex vivo, e uma membrana base secretada de referidas células.

Efeito da Invenção De acordo com a presente invenção, uma camada de célula epi- telial de pigmento retinal tendo uma constituição tendo uma membrana base que aparece em uma superfície pode ser preparada facilmente e estavel- mente. Desde que a camada de célula da presente invenção é superior na taxa de enxerto e funcionalidade, e extremamente útil para transplante, uma camada composta de uma membrana base e células epiteliais de pigmento retinal pode ser produzida e aplicada aos pacientes com doenças oftálmicas, tais como pacientes com degeneração macular relacionada à idade, e simila- res, por transplante. Particularmente, quando a célula a ser usada para cul- tura é uma célula epitelial de pigmento retinal derivada de uma célula iPS, rejeição no transplante pode ser evitada pela utilização da célula dos pró- prios pacientes como uma fonte.

Breve Descrição dos Desenhos - A Fig. 1 mostra os resultados do teste da capacidade secretória de citocina da camada de célula epitelial de pigmento retinal. , Descrição das Modalidades A presente invenção é explanada em detalhe em seguida.

A presente invenção proporciona um método de produção de uma camada de célula, incluindo as seguintes etapas: (1) semeadura e cultivo de células epiteliais de pigmento retinal em um gel de colágeno para formar uma camada de célula composta das ' 10 células epiteliais de pigmento retinal, e BR (2) degradação do gel de colágeno com colagenase para desta- : car a camada de célula composta das células epiteliais de pigmento retinal. . Enquanto que a célula epitelial de pigmento retinal a ser semea- da na etapa (1) pode ser uma célula derivada de qualquer mamífero, consi- derando-se que ela é derivada de um mamífero (por exemplo, humano, ma- caco, camundongo, rato, cão, bovino, cavalo, suíno, ovelha, cabra, gato, co- elho, hamster, porquinho-da-índia, etc.), ela é preferivelmente uma célula derivada de humano.

A célula epitelial de pigmento retinal a ser semeada pode ser uma célula primária diretamente coletada de um globo ocular, ou uma célula após várias passagens.

As células epiteliais de pigmento retinal primárias podem ser isoladas por um método conhecido.

Por exemplo, no caso de cé- lulas epiteliais de pigmento retinal derivadas do globo ocular, um globo do olho cadavérico é isolado, rapidamente dividido no segmento equatorial, o corpo vítreo e a retina são removidos e tratados com colagenase, hialuroni- dase, e similares, conforme necessário, as células são coletadas por raspa- gem com um raspador de célula, ou tratamento em tripsina ou solução de EDTA para liberar as células a partir da membrana de Bruch, suportada em um meio de cultura para induzir adesão ao prato de cultura e crescimento, e as células crescidas no número requerido são apropriadamente passadas com um tratamento de tripsina, etc, para assegurar o número de células.

Além disso, estas células podem também serem as células obti-

i 8/34 das por indução de diferenciação de células-tronco pluripotentes não dife- - renciadas, tais como célula-tronco embriônica (célula ES), célula-tronco plu- ripotente induzida (célula iPS), e similares, células-tronco incluindo células- : tronco somáticas, tais como célula-tronco neural, e similares, ou células pro- genitoras incluindo célula progenitora neural e célula progenitora retinal.

A célula ES pode também ser uma célula ES produzida por reprogramação nuclear de uma célula somática.

Em adição, como a célula-tronco, a célula objeto pode ser preparada por indução de diferenciação de célula-tronco pluripotente induzida (célula iPS) reportada nos anos recentes.

A célula iPS ' 10 é uma célula-tronco induzida derivada de célula somática tendo proprieda- : des equivalentes àquelas da célula ES, que podem ser produzidas por intro- : dução de uma substância de reprogramação nuclear particular (ácido nuclei- : co, proteína, composto de baixo peso molecular, etc.) em uma célula somá- tica [Takahashi, K. and Yamanaka, S., Cell, 126: 663-676 (2006); Takahashi, Ketal., Célula, 131: 861-872 (2007)]). As condições e meios usados para diferenciação da célula-tronco antes mencionados na célula diferenciada do indivíduo podem seguir as condições e meios convencionalmente conheci- dos, ou podem ser apropriadamente determinados por aqueles técnicos no assunto.

Na presente invenção, uma célula obtida por indução de diferencia- ção de célula-tronco, ou célula progenitora, preferivelmente célula-tronco pluripotente, é preferivelmente usada como a célula epitelial de pigmento retinal a ser usada para camada de célula, visto que uma célula epitelial de pigmento retinal em um estágio de maturação apropriado pode ser prepara- da, e particularmente, comparativamente células epiteliais de pigmento reti- nalimaturas podem ser preparadas, e uma camada de célula pode ser van- tajosamente formada.

Em adição, quando a camada de célula a ser produzi- da pela presente invenção é para transplante, o uso de uma célula iPS é preferível, visto que uma camada de célula obtida usando uma célula somá- tica do indivíduo, que recebe transplante, como uma fonte de célula iPS, não tem antigenicidade contra o indivíduo.

Quando uma célula-tronco é induzida a diferenciar, por exemplo, célula ES humana, ou célulta-tronco pluripotente, tal como célula iPS e similares, é cultivada em um meio de diferenciação de

ES adicionado com antagonista Wnt, tais como DKk-1, CKI-7, e similares, e . antagonista Nodal, tais como Lefty A, SB-431542, e similares. Quando culti- vados por um dado período, Rx, Pax6 e Mitf, que são marcadores de célula : progenitora retinal, são expressos, e células epiteliais de pigmento retinal humanas podem ser obtidas por observação morfológica com um microscó- pio ótico, por confirmação de células tendo uma forma poligonal e pigmento [Neuroscience Letters 2009 Jul 24 458(3) 126-31, Journal of Cell Science 2009 Sep 1 122(Pt 17) 3169-79].

As células epiteliais de pigmento retinal da presente invenção ' 10 são cultivadas por semeadura em um gel de colágeno. O colágeno usado BR para o gel de colágeno pode ser qualquer um desde que seja derivado de : um mamífero (por exemplo, humano, macaco, camundongo, rato, cão, bovi- : no, cavalo, suíno, ovelha, cabra, gato, coelho, hamster, porquinho-da-índia, etc.) e, por exemplo, colágeno derivado de humano ou suíno, é usado. E- xemplos do tecido derivado de colágeno incluem tendão, pele, e similares. Enquanto que o tipo do colágeno pode ser qualquer um outro do que o colá- geno que constitui a membrana base humana é preferível, um outro do que colágeno tipo IV é especificamente preferível. Destes, colágeno tipo | é pre- ferivelmente usado. Enquanto que um gel de colágeno pode ser produzido por, por exemplo, um método de produção convencionalmente conhecido, na presente invenção, um gel composto de uma rede de fibra de colágeno é produzido por indução de fibrogênese de colágeno, conforme descrito no Exemplo abaixo mencionado. Desde que o colágeno fibrótico tem resistência e flexibilidade em combinação, ele é fácil de manusear, mostra boa manu- tenção de proliferação de célula e diferenciação de célula, e é preferível co- mo o gel de colágeno a ser usado na presente invenção. Em adição, o colá- geno a ser usado na presente invenção é requerido para manter células, que são semeadas no gel de colágeno, na superfície do gel sem permitir que as mesmas afundassem na camada de gel. Como o colágeno, portanto, prefe- ridoé um no qual o gel tem a resistência necessária para proliferação de célula e, por exemplo, colágeno tendo uma grande quantidade de reticulação intermolecular é preferível. Como tal colágeno, colágeno derivado de tendão pode ser mencionado.

- Enquanto que a concentração de colágeno do gel de colágeno antes mencionado pode ser em qualquer faixa considerando-se que ela po- ' de proporcionar um gel tendo resistência que permite enxerto e crescimento de células epiteliais de pigmento retinal, e satisfaz a solubilidade que facilita a degradação por colagenase, a viscosidade capacita fácil manuseio e simi- lares, é preferivelmente 0,1% (P/V) — 0,5% (P/V), mais preferivelmente 0,2% (PV) — 0,3% (P/V). Quando a concentração de colágeno do gel de colágeno é menor do que 0,1% (P/V), a resistência do gel de colágeno torna-se insufi- ' 10 ciente, e, portanto, a taxa de colonização e taxa de proliferação de célula de . células epiteliais de pigmento retinal diminuem. Quando a concentração de : colágeno do gel de colágeno excede 0,5% (P/V), o tempo de um tratamento : de colagenase para degradar o gel de colágeno torna-se longo, que é temido exercer uma influência adversa nas células.

Enquanto que o volume de uma solução misturada de gel de co- lágeno usada para a produção do gel de colágeno antes mencionado varia dependendo da área de cultura, e forma de um substrato de cultura a ser usado para a cultura de célula, é preferivelmente cerca de 100 ul - cerca de 250 ul, mais preferivelmente cerca de 150 ul - cerca de 200 ul, por área uni- tária(cm?). Quando a quantidade da solução misturada de gel de colágeno é muito pequena, uma camada de gel de colágeno tendo uma parte central delgada devido à influência de uma tensão superficial aplicada à superfície do gel é formada, e a camada tende a ser danificada durante corte da cama- da de célula, visto que as células contatam diretamente com um substrato de cultura para quando as células epiteliais de pigmento retinal são cultivadas. Quando a quantidade da solução misturada do gel de colágeno está em ex- cesso, uma camada de gel de colágeno espessa é formada em um substrato de cultura, que relativamente reduz a quantidade do meio de cultura, e, por- tanto, a manutenção da cultura não é fácil de realizar, tratamento de colage- —naselevatempo, e danos na camada de célula são temidos.

Na etapa (1), uma camada de célula pode ser produzida por se- meadura e cultivo das células epiteliais de pigmento retinal antes menciona-

das no gel de colágeno de um substrato de cultura de célula. O substrato de - cultura de célula na presente invenção não é particularmente limitado, consi- derando-se que é para cultura de célula. Exemplos destes incluem recipien- : tes de cultura tendo uma membrana porosa, tais como transcavidade e simi- lares, frasco, frasco de cultura de tecido, prato, prato petri, prato de cultura de tecido, multi prato, microplaca, placa de microcavidade, multiplaca, placa de multicavidade, fecho de câmara, prato petri, tubo, bandeja, saco de cultu- ra e garrafa cilíndrica. Os recipientes de cultura tendo uma membrana poro- sa são preferíveis, visto que um tratamento de colagenase e uma operação ' 10 de corteda camada de célula são convenientemente realizados. Por exem- ' plo, uma transcavidade comercialmente disponível é preferivelmente usada. ' Exemplos do material do substrato de cultura de célula no presente relatório : descritivo incluem, mas não são limitados a, materiais inorgânicos, tais co- mo, metal, vidro, cerâmica, silício, e similares, materiais orgânicos represen- tados por elastômero, plástico (por exemplo, resina de poliéster, resina de polietileno, resina de polipropileno, resina ABS, nylon, resina acrílica, fluoro- resina, resina de policarbonato, resina de poliuretano, resina de metilpente- no, resina de fenol, resina de melamina, resina epóxi, resina de cloreto de vinila).

O número das células epiteliais de pigmento retinal a serem se- : meadas pode ser em qualquer faixa considerando-se que ela é uma densi- dade de célula capaz de formar uma camada de célula. Contudo, quando a densidade da célula é muito baixa, a forma da célula é ruim, o tempo de cul- tura antes de alcançar confluência é longo, e ainda, o tempo necessário para maturação e coloração da célula é longo. Quando a densidade da célula é Ê muito alta, similarmente, a proliferação de célula é suprimida, o tempo de cultura antes de alcançar confluência tende a ser longo, e as células podem morrer de superlotação. Portanto, a densidade das células a serem semea- das é preferivelmente cerca de 4,5x10º células/cm? - cerca de 8,5x10* célu- las/cm?, mais preferiveimente cerca de 8,5x10º células/cm? - cerca de 8,5x10º células/cm?, mais preferivelmente cerca de 4,5x10º células/cm?. Uma população de célula de camada única (camada de célula)

composta de células epiteliais de pigmento retinal pode ser formada por cul- - tura das células epiteliais de pigmento retinal semeadas no gel de colágeno em um meio de cultura.

Um meio de cultura pode ser usado sem limitação ] particular considerando-se que ele é um meio de cultura de célula geralmen- te usado no campo pertinente.

Por exemplo, meio basal descrito em “Japan tissue culture conference ed., Technique of Tissue Culture 3rd edition” page 581, publicado por Asakura Shoten, tais como meio F-10, meio F12, MEM, meio BME, DMEM, aMEM, meio IMD, meio ES, meio DM-160, meio Fisher, meio WE, meio RPMI1640, e similares, pode ser usado.

Além disso, soro ] 10 (soro fetal bovino, etc.), vários fatores de crescimento (EGF, FGF, HGF, ' PDGF etc.), antibióticos, amino ácido, e similares, pode ser adicionado ao ] meio basal.

O pH do meio é preferivelmente cerca de 6 - cerca de 8. Como ' para cultura, por exemplo, uma cultura primária é realizada geralmente a cerca de 30 - cerca de 40ºC por cerca de 15 - cerca de 60 horas, até que as células epiteliais de pigmento retinal tornam-se confluentes.

Em seguida, uma cultura secundária é realizada por cerca de 1 semana - cerca de 2 me- ses, enquanto que mudando o meio, após o qual a cultura é realizada en- quanto que aeração e agitação onde necessário até formação de uma ca- mada de célula.

As células que constituem a camada de célula obtida por tal culturasão mantidas nas células epiteliais de pigmento retinal.

A manuten- ção das células como células epiteliais de pigmento retinal pode ser confir- mada por detecção de BEST1, RPE65, MERTK, CRALBP, ou similares, co-

mo um marcador de diferenciação específico.

Desde que a camada de célula formada na etapa (1) é aderida ao gel de colágeno, por exemplo, quando ela é diretamente usada para transplante e similares, o gel de colágeno é temido impedir enxerto em um recipiente de transplante.

Se o gel de colágeno pode ser removido em avan- ço, ele é condutível à solução de tal problema.

Na etapa (2) da presente in- venção, o gel de colágeno que adere à camada de célula formada na etapa (1) é degradado pela colagenase.

Aqueles técnicos no assunto podem sele- cionar colagenase apropriada de acordo com o tipo do colágeno usado para preparação do gel de colágeno.

Enquanto que a colagenase a ser usada para a degradação do gel de colágeno não é particularmente limitada consi- - derando-se que ela tem uma atividade para digerir gel de colágeno, uma que não degrada facilmente o colágeno que constitui a membrana base humana : (por exemplo, colágeno tipo IV, etc.) é preferível. Por exemplo, a colagenase derivada de um micro-organismo induzido de Clostridium (Clostridium his- tolyticum) ou Streptomyces (Streptomyces parvulus), que são disponíveis a . um nível comercial, segurança, e tem uma alta atividade de enzima, pode ser usada.

Como a atividade da colagenase acima mencionada, a atividade ] 10 específica relativa ao peso do colágeno no gel de colágeno é importante pre- ' ferivelmente do que a atividade por peso unitário de colagenase, e a ativida- ] de por volume unitário de uma solução aquosa de colagenase. A atividade . específica da colagenase a ser usada para dissolução de gel de colágeno (atividade de colagenase/peso de colágeno) é preferivelmente não menor do que0,1U/mg. Quando a atividade específica da colagenase é menor do que 0,1 U/mg, a dissolução do gel de colágeno pode não preferivelmente levar muito tempo, ou o gel pode não preferivelmente ser dissolvido insuficiente- mente. Ele está mais preferivelmente dentro da faixa de 0,1 — 10.000 U/mg, preferivelmente adicionalmente 1 — 3.000 U/mg.

No método de produção da camada de célula da presente in- venção, um método de atuar colagenase no gel de colágeno não é particu- larmente limitado. Uma solução de colagenase preparada usando, como um solvente, um meio ou uma solução isotônica tendo uma capacidade de tam- ponamento, pode ser adicionada a um meio, ou um gel de colágeno fixado na célula destacado de um prato de cultura de célula pode ser imerso na solução de colagenase antes mencionada. Desde que uma transcavidade é usada como um substrato de cultura de célula na presente invenção, uma camada de gel de colágeno pode ser exposta por recuperação de um inserto e remoção da membrana no fundo do inserto, e o gel de colágeno exposto é preferivelmente imerso diretamente na solução de colagenase acima men- cionada.

No método de produção da camada de célula da presente in-

i 14/34 venção, o tempo de dissolução do gel de colágeno por colagenase não é - particularmente limitado. Quando o tempo de ação da colagenase é muito longo, as funções da célula, tais como capacidade de adesão, capacidade , proliferativa, e similares, podem ser não preferivelmente degradadas. En- ' quanto que o tempo de dissolução por colagenase é submetido à mudança devido à atividade específica de colagenase, temperatura, a forma de gel de colágeno, método de tratamento de colagenase, e similares, ele é geralmen- te 15 min - 60 min. O tratamento de colagenase pode ser um tratamento úni- co ou tempos plurais realizados. ' 10 A temperatura durante o tratamento de gel de colágeno por co- , lagenase no método de produção da camada de célula da presente invenção : é preferivelmente ajustada dentro de uma faixa de 10 - 42ºC, mais preferi- : velmente 30 - 40ºC, ainda preferivelmente 36 - 38ºC, visto que a fluidez do citoplasma da célula geralmente diminui, e a capacidade metabólica diminui quando a temperatura dentro dos organismos vivos torna-se não mais do que 10ºC (cerca de 30ºC em humano), a proteína é desnaturada, e a função da célula diminui quando a temperatura excede 42ºC, e a temperatura ótima de colagenase é, em sua maioria, 37ºC, e a temperatura abaixo deste nível prolonga o tempo de dissolução.

No método de produção de camada de célula da presente in- venção, quando a dissolução de gel de colágeno procede, a camada de cé- lula é gradualmente destacada do gel, e finalmente liberada na solução de colagenase. Para recuperar a camada de célula, a camada de célula pode | ser mecanicamente destacada do gel remanescente, ou pode ser recupera- da após dissolução completa do gel. Enquanto que o destacamento mecâni- co encurta o tempo até a recuperação da camada de célula, visto que a ca- mada de célula pode ser destruída, ela é preferivelmente recuperada após dissolução completa do gel.

Enquanto que a camada de célula recuperada conforme men- cionado acima pode ser diretamente usada para várias aplicações, visto que a colagenase residual pode inibir a adesividade entre a camada de células ou adesividade a um tecido, ela é preferivelmente lavada com um meio ou uma solução isotônica tendo uma capacidade de tamponamento. A tempera- - tura durante limpeza pode ser determinada de acordo com o tratamento de dissolução de gel de colágeno por colagenase. Para remover suficientemen- É te colagenase residual, a camada é preferivelmente lavada uma ou mais ve- zescom um meio ou uma solução isotônica tendo uma capacidade de tam- ponamento. Na camada de célula obtida pelo método da presente invenção, citocina específica a uma célula epitelial de pigmento retinal é secretada com a polaridade similar àquela nos organismos vivos, e resistência elétrica tran- Ú 10 sepitelial (TER) a ser um índice de ligação de adesão fechada entre células - elevadas nos organismos vivos. Portanto, ela tem uma função de barreira de : camada de célula similar àquela nos organismos vivos. De acordo com o . método da presente invenção, uma camada de célula tendo funções simila- res àqueles organismos vivos pode ser obtida.

Na camada de célula obtida pelo método da presente invenção, uma junção hermética é formada entre as células epiteliais de pigmento reti- nal, e uma membrana base é formada em uma face de contato com o gel de colágeno. No presente relatório descritivo, a “membrana base" é uma mem- brana formada a partir dos componentes produzidos de células epiteliais de pigmento retinal, e significa uma membrana contendo pelo menos uma parte do componente da membrana base (daqui por diante para ser referida como uma “membrana base de células epiteliais de pigmento retinal”). A membra- na base da célula epitelial de pigmento retinal em organismos vivos está presente como uma película delgada entre uma camada de célula epitelial de pigmento retinal e uma camada interna de colágeno que constitui a mem- brana de Bruch, e é uma matriz extracelular tendo colágeno Tipo IV, laminin, heparan sulfato proteoglican (perlecan), nidogen, e similares, como compo- nentes representativos. A membrana de Bruch é uma película delgada entre a camada de célula epitelial de pigmento retinal e coróide, e tem uma estru- turade5 camadas de uma membrana base de células epiteliais de pigmento retinal, uma camada interna de colágeno, uma camada de elastina, uma ca- mada externa de colágeno, e uma membrana base de lâmina capilar de co-

róide. A camada de célula da presente invenção contém uma parte (mem- - brana base de célula epitelial de pigmento retinal) da estrutura da membrana de Bruch. A formação da junção hermética pode ser confirmada por obser- ] vação de forma de célula aderida intimamente hexagonalmente moldada, e expressão de occludin, ZO-1, e similares, entre células por imunocoloração. A formação da membrana base pode ser confirmada por observação de ex- pressão de marcadores de membrana base, tais como laminin, heparan sul- fato proteoglican (perlecan), nidogen, ou colágeno Tipo IV, e similares, em uma superfície de célula por imunocoloração, ou observação com um mi- croscópio de elétron de varredura.

- Geralmente, as células epiteliais de pigmento retinal cultivadas ] em um prato de cultura produzem componentes de membrana base, mas é ' extremamente difícil destacar as células na forma de uma camada de célula epitelial de pigmento retinal utilizável destacada de um prato de cultura (In- vest. Ophthalmol. Vis. Sci., 36(2), 1995, 381-390). De acordo com o método da presente invenção, as células epiteliais de pigmento retinal juntas com uma membrana base produzida de células epiteliais de pigmento retinal po- dem ser recuperadas como uma camada sem utilizar uma membrana artifi- cial. Desde que as células epiteliais de pigmento retinal formam uma estrutu- rade camada única, quando elas são manuseadas unicamente, a estrutura de camada é desintegrada, e as células são difundidas em unidades de célu- la. Desse modo, o transplante destas como uma camada é extremamente difícil. Por outro lado, desde que a camada de célula da presente invenção acompanha uma membrana base e tem rigidez suficiente, ela não é facil- mente encolhível durante recuperação, que torna o manuseio desta extre- mamente fácil. Consequentemente, visto que a montagem em um dispositivo de transplante de célula e uma operação de transplante pode ser realizada suavemente, o transplante de célula pode ser realizado com invasão míni- ma, e ambos o efeito e a prognose são esperados serem aperfeiçoados. Em adição, desde que a camada de célula acompanha uma membrana base, é extremamente vantajoso para transplante em uma doença no qual a mem- brana base é simultaneamente desordenada. Por exemplo, degeneração macular relacionada à idade, às vezes, acompanha distúrbio de membrana - de Bruch. A membrana base na camada de célula da presente invenção compensa a parte desordenada, pelo que a taxa de enxerto da camada de Í célula pode ser aperfeiçoada, e um efeito de tratamento deste pode também ser esperado. Consequentemente, a camada de célula da presente invenção é preferível como uma camada para transplante tendo como alvo uma doen- ça com uma membrana base desordenada, e pode ser preferivelmente utili- zada como uma camada para transplante particularmente tendo como alvo degeneração macular relacionada à idade. O método de produção da camada de célula da presente inven- - ção pode conter adicionalmente a seguinte etapa (3): : (3) confirmação da presença ou ausência de uma membrana ' base na superfície de contato entre a camada de célula destacada e o gel de colágeno.

Na etapa (3), a formação de uma camada de célula tendo uma camada de célula composta de células epiteliais de pigmento retinal e uma membrana base pode ser determinada por confirmação da presença ou au- sência da membrana base da camada de célula. A presença ou ausência da membrana base pode ser confirmada por um método similar à confirmação antesmencionada da formação da membrana base, por exemplo, expressão de um marcador de membrana base, observação com um microscópio de elétron de varredura, e similares. Para detecção da membrana base, a ex- pressão de um marcador de membrana base pode ser confirmada em qual- quer local da célula (por exemplo, citoplasma, membrana celular, membrana nuclear, e similares). Preferivelmente, um marcador expresso em uma face de contato com gel de colágeno é objetivado.

O marcador de membrana base no presente relatório descritivo inclui um produto de transcrição, um produto de translação, ou um produto de degradação de um gene especificamente expresso na membrana base.

Exemplos de tal gene inclui laminin, heparan sulfato proteoglican (perlecan), nidogen, colágeno Tipo IV, e similares. Destes, laminin, colágeno Tipo IV, e similares, que são componentes principais da membrana base, são preferi-

i 18/34 velmente usados. ' - Uma amostra a ser usada para “confirmação da presença ou au- sência de uma membrana base na superfície de contato entre a camada de ] célula destacada e o gel de colágeno” não é particularmente limitada, consi- derando-se que ela contém um marcador de membrana base (por exemplo, RNA, proteína, produto de degradação destes, e similares) derivada a partir da camada de célula (ou célula) destacada na etapa (2). A expressão do gene do marcador de membrana base quando a amostra acima mencionada é RNA pode ser examinada por preparação de uma fração de RNA (por exemplo, RNA total, MRNA) a partir da célula da , camada de célula destacada na etapa (2), e detecção de um produto de ' transcrição do gene do marcador contido na fração, ou diretamente detec- : tando um produto de gene de marcador na célula sem extração de RNA a partir da célula.

Quando uma fração de RNA (por exemplo, RNA total, mMRNA) é preparada a partir da célula, ela pode ser preparada usando um método co- nhecido, tais como método de ultracentrifugação de guanidina-CsCl, método de AGPC, e similares. Usando-se um kit de extração de RNA comercialmen- te disponível (por exemplo, Kit RNeasy Mini; manufaturado por QIAGEN etc), RNA total com alta pureza pode ser preparado rapidamente e conveni- entemente de uma quantidade de traço de uma amostra. Exemplos do mé- todo para detecção de um produto de transcrição de um gene de marcador de membrana base em uma fração de RNA inclui um método usando hibridi- zação (Northernblot, mancha de ponto, análise de chip de DNA, etc.), um método usando PCR (RT-PCR, PCR competitivo, PCR de tempo real, etc.), e similares. Métodos de PCR quantitativos, tais como PCR competitivo, PCR de tempo real, e similares, são preferíveis, visto que variação de expressão de um gene de marcador de membrana base pode ser detectada rapidamen- te e convenientemente de uma quantidade de traço de uma amostra, e aná- lisede chipde DNA é preferível, visto que variação de expressão de genes de marcadores plurais pode ser coletivamente detectada, e desempenho de quantificação pode também ser aperfeiçoado por seleção de um método de detecção, e similares.

Quando Northernblot ou hibridização de mancha por ponto é empregada, o gene de marcador de membrana base pode ser detectado ' usando um ácido nucleico (sonda) capaz de hibridizar com um produto de transcrição do gene.

Exemplos de tal ácido nucleico incluem ácido nucleico capaz de hibridizar com um produto de transcrição de um gene de marcador de membrana base sob altas condições estringentes.

Exemplos das “altas condições estringentes” incluem reação de hibridização a 45ºC em 6xSSC (cloreto de sódio/citrato de sódio), seguido por lavagem uma vez ou mais a 65ºC em 0,2x8SSC/0,1% de SDS, e similares.

Aqueles técnicos no assunto R podem facilmente se ajustar a uma estringência desejada por mudança a- ] propriadamente da concentração de sal de uma solução de hibridização, . temperatura de reação de hibridização, concentração da sonda, comprimen- to da sonda, número de incompatibilidade, tempo de reação de hibridização, concentração de sal de lavagem, temperatura de lavagem, e similares.

O ácido nucleico pode ser DNA, RNA ou DNA/RNA quimera, com preferência dada ao DNA.

O ácido nucleico a ser usado como uma sonda pode ser de tran- çado duplo ou de trançado único.

Quando de trançado duplo, ele pode ser DNA de trançado duplo, RNA de trançado duplo, ou híbrido DNA:RNA.

Quando de trançado único, uma trança de anti sentido pode ser usada.

En- quanto que o comprimento do ácido nucleico não é particularmente limitado considerando-se que ele pode especificamente hibridizar com o ácido nucle- ico-alvo, ele é, por exemplo, não menor do que cerca de 15 bases, preferi- velmente não menor do que cerca de 30 bases.

Para capacitar a detecção e quantificação do ácido nucleico-alvo, o ácido nucleico é preferivelmente eti- quetado.

Exemplos da etiqueta incluem radioisótopo, enzima, substância fluorescente, substância de luminescência, e similares.

Exemplos do radioi- sótopo incluem [º?P], [PH], [C], e similares.

Como a enzima, uma enzima estável tendo uma alta atividade específica é preferível, por exemplo, B- galactosidase, B-glucosidase, fosfatase alcalina, peroxidase, ácido mélico dehidrogenase, e similares.

Exemplos da substância fluorescente incluem fluorescamina, fluoresceína isotiocianato, e similares.

Exemplos da substân- : cia de luminescência incluem luminol, derivado de luminol, luciferin, lucige- nin, e similares.

Além disso, biotin-(strept)avidin pode também ser usado Ú para ligação de uma sonda e uma etiqueta.

Quando hibridização de Northern é empregada, uma fração de RNA preparada conforme mencionado acima é separada por eletroforese de gel, transferida a uma membrana de nitrocelulose, nylon, difluoreto de polivi- nilideno, e similares, hibridizada com as “altas condições estringentes” acima mencionadas em um tampão de hibridização contendo uma sonda de etique- tação preparada conforme mencionado acima, e a quantidade da etiqueta - ligada à membrana é medida para cada faixa por um método adequado, pelo Ú que o nível de expressão de cada gene de marcador de membrana base . pode ser medido.

Também no caso de mancha por ponto, uma membrana manchada com uma fração de RNA é submetida a uma reação de hibridiza- ção similar (realizada para cada gene de marcador), e a quantidade da eti- queta na mancha é medida, pelo que o nível de expressão de cada gene de marcador pode ser medido.

Quando análise de chip de DNA é empregada, por exemplo, o CDNA introduzido com um promotor adequado, tal como promotor T7, e simi- lares, por uma reação de transcrição reversa, é sintetizado de uma fração de RNA preparada como mencionado acima, o cRNA é sintetizado usando RNA polimerase (neste caso, cRNA etiquetado é obtido pelo uso de um mononu- cleotídeo etiquetado com biotin e similares, como um substrato). O cRNA etiquetado é contatado com um chip tendo a sonda imobilizada deste acima mencionada para realizar uma reação de hibridização, e a quantidade da etiqueta ligada com cada sonda na fase sólida é medida, pelo que o nível de expressão de cada gene de marcador de membrana base pode ser medido.

Este método é vantajoso em termos de rapidez e conveniência conforme o número dos genes de marcador diferenciado detectado (portanto, sondas a serem de fase sólida) aumenta.

Por outro lado, quando um gene de marcador é detectado sem extração de RNA a partir da célula, hibridização in situ pode ser usada como o meio de detecção. Neste método, a célula é imobilizada por tratamento da - célula com um agente de fixação, preferivelmente, um agente de fixação de precipitação, por exemplo, acetona, ou incubando a célula por um curto tem- po em uma solução de formaldeído de tamponamento, ao invés de extração deRNA a partirda célula. Após imobilização, a célula é embebida em para- fina para formar um bloco, e um corte em fatia desta pode ser usado como É uma amostra. Uma amostra embebida de parafina bem preparada pode ser preservada à temperatura ambiente por muitos anos. Como ácido nucleico a : ser usado como uma sonda, aquele similar aos exemplos acima menciona- , 10 dos pode ser usado. A hibridização in situ é preferivelmente usada na pre- - sente invenção, visto que expressão de um marcador de membrana base na Ú superfície de contato entre a célula e gel de colágeno pode ser diretamente : confirmada. Alternativamente, a expressão de um marcador de membrana base na camada de célula destacada na etapa (2) pode ser confirmada por preparação de uma fração de proteína a partir da camada de célula (ou célu- la), e detecção de um produto de translação (isto é, marcador de proteína) do gene de marcador contido na fração, ou diretamente detectando um pro- duto de translação do gene de marcador na camada de célula (ou célula), sem extração da proteína a partir da camada de célula (ou célula). Um mar- cador de proteína pode ser detectado por um método de medição imunológi- co (por exemplo, ELISA, FIA, RIA, Western blot etc.) usando um anticorpo para cada proteína e, no caso de uma proteína mostrando uma atividade fisiológica mensurável, tal como uma enzima e similares, ela pode ser detec- ' 25 tada por medição da atividade fisiológica de cada marcador de proteína por um método conhecido. Alternativamente, um marcador de proteína pode também ser detectado por um método de espectrometria de massa, tal como MALDI-TOFMS, e similares.

Um anticorpo para cada marcador de proteína pode ser obtido - de acordo com um anticorpo policlonal geralmente usado, ou técnica de pro- dução de anticorpo monocional e usando um marcador de proteína ou prote- ina, ou um peptídeo parcial deste como um antígeno de imunização.

Quando respectivos métodos de medição imunológicos são apli- . cados ao método de exame da presente invenção, ajuste de condições es- peciais, operações e similares, não são necessários.

Um sistema de medi- ] ção da proteína do marcador de membrana base pode ser construído pela adiçãode consideração de técnica geral daqueles técnicos no assunto para condições gerais e métodos de operação em cada método.

Como para o detalhe destas técnicas gerais, meios, compêndio, livros e similares, podem ser referidos.

Por exemplo, “Radioimmunoassay”" editado por Hiroshi Irie : (Kodansha, publicado em 1974), “cont.

Radioimmunoassay” editado por Hi- roshi Irie (Kodansha, publicado em 1979), “Enzyme Immunoassay” editado - por Eiji Ishikawa et al. (Igaku-Shoin, publicado em 1978), “Enzyme Immuno- Ú assay” editado por Eiji Ishikawa et al. (2º edição) (Igaku-Shoin, publicado em . 1982), “Enzyme Immunoassay” editado por Eiji Ishikawa et al. (3º edição) (Igaku-Shoin, publicado em 1987), “Methods in ENZYMOLOGY", Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Parte A)), ibidem, Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Parte B)), ibidem, Vol. 74 (Immunochemíical Techniques (Parte C)), ibidem, Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Parte D: Selected Immu- noassays)), ibidem, Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Parte E: Mono- clonal Antibodies and General Immunoassay Methods)), ibidem, Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Parte |: Hybridoma Technology and Mono- clonal Antibodies)) (todos publicados por Academic Press) e similares, po-

dem ser referidos.

A presente invenção também refere-se a uma camada de célula obtida de acordo com o método de produção de camada de célula antes mencionado, preferivelmente, uma camada de célula para transplante, com- preendendo uma camada de célula formada de células epiteliais de pigmen- to retinal obtida por indução de diferenciação ex vivo, e uma membrana ba- se.

A camada de célula epitelial de pigmento retinal da presente invenção é preferível como um material de transplante para o tratamento retinal de paci- entes com doenças oftálmicas.

Exemplos da doença oftálmica incluem do- enças degenerativas retinais, tals como doença de degeneração macular | relacionada à idade, retinite pigmentosa, retinopatia diabética, descolamento de retina, e similares.

Desde que a camada de célula da presente invenção ' contenha uma membrana base, ela pode ser transplantada com uma alta taxa de enxerto para uma doença envolvendo simultaneamente membrana Ú de Bruch desordenada.

Em adição, desde que a camada de célula epitelial de pigmento retinal da presente invenção tenha uma membrana base produ- zida de componentes similares àqueles em organismos vivos, ela pode tam- bém ser utilizada para várias propostas de classificação, tais como classifi- cação de eficácia, avaliação de toxicidade, e similares, nas doenças oftálmi- : cas antes mencionadas.

Para a classificação de eficácia para as doenças —oftálmicas antes mencionadas, por exemplo, a camada de célula da presen- - te invenção pode ser aplicada para classificação de uma substância tendo Ú eficácia para as doenças oftálmicas antes mencionadas, de acordo com o BR método descrito em JP-A- 2007-500509. Para ser específico, a camada de célula da presente invenção é cultivada na presença ou ausência de uma substância candidata tendo eficácia sob as condições de estresse possivel- mente causando as doenças oftálmicas antes mencionadas (por exemplo, luz (por exemplo, luz branca, luz azul; luz que induz morte de células reti- nais, particularmente células fotorreceptoras, e pode ser um fator de incita- ção de degeneração macular), A2E [retinóide N-retinilideno-N-retinil- etanolamina] (acúmulo de AZE é considerado contribuir para neurodegene- ração relacionada à idade de células retinais, particularmente expressão de degeneração macular), agregado de fumo de cigarros (fumo é considerado ser um fator de risco de degeneração macular), pressão externa (por exem- plo, pressão hidrostática; aumento na pressão intraocular é suspeitado estar envolvido em glaucoma), e avaliação pode ser realizada baseado no número de fotorreceptor que expressa rodopsina, e por imunocoloração usando anti- corpo anti-caspase 3. Para avaliação da toxicidade, a camada de célula da presente invenção pode ser aplicada para classificação de uma substância tóxica de acordo com o método descrito em JP-A- 2007-517210. Para ser específico, a camada de célula da presente invenção é cultivada na presen- ça ou ausência de uma substância candidata de toxicidade, e usando o pep- tídeo marcador integrin descrito em JP-A- 2007-517210, excitado com um i 24/34 laser em um comprimento de onda de 488 nm, e a fluorescência a 520 nm é detectada para avaliação.

Além disso, a camada de célula epitelial de pig- " mento retinal da presente invenção pode também ser utilizada como um mo- : delo in vitro para a avaliação de várias funções in vivo de célula epitelial de pigmento retinal, tal como a função relacionada a manutenção de células visuais, tal como capacidade fagocítica de segmento externo de fotorrecep- ' tor, ação neuroprotetora e similares, função de barreira de vaso sanguíneo retinal, tais como ação de bombeio, junção hermética, e similares. : A camada de célula para transplante da presente invenção pode serusada para o tratamento das doenças acima mencionadas em humano e - mamíferos outros do que humano (por exemplo, macaco, camundongo, rato, cão, bovino, cavalo, suíno, ovelha, cabra, gato, coelho, hamster, porquinho- BR da-índia, etc.). A faixa da área da doença a qual a camada de célula para transplante da presente invenção pode ser aplicada é apropriadamente de- terminada dependendo da doença-alvo, da espécie de animal, idade, sexo, peso corpóreo e sintoma de administração objeto, e similares.

A camada de célula para transplante da presente invenção pode ser transplantada imediatamente, ou em várias porções.

O número de apli- cação de transplante é determinado pelos profissionais de cuidado de saúde de acordo com a doença e a orientação.

Por exemplo, quando a doença é doença de degeneração macular relacionada à idade, a camada de célula para transplante da presente invenção pode ser transplantada duas ou mais vezes, dependendo da severidade da mesma.

Quando transplante é realiza- do várias vezes, o intervalo não é particularmente limitado, e um período de vários dias a várias semanas pode ser colocado.

A camada de célula para transplante da presente invenção é transplantada pelos profissionais de cuidado de saúde de acordo com um método de transplante apropriado de acordo com a orientação.

Quando a camada de célula para transplante da presente invenção é transplantada sob a retina, um método de transplante incluindo distribuição da camada em um fluxo de água de uma agulha de injeção de punção, até o local de transplan-

te sob a retina do globo ocular, pode ser empregado, ou um aparelho tera- - pêutico exclusivo para transplante pode também ser usado. Exemplos ' A presente invenção é explanada em mais detalhe em seguida por referência a Exemplos, que são meras exemplificações e não limitam o escopo da presente invenção de qualquer modo. Exemplo de Produção 1. Preparação de células epiteliais de | pigmento retinal Como as células epiteliais de pigmento retinal a serem usadas ' 10 para cobertura no seguinte Exemplo 1, foram usadas células epiteliais de . pigmento retinal maturas (253G1, K11PD2, 59M8, 59SV2, 59SV3, 59SV9, ' 46a, K21EV15, 101EV3, KI11EV9, 454E2), obtidas por indução de diferenci- ' ação de célula iPS, e células epiteliais de pigmento retinal (nES, CMKS6), ob- tidas por indução de diferenciação de célula ES, de acordo com o método descrito em Neuroscience Letters 458 (2009) 126-131. Células epiteliais de pigmento retinal derivadas de iPS humano 253G1 é uma célula epitelial de pigmento retinal obtida por indu- ção de diferenciação de célula iPS humana derivada de um humano saudá- vel, e KI1PD2 e 59M8 são células epiteliais de pigmento retinal induzidas a diferenciar de células iPS humanas derivadas de pacientes de retinite pig- mentosa diferentes entre si. As células iPS foram estabelecidas por um mé- todo incluindo introdução de genes Oct3/4, Sox2, KIf4 e c-Myc em fibroblas- tos derivados de pele humana usando retrovírus, de acordo com o método descrito em Cell 131, 861-872, 2007. 59SV2, 59SV3 e 59SV9 são células epiteliais de pigmento retinal obtidas por indução de diferenciação de células iPS humanas derivadas a partir do mesmo paciente de retinite pigmentosa. As células iPS foram esta- belecidas por um método incluindo introdução de Oct3/4, Sox2, KIf4 e c-Myc em fibroblastos derivados de pele humana pelo uso de vírus Sendai, de a- cordo com o método descrito em Proc. Jpn. Acad., Ser. B 85 (2009) 348-

362. K21EV15, 101EV3, KI1EV9 e 454E2 são células epiteliais de pigmento retinal obtidas por indução de diferenciação de células iPS huma- ' . nas derivadas de pacientes de retinite pigmentosa diferentes entre si.

As células iPS foram estabelecidas por um método incluindo introdução de ' Oct3/4, Sox2, KIf4, L-Myc e LIN28 humano em fibroblastos derivados de pele ' humana pelo uso de vetor epissomal, de acordo com o método descrito em Nat Methods. 2011 May; 8(5): 409-12). Células epiteliais de pigmento retinal derivadas de iPS de maca- co : 46a é uma célula epitelial de pigmento retinal obtida por indução : 10 de diferenciação de célula iPS de macaco (macaco cynomolgus), de acordo - com o método descrito em Jpn.

J.

Transplant. 44, 231-235. : Células epiteliais de pigmento retinal derivadas de ES . hES é uma célula epitelial de pigmento retinal obtida por indução de diferenciação de linha de célula ES humana khES-1. CMK6 é uma célula epitelial de pigmento retinal obtida por indução de diferenciação de célula ES de macaco, de acordo com o método descrito em Neuroscience Letters 458 (2009) 126-131. Exemplo 1. Método de produção de camada de célula epitelial de pigmento retinal Preparação de solução misturada do gel de colágeno A: Colágeno Tipo | solúvel em ácido derivado de tendão de suí- no Cellmatrix |-A (Nitta Gelatin, 3,0 mg/ml), B: meio de cultura concentrado em concentração 5 vezes [DMEM/F12 (Invitrogen, 12500-062, 3 g) foi dis- solvido em MIilliQ water, e o volume total (50 ml) foi tratado em filtro), e C: tampão para reconstituição [NíAOH 1N (50 mM, 5 m!), NaHCO; (260 mM, 2,2 g) e HEPES (200 mM, 4,77 g) foram dissolvidos em MÍilliQ water, e o volume total (100 ml) foi tratado em filtro] foram preparados.

Sob resfriamento, B (2 vol) foi misturado (amarelo pálido) com A (7 vol) sem borbulhamento.

Em seguida, C (1 vol) foi adicionado, e a mistura foi mesclada (rosa pálido) para dar0,21% de solução misturada do gel de colágeno.

Preparação de camada de célula epitelial de pigmento retinal O 0,21% de solução misturada do gel de colágeno (200 ul) foi

. 27/34 adicionado no inserto de um inserto de transcavidade de 12 mm (membrana - de Poliéster de Poro de 0,4 um; Cornig, 3460), e a mistura foi incubada a : 37ºC por 30 min.

Em seguida, F10-10% de FBS [F-10 (Sigma, N6908, 445 ' ml), FBS (50 ml), Penicilina-Estreptomicina (Invitrogen, 15140-122, 5 ml)] foi adicionado por 1500 ul ao lado exterior do inserto, e 500 ul ao lado interior do inserto, e a transcavidade foi incubada a 37ºC por 24 horas.

Em seguida, os lados interior e exterior do inserto foram lavados uma vez com F10-10% de FBS, respectivas células epiteliais de pigmento retinal obtidas no Exem- plo de Produção 1 foram semeadas a 5x10º células (F10-10% de FBS, 500 : 10 ul)nolado interior do inserto, e F10-10% de FBS (1500 ul) foi adicionado ao . lado exterior do inserto.

As células epiteliais de pigmento retinal foram culti- o vadas em F10-10% de FBS até confluência.

Após alcançar confluência, o : . meio foi mudado para SFRM-B27 (DMEM (Sigma, D6046, 350 ml), F12 HAM (Sigma, N6658, 150 ml), B27 (Invitrogen, 17504-044, 10 ml), 200 mM de L- Glutamina (Sigma, G7513, 5 ml), Penicilina-Estreptomicina (lInvitrogen, 15140-122, 5 ml), bFGF (wako, 060-04543, 10 ng/ml)) (1500 ul ao lado ex- terno do inserto, 500 ul ao lado interior do inserto, a mudança de meio foi 3 vezes/semana), e as células epiteliais de pigmento retinal foram cultivadas até que elas mostrem cor e forma adequada.

Corte Após progresso por 6 semanas a partir do início da cultura, a membrana do inserto foi removida, colagenase L (Nitta Gelatin, PBS(+): Sigma, 2600 U/ml, 100 ul) foi adicionada sob o inserto, e o inserto foi incu- bado a 37ºC por 60 min, e lavado 3 vezes com PBS(+). SFRM-B27 foi adi- cionado gota a gota de modo que a camada de célula epitelial de pigmento | retinal não ficaria seca e cortada em um tamanho desejado com PALM Mi- croBeam (ZEISS). Exemplo 2. Método de produção de camada de célula epitelial de pigmento retinal (tipo de colágeno) Na mesma maneira como no Exemplo 1, exceto que, na etapa de produção de uma camada de célula usando 253G1 (iPS-células epiteliais de pigmento retinal) no Exemplo 1, (A) colágeno TE Tipo | derivado de pele

] 28/34 de suíno (produto de ordem especial: principalmente contendo colágeno Ti- ' po |, uma pequena a small de colágeno Tipo III, Nitta Gelatin, 5 mg/ml) foi usado como 0,35% de solução misturada com colágeno/cavidade, (B) colá- ' geno T-1002 Tipo | derivado de tendão de suíno (produto de ordem especial: colágeno Tipo |, Nitta Gelatin, 5,1 mg/ml) foi usado como 0,35% de solução misturada com colágeno/cavidade, (C) colágeno | etiquetado com FITC (Chondrex, 1 mg/ml) foi usado como 0,07% de solução misturada com colá- geno/cavidade, (D) colágeno | etiquetado com FITC (ordem especial, Chon- : drex, 3 ma/ml) foi usado como 0,21% de solução misturada com coláge- - 10 —nof/cavidade, (E) atelocolágeno (KOKEN, 3 mg/ml) foi usado como 0,21% de - solução misturada com colágeno/cavidade, e (F) permeabilidade de mem- brana de colágeno para cultura de célula (KOKEN) foi usada, respectiva- . mente, ao invés de colágeno Tipo | solúvel em ácido derivado de tendão de suíno Cellmatrix |-A (Nitta Gelatin, 3 mg/ml) como 0,21% de solução mistu- rada com colágeno/cavidade, camadas de célula foram produzidas e corta- das para dar camadas de célula epitelial de pigmento retinal.

Os resultados do teste do Exemplo 1 e os casos usando cada um dos colágenos antes mencionados foram comparados e avaliados em termos de 4 itens [1. resistência de gel; 2. adesão de célula; 3. crescimento decélula;4. Segurançal. Como um resultado, (A) (1. inferior; 2. equivalente;

3. inferior; 4. bom), (B) (1. bom (5,1 mg/ml); 2. equivalente; 3. inferior; 4. bom), (C) (1. inferior (1 mg/ml); 2. inferior; 3. desconhecido; 4. desconheci- do), (D) (1. equivalente (3 mg/ml); 2. equivalente; 3. inferior; 4. desconheci- do), (E) (1. Equivalente (3 mg/ml); 2. inferior; 3. desconhecido; 4. bom), e (F) (não foi lisado por colagenase, desse modo, não utilizável). Como para a resistência de gel, um certo nível de resistência é requerido para capacitar crescimento de células epiteliais de pigmento retinal. A partir de tal aspecto, tipo particularmente preferível e concentração de colágeno foram o colágeno Tipo !| solúvel em ácido derivado de tendão de suíno Cellmatrix |-A do Exem- plo1,e(B) colágeno T-1002 Tipo | derivado de tendão de suíno usado na concentração acima mencionada. Quando o substrato não tem um certo ní- vel de resistência, epitélio de pigmento retinal não cresce e não pode ser usado para a presente invenção. . Exemplo 3. Método de produção de camada de célula epitelial ' de pigmento retinal (quantidade de colágeno) ' Na mesma maneira como no Exemplo 1, exceto que, na etapa de produção de uma camada de célula usando 253G1 (iPS-célula epitelial de pigmento retinal) do Exemplo 1, a quantidade da solução misturada do gel de colágeno a ser usada foi mudada para 100 ul ou 300 ul de 200 ul, camadas de célula foram produzidas e cortadas, pelo que camadas de célu- : la epitelial de pigmento retinal foram recuperadas.

Conforme comparado ao Exemplo 1, quando a quantidade da - solução misturada do gel de colágeno usada foi 100 ul, uma camada de gel de colágeno delgada foi formada na parte central devido a uma influência da ' tensão superficial causada pela pequena quantidade da solução misturada do gel de colágeno e, à medida que a cultura procede, as células epiteliais de pigmento retinal semeadas diretamente contatadas na membrana de fun- do com facilidade, que causou ruptura da camada de célula epitelial de pig- mento retinal durante uma operação para cortar a camada.

Quando a quan- tidade da solução misturada do gel de colágeno usada foi 300 ul, desde que a quantidade da solução misturada do gel de colágeno foi alta, uma camada degelde colágeno espessa foi formada, que relativamente reduziu a quanti- dade do meio que pode ser retido no inserto, e, portanto, a manutenção de cultura não foi fácil de realizar, tratamento de colagenase leva tempo, e da- nos na camada de célula foram temidos para tornar-se maior.

Quando a quantidade da solução misturada do gel de colágeno usada foi 100 ul, as células diretamente contatam a membrana, e a camada de célula foi rompida de tal parte na remoção da membrana.

Exemplo 4. Método de produção de camada de célula epitelial de pigmento retinal (quantidade de colagenase e tempo de tratamento) Na mesma maneira como no Exemplo 1, exceto que na etapa de produção de uma camada de célula usando 253G1 (célula epitelial de pig- mento retinal iPS) do Exemplo 1, 1% de Colagenase L (Nitta Gelatin) ou co- lagenase Tipo | (Roche), foi contatada com a camada de célula epitelial de pigmento retinal por 10 min em uma quantidade de 10 ul, 20 min em uma - quantidade de 10 ul, 30 min em uma quantidade de 10 ul, 20 min em uma : quantidade de 20 ul, 60 min em uma quantidade de 20 ul, e 50 min em uma ' quantidade de 30 ul, ao invés de 30 min em uma quantidade de 30 ul, as camadas de célula foram produzidas e cortadas, pelo que as camadas de célula epitelial de pigmento retinal foram recuperadas.

Como um resultado, quando um tratamento de colagenase foi realizado por 60 min em uma quantidade de 10 ul ou 60 min em uma quanti- dade de 20 ul, a degradação de colágeno do mesmo nível como com 30 ul : 10 por30minfoi observada. - Exemplo 5. Método de produção de camada de célula epitelial ' de pigmento retinal (número de células semeadas) : Na mesma maneira como no Exemplo 1, exceto que na etapa de produção de uma camada de célula usando 253G1 (célula epitelial de pig- mento retinal iPS) do Exemplo 1, o número das células a serem semeadas dentro do inserto foi mudado para (A) 5x10º de células/500 ul, (B) 1x10º/500 ul ou (C) 1x108º/500 ul de 5x10º de células/500 ul, camadas de célula foram produzidas e cortadas, pelo que camadas de célula epitelial de pigmento retinal foram recuperadas.

Conforme comparado ao Exemplo 1, (A) e (B) requerem um tempo mais longo para alcançar confluência de célula devido ao pequeno número de células, e (C) mostra baixo crescimento e também tende a reque- rer um tempo mais longo para alcançar confluência de célula.

Exemplo 6. Membrana base formada na camada de célula epite- lialde pigmento retina! Uma crio seção (seção congelada) foi produzida a partir da ca- mada de célula produzida de 253G1 (célula epitelial de pigmento retinal iPS) no Exemplo 1, e submetida a coloração imunohistoquímica. A formação de uma junção hermética foi confirmada pela expressão de ZO-1, e formação deuma membrana base foi confirmada pela expressão de laminin e coláge- | no Tipo IV. Para detecção de cada proteína, respectivos anticorpos de coe- lho anti-ZO-1 manufaturados por Zymed (diluição 1:100), laminin de coelho manufaturado por Abcam (diluição 1:200), e anticorpo de colágeno tipo IV - anti-humano de camundongo manufaturado por Calbiochem (1:40), foram 2 usados.

Além disso, a camada de célula epitelial de pigmento retinal foi con- ' firmada para ter uma forma epitelial de camada única a partir do estado de coloração nuclear usando 4',6-diamidino-2-fenillindole manufaturado por Mo- lecular Probes (DAPI; 1 ug/ml). Avaliação 1. Perfil de expressão de gene específico epitelial de pigmento retina! de camada de célula Na etapa. de produção de uma camada de célula de 59SV3, . 10 59SV9 (células epiteliais de pigmento retinal iPS) no Exemplo 1, a expressão . de BEST1, RPE65, MERTK, CRALBP nas células que constituem as cama- Ú das após lapso de 1 semana, 4 semanas, 2 meses, em que o dia quando o meio foi mudado para SFRM-B27 após confluência de célula foi dia O, foi confirmado por RT-PCR.

Como um resultado, a expressão do mesmo nível conforme aquele do controle positivo (RNA total de célula epitelial de pig- mento retinal humana (manufaturado por ScienCell, Cat NO. 6545)), foi ob- servada.

Aqui, BEST1, RPE65, MERTK são genes especificamente expres- sos em células epiteliais de pigmento retinal.

CRALBP é um gene expresso em células epiteliais de pigmento retinal e células Muller.

Avaliação 2. Medição de colágeno residual em camada epitelial : de pigmento retinal Crio seções (seção congelada) foram produzidas por corte, an- tes e após tratamento de colagenase, de respectivas camadas de célula produzidas de 253G1 (célula epitelial de pigmento retinal iPS) no Exemplo 1, e submetidas a coloração de imunohistoquímica.

O núcleo foi manchado com 4',6-diamidino-2-fenillindole (DAPI; 1 pg/ml) manufaturado por Molecu- lar Probes, e Colágeno tipo 1 foi manchado com anticorpo de colágeno tipo | anti-humano de coelho (diluição 1:40) manufaturado por Calbiochem.

Como um resultado, o colágeno não foi detectado a partir das camadas após o tra- tamento de colagenase, e foi confirmado que colágeno removido de colage- nase revestiu o prato de cultura.

Por outro lado, o colágeno foi detectado das camadas cortadas antes do tratamento de colagenase.

: 32/34 Avaliação 3. Capacidade de secreção de citocina de camada de . célula epitelial de pigmento retinal : Os meios de cultura no lado Apical e no lado Basal na transcavi- ' dade foram recuperados antes da etapa de corte das camadas de célula epi- telial de pigmento retinal a partir das camadas de célula produzidas de 253G1 (célula epitelial de pigmento retinal iPS) e 454E2 (célula epitelial de pigmento retinal iPS) no Exemplo 1, e as quantidades de produção de VEGF e PEDF foram detectadas por ELISA de acordo com o método descrito em Arvydas M, IOVS. 2006; 47: 3612-3624. Como um resultado, foi confirmado : 10 que, similar ao epitélio de pigmento retinal derivado de embrião humano re- . portado em Arvydas M, IOVS. 2006; 47: 3612-3624, VEGF foi principalmente ' secretado no lado Basal, e PEDF foi principalmente secretado no lado Apical : (Fig. 1). Foi mostrado que a camada de célula da presente invenção tem capacidade secretória de citocina similar àquela nos organismos vivos, e é superior em funcionalidade.

Avaliação 4. Resistência elétrica transepitelial de camada de cé- lula epitelial de pigmento retinal Uma forte correlação é vista entre a função de barreira de uma camada de célula e impedância, a saber, resistência elétrica transepiteli- alitransendotelial (TER). Uma sonda foi colocada no meio dentro e fora do inserto, de acordo com o método descrito por MILLIPORE (usando Millicel! ERS-2), antes da etapa de corte da camada de célula epitelial de pigmento retinal produzida de 454E2 (célula epitelial de pigmento retinal iPS) no E- xemplo 1, e TER foi eletricamente medida.

Como um resultado, TER foi 6400-cm?, e mostrou um alto valor de TER similar ao epitélio de pigmento retinal derivado de embrião humano reportado em Nature Protocols vol 4, No 5 662-673 (2009), Fig 10. Foi mostrado que a camada de célula da presente invenção tem uma alta função de barreira similar àquela em organismos vi- vos.

Avaliação 5. Transplante de camada de célula epitelial de pig- mento retinal derivada de célula ES de macaco Uma camada de célula epitelial de pigmento retinal de macaco produzida de células epiteliais de pigmento retinal derivadas de célula ES de . macaco, CMK6 no Exemplo 1 foi transplantado em um olho de macaco de ? acordo com o método descrito em Invest Ophthalmol Vis Sci. 1995 Feb; Ú 36(2): 381-90. Antes do transplante, fotocoagulação retinal foi realizada para distúrbio da retina do olho a ser submetida a transplante.

No dia 28 a partir do transplante no interior do olho do macaco tendo mácula de fotocoagula- ção retinal formada neste, fotografias do fundo do olho foram tomadas, e imagens das seções do fundo ocular foram produzidas como seções histoló- : gicas pelo uso de OCT (Optical coherence tomograph), baseado nas quais a : 10 condição da retina foi confirmada.

Como um resultado, nenhum vazamento - de fluorescência foi verificado por angiografia de fluoresceína, o enxerto so- ' breviveu, e um distúrbio, tais como adelgaçamento de retina sensorial e simi- lares, não foram verificados.

Avaliação 6. Transplante de camada de célula epitelial de pig- mento retinal derivada de célula iPS de macaco Uma camada de célula epitelial de pigmento retinal de macaco produzida de células epiteliais de pigmento retinal derivadas de célula iPS de macaco, 46a no Exemplo 1, foi transplantada sob a retina de um olho para transplante autólogo, e três olhos para transplante cruzado de acordo com o método descrito em Invest Ophthalmo!l Vis Sci. 1995 Feb; 36(2): 381-90. Até um ano pós-transplante, fotografias do fundo do olho foram tomadas, e ima- gens das seções de fundo ocular foram produzidas como seções histológi- cas pelo uso de OCT (Optical coherence tomograph), baseado nas quais a condição da retina foi observada com o lapso de tempo.

No transplante cru- —zado,reações de rejeição claras, tais como mudanças fibrosas na periferia do enxerto, vazamento de fluorescência por angiografia de fluoresceína, e lesão de alto brilho sob a retina por OCT, foram verificados.

Por outro lado, em transplante autólogo, tal rejeição clara não foi observada, nenhum vaza- mento de fluorescência foi verificado por angiografia de fluoresceína, o en- xerto sobreviveu, e um distúrbio, tais como adelgaçamento de retina senso- rial, e similares, não foram encontrados.

: 34/34 Aplicabilidade Industrial . Usando-se o método da presente invenção, uma camada de cé- ? lula epitelial de pigmento retinal a ser aplicada por transplante a pacientes ' com degeneração macular relacionada à idade, pode ser produzida compa- rativamente convenientemente.

Particularmente, quando as células a serem usadas para cultura são células epiteliais de pigmento retinal derivadas de célula iPS, as células do próprio paciente podem ser utilizadas, que pode evitar rejeição no transplante.

Além disso, desde que a camada de célula : obtida pelo método da presente invenção tenha uma membrana base produ- > 10 zidaa partir dos mesmos componentes como em organismos vivos, uma - camada de célula epitelial de pigmento retinal mais próxima ao estado nos S organismos vivos pode ser reproduzida, que é útil para várias propostas de ' classificação.

Este pedido é baseado em um pedido de patente No. 2011- 040130, depositado no Japão (data de depósito: 25 de fevereiro de 2011), os conteúdos do qual são incorporados totalmente aqui.

Claims (1)

1. : 12

   REIVINDICAÇÕES ' 1. Método de produção de uma camada de célula compreen- í dendo as seguintes etapas: ] (1) semeadura e cultivo de células epiteliais de pigmento retinal em um gel de colágeno para formar uma camada de célula composta das células epiteliais de pigmento retinal, e (2) degradação do gel de colágeno com colagenase para desta- car a camada de célula composta das células epiteliais de pigmento retinal.

   . 2. Método de produção da camada de célula, de acordo com a . 10 reivindicação 1, no qual as células epiteliais de pigmento retinal são células - obtidas por indução de diferenciação de células-tronco ou células progenito- ' ras.

   3. Método de produção da camada de célula, de acordo com a reivindicação 2, em que as células-tronco são células ES ou células iPS.

   4. Método de produção da camada de célula, de acordo com a reivindicação 1, em que a concentração de colágeno no gel de colágeno é 0,1% - 0,5%.

   5. Método de produção da camada de célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações | a 4, compreendendo adicionalmente a seguinte etapa (3): (3) confirmar a presença ou ausência de uma membrana base na superfície de contato entre a camada de célula destacada e o gel de co- lágeno.

   6. Camada de célula produzida pelo método, como definido em qualquer uma das reivindicações 1a5.

   7. Camada de célula para transplante, compreendendo uma ca- mada de célula formada com células epiteliais de pigmento retinal obtidas por indução de diferenciação de células-tronco ou células progenitoras ex vivo, e uma membrana base secretada a partir das células.

   8. Camada de célula para classificação, compreendendo uma camada de célula formada com células epiteliais de pigmento retinal obtidas

   " | 2/2 por indução de diferenciação de células-tronco ou células progenitoras ex ' vivo, e uma membrana base secretada de referidas células. c

   FÃ

   Fig. 1 253G1 (iPS-RPE) (48hr) ! [tacavidade)] VEGF. | PEDF. |

   | Basar | 2453 | 429 referência :Arvydas M, 454E2 (iPS-RPE) (48hr) 1OVS.2006;47:3612-3624 (24hr [ngreavidado) | VEGF | PEDF | [mngcavidade] VEGF | PEDF | | apical | 165 | 644 | | Apical | 87 | 661 |