BRPI0708039A2

BRPI0708039A2 - células alimentadoras derivadas de células-tronco de tecido

Info

Publication number: BRPI0708039A2
Application number: BRPI0708039-5A
Authority: BR
Inventors: Shigeto Shimmura; Hideyuki Miyashita; Satoru Yoshida; Kazuo Tsubota
Original assignee: Univ Keio
Priority date: 2006-02-08
Filing date: 2007-01-17
Publication date: 2011-05-17
Also published as: CA2637856A1; EP1990407A1; JPWO2007091409A1; EP1990407A4; US20090047738A1; EP2130911A1; WO2007091409A1

Abstract

CéLULAS ALIMENTADORAS DERIVADAS DE CéLULAS-TRONCO DE TECIDO. E um objetivo da presente invenção prover células alimentadoras com menos variação na qualidade. A presente invenção refere-se a uma célula alimentadora derivada a partir de uma célula-tronco de tecido e/ou de uma célula progenitora. Também são providos um método para a preparação da célula alimentadora, um método para a preparação de uma célula cultivada com a utilização da célula alimentadora e um kit de cultura de célula.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "CÉLULASALIMENTADORAS DERIVADAS DE CÉLULAS-TRONCO DE TECIDO".

CAMPO TÉCNICO

A presente invenção refere-se a células alimentadoras derivadasa partir de células-tronco de tecido e o uso das mesmas.

ANTECEDENTES DA TÉCNICA

O transplante de folhas epiteliais cultivadas é usado para o tra-tamento da exaustão de células-tronco no limbo da córnea. A exaustão decélulas-tronco no limbo da córnea é uma condição na qual as células-troncodo epitélio da córnea estão mortas devido à lesão por álcali ou semelhante,levando a danos graves na visão como o resultado da invasão da conjuntivaopaca (Documento Não Patente 1).

Existem dois tipos de métodos para o cultivo de células epiteli-ais. Um tipo não usa células alimentadoras e o outro tipo usa células alimen-tadoras. Este último tipo (que usa células alimentadoras) é superior em man-ter a capacidade das células epiteliais (Documento Não Patente 2). As célu-las alimentadoras são fibroblastos cujo crescimento foi terminado, por exem-plo, através de tratamento com drogas. As células alimentadoras têm a fun-ção de promover o crescimento de células epiteliais e inibir o crescimentodos fibroblastos misturados com elas (Documento Não Patente 3). As folhasepiteliais cultivadas com células 3R3 como uma camada de alimentação têmsido usadas em cenas clinicas durante mais de 20 anos.

No entanto, como as células 3T3 são derivadas a partir de ca-mundongo, o risco de injeção xenogênica não pode ser completamente eli-minado. O transplante de folhas epiteliais cultivadas com células 3T3 é clas-sificado como um xenotransplante, nas diretrizes providas pelo Ministério deSaúde, Trabalho e Bem-Estar (Documento Não Patente 4).

Com a finalidade e evitar esse problema, podem ser usadas cé-lulas humanas como a camada de alimentação. Na realidade, tem sido re-portado que as células da epiderme (células epiteliais da pele) podem sercultivadas e mantidas com a utilização de fibroblastos humanos como a ca-mada de alimentação (Documento Não Patente 5).No entanto, ao contrário da 3T3 que é uma cepa de células es-tabelecida (isto é, células imortalizadas) a partir de camundongo, os fibro-blastos humanos normais são conhecidos como ficando gradualmente maisvelhos através de sub-culturas repetidas. Isso significa que é impossível ouso de células permanentemente de um só lote. Dessa forma, a qualidadedas células de alimentação pode variar devido à sub-cultura ou a diferençano lote. É previsto que essa possibilidade irá proporcionar efeitos adversossobre o controle da qualidade as folhas epiteliais cultivadas.

Recentemente, foi desenvolvido um método para o cultivo e amanutenção de células-tronco do cérebro ou da pele. As células-tronco culti-vadas através desse método não se diferenciam no epitélio, porem elas sãocapazes de se diferenciarem dentro dos fibroblastos. Tem sido reportadoque, não somente as células de camundongo, mas também as células-tronco humanas podem ser mantidas durante um longo tempo através dautilização deste método. (Documento Não Patente 6). O grupo dos presentesinventores também foi bem-sucedido no isolamento e na cultura de células-tronco a partir do estroma da córnea de camundongos com a utilização des-se método (Documento Não Patente 7).

Documento Não Patente 1: Ann Acad Med Singapore 2004; 33: 576 a 80

Documento Não Patente 2: CÂNCER RESEARCH 63, 7815-7824, November 15, 2003

Documento Não Patente 3: Proc. Natl. Acad. Sei. USA Vol. 76,No. 11, pp. 5665 a 5668, November 1979

Documento Não Patente 4: Guidelines on Epithelial System Re-generative Medicine Using 3T3J2 or 3T3NIH as Feeder Cells based on "Pub-lic Health Guidelines on Infectious Disease Issued in Xenotransplantaion",Hiroshi Yoshikura (Director, the National Institute of Infectious Diseases),Chief Researcher, Health Sciences Special Research Program funded by2003 Health Labour Sciences Research Grant

Documento Não Patente 5: STEM CELLS 2003; 21: 481 a 494

Documento Não Patente 6: STEM CELLS 2005; 23: 727 a 737Documento Não Patente 7: Investigative Ophthalmology & VisualScience, May 2005, Vol. 46, N9 5, 1653-1658.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

PROBLEMA PARA SER SOLUCIONADO PELOS INVENTORES

É um objetivo da presente invenção prover células alimentado-ras com menos variação na qualidade.

MEIOS PARA A SOLUÇÃO DO PROBLEMA

É possível a utilização de células-tronco com a capacidade deauto-replicação (isto é, sem variação na qualidade) como uma fonte de célu-las alimentadoras, é presumido que, teoricamente, células de alta qualidade.Em seguida, os presentes inventores tiveram sucesso em cultivar folhas epi-teliais humanas transplantáveis com a utilização de células alimentadoraspreparadas a partir de células-tronco da córnea de camundongo. Dessa for-ma, a presente invenção foi conseguida.

A presente invenção refere-se às seguintes invenções.

(1) Uma célula alimentadora derivada de uma célula-tronco detecido e/ou progenitora.

(2) A célula alimentadora de (1) acima, na qual a célula-troncode tecido e/ou progenitora é derivada a partir de um mamífero.

(3) A célula alimentadora de (2) acima na qual o mamífero é umser humano.

(4) A célula alimentadora de qualquer um de (1) até (3) acima,na qual a célula-tronco de tecido e/ou progenitora é derivada a partir do es-troma da córnea, pele ou do mesênquima da medula óssea.

(5) Um método para a preparação de uma célula alimentadora,que compreende o tratamento da célula-tronco de tecido e/ou progenitorapara a diminuição da capacidade de crescimento da mesma, opcionalmentedepois de induzir a célula-tronco de tecido e/ou progenitora dentro de umfibroblasto.

(6) O método de (5) acima, no qual a célula-tronco de tecidoe/ou progenitora é derivada a partir de um mamífero.

(7) O método de (6) acima, no qual o mamífero é um ser huma-no.

(8) O método de qualquer uma de (5) até (7) acima, no qual acélula-tronco de tecido e/ou progenitora é derivada a partir do estroma dacórnea, pele, ou do mesênquima da medula óssea.

(9) Um método para a preparação de uma célula cultivada, quecompreende a co-cultura de uma célula com a célula alimentadora de qual-quer um de (1) até (4) acima.

(10) O método de (9) acima, no qual a célula co-cultivada com acélula alimentadora de qualquer um de (1) até (4) acima é derivada a partirde um mamífero.

(11)0 método de (10) acima, no qual o mamífero é um ser hu-mano.

(12) O método de qualquer um de (9) até (11) acima, no qual acélula co-cultivada com a célula alimentadora de qualquer um de (1) até (4)acima é selecionada a partir do grupo que consiste em células da córnea,células da pele, células cardíacas, células gastrointestinais, células da me-dula óssea, células-tronco embrionias e células da mucosa oral.

(13) O método de (12) acima, no qual a célula co-cultivada coma célula alimentadora de qualquer um de (1) até (4) acima é uma célula epi-telial da córnea ou célula da pele.

(14) O método de (13) acima, no qual a célula cultivada é estrati-ficada.

(15) O método de qualquer um de (9) até (14) acima, no qual acélula cultivada é usada para transplante.

(16) Um kit de cultura de células que compreende a célula ali-mentadora de qualquer um de (1) até (4) acima.

EFEITO DA INVENÇÃO

A vantagem da presente invenção consiste em que células ali-mentadoras homogêneas podem ser supridas de forma estável devido a queas células-tronco são usadas como uma fonte de células. Além disso, quan-do é usada uma célula humana como uma célula alimentadora, é possível aredução do risco de uma infecção xenogênica.O presente relatório descritivio engloba o conteúdo descrito norelatório e/ou nos desenhos do Pedido de Patente Japonesa N9 2006-030997 com base no qual o presente pedido de patente reivindica prioridade.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1

A: células-tronco de estroma de camundongo em cultura; B: cé-lulas alimentadoras obtidas a partir de células mostradas AM A através dotratamento com fármacos; C: prática de cultura epitelial; e D: células epiteli-ais em cultura.

A Figura 2 mostra amostras de tecido de células epiteliais culti-vadas. HE: imagens manchadas com hematoxilina-eosina; K3: imagens deimunomarcação de queratina-3 que é um marcador de diferenciação epitelialde córnea; Cx43: imagens de imuno marcação de conexina 43 que é ummarcador de diferenciação de célula epitelial; Int b1: imagens de imunomar-cação de integrina β1 que é um indicador para epitélio diferenciado; e p63:imagens de imuno marcação de p63 que é um marcador para células epiteli-ais não-diferenciadas.

A Figura 3 mostra imagens marcadas com rodamina B de 1000células epiteliais depois de co-cultivadas com células alimentadoras indivi-duais durante duas semanas. Painel mais baixo à esquerda: eficiência deformação de colônia epitelial (CFE). Painel mais baixo à direita: tamanhomédio das colônias epiteliais.

A Figura 4 mostra folhas epiteliais cultivadas preparadas comcélulas epiteliais e células alimentadoras derivadas de células-tronco do me-sênquima de medula óssea (MASCf). Co-cultura de contato: células epiteli-ais cultivadas em contato com células alimentadoras através de semeadurade células epiteliais junto com células alimentadoras em insertos de cultura.Co-cultura dúplex: folhas epiteliais cultivadas em contato com células ali-mentadoras sob o suprimento contínuo de fatores humorais através da se-meadura de células alimentadoras tanto em insertos de cultura como emcavidades por baixo dos insertos. Co-cultura separada: folhas epiteliais co-cultivadas com células alimentadoras sem contato através da semeadura decélulas alimentadoras somente nas cavidades por baixo dos insertos de cul-tura. HE: imagens marcadas com hematoxilina-eosina; K3: imagens de imu-no marcação de queratina 3 que é um marcador de diferenciação de epitelialde córnea; e K15: imagens de imunomarcação de queratina 15 que é ummarcador para o epitélio do limbo da córnea.

A Figura 5 mostra folhas epiteliais cultivadas preparadas comcélulas epiteliais e células alimentadoras derivadas de células-tronco do me-sênquima de medula óssea (MASCf). K12: imagens de imuno marcação dequeratina 12 que é um marcador de diferenciação de epitelial de córnea;K15: imagens de imunomarcação de queratina 15 que é um marcador para oepitélio do limbo da córnea; e K12 + K15: imagens de marcação dupla comqueratina 12 e queratina 15.

MELHOR MODO PARA A EXECUÇÃO DA INVENÇÃO

Abaixo, aqui, neste pedido de patente, a presente invenção serádescrita em detalhe.

A presente invenção proporciona uma célula alimentadora deri-vada a partir de uma célula-tronco de tecido e/ou de uma célula progenitora.

A célula-tronco de tecido e/ou de uma célula progenitora podeser derivada a partir de um mamífero (como por exemplo, um ser humano oucamundongo). De preferência, a célula é derivada a partir de um mamíferoespecialmente um ser humano.

A célula-tronco de tecido e/ou de célula progenitora pode serderivada tanto de adultos como de embriões.

A célula-tronco de tecido e/ou de célula progenitora pode serderivada de qualquer tecido, por exemplo, medula óssea, músculo, nervo,pele, córnea, fígado, baço, intestino delgado, mucosa oral ou de gordura. Depreferência, a célula é derivada a partir da córnea (especialmente do estro-ma da córnea), pele, medula óssea (especialmente do mesênquima da me-dula óssea).

A célula-tronco de tecido e/ou de célula progenitora pode serpreparada como escrito abaixo. Em resumo, uma seção do tecido de inte-resse é coletada e as partes não necessárias são removidas o tanto quantopossível. Depois de um tratamento de um dia para o outro com dispersão a4-C, o epitélio é removido. Em seguida, o tecido é derretido através de tra-tamento com colágeno durante de 1 a 2 horas a 37-C. As células são colhi-das por centrifugação e cultivadas em um meio isento de soro para células-tronco de tecido e/ou de células progenitoras. As células são sub cultivadasa cada duas ou três semanas.

As células alimentadoras da presente invenção podem ser pre-paradas através do tratamento de uma célula-tronco de tecido e/ou de célulaprogenitora para a diminuição da capacidade de crescimento da mesma,opcionalmente depois da indução da célula-tronco de tecido e/ou de célulaprogenitora dentro de um fibroblasto.

A indução de uma célula-tronco de tecido e/ou de célula progeni-tora dentro de um fibroblasto pode ser realizada através dos procedimentosque se seguem. Uma célula-tronco de tecido e/ou de célula progenitora emum meio isento de soro é colhida através de centrifugação e dispersa pelotratamento com uma enzima (Accumax®, Innovative Cell Technologies, Inc.)a 37°C. A célula dispersa é cultivada em um meio que contém 10% de soropara por meio disso induzir a diferenciação dentro de um fibroblasto. Estaetapa de indução dentro de um fibroblasto é uma etapa opcional. Entre ascélulas-tronco de tecido e células progenitoras, aquelas que têm inerente-mente a natureza do fibroblasto (tal como a célula do mesênquima da medu-la óssea) não necessitam de indução de diferenciação especial e podem sersubmetidas à capacidade de diminuição de crescimento diretamente.

O fibroblasto induzido a partir de uma célula-tronco de tecidoe/ou de célula progenitora é tratado com radiação, mitomicina ou semelhantepara a diminuição da capacidade de crescimento da mesma. Por exemplo, ofibroblasto que chegou a semiconfluência é cultivado em meio C adicionadocom mitomicina a 379C durante 2 horas. De forma alternativa, pode ser dadaao fibroblasto uma dose letal de radiação.

Através da co-cultura de uma célula com a célula alimentadorada presente invenção, é possível regular o crescimento ou a diferenciaçãoda célula cultivada resultante.

De preferência, a célula a ser cultivada com a célula alimentado-ra da presente invenção é uma célula humana.

O tipo da célula a ser co-cultivada com a célula alimentadora dapresente invenção não está especificamente limitado. Os exemplos de célu-las que podem ser co-cultivadas com a célula alimentadora da presente in-venção incluem, porém não estão limitadas a, células da córnea (como porexemplo, célula epitelial da córnea), células da pele (como por exemplo, cé-lulas da epiderme), células cardíacas (como por exemplo o cardiomiócito),células gastrointestinais (como por exemplo, célula epitelial da mucosa gás-trica, célula epitelial da mucosa do intestino delgado e célula epitelial da mu-cosa do cólon), células da medula óssea, células-tronco de embrião e célu-las da mucosa oral. Quando a célula-tronco de tecido e/ou de célula progeni-tora estão presentes na célula a ser cultivada, é possível não somente man-ter a sobrevivência da célula, porém também cultivar ou diferenciar a célulaatravés da co-cultura com a célula alimentadora da presente invenção.Quando a célula s ser cultivada é uma célula de tecido, o tecido pode serregenerado em algumas ocasiões. O tecido regenerado dessa forma podeser transplantado.

Quando a célula a ser co-cultivada com a célula alimentadora dapresente invenção for uma célula do epitélio da córnea ou célula da pele, acélula cultivada resultante pode ser crescida e estratificada.

Quando a célula a ser co-cultivada com a célula alimentadora dapresente invenção for uma célula-tronco de medula óssea ou uma célula-tronco de embrião, a célula cultivada resultante pode ser crescida, porémnão poderá ser estratificada.

A co-cultura com a célula alimentadora da apresente invençãopode ser executada como descrito abaixo. Primeiro, a célula alimentadora ésemeada em pratos de cultura para dar de 70 a 90% de confluência. No diaseguinte, a célula a ser co-cultivada é semeada. A célula pode ser cultivadaem contato com a célula de alimentação. Alternativamente, a célula pode sercultivada sem contato com a célula alimentadora através da utilização deinsertos de cultura ou semelhantes.

Quando uma célula for uma célula do epitélio da córnea, célulaepidérmica da pele ou célula epitelial da mucosa oral é para ser estratificadaa célula pode ser cultivada até que ela alcance a confluência nos insertos decultura em um meio com a adição de soro. Em seguida, o meio pode ser re-duzido até que a célula entre em contato com a interface líquido=ar. Em se-guida, a célula pode ser cultivada durante cerca de uma semana.

Através da co-cultura de uma célula com a célula alimentadorada presente invenção, é possível preparar uma célula cultivada para ser u-sada em um transplante. Com a finalidade de cobrir uma área ampla comuma quantidade limitada de tecido, um enxerto que é um epitélio cultivadosobre uma membrana amniótica é previamente preparado através do méto-do descrito acima. Em resumo, uma camada de membrana amniótica é co-locada em um prato de cultura, e uma córnea a partir de um doador ou umapequena quantidade de células recolhidos de um paciente são cultivadassobre a mesma. O transplante de folhas de células epiteliais cultivadas évantajoso quando comparado ao somente o transplante de membrana amni-ótica, devido a que o primeiro permite a cicatrização de uma lesão a partir deum estágio inicial e é efetivo na inibição de inflamação. Além disso, é sugeri-do que células não diferenciadas também estão contidas em células cultiva-das. Desse modo, existe uma possibilidade latente de que o epitélio da cór-nea pode ser regenerado a partir de uma pequena quantidade de células-tronco. Em operações cirúrgicas, o epitélio anormal que cobre a córnea écompletamente retirado, seguido por estancamento. Em seguida, uma folhade célula cultivada é desenvolvida sobre a superfície do olho e fixada comsutura cirúrgica. Uma lente de contato de proteção é aplicada ao olho de talforma que a folha de célula cultivada não caia. Desse modo, a cirurgia éconseguida.

Também, a presente invenção proporciona um kit de cultura decélula que compreende a célula alimentadora acima descrita.

O kit da presente invenção pode compreender, além da célulaalimentadora um meio (como por exemplo, DMEM/F12 ou DMEM), fatoresde crescimento (como por exemplo, EGF1 insulina, toxina da cólera, hidro-cortisona, transferina, isoptoterenol, triídrotironina e adenina) e os semelhan-tes. Com o kit da presente invenção, é possível a cultura de uma célula, e acélula cultivada resultante pode ser usada para transplante.

EXEMPLOS

Abaixo, aqui, neste pedido de patente, a presente invenção serádescrita de forma mais específica com relação aos Exemplos que se se-guem. No entanto, o âmbito da presente invenção não está limitado a essesexemplos.

Exemplo 1

Método experimental e Materiais

Células progenitoras do estroma de córnea de camundongo, tra-tadas com tripsina, colagenase e hialuronidase foram dispersas mecanica-mente, suspensas em DMEM/F12 suplementado com 10% de soro fetal bo-vino (FBS), semeado em frascos de 75 cm3 de tal forma que 3 χ 106 célulasestejam presentes por frasco e cultivados a 37eC durante 4 dias para pormeio disso induzir fibroblastos de acordo com o método descrito em Inventi-gative Ophthalmology & Visual Science, May 2005, Vol.46, Ns 5, pp. 1653 -1658. As células depois da indução foram tratadas com 4 μg/ml de mitomici-na C (Sigma) a 37gC durante 2 horas. Em seguida, as células foram disper-sas por tratamento com 0,05% de tripsina EDTA (Invitrogen), diluída com umbanqueiro de célula (Juzen Field) para dar uma densidade de 3 χ 106 célulaspor ml e preservadas em congelamento com um congelador. Um dia antesda semeadura de células epiteliais, essas células foram descongeladas, dilu-idas com DMEM/F12 suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), esemeadas em pratos de 6 cavidades (FaIcon) em uma densidade de 2,5 X104/cm2.

No dia seguinte, o limbo foi separado da parte restante das se-ções "esclerocórneas" (do banco de olhos dos Estados Unidos) usados nostransplantes de córneas, seguido pela remoção cirúrgica da Iris, corpo ciliar,membrana de Descemet, endotélio e conjuntiva. As seções preparadas des-sa forma foram tratadas de um dia para o outro em um meio adicionado comsoro suplementado com Dispase (invitrogen, 10 mg/ml) e D-sorbitol (Wako, 9mg/ml) a 4-C. A seguir, o epitélio foi descolado do estroma e em seguida ascélulas epiteliais foram dispersas através do tratamento com EDTA com 5%de tripsina a 37-C durante 30 minutos. As células epiteliais foram semeadasem insertos de cultura revestidos com gel de fibrina (Bolheal®; KAKETSU-KEN; 2 mg/cm2) (Corning; Transwell®, cat ns 3450) e co-cultivadas com acélula alimentadora preparada no dia anterior durante cerca de duas sema-nas. Como o meio, foi usado DMEM/F12 suplementado com FBS (10%) fatorde crescimento epidérmico humano recombinante, (Invitrogen, 10 ng/ml),insulina humana recombinante (Wako, 5 pg/ml), cultura de células humanastestadas com transferina (Sigma, 5 pg/ml), hidrocortisona solúvel em água(Sigma, 0,5 Mg/ml), cloridrato de DL-isoproterenol (Sigma 0,25 Mg/ml) e es-treptomicina/penicilina [isto é, meio hormonal de suplemente epitelial(SHEM)] ao qual foi ainda adicionada aprotinina (Wako, 666 KlU/ml), que foimudado três vezes por semana. Quando as células alcançaram a confluên-cia, o meio foi reduzido para expor as células ao ar, seguido pela cultura du-rante outros seis dias com a troca diária do meio

As células cultivadas dessa forma foram fixadas em formalina,seguida pela preparação de seções de parafina e marcação com HE. Alter-nativamente, as células cultivadas foram embebidas em solução de CMC a4% (Sakura Finetek) e congeladas com nitrogênio líquido, seguido pela pre-paração secções congeladas. As secções congeladas foram fixadas em ace-tona, bloqueadas com PBS consistindo em 10% de soro, marcadas com an-ticorpo monoclônico de camundongo anti queratina-3(AE5; Progen Biotech-nik GmbH), anticorpo anti-conexina 43 (Chemicon International Inc.), anti-corpo anti-integrina β1 (Chemicon) e anti corpo anti-p63 (Oncogene Resear-ch Products) e reagidas com anticorpo anti-camundongo marcados comCy3. Em seguida a marcação foi detectada com um microscópio de fluores-cência.

Na medição da eficiência de formação de colônia, as células a-limentadoras foram semeadas em pratos de 100 mm. No dia seguinte, 1000células epiteliais foram semeadas nos pratos. Depois de uma cultura de 2semanas, as células foram fixadas com 10% de formalina e marcadas comrodamina B.

Resultados

Os resultados estão mostrados na Figura 1. A Figura 1A mostracélulas-tronco de estroma de camundongo em cultura. A Figura B1 mostracélulas alimentadoras obtidas a partir das células mostradas na Figura 1Aatravés do tratamento com drogas. A Figura C1 mostra a pratica da culturade células epiteliais. As células alimentadoras são colocadas no fundo dospratos de cultura. As células epiteliais são cultivadas em insertos de culturacolocados sobre as células alimentadoras. A Figura 1D mostra as célulasepiteliais em cultura.

A folha de células epiteliais cultivadas preparadas com a utiliza-ção das células-tronco de estroma de camundongo (mostradas na colunacentral na Figura 2) está estratificada como na folha epitelial cultivada prepa-rada com a utilização de 3T3 convencionais (mostradas na coluna à esquer-da na Figura 2). Além disso, a primeira folha epitelial e a ultima folha epitelialmostram padrões de expressão quase similares em marcadores de diferen-ciação e em marcadores de não diferenciação. Isto é, as células positivas K3foram reconhecidas na camada mais externa; as células positivas Cx43 fo-ram reconhecidas por sobre todo o epitélio incluindo as células basais; e aexpressão da integrina β1 e p63 foi reconhecida sobre todo o epitélio excetocom relação à camada mais externa. Esses resultados sugerem que as fo-lhas epiteliais cultivadas não são diferentes em qualidade quando uma célulaalimentadora derivada a partir de uma célula-tronco do estroma da córneade um camundongo é usada e quando uma 3T3 é usada.

A Figura 3 mostra as diferenças na eficiência de formação decolônia quando um número extremamente pequeno de células epiteliais foisemeado. Embora não tenha sido reconhecida a formação de colônias decélulas epiteliais sem as células alimentadoras, a formação de colônia decélulas epiteliais foi reconhecida quando essa célula alimentadora foi usada.Esses resultados sugerem que esta célula alimentadora é capaz de proverum micro ambiente capaz de sustentar a sobrevivência e o crescimento decélulas epiteliais.

Exemplo 2

Método experimental θ Materiais

Células-tronco do estroma da córnea (as COP) foram cultivadase induzidas em fibroblastos com a utilização de meio com a adição de sorode acordo com o método de Yoshida et al. (Invest Ophthalmol Vis Sei. 2005May; 46(5): 1653 - 8). Células-tronco do mesênquima de medula óssea hu-mana (as MASC) foram supridas por SanBio e cultivadas de acordo com oprotocolo da SanBio. Quando as células alcançaram a confluência, elas fo-ram tratadas com mitomicina C (4 μg/ml, 37-C, 2 horas) para a preparaçãode células alimentadoras, as quais foram preservadas em congelamento a -80-C até serem usadas.

Com a finalidade de examinar a capacidade de sustentação docrescimento epitelial das células alimentadoras, células epiteliais de limbohumano foram preparadas a partir do banco de córneas dos Estados Unidosatravés do tratamento com enzima, semeadas em pratos de cultura de 100mm (1000 células por prato) os quais continham células alimentadoras COPou MASC, e co-cultivadas durante 2 semanas. Como o meio foi usado oSHEM (o mesmo meio usado no Exemplo 1). Depois do cultivo, os pratosforam fixados com formalina e as colônias epiteliais foram marcadas comrodamina Β. A percentagem obtida através da divisão do número de colôniaspelo número de células semeadas foi tomada como a eficiência na formaçãode colônias.

Com o propósito de examinas se as células alimentadoras po-dem ou não podem sustentar a diferenciação e a estratificação das célulasepiteliais, cada célula alimentadora foi colocada em pratos de 6 cavidades einsertos de cultura de célula revestidos com fibrina. Nesses insertos, foramcultivadas de forma tridimensional células epiteliais de limbo humano. Comono Exemplo 1, foram usados insertos de cultura revestidos com 1, Bolheal(KAKETSUKEN; 2 mg/cm2 (Corning; Transwell®, cat. ne 3450). Quando ascélulas epiteliais humanas alcançaram a confluência, foi executada uma se-mana de cultura no ar das em seguida para por meio disso preparar folhasepiteliais cultivadas. As folhas epiteliais resultantes foram fixadas em forma-lina, e as seções de parafina foram preparadas a partir das mesmas, marca-das com HE e submetidas à análise histológica. Alternativamente, as folhasepiteliais foram submetidas à análise imunohistológica na forma de seçõescongeladas frescas. Na analise imunohistológica, foi usado como um primei-ro anticorpo o anticorpo antiqueratina-3, anticorpo anti-queratina-12, anticor-po anti-queratina-15, anticorpo anticonexina 3, anticorpo anti-integrina β1 ouanticorpo anti-p63; Anticorpo Alexa marcado com farinha (Invitrogen) foi u-sado como um anticorpo secundário, e DAPI foi usado para a marcação nu-clear. Em seguida, a presença ou a ausência de expressão foi examinadacom um microscópio de fluorescência (Axioplan 2; Carl Zeiss).Resultados

Como mostrado na Figura 2, as folhas epiteliais cultivadas pude-ram ser preparadas com células-tronco do estroma da córnea. Essas folhasforam equivalentes àquelas folhas obtidas através da co-cultura com as 3T3de camundongo convencionais. Especificamente, as folhas epiteliais co-cultivadas com células-tronco do estroma da córnea foram estratificadas,continham células expressando os marcadores de diferenciação K3 e Cc43,e ainda continha células expressando os marcadores de não diferenciaçãoInt b1 e p63. Além disso, como mostrado na Figura 3, as células epiteliaiscultivadas co-cultivadas com as células-tronco do estroma da córnea foramcélulas de manutenção que retiveram essa capacidade de crescimento quepermitiu a formação de colônias. Por outro lado, as células epiteliais co-cultivadas sem células alimentadoras quase não foram estratificadas, exibi-ram uma pequena expressão de marcadores de diferenciação e não manti-veram aquelas células com a capacidade de formação de colônia. Comomostrado nas Figuras 4 e 5, as células epiteliais co-cultivadas com uma cé-lula alimentadora a partir de células-tronco do mesênquima humano tambémpuderam formas folhas epiteliais estratificadas. Sem levar em conta contatoou não com a célula alimentadora, essas folhas epiteliais continham célulasdiferenciadas que expressavam K3 e K12. Especialmente quando foram su-pridos de forma continua os fatores humorais (co-cultura Duplex e co-culturaSeparada), a expressão de K15 foi reconhecida como reconhecida no limboda córnea onde as células-tronco epiteliais da córnea estavam presentes.

Todas as publicações, patentes e pedidos de patente citadosaqui, neste pedido de patente ficam incorporados aqui, neste pedido de pa-tente por referência em sua totalidade.

APLICABILIDADE INDUSTRIAL

De acordo com a presente invenção, é provida uma célula ali-mentadora. Através da utilização da célula alimentadora da presente inven-ção, é possível a preparação de células cultivadas que podem ser transplantadas.

Claims

1. Célula alimentadora derivada de uma célula-tronco de tecidoe/ou de uma célula progenitora.

2. Célula alimentadora de acordo com a reivindicação 1, em quea célula-tronco de tecido e/ou de uma célula progenitora é derivada a partirde um mamífero.

3. Célula alimentadora de acordo com a reivindicação 2, em queo mamífero é um ser humano.

4. Célula alimentadora de acordo com qualquer uma das reivin-dicações de 1 a 3, na qual a célula-tronco de tecido e/ou de uma célula pro-genitora é derivada a partir do estroma da córnea, ou mesênquima da peleou da medula óssea.

5. Método para a preparação de uma célula alimentadora, quecompreende o tratamento de uma célula-tronco de tecido e/ou de uma célulaprogenitora para a diminuição da capacidade de crescimento da mesma,opcionalmente depois induzindo a célula-tronco de tecido e/ou de uma célulaprogenitora dentro de um fibroblasto.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, em que a célula-tronco de tecido e/ou de uma célula progenitora é derivada a partir de ummamífero.

7. Método de acordo com a reivindicação 5, em que o mamíferoé um ser humano.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 5até 7, em que a célula-tronco de tecido e/ou de uma célula progenitora é de-rivada a partir do estroma da córnea, ou mesênquima da pele ou da medulaóssea.

9. Método para a preparação de uma célula cultivada, que com-preende a co-cultura de uma célula com a célula alimentadora como definidaem qualquer uma das reivindicações de 1 até 4.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, em que a célulaco-cultivada com a célula alimentadora como definida em qualquer uma dasreivindicações de 1 até 4 é derivada a partir de um mamífero.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, em que o mamífe-ro é um ser humano.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 9 até 11, em que a célula co-cultivada com a célula alimentadora como defi-nida em qualquer uma das reivindicações de 1 até 4, é selecionada a partirdo grupo que consiste em células da córnea, células da pele, células dasgengivas, células cardíacas, células gastrintestinais, células da medula ós-sea, células-tronco de embrião e células da mucosa oral.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, em que a célulaco-cultivada com a célula alimentadora como definida em qualquer uma dasreivindicações de 1 até 4, é uma célula epitelial da córnea ou da pele.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, em que a célulacultivada é estratificada.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 9 até 14, em que a célula cultivada é usada em transplantes.

16. Kit de cultura de células que compreende a célula alimenta-dora como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 até 4.