KR20230124246A - 각막 조직으로부터 유래한 내피세포 분리 및 배양 방법 - Google Patents

Abstract

세포외 기질 단백질로 코팅된 플라스틱 디쉬와 성장인자를 함유하는 배양액으로 구성된 시스템에서 임계밀도로 실험실 조건에서 비효소적 수집 및 내피세포에 의한 인간의 각막 내피세포의 분리방법은 절개된 공여각막에서 세포교체 과정 또는 이식을 위한 내피세포의 확장된 아집단(sub-population)을 만들기 위해 사용된다. 특화된 공정이 공여 각막으로부터 천연의 각막 내피를 제거하고 이식하기위하여 절개된 각막 위에 배양된 각막 내피세포를 접종하는 방법에 포함된다.

Description

각막 조직으로부터 유래한 내피세포 분리 및 배양 방법{Method of endotheliocyte isolation and culture in cornea}

본 특허출원은 2003년 10월 10일자 출원된 미국특허출원 제 60/510,344호를 우선권으로 하고, 이 문헌은전체적으로 본 명세서의 참고문헌으로 포함하였다.

본 발명은 세포외 기질(extracellular matrix)에서의 인간의 각막 내피세포 배양물의 절제, 접종 및 이후증식의 개량된 방법에 관한 것이다.

다양한 이유로, 눈의 각막 부위는 외과적으로 치료 또는 교체되어야 할 필요가 있다. 예를 들면, 각막이할퀴어 상처가 나거나, 흉터가 생기거나 또는 다른 물리적인 방법으로 손상을 입으면, 시력이 크게 감퇴된다. 또한, 각막은 다양한 퇴행성 질환에 영향을 받으며, 그러한 환자가 각막을 교체하면 정상 또는 정상근처의 시력을 갖는다.

인간 눈의 각막은 대체로 평행한 상대적으로 탄탄한 조직의 층으로 구성된 특화된 구조이다. 각막의 가장 바깥쪽 또는 대부분의 표면층은 상피층이다. 이는 상해시에 재생되는 조직의 보호층이다. 눈내부로 들어가면 보우만막(Bowman's membrane)이라 알려진 상피층의 기저(base) 표면이 나온다. 산존하는(scattered) 케라토사이트(keratocyte)가 있는 세포외 콜라겐 구조 기질인 각막의 각막기질(stroma)은 보우만막에 바로 가까이에 인접해 있다. 각막기질층은 데스메막(Descemet's membrane)이라 불리워지는 표피의 세포막에 의해서, 각막기질의 맨 아래에서 경계지어지고, 각막의 후부(posterior) 표면을 형성하는 특화된 내피세포의 단일세포 두께를 가지는 단일층(monolayer)이 이어진다. 내피층은 재생되지 않아서, 그것이 병들거나 할퀴어 상처입거나 또는 다른 방법으로 상해를 입으면, 반드시 교체되어야만 한다.

인간을 포함한 몇개의 동물종에서, 각막 내피는 생체조건에서 정상적으로 복제되지 않아서, 상해또는 노화로 인해 손실된 세포를 교체해야 한다(참조: Murphy C, et al., Invest. Ophthalmology Vis.Sci. 1984; 25:312-322; Laing R A, et al., Exp. Eye Res. 1976; 22:587-594). 그러나, 인간의 각막세포는 정상적인 조직배양 조건하에서 성장인자가 풍부하고 우태아혈청을 포함하는 배양액으로 실험실 조건(in vitro)에서 배양될 수 있다(참조: Baum JL, et al., Arch. Ophthalmol. 97:1136-1140, 1979;Engelmann K, et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 29:1656-1662, 1998; Engelmann K, and Friedl P;In vitro Cell Develop. Biol. 25:1065-1072, 1989). 만일 배양된 세포가 각막 내피세포의 손실을 대체하는데 이용될 수 있다면, 인간 각막의 공여 풀(donor pool)을 크게 증대시킬 것이다. 이는 이식과정에서 부적당한 내피세포 수로 인해 현재 거부되는 공여 각막을 증가시킬 수 있어 중요하다(참조:Gospodarowicz D, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 76:464-468, 1979; Gospodarowicz D, et al.,Arch. Ophthalmol. 97:2163-2169, 1979). 낮은 내피세포 밀도로 인해 거부된 각막의 풀은 매년 기부된전체 각막의 30%를 차지한다(참조: National Eye Institute: Summary report on the cornea task force.Invest Ophthalmol Vis Sci 12:391-397, 1973). 아울러, 낮은 초기밀도에서 인간의 각막 내피세포를 배양하는 방법 및 절개된 각막 버튼(denuded corneal button) 위에 실험실 조건에서 성장시킨 세포를 재접종하는 능력은, 알로-세포(allo-cell) 및 오토-각막기질(auto-stroma) 형태의 이식에 있어서, 수령인의 손상되지 않은 각막기질을 사용할 수 있게 할 것이다(참조: Insler MS, and Lopez JG, Cornea 10:136-148,1991).

조직배양 기술은 조직 및 기관의 등가물(equivalent)의 개발에 성공적으로 이용되고 있다. 이러한 기술의 기초는 살아 있는 세포, 영양분 및 배양조건의 적절한 조합을 이용함으로써, 기능적인 조직 및기관으로 개조될 수 있는 능력을 가진 콜라겐 기질구조와 관련된다. 조직 등가물(tissue equivalent)은본 명세서에 참고문헌으로 인용된 미국특허 제 4,485,096; 4,485,097; 4,539,716; 4,546,500; 4,604,346;4,837,379; 및 5,827,641을 포함한 많은 특허에서 충분히 기술되었다. 조직 등가물의 한가지 성공적인 적용은 실제 인간의 피부와 유사한 형태를 가지는 살아 있는 피부 등가물이다. 살아 있는 피부 등가물은 콜라겐 기질 내 인간 피부 섬유아세포의 두꺼운 아랫층을 덮는 분화되고 층화된 인간 상피 케라토사이트로이루어진 윗부분을 포함하는, 2개의 층으로 구성된다(참조: Bell, et al., "Recipes for ReconstitutingSkin", J. of Biochemical Engineering, 113:113-119, 1991).

각막 상피세포 및 내피세포의 배양에 대한 연구들이 이루어져왔다(참조: Xie, et al., "A simplifiedtechnique for the short-term tissue culture of rabbit corneal cells", In Vitro Cellular &Developmental Biology, 25:20-22, (1989) 및 Simons, et al., "Corneal Epithelial Wound Closure inTissue Culture: An in vitro model of ocular irritancy," Toxicology and Applied Pharmacology,88:13-23 (1987).

본 발명의 출현에 이르기까지, 인간의 각막 내피세포(HCEC)를 배양하는 선행기술은 HCEC 세포를고세포밀도(2000 내지 5000세포/mm2)로만 접종할 수 있어 적은 시료로 일차배양을 수행할 가능성을 제한하고, 저접종밀도(50 내지 100세포/mm2)로 HCEC 세포를 연속적으로 계대접종할 수 없어 보관 및 추후 사용을위한 HCEC 스탁(stock)의 확장을 제한한다는 문제점들에 직면하였다.

본 발명의 목적은 뇌, 췌장 베타세포 및 크론도사이트 (chrondocyte)와 같은 인간기원의 다른세포형태의 연속적 배양 및 수립에 사용될 수 있 HCEC 세포의 배양방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 다른 목적으로 사용될 수 있는 HCEC를 충분한 양으로 만드는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 실험실 조건에서 인간의 각막의 세포배양 모델을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 목적은 손상된 각막 내피세포를 본 발명의 배양 시스템에서 성장시킨 HCEC로 교체함으로써, 각막 내의 각막 내피세포를 재생하는 수단을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가적인 측면은 손상된 내피세포를 본 발명의 배양 시스템에서 성장시킨 내피세포로 교체함으로써, 손상된 인간 및 포유동물의 내피세포의 다른 형태를 재생하기 위한 수단을 제공하는 것이다.

본 발명은 HCEC의 적은 시료(100 내지 500세포)로부터 일차배양을 수행할 수 있는 새로운 세포외 기질 위 에서 HCEC를 배양하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 연속적 계대접종을 통해 이러한 일차 HCEC 콜로니를 이식 및 추후 사용을 위한 동결보존을 위한 많은 양의 세포로 확장하는 방법을 제공한다.

절제(dissecting)를 이용함으로써, 인간 기원의 각막 내피세포를 포함하는 각막 내피세포의 최초 일차배양방법은 배양을 낮은 최초밀도(100 내지 500세포/mm2)로 시작할 수 있게 하고, 1 내지 32의 접종밀도로부터증식되게 할 수 있다. 이러한 세포들은 세포내 견고연접(tight junction)의 형성 및 나트륨/칼륨 펌프(Na/K pump)의 활성화와 같은 생리적 기능과 형태학적 보전을 잃지 않고 7 내지 8회까지 효과적으로 계대접종될 수 있다. 각막 내피세포 배양물은 섬유아세포 성장인자 1 및 2(FGF1, FGF2), 표피 성장인자(Epidermal growth factor: EGF), 변형성장인자 β(Transforming growth factor β: TGFβ), 내피세포 성장인자(ECGF) 및 세포배양 기술에 알려진 다른 성장인자들과 같이 선택된 성장인자들이 풍부한 일반적으로사용되는 우태아혈청(FBS)이 첨가된 배양배지 내에서 유지될 수 있다. 특히, 만일 각막 내피세포가 송아지 각막 내피세포 배양에 의해 공급되는 것과 같은 자연적인 세포외 기질, 또는 피브로넥틴, 라미닌, 콜라겐 타입 I, IV 및 RGDS와 같은 성분을 포함하는 합성된 부착 단백질 혼합물, 또는 다이아몬드-유사-탄소(Diamond-Like-Carbon: DLC)로 알려진 탄소 플라즈마(plasma)에서 증식된다면, 배양물은 10회까지의 계대접종동안 높은 분주율(split ratio) (1:32 또는 1:64)로 반복된 계대접종을 통해 더욱 6각형에 가까운 형태를 갖게 될 것이다. 각막 내피세포, 특히 인간기원의 각막 내피세포의 대형 풀(large pool)의 세대(generation)는 냉동보존되어 보관될 수 있고, 추후 세포이식에 사용될 수 있다.

절제(dissecting)를 이용함으로써, 인간 기원의 각막 내피세포를 포함하는 각막 내피세포의 최초 일차배양방법은 배양을 낮은 최초밀도(100 내지 500세포/mm2)로 시작할 수 있게 하고, 1 내지 32의 접종밀도로부터증식되게 할 수 있다. 이러한 세포들은 세포내 견고연접(tight junction)의 형성 및 나트륨/칼륨 펌프(Na/K pump)의 활성화와 같은 생리적 기능과 형태학적 보전을 잃지 않고 7 내지 8회까지 효과적으로 계대접종될 수 있다. 각막 내피세포 배양물은 섬유아세포 성장인자 1 및 2(FGF1, FGF2), 표피 성장인자(Epidermal growth factor: EGF), 변형성장인자 β(Transforming growth factor β: TGFβ), 내피세포 성장인자(ECGF) 및 세포배양 기술에 알려진 다른 성장인자들과 같이 선택된 성장인자들이 풍부한 일반적으로사용되는 우태아혈청(FBS)이 첨가된 배양배지 내에서 유지될 수 있다. 특히, 만일 각막 내피세포가 송아지 각막 내피세포 배양에 의해 공급되는 것과 같은 자연적인 세포외 기질, 또는 피브로넥틴, 라미닌, 콜라겐 타입 I, IV 및 RGDS와 같은 성분을 포함하는 합성된 부착 단백질 혼합물, 또는 다이아몬드-유사-탄소(Diamond-Like-Carbon: DLC)로 알려진 탄소 플라즈마(plasma)에서 증식된다면, 배양물은 10회까지의 계대접종동안 높은 분주율(split ratio) (1:32 또는 1:64)로 반복된 계대접종을 통해 더욱 6각형에 가까운 형태를 갖게 될 것이다. 각막 내피세포, 특히 인간기원의 각막 내피세포의 대형 풀(large pool)의 세대(generation)는 냉동보존되어 보관될 수 있고, 추후 세포이식에 사용될 수 있다.

도 1은 다른 기질들 위에서 배양된 인간 내피세포의 장기적 연속 증식에 대한 발생곡선(generation curve)이다.
도 2는 bFGF의 유무하에, 배양된 인간의 각막 내피세포의 생장에 대한 다양한 부착인자들의 영향을 나타내는 그래프이다.
도 3은 시간의 경과에 따른, 부착제로 코팅된 절개된(denuded) 인간의 각막 버튼 위에 배양된 인간의 각막내피세포의 부착을 나타내는 그래프이다.

실험실 조건에서 각막 모델을 제조하는 최초단계에서, 내피세포를 세포배양물의 막 위에접종한다. 상기 내피세포는 각막 등가물의 내층(inner layer) 또는 기저층(basal layer)을 형성하게 될것이다.

세포 수가 부적절하거나 질병 또는 물리적 파괴에 의해서 손상을 입은 내피세포들을 가진 공여 각막(donor cornea)으로부터 천연 각막 상피를 데스메막(Descemet's membrane)의 보전 및 각막기질의 구조와 기능에 손상을 입히지 않고 제거할 수 있는 시스템을 개발하였다. 이러한 절개된 각막의 제조는 4 내지 25℃에서 2 내지 60분 동안 0.5 내지 5%의 트리톤 X-100 또는 10 내지 200mM의 농도 범위 내의 수산화암모늄과 같은 희석 세정제를 처리하여 이루어진다. 어떠한 세정제 또는 남아 있는 수산화암모늄을 제거하기 위해서, 절개된 각막을 PBS로 8 내지 10회 세척한다. 그런 다음, 절개된 각막은 배양된 인간의 각막내피세포 스탁으로 세포 코팅될 준비가 된다.

절개된 각막 표면 위에 세포를 접종하기 전에, PBS에 0.1 내지 500㎍/㎖의 농도로 용해된 피브로넥틴, PBS에 0.1 내지 500㎍/㎖의 농도로 용해된 라미닌, PBS에 0.01 내지 100㎍/㎖의 농도로 용해된RGDS, 0.1M 아세트산에 0.1 내지 1000㎍/㎖의 농도로 용해된 콜라겐 타입 IV을 포함하는 부착 단백질의 미리 정의된 혼합물을 절개된 표면(데스메막) 위에 조심스럽게 가하고, 4℃에서 5분 내지 한시간 동안 방치한다. 남아 있는 단백질 혼합물을 방치시간 후에 제거하고, 각막을 PBS로 세번 헹궈서 Teflon concaveholder에 내피면을 위로 하여 위치시킨다. 11 크기의 관상톱(trephine)으로 천공하여 직경 11mm의 버튼을만든다. 이 버튼은 배양된 각막 내피세포를 수용할 준비가 된다.

배양된 인간 내피세포를 0.05% 트립신 및 O.O2% EDTA을 포함하는 생리식염수가 담긴 조직배양용디쉬에서 제거한다. 세포 현탁액을 세포계수기(Coulter Particle Counter: ZI model, Beckman Coulter)로 계수하고, 5% 우태아혈청을 포함하는 DME-16 배양액 또는 피브로넥틴, 라미닌 및 섬유아세포 성장인자의 혼합물이 함유된 비혈청 배양액의 200㎕에 세포 농도를 약 50,000 내지 500,000세포/㎖, 바람직하게는약 200,000세포/㎖로 적정하여, 절개된 각막 버튼 위에 조심스럽게 가한다. 보호제로서, 0.1 내지 0.5㎖의 약 10mg/㎖ 농도로 Healon®(Advanced Medical Optics, Santa Ana, CA)과 같은 히알루론산나트륨층을 세포 현탁액 위에 덮는다. 그런 다음, 상기 각막 버튼을 10분 내지 24시간 동안 37℃에서 10% 이산화탄소배양기에서 배양한다. 선택적으로, 코팅된 각막 버튼을 20분 동안 배양하고, 각막을 25℃에서 PBS로 3번세척하면 이식 준비가 된다.

선택적으로, 배양시에 인간의 각막 내피세포의 유지, 각막 내피세포의 증식 및 부착 단백질의 제조공정은고분자-젤 조성물로부터 생성된 인공적인 각막기질의 코팅에 이용될 수 있다. 간단히, 폴리-젤 각막기질을 각막 모양으로 성형하고, 오목한 면(내피세포 면)을 PBS에 0.1 내지 500㎍/㎖의 농도로 용해된 피브로넥틴, PBS에 0.1 내지 500㎍/㎖의 농도로 용해된 라미닌, PBS에 0.01 내지 100㎍/㎖의 농도로 용해된RGDS, 0.1M 아세트산에 0.1 내지 1000㎍/㎖의 농도로 용해된 콜라겐 타입 IV, PBS에 10 내지 400ng/㎖의농도로 용해된 b-FGF, PBS에 10 내지 400ng/㎖의 농도로 용해된 EGF, 및 PBS에 1 내지 100ng/㎖의 농도로용해된 TGFβ를 포함하는 부착 단백질 용액과 성장인자의 혼합물로 처리한다. 10분 내지 2시간 동안 4℃에서 방치한 후에, 인공 각막기질을 PBS로 3번 세척하고, 배양액(5% FCS를 포함하는 DMA-H16 또는 피브로넥틴, 라미닌, RGDS 및 콜라겐 IV를 포함하는 부착 단백질의 혼합물)에 약 50,000 내지 106세포/㎖, 바람직하게는 150,000 내지 250,000세포/200㎖의 밀도로 존재하는 배양된 각막 내피세포를 직경 11mm 각막 버튼 위에 가한다. 보호제로서 0.2 내지 0.5㎖의 약 10mg/㎖ 농도의 히알루론산나트륨층을 세포 현탁액 위에 조심스럽게 덮는다. 그런 다음, 상기 각막 버튼을 10분 내지 24시간 동안 37에서 10% 이산화탄소 배양기에서 배양한다. 배양 후에, 인공의 각막 버튼을 PBS로 3번 세척하면 이식 준비가 된다.

다른 실시태양에 따르면, 내피층을 형성하기 위해 사용할 각막 내피세포를 다양한 포유동물원으로부터 얻을 수 있다. 양, 토끼 및 소로부터 얻어진 형질전환되지 않은 각막 내피세포가 사용되었다. 쥐 각막 내피세포는 SV40의 큰 T 항원으로 형질전환되었다(참조: Muragaki, Y., et al., Eur. J. Biochem.207(3):895-902, 1992). 사용될 수 있는 비인간 세포형은 형질전환된 쥐 각막 내피세포주 또는 양 및 토끼로부터 얻어진 정상 각막 내피세포를 포함한다. 정상 토끼 각막 내피세포는 효소적으로 분리된 각막 상피 또는 각막의 체외이식조직(explant)으로부터 얻어질 수 있고, 헤파린 50㎍/㎖ 및 헤파린 결합 성장인자-1 0.4㎍/㎖이 가해진 변형된 MSBM 배양액(MSBME; 참조: Johnson, W.E. et al., In Vitro Cell. Dev.Biol. 28A:429-435, 1992)에서 연속적으로 배양된다.

또 다른 실시태양에 따르면, 비각막 기원(origin)으로부터 얻어진 내피세포 또한 본 발명에 이용될 수 있다. 본 발명에서 이용된 비각막 기원 내피세포는 양 및 개과동물의 도관(vascular) 및 인간 배꼽 정맥(umbilical vein) 내피세포를 포함한다. 내피세포는 SV40의 큰 T 항원을 포함하는 재조합 레트로바이러스로 형질전환될 수 있다(참조: Muragaki, et al., 1992, supra). 형질전환된 세포는 각막 등가물에서 계속적으로 자라게 하고, 접촉제한(contact inhibition)이 없으므로 무세포(acellular)층의 윗면에 세포더미(mound)를 형성한다. 비형질전환된 세포는 각막기질세포-콜라겐층 아래에 놓여 있는 단일층(monolayer)을형성한다. 선택적으로, 정상 내피세포는 상술한 바와 같이 형질도입될 수 있고, 열에 민감한 유전자를 발현시키는 재조합체를 가함으로써 형질도입될 수도 있다. 이러한 형질전환된 세포는 낮은 온도하에서 연속적인 배양으로 키워진다. 상호접촉된 내피세포층을 수립한 후에, 형질전환 유전자를 비활성화시키기 위해온도를 높여, 세포가 정상적인 조절기작을 되찾고 접촉제한을 나타내게 만들어, 비형질전환된 세포와 유사한 내피세포 단일층을 형성하게 한다. 열충격(heat shock) 단백질을 제외한 대부분의 펩타이드는 열에 민감하여, 배양 온도를 높임으로써 비활성화되는 펩타이드들을 광범위하게 선택할 수 있다. 또한, 이러한방식의 형질전환은 배양 및 수득이 어려운 인간의 각막 내피세포와 같은 세포형태의 이용을 용이하게한다.

일차 각막 내피배양 및 이후 계대접종을 위한 세포외 기질(ECM)이 코팅된 플레이트의 제조 배양시, 10%의 FCS, 5%의 CS, 5%의 덱스트란(dextran), 300㎍/㎖의 글루타민, 2.5㎍/㎖의 암포테리신B(amphotericin B) 및 50ng/㎖의 bFGF를 포함하는 DME-H16 배지가 담긴 디쉬 위에 송아지 각막 내피세포(BCEC)를 접종한다. 상호접촉될 때(위치시킨 후 약 7 내지 10일), 플레이트의 적어도 2/3를 덮기에 충분한 양의 20mM NH4OH를 디쉬에 처리한다. 교반기(shaker)에서 5분 동안 흔들어준 후, NH4OH를 흡인하고,디쉬를 PBS로 5번 세척한다. 사용하기 전에 일주일 동안 4℃에서 디쉬를 보관하여 살아 있는 BCEC를 제거한다. 라미닌 및 피브로넥틴을 증류수에 100㎍/㎖의 농도로 용해시킨다. 콜라겐 타입 IV를 0.06% v/v 아세트산에 용해시킨다. 라미닌, 피브로넥틴 및 콜라겐 타입 IV를 배양 목적에 필요한 ECM 플레이트에 가한 실시예 1: 인간의 일차 각막 내피 세포의 비효소적 절제 중앙부분을 이식을 위해 제거한 후 기증자로부터 기증받은 각막 림(rim) 또는 기증된 각막 전체를 PBS 50㎖로 세척한다. 그런 다음, 그것들을 용기(holder)에서 내피면을 위로 하여 위치시킨다. 섬유주(trabecular meshwork)와 홍채 잔여물은 미세절제 방법으로 조심스럽게 제거한다. 어떠한 깔려진 각막기질 조직도 포함되지 않도록, 날카롭고 뾰족한 쥴러 집게(jeeler's forcep)를 이용하여 내피세포층과 데스메막을 매우 조심스럽게 분리한다. 이 단계는 도립현미경 아래에 절제된 데스메막을 관찰하여, 단지 한쪽면에만 각막 내피세포가 있고, 다른쪽 면에는 아무것도 없음을 확인함으로써, 보증될 수 있다. 전기 분리된 조직을 ECM 코팅된 35mm 조직배양용 디쉬 또는 유사한 적절한 용기에 놓고, b-FGF 250ng/㎖이 포함된15% 소혈청이 함유된 약 0.5㎖의 배양 배지를 채웠다. 상기 배양용 디쉬를 24시간 동안 37℃에서, 10% 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 그 후, 배양액을 1㎖ 더 가한다. 각막 내피 세포의 콜로니가 상기 조직 시료에서 바깥쪽으로 이동하였는지 살펴보면서, 상기 시료(sample)를 아무런 방해 없이 약 7일 동안 배양하고, 상기 시료가 배양된지 7 내지 14일이 경과한 시점에서 상기 배양액을 세포수가 200 내지 500에 이르기까지 이틀마다 교체한다.

실시예 2: 인간의 각막 내피세포의 고분주율로의 배양

조직 시료 증식물에서 일차 배양된 세포수가 150 내지 750, 바람직하게는 200 내지 500에 달할 때, 전기세포를 STV 용액(0.05% 트립신 및 O.O2% EDTA를 포함하는 생리생리식염수)을 이용하여 디쉬에서 이탈시킨다. 상기 세포가 모아지지만 여전히 배양용 디쉬에 부착되어 있을때, 상기 STV 용액을 제거한다. 남아있는 STV는 15% 우태아혈청이 함유된 성장배지에 의해 불활성화되므로, 원심분리 단계는 필요하지 않다.각막세포를 60mm의 ECM 코팅된 디쉬상에 디쉬당 약 250 내지 1000세포수, 바람직하게는 약 500세포수로 위치시킨다. 배양액을 이틀마다 교체하고, 배양액 교체시에 b-FGF를 250ng/㎖의 농도로 추가한다. 상호접촉될 때(위치시킨 후 약 7 내지 10일), 상기 세포를 동일한 분주율(약 1:16 내지 1:64)로 계대접종하거나또는 앰플(ampoule) ㎖당 약 5 X 105내지 약 5 X 106세포, 바람직하게는 106세포의 밀도로 10% DMSO 및15% FCS에서 동결시키고, 다음 사용을 위해 액체 질소에 보관한다. 세포의 기능 또는 형태학적 보전의 손실 없이 상기 계대접종을 8번까지 수행할 수 있다.

HCEC 스탁의 동결

수득된 HCEC 5㎖의 각각을 위하여, 전기 세포 현탁액에 DMSO 0.5㎖를 가한다. 혼합물의 각 1.1㎖을 바이알(vial)당 약 백만 세포수의 최종 농도로 만들어 1.5㎖의 냉동보존 튜브에 분주한다. 그런 다음, 전기바이알을 스티로폼 박스 안에 넣고 24시간 동안 -80℃ 냉동고에서 방치한다. 하루가 경과한 후, 장기간저장을 위해서 전기 앰플들을 액체 질소로 옮긴다.

실시예 3 : 각막 버튼의 절개

인간의 공여 각막 버튼을 안구은행으로부터 수득하였다. 이들 각막 버튼은 불충분한 내피세포 수 때문에,이식하기에 부적절하다고 여겨졌으나, 다른 시각에서 보자면 건강하고 질병이 없으며 안구은행의 지침에따라 수집된다.

상기 각막 버튼을 용기에 내피 면을 위로하여 위치시키고, PBS로 3번 세척한다. 그런 다음, 10 내지200mM 농도의 수산화암모늄 용액을 위쪽에 흘리지않으면서 전기 각막 버튼의 내부에 조심스럽게 가한다.상기 각막을 약 10 내지 25℃의 온도에서 5분 내지 2시간 동안 유지시킨다. 이어, 수산화암모늄을 제거하고, 각막 버튼의 내부를 PBS로 약 10번 정도 세척한다. 면봉으로 내피 표면을 가로질러 닦아주어, 남아있는 모든 세포 골격이나 파편을 제거한다. 상기 각막 버튼을 PBS로 다시 3번 세척하고, 11mm의 관상톱(trephine)으로 천공한 다음, 배양된 인간의 각막 내피세포로 코팅하기 위하여 준비한다.

또 다른 방법으로는, 천연의 각막 내피를 5분 내지 2시 동안 10℃를 유지한 증류수에 0.5 내지 5% 농도로 희석된 Triton-X100을 가하여 제거하고, 그 이후에는 상술한 방법으로 처리할 수 있다. 아울러, 상기각막 내피를 4 내지 25℃의 온도에서 20분 내지 2시간 동안 증류수로 처리할 수 있다. 그런 다음, 면봉으로 내피 표면을 가로질러 닦아주어, 남아 있는 모든 세포 골격이나 파편을 제거한다. 이어, 전기 각막을11mm의 관상톱으로 천공한다.

실시예 4 : 부착 단백질 및 성장인자를 이용한, 절개된 각막의 처리

천공한 후, 절개된 각막 버튼을 다시 용기에 내피 면을 위로하여 위치시킨다. PBS에 10 내지 500㎍/㎖의 농도로 용해된 피브로넥틴, PBS에 10 내지 500㎍/㎖의 농도로 용해된 라미닌, PBS에 1 내지 100㎍/㎖의 농도로 용해된 RGDS, 0.1M 아세트산에 10 내지 1000㎍/㎖의 농도로 용해된 콜라겐 타입 IV, PBS에 1 내지500ng/㎖의 농도로 용해된 b-FGF, PBS에 1 내지 500ng/㎖의 농도로 용해된 EGF를 포함하는 부착 단백질 용액을 상기 절개된 각막 버튼 위에 조심스럽게 가한다. 상기 표본을 4℃에서 5분내지 2시간 동안방치하고, 끝으로 칵테일(cocktail)을 제거하며, 각막을 PBS로 3번 세척한다.

실시예 5 : 배양한 인간 내피세포로 절개된 각막을 코팅

상술한 바와 같이, STV 용액(0.05% 트립신 및 O.O2% EDTA를 포함하는 생리생리식염수)으로 전기 배양된 각막 내피세포를 디쉬로부터 이탈시킨다. 전기 세포를 2000rpm으로 5분 동안 원심분리하고, 배양액을 제거한다. 전기 세포 펠렛을 0.1 내지 5% 농도의 우태아혈청을 포함하는 DME-H16 배양액 2㎖에 재현탁시킨다.

전기 현탁액 약 100㎕를 세포계수기(Coulter Particle Counter)로 계수하여 ㎖당 세포수를 결정한다. 그런 다음, 세포 농도를 약 5 X 105내지 107세포/㎖, 바람직하게는 약 106세포/㎖로 적정하고, 전기 세포 현탁액 200㎍을 11mm의 천공된 각막 버튼에 조심스럽게 가한다. 보호제로서, 0.2 내지 0.5㎖의 약 10mg/㎖농도의 히알루론산나트륨(Healon®)층을 세포현탁액 위에 덮는다. 그런 다음, 상기 각막 버튼을 20분 내지 24시간 동안 37℃에서 10% 이산화탄소 배양기에서 배양한다. 인간의 각막 내피세포로 코팅된 버튼은이식할 준비가 된다.

변형된 실시태양에 따르면, HCEC의 성장 및 형태학적 보전(6각형)을 촉진하는데 효과적이지 않는 재료로인공 기질을 만들수 있다.

인공 기질을 제조하기 위해서, 피브로넥틴, 라미닌 및 RGDS를 증류수에 약 100㎍/㎖의 농도로 용해시키고,콜라겐 타입 IV를 약 1mg/㎖의 농도로 0.01%의 아세트산에 용해시킨다. 기초 FGF를 0.05% wv의 송아지혈청알부민에 약 100㎍/㎖의 농도로 용해시킨다. 모든 재료를 15㎖ 원심분리 튜브에 함께 혼합하고, 버블이생기지 않게 부드럽게 흔든다. 그런 다음, 혼합물을 4℃에서 2시간 동안 방치한다.

조직배양용 디쉬를 코팅하기 위해서, 혼합물을 PBS로 1:10으로 희석하고, 그런 다음, 용액의 1㎖을 35mm의접시에 가하여 4℃에서 1시간 동안 방치한다. 사용전에 용액을 흡인하고, 세포 현탁액을 접시에 가한다.

Claims (1)

1. (i) 조직원(tissue source)으로부터 각막 내피세포를 절제(dissecting)하고, 전기 각막 내피세포를 일정기간 동안 세포외 기질(extracellular matrix: ECM)로 코팅된 배양 플레이트(plate)에서 저밀도로 성장시키는 단계;
   (ii) 상기 세포를 ECM 코팅된 배양용 플레이트와 충분한 세포성장인자(cellular growth factor)를 포함하는 이차배양 시스템에 계대접종하는 단계;
   (iii) 상기 각막 내피세포가 상호접촉될 때까지 성장시키는 단계; 및,
   (iv) 상기 각막 내피세포를 이차배양 시스템으로부터 체내 조건(in vivo)에서 대상물(subject)에 이식하도록 충분한 양만큼 수집하는 단계를 포함하는, 이식을 위한 각막 상피세포의 비효소적 수집 및 실험실 조건(in vitro)에서 배양하는 방법.