WO2007043255A1 - 培養角膜内皮シート及びその作製方法 - Google Patents

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WO2007043255A1
WO2007043255A1 PCT/JP2006/317511 JP2006317511W WO2007043255A1 WO 2007043255 A1 WO2007043255 A1 WO 2007043255A1 JP 2006317511 W JP2006317511 W JP 2006317511W WO 2007043255 A1 WO2007043255 A1 WO 2007043255A1
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thin film
corneal endothelial
collagen gel
cells
gel thin
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PCT/JP2006/317511
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Shigeru Kinoshita
Noriko Koizumi
Kiyoko Matsui
Eiji Kurihara
Junji Hamuro
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Arblast Co., Ltd.
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Publication date
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    • A61L2430/16—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of eye parts, e.g. intraocular lens, cornea

Definitions

  • the present invention relates to a cultured corneal endothelial sheet and a method for producing the same.
  • the cultured corneal endothelium sheet provided by the present invention can be used as a transplant material in the treatment of diseases requiring transplantation of the corneal endothelium, such as bullous keratopathy, corneal edema, corneal vitiligo, keratoconus, etc. .
  • a corneal endothelial cell is a single-layer cell located on the innermost side of the cornea and plays an important role in maintaining the transparency of the cornea.
  • corneal endothelial cells do not divide or proliferate in vivo, so if the corneal endothelial cells are damaged due to disease, trauma, ophthalmic surgery, etc., the cornea becomes cloudy and causes significant visual impairment. .
  • Such a disease is called bullous keratopathy.
  • TGF- ⁇ transforming growth factor beta
  • VIP vasoactvie intestinal peptide
  • corneal endothelial cell sheets can be prepared by finding appropriate substrates and culture conditions.
  • corneal endothelial cell layer Bednar z J, iingelmann K: Indication for precursor cells in the adult human corneal endotnel ium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (suppl): S274, 2001.). Therefore, if corneal endothelial stem cells having high proliferative ability can be cultured and proliferated in vitro, a corneal endothelial sheet that can be used as a material for transplanting corneal endothelial cell force obtained slightly may be produced. In particular, it is expected that if corneal endothelial cells remaining in the self are used, the development of corneal transplantation that does not cause any rejection reaction is expected.
  • corneal endothelial cells grow well on collagen and are similar to corneal endothelium. It is becoming clear to build a layer structure. It has also been confirmed that if the constructed cell layer is transplanted into a living body, it has a certain therapeutic effect.
  • Patent Document 4 a type I collagen sheet obtained by air-drying alkali-soluble collagen was used as a substrate for corneal endothelial cells.
  • the Type I Kola one Genshito depending swelling when moving the dry strength is also wet, becomes a thickness of about 40 i um ⁇ 50 i um in use. Therefore, the total thickness of the sheet-like laminate (cultured corneal endothelium sheet) obtained by forming a cell layer derived from the corneal endothelium on this as a substrate is the thickness of the wet collagen sheet (about 40 mm). ( ⁇ m-50 ⁇ m) plus cell layer thickness.
  • Such a very thick sheet-like laminate (1) is difficult to form a transplant space considering that it is planned to be transplanted to a deep cornea layer where physical space is scarce, and ( 2) Even if a space for transplantation can be secured, it is not suitable as a transplant material for corneal endothelium reconstruction because it causes a significant change in corneal thickness before and after transplantation and it is difficult to say that a high therapeutic effect can be obtained. Further, the strength of the type I collagen sheet is not so practical because it requires careful handling mainly at the time of transplantation.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-24852
  • Patent Document 2 International Publication No. 03Z092762 Pamphlet
  • Patent Document 3 International Publication No. 2005Z014774 Pamphlet
  • Patent Document 4 Japanese Patent Laid-Open No. 2005-229869
  • an object of the present invention is to provide a cultured corneal endothelium sheet that can be expected to have a high therapeutic effect and a method for producing the same.
  • a substrate for constructing a corneal endothelial sheet that can be expected to have a high therapeutic effect is described below.
  • the collagen gel thin film hardly swells when moving from a dry state to a wet state as compared to a collagen collagen thin film that is generally circulated such as natural collagen or collagen. It was found that if this is used as a substrate, a very thin cultured corneal endothelium sheet can be constructed. We proceeded with the study and actually tried to construct a cell layer using corneal lining cells, and the usefulness of the substrate was confirmed.
  • the present invention is mainly based on the above knowledge and provides the following configuration.
  • a cultured corneal endothelium sheet comprising a vitrified collagen gel thin film having a thickness of about 20 m or less and a corneal endothelial cell-derived cell layer formed thereon.
  • the cell layer has a single layer structure
  • the cell density of the cell layer is about 2,000 to about 4,000 cells Zmm 2 ;
  • the planar view shape of the cells constituting the cell layer is a substantially hexagonal shape
  • the cells are substantially uniformly and regularly aligned
  • the cell layer has a pump function.
  • a method for producing a cultured corneal endothelial sheet comprising the following steps:
  • FIG. 1 is a graph showing the cell density in primary culture of force-cynomolgus corneal endothelial cells.
  • FIG. 2 is a graph showing the cell proliferation rate of force-quizal corneal endothelial cells cultured in uncoated or coated wells.
  • FIG. 3 is a diagram showing the morphology of force-quizal corneal endothelial cells cultured in uncoated or coated wells.
  • ⁇ 4 This is the result of analysis of a cell layer (a cell layer derived from force quizal corneal endothelial cells) formed on a vitrified collagen gel thin film prepared using type 1 collagen.
  • A is an alizarin stained image
  • B is an immunostained image for ZO-1
  • C is an immunostained image for Na / K ATPase.
  • FIG. 5 is a view schematically showing a support used for producing a vitrified collagen gel thin film.
  • cultured corneal endothelial sheet refers to a sheet-like construct provided with a cell layer formed by culturing corneal endothelial cells collected from a living body in vitro.
  • corneal endothelial cell is used as a comprehensive expression of cells derived from the corneal endothelium unless otherwise specified, that is, includes corneal endothelial stem cells.
  • cell layer derived from corneal endothelial cells refers to a cell layer constructed by culturing corneal endothelial cells.
  • collagen gel is prepared by gelling a collagen sol with a network structure containing a large amount of water.
  • dried collagen gel refers to a substance obtained by drying a collagen gel into a thin film under the condition of vitrification.
  • collagen gel thin film refers to a sheet-like structure obtained by rehydrating a dried collagen gel.
  • vitrification refers to changing to a hard and transparent material by drying (Takush i E ”Edible eyeballs from fish. Nature 345, 298, 1990).
  • the first aspect of the present invention relates to a cultured corneal endothelium sheet.
  • the cultured corneal endothelial sheet of the present invention comprises (1) a vitrified collagen gel thin film having a thickness of about 20 m or less, and (2) a corneal endothelial cell-derived cell layer formed thereon.
  • the cultured corneal endothelium sheet of the present invention is characterized by using a specific collagen gel thin film as a substrate for a cell layer derived from corneal endothelial cells.
  • the cell layer formed on the collagen gel thin film is constructed by cells derived from the corneal endothelium. This is due to the morphology of the cells contained in the cell layer, mAb 9.3.E stained cells, ZO-1, Na + / K + ATPase expression and the absence of K3, K12 and Vimentin, and other cells than corneal endothelium. (MAb 9.3.E is described in Joyee NC, Zhu CC. Corea 2004 / Nov; 23: S8-S19).
  • the cell layer preferably comprises some of the following characteristics, particularly preferably all of the following: It has features.
  • the cell layer has a single layer structure (single layer structure). This is one of the features of a living corneal endothelial cell layer.
  • the cell density of the living corneal endothelial cell layer is said to be about 4,000 cells Zmm 2 in human newborns.
  • the cell density in the cell layer of the present invention is preferably about 2,000 to about 4,000 cells / mm 2 .
  • the cell density in the cell layer of the present invention is preferable.
  • the shape of the cells constituting the cell layer in plan view is a substantially hexagon. This is one of the characteristics of the cells constituting the corneal endothelial cell layer in the living body.
  • the cell layer of the present invention is similar to the corneal endothelial cell layer of a living body, and is expected to exhibit the same function as the corneal endothelial cell layer.
  • the cells are arranged almost uniformly and regularly.
  • the cells that constitute it are arranged uniformly and regularly, and this is considered to maintain high transparency and to properly exert the water regulation function of the cornea. Yes. Therefore, by providing such morphological features, the cell layer of the present invention is expected to exhibit the same function as the corneal endothelial cell layer in a living body.
  • Tight junctions are observed between cells in the cell layer. The presence or absence of tight junctions can be confirmed by examining the expression of tight junction-related protein ZO-1.
  • the cell layer has a pump function.
  • Providing a pump function is an indicator that it is a functionally separated endodermal cell layer. The presence or absence of the pump function can be confirmed by examining the expression of Na / K ATPase.
  • Step of preparing a vitrified collagen gel thin film with a thickness of about 20 ⁇ m or less Step of preparing corneal endothelial cells
  • the collagen gel thin film can be prepared according to the method described in International Publication No. 014774 (WO2005 / 014774A1) or Cell transplantation, Vol.13, pp.463-473, 2004.
  • the outline of the preparation method is shown below (for details, see the above-mentioned publications and literature).
  • a collagen aqueous solution eg, type I collagen aqueous solution
  • a predetermined concentration eg, 0.5% (w / v)
  • buffer solution eg, phosphate buffer solution
  • the collagen sol thus obtained is transferred to a suitable container (for example, a culture dish) and allowed to stand for 2 hours in a moisturizing incubator at 37 ° C. and 5% CO for 2 hours. Then, place the container at 10 ° C
  • a collagen gel thin film is obtained by returning the dried collagen gel to a wet state (rehydration) with an appropriate liquid (for example, physiological saline, a buffer solution such as PBS, or a culture solution).
  • an appropriate liquid for example, physiological saline, a buffer solution such as PBS, or a culture solution.
  • a vitrified collagen gel thin film is used.
  • a vitrified collagen gel thin film has excellent strength and high transparency. In addition, it can be made extremely thin during use (wet state) with very little swelling during the transition from the dry state to the wet state.
  • a normal collagen sheet that has not been vitrified for example, a type I collagen sheet disclosed in JP-A-2005-229869
  • the limit of producing a dry collagen body of about 10 m in thickness is the conventional level. Collagen sheets are 3 to 5 times as thick as dry bodies when used, that is, about ⁇ to 50 / ⁇ m.
  • Such a thick collagen sheet lacks qualification as a substrate for a cultured corneal endothelium sheet to be transplanted into the deep cornea where physical space is scarce.
  • the dry state force is very little swelled when shifting to the wet state, and therefore it can be made extremely thin at the time of use when used as a substrate for a cultured corneal endothelial sheet. This is the greatest advantage of the collagen gel thin film.
  • a vitrified collagen gel thin film has many characteristics preferable as a substrate for constructing a corneal endothelial cell layer.
  • the cultured corneal endothelium sheet obtained by using the vitrified collagen gel thin film retains the strength suitable for transplantation, and can be expected to have a high therapeutic effect that is easy to handle.
  • the thickness of the collagen gel thin film used in the present invention is about 20 m or less.
  • a thin and highly transparent cultured corneal endothelial sheet suitable for corneal endothelial transplantation is constructed.
  • the substrate as a carrier should be as thin as possible.
  • the substrate is required to have sufficient strength to support the cell layer.
  • the thickness of the collagen gel thin film as a substrate is preferably about 5 ⁇ m to about 20 ⁇ m, more preferably about 5 ⁇ m to about 15 ⁇ m, and even more preferably About 5 m to about 10 m.
  • the type and origin of collagen constituting the collagen gel thin film are not particularly limited.
  • Collagen types include type I collagen, type III collagen, type IV collagen, type VIII collagen and the like.
  • a collagen gel thin film can be constructed with a mixture of multiple types of collagen. It is preferable that a collagen gel thin film is constituted by type I collagen (or main component is type I collagen). A very good proliferation of corneal endothelial cells is observed on a collagen gel thin film that also has type I collagen power (see Examples below), and type I collagen is a force that is easy to supply stably.
  • Examples of the origin of collagen include horse, ushi, pig, hidge, monkey, chimpanzee, and human.
  • (recombinant) human collagen prepared by a gene recombination technique may be used. Of these, collagen from recombinant human collagen, horse, ushi, or pig is preferred. It is also easy to obtain.
  • a physiologically active substance may be added to the collagen gel thin film.
  • the physiologically active substance include cell growth factor, differentiation inducing factor, cell adhesion factor, cyto force-in, fibrin, trehalose, taurine and other thiol compounds, preservatives and the like.
  • a combination of different biologically active substances may be added.
  • the strength of the collagen gel thin film is better as a rule. Therefore, preferably, a collagen gel thin film having a compressive fracture strength of 3 ⁇ 4 times to 20 times (about 100 g to about 800 g when measured under the following measurement conditions) as compared to the state before vitrification treatment (collagen gel). used.
  • a collagen gel thin film that satisfies this condition can be obtained by storing and maintaining it at room temperature for about 40 days or longer. In order to homogenize the gelation of the contained collagen, it is desirable to control the gelling process at 15 ° C or 4 ° C.
  • a collagen gel thin film having an absorbance at 400 nm of 10% to 70% (absorbance of about 0.1 to 0.2) as compared to (collagen gel) is used.
  • a collagen gel thin film satisfying this condition can be obtained by storing and maintaining after drying for about 40 days or more.
  • the gelation process can be controlled at 15 ° C or 4 ° C.
  • air drying at normal temperature is desirable. Methods performed in this field such as reduced pressure drying and freeze drying can be used.
  • a collagen gel thin film provided with a support.
  • the support By using the support, the morphology of the collagen gel thin film can be maintained. At the same time, it is easy to peel off the container force when manufacturing the thin film. As a result, it is possible to ensure and maintain the flatness of the collagen gel thin film at the time of seeding or culturing of the following corneal endothelial cells, and the cell adhesion, proliferation and tissue properties are improved, and high quality cells are obtained.
  • the layer is built. Further, when the formed cell layer is recovered together with the collagen gel thin film, the collage gel thin film can be peeled off relatively easily by culturing the container by grasping the support with tweezers.
  • the operability when collecting the prepared cultured corneal endothelial sheet is also improved. Furthermore, since the cultured corneal endothelium sheet can be collected while maintaining its shape by the support, it can be transferred to a transplantation device without damaging the formed cell layer. It is possible to obtain a cultured corneal endothelium sheet having high flatness suitable for transplantation.
  • the collagen gel thin film with the support can be prepared, for example, by the following procedure.
  • a nylon membrane molded into a donut shape is prepared as a support.
  • collagen sol is prepared and added to the culture dish, gelled, and vitrified by the procedure described above. With the above steps, a collagen gel thin film having a support attached on one side of the outer peripheral portion is completed.
  • the material for the support examples include synthetic fibers (synthetic resins) such as nylon, natural fibers such as cotton, bioabsorbable materials such as polylactic acid, and metals.
  • synthetic fibers synthetic resins
  • the shape of the support is preferably circular (circle, ellipse, square, etc.).
  • Corneal endothelial cells can be collected from the recipient himself or from the cornea of an appropriate donor by conventional methods. For example, after detaching the corneal tissue desmembranous membrane and the endothelial cell layer, the corneal stroma is transferred to a culture dish and treated with dispase or the like. This causes corneal endothelial cells to fall off the Desme membrane. Corneal endothelial cells remaining on the Descemet's membrane can be removed by pipetting or the like. After removing the Descemet's membrane, the corneal endothelial cells are cultured in an appropriate culture medium in which corneal endothelial cells can grow as necessary.
  • Examples of the culture solution include commercially available DMEM (Dullbecco's Modified Eagle's Medium), Optiso® MEM, FBS (Bush Fetal Serum), b-FGF (basic-fibroblast growth factor), EuF (epidermal growth factor), insmin, and Antibiotics such as penicillin and streptomycin can be used as appropriate.
  • DMEM Dullbecco's Modified Eagle's Medium
  • Optiso® MEM FBS (Bush Fetal Serum)
  • b-FGF basic-fibroblast growth factor
  • EuF epidermatitismin
  • Antibiotics such as penicillin and streptomycin can be used as appropriate.
  • human serum As serum added to the medium, human serum, fetal bovine serum, sheep serum and the like can be used. Among them, it is preferable to use serum derived from the same species (human serum) or autologous serum (that is, the serum of the recipient itself). Of course, if possible, it is most preferable to use autologous serum that eliminates the risk of causing immune rejection.
  • a serum-free medium which does not contain any protein component derived from a different animal such as a commercially available ACF medium (Stem Alpha, Saint-Clement Les Places, France) can also be used. That is, a serum-free culture method may be employed as the culture method in the present invention. In such an embodiment, problems such as immune rejection due to contamination of serum-derived components can be avoided.
  • a culture vessel (culture dish) whose surface is coated with an extracellular matrix of type I collagen, type IV collagen, fibronectin, laminin, or mouse endothelial cells. This is because adhesion of corneal endothelial cells to the surface of the culture container is promoted, and good growth is performed.
  • the surface of a synthetic polymer or the like is treated with nanotechnology to use a material having an interface structure suitable for the proliferation of corneal endothelial cells.
  • the temperature conditions for culturing corneal endothelial cells are as long as the corneal endothelial cells grow.
  • the temperature is about 25 ° C to about 45 ° C, preferably about 30 ° C to about 40 ° C, more preferably about 37 ° C in consideration of the growth efficiency.
  • the culture time (ie, primary culture time) for subsequent subculture is, for example,? -14 days, depending on the state of the cells used.
  • the recipient's own corneal endothelial cells when available. This is because it is possible to produce a corneal endothelium-like sheet free from immune rejection when subjected to transplantation, that is, transplantation without immune rejection is possible. If the recipient's own corneal endothelial cells are not available or difficult to obtain, the ability to use non-recipient corneal endothelial cells. In this case, select a donor in consideration of immunocompatibility. I prefer that.
  • Subculture can be performed after the corneal endothelial cells subjected to the culture proliferate.
  • the subculture is preferably subconfluent, and subculture is performed when confluent.
  • Subculture can be performed as follows. First, after removing the cell culture medium, the cells are washed with PBS ( ⁇ ) solution, treated with trypsin-EDTA or the like to remove the cell surface force of the culture container, and then the cells are recovered. A culture solution is added to the collected cells to prepare a cell suspension. Centrifugation is preferably performed when cells are collected or after collection. A cell suspension with a high cell density can be prepared by vigorous centrifugation.
  • the cell suspension is seeded in a culture vessel in the same manner as in the primary culture described above and used for culture.
  • Subculture can be performed under the same culture conditions as the above primary culture.
  • the culture time varies depending on the state of the cells used, but is, for example,? -21 days.
  • the above subculture can be performed multiple times as necessary. By repeating subculture, the number of cells can be increased and a cell suspension with a high cell density can be prepared. It is preferable to finally prepare a cell suspension with a cell density of about 5 ⁇ 10 5 cells Zml to 2 ⁇ 10 6 cells Zml
  • Step (1) and step (2) described above are performed independently. Therefore, either step can be performed first (or both at the same time), but the materials handled in each step ( That is, considering the properties of collagen and cells), the preparation of a collagen gel thin film is usually carried out in advance.
  • corneal endothelial cells having corneal endothelial force also prepared are seeded on the collagen gel thin film prepared by the above procedure.
  • a culture solution is added to a dried collagen gel prepared in a culture vessel and incubated (for example, at 37 ° C. for about 5 to 20 minutes).
  • the corneal endothelial cell suspension is seeded on the vitrified collagen gel thin film thus obtained.
  • it is preferable to adjust the number of cells to be seeded so that a cell layer having a desired cell density is formed in the finally produced cultured corneal endothelial sheet.
  • the culture can be performed under the same conditions as the primary culture described above.
  • the culture time varies depending on the state of the cells used, but is, for example, 3 days to 1 month.
  • the culture of corneal endothelial cells is preferably performed in the absence of heterologous animal cells.
  • “in the absence of heterologous animal cells” means that animal cells that are heterologous to the corneal endothelial cells are not used as a condition for culturing the corneal endothelial cells.
  • the conditions are such that cells of animal species other than humans, such as mice and rats, do not exist (coexist) in the culture medium.
  • Corneal tissue strength The collected corneal endothelial cells may be seeded and cultured directly on the collagen gel thin film instead of culturing and proliferating once and then seeding on the collagen gel thin film. That is, the culture step (primary culture and subculture of corneal endothelial cells) performed before seeding on the collagen gel thin film may be omitted. In this way, the culturing operation can be simplified, and the corneal endothelial cell layer can be constructed by a substantially one-step culturing operation.
  • a cultured corneal endothelium sheet in which a cell layer composed of cells derived from corneal endothelium is formed on a collagen gel thin film is obtained.
  • the cultured corneal endothelium sheet can be recovered by releasing the adhesion between the culture vessel and the collagen gel thin film.
  • the collagen gel thin film is peeled off using tweezers or a knife.
  • the collage gel thin film can be peeled off relatively easily by culturing the container by grasping the support with tweezers.
  • the support can maintain the form of the collagen gel thin film at the time of peeling, and thus the cultured corneal endothelium sheet.
  • a collagen gel thin film with a support is used, a cultured corneal endothelium sheet in good condition can be collected by an easy operation.
  • the cultured corneal endothelium sheet of the present invention is provided, for example, in a state where it is housed in a glass or plastic container and immersed in a cell culture medium or a storage solution such as a UW solution.
  • the cultured corneal endothelium sheet prepared by the above method can be used as a transplant material (substitute for corneal endothelium) in the treatment of diseases requiring transplantation of the corneal endothelium, such as bullous keratopathy, corneal edema, corneal vitiligo and keratoconus. it can.
  • transplantation methods include full-thickness trepanation and deep keratotomy.
  • the former method is a method in which the entire corneal layer is once collected using trepan, the corneal endothelial cell layer is replaced with the cultured corneal endothelial sheet of the present invention, and then returned to the recipient.
  • the method is performed as follows. be able to. First, the recipient's (host) cornea is fully incised with a trepan and a part (or all) of the cornea is collected in a button shape. Next, the desme membrane and the corneal endothelial cell layer are peeled from the collected cornea pieces. The cultured corneal endothelial sheet of the present invention is adhered to the exposed corneal stroma. At this time, the collagen layer should be on the substantial side. The corneal piece is then returned to the recipient and secured with a suture.
  • deep cornea excision is not a method that removes the entire cornea but only the deep cornea, and is considered to be a method that places less burden on the recipient.
  • It can be done as follows. First, a part of the recipient's cornea is exfoliated, and a part of the deep corneal layer, a part of the Descemet's membrane and the endothelial cell layer are excised. Note that only the endothelial cell layer or only the endothelial cell layer and the Descemet's membrane may be peeled and excised.
  • the cultured corneal endothelial sheet of the present invention is inserted into the excision using a spatula or the like. If necessary, inject air into the anterior chamber to fix the graft.
  • the transplanted cultured corneal endothelium sheet is capable of exerting a barrier function and a pump function in the same manner as the corneal endothelial cell layer in the living body is confirmed, for example, by examining changes in corneal thickness after transplantation and occurrence of edema. be able to.
  • type I collagen (collagen type I), type IV collagen (collagen type IV), FN coating mix, gelatin (gelatin), positive L-zidine (poly- L- 1 ysine), poly -Incubate with D-lysine coated and uncoated wells and use CellTiter 96 Aqueous One Solution (Promega) on day 11
  • CellTiter 96 Aqueous One Solution Promega
  • a vitrified collagen gel thin film having a thickness of 10 m to 20 m prepared according to the method described in the pamphlet of International Publication No. 2005Z014774 was obtained from Asahi Techno Glass Co., Ltd. (Chiba, Japan). The outline of the method for preparing the collagen gel thin film is described below.
  • a circular support as shown in FIG. 5 was prepared by cutting a nylon membrane (Amersham # RPN1782B), sterilized, and then placed in a hydrophobic polystyrene culture dish.
  • a cell culture solution 0.5% type 1 collagen aqueous solution (Ushi type I collagen, manufactured by Nitta Gelatin Co., Ltd.) was added to a sterile coal tube cooled on ice and mixed uniformly. After placing the collagen mixture in a hydrophobic polystyrene culture dish containing the previous support, 5% CO / 95%
  • the collagen gel thin film obtained by returning the dried collagen gel to a wet state has very high transparency and strength (for details, see International Publication No. 2005Z014774 pamphlet).
  • almost no swelling is observed when moving from a dry state to a wet state! / ⁇ .
  • a continuous monolayer of cell layers was constructed.
  • phase-contrast microscopy and alizarin staining were performed, and the cell morphology and cell density constituting the formed cell layer were measured.
  • the cell density of the formed cell layer was 2800 cell s / mm 2 equivalent to that of normal corneal endothelium.
  • the cells constituting the cell layer had a hexagonal flat shape equivalent to that of living corneal endothelial cells (Fig. 4).
  • Fig. 4 living corneal endothelial cells
  • endothelial cells and Descemet's membrane were exfoliated from human cornea (12 eyes) obtained from Northewest Lions Eye Bank, treated with 1.2 U dispase for 30 minutes, and then coated with FNC coating mix (AES) with 10% FCS. And DFGF (GIBCOBRL) containing bFGF.
  • Human corneal endothelial cells were cultured using the collagen gel thin film obtained in 1-2 as a substrate to produce a cultured corneal endothelial sheet.
  • a culture solution for corneal endothelium was placed in a culture dish to which a dried collagen gel was adhered and incubated at 37 ° C for 15 minutes to rehydrate the dried collagen gel.
  • Cell suspension obtained by trypsinization of human corneal endothelial cells subcultured by the method shown in section 2-1.
  • a continuous single-layer cell layer was constructed, just like a living body.
  • the cell density of the formed cell layer was 2780 cell S / mm 2 equivalent to that of normal corneal endothelium.
  • the cells constituting the cell layer had a hexagonal flat shape equivalent to that of living corneal endothelial cells.
  • the cells were regularly arranged with high uniformity.
  • a cultured corneal endothelial sheet having a cell density and cell morphology equivalent to that in vivo could be produced even when V was used.
  • the patient's cornea (host cornea) parenchyma is removed, and the parenchyma of the central part ⁇ 8mm in diameter is excised including the endothelial cell layer. Or from the front chamber to the center? ⁇ 8mm diameter endothelial cells and death Only the film is peeled off.
  • the cultured corneal endothelium sheet is inserted from the parenchyma or the anterior chamber with a spatula and placed in accordance with the excision range. Thereafter, air is injected into the anterior chamber to fix the graft.
  • a full-thickness incision is made in the central part of the patient's cornea (host cornea) with a ⁇ -8mm diameter trepan.
  • the desme membrane of the host cornea piece collected on the button is peeled off along with the endothelial cell layer.
  • the cultured corneal endothelial sheet is adhered to the corneal stroma by absorbing moisture with a sponge and drying it gently.
  • the host cornea piece on which the cultured corneal endothelium sheet is placed is sutured to the host cornea with 10-0 nylon thread.
  • the cultured corneal endothelium sheet of the present invention can be used as a transplant material in various diseases requiring transplantation of corneal endothelial cells.
  • the cultured corneal endothelial sheet of the present invention includes a cell layer having a structure very close to that of a living corneal endothelial cell layer.
  • the cell layer constituting the cultured corneal endothelium sheet of the present invention is excellent in adaptability to a living body and exhibits a barrier function and a pump function that are functions of the corneal endothelial cell layer, and is extremely useful for the reconstruction of a damaged corneal endothelial cell layer. It is very useful.
  • the cultured corneal endothelial sheet of the present invention is formed by culturing and proliferating the collected corneal endothelial cells in vitro. Therefore, it is possible to prepare a transplant material based on a small number of corneal endothelial cells, and even a patient with a reduced number of corneal endothelial cells can prepare a transplant material such as his own corneal endothelial cells. This means that keratoplasty without rejection can be achieved.
  • corneal endothelium transplantation that replaces only the damaged site is possible, and there has been no problem during intraoperative or postoperative complications that have been a problem with conventional full-thickness corneal transplantation. I can expect.

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Abstract

　高い治療効果が期待できる培養角膜内皮シート及びその作製方法を提供する。厚さが約20μm以下のガラス化処理されたコラーゲンゲル薄膜上で角膜内皮細胞を培養し、培養角膜内皮シートを構築する。

Description

培養角膜内皮シート及びその作製方法
技術分野
[0001] 本発明は培養角膜内皮シート及びその作製方法に関する。本発明が提供する培 養角膜内皮シートは、角膜内皮の移植が必要とされる疾患、例えば水疱性角膜症、 角膜浮腫、角膜白斑、円錐角膜等の治療における移植材料としてその利用が図られ る。
背景技術
[0002] 角膜内皮細胞は、角膜の最も内側に位置する 1層の細胞であり、角膜の透明性維 持に重要な役割を果たす。ヒトゃサルなどの高等動物では、生体内では角膜内皮細 胞は分裂、増殖しないため、疾患や外傷、眼科手術などによって角膜内皮細胞が障 害されると、角膜が混濁して著しい視力障害をきたす。そのような疾患を水疱性角膜 症とよぶ。
水疱性角膜症の治療として、現在では角膜内皮のみではなく全層を入れ替える全 層角膜移植が行われているが、移植後拒絶反応や角膜乱視など、角膜全層を移植 することによって生じる種々の問題があり、治療成績は満足できるものではない。 一方、正常の前眼部は免疫抑制環境であることは良く知られている。この免疫抑制 環境を構成する因子として角膜、虹彩から産生される transforming growth factor beta (TGF- β )、 vasoactvie intestinal peptide (VIP)等の免疫抑制物質が重要な役割を 果たしている。また、前眼部組織力ものこれら免疫抑制物質の産生は実質内を走行 する角膜知覚神経と密接に関連しており、全層角膜移植における角膜知覚神経の 切断によりその産生が抑制されることが報告されている（Streilein JW, Bradley D, San o Y, Sonoda Y: Immunosuppressive properties or tissues obtained from eyes with ex perimentally manipulated corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 37(2):413-424, 1996. Sano Y, Streilein JW: Effects of corneal surgical wounds on ocular immune privilege. In: Nussenblatt RB, Wnitcup SM, Caspi RR, and Gery I eds. Advances in Ocular im munology. Amsterdam, ELSEVIER:207- 210, 1994.) 0従って、これまで全層角膜移 植が行われていた角膜内皮疾患に対し、前眼部の免疫抑制環境の破綻を最小限に とどめるべく、障害された内皮細胞のみを健常な内皮細胞と置き換えることができれ ば拒絶反応の抑制が期待できる理想的な術式となる。さらに、角膜裏面だけを置き 換えるため、手術後の角膜乱視が少なぐ早期力 の視力回復が望める。
[0003] 角膜内皮細胞を移植するためにはそのキャリアとしての基質が不可欠であることか ら、基質上に角膜内皮細胞が層をなしたシートを in vitroで作製する必要がある。これ まで角膜内皮細胞は増殖能を持たないとされていた力 in vitroではその増殖が確認 れ一しおり (Hyldahl L: Primary cell cultures from human embryonic corneas. J Cell S ci. 66: 343—351, 1984. Senoo T, Obara Y, Joyce N: EDTA: A promoter of proliferati on in human corneal endothelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41: 2930—2935, 2000. Miyata K, Drake J, Osakabe Y, et al.: Effect of donor age on morphologic variation of cultured human corneal endothelial cells. Cornea. 20: 59-63, 2001 )、適切な基質 や培養条件を見出せば角膜内皮細胞シートを作製することが可能であると考えられ る。
一方、角膜内皮細胞層の周辺部に幹細胞の存在が示唆されはじめている（Bednar z J, iingelmann K: Indication for precursor cells in the adult human corneal endotnel ium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42(suppl): S274, 2001.)。従って、高い増殖能をもつ た角膜内皮幹細胞を in vitroで培養し増殖させることができれば、わずかに得られた 角膜内皮細胞力 移植用材料として利用可能な角膜内皮シートを作製できる可能性 がある。特に、自己の残存した角膜内皮細胞を用いれば拒絶反応を全く生じない角 膜移植術の開発に発展することが期待される。
[0004] 本発明者らの研究グループでは、再生医療の観点に基づいた水疱性角膜症等に 対する新しい外科的治療として、角膜内皮細胞のみを移植する「角膜内皮シート移 植術」の開発を目指して研究を重ねてきた。その成果の一つとして、角膜内皮細胞の 基質として羊膜を利用した培養角膜内皮シートの作製方法を開発した (特許文献 1、 2を参照)。その後、他の研究グループによっても、羊膜の主要成分であるコラーゲン 力 角膜内皮細胞の基質として優れていることが検証された (非特許文献 1を参照)。 このように、コラーゲン上では角膜内皮細胞が良好に増殖し、そして角膜内皮類似の 層構造を構築することが明らかになつている。また、構築された細胞層を生体に移植 すれば、一定の治療効果があることも確認されて 、る。
一方、最近になって、アルカリ可溶性コラーゲンを風乾して得られる I型コラーゲンシ ートを角膜内皮細胞の基質として用いた例が報告された (特許文献 4)。当該 I型コラ 一ゲンシートは、乾燥状態力も湿潤状態に移行する際の膨潤によって、使用時には 約40 iu m〜50 iu m程度の厚さとなる。従って、これを基質とし、その上に角膜内皮由 来の細胞層を形成させて得られるシート状積層体 (培養角膜内皮シート)全体の厚さ は、湿潤状態のコラーゲンシートの厚さ（約 40 μ m〜50 μ m)に細胞層の厚さを足した ものとなる。このように非常に厚いシート状積層体は、（1)物理的なスペースに乏しい 角膜深層部への移植が予定されたものであることを考えれば移植スペースの形成が 困難であること、及び (2)仮に移植スペースを確保できたとしても移植前後で角膜厚に 大幅な変化をもたらし、高い治療効果が得られるとは言い難い等の理由から、角膜 内皮再建用の移植材料として適当でない。また、当該 I型コラーゲンシートの強度は それほど高くなぐ移植時を中心に慎重な取り扱いが要求されるもので実用性には乏 しいものであった。
[0005] 特許文献 1 :特開 2004— 24852号公報
特許文献 2：国際公開第 03Z092762号パンフレット
特許文献 3：国際公開第 2005Z014774号パンフレット
特許文献 4：特開 2005 - 229869号公報
特干文献 1 : Tatsuya imura et ai., Investigative Ophthalmology & Visual Science, September 2004, Vol.45, No.9, 2992-2997.
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 本発明は以上の背景に鑑み、高い治療効果が期待できる培養角膜内皮シート及 びその作製方法を提供することを課題とする。
課題を解決するための手段
[0007] 同士 本発明者らは以上の課題に鑑み鋭意検討を行った。まず、本発明者らの経験 に基づき、高い治療効果が期待できる角膜内皮シートを構築するための基質には以 下の特性、即ち (1)移植適用時に薄いこと、（2)透明度が高いこと、（3)強度が高いこと、 (4)角膜内皮細胞同士の良好な接着性、及び角膜内皮細胞と基質間の良好な接着 性が得られること、並びに (5)その上に播種された角膜内皮細胞の機能を保持できる ことが要求されると考えた。これらの特性に着眼点をおき基質を模索したところ、ガラ ス化された薄膜状のコラーゲンゲル (コラーゲンゲル薄膜)が最適であることを見出し た。特に、当該コラーゲンゲル薄膜は、天然コラーゲンゃァテロコラーゲンなど一般 的に流通しているコラーゲンで作製したものに比較して、乾燥状態から湿潤状態に 移行する際の膨潤がほとんどな 、と 、う特徴を有し、これを基質とすれば極めて薄 ヽ 培養角膜内皮シートを構築可能であることを見出した。検討を進め、実際に角膜内 皮細胞を用いて細胞層の構築を試みたところ、当該基質の有用性が確認された。本 発明は主として以上の知見に基づくものであって、以下の構成を提供する。
[1] 厚さが約 20 m以下のガラス化処理されたコラーゲンゲル薄膜と、その上に形 成された角膜内皮細胞由来の細胞層と、を備える培養角膜内皮シート。
[2] 前記コラーゲンゲル薄膜の厚さが約 5 μ m〜約 10 μ mである、 [1]に記載の培養 角膜内皮シート。
[3] 前記培養角膜内皮シートの湿潤時の厚さが約 40 m以下である、 [1]に記載の 培養角膜内皮シート。
[4] 前記コラーゲンゲル薄膜が I型コラーゲン力もなる、 [1]〜[3]のいずれかに記載 の培養角膜内皮シート。
[5] 前記コラーゲンゲル薄膜に、その形状を維持するための支持体が付いている 、 [1]〜[4]のいずれかに記載の培養角膜内皮シート。
[6] 以下の (1)〜(6)力もなる群より選択される一つ以上の特徴を備える、 [1]〜[5]の いずれかに記載の培養角膜内皮シート：
(1)前記細胞層が一層構造である；
(2)前記細胞層の細胞密度が約 2,000〜約 4,000細胞 Zmm2である；
(3)前記細胞層を構成する細胞の平面視形状が略六角形である；
(4)前記細胞層にお 、て細胞がほぼ均一に且つ規則正しく整列して 、る；
(5)前記細胞層において細胞間にタイトジャンクションが認められる； (6)前記細胞層がポンプ機能を備える。
[7] 前記 (1)〜(6)の特徴の全てを備える、 [6]に記載の培養角膜内皮シート。
[8] 以下のステップを含む、培養角膜内皮シートの作製方法：
(1)厚さが約 20 m以下のガラス化されたコラーゲンゲル薄膜を用意するステップ；
(2)角膜内皮細胞を用意するステップ；
(3)前記コラーゲンゲル薄膜上に前記角膜内皮細胞を播種し、培養するステップ；
(4)培養後、前記コラーゲンゲル薄膜と、その上に形成された細胞層とを回収するス テツプ。
[9] 前記コラーゲンゲル薄膜の厚さが約 5 μ m〜約 10 μ mである、 [8]に記載の作製 方法。
[10] 前記培養角膜内皮シートの湿潤時の厚さが約 40 m以下である、 [8]又は [9] に記載の作製方法。
[11] 前記コラーゲンゲル薄膜が I型コラーゲン力もなる、 [8]〜[10]のいずれかに 記載の作製方法。
[12] 前記コラーゲンゲル薄膜に、その形状を維持するための支持体が付いてい る、 [8]〜[11]のいずれかに記載の作製方法。
図面の簡単な説明
[図 1]力-クイザル角膜内皮細胞の初代培養における細胞密度を示すグラフである。
[図 2]コーティングなしのゥエル又はコーティングを施したゥエルで培養した力-クイザ ル角膜内皮細胞の細胞増殖率を示すグラフである。
[図 3]コーティングなしのゥエル又はコーティングを施したゥエルで培養した力-クイザ ル角膜内皮細胞の形態を示す図である。
圆 4]1型コラーゲンを用いて調製したガラス化コラーゲンゲル薄膜上に形成された細 胞層（力二クイザル角膜内皮細胞に由来する細胞層）に対する分析の結果である。 A はァリザリン染色像、 Bは ZO-1に対する免疫染色像、 Cは Na/K ATPaseに対する免 疫染色像である。
圆 5]ガラス化されたコラーゲンゲル薄膜の作製に使用される支持体を模式的に示す 図である。 発明を実施するための最良の形態
[0009] (用語）
用語「培養角膜内皮シート」とは、生体から採取された角膜内皮細胞を生体外で培 養することによって形成された細胞層を備えたシート状構築物をいう。
用語「角膜内皮細胞」とは、特に記載のない限り、角膜内皮に由来する細胞を包括 した表現として使用され、即ち角膜内皮幹細胞をも含む。
用語「角膜内皮細胞由来の細胞層」とは、角膜内皮細胞を培養することによって構 築される細胞層をいう。
用語「コラーゲンゲル」とは、多量の水を保有した網目状構造のコラーゲンを 、 、、 コラーゲンゾルをゲルイ匕することで調製される。
用語「コラーゲンゲル乾燥体」とは、ガラス化される条件下でコラーゲンゲルを薄膜 状に乾燥して得られる物質を 、う。
用語「コラーゲンゲル薄膜」とは、コラーゲンゲル乾燥体を再水和させて得られるシ ート状構造体をいう。
用語「ガラス化」とは、乾燥させることで固くて透明な物質に変えることをいう（Takush i E" Edible eyeballs from fish. Nature 345, 298, 1990)。
[0010] (培養角膜内皮シート）
本発明の第 1の局面は培養角膜内皮シートに関する。本発明の培養角膜内皮シー トは、（1)厚さが約 20 m以下のガラス化処理されたコラーゲンゲル薄膜と、（2)その上 に形成された角膜内皮細胞由来の細胞層とを備える。このように、本発明の培養角 膜内皮シートは、角膜内皮細胞由来の細胞層の基質として、特定のコラーゲンゲル 薄膜を利用していることを特徴の一つとする。
一方、コラーゲンゲル薄膜上に形成された細胞層は、角膜内皮由来の細胞によつ て構築されている。このことは、細胞層に含まれる細胞の形態、 mAb 9.3.E染色細胞、 ZO- 1、 Na+/K+ ATPaseの発現や K3、 K12や Vimentinが発現していないことで角膜内 皮細胞以外の細胞の混入を否定することによって確認することができる（mAb 9.3.E は Joyee NC, Zhu CC. Corea 2004/Nov; 23:S8- S19に記載されている）。
細胞層は、好ましくは以下の特徴のいくつかを備え、特に好ましくは以下の全ての 特徴を備える。
(1)細胞層が一層構造 (単層構造)である。これは生体の角膜内皮細胞層が備える 特徴の一つである。
(2)生体の角膜内皮細胞層の細胞密度はヒト新生児で約 4,000細胞 Zmm2といわれ
、成長、加齢とともに低下し、成人では正常な状態で約 2,000〜約 3,000細胞 Zmm2で ある。このことを考慮すれば、本発明の細胞層における細胞密度は約 2,000〜約 4,00 0細胞/ mm2であることが好ましい。特に、成人をレシピエント (移植者）とする場合に は約 2,000〜約 3,000細胞 Zmm2であることが好ましい。
(3)細胞層を構成する細胞の平面視形状が略六角形である。これは生体における角 膜内皮細胞層を構成する細胞が備える特徴の一つである。この特徴が認められるこ とにより、本発明の細胞層は生体の角膜内皮細胞層に類似し、角膜内皮細胞層と同 様の機能を発揮することが期待される。
(4)細胞層にお 、て細胞がほぼ均一に且つ規則正しく整列して 、る。生体の角膜内 皮細胞層においてはそれを構成する細胞は均一に且つ規則正しく整列しており、こ れによって高い透明性が維持され、また角膜の水分調整機能が適切に発揮されると 考えられている。したがって、このような形態的な特徴を備えることにより、本発明の細 胞層は生体における角膜内皮細胞層と同様の機能を発揮することが期待される。
(5)細胞層において細胞間にタイトジャンクションが認められる。タイトジャンクション の有無は、タイトジャンクション関連タンパク質である ZO-1の発現を調べることによつ て確認できる。
(6)細胞層がポンプ機能を備える。ポンプ機能を備えることは、機能的に分ィ匕した内 皮細胞層であることに指標となる。ポンプ機能の有無は、 Na/K ATPaseの発現を調 ベること〖こよって確認できる。
以下に本発明の培養角膜内皮シート及びその作製方法の特徴を詳述する。
(培養角膜内皮シートの作製方法）
本発明における培養角膜内皮シートの作製方法では次のステップ (1)〜(4)を実施 する。
(1)厚さが約 20 μ m以下のガラス化されたコラーゲンゲル薄膜を用意するステップ (2)角膜内皮細胞を用意するステップ
(3)前記コラーゲンゲル薄膜上に前記角膜内皮細胞を播種し、培養するステップ
(4)培養後、前記コラーゲンゲル薄膜と、その上に形成された細胞層とを回収するス テツプ
以下、各ステップの詳細を説明する。
[0012] (1)コラーゲンゲル薄膜を用意するステップ
コラーゲンゲル薄膜は国際公開第 014774号公報 (WO2005/014774A1)又は Cell transplantation, Vol.13, pp.463-473, 2004に記載の方法に従って調製することがで きる。調製方法の概要を以下に示す (詳細については上記公報及び文献を参照)。 まず、所定濃度 (例えば 0.5%(w/v))のコラーゲン水溶液 (例えば、 I型コラーゲン水 溶液）と、等量の緩衝液 (例えばリン酸系緩衝液)を混合する。このようにして得られた コラーゲンゾルを適当な容器 (例えば培養皿）に移し、保湿インキュベーター内で 37 °C、 5%CO条件下 2時間静置することでゲルイ匕させる。続いて、容器を 10°C
2 、 40%湿度 の条件下のクリーンベンチ内に移し、容器内を開放した状態で 2日間放置し、完全に 乾燥させる。これによつてコラーゲンゲルがガラス化する。このようにして得られたコラ 一ゲンゲル乾燥体はそのままの状態で、又は PBS等でのリンス及びその後の乾燥 (例 えば、上記乾燥処理と同条件で乾燥させる）を得た後に、室温で無菌的にコラーゲン ゲル乾燥体として保管維持する。この保管維持の時間を十分に確保することによって
、強度の増強を図れる。コラーゲンゲル乾燥体を適当な液体 (例えば生理食塩水、 P BS等の緩衝液、培養液)で湿潤状態に戻すこと (再水和）によってコラーゲンゲル薄 膜が得られる。
[0013] 本発明ではガラス化処理されたコラーゲンゲル薄膜が使用される。ガラス化処理さ れたコラーゲンゲル薄膜は強度に優れ、透明度も高い。また、乾燥状態から湿潤状 態に移行する際の膨潤が極めて少なぐ使用時 (湿潤状態）において極めて薄い状 態にできる。これに対して、ガラス化処理されていない通常のコラーゲンシート（例え ば特開 2005— 229869号公報に開示される I型コラーゲンシート）は 3〜5倍程度に 膨潤する。このことと、現在の技術レベルでは、通常のコラーゲンシートの乾燥体とし て 10 m程度の厚さのものを製造するのが限界であることを考え合わせれば、従来の コラーゲンシートでは使用時に乾燥体の 3〜5倍の厚さ、即ち πι〜50 /ζ m程度に なってしまう。このように厚いコラーゲンシートは、物理的なスペースに乏しい角膜深 層部に移植される培養角膜内皮シートの基質としての適格を欠く。以上の説明から 明らかなように、乾燥状態力も湿潤状態に移行する際の膨潤が極めて少なぐそれ故 に使用時に極めて薄い状態にできる点は、培養角膜内皮シート用の基質として使用 する場合における、コラーゲンゲル薄膜の最大の利点といえる。
一方、後述の実施例に示すように、本発明者らの検討の結果、ガラス化処理された コラーゲンゲル薄膜上に角膜内皮細胞が良好に接着するとともに細胞同士の接着 性も良好であった。また、高い細胞増殖効率も得られ、し力も角膜内皮細胞の機能が 保持されることが判明した。以上のように、ガラス化処理されたコラーゲンゲル薄膜は 、角膜内皮細胞層を構築するための基質として好ましい特性を数多く備えることが明 らかとなつた。そして、ガラス化処理されたコラーゲンゲル薄膜を使用して得られる培 養角膜内皮シートは移植に適合する強度を保持しており、取り扱い易ぐ高い治療効 果ち期待できるものとなる。
[0014] 本発明で使用されるコラーゲンゲル薄膜の厚さは約 20 m以下である。このように 非常に薄いコラーゲンゲル薄膜を使用することによって、角膜内皮移植術に適した、 薄く且つ透明度の高い培養角膜内皮シートが構築される。ここで、培養角膜内皮シ ートが移植されることになる角膜深層部は物理的なスペースに乏しい。従って、キヤリ ァとしての基質はできるだけ薄い方がよい。一方で、基質には細胞層を支持するため の十分な強度が要求される。これらの点を考慮すれば、基質としてのコラーゲンゲル 薄膜の厚さは好ましくは約 5 μ m〜約 20 μ m、更に好ましくは約 5 μ m〜約 15 μ m以下 であり、より一層好ましくは約 5 m〜約 10 mである。このように非常に薄いコラーゲ ンゲル薄膜を使用することによって、湿潤時の厚さが約 40 m以下の培養角膜内皮 シートを構築可能である。
[0015] コラーゲンゲル薄膜を構成するコラーゲンの種類、由来は特に限定されない。コラ 一ゲンの種類としては I型コラーゲン、 III型コラーゲン、 IV型コラーゲン、 VIII型コラー ゲンなどが挙げることができる。複数の種類のコラーゲンが混在した状態でコラーゲ ンゲル薄膜が構築されて 、てもよ 、。 I型コラーゲンによって (又は主要成分を I型コラーゲンとして)コラーゲンゲル薄膜が 構成されて 、ることが好ま 、。 I型コラーゲン力もなるコラーゲンゲル薄膜上では角 膜内皮細胞の極めて良好な増殖が認められるとともに (後述の実施例を参照）、 I型コ ラーゲンは安定供給が容易だ力 である。
コラーゲンの由来としてはゥマ、ゥシ、ブタ、ヒッジ、サル、チンパンジー、及びヒトを 例示できる。また、遺伝子組換え技術で調製した (リコンビナント)ヒトコラーゲンを使 用してもよい。中でもリコンビナントヒトコラーゲン、ゥマ、ゥシ、又はブタ由来のコラー ゲンであることが好まし 、。入手が容易だ力もである。
[0016] コラーゲンゲル薄膜に生理活性物質が添加されていてもよい。ここでの生理活性物 質としては、細胞増殖因子、分化誘導因子、細胞接着因子、サイト力イン、フイブリン 、トレハロース、タウリンその他のチオールィ匕合物、防腐剤等を例示できる。異なる生 理活性物質を組み合わせて添加してもよ ヽ。
[0017] 培養角膜内皮シートの取り扱いの点及び移植後の形態保持の点などから、コラー ゲンゲル薄膜の強度は原則として高いほどよい。そこで好ましくは、ガラス化処理前 の状態 (コラーゲンゲル）に比較して圧縮破壊強度力 ¾倍〜 20倍 (以下の測定条件で 測定した場合、約 100g〜約 800g程度)であるコラーゲンゲル薄膜が使用される。この 条件を満たすコラーゲンゲル薄膜は、常温での乾燥時の保管維持を約 40日以上行 うことによって得ることが可能である。含有するコラーゲンのゲルィ匕を均一化するため には、ゲルィ匕過程を 15°Cや 4°Cなどに制御して行うことが望ましい。また、乾燥は常温 での風乾が望ましいが、減圧乾燥、凍結乾燥など当該分野で行われる方法を用いる ことができる。細部の条件は製造されるコラーゲンゲル薄膜の強度、透明度、均一性 、細胞接着性、薄膜製造時の容器からの剥離の容易性を指標として適宜変更するこ とが可能である。
[0018] <圧縮破壊強度の測定条件 >
日本電産工業株式会社製の強度測定機 (デジタルフォースゲージ)に接触面積 1.1 3cm2の円形アダプターを取りつけ、 9mm/minの速度で薄膜を押し、薄膜破断時の最 大負荷を測定する。
[0019] 一方、培養角膜内皮シートの透明度を高めて高い治療効果を発揮させるため、コラ 一ゲンゲル薄膜の透明度は高いほどよい。そこで好ましくは、ガラス化処理前の状態
(コラーゲンゲル）に比較して 400nmにおける吸光度が 10%〜70% (吸光度約 0.1〜0. 2程度)であるコラーゲンゲル薄膜が使用される。この条件を満たすコラーゲンゲル薄 膜は、乾燥後の保管維持を約 40日以上行うことによって得ることが可能である。ゲル 化過程を 15°Cや 4°Cなどに制御して行うこともできる。また、常温での風乾が望ましい 力 減圧乾燥、凍結乾燥など当該分野で行われる方法を用いることができる。
[0020] ここで、本発明では支持体が付 、たコラーゲンゲル薄膜を用意することが好ま ヽ 。支持体の使用によって、コラーゲンゲル薄膜の形態を維持することができる。同時 に、薄膜製造時の容器力もの剥離が容易となる。その結果、以下の角膜内皮細胞の 播種時又は培養中におけるコラーゲンゲル薄膜の平坦性の確保及び維持を図ること ができ、細胞の接着性、増殖性、組織ィ匕が良好となり、高品質の細胞層が構築される 。また、形成された細胞層をコラーゲンゲル薄膜とともに回収する際、支持体をピンセ ットで掴む等して比較的容易にコラーゲル薄膜を培養容器力 剥離することができる 。つまり、支持体を用いることによって、作製された培養角膜内皮シートを回収する際 の操作性も向上する。更には、支持体によってその形態を維持した状態で培養角膜 内皮シートを回収できることから、形成された細胞層を損傷することなぐ移植器具に 移動できる。し力も移植に適した平坦性の高い培養角膜内皮シートを得ることができ る。
[0021] 支持体が付いたコラーゲンゲル薄膜は例えば以下の手順で用意することができる。
まず、支持体としてドーナツ状に成形したナイロン膜を用意する。次にナイロン膜を培 養皿に入れる。その後、上述した通りの手順で、コラーゲンゾルの調製及び培養皿へ の添加、ゲル化、及びガラス化を実施する。以上の工程を得て、外周部分の片面側 に支持体が付着したコラーゲンゲル薄膜が完成する。
支持体の材質として、ナイロンなどの合成繊維 (合成樹脂)、綿などの天然繊維、ポ リ乳酸などの生体吸収性材料、及び金属を例示することができる。一方、支持体の形 状は好ましくは環状（円、楕円、四角等)である。
支持体が付 ヽたコラーゲンゲル薄膜を用いて形成された培養角膜内皮シートの場 合、培養角膜内皮シートを患者に移植する前 (培養角膜内皮シートの調製後力 培 養角膜内皮シートの移植直前までの間）に支持体が除去される。
[0022] (2)角膜内皮細胞を用意するステップ
(2-1)角膜内皮細胞の採取
角膜内皮細胞はレシピエント自身又は適当なドナーの角膜から常法で採取するこ とができる。例えば、角膜組織のデスメ膜と内皮細胞層を角膜実質力 剥離した後、 培養皿に移し、デイスパーゼなどで処理する。これによつて角膜内皮細胞はデスメ膜 より脱落する。デスメ膜に残存している角膜内皮細胞はピペッティングなどによって脱 落させることができる。デスメ膜を除去した後、必要に応じて、角膜内皮細胞が成育 できる適当な培養液中で角膜内皮細胞を培養する。培養液としては例えば市販の D MEM (Dullbecco's Modified Eagle's Medium)や Optiso卜 MEMに FBS (ゥシ胎仔血清） 、 b-FGF (basic- fibloblast growth factor)、 EuF (epidermal growth factor)、 insmin、及 びペニシリン、ストレプトマイシンなどの抗生物質を適宜添カ卩したものを使用すること ができる。
[0023] 培地中に添加する血清としては、ヒト血清、牛胎仔血清、羊血清などを用いることが できる。中でも、同種由来の血清 (ヒト血清）を使用するか、自家血清 (即ちレシピエン ト自身の血清）を使用することが好ましい。勿論、可能であれば、免疫拒絶反応の惹 起のおそれがなくなる自家血清を使用することが最も好ましい。たとえば、市販の AC F培地（Stem Alpha, Saint-Clement Les Places, France)などのような異種動物由来 の蛋白成分を全く含有しない無血清培地を用いることもできる。即ち、本発明におけ る培養方法として無血清培養法を採用してもよい。このような態様では、血清由来の 成分の混入による免疫拒絶等の問題を回避することができる。
[0024] 培養容器 (培養皿）にはその表面に I型コラーゲン、 IV型コラーゲン、フイブロネクチ ン、ラミニン、又はゥシ内皮細胞の細胞外マトリックスなどをコーティングしてあるもの を使用することが好ましい。角膜内皮細胞の培養容器表面への接着が促され、良好 な増殖が行われるからである。あるいは、合成高分子などの表面がナノテクノロジー 技術で処理されて角膜内皮細胞の増殖に適する界面構造を有する素材を用いるこ とちでさる。
[0025] 角膜内皮細胞を培養する際の温度条件は角膜内皮細胞が成育する限りにおいて 特に限定されないが例えば、約 25°C〜約 45°C、増殖効率を考慮すれば好ましくは約 30°C〜約 40°C、更に好ましくは約 37°Cである。後に継代培養を行う場合の培養時間 (即ち初代培養の時間）は、使用する細胞の状態などによっても異なるが例えば?〜 1 4日間である。
ここで、利用可能な場合にはレシピエント自身の角膜内皮細胞を用いることが好ま しい。移植に供した際に免疫拒絶反応の惧れが無い角膜内皮様シートの作製が可 能となり、即ち免疫拒絶反応を伴わない移植術が可能となるからである。レシピエント 自身の角膜内皮細胞が入手できないか或は入手が困難な場合にはレシピエント以 外の角膜内皮細胞を用いることもできる力 この場合には免疫適合性を考慮してドナ 一を選択することが好まし 、。
[0026] (2-2)継代培養、細胞浮遊液の調製
培養に供された角膜内皮細胞が増殖した後に継代培養を行うことができる。好まし くはサブコンフルェントな 、しコンフルェントになった時点で継代培養を行う。継代培 養は次のように行うことができる。まず細胞培養液を除去後、 PBS (-)液にて細胞を洗 浄の後、トリプシン- EDTA等で処理することによって細胞を培養容器表面力も剥がし 、次いで細胞を回収する。回収した細胞に培養液を加えて細胞浮遊液とする。細胞 を回収する際、或は回収後に遠心処理を行うことが好ましい。力かる遠心処理によつ て細胞密度の高い細胞浮遊液を調製することができる。尚、ここでの遠心処理の条 件としては例えば、 500 rpm (30g)〜1000 rpm (70g)、 1〜10分を挙げることができる。 細胞浮遊液は上記の初代培養と同様に培養容器に播種され、培養に供される。継 代培養は上記の初代培養と同様の培養条件で行うことができる。培養時間は使用す る細胞の状態などによっても異なるが例えば?〜 21日間である。以上の継代培養は 必要に応じて複数回行うことができる。継代培養を繰り返すことにより細胞数を増加で き、また細胞密度の高い細胞浮遊液を調製することができる。最終的に約 5 X 105細 胞 Zml〜2 X 106細胞 Zmlの細胞密度を有する細胞浮遊液を調製することが好ましい
[0027] 以上で説明したステップ (1)とステップ (2)は独立して実施される。従って、いずれの ステップを先に（又は両者を同時に)行ってもょ 、と 、えるが、各ステップで扱う材料 ( 即ち、コラーゲン、細胞)の性質を考慮すれば、通常は、コラーゲンゲル薄膜の用意 を先行して実施する。
[0028] (3)角膜内皮細胞を播種及び培養するステップ
このステップでは、角膜内皮力も調製された角膜内皮細胞を、上記の手順で調製し たコラーゲンゲル薄膜上に播種する。具体的には例えば、培養容器内に調製したコ ラーゲンゲル乾燥体に培養液を添加し、インキュベート (例えば 37°C、 5分〜 20分程 度)する。このようにして得られた、ガラス化されたコラーゲンゲル薄膜上に角膜内皮 細胞浮遊液を播種する。この際、最終的に作製される培養角膜内皮シートにおいて 所望の細胞密度の細胞層が形成されるように播種する細胞数を調整することが好ま しい。具体的には細胞密度が約 2,000〜約 4,000細胞 Zmm2の細胞層が形成されるよ うに例えば、 1 mm2あたり約 3, 000個〜約 7,500個、好ましくは約 5,000個〜 7,500個の 細胞を播種する。培養は上記の初代培養などと同様の条件で行うことができる。培養 時間は使用する細胞の状態などによっても異なるが例えば 3日〜1ヶ月である。
[0029] 角膜内皮細胞の培養は、異種動物細胞非存在下で行うことが好ま 、。本発明に おいて「異種動物細胞非存在下」とは、角膜内皮細胞を培養する際の条件として、当 該角膜内皮細胞に対して異種である動物の細胞が使用されないことをいう。具体的 には角膜内皮細胞としてヒト角膜内皮細胞を使用する場合に、マウスやラット等、ヒト 以外の動物種の細胞が培養液中に存在 (併存)しな 、条件のことを 、う。このような条 件で培養を実施することによって、最終的に得られる移植材料 (即ち培養角膜内皮 シート)の細胞成分に異種由来の成分 (異種細胞自体を含む）が混入するおそれが なくなる。尚、初代培養 (及び必要に応じた継代培養）についても、異種動物細胞非 存在下で行われることが好ま U、。
[0030] 角膜組織力 回収した角膜内皮細胞を一旦培養し増殖させた後にコラーゲンゲル 薄膜上に播種するのではなぐ直接コラーゲンゲル薄膜上に播種して培養することに してもよい。つまり、コラーゲンゲル薄膜上への播種前に行う培養工程 (角膜内皮細 胞の初代培養及び継代培養)を省略してもよい。このようにすれば、培養操作を簡略 化でき、実質的に一段階の培養操作によって角膜内皮細胞層の構築を行える。
[0031] (4)培養角膜内皮シートを回収するステップ 以上の方法で培養することにより、コラーゲンゲル薄膜上に角膜内皮由来の細胞か らなる細胞層が形成された培養角膜内皮シートが得られる。培養容器とコラーゲンゲ ル薄膜との間の接着を解除することによって培養角膜内皮シートを回収することがで きる。例えばピンセットやメスなどを用いてコラーゲンゲル薄膜を剥離する。ここで、支 持体付きのコラーゲンゲル薄膜を用いて培養角膜内皮シートを作製した場合、支持 体をピンセットで掴む等して比較的容易にコラーゲル薄膜を培養容器力 剥離する ことができる。また、支持体によって、剥離時におけるコラーゲンゲル薄膜ひいては培 養角膜内皮シートの形態を維持できる。このように、支持体付きのコラーゲンゲル薄 膜を使用すれば、状態のよい培養角膜内皮シートを容易な操作で回収することがで きる。
[0032] (培養角膜内皮シートの提供形態）
本発明の培養角膜内皮シートは、例えば、ガラスやプラスチックの容器に収納され 、細胞培養用培地や UW液等の保存液などに浸漬された状態で提供される。
[0033] (培養角膜内皮シートの適用症例）
以上の方法で作製された培養角膜内皮シートは角膜内皮の移植が必要な疾患、 例えば水疱性角膜症、角膜浮腫、角膜白斑、円錐角膜の治療における移植材料（ 角膜内皮の代替)として用いることができる。
[0034] (培養角膜内皮シートの移植方法）
移植方法の例としては全層トレパネーシヨン法及び深層角膜切除法を挙げることが できる。前者の方法はトレパンを用いて一旦角膜全層を採取し、角膜内皮細胞層を 本発明の培養角膜内皮シートで置き換えた後にレシピエントに戻す方法であって、 具体的には次のように行うことができる。まず、レシピエント (ホスト）の角膜をトレパン にて全層切開し、角膜の一部（又は全部）をボタン状に採取する。次に採取された角 膜片からデスメ膜、及び角膜内皮細胞層を剥離する。露出された角膜実質上に本発 明の培養角膜内皮シートを接着させる。この際、コラーゲン層が実質側となるようにす る。その後、角膜片をレシピエントに戻し、縫合糸を用いて固定する。
他方、深層角膜切除法は角膜全層を摘出するのではなく角膜深層部のみを切除 するものであって、レシピエントへの負担がより少ない方法と考えられる。具体的には 次のように行うことができる。まず、レシピエントの角膜実質の一部を剥離し、角膜実 質深層の一部とデスメ膜及び内皮細胞層の一部を切除する。尚、内皮細胞層のみ、 又は内皮細胞層及びデスメ膜のみを剥離切除してもよい。次に、本発明の培養角膜 内皮シートをスパーテルなどを用 、て切除部に挿入する。必要に応じて前房内に空 気を注入して移植片の固定を行う。
尚、移植した培養角膜内皮シートが生体における角膜内皮細胞層と同様にバリア 機能、ポンプ機能を発揮する力否かは例えば、移植後の角膜厚の変化、浮腫の発 生を調べることによって確認することができる。
実施例
[0035] 1.力-クイザル角膜内皮細胞を用いた培養角膜内皮シートの作製
1 - 1.種々の培養基質を用いた角膜内皮細胞の増殖実験
(1)角膜内皮細胞の採取及び初代培養
培養角膜内皮移植術の開発を目的として、角膜内皮細胞の培養に適した基質を検 索した。 3〜11歳（ヒトの約 15〜40歳に相当）の力-クイザル（Macaca fascicularis)角 膜 (16頭、 32眼)から内皮細胞およびデスメ膜を剥離し、 1.2Uデイスパーゼで 15〜20分 間処理した後に、 I型コラーゲン（collagen type I)あるいは FNC coating mix (AES)で コーティングしたゥエルで、 10%FCSと bFGFを含む DMEM (GIBCOBRL社製）を使用し ·¾ ' しフ^ 0
[0036] (2)継代培養
コンフルェントに達した細胞について、 I型コラーゲン（collagen type I)、 IV型コラー ゲン (collagen type IV)、 FN coating mix、ゼラチン (gelatin)、ポジ一 L—ジジン (poly— L— 1 ysine)、ポリ- D-リジン（poly-D- lysine)のそれぞれでコーティングしたゥエルおよびコ 一ティングなし (uncoated)のゥエルで ϋ代培養を行い、 CellTiter 96 Aqueous One So lution (Promega)を用いて培養 11日目までの角膜内皮細胞数および細胞の形態を比 較した。
[0037] (3)結果'評価
16頭中 11頭の力-クイザルカ コンフルェントに達する培養角膜内皮細胞が得られ た。細胞密度は 824〜2720 cells/mm2 (mean=1806± 715 cells/mm2 )であり、若年サル 内皮は壮年サル内皮より内皮密度が高!、傾向があった（図 1)。
継代細胞を用いた細胞増殖の検討では、 I型コラーゲン、 IV型コラーゲン、又は FN C coating mixでコーティングしたゥエルではコーティングなしのゥエルに比べて有意 に細胞増殖が良好で (Pく 0.001)、細胞形態も良好であった (図 2、 3)。ポリ- L-リジン、 ポリ- D-リジンでコートしたプレート上では細胞増殖は得られな力つた。
[0038] 1 - 2.ガラス化されたコラーゲンゲル薄膜の調製
国際公開第 2005Z014774号パンフレットに記載の方法に従って調製された、厚 さ 10 m〜20 mのガラス化されたコラーゲンゲル薄膜を、旭テクノグラス株式会社（ 千葉、 日本)より入手した。尚、当該コラーゲンゲル薄膜の調製方法の概要を以下に 記載する。
まず、図 5に示すような円形の支持体をナイロンメンブレン (Amersham#RPN1782B) を切り抜いて作製し、滅菌処理後、疎水性ポリスチレン製培養用シャーレに入れた。 氷上で冷却した滅菌コ-カルチューブに細胞培養液 0.5%1型コラーゲン水溶液 (ゥシ I型コラーゲン、新田ゼラチン社製)を加え、均一に混和した。コラーゲン混合液を先 の支持体を入れた疎水性ポリスチレン製培養用シャーレに入れた後、 5%CO /95%
2 空気存在下の 37°Cの保湿インキュベーターで 2時間維持してゲルイ匕した。この終濃 度 0.25%コラーゲンゲルを、 10°C、 40%湿度の条件下のクリーンベンチ内でふたをは ずした状態で無菌的に 2日間完全に乾燥することでガラス化させた。これに 3mlの PBS をカロえることで、ガラス化したコラーゲンゲル乾燥体を再水和した。さらに数回 3mlの P BSでリンスした。さらにこのコラーゲンゲル薄膜を、 10°C、 40%湿度の条件下のタリー ンベンチ内でふたをはずした状態で無菌的に 2日間完全に乾燥させた。その後、室 温で無菌的に保管維持した。以下の実験では、 40日間以上、保管維持したコラーゲ ンゲル乾燥体を使用した。尚、 40日間以上保管維持した場合、コラーゲンゲル乾燥 体を湿潤状態に戻して得られるコラーゲンゲル薄膜は非常に高い透明度及び強度 を有する (詳しくは国際公開第 2005Z014774号パンフレットを参照)。また、乾燥 状態から湿潤状態に移行する際、ほとんど膨潤が認められな!/ヽ。
[0039] 1— 3.培養角膜内皮シートの作製
(1)作製手順 1 - 2.で得られたコラーゲンゲル薄膜を基質として、力-クイザル角膜内皮細胞を 培養し、培養角膜内皮シートを作製した。
まず、コラーゲンゲル乾燥体が付着した培養皿に角膜内皮用培養液 (DMEM、 10% FCS、 2ng/mL bFGF、 50U/mLペニシリン 'ストレプトマイシン）を入れて 37°Cで 15分 間インキュベートし、コラーゲンゲル乾燥体の再水和処理を行った。その結果得られ た湿潤状態のコラーゲンゲル薄膜（10 mもしくは 20 m厚）の上に、 1— 1.の欄に 示した方法（FNC coating mixでコーティングしたゥエルを使用）で継代培養した力- クイザル角膜内皮細胞をトリプシン処理して得られた細胞浮遊液 (細胞密度 1 X 105〜
5 X 105個/ ml)を播種した。 37°C、 5%COの条件で約 7日間培養したところ生体と同様
2
に連続的な単層の細胞層が構築された。一方、 4週間培養後、位相差顕微鏡観察 及びァリザリン染色を実施し、形成された細胞層を構成する細胞形態の記録と細胞 密度を測定した。さらに、角膜内皮の機能に関連するタンパクである、 ZO-1と Na/K A TPaseに対する免疫染色も行った。
[0040] (2)培養角膜内皮シートの評価
測定の結果、形成された細胞層の細胞密度は、正常な角膜内皮と同等の 2800 cell s/mm2であった。一方、細胞層を構成する細胞は、生体の角膜内皮細胞と同等の六 角形の扁平な形態を有していた（図 4)。また、細胞層では、高い均一性で規則正しく 細胞が整列していることが認められた。以上のように、ガラス化されたコラーゲンゲル 薄膜を基質として用いることにより、 in vivoと同等の細胞密度と細胞形態をもつ培養 角膜内皮シートを作製することができた。
一方、免疫染色の結果から、構築された細胞層では良好な細胞間接着構造が形 成されており、細胞間にはタイトジャンクション関連タンパクである ZO-1の発現が確認 された。また、角膜内皮細胞のポンプ機能に関連するタンパクである Na/K ATPaseの 発現も認められた。
以上のように、ガラス化されたコラーゲンゲル薄膜を基質として用いることにより、形 態的、機能的に分ィ匕した角膜内皮細胞のシートの作製に成功した。
[0041] 2.ヒト角膜内皮細胞を用いた培養角膜内皮シートの作製
培養角膜内皮シート移植を実現するために不可欠なのが、ヒトに対して高い安全性 を保証できる培養角膜内皮シートの開発である。そこで、上記の力-クイザル角膜内 皮細胞を用いた検討結果を踏まえ、ヒト角膜内皮細胞を用いて、移植可能な内皮細 胞シートの作製を試みた。
[0042] 2- 1.種々の培養基質を用いた角膜内皮細胞の増殖実験
(1)角膜内皮細胞の採取及び初代培養
まず、 Northewest Lions Eye Bankより入手したヒト角膜 (12眼)から内皮細胞および デスメ膜を剥離し、 1.2Uデイスパーゼで 30分間処理した後に、 FNC coating mix (AES )でコーティングしたゥエルで、 10%FCSと bFGFを含む DMEM (GIBCOBRL社製）を使 用して培養した。
[0043] (2)継代培養
コンフルェントに達したヒト角膜内皮細胞を、 FN coating mixでコーティングしたゥェ ルで継代培養した。内皮細胞数の測定及び細胞の形態を観察し、力-クイザル角膜 内皮細胞を用いた場合と同等の細胞層が構築されたことを確認した。
以上のように、力二クイザル角膜内皮細胞の単離 ·増殖'継代方法に従い、ヒト角膜 内皮細胞の単離 '増殖'継代などの手技を確立させた。
[0044] 2— 2.培養角膜内皮シートの作製
(1)作製手順
1— 2.で得られたコラーゲンゲル薄膜を基質としてヒト角膜内皮細胞を培養し、培 養角膜内皮シートを作製した。まず、コラーゲンゲル乾燥体が付着した培養皿に角 膜内皮用培養液を入れて 37°Cで 15分間インキュベートし、コラーゲンゲル乾燥体の 再水和処理を行った。その結果得られた湿潤状態のコラーゲンゲル薄膜 (約 13 μ m) の上に、 2—1.の欄に示した方法で継代培養したヒト角膜内皮細胞をトリプシン処理 して得られた細胞浮遊液 (細胞密度約 1 X 105〜5 X 105個/ ml)を播種した。 37°C、 5% COの条件で約 7日間培養したところ生体と同様に連続的な単層の細胞層が構築さ
2
れた。一方、 4週間培養後、位相差顕微鏡観察及びァリザリン染色を実施し、形成さ れた細胞層を構成する細胞形態の記録と細胞密度を測定した。さらに、角膜内皮の 機能に関連するタンパクである、 ZO-1と Na/K ATPaseに対する免疫染色も行った。 一方、細胞層を構成する細胞について、核型解析及び細胞増殖関連マーカーの発 現解析を行い、細胞層の安全性を検証した。
[0045] (2)培養角膜内皮シートの評価
測定の結果、形成された細胞層の細胞密度は、正常な角膜内皮と同等の 2780cellS /mm2であった。一方、細胞層を構成する細胞は、生体の角膜内皮細胞と同等の六 角形の扁平な形態を有していた。また、細胞層では、高い均一性で規則正しく細胞 が整列していることが確認された。以上のように、ヒト角膜内皮細胞を用いた場合にお Vヽても in vivoと同等の細胞密度と細胞形態をもつ培養角膜内皮シートを作製すること ができた。
一方、免疫染色の結果から、構築された細胞層では良好な細胞間接着構造が形 成されており、細胞間にはタイトジャンクション関連タンパクである ZO-1の発現が確認 された。また、角膜内皮細胞のポンプ機能に関連するタンパクである Na/K ATPaseの 発現も認められた。
以上のように、ヒト角膜内皮細胞を用いた系においても、ガラス化されたコラーゲン ゲル薄膜を基質として用いて、形態的、機能的に分ィ匕した角膜内皮細胞のシートの 作製に成功した。
一方、細胞層に対する核型解析及び細胞増殖関連マーカーの発現解析の結果、 正常状態の細胞によって細胞層が形成されていていることが確認された。
[0046] 3.一段階培養法による、培養角膜内皮シートの作製
2- 1.の（1)と同様の手順で、ヒト角膜からの内皮細胞およびデスメ膜の剥離及び デイスパーゼ処理を行い、ヒト角膜内皮細胞浮遊液を調製する。この細胞浮遊液を、 FNC coating mix (AES)でコーティングしたゥエルに播種するのではなぐ 2— 2.の（1 )と同様の手順で調製したガラス化されたコラーゲンゲル薄膜上へ播種する。その後 、 2- 2. (1)と同様の操作で角膜内皮細胞を培養する。以上のように、採取したヒト 角膜内皮細胞をコラーゲンゲル薄膜上で直接培養して培養角膜内皮シートを得る。
[0047] 4.培養角膜内皮シートの移植
4—1.深層角膜切除法による移植
患者の角膜 (ホスト角膜)実質を剥離し、中央部?〜 8mm径の実質深層を内皮細胞 層を含めて切除する。あるいは前房内から中央部？〜 8mm径の内皮細胞およびデス メ膜のみを剥離除去する。培養角膜内皮シートをスパーテルにて実質層間あるいは 前房内より挿入し、切除範囲にあわせて留置する。その後、前房内に空気を注入し て移植片を固定する。
[0048] 4- 2.全層トレパネーシヨンでの移植
患者の角膜 (ホスト角膜）中央部を?〜 8mm径のトレパンにて全層切開する。ボタン 上に採取されホスト角膜片のデスメ膜を内皮細胞層ごと剥離する。培養角膜内皮シ 一トを鑷子にて培養皿から取り出した後、 6〜8mmのトレパンにて切開し、それをデス メ膜および内皮細胞層が剥離されたホスト角膜片の実質上に留置する。この際縫合 糸は用いず、スポンジにて水分を吸収し軽度に乾燥させることにより培養角膜内皮シ ートを角膜実質に接着させる。培養角膜内皮シートが留置されたホスト角膜片を 10-0 ナイロン糸にてホスト角膜に縫合する。
産業上の利用可能性
[0049] 本発明の培養角膜内皮シートは、角膜内皮細胞の移植が必要とされる各種疾患に おける移植材料として用いることができる。本発明の培養角膜内皮シートは、生体の 角膜内皮細胞層に極めて近似した構造の細胞層を備える。本発明の培養角膜内皮 シートを構成する細胞層は生体への適合性に優れるとともに、角膜内皮細胞層の機 能であるバリア機能及びポンプ機能を発揮し、損傷した角膜内皮細胞層の再建に極 めて有用なものである。
一方、本発明の培養角膜内皮シートは、採取した角膜内皮細胞を in vitroで培養、 増殖させること〖こよって形成される。したがって、僅かな角膜内皮細胞をもとに移植材 料を作製することが可能であり、角膜内皮細胞数が減少した患者においても自己の 角膜内皮細胞カゝら移植材料を作製できる。このことは拒絶反応を生じな ヽ角膜移植 術を実現できることを意味する。また、障害された部位のみを置換する角膜内皮移植 術が可能となり、これまでの全層角膜移植で問題となっていた術中、術後の合併症を 生じな ヽ理想的な手術法の実現を期待できる。
[0050] この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものでは ない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々 の変形態様もこの発明に含まれる。 本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その 全ての内容を援用によって引用することとする。

Claims

請求の範囲 [1] 厚さが約 20 μ m以下のガラス化処理されたコラーゲンゲル薄膜と、その上に形成さ れた角膜内皮細胞由来の細胞層と、を備える培養角膜内皮シート。 [2] 前記コラーゲンゲル薄膜の厚さが約 5 μ m〜約 10 μ mである、請求項 1に記載の培 養角膜内皮シート。 [3] 前記培養角膜内皮シートの湿潤時の厚さが約 40 μ m以下である、請求項 1に記載 の培養角膜内皮シート。 [4] 前記コラーゲンゲル薄膜が I型コラーゲン力もなる、請求項 1〜3のいずれかに記載 の培養角膜内皮シート。 [5] 前記コラーゲンゲル薄膜に、その形状を維持するための支持体が付 、て 、る、請 求項 1〜4のいずれかに記載の培養角膜内皮シート。 [6] 以下の (1)〜(6)力もなる群より選択される一つ以上の特徴を備える、請求項 1〜5の いずれかに記載の培養角膜内皮シート：
(1)前記細胞層が一層構造である；
(2)前記細胞層の細胞密度が約 2,000〜約 4,000細胞 Zmm2である；
(3)前記細胞層を構成する細胞の平面視形状が略六角形である；
(4)前記細胞層にお 、て細胞がほぼ均一に且つ規則正しく整列して 、る；
(5)前記細胞層において細胞間にタイトジャンクションが認められる；
(6)前記細胞層がポンプ機能を備える。
[7] 前記 (1)〜(6)の特徴の全てを備える、請求項 6に記載の培養角膜内皮シート。
[8] 以下のステップを含む、培養角膜内皮シートの作製方法：
(1)厚さが約 20 m以下のガラス化されたコラーゲンゲル薄膜を用意するステップ；
(2)角膜内皮細胞を用意するステップ；
(3)前記コラーゲンゲル薄膜上に前記角膜内皮細胞を播種し、培養するステップ；
(4)培養後、前記コラーゲンゲル薄膜と、その上に形成された細胞層とを回収するス テツプ。
[9] 前記コラーゲンゲル薄膜の厚さが約 5 μ m〜約 10 μ mである、請求項 8に記載の作 製方法。
[10] 前記培養角膜内皮シートの湿潤時の厚さが約 40 μ m以下である、請求項 8又は 9に 記載の作製方法。
[11] 前記コラーゲンゲル薄膜が I型コラーゲン力もなる、請求項 8〜： LOのいずれかに記 載の作製方法。
[12] 前記コラーゲンゲル薄膜に、その形状を維持するための支持体が付いている、請 求項 8〜： L 1のいずれかに記載の作製方法。
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