KR20080097226A - 결막 조직 시스템 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 결막 줄기 세포를 포함하는 결막 세포를 지닌 조직 시스템에 관한 것이다. 결막 조직 시스템은 결막 세포를 포함하는 분리된 조직으로부터 유도되며, 안구 표면 손상, 특히 손상된 또는 질병에 걸린 결막에 의한 결과물을 치유하기에 적합하다. 조직 시스템은 단순한 단일 배지 배양법 및 지지 물질, 예컨대 인간 양막을 사용하여 생성된다. 생성된 결막 조직 시스템은 손상되었거나 또는 질병에 걸린 대상체의 눈의 안구 표면을 치료하기 위한 이식술에 적합하다.
결막 조직, 결막 줄기 세포, 양막, 안구 손상
Description
본 발명은 조직 시스템, 조직 시스템의 제조 방법 및 손상된 또는 질병에 걸린 안구(ocular) 표면을 회복시키기 위하여 결막 세포를 포함하는 조직 시스템을 사용하는 치료 방법에 관한 것이다. 본원의 조직 시스템은 포유류 결막 세포, 바람직하게는 결막의 원개 영역으로부터 유도된 전구 결막 세포를 포함한다. 본원은 특히 조절된 배양 조건하에서 적합한 지지 물질 예컨대, 양막(amniotic membrane) 상에서 전구 결막 세포를 배양하는 것에 관한 것이다.
줄기 세포는 유기체의 일생 동안 세포 치환 및 조직 재생을 책임지고 있다. 줄기 세포는 특정화된 세포를 발생시키며, 광범위한 증식능을 보유한 불특정화 세포이다. 줄기 세포의 유형에 따라, 이러한 세포는 몇몇 세포 계통으로 분화되거나 및/또는 이식시 조직을 재생시킬 수 있다. 배아 줄기(ES) 세포는 무제한적으로 자기-재생을 하며 다능성인 전형적인 줄기 세포이며, 포배-단계의 배아의 내부 세포 덩이(cell mass)로부터 유도된다. 성체 줄기 세포는 특정화된 미분화 줄기 세포로서, 탄생 후 성인기에 이를 때까지 유기체 내의 세포 치환 및 조직 재생능을 보유한다. 일반적으로 성체 줄기 세포는 ES 세포에 비하여 자기-재생능이 적으며, 그럼에도 여러 계통으로 분화할 수 있으며, 이는 일반적으로 다능성으로 설명된다고 이 해한다. 세포 치료법은 질병에 걸린 또는 손상된 조직을 치유 또는 대체하기 위하여 ES 세포 또는 성체 줄기 세포를 불문하고 줄기 세포를 조작을 포함하나 이에 한정되지 않는 세포 기능장애 또는 손상과 관련된 모든 질병을 치료하는 능력을 보유한다. 이러한 능력은 과학, 의학, 생명공학분야에 엄청난 흥분을 불러일으켰다.
성체 줄기 세포("조직-특정화 줄기 세포")는 골수(Weissman, Science 287:1442-1446, 2000), 신경 조직(Gage, Science 287:1433-1438, 2000), 위장관 조직 (Potten, Phil Trans R Soc Lond. B. 353:821-830, 1998), 표피 조직(Watt, Phil Trans R Soc Lond B. 353:831, 1997), 간장 조직(Alison and Sarraf, J Hepatol. 29:678-683, 1998), 및 중간엽 조직(Pittenger et al., Science 284:143-147, 1999)을 포함하는 성인 신체의 다양한 조직에서 발견된다. 포유류 눈의 각공막윤부 내에서 발견되는 성체 줄기 세포는 건강한 안구 표면의 유지에 필수적이며, 건강한 안구 및 각막 표면의 동적 평형에 관여한다.
눈 표면은 각막, 결막, 및 각공막 경계, 또는 윤부로 알려진 이들 둘 사이의 경계로 구성된다. 눈(optical) 표면은 두 개의 기초 상피 표면, 각막 상피 및 결막 상피를 보유한다. 결막은 속눈썹상에서 시작된 점막피부 접합부에서 눈꺼풀의 내부 표면까지 연장되고 눈 위의 안구 표면을 지나 윤부에서 끝나는 2 내지 3 개의 층상 상피이다. 결막 상피를 지속적으로 대체하는 줄기 세포는 결막 원개에 존재하는 것으로 알려져 있다(Wei et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. 34:1814-28, 1993). 공막 및 눈꺼풀 간의 원개 접합부의 결막의 최상부 및 최하부에 있는 이러한 줄기 세포는 결막 줄기 세포 또는 전구 결막 세포로서 알려져 있다.
결막의 주요 역할은 결막 상피 세포 사이에 산재된 고도로 분화된 상피 세포인 점액소-생성 배상(goblet) 세포에 의한 누액(tears)의 생성을 통하여 안구 표면의 수화 및 윤활작용을 제공하는 것이다. 점액소는 결막 내에 존재하는 배상 세포에 의하여 1차적으로 분비되는 고도로 글리코실화된 단백질이다. 결막 표면 통합성은 배상 세포에서 분비된 안구 점액소의 수준에 의하여 영향을 받는다. 점액소 생성은 결막 세포의 주요 특징이다. 산재된 배상 세포와 함께 층상 결막 상피의 다중층은 안구 표면의 기능적 통합성의 유지를 지속적으로 재생시킨다(Kessing, SV, Acta Ophthalmol 44:439-453, 1966; Lemp, et al., Arch Ophthalmol. 83:89-94, 1970).
점액소 결핍은 알칼리 화상, 화학 및 열 화상, 스티븐스-존슨 증후군(SJS), 신경영양각막염 및 안구 반흔성 유사천포창(OCP)에서 검출된다(Gilbard and Rossi, Ophthalmol. 97:308-312; 1990; Lemp, Int Ophthalmol Clin. 13:185-189, 1973; Tseng et al., Ophthalmol. 91 :545-552, 1984). 결막은 또한 부드럽고 습한 세포 표면을 제공하여 각막 표면상에 눈물막을 지원하도록 하며, 이로써, 차례로 광학적으로 맑은 눈 표면 및 맑은 시야를 제공한다. 따라서, 결막은 각막 상피의 건강을 지원한다. 각막 상피는 맑은 시야를 유지하기 위하여 건강한 결막 표면에 의존하기 때문에, 많은 안구 표면 질환은 결막 손상으로부터 시작되며, 2차적 윤부 및 각막 손상이 따르게 된다. 층상 상피는 기저 세포 증식에 의하여 균형잡힌 최종적으로 분화된 표재성 세포의 지속적인 감소에 의하여 요구되는 지속적인 재구성을 하고 있는 자기-재생 조직이다. 따라서, 건강한 상피 구조를 유지하기 위한, 세포 증식 및 분화 사이의 임계적 균형은 항상 달성되어야 한다.
조직 배양 기법은 각질형성세포 증식 및 성숙시 중요한 그러한 인자를 확인하기 위하여 층상 상피 예컨대, 표피 및 각막에 널리 사용되어왔다. 이 분야의 연구자들은 배양액 내의 레빗 또는 소 결막 상피 세포를 사용하여 왔으며, 일반 인간 결막 각질형성세포의 배양을 위한 수종의 모델이 발달 되어 왔다. 1차 인간 결막 각질형성세포는 사체의 눈으로부터, 혈청 함유 배양 배지를 사용하는 장기 배양에서 증식되었으며, 어떠한 경우, 섬유모세포 영양세포층이다(Lindberg K, Brown ME, Chaves HV, Kenyon KR, Rheinwald JG. In vitro propagation of human ocular surface epitherial cells for transplantation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1993;34:2672-2679.Tsai RJ, Ho YS, Chen JK. The effects of fibroblasts on the growth and differentiation of human bulbar conjunctival epitherial cells in an in vitro conjunctival equivalent. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1994;35:2865-2875).
눈 외상에 대한 임상적 견지에서, 결막의 관련성은 안구 및 원개 결막을 4분하고, 관여된 영역을 결정함으로써 추정하여 왔다. 안구 및 원개(fomiceal) 결막의 관련성은 안구 외상 또는 질병 후 최후 결과에 중요하다고 생각된다(Argueso et ah, Invest Ophthalmol Vis Sci.43:1004-1011, 2002; Dua et ah, Br J Ophthalmol. 845:1379-1383, 2001; Pfister, Opthalmology 90:1246-53, 1983). 예를 들어, 잔존 각막 및 결막 상피가 얇아서 거의 없는 4, 5 및 6도 안구 화상에서, 바람직한 안구 관리는 교대로 각막 및 결막 상피 덮개 양자를 재건하는 회복성 및 재건성의 간섭 으로 시도될 수 있다(Dua, Br J Opthalmol. 82: 1407-11, 1998). 문헌 Nakamura et al, Invest Ophthalmol Vis Sci 44(1): 106-116, 2003에서는, 각막 절편의 재건이 양호한 예후를 지닌 인간 양막(HAM)에 배양된 윤부 줄기 세포를 이식하는 것으로 시도되었다(Shimazaki et al, Ophthalmology 109(7):1285-1290, 2003; Tseng et al., Arch Ophthalmol 116:431-41, 1998; Koizumi et al., Ophthalmology 108(9):1569-1574, 2001). 결막 자가이식과 HAM 상에서 안구 및 원개 영역으로부터 전구체를 배양하는 것이 문헌상 보고된바 있다(Grueterich et al., Surv Ophthalmol. 48(6):631-46, 2003; Wei et al., Invest Ophthalmol Vis Sci 34:1814-1828, 1993).
결막 조직 등가물에 관하여서는, 미국 특허 제7,049,139호에서는 3종의 다른 배지를 사용하여 결막 조직 등가물을 생산하는 다단계 공정에서 HAM 상에서 결막 세포를 배양하는 방법을 개시하였다. 조직 등가물을 제조하기 위하여 사용하는 다른 세 단계에는 1차 배양 배지, 증식성 배양 배지, 및 분화성 배양 배지 내에서 결막 세포를 배양하는 방법을 포함한다. 공개된 3종의 배지 중의 2종은 배지 성분의 하나로서 콜레라 독소를 포함한다. 잠재적인 발암원인 콜레라 독소는 눈에 자극을 유발시킬 수 있다. 다단계 공정은 임상적 이식술을 위한 조직 등가물의 안정성을 향상시키기 위하여 사용된다. HAM에서 무-혈청 조건 하에서 배양된 결막 조직 등가물의 효능은 이식편이 다른 결막 표면 질환을 지닌 7명의 환자에 이식된 후에 연구되었다. 상피화 및 이식 통합성이 연구되었다(Tan et al., Transplantation 77(11):1729-1734, 2004, Ang etal, (2004) Invest Ophthalmol Vis Sci 45 (6):1789-1795). 이 특허는 3단계의 배양, 증식 및 분화를 설명하며, 동시에 3종의 다른 배지를 사용한다. 분화에 사용되는 배지는 칼슘 농도가 높으며, 추가로 콜레라 독소를 포함한다.
조직 등가물 또는 조직 시스템에 대한 대부분의 연구는 기원의 조직의 구조적 및 기능적 특성을 지닌 조직 등가물의 재구성 능력에 집중되었다. 이는 배양시 세포 분화, 예를 들어, 배양 조건 및 에어-리프팅을 조절함으로써 달성된다. 최종적으로 분화된 세포는 제한된 장기 증식능을 보유하나, 이식 후 재생능이 떨어지게 된다. 이와 함께, 안구 표면 이식용 상피 조직 구조의 사용은 세포가 기저 기질층에 충분하게 부착될 것을 요함으로써 외과적 이식 도중 또는 이후 직접적인 기계적 또는 전단력에 의하여 탈피되지 않게 된다. 따라서, 이식된 세포의 증식능을 보존하기 위하여 미세한 균형이 필요하게 되며, 동시에 필요한 조직 기관의 기능적 특성을 확보하도록 하여야 한다. 이상적인 조직 구조는 이식된 세포가 세포 재생 및 조직 대체를 위한 장기 재생 능력을 보유하는 것 중의 하나이다.
발생된 조직 등가물이 종래의 방법으로 이식되는 경우, 예를 들어, 눈에 이식편을 봉합하는 경우, 이는 수이식자에게 불편을 초래할 수 있다. 추가적으로, 질병에 걸린 또는 손상된 눈 부위를 명확하게 볼 수 없기 때문에 봉합 행위는 무봉합 방법에 비하여 더욱 정밀함이 요구된다. 이와 아울러, 이러한 이식술은 그 부위에 상처를 남긴다. 따라서, 무봉합 이식술이 종래의 방법보다 선호되므로, 이식 부위에 봉합 없이 접합될 수 있는 다른 기법 또는 세포-기초 막 전달 시스템의 개발이 필요하다. 문헌 Pfister and Sommers, Cornea 24(5):593-598, 2005에서는 각막 줄 기 세포 이식편을 윤부 함요에 결찰시키는 섬유소(fibrin) 봉합제를 발견하였다.
더 바람직한 결막 조직 등가물의 수요에 응하기 위하여, 본원은 안구 표면상의 손상된 또는 질병에 걸린 조직의 세포 재생 및 대체를 위한 장기(long-term) 재생능을 지닌 조직 시스템을 개시한다. 현재 개시된 결막 조직 시스템의 이점은 상대적으로 단순한 배양 개요를 가지며, 배양, 증식 및 분화를 위하여 사용되는 단일 배지를 사용하고, 독소 예컨대, 콜레라독소 및 고 칼슘 농도를 회피할 수 있다는 점이다.
단일 단계의 세포 배양은 용이하며, 인간 임상 시험 전에 cGMP 설비 내에서의 오염 문제를 최소화할 수 있으며, 무봉합 방법을 사용하여 안구 표면에 도입될 수 있다.
발명의 개요
본원은 적절한 지지 물질, 예컨대, 생체적합성 막 또는 세포외 기질 상에서 배양된 결막 세포를 포함하는 조직 시스템 및 이러한 결막 조직 시스템의 제조 방법을 개시한다. 본 발명의 바람직한 실시상태에서, 결막 세포는 양막, 예컨대, 인간 양막(HAM) 상에서 배양되어 결막 조직 시스템을 생성한다. 바람직하게는, 본원에서 개시한 결막 조직 시스템은 안구 표면상의 결막 조직 등가물이다. 놀랍게도, 본원의 결막 조직 시스템은, 단일 배지 내의 결막 생검을 배양하여 제조되며, 임상용 이식에 사용될 수 있도록 충분히 안정적이고, 층상이며, 접착력이 있다. 바람직하게는, 안정적인 결막 조직 시스템은 수이식자의 눈에 도입된 후 쉽게 분리되지 않으며, 따라서 이 방법의 임상적 성공을 증가시키게 되고, 수이식자의 회복 기간을 감소시켜준다.
결막 조직 시스템의 제조 방법은 결막 세포를 배양하기 위한 단일 배양 배지를 포함하며, 따라서 소망하는 결막 조직 시스템을 생성하게 하는 단순한 시스템을 제공하게 된다. 본 발명의 바람직한 실시상태에서, 단일-단계 배양 배지는 다중층 결막 세포를 포함하는 조직 시스템을 생성할 수 있다. 바람직하게는, 결막 조직 시스템은 다층의 결막 세포를 포함하는 층상 편평 상피를 보유한다. 본 발명의 선호하는 다른 실시상태에서, 결막 조직 시스템은 다층의 결막 세포는 각 층 내의 연접 세포간에 형성된 하나 이상의 데스모좀 구조에 의하여 연결된다. 결막 조직 시스템은 첨단부 미세융모, 세포간 연접, 및/또는 일반 세포골격를 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 실시상태에서, 결막 조직 시스템은 지지 물질 예컨대, 유리 슬라이드의 단순한 배양 개요를 사용하는 HAM 상의 결막 세포 배양에 의하여 생성될 수 있다.
본원에서 사용된, 결막 세포는 전구 결막 세포, 분화된 결막 세포, 또는 이 두 세포 유형의 조합이 될 수 있다. 본 발명의 특정 실시상태에서, 조직 시스템은 전구 결막 세포를 포함하며, 여기서, 조직 시스템 내의 최소한 약 20-90%의 세포는 전구 결막 세포이다. 바람직하게는, 조직 시스템은 최대 약 20%의 최종적으로-분화된 세포를 포함한다. 본 발명의 다른 실시상태에서, 결막 조직 시스템은 안구 표면상의 손상된 또는 질병에 걸린 부위, 예를 들어 결막에 이식되어, 이 부위에서의 결막 표면을 치료 및/또는 복구하게 된다. 본 발명의 특정 실시상태에서, 이식된 세포는 이식 부위로부터 수이식자의 세포 구조 내로 이동하고, 안구 표면의 치료 또는 복구에 도움을 준다. 본 발명의 다른 실시상태에서는, 결막 조직 등가물에 의한 치료는 중대한 합병증 없이 기저 질환을 치료하거나 및/또는 결막 상피화를 유지하게 된다. 바람직하게는 결막 조직 시스템의 통합성은 필요한 만큼 유지되며, 수술 후 양호하게 상피화된 채로 남게 된다. 바람직한 임상적 결과는 치료된 눈의 양호한 기능적 및 심미적 결과이다.
본 발명의 다양한 실시상태에서, 조직 시스템에서 발견되는 결막 세포는 하나 이상의 줄기 세포 마커 유전자 예컨대, 예를 들어, Oct-4를 발현한다. 바람직하게는 결막 조직 시스템 내의 약 30-35%의 세포는 Oct-4-양성이다. 본 발명의 다른 실시상태에서, 결막 조직 시스템은 사이토케라틴 마커 예컨대, AE1, AE3, 사이토케라틴-4 (KA), 사이토케라틴-7(K7), 및 사이토케라틴-19(K19)에 양성인 결막 세포를 포함한다. 케라틴은 상피 세포에서 발현하는 중간 필라멘트 세포질 단백질의 일족이다. 사이토케라틴 AE-1 및 AE-3은 상피 세포의 특징적인 중간 필라멘트 단백질의 마커이다. 사이토케라틴 K4는 비-케라틴화된, 층상 상피의 마커이다. 본 발명의 특정 실시상태에서, 결막 조직 시스템은 점액소 마커, 예컨대, MUC5AC 및 MUC4에 양성인 결막 세포를 포함한다. 본 발명의 또 다른 실시상태에서, 조직 시스템 내의 세포는 세포-특이적 마커 예컨대, P63을 발현한다. 본원은 하나 이상의 상기 마커를 사용하는 조직 시스템 내에 존재하는 결막 세포의 분자 및 세포 특성화를 제공한다. 일 실시상태에서, 결막 조직 시스템 내의 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%의 세포는 AE1, AE3, K4, K7, 및/또는 K19를 발현한다. 바람직하게는, 본원의 결막 조직 시스템은 배상 세포를 포함한다. 본 조직 시스템 내의 배상 세포 밀도는 약 2.5 ± 1.1 배상 세포/100 세포이다. 본 발명의 바람직한 실시상태에서, 조직 시스템은 생육가능한 전구 결막 세포, 예를 들어 조직 시스템 내에 약 200 내지 250만 개의 세포의 범위를 포함한다. 조직 시스템 내에 존재하는 전구 결막 세포의 수는 수이식자의 수요에 따라 증가되거나 또는 감소될 수 있다. 세포의 밀도 범위는 환자의 필요에 따라 다양할 수 있으며, 범위는 1 x 106, 1.5 x 106 및 2 x 106 내지 2.5 x 106 세포/배양액이다.
본 발명의 다양한 실시상태에서, 본 발명은 결막 세포를 전달하기 위한 지지 물질을 포함하는 조직 시스템을 제공한다. 지지 물질은 적절한 생체적합성 막, 예컨대, 양막(HAM)을 포함할 수 있다. 본원의 조직 시스템은 바람직하게는 생체적합성 막(membrane)상에서 결막 세포를 배양하는 것을 포함하며, 이는 눈에 사용되기에 적합하고, 일반적인 상처 치유 과정에 관여하지 않는다.
본원의 결막 조직 시스템은 기술 분야에 잘 알려진 방법을 사용하여 눈의 적절한 부위에 이식될 수 있음에도, 본원은 조직 시스템을 대상체의 눈에 전달하기 위한 무봉합 방법을 설명한다. 본원에서, 용어 "대상체," "환자," 및 "수이식자"는 상호 호환되어 사용할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시상태에서, 본원은 결막 조직 시스템을 대상체의 안구 표면에 전달하기 위한 무봉합 전달 방법을 제공한다. 본 발명의 특정 실시상태에서, 조직 시스템은 본원의 조직 시스템을 수이식자의 눈에 접착하기 위한 조직 접착제 또는 생체적합성 아교를 사용한다. 일 실시상태에서, 생체적합성 아교는 암크릴레이트(Amcrylate) 또는 섬유소 봉합제를 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시상태에서, 생체적합성 아교는 폴리락틴산, 폴리락타이드 글리콜산, 폴리락틴산과 아크릴산염의 공중합체, 및 이들의 모든 조합으로부터 선택된 무균성 조직 접착제이다. 본 발명의 다른 실시상태에서, 생체적합성 아교는 대상체의 눈에 생체적합성인 모든 접착제를 포함한다. 생체적합성 아교를 사용함으로써 더 갈끔하며, 덜 성가시게 될 수 있으며, 봉합보다 안전하며, 따라서, 배양된 결막 이식은 수이식자의 눈에 최소한의 교란을 갖게 하며, 이식된 세포의 최소한 일부가 통합된 외상을 남기게 된다.
다음의 도면은 본 발명의 일부를 구성하며, 본 발명의 주요 특징을 실현 및 증명하기 위하여 포함되었다. 본 발명은 본원에 제공된 특정 실시 상태의 상세한 설명과 다음의 도면에 의하여 더 잘 이해할 수 있다.
도 1: HAM 상에서의 결막 세포 배양 특성. 도 1A는 HAM에서 돌출된 결막 세포의 3일 배양물을 나타낸다. 도 1B는 HAM 상의 세포의 14일 융합 배양물을 나타낸다. 도 1C는 배양 섹션 상의 사이토케라틴 AE-1에 의한 면역형광 염색을 나타낸다. 도 1D는 배양 섹션 상의 사이토케라틴 AE-3에 의한 면역형광 염색을 나타낸다. 도 1E는 20일 배양물의 전조직 표본의 PAS 염색을 나타낸다. PAS는 배상 세포 마젠타(magenta)를 염색한다.
도 2: 결막 조직 시스템 및 결막 생검 내의 MUC5AC 및 MUC4의 발현. 각각 MUC5AC(103 bp) (레인 3, 7) 및 MUC4(102 bp) (레인 4, 8) 마커에 의한 결막에서 배양된 세포 및 결막 생검의 RT-PCR 분석이다. 레인 1은 1 Kb DNA 크기의 마커이다; 레인 2 및 6은 각각 배양된 결막 세포 및 결막 생검의 GAPDH(상시 발현 유전자)이다. 레인 5는 반응 혼합물에 첨가되는 cDNA가 없는 음성 대조구이다.
도 3: 화학적 외상을 발생시킨 레빗 모델 및 외상, 이식 및 치유를 나타내는 이식술. 도 3A는 레빗의 일반적인 눈을 나타낸다. 도 3B는 레빗 결막 상에 넣은 포화된 NaOH 여과지를 나타낸다. 도 3C는 이식 직전의 외상 부위를 나타낸다. 도 3D 및 3E는 이식된 부위를 나타낸다. 도 3F는 외상을 만들고 이를 추적한 대조구 눈을 나타내며, 약간의 외상을 보여준다. 도 3G는 치유된 외상을 나타낸다.
도 4: 외상의 이식 효과의 평가, 잔존하고, 생존한 생체 내 인간 세포의 검출. 도 4A는 (배상 세포 검출을 위하여) PAS로 검출된 일반 레빗의 결막 섹션을 나타낸다. 배상 세포는 마젠타를 염색한다. 도 4B는 배상 세포 및 탈피된 상피가 보이지 않는 외상 부위를 나타낸다. 도 4C는 눈 위에 HAM 만이 이식된 경우의 눈 안의 상피가 없이 상처가 치유되는 것을 나타낸다. 도 4D는 이식 없이 외상만 있는 눈의 상처 치유를 나타낸다. 도 4E는 배양된 결막 세포를 지닌 조직 시스템의 이식 후 외상 부위의 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 나타낸다. 도 4F는 이식 부위에 이식된 인간 및 레빗 세포의 PAS 염색을 나타낸다. 도 4G 및 4H는 이식 부위에서 검출된 항-인간-미토콘드리아-항체-양성 갈색 인간 세포를 나타낸다. 도 4I는 레빗 결막의 상피 하부 영역으로 이동한 인간 세포를 나타낸다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 결막 세포, 즉, 전구 결막 세포, 분화된 결막 세포, 또는 이들의 조합을 포함하는 조직 시스템으로 치료함으로써, 손상 또는 질병에 의한 결막 상피의 파손을 치료하는 신규의 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 결막 조직 시스템은 또한 배상 세포를 포함하며, 이는 타원형이며, 점액소를 함유한 거대 분비과립을 함유한다는 특징이 있다. 본 발명은 결막 조직 시스템의 분리, 증식 및 생성을 설명한다. 본 발명의 바람직한 실시상태에서, 결막 조직 시스템은 조직 시스템의 수이식자의 결막의 기능적 통합성을 복구한다. 바람직하게는, 본원의 결막 조직 시스템은 결막 세포(예컨대, 생검 또는 체외이식편)를 포함하는 조직으로부터 단순한 단일-단계 방법을 사용하여 배양되며, 여기서 세포는 생체 외에서 증식하여 결막 조직 등가물을 형성한다. 이러한 방법이 임상적 이식에 필요한 안정성을 지닌 조직 배양물을 생산할 수 있다는 것은 놀라운 것이었다. 예를 들어, 결막 조직 시스템은 외과적 조작 및 이식 후 구조적 통합성을 확보하기 위한 세포 대 세포 및 세포 대 기질 유착 구조를 포함한다. 이 단일-단계 방법은 바람직하게는 질병에 걸린 또는 손상된 결막의 치료에 사용될 수 있는 결막 생검 또는 체외이식편 내의 세포의 생성, 전구 결막 세포를 포함하는 결막 세포의 증식, 및 조직 시스템의 형성을 지원할 수 있는 배지를 이용한다. 본 발명의 특정 실시상태에서, 단일-단계 방법은 조직 시스템 내의 세포의 최종 분화의 적절한 수준을 지원한다. 이와 함께, 본원은 조직 접착제 또는 생체적합성 아교를 사용하여 환자의 눈 표면에 결막 조직 시스템을 전달하는 신규의 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 실시상태에서, 본원의 결막 조직 시스템은 안구 손상 또는 질환, 결막의 특정 안구 표면 장애를 지닌 대상체의 치료학상의 치료에 사용된 다. 눈 손상은 외상 또는 외상성 장애에 의하여 야기될 수 있다. 본원에서 사용된, "결막 조직 시스템"은 적절한 지지 물질, 바람직하게는 포유류 대상체의 이식에 적합한 지지 물질 상의 결막 세포를 포함하는 세포 집단이다. 바람직하게는, 본원의 결막 조직 시스템은 안구 표면상의 결막 조직 등가물이다. 본 발명의 바람직한 실시상태에서, 조직 시스템은 세포의 다중층 군집에 의한 이식, 예를 들어 외과적 이식 또는 복합 이식이다. 본원에서 용어 "이식편(transplant)," "이식한(transplanting)," "이식된(transplanting)" 또는 "이식술"은 "이식편(implant)," "이식한(implanting)," "이식된(implanted)," "이식술(implantation)," "이식(graft)," "이식된(grafted)," 또는 "이식한(grafting)" 등의 용어와 혼용될 수 있다. 전구 세포 또는 분화된 세포임을 불문하고 결막 세포를 모든 적합한 포유류로부터 획득하는 경우, 인간 조직이 특히 선호되는 조직이다.
본원의 결막 조직 시스템은 예를 들어, 안구 표면 수화 및 윤활성을 복구함으로써 결막 손상 또는 질환이 있는 대상체를 치료하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시상태에서, 결막 조직 시스템은 외상 또는 질환 부위의 점액소-생성 배상 세포를 복구하고, 따라서 누액을 통한 윤활화를 향상시킨다. 바람직하게는, 결막 조직 시스템은 대상체 내에서 부드럽고 습한 세포 표면을 복구하는 기능을 하여 각막 표면상에 누액막을 지원하게 되며, 따라서 시야를 향상시킨다. 본 발명의 바람직한 실시상태에서, 결막 조직 시스템은 각막 상피를 지원하는 건강한 결막을 복구할 수 있다. 따라서, 본원의 결막 조직 시스템은 손상된 또는 질병에 걸 린 결막 상피를 치료하기 위하여 사용할 뿐만 아니라, 2차 각막 및 윤부 손상을 예방하기 위하여 사용될 수도 있으며, 따라서 잠재적으로 2차 윤부 줄기 세포 결핍을 예방하게 된다. 본원에서 개시한 바와 같이 결막 조직 시스템을 이용한 치료에 의하여 신생혈관증식, 만성 염증, 재발성 상피 결손, 또는 기질 흉터가 거의 없거나 또는 없게 된다.
본 발명의 바람직한 실시상태에서, 본원의 결막 조직 시스템은 알칼리 화상, 화학 및 열 화상, 스티븐스-존슨 증후군(SJS), 신경영양각막염, 안구 반흔성 유사천포창(OCP), 눈 수술 예컨대, 익상편 절제술, 녹내장 수술(예컨대, 섬유주절제술 또는 절개 수술), 망막 박리 및 사시 수술 후의 결막 재건, 결막 모반, 잔류 누액 섬유주절제술 여과포, 상윤부 각결막염, 및 기타 결막이 손상되는 안구 표면 질환 또는 외상의 치료에 사용될 수 있다. 결막 조직 시스템은 점액소 결핍 부위를 치료하기 위하여 사용될 수 있다. 본 발명의 특정 실시상태에서, 안구 표면 질환 치료를 위한 본원의 결막 조직 시스템의 치료학적 응용은 각막 손상 및/또는 윤부 줄기 세포 결핍을 치료하는 2차 치료학적 처치와 결합할 수 있으며, 이는, 예를 들어, 본원에 참고자료로서 일체성을 가지고 포함된 미국 특허 출원 제11/043,019호에 개시된 바와 같다. 결막 조직 시스템의 치료학적 응용은 다양한 기간, 예를 들어 일, 주, 월, 또는 년간의 윤부 줄기 세포 결핍의 치료학적 처치에 선행할 수 있다.
"결막 전구 세포," "전구 결막 세포", 및 "결막 줄기 세포"는 상호 혼용이 가능하며, 안결막의 전구체 세포 또는 줄기 세포이다. 결막 전구 세포의 위치 및 분포는 마우스 및 레빗의 원개 영역에 나타난다 (Diebold et al., Graefes Arch Clin Exp Opthalmol 235:268-276, 1997; Pellegrini et al., J Cell Biol 145(4):769-782, 1999). 이러한 전구 세포는 공막 및 눈꺼풀 사이의 원개 연결부의 결막 최상부 및 최하부에 1차적으로 나타난다. 결막 표면상의 결막 상피 세포 사이에 산재된 점액소-생성 배상 세포는 결막 전구 세포로부터 유도된다고 알려져 있다.
본 발명의 바람직한 실시상태에서, 결막 조직 시스템은 전구 결막 세포를 포함하며, 여기서 조직 시스템 내의 최소한 약 20-90%의 세포는 전구 결막 세포이다. 바람직하게는, 전구 결막 세포는 조직 시스템 내 세포의 최소한 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%를 포함한다. 본 발명의 다른 실시상태에서, 결막 조직 시스템은 단지 약 20% 최종적으로-분화된 세포를 포함한다. 바람직하게는, 결막 조직 시스템은 분화된 결막 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는 최종적으로-분화된 세포의 최대 약 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10% 또는 5%를 포함한다.
본 발명의 다양한 실시상태에서, 조직 시스템 내에서 발견되는 결막 세포는 하나 이상의 줄기 세포 마커 유전자 예컨대, 예를 들어, Oct-4, p63. Cormexin43를 발현한다. 바람직하게는 결막 조직 시스템은 약 10-20%, 20-30%, 30-35%, 40-45%, 또는 45-50%의 Oct-4-양성 세포를 포함한다. 본 발명의 다른 실시상태에서, 조직 시스템 내의 결막 세포는 사이토케라틴 마커 예컨대, AE1, AE3, K4, K7, 및 K19, 및 점액소 마커 예컨대, MUC5 AC 및 MUC4에 양성이다. 본 발명의 특정 실시상태에서, 결막 조직 시스템 내 세포의 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 또는 70% 는 AE1-양성 세포, AE3-양성 세포, K4-양성 세포, K7-양성 세포, K19-양성 세포, MUC5AC-양성 세포, 및/또는 MUC4-양성 세포이다. 본 발명의 바람직한 실시상태에서, 결막 조직 시스템은 약 75-80% P63-양성 세포, 및 약 30-35% Oct-4-양성 세포를 포함한다. 본 발명의 다른 실시상태에서, 조직 시스템 내의 세포는 하나 이상의 세포-특이성 마커 예컨대, 예를 들어, P63, oct-4, connexing43, ABCG2를 발현한다(Budak MT, Alpdogan OS, Zhou M, Lavker RM, Akinci MA, Wolosin JM. Ocular surface epithelia contain ABCG2-dependent side population cell exhibiting features associated with stem cells. J Cell Sci. 2005 Apr 15; 118(Pt 8): 1715-24.). 바람직하게는 결막 조직 시스템은 약 40-45%, 45-50%, 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90%, 또는 90-95%의 P63-양성 세포를 포함한다. P63 및 Oct-4는 전구 결막 세포의 마커이며, 배양된 세포 내의 이러한 마커의 존재는 전구 세포 및 분화된 세포의 혼합 세포군을 입증하며, 이는 바람직한 범위에서, 조직 시스템 내에서 단지 약 20%의 최종적으로-분화된 세포가 된다.
본 발명의 바람직한 실시상태에서, 결막 조직 시스템은 배상 세포를 포함한다. 본원의 조직 시스템 내의 배상 세포 밀도는 100 세포당 약 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5 또는 5 개의 배상 세포이다. 본 발명의 특정 실시상태에서, 조직 시스템은 약 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 또는 그 이상의 배상 세포를 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시상태에서, 조직 시스템은, 예를 들어, 조직 시스템 내에서 약 200만 내지 250만 세포의 범위의 생육가능한 전구 결막 세포를 포함한다.
본 발명의 다른 실시상태에서, 전구 조직 시스템 내의 결막 세포의 범위는 약 50만 내지 100만 세포, 100만 내지 150만 세포, 150만 내지 200만 세포, 250만 내지 300만 세포, 또는 300만 내지 350만 세포이다. 조직 시스템 내에 존재하는 전구 결막 세포의 수는 수이식자의 필요에 따라 증가되거나 또는 감소될 수 있다. 바람직하게는 조직 시스템은 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 생육가능한 전구 결막 세포를 포함한다. 일 실시상태에서, 결막 조직 시스템은 약 1-5%, 5-10%, 10-15%, 15-20%, 20-25%, 25-30%, 30-35%, 35-40%, 40-45%, 45-50%, 또는 50-55%의 K4-양성 세포를 포함한다. 본 발명의 다른 실시상태에서, 결막 조직 시스템은 약 1-5%, 5-10%, 10-15%, 15-20%, 20-25%, 25-30%, 30-35%, 35-40%, 40-45%, 45-50%, 또는 50-55%의 K7-양성 세포를 포함한다. 본 발명의 또 다른 실시상태에서, 결막 조직 시스템은 약 1-5%, 5-10%, 10-15%, 15-20%, 20-25%, 25-30%, 30-35%, 35-40%, 40-45%, 45-50%, 또는 50-55%의 K19-양성 세포를 포함한다. 바람직하게는, 결막 조직 시스템은 케라틴 K12를 발현하는 세포를 포함하지 않거나, 또는 단지 소량만을 포함한다. 본 발명의 다른 실시상태에서, 본원의 결막 조직 시스템은 투명하며 이들의 표면상에 각질화된 선조체가 부재한다. 바람직하게는 결막 조직 시스템은 사이토케라틴 K3, 각막-특이성 사이토케라틴을 발현하는 세포가 있더라도 매우 적게 포함한다(Schermer et al., J Cell Biol 103:49-62, 1986).
조직 시스템 내에 큰 세포집단의 존재 또는 결막 전구 세포의 높은 백분율은 포유류 대상체에 이식 후 손상된 또는 질병에 걸린 안구 표면을 치유하는 조직 시 스템의 능력을 매우 크게 촉진하게 된다. 이와 함께, 조직 시스템 내의 결막 전구 세포의 높은 비율은 안구 표면의 건강한 기능에 필수적인 생육가능한 결막 전구 세포를 보유한 안구 표면을 계속적으로 재증식시킴으로써 장기간의 안정적인 시스템을 가능하게 한다. 본 발명의 특정 실시상태에서, 조직 시스템은 복수의 결막 전구 세포 및 최종적으로 분화된 세포를 지닌 세포외 기질, 예를 들어, 양막(예컨대, HAM)을 포함하는 복합 이식편이며, 여기서 복수의 결막 전구 세포는 세포 외 기질 상에서 생체 외 배양된다. 본 발명의 다른 실시상태에서, 조직 시스템은 생체적합성 중합체 상에 결막 세포를 포함한다. 본 발명의 또 다른 실시상태에서, 결막 세포는 상피 조직을 지원하는 인공 기질 상에서 성장한다. 바람직하게는 결막 세포 성장 및 조직 시스템의 형성을 지원하기 위하여 사용된 기질은 조직 층화(stratification)를 촉진한다. 본 발명의 특정 실시상태에서, 기질은 최종 분화를 지원할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시상태에서, 결막 조직 시스템의 생성에 사용된 결막 세포의 공여자는 조직 시스템 이식의 수이식자이다 (즉, 자가 조직 시스템). 다른 실시 상태에서, 결막 조직 생검의 공여자는 결막 조직 시스템의 수이식자가 아닐 수 있다(즉, 이종 조직 시스템). 이종 조직 시스템에서, 바람직하게는 공여자는 생체-적합성 공여자, 예를 들어 수이식자의 근친, 또는 생체 적합한(예컨대, 조직적합성) 사체 (즉, 알러지원 조직 시스템)으로부터의 생검이 될 수 있다. 일반적으로 조직 거부 반응의 문제를 회피하기 위하여 이식된 세포 또는 조직은 이식편의 수이식자와 유전적으로 일치하는 것이 바람직하다.
본원의 조직 시스템을 생성하기 위하여, 우선 결막 세포를 포함하는 생검, 또는 대안적으로 당해 기술 분야에 공지된 방법에 의하여 분리된 결막 세포가 수집되거나 또는 분리되어야 한다. 조직 시스템을 생성하기 위하여 사용된 결막 조직은 특히 선호하는 공급원으로서 인간 조직을 지닌 모든 적합한 포유류로부터 분리될 수 있다. 예를 들어, 결막 조직은 인간 눈의 원개 영역, 예컨대, 원개 결막으로부터 분리되어야 한다. 바람직하게는 결막 전구 세포는 이러한 분리된 조직에서 배양된다. 본원의 방법에 따라 생성된 조직 시스템은 수이식자, 특히 하나 또는 양안에 점액소 결핍, 또는 기타 외상 또는 질환을 지닌 수이식자의 이식에 적합하여야 한다. 본 발명의 선호하는 다른 실시상태에서, 수이식자와 공여자는 동일인이다.
본원과 같이 조직 시스템을 유도하는 공급원으로서 결막 조직을 사용하는 이점은 공여자로부터 결막 조직을 획득하기 상대적으로 쉽다는 것이다. 또 다른 이점은 생검 획득이 모든 후속적인 각막 또는 윤부 손상의 위험을 최소화시킨다는 점이다. 이 절차는 안전하고, 단순하며, 효율적인 소수술을 필요로 하며, 결막 조직의 작은 생검만을 필요로 한다. 이 절차는 무균 상태 및 국소 마취하에서 수행된다. 바람직하게는 생검은 상부 결막 원개의 상부, 또는 하부 결막 원개의 하부의 영역에서 분리된다. 이러한 위치는 전구 결막 세포의 최대 밀도를 제공한다. 인간 결막 생검 시편은 비강 익상편(Girolamo et al., Br J Ophthalmol. 83:1077-1082, 1999) 또는 백내장의 일상적인 수술을 한 환자로부터 획득할 수 있다. 생검을 얻기 위하여, 일반 결막의 절편(예컨대, 1 x 3 mm 크기)은 윤부로부터 1O 내지 15 mm 떨어진 상부 안구 영역에서 제거될 수 있다. 2차 유사한 크기의 생검은 결막 세포의 추가 적 대체 공급원으로 제공되기 위하여 획득할 수 있다. 결막 생검은 예를 들어 조직 시스템의 이식 2 주 전 또는 그 이전에 결막 조직 시스템을 생성하기 위하여 수집될 수 있다. 생검이 분리된 후, 잠재적인 외상 없이 절개될 수 있고, 이동 배지에 놓여, 조직 시스템의 제조를 위하여 실험실로 보낼 수 있다.
공여자로부터 결막 세포를 포함한 조직의 제거 후, 예를 들어, 편의를 위하여 이동될 수 있으며, 본원에 개시된 바와 같이 생검이 조직 시스템을 생성하도록 배양될 수 있다. 충분한 비율의 생검이 이동 중 생육가능한 상태로 잔존하여, 조직 시스템이 이들로부터 유도될 수 있다는 점이 중요하다. 세포의 생육성을 유지하도록 설계된 이동 기기의 예는 참고자료로서 본원에 통합된 미국 특허 출원 제11/385,017호에서 개시하였다. 바람직하게는, 생검은 이동되거나 또는 생검의 생육성을 지원하는 배지 내에서 저장된다. 결막 조직 생검은 수집 후 가능한 빨리 처리하여야 한다. 생검은 무손상 체외이식편으로서, 또는 배양물 내에 위치되기 전에 몇 개의 절편 또는 조각으로 절단되어 배양될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시상태에서, 적절한 지지 물질의 존재에 의하여 조직 생검 내의 결막 세포의 결합을 촉진하고, 따라서 결막 세포의 성장을 촉진시킨다. 일 실시 상태에서, 이동 용기로부터 제거한 후, 생검은 PBS에 넣을 수 있다. 미세 절개 겸자 및 소도를 사용하여, 결막 생검은 예를 들어 0.5 mm의 크기인 여러 개의 소절편(즉, 체외이식편)으로 분할될 수 있다. 그 다음 체외이식편은 배양을 위하여 지지물질 상에 위치될 수 있으며, 배양 배지 내로 조심스럽게 침지될 수 있다. 양막 예컨대, HAM이 지지 물질인 경우, 체외이식편은 양막의 기저막 측에 놓여질 수 있다. 그 다음 체외이식편이 탈 거되지 않도록 주의하면서 배지를 규칙적으로 교환한다. 체외이식편의 세포는 일반적으로 배양액 내에서 수일 후 지지 물질과 융합할 때까지 성장시킬 수 있다.
본 발명의 조직 시스템을 생성시키는 상기 방법의 바람직한 실시상태에서, 결막 조직은 결막 세포, 바람직하게는 결막 전구 세포의 성장을 지원하는 배양 배지 내에서 배양될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시상태에서, 분리된 결막 세포는 단일 배지에서 배양, 증식 및 분화되며, 따라서 복합 배지 성분 및 배지 이동에 관여하는 단계를 회피할 수 있다. 바람직하게는 배지는 비-발암성, 비-자극성 성분을 사용한다. 배지는 바람직하게는 생검 내에 존재하는 결막 세포의 생육성 및 증식 및 전구 결막 세포의 분화능을 유지시켜준다. 배지는 또한 바람직하게는 결막 세포, 예컨대, 전구 결막 세포의 바람직한 성장을 지원한다. 본 발명의 특정 실시상태에서, 배지는 또한 세포 분화를 증진시켜 상피 세포 표현형을 발현하도록 하는 인자를 함유할 수 있다. 결막 조직 시스템을 제조하기 위한 본원의 배양 방법은 모든 영양 세포 또는 영양세포층의 사용을 생략하게 된다.
본 발명의 바람직한 실시상태에서, 본원의 조직 시스템은 결막 세포의 배양, 증식 및 분화를 위한 단일 배지를 사용함으로써 획득할 수 있다. 결막 조직 시스템을 생산하는 본원의 절차는 바람직하게는 이식에 적합한 조직 시스템의 형태로 결막 세포를 큰 세포 집단을 생산하게 된다. 조직된 결막 조직 등가물은 일반적으로 다중층 배열 내에 결막 세포를 포함하며, 바람직하게는 결막 세포 사이에 산재된 배상 세포를 포함한다. 기술 분야에 공지된 모든 안정적인 염기성 배양 배지를 결막 조직 시스템을 배양하기 위한 배지를 생성하기 위하여 사용할 수 있다. 결막 조 직의 배양에 사용되는 바람직한 배지는 둘베코 변형 필수 배지(DMEM), DMEM:F-12 (1:1) 배지, 또는 헴 F-12(1:1) 배지, 바람직하게는 영양 혈청, 예를 들어 혈청 또는 세포의 성장 및 생육성을 유지시키기에 효과적인 영양소를 제공하는 혈청-기초 용액으로 보충된 배지(예컨대, 녹-아웃 혈청, 열-불활성화 인간 혈청, 인간 제대혈 혈청, 인간 혈청 알부민). 배지 내의 영양 혈청의 바람직한 백분율은 약 0.5% 내지 25%, 더 바람직하게는 약 15% 내지 20%이다.
배지는 성장 인자로 보충될 수 있다. 본원에서 사용된, 용어 "성장 인자"는 세포 증식 및 분화를 1차적으로 활성화시키는 세포 표면상의 수용체에 결합하는 단백질을 말한다. 바람직하게는 어떠한 단계에서든 결막 세포의 배양에 사용되는 성장 촉진제는 인간 또는 인간 재조합 기원의 것이다. 결막 조직을 배양하기 위하여 바람직한 성장 인자는 표피 성장 인자(EGF) (예컨대, 인간 EGF, 재조합 인간 EGF), 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF), 인슐린, 아셀레늄산 나트륨, 또는 인간 트렌스페린, 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 다양한 성장 인자의 바람직한 농도는 다음과 같다: (1) 약 5 내지 15 ng/㎖ EGF, 더 바람직하게는 약 10 ng/㎖ EGF, (2) 약 2 내지 10 ng/㎖ bFGF, 더 바람직하게는 약 4 ng/㎖ bFGF, (3) 약 1 내지 10 ㎍/㎖ 인슐린, 더 바람직하게는 약 5 ㎍/㎖ 인슐린, (4) 약 1 내지 10 ㎍/㎖ 트렌스페린, 더 바람직하게는 약 5 ㎍/㎖ 트렌스페린, (5) 약 1 내지 10 ㎍/㎖ 아셀레늄산 나트륨, 더 바람직하게는 약 5 ㎍/㎖ 아셀레늄산 나트륨, 및 (6) 약 1 내지 10 ㎍/㎖ 하이드로코르티손, 더 바람직하게는 약 0.5 ㎍/㎖, 하이드로코르티손.
바람직하게는 배지에 항생제, 예컨대, 페니실린, 스트렙토마이신, 또는 이들 의 조합을 추가로 포함한다. 배지에 사용되는 항생제에 대하여, 항생제 또는 항생제의 혼합물은 바람직하게는 약 40 내지 60 IU/㎖의 페니실린, 약 40 내지 60 ㎍/㎖의 스트렙토마이신, 40 내지 60 ㎍/㎖의 젠타마이신, 및/또는 40 내지 60 ng/㎖의 암포테리신 B를 포함한다. 본 발명의 특정 실시상태에서, 배지는 50 U/㎖의 페니실린-스트렙토마이신을 포함한다. 또 다른 실시 상태에서, 조직 시스템은 예컨대, 눈 자극을 유발할 수 있는 콜레라 독소 등의 발암성 물질을 포함하는 배지 성분을 사용한다.
본 발명의 특정 실시상태에서, 배양 배지는 영양 혈청, 예를 들어, 소 태아 혈청(FBS), 인간 혈청 알부민, 또는 인간 제대혈 혈청으로 추가적으로 보충된 DMEM 또는 DMEM:F-12를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 배양 배지는 하나 이상의 가용성 인자, 예를 들어 0.1% 디메틸 설폭사이드(DMSO), 10 ng/㎖ 재조합 인간 표피 성장 인자(rhEGF), 5 ㎍/㎖ 인슐린, 5 ㎍/㎖ 아셀레늄산 나트륨, 5 ㎍/㎖ 트렌스페린, 5 ㎍/㎖ 하이드로코르티손, 4 ng/㎖ bFGF, 및 하나 이상의 항생제로 보충된다. 본 발명의 다른 실시상태에서, 결막 조직 생검을 이동시키기 위한 배지, 생검을 배양시키기 위한 배지, 및 조직 시스템을 이동시키기 위한 배지를 포함하는 조직 시스템을 제조하기 위한 배지는 비-인간 동물 기원의 혈청 또는 다른 인자를 함유하지 않는다. 이는 이종유전 성분의 조직 시스템의 오염의 위험을 최소화시키는데 도움이 되며, 따라서 인간 투여용 조직 시스템을 안전하게 제조할 수 있다.
본 발명의 특정 실시상태에서, 결막 조직은 적절한 지지 물질 예컨대, 세포외 기질 또는 기타 생체적합성 중합체 상에서 배양될 수 있으며, 이들은 생체코팅 표면, 예를 들어 세포외 기질 담체 또는 생체코팅 페트리디쉬를 보유한다. 바람직하게는, 세포외 기질은 양막, 더 바람직하게는 HAM이다. 지지 물질은 피브리노겐, 라미닌, 콜라겐 IV, 테나신, 피브로넥틴, 콜라겐, 소 뇌하수체 추출물, EGF, 간세포 성장 인자, 각질형성세포 성장 인자, 하이드로코르티손, 또는 모든 이들의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는 하나 이상의 흡착 인자로 생체 코팅된다. 본 발명의 다른 실시 상태에서, 지지 물질은 니트로셀룰로스 여과지 상에 놓여 결막 조직 시스템 자체의 생성을 촉진하게 된다. 니트로셀룰로스 시트는 결막 조직 시스템용 지지체를 추가로 제공할 수 있다. 지지 물질이 양막인 경우, 이는 기저막측이 위로 오도록 니트로셀룰로스 여과지상에 위치시킬 수 있다. 사용하기 전, 막은 모든 양막 상피 세포의 제거하기 위하여 중립 프로테아제(dispase)와 함께 배양될 수 있으며, 결막 세포의 후속적인 성장을 예방할 수 있다.
바람직하게는, 지지 물질은 천연 안구 표면의 특성을 지니며, 이러한 특징은 투명하고, 얇으며, 탄성이 있고, 생체적합성이며, 무혈관, 및/또는 비-항원성을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이와 함께, 지지 물질은 바람직하게는 결막 세포, 전구 또는 분화된 결막 세포의 성장, 및 이식 후 일반 분화 및/또는 통합을 지원한다. 본 발명의 선호하는 다른 실시상태에서, 지지 물질은 조직 시스템의 이식 후 생체 내로 점진적으로 재흡수될 것이다. 이와 함께, 지지 물질은 바람직하게는 비-항원성이다.
양막, 특히 HAM은 본원의 생검된 결막 조직의 배양, 조직 시스템의 생성에 선호된다. 인간 양막의 제조 방법은 당해 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다 (예를 들어, 미국 특허 제6,152,142호, 및 문헌 Tseng et al, (1997) Am. J. Ophthalmol. 124:765-774, 각각은 참고자료로서 본원에 포함). 양막은 상피 표면이 무손상으로, 또는 상피 세포가 노출되어 사용될 수 있다. 예를 들어, 양막은 동결-융해, 효소적 소화, 및/또는 기계적 스크레이핑에 의한 내인성 양막 상피 세포의 제거 및 그 다음의 표면의 성장 인자, 세포외 기질 화합물, 및/또는 흡착-강화 분자에 의한 처리에 의하여 결막 세포의 성장을 강화하도록 제조될 수 있다. 양막은 결막 세포의 생육성 및 성장을 촉진하는 천연 기질이기 때문에 조직 시스템을 생성하는 바람직힌 기질이다. 일 실시 상태에서, 기저막 또는 스트로마측이 위로 오는 양막은 결막 세포 배양용 배양 플레이트상에 부드럽게 고정된다. 생체적합성 막은 눈에 결합되며, 배양된 세포의 존재에 도움에 되는 물질로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 다른 실시상태에서, 결막 조직 시스템은 적절한 지지 물질 예컨대, 조직 시스템을 생성하기 위한 조직 베이스 상에서 배양될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시상태에서, 조직 베이스는 포유류 양막, 마트리겔(Matrigel™), 라미닌, 콜라겐 IV 또는 콜라겐 IV 시트, 테나신, 피브리노겐, 피브로넥틴, 및 피브리노겐과 트롬빈 시트(섬유소 봉합제, Reliseal™), 또는 모든 이들의 조합이다. 조직 베이스는 인간 양막, 라미닌, 콜라겐 IV, 테나신, 피브리노겐, 트롬빈, 피브로넥틴, 또는 이들의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는 지지 물질로 생체코팅 될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시상태에서, 조직 베이스는 인간 양막이며, 더 바람직하게는 생체코팅된 인간 양막이다. 결막 조직은 바람직하게는 세포가 실질적으로 분화없이 증식할 수 있도록 하는 배지, 예를 들어, 영양 혈청 및/또는 하나 이 상의 가용성 성장 인자로 보충된 배양 배지 내에서 배양된다.
일 실시상태에서, 적절한 지지 물질 상에서 배양된 결막 세포는 지지 물질로부터 해리되어 전구 결막 세포에서 분리하게 된다. 다른 실시 상태에서, 결막 세포는 당해 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있는 방법, 예를 들어 자기-친화도 세포 분류(MACS), 또는 형광-활성화 세포 분류(FACS), 또는 면역-표지 또는 면역-형광-염색 기법(예컨대, 고체상 흡착)을 사용하여 분류되어, 안정적인 지지 물질 상에서의 배양 전, 후에 결막 전구 세포 및/또는 분화된 결막 세포의 집단을 분리하게 된다. 상기 방법 중의 하나를 사용하여 강화된 결막 세포의 세포 집단을 분리하는 일 실시 상태에서, 분리된 세포는 전구 세포의 성장 및 손상된 또는 질병에 걸린 눈에 이식을 위한 조직 시스템의 발달을 지원하는 배지와 조건하에서 배양되는 것이 바람직하다.
바람직하게는 결막 세포를 포함하는 조직은 10-20일, 더 바람직하게는 12-14일간 배양되어 결막 조직 시스템을 생성하게 된다. 세포는 당해 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있는 조건, 예를 들어 침지 또는 공기-부양 조건 하에서 배양된다. 바람직하게는 이러한 조건 하에서 배양된 조직 시스템은 최소한 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%의 전구 결막 세포를 포함하게 된다. 본 발명의 바람직한 실시상태에서, 분리된 전구 결막 세포는 전구 결막 세포를 지닌 조직 시스템을 위한 강화된 배지의 존재하에 지지 물질 상에서 배양된다. 바람직하게는, tis 지지 물질은 천연 결막 조직에 근접한 특성을 지니며, 전구 결막 세포의 성장, 및 이식 후 일반 분화를 지원한다. 본원의 조직 시스템이 생성된 후, 수이식자의 이식 위치에 이동되어야 한다. 바람직하게는, 조직 시스템의 이동에 사용되는 수단은 이동 후 이식편으로서 충분히 유용하도록 조직 시스템의 생육성을 유지한다.
바람직하게는 조직 시스템은 심각한 결막 손상 또는 질환을 지닌 대상체 내에서 손상된 또는 질병에 걸린 눈에 이식되며, 안구 표면 손상을 복구할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 심각한 결막 손상 또는 질환을 지닌 대상체는 손상된 또는 질병에 걸린 눈에서 결막 전구 세포가 완전하게 부재하는 것일 수도 있다. 결막 조직 시스템은 각막에 인접한 위치를 포함하는 안구 표면의 모든 위치에 대체 또는 지지되도록 이식될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시상태에서, 결막 조직 시스템은 안구 표면의 공막, 원개 또는 안검판 영역에 이식된다. 결막 조직 시스템은 눈꺼풀의 내부 표면상에 존재하는 결막에 위치될 수 있다. 당해 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있는 다양한 외과적 접근법은 안구 조직 등가물을 선택하고, 수확하고, 수이식자 눈에 적절한 천연 해부학적 영역에 전달하는 것과 관련되어 있다. 이식 전에, 질병에 걸린 또는 손상된 결막은 결막 결함 위에 위치한 자가 또는 이종 결막 조직 시스템에 의하여 제거될 수 있다. 결막 조직 시스템의 이식은 무균 상태 및 국소 마취 상태 하에서 수행된다. 다른 이식편은 결막 조직 시스템, 예를 들어 추가적인 양막 패치 이식편 상에 위치하여 보호 패치 역할을 할 수 있다. 다른 실시 상태에서, 이식편을 보호하기 위하여 콘텍트 렌즈를 조직 시스템 위에 위치시킬 수 있다. 조직 시스템을 수이식자의 눈에 이식하기 위한 외과적 방법은 당해 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다(Nguyen DQ, Hale J, Von Lany H, Harrad RA. Releasable copnjunctival suture for adjustable suture surgery. J Pediatr Ophthalmol Strabismus. 2007 Jan- Feb;44(1):35-8. and Bahar I, Weinberger D, Dan G, Avisar R. Pterygium surgery: fibrin glue versus Vicryl sutures for conjunctival closure. Cornea. 2006 Dec;25(10):1168-72)
당해 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있는 봉합법 및 봉합 기법의 다양한 종류는 이식편을 안구 표면에 고정시키기 위하여 사용될 수 있다. 일반적으로 성공적인 방법이긴 하나, 얇은 조직을 안구 조직에 봉합하는 것은 조직-대-조직 부가, 출혈, 염증, 시야, 안구 표면상의 노출된 봉합부에서 오는 환자의 이물감에 관계된 특수한 문제를 야기한다. 봉합 없이 생물학적으로 안정적인 제품을 사용하여 최적의 조직 부가를 달성하는 목표가 매우 바람직하다. 이와 함께, 수술시간의 감소는 설비 비용을 줄이게 된다.
안구 외상 또는 상태의 복구를 돕기 위하여 적절한 조직 시스템이 필요한 경우, 결과물을 향상시키고, 합병증을 최소화하며, 환자에게 편안함을 제공하고, 절차를 간소화시키는 다양한 안과적 절차에 있어서 봉합을 줄이거나 또는 대체할 필요가 있다. 따라서, 본 발명의 특정 실시상태에서, 본원은 조직 시스템을 환자의 눈에 무봉합 전달하는 것을 제공한다. 이 절차는 생체적합성 접착제 예컨대, 아교, 예를 들어, 조직 접착제로서 사용될 수 있는 암크릴레이트 또는 섬유소 봉합제를 사용하는 것과 관련되어 있다. 이 기법은 각막 및 결막 세포를 손상된 또는 질병에 걸린 눈에 전달하기 위하여 사용될 수 있다. 본원의 조직 시스템의 무봉합 전달법은 각막 윤부에서 유도된 미분화 줄기 세포를 포함하는 조직 시스템으로 사용할 수 있으며, 미국 특허 출원 제11/043,019호에 개시되어 있고, 이는 일체성을 가지고 참고자료로서 본원에 포함되어 있다. 본 발명의 바람직한 실시상태에서, 본원은 암크릴레이트를 사용하는 결막 세포를 포함하는 조직 시스템을 전달하는 방법을 제공한다. 본 발명의 선호하는 다른 실시상태에서, 생체적합성 접착제는 폴리락틴산, 폴리락타이드 글리콜산, 폴리락틴산과 아크릴산염의 공중합체, 또는 이들의 모든 조합으로부터 선택된 무균성 조직 접착제이다. 본 발명의 또 다른 실시상태에서, 생체적합성 접착제는 눈에 생체적합성이 있으며, 봉합보다 더 깔끔하고, 안전하며, 더 간편한 모든 접착제를 포함하여, 수이식자의 눈에 장애를 최소화하면서 배양된 조직 시스템이 외상을 치유하게 된다. 바람직하게는, 조직 시스템에 접착제를 사용함으로써 이식된 세포와 손상된 또는 질병에 걸린 눈의 통합성을 촉진하게 된다.
본원의 결막 조직 시스템은 치료학적 응용, 예를 들어, 치료가 필요한 대상체를 위한 이식편으로서 사용될 수 있다. 본원의 조직 시스템은 치료가 필요한 모든 대상체를 치료하기 위하여 사용될 수 있으며, 인간, 영장류, 및 가정용, 농장, 애완용, 또는 스포츠 동물, 예컨대, 개, 말, 고양이, 양, 돼지, 가축, 레트, 마우스, 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본원에서 사용된 용어 "치료학적," "치료학적으로," "치료하기 위한," "치료," 또는 "치료법"은 치료학적 치료 및 예방학적 또는 예방적 수단을 모두 의미한다. 치료학적 치료는 특정 질병, 상태, 손상, 외상 또는 질환의 증상을 감소 또는 제거하거나 또는 현존하는 질병, 상태, 손상, 외상 또는 질환의 진행을 감속, 완화 또는 치료하는 것을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 이러한 치료법이 필요한 대상체는 치료학적 유효량의 결막 조직 시스템으로 치료하여 기능을 복구 또는 재생시키게 된다. 본원에서 사용된, 결막 조직 시스템의 "치료학적 유효량"은 대상체 내의 결막 세포 또는 조직의 손실, 손상, 이상, 또는 변성에 의하여 야기된 생리학적 효과를 저지 또는 개선하기에 충분한 양이다.
사용된 조직 시스템의 치료학적 유효량은 당해 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있는 다양한 인자, 예컨대, 대상체의 필요성, 대상체의 연령, 생리학적 조건 및 건강, 소망하는 치료학적 효과, 치료 표적인 조직 영역의 크기, 이식 부위, 병리의 범위, 선택된 전달 경로, 및 치료 전략에 달려있다. 당해 기술 분야의 숙련자는 이러한 인자를 환자의 치료에 필요한 본원의 조직 시스템의 치료학적 유효량을 결정하기 위하여 사용할 수 있다. 조직 시스템은 바람직하게는 조직 시스템을 의도한 부위에 이식하는 방법으로 환자에 투여될 수 있으며, 기능적 결손 영역을 재구성 또는 재생시키게 된다.
특정 실시 상태에서, 본원은 유리 슬라이드를 사용하는 비정형이며 단순한 배양 방식으로 HAM 상에서 인간 원개 결막 전구 및/또는 분화된 세포를 배양하는 것과 관련되어 있다. 제조된 조직 시스템은 안구 결막 화상성 외상의 레빗 모델에 의하여 특성화되고 안전성이 평가되었으며, 이는 봉합과 무관하다. 생육가능하며 기능성인 결막으로부터 유도된 이식된 인간 세포는 이 레빗 모델 내에서 추적되었다. 실시예 1 및 2를 참조한다. 본원에서 설명한 바와 같이, 이식편 하부의 비정상적인 혈관 생성, 및 다형핵 백혈구(PMN) 침윤의 관점에서 조직 시스템의 안전성이 대조구와 동시에 비교되었다. 몇몇 결막 상피의 양측 파괴는 원개 또는 결막의 다른 영역으로부터 증식된 배상 세포와 함께 결막 상피의 배양물의 이식에 의하여 치 료될 수 있다(Shatos et al., IOVS 44(6):2477-2486, 2003; Zieske, Eye 8:163-169, 1994; Tsai et al, Prog Retinal Eye Res 16:227- 241, 1997).
다음의 실시예는 본원의 바람직한 실시 상태를 입증하기 위하여 첨부된다. 당해 기술 분야의 숙련자는 실시예 내에서 개시된 기법은 본 발명의 실시시 잘 기능하도록 발명자에 의하여 고안된 것이며, 따라서 실시의 바람직한 상태를 구성하는 것으로 이해하여야 한다. 그러나, 당해 기술 분야의 숙련자는 본원의 관점에서 개시된 많은 특정 실시 상태에서 많은 변화가 가능하며, 본 발명의 사상과 범위 내에서 여전히 유사하거나 밀접한 결과를 도출할 수 있다는 것을 이해하여야 한다.
실시예
1.
결막 조직 시스템의 생성
.
이 실시예에서 개시된 바와 같이 조직 생검으로부터 결막 세포를 배양하는 절차는 매우 단순하며, 현존하는 밀리셀법과는 다르다(Pellegrini et al., J. Cell Biol 145(4):769-782, 1999; Belyakov et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 102(40):14203-208, 2005). 윤리 위원회의 인가를 얻어, 각 환자 및 공여자의 공지 승낙전에 결막 생검의 수집을 시행하였다. 다음의 절차는 헬싱키 선언의 정신을 따르며, 리라이언스 라이프 사이언스(RLS)사의 윤리 위원회의 인가를 얻었다. 약 2 ㎟ 의 인간 결막 조직이 안구주위 수술 과정에서 원개로부터 외과적으로 제거되었다(the Zee Eye clinic, Bandra, Mumbai, India). 결막은 안구 주변 및 눈꺼풀의 내부 표면에서 조심스럽게 수집되었다. 절개된 조직을 즉시 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM), 5% 열 불활성화 소 태아 혈청 (Hyclone USA), 및 50 ㎍/㎖ 페니실린-스트 렙토마이신으로 구성된 이동 배지에 넣는다. 이동 배지의 pH는 7 내지 7.4였다. 생검은 배양시까지 4℃로 저장된다.
조직 생검을 제공한 동일 환자로부터 약 2-5 ㎖의 혈액 시료를 수집하고 각 결막 생검을 중앙에 위치시킨 cGMP 기기로 이동시켰다. 혈액 시료를 감염성 질환인 B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스 (HCV), 매독 및 CMV 등으로 즉시 시험하였다.
그 다음 생검을 생검 내의 결막 세포의 배양을 위한 적절한 기질 상에 위치시킨다. 이 기질 인간 양막 (HAM)을 다음과 같이 제조한다. 공여자의 적절한 공지 승낙을 얻고, 헬싱키 선언의 정신을 따라, 인간 태반을 제왕 절개시 혈청 음성 공여자로부터 획득하였다. HAM 분리에 사용된 방법은 문헌 Tseng et al., Arch Ophthalmol. 116:431-41, 1998에서 설명된 방법과 유사하며, 이는 참고자료로서 본원에 포함된다. 가공된 HAM은 무균성 니트로셀룰로스막에 도포 된 후 5 x 5 ㎠ 의 크기로 절단되었다. 절단편은 사용시까지 -70℃에서 글리세롤 및 FBS을 함유한 DMEM에서 저장한다. 저장 배지의 무균성은 제조일과 냉장 저장 14일 후에 검사하였다. 사용 전, HAM를 해동하고 0.5% Trypsin-EDTA(Gibco-BRL, USA) 용액으로 처리하여, 박피시키고 충분한 배지를 가한 무균성 페트리 플레이트에 보관된 5 x 5 ㎠ 무균성 유리 슬라이드상에서 스트레치시켰다.
결막 전구 세포를 배양 및 증식시키기 위하여, 결막 생검 조직의 상피를 우선 입체현미경하에서 기저 스트로마로부터(거의 완전하게) 분리하였다. 상피 부분을 미세하게 절단하여 10 개의 작은 조각으로 나누고 PBS 및 25 U/㎖ Pen- Strep(Giboc-BRL, USA)으로 전항원 처리한 후 박피와 스트레치된 HAM 위에 위치시켰다. 결막 세포를 포함하는 생검의 조각을 동심원 고리의 방식으로 HAM 상에 두었으며, 접촉 억제에 의하여 세포를 층상 구조로 만들었다. 실험 당일, 생검 조직을 DMEM:F12(1:1), 20% 소 태아 혈청(hyclone, Logan UT), 0.1% DMSO(Sigma USA), 10 ng/㎖ 인간 표피 성장 인자(hEGF)(Sigma USA), 4 ng/㎖ 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF)(R&D MN), 5 ㎍/㎖의 인슐린(Sigma USA), 트렌스페린(Giboc-BRL, USA)과 아셀레늄산 나트륨(Sigma USA) 각각, 0.5 ㎍/㎖, 하이드로코르티손(Sigma USA) 및 50 U/㎖ Pen-Strep로 구성되는 750 ㎕의 배양 배지로 피복하였다. 실험 2일에, 2.5 ㎖의 배양 배지를 준비물에 첨가하고, 이식의 준비가 될 때까지 배지를 2일마다 교환하였다. 세포를 37℃에서 5% CO2 하에서 성장시켰다. 이 단일 배양 배지를 조직 시스템의 제조에 사용하였다.
결막 세포의 증식 및 분화를 위한 동일한 단일-단계 배지를 사용한 방법에 의하여 이식을 위한 조직 시스템을 성공적으로 생산하였으며, 이는 단일 단계 배지와 조합한 이러한 조직 시스템에 필요한 구조적 특성을 지니며, 이 배지는 증식 및 분화를 유지시킨다는 사실은 놀라운 것이었다. 본원은 동일한 배양물 내에서 증식 및 분화된 세포를 달성하였다. 인슐린, hEGF 및 하이드로코르티손 모두는 배양 절차 중에 섬유모세포보다 결막 상피 세포의 성장을 증진시키는 기능을 한다. 14 일간의 배양 후, 전 범위의 양막이 세포에 피복되고 융합되었다.
5 x 5 ㎠ 크기의 배양된 결막 조직 시스템의 반이 실시예 2에서 설명하는 결 막 외상의 레빗 모델의 이종-이식편으로 사용되었으며, 반은 3 조각으로 절단하였다. 한 조각은 RT-PCR에 의하여 세포로부터 RNA를 수집하기 위하여 사용하여 특정 마커의 발현을 측정 및 평가할 수 있게 한다. 두 번째 조각은 파리핀 블럭 내에서 분할을 위하여 준비되었으며, 마지막 조각은 온조직 표본으로서 준비되었다.
RNA 분리 및 RT - PCR : 배양된 결막 세포의 전체 RNA를 TRIzol 법(Invitrogen, USA)에 의하여 분리하였으며, cDNA 합성을 위하여 1 ㎍의 분리된 RNA를 RNase-OUT 리보뉴클레아제 억제제(Invitrogen, USA)로 처리하였다. 역-전사는 반응을 준비하기 위하여 수퍼스크립트 역-전사효소 II(Invitrogen, USA) 및 올리고 dT(Invitrogen, USA)를 사용하여 수행하였다. 점액소의 발현을 확인하기 위하여 MUC5AC 및 MUC4 유전자에 의하여 세포의 RT-PCR을 수행하였다. 2㎕의 cDNA를 Abgene 2X PCR 마스터 믹스(Abgene, USA) 및 적절한 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄 반응을 30 주기 수행함으로써 수행하였다(Shatos et al., IOVS 42(7):1455-1464, 2001; Shatos et al., IOVS 44(6):2477-2486, 2003; 이는 각각 참고자료로서 본원에 포함된다). 이 반응에 사용된 프라이머 서열을 표 1에 나타내었다.
| 유전자 | 프라이머 서열 | 붙임 온도 | 기능 |
| GAPDH | 순-5`ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC3` (SEQ ID NO:1) 역-5`TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA3` (SEQ ID NO:2) | 60℃ | 상시 발현 유전자 |
| MUC5AC | 순-5`TCC ACC ATA TAC CGC CAC AGA3` (SEQ ID NO:3) 역-5`TGG ACG GAC AGT CAC TGT CAA C3` (SEQ ID NO:4) | 65.9℃ | 인간 결막 배상 세포는 이 거대 겔 형성 뮤신을 특이적으로 발현한다 |
| MUC4 | 순-5`GCC CAA GCT ACA GTG TGA CTC A3` (SEQ ID NO:5) 역-5`ATG GTG CCG TTG TAA TTT GTT GT3` (SEQ ID NO:6) | 막 결합 뮤신 |
결막 배양 온조직 표본의 제조 : 배양된 결막 세포를 포함하는 조직 시스템 조각을 표면을 상하지 않도록 절단 유리 슬라이드 상에 펼친다. 소량의 배양 배지를 제거하고, 시료를 실온에서 30분간 포름알데히드로 고정한다. 그 다음으로, 고정된 배양물을 완전히 공기 건조시키고 염색하였다.
조직라벨링 및 조직병리학 : 조직 시스템의 특성을 결정하기 위하여, 복합 세포 배양물을 4% 파라포름알데히드로 실온에서 10분간 고정시켰으며, 탈수시키고, 파리핀을 내장하였다. 약 3㎛ 파라핀 섹션을 제조하였다. 면역형광을 위하여, 탈파라핀 후, 섹션에 항원 복구를 위한 마이크로웨이브 법을 가하고 1X PBS로 10 분간 전항온 처리하였다. 섹션을 0.2% Triton X-100으로 5 분간 처리하였으며, PBS로 15 분간 중간 세척하면서 1% BSA로 1 시간 동안 차단시켰다. 1차 항체 AE-1(1:500) 및 AE-3(1:500) (Chemicon, CA)를 섹션에 첨가하고 40℃로 1일간(overnight) 배양하였다. 섹션을 개별 2차 항체로 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. 섹션을 표본제작용 배지(Sigma US)에 탑재시키고 형광 현미경으로 조사하였다. 과요오드산쉬프(PAS) 염색을 위하여, 온조직 표본과 함께 탈파라핀화된 섹션을 실온에서 0.5% 과요오드산으로 5 분 및 쉬프 시약으로 30분 처리하였다. 섹션을 헤마톡실린으로 대조 염색하였다.
박리된 양막 상에서 배양된 결막 세포의 특성화 : 본원에서 설명한 바와 같이, 사이토케라틴 및 특이적 점액소 타입의 마커(Ohno-Matsui et al., Molecular Vision 11:1-10, 2005)는 배양된 결막 세포에 의하여 발현하는 것으로서 확인되었다. 이식 전에, 결막 조직 시스템은 시험관 내에서 층상화되었다. 생검 후 3일간 배양된 배양물 내에서 성장이 개시되는 것을 보여준 1차 배양물을 양막상의 체외이식편에서 나온 거대 세포와 함께 HAM 위에 위치시켰다(도 1A). 배양 14일 후, HAM의 전 범위가 피복되고 세포와 융합되었다(도 1B). 배양 20일 후, 배양 섹션의 면역형광 염색에 의하여 AE-1 및 AE-3의 세포질 발현이 입증되었다(도 1C 및 1D). 20일의 말일에 준비된 결막 조직 시스템 온조직 표본의 PAS 염색은 배상 세포의 성장 및 분배를 나타내며, 이는 조직 시스템 내에서 일정하게 관찰되는 것은 아니다(도 1E). 결막 조직 시스템 내에서 MUC5AC 및 MUC4의 발현을 검출하기 위한 상보적 RT-PCR 분석은 조직 시스템 및 결막 생검 내의 이러한 두 마커의 발현을 확인하게 된다(도 2). 이하의 실시예 2에서 설명한 바와 같이, 이식된 결막 조직 시스템은 결막 외상을 치료할 수 있었다.
실시예
2
제공된 실시예는 조직 시스템이 이종-이식된 안구 결막 화상성 외상의 레빗 모델의 손상된 눈을 치료하기 위한 실시예 1에서 설명된 평범한 배양 방법을 사용하여 제조된 결막 조직 시스템의 능력을 조사한다. 결막 조직 시스템은 레빗 모델에 조직 접착제를 사용하여 이식하였다. 이식 후, 인간 세포의 생존율 및 통합성을 조직병리학 및 면역염색법을 사용하여 추적하고 평가하였다. 하부의 비정상적인 혈관 형성 및 다형핵 백혈구(PMN) 침윤의 관점에서 결막 조직 시스템의 안전성을 대조구와 병행하여 검사하였다.
화학적 외상을 지닌 레빗 모델은 다음과 같이 준비되었다. 내부 검토 위원회(IRB)의 승인 전에, 동물 윤리 위원회(IAEC), 및 동물실험 감독 및 조절 위원회(CPCSEA)는 본원에서 설명한 바와 같은 동물 프로토콜을 획득하였다. 6 마리의 뉴질랜드 화이트 레빗(중량: 1.5kg; 연령: 6개월)을 케타민(35mg/kg) 및 자일라진(5mg/kg)으로 마취시키고, 유지 봉합을 적용하여 눈꺼풀을 밀어넣었다. 도 3A는 레빗의 일반적인 눈을 나타낸다. 안구-눈꺼풀 결막 상의 외상은 눈의 그 위치에 1N NaOH로 포화된 무균성 여과지(60㎟)를 40초간 위치시킴으로써 생성시킨다(도 3B). 여과지의 제거 후, 손상된 영역의 잔여 상피를 외과용 칼로 제거하고, 상처 부위를 PBS로 자유롭게 세척하였다. 외상을 동물의 한쪽 눈에 생성시켰다. 외상을 생성시키는 방법을 동일 영역에 15일 후 다시 수행하였으며, 전과 같이 10일을 관찰하였다.
이종이식 실험에 있어서, 두 종의 대조구가 있다. 일 대조구는 눈이 손상된 동물이며, 45일간 추적하였다(n=2). 제2 대조구는 눈이 손상된 동물(도 3C)이며, 배양된 결막 세포 없이 HAM으로 피복되었다(n=2). 시험 실험은 본원에서 설명한 바와 같이 외상에 인간 결막 조직 시스템이 이식되었다(도 3D 및 3E). 상부로 접한 배양된 세포를 지닌 20㎟ 조각의 결막 조직 시스템으로 외상을 피복시키며, 가장자리를 암크릴레이트(India, Concord Drugs Ltd, Andhra Pradesh)라는 무균성 조직 접착제를 사용하여 고정한다. 이 고분자는 이소아밀 2-시아노아크릴레이트이며, 단량체는 수분과 접촉시 중합되며, 무독성, 생체적합성, 및 불활성 물질로 나타난다. 이 조직 접착제를 노출 결막 조직상에 이식편을 접착하기 위하여 사용하였다. 5㎕ 액적 4 방울의 조직 접착제를 외상의 4곳의 가장자리에 바르고, 이식편을 위치시켜, HAM이 아교와 접촉하도록 위치시키고 세포가 위에 접하도록 한다.
각 눈을 외상 후 15일간 일일 2회 덱사메타존/젠타마이신 용액으로 처리하였다. 수술 후, 0.5% 시클로스포린 A 및 0.05% 덱사메타존-젠타마이신 용액을 첫주에는 안약으로 1일 3회 투여하고, 그 이후에는 1일 2회 투여하였다. 동물들을 1달간 추적하였다. 이식편의 효능은 대조구 동물과 비교하여 외상 부위의 배상 세포의 재-상피화 및 재발생에 의하여 정량화하였다.
동물 실험의 마지막 단계에서, 레빗을 희생시켰으며, 결막 조직과 함께 전체 안구를 제거하고, 10% 포르말린으로 고정하였다. 레빗을 티오펜톤 나트륨 용액을 심장내 주입하여 희생시켰다. 조직병리학적 평가를 위하여, 대조구 및 치료 부위의 결막 조직을 통상적으로 가공하였으며, ~5 마이크론의 얇은 섹션을 헤마톡실렌 및 에오신 염색제로 염색하였고, 복구 정도를 현미경적으로 관찰하였다. 면역조직화학에 있어서, 섹션을 항원 회수를 가한 후에, 이들에 3% H2O2 수용액을 15 분간 처리하였다. 1차 항체 항-인간 미토콘드리아 항체(Chemicon, CA) 배양을 40℃로 1일간(overnight) 수행하였다. 염색의 나머지 절차는 사용된 벡타염색 엘리트 ABC 키트(Vector Laboratories, Burlingame, CA)의 설명서에 따랐다. 사용된 기질은 디아미노벤지딘(DAB)이었다. 인간 세포의 세포질 내에서 갈색 스파게티 같은 양성 염색 패턴이 광학 현미경(Nikon E600)에 의하여 가시화되었다. 온조직 표본과 함께 과요오드산쉬프 염색, 탈파라핀화된 섹션을 0.5% 과요오드산으로 5 분간 처리하였으며 실온에서 쉬프 시약으로 30분간 처리하였다. 섹션은 헤마톡실린으로 대조 염색되었다.
외상 및 이식 후 임상적 관찰 : 외상 후 24 시간, 모든 눈은 외상 부위 주변에 약간의 출혈을 나타내고 있으며, 외상 부위의 혈액 응고가 나타났다. 48 시간 후, 혈액 응고의 크기가 감소되었으며(데이터 미기재), 출혈도 감소되었고, 외상의 부위도 구분될 수 있었다. 결막 조직 시스템의 이식 후 관찰되는 알러지 반응도 없으며, 거부 반응도 없었다. 눈은 진정되었으며, 관찰 기간 중 비정상적인 혈광 생성도 관찰되지 않았다. 외상만을 지닌 눈을 실험 종료일까지 관찰하였으며, 발생된 원래의 외상의 2/3를 나타내었다(도 3F). 결막 인간 세포를 포함하는 조직 시스템이 이식된 눈은 절개를 위하여 동물을 사멸시키기 직전에 그 부위의 표면 통합성 및 및 혈관 생성의 관점에서 건강해보였다(도 3G).
결막 조직 시스템이 레빗 모델의 손상된 눈을 치료하는 능력을 평가하기 위하여, 눈을 일반 레빗 결막 섹션과 비교하였으며, 이들은 배상 세포의 건강한 집단을 보유하였고, 도 4A에 나타내었다. 외상 후, 외상 부위에서 배상 세포를 전혀 관찰할 수 없었으며, 상피가 탈피되었다(도4B). 이와 함께, 외상만을 지닌 대조구 동물의 섹션은 왜곡된 상피 세포를 나타내었으며 혈관이 PMN의 완만한 침윤으로 울혈되었다. 박리된 HAM가 외상 부위에 이식된 대조구 레빗에서는, 상피가 재생되지 않았으며, 대부분의 영역에서 탈피되었다(도 4C). 그 부위에서 소량의 배상 세포도 발견되지 않았으며, 혈관은 충혈되었고, 침출된 RBC가 도처에서 관찰되었다. 이식을 받지 않은 대조구 레빗의 경우에도 침출된 RBC가 도처에서 관찰되었다(도 4D). 이식 전에, 결막 조직 시스템은 시험관 내에서 층상화된 것으로 나타났다. 조직 시스템을 레빗 모델에 이식한 지 1 개월 후, 세포는 도포 부위에서 무손상인 것으로 관찰되었으나 계속적인 것은 아니었다(도 4E 및 4F). 결막 조직 시스템이 이식된 시험한 눈의 섹션은 산재된 인간 및 레빗 세포 모두를 지닌 다층 상피를 나타내었다. 배상 세포 및 산재된 내피 세포의 재발생은 외상 부위의 세포의 재생 및 치유를 나타낸다.
잔존하거나 생존한 생체 내 인간 세포의 검출 : 이식된 인간 세포 조직 시스템의 HAM의 제자리에서 모두 확인되었으며, 결막 조직 시스템이 이식된 레트 모델의 상피하 영역에 내장되었다(도 41). 이식 부위에 산재된 인간 세포의 관찰 및 HAM5로부터 동물 조직 내부의 세포 이동은 이들이 외상의 치유에 중요한 역할을 하고 있다는 것을 시사한다. 인간 세포는 인간 미토콘드리아가 항-인간 미토콘드리아 1차 항체로 갈색 스파게티와 유사하게 염색된 것에 기초하여 검출되었다. 이동한 세포의 백분율은 동물마다 다양하며, 이동의 일정한 수준이 관찰되지 않았다. 잔존한 인간 세포를 신장시켰으며, 동물 세포와 비교해서 크기가 컸고, 잘 구별되었다. 무균성 조직 접착제 암크릴레이트를 사용하여 수행된 결막 조직 시스템의 무봉합 전달법은 이 방법의 안전성과 편의성을 입증하였다. 이 무균성 조직 접착제는 혈류 내로 흡수되지 않으며, 미용 수술시 동맥과 정맥의 재결합을 위한 봉합 대체물 또는 보충물로써 사용되어왔다. 이식 후, 현미경 관찰에 의하여 레빗의 결막 섹션의 HAM 부분의 하부에 소량의 아교도 남지 않았음을 알게 되었으며, 이는 아교가 이식의 통합시 세척되어야 함을 시사한다. 이식 및 조직 접착제 모두의 안전성은 이식 후 PMN 침윤 및 유도된 모든 비정상적인 혈관 생성의 관찰에 의하여 조사되었다. 분리된 조직에서 만들어진 섹션의 조직병리학적 평가 결과를 표 2에 나타내었다.
| 외상 단독 | HAM 이식을 한 외상 | 결막 조직시스템을 이식한 외상 |
| 왜곡된 상피세포 | 대부분의 영역에서 상피가 탈피 | 다층 상피 |
| 배상 세포가 관찰되지 않음 | 배상 세포가 관찰되지 않음 | 배상 세포의 재발생 |
| PMN 세포의 침윤으로 충혈된 혈관 | 혈관은 충혈되었고, 침출된 RBC가 도처에서 관찰되었다 | 내피세포로 라이닝된 상피하의 PMN 세포의 소상 축적 |
본원의 결막 조직 시스템의 기초적인 신규의 특징을 기술하였음에도, 다양한 생략, 형태 및 세부사항의 치환과 변형은 본 발명의 사상에서 벗어나지 않고도 가능하다는 사실을 이해하여야 한다. 예를 들어, 실질적으로 동일한 기능을 실질적으로 동일한 방법으로 수행하여 동일한 결과를 달성하는 이러한 요소 및/또는 방법 단계의 조합은 본 발명의 범위 내에 있다.
본원에서 개시되고 주장된 모든 합성물 및 방법은 본 발명의 견지에서 과도한 실험없이도 수행되거나 만들어질 수 있다. 본 발명의 합성물 및 방법이 바람직한 실시상태에 의하여 설명되었음에도, 당해 기술 분야의 숙련자라면 변형을 본 발명의 합성물 및/또는 방법 및 단계 또는 단계의 순서에 본 발명의 사상, 범위에서 벗어나지 않고도 적용할 수 있다는 것은 자명하다. 더 자세하게는, 화학적 또는 생리학적으로 관련된 특정 약재는 동일 또는 유사한 결과를 나타내는 한 본원의 약재로 치환될 수 있다는 것은 명백하다. 당해 기술 분야의 숙련자에게 자명한 이러한 모든 유사한 치환 및 변형은 첨부된 청구항에 의하여 정의된 본 발명의 정신, 사상 및 개념 안에 있는 것으로 간주된다.
Claims (63)
- (a) 둘베코 변형 필수 배지(DMEM), DMEM:F-12(1:1) 배지, 또는 햄 F-12(1:1) 배지;(b) 녹-아웃 혈청, 열-불활성 인간 혈청, 인간 제대혈 혈청, 인간 혈청 알부민, 및 소 태아 혈청으로 구성되는 군으로부터 선택된 영양 혈청;(c) 표피 성장 인자(EGF);(d) 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF);(e) 인슐린;(f) 아셀레늄산 나트륨;(g) 트렌스페린; 및(h) 항생제 또는 항생제의 혼합물을 포함하는 단일 배지 내에서 지지 물질 상에서 결막 전구 세포를 포함하는 조직의 세포를 배양하는 단계를 포함하는 결막 조직 시스템의 생성 방법으로서, 단일 배지가 지지 물질 상의 결막 전구 세포의 증식 및 확장을 지원하여 결막 조직 시스템을 형성하는 결막 조직 시스템의 생성 방법.
- 제1항에 있어서, 영양 혈청은 녹-아웃 혈청인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 영양 혈청은 열-불활성 인간 혈청인 것을 특징으로 하는 방 법.
- 제1항에 있어서, 영양 혈청은 인간 제대혈 혈청인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 영양 혈청은 인간 혈청 알부민인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 영양 혈청은 소 태아 혈청인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, EGF는 인간 EGF 또는 재조합 인간 EGF인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 트렌스페린은 인간 트렌스페린인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 단일 배지는 디메틸 설폭사이드를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 항생제 또는 항생제의 혼합물은 페니실린, 스트렙토마이신, 젠타마이신, 암포테리신 B, 및 이들의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 단일 배지는:(a) 15% 내지 20%의 영양 혈청;(b) 5 내지 15 ng/㎖의 EGF;(c) 2 내지 10 ng/㎖의 bFGF;(d) 1 내지 10 ㎍/㎖의 인슐린;(e) 1 내지 10 ㎍/㎖의 아셀레늄산 나트륨; 및(f) 1 내지 10 ㎍/㎖의 트렌스페린을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제11항에 있어서, 단일 배지는:(a) 20%의 영양 혈청;(b) 10 ng/㎖의 EGF;(c) 4 ng/㎖의 bFGF;(d) 5 ㎍/㎖의 인슐린;(e) 5 ㎍/㎖의 아셀레늄산 나트륨; 및(f) 5 ㎍/㎖의 트렌스페린을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제12항에 있어서, 단일 배지는 0.1% 디메틸 설폭사이드를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 지지 물질은 생체적합성 막인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제14항에 있어서, 생체적합성 물질은 양막인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제15항에 있어서, 양막은 인간 양막인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제15항에 있어서, 배양 단계는 양막의 기저막측의 표면상에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 배양 단계는 공급자 세포 없이 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 결막 전구 세포를 포함하는 조직은 결막의 원개 영역으로부터 조직 생검에 의하여 분리하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항의 방법에 의하여 생성된 결막 조직 시스템을 안구 표면에 이식하는 단계를 포함하는 손상된 또는 질병에 걸린 환자의 눈의 안구 표면을 치료하는 방법.
- 제20항에 있어서, 손상된 또는 질병에 걸린 안구 표면은 알칼리 화상, 화학 적 화상, 열 화상, 스티븐스-존슨 증후군(SJS), 신경영양각막염, 안구 반흔성 유사천포창(OCP), 익상편 절제술, 녹내장 수술, 섬유주절제술 수술, 절개 수술, 망막 박리, 사시 수술, 결막 모반, 잔류 누액 섬유주절제술 여과포, 또는 상윤부 각결막염에 의한 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제21항에 있어서, 결막 조직 시스템을 각막 또는 각막의 인접 영역에 이식하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제21항에 있어서, 무균성 조직 접착제를 사용하여 이식된 결막 조직 시스템을 환자의 눈에 접착하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제23항에 있어서, 무균성 조직 접착제는 이소아밀 2-시아노아크릴레이트인 것을 특징으로 하는 방법.
- (i) 결막 전구 세포를 포함하는 조직의 생검을 분리하는 단계;(ii) (a) 둘베코 변형 필수 배지(DMEM), DMEM:F-12(1:1) 배지, 또는 햄 F-12(1:1) 배지;(b) 녹-아웃 혈청, 열-불활성 인간 혈청, 인간 제대혈 혈청, 인간 혈청 알부민, 및 소 태아 혈청으로 구성되는 군으로부터 선택된 영양 혈청;(c) 표피 성장 인자(EGF);(d) 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF);(e) 인슐린;(f) 아셀레늄산 나트륨;(g) 트렌스페린; 및(h) 항생제 또는 항생제의 혼합물을 포함하는 단일 배지 내에서 지지 물질 상에서 조직을 배양함으로써, 단일 배지가 지지 물질 상의 결막 전구 세포의 증식 및 확장을 지원하여 결막 조직 시스템이 형성되는 단계, 및(iii) 환자의 눈의 손상된 또는 질병에 걸린 안구 표면에 결막 조직 시스템을 이식하는 단계를 포함하는 손상된 또는 질병에 걸린 환자의 눈의 안구 표면을 치료하는 방법.
- 제25항에 있어서, 영양 혈청은 녹-아웃 혈청인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제25항에 있어서, 영양 혈청은 인간 혈청 알부민인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제25항에 있어서, EGF는 인간 EGF 또는 재조합 인간 EGF인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제25항에 있어서, 트렌스페린은 인간 트렌스페린인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제25항에 있어서, 단일 배지는 디메틸 설폭사이드를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제25항에 있어서, 항생제 또는 항생제의 혼합물은 페니실린, 스트렙토마이신, 젠타마이신, 암포테리신 B, 및 이들의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제25항에 있어서, 단일 배지는:(a) 15% 내지 20%의 영양 혈청;(b) 5 내지 15 ng/㎖의 EGF;(c) 2 내지 10 ng/㎖의 bFGF;(d) 1 내지 10 ㎍/㎖의 인슐린;(e) 1 내지 10 ㎍/㎖의 아셀레늄산 나트륨; 및(f) 1 내지 10 ㎍/㎖ 트렌스페린을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제32항에 있어서, 단일 배지는:(a) 20%의 영양 혈청;(b) 10 ng/㎖의 EGF;(c) 4 ng/㎖의 bFGF;(d) 5 ㎍/㎖의 인슐린;(e) 5 ㎍/㎖의 아셀레늄산 나트륨; 및(f) 5 ㎍/㎖의 트렌스페린을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제33항에 있어서, 단일 배지는 0.1% 디메틸 설폭사이드를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제25항에 있어서, 지지 물질은 생체적합성 막인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제35항에 있어서, 생체적합성 물질은 양막인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제36항에 있어서, 양막은 인간 양막인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제36항에 있어서, 배양 단계는 양막의 기저막측의 표면상에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제25항에 있어서, 조직의 생검은 결막의 원개 영역에서 분리하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제25항에 있어서, 조직의 생검은 환자로부터 분리하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제25항에 있어서, 손상된 또는 질병에 걸린 안구 표면은 알칼리 화상, 화학적 화상, 열 화상, 스티븐스-존슨 증후군(SJS), 신경영양각막염, 안구 반흔성 유사천포창 (OCP), 익상편 절제술, 녹내장 수술, 섬유주절제술 수술, 절개 수술, 망막 박리, 사시 수술, 결막 모반, 잔류 누액 섬유주절제술 여과포, 또는 상윤부 각결막염에 의한 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제25항에 있어서, 결막 조직 시스템을 안구 표면의 각막 또는 각막 인접 영역에 이식하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제25항에 있어서, 무균성 조직 접착제를 사용하여 이식된 결막 조직 시스템을 손상된 또는 질병에 걸린 안구 표면에 접착하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제43항에 있어서, 무균성 조직 접착제는 이소아밀 2-시아노아크릴레이트인 것을 특징으로 하는 방법.
- (i) 결막 전구 세포를 포함하는 조직의 생검을 분리하는 단계;(ii) 단일 배지 내에서 지지 물질 상에서 조직을 배양함으로써, 단일 배지가 지지 물질 상의 결막 전구 세포의 증식 및 확장을 지원하여 결막 조직 시스템이 형성되는 단계; 및(iii) 결막 조직 시스템을 환자의 눈의 손상된 또는 질병에 걸린 안구 표면에 이식하고, 무균성 조직 접착제를 사용하여 이식된 결막 조직 시스템을 손상된 또는 질병에 걸린 안구 표면에 접착하는 단계를 포함하는 손상된 또는 질병에 걸린 환자의 눈의 안구 표면을 치료하는 방법.
- 제45항에 있어서, 단일 배지는:(a) 둘베코 변형 필수 배지(DMEM), DMEM:F-12(1:1) 배지, 또는 햄 F-12(1:1) 배지;(b) 녹-아웃 혈청, 열-불활성 인간 혈청, 인간 제대혈 혈청, 인간 혈청 알부민, 및 소 태아 혈청으로 구성되는 군으로부터 선택된 영양 혈청;(c) 표피 성장 인자(EGF);(d) 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF);(e) 인슐린;(f) 아셀레늄산 나트륨;(g) 트렌스페린; 및(h) 항생제 또는 항생제의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제46항에 있어서, 영양 혈청은 녹-아웃 혈청인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제46항에 있어서, 영양 혈청은 인간 혈청 알부민인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제46항에 있어서, 단일 배지는 디메틸 설폭사이드를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제46항에 있어서, 단일 배지는:(a) 15% 내지 20%의 영양 혈청;(b) 5 내지 15 ng/㎖의 EGF;(c) 2 내지 10 ng/㎖의 bFGF;(d) 1 내지 10 ㎍/㎖의 인슐린;(e) 1 내지 10 ㎍/㎖의 아셀레늄산 나트륨; 및(f) 1 내지 10 ㎍/㎖의 트렌스페린을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제50항에 있어서, 단일 배지는:(a) 20%의 영양 혈청;(b) 10 ng/㎖의 EGF;(c) 4 ng/㎖의 bFGF;(d) 5 ㎍/㎖의 인슐린;(e) 5 ㎍/㎖의 아셀레늄산 나트륨; 및(f) 5 ㎍/㎖의 트렌스페린을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제51항에 있어서, 단일 배지는 0.1% 디메틸 설폭사이드를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제45항에 있어서, 지지 물질은 생체적합성 막인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제53항에 있어서, 생체적합성 물질은 양막인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제54항에 있어서, 양막은 인간 양막인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제54항에 있어서, 배양 단계는 양막의 기저막측의 표면상에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제45항에 있어서, 조직의 생검은 결막의 원개 영역에서 분리하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제45항에 있어서, 조직의 생검은 환자로부터 분리하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제45항에 있어서, 손상된 또는 질병에 걸린 안구 표면은 알칼리 화상, 화학적 화상, 열 화상, 스티븐스-존슨 증후군(SJS), 신경영양각막염, 안구 반흔성 유사천포창(OCP), 익상편 절제술, 녹내장 수술, 섬유주절제술 수술, 절개 수술, 망막 박리, 사시 수술, 결막 모반, 잔류 누액 섬유주절제술 여과포, 또는 상윤부 각결막염에 의한 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제45항에 있어서, 결막 조직 시스템을 안구 표면의 각막 또는 각막의 인접영역에 이식하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제45항에 있어서, 무균성 조직 접착제는 이소아밀 2-시아노아크릴레이트인 것을 특징으로 하는 방법.
- 조직 시스템을 환자의 눈의 손상된 또는 질병에 걸린 안구 표면에 이식하고, 무균성 조직 접착제를 사용하여 이식된 조직 시스템을 손상된 또는 질병에 걸린 안구 표면에 접착하는 단계를 포함하는 손상된 또는 질병에 걸린 환자의 눈의 안구 표면을 치료하는 방법.
- 실시예와 도면을 참고하여 본원에서 설명한 바와 같이 실질적으로 전술한 청구항에 따라 결막 조직 시스템을 생성하는 방법.
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8372437B2 (en) | 2006-08-17 | 2013-02-12 | Mimedx Group, Inc. | Placental tissue grafts |
| BRPI0810558A2 (pt) * | 2007-04-26 | 2015-07-07 | Medinnova As | Armazenador para transplante |
| US8357403B2 (en) | 2007-09-07 | 2013-01-22 | Mimedx Group, Inc. | Placental tissue grafts |
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| EP2309003A1 (en) * | 2009-09-18 | 2011-04-13 | Bioftalmik, S.L. | Method for the diagnosis of limbal stem cell deficiency |
| US8883210B1 (en) | 2010-05-14 | 2014-11-11 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Tissue-derived tissuegenic implants, and methods of fabricating and using same |
| US10130736B1 (en) | 2010-05-14 | 2018-11-20 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Tissue-derived tissuegenic implants, and methods of fabricating and using same |
| US9352003B1 (en) | 2010-05-14 | 2016-05-31 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Tissue-derived tissuegenic implants, and methods of fabricating and using same |
| CN102266587B (zh) * | 2011-07-20 | 2013-12-04 | 山东省眼科研究所 | 一种含杯状细胞的重组眼结膜上皮膜片的制备方法 |
| US8497124B2 (en) * | 2011-12-05 | 2013-07-30 | Factor Bioscience Inc. | Methods and products for reprogramming cells to a less differentiated state |
| CN104080482B (zh) | 2011-12-05 | 2015-11-25 | 菲克特生物科学股份有限公司 | 用于转染细胞的方法和产品 |
| WO2014143943A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | NuTech Spine, Inc. | Preparations containing hepatocyte growth factor and hyaluronic acid, and methods of making and using same |
| CA2986702C (en) | 2015-05-21 | 2023-04-04 | David Wang | Modified demineralized cortical bone fibers |
| CN108339147B (zh) * | 2017-01-24 | 2021-05-07 | 沈阳何氏眼产业集团有限公司 | 玻璃体或视网膜手术切口用粘合剂及粘合系统 |
Family Cites Families (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT1255657B (it) | 1992-05-29 | 1995-11-09 | Colture di tessuto di mucosa congiuntivale differenziata, procedimentoper la loro preparazione e supporti per il loro uso. | |
| US6152142A (en) * | 1997-02-28 | 2000-11-28 | Tseng; Scheffer C. G. | Grafts made from amniotic membrane; methods of separating, preserving, and using such grafts in surgeries |
| ATE263142T1 (de) * | 1997-08-07 | 2004-04-15 | Cancel Richard | Hochreine alkyl-2-cyanoacrylate |
| WO2000073421A2 (en) | 1999-06-02 | 2000-12-07 | Lifebank Services, L.L.C. | Methods of isolation, cryopreservation, and therapeutic use of human amniotic epithelial cells |
| JP4397082B2 (ja) * | 1999-12-09 | 2010-01-13 | 有限会社ジャパン・オフサルミック・コンサルタンツ | 移植用細胞片及びその作成方法 |
| US20020039788A1 (en) * | 2000-02-29 | 2002-04-04 | Isseroff Roslyn R. | Corneal epithelial graft composites |
| US6921665B2 (en) * | 2000-11-27 | 2005-07-26 | Roslin Institute (Edinburgh) | Selective antibody targeting of undifferentiated stem cells |
| US7347876B2 (en) * | 2001-04-25 | 2008-03-25 | Ray Jui-Fang Tsai | Method for expansion of epithelial stem cells |
| ITRM20010476A1 (it) * | 2001-08-03 | 2003-02-03 | Idi Irccs | Lamine di epitelio corneale umano ricostruite e metodo per il loro ottenimento. |
| WO2003030959A1 (en) | 2001-10-06 | 2003-04-17 | Btg International Limited | Corneal repair device |
| ATE521697T1 (de) * | 2002-03-29 | 2011-09-15 | Singapore Eye Res Inst | Verfahren zum wachstum von menschlichen bindehautgewebeäquivalenten für die forschung, die klinische augenoberflächentransplantation und die geweberekonstruktion |
| ITUD20020092A1 (it) | 2002-04-30 | 2002-07-30 | Univ Degli Studi Udine | Metodo per l'identificazione e l'isolamento di cellule staminali di un tessuto umano |
| US20050186672A1 (en) * | 2004-01-27 | 2005-08-25 | Reliance Life Sciences Pvt. Ltd. | Tissue system with undifferentiated stem cells derived from corneal limbus |
| JP2005218585A (ja) * | 2004-02-04 | 2005-08-18 | National Institute For Materials Science | 医療用材料及びその製造方法 |
| JPWO2006003818A1 (ja) * | 2004-06-30 | 2008-04-17 | アルブラスト株式会社 | 角膜上皮シート及びその作製方法 |
| ZA200602094B (en) * | 2006-01-16 | 2007-11-28 | Reliance Life Sciences Pvt Ltd | Device for culturing and transporting cells |
| US20070185014A1 (en) * | 2006-02-09 | 2007-08-09 | The Schepens Eye Research Institute, Inc. | Methods and compositions for modulating conjunctival goblet cells |
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2008
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Cited By (3)
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|---|---|---|---|---|
| WO2017115962A1 (ko) * | 2015-12-31 | 2017-07-06 | 가톨릭대학교 산학협력단 | 양막 슬라이드 지지체를 이용한 윤부줄기세포 배양방법 |
| CN108699526A (zh) * | 2015-12-31 | 2018-10-23 | 加图立大学校产学协力团 | 用于通过利用羊膜载玻片支架培养角膜缘干细胞的方法 |
| CN108699526B (zh) * | 2015-12-31 | 2023-09-29 | 加图立大学校产学协力团 | 用于通过利用羊膜载玻片支架培养角膜缘干细胞的方法 |
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