TW202122573A - 治療血管疾病之組成物及方法 - Google Patents

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奴丹 普拉森
阿姆里塔 辛格
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Abstract

本發明大體上係關於新穎中胚層源性血管先驅細胞（meso-VPC）及產生該等meso-VPC之方法。本發明亦係關於藉由投予該等meso-VPC至個體中來治療血管疾病（諸如嚴重肢體缺血）的方法。

Description

治療血管疾病之組成物及方法
本發明係關於新穎中胚層源性血管先驅細胞（meso-VPC）及產生meso-VPC之方法。本發明亦係關於使用該等meso-VPC治療血管疾病（諸如缺血）的方法。相關申請案
本申請案基於35 U.S.C. §119(e)主張2019年8月28日申請之美國臨時申請案第62/892,724號之之利益，該美國臨時申請案特此以全文引用之方式併入。
血管疾病為影響身體之血管網路之病狀。超過78,000,000美國人患有最常見形式之血管疾病——高血壓。另外，在美國外周動脈疾病（peripheral artery disease，PAD）影響12,000,000至15,000,000人，且有遠更大量的未確診病例。
外周動脈疾病（PAD）為將血液自心臟運送至其他器官及組織之血管的變窄或堵塞。其主要由動脈中之脂肪斑塊堆積（稱作動脈粥樣硬化）引起。PAD可能發生在任何血管中，但在腿部比手臂更常見。
缺血為由涉及組織、器官或四肢之動脈血供應之中斷的外周動脈疾病所引起的病狀，其若不治療則會引起組織死亡。其可能由栓塞、動脈粥樣硬化動脈之血栓、或創傷引起。靜脈問題，如靜脈流出堵塞及低流速病況可導致急性動脈缺血。腿部缺血會引起腿部活動疼痛或絞痛（跛行）、皮膚顏色變化、瘡或潰瘍及腿部感覺疲倦。循環之整體缺失會引起壞疽及肢體缺失。
血管疾病（諸如缺血）之治療受到限制。大部分治療方法涉及侵入性外科程序，而其他方法集中於預防現有病狀之進展。因此，在所屬技術領域中仍然需要改良的用於血管疾病（諸如缺血）的治療。
本發明係關於藉由多能幹細胞之試管內分化產生中胚層源性血管先驅細胞（meso-VPC）之新穎方法。本發明進一步提供使用本發明之meso-VPC治療血管疾病（例如嚴重肢體缺血）的方法。
因此，在一個方面，本發明提供自多能幹細胞產生中胚層源性血管先驅細胞（meso-VPC）之群體之方法，其中該方法包含在非黏著或低黏著條件下於包含一或多種選自由以下者組成之群的因子之培養基中培養來源於多能幹細胞之中胚層細胞：血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、纖維母細胞生長因子（fibroblast growth factor，FGF）、骨成形性蛋白質4（bone morphogenetic protein 4，BMP4）、及轉形生長因子-β（transforming growth factor-beta，TGF-β）I型受體之小分子抑制劑，藉此產生中胚層源性血管先驅細胞（meso-VPC）之群體。
在一個實施方式中，該中胚層細胞藉由在包含一或多種選自由以下者組成之群的中胚層誘導性生長因子之培養基中培養多能幹細胞而自該多能幹細胞得到：活化素-A、血管內皮生長因子（VEGF）、纖維母細胞生長因子（FGF）、及骨成形性蛋白質4（BMP4）。
在一個實施方式中，該meso-VPC以血管樣物（vasculonoid）形式產生。在另一實施方式中，meso-VPC解離成單細胞。
在一個實施方式中，該中胚層誘導性生長因子包含活化素-A、VEGF165、FGF-2及BMP4。在一個實施方式中，該活化素-A以約5-15 ng/mL之濃度使用。在一個實施方式中，該VEGF165以約5-25 ng/mL之濃度使用。在一個實施方式中，該FGF-2以約5-25 ng/mL之濃度使用。在一個實施方式中，該BMP4以約5-50 ng/mL之濃度使用。在一個實施方式中，該方法進一步包含在培養約24小時之後自該培養基移除活化素-A。
在一個實施方式中，在細胞外基質表面上培養該多能幹細胞。在一個實施方式中，該細胞外基質表面為經基質膠（Matrigel）塗佈表面。在一個實施方式中，培養該多能幹細胞約3天至約5天。
在一個實施方式中，該轉形生長因子-β（TGF-β）I型受體之小分子抑制劑為SB431542。在另一實施方式中，該一或多種因子包含VEGF165、FGF-2、BMP4、及SB431542。在一個實施方式中，該一或多種因子進一步包含弗斯可林（Forskolin）。在一個實施方式中，該弗斯可林以約2-10 µM之濃度使用。在一個實施方式中，該VEGF165以約10-50 ng/mL之濃度使用。在一個實施方式中，該FGF-2以約10-50 ng/mL之濃度使用。在一個實施方式中，該BMP4以約10-50 ng/mL之濃度使用。在一個實施方式中，該SB431542以約5-20 µM之濃度使用。
在一個實施方式中，培養該中胚層細胞進行約3天至約7天。
在一個實施方式中，培養該中胚層細胞係在5% CO2 及20% O2 之常氧條件下進行。
在一個實施方式中，培養該等多能幹細胞係在5% CO2 及20% O2 之常氧條件下進行。
在一個實施方式中，該非黏著或低黏著條件為在超低附著表面上。
在一個方面，本發明提供自多能幹細胞產生中胚層源性血管先驅細胞（meso-VPC）之群體之方法，其中該方法包含（a）在包含一或多種選自由以下者組成之群的因子之培養基中在細胞外基質表面上培養來源於多能幹細胞之中胚層細胞：血管內皮生長因子（VEGF）、纖維母細胞生長因子（FGF）、及骨成形性蛋白質4（BMP4）；及（b）在包含一或多種選自由以下者組成之群的因子之培養基中在細胞外基質表面上培養步驟（a）中所產生的細胞：血管內皮生長因子（VEGF）、纖維母細胞生長因子（FGF）、骨成形性蛋白質4（BMP4）、及轉形生長因子-β（TGF-β）I型受體之小分子抑制劑，藉此產生該中胚層源性血管先驅細胞之群體。
在一個實施方式中，該中胚層細胞藉由在包含一或多種選自由以下者組成之群的中胚層誘導性生長因子之培養基中培養多能幹細胞而自該多能幹細胞得到：活化素-A、血管內皮生長因子（VEGF）、纖維母細胞生長因子（FGF）、及骨成形性蛋白質4（BMP4）。
在一個實施方式中，該方法進一步包含將該meso-VPC之群體解離成單細胞。
在一個實施方式中，該中胚層誘導性生長因子包含活化素-A、VEGF165、FGF-2及BMP4。在一個實施方式中，該活化素-A以約5-15 ng/mL之濃度使用。在一個實施方式中，該VEGF165以約5-25 ng/mL之濃度使用。在一個實施方式中，該FGF-2以約5-25 ng/mL之濃度使用。在一個實施方式中，該BMP4以約5-50 ng/mL之濃度使用。在一個實施方式中，該方法進一步包含在培養約24小時之後自該培養基移除活化素-A。
在一個實施方式中，步驟（a）中之細胞外基質表面為經膠原蛋白IV塗佈表面。
在一個實施方式中，培養該多能幹細胞約3天至約5天。
在一個實施方式中，步驟（a）中之一或多種因子包含VEGF165、FGF-2、及BMP4。
在一個實施方式中，該轉形生長因子-β（TGF-β）I型受體之小分子抑制劑為SB431542。在另一實施方式中，步驟（b）中之一或多種因子包含VEGF165、FGF-2、BMP4、及SB431542。
在一個實施方式中，步驟（a）中之一或多種因子進一步包含弗斯可林。
在一個實施方式中，步驟（b）中之一或多種因子進一步包含弗斯可林。
在一個實施方式中，該弗斯可林以約2-10 µM之濃度使用。
在一個實施方式中，該VEGF165以約10-50 ng/mL之濃度使用。
在一個實施方式中，該FGF-2以約10-50 ng/mL之濃度使用。
在一個實施方式中，該BMP4以約10-50 ng/mL之濃度使用。
在一個實施方式中，該SB431542以約5-20 µM之濃度使用。
在一個實施方式中，步驟（a）及（b）中之細胞外基質表面為經膠原蛋白IV塗佈表面。
在一個實施方式中，執行步驟（a）中之培養約1天。
在一個實施方式中，執行步驟（b）中之培養約4天至約7天。
在一個實施方式中，步驟（a）中之培養係在5% CO2 及20% O2 之常氧條件下進行。
在一個實施方式中，步驟（b）中之培養係在5% CO2 及5% O2 之低氧條件下進行。
在一個實施方式中，培養該等多能幹細胞係在5% CO2 及20% O2 之常氧條件下進行。
在一個實施方式中，該多能幹細胞為人類胚胎幹細胞。
在一個實施方式中，該多能幹細胞為人類誘導性多能幹細胞。
在一個實施方式中，根據本發明之方法中之任一者產生的meso-VPC之群體表現選自由以下者組成之群的細胞表面標記中之至少一者：CD31/PECAM1、CD309/KDR、CD43、CD144、CD34、CD184/CXCR4、CD146、及PDGFRb。
在一個實施方式中，根據本發明之方法中之任一者產生的meso-VPC之群體表現以下細胞表面標記（a）CD146、CD31/PECAM1、及CD309/KDR；或（b）CD31/PECAM1、CD309/KDR、CD146、及（i）CD144、CD34、CD184/CXCR4、CD43、或PDGFRb中之至少一者、（ii）CD34、CD184/CXCR4、及PDGFRb；（iii）CD184/CXCR4；（iv）PDGFRb；（v）CD144及CD184/CXCR4；（vi）CD184/CXCR4及CD43；或（vii）CC184/CXCFR4。
在一個實施方式中，根據本發明之方法中之任一者產生的meso-VPC之群體展現以下者之受限偵測或無偵測：（a）選自由CXCR7、CD45、及NG2組成之群的細胞表面標記中之一或多者；（b）CXCR7、CD45、及NG2；或（c）選自由CD144、CD34、CD184/CXCR4、CXCR7、CD43、CD45、PDGFRb、及NG2組成之群的細胞表面標記中之一或多者。
在一個實施方式中，根據本發明之方法中之任一者產生的meso-VPC之群體表現至少一種選自以下者之miRNA標記：hsa-miR-3917、hsa-miR-450a-2-3p、hsa-miR-542-5p、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-24-3p、hsa-let-7e-5p、hsa-miR-99a-5p、hsa-miR-223-5p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-483-3p、miR 214、miR 335-3p、及miR-199a-3p。
在一個實施方式中，根據本發明之方法中之任一者產生的meso-VPC之群體展現至少一種選自以下者之miRNA標記的受限表現或不表現：hsa-let-7e-3p、hsa-miR-99a-3p、hsa-miR-133a-5p、hsa-miR-11399、hsa-miR-196b-3p、hsa-miR-5690、及hsa-miR-7151-3p。
在一個實施方式中，根據本發明之方法中之任一者產生的meso-VPC之群體表現hsa-miR-3917、hsa-miR-450a-2-3p、及hsa-miR-542-5p。
在一個實施方式中，根據本發明之方法中之任一者產生的meso-VPC之群體包含至少一種meso-VPC，其對於至少一種選自由以下者組成之群的miRNA標記呈陽性：mir126、mir125a-5p、mir24、及mir483-5p。在一個實施方式中，miRNA標記為mir483-5p。
在一個實施方式中，根據本發明之方法中之任一者產生的meso-VPC之群體包含至少一種展現受限表現或不表現至少一種選自由以下者組成之群的miRNA標記之meso-VPC：mir367、mir302a、mir302b、mir302c、mirLet7-e、mir223、mir99a、mir142-3p、及mir133a。
在一個實施方式中，本發明之方法進一步包含藉由該meso-VPC之分化產生血管內皮細胞。
在一個實施方式中，該分化係在經纖維接合素塗佈表面上執行。
在一個方面，本發明提供包含藉由本發明之方法中之任一者產生的meso-VPC之群體之組成物。
在一個方面，本發明提供包含藉由來源於多能幹細胞之中胚層細胞之試管內分化產生的中胚層源性血管先驅細胞（meso-VPC）之群體之組成物，其中該meso-VPC之群體表現至少一種選自由以下者組成之群的細胞表面標記：CD31/PECAM1、CD309/KDR、CD43、CD144、CD34、CD184/CXCR4、CD146、及PDGFRb。
在一個實施方式中，該包含meso-VPC之群體之組成物表現至少兩種選自由以下者組成之群的細胞表面標記：CD31/PECAM1、CD309/KDR、CD43、CD144、CD34、CD184/CXCR4、CD146、及PDGFRb。
在一個實施方式中，該包含meso-VPC之群體之組成物表現細胞表面標記CD146、CD31/PECAM1、及CD309/KDR。
在一個實施方式中，該包含meso-VPC之群體之組成物表現細胞表面標記CD31/PECAM1、CD309/KDR、CD146、及（i）CD144、CD34、CD184/CXCR4、CD43、或PDGFRb中之至少一者、（ii）CD34、CD184/CXCR4、及PDGFRb；（iii）CD184/CXCR4；（iv）PDGFRb；（v）CD144及CD184/CXCR4；（vi）CD184/CXCR4及CD43；或（vii）CC184/CXCFR4。
在一個實施方式中，該包含meso-VPC之群體之組成物展現以下者之受限偵測或無偵測（a）一或多種選自由CXCR7、CD45、及NG2組成之群的細胞表面標記；（b）CXCR7、CD45、及NG2；或（c）一或多種選自由CD144、CD34、CD184/CXCR4、CXCR7、CD43、CD45、PDGFRb、及NG2組成之群的細胞表面標記。
在一個實施方式中，該包含meso-VPC之群體之組成物表現至少一種選自以下者之miRNA標記：hsa-miR-3917、hsa-miR-450a-2-3p、hsa-miR-542-5p、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-24-3p、hsa-let-7e-5p、hsa-miR-99a-5p、hsa-miR-223-5p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-483-3p、miR 214、miR 335-3p、及miR-199a-3p。
在一個實施方式中，該包含meso-VPC之群體之組成物展現至少一種選自以下者之miRNA標記的受限表現或不表現：hsa-let-7e-3p、hsa-miR-99a-3p、hsa-miR-133a-5p、hsa-miR-11399、hsa-miR-196b-3p、hsa-miR-5690、及hsa-miR-7151-3p。
在一個實施方式中，該包含meso-VPC之群體之組成物表現hsa-miR-3917、hsa-miR-450a-2-3p、及hsa-miR-542-5p。
在一個實施方式中，該meso-VPC之群體包含meso-VPC之血管樣物。
在一個實施方式中，該meso-VPC之群體包含meso-VPC之單細胞。
在一個實施方式中，本發明提供藉由來源於多能幹細胞之中胚層細胞之試管內分化產生的meso-VPC，其中該meso-VPC對於至少一種選自由以下者組成之群的miRNA標記呈陽性：mir126、mir125a-5p、mir24、及mir483-5p。
在一個實施方式中，該meso-VPC對於miRNA標記mir483-5p呈陽性。
在一個實施方式中，該meso-VPC對於至少一種選自由以下者組成之群的miRNA標記呈陰性：mir367、mir302a、mir302b、mir302c、mirLet7-e、mir223、mir99a、mir142-3p、及mir133a。
在一個實施方式中，該多能幹細胞為人類多能幹細胞。
在一個實施方式中，該多能幹細胞為人類胚胎幹細胞（human embryonic stem cell，hESC）。
在一個實施方式中，該多能幹細胞為人類誘導性多能幹細胞（human induced pluripotent stem cell，hiPSC）。
在一個實施方式中，該多能幹細胞首先分化成中胚層細胞，該中胚層細胞繼而分化成該meso-VPC。
在一個方面，本發明提供包含有包含本發明之meso-VPC之群體或meso-VPC中之任一者的組成物之醫藥組成物。
在一個方面，本發明提供治療個體中之血管疾病或病症的方法，該方法包含向個體投予有效量的本發明之包含meso-VPC之群體或中胚層源性血管先驅細胞（meso-VPC）之組成物中之任一者或本發明之醫藥組成物中之任一者，藉此治療該個體之該血管疾病或病症。
在一個實施方式中，該血管疾病或病症係選自由以下者組成之群：動脈粥樣硬化、外周動脈疾病（PAD）、頸動脈疾病、靜脈疾病、血凝塊、主動脈瘤、纖維肌性發育不全、淋巴水腫、及血管損傷。
在一個實施方式中，該外周動脈疾病係選自由以下者組成之群：嚴重肢體缺血、腸道缺血症候群、腎動脈疾病、膕部陷套症候群（popliteal entrapment syndrome）、雷諾氏現象（Raynaud's phenomenon）、柏格氏病（Buerger's disease）。
在一個實施方式中，該外周動脈疾病為嚴重肢體缺血。
在一個實施方式中，該包含meso-VPC之群體、meso-VPC之組成物或該醫藥組成物係肌肉內或全身性投予。
在一個實施方式中，投予該包含meso-VPC之群體、meso-VPC之組成物或該醫藥組成物增大該個體之血流量。
在一個實施方式中，投予該包含meso-VPC之群體、meso-VPC之組成物或該醫藥組成物促進該個體之血管新生及/或脈管發生（vasculogenesis）。
在一個實施方式中，投予該包含meso-VPC之群體、meso-VPC之組成物或該醫藥組成物減輕該個體之缺血嚴重度。
在一個實施方式中，投予該包含meso-VPC之群體、meso-VPC之組成物或該醫藥組成物減小該個體肢體之壞死面積。
在一個實施方式中，向該個體投予約1×104 至約1×1013 個meso-VPC。
在一個實施方式中，以醫藥組成物形式投予該meso-VPC。
在一個實施方式中，該醫藥組成物包含（a）使溶液維持在生理pH下之緩衝液；（b）至少5%（w/v）葡萄糖；及（c）使溶液維持在生理滲透壓之滲透活性劑。
在一個實施方式中，該葡萄糖為D-葡萄糖（右旋糖（Dextrose））。
在一個實施方式中，該滲透活性劑為鹽。
在一個實施方式中，該鹽為氯化鈉。
I.    定義
為了使本發明可更易於理解，首先對某些術語進行定義。亦應注意不論何時敍述參數之值或值之範圍，希望值及所述值之範圍內的中間值亦為本發明之部分。
在以下描述中，出於解釋之目的，闡述具體數量、材料及組態以便提供對本發明之透徹理解。然而，本領域中具有通常知識者將顯而易知，本發明可在無此等具體細節之情況下實踐。在一些情況下，可省略或簡化熟知特徵以免模糊本發明。此外，本說明書中提及諸如「一個實施方式」或「一實施方式」之片語意謂結合實施方式所描述之一特定特徵、結構或特性包括於本發明之至少一個實施方式中。諸如「在一個實施方式中」之片語在本說明書中各處之出現未必皆指同一實施方式。
冠詞「一（a/an）」在本文中用以指冠詞之一個或多於一個（即至少一個）文法對象。藉助於實例，「一要素」係指一個要素或多於一個要素。
關於組成物、方法及其相應組分在本文中使用「包含（comprising/comprises）」一詞，該等組成物、方法及其相應組分對本發明而言為必需的，而對於未規定的要素之內容而言為開放的，無論其是否為必需的。
如本文所用，「多能細胞」、「多能幹細胞」及「PSC」廣泛地指一種細胞，其能夠在試管內長時間或幾乎無限增殖，同時保持其未分化狀態、展現穩定（較佳地正常）核型且具有在適當條件下分化成全部三個生殖層（亦即外胚層、中胚層及內胚層）之能力。典型地，多能細胞（a）在免疫缺陷（SCID）小鼠中移植時能夠誘導畸胎瘤；（b）能夠分化成全部三個生殖層之細胞類型（例如外胚層、中胚層及內胚層細胞類型）；及（c）表現至少一種hES細胞標記（諸如Oct-4、鹼性磷酸酶、SSEA 3表面抗原、SSEA 4表面抗原、NANOG、TRA 1 60、TRA 1 81、SOX2、REX1）。例示性多能細胞可表現Oct-4、鹼性磷酸酶、SSEA 3表面抗原、SSEA 4表面抗原、TRA 1 60及/或TRA 1 81。另外的例示性多能細胞包括（但不限於）胚胎幹細胞、誘導多能細胞（iPS）、胚胎源性細胞、產生自胚胎生殖（embryonic germ，EG）細胞之多能細胞（例如藉由在FGF-2、LIF及SCF存在下培養）、孤雌生殖ES細胞、產生自培養的內細胞塊細胞（cell mass cell，ICM）之ES細胞、產生自分裂球之ES細胞及藉由核轉移（例如轉移至接受體卵母細胞中之體細胞核）產生之ES細胞。例示性多能細胞可在不破壞胚胎之情況下產生。舉例而言，誘導多能細胞可產生自在不破壞胚胎的情況下獲得之細胞。作為另一實例，多能細胞可產生自活檢分裂球（其可在不傷害其餘胚胎的情況下完成）；視情況，其餘胚胎可為低溫保存、培養及/或植入至適合宿主中。多能細胞（來自任何來源）可經基因修飾或以其他方式修飾。
如本文所用，「胚胎（Embryo/embryonic）」廣泛地指尚未植入至母體宿主之子宮膜中之發育細胞塊。「胚胎細胞」為自胚胎分離或胚胎中所含有的細胞。此亦包括早在二細胞期獲得之分裂球及聚集分裂球。
「胚胎幹細胞（ES細胞或ESC）」涵蓋產生自胚胎細胞（諸如來自培養的內細胞塊細胞或培養的分裂球）之多能細胞。此類細胞常常為或已依序繼代為細胞系。在產生如本文所述之中胚層細胞及meso-VPC之過程中胚胎幹細胞可用作多能幹細胞。舉例而言，ES細胞可藉由所屬領域中已知之方法產生，該等方法包括自藉由任何方法（包括藉由性或無性方式）（諸如用精子或精子DNA使卵細胞授精、核轉移（包括體細胞核轉移）或孤雌生殖）產生的胚胎衍生。作為另一實例，即使在將非胚胎細胞用於過程時，胚胎幹細胞亦包括藉由體細胞核轉移產生的細胞。舉例而言，ES細胞可來源於囊胚期胚胎之ICM，以及來源於一或多種分裂球的胚胎幹細胞。此類胚胎幹細胞可產生自藉由授精或藉由無性方式產生之胚胎材料，無性方式包括體細胞核轉移（somatic cell nuclear transfer，SCNT）、孤雌生殖及雄核生殖。如上文進一步論述，ES細胞可經基因修飾或以其他方式修飾。
ES細胞可用一或多種HLA基因中之純合子或雜合子生成，例如經由基因操控、篩選自發性雜合子缺失等。胚胎幹細胞，無關於其來源或用於產生其特定方法，典型地擁有以下屬性中之一或多者：（i）分化成全部三個生殖層之細胞的能力、（ii）表現至少Oct-4及鹼性磷酸酶、及（iii）當移植至免疫功能不全動物中時產生畸胎瘤之能力。可用於本發明之實施方式的胚胎幹細胞包括（但不限於）人類ES細胞（「hESC」或「hES細胞」），諸如CT2、MA01、MA09、ACT-4、No.3、J1、H1、H7、H9、H14及ACT30胚胎幹細胞。另外的例示性細胞系包括NED1、NED2、NED3、NED4、NED5及NED7。亦參見NIH人類胚胎幹細胞登記。可使用之例示性人類胚胎幹細胞系為J1細胞。
例示性人類胚胎幹細胞（hESC）標記包括（但不限於）鹼性磷酸酶、Oct-4、Nanog、階段特異性胚胎抗原-3（Stage-specific embryonic antigen -3，SSEA-3）、階段特異性胚胎抗原-4（SSEA-4）、TRA-1-60、TRA-1-81、TRA-2-49/6E、Sox2、生長及分化因子3（growth and differentiation factor 3，GDF3）、還原型表現1（reduced expression 1，REX1）、纖維母細胞生長因子4（FGF4）、胚胎細胞特異性基因1（ESG1）、發育多能性相關2（DPPA2）、DPPA4、端粒酶反轉錄酶（telomerase reverse transcriptase，hTERT）、SALL4、E-CADHERIN、團簇標識30（CD30）、畸胎瘤衍化生長因子（Cripto）（TDGF-1）、GCTM-2、Genesis、生殖細胞核因子及幹細胞因子（SCF或c-Kit配體）。另外，胚胎幹細胞可表現Oct-4、鹼性磷酸酶、SSEA 3表面抗原、SSEA 4表面抗原、TRA 1 60及/或TRA 1 81。
ESC最初可在所屬領域中已知的保持ESC之多能性之任何培養基中在存在或不存在滋養細胞下培養，滋養細胞為諸如鼠類胚胎滋養細胞（murine embryonic feeder，MEF）細胞或人類滋養細胞，諸如人類真皮纖維母細胞（human dermal fibroblast，HDF）。在於共培養物中接種ESC之前，可使MEF細胞或人類滋養細胞有絲分裂失活，例如藉由曝露於絲裂黴素C、γ照射或藉由任何其他已知方法，且由此MEF不在培養物中繁殖。另外，可微觀檢測ESC細胞培養且可例如使用幹細胞切割工具藉由雷射切除或其他方式來選取及捨棄含有非ESC細胞形態之菌落。典型地，在收集用於胚狀體形成之接種之ESC的時刻之後不使用另外的MEF細胞或人類滋養細胞。
替代地，可藉由本領域中已知的任何方法（例如Klimanskaya等人, Lancet 365:1636-1641 (2005)）在無滋養物條件下在固體表面（諸如細胞外基質，例如Matrigel®、層黏連蛋白或iMatrix-511、或本文所揭示或所屬領域中已知的任何其他細胞外基質）上培養hES細胞。因此，用於本文中所描述之方法中之hES細胞可在無滋養物培養物上培養。
如本文所用，「胚胎源性細胞（Embryo-derived cell）」廣泛地指多能桑椹胚源性細胞、囊胚源性細胞（包括內細胞塊、胚胎防護或上胚層之彼等）或早期胚胎之其他多能幹細胞（包括原生內胚層、外胚層及中胚層及其衍生物）。「EDC」亦包括分裂球及來自聚集的單個分裂球之細胞塊或來自不同發育期之胚胎，但不包括已繼代為細胞系之人類胚胎幹細胞。
如本文所用，「經誘導之多能幹細胞」或「iPSC」或「iPS細胞」係指藉由將體細胞再程式化而生成的多能幹細胞。iPSC可藉由表現一組因子或誘導一組因子之表現（「將因子再程式化」）來生成。iPS細胞可使用胎兒、產後、新生兒、幼兒或成人的體細胞來生成。iPS細胞可獲自細胞庫。替代地，iPS細胞可在開始分化成血管先驅細胞（VPC）或另一細胞類型之前新生成（藉由所屬領域中已知的過程）。製備iPS細胞可為產生經分化細胞之初始步驟。可使用來自特定患者或匹配供體之材料來特異性生成iPS細胞，從而生成組織匹配的VPC。iPS細胞可產生自在預期接受體中實質上非免疫性的細胞，例如產生自自體細胞或產生自與預期接受體組織相容性的細胞。如上文進一步論述（參見「多能細胞」），包括iPS細胞之多能細胞可經基因修飾或以其他方式修飾。可使用之例示性人類iPSC細胞系為GMP1細胞。
作為另一實例，經誘導之多能幹細胞可藉由將體細胞或其他細胞再程式化來生成，再程式化係藉由使細胞與一或多種再程式化因子接觸。舉例而言，再程式化因子可由細胞表現，例如來自添加至細胞中之外源核酸，或來自響應於因子（諸如促進或誘導內源基因之表現的小分子、微RNA或類似因子）之內源基因（參見Suh及Blelloch, Development 138, 1653-1661 (2011)；Miyoshi等人, Cell Stem Cell (2011), doi:10.1016/j.stem.2011.05.001；Sancho-Martinez等人, Journal of Molecular Cell Biology (2011) 1-3；Anokye-Danso等人, Cell Stem Cell 8, 376-388, 2011年4月8日；Orkin及Hochedlinger, Cell 145, 835-850, 2011年6月10日,或Warren等人, Scientific Reports, 10.1038/srep00657, 2012年9月14日，其各自以全文引用的方式併入本文中）。再程式化因子可由外源來源提供，例如藉由添加至培養基中，且可藉由所屬領域中已知之方法引入細胞中，諸如經由與細胞進入胜肽耦合、蛋白或核酸轉染試劑、脂質體轉染、電穿孔、基因槍顆粒遞送系統（基因槍）、顯微注射及其類似方法。在某些實施方式中，可用於將體細胞再程式化成多能幹細胞之因子包括例如Oct4（有時稱為Oct 3/4）、Sox2、c-Myc及Klf4之組合。在其他實施方式中，可用於將體細胞再程式化成多能幹細胞之因子包括例如Oct-4、Sox2、Nanog及Lin28之組合。在其他實施方式中，體細胞係藉由表現至少2種再程式化因子、至少三種再程式化因子或四種再程式化因子來再程式化。在另一實施方式中，體細胞係藉由表現Oct4、Sox2、MYC、Klf4、Nanog及Lin28來再程式化。在其他實施方式中，鑑別另外的再程式化因子且單獨或將其與一或多種已知再程式化因子組合使用來將體細胞再程式化成多能幹細胞。iPS細胞典型地可藉由與胚胎幹細胞相同的標記之表現來鑑別，儘管特定iPS細胞系在其表現輪廓方面可能不同。
誘導性多能幹細胞可藉由在體細胞中表現一或多種再程式化因子或誘導一或多種再程式化因子之表現來產生。在一實施方式中，體細胞為纖維母細胞，諸如真皮纖維母細胞、滑膜纖維母細胞、肺纖維母細胞或非纖維母細胞體細胞。在一實施方式中，體細胞係藉由表現至少1、2、3、4、5種如上文所述之再程式化因子來再程式化。在另一實施方式中，再程式化因子之表現可藉由使體細胞與至少一種誘導再程式化因子之表現的試劑（諸如小有機分子試劑）接觸來誘導。
體細胞亦可使用其中表現再程式化因子（例如使用病毒載體、質體及其類似物）且誘導再程式化因子之表現（例如使用小有機分子）的組合方法來再程式化。舉例而言，再程式化因子可藉由使用病毒載體（諸如反轉錄病毒載體或慢病毒載體）感染而在體細胞中表現。而且，再程式化因子可使用非整合載體（諸如游離型質體或mRNA）在體細胞中表現。參見例如Yu等人, Science. 2009年5月8日;324(5928):797-801，其特此以全文引用之方式併入。當再程式化因子係使用非整合載體表現時，因子可用載體使用電穿孔、轉染或體細胞之轉型來在細胞中表現。
在再程式化因子在細胞中表現後，藉由本領域中已知的任何方法培養細胞。隨時間推移具有ES特性之細胞出現在培養皿中。細胞可基於例如ES形態或基於可選擇或可偵測標記物之表現而選擇及繼代培養。可培養細胞以產生類似ES細胞之細胞培養物——此等細胞培養物為假定的iPS細胞。iPS細胞典型地可藉由與其他胚胎幹細胞相同的標記之表現鑑別，儘管特定iPS細胞系可能在其表現輪廓方面不同。例示性iPS細胞可表現Oct-4、鹼性磷酸酶、SSEA 3表面抗原、SSEA 4表面抗原、TRA 1 60及/或TRA 1 81。
為了確認iPS細胞之多能性，可在一或多種多能性之分析中測試細胞。舉例而言，可針對ES細胞標記之表現測試細胞；可針對當移植至SCID小鼠中時產生畸胎瘤的能力來評估細胞；可針對分化以產生全部三個生殖層之細胞類型的能力來評估細胞。在獲得多能iPS細胞後，可將其用以產生中胚層細胞及血管先驅細胞，例如中胚層源性血管先驅細胞。
如本文所用，「中胚層」係指所有哺乳動物之極早期胚胎中的三個原生生殖層中之一者。中胚層形成間質、間皮、非上皮血細胞及體腔細胞。早期中胚層定型由上皮細胞向間葉細胞轉化引起，上皮細胞向間葉細胞轉化後特定中胚層系細胞隨著原腸胚形成進行內向遷移。中胚層系之細胞註定形成血管及淋巴系統，包括能夠分化成多種特定細胞類型之血液血管母細胞及多潛能間質幹細胞。中胚層經由形成胚外中胚層且隨後形成胚胎內臟中胚層而引起脈管發生。生長因子（諸如血管內皮生長因子（VEGF）及胎盤生長因子（placental growth factor，PIGF或PGF））刺激新血管之生長及發育。在一個實施方式中，中胚層系之細胞註定為血管前驅物細胞或血管先驅細胞。在一個實施方式中，多能幹細胞例如hESCs或iPSC，例如hiPSCs可分化成中胚層系細胞，例如中胚層前驅物細胞。因此，術語「中胚層」亦包括來源於多能幹細胞之中胚層系細胞（無關於細胞之成熟度），且由此術語涵蓋各種成熟水平之中胚層細胞，包括中胚層前驅物細胞。
例示性中胚層標記包括（但不限於）CD309/KDR、CD56/NCAM1、APLNR/APJ、GARP、CD13、N-鈣黏素、活化素A、活化素AB、活化素AC、活化素B、活化素C、BMP及其他活化素受體活化因子、BMP及其他活化素受體抑制劑、BMP-2、BMP-2/BMP-4、BMP-2/BMP-6雜二聚體、BMP-2/BMP-7雜二聚體、BMP-2a、BMP-4、BMP-6、BMP-7、隱形因子（Cryptic）、FABP4/A-FABP、FGF-5、GDF-1、GDF-3、INHBA、INHBB、Nodal、TGF-β、TGF-β 1, TGF-β 1,2,3、TGF-β 1.2、TGF-β 1/1.2、TGF-β 2、TGF-β 2/1.2、TGF-β 3、TGF-β受體抑制劑、Wnt-3a、Wnt-8a、MESDC2、Nicalin、Brachyury、EOMES、FoxC1、FoxF1、Goosecoid、HAND1、MIXL1、Slug、Snail、TBX6、Twist-1及Twist-2。在一個實施方式中，中胚層細胞為中胚層前驅物細胞，其對於一或多種選自CD309/KDR、CD56/NCAM1、APLNR/APJ、GARP及CD13之標記呈陽性。
如本文所用，「脈管發生」係指形成新血管。脈管發生包括來源於中胚層的內皮之形成。如本文所用，「血管新生」係指自預先存在的血管形成血管。參見例如Developmental Biology by Gilbert, Scott F. Sunderland (MA): Sinauer Associates公司; c2000及Molecular Biology of the Cell 第4版 Alberts, Bruce; Johnson, Alexander; Lewis, Julian; Raff, Martin; Roberts, Keith; Walter, Peter New York and London: Garland Science; c2002。
如本文所用，「血管先驅細胞（VPC）」係指具有分化成內皮細胞、平滑肌細胞及外被細胞以及其他血管細胞系之能力的細胞。在一個實施方式中，血管先驅細胞為中胚層源性血管先驅細胞（meso-VPC）。
如本文所用，「中胚層源性血管先驅細胞（meso-VPC）」係指自藉由多能幹細胞（例如ESC或iPSC）之試管內分化衍生的中胚層細胞產生的VPC。Meso-VPC可藉由如本文進一步描述之一或多種細胞表面標記之表現鑑別。在一個實施方式中，中胚層源性血管先驅細胞自多能幹細胞之試管內分化產生，例如分化成中胚層細胞之ESC或iPSC，中胚層細胞繼而分化成meso-VPC。
Meso-VPC可自小鼠PSC及人類PSC兩者試管內衍生。Meso-VPC能夠分化成造血及內皮細胞系，且可能亦能夠變成平滑肌細胞。本發明之meso-VPC之群體可能對於至少一種諸如CD31/PECAM1、CD309/KDR、CD43、CD144、CD34、CD184/CXCR4、CD146、及PDGFRb之標記呈陽性。在一個實施方式中，meso-VPC之群體對於上文鑑別的標記之1、2、3、4、5、6、7或8種呈陽性。在一個實施方式中，meso-VPC之群體對於CD146、CD31/PECAM1、及CD309/KDR呈陽性。在另一實施方式中，meso-VPC之群體表現CD31/PECAM1、CD309/KDR、CD146、及（i）CD144、CD34、CD184/CXCR4、CD43、或PDGFRb中之至少一者、（ii）CD34、CD184/CXCR4、及PDGFRb；（iii）CD184/CXCR4；（iv）PDGFRb；（v）CD144及CD184/CXCR4；（vi）CD184/CXCR4及CD43；或（vii）CC184/CXCFR4。在一實施方式中，meso-VPC之群體表現至少1種、至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種、至少11種、至少12種、至少13種、至少14種或至少15種選自以下者之miRNA標記：hsa-miR-3917、hsa-miR-450a-2-3p、hsa-miR-542-5p、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-24-3p、hsa-let-7e-5p、hsa-miR-99a-5p、hsa-miR-223-5p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-483-3p、miR 214、miR 335-3p、及miR-199a-3p。在一個實施方式中，meso-VPC之群體表現hsa-miR-3917、hsa-miR-450a-2-3p、及hsa-miR-542-5p。在一實施方式中，若組成物中meso-VPC之至少約20%表現標記，則認為meso-VPC之群體表現某一標記。在一個實施方式中，本發明之meso-VPC對於至少一種、至少兩種、至少三種或至少四種選自由以下者組成之群的miRNA標記呈陽性：mir126、mir125a-5p、mir24、及mir483-5p。在一個實施方式中，miRNA標記為mir483-5p。在一個實施方式中，meso-VPC之群體包含至少一種meso-VPC，meso-VPC對於至少一種、至少兩種、至少三種或至少四種選自由以下者組成之群的miRNA標記呈陽性：mir126、mir125a-5p、mir24、及mir483-5p。在一個實施方式中，miRNA標記為mir483-5p。在一實施方式中，meso-VPC之群體以比HE細胞之群體更高的水平表現CD31及KDR。在另一實施方式中，meso-VPC之群體以比HE細胞之群體更低的水平表現CD146。在又一實施方式中，meso-VPC之群體以比HE細胞之群體更低的水平表現CD184/CXCR4。
在實施方式之任一者中，meso-VPC之群體展現CXCR7、CD45、及NG2中之一者、兩者或三者受限偵測或不偵測。在實施方式之任一者中，meso-VPC之群體展現CXCR7、CD45、及NG2之全部的受限偵測或不偵測。在實施方式之任一者中，meso-VPC之群體展現CD144、CD34、CD184/CXCR4、CXCR7、CD43、CD45、PDGFRb或NG2之至少1種、至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種或至少8種的受限偵測或不偵測。在一實施方式中，meso-VPC之群體展現至少1種、至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種或至少7種選自以下者之miRNA標記之受限表現或不表現：hsa-let-7e-3p、hsa-miR-99a-3p、hsa-miR-133a-5p、hsa-miR-11399、hsa-miR-196b-3p、hsa-miR-5690、及hsa-miR-7151-3p。在一實施方式中，若組成物中meso-VPC之低於約20%表現標記，則認為meso-VPC之群體展現該標記之受限偵測或不偵測。在一實施方式中，本發明之meso-VPC展現至少1種、至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種或至少9種選自由以下者組成之群的miRNA標記之受限表現或不表現：mir367、mir302a、mir302b、mir302c、mirLet7-e、mir223、mir99a、mir142-3p、及mir133a。在本發明之一實施方式中，meso-VPC之群體包含至少一種meso-VPC，meso-VPC展現至少1種、至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種或至少9種選自由以下者組成之群的miRNA標記之受限表現或不表現：mir367、mir302a、mir302b、mir302c、mirLet7-e、mir223、mir99a、mir142-3p、及mir133a。
如本文所用，「血管樣物」係指細胞之菌落樣聚集體，例如在例如細胞培養期間所形成的中胚層源性血管先驅細胞（meso-VPC）。在一個實施方式中，血管樣物由使用3D-血管樣物分化平台產生之meso-VPC形成。
如本文所用，「療法（therapy/therapeutic）」、「治療（treating/treat/treatment）」廣泛地指治療疾病、遏制或減輕疾病或其臨床症狀之發展及/或緩解疾病、使得疾病或其臨床症狀消退。「療法」、「治療」涵蓋防治、預防、治療、治癒、補救、減輕、緩解及/或使疾病、病徵及/或疾病之症狀緩解。「療法」、「治療」涵蓋具有持續疾病病徵及/或症狀之患者之病徵及/或症狀之緩解。「療法」、「治療」亦涵蓋「防治」及「預防」。防治包括預防在治療患者之疾病之後出現疾病或減小患者之疾病的發病率或嚴重度。出於「療法」、「治療」之目的，術語「減輕」廣泛地指病徵及/或症狀之臨床顯著減輕。「療法」、「治療」包括治療復發或反覆性病徵及/或症狀。「療法」、「治療」涵蓋但不限於阻止病徵及/或症狀在任何時候出現以及減輕現有病徵及/或症狀及消除現有病徵及/或症狀。「療法」、「治療」包括治療慢性疾病（「維持」）及急性疾病。舉例而言，治療包括治療或預防復發或病徵及/或症狀之反覆。在一個實施方式中，治療包括血管疾病（諸如嚴重肢體缺血）之病徵及/或症狀的臨床顯著減輕。
如本文所用，「使病變正常化」係指將由疾病引起之異常結構及/或功能恢復至更正常狀態。正常化表明藉由矯正由疾病引起之結構及/或組織、器官或細胞類型之功能中的異常，可控制及改善病變之進展。舉例而言，在用本發明之meso-VPC治療後，可改善、矯正及/或逆轉由血管疾病造成的肢體異常（例如嚴重肢體缺血）。
如本文所用，「血管疾病」係指血管（動脈及靜脈）之任何異常病狀。心臟外之血管疾病可單獨存在於任何地方。最常見血管疾病為中風、外周動脈疾病（PAD）、腹部主動脈瘤（abdominal aortic aneurysm，AAA）、頸動脈疾病（carotid artery disease，CAD）、動靜脈畸形（arteriovenous malformation，AVM）、嚴重肢體缺血（critical limb ischemia，CLI）、肺栓塞（血凝塊）、深層靜脈栓塞（deep vein thrombosis，DVT）、慢性靜脈功能不全（chronic venous insufficiency，CVI）及靜脈曲張。在一個實施方式中，血管疾病為外周動脈疾病（PAD）。在一個實施方式中，血管疾病為缺血疾病，諸如嚴重肢體缺血（CLI）。在一個實施方式中，血管疾病為動脈粥樣硬化、外周動脈疾病（PAD）、頸動脈疾病、靜脈疾病、血凝塊、主動脈瘤、纖維肌性發育不全、淋巴水腫或血管損傷。在一個實施方式中，血管疾病為諸如嚴重肢體缺血（CLI）之外周動脈疾病、腸道缺血症候群、腎動脈疾病、膕部陷套症候群、雷諾氏現象或柏格氏病。 II. 中胚層源性血管先驅細胞（Meso-VPC）之試管內產生
本發明提供自來源於多能幹細胞之中胚層細胞產生中胚層源性血管先驅細胞（meso-VPC）之方法。該等方法包括以下步驟：於含有一或多種中胚層誘導性生長因子之培養基中培養多能幹細胞以產生中胚層細胞，及在適當表面上於含有一或多種引導中胚層細胞分化成中胚層源性血管先驅細胞（meso-VPC）之因子的培養基中培養中胚層細胞。在一些實施方式中，該等方法進一步包括將複數個meso-VPC解離成單細胞。
用於本發明之多能幹細胞可藉由上文提供之方法中之任一者來獲得及培養。在一個實施方式中，多能幹細胞，例如人類胚胎幹細胞（hESC）或人類誘導多能幹細胞（hiPSC）係在無滋養物（feeder-free，FF）條件中培養且塗覆在細胞外基質上。在一個實施方式中，多能幹細胞係在滋養物培養條件中培養且塗覆在細胞外基質上。
在一些實施方式中，細胞外基質係選自由以下者組成之群：層黏連蛋白、纖維接合素、玻璃黏連蛋白、蛋白多糖、巢蛋白、膠原蛋白、膠原蛋白I、膠原蛋白IV、硫酸乙醯肝素、來自Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）小鼠肉瘤細胞之可溶製劑、Matrigel®（Corning）、明膠及人類基底膜提取物。在一個實施方式中，細胞外基質可來源於任何哺乳動物，包括人類來源。在一個實施方式中，用於培養多能幹細胞之細胞外基質表面為經基質膠塗佈表面。
在一些實施方式中，多能幹細胞係在適合於支持多能性之培養基中培養且任何此類培養基為所屬領域中已知的。在一些實施方式中，支持多能性之培養基為Nutristem™。在一些實施方式中，支持多能性之培養基為TeSR™。在一些實施方式中，支持多能性之培養基為StemFit™。在其他實施方式中，支持多能性之培養基為Knockout™ DMEM（Gibco），其可補充有Knockout™血清替代物（Gibco）、LIF、bFGF或任何其他因子。此等例示性培養基中之各者為所屬領域中已知且可商購的。在其他實施方式中，支持多能性之培養基可為、補充有bFGF或任何其他因子。在一實施方式中，bFGF可以低濃度（例如4 ng/mL）補充。在另一實施方式中，bFGF可以較高濃度（例如100 ng/mL）補充。在一實施方式中，培養基不含血清。在另一實施方式中，培養基包含血清。
多能幹細胞可在所屬領域中已知的任何適合容器中培養、繼代或收集。例示性組織培養容器包括15 cm組織培養盤、10 cm組織培養盤、3 cm組織培養盤、6孔組織培養盤、12孔組織培養盤、24孔組織培養盤、48孔組織培養盤、96孔組織培養盤、T-25組織培養瓶、T-75組織培養瓶。在一個實施方式中，多能幹細胞係在6孔組織培養盤中培養。
在一些實施方式中，在培養約1、2、3、4、5或6天之後執行培養基改變以保持多能幹細胞之最佳狀況。對於培養基改變，可使用相同培養基作為起始條件或可根據培養需要調節培養基。在一些實施方式中，多能幹細胞在約1、2、3、4、5、6、7、8或9天之後或在細胞培養達至約60-90%融合度時分裂及繼代。對於細胞繼代，可使用相同培養基作為起始條件或可根據培養需要調節培養基。細胞可在1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19或1:20稀釋比率下分裂及繼代。在一個實施方式中，多能幹細胞在1:3稀釋比率下繼代。
在一些實施方式中，多能幹細胞可在約5% CO2 及約20% O2 之常氧條件或適合於多能幹細胞生長之其他已知條件下培養。
在一些實施方式中，多能幹細胞係在培養基中在其中培養物中不含細胞之滋養層之無滋養物條件下培養、繼代或收集。在一些實施方式中，多能幹細胞係在培養基中在其中培養物中含有一層滋養細胞（諸如人類真皮纖維母細胞（HDF）或所屬領域中具有通常知識者已知之其他細胞類型）的滋養物培養條件下培養、繼代或收集。
為了藉由多能幹細胞之試管內分化產生中胚層細胞，將多能幹細胞（例如hESC或hiPSC）在適合表面（例如細胞外基質表面）上培養。在一些實施方式中，細胞外基質係選自由以下者組成之群：層黏連蛋白、纖維接合素、玻璃黏連蛋白、蛋白多糖、巢蛋白、膠原蛋白、膠原蛋白I、膠原蛋白IV、硫酸乙醯肝素、來自Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）小鼠肉瘤細胞之可溶製劑、基質膠、明膠及人類基底膜提取物。在一個實施方式中，細胞外基質可來源於任何哺乳動物，包括人類來源。在一個實施方式中，用於多能幹細胞試管內分化成中胚層細胞之細胞外基質表面為經基質膠塗佈表面。
在一個實施方式中，塗覆多能幹細胞且在培養基中培養約1小時至約24小時以使細胞在誘導分化之前沈降。為誘導多能幹細胞分化成中胚層細胞，將多能幹細胞在培養基中在適合表面（例如如上文所述之細胞外基質表面）上培養。
用於誘導多能幹細胞分化成中胚層細胞之培養基可為支持分化之任何培養基且可為所屬領域中已知的培養基。在一些實施方式中，培養基可為支持血管培養及/或擴增之任何培養基，且包括（但不限於）Stemline® II（Sigma）、StemSpan™ SFEMII（StemCell Technologies）、StemSpan™ AFC（StemCell Technologies）、最低必需培養基（Minimal Essential Media，MEM）（Gibco）及αMEM。在一實施方式中，培養基不含血清。在另一實施方式中，培養基包含血清。培養基可進一步包含一或多種中胚層誘導性生長因子，諸如活化素-A、血管內皮生長因子（VEGF）、纖維母細胞生長因子（FGF）、及骨成形性蛋白質4（BMP4）。在一個實施方式中，用於該方法之VEGF為VEGF165。在一個實施方式中，用於該方法之FGF為鹼性FGF（bFGF）。在一個實施方式中，多能幹細胞係在包含活化素-A、VEGF165、bFGF及BMP4之培養基中培養。在一個實施方式中，培養持續時間為約1、2、3、4、5、6或7天。在一個實施方式中，培養持續時間為約4天。在一個實施方式中，培養基在培養約24小時之後改變且由不含活化素-A之培養基替代。
VEGF（例如VEGF165）可以約1 ng/mL至約100 ng/mL，或更佳地約5 ng/mL至約20 ng/mL之濃度使用。在一個實施方式中，VEGF以約1 ng/mL、約2 ng/mL、約3 ng/mL、約4 ng/mL、約5 ng/mL、約10 ng/mL、約15 ng/mL或約20 ng/mL之濃度使用。活化素-A可以約1 ng/mL至約100 ng/mL，或更佳地約5 ng/mL至約20 ng/mL之濃度使用。在一個實施方式中，活化素-A以約1 ng/mL、約2 ng/mL、約3 ng/mL、約4 ng/mL、約5 ng/mL、約10 ng/mL、約15 ng/mL或約20 ng/mL之濃度使用。FGF（例如bFGF）可以約1 ng/mL至約100 ng/mL，或更佳地約5 ng/mL至約20 ng/mL之濃度使用。在一個實施方式中，FGF以約1 ng/mL、約2 ng/mL、約3 ng/mL、約4 ng/mL、約5 ng/mL、約10 ng/mL、約15 ng/mL或約20 ng/mL之濃度使用。BMP4可以約1 ng/mL至約100 ng/mL，或更佳地約5 ng/mL至約35 ng/mL之濃度使用。在一個實施方式中，BMP4以約1 ng/mL、約2 ng/mL、約3 ng/mL、約4 ng/mL、約5 ng/mL、約10 ng/mL、約15 ng/mL、約20 ng/mL、約25 ng/mL、約30 ng/mL或約35 ng/mL之濃度使用。在一個實施方式中，VEGF以10 ng/mL之濃度使用，活化素-A以10 ng/mL之濃度使用，FGF以10 ng/mL之濃度使用，且BMP4以25 ng/mL之濃度使用。
多能幹細胞分化成中胚層細胞可在約5% CO2 及約20% O2 之常氧條件或適合於多能幹細胞之分化的其他已知條件下執行。
多能幹細胞分化成中胚層細胞可在所屬領域中已知的任何適合容器中進行。例示性組織培養容器包括（但不限於）15 cm組織培養盤、10 cm組織培養盤、3 cm組織培養盤、6孔組織培養盤、12孔組織培養盤、24孔組織培養盤、48孔組織培養盤、96孔組織培養盤、T-25組織培養瓶、T-75組織培養瓶。在一個實施方式中，多能幹細胞分化成中胚層細胞係在10 cm組織培養盤中進行。
中胚層細胞可進一步解離成單細胞用於進一步用途。在一個實施方式中，藉由多能幹細胞之試管內分化的產生中胚層細胞係藉由酶催化處理成單細胞來解離。
在一個實施方式中，中胚層細胞表現至少1種、至少2種、至少3種、至少4種或至少5種選自包含以下者之群的標記：CD309/KDR、CD56/NCAM1、APLNR/APJ、GARP及CD13。
中胚層細胞亦可表現一或多種選自由以下者組成之群的其他中胚層標記：N-鈣黏素、活化素A、活化素AB、活化素AC、活化素B、活化素C BMP及其他活化素受體活化因子、BMP及其他活化素受體抑制劑、BMP-2、BMP-2/BMP-4、BMP-2/BMP-6雜二聚體、BMP-2/BMP-7雜二聚體、BMP-2a、BMP-4、BMP-6、BMP-7、隱形因子、FABP4/A-FABP、FGF-5、GDF-1、GDF-3、INHBA、INHBB、Nodal、TGF-β、TGF-β 1、TGF-β 1,2,3、TGF-β 1.2、TGF-β 1/1.2、TGF-β 2、TGF-β 2/1.2、TGF-β 3、TGF-β受體抑制劑、Wnt-3a、Wnt-8a、MESDC2、Nicalin、Brachyury、EOMES、FoxC1、FoxF1、Goosecoid、HAND1、MIXL1、Slug、Snail、TBX6、Twist-1及Twist-2。
使用本文所揭示之兩個平台中之一者使藉由本發明之方法產生的中胚層細胞進一步分化成中胚層源性血管先驅細胞（meso-VPC）：3D-血管樣物分化平台或2D分化平台。
3D-血管樣物分化平台提供使自多能幹細胞（例如hESC或hiPSC）產生之中胚層細胞之試管內分化成meso-VPC的方法。
3D-血管樣物分化平台方法係藉由在培養基中在非黏著或低黏著條件下（例如在超低附著表面或懸浮培養物上）培養中胚層細胞執行，其中培養基可為支持分化之任何培養基且可為所屬領域中已知的。在一些實施方式中，培養基可為支持血管培養及/或擴增之任何培養基，且包括（但不限於）Stemline® II（Sigma）、StemSpan™ SFEMII（StemCell Technologies）、StemSpan™ AFC（StemCell Technologies）、最低必需培養基（MEM）（Gibco）及αMEM。在一實施方式中，培養基不含血清。在另一實施方式中，培養基包含血清。培養基可進一步包含一或多種誘導中胚層細胞分化成meso-VPC之因子，例如血管內皮生長因子（VEGF）、纖維母細胞生長因子（FGF）、骨成形性蛋白質4（BMP4）、轉形生長因子-β（TGF-β）I型受體之小分子抑制劑及弗斯可林。在一個實施方式中，用於該方法之VEGF為VEGF165。在一個實施方式中，用於該方法之FGF為鹼性FGF（bFGF）。在一個實施方式中，轉形生長因子-β（TGF-β）I型受體之小分子抑制劑為SB431542。在一個實施方式中，多能幹細胞係在包含VEGF165、bFGF、BMP4、及SB431542之培養基中培養。在一個實施方式中，多能幹細胞係在包含VEGF165、bFGF、BMP4、SB431542及弗斯可林之培養基中培養。在一個實施方式中，培養持續時間為約1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天。在一個實施方式中，培養持續時間為約5天。在一個實施方式中，培養基在分化開始之後約2天及之後約4天改變。
VEGF（例如VEGF165）可以約1 ng/mL至約100 ng/mL，或更佳地約10 ng/mL至約100 ng/mL之濃度使用。在一個實施方式中，VEGF以約1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、15 ng/mL、20 ng/mL、25 ng/mL、30 ng/mL、35 ng/mL、40 ng/mL、45 ng/mL、50 ng/mL、55 ng/mL、60 ng/mL、65 ng/mL、70 ng/mL、75 ng/mL、80 ng/mL、85 ng/mL、90 ng/mL、95 ng/mL或100 ng/mL之濃度使用。FGF（例如bFGF）可以約1 ng/mL至約100 ng/mL，或更佳地約10 ng/mL至約100 ng/mL之濃度使用。在一個實施方式中，FGF以約1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、15 ng/mL、20 ng/mL、25 ng/mL、30 ng/mL、35 ng/mL、40 ng/mL、45 ng/mL、50 ng/mL、55 ng/mL、60 ng/mL、65 ng/mL、70 ng/mL、75 ng/mL、80 ng/mL、85 ng/mL、90 ng/mL、95 ng/mL或100 ng/mL之濃度使用。BMP4可以約1 ng/mL至約100 ng/mL，或更佳地約10 ng/mL至約100 ng/mL之濃度使用。在一個實施方式中，BMP4以約1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、15 ng/mL、20 ng/mL、25 ng/mL、30 ng/mL、35 ng/mL、40 ng/mL、45 ng/mL、50 ng/mL、55 ng/mL、60 ng/mL、65 ng/mL、70 ng/mL、75 ng/mL、80 ng/mL、85 ng/mL、90 ng/mL、95 ng/mL或100 ng/mL之濃度使用。轉形生長因子-β（TGF-β）I型受體之小分子抑制劑（例如SB431542）可以約0.1 µM至約100 µM，或更佳地約1 µM至約100 µM之濃度使用。在一個實施方式中，轉形生長因子-β（TGF-β）I型受體之小分子抑制劑以約0.1 µM、1 µM、2 µM、3 µM、4 µM、5 µM、6 µM、7 µM、8 µM、9 µM、10 µM、15 µM、20 µM、25 µM、30 µM、35 µM、40 µM、45 µM、50 µM、55 µM、60 µM、65 µM、70 µM、75 µM、80 µM、85 µM、90 µM、95 µM或100 µM之濃度使用。弗斯可林可以約0.1 µM至約10 µM之濃度使用。在一個實施方式中，弗斯可林以約0.1 µM、0.5 µM、1 µM、1.5 µM、2 µM、2.5 µM、3 µM、3.5 µM、4 µM、4.5 µM、5 µM、5.5 µM、6 µM、6.5 µM、7 µM、7.5 µM、8 µM、8.5 µM、9 µM、9.5 µM或10 µM之濃度使用。
在一個實施方式中，VEGF以約50 ng/mL之濃度使用，FGF以約50 ng/mL之濃度使用，BMP4以約25 ng/mL之濃度使用，小分子抑制劑以約10 µM之濃度使用，且弗斯可林以約2 µM之濃度使用。
使用3D-血管樣物分化平台使中胚層細胞分化成meso-VPC可在約5% CO2 及約20% O2 之常氧條件或適合於多能幹細胞之分化的其他已知條件下執行。
使用3D-血管樣物分化平台使中胚層細胞分化成meso-VPC可在所屬領域中已知的任何適合容器中進行。例示性組織培養容器包括（但不限於）15 cm組織培養盤、10 cm組織培養盤、3 cm組織培養盤、6孔組織培養盤、12孔組織培養盤、24孔組織培養盤、48孔組織培養盤、96孔組織培養盤、T-25組織培養瓶、T-75組織培養瓶。在一個實施方式中，使用3D-血管樣物分化平台使中胚層細胞分化成meso-VPC在10 cm組織培養盤中進行。
使用3D-血管樣物分化平台使中胚層細胞分化成meso-VPC可在非黏著性或低黏著性條件中進行，在非黏著性或低黏著性條件下細胞最低限度地附著於培養容器。在一個實施方式中，使用3D-血管樣物分化平台使中胚層細胞分化成meso-VPC在超低附著表面或懸浮培養物上進行。
在一些實施方式中，藉由3D-血管樣物分化平台產生的meso-VPC形成血管樣物。如本文所用，血管樣物係指細胞聚集體，例如藉由血管細胞系（例如meso-VPC）所形成的菌落樣聚集體。血管樣物之形態可視用於產生血管細胞之方法而變化。本發明進一步提供解離血管樣物中之複數個細胞以獲得單細胞之方法。在一個實施方式中，藉由3D-血管樣物分化平台產生的meso-VPC可進一步解離成單細胞。在一個實施方式中，藉由酶催化處理使血管樣物中之複數個meso-VPC解離成單細胞。
2D分化平台提供使自多能幹細胞（例如hESC或hiPSC）產生之中胚層細胞之試管內分化成meso-VPC的方法。
2D分化平台方法係藉由在培養基在適合表面（例如細胞外基質表面）上培養中胚層細胞來執行。在一些實施方式中，細胞外基質係選自由以下者組成之群：層黏連蛋白、纖維接合素、玻璃黏連蛋白、蛋白多糖、巢蛋白、膠原蛋白、膠原蛋白I、膠原蛋白IV、硫酸乙醯肝素、來自Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）小鼠肉瘤細胞之可溶製劑、基質膠、明膠及人類基底膜提取物。在一個實施方式中，細胞外基質可來源於任何哺乳動物，包括人類來源。在一個實施方式中，用於中胚層細胞之試管內分化的細胞外基質表面為經膠原蛋白IV塗佈表面。
培養基可為支持中胚層細胞之分化的任何培養基且可為所屬領域中已知的培養基。在一些實施方式中，培養基可為支持血管培養及/或擴增之任何培養基，且包括（但不限於）Stemline® II（Sigma）、StemSpan™ SFEMII（StemCell Technologies）、StemSpan™ AFC（StemCell Technologies）、最低必需培養基（MEM）（Gibco）及αMEM。在一實施方式中，培養基不含血清。在另一實施方式中，培養基包含血清。培養基可進一步包含一或多種誘導中胚層細胞分化成meso-VPC之因子。因子係選自血管內皮生長因子（VEGF）、纖維母細胞生長因子（FGF）、骨成形性蛋白質4（BMP4）、轉形生長因子-β（TGF-β）I型受體之小分子抑制劑及弗斯可林。在一個實施方式中，用於該方法之VEGF為VEGF165。在一個實施方式中，用於該方法之FGF為鹼性FGF（bFGF）。在一個實施方式中，轉形生長因子-β（TGF-β）I型受體之小分子抑制劑為SB431542。
在一實施方式中，用於分化中胚層細胞以獲得meso-VPC之2D分化平台之方法包含兩個步驟。中胚層細胞首先在支持分化之培養基中分化且可為所屬領域中已知的培養基。在一些實施方式中，培養基可為支持血管培養及/或擴增之任何培養基，且包括（但不限於）Stemline® II（Sigma）、StemSpan™ SFEMII（StemCell Technologies）、StemSpan™ AFC（StemCell Technologies）、最低必需培養基（MEM）（Gibco）及αMEM。在一實施方式中，培養基不含血清。在另一實施方式中，培養基包含血清。培養基可進一步包含一或多種選自血管內皮生長因子（VEGF）、纖維母細胞生長因子（FGF）、骨成形性蛋白質4（BMP4）及弗斯可林之因子。在一個實施方式中，培養基包含VEGF165、bFGF及BMP4。在一個實施方式中，培養基包含VEGF165、bFGF、BMP4及弗斯可林。此步驟中之培養執行約12小時至約2天。在一個實施方式中，2D分化平台將中胚層細胞分化成meso-VPC之第一步驟執行約1天。
VEGF（例如VEGF165）可以約1 ng/mL至約100 ng/mL，或更佳地10 ng/mL至約100 ng/mL之濃度使用。在一個實施方式中，VEGF以約1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、15 ng/mL、20 ng/mL、25 ng/mL、30 ng/mL、35 ng/mL、40 ng/mL、45 ng/mL、50 ng/mL、55 ng/mL、60 ng/mL、65 ng/mL、70 ng/mL、75 ng/mL、80 ng/mL、85 ng/mL、90 ng/mL、95 ng/mL或100 ng/mL之濃度使用。FGF（例如bFGF）可以約1 ng/mL至約100 ng/mL，或更佳地約10 ng/mL至約100 ng/mL之濃度使用。在一個實施方式中，FGF以約1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、15 ng/mL、20 ng/mL、25 ng/mL、30 ng/mL、35 ng/mL、40 ng/mL、45 ng/mL、50 ng/mL、55 ng/mL、60 ng/mL、65 ng/mL、70 ng/mL、75 ng/mL、80 ng/mL、85 ng/mL、90 ng/mL、95 ng/mL或100 ng/mL之濃度使用。BMP4可以約1 ng/mL至約100 ng/mL，或更佳地約10 ng/mL至約100 ng/mL之濃度使用。在一個實施方式中，BMP4以約1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、15 ng/mL、20 ng/mL、25 ng/mL、30 ng/mL、35 ng/mL、40 ng/mL、45 ng/mL、50 ng/mL、55 ng/mL、60 ng/mL、65 ng/mL、70 ng/mL、75 ng/mL、80 ng/mL、85 ng/mL、90 ng/mL、95 ng/mL或100 ng/mL之濃度使用。弗斯可林可以約0.1 µM至約10 µM之濃度使用。在一個實施方式中，弗斯可林以約0.1 µM、0.5 µM、1 µM、1.5 µM、2 µM、2.5 µM、3 µM、3.5 µM、4 µM、4.5 µM、5 µM、5.5 µM、6 µM、6.5 µM、7 µM、7.5 µM、8 µM、8.5 µM、9 µM、9.5 µM或10 µM之濃度使用。
在一個實施方式中，VEGF以約50 ng/mL之濃度使用，FGF以約50 ng/mL之濃度使用，BMP4以約25 ng/mL之濃度使用，且弗斯可林以約2 µM之濃度使用。
使用2D分化平台使中胚層細胞分化成meso-VPC之第一步驟可在約5% CO2 及約20% O2 之常氧條件或適合於中胚層細胞之分化的其他已知條件下執行。
2D分化平台之第二步驟進一步在支持分化之培養基中將第一步驟中所獲得之細胞分化成meso-VPC。在一些實施方式中，培養基可為支持血管培養及/或擴增之任何培養基，且包括（但不限於）Stemline® II（Sigma）、StemSpan™ SFEMII（StemCell Technologies）、StemSpan™ AFC（StemCell Technologies）、最低必需培養基（MEM）（Gibco）及αMEM。在一實施方式中，培養基不含血清。在另一實施方式中，培養基包含血清。培養基可進一步包含一或多種因子，諸如血管內皮生長因子（VEGF）、纖維母細胞生長因子（FGF）、骨成形性蛋白質4（BMP4）、轉形生長因子-β（TGF-β）I型受體之小分子抑制劑及/或弗斯可林。在一個實施方式中，培養基包含VEGF165、bFGF、BMP4、及SB431542。在一個實施方式中，培養基包含VEGF165、bFGF、BMP4、SB431542及弗斯可林。此步驟中之培養執行約1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天。在一個實施方式中，2D分化平台將中胚層細胞分化成meso-VPC之第二步驟執行約6天。在一個實施方式中，培養基在2D分化平台之第二步驟開始之後約2天及之後約4天改變。
VEGF（例如VEGF165）可以約1 ng/mL至約100 ng/mL，或更佳地10 ng/mL至約100 ng/mL之濃度使用。在一個實施方式中，VEGF以約1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、15 ng/mL、20 ng/mL、25 ng/mL、30 ng/mL、35 ng/mL、40 ng/mL、45 ng/mL、50 ng/mL、55 ng/mL、60 ng/mL、65 ng/mL、70 ng/mL、75 ng/mL、80 ng/mL、85 ng/mL、90 ng/mL、95 ng/mL或100 ng/mL之濃度使用。FGF（例如bFGF）可以約1 ng/mL至約100 ng/mL，或更佳地約10 ng/mL至約100 ng/mL之濃度使用。在一個實施方式中，FGF以約1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、15 ng/mL、20 ng/mL、25 ng/mL、30 ng/mL、35 ng/mL、40 ng/mL、45 ng/mL、50 ng/mL、55 ng/mL、60 ng/mL、65 ng/mL、70 ng/mL、75 ng/mL、80 ng/mL、85 ng/mL、90 ng/mL、95 ng/mL或100 ng/mL之濃度使用。BMP4可以約1 ng/mL至約100 ng/mL，或更佳地約10 ng/mL至約100 ng/mL之濃度使用。在一個實施方式中，BMP4以約1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、15 ng/mL、20 ng/mL、25 ng/mL、30 ng/mL、35 ng/mL、40 ng/mL、45 ng/mL、50 ng/mL、55 ng/mL、60 ng/mL、65 ng/mL、70 ng/mL、75 ng/mL、80 ng/mL、85 ng/mL、90 ng/mL、95 ng/mL或100 ng/mL之濃度使用。轉形生長因子-β（TGF-β）I型受體之小分子抑制劑（例如SB431542）可以約0.1 µM至約100 µM，或更佳地約1 µM至約100 µM之濃度使用。在一個實施方式中，轉形生長因子-β（TGF-β）I型受體之小分子抑制劑以約0.1 µM、1 µM、2 µM、3 µM、4 µM、5 µM、6 µM、7 µM、8 µM、9 µM、10 µM、15 µM、20 µM、25 µM、30 µM、35 µM、40 µM、45 µM、50 µM、55 µM、60 µM、65 µM、70 µM、75 µM、80 µM、85 µM、90 µM、95 µM或100 µM之濃度使用。弗斯可林可以約0.1 µM至約10 µM之濃度使用。在一個實施方式中，弗斯可林以約0.1 µM、0.5 µM、1 µM、1.5 µM、2 µM、2.5 µM、3 µM、3.5 µM、4 µM、4.5 µM、5 µM、5.5 µM、6 µM、6.5 µM、7 µM、7.5 µM、8 µM、8.5 µM、9 µM、9.5 µM或10 µM之濃度使用。
在一個實施方式中，VEGF以約50 ng/mL之濃度使用，FGF以約50 ng/mL之濃度使用，BMP4以約25 ng/mL之濃度使用，小分子抑制劑以約10 µM之濃度使用，且弗斯可林以約2 µM之濃度使用。
使用2D分化平台使中胚層細胞分化成meso-VPC之第二步驟可在約5% CO2 及約5% O2 之低氧條件或適合於分化成血管先驅細胞之其他已知條件下執行。
使用2D分化平台使中胚層細胞兩步驟分化成meso-VPC可在所屬領域中已知的任何適合容器中進行。例示性組織培養容器包括（但不限於）15 cm組織培養盤、10 cm組織培養盤、3 cm組織培養盤、6孔組織培養盤、12孔組織培養盤、24孔組織培養盤、48孔組織培養盤、96孔組織培養盤、T-25組織培養瓶、T-75組織培養瓶。在一個實施方式中，使用2D分化平台將中胚層細胞分化成meso-VPC係在T-75組織培養燒瓶中進行。
使用2D分化平台將中胚層細胞分化成meso-VPC可在任何適合表面上進行。在一個實施方式中，使用2D分化平台將中胚層細胞分化成meso-VPC係在細胞外基質表面上進行。在一個實施方式中，細胞外基質表面為經膠原蛋白IV塗佈表面。
在一個實施方式中，藉由2D分化平台產生之meso-VPC可進一步藉由酶催化處理解離成單細胞。
在本發明之一些實施方式中，每個步驟中產生之中胚層細胞或meso-VPC可進一步藉由所屬領域中已知的方法（例如流式細胞量測術）分選以選擇具有分子標記（例如細胞表面標記或miRNA標記）之某些表現輪廓的細胞。表徵藉由本發明之方法所產生的細胞之方法進一步提供於下文中。 III.  Meso-VPC之特性及組成物
本發明提供使用本文所揭示之方法藉由來源於多能幹細胞的中胚層細胞之試管內分化所獲得之中胚層源性血管先驅細胞（meso-VPC）。在一個實施方式中，多能幹細胞首先分化成中胚層細胞，中胚層細胞繼而分化成meso-VPC。某些表型標記之表現水平可藉由本領域中已知的任何方法測定，諸如流式細胞量測術/螢光活化細胞分選（fluorescence-activated cell sorting，FACS）、單細胞mRNA剖析或免疫組織化學。某些基因之表現可藉由本領域中已知的任何方法測定，諸如RT-PCR及RNA-Seq。
在一個實施方式中，本發明之meso-VPC之群體表現至少1種、至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種或至少8種選自由以下者組成之群的標記：CD31/PECAM1、CD309/KDR、CD43、CD144、CD34、CD184/CXCR4、CD146、及PDGFRb。在一個實施方式中，meso-VPC之群體表現CD31/PECAM1、CD309/KDR及CD146。在另一實施方式中，meso-VPC之群體表現CD31/PECAM1、CD309/KDR、CD146、及（i）CD144、CD34、CD184/CXCR4、CD43、或PDGFRb中之至少一者、（ii）CD34、CD184/CXCR4、及PDGFRb；（iii）CD184/CXCR4；（iv）PDGFRb；（v）CD144及CD184/CXCR4；（vi）CD184/CXCR4及CD43；或（vii）CC184/CXCFR4。在一實施方式中，若組成物中meso-VPC之至少約20%表現標記，則認為meso-VPC之群體表現某一標記。
在實施方式之任一者中，meso-VPC之群體展示CXCR7、CD45、及NG2中之一或多者的受限偵測或不偵測。在實施方式之任一者中，meso-VPC之群體展現CXCR7、CD45、及NG2之全部的受限偵測或不偵測。在實施方式之任一者中，meso-VPC之群體展現CD144、CD34、CD184/CXCR4、CXCR7、CD43、CD45、PDGFRb或NG2中之一或多者的受限偵測或不偵測。在一實施方式中，若組成物中meso-VPC之低於約20%表現標記，則認為meso-VPC之群體展現該標記之受限偵測或不偵測。
在一個實施方式中，組成物中meso-VPC之至少約20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%表現至少1種、至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種或至少8種選自由以下者組成之群的標記：CD31/PECAM1、CD309/KDR、CD43、CD144、CD34、CD184/CXCR4、CD146、及PDGFRb。在本發明之一個實施方式中，本發明之組成物中meso-VPC之至少約20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%表現CD31/PECAM1、CD309/KDR及CD146。在本發明之一個實施方式中，本發明之組成物中meso-VPC之至少約20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%表現CD31/PECAM1、CD309/KDR、CD146、及（i）CD144、CD34、CD184/CXCR4、CD43、或PDGFRb中之至少一者、（ii）CD34、CD184/CXCR4、及PDGFRb；（iii）CD184/CXCR4；（iv）PDGFRb；（v）CD144及CD184/CXCR4；（vi）CD184/CXCR4及CD43；或（vii）CC184/CXCFR4。
在實施方式之任一者中，本發明之組成物中meso-VPC之低於約20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%或1%表現CXCR7、CD45、及NG2中之一或多者。在實施方式之任一者中，本發明之組成物中meso-VPC之低於約20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%或1%表現CXCR7、CD45、及NG2之全部。在實施方式之任一者中，本發明之組成物中meso-VPC之低於約20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%或1%表現CD144、CD34、CD184/CXCR4、CXCR7、CD43、CD45、PDGFRb或NG2中之一或多者。
本發明之meso-VPC可進一步藉由單細胞miRNA輪廓表徵。在一個實施方式中，本發明之meso-VPC對於至少1種、至少2種、至少3種或至少4種選自由以下者組成之群的miRNA標記呈陽性：mir126、mir125a-5p、mir24、及mir483-5p。在實施方式之任一者中，meso-VPC對於至少1種、至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種或至少9種選自由以下者組成之群的標記呈陰性：mir367、mir302a、mir302b、mir302c、mirLet7-e、mir223、mir99a、mir142-3p、及mir133a。在一個實施方式中，meso-VPC對於mir126、mir125a-5p、mir24、及mir483-5p呈陽性。在另一實施方式中，meso-VPC對於mir483-5p呈陽性。
在一個實施方式中，組成物中meso-VPC之約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%對於至少1種、至少2種、至少3種或至少4種選自由以下者組成之群的miRNA標記呈陽性：mir126、mir125a-5p、mir24、及mir483-5p。在本發明之一個實施方式中，組成物中meso-VPC之至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%對於至少1種、至少2種、至少3種或至少4種選自由以下者組成之群的標記呈陽性：mir126、mir125a-5p、mir24、及mir483-5p。在實施方式之任一者中，組成物中meso-VPC之低於約50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%或1%表現至少1種、至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種或至少9種選自由以下者組成之群的標記：mir367、mir302a、mir302b、mir302c、mirLet7-e、mir223、mir99a、mir142-3p、及mir133a。在本發明之一個實施方式中，組成物中meso-VPC之至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%對於mir126、mir125a-5p、mir24、及mir483-5p呈陽性。在另一實施方式中，組成物中meso-VPC之至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%對於mir483-5p呈陽性。
在一個實施方式中，meso-VPC之群體表現至少1種、至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種、至少11種、至少12種、至少13種、至少14種或至少15種選自以下者之miRNA標記：hsa-miR-3917、hsa-miR-450a-2-3p、hsa-miR-542-5p、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-24-3p、hsa-let-7e-5p、hsa-miR-99a-5p、hsa-miR-223-5p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-483-3p、miR 214、miR 335-3p、及miR-199a-3p。在一個實施方式中，meso-VPC之群體表現hsa-miR-3917、hsa-miR-450a-2-3p、及hsa-miR-542-5p。在一實施方式中，若組成物中meso-VPC之至少約20%表現標記，則認為meso-VPC之群體表現某一標記。
在一個實施方式中，組成物中meso-VPC之約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%表現至少1種、至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種、至少11種、至少12種、至少13種、至少14種或至少15種選自以下者之miRNA標記：hsa-miR-3917、hsa-miR-450a-2-3p、hsa-miR-542-5p、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-24-3p、hsa-let-7e-5p、hsa-miR-99a-5p、hsa-miR-223-5p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-483-3p、miR 214、miR 335-3p、及miR-199a-3p。在本發明之一個實施方式中，組成物中meso-VPC之至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%表現至少1種、至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種、至少11種、至少12種、至少13種、至少14種或至少15種選自以下者之miRNA標記：hsa-miR-3917、hsa-miR-450a-2-3p、hsa-miR-542-5p、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-24-3p、hsa-let-7e-5p、hsa-miR-99a-5p、hsa-miR-223-5p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-483-3p、miR 214、miR 335-3p、及miR-199a-3p。在一個實施方式中，組成物中meso-VPC之約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%表現hsa-miR-3917、hsa-miR-450a-2-3p、及hsa-miR-542-5p。在一個實施方式中，組成物中meso-VPC之至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%表現hsa-miR-3917、hsa-miR-450a-2-3p、及hsa-miR-542-5p。
在一個實施方式中，meso-VPC之群體展現至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個或至少7個選自以下者之miRNA標記之受限表現或不表現：hsa-let-7e-3p、hsa-miR-99a-3p、hsa-miR-133a-5p、hsa-miR-11399、hsa-miR-196b-3p、hsa-miR-5690、及hsa-miR-7151-3p。在一個實施方式中，meso-VPC之群體展現hsa-let-7e-3p、hsa-miR-99a-3p、及hsa-miR-133a-5p之受限表現或不表現。在一實施方式中，meso-VPC之群體展現hsa-miR-11399、hsa-miR-196b-3p、hsa-miR-5690、及hsa-miR-7151-3p之受限表現或不表現。在一實施方式中，若組成物中meso-VPC之低於約20%表現標記，則認為meso-VPC之群體展現該標記之受限偵測或不偵測。
在一個實施方式中，組成物中meso-VPC之約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%展現至少1種、至少2種或至少3種選自hsa-let-7e-3p、hsa-miR-99a-3p、及hsa-miR-133a-5p之miRNA標記的受限表現或不表現。在一個實施方式中，組成物中meso-VPC之至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%展現至少1種、至少2種或至少3種選自hsa-let-7e-3p、hsa-miR-99a-3p、及hsa-miR-133a-5p之miRNA標記的受限表現或不表現。
除了上文所述之特性以外，本發明之meso-VPC亦擁有血管先驅細胞之其他性質，例如分化成血管細胞（諸如內皮細胞、平滑肌細胞及造血細胞）之效能。在一個實施方式中，本發明之meso-VPC擁有分化成血管內皮細胞之效能。meso-VPC之其他血管細胞性質可藉由例如基質膠及AcLDL攝取分析來測定。
在一個實施方式中，本發明之meso-VPC具有血管細胞之形態，諸如卵石內皮樣形態。表徵本發明之meso-VPC之其他方法包括核型分析以確定染色體完整性。
在一實施方式中，本發明之meso-VPC實質上相對於多能幹細胞及中胚層細胞經純化。在另一實施方式中，本發明之meso-VPC實質上相對於多能幹細胞及中胚層細胞經純化，從而該等細胞包含至少約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%meso-VPC。多能幹細胞可為本文所描述之任何多能幹細胞。
meso-VPC可包含低於約30%、25%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%、0.01%、0.009%、0.008%、0.007%、0.006%、0.005%、0.004%、0.003%、0.002%、0.001%、0.0009%、0.0008%、0.0007%、0.0006%、0.0005%、0.0004%、0.0003%、0.0002%或0.0001%多能幹細胞及中胚層細胞。組成物可能缺乏多能幹細胞及中胚層細胞。 IV.  包含Meso-VPC之醫藥組成物
本發明提供包含本文所描述之meso-VPC中之任一者的醫藥組成物。包含本發明之meso-VPC之醫藥組成物可與醫藥學上可接受之載劑一起調配。舉例而言，本發明之meso-VPC可單獨投予或作為醫藥調配物之組分投予，其中meso-VPC可調配用於以用於醫藥中之任何適宜方式投予。用於本發明之適合載劑包括習知使用之彼等載劑，例如水、生理鹽水、右旋糖水溶液、乳糖、林格氏溶液（Ringer's solution）、緩衝溶液、玻尿酸及二醇為例示性液體載劑，特定言之（在等張時）用於溶液。
其他例示性載劑或賦形劑描述於例如Hardman, 等人 (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N. Y.；Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, N. Y.；Avis, 等人 (編) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY；Lieberman, 等人 (編) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY；Lieberman, 等人 (編) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY；及Weiner及Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker公司, New York, N. Y.中。
包含meso-VPC之醫藥組成物可與一或多種選自由以下者組成之群的醫藥學上可接受之無菌等張水溶液或非水性溶液組合調配：分散劑、懸浮液、乳劑、視情況復水成無菌可注射溶液或在即將使用之前分散的無菌粉末、抗氧化劑、緩衝液、殺菌劑、溶質或懸浮劑及增稠劑。
本發明之例示性醫藥組成物可為適合用於治療人類患者（諸如罹患血管疾病或病症之患者）的任何調配物。在一個實施方式中，將包含meso-VPC之醫藥組成物調配為可注射材料，例如適合於肌肉內注射之材料。包含meso-VPC之醫藥組成物可在生理pH下的緩衝溶液中投予，其進一步含有使溶液維持在生理滲透壓下之滲透活性劑。在一個實施方式中，包含meso-VPC醫藥組成物可在包含至少5%（w/v）葡萄糖之緩衝液中投予。在一個實施方式中，包含meso-VPC之醫藥組成物可在包含氯化鈉緩衝液中投予。本領域中已知之其他試劑亦可用以調配醫藥組成物。在一個實施方式中，用於調配醫藥組成物之緩衝液或溶液在使用之前經滅菌。
用於本文中所描述之方法中之包含meso-VPC醫藥組成物可在懸浮液、凝膠、膠體、漿液或混合物中遞送。而且，在遞送時，可用可商購之平衡鹽溶液使低溫保存meso-VPC再懸浮以達成所期望的滲透壓及藉由注射（例如推注或靜脈內）投予之濃度。包含meso-VPC醫藥組成物可例如經由一或多次注射在與持久惰性基質混合物中遞送至個體。持久惰性基質（諸如水凝膠—天然或合成的不可溶於水之聚合物）可在投予部位為細胞之生長及擴增提供骨架。在一個實施方式中，包含meso-VPC之醫藥組成物在玻尿酸水凝膠中投予。在一個實施方式中，包含meso-VPC之醫藥組成物在甲基纖維素水凝膠中投予。所屬領域中已知的為細胞生長及擴增提供持久惰性基質骨架之其他適合材料亦可用於本文所描述之方法。
包含meso-VPC之醫藥組成物可藉由一或多次注射（例如經由注射器）遞送。替代地，包含meso-VPC之醫藥組成物可藉由所屬領域中已知之其他適合方法遞送。適合遞送方法可進一步有助於meso-VPC之生長及存活且防止投予部位處之細胞缺失。在某些實施方式中，適當遞送方法輔助使meso-VPC保留在投予部位處且為細胞生長提供最佳環境。因此，包含meso-VPC之醫藥組成物亦可調配至例如為醫藥組成物中之meso-VPC提供足夠支持的水凝膠管子、水凝膠片材、由天然或人工材料製成之生物工程改造貼片或細胞片材中。在一個實施方式中，包含meso-VPC之醫藥組成物以水凝膠管之形式遞送。在一個實施方式中，包含meso-VPC之醫藥組成物以水凝膠片材之形式遞送。在一個實施方式中，包含meso-VPC之醫藥組成物以生物工程改造貼片之形式遞送。在一個實施方式中，包含meso-VPC醫藥組成物以細胞片材之形式遞送。所屬領域中已知之任何其他適合方法亦可用於遞送本文所描述之醫藥組成物。
醫藥組成物典型地應在製造及儲存條件下為無菌及穩定的。組成物可調配為溶液、微乳劑、脂質體或其他有序結構。載劑可為含有例如水、乙醇、多元醇（例如甘油、丙二醇及液體聚乙二醇及其類似物）及其適合混合物之溶劑或分散介質。適當流動性可例如藉由使用包衣（諸如卵磷脂）、藉由在分散液之情況下維持所需粒徑及藉由使用界面活性劑來維持。在許多情況下，組成物中將需要包括等張劑，例如糖、多元醇（諸如甘露糖醇、山梨糖醇）或氯化鈉。藉由使組成物中包括延遲吸收之藥劑（例如單硬脂酸鹽及明膠），可得到可注射組成物之延長吸收。此外，可溶因子可在定時釋放調配物中投予，例如在包括緩慢釋放聚合物之組成物中。活性化合物可與將保護化合物免於快速釋放之載劑一起製備，該等載劑為諸如控釋調配物，包括植入物及微膠囊化遞送系統。可使用生物可降解、生物相容聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯、聚乳酸與聚乳酸、聚乙醇酸共聚物(polyglycolic copolymer，PLG)。用於製備此類調配物之許多方法已獲得專利或通常為發明所屬領域中具通常知識者已知的。
本發明之一個方面係關於適合用於哺乳動物患者（例如人類患者）之醫藥組成物，其包含至少104 、105 、106 、107 、108 、109 、1010 、1011 、1012 或1013 個meso-VPC及醫藥學上可接受之載劑。投予meso-VPC之醫藥製劑的濃度可為有效且例如實質上不含PSC之任何量。舉例而言，醫藥組成物可包含本文所描述之meso-VPC的數量及類型。在一特定實施方式中，meso-VPC之醫藥組成物包含約1×104 至約1×105 、約1×105 至約1×106 、約1×106 至約1×107 、約1×107 至約1×108 、約1×108 至約1×109 、約1×109 至約1×1010 、約1×1010 至約1×1011 、約1×1011 至約1×1012 或約1×1012 至約1×1013 個meso-VPCs用於全身性投予至有需要之宿主或約1×104 至約1×105 、約1×105 至約1×106 、1×106 至約1×107 、約1×107 至約1×108 、約1×108 至約1×109 、約1×109 至約1×1010 、約1×1010 至約1×1011 、約1×1011 至約1×1012 或約1×1012 至約1×1013 個該等meso-VPC用於局部投予至有需要之宿主。 V.   治療血管疾病之方法
本文所描述之meso-VPC及包含meso-VPC之醫藥組成物可用於基於細胞之治療。特定言之，本發明提供用於治療例如嚴重肢體缺血的血管疾病之方法。方法包括向有需要之個體投予有效量的meso-VPC，其中meso-VPC藉由來源於多能幹細胞之中胚層細胞的試管內分化獲得。在一個實施方式中，多能幹細胞分化成中胚層細胞，中胚層細胞繼而分化成meso-VPC。
血管疾病係指血管（動脈及靜脈）之任何異常病狀。心臟外之血管疾病可單獨存在於任何地方。最常見血管疾病為中風、外周動脈疾病（PAD）、腹部主動脈瘤（AAA）、頸動脈疾病（CAD）、動靜脈畸形（AVM）、嚴重肢體缺血（CLI）、肺栓塞（血凝塊）、深層靜脈栓塞（DVT）、慢性靜脈功能不全（CVI）及靜脈曲張。在一個實施方式中，血管疾病為外周動脈疾病（PAD）。在一個實施方式中，血管疾病為缺血疾病，諸如嚴重肢體缺血（CLI）。在一個實施方式中，血管疾病為動脈粥樣硬化、外周動脈疾病（PAD）、頸動脈疾病、靜脈疾病、血凝塊、主動脈瘤、纖維肌性發育不全、淋巴水腫或血管損傷。在一個實施方式中，血管疾病為諸如嚴重肢體缺血（CLI）之外周動脈疾病、腸道缺血症候群、腎動脈疾病、膕部陷套症候群、雷諾氏現象或柏格氏病。
meso-VPC或醫藥組成物可用以治療個體之任何血管疾病。在一個實施方式中，meso-VPC或醫藥組成物用於治療外周動脈疾病。在一個實施方式中，meso-VPC或醫藥組成物用於治療包括嚴重肢體缺血（CLI）之外周動脈疾病、腸道缺血症候群、腎動脈疾病、膕部陷套症候群、雷諾氏現象或柏格氏病。在一個實施方式中，meso-VPC或醫藥組成物用於治療嚴重肢體缺血（CLI）。
本發明之meso-VPC或醫藥組成物可全身性或局部投予。meso-VPC或醫藥組成物可使用所屬領域中已知的模式投予，包括（但不限於）經由靜脈內、顱內、肌肉內、腹膜內或其他投予途徑注射或局部植入，視所治療之特定病變而定。在一個實施方式中，meso-VPC或醫藥組成物係肌肉內投予。
本發明之meso-VPC或醫藥組成物可經由局部植入投予，其中利用遞送裝置。本發明之遞送裝置為生物相容及生物可降解的。本發明之遞送裝置可使用選自包含以下者之群的材料製造：生物相容纖維、生物相容紗線、生物相容發泡體、脂族聚酯、聚(胺基酸)、共聚(醚-酯)、聚伸烷草酸酯、聚醯胺、酪胺酸衍生之聚碳酸酯、聚(亞胺基碳酸酯)、聚原酸酯、聚氧雜酯、聚醯胺酯、含有胺基之聚氧雜酯、聚(酸酐)、聚磷氮烯、生物聚合物；交酯、乙交酯、ε-己內酯、對二氧環己酮、碳酸三亞甲酯之均聚物及共聚物；交酯、乙交酯、ε-己內酯、對二氧環己酮、碳酸三亞甲酯之均聚物及共聚物、纖維狀膠原蛋白、非纖維狀膠原蛋白、未經胃蛋白酶處理的膠原蛋白、膠原蛋白與其他聚合物之組合、生長因子、細胞外基質蛋白、生物學相關肽片段、肝細胞生長因子、血小板衍生之生長因子、富含血小板血漿、胰島素生長因子、生長分化因子、血管內皮細胞源性生長因子、菸鹼醯胺、升糖素樣胜肽、肌腱蛋白-C、層黏連蛋白、抗排斥藥劑、鎮痛劑、抗氧化劑、抗細胞凋亡藥劑、抗炎劑及細胞生長抑制劑。
特定治療方案、投予途徑及輔助療法可基於特定病變、病變之嚴重度及患者之整體健康狀態調整。投予meso-VPC或醫藥組成物可對減輕病變之表現之嚴重度及/或對防止病變之表現的進一步退化有效。
本發明之治療模式可包含投予單一劑量之meso-VPC或醫藥組成物。替代地，本文所描述之治療模式可包含在一定時間段內多次投予meso-VPC或醫藥組成物之療法過程。例示性治療過程可包含每週、每兩週、每月、每季、每半年或每年治療。替代地，治療可按階段進行，由此起初需要多個劑量（例如第一週之日劑量），且隨後需要愈來愈不頻繁的劑量。
在一個實施方式中，在患者之生命中一或多次週期性向患者投予meso-VPC或醫藥組成物。在本發明之另一實施方式中，每年一次、每6-12個月一次、每3-6個月一次、每1至3個月一次或每1-4週一次投予meso-VPC或醫藥組成物。替代地，某些病狀或病症可期望更加頻繁的投予。在一個實施方式中，在該患者之生存期中經由裝置一次、超過一次、週期性投予meso-VPC或醫藥組成物，或視特定患者及所治療的患者之病變需要。類似涵蓋的為隨時間推移而改變之治療方案。舉例而言，在開始時可需要更加頻繁的治療（例如每天或每週治療）。隨時間推移，隨著患者病狀改善，可需要較不頻繁的治療或甚至無需進一步治療。
在一些實施方式中，向個體投予約1×104 、約1×105 、約1.5×105 、約2×105 、約5×105 、約1×106 、約5×106 、約10,000,000、約20,000,000、約40,000,000、約60,000,000、約80,000,000、約100,000,000、約120,000,000、約140,000,000、約160,000,000、約180,000,000、約200,000,000、約220,000,000、約240,000,000、約260,000,000、約280,000,000、約300,000,000、約320,000,000、約340,000,000、約360,000,000、約380,000,000、約400,000,000、約420,000,000、約440,000,000、約460,000,000、約480,000,000、約500,000,000、約520,000,000、約540,000,000、約560,000,000、約580,000,000、約600,000,000、約620,000,000、約640,000,000、約660,000,000、約680,000,000、約700,000,000、約720,000,000、約740,000,000、約760,000,000、約780,000,000、約800,000,000、約820,000,000、約840,000,000、約860,000,000、約880,000,000、約900,000,000、約920,000,000、約940,000,000、約960,000,000或約980,000,000個meso-VPC。在一些實施方式中，投予約10億、約20億、約30億、約40億或約50億meso-VPC或更多。在一些實施方式中，meso-VPC之數量在約20,000,000至約40億meso-VPC之間、約40,000,000至約10億meso-VPC之間、約60,000,000至約750,000,000 meso-VPC之間、約80,000,000至約400,000,000 meso-VPC之間、約100,000,000至約350,000,000 meso-VPC之間及約175,000,000至約250,000,000 meso-VPC之間的範圍內。
本文所描述之方法可進一步包含使用所屬領域中已知之方法監測治療功效或預防之步驟。在一個實施方式中，投予meso-VPC或醫藥組成物增大個體之血流量。在一個實施方式中，投予meso-VPC或醫藥組成物促進個體之血管形成，諸如脈管發生及血管新生。在一個實施方式中，投予meso-VPC或醫藥組成物減輕個體之缺血嚴重度。在一個實施方式中，投予meso-VPC或醫藥組成物減小個體之壞死區域。亦可量測及定量個體之其他生理及功能變化以確定血管疾病之治療方法的功效。 VI.  套組
在一些實施方式中，本發明提供在一或多個獨立隔間中包含本發明之meso-VPC或醫藥組成物之套組。套組可進一步在一或多個隔間中包含另外的成分，例如膠凝劑、潤膚劑、界面活性劑、保濕劑、增黏劑、乳化劑。套組可視情況包含調配meso-VPC或醫藥組成物用於診斷性或治療性應用之說明書。套組亦可包含在血管病症及/或疾病之療法中使用組分（分別地或一起）之說明書。在一個實施方式中，本發明之套組包括用於注射包含meso-VPC之醫藥組成物的注射器。
在一些實施方式中，本發明提供包含本發明之meso-VPC以及用於選擇、培養、擴增、維持及/或移植meso-VPC之試劑的套組。細胞選擇套組、培養套組、擴增套組、移植套組之代表性實例為所屬領域中已知的。亦可藉由使用細胞之基因產物之表現的陽性選擇、陰性選擇或其組合使細胞在樣本中增濃。
藉由以下實施例進一步說明本發明，該等實施例並不意欲以任何方式限制。整個本申請案中所列舉之所有參考文獻、專利及公開專利申請案之全部內容以及圖式在此以引用之方式併入本文中。實施例 實施例 1 ：人類多能幹細胞之培養及分化成中胚層細胞
將專有的人類胚胎幹細胞（hES）系J1及人類誘導性多能幹細胞（hiPS）系GMP1用於此等研究。在37℃下在5 % CO2 加20% O2 常氧條件下將細胞維持在6孔組織培養盤中之mTeSR1完全培養基（Stem Cell Technologies）中，6孔組織培養盤預塗有基質膠（Corning）用於無滋養物培養條件（此後稱作「FF」）或預塗有基質膠加人類真皮纖維母細胞或HDF用於滋養物培養條件（此後稱作「HDF」）（圖1）。培養基改變係在塗覆細胞（第0天）之後第1、2及3天執行。細胞在第4天或在細胞融合度達到60-70%時繼代。為了繼代，使用1 mL/孔之分散酶（1 U/ml，STEMCELL Technologies）用於FF培養之人類多能幹細胞或使用1 ml/孔之細胞解離緩衝液（CDB）（Gibco）用於HDF培養之人類多能幹細胞。將細胞在37℃下培育5-7分鐘或直至菌落之邊緣自盤上升為止。自盤小心地抽吸出含分散酶或CDB之培養基且將細胞輕輕地用DMEM-F12（Gibco）洗滌以移除任何殘餘量之酶或緩衝液。隨後將新鮮mTeSR1完全培養基用於使用有力洗滌及用拋棄式細胞刮擦器刮擦（小心以避免形成氣泡）來自盤收集菌落，隨後在室溫（RT）下以300 x g離心5分鐘以獲得細胞丸粒。在移除上清液後，使細胞丸粒再懸浮於mTeSR1完全培養基中，且在含有2 mL之mTeSR1完全培養基的6孔組織培養盤（如上文所述對於FF培養預塗有基質膠或預塗有基質膠加HDF）之各孔中添加1 mL之此均勻混合細胞懸浮液。對於FF培養小細胞凝塊中大約500,000個細胞或對於HDF培養小細胞凝塊中250,000個細胞均勻分佈於各孔中。隨後使用多次邊到邊振盪動作同時避免任何渦漩而使細胞在孔內散開。每日檢驗培養物之生長品質及形態。
為了使多能幹細胞分化成中胚層細胞，藉由添加5 mL基質膠/培養皿來製備預塗基質膠之10-cm組織培養皿（Corning）。在自各培養皿移除非附著基質膠之後立即添加10 mL mTeSR1完全培養基/10-cm培養皿以避免經基質膠塗佈表面變乾。將各預塗基質膠之10-cm培養皿用均勻分佈於10 mL TeSR1完全培養基的於來自FF或HDF培養的GMP1細胞培養物之小細胞凝塊中之大約1,500,000個細胞（或於來自HDF培養之J1細胞培養物的小細胞凝塊中之大約300,000個細胞/10-cm培養皿）接種。隨後使用多次邊到邊振盪動作同時避免任何渦漩使細胞在培養皿內散開，且在37℃下在5 % CO2 加20% O2 常氧條件下培育該等盤一24小時（D-1）（圖1）。在分化之D0，將mTeSR1完全培養基替換為12 mL/10-cm培養皿含有中胚層誘導性生長因子、活化素A（10 ng/mL；Humanzyme）、FGF-2（10 ng/mL；Humanzyme）、VEGF165（10 ng/mL，Humanzyme）及BMP4（25 ng/mL，Humanzyme）之混合液的Stemline II培養基（Sigma）。在分化之D1，自中胚層混合液移除活化素-A且將培養基替換為12 mL/培養皿含有FGF-2（10 ng/mL）、VEGF165（10 ng/mL）及BMP4（25 ng/mL）之新鮮Stemline II培養基以促成中胚層細胞出現及擴增。在分化之D3藉由添加15 mL/培養皿含有FGF-2（10 ng/mL）、VEGF165（10 ng/mL）及BMP4（25 ng/mL）之新鮮Stemline II培養基而作出最終培養基改變。繼續培養直至第4天，始終在37℃下在5 % CO2 加20% O2 常氧條件下（圖1）。隨後藉由使用Stempro Acutase酶（Gibco）將其解離成單細胞來收集細胞。執行細胞表徵（藉由FACS及q-PCR分析）以確認D4所收集之細胞的中胚層特性之存在（圖2A-B）。實施例 2 ： 經由 3D- 血管樣物 分化平台使人類中胚層細胞分化成血管先驅細胞 （ meso-VPC ）
藉由使用超低附著組織培養皿（Corning）在促成血管先驅細胞出現及擴增之因子存在下使實施例1中所獲得之中胚層細胞懸浮於VPC分化培養基中來產生新穎3D 血管樣物分化平台（圖3）。在D0，將1百萬未分類D4中胚層細胞懸浮於超低附著6孔盤之各孔中且在VPC 3D分化培養基（含有50 ng/mL VEGF165、50 ng/mL FGF-2、25 ng/mL BMP4、10 µM SB431542且具有2 µM弗斯可林（「Meso-3D血管樣物VPC1」方案）或不具有弗斯可林（「Meso-3D血管樣物VPC2」方案）之Stemline II培養基）中在常氧（37℃及5 % CO2 及20% O2 ）下分化。相應培養基在D2及D4改變且分化培養在第5天完成。在分化5天之後，藉由使用Stempro Acutase酶將其解離成單細胞來收集來自兩種方案之MESO-VPC。隨後對細胞進行計數且量測生存力，隨後低溫保存。實施例 3 ： 經由 2D- 分化平台使人類中胚層細胞分化成血管先驅細胞 （ MESO-VPC ）
新穎的基於2D之VPC分化平台亦藉由將根據實施例1產生之中胚層細胞接種至黏著性人類細胞外基質（經膠原蛋白IV塗佈的組織培養皿）上。在D0，將1,200,000個未經分選D4中胚層細胞（來自以上）接種至經人類膠原蛋白IV塗佈（5 mg/cm2 ）T-175燒瓶（Corning）上且在VPC 2D分化培養基中使用兩種不同（Meso-2D VPC2及Meso-2D VPC3）分化方案分化（圖4）。對於Meso-2D VPC2方案，在D0使用含有50 ng/mL VEGF165、50 ng/mL FGF-2及25 ng/mL BMP4之Stemline II培養基（40 mL/燒瓶），且自D1至D7使用含有50 ng/mL VEGF165、50 ng/mL FGF-2、25 ng/mL BMP4加10 µM SB431542之Stemline II培養基（45 mL/燒瓶）。對於Meso-2D VPC3方案，在D0使用含有50 ng/mL VEGF165、50 ng/mL FGF-2、25 ng/mL BMP4及2 µM弗斯可林之Stemline II培養基，且自D1至D7使用含有50 ng/mL VEGF165、50 ng/mL FGF-2、25 ng/mL BMP4及2 µM弗斯可林加10 µM SB431542之Stemline II培養基。D0細胞係在常氧條件（37℃與5 % CO2 及20% O2 ）中培養。D1-D7細胞係在低氧條件（37℃與5% CO2 及5% O2 ）中培養，以及培養基改變在分化之D3（50 mL/燒瓶）及D5（60 mL/燒瓶）執行。在分化7天之後，藉由酶催化解離使用Stempro Acutase酶以單細胞形式收集來自Meso-2D VPC2及Meso-2D VPC3方案之MESO-VPC。隨後如實施例2中所描述對細胞進行計數且量測生存力，隨後低溫保存。實施例 4 ：基質膠 /AcLDL 分析
將來自實施例2-3之低溫保存Meso-VPC在37℃水浴中迅速解凍（2-3分鐘）。隨後將細胞轉移至具有10 mL內皮細胞或EC培養基（來自LifeLine Cell Technology之VascuLife® VEGF培養基）之15 mL錐形管中且以300 x g離心5分鐘。在離心之後，移除上清液且使細胞再懸浮於1 mL新鮮EC培養基中以便對細胞計數。使用來自Nexcelom Bioscience之錐蟲藍（Trypan blue）及K2 Cellometer對細胞進行計數。使用EC培養基以10,000-20,000個可用MESO-VPC /mL之濃度製備總共18 mL細胞懸浮液。在常氧條件（37℃與5 % CO2 and 20% O2 ）中將3 mL/孔之此細胞懸浮液塗覆至經纖維接合素（FN）塗佈的6孔盤上3-4天以製備用於基質膠及AcLDL攝取分析之細胞。
為了基質膠/AcLDL分析，添加250 µL基底膜基質膠（Corning）至NuncTM 4孔盤（Thermo Scientific）之各孔且在RT下培育盤30分鐘。在塗佈盤後以250 µL EC培養基中5.0×104 個細胞/孔之密度接種細胞。在塗覆2-3小時之後，將培養基替換為新鮮的250 µL含有AcLDL（Molecular Probes）之EC培養基（5 µL AcLDL加245 µL EC培養基）。在常氧條件中培育盤整夜。在培育24小時之後，移除含AcLDL之培養基，將盤用D-PBS洗滌3次，且添加新鮮的250 µL EC培養基/孔。最後，以×4放大倍數使用基恩士顯微鏡（Keyence Microscope）自各孔取得顯微照片。實施例 5 ：流式細胞量測術分析
將第5天收集的Meso-3D血管樣物VPC及第7天收集的Meso-2D VPC之低溫保存小瓶（來自上文實施例2-3）解凍且製備成於EC培養基中之單細胞懸浮液用於細胞計數。在執行細胞計數之後將細胞再懸浮於FACS緩衝液（含有2%FBS之D-PBS）中。在100 µL FACS緩衝液製備細胞之等分試樣（100,000-200,000個細胞/FACS分析樣本）用於表面標記抗體染色。以於100 µL總體積中5 µL/樣本使用抗人類CD31/PECAM1（BioLegend）、CD34（BD Biosciences）、CD144/VE-Cadh（BioLegend）、CD309/KDR（BioLegend）、CD43（BD Biosciences）、CD45（BD Biosciences）、CD184/CXCR4（BD Biosciences）、CXCR7（BioLegend）、CD146（BioLegend）、NG2（BD Biosciences）及PDGFRb（BioLegend）單株抗體。用抗體在冰上培育細胞20-30分鐘。在培育之後，洗滌細胞以移除具有1 mL FACS緩衝液之未結合抗體。隨後以300 x g離心細胞5分鐘，移除上清液，隨後在1:1000稀釋下將細胞再懸浮於新鮮的100 µL具有碘化丙錠（PI，Sigma）之FACS緩衝液。將PI添加至細胞懸浮液且用於在FACS分析期間除去死細胞。使用SONY SA3800光譜分析儀用於分析。藉由使用陽性（HUVEC）及陰性（未分化J1或GMP1細胞）對照組設定補償。實施例 6 ：比較性細胞
為了與本發明之Meso-VPC比較，使用HE及HB方案自人類胚胎幹細胞（例如J1 hESC）或人類誘導多能幹細胞（例如GMP-1 iPSC）產生造血內皮細胞（HE）及血液血管母細胞（HB），HE及HB方案如先前例如美國專利第9,938,500號；美國專利第9,410,123號；WO 2013/082543；WO 2014/100779；美國專利第9,993,503號；及美國臨時申請案第62/892,712號（2019年8月28日申請）及其PCT申請案主張優先權中所描述，其均以全文引用之方式併入本文中。簡言之，為了HE產生，用Gibco®細胞解離緩衝液（CDB）解離hESC或iPSC以獲得單細胞聚集體。以400,000個細胞/10 mL之最終密度使細胞再懸浮於含有最終濃度為10 µM的Y-27632（Stemgent）之mTeSR™1培養基（STEMCELL Technologies）中。將10 mL細胞懸浮液轉移至經膠原蛋白IV塗佈之10 cm盤中（第1天）。將盤放入常氧培育箱中整夜。第二天（第0天），自各10 cm盤輕輕地移除mTeSR™1/Y-27632培養基且替換為10 mL BVF-M培養基[Stemline® II造血幹細胞擴增培養基（Sigma）；25 ng/mL BMP4（Humanzyme）；50 ng/mL VEGF165（Humanzyme）；50 ng/mL FGF2（Humanzyme）]。在低氧箱（5% CO2 /5% O2 ）中培育盤2天。在第2天，抽吸培養基且將新鮮的10-12 mL BVF-M添加至各10 cm盤。在第4天，再次抽吸培養基且將新鮮的10-15 mL BVF-M添加至各10 cm盤。在第6天，收集細胞用於移植及/或用於進一步測試。自各盤抽吸培養基且藉由添加10 mL D-PBS（Gibco）且抽吸D-PBS來洗滌盤。將5 mL StemPro Accutase（Gibco）添加至各10 cm盤且在常氧CO2 培育箱（5% CO2 /20% O2 ）中培育3-5分鐘。用5 mL吸管吸取細胞5次，隨後用P1000吸管吸取約5次。隨後經由30 µM細胞過濾器過濾細胞且將其轉移至收集管中。用10 mL EGM-2培養基（Lonza）或Stemline® II造血幹細胞擴增培養基（Sigma）再次淋洗各10 cm盤且將細胞傳送通過30 µM細胞過濾器並在收集管中收集。以120-250 x g離心管子5分鐘。隨後用EGM-2培養基或Stemline® II造血幹細胞擴增培養基（Sigma）使細胞再懸浮並計數。在計數之後，使細胞快速離心（250 x g持續5分鐘）且以3×106 個細胞/mL之濃度用冷凍培養基（10% DMSO +熱滅活FBS）再懸浮。為形成冷凍儲備液，將細胞懸浮液分到2 mL FBS（Hyclone）及DMSO（Sigma）/冷凍小瓶（6×106 個細胞/2 mL/小瓶）。
為了產生血液血管母細胞（HB），用4 mg/mL膠原蛋白酶IV（Gibco）解離hESC或iPSC以獲得細胞凝塊且隨後再懸浮於BV-M培養基[Stemline® II造血幹細胞擴增培養基（Sigma）；25 ng/mL BMP4（Humanzyme）；50 ng/mL VEGF165（Humanzyme）]中且以約750,000-1,200,000個細胞/孔之密度塗覆至超低附著表面6孔盤（Corning）上。在常氧CO2 培育箱中將盤放入培育箱中48小時以形成胚狀體（第0-2天）。隨後收集各孔中培養基及細胞且以120-300 g離心3分鐘。移除上清液之一半且替換為2 mL含有50 ng/mL bFGF之BV-M。因此，細胞懸浮液中bFGF之最終濃度為約25 mg/mL，將4 mL細胞懸浮液塗覆至超低附著表面6孔盤之各孔上且再放入常氧CO2 培育箱中48小時（第2-4天）以繼續形成胚狀體。在第4天，將胚狀體收集至15 mL管子中，以120-300 x g離心2分鐘，用D-PBS洗滌，且使用StemPro Accutase（Gibco）解聚成單細胞懸浮液。將FBS（Hyclone）用於使Accutase失活且將單細胞傳送通過細胞過濾器、離心且以約1×106 個細胞/mL再懸浮於Stemline II培養基（Sigma）中。將約3×106 個細胞在30 mL Methocult BGM培養基[MethoCult™ SF H4536（無EPO）（StemCell Technologies）；青黴素/鏈黴素（Gibco）；ExCyte細胞生長補充劑（1:100）（Millipore）；50 ng/mL Flt3配體（PeproTech）；50 ngm/ml VEGF（Humanzyme）；50 ng/mL TPO（PeproTech）；30 ng/mL bFGF（Humanzyme）]中混合，再塗覆於超低附著表面10 cm培養皿（Corning）上，且在常氧CO2 培育箱中培育7天（第4-11天）以形成血液血管母細胞。在第11天，收集血液血管母細胞用於移植及/或用於進一步測試。藉由用D-PBS（Gibco）稀釋甲基纖維素來收集血液血管母細胞。以300 x g離心細胞混合物15分鐘兩次，且再懸浮於30 mL之EGM2 BulletKit培養基（Lonza）或StemlineII中且如上文所述對細胞進行計數並冷凍。實施例 7A ： 3D 血管樣物分化平台產生具有血管先驅細胞性質之細胞
如實施例2中所描述，使用兩種不同3D分化方案（Meso-3D血管樣物VPC1及Meso-3D血管樣物VPC2）在常氧條件（37℃與5 % CO2 及20% O2 ）下5天來生成Meso-VPC（圖3）。接種之中胚層細胞保持有活力且早在第1天即形成細胞聚集體（資料未示出）。此等細胞聚集體（此後稱作「血管樣物」）在尺寸上生長截至第5天（圖5；上圖），此時將其收集。Meso-3D血管樣物VPC1方案產生與Meso-3D血管樣物VPC2方案相比更大的血管樣物聚集體。在細胞收集之後，將細胞再塗覆於經FN塗佈盤中以確定其進行進一步分化成內皮細胞系之能力。如圖5；中圖中所展示，當在經FN塗佈的盤上於促成內皮分化之培養基中培養細胞時其獲取內皮細胞之卵石形態典型。Meso-3D VPC亦展現穩固的在基質膠上形成微血管樣網路之能力，且顯示AcLDL攝取（圖5；下圖）。VPC2細胞展示與VPC1細胞相比更高的管形成能力（圖5；下圖）。
另外，血管標記之FACS分析指示J1源性及GMP1源性Meso-3D血管樣物VPC1及VPC2細胞均顯示內皮細胞標記KDR、CD31以及內皮細胞/外被細胞（CD146）之穩固表現（＞20%）（圖6A）及造血標記CD43之低表現。其寬血管標記表現輪廓不同於未分化多能幹細胞（GMP1及J1）或HUVEC細胞中所觀測到之表現輪廓及其他PSC源性細胞（例如HB及HE）中所觀測到之表現輪廓（圖6 B-C）。此等經分化細胞之染色體穩定性係藉由G-帶核型分析執行且細胞顯示正常核型，指示hES及hiPS細胞經由Meso-3D血管樣物VPC1及Meso-3D血管樣物VPC2方案分化並未在分化期間改變染色體穩定性（資料未示出）。實施例 7B ： 2D 分化平台產生具有血管先驅細胞性質之細胞
如實施例3中所描述，在常氧及低氧培養條件下歷時總共7天使用兩種不同2D分化方案（Meso-2D VPC2及Meso-2D VPC3）自iPS細胞（GMP1）及hES細胞（J1）生成Meso-VPC（圖4）。接種的中胚層細胞附著至經膠原蛋白IV塗佈表面，截至第7天（收集日）以2D分化黏著性細胞培養物形式生長及擴增至更大的緊密細胞菌落中（圖7上圖）。對於J1源性及GMP1源性細胞Meso-2D VPC2方案均比Meso-2D VPC3方案產生更多緊密細胞菌落（菌落更「尖」或「漩渦」）。在第7天之細胞收集之後及在進一步在經FN塗佈盤上培養並曝露於內皮細胞培養基後，細胞展現典型血管先驅細胞性質，包括卵石內皮細胞樣形態（圖7；中圖）及在基質膠上形成微血管樣網路及AcLDL攝取之能力（圖7；下圖），然而以低於Meso-3D細胞之規模（比較圖5及圖7下圖）。
另外，血管標記之FACS分析指示J1源性及GMP1源性Meso-2D VPC1及VPC2細胞均顯示CD146之高表現，內皮細胞標記KDR、CD31之穩固表現（＞20%）及PDGFRb之可偵測表現（10-40%）。此表現輪廓不同於未分化的多能幹細胞或HUVEC細胞中所觀測到之表現輪廓及其他PSC源性血管先驅細胞（例如HB及HE）中所觀測到之彼等表現輪廓（圖6B及6C）。與Meso-3D細胞相比，Meso-2D VPC表現更高水平之CD146及表明更傾向於外被細胞分化的PDGFR之特有表現（圖6A-B）。此外，不同於Meso-3D，Meso-2D VPC並不表現血液標記CD45或CD43中之任一者。實施例 8 ：單細胞 miRNA 輪廓
如下文所描述執行使用單細胞qRT-PCR分析以評估96種與多能性或血管細胞身分相關之微RNA的表現水平之另外的分析。訂購TaqMan基因表現分析（Applied Biosystems）用於96種人類miRNA。10X分析藉由將25 µL之20X Taqman分析與25 µL之2X分析加料試劑（Fluidigm）混合得到50 µL體積的最終儲備液來準備分析。製備在66,000至250,000個細胞/mL範圍內的細胞之等分試樣（冷凍或新鮮收集的）。在室溫下用LIVE/DEAD染色溶液（LIVE/DEAD生存力/細胞毒性套組）培育細胞10分鐘。隨後洗滌細胞，懸浮於培養基中且經由40 µm過濾器過濾。使用cellometer執行細胞計數得到生存力及細胞濃度。藉由將細胞（60 µL）與懸浮試劑（40 µL）（Fluidigm）以3:2之比率混合製備細胞混合物。將6 µL之細胞懸浮混合物加料至中等細胞（10-17 µm）或較大細胞（17-25 µm）之預塗佈C1單細胞Autoprep IFC微流晶片上，且隨後在Fluidigm C1儀器上使用「STA: Cell Load(1782x/1783x/1784x)」腳本處理該晶片。此步驟在96個捕獲箱中之各者中捕獲一個細胞。隨後將晶片轉移至基恩士顯微鏡且掃描各箱以對單細胞捕獲之數目、細胞之存活/死亡狀態及所捕獲之聚集體的二重峰/細胞評分。對於C1上之細胞溶胞、反轉錄及預擴增，根據製造商的方案將收集試劑、溶胞最終混合物、RT最終混合物及預擴增混合物添加至C1晶片之指定孔中。隨後將IFC放入C1中且使用「STA:miRNA Preamp (1782x/1783x/1784x)」腳本。將cDNA收集程序化以結束下一上午。將cDNA自C1晶片之各箱轉移至預加料有12.5 µL C1DNA稀釋試劑的新鮮96孔盤。根據製造商之說明製備管對照組（諸如無模板對照組及陽性對照組）用於各實驗。藉由qPCR使用96.96 Dynamic Array™ IFC及BioMark™ HD系統來分析預擴增cDNA樣本。按照製造商之方案執行預塗佈於JUNO儀器中之IFC的處理，隨後為cDNA樣本混合物之加料及10X分析。隨後將IFC放入Biomark™ HD系統中且使用協定「GE96x96 miRNA Standard v1.pcl」執行PCR。使用由Fluidigm提供之即時PCR分析軟體執行資料分析。自分析移除死亡細胞、複製品等且使用基於線性導數基線及用戶偵測Ct臨限之方法用於分析。在Heatmap視圖中檢視資料且導出為CSV文件。隨後將「R」軟體用於執行產生「FSO」文件之「離群值識別」分析，且隨後遵循「自動分析」之說明書。 結果 表1：miRNA輪廓
   J1 HB HE 2D VPC2 2D VPC3 3D VPC1 3D VPC2 HUVEC
多能
367 + - - - - - - -
302 a + - - - - - - -
302 b + - - - - - - -
302 c + - - - - - - -
血管
126 - + + + + + + +
125a-5p - - + + + +/- +/- +
24 - + + + + + + +
99a - - - - - - - +
Let 7b,d,e - - - - - - - +
特有
                          
223 - + - - - +/- +/- -
142-3p - + - - - - - -
133a       +               
483-5p - - - + + + + -
如表1中所示，MESO-VPC（3D或2D）均對於多能幹細胞miRNA標記（mir376、mir302a、mir302b及mir 302c）呈陰性而對於HUVEC中表現的內皮細胞miRNA標記（諸如mir126、mir125a-5p及mir24）呈陽性。又，MESO-VPC對於HUVEC特異性miRNA（mirLet7-e、mir223及mir99a）呈陰性。最後，MESO-VPC展示miRNA 483-5P之獨特表現且對於HB及HE特有miRNA mir142-3p及133a分別呈陰性。實施例 9 ： 後肢 缺血模型中之活體內研究
外周動脈疾病（PAD）為外周血管疾病（PVD）之一種形式，其中存在對肢體（通常為腿部）的血液供應之部分或完全堵塞，引起消減的血流量及組織之低氧。當PAD進展時，其達至嚴重肢體缺血（CLI）階段，伴有皮膚潰瘍、壞疽及不可避免的切斷術。已將後肢缺血動物模型用於評估各種治療方法。在此研究中，將穩定嚴重缺血模型（Ishikane等人 (2008)Stem Cells , 16:2625-2633）用於評估meso-VPC之功效及用於證實血流量恢復及缺血肢體中供體細胞併入的病徵之改善。小鼠之後肢缺血之誘導涉及胯之近端與股動脈之兩次接合及在兩根結紮絲之間切開。手術導致血流之堵塞及隨後導致嚴重缺血損傷。 物種
在研究起始6-8週大且最小及最大體重在組平均重量之+/- 20%範圍內的小鼠/Balb/cOlaHsd-Foxn1nu （Charles River Laboratories）。 測試物品
測試物1=根據實施例3製備之J1-HDF Meso-2D VPC2
測試物2=根據實施例2製備之J1-HDF Meso-3D血管樣物VPC2
測試物3=根據實施例3製備之GMP-1-HDF Meso-2D VPC2
測試物4=根據實施例2製備之GMP1-HDF Meso-3D血管樣物VPC2
測試物5=根據實施例2製備之GMP1-HDF Meso-3D血管樣物VPC1 媒劑（陰性對照組）
GS2（如WO 2017/031312中所描述之無細胞培養基，以全文引用之方式併入本文中）[對於552.2 mL之GS2：0.9%氯化鈉灌注液USP（Baxter Healthcare或Hospira）（408.6 mL）；5%右旋糖/0.9%氯化鈉，注射液USP（Baxter或Braun）（33.2 mL）及BSS灌注溶液（Alcon）（110.4 mL）] 研究設計及時間線
根據以下研究設計（表2）及時間線（表3）進行研究表 2 ：研究設計
組 處理 劑量體積 投予途徑 動物之編號（動物數量） 終止
1M 假手術 N/A N/A （19、20、39、40、59、60、79、80、99、100、101、102、103、104、105） 第36天
2M 媒劑 100 µl IM （13、14、15、16、17、18、54、55、56、57、58、77、78、97、98）
3M 測試物1 IM （61、62、63、64、65、66、67、68、76、90、91、92、93、94、95、96）
4M 測試物2 IM （69、70、71、72、73、74、75、81、82、83、84、85、87、88、89）
5M 測試物3 IM （1、2、3、4、5、9、10、11、12、21、22、23、24、25、26）
6M 測試物4 IM （6、7、8、36、37、38、45、46、47、48、49、50、51、52、53）
7M 測試物5 IM （27、28、29、30、31、32、33、34、35、41、42、43、44）
IM=局部肌肉內注射至缺血肢體表 3 ：時間線
研究日 程序 犧牲
處理前及其後每週一次 體重   
第0天 HLI手術   
第0天 測試物IM注射   
在HLI手術之前及之後以及在第7、14、21、28及35天 血流量量測   
在第7、21及35天 血管成像   
在第7、14、21、28及35天 肢體功能及肢體壞死評估   
一週兩次 臨床評分   
在第35天 肢體壞死之臨床評估（藉由級別）   
在第36天    腓腸肌肌肉收集
實驗程序發病率及死亡率觀測
在手術日期間及其後一天兩次（在週末一天一次）持續監測動物。體重
在處理前及其後一週一次記錄體重。HLI 手術程序
在麻醉及鎮痛下，以腹部側向上放入小鼠。
在手術當天（第0天）切開右後肢之腹股溝區域中之皮膚。用6-0絲線使股動脈接合兩次且在兩根結紮絲之間橫切。用5-0 Vicryl可吸收縫線使傷口閉合且使小鼠恢復。測試物投予程序
在第0天緊接著手術之後，在以下兩個部位對每個動物進行肌肉內注射：手術傷口之近端及末端。在每個部位對動物注射50 µl，總共100 µl/動物。總量/小鼠為1 M細胞/小鼠。血流量量測程序
針對納入標準（僅包括其中血流量與未受損傷腿部相比減少至少30%的動物）在手術前、緊接在手術之後及臨處理之前以及在研究日：手術後7、14、21、28及35天用非接觸式Peri-Med雷射都卜勒量測每個小鼠之雙腿的血流量。血流量量測值以手術之後缺血肢體中之流量比正常肢體中之流量的比率及以右肢中之流量比左肢中之流量的比率表示。血管成像程序
藉由RSOM Explorer P50（i-Thera Medical）成像系統量測3個時間點（手術之後7、21及35天）之每組3隻小鼠的雙腿（股骨及脛骨區域中）之血管成像。RSOM（Raster Scanning Optoacoustic Mesoscopy）探測器P50藉由用532 nm下之奈秒雷射脈衝照射及球形聚焦的50 MHz偵測器而工作。八十秒收集時間得到視野為5×5 mm、穿透率為3 mm及軸向/側向解析度為40 μm/10 μm之成像。缺血嚴重度之宏觀評估程序
在手術之後自第7天開始每週藉由使用如表4之壞死區域的形態等級（參見Goto等人 Tokai J. Exp. Clin. Med. 2006. 31:128-132）進行缺血肢體之宏觀評估。表 4 ：壞死區域之形態等級
等級 描述
0 不存在壞死
1 壞死限於腳趾（腳趾損傷），
2 壞死擴展至腳背（足損傷），
3 壞死擴展至小腿（膝蓋損傷）
4 壞死擴展至大腿（整個後肢損傷）
肢體功能之活體內評估程序
在手術之後自第7天開始每週使用表5中之以下級別（參見Stabile等人 Circulation. 2003. 108:205-210）執行缺血肢體之受損用途之半定量評估。表 5 ：肢體功能之評估
等級 描述
0 使腳趾彎曲以抵擋尾部之溫和牽引
1 足底彎曲
2 無牽拽但無足底彎曲
3 足之牽拽
在部分肢體切除術或全部肢體切除術之情況下，將肢體功能分級為「不適用」或「N/A」在此等情況下，血流量量測不包括於統計分析中。動物犧牲及組織固定
在第36天，將小鼠犧牲。收集來自兩個後肢之腓腸肌肌肉，將其固定於福爾馬林中且包埋於石蠟中（5隻動物/組）。自每組的3隻動物將肌肉OCT包埋、冷凍及儲存用於進一步運送。將包埋的肌肉樣本切片、藉由H&E + IHC Isolectin B4-HRP綴合物染色且由病理學家評估。針對組織中人類細胞之存在執行用於人類特異性抗體（Stem 121）之IHC。執行CD34之ICH染色及血管密度評估。結果 死亡率
十四隻動物在研究期間死亡。其中：一隻小鼠在程序期間死亡。在HLI手術後11天內發現十三隻小鼠在其籠中死亡。其中來自1M組之小鼠編號：19、40、99、100及101；來自2M組之小鼠編號：97；來自4M組之小鼠編號：69、72、88及89；來自6M組之小鼠編號：38及50；來自7M組之小鼠編號：28。由於腿部切除術根據人道主義原因將二十隻小鼠安樂死（來自2M組之小鼠編號：58及98；來自3M組之小鼠編號：61、63、64、90、91、92、93及95；來自4M組之小鼠編號：81；來自5M組之小鼠編號：21；來自6M組之小鼠編號：36、37、47及53；來自7M組之小鼠編號：29、30、32及34）。在每個時間點存活之所有動物均在彼時間點評估。體重
監測體重直至研究第35天。重量在手術後第一週期間下降，但在第二週期間開始恢復至在最後一週期間達至近似完全恢復。所有動物組同時恢復。使用GraphPad Prism 5軟體執行之二因子ANOVA接著Bonferroni事後比較並不揭示所有組之間體重方面的統計學顯著差異。血流量量測
在測試物處理之前評估血流量且其後在所有經手術動物中均觀測到明顯改變。在整個研究中與用媒劑處理之組（2M）相比在所有經處理組（3-7M）中均觀測到血流量之顯著提高。對於來自3M組之第21天之右側手術肢體及另一經處理組之自第28天直至第35天此提高為統計學顯著的（二因子ANOVA之後為Bonferroni多重比較）（圖8）。血管成像
藉由使用RSOM Explorer P50（i-Thera Medical）成像系統量測3個時間點（手術之後7、21及35天）之每組3隻小鼠的雙腿（在股骨及脛骨區域）之血管成像。
將若干分析方法用於評估缺血後肢中小血管密度之可能的增加。最後，使用100個最高切片之整合，因為更可信賴以看見血管新生。結果以第35天之彙總與第7天之百分比形式提供。為了使資料更清晰，提供所有組與媒劑組相比之增加或降低之平均值。在整個研究中與用媒劑處理之組（2M）相比在經處理組（3、4、6及7M）觀測到小血管密度之提高（圖9）。缺血嚴重度之宏觀評估
自第7天直至第35天藉由使用壞死區域之分級化形態級別來宏觀上評估缺血肢體。在來自所有組之動物中均觀測到足部切斷且在4M及5M組中最低。（參見表6及7）。表 6 ：在第 7 天肢體壞死評分為 0 、 1 及 2 之小鼠之發病率
組 肢體壞死評分為 0 之小鼠之百分比 肢體壞死評分為 1 之小鼠之百分比 肢體壞死評分為 2 之小鼠之百分比
2M媒劑 64.3 35.7 0
3M TI1 37.5 37.5 25.0
4M TI2 36.4 63.6 0
5M TI3 86.6 6.7 6.7
6M TI4 64.3 35.7 0
7M TI5 91.7 8.3 0
表 7 ：在第 35 天肢體壞死評分為 0 、 1 及 2 之小鼠之發病率
組 肢體壞死評分為 0 之小鼠之百分比 肢體壞死評分為 1 之小鼠之百分比 肢體壞死評分為 2 之小鼠之百分比
2M媒劑 35.8 50.0 14.2
3M TI1 25.0 25.0 50.0
4M TI2 27.3 63.6 9.1
5M TI3 60.0 33.3 6.7
6M TI4 23.0 38.5 38.5
7M TI5 16.7 50.0 33.3
肢體功能之評估
自第7天直至第35天藉由使用分級化官能級別執行缺血肢體之受損用途之半定量評估。在所有動物組中均存在肢體功能之自發性改善。儘管如此，對比用媒劑處理之（2M）對照組4M及5M組中之用測試物處理的動物展示更佳的功能改善（參見表8及9）。表 8 ：在第 7 天肢體功能評分為 0 、 1 、 2 及 3 之小鼠之發病率
組 肢體功能評分為 0 之小鼠之百分比 肢體功能評分為 1 之小鼠之百分比 肢體功能評分為 2 之小鼠之百分比 肢體功能評分為 3 之小鼠之百分比
2M媒劑 0 0 71.4 28.6
3M TI1 0 8.3 25.0 66.7
4M TI2 0 0 18.2 81.8
5M TI3 0 14.3 50.0 35.7
6M TI4 0 7.1 78.6 14.3
7M TI5 0 0 66.7 33.3
表 9 ：在第 35 天肢體功能評分為 0 、 1 、 2 及 3 之小鼠之發病率
組 肢體功能評分為 0 之小鼠之百分比 肢體功能評分為 1 之小鼠之百分比 肢體功能評分為 2 之小鼠之百分比 肢體功能評分為 3 之小鼠之百分比
2M媒劑 33.3 41.7 25.0 0
3M TI1 44.4 44.4 11.2 0
4M TI2 20.0 70.0 10.0 0
5M TI3 64.3 35.7 0 0
6M TI4 40.0 50.0 10.0 0
7M TI5 25.0 37.5 37.5 0
組織學結果
所有載片均用H&E及Masson三色染色法染色劑染色且由一個病理學家檢測。進行此評估作為半定量分析（參見下文分級）。轉印CD34+ 高分辨率組織學圖片用於定量圖像分析。肌肉萎縮等級：
0= 完全沒有萎縮。
1= 極輕度萎縮（最多10%之肌纖維）
2= 輕度萎縮（＞10%且＜25%之肌肉纖維）
3= 適度萎縮（＞25%且＜75%之肌肉纖維）
4= 嚴重萎縮（＞75%且＜100%之肌肉纖維）發炎（巨噬細胞及衛星細胞）等級：
0= 完全沒有發炎滲透。
1= 輕度細胞滲透，具有最多10個細胞/X20 HPF之增加。
2= 適度細胞滲透，具有10-20個細胞/X20 HPF之增加。
3= 高度細胞滲透，具有20-50個細胞/X20 HPF之增加。
4= 極高細胞滲透，具有＞50個細胞/X20 HPF之增加。
在所有動物組中，均觀測到肌肉纖維之中度至重度萎縮。觀測到肌細胞之變性脂肪改變及衛星細胞與巨噬細胞之增加。在一些情況下，存在纖維組織及淋巴細胞性滲透之明顯增加。少數動物亦展示一些營養不良礦化。與4M、5M及6M組比較2M及3M組一般展示更嚴重的改變。7M組展示中等改變。微血管密度之免疫組織化學及分析
評估染色區域且藉由配備有連接至CCD相機（DMX1200F；Nikon）的Plan Fluor物鏡之螢光顯微鏡（E600；Nikon，Tokyo，Japan）拍照。Cy3展示亮紅色螢光：Ex（max）：543 nm；Em（max）：570 nm，而螢光素聚葡萄糖展示強烈的綠色螢光（Ex（max）：488 nm；Em（最大值）：530 nM）。收集數位影像且使用Image Pro+軟體分析。自來自1 M及7M組之五個動物中的相同區域取得肌肉樣本之兩個切片。量測血管之面積。密度表示為每一視野之微血管的平均數目。全部血管代表量測區域中的所有血管。與研究之第36天的對照組2M相比所有經處理組中CD-34陽性微血管之數量更大。CD-34陽性染色被視為小微血管形成之指示，且由此所獲得的結果支持在經細胞處理之動物組中所觀測到的血流量提高。藉由雷射都卜勒測量的血流量與及微血管密度之間存在較強統計學顯著相關性（參見圖10及11）。 討論
將測試物IM投予至缺血肢體顯示肢體功能之一些改善（主要在經處理組4M及5M中），血流量、RSOM成像及血管定量組織學之提高（經由雷射都卜勒監測）。與用媒劑處理之對照組相比到研究結束時（在第36天）在所有經處理組中處理使血液灌注恢復（在最佳組4M中高達其正常值之78%）。此血液灌注恢復與RSOM成像分析之結果及與經手術後肢中微血管密度之免疫組織化學結果非常相關。組之評級指示4M為最佳，6M及7M緊接其後。腓腸肌石蠟包埋載片之STEM 121染色未能展示人類幹細胞，然而人類幹細胞在更接近於注射部位之四頭肌肌肉中觀測到。實施例 10 ： Meso-3D 血管樣物 VPC2 細胞之大量小 RNA-seq 分析
根據實施例2生成Meso-3D血管樣物VPC2細胞。將約1-2百萬個細胞的丸粒溶胞、分離RNA、定序、生物資訊學比對並分析小RNA在整個已知人類總轉錄本（約2000個miRNA）中之表現。圖12A展示來自三個重複之相比於J1細胞之群體及J1源性HE細胞之群體存在於J1源性Meso-3D血管樣物VPC2細胞之群體中的特有人類miRNA，包括hsa-miR-3917、hsa-miR-450a-2-3p、及hsa-miR-542-5p。圖12A亦展示存在於J1源性HE細胞之群體中之特有人類miRNA，包括hsa-miR-11399、hsa-miR-196b-3p、hsa-miR-5690、及hsa-miR-7151-3p。
另外，大量小RNA-seq分析顯示miR 214在J1源性HE及meso 3D血管樣物VPC2細胞中均以高水平表現，且miR 335-5p在J1及J1源性HE細胞中以高水平表現，而miR 335-3p在J1源性HE及meso 3D血管樣物VPC2細胞中以高水平表現。相似地，miR 199a-3p在J1源性HE及meso 3D血管樣物VPC2細胞中均以更高水平表現（資料未示出）。
圖12B展示先前在單細胞上分析之J1源性Meso-3D血管樣物VPC2細胞的群體中miRNA之表現水平。圖12B展示hsa-miR-126-5p、hsa-miR-125a-5p、及hsa-miR-24-3p在J1細胞之群體及J1源性Meso-3D血管樣物VPC2細胞之群體中均表現。圖12C展示J1源性Meso-3D血管樣物VPC2細胞之群體表現hsa-let-7e-5p、hsa-miR-99a-5p、hsa-miR-223-5p、及hsa-miR-142-3p且並不表現hsa-let-7e-3p、hsa-miR-99a-3p、及hsa-miR-133a-5p或低表現其等。圖12D亦展示J1源性Meso-3D血管樣物VPC2細胞之群體表現hsa-miR-483-5p及hsa-miR-483-3p。實施例 11 ： Meso-3D 血管樣物 VPC2 細胞之單細胞 RNA-seq 分析
亦在根據實施例2生成之J1源性Meso-3D血管樣物VPC2細胞上執行單細胞RNA-seq分析。對於各細胞類型（J1細胞、J1源性Meso-3D血管樣物VPC2細胞及HUVEC）捕獲約3,700-8,000個單細胞，處理該等細胞並使用10X Genomics（Pleasonton，CA）平台及其Cell Ranger分析管線進行單細胞定序分析。使用R套裝Seurat執行進一步資料QC及分析（Butler等人, Nature Biotechnology 36:411-420 (2018)；Stuart等人, Cell 177:1888-1902 (2019)）。一種此類分析係用以執行J1細胞、J1源性Meso-3D血管樣物VPC2細胞及HUVEC之整合分析以確認三個樣本中頂部差異表現之基因。此分析遵循Stuart等人, Cell 177:1888-1902 (2019)中且亦在https:// satijalab.org/ seurat/ v3.0/ pancreas_integration_label_transfer.html描述之準則。分析中僅保留在≥10個細胞中表現之基因及具有至少200種所偵測基因的細胞。圖13展示相比於單一J1或HUVEC細胞在J1源性Meso-3D血管樣物VPC2細胞樣本中最被上調或下調的基因之表現。實施例 12 ：血管樣物展現增加之試管內細胞存活且顯示活體內功效
根據實施例2生成J1源性Meso-3D血管樣物VPC2細胞之血管樣物，但將細胞低溫保存而不解離成單細胞以使得細胞保持聚集體形式。
約150個未解離Meso-3D血管樣物VPC2（相當於約1,500,000解離的單細胞）於1:1比率之膠原蛋白I及生長因子減少的基質膠中混合且塗覆於96孔盤之4個孔中。使凝膠在37℃下固化30分鐘隨後與50 ul補充有20 ng/mL FGF、25 ng/mL BMP4、45 ng/mL VEGF及10 uM SB431542-之完全VascuLife®基本培養基（Lifeline® Cell Technology，Frederick，MD）重疊。培養血管樣物14天。將凝膠用4%PFA固定，用0.05% Triton-X滲透至多4小時且用結合若丹明（rhodamine）之荊豆I（Ulex europaeus I，UEA1）、人類特異性內皮細胞標記染色整夜。將凝膠充分洗滌且用核標記DAPI對比染色。在Leica SP8共焦顯微鏡上使凝膠成像。圖14A展示在14天之後在低放大倍數（10x物鏡）下自J1源性Meso-3D血管樣物VPC2血管樣物之經包埋聚集體延伸的大面積血管網路。
隨後，將解離（或「單一」）及未解離（或血管樣物或「複數」）Meso-3D血管樣物VPC2細胞接種至於100 ul培養基中的經組織培養處理之96孔盤（約14,000個單細胞/孔）或超低附著96孔盤（約70個複數細胞或血管樣物/孔，等於約14,000個單細胞/孔）中。為了測試CLI-模擬病狀（亦即高血糖症及/或低氧），在正常（20% O2 ）或缺氧（5% O2 ）氧氣條件下用具有5.5 mMD-葡萄糖之完全VascuLife®基礎培養基（Lifeline® Cell Technology，Frederick，MD）作為對照組或用具有高葡萄糖濃度（30 mM）之完全VascuLife®基礎培養基來培養細胞72小時。在72小時之後，藉由用100 ul之CellTiter-Glo®試劑（Promega，Madison，WI）按照製造商之說明培育各孔45分鐘來量測相對細胞存活。量測每個氧氣條件中之單細胞及複數細胞之發光且標準化至5.5 mM對照組，作為細胞存活之讀出。圖14B展示在如上文所述解凍之後當在常氧（20% O2 ）或低氧（5% O2 ）下在模擬CLI之條件下試管內培養此等血管樣物時，與已以單細胞形式低溫保存之J1源性Meso-3D血管樣物VPC2細胞相比血管樣物展示更佳的細胞存活。
為了測試活體內功效，在如實施例9中所詳述誘導後肢缺血後以單細胞形式（Meso3D單細胞；總共1百萬個單細胞/動物）或以未解離複數細胞或血管樣物（Meso3D血管樣物；25,000個/動物，大約相當於總共1百萬個單細胞/動物）將GMP1-Meso3D VPC注射至Balb/c裸鼠（n=15隻/組）之四頭肌肌肉中。在手術後立即藉由雷射都卜勒灌注成像（laser Doppler perfusion imaging，LDPI）評估血流量，其後每週評估直至第64天。圖14C展示與用媒劑處理之組（單獨GS2培養基）相比在整個研究中在投予單細胞或血管樣物之後血流量的統計學顯著提高；二因子ANOVA之後為杜凱氏測試。實施例 13 ： HLI 模型中 Meso-3D 血管樣物 VPC2 細胞之長期作用
根據實施例2生成meso-3D血管樣物VPC2細胞（以解離單細胞形式）且將其投予至實施例9中所描述之HLI動物模型且觀測長期作用。在此等研究中，在HLI手術後將含1百萬個GMP1源性細胞（GMP1 Meso3D血管樣物VPC2、GMP1-HE及GMP1-HB）/動物之GS2培養基或單獨GS2培養基（媒劑）注射至右側四頭肌肌肉（n=12-19隻小鼠/組）。如實施例9中所描述執行肢體壞死及功能評分。對於一些細胞類型，使用超過一批產生自獨立分化實驗之細胞，因此當組合來自超過一批相同細胞類型之資料時可見更大動物計數。資料為平均值±平均值之標準誤差，在兩次獨立及重複研究間平均。單因子ANOVA之後為鄧尼特測試得到之*p＜0.05對比媒劑對照組（GS2培養基）。
圖15A展示在第21天與HE及HB細胞相比用meso-3D血管樣物VPC2細胞處理之動物具有更佳的平均壞死及功能評分。圖15B展示相比於媒劑用meso-3D血管樣物VPC2細胞、HE及HB細胞處理之動物在第63天之血流量提高。四頭肌中（圖15C）及腓腸肌（圖15D）中之CD34血管生長展示全部三種細胞類型之提高，其中在大約第35天HB展示更佳生長。然而，截至第63天，全部三種細胞類型似乎類似地促成生長，其中在腓腸肌中Meso-3D血管樣物VPC2細胞比HE及HB稍微更佳地促進生長。
在處理之後Meso-3D血管樣物VPC2細胞亦展示超過63天之長期植入（圖16A）。在此研究中，在HLI手術後將含1百萬個細胞/動物之GS2培養基或單獨GS2培養基（媒劑）注射至右側四頭肌肌肉中（媒劑= 18隻小鼠、GMP1-Meso3D批次號1 = 19隻小鼠、GMP1-Meso3D批次號2 = 18隻小鼠、GMP1-Meso3D批次號3 = 19隻小鼠、GMP1-HE = 19隻小鼠及J1-HE = 19隻小鼠）。隨後用刺紋標記注射部位。在第14、35、63及180天，收集來自經手術之右後肢之四頭肌肌肉，將其固定於PFA中、包埋於石蠟中且用Ku80人類特異性標記染色。每一動物分析兩張圖像（20x放大倍數），每組中至少n = 3，除第14天之J1-HE之外，其單獨為n = 1。資料表示根據不知情的獨立組織病理學家使用以下半定量級別之平均值±平均值之標準誤差；0 =不存在呈陽性Ku-80細胞；1=＜5存在呈陽性Ku-80細胞；2=＞5＜15存在呈陽性Ku-80細胞；3=＞15＜50存在呈陽性Ku-80細胞；4=＞50存在呈陽性Ku-80細胞。圖16A展示在處理之後第63天及第180天植入的供體GMP1-Meso3D血管樣物VPC2細胞，指示細胞之長期植入，但在第180天GMP-1-源性HE似乎展示更佳的植入。
在第二個研究中（圖16B），在HLI手術後將含1百萬個細胞/動物之GS2培養基注射至右側四頭肌肌肉中（GMP1-Meso3D血管樣物VPC2細胞= 16隻小鼠、GMP1-HE批次號1 = 16隻小鼠、GMP1-HE批次號2 = 17隻小鼠、GMP1-HB批次號1 = 16隻小鼠、GMP1-HB批次號2 = 16隻小鼠）。隨後用刺紋標記注射部位。在第14、35及63天，收集來自經手術之右後肢之四頭肌肌肉，將其固定於PFA中、包埋於石蠟中且用Ku80人類特異性標記染色。對每一動物分析使用Olympus BX60光學顯微鏡取得之兩張圖像（20x放大倍數），每組中至少n = 2。由不知情的獨立組織病理學家定量Ku80+細胞。資料表示平均值±平均值之標準誤差。圖16B展示截至第35及63天，meso-3D血管樣物VPC2細胞展示植入，但在第63天GMP-1-源性HE之一個批次似乎展示更佳植入。
在另一研究中（圖16C），在HLI手術後將含1百萬個細胞/動物之GS2培養基注射至右側四頭肌肌肉中（GMP1-Meso3D血管樣物VPC2細胞= 24-25隻來自兩個批次之小鼠）。在第63天，收集來自經手術之右後肢的四頭肌肌肉，將其固定於PFA中且包埋於石蠟中。隨後將切片用同工凝集素-B4（小鼠內皮細胞之標記）及荊豆I（UEA1，人類內皮細胞之標記）或Ku80（人類特異性標記）、UEA1及平滑肌α-肌蛋白（SMA，小鼠及人類兩者之平滑肌標記）染色。將DAPI用於對比標記核。圖16C展示所注射之Meso3D血管樣物VPC2之螢光圖像，顯示在HLI手術之後63天Balb/c裸鼠中之長期植入（Ku80+）、人類血管結構（UEA1+血管）之形成及旁分泌宿主血管生長（IB4+及SMA+血管）之促進。等效事物
發明所屬領域中具通常知識者將認識到或能夠僅使用常規實驗即可確定本文所描述之本發明特定實施方式的許多等效事物。此類等效事物意欲由以下申請專利範圍所涵蓋。本申請案通篇所引用之所有參考文獻、專利及公開專利申請案之內容均以引用之方式併入本文中。
無
[圖1]為人類多能幹細胞試管內分化成中胚層細胞之過程的示意性說明。
[圖2A]為展示細胞表面標記KDR、CD56/NCAM1、APLNR/APJ、GARP、或CD13在由人類誘導性多能幹細胞系GMP1分化的中胚層細胞上之表現的圖，該表現確定分化成中胚層系。
[圖2B]為展示多能、內胚層、外胚層、及血液血管細胞表面標記在由人類誘導性多能幹細胞系GMP1分化的中胚層細胞上之受限表現或不表現的圖，該受限表現或不表現確定分化成中胚層系。
[圖3]為人類多能幹細胞試管內分化成中胚層細胞（左）、及使用Meso-3D-血管樣物VPC1方案（右上）或Meso-3D-血管樣物VPC2方案（右下）使中胚層細胞試管內分化成中胚層源性血管先驅細胞（meso-VPC）之過程的示意性說明。
[圖4]為人類多能幹細胞試管內分化成中胚層細胞（左）、及使用Meso-2D VPC2方案（右上）或Meso-2D VPC3方案（右下）使中胚層細胞試管內分化成中胚層源性血管先驅細胞（meso-VPC）之過程的示意性說明。
[圖5]為一組展示藉由Meso-3D-血管樣物方案產生之meso-VPC進行進一步分化成內皮細胞系之能力的顯微鏡影像。上圖展示在收集之前第5天meso-VPC之形態。中圖展示使用經纖維接合素塗佈之盤及促進內皮分化之培養基的meso-VPC之內皮分化。下圖展示由meso-VPC所形成的微血管樣基質膠網路。
[圖6A]為展示細胞表面標記CD31/PECAM1、CD309/KDR、CXCR4/CD184、CD43、CD146、及PDGFRb在使用Meso-3D-血管樣物-VPC1、Meso-3D-血管樣物-VPC2、Meso-2D-VPC2、或Meso-2D-VPC3方案產生的meso-VPC上之表現的圖。
[圖6B]為展示對於所選擇的細胞表面標記呈陽性之meso-VPC及比較性造血內皮細胞（HE）或血液血管母細胞（HB）之分數的熱圖。亦展示與未分化多能幹細胞（J1及GMP1）及人類臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）之比較。
[圖6C]為展示藉由Meso-3D-血管樣物方案或Meso-2D方案產生的meso-VPC、比較性造血內皮細胞（HE）、比較性血液血管母細胞（HB）、未分化多能幹細胞（J1及GMP1）或人類臍靜脈內皮細胞（HUVEC）之血管細胞表面標記表現輪廓的主成分分析（principal component analysis，PCA）圖。
[圖7]為一組展示藉由Meso-2D方案產生之meso-VPC進行進一步分化成內皮細胞系之能力的顯微鏡影像。上圖展示在收集之前第7天meso-VPC之形態。中圖展示使用經纖維接合素塗佈之盤及促進內皮分化之培養基的meso-VPC之內皮分化。下圖展示由meso-VPC所形成的微血管樣基質膠網路。
[圖8]為展示如實施例9中所描述之用meso-VPC處理之動物中血流量增加的圖。具體而言，動物經假手術（1M）或用媒劑對照組（2M）、J1-HDF Meso-2D VPC2（3M）、J-HDF Meso-3D血管樣物VPC2（4M）、GMP1HDF Meso-2D VPC2（5M）、GMP1-HDF Meso-3D血管樣物VPC2（6M）或GMP1-HDF Meso-3D血管樣物VPC1（7M）處理。
[圖9]為展示如實施例9中所描述之用meso-VPC處理之動物中血管密度改變的圖。具體而言，動物用媒劑對照組（2M）、J1-HDF Meso-2D VPC2（3M TI1）、J-HDF Meso-3D血管樣物VPC2（4M TI2）、GMP1HDF Meso-2D VPC2（5M TI3）、GMP1-HDF Meso-3D血管樣物VPC2（6M TI4）或GMP1-HDF Meso-3D血管樣物VPC1（7M TI5）處理。
[圖10]為展示用meso-VPC處理之動物中的CD34+染色（其為小微血管形成之指標）、總血管數量、及血流量測試之組合定量結果的圖。具體而言，動物經假手術（1M）或用媒劑對照組（2M）、J1-HDF Meso-2D VPC2（3M TI1）、J-HDF Meso-3D血管樣物VPC2（4M TI2）、GMP1HDF Meso-2D VPC2（5M TI3）、GMP1-HDF Meso-3D血管樣物VPC2（6M TI4）或GMP1-HDF Meso-3D血管樣物VPC1（7M TI5）處理。
[圖11]展示用meso-VPC處理之各組動物的藉由雷射都卜勒（Laser Doppler）量測之血流量與平均微血管密度之間的強烈及統計學顯著的相關性。
[圖12A]提供展示來自三個重複之相比於J1細胞之群體及J1源性HE細胞之群體存在於J1源性Meso-3D血管樣物VPC2細胞之群體中的特有人類miRNA（包括hsa-miR-3917、hsa-miR-450a-2-3p、及hsa-miR-542-5p）之圖及圖示。圖12A亦展示存在於J1源性HE細胞之群體中之特有人類miRNA，包括hsa-miR-11399、hsa-miR-196b-3p、hsa-miR-5690、及hsa-miR-7151-3p。「表現」為在全部3個重複中標準化表現＞0。
[圖12B]為展示先前在單細胞上分析之J1源性Meso-3D血管樣物VPC2細胞之群體中miRNA之表現水平的圖，且展示在J1細胞之群體及J1源性Meso-3D血管樣物VPC2細胞之群體中均表現hsa-miR-126-5p、hsa-miR-125a-5p、及hsa-miR-24-3p。
[圖12C]為展示J1源性Meso-3D血管樣物VPC2細胞之群體表現hsa-let-7e-5p、hsa-miR-99a-5p、hsa-miR-223-5p、及hsa-miR-142-3p且並不表現hsa-let-7e-3p、hsa-miR-99a-3p、及hsa-miR-133a-5p或低表現其等的圖。
[圖12D]為展示J1源性Meso-3D血管樣物VPC2細胞之群體表現hsa-miR-483-5p及hsa-miR-483-3p的圖。
[圖13]為展示在單細胞RNA-seq分析中相比於單一J1或HUVEC細胞在J1源性Meso-3D血管樣物VPC2細胞樣本中最被上調或下調的基因之表現的圖。
[圖14A]為藉由DAPI及UAE1染色展示在14天之後自J1源性Meso-3D血管樣物VPC2血管樣物之經包埋聚集體延伸的大面積血管網路之低放大倍數（10x物鏡）下的影像。
[圖14B]為展示當在解凍之後在常氧（20% O2 ）（左圖）或低氧（5% O2 ）（右圖）下在模擬CLI之條件下試管內培養J1源性Meso-3D血管樣物VPC2血管樣物（「複數」）或解離成單細胞之J1源性Meso-3D血管樣物VPC2細胞（「單細胞」）時，與已以單細胞形式低溫保存之J1源性Meso-3D血管樣物VPC2細胞相比血管樣物展示較佳的細胞存活的圖。
[圖14C]為展示與用媒劑處理之組（單獨GS2培養基）相比在整個研究中在投予J1源性Meso-3D血管樣物VPC2單細胞（「sc」）或血管樣物之後血流量的統計學顯著的提高之圖；二因子ANOVA之後為杜凱氏（Tukey's）測試。
[圖15A]為展示在第21天與HE及HB細胞相比用meso-3D血管樣物VPC2細胞處理之動物具有更佳的平均壞死（左圖）及功能評分（右圖）之圖。單因子ANOVA之後為鄧尼特（Dunnett's）測試。平均值± sem。
[圖15B]為展示相比於媒劑用meso-3D血管樣物VPC2細胞、HE、及HB細胞處理之動物在第63天之血流量提高的圖。*p＜0.05對比媒劑。平均值+/- s.d.。二因子ANOVA之後為杜凱氏測試。
[圖15C]為展示用Meso-3D血管樣物VPC2細胞、HE、及HB細胞處理之動物的四頭肌中CD34+ 血管生長的圖。*p＜0.05對比媒劑。平均值+/- sem。二因子ANOVA之後為未校正的費雪氏（Fisher's）LSD測試。
[圖15D]為展示在投予Meso-3D血管樣物VPC2細胞、HE、或HB細胞之後腓腸肌之改善的圖。*p＜0.05對比媒劑。平均值+/- sem。二因子ANOVA之後為未校正的費雪氏LSD測試。
[圖16A]為藉由Ku80+染色展示在處理之後第63天及第180天植入的供體GMP1-Meso3D血管樣物VPC2細胞的圖，其指示細胞之長期植入。
[圖16B]為藉由Ku80+染色展示截至第35天及第63天，Meso-3D血管樣物VPC2細胞展示之植入的圖。
[圖16C]為所注射之Meso3D血管樣物VPC2之螢光影像，其顯示在HLI手術之後63天Balb/c裸鼠中之長期植入（Ku80+）、人類血管結構（UEA1+血管）之形成、及旁分泌宿主血管生長（IB4+及SMA+血管）之促進。

Claims (99)

  1. 一種自多能幹細胞產生中胚層源性血管先驅細胞（mesoderm-derived vascular progenitor cell，meso-VPC）之群體之方法，其中該方法包含 在非黏著或低黏著條件下於包含一或多種選自由以下者組成之群的因子之培養基中培養來源於多能幹細胞之中胚層細胞：血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、纖維母細胞生長因子（fibroblast growth factor，FGF）、骨成形性蛋白質4（bone morphogenetic protein 4，BMP4）、及轉形生長因子-β（transforming growth factor-beta，TGF-β）I型受體之小分子抑制劑，藉此產生中胚層源性血管先驅細胞（meso-VPC）之群體。
  2. 如請求項1之方法，其中該中胚層細胞藉由在包含一或多種選自由以下者組成之群的中胚層誘導性生長因子之培養基中培養多能幹細胞而自該多能幹細胞得到：活化素-A、血管內皮生長因子（VEGF）、纖維母細胞生長因子（FGF）、及骨成形性蛋白質4（BMP4）。
  3. 如請求項1或2之方法，其中該等meso-VPC以血管樣物（vasculonoid）形式產生。
  4. 如請求項3之方法，其進一步包含將該血管樣物中之該等meso-VPC解離成單細胞。
  5. 如請求項2至4中任一項之方法，其中該等中胚層誘導性生長因子包含活化素-A、VEGF165、FGF-2及BMP4。
  6. 如請求項5之方法，其中該活化素-A以約5-15 ng/mL之濃度使用。
  7. 如請求項5之方法，其中該VEGF165以約5-25 ng/mL之濃度使用。
  8. 如請求項5之方法，其中該FGF-2以約5-25 ng/mL之濃度使用。
  9. 如請求項5之方法，其中該BMP4以約5-50 ng/mL之濃度使用。
  10. 如請求項2至9中任一項之方法，其進一步包含在培養約24小時之後自該培養基移除活化素-A。
  11. 如請求項2至10中任一項之方法，其中該等多能幹細胞係在細胞外基質表面上培養。
  12. 如請求項11之方法，其中該細胞外基質表面為經基質膠（Matrigel）塗佈表面。
  13. 如請求項2至12中任一項之方法，其中該等多能幹細胞培養約3天至約5天。
  14. 如請求項1至13中任一項之方法，其中該轉形生長因子-β（TGF-β）I型受體之小分子抑制劑為SB431542。
  15. 如請求項1至14中任一項之方法，其中該一或多種因子包含VEGF165、FGF-2、BMP4、及SB431542。
  16. 如請求項1至15中任一項之方法，其中該一或多種因子進一步包含弗斯可林（Forskolin）。
  17. 如請求項16之方法，其中該弗斯可林以約2-10 µM之濃度使用。
  18. 如請求項15至17中任一項之方法，其中該VEGF165以約10-50 ng/mL之濃度使用。
  19. 如請求項15至17中任一項之方法，其中該FGF-2以約10-50 ng/mL之濃度使用。
  20. 如請求項15至17中任一項之方法，其中該BMP4以約10-50 ng/mL之濃度使用。
  21. 如請求項14至20中任一項之方法，其中該SB431542以約5-20 µM之濃度使用。
  22. 如請求項1至21中任一項之方法，其中培養該中胚層細胞進行約3天至約7天。
  23. 如請求項1至22中任一項之方法，其中培養該中胚層細胞係在5% CO2 及20% O2 之常氧條件下進行。
  24. 如請求項2至23中任一項之方法，其中培養該等多能幹細胞係在5% CO2 及20% O2 之常氧條件下進行。
  25. 如請求項1至24中任一項之方法，其中該等非黏著或低黏著條件為在超低附著表面上。
  26. 一種自多能幹細胞產生中胚層源性血管先驅細胞（meso-VPC）之群體之方法，其中該方法包含 （a）在包含一或多種選自由以下者組成之群的因子之培養基中在細胞外基質表面上培養來源於多能幹細胞之中胚層細胞：血管內皮生長因子（VEGF）、纖維母細胞生長因子（FGF）、及骨成形性蛋白質4（BMP4）；及 （b）在包含一或多種選自由以下者組成之群的因子之培養基中在細胞外基質表面上培養步驟（a）中所產生的細胞：血管內皮生長因子（VEGF）、纖維母細胞生長因子（FGF）、骨成形性蛋白質4（BMP4）、及轉形生長因子-β（TGF-β）I型受體之小分子抑制劑， 藉此產生該中胚層源性血管先驅細胞之群體。
  27. 如請求項26之方法，其中該中胚層細胞藉由在包含一或多種選自由以下者組成之群的中胚層誘導性生長因子之培養基中培養多能幹細胞而自該多能幹細胞得到：活化素-A、血管內皮生長因子（VEGF）、纖維母細胞生長因子（FGF）、及骨成形性蛋白質4（BMP4）。
  28. 如請求項26或27之方法，其中該方法進一步包含將該meso-VPC之群體解離成單細胞。
  29. 如請求項27或28之方法，其中該等中胚層誘導性生長因子包含活化素-A、VEGF165、FGF-2及BMP4。
  30. 如請求項29之方法，其中該活化素-A以約5-15 ng/mL之濃度使用。
  31. 如請求項29之方法，其中該VEGF165以約5-25 ng/mL之濃度使用。
  32. 如請求項29之方法，其中該FGF-2以約5-25 ng/mL之濃度使用。
  33. 如請求項29之方法，其中該BMP4以約5-50 ng/mL之濃度使用。
  34. 如請求項29至33中任一項之方法，其進一步包含在培養約24小時之後自該培養基移除活化素-A。
  35. 如請求項26至34中任一項之方法，其中步驟（a）中的該細胞外基質表面為經膠原蛋白IV塗佈表面。
  36. 如請求項27至35中任一項之方法，其中該等多能幹細胞培養約3天至約5天。
  37. 如請求項26至36中任一項之方法，其中步驟（a）中的該一或多種因子包含VEGF165、FGF-2、及BMP4。
  38. 如請求項26至37中任一項之方法，其中該轉形生長因子-β（TGF-β）I型受體之小分子抑制劑為SB431542。
  39. 如請求項26至38中任一項之方法，其中步驟（b）中之該一或多種因子包含VEGF165、FGF-2、BMP4、及SB431542。
  40. 如請求項26至39中任一項之方法，其中步驟（a）中之該一或多種因子進一步包含弗斯可林。
  41. 如請求項26至40中任一項之方法，其中步驟（b）中之該一或多種因子進一步包含弗斯可林。
  42. 如請求項40或41之方法，其中該弗斯可林以約2-10 µM之濃度使用。
  43. 如請求項37至42中任一項之方法，其中該VEGF165以約10-50 ng/mL之濃度使用。
  44. 如請求項37至42中任一項之方法，其中該FGF-2以約10-50 ng/mL之濃度使用。
  45. 如請求項37至42中任一項之方法，其中該BMP4以約10-50 ng/mL之濃度使用。
  46. 如請求項38或39之方法，其中該SB431542以約5-20 µM之濃度使用。
  47. 如請求項26至46中任一項之方法，其中步驟（a）及（b）中之該細胞外基質表面為經膠原蛋白IV塗佈表面。
  48. 如請求項26至47中任一項之方法，其中步驟（a）中的培養執行約1天。
  49. 如請求項26至48中任一項之方法，其中步驟（b）中之培養執行約4天至約7天。
  50. 如請求項26至49中任一項之方法，其中步驟（a）中之培養係在5% CO2 及20% O2 之常氧條件下進行。
  51. 如請求項26至50中任一項之方法，其中步驟（b）中之培養係在5% CO2 及5% O2 之低氧條件下進行。
  52. 如請求項27至51中任一項之方法，其中培養該等多能幹細胞係在5% CO2 及20% O2 之常氧條件下進行。
  53. 如請求項1至52中任一項之方法，其中該多能幹細胞為人類胚胎幹細胞。
  54. 如請求項1至52中任一項之方法，其中該多能幹細胞為人類誘導性多能幹細胞。
  55. 如請求項1至54中任一項之方法，其中該meso-VPC之群體表現選自由以下者組成之群的細胞表面標記中之至少一者：CD31/PECAM1、CD309/KDR、CD43、CD144、CD34、CD184/CXCR4、CD146、及PDGFRb。
  56. 如請求項55之方法，其中該meso-VPC之群體表現以下細胞表面標記：（a）CD146、CD31/PECAM1、及CD309/KDR；或（b）CD31/PECAM1、CD309/KDR、CD146、及（i）CD144、CD34、CD184/CXCR4、CD43、或PDGFRb中之至少一者、（ii）CD34、CD184/CXCR4、及PDGFRb；（iii）CD184/CXCR4；（iv）PDGFRb；（v）CD144及CD184/CXCR4；（vi）CD184/CXCR4及CD43；或（vii）CC184/CXCFR4。
  57. 如請求項1至56中任一項之方法，其中該meso-VPC之群體展現以下者之受限偵測或無偵測：（a）選自由CXCR7、CD45、及NG2組成之群的細胞表面標記中之一或多者；（b）CXCR7、CD45、及NG2；或（c）選自由CD144、CD34、CD184/CXCR4、CXCR7、CD43、CD45、PDGFRb、及NG2組成之群的細胞表面標記中之一或多者。
  58. 如請求項1至57中任一項之方法，其中該meso-VPC之群體表現至少一種選自以下者之miRNA標記：hsa-miR-3917、hsa-miR-450a-2-3p、hsa-miR-542-5p、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-24-3p、hsa-let-7e-5p、hsa-miR-99a-5p、hsa-miR-223-5p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-483-3p、miR 214、miR 335-3p、及miR-199a-3p。
  59. 如請求項1至58中任一項之方法，其中該meso-VPC之群體展現至少一種選自以下者之miRNA標記之受限表現或不表現：hsa-let-7e-3p、hsa-miR-99a-3p、hsa-miR-133a-5p、hsa-miR-11399、hsa-miR-196b-3p、hsa-miR-5690、及hsa-miR-7151-3p。
  60. 如請求項1至59中任一項之方法，其中該meso-VPC之群體表現hsa-miR-3917、hsa-miR-450a-2-3p、及hsa-miR-542-5p。
  61. 如請求項1至60中任一項之方法，其中該meso-VPC之群體包含至少一種meso-VPC，該meso-VPC對於至少一種選自由mir126、mir125a-5p、mir24、及mir483-5p組成之群的miRNA標記呈陽性。
  62. 如請求項61之方法，其中該miRNA標記為mir483-5p。
  63. 如請求項1至62中任一項之方法，其中該meso-VPC之群體包含至少一種meso-VPC，該meso-VPC展現至少一種選自由mir367、mir302a、mir302b、mir302c、mirLet7-e、mir223、mir99a、mir142-3p、及mir133a組成之群的miRNA標記之受限表現或不表現。
  64. 如請求項1至63中任一項之方法，其進一步包含藉由該meso-VPC之分化產生血管內皮細胞。
  65. 如請求項64之方法，其中該分化係在經纖維接合素塗佈表面上進行。
  66. 一種組成物，其包含藉由如請求項1至63中任一項之方法產生的meso-VPC之群體。
  67. 一種組成物，其包含藉由來源於多能幹細胞之中胚層細胞之試管內分化而產生的中胚層源性血管先驅細胞（meso-VPC）之群體，其中該meso-VPC之群體表現至少一種選自由以下者組成之群的細胞表面標記：CD31/PECAM1、CD309/KDR、CD43、CD144、CD34、CD184/CXCR4、CD146、及PDGFRb。
  68. 如請求項67之組成物，其中該meso-VPC之群體表現至少兩種選自由以下者組成之群的細胞表面標記：CD31/PECAM1、CD309/KDR、CD43、CD144、CD34、CD184/CXCR4、CD146、及PDGFRb。
  69. 如請求項67至68中任一項之組成物，其中該meso-VPC之群體表現細胞表面標記CD146、CD31/PECAM1、及CD309/KDR。
  70. 如請求項67至69中任一項之組成物，其中該meso-VPC之群體表現細胞表面標記CD31/PECAM1、CD309/KDR、CD146、及（i）CD144、CD34、CD184/CXCR4、CD43、或PDGFRb中之至少一者、（ii）CD34、CD184/CXCR4、及PDGFRb；（iii）CD184/CXCR4；（iv）PDGFRb；（v）CD144及CD184/CXCR4；（vi）CD184/CXCR4及CD43；或（vii）CC184/CXCFR4。
  71. 如請求項67至70中任一項之組成物，其中該meso-VPC之群體展現以下者之受限偵測或無偵測：（a）一或多種選自由CXCR7、CD45、及NG2組成之群的細胞表面標記；（b）CXCR7、CD45、及NG2；或（c）一或多種選自由CD144、CD34、CD184/CXCR4、CXCR7、CD43、CD45、PDGFRb、及NG2組成之群的細胞表面標記。
  72. 如請求項67至71中任一項之組成物，其中該meso-VPC之群體表現至少一種選自以下者之miRNA標記：hsa-miR-3917、hsa-miR-450a-2-3p、hsa-miR-542-5p、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-24-3p、hsa-let-7e-5p、hsa-miR-99a-5p、hsa-miR-223-5p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-483-3p、miR 214、miR 335-3p、及miR-199a-3p。
  73. 如請求項67至72中任一項之組成物，其中該meso-VPC之群體展現至少一種選自以下者之miRNA標記之受限表現或不表現：hsa-let-7e-3p、hsa-miR-99a-3p、hsa-miR-133a-5p、hsa-miR-11399、hsa-miR-196b-3p、hsa-miR-5690、及hsa-miR-7151-3p。
  74. 如請求項67至73中任一項之組成物，其中該meso-VPC之群體表現hsa-miR-3917、hsa-miR-450a-2-3p、及hsa-miR-542-5p。
  75. 如請求項67至74中任一項之組成物，其中該meso-VPC之群體包含meso-VPC之血管樣物。
  76. 如請求項67至74中任一項之組成物，其中該meso-VPC之群體包含meso-VPC之單細胞。
  77. 一種藉由來源於多能幹細胞之中胚層細胞的試管內分化產生之meso-VPC，其中該meso-VPC對於至少一種選自由mir126、mir125a-5p、mir24、及mir483-5p組成之群的miRNA標記呈陽性。
  78. 如請求項77之meso-VPC，其中該meso-VPC對於miRNA標記mir483-5p呈陽性。
  79. 如請求項77或78之meso-VPC，其中該meso-VPC對於至少一種選自由mir367、mir302a、mir302b、mir302c、mirLet7-e、mir223、mir99a、mir142-3p、及mir133a組成之群的miRNA標記呈陰性。
  80. 如請求項66至79中任一項之組成物或meso-VPC，其中該多能幹細胞為人類多能幹細胞。
  81. 如請求項80之組成物或meso-VPC，其中該多能幹細胞為人類胚胎幹細胞（human embryonic stem cell，hESC）。
  82. 如請求項80之組成物或meso-VPC，其中該多能幹細胞為人類誘導性多能幹細胞（human induced pluripotent stem cell，hiPSC）。
  83. 如請求項66至82中任一項之組成物或meso-VPC，其中該多能幹細胞首先分化成中胚層細胞，該中胚層細胞繼而分化成該meso-VPC。
  84. 一種醫藥組成物，其包含如請求項66至83中任一項之組成物或meso-VPC。
  85. 一種治療個體之血管疾病或病症的方法，該方法包含向該個體投予有效量之如請求項66至83中任一項之組成物或中胚層源性血管先驅細胞（meso-VPC）或如請求項83之醫藥組成物，藉此治療該個體之該血管疾病或病症。
  86. 如請求項85之方法，其中該血管疾病或病症係選自由以下者組成之群：動脈粥樣硬化、外周動脈疾病（peripheral artery disease，PAD）、頸動脈疾病、靜脈疾病、血凝塊、主動脈瘤、纖維肌性發育不全、淋巴水腫、及血管損傷。
  87. 如請求項86之方法，其中該外周動脈疾病係選自由以下者組成之群：嚴重肢體缺血、腸道缺血症候群、腎動脈疾病、膕部陷套症候群（popliteal entrapment syndrome）、雷諾氏現象（Raynaud's phenomenon）、柏格氏病（Buerger's disease）。
  88. 如請求項87之方法，其中該外周動脈疾病為嚴重肢體缺血。
  89. 如請求項85至88中任一項之方法，其中該組成物、meso-VPC或該醫藥組成物係肌肉內或全身性投予。
  90. 如請求項85至89中任一項之方法，其中投予該組成物、meso-VPC或該醫藥組成物增大該個體之血流量。
  91. 如請求項85至90中任一項之方法，其中投予該組成物、meso-VPC或該醫藥組成物促進該個體之血管新生（angiogenesis）及/或脈管發生（vasculogenesis）。
  92. 如請求項85至91中任一項之方法，其中投予該組成物、meso-VPC或該醫藥組成物減輕該個體之缺血嚴重度。
  93. 如請求項85至92中任一項之方法，其中投予該組成物、meso-VPC或該醫藥組成物減小該個體之肢體之壞死面積。
  94. 如請求項85至93中任一項之方法，其中向該個體投予約1×104 至約1×1013 個meso-VPC。
  95. 如請求項85至94中任一項之方法，其中該meso-VPC係以醫藥組成物形式投予。
  96. 如請求項95之方法，其中該醫藥組成物包含 （a）使溶液維持在生理pH下之緩衝液； （b）至少5%（w/v）葡萄糖；及 （c）使該溶液維持在生理滲透壓下之滲透活性劑。
  97. 如請求項96之方法，其中該葡萄糖為D-葡萄糖（右旋糖）。
  98. 如請求項96之方法，其中該滲透活性劑為鹽。
  99. 如請求項96之方法，其中該鹽為氯化鈉。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114231481A (zh) * 2021-12-21 2022-03-25 中国人民解放军总医院 一种重编程真皮成纤维细胞为内皮祖细胞的化学诱导方法

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI772270B (zh) 2015-08-18 2022-08-01 美商安斯泰來再生醫藥協會 臨床調配物
WO2024020399A1 (en) * 2022-07-19 2024-01-25 Lung Biotechnology Pbc Methods for differentiating endothelial cells

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102651433B1 (ko) 2006-04-14 2024-03-25 아스텔라스 인스티튜트 포 리제너러티브 메디슨 혈관 콜로니 형성 세포
ES2685969T3 (es) 2008-05-06 2018-10-15 Astellas Institute For Regenerative Medicine Células formadoras de colonias hemangioblásticas y células hemangioblásticas no injertables
BR112013030166A2 (pt) * 2011-06-09 2017-03-21 Hoffmann La Roche método de diferenciação de células haste pluripotentes em células leito vasculares, células endoteliais ou células dos músculos moles vasculares, banco biológico e uso de células endoteliais ou células dos músculos moles vasculares, composição terapêutica, métodos e usos.
JP2015500810A (ja) 2011-11-30 2015-01-08 アドバンスド セル テクノロジー、インコーポレイテッド 間葉系間質細胞及びその関連用途
CA2896053A1 (en) 2012-12-21 2014-06-26 Ocata Therapeutics, Inc. Methods for production of platelets from pluripotent stem cells and compositions thereof
TWI772270B (zh) 2015-08-18 2022-08-01 美商安斯泰來再生醫藥協會 臨床調配物

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114231481A (zh) * 2021-12-21 2022-03-25 中国人民解放军总医院 一种重编程真皮成纤维细胞为内皮祖细胞的化学诱导方法

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