KR102559192B1 - 캡슐화된 간 조직 - Google Patents

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Abstract

본 개시내용은, 간 기능 개선을 위해 생체내에서, 작용제의 간 대사 및/또는 간독성을 결정하기 위해 시험관내에서, 그리고 환자의 생물학적 유체로부터 독성 화합물을 제거하기 위해 생체외에서 사용될 수 있는 캡슐화된 간 조직을 제공한다. 캡슐화된 간 조직은 생체적합성 가교 중합체로 적어도 부분적으로 커버링된 적어도 하나의 간 오르가노이드를 포함한다. 캡슐화된 간 조직의 제조 방법이 또한 제공된다.

Description

캡슐화된 간 조직
관련 출원 및 문헌에 대한 상호 참조
본 출원은 2017년 11월 23일자로 출원된 미국 가특허출원 제62/425,811호로부터 우선권을 청구하며, 상기 출원의 내용은 그 전문이 본원에 포함된다.
본 발명의 기술 분야
본 개시내용은, 생체적합성 가교 중합체 내에 캡슐화될 수 있는, 간, 간엽(mesenchymal) 및 선택적으로 내피 세포를 포함하는 간 오르가노이드, 뿐만 아니라 간 기능 회복 또는 개선, 그리고 작용제 (예를 들어 선도 화합물, 또는 시험용 신약)의 간 대사 및/또는 간독성의 측정을 위한 이들의 용도에 관한 것이다.
간경변 및 만성 간 부전 (LF)은 대부분의 진행성 간 질환의 공통적인 결과이다. 간의 합성 및 해독 기능의 손실은 특히, 복수, 간 뇌병증 및 위장 출혈과 같은 주요 전신적 결과를 수반한다. 추가로, 모든 암이 아닌 간-관련 사망의 거의 10%는 급성 LF에 기인하고, 이는 장기의 타고난 재생 능력을 넘어서는 간에 대한 갑작스런 손상으로부터 발생하는 극도로 중증인 진행성 증후군이다. 아동 및 청소년에서의 급성 LF는 불량한 결과를 가지며, 환자의 단지 50%만이 이들의 자생 간으로 생존한다. 또한, 간 부전을 일으키지 않지만 중증 간 및 간외 결과를 수반하는 간 대사의 선천적 이상 (우레아 사이클 결함, 크리글러-나자르(Criggler-Najjar) 증후군, 가족성 고콜레스테롤혈증 등)과 같은, 상당 수의 간 병태가 존재한다. 개별적으로는 희귀하지만, 함께 고려되는 경우, 간에 기초한 대사성 질환은 소아 간 이식의 10% 초과를 차지한다. 치료는 이러한 병태의 단지 몇몇에 대해 이용가능하다. 모든 경우에, 치료는 증상을 감소시키고 예후를 개선시키지만, 질환을 치유하지는 못한다. 간 대사의 대부분의 선천적 이상에 관하여, 급성, 만성 및 급만성(acute-on-chronic) LF에 대한 관리의 표준은 간 이식이지만, 연간 5,000건 초과의 간 사망에 비해 캐나다에서는 매년 단지 400건의 이식만이 수행된다. 간 이식에 적격인 소수의 환자의 경우, 적합한 장기 공여자를 기다리는 동안의 사망이 너무 흔하다. 급성 LF를 갖는 아동은, 이들의 질환이 비가역적으로 지나치게 중증이 되기 전에 진단으로부터 수일 내에 이식되어야 한다 (공여자를 기다리면서 20%가 사망). 유아는 훨씬 더 큰 위험을 갖고, 거의 절반이 이식 전에 사망하고, 이식된 환자의 50%가 수술 후 사망한다. 또한, 간 이식은 중요한 제한을 갖는다. 상당한 단기간 치사율 및 이환율 위험을 수반하는 것 외에, 이는 평생의 면역억제를 필요로 하고, 종종 중증 장기간 간 및 간외 문제의 합병증이 발생한다. 간 대사의 선천적 이상을 갖는 아동의 결과는 훨씬 더 양호하지만, 이러한 환자는 대기 목록에서 매우 낮은 우선권을 갖고, 종종 이식을 기다리는 동안 전신 합병증이 발생한다. 이러한 높은 위험은, 간 재생 동안 단지 간 기능의 일시적 대체를 필요로 하는 급성 LF를 갖는 많은 환자에서, 뿐만 아니라 정상 간 실질(normal liver parenchyma)이지만 단일 효소 결핍을 특징으로 하는 많은 대사성 간 질환에서 불균형화된다. 따라서, LF 및 대사성 간 질환을 갖는 아동 및 성인에서 간 기능을 회복하기 위한 새로운 치료법에 대한 긴급한 필요성이 존재한다.
간 기능을 일시적으로 대체하기 위한 부분 간 이식 또는 체외 해독 장치에 기초한 여러 대안적 접근이 수년에 걸쳐 개발되지만, 결과는 거의 만족스럽지 않았다. 지난 20년간, 건강한 공여자로부터의 일차 간 세포의 이식은 만성 LF 및 간 대사의 선천적 이상을 갖는 환자에서 일시적인 개선을 유도하는 것으로 나타났다. 이러한 접근은 간 질환에 대한 세포 요법의 실행성을 나타내었지만, 이는 장기 부족, 반복된 주사 및 평생 면역억제에 대한 필요성, 및 세포 품질의 극도의 변동성에 의해 제한된다.
또한, 화학적 독성을 평가하기 위한 금 표준 독물학적 접근은 시간 소모적이고 비용이 드는 복잡한 생체내 연구를 포함한다. 동물 시험은 동물 복지, 시간 및 비용에 대한 문제를 제기한다. 추가로, 인간 건강 부작용에 대한 설치류의 생체내 시험의 예측 정확도는 최근 몇년간 분쟁의 문제가 되었다. 독성 시험에서 시험관내 모델 시스템의 사용은, 동물 수 감소, 동물 유지 및 관리 비용 감소, 시험에 필요한 화학물질의 소량, 필요한 시간의 단축, 및 다수의 화학물질 및 이들의 대사물질 평가를 위한 처리량 증가를 포함한 많은 이점을 갖는다. 시험관내 시스템은 또한 화학물질 대사를 연구하고, 독성의 메커니즘을 평가하고, 효소 동력학을 측정하고, 용량-반응 관계를 검사하는 것을 가능하게 한다. 간은 장을 통해 흡수된 또는 피하, 근육내 또는 정맥내 경로를 통해 주사된 임의의 화합물의 대사, 활성화 또는 불활성화에 있어 핵심적 역할을 한다. 일차 인간 간세포의 사용은 이들의 희소한 이용가능성 및 이들의 품질에서의 극도의 변동성 및 시험관내 대사 활성에 의해 제한되어 왔으나, 반면 이용가능한 세포주는 간 생리학을 충분히 대표하지 못한다.
따라서, 선도 화합물 또는 시험용 약물이 간에 의해 대사되는 방식, 및 간 독성을 유도하는지의 여부를 평가하기 위한 실행가능 시험관내 배양 시스템을 확립하기 위한 필요성이 존재한다.
발명의 개요
제1 양태에 따르면, 본 개시내용은 제1 생체적합성 가교 중합체로 적어도 부분적으로 커버링된 적어도 하나의 간 오르가노이드를 포함하는 캡슐화된 간 조직을 제공한다. 간 오르가노이드는 간, 간엽 및 선택적으로 내피 세포를 포함하는 세포 코어를 포함한다. 간 오르가노이드는 실질적으로 구 형상, 및 약 50 내지 약 500 ㎛의 상대적 직경을 갖는다. 하나의 구현예에서, 적어도 하나의 간 오르가노이드는 제1 생체적합성 가교 중합체로 실질적으로 커버링된다. 또 다른 구현예에서, 세포 코어는 간세포 및/또는 담즙 상피 세포를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 제1 생체적합성 가교 중합체는 폴리(에틸렌) 글리콜 (PEG)을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 캡슐화된 간 조직은 제2 생체적합성 가교 중합체를 추가로 포함하고, 여기서 제1 생체적합성 가교 중합체는 제2 생체적합성 가교 중합체로 적어도 부분적으로 커버링된다. 하나의 구현예에서, 제1 생체적합성 가교 중합체는 제2 생체적합성 가교 중합체로 실질적으로 커버링된다. 또 다른 구현예에서, 제1 생체적합성 가교 중합체는 적어도 부분적으로 생분해성이고/거나, 제2 생체적합성 가교 중합체는 적어도 부분적으로 생분해에 대해 저항성이다. 또 다른 구현예에서, 제2 생체적합성 가교 중합체는 폴리(에틸렌) 글리콜 (PEG)을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 캡슐화된 간 조직은 제1 생체적합성 가교 중합체 전반에 걸쳐 분산된 복수의 간 오르가노이드를 포함한다.
제2 양태에 따르면, 본 개시내용은 캡슐화된 간 조직의 제조 방법을 제공한다. 광범위하게, 방법은 먼저, 간, 간엽 및 선택적으로 내피 세포를 현탁액 중에서 조합하고 배양시켜, (i) 간, 간엽 및 선택적으로 내피 세포를 포함하는 세포 코어, (ii) 실질적으로 구 형상, 및 (iii) 약 50 내지 약 500 ㎛의 상대적 직경을 갖는 적어도 하나의 간 오르가노이드를 얻는 단계를 포함한다. 방법은 또한, 적어도 하나의 간 오르가노이드를 제1 생체적합성 가교 중합체로 적어도 부분적으로 커버링하는 단계를 포함한다. 하나의 구현예에서는, 간 세포 및 간엽 세포를, 1: 0.2-7의 비율로, 배양 전에 조합한다. 또 다른 구현예에서는, 간 세포 및 내피 세포를, 1: 0.2-1의 비율로, 배양 전에 조합한다. 하나의 구현예에서, 간, 간엽 및 내피 세포 중 적어도 하나는, 예를 들어, 다분화능 줄기 세포와 같은 줄기 세포의 분화로부터 얻는다. 또 다른 구현예에서, 간 세포는 완전 내배엽(definitive endoderm), 후부 전장(posterior foregut) 또는 간 모세포(heteroblast)로부터 유래될 수 있고, 간 모세포 및/또는 간세포일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 간엽 세포는 간엽 줄기 세포 또는 간엽 전구체 세포이다. 또 다른 구현예에서, 내피 세포는 내피 전구체 세포이다. 하나의 구현예에서, 방법은 적어도 하나의 간 오르가노이드를 제1 생체적합성 가교 중합체로 실질적으로 커버링하는 단계를 포함한다. 추가의 구현예에서, 제1 생체적합성 가교 중합체는 폴리(에틸렌) 글리콜 (PEG)을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 방법은 제1 생체적합성 가교 중합체를 제2 생체적합성 가교 중합체로 적어도 부분적으로 커버링하는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 방법은 제1 생체적합성 가교 중합체를 제2 생체적합성 가교 중합체를 실질적으로 커버링하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 제1 생체적합성 가교 중합체는 적어도 부분적으로 생분해성이고/거나, 제2 생체적합성 가교 중합체는 적어도 부분적으로 생분해에 대해 저항성이다. 하나의 구현예에서, 제2 생체적합성 가교 중합체는 폴리(에틸렌) 글리콜 (PEG)을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 방법은 복수의 간 오르가노이드를 제1 생체적합성 가교 중합체 내에 포함시키는 단계를 추가로 포함한다.
제3 양태에 따르면, 본 개시내용은 본원에 기재된 방법에 의해 수득가능한 또는 수득된 캡슐화된 간 조직을 제공한다.
제4 양태에 따르면, 본 개시내용은 의약 제조를 위한 본원에 정의된 바와 같은 캡슐화된 간 조직을 제공한다.
제5 양태에 따르면, 본 개시내용은 간 기능의 회복 또는 개선을 필요로 하는 대상체에서의 간 기능의 회복 또는 개선을 위한, 본원에 정의된 캡슐화된 간 조직을 제공한다. 캡슐화된 간 조직은 간 부전과 관련된 증상의 치료 또는 완화에 사용될 수 있다. 하나의 구현예에서, 간 부전은 급성, 만성 또는 급만성 간 부전일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 캡슐화된 간 조직은 간 대사의 선천적 이상과 관련된 증상의 치료 또는 완화에 사용될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 캡슐화된 간 조직은 제1 생체적합성 가교 중합체 내의 복수의 간 오르가노이드를 포함한다. 대상체는 포유류, 예를 들어 인간일 수 있다.
제6 양태에 따르면, 본 개시내용은 간 기능의 회복 또는 개선을 필요로 하는 대상체에서의, 간 기능의 회복 또는 개선 방법을 제공한다. 광범위하게, 방법은 대상체에서 간 기능을 개선시기기 위해, 본원에 기재된 캡슐화된 간 조직의 간 오르가노이드 유효량을 대상체의 생물학적 유체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 하나의 구현예에서, 방법은 간 기능의 회복 또는 개선을 위한 것이며, 이는 간 부전과 관련된 증상의 치료 또는 완화를 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 간 부전은 급성, 만성 또는 급만성 간 부전이다. 또 다른 구현예에서, 방법은 대사의 선천적 이상과 관련된 간 기능의 회복 또는 개선을 위한 것이다. 또 다른 구현예에서, 캡슐화된 간 조직은 제1 및 제2 생체적합성 가교 중합체를 포함한다. 대상체는 포유류, 예를 들어 인간일 수 있다.
제7 양태에 따르면, 본 개시내용은 작용제의 간 대사 및/또는 간독성의 결정 방법을 제공한다. 광범위하게, 방법은 하기 단계를 포함한다: a) 작용제를, 기재된 바와 같은 캡슐화된 간 조직과 접촉시켜 시험 혼합물을 얻는 단계; b) 상기 시험 혼합물 내의 적어도 하나의 작용제-관련 간 대사물질 또는 간 파라미터를 결정하는 단계; 및 c) 단계 b)의 상기 적어도 하나의 작용제-관련 간 대사물질 또는 상기 간 파라미터를, 대조군 작용제-관련 간 대사물질 또는 간 파라미터와 비교하여, 작용제의 간 대사 및/또는 간독성을 결정하는 단계. 하나의 구현예에서, 방법은, 작용제가 캡슐화된 조직(예를 들어, 간세포 또는 담즙 상피 세포)의 적어도 하나의 간 오르가노이드의 적어도 하나의 세포 유형에서 간독성을 유도하는지 여부를 결정하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 방법은 작용제를 제1 간 오르가노이드를 포함하는 제1 캡슐화된 간 조직 및 제2 간 오르가노이드를 포함하는 제2 캡슐화된 간 조직과 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 제1 간 오르가노이드의 세포 (예를 들어, 간세포 및/또는 담즙 상피 세포)가 제2 간 오르가노이드의 세포 (예를 들어, 간세포 및/또는 담즙 상피 세포)에 대해 동종이계이다. 또 다른 구현예에서, 캡슐화된 간 조직은 본질적으로 제1 생체적합성 가교 중합체 및 적어도 하나의 간 오르가노이드로 이루어진다.
제8 양태에 따르면, 본 개시내용은 작용제의 간 대사를 결정하기 위한 키트에 관한 것으로, 이는 본원에 기재된 캡슐화된 간 조직 및 본원에 기재된 방법의 수행을 위한 지침서를 포함한다. 하나의 구현예에서, 키트는 조직 배양 지지체를 추가로 포함한다. 또 다른 구현예에서, 조직 배양 지지체는 적어도 하나의 웰을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 캡슐화된 간 조직은 적어도 하나의 웰의 저부에 있다.
본 발명의 성질을 일반적으로 기재한 바, 이하에서, 본 발명의 바람직한 구현예를 나타내는 예시로서 첨부 도면을 참조할 것이며, 여기서:
도 1a 내지 도 1d는 엄격한 무이종(xeno-free) 및 공급자 없는(feeder-free) 조건에서 말초 혈액 단핵 세포로부터 생성된 인간 유도된 다분화능 줄기 세포 (iPSC)의 구현예를 나타낸다. (도 1a) 현미경측정에 의해 측정된, 비트로넥틴 상의 E8 플렉스 배지 내의 iPSC 콜로니의 대표적 양태 (스케일 바 1000 ㎛ 상단, 200 ㎛ 하단). (도 1b) 역전사 실시간 PCR (RT-qPCR)에 의해 측정된, 섬유모세포 (밝은 회색 바), 배아 줄기 세포 (ESC, 백색 바) 및 iPSC (대각선 바)에서의 다분화능 유전자 (NANOG, POU5F1 및 SOX2)의 발현. (도 1c) iPSC의 대표적 유동 세포계측 분석으로, 이는 다분화능 마커 (SSEA4 및 TRA-1-81 [게이티드 세포(gated cell)의 90.8%], TRA-1-81 및 NANOG (게이티드 세포의 88. 8%) 발현의 높은 균질성을 보여줌. (도 1d) 면역형광법에 의해 측정된 피부 섬유모세포 (하부 열)와 비교한 iPSC (상단 열)에서의 다분화능 마커 (SOX2, TRA-1-81, NANOG, SSEA4 및 POU5F1)의 발현 (스케일 바 200 ㎛). 삽입물은 핵 (DAPI) 염색을 나타낸다.
도 2a 내지 도 2n은 iPSC의 시험관내 분화를 나타낸다. (도 2a) RT-qPCR에 의해 측정된, iPSC (밝은 회색 바)와 비교된 경우, iPSC-유래된 완전 내배엽 (백색 바)에서의 내배엽-특이적 유전자 (SOX17, FOXA2, CXCR4, GATA4)의 상향조절, 및 다분화능 유전자 (SOX2, NANOG, POU5F1)의 하향조절. 결과를 다양한 시험 유전자에서 로그 배수 변화로 나타내었다. (도 2b) 면역형광법에 의해 측정된, 시험관내 분화시 내배엽-특이적 마커(SOX17, FOXA2, CXCR4, GATA4)의 발현 (스케일 바 200 ㎛). 결과를 완전 내배엽 (상단 열) 및 미분화된 iPSC (하단 열)에 대해 나타내었다. 삽입물은 핵 (DAPI) 염색을 나타낸다. (도 2c) FOXA2, CXCR4 및 SOX17 마커에 대한, 완전 완전 내배엽에서 분화된 iPSC의 대표적 유동 세포계측 분석. 세포의 87.2%는 FOXA2+ 및 CXCR4+였고, 그의 98.4%는 또한 SOX17+였다 (삼중-양성 세포의 85.8%). (도 2d) 간 전구체 세포를 발생시키는, iPSC-유래된 복부 후부 전장 세포에서의 HNF4α의 증가된 발현. 결과를, iPSC, 완전 내배엽에서 분화된 iPSC, 또한 후부 전장에서 분화된 iPSC에서의 HNF4α 유전자의 mRNA 발현에서의 배수 변화로 나타내었다. (도 2e) RT-qPCR에 의해 측정된, 미분화된 iPSC (밝은 회색 바)와 비교시, iPSC-유래된 간 세포 (백색 바)에서의 간-특이적 유전자 (AFP, 알부민 및 HNF4α)의 상향조절. 결과를 다양한 시험 유전자에서 로그 배수 변화로 나타내었다 (X-축에서 확인됨). (도 2f) 면역형광법에 의해 측정된, iPSC-유래된 간세포 (우측 컬럼) 및 미분화된 iPSC (좌측 컬럼)에서의 간-특이적 마커 (AFP, 상단 패널; 알부민, 중앙 패널; E-카드헤린, 하단 패널)의 발현 (스케일 바 200 ㎛). (도 2g) iPSC-유래된 간세포의 대표적 형태. (도 2h) iPSC-유래된 간세포는 CyP3A4 활성 (좌측 패널), 알부민 (중앙 패널) 및 우레아(좌측 패널) 합성과 같은 간-특이적 기능을 획득한다. 미분화된 iPSC ("iPSC"로 라벨링됨), iPSC-유래된 간세포 ["iPSC-간세포(iPSC-Heps)"로 라벨링됨], iPSC-유래된 간세포 전구세포 ("간모세포"로 라벨링됨), iPSC-유래된 완전 내배엽 ("내배엽"으로 라벨링됨) 및 일차 인간 간세포 ("PHH"로 라벨링됨)에 대한 결과가 제공된다. 괄호 안의 수는 iPSC로부터 각각의 세포 유형을 얻기 위해 필요한 분화의 일수를 지칭한다. (도 2i) 현미경측정에 의해 측정된, iPSC로부터 유래된 간엽 전구세포의 대표적 형태 (스케일 바 200 ㎛). (도 2j) 면역형광법 (평활근 액틴(αSMA) - 좌측, 및 피브로넥틴 - 우측) 또는 유동 세포계측 (CD90, CD117 및 CD133) 및 iPSC-유래된 간엽 전구체 세포 (백색 바)에 의해 나타난 라인(line)-특이적 마커의 발현. 결과를 iPSC-유래된 간엽 세포 (상단 열) 및 미분화된 iPSC (하부 열)에 대하여 면역형광법 (좌측 패널)으로 나타내었다 (스케일 바 200 ㎛). 결과를 또한, 탯줄 매트릭스 줄기 세포 (UCMSC, 밝은 회색 바) 및 iPSC-유래된 간엽 세포 (iPSC-MPC, 백색 바)에 대하여 유동 세포계측 (우측 패널)으로 나타내었다. (도 2k) iPSC-MPC는, 각각 알리자린(Alizarin) 레드 S 염색 (상단 패널) 및 리피드톡스(LipidTox) 염색에 의해 나타난 바와 같이, 골세포 또는 지방세포로 분화될 수 있다. 스케일 바는 200㎛이다. (도 2l) iPSC-유래된 내피 전구체 세포 (iEPC)의 특성화. 결과를, 현미경측정에 의한 대표적 형태 (좌측 상단 패널, 스케일 바 200 ㎛), HUVEC (밝은 회색 바) 및 iPSC-분화된 내피 전구체 세포 (백색 바)에서 유동 세포계측에 의해 측정된 라인-특이적 마커(CD31)의 발현 (우측 상단 패널), 또는 iPSC (좌측 패널), iPSC-분화된 내피 전구체 세포 (중앙 패널) 또는 HUVEC (우측 패널)에 대해 면역형광법에 의해 측정된 것(하단 패널)으로 나타내었다. (도 2m) iEPC는 대표적 현미경측정에 의해 나타난 바와 같이 마트리겔(Matrigel)®에서 배양시 3D 맥관 구조를 형성할 수 있다 (내피 튜브 형성 검정). 스케일 바 1000㎛ 좌측 패널, 200㎛ 우측 패널.
도 3a 내지 도 3h는 iPSC-유래된 세포로부터 제조된 간 오르가노이드의 구현예를 나타낸다. (도 3a) 시딩 후 1, 2, 3, 7, 9 또는 11일차의, iPSC-유래된 내배엽-유래된/간 세포, UCMSC 및 HUVEC (1-유형) (상단 패널) 또는 iPSC-유래된 내배엽-유래된/간 세포, 내피 및 간엽 세포 (3-유형) (하단 패널)가 생성된 현탁액-성장된 간 오르가노이드의 현미경 관찰. (도 3b) 1-유형 (좌측 패널) 및 3-유형 (우측 패널) 간 오르가노이드의 헤마톡실린-에오신 염색. (도 3c) 간 오르가노이드의 알부민, 사이토케라틴 19 (CK19), EpCam, α-태아 단백 (AFP), ZO1 및 CD31의 면역형광법. 스케일 바는 200㎛이다. (도 3d) RT-qPCR로 측정할 때의, 비분화된 iPSCs (사선 막대), 배양 28일 후의 iPSCs-분화된 간세포 (백색 막대), 및 10일의 배양 이후의 간 오르가노이드(회백색 막대)에서의 간 특이적 마커 (AFP 및 알부민)의 발현. 결과를 상이한 유전자의 함수로 mRNA 발현의 로그 배수 변화로 나타내었다 (X축 아래에서 확인됨). (도 3e) iPSC-유래된 간 오르가노이드는 우레아 및 알부민 합성과 같은 일차 간세포의 전형적인 기능을 수행한다. 결과를, 미분화된 iPSC, iPSC-유래된 완전 내배엽 (분화 10일 후), iPSC-유래된 간모세포 (d18: 분화 18일 후), 간 버드 (d10: 시딩 10일 후), 1-유형 간 오르가노이드 (d10: 시딩 10일 후), 3-유형 간 오르가노이드 (d10: 시딩 10일 후) 및 일차 인간 간세포에서의, 알부민 (ng/24h/1×106 세포, 좌측 패널) 또는 우레아 (㎍/24h/1×106 세포, 우측 패널) 분비로서 나타내었다. (도 3f) iPSC-유래된 간 오르가노이드는 CyP3A4 활성을 나타낸다. 결과를, 간모세포 (d16: 분화 16일 후), iPSC-유래된 간세포 (d28: 분화 28일 후) 또는 3-유형 간 오르가노이드 (d10: 시딩 10일 후)에 대한 Cyp3A4 활성에서의 배수 증가 (iPSC와 비교시)로 나타내었다.
도 4a 내지 도 4t는 캡슐화된 간 조직의 구현예를 나타낸다. (도 4a) 간 오르가노이드의 캡슐화 방법, 및 캡슐화된 간 조직의 제조를 위한 방법의 구현예. (도 4b) PEG-캡슐화된 간 오르가노이드 (캡슐화된 간 조직)의 거시적 양태, 및 캡슐화된 간 조직의 조작 (상단 열: 마우스에서의 이식 준비가 된 캡슐화된 간 조직; 하단-좌측 및 중심: 96-웰 포맷에서의 캡슐화된 간 조직; 하단-우측: 바이오물질 내의 간 오르가노이드의 미시적 양태, 스케일 바 1000㎛). (도 4c) 3개의 상이한 캡슐화된 간 조직의 세포 생존능의 대표적 면역형광법 (생존/사망 검정). 스케일 바: 3개의 좌측 상단 패널에 대해 1000㎛, 상단-우측 패널 및 3개의 하단-우측 패널에 대해 200 ㎛, 및 하단-좌측 패널에 대해 100㎛. (도 4d) 2개의 대표적 캡슐화된 간 조직에 대한 조직학적 이미지. 스케일 바 50㎛. (도 4e) 일차 간세포 (PHH), HepG2 세포주의 세포 (HepG2), iPSC, iPSC-유래된 간세포 (iHeps, 분화 28일 후) 및 캡슐화된 간 오르가노이드 (ELT)에서의 CyP3A4 활성, 우레아 생산, α-태아 단백 (AFP) 섹션 및 알부민 분비의 비교. CyP3A4 활성에 대하여, 결과를 세포/오르가노이드 유형의 함수로 활성 (RLU, 또는 106 간 세포 당 상대적 광 단위로 나타냄, *** = p<0.001)으로 나타내었다. 우레아 생산에 대하여, 결과를 세포/오르가노이드 유형의 함수로 생산된 우레아 (㎍/24h/106 세포)로 나타내었다. AFP 분비에 대하여, 결과를 배양액 내의 시간 경과에 따른 캡슐화된 간 조직의 AFP의 양 (ng/106 세포/24h로서 측정됨, * = p<0.05)으로 나타내었다. 알부민 분비에 대하여, 결과를 배양액 내의 생산된 알부민의 양 (ng/24h/1×106 세포)을 시간의 함수로 나타내었다 (** = p<0.01). (도 4f) 시험관내에서의 캡슐화된 간 조직에 의한 암모니아 대사 (좌측 패널) 및 우레아 생산 (우측 패널). 암모니아 대사에 대하여, 결과를 배양에서 시간 (h)의 함수로서의 암모니아의 농도 (mmol/L) (* = p<0.05)로 나타내었다. 우레아 생산에 대하여, 결과를 암모니아 (1 mM)의 부재 (-) 또는 존재 (+) 하에 생산된 우레아 (㎍/24h/106 세포, *** = p<0.001)로 나타내었다. (도 4g) 시험관내에서의 캡슐화된 간 조직에 의한 타크롤리무스 대사. 결과를 리팜피신의 존재 (■) 또는 부재 (●) 하에, 항온처리 시간 (h)의 함수로서의 타크롤리무스 농도 (ng/㎖, *** = p<0.001)로 나타내었다. (도 4h) 동결 전, 해동 후, 및 해동 7일 후(d7) 캡슐화된 간 조직의 알부민 분비 (좌측 패널) 및 CyP3A4 활성 (우측 패널). 알부민 분비에 대하여, 결과를 시험된 조건의 함수로서의 생산된 알부민의 양 (ng/24h/1×106 세포)으로 나타내었다. CyP3A4 활성에 대하여, 결과를 시험된 조건의 함수로서의 활성 (RLU/106 세포)으로 나타내었다. (도 4i) 캡슐화된 간 조직의 복강내 이식 동안 얻어진 거시적 관찰. (도 4j) 캡슐화된 간 오르가노이드의 복강내 이식 1주 후 (좌측 패널) 또는 4주 후 (우측 패널)에 얻어진 거시적 관찰 (임의의 가시적인 부착 또는 염증이 없는 외식된(explanted) ELT의 사진). (도 4k) 비-캡슐화된 iPSC의 거시적 관찰(좌측 패널), 및 현미경 관찰 (헤마톡실린 및 에오신 염색, 중앙 및 우측 패널)이며, 이는 면역억제된 마우스에서 기형종(teratoma)의 형성을 보여줌. (도 4l) 마우스에서 이식 8주 후 캡슐화된 iPSC의 대표적 거시적 관찰로, 이는 동물에서 기형종의 형성이 없음을 보여줌. (도 4m) 혼합 림프구 반응 (MLR)이 실시된, 세포의 유동 세포계측에 의해 측정된 CD25, HLA-DR, 증식 (카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르, CFSE) 인터페론-γ (IFNg), CD3+IFNg 및 CD69 발현. MLR의 조건은 도의 좌측에 제공되어 있다. (도 4n) 동종이계 PBMC 단독 (효과기(Effector) PBMC 단독), 캡슐화 생체물질 단독 (생체 물질), 성숙된 수지상 세포 (mDC), 캡슐화된 mDC, 간 오르가노이드 및 캡슐화된 간 오르가노이드 (ELT)의 존재 하의, 혼합 림프구 반응에서 인터페론-γ (IFNg) 생산. 결과를 시험된 조건의 함수로 IFNg의 양 (pg/㎖)으로 나타내었다. (도 4o) 세포 및 오르가노이드의 캡슐화는 동종이계 T 세포 증식을 막는다 (MLR 검정). 간 오르가노이드는 단지 최소 T 세포 증식을 유도하였다. 동종이계 간 오르가노이드, PBMC 또는 심지어 성숙된 수지상 세포의 캡슐화시 T 세포 활성화는 나타나지 않았다. 약어: ctrl = 세포 없음; +gel = 바이오물질 내의 캡슐화; allo DC = 동종이계 성숙된 수지상 세포; PBMC = 동종이계 말초 혈액 단핵 세포; 간 org = 비-캡슐화된 iPSC-유래된 간 오르가노이드; 간 org+gel = ELT. 결과를 증식성 세포 또는 CD25, HLA-DR, CD69 또는 IFNg에 대해 양성인 세포의 백분율로 나타내었다 (유동 세포계측을 사용하여 측정). (도 4s) 모의(sham)-치료된 동물 또는 캡슐화된 간 조직 (ELT)으로 치료된 동물에서의 생존율 (좌측 패널), 및 체중 증가 또는 감소 (우측 패널). 생존율에 대하여, 결과를 가-치료된 (파선) 및 ELT-치료된 (실선) 동물에서의 간 부전의 유도 30일 후 생존율의 백분율로 나타내었다. 체중 증가 또는 감소에 대하여, 결과를 모의-치료된 동물(■) 및 ELT-치료된 (●) 동물에 대하여 간 부전 0일차의 동물의 체중 대비 7일차의 동물의 체중의 백분율로 나타내었다. p = 0.0095. (도 4q) 이중 PEG 캡슐화 (상단) 및 이중 PEG 캡슐화된 소낭의 현미경 관찰의 개략도 (스케일 바 500 ㎛, ND : 비-분해성, D : 분해성).
캡슐화된 간 조직
캡슐화된 간 조직은 생체적합성 가교 중합체로 적어도 부분적으로 커버링된 적어도 하나의 (및 하나의 구현예에서 복수의) 간 오르가노이드를 포함한다. 본 개시내용과 관련하여 사용되는 바와 같이, "간 오르가노이드"는 배양된 간, 간엽 및, 선택적으로 내피 세포의 혼합물을 지칭한다. 일부 구현예에서, 간 오르가노이드는 배양된 간, 간엽 및 내피 세포의 혼합물을 포 함한다. 간 오르가노이드는 형상이 일반적으로 구형이고, 그의 표면은 불규칙적일 수 있다. 간 오르가노이드의 상대적 직경은 약 50 내지 약 500 ㎛이다. 간의 세포 코어는 간 세포, 간엽 세포 및, 선택적으로, 내피 세포로 구성되고, 일부 구현예에서, 세포외 매트릭스 간, 간엽 및, 선택적으로 내피 세포가 배양되는 동안 생산되고 조립되었다. 간 오르가노이드는 세포를 현탁액 중에서 배양시킴으로써 얻을 수 있다. 일부 구현예에서, 특히 캡슐화된 간 조직의 배양/분화 전에, 간 오르가노이드의 표면은 내배엽 (예를 들어, 간)-유래된 간 세포, 예컨대 간세포 및/또는 담즙 상피 세포로 적어도 부분적으로 커버링된다 (또한 일부 구현예에서는 실질적으로 커버링된다). 또 다른 구현예에서, 간 세포는 세포 코어 전반에 걸쳐 (그러나 반드시 균질하게는 아님) 분산된다. 캡슐화된 간 조직 중에 존재하는 오르가노이드는 제1 생체적합성 가교 중합체로 적어도 부분적으로 커버링된다 (또한 일부 구현예에서는 실질적으로 커버링된다).
캡슐화되기 전에, 간 오르가노이드는 외생 세포외 매트릭스를 갖지 않는다. 간 오르가노이드는 실질적으로 배양된 간, 간엽 및, 선택적으로, 내피 세포로 구성된다. 또한, 간 오르가노이드 (캡슐화된 또는 제1 생체적합성 중합체 내에 있지 않은)는 간 기능을 나타내고, 예를 들어, 간 오르가노이드는 알부민과 응고 인자를 합성할 수 있고, CyP3A4 활성을 나타낼 수 있고, 암모니아를 우레아로 해독할 수 있고, 약물 (즉, 타크롤리무스 또는 리팜피신)의 간-특이적 대사를 수행할 수 있다.
본 개시내용의 간 오르가노이드는 형상이 실질적으로 구형이고, 마이크로미터 범우의 상대적 직경을 갖는다 (예를 들어, 이는 직경이 1mm 미만임). 하나의 구현예에서, 간 오르가노이드는, 그의 캡슐화 전에, 적어도 약 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480 또는 490 ㎛의 상대적 직경을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 간 오르가노이드는, 그의 캡슐화 전에, 약 500, 490, 480, 470, 460, 450, 440, 430, 420, 410, 400, 390, 380, 370, 360, 350, 340, 330, 320, 310, 300, 290, 280, 270, 260, 250, 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70 또는 60 ㎛ 이하의 상대적 직경을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 간 오르가노이드는, 그의 캡슐화 전에, 적어도 약 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480 또는 490 ㎛, 내지 약 500, 490, 480, 470, 460, 450, 440, 430, 420, 410, 400, 390, 380, 370, 360, 350, 340, 330, 320, 310, 300, 290, 280, 270, 260, 250, 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70 또는 60 ㎛ 이하의 상대적 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, 간 오르가노이드는, 그의 캡슐화 전에, 적어도 약 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280 또는 290 ㎛, 내지 약 300, 290, 280, 270, 260, 250, 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70 또는 60 ㎛ 이하의 상대적 직경을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 간 오르가노이드는, 그의 캡슐화 전에, 적어도 약 100 ㎛ 및 약 300 ㎛ 이하의 상대적 직경을 갖는다. 예를 들어, 간 오르가노이드는, 그의 캡슐화 전에, 적어도 약 150, 160, 170, 180 또는 190 ㎛이고, 200, 190, 180, 170 또는 160 ㎛ 미만의 상대적 직경을 갖는다. 또한 추가의 구현예에서, 간 오르가노이드는, 그의 캡슐화 전에, 적어도 약 150㎛ 및 약 200㎛ 이하의 상대적 직경을 갖는다. 간 오르가노이드의 크기는 이것이 함유하는 세포가 캡슐화된 간 조직과 접촉되는 다양한 영양소 및 생물학적 유체/세포로의 이들의 노출을 증가시킬 수 있게 한다. 일부 구현예에서, 이는 간 오르가노이드가, 이들을 숙주의 혈관계 (예를 들어, 캡슐화된 간 조직을 수용한 숙주의 혈관계)로 혈관화할 필요 없이 생체내에서 생존가능하게, 또한 생물학적으로 활성으로 남아있을 수 있게 한다.
간 오르가노이드의 내배엽 (간) 세포는 전체 오르가노이드를 통해 분산될 수 있고, 일부 구현예에서, 이들의 일부는 간 오르가노이드의 세포 코어의 표면에 위치할 수 있다. 간 오르가노이드의 간 세포는, 예를 들어, 완전 내배엽, 후부 전장 세포, 간모세포 또는 간 전구체 세포로부터의 세포일 수 있다. 간 오르가노이드의 간 세포는 간세포 및/또는 담즙 상피 세포일 수 있다. 간 오르가노이드의 간 세포는 단일 세포 유형 (예를 들어, 완전 완전 내배엽, 후부 전장 세포, 간모세포, 간세포 or 담즙 상피 세포)으로부터 또는 세포 유형의 혼합물 (예를 들어, 하기 세포 유형: 완전 완전 내배엽, 후부 전장 세포, 간모세포, 간세포 및/또는 담즙 상피 세포 중 적어도 둘의 혼합물)로부터의 것일 수 있다. 간 오르가노이드의 시험관내 세포 배양 동안 또는 심지어 간 오르가노이드가 생체내 배치될 때, 간 세포 유형(들)은 변하거나 분화될 수 있다. 예를 들어, 간 오르가노이드의 간 세포는 간엽 및 선택적으로 내피 세포와의 공동-배양 동안 또는 심지어 생체내 배치시, (완전 내배엽, 후부 전장 또는 간모세포로부터 간세포 또는 담즙 상피 세포로) 분화될 수 있다. 간세포가 간 오르가노이드 중에 존재하는지를 결정하기 위해, 당업계에 공지된 수단에 의해 시토크롬 P450 패밀리 3 서브패밀리 A 구성원 4 (CyP3A4), α 태아단백 (AFP)의 발현을 결정할 수 있다. 알부민, 응고 인자 및 우레아의 합성, 뿐만 아니라 CyP3A4의 활성을 또한 모니터링하여 간세포가 간 오르가노이드 중에 존재하는지를 결정할 수 있다. 완전 내배엽 또는 후부 전장 세포가 간 오르가노이드 중에 존재하는지를 결정하기 위해, SOX17, FOXA2, CXCR4, GATA4 또는 HNF4α의 발현을 당업계에 공지된 수단에 의해 결정할 수 있다.
간 오르가노이드의 간엽 세포는, 예를 들어, 상이한 기원 (골수 (혈액 포함), 탯줄 또는 지방 조직)의 간엽 줄기/전구체 세포, 지방세포, 근육 세포, 간 성상 세포, 근섬유모세포 및/또는 섬유모세포일 수 있다. 간 오르가노이드의 간엽 세포는 단일 세포 유형 (예를 들어, 간엽 줄기/전구체 세포, 지방세포, 근육 세포 또는 섬유모세포)으로부터 또는 세포 유형의 혼합물 (예를 들어, 하기 세포 유형: 간엽 줄기/전구체 세포, 지방세포, 근육 세포, 간 성상 세포, 근섬유모세포 및/또는 섬유모세포 중 적어도 둘의 혼합물)로부터의 것일 수 있다. 간 오르가노이드의 간엽 세포의 유형은 간 및 선택적으로 내피 세포와의 공동-배양 동안 또는 생체내 배치시 (간엽 줄기/전구체 세포로부터 섬유모세포, 지방세포 또는 근육 세포로) 분화될 수 있다. 간엽 줄기/전구체 세포는, 다른 유전자들 중에서도 특히, α 평활근 액틴 (αSMA), 피브로넥틴, CD90 및 CD73을 발현할 수 있다. 간 오르가노이드 중의 간엽 세포의 위치 또는 존재를 결정하기 위해, 다른 것들 중에서도 특히, 간엽 리니지에 특이적인 또는 그와 관련된 유전자 또는 단백질의 발현을 결정할 수 있다.
간 오르가노이드의 내피 세포는, 존재하는 경우, 예를 들어, 다양한 기원의 내피 전구체 세포 및/또는 내피 세포일 수 있다. 간 오르가노이드의 내피 세포는 단일 세포 유형 (예를 들어, 내피 전구체 세포 또는 내피 세포)으로부터 또는 세포 유형의 혼합물 (예를 들어, 내피 전구체 세포 및 내피 세포의 혼합물)로부터의 것일 수 있다. 간 오르가노이드의 내피 세포의 유형은 내배엽 및 간엽 세포와의 시험관내 공동-배양 동안 또는 생체내 배치시 (내피 전구체 세포로부터 내피 전구체 세포로) 분화될 수 있다. 일부 구현예에서, 간 오르가노이드의 내피 세포는, 내피 세포가 루멘의 내부 표면을 정렬시키는 모세관 또는 모세관-유사 구성으로 조직화될 수 있다 (이는 부분적일 수 있음).
상기에 기재된 바와 같이, 간 오르가노이드의 세포 코어는 간, 간엽 및 선택적으로 내피 세포 및, 일부 구현예에서, 배양 동안 세포에 의해 생산되고 가정되는 세포외 매트릭스로 구성된다. 간 오르가노이드의 세포 코어는 괴사/아팝토시스 세포에 있어 실질적으로 빈약하며 (예를 들어, 이는 조직학에 의해 검사시 괴사 영역을 갖지 않음), 이는 간 오르가노이드가 배양되는 배지로부터의 영양소가 세포 코어를 가로질러 확산될 수 있고, 따라서 세포 코어 내에서 전달될 수 있고, 세포 코어의 세포의 대사 노폐물이 간 오르가노이드로부터 확산될 수 있기 때문이다. 간 오르가노이드 자체 (캡슐화 전)는 외생 세포외 매트릭스 또는 합성 중합체 물질을 포함하지 않는다 (예를 들어, 이를 갖지 않음). 일부 구현예에서, 간 세포는 세포 코어의 표면 상에 존재할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 간 세포는, 세포 코어의 세포와 조합되어, 세포외 매트릭스 물질 (예를 들어 콜라겐 및 피브로넥틴) 및, 일부 구현예에서는, 기저 멤브레인 물질을 조립한다.
상기에 기재된 바와 같이, 간 세포는 간 오르가노이드의 세포 코어의 표면을 적어도 부분적으로 커버링할 수 있다. 본 개시내용과 관련하여, "간 세포가 세포 코어의 표면을 적어도 부분적으로 커버링한다"는 표현은, 간 세포가 세포 코어의 표면의 적어도 약 10%, 20%, 30% 또는 40%를 점유함을 나타낸다. 일부 구현예에서, 간 세포는 세포 코어의 표면을 실질적으로 커버링한다. 본 개시내용과 관련하여, "간 세포가 세포 코어의 표면을 실질적으로 커버링한다"는 표현은, 간 세포가 세포 코어의 표면의 대부분, 예를 들어, 세포 코어의 표면의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%를 점유함을 나타낸다. 하나의 구현예에서, 간 세포는 세포 코어의 표면을 완전히 커버링한다 (예를 들어, 세포 코어의 표면의 99% 초과가 간 세포로 커버링됨).
하나의 구현예에서, 본 개시내용의 간 오르가노이드는, 제1 가교 생체적합성 중합체 내의 캡슐화 전에, 간세포에 비해 더 높은 비율의 간엽 (또한 존재하는 경우 내피) 세포 및/또는 포유류 간에서 나타나는 것에 비해 더 높은 비율의 담즙 상피 세포를 갖는다. 그러나, 제1 가교 생체적합성 중합체 내의 캡슐화 후, 본 개시내용의 간 오르가노이드는, 간엽 (또한 존재하는 경우 내피) 세포에 비해 더 높은 비율의 간 세포를 갖는다. 포유류 간은 약 90%의 간 세포로 구성된다고 공지되어 있다. 이와 같이, 본 개시내용의 일부 구현예에서, 간 오르가노이드 중의 간 세포의 비율은 (간 오르가노이드의 세포의 총 수에 비해) 약 90%, 85%, 80% 또는 75% 미만이다.
간 오르가노이드는 상이한 기원의 세포로부터 제조될 수 있다. 하나의 구현예에서, 간, 간엽 또는 내피 세포 중 적어도 하나는 포유류, 예를 들어 인간으로부터의 것이다. 또 다른 구현예에서, 간, 간엽 또는 내피 세포 중 적어도 둘은 포유류, 예를 들어 인간으로부터의 것이다. 또 다른 구현예에서, 간, 간엽 및 내피 세포는 모두 포유류, 예를 들어 인간으로부터의 것이다. 간 오르가노이드 내에서, 상이한 기원으로부터의 세포가 조합될 수 있다. 예를 들어, 간엽 및 내피 세포는 쥐 또는 돼지 기원으로부터의 것일 수 있고, 간 세포는 인간 기원으로부터의 것일 수 있다. 이들 조합이 전부는 아니며, 당업자는 본 개시내용과 관련하여 적합할 수 있는 추가의 조합을 고려할 것이다.
간 오르가노이드의 세포는 상이한 공급원으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 간 오르가노이드의 세포는 일차 세포 배양물, 확립된 세포주 또는 분화된 줄기 세포로부터 유래될 수 있다. 간 오르가노이드 내에서, 상이한 공급원으로부터의 세포가 조합될 수 있다. 예를 들어, 간 세포는 일차 세포 배양물로부터의 것일 수 있고, 간엽 세포는 확립된 세포주로부터의 것일 수 있고, 내피 세포는 분화된 세포주로부터의 것일 수 있다. 대안적으로, 간 오르가노이드 내에서, 동일한 공급원으로부터의 세포 (예를 들어 분화된 줄기 세포)가 또한 조합될 수 있다. 구체적 구현예에서, 간 오르가노이드의 세포는 간, 간엽 및, 선택적으로, 내피 세포에서 분화된 단일 줄기 세포 집단으로부터 유래된다. 줄기 세포 집단은 배아 줄기 세포 또는 유도된 다분화능 줄기 세포로부터의 것일 수 있다. 구체적 구현예에서, 간 오르가노이드의 세포는 간, 간엽 및, 선택적으로 내피 세포에서 분화된 단일 다분화능 줄기 세포 집단으로부터 유래된다.
캡슐화된 간 조직에서 사용될 수 있는 중합체 (또한 중합체 매트릭스로서 언급됨)는 간 오르가노이드(들) 주위에 히드로겔을 형성한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 히드로겔은 물이 분산 매질인 친수성인 중합체 사슬을 지칭한다. 히드로겔은 천연 또는 합성 중합체 네트워크로부터 얻을 수 있다. 본 개시내용과 관련하여, 히드로겔 내의 캡슐화는 매립된 간 오르가노이드가 중합체로부터 누출되는 것을 막고, 따라서 간 오르가노이드의 세포가 이식시 수용자의 체내에서 면역 반응 또는 종양을 일으킬 수 있는 위험을 제거하거나 감소시킨다. 하나의 구현예에서, 각각의 간 오르가노이드는 개별적으로 캡슐화되고, 캡슐화된 간 오르가노이드는, 또 다른 구현예에서, 중합체 매트릭스 내에 추가로 포함될 수 있다. 또 다른 구현예에서는, 간 오르가노이드를 중합체 매트릭스 내에 포함시켜 이들을 캡슐화한다.
본 개시내용과 관련하여, 중합체는, 이것이 대상체 (예를 들어, 예: 인간) 내로 도입될 때 독성을 나타내지 않는 경우에 "생체적합성"으로 고려된다. 본 개시내용과 관련하여, 생체적합성 중합체는 대상체 (예를 들어, 예: 인간)에서 생체내 배치시 또는 간 오르가노이드의 세포를 향하여 독성을 나타내지 않는 것이 바람직하다. 간독성은, 예를 들어, 간세포 아팝토시스 사망률 (예를 들어, 여기서 아팝토시스의 증가는 간독성의 지표임), 트랜스아미나제 수준 (예를 들어, 여기서 트랜스아미나제 수준의 증가는 간독성의 지표임), 간세포의 벌루닝 (예를 들어, 여기서 벌루닝은 간독성의 지표임), 간세포에서의 미세소포형 지방증 (예를 들어, 지방증의 증가는 간독성의 지표임), 담즙 세포 사망률 (예를 들어, 담즙 세포 사망률의 증가는 간독성의 지표임), γ-글루타밀 트랜스펩티다제 (GGT) 수준 (예를 들어, 여기서 GGT 수준의 증가는 간독성의 지표임)을 결정함으로써 측정할 수 있다. 생체적합성 중합체는, 탄수화물 (글리코사미노글리칸, 예컨대 히알루론산 (HA), 콘드로이틴 술페이트, 데르마탄 술페이트, 케라탄 술페이트, 헤파란 술페이트, 알기네이트, 키토산, 헤파린, 아가로스, 덱스트란, 셀룰로스, 및/또는 그의 유도체), 단백질 (콜라겐, 엘라스틴, 피브린, 알부민, 폴리 (아미노산), 당단백, 항체 및/또는 그의 유도체) 및/또는 합성 중합체 (예를 들어, 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG), 폴리(히드록시에틸 메타크릴레이트) (PHEMA) 및/또는 폴리(비닐 알콜) (PVA) 기재)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 생체적합성 중합체는 단일 중합체 또는 상이한 중합체의 혼합물 (예를 들어 US2012/0142069에 기재된 것들)일 수 있다. 예시적 생체적합성 중합체는, 폴리(에틸렌) 글리콜, 폴리락트산 (PLA), 폴리글리콜산 (PGA), 폴리카프로락톤 (PCL), 피브린, 폴리사카라이드 물질 (예컨대, 키토산, 프로테오글리칸 또는 글리코사미노글리칸 (GAG)), 알기네이트, 콜라겐, 티올화된 헤파린 및 이들의 혼합물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 생체적합성 중합체는 선형, 분지형 및 선택적으로 펩티드 (예를 들어, RGD), 성장 인자, 인테그린 또는 약물로 그래프트될 수 있다.
일부 구현예에서, 중합체는 "저-면역원성 중합체"이고, 수용자에서 단지 최소 (즉, 중합체의 분해, 변형 또는 기능 손실을 일으키지 않는) 면역 반응만을 유도하거나 이를 유도하지 않는다. 이러한 저-면역원성 중합체는 또한, 세포의 하나 이상의 항원 결정인자를 마스킹하고 항원 결정인자에 대한 면역 반응을 감소시키거나 심지어 막을 수 있다(이러한 항원 결정인자가 동종이계 대상체 내로 도입될 때).
본 개시내용의 캡슐화된 간 조직 중에 존재하는 중합체는 바람직하게는 가교가능하고, 예를 들어, 가교될 수 있다. 중합체는, 열적으로, 화학적으로 (예를 들어, 하나 이상의 펩티드, 예컨대 VPMS, RGD 등의 사용에 의해) 또는 pH 또는 빛의 사용에 의해 (예를 들어, 예컨대 UV 광을 사용한 광중합) 가교될 수 있다. 일부 구현예에서, 가교는 간 오르가노이드 (중합체 매트릭스에 의해 캡슐화된 또는 캡슐화되지 않음)가 중합체 매트릭스 내에 분산된 후에 수행될 수 있다.
본 개시내용의 중합체는 전적으로 또는 부분적으로 생분해성 (예를 들어, 살아있는 유기체의 대사에 의해 가수분해될 수 있음) 또는 전적으로 또는 부분적으로 생분해에 대해 저항성 (예를 들어, 살아있는 유기체의 대사에 적용시 가수분해에 대해 저항성임)일 수 있다. 예시적 생체적합성 및 생분해성 중합체는, 폴리(에틸렌- 글리콜)-말레이미드 (PEG-Mal) 8-아암을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예시적 생체적합성 및 생분해-저항성 중합체는, 폴리(에틸렌-글리콜)-비닐 술폰 (PEG-VS)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
캡슐화된 간 조직은, 간 오르가노이드를 적어도 부분적으로 (또한 일부 경우에는 실질적으로) 커버링하는 제1 생체적합성 및 가교 중합체를 포함한다. 제1 생체적합성 중합체는 간 오르가노이드의 세포와 물리적으로 접촉한다. 본 개시내용과 관련하여, "간 오르가노이드(들)가 제1 생체적합성 및 가교 중합체에 의해 적어도 부분적으로 커버링된다"는 표현은, 제1 생체적합성 및 가교 중합체가 간 오르가노이드의 표면의 적어도 약 10%, 20%, 30% 또는 40%를 점유함을 나타낸다. 일부 구현예에서, 제1 생체적합성 및 가교 중합체는 간 오르가노이드(들)를 실질적으로 커버링한다. 본 개시내용과 관련하여, "간 오르가노이드(들)가 제1 생체적합성 및 가교 중합체에 의해 실질적으로 커버링된다"는 표현은, 제1 생체적합성 및 가교 중합체가 간 오르가노이드의 표면의 대부분, 예를 들어, 오르가노이드의 표면의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%를 점유함을 나타낸다. 하나의 구현예에서, 제1 생체적합성 및 가교 중합체는 간 오르가노이드의 표면을 완전히 커버링한다 (예를 들어, 간 오르가노이드의 표면의 99% 초과가 제1 생체적합성 및 가교 중합체로 커버링됨).
일부 구현예에서, 캡슐화된 간 조직은 또한, 제1 생체적합성 및 가교 중합체를 적어도 부분적으로 (또한 일부 경우에는 실질적으로) 커버링하는 제2 생체적합성 및 가교 중합체를 포함할 수 있다. 제2 생체적합성 중합체는 제1 생체적합성 가교된 것들과, 그리고 구현예에서는 간 오르가노이드의 세포와 물리적으로 접촉한다. 본 개시내용과 관련하여, "제1 생체적합성 가교 중합체가 제2 생체적합성 및 가교 중합체에 의해 적어도 부분적으로 커버링된다"는 표현은, 제2 생체적합성 및 가교 중합체가 제1 생체적합성 및 가교 제1 중합체의 표면의 적어도 약 10%, 20%, 30% 또는 40%를 점유함을 나타낸다. 일부 구현예에서, 제2 생체적합성 및 가교 중합체는 제1 생체적합성 및 가교 중합체의 표면을 실질적으로 커버링한다. 본 개시내용과 관련하여, "제1 생체적합성 및 가교 중합체가 제2 생체적합성 및 가교 중합체에 의해 실질적으로 커버링된다"는 표현은, 제2 생체적합성 및 가교 중합체가 제1 생체적합성 및 가교 중합체의 표면의 대부분, 예를 들어, 제1 생체적합성 및 가교 제1 중합체의 표면의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%를 점유함을 나타낸다. 하나의 구현예에서, 제2 생체적합성 및 가교 중합체는 제1 생체적합성 및 가교 중합체의 표면을 완전히 커버링한다 (예를 들어, 제1 생체적합성 및 가교 중합체의 표면의 99% 초과가 제2 생체적합성 및 가교 중합체로 커버링됨). 또 다른 구현예에서, 제2 생체적합성 및 가교 중합체는 간 오르가노이드 (제1 생체적합성 및 가교 중합체로 적어도 부분적으로 커버링됨)가 산재되어 있는 매트릭스를 형성한다. 이러한 구현예에서, 간 오르가노이드 (제1 생체적합성 및 가교 중합체로 적어도 부분적으로 커버링됨)는 제2 생체적합성 및 가교 매트릭스로 둘러싸일 수 있거나, 또 다른 간 오르가노이드 (제1 생체적합성 및 가교 중합체로 적어도 부분적으로 커버링됨)와 물리적으로 접촉할 수 있다. 캡슐화된 간 조직은 제2 생체적합성 및 가교 중합체를 커버링하는 추가의 생체적합성 및 가교 중합체를 포함할 수 있다.
제1 및 제2 생체적합성 및 가교 중합체는 동일하거나 상이할 수 있다. 하나의 구현예에서, 제1 생체적합성 및 가교 중합체는 적어도 부분적으로 (또한 일부 구현예에서는 전적으로) 생분해성 중합체이다. 또 다른 구현예에서, 제2 생체적합성 및 가교 중합체는 적어도 부분적으로 (또한 일부 구현예에서는 전적으로) 생분해에 대해 저항성이다. 또 다른 구현예에서, 제1 생체적합성 및 가교 중합체는 생분해성 중합체이고, 제2 생체적합성 및 가교 중합체는 생분해에 대해 저항성이다. 이러한 구현예에서, 제1 생체적합성 가교 중합체는 제2 생체적합성 가교 중합체보다 더 생분해성 (예를 들어, 생분해에 대해 덜 저항성)일 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 생체적합성 및 가교 중합체는 복수의 간 오르가노이드를 포함한다. 이러한 구현예에서, 캡슐화된 간 조직은 1 cm2 당 적어도 약 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450 또는 500개의 간 오르가노이드를 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 캡슐화된 간 조직은 1 cm2 당 약 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 175, 150, 125, 100, 90, 80, 70, 60 또는 50개 이하의 간 오르가노이드를 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 캡슐화된 간 조직은 1 cm2 당 약 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400 또는 450 내지 약 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 175, 150, 125, 100, 90, 80, 70 또는 60개의 간 오르가노이드를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 캡슐화된 간 조직은 1 cm2 당 약 50 내지 500개의 간 오르가노이드를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 캡슐화된 간 조직은 1 cm3 당 적어도 약 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400 또는 2500개의 간 오르가노이드를 포함한다. 또한 추가의 구현예에서, 캡슐화된 간 조직은 1 cm3 당 약 2500, 2400, 2300, 2200, 2100, 2000, 1900, 1800, 1700, 1600, 1500, 1400, 1300, 1200, 1100, 1000, 950, 900, 850, 800, 750, 700, 650, 600, 550, 500, 450, 400, 350, 300 또는 250개 이하의 간 오르가노이드를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 캡슐화된 간 조직은 1 cm3 당 약 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300 또는 2400 내지 약 2500, 2400, 2300, 2200, 2100, 2000, 1900, 1800, 1700, 1600, 1500, 1400, 1300, 1200, 1100, 1000, 950, 900, 850, 800, 750, 700, 650, 600, 550, 500, 450, 400, 350 또는 300개의 간 오르가노이드를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 캡슐화된 간 조직은 1 cm3 당 약 250 내지 2500개의 간 오르가노이드를 포함한다.
하나의 구현예에서, 배양물에서 또는 생체내 이식시 캡슐화된 간 조직은 간, 간엽 및 선택적으로 내피 세포와 관련된 유전자 및 단백질을 발현할 수 있다. 추가의 구현예에서, 캡슐화된 간 조직 (시험관내 또는 생체내)은 알부민을 생산할 수 있고/거나, 암모니아로부터 우레아를 형성할 수 있고/거나, CyP3A4 활성을 나타낼 수 있고/거나, 약물 (간에 의해 대사되는 것으로 공지된 것, 예컨대 타크롤리무스 및/또는 리팜피신)을 대사시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 캡슐화된 간 조직은 조직 내에서 간 오르가노이드 1g 당 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 mg의 알부민을 생산할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 동결-해동 사이클시 캡슐화된 간 조직은 간, 간엽 및 선택적으로 내피 세포와 관련된 유전자 및 단백질을 발현할 수 있고/거나, 알부민을 생산할 수 있고/거나, 암모니아로부터 우레아를 제조할 수 있고/거나, CyP3A4 활성을 나타낼 수 있고/거나, 약물 (예컨대 타크롤리무스 및/또는 리팜피신)을 간-특이적 대사시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 동결 후, 캡슐화된 간 조직은 조직 내에서 간 오르가노이드 g 당 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 mg의 알부민을 생산할 수 있다.
캡슐화된 간 조직의 제조 방법
캡슐화된 간 조직의 제조 방법은 먼저, 간 오르가노이드(들)를 제조하고, 이어서 이(들)를 제1 생체적합성의 가교 중합체 (및 선택적으로 제2의 추가의 생체적합성 가교 중합체) 내에 (적어도 부분적으로) 캡슐화하는 것을 필요로 한다.
간 오르가노이드는, 간 세포, 간엽 세포 및 선택적으로 내피 세포 (모두 상기에 기재된 바와 같음)를, (i) 간, 간엽 및 선택적으로 내피 세포를 포함하는 세포 코어, (ii) 실질적으로 구 형상, 및 (iii) 약 50 내지 약 500 ㎛의 상대적 직경을 갖는 간 오르가노이드를 얻기 위해 필수적인 조건에서 공동-배양함으로써 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 이들 조건은 세포를 현탁액 (예를 들어, 초저 부착 조건) 중에서 배양하여 간 오르가노이드의 형성을 촉진시키는 것을 포함한다.
캡슐화된 간 조직 내에 포함되는 간 세포는, 상이한 기원 (예를 들어 포유류) 및 공급원 (일차 세포 배양물, 세포주, 분화된 줄기 세포)으로부터 얻을 수 있다. 간 세포는 상이한 유형, 예컨대 완전 완전 내배엽, 후부 전장 세포, 간모세포, 간세포 및/또는 담즙 상피 세포로부터의 것일 수 있다. 단일 오르가노이드로부터의 간 세포는 동일한 또는 상이한 기원으로부터, 동일한 또는 상이한 공급원으로부터, 또한 동일한 또는 상이한 유형으로부터의 것일 수 있다. 하나의 구현예에서는, 완전 완전 내배엽이 사용된다. 또 다른 구현예에서, 완전 완전 내배엽은 줄기 세포 (예컨대 다분화능 줄기 세포) 분화로부터 얻어진다. 또 다른 구현예에서, 완전 내배엽으로부터 유래된 세포는 다분화능 줄기 세포 분화로부터 얻어진다 (예를 들어 다분화능 줄기 세포를 CHIR99021 및 녹-아웃(knock-out) 혈청 대체와 조합하여 액티빈(Activin) A와 배양함으로써). 하나의 구현예에서는, 후부 전장로부터의 세포가 사용된다. 또 다른 구현예에서, 후부 전장로부터의 세포는 줄기 세포 (예컨대 다분화능 줄기 세포) 분화로부터 얻어진다. 또 다른 구현예에서, 후부 전장로부터의 세포는 다분화능 줄기 세포 분화로부터 얻어진다 (예를 들어 다분화능 줄기 세포를 bFGF, 녹-아웃 혈청 대체물 (인슐린과 함께 또는 이것 없이), 및/또는 IWP2 및/또는 A83-01과 조합하여 BMP4와 배양함으로써). 하나의 구현예에서는, 간세포 및 간모세포가 사용된다. 또 다른 구현예에서, 간세포 및 간모세포는 줄기 세포 (예컨대 다분화능 줄기 세포) 분화로부터 얻어진다. 또 다른 구현예에서, 간세포 및 간모세포는 (예를 들어 다분화능 줄기 세포를 bFGF, 녹-아웃 혈청 대체물 (인슐린과 함께 또는 이것 없이) 및/또는 CHIR99021, IWP2, A83-01, HGF, 온코스타틴 M 및/또는 덱사메타손과 조합하여 BMP4와 배양함으로써) 다분화능 줄기 세포 분화로부터 얻어진다. 간 세포는 간 오르가노이드의 형성 전에 동결보존되어 또는 신선하게 사용될 수 있다.
캡슐화된 간 조직 내에 포함되는 간엽 세포는, 상이한 기원 (예를 들어 포유류) 및 공급원 (일차 세포 배양물, 세포주, 분화된 줄기 세포)으로부터 얻을 수 있다. 간엽 세포는 상이한 유형, 예컨대 간엽 줄기 세포, 지방세포, 근육 세포 or 섬유모세포로부터의 것일 수 있다. 단일 오르가노이드로부터의 간엽 세포는 동일한 또는 상이한 기원으로부터, 동일한 또는 상이한 공급원으로부터, 또한 동일한 또는 상이한 유형으로부터의 것일 수 있다. 하나의 구현예에서는, 간엽 줄기/전구체 세포가 사용된다. 또 다른 구현예에서, 간엽 줄기/전구체 세포는 줄기 세포 (예컨대 다분화능 줄기 세포) 분화로부터 얻어진다. 또 다른 구현예에서, 간엽 줄기/전구체 세포는 다분화능 줄기 세포 분화로부터 얻어진다 (예를 들어 다분화능 줄기 세포를 녹-아웃 혈청 대체물 보충된 DMEM 고글루코스 중에서의 코팅 없이 플라스틱 상에서 배양함으로써). 간엽 세포는 간 오르가노이드의 형성 전에 동결보존되어 또는 신선하게 사용될 수 있다.
존재하는 경우, 캡슐화된 간 조직 내에 포함되는 내피 세포는, 상이한 기원 (예를 들어 포유류) 및 공급원 (일차 세포 배양물, 세포주, 분화된 줄기 세포)으로부터 얻을 수 있다. 내피 세포는 상이한 유형, 예컨대 내피 전구체 세포 및 내피 세포로부터의 것일 수 있다. 하나의 구현예에서는, 내피 전구체 세포가 사용된다. 단일 오르가노이드로부터의 내피 세포는 동일한 또는 상이한 기원으로부터, 동일한 또는 상이한 공급원으로부터, 또한 동일한 또는 상이한 유형으로부터의 것일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 내피 전구체 세포는 줄기 세포 (예컨대 다분화능 줄기 세포) 분화로부터 얻어진다. 또 다른 구현예에서, 내피 전구체 세포는 다분화능 줄기 세포 분화로부터 얻어진다 (예를 들어 다분화능 줄기 세포를 BMP4, bFGF 및/또는 VEGF와 조합하여 CHIR99021 및/또는 액티빈 A와 배양함으로써). 내피 세포는 간 오르가노이드의 형성 전에 동결보존되어 또는 신선하게 사용될 수 있다.
하나의 구현예에서, 간 오르가노이드는 다분화능 줄기 세포의 단일 집단으로부터 제조될 수 있다. 다분화능 줄기 세포는 당업계에 공지된 방법, 예컨대 바이러스 형질도입 (예를 들어 센다이(Sendai) 바이러스 시스템 사용)을 사용하여 또는 합성 mRNA 접근을 사용하여 유도될 수 있다. 다분화능 줄기 세포의 집단은 유도된 다분화능 줄기 세포 (iPSC)의 하나 이상의 콜로니로부터 얻을 수 있다. 간 오르가노이드가 다분화능 줄기 세포의 동일한 집단으로부터 제조되는 구현예에서, iPSC의 집단은 적어도 2개 (또한 일부 구현예에서는 적어도 3개)의 하위집단으로 분할되고, 이들 각각은 간 및 간엽 (또한, 일부 구현예에서, 내피 세포)을 생성하도록 상이한 배양 조건에 전달된다.
상이한 세포 각각이 얻어지면, 이들을 조합하고, 현탁액 중에서 배양하여 간 오르가노이드를 생성한다. 간 오르가노이드의 크기 조절을 위해, 세포를 100 내지 1 000 ㎛의 직경을 갖는 마이크로-캐비티를 사용하여 초저-부착 조건에서 (예를 들어, 현탁액 중에서) 배양할 수 있다. 일부 구현예에서, 마이크로-캐비티는 1 cm2 당 약 500㎛의 깊이 및 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, 원래의 간 오르가노이드가 형성되면, 이들을 생물반응기 내에서 현탁액 중에서 배양 (확장을 위해)할 수 있다. 내배엽-유래된 세포의 간세포 및/또는 담즙 상피 세포로의 분화를 촉진시키기 위해, 간 오르가노이드를 녹-아웃 혈청 대체물, 및/또는 인슐린, EGF, HGF, VEGF, bFGF, 온코스타틴 M 및/또는 덱사메타손의 존재 하에 배양할 수 있다. 하나의 구현예에서, 간 및 간엽은, 배양 전에, 1개의 완전 내배엽 대 0.1-0.7개의 간엽 세포의 비율로 조합된다. 또 다른 구현예에서, 내피 세포가 존재하는 경우, 이들은, 배양 전에, 1개의 완전 내배엽 대 0.2-1개의 내피 세포의 비율로 완전 내배엽와 조합된다. 또 다른 구현예에서, 간, 간엽 및 내피 세포 사이의 비율은, 배양 전에, 1: 0.2:0.7이다. 배양 동안, 상이한 세포 사이의 비율은, 일부가 우선적으로 증식하면서 다른 것은 우선적으로 분화될 것이기 때문에, 달라질 수 있음을 이해한다. 또한, 본원에 기재된 바와 같은 간 오르가노이드를 얻기 위해 다른 비율이 사용될 수 있음을 이해한다. 간 오르가노이드의 제조 방법 동안, 물리적 스캐폴드(scaffold) 또는 외생 매트릭스 물질 (조직 배양 용기 이외)은 요구되지 않는다.
캡슐화된 간 조직의 제조에 간 오르가노이드를 직접 사용할 수 있다. 하나의 구현예에서, 간 오르가노이드는 캡슐화된 간 조직 내의 이들의 도입 전에 동결보존될 수 있다.
캡슐화된 간 조직에서 사용될 수 있는 중합체는, 간 오르가노이드(들) 주위에 히드로겔을 형성한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 히드로겔은 물이 분산 매질인 친수성인 중합체 사슬을 지칭한다. 히드로겔은 천연 또는 합성 중합체 네트워크로부터 얻을 수 있다. 본 개시내용과 관련하여, 히드로겔 내의 캡슐화는 매립된 간 오르가노이드가 중합체로부터 누출되는 것을 막고, 따라서 간 오르가노이드의 세포가 이식시 수용자의 체내에서 면역 반응 또는 종양을 일으킬 수 있는 위험을 제거하거나 감소시킨다.
본 개시내용과 관련하여, 중합체는, 이것이 대상체 (예를 들어, 예: 인간) 내로 도입될 때 또는 간 오르가노이드의 세포에 대해 독성을 나타내지 않는 경우에 "생체적합성"으로 고려된다. 본 개시내용과 관련하여, 생체적합성 중합체는 대상체 (예를 들어, 예: 인간)에서 생체내 배치시 또는 간 오르가노이드의 세포를 향하여 독성을 나타내지 않는 것이 바람직하다. 간독성은, 예를 들어, 간세포 아팝토시스 사망률 (예를 들어, 여기서 아팝토시스의 증가는 간독성의 지표임), 트랜스아미나제 수준 (예를 들어, 여기서 트랜스아미나제 수준의 증가는 간독성의 지표임), 간세포의 벌루닝(ballooning) (예를 들어, 여기서 벌루닝은 간독성의 지표임), 간세포에서의 미세소포형 지방증 (예를 들어, 지방증의 증가는 간독성의 지표임), 담즙 세포 사망률 (예를 들어, 담즙 세포 사망률의 증가는 간독성의 지표임), γ-글루타밀 트랜스펩티다제 (GGT) 수준 (예를 들어, 여기서 GGT 수준의 증가는 간독성의 지표임)을 결정함으로써 측정할 수 있다. 생체적합성 중합체는, 탄수화물 (글리코사미노글리칸, 예컨대 히알루론산 (HA), 콘드로이틴 술페이트, 데르마탄 술페이트, 케라탄 술페이트, 헤파란 술페이트, 알기네이트, 키토산, 헤파린, 아가로스, 덱스트란, 셀룰로스, 및/또는 그의 유도체), 단백질 (콜라겐, 엘라스틴, 피브린, 알부민, 폴리 (아미노산), 당단백, 항체 및/또는 그의 유도체) 및/또는 합성 중합체 (예를 들어, 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG), 폴리(히드록시에틸 메타크릴레이트) (PHEMA) 및/또는 폴리(비닐 알콜) (PVA) 기재)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 생체적합성 중합체는 단일 중합체 또는 상이한 중합체의 혼합물 (예를 들어 US2012/01420069에 기재된 것들)일 수 있다. 예시적 생체적합성 중합체는, 폴리(에틸렌) 글리콜, 폴리락트산 (PLA), 폴리글리콜산 (PGA), 폴리카프로락톤 (PCL), 피브린, 폴리사카라이드 물질 (예컨대, 키토산, 프로테오글리칸 또는 글리코사미노글리칸 (GAG)), 알기네이트, 콜라겐, 티올화된 헤파린 및 이들의 혼합물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 생체적합성 중합체는 선형, 분지형 및 선택적으로 펩티드 (예를 들어, RGD), 성장 인자, 인테그린 또는 약물로 그래프트될 수 있다.
일부 구현예에서, 중합체는 "저-면역원성 중합체"이고, 수용자에서 단지 최소 면역 반응만을 유도하거나 이를 유도하지 않는다. 이러한 저-면역원성 중합체는 또한, 이러한 항원 결정인자가 동종이계 대상체 내로 도입될 때, 세포의 하나 이상의 항원 결정인자를 마스킹하고 항원 결정인자에 대한 면역 반응을 감소시키거나 심지어 막을 수 있다.
본 개시내용의 캡슐화된 간 조직 중에 존재하는 중합체는, 바람직하게는 가교가능하고, 예를 들어, 가교될 수 있다. 중합체는, 열적으로, 화학적으로 (예를 들어, 하나 이상의 펩티드, 예컨대 VPMS, RGD 등의 사용에 의해) 또는 pH 또는 빛의 사용에 의해 (예를 들어, 예컨대 UV 광을 사용한 광중합) 가교될 수 있다.
본 개시내용의 중합체는 생분해성 (예를 들어, 살아있는 유기체의 대사에 의해 가수분해될 수 있음) 또는 전적으로 또는 부분적으로 생분해에 대해 저항성 (예를 들어, 살아있는 유기체의 대사에 적용시 가수분해에 대해 저항성임)일 수 있다. 예시적 생체적합성 및 생분해성 중합체는, 폴리(에틸렌-글리콜)-말레이미드 (PEG-Mal) 8-아암을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예시적 생체적합성 및 생분해-저항성 중합체는, 폴리(에틸렌-글리콜)-비닐 술폰 (PEG-VS)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
간 오르가노이드가 얻어지면, 이들을 제1 생체적합성 및 가교가능 중합체와 접촉시켜 적어도 부분적으로 (또한 일부 구현예에서는 실질적으로) 간 오르가노이드를 커버링한다. 중합체는 상이한 농도로 사용될 수 있다. 하나의 구현예에서, 간 오르가노이드와 접촉시, 중합체의 농도는, 약 1% 내지 15% (중량/부피)이다. 하나의 구현예에서, 간 오르가노이드와 접촉시, 중합체의 농도는, 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13% 또는 14 %이다. 또 다른 구현예에서, 간 오르가노이드와 접촉시, 중합체의 농도는, 약 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3% 또는 2% 이하이다. 간 오르가노이드가 제1 중합체와 접촉되면, (열적으로, 화학적으로 또는 pH 또는 빛의 사용에 의해) 제1 중합체를 가교시킨다. 제1 생체적합성 중합체의 가교는, 중합체의 상이한 분자 사이에 및/또는 중합체의 동일한 분자 내에 추가의 결합 (또한 일부 구현예에서는 추가의 공유 결합)을 생성함으로써 달성된다. 일부 구현예에서, 제1 생체적합성 중합체의 가교는 중합체 분자와 간 오르가노이드의 표면 사이에 추가의 결합 (또한 일부 구현예에서는 추가의 공유 결합)을 생성할 것이다. 일부 구현예에서, 제1 중합체는 적어도 부분적으로 생분해성이다.
일부 구현예에서는, 제1 생체적합성 가교 중합체로 (적어도 부분적으로) 커버링되거나 캡슐화된 간 오르가노이드를 제2 생체적합성 가교가능 중합체와 접촉시켜 캡슐화된 간 조직을 적어도 부분적으로 (또한 일부 구현예에서는 실질적으로) 커버링할 수 있다. 캡슐화된 간 오르가노이드가 제2 중합체와 접촉되면, (열적으로, 화학적으로 또는 pH 또는 빛의 사용에 의해) 제2 중합체를 가교시킨다. 제2 생체적합성 중합체의 가교는, 중합체의 상이한 분자 사이에 및/또는 중합체의 동일한 분자 내에 추가의 결합 (또한 일부 구현예에서는 추가의 공유 결합)을 생성함으로써 달성된다. 일부 구현예에서, 제2 생체적합성 중합체의 가교는 중합체 분자와 제1 생체적합성 및 가교 중합체 사이에, 그리고 일부 구현예에서는 간 오르가노이드의 표면 사이에 추가의 결합 (또한 일부 구현예에서는 추가의 공유 결합)을 생성할 것이다. 일부 구현예에서, 제2 중합체는, 적어도 부분적으로, 생분해에 대해 저항성이다.
일부 구현예에서, 방법은 또한, 캡슐화된 간 오르가노이드 (제1/제2 생체적합성 가교 중합체에 의해 적어도 부분적으로 커버링됨)를 추가의 생체적합성 및 가교가능 중합체와 접촉시켜 캡슐화된 간 오르가노이드를 커버링하는 단계를 포함한다. 간 오르가노이드가 추가의 중합체와 접촉되면, 추가의 중합체를 가교시킨다 (열적으로, 화학적으로 또는 pH 또는 빛의 사용에 의해). 추가의 생체적합성 중합체의 가교는, 중합체의 상이한 분자 사이에 및/또는 중합체의 동일한 분자 내에 추가의 결합 (또한 일부 구현예에서는 추가의 공유 결합)을 생성함으로써 달성된다. 일부 구현예에서, 추가의 생체적합성 중합체의 가교는 중합체 분자와 제2 생체적합성 및 가교 중합체 및, 일부 구현예에서, 제1 생체적합성 및 가교 중합체 및/또는 간 오르가노이드의 표면 사이에 추가의 결합 (또한 일부 구현예에서는 추가의 공유 결합)을 생성할 것이다.
방법은 도 4a에 나타낸 바와 같이 제1 생체적합성 및 가교 중합체 내에 복수의 단분산된 간 오르가노이드를 제공하도록 디자인될 수 있다. 도 4A에 나타낸 구현예에서, 간모세포, 내피 전구체 세포 및 간엽 전구체 세포는 간 오르가노이드의 간 세포 iPSC의 분화로부터 얻어진다. 세포를 혼합하고, 현탁액 중에서 공동-배양하여 간 오르가노이드를 형성한다. 도 4a에 나타낸 간 오르가노이드의 구현예에서, 간모세포는 (캡슐화된 간 조직 내의 간 오르가노이드의 도입 전에) 간엽 및 내피 전구체 세포에 의해 형성된 세포 코어를 실질적으로 덮는 간세포로 분화되었다. 도 4A 상에 나타낸 간 오르가노이드의 구현예는 형상이 실질적으로 구형이고 약 150 ㎛의 상대적 직경을 갖는다. 이어서, 간 오르가노이드는, 가교제 (도 4A에 나타낸 UV 광)를 사용하여 제1 적합성 및 가교가능 매트릭스 내에 캡슐화된다. 캡슐화된 간 조직은 재생 의약에서 이식가능한 간 조직 (예를 들어, 5 mm 내지 10 cm의 크기를 가짐)으로서 사용될 수 있다. 대안적으로, 간 오르가노이드는 다중웰 플레이트로 디자인되어 스크리닝 화합물의 대사 또는 간독성을 결정하기 위한 약물 개발에 사용될 수 있다.
방법은, 개별적으로 제1 생체적합성 및 가교 중합체로 (적어도 부분적으로) 커버링되고, 이어서 제2 생체적합성 및 가교 중합체로 제조된 매트릭스 내에 혼입되는 복수의 간 오르가노이드를 제공하도록 디자인될 수 있다. 이러한 구현예에서는, 개별적으로 제1 생체적합성 및 가교 중합체로 (적어도 부분적으로) 커버링된 복수의 간 오르가노이드가 먼저 형성되고, 이어서 이것이 제2 생체적합성 및 가교가능 중합체와 접촉되어 가교된다.
방법은 또한, 제1 및, 선택적으로 제2 적합성 및 가교 중합체에 의해 커버링된 복수의 개개의 (예를 들어, 단분산된) 간 오르가노이드를 제공하도록 디자인될 수 있다. 이러한 구현예에서, 캡슐화된 간 조직은 1 cm2 당 적어도 약 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450 또는 500개의 간 오르가노이드를 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 캡슐화된 간 조직은 1 cm2 당 약 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 175, 150, 125, 100, 90, 80, 70, 60 또는 50개 이하의 간 오르가노이드를 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 캡슐화된 간 조직은 1 cm2 당 약 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400 또는 450 내지 약 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 175, 150, 125, 100, 90, 80, 70 또는 60개의 간 오르가노이드를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 캡슐화된 간 조직은 1 cm2 당 약 50 내지 500개의 간 오르가노이드를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 캡슐화된 간 조직은 1 cm3 당 적어도 약 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400 또는 2500개의 간 오르가노이드를 포함한다. 또한 추가의 구현예에서, 캡슐화된 간 조직은 1 cm3 당 약 2500, 2400, 2300, 2200, 2100, 2000, 1900, 1800, 1700, 1600, 1500, 1400, 1300, 1200, 1100, 1000, 950, 900, 850, 800, 750, 700, 650, 600, 550, 500, 450, 400, 350, 300 또는 250개 이하의 간 오르가노이드를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 캡슐화된 간 조직은 1 cm3 당 약 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300 또는 2400 내지 약 2500, 2400, 2300, 2200, 2100, 2000, 1900, 1800, 1700, 1600, 1500, 1400, 1300, 1200, 1100, 1000, 950, 900, 850, 800, 750, 700, 650, 600, 550, 500, 450, 400, 350 또는 300개의 간 오르가노이드를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 캡슐화된 간 조직은 1 cm3 당 약 250 내지 2500개의 간 오르가노이드를 포함한다.
하나의 구현예에서, 캡슐화된 간 조직은 치료 및 진단 방법에 직접 사용될 수 있거나, 또는 그의 저장 시간을 증가시키기 위해 동결보존될 수 있다.
캡슐화된 간 조직의 치료 용도
본원에 기재된 캡슐화된 간 조직은 의약으로서 사용될 수 있다. 이는 간의 생물학적 기능의 일부를 나타내고, 따라서 간 기능의 회복 또는 개선을 필요로 하는 대상체에서 간 기능의 회복 또는 개선을 위해 생체내에서 or 생체외에서 사용될 수 있다. 간 기능은, 예를 들어, 알부민 및 응고 인자 (예를 들어, 피브리노겐, 프로트롬빈, 인자 V, VII, VIII, IX, X, XI, XIII, 뿐만 아니라 단백질 C, 단백질 S 및 항트롬빈)의 합성을 결정함으로써 평가될 수 있으며, 알부민 및/또는 응고 인자의 합성 증가는 회복된 또는 개선된 간 기능의 지표이다. 간 기능은 또한 국제 표준화 비율(International Normalized Ratio) 또는 INR을 측정함으로써 평가될 수 있다 (예를 들어, INR의 감소는 회복된 또는 개선된 간 기능의 지표임). 간 기능은 또한, 암모니아의 우레아로의 해독을 측정함으로써 평가될 수 있다 (예를 들어, 암모니아의 수준 감소 및/또는 우레아의 수준 증가는 회복된 또는 개선된 간 기능의 지표임).
캡슐화된 간 조직은 치료하고자 하는 생물학적 유체와 접촉되어야 한다. 이러한 구현예에서, 캡슐화된 간은 대상체가 필요한 합성된 단백질 및 대사물질 (알부민, 응고 인자 및/또는 우레아)을 생물학적 유체 내로 방출하고, 심지어 생물학적 유체로부터 대사되는 독성 물질 (암모니아, 비결합 빌리루빈, 콜레스테롤, 티로신 등)을 흡수할 수 있다. 캡슐화된 간 조직은 간 대사의 선천적 이상에서 결핍/감소된 효소 기능을 회복시키는 데 사용될 수 있다.
간 기능을 회복 또는 개선시키기 위해, 캡슐화된 간 조직을 간 기능이 감소된, 거의 없는 내지 없는 대상체에서 생체내에서 그래프팅할 수 있다. 이와 같이, 캡슐화된 간 조직을, 예를 들어, 복막액과 함께 복강 내에 이식할 수 있다. 대안적으로, 캡슐화된 간 조직을 간 유체와 함께 수용자의 간 상에 그래프팅할 수 있다. 또한 또 다른 예에서, 캡슐화된 간 조직을 림프액 또는 혈액과 함께 피하 또는 근육내 그래프팅할 수 있다.
대안적으로, 간 기능을 회복 또는 개선시키기 위해, 캡슐화된 간 조직을 생체외에서 해독 장치 (예를 들어, 체외 장치)의 세포 성분으로서 사용할 수 있다. 이러한 구현예에서는, 치료 대상체의 혈액 및/또는 복막액을 생체외에서 캡슐화된 간 조직과 접촉시켜 단백질 및 대사물질 (알부민, 응고 인자 및/또는 우레아)을 제공하고 잠재적으로 독성인 물질 (암모니아, 비결합 빌리루빈, 콜레스테롤, 티로신 등)을 흡수하고 대사시킨다.
캡슐화된 간 조직은, 간 기능의 회복 또는 개선으로부터 이득을 얻는 포유류 및 특히 인간을 포함한 다양한 대상체에 사용될 수 있다. 캡슐화된 간 조직의 세포는 치료하고자 하는 대상체에 대해 자기유래, 동종이계 또는 이종일 수 있다. 그러나, 캡슐화된 간 조직은 의도된 수용자의 세포 (특히 면역 세포)와의 물리적 접촉을 막기 위해 디자인될 수 있기 때문에, 의도된 수용자에 의한 면역학적 인식 및 반응을 막기 위해 자기유래 세포 또는 면역억제 약물을 사용할 필요가 없다. 이는, 예를 들어, 단지 하나의 생체적합성 및 가교 중합체 또는 제1 및 제2 생체적합성 및 가교 중합체 둘 다를 포함하는 캡슐화된 간 조직을 사용함으로써, 및/또는 저-면역원성 중합체를 사용함으로써 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 캡슐화된 간 조직은, 예를 들어 복강경수술 절차를 사용하여, 수술에 의해 대상체 내로 조작 및 도입되도록 디자인될 수 있다. 추가로, 간 조직은 생체적합성 (또한 일부 구현예에서, 저-면역원성) 중합체 내에 캡슐화되기 때문에, 간 기능이 회복되면 또는 캡슐화된 간 조직이 간 기능을 더 이상 개선시킬 수 없으면 대상체로부터 캡슐화된 간 조직을 제거할 수 있다.
캡슐화된 간 조직은 간 부전 치료에 사용될 수 있다. 간 부전은, 간의 대부분이 회복될 수 없을 정도로 손상되고 간이 더 이상 기능할 수 없는 경우에 발생한다. 간 부전의 조기 증상은 메스꺼움, 식욕 상실, 피로감 및 설사를 포함한다. 병태가 진행됨에 따라, 하기 증상이 또한 나타날 수 있다: 황달, 출혈, 복부 팽윤, 정신 혼미 또는 착란 (간 뇌병증으로서 공지됨), 졸음 뿐만 아니라 혼수상태. 간 부전은 급성, 만성 또는 급만성일 수 있다. 만성 간 부전의 가장 통상적인 원인은 비-알콜성 지방간염, B형 간염, C형 간염, 장기간 알콜 소비, 간경변, 혈색소침착증 및 영양실조이다. 만성 간 부전에서, 간 세포 이식은 문맥 순환을 통해 가장 흔하게 실행된다. 그러나, 간경변에 뒤따르는 만성 간 부전의 경우, 간 시누소이드 천공 (모세관화)의 소실은 문맥 순환을 통해 주입된 주입 세포가 간 실질(liver parenchyma)에 도달하고 간 소엽(liver lobule) 내에 이식되는 것을 막을 수 있다. 이는 이식된 세포의 성숙 및 기능을 방해하고, 시누소이드 및 문맥 혈전증과 같은 합병증을 수반할 수 있다. 이는 문맥내 주사 또는 면역억제를 필요로 하지 않기 때문에, 본원에 기재된 캡슐화된 간 조직은 간경변 및 만성 (또는 급만성) 간 부전을 갖는 수백 또는 수천명의 환자, 심지어 이식에 적격이 아닌 환자의 치료, 중증 합병증 (간 뇌병증, 응고장애 등)의 방지 또는 감소 및 생존율 향상을 가능하게 한다.
본원에 기재된 캡슐화된 간 조직은, 또한 급성 간 부전의 치료에 사용될 수 있다. 급성 간 부전의 가장 통상적인 원인은 처방의 과다투여 또는 그에 대한 반응 및 약초 의약, 바이러스 감염 (A, B, 및 C형 간염), 뿐만 아니라 독성 야생 버섯의 섭취, 자가면역 간염 또는 윌슨(Wilson)병이다. 급성 간 부전은 급속히, 때로는 48시간 미만 내에 발생할 수 있으므로, 예방이 어렵다. 또한 급성 간 부전에서는, 간 기능이 매우 손상되어, 대상체가 완전히 성숙된 기능성 간 세포로 이식되어야 한다. 일부 구현예에서, 캡슐화된 간 조직은 급성 간 부전의 증상을 치료하거나 완화시키기 위해 사용될 수 있다. 캡슐화된 간 조직은 이를 필요로 하는 대상체에서 그래프팅되거나 외부 (생체외) 해독 장치로서 사용되어 이를 필요로 하는 대상체의 혈액을 치료한다 (체외 간 지지체, 생체인공 간 장치 또는 간 투석). 캡슐화된 간 조직 내의 간 오르가노이드의 수 및 병태의 중증도에 따라, 하나 또는 하나 초과의 캡슐화된 간 조직을 사용하여 대상체를 치료할 수 있다. 캡슐화된 간 조직(들)은 동시에 또는 차례로 사용될 수 있다. 캡슐화된 간 조직이 간 부전의 증상을 치료하거나 완화시키는 데 사용되는 경우, 치료되는 대상체에 대한 동종이계의 세포가 사용될 수 있다.
캡슐화된 간 조직은 또한, 간 대사의 단일유전자 선천적 이상 (예를 들어, 크리글러-나자르 증후군, 가족성 고콜레스테롤혈증, 우레아 사이클 이상, 예컨대 N-아세틸글루타메이트 신타제 결핍, 카르바모일 포스페이트 신타제 결핍, 오르니틴 트랜스카르바밀라제 결핍, 시트룰린혈증, 아르기니노숙시네이트 리아제 결핍, 아르기나제 결핍, 유전적 티로신혈증 유형 I 등)의 증상을 치료하거나 완화시키는 데 사용될 수 있다. 이 구현예에서, 캡슐화된 간 조직은 결핍 대사 기능을 제공하여, 증상을 감소시키고/거나, 합병증을 방지 또는 감소시키고/거나, 평생 치료 또는 식이요법에 대한 필요성을 감소시키거나 제거한다.
캡슐화된 간 조직은, 면역억제에 대한 필요성 없이 급성 및 만성 간 부전을 치료하기 위한 이식가능 생성물 (예를 들어 캡슐화된 간 조직 시트)로서 디자인될 수 있다. 이러한 구현예에서, 이식가능 조직 시트는 1 cm2 당 약 수천개의 간 오르가노이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 캡슐화된 간 조직 시트는, 용이한 조작 및 요망되는 이식 부위로의 고정을 위해 컨테이너 (예를 들어 주문 제작된, 침투가능 백 등) 내에 배치될 수 있다. 추가의 구현예에서는, 용이하게 조작하기 위해, 이식가능 조직 시트는 적어도 1 mm-두께일 수 있고, 일부 추가의 구현예에서는, 적어도 5 mm 내지 10 cm-폭일 수 있다. 캡슐화된 간 조직은 필요한 임의의 형상 또는 크기로 제조될 수 있고, 시행 동안 트리밍 또는 절단될 수 있다.
간 대사 및 간독성 스크리닝 방법 및 키트
본원에 기재된 캡슐화된 간 조직은 적어도 일부 간 기능을 유지하기 때문에, 이는 약물 발견 및 개발을 합리화하기 위해 작용제 (예컨대 잠재적 약물)가 간에 의해 대사되는 방식을 결정하는 시험관내 모델로서 사용될 수 있다. 이는 또한, 작용제가 간독성을 나타내는지를 결정하는 데 사용될 수 있다. 일반적 순환에 투여시, 대다수의 (의심되는) 치료제 (승인된 또는 개발 중인)는 일부 방식으로 또는 또 다르게는 간의 세포에 의해 대사된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 캡슐화된 간 조직은, 작용제 (예컨대 추정 치료제)의, 존재하는 경우, 간독성 (예를 들어, 약물-유도된 간 독성)을 결정하는 데 사용될 수 있다. 약물 (승인된 및 시험용)은 간 손상의 중요한 원인이다. 900종 초과의 약물, 독소, 및 약초가 간 손상을 일으킨다고 보고되었고, 약물은 전격성 간 부전의 모든 경우의 20-40%에 달한다. 특이체질성 약물 반응의 대략 75%가 간 이식 또는 사망을 초래한다. 약물-유도된 간 손상은 승인된 약물의 회수에 있어 언급되는 가장 통상적 이유이다. 작용제 (예컨대 약물)의 조기 간독성 프로파일의 결정은 약물 발견 및 개발을 합리화하기 위해 유용할 수 있다.
본원에 기재된 캡슐화된 간 조직은 적어도 일부 간 기능을 나타내고, 따라서 작용제 (예컨대 화학적 작용제, 생물학적 작용제, 천연 약물 생성물 또는 혼합물)의 간 대사 및/또는 간독성을 결정하기 위해 시험관내에서 사용될 수 있다. 방법은 단일 작용제 또는 작용제들의 조합의 간 대사를 결정하기 위해 사용될 수 있다.
이를 수행하기 위해, 시험하려는 작용제 또는 작용제들의 조합을 캡슐화된 간 조직과 접촉시켜 배치하여, 캡슐화된 간 조직의 적어도 하나의 간 오르가노이드의 적어도 하나의 (또한 일부 구현예에서, 2 또는 3종의) 세포 유형에 대한 작용제의 영향을 허용하기에 충분한 조건 하에 시험 혼합물을 제공한다. 시험 혼합물은 작용제 및 캡슐화된 간 조직을 포함한다. 이어서, 작용제의 적어도 하나의 작용제-관련 간 대사물질이, 캡슐화된 간 조직의 적어도 하나의 간 오르가노이드의 적어도 하나의 (또한 일부 구현예에서, 2 또는 3종의) 세포 유형에서 또는 시험 혼합물에서 결정된다. 본 개시내용과 관련하여 사용되는 바와 같이, "작용제-관련 대사물질"이라는 표현은, 시험되는 작용제를 가수분해시킴으로써 형성될 수 있는 대사물질을 지칭한다.
대안적으로 또는 조합하여, 적어도 하나의 간 파라미터가, 캡슐화된 간 조직의 적어도 하나의 간 오르가노이드의 적어도 하나의 (또한 일부 구현예에서, 2 또는 3종의) 세포 유형에서 또는 시험 혼합물에서 결정된다. 결정될 수 있는 간 파라미터는, 알부민 생산, 우레아 생산, ATP 생산, 글루타티온 생산, 시토크롬 P450 (CYP) 대사 활성, 간-특이적 유전자 또는 단백질 (예를 들어, CYP 효소 (CyP2C9, CyP3A4, CyP1A1, CyP1A2, CyP2B6 및/또는 CyP2D6)의 발현, 간독소에 대한 반응, 세포 사망 (예를 들어 시험 혼합물 중의 락테이트 데히드로게나제 또는 트랜스아미나제 측정에 의함), 세포 아팝토시스, 세포 괴사, 세포 대사 활성 (예를 들어 생존/사망 검정, 캐스파제 3/7 검정, MTT 검정 또는 WST-1 기반 시험), 미토콘드리아 기능, 및/또는 담즙산 생산을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 적어도 하나의 (또는 복수의) 간 파라미터가 얻어지면, 이를 상응하는 대조군 간 파라미터와 비교한다. 하나의 구현예에서, 대조군 간 파라미터는 스크리닝제 (또는 스크리닝제들의 조합)의 부재 하에 또는 스크리닝제 (또는 스크리닝제들의 조합)의 용해를 위한 비히클의 존재 하에 얻어질 수 있다. 결정 단계는 캡슐화된 간 조직의 세포의 전부 또는 일부에 대해 수행될 수 있다. 하나의 구현예에서, 결정 단계는 캡슐화된 간 조직의 간세포 및/또는 담즙 상피 세포 상에서 수행된다.
방법은 또한, 작용제가 캡슐화된 간 조직의 간 오르가노이드에 의해 대사되는지 및/또는 작용제가 캡슐화된 간 조직의 간 오르가노이드 세포를 향해 간독성을 나타내는지의 결정을 비교하는 것을 포함한다. 이를 수행하기 위해, 측정 작용제-관련 간 대사물질과 대조군 작용제-관련 간 대사물질을 비교한다. 예를 들어, 대조군 작용제-관련 대사물질은 그 자체가 무손상(intact) (예를 들어, 비가수분해된) 형태의 작용제일 수 있다. 대조군 작용제-관련 대사물질과 상이한 작용제-관련 대사물질이 존재한다고 결정되면, 작용제가 간 세포에 의해 대사되는 방식을 결정한다. 또한, 측정 간 파라미터와 대조군 간 파라미터를 비교할 수 있다. 예를 들어, 대조군 간 파라미터는 작용제의 부재 하에 얻어질 수 있다. 간 파라미터가 대조군 간 파라미터와 상이하다고 결정되면, 작용제가 간독성을 나타내는지를 결정한다.
하나의 구현예에서, 방법은, 스크리닝제 (또는 스크리닝제들의 조합)이 간독성으르 나타내는지를 결정하기 위해 사용된다. 이러한 구현예에서는, 접촉 스크리닝제 (또는 스크리닝제들의 조합)가 캡슐화된 간 조직의 간 오르가노이드의 적어도 하나의 세포 (예를 들어 간세포 또는 담즙 상피 세포)에서 독성을 유도하는지가 결정된다. 독성은, 예를 들어 세포 사망 (예를 들어 시험 혼합물 중의 락테이트 데히드로게나제 또는 트랜스아미나제 측정에 의함), 세포 대사 생존능 (예를 들어 생존/사망 검정, 캐스파제 3/7 검정, MTT 검정 또는 WST-1 기반 시험), 미토콘드리아 기능 (예를 들어, 미토콘드리아 기능의 감소는 간독성의 지표임), 시토크롬 P450 시스템에서 하나 이상의 효소 (예를 들어, CYP2E1 등)의 활성 조절 (예를 들어, 시토크롬 P450 시스템의 효소(들)의 활성 증가는 간독성의 지표임) 및/또는 담즙산의 생산 조절 (예를 들어, 담즙산 생산의 증가는 간독성의 지표임)을 결정함으로써 측정될 수 있다. 방법은 대조군 작용제 (간독성을 유도하지 않는다고 공지되거나 간독성을 유도한다고 공지됨)와 스크리닝제의 독성 결과를 비교하는 것을 포함할 수 있다.
방법은 또한, 상이한 대사 활성을 갖는 간 오르가노이드로 얻어진 캡슐화된 간 조직에 대하여 스크리닝제 (또는 복수의 스크리닝제)를 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 간 오르가노이드는, 상이한 수준으로 특이적 대사 기능을 수행 (따라서, 일반적 집단에서 개체들 사이에서 나타나는 변동을 나타냄)하기 위해 상이한 기원 및 공급원으로부터의 세포를 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 상이한 대사 활성을 갖는 얻어진 캡슐화된 간 조직을 상이한 플레이트의 상이한 웰에서 생성하여 이들 각각 및 모두에 대하여 비교하여 스크리닝제를 시험하는 것이 가능할 수 있다. 하나의 구현예에서, 간 오르가노이드는 상이한 성별, 인종 및/또는 유전자형으로부터 유래될 수 있다. 스크리닝제를 이들 상이한 성별, 인종 및/또는 유전자형에 대하여 시험하여 대사의 차이 및 모든 또는 단지 일부의 성별, 인종 및/또는 유전자형에서 간독성이 존재하는지를 결정할 수 있다. 하나의 구현예에서, 간 오르가노이드의 간엽 및/또는 내피 화합물은 복수의 간 오르가노이드 사이에서 유사할 수 있지만, 간세포 및 담즙 상피 세포는 상이한 성별, 인종 및/또는 유전자형으로부터의 것이다. 하나의 예로, 각각의 상이한 캡슐화된 간 조직이 상이한 웰에 (필요한 경우 다중 반복으로) 위치할 수 있고, 동일한 스크리닝제가 각각 상이한 캡슐화된 간 조직과 접촉될 수 있다.
일부 구현예에서, 스크리닝 방법에 사용되는 캡슐화된 간 조직은 제2 또는 추가의 생체적합성 가교 중합체를 포함하지 않고, 대신에 본질적으로 본원에 기재된 바와 같은 간 오르가노이드 및 제1 생체적합성 가교 중합체로 이루어진다.
스크리닝 방법은 개별적으로 캡슐화된 간 오르가노이드 또는 하나 초과의 간 오르가노이드를 함유하는 매트릭스 내에서 캡슐화된 간 오르가노이드를 사용할 수 있다. 후자에서, 캡슐화된 간 조직은 웰의 저부에 위치할 수 있고, 이는 스크리닝제를 첨가하는 것을 매우 편리하게 하고, 결정 단계 전에 캡슐화된 간 조직을 세척한다.
본 개시내용은 또한 간 대사 또는 간독성의 결정을 위한 키트를 제공한다. 키트는 본원에 기재된 캡슐화된 간 조직 및 기재된 방법을 수행하기 위한 지침서를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는, 선택적으로 적어도 하나의 웰을 포함할 수 있는 조직 배양 지지체를 추가로 포함한다. 추가의 구현예에서, 캡슐화된 간 조직은 적어도 하나의 웰의 저부에 위치할 수 있고, 필요한 경우, 웰의 표면에 부착 (공유적으로 또는 비공유적으로)될 수 있다. 키트는 또한 간 대사 또는 간독성 측정 (예를 들어, 생존/사망 검정, 캐스파제 3/7 검정, MTT 검정, WST-1 검정, 및/또는 LDH 측정)을 수행하기 위한 시약을 포함할 수 있다.
본 발명은 하기 실시예를 참조함으로써 보다 쉽게 이해될 것이며, 이들 실시예는 본 발명의 범위를 제한하기보다는 이를 예시하기 위해 주어진 것이다.
실시예 1 -간 오르가노이드의 제조
말초 혈액 단핵 세포 ( PBMC ) 단리. 혈액을 나트륨 헤파린 8㎖을 갖는 BD 바커테이너(Vacutainer)® CPT™ 튜브 내로 직접 수집하였다. BD 바커테이너® CPT™ 튜브를 실온에서, 그러나 4시간(h) 이하로 저장하였다 (이들을 즉시 처리하지 않는 경우). BD 바커테이너® CPT™ 튜브를 실온에서 20분(min) 동안 1 800g (2,800 rpm)로 원심분리하였다. 원심분리 후, 5㎖ 피펫을 사용하여, 혈장을 겔 플러그에 대하여 온화하게 상하로 피펫팅하여 겔의 상단에 부착되어 있을 수 있는 세포를 제거하였다. 세포 현탁액을 50㎖ 팔콘(Falcon)™ 튜브로 전달하여, 필요한 경우 각각의 튜브로부터 세포를 모았다. 무혈청 배지, 스템프로(StemPro)-34®를 40㎖의 총 부피로 첨가하였다. 카운팅 (혈구계 또는 자동화 세포 카운터) 및 세포 생존능 결정 (트리판 블루(Trypan Blue)™ 배제 방법 사용)을 위해 10㎕ 분취량의 현탁액을 얻었다. 세포 현탁액을 실온에서 7분 동안 250 g (1 200 rpm)로 원심분리하였다. 원심분리된 세포를 완전 스템프로(StemPro)-34™ 배지 중에 5×106 생존가능 세포/㎖로 현탁시키고, 선택적으로 동결보존하였다.
PBMC 재프로그래밍. 재프로그래밍 4일 전, 신선한 또는 해동된 PBMC를 시토카인 (SCF, FLT3, IL3, IL6) 보충된 완전 스템프로-34™ (c스템프로-34™) 배지 중에 5×105 세포/㎖로 재현탁시키고, 시딩 및 37℃/5% CO2에서 인큐베이션시켰다. PBMC를 재프로그래밍한 날, 세포를 카운팅하고, 센다이(Sendai) 바이러스 시토튠(CytoTune) 2.0™로 형질도입하였다 (제조업자의 지시에 따름). 보다 구체적으로, 세포를 카운팅하고, 정품 인증서 (CoA) 상의 역가 정보 및 표적 감염 다중도(MOI)에 도달하기 위해 필요한 각각의 바이러스의 부피를 하기와 같이 결정하였다:
Vol 바이러스 (㎕)= MOI (세포 감염 단위 또는 CIU/세포) × 세포의 no/바이러스의 역가 (CIU7mL)×10-3(㎕/㎖)
세포를 수확하고, 형질도입을 위해 2,5-5×105 세포/웰로 6-웰 플레이트에서 시딩하였다. 계산된 부피의 3개의 시토튠 2.0™ 센다이 튜브 각각을 37℃로 예열된 1㎖의 c스템프로-34™ 배지에 첨가하였다. 혼합물을 온화하게 상하로 피펫팅하였다. 플레이트의 연부를 파라필름(Parafilm)™으로 밀봉하고 실온에서 90분 동안 2 250 rpm으로 원심분리하였다. 추가의 1㎖의 c스템프로-34™ 배지를 각각의 웰에 첨가하고, 세포를 밤새 인큐베이션시켰다. 다음 날, 세포 및 배지를 배양 플레이트로부터 제거하고, 15㎖ 튜브로 전달하였다. 세포를 1㎖의 c스템프로®-34 배지로 온화하게 헹구어 대부분의 세포가 수확되도록 보장하였다. 세포 현탁액을 10분 동안 1,200 rpm으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하고, 세포를 6-웰 플레이트의 웰 당 0.5㎖의 c스템프로-34™ 배지 중에 재현탁시켰다. 세포를 37℃/5% CO2에서 2일 동안 배양하였다. 재프로그래밍 3일 후, 세포를 비트로넥틴 또는 라미닌-코팅 배양 디쉬 상에 배치하였다 (시토카인 없이 디쉬 스템프로®-34 배지 당 10,000 및 50,000개의 살아있는 세포). 재프로그래밍 7일 후, 세포를 iPSC 배지로 전이시켰다 (에센셜 8 플렉스 배지, 먼저 1:1 비율로 c스템프로®-34와 함께, 이어서 단지 에센셜 8 플렉스™ 배지 중에서). 콜로니 (예를 들어, 세포 클럼프)는 일반적으로 재프로그래밍 15-21일 후에 나타난다. 재프로그래밍된 콜로니를 확인하고, 세포 멤브레인 마커 TRA1-60에 대하여 라이브 염색 후 피킹을 위해 선택하였다. 상세히, 세포를 가온 PBS로 세척하고, 이어서 FITC 결합 항체 항인간 TRA1-60 (신선한 에센셜 8 플렉스 배지 중에 1:100 희석하고, 시린지 필터 SFCA 멤브레인, 0.2㎛를 사용하여 여과함)과 37℃에서 1h 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 세포를 신선한 에센셜 8 플렉스 배지로 세척하고, 이어서 형광 현미경 하에 검사하였다. 성공적으로 재프로그래밍된 콜로니를 마킹하고, 비트로넥틴 코팅 플레이트 상에서 확장을 위해 수동 피킹하였다. 피킹된 세포 콜로니를 비트로넥틴-코팅 배양 플레이트 상에서 완전 에센셜 8 플렉스™ 배지 중에서 37℃/4% O2/5% CO2에서 배양하였다. 세포 콜로니를 24 h 동안 부착시킨 후 매일 배지를 교환하였다. 이어서, iPSC를 에센셜 8 플렉스 배지 중에서, 또한 비트로넥틴-코팅 배양 용기 상에서 매일 배지를 교환하며 배양하였다.
피부 섬유모세포 재프로그래밍. 형질도입 2일 전, 섬유모세포 세포를 6-웰 플레이트 상에서 적절한 밀도로 플레이팅하여 섬유모세포 배지 (DMEM 고 글루코스) 내에 형질도입 당일에 웰 당 2×105-3×105 세포를 달성하였다. 당일에, 섬유모세포 세포를 재프로그래밍하고, 세포를 카운팅하고, 센다이 바이러스 시토튠 2.0™으로 형질도입하였다 (제조업자의 지시에 따름). 보다 구체적으로, 세포를 카운팅하고, CoA 상의 역가 정보 및 표적 감염 다중도(MOI)에 도달하기 위해 필요한 각각의 바이러스의 부피를 하기와 같이 결정하였다:
Vol 바이러스 (㎕)= MOI (CIU/세포)×세포의 no/바이러스의 역가 (CIU/㎖)×10-3(㎕/㎖)
세포를 수확하고, 형질도입을 위해 2,5-5×105 세포/웰로 6-웰 플레이트에서 시딩하였다. 계산된 부피의 3개의 시토튠 2.0™ 센다이 튜브 각각을 37℃로 예열된 1㎖의 섬유모세포 배지에 첨가하였다. 혼합물을 온화하게 상하로 피펫팅하였다. 추가의 1㎖의 섬유모세포 배지를 각각의 웰에 첨가하고, 세포를 밤새 인큐베이션시켰다. 다음 날, 바이러스와 배지를 제거하고, 신선한 배지를 첨가하였다. 재프로그래밍 7일 후, 섬유모세포 세포를 통과시키고, 5×105 세포를 비트로넥틴-코팅 배양 디쉬 (100mm 페트리(Petri) 디쉬) 상에 배치하였다. 재프로그래밍 8일 후, 세포를 에센셜 8 플렉스™ 배지 중에 배치하였다. 콜로니 (예를 들어, 세포 클럼프)는 일반적으로 재프로그래밍 15-20일 후에 나타난다. 라이브 염색 후 재프로그래밍된 콜로니를 선택하였다 (PBMC 재프로그래밍에 대하여 상기에 기재된 절차 참조). 세포 콜로니를 수동 피킹하고, 비트로넥틴- 또는 라미닌-코팅 플레이트 상에 전달하였다. 재프로그래밍시, 얻어진 임상 등급 iPSC는 다분화능 줄기 세포에 있어 전형적인 자기-재생 능력 및 발현 수준을 획득하였으며, 간 오르가노이드의 간 세포-세포 분석에서 집단간에 높은 수준의 균질성을 나타내었다.
내배엽으로의 iPSC 분화. 분화 3일 전, 아큐타제(Accutase)™를 사용한 단일-세포 패시징(passaging)을 수행하였고, 세포를 라미닌 (재조합 인간 라미닌 521)-코팅 플레이트 상에 플레이팅하였다. 세포를 플레이팅 후 최초 24시간 동안 레비타(Revita) 세포™ 보충된 에센셜 8 플렉스™ 배지 중에서 배양하였다. 세포를 37℃에서 주변 O2/5% CO2에서 밤새 배치하고, 분화를 개시하였다. 내배엽 사양을 촉진시키기 위해 (1일 및 2일차에), 세포를 DMEM/F-12 배지로 세척하고, 이어서 1% 녹아웃 혈청 대체물, 100 ng/㎖ 액티빈 A 및 3㎛ CHIR99021 보충된 RPMI/B27 (마이너스 인슐린) 배지 중에서 배양하였다. 세포를 37℃에서 주변 O2/5% CO2에서 2일 동안 배양하였다. 내배엽 투입 (완전 내배엽, 3일 내지 5일차에)을 촉진시키기 위해, 세포를 DMEM/F-12 배지로 세척하고, 이어서 100 ng/㎖ 액티빈 A 보충된 RPMI/B27 (8 플렉스 인슐린) 중에서 배양하였다. 세포를 3일 동안 37℃에서 주변 O2/5%CO2에서 배양하였다. 후부 전장에서의 분화를 촉진시키기 위해 (6일 내지 8일차에), 세포를 DMEM/F-12 배지로 세척하고, 이어서 3일 동안 2% 녹아웃 혈청 대체물, 20 ng/㎖ BMP4 및 10ng/㎖ bFGF 보충된 RPMI/B27 배지 (인슐린 함유) 중에서 배양하였다. iPSC로부터 분화된 완전 내배엽은 mRNA 및 단백질 수준 둘 다에서 유래된 *완전 내배엽 세포 및 후부 전장 세포에 있어 전형적인 마커를 발현하였다.
간세포-유사 세포 ( iHeps ) 로의 내배엽 분화. 간 사양 (간모세포 형성)을 촉진시키기 위해, 세포를 2% 녹아웃 혈청 대체물 20 ng/㎖ BMP4 및 10 ng/㎖ bFGF 보충된 RPMI/B27 배지 (인슐린 함유) 중에서 2일 동안 배양하였다. 간 성숙에서 제1 단계 (예를 들어, 미성숙 간세포 형성)를 촉진시키기 위해, 세포를 DMEM/F-12 배지로 세척하고, 2% 녹아웃 혈청 대체물 및 20 ng/㎖ HGF 보충된 RPMI/B27 (인슐린 함유) 배지 중에서 5일 동안 배양하였다. 간 성숙에서 제2 단계 (예를 들어, 성숙 간세포 형성)를 촉진시키기 위해, 세포를 DMEM/F-12 배지로 세척하고, 일차 간세포 유지 보충물, 20 ng/㎖ OSM 및 10㎛ 덱사메타손 보충된 윌리엄(William) E 배지 중에서 10일 동안 배양하였다. 2D 분화시,완전 내배엽은 미성숙 및 성숙 간세포-유사 세포 둘 다에 있어 전형적인 마커를 획득하고, 성숙 간세포 특유의 기능 (예컨대 알부민 분비, 우레아 합성 및 시토크롬 P450 3A4 활성)을 수행한다.
간엽 전구체 세포 ( iMPC 또는 iMSC ) 로의 iPSC 분화. 분화 3일 전, 아큐타제™를 사용한 단일-세포 패시징을 수행하였고, 세포를 비트로넥틴-코팅 플레이트 상에 플레이팅하고, 플레이팅 후 최초 24시간 동안 레비타 세포™ 보충된 에센셜 8 플렉스™ 배지 중에서 배양하였다. 세포를 DMEM/F-12 배지 중에서 세척하고, 이어서 간엽 줄기 세포 (MSC) 배지 (DMEM/고 글루코스, 10% 녹아웃 혈청 대체물, 1% Pen/Strep, 글루타민, HEPES, 비-필수 아미노산)로 2주 동안 배양하였다. 그 후, 세포를 MSC 배지 중에서 코팅 없이 플레이트 상에서 배양하였다. 패시지 4로부터 출발하여, 세포는 간엽 전구체 세포로 고려된다. 이들은 면역 형광법 및 유동 세포계측에서 탯줄 매트릭스 줄기 세포와 구별되지 않았고, 이들의 다분화능이 골형성 및 지방형성 분화능에 의해 입증되었다.
내피 전구체 세포 ( iEPC ) 로의 iPSC 분화. 분화 3일 전, 아큐타제™를 사용한 단일-세포 패시징을 수행하였고, 세포를 라미닌 (재조합 인간 라미닌 521)-코팅 플레이트 상에 플레이팅하고, 플레이팅 후 최초 24시간 동안 레비타 세포™ 보충된 에센셜 8 플렉스™ 배지 중에서 배양하였다. 분화를 개시하고 중배엽 유도를 촉진시키기 위해, 세포를 DMEM/F-12 배지로 세척하고, 6 ㎛ CHIR99021, 10 ng/㎖ 액티빈 A 및 20ng/㎖ BMP4 보충된 StemDiff™ APEL™ 배지 중에서 2일 동안 배양하였다. 내피 분화를 촉진시키기 위해, 세포를 DMEM/F-12 배지로 세척하고, 10 ng/㎖ bFGF, 20 ng/㎖ BMP4 및 50 ng/㎖ VEGF 보충된 StemDiff™ APEL™ 배지 중에서 5일 동안 배양하였다. 얻어진 iEPC는 탯줄 혈관 내피 세포 (HUVEC)와 유사한 형태를 획득하였고, 인간 전구세포 내피 세포에 있어 전형적인 마커 (예컨대 면역형광법에서 VE-카드헤린 및 유동 세포계측에서 세포의 적어도 60%에서 CD-31)를 발현하였고, 마트리겔®에서 배양시 도관을 형성할 수 있었다 (튜브 형성 검정). 제 7일부터 세포를 내피 증폭 배지 중에서 유지하였다 (완전 EBM2 배지:론자(Lonza)로부터의 EGM2 불레트키트(BulletKit) 보충된 EBM2 기본 배지) (비트로넥틴-코팅 플레이트 상에서).
오르가노이드 생성. iEPC를 아큐타제™로 해리시키고, 완전 EBM2 배지 중에 700 000 생존가능 세포/㎖의 밀도로 재현탁시켰다. iMPC를 아큐타제™로 해리시키고, 완전 DMEM 배지 중에 200,000 생존가능 세포/㎖의 밀도로 재현탁시켰다. 간 세포를 아큐타제™로 해리시키고, 완전 윌리엄 E 배지/완전 EBM2 (1:1) 배지 중에 1 000 000 생존가능 세포/㎖의 밀도로 재현탁시켰다. iEPC, iMPC 및 간 세포를 1 (간): 0.7 (iEPC): 0.2 (iMPC)의 비율로 혼합하고, 완전 윌리엄 E배지/ 완전 EMB2 (1:1) 배지 (20 ng/㎖ OSM 및 10 ㎛ 덱사메타손 보충됨)를 사용하여, 500 ㎛의 1 cm2 당 깊이 및 직경을 갖는 157 마이크로캐비티 (총 3200 마이크로캐비티/플라스크) (숫자는 근사치임)를 갖는 초저 부착 T-25 구상 마이크로캐비티 플라스크 (코닝(Corning)) 내에 플레이팅하였다. 세포를 37℃에서 주변 O2/5% CO2에서 5일 동안 배양하였다.
조절된 크기의 오르가노이드 형성 (도 3c). iEPC, iMPC 및 간 세포를 1 (간): 0.7 (iEPC): 0.2 (iMPC)의 비율로 조합하고, 초저 부착 (ULA) T-25 구상 마이크로캐비티 플라스크 (코닝) 내로 플레이팅하였다. 157 마이크로캐비티/cm2가 존재하고, 마이크로캐비티는 직경 및 깊이가 500㎛이고, 총 3200 마이크로캐비티/플라스크이다 (숫자는 근사치임). 오르가노이드는 약 50-250 ㎛의 직경을 가지며 크기가 매우 균일하게 나타났다. 이들 모두 동일한 구성을 나타내었고, 대부분의 간엽 및 내피 세포는 코어 내에, 또한 간세포 및 담즙 세포는 대부분 외부 표면 상에 있었다. 이러한 오르가노이드의 코어에서는 괴사가 나타나지 않았다. 오르가노이드는 간-특이적 마커를 나타내었고, 컨디셔닝된 배지 중에서 알부민 분미, 우레아 합성 및 CyP3A4 활성과 같은 성숙 간 기능을 수행할 수 있었다.
오르가노이드 캡슐화 (도 4a). 오르가노이드를 초저 부착 플라스크로부터 수확하고, 저속 (400g, 5분 동안) 원심분리하여 펠릿을 형성하였다. 펠릿 (약 3,000 오르가노이드)을 0.1% N-비닐-2-피릴리돈 및 0.4 mg/㎖ 이르가큐어(Irgacure) 2959 보충된 칼슘 및 마그네슘이 없는 멸균 PBS 중의 5% 4-아암 PEG-비닐 술폰 (20 kDa) 용액 중에 재현탁시켰다. 이러한 용액 (약 100 오르가노이드 함유)의 50㎕ 액적을 생성시키고, 96-웰 플레이트의 웰 내에 퇴적시키고, 이어서 UV 광 하에 가교시켰다 (4cm의 거리에서 5분 1090 μW/cm2). 생성된 캡슐화된 간 조직을 완전 윌리엄 E 배지/완전 EMB2 (1:1) 배지 (20 ng/㎖ OSM 및 10㎛ 덱사메타손 보충됨) 중에서 5일 동안 유지하였다. 캡슐화 5일 후, OSM 보충물을 현탁시키고, 완전 윌리엄 E 배지/완전 EBM2 배지 비율을 1:1로부터 4:1로 변화시켰다. 조직을 37℃에서 주변 O2/5%CO2에서 배양하고, 배지를 격일로 교환하였다. 알부민 분비를 컨디셔닝된 배지 중에서 매주 평가하였다. 캡슐화된 오르가노이드는 배양 7주 초과 동안 히드로겔을 통해 알부민을 분비하는 이들의 능력을 보존하였고, 이는 중합체 내에서의 이들의 생존율 및 이들의 분화된 상태의 유지를 입증하며, 그의 외부의 분비된 단백질의 확산을 확인시켜준다. 캡슐화된 간 조직은 그의 형상 및 완전성을 잃지 않으면서 기기로 조작되기에 충분히 고체이다.
분해성 히드로겔 제조. 단백질분해 분해성 PEG 비닐 술폰 히드로겔 ("D-PEG-VS")을, 젠켐(JenKem)으로부터 얻은 8-아암 PEG-VS (트리펜타에리트리톨 코어; Mw = 40 kDa) (카탈로그 번호 "8ARM(TP)-VS")를 사용하여 제조하였다. 8-아암 PEG-VS를 5% 내지 10% (w/v)의 최종 농도로 등장 HEPES 완충액 (0.1 M HEPES, 0.1 M NaCl, pH 7. 4) 중에 용해시켜 분해성 PEG 비닐 술폰 히드로겔 전구체 용액을 제조하였다. 이어서, 분해성 PEG 비닐 술폰 히드로겔 전구체 용액을 1:1 몰비의 -SH 및 -VS 기의 3개의 반응성 티올을 갖는 플라스민 민감성 가교제와 혼합하였다. 플라스민 민감성 가교제는 맞춤 합성이고 (진스크립트(Genscript), 미국 뉴저지주 피스카타웨이), 하기 아미노산 서열을 갖는다:
Ac-GCYK↓NSGCYK↓NSCG (서열 번호: 1)
플라스민 민감성 가교제의 아미노산 서열에서, N-말단 아세틸 기는 이 말단 상의 전기 전하를 제거하기 위해 첨가된다. 화살표는 프로테아제 절단 부위를 나타낸다. PEG 비닐 술폰 히드로겔 전구체 용액 및 플라스민 민감성 가교제의 혼합은 마이클(Michael)형 부가 (MTA) 반응을 개시하였고, 이를 적어도 5분 동안 진행시켜 PEG 비닐 술폰 히드로겔을 가교시키고 분해성 PEG 비닐 술폰 히드로겔을 생성하였다.
비- 분해성 히드로겔 제조. 비-분해성 PEG 비닐 술폰 히드로겔 ("ND-PEG-VS")을, 젠켐으로부터 얻은 4-아암 PEG-VS (펜타에리트리톨 코어; Mw = 20 kDa) (카탈로그 번호 "A7025-1" 또는 "4ARM-VS")를 사용하여 제조하였다. 4-아암 PEG-VS를 5% 내지 10% (w/v)의 최종 농도로 0.4 mg/100㎕의 광개시제 (예를 들어, 알파 히드록시 케톤 등, 예를 들어, 2-히드록시-4'-(2-히드록시에톡시)-2-메틸프로피오페논, 이르가큐어 2959로서 판매됨 (바스프(BASF), 물질 번호 55047962) (예를 들어, Elisseeff 등 (2005) Biomaterials 26(11):1211-18 참조) 및 0.1% (v/v) N-비닐-2-피릴리돈 (PVP) (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 미국 세인트 루이스)를 함유하는 둘베코(Dulbecco) 포스페이트 완충 식염수 (D-PBS) (pH 7. 4) 중에 용해시켜 비-분해성 PEG 비닐 술폰 히드로겔 전구체 용액을 제조하였다. PVP는 세포적합성에 영향을 주지 않으면서 겔화를 향상시키는 것으로 나타났다 (예를 들어, Lin 등 (2014) Acta Biomater 10(1):104-14 참조, 본원에 참조로 포함됨). 비-분해성 PEG 비닐 술폰 히드로겔 전구체 용액을 5% 내지 10% (w/v)의 최종 농도로 제조하였고, 이는 2. 5-30 mg/100㎕의 PEG-VS와 등가이다. 비-분해성 PEG 비닐 술폰 히드로겔 전구체 용액을 다양한 방사 시간 (예를 들어, 3-10분) 동안 일정 강도 (1090 μW/cm2, 4 cm의 거리)의 자외선 광에 노출시켜 비-분해성 PEG 비닐 술폰 히드로겔을 제조하였다.
이중 히드로겔 제조. 분해성 PEG 비닐 술폰 히드로겔 ("D-PEG-VS")을 상기와 같이 제조하여 이중 PEG 히드로겔 제조의 "내부 코어"를 제공하였다. 내부 (분해성) 코어의 겔화가 완료된 후 (고체 농도에 따라, 대략 7-10분), 가교된 내부 코어를 상기에 기재된 바와 같은 비-분해성 PEG 비닐 술폰 히드로겔 전구체 용액의 10-㎕ 비드의 중심으로 전달하고, 다양한 방사 시간 (대략 3-10분) 동안 일정 강도 (1090 μW/cm2, 4 cm의 거리)의 자외선 광에 노출시켜 "내부 코어" 주위의 "외부 쉘"을 제공하였다.
D-PEG-VS, ND-PEG-VS, 및 이중 PEG 히드로겔의 난소 캡슐화. 난소 조직의 캡슐화를, 조직에 대한 주변 손상을 최소화하기 위해 가열 단계에서 멸균 바이오하자드 캐비넷에서 수행하였다. PEG-기반 이식물을 제조하기 위해, 난소 단편을 유지 배지로부터 인큐베이터 내에 전달하고, 인슐린 (27G) 니들을 사용하여 소수성 슬라이드 상에 놓았다. 각각의 난소 단편은 부피가 약 1 내지 1. 5 mm3였다. PEG 전구체의 액적 (5㎕)을 동일한 슬라이드 상에 피펫팅하고, 난소 단편을 분해성 PEG 비닐 술폰 히드로겔 전구체 용액의 액적 내로 전달하였다. D-PEG-VS를 제조하기 위해, 추가의 5㎕의 용해 피펫 가교제를 PEG-VS의 액적에 첨가하여 혼합하였다. 이어서, 슬라이드를 탑 슬라이드로 커버링하고, 5분 동안 겔을 형성시켰다. 겔화가 완료된 후, 히드로겔은 이식 준비가 되었다.
난소 조직을 갖는 비-분해성 PEG 비닐 술폰 히드로겔을 제조하기 위해, 개시제 및 PVP를 갖는 PEG 비닐 술폰 전구체 용액의 액적 (10㎕)을 소수성 유리 슬라이드 상에 피펫팅하였다. 난소 조직의 단편을 유리 상에 배치하고, 니들에 의해 액적 내로 전달하였다. 조직을 갖는 PEG-VS 전구체 용액을 다양한 방사 시간 (예를 들어, 3 내지 10분) 동안 일정 강도 (1090 μW/㎠, 4 cm의 거리)의 자외선 광에 노출시켜 비-분해성 PEG 비닐 술폰 히드로겔을 제조하였다.
이중 PEG 히드로겔 내의 난소 조직 단편의 캡슐화를 위해, 난소 단편을 분해성 PEG 비닐 술폰 히드로겔 전구체 용액의 액적 내로 전달하고, 상기에 기재된 바와 같이 겔화시키고, 이어서 겔화된 분해성 PEG 비닐 술폰 히드로겔을 상기에 기재된 바와 같이 비-분해성 PEG 비닐 술폰 히드로겔 내에 캡슐화하여 이중 히드로겔을 제조하였다.
실시예 II - 캡슐화된 조직 특성화
세포 면역형광법 . 세포를 4% 파라포름알데히드 내에 고정시키고, 0,2% 트리톤(Triton) X™-100 중에서 실온에서 5분 동안 침투성화하였다. 세포를 3% 블록킹 혈청 (일차 항체에 상응) 용액으로 실온에서30분 동안 인큐베이션하며 비특이적 부위를 블록킹하였다. 고정 및 침투성화된 세포를 일차 항체 용액 (항체를 PBS-BSA 중에 희석, 2%)으로 실온에서 1 h 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 세포를 이차 라벨링 항체 용액 (형광)으로 실온에서 30분 동안 광으로부터 보호 하에 인큐베이션시켰다. 최종 15분 동안 염료(퓨어블루(Pureblue)™ 핵 염색, 바이오라드(BioRad))를 첨가하여 핵을 염색하였다. 세포를 안티페이드(Antifade)™ 시약 (프로롱 골드(ProLong Gold))으로 마운팅하였다. 절차 다음 날 형광을 분석하였다.
간 오르가노이드 상의 면역형광법 . 오르가노이드를 4% 파라포름알데히드 중에 고정시키고, 이어서 파라핀 내에 매립시켰다. 파라핀 섹션을 탈-파라핀화하고, 농도를 (100%로부터 30%로) 감소시키며 자일렌 및 에탄올 용액을 사용하여 재수화시켰다. 슬라이드를 3% 블록킹 혈청 (일차 항체에 상응) 용액으로 실온에서20분 동안 인큐베이션하며 비특이적 부위를 블록킹하였다. 슬라이드를 일차 항체 용액 (항체를 PBS-BSA 중에 희석, 2%)으로 실온에서 1 h 동안 인큐베이션시켰다. 슬라이드를 이차 라벨링 항체 용액 (형광)으로 실온에서 30분 동안 광으로부터 보호 하에 인큐베이션시켰다. 슬라이드를 안티페이드™ 시약 (프로롱 골드)으로 마운팅하였다. 절차 다음 날 형광을 분석하였다.
세포 및 오르가노이드 상의 면역형광법에 사용된 항체. 항-인간 NANOG 희석액 1:10 (Novus Biological); 항-인간 TRA1-81 희석액 1:50 (Fisher Scientific); 항-인간 SSEA4 희석액 1:50 (Fisher Scientific); 항-인간 POU5F1 희석액 1:50 (Novus Biological); 항-인간 SOX2 희석액 1:50 (Novus Biological); 항-인간 FOXA2 희석액 1:100 (ABCAM); 항-인간 SOX17 희석액 1:100 (ABCAM); 항-인간 CXCR4 희석액 1:100 (ABCAM); 항-인간 GATA4 희석액 1:50 (ABCAM); 항-인간 AFP 희석액 1:100 (DAKO); 항-인간 알부민 희석액 1:100 (DAKO); 항-인간 E-카드헤린 희석액 1:100 (BD Bioscience); 항-인간 αSMA 희석액 1:100 (ABCAM); 항-인간 피브로넥틴 희석액 1:100 (ABCAM); 항-인간 CD31 희석액 1:100 (ABCAM); 항-인간 VE-카드헤린 희석액 1:100 (ABCAM); 항-인간 CK19 희석액 1:100 (ABCAM), 항-인간 ZO1 희석액 1:100 (ABCAM, 항-인간 EpCAM 희석액 1:100 (ABCAM).
FACS 분석. 0.5-1×106 세포를 각각의 검정 튜브 내로 분취하였다. 세포를 100㎕의 형광색소-결합 일차 항체 용액 (멤브레인 항원)으로 실온에서 (광으로부터 보호) 20분 동안 염색하였다. 이어서, 세포를 4% 파라포름알데히드로 실온에서 10분 동안 고정시켰다. 세포를 1% 트리톤 X™-100으로 침투성화하였다. 세포를 100㎕의 형광색소-결합 항체 용액 (세포내 항원)으로 염색하고, 암소에서 실온에서 20분 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 0.5㎖ PBS-BSA 1% 중에 재현탁시키고, 4℃에서 유지하고 분석하였다. FACS에 사용된 항체: BD Bioscience 사: PE 항-인간 SSEA4; 알렉사(Alexa) 647 항-인간 NANOG; PERCP-CY 5,5 항-인간 TRA1-81; APC-R700 항-인간 CD117; FITC 항-인간 CD90; PE 항-인간 CD133; PE 항-인간 CD31, PE 항-인간 CD25, 항-인간 7AAD;APC 항-인간 CD3, PEcy7 항-인간 HLA-DR, PerCp-Cy5. 5 항-인간 CD69; Invitrogen사:FITC 항-인간 CFSE.
실시간 RT- PCR . 총 RNA를 간 오르가노이드의 간 세포-스트랜드 cDNA의 합성을 위해 템플레이트로서 배양된 세포 또는 오르가노이드로부터 추출하였다 (릴리아프렙(ReliaPrep)™ RNA 세포 미니프렙(Miniprep) 시스템, 프로메가(Promega) 사). 역전사를 수행하여 cDNA를 얻었다. PCR 반응 혼합물을 제조하고, 그 후 플레이트 내에 로딩한다. 플레이트를 밀봉하고, 원심분리하고, 이어서 기기 내에 로딩한다. 표준 TaqMan qPCR 반응 조건을 사용하였다. 유전자 발현의 상대적 정량 계산을 위해 비교 CT (ΔΔCT) 방법을 사용하여 데이터를 분석하였다. 하기 유전자 발현 검정 (써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher scientific))을 사용하였다: Hs04399610G1 Nanog Taqman 유전자 발현 검정; Hs01895061_U1 POU5F Taqman 유전자 발현 검정; Hs1053049_S1 SOX2 Taqman 유전자 발현 검정; Hs00751752_S1 SOX17 Taqman 유전자 발현 검정; Hs00171403_M1 GATA4 Taqman 유전자 발현 검정; Hs002230853_M1 HNF4A Taqman 유전자 발현 검정; Hs00173490_M1 AFP Taqman 유전자 발현 검정; Hs00609411_M1 알부민 Taqman 유전자 발현 검정; Hs99999905_M1 GAPDH Taqman 유전자 발현 검정. 나타낸 결과는 3회 반복으로부터 얻은 평균 발현이다.
Cyp3A4 활성. 제조업자의 지시에 따라, 프로메가로부터의 P450-Glo™ 검정을 사용하여 Cyp3A4 활성을 평가하였다.
우레아 합성. 제조업자의 지시에 따라, 젠타우르(Gentaur)로부터의 쿠안티크롬(Quantichrom) 우레아 검정 키트™를 사용하여 우레아 합성을 평가하였다.
알부민 생산 . 아키텍트(Architect) c시스템즈(Systems) 상에서의 알부민의 정량 측정, 멀티젠트(Multigent)® 마이크로알부민 검정을 사용하여 알부민 생산을 평가하였다. 이는 인간 알부민에 대한 폴리클로날 항체를 사용하는 탁도계측 면역분석이다. 시편 (이 경우, 배지 교환 48h 후 수집된, 96-웰 플레이트의 각각의 웰로부터의 200㎕ 상청액)을 시약과 혼합하는 경우, 시편 중의 알부민이 시약 중의 항-인간 알부민 항체 (염소)와 조합되어 불용성 응집물이 얻어지고, 이는 용액 중의 탁도를 증가시킨다. 탁도는 시편 중의 알부민의 농도에 비례하고, 광학적으로 측정될 수 있다. 시약 키트: 2K98-20 MULTIGENT 마이크로알부민.
헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색. 간 버드, 오르가노이드 및 난소의 섹션을 증류수로 전달하였다. 핵을 명반(alum) 헤마톡실린으로 염색하였다. 섹션을 흐르는 수돗물로 헹구고, 0.3% 산 알콜로 분화시켰다. 섹션을 에오신으로 2분 동안 염색하였다. 섹션을 탈수시키고, 정화 및 마운팅하였다.
혼합 림프구 반응. MLR을 106 효과기 PBMC, 105 동종이계 성숙된 수지상 세포 (mDC) 간 오르가노이드 (6×105 세포로 구성) 상에서 2회 수행하였다. 표적 세포 또는 조직을 광조사하고, MLR의 6-일 공동-배양 전에 유리시켜 또는 히드로겔 내에 캡슐화하여 (+ 겔) 방치하였다.
IFN -γ 생산. 제조업자의 지시에 따라, 페프로테크(PEPROTECH)로부터의 인간 IFN-γ 표준 ABTS ELISA 개발 키트로 IFN-γ 생산을 평가하였다.
알자린 레드 S 염색. 시그마-알드리치로부터의 알자린 레드 S 염색을 사용하여 iMPC-유래된 골세포의 칼슘 침착물 평가하였다. 세포를 4% 파라포름알데히드 중에 고정시키고, 이어서 PBS로 세척하고, 알자린 레드 S로 실온에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 알자린 레드 S 용액을 제거하고, 세포를 PBS로 세척하였다. 염색된 시편을 현미경 검사하였다.
중성 지질 염색. 제조업자의 지시에 따라, 인비트로겐(Invitrogen)으로부터의 HCS 리피드톡스™ 중성 지질 염색을 사용하여 iMPC-유래된 지방세포에서의 중성 지질 염색을 수행하였다.
튜브 형성 검정. iPSC-유래된 내피 전구체 세포 (iEPC)를 아큐타제™로 해리시키고, 이어서 완전 EBM2 배지 중에서 성장 인자-감소된 마트리겔 (코닝)로 코팅된 24-웰 플레이트의 웰 당 7×104의 밀도로 플레이팅하였다. 플레이트를 37℃에서 주변 O2/5% CO2에서 밤새 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 16h 후, 광 현미경 하에 튜브 형성을 가시화하였다.
세포 생존능 검정. 써모피셔 사이언티픽으로부터의 포유류 세포에 대한 생존/사망™ 생존능/세포독성 키트로 캡슐화된 간 조직의 세포 생존능을 결정하였다. ELT (96-웰 플레이트 내에서 생성)를 각각 150㎕의 PBS의 용액, 에티듐 호모다이머-1 및 칼사인-AM (제조업자의 지시에 따라 제조)으로 37℃에서 주변 O2/5% CO2에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후 형광 현미경 하에 녹색 및 적색 형광을 분석하였다.
암모니아 대사. ELT를 1 mM 염화암모늄, 4 mM L-글루타민/알라닌 및 4 mM L-오르니틴 보충된 완전 ELT 배지 (완전 윌리엄 E 배지/ 완전 EBM2 배지 4:1)로 24h 동안 인큐베이션시켰다. 24h 후, 소비된 배양 배지를 수확하고, 제조업자의 지시에 따라 ABCAM으로부터의 암모니아 검정 키트를 사용하여 암모니아 농도 결정을 위해 500g로 5분 동안 원심분리하였다. 제조업자의 지시에 따라, 젠타우르로부터의 쿠안티크롬 우레아 검정 키트™를 사용하여 24h 동안 1 mM 염화암모늄, 4 mM L-글루타민/알라닌 및 4 mM L-오르니틴 보충된 완전 ELT 배지로의 인큐베이션 전과 후에 ELT의 우레아 생산을 측정하였다.
타크롤리무스 대사 (도 4k): ELT를, 20 μM 리팜피신 보충 하에 또는 보충 없이, 푸지사와 헬쓰케어(Fujisawa Healthcare)로부터의 20 ng/㎖ FK506 (타크롤리무스) 보충된 완전 ELT 배지 (완전 윌리엄 E 배지/ 완전 EBM2 배지 4:1)로 37℃에서 주변 O2/5% CO2에서 12시간 동안 인큐베이션시켰다. 12h 후, 소비된 배지를 수확하고, 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분광측정 검정에 의해 타크롤리무스 농도를 측정하였다. 전기분무 이온화를 사용하여 선택적 반응 모니터링 모드로 m/z 821,5 → 768,6 (타크롤리무스)의 전이를 갖는 암모늄-부가생성물 이온을 측정하였다.
ELT 동결후 특성화. ELT를 동결 배지 (완전 ELT 배지 10% DMSO) 중에서 3일 동안 -80℃에서 동결시켰다. 3일 후, ELT를 해동시키고, 상기에 기재된 바와 같이 해동 24h 및 1주 후 알부민 생산 뿐만 아니라 CyP3A4 활성을 측정하였다.
이물 반응 평가. ELT를 면역억제 처리 없이 면역적격 마우스의 복강 내에 이식하였다 (도 4m에 나타냄). 이어서, ELT를 1주 (도 4n 좌측) 및 4주 (도 4n 우측) 후 복막강으로부터 제거하고, 이물 반응 (즉, 섬유증, 염증)의 징후의 존재에 대해 검사하였다.
기형종 형성 검정. 미분화 iPSCs는 5% PEG-VS 히드로겔 내의 캡슐화시 NOD/SCID IL-2Rγ-/- 마우스 내로 피하 주사 또는 피하 이식하였다. 8주 후, 마우스를 희생시키고, 기형종 형성을 평가하였다.
면역억제 없이 급성 간 부전을 갖는 면역적격 마우스에서의 캡슐화된 간 조직의 이종이식의 단기간 생체내 효능의 예비 평가. 음수로부터 NTBC 보충물의 회수를 통해 면역적격 Fah -/- (티로신혈증) 마우스에서 급성 간 부전을 촉발시켰다. 6마리의 동물에 - 캡슐화된 간 조직을 이식(복강내에 상기에 기재된 바와 같이 인간 세포로부터 생성된 8×2 mm 원통형 캡슐화된 간 조직을 이식)한 후, 30일 동안 생존율을 평가하였다. 이종이식에도 불구하고 면역억제제를 투여하지 않았다. 비어있는 바이오물질을 수용한 6마리의 마우스가 대조군으로서 제공되었다. 이식 7일 후 체중 감소를 이차적 결과로서 평가하였다. 제30일에 여전히 살아있는 모든 동물을 안락사시키고, 제조업자의 지시에 따라, 앱캠(Abcam)으로부터의 인간 알부민 ELISA 키트를 사용하여 마우스 혈청에서 인간 알부민을 특이적으로 측정하였다.
14개의 인간 iPSC 집단을 생성시키고, 엄격한 제노-프리 및 피더-프리 조건에서 유지하였다 (도 1a 내지 도 1d). 피부 섬유모세포 또는 1.5 mL의 말초 혈액으로부터, 6.3±5.6의 고도 균질 iPSC 집단을 얻었다. iPSC를 재현가능하게완전 내배엽 및 후부 전장로 (도 2a 내지 도 2d), 또한 이어서 간-특이적 마커 및 기능을 발현하는 간세포-유사 세포로 추가로 (도 2e 내지 도 2h) 분화시켰다. 단일 iPSC 집단으로부터 출발하여, 간 전구체 세포 (간모세포), 내피 전구체 세포 및 간엽 전구체 세포 (골세포 및 지방세포 포함)가 얻어졌다 (도 2i 내지 도 2m).
3종의 iPSC-유래된 세포 유형을 고정 크기의 초저-부착 마이크로웰 내에서 현탁액 중에서 배양하였다 (도 3a). 성숙 배지 내에서 5일에 마이크로웰 내에서 분화된 조절된 크기의 오르가노이드 (직경 50-250 ㎛, 도 3c)는, 인간 간을 연상시키는 3D 구조를 나타내었고 (도 3b 및 3c), 간 마커를 발현하였고 (도 3d), 상당한 알부민 및 우레아 분비 능력 (도 3e) 뿐만 아니라 CyP3A4 활성을 획득하였다 (도 3f).
생체내에서 간 오르가노이드의 성숙을 발전시키고 이들의 생존율을 향상시키기 위해, 캡슐화 전략이 개발되었다 (도 4a 및 4b). 복수의 간 오르가노이드 (예를 들어 50-150)를 액체 5%, 20 kDa, 4-아암 PEG-VS 바이오물질 내에 분산시켰다 (도 4a). 광중합에 의해 캡슐화된 간 조직 (ELT)을 얻을 수 있었고, 이는 수술 도구로 조작되기에 충분히 고체였다 (도 4b). 이러한 ELT를 이식가능 생성물로서 (8×2 mm 원통형 형상) 또는 시험관내 검정으로서 (96-웰 포맷 내) 생성시켰다. 캡슐화 절차는 유의한 세포독성을 일으키지 않았다 (생존/사망 검정에서 >90% 세포 생존능, 도 4C). 바이오물질 내에서, 간 오르가노이드는 상당히 성숙하였으며, 이들의 크기는 유의하게 변하지 않았다. 캡슐화 30일 후, 간세포를 전체 오르가노이드에 걸쳐 분산시켰고, 담관이 가시적이었다 (도 4d). 간세포는 성숙되었고, 성체 표현형을 획득하였다. 캡슐화 7일 후, ELT는 일차 인간 간세포와 같이 또는 그보다 더 효율적으로 시험관내에서 성숙 간 기능 (알부민 및 우레아 분비 증가, CyP3A4 활성, 암모니아 또는 타크롤리무스 대사, AFP 분비 감소)을 수행할 수 있었다 (도 4e 내지 도 4h). 알부민 생산, 우레아로의 암모니아 대사는 일차 간세포에서보다 ELT에서 상당히 더 효과적이었고, 인간 간과 유사하였다 (12 mg 알부민/g 조직 대 20 mg/g 인간 간; 347 ㎛ol 암모니아/분/이식가능 장치 대 400 ㎛ol/분/간; 도 4e 내지 도 4f). CyP3A4에 의한 타크롤리무스 대사는 인간 간과 유사하였고, 리팜피신의 보충에 의해 유도가능하였다 (도 4g). 모든 이들 기능은 적어도 7주 동안 유지되었고, 시간에 따라 안정적이었다 (반면, 일차 인간 간세포는 시딩으로부터 수일 내에 이들의 대사 활성을 상실함). ELT는 그의 간 기능의 임의의 유의한 상실 없이 동결보존을 견딜 수 있었고 (도 4h), 이는 일차 인간 간세포의 경우에는 그렇지 않다. 인간 다분화능 줄기 세포로부터 생성된 간 오르가노이드를 함유하는 ELT를 면역적격 마우스의 복강 내로 이식하여 그의 생체적합성을 평가하였다 (도 4i). 1 또는 4주 후에는 이물 반응이 나타나지 않았다 (부착 없음, 염증 없음; 도 4j). 간 오르가노이드 생성에 사용된 다분화능 줄기 세포는 면역억제된 NSG 마우스에서 피하 주사시 기형종을 형성할 수 있다 (도 4k). 상기에 기재된 PEG-기반 바이오물질 내의 이러한 다분화능 줄기 세포의 캡슐화는 매립된 세포가 수용자 조직 내로 분산되는 것을 막았고, 따라서 기형종의 형성을 막았다 (도 4l). 이는, 캡슐화가 줄기 세포-유래된 분화된 세포 또는 오르가노이드의 이식으로부터의 종양 형성의 위험을 상당히 감소시킬 수 있음을 시사한다 (따라서, ELT의 종양형성성이 없거나 낮음을 시사함). ELT의 면역원성, 및 바이오물질 내의 캡슐화에 의해 제공되는 면역 분리를 평가하기 위해, 본 발명자들은 혼합 림프구 반응 검정을 수행하였다 (도 4m 내지 도 4o). 비-캡슐화된 간 오르가노이드는 동종이계 효과기 T 세포의 매우 낮은 활성화 능력을 나타내었다. 캡슐화는 캡슐화된 세포와 면역 세포 사이의 임의의 접촉을 막아, T 세포 활성화를 막았다. 바이오물질의 면역 분리 능력은, 동종이계 성숙된 수지상 세포의 캡슐화시 T 세포 활성화의 부재를 통해 추가로 확인되었다 (도 4m 내지 도 4o). 이들 데이터는, 면역억제의 필요 없이 동종이계 캡슐화된 간 조직을 이식할 수 있음을 시사한다.
개념 증명 실험(proof-of-concept)을 면역적격 마우스에서 수행하였다. 티로신혈증 Fah-/- 마우스에서 급성 간 부전이 유도된 후, 인간 ELT를 면역억제 없이 동물의 복강 내에 이식하였다. 비어있는 바이오물질을 수용한 마우스가 대조군으로서 제공되었다. 수술 7일 후, ELT를 수용한 모든 마우스가 체중 증가되었으나, 모든 대조군은 안정적이거나 체중 감소되었다 (도 4p). 수술 30일 후, ELT를 수용한 마우스의 67%가 살아있었고, 이는 대조군의 0%와 비교되었다. 제30일에 모든 생존 동물의 혈액에서 인간 알부민이 검출되었다. 이는, 면역억제 필요 없이, 간 부전을 갖는 대상체에서의 간 기능 회복 및 생존율 향상에 있어 ELT의 많은 잠재력을 시사한다.
본 발명을 그의 구체적 구현예와 관련하여 기재하였지만, 청구범위의 범주는 실시예에 기재된 바람직한 구현예에 의해 제한되지 않아야 하고, 전체적으로 기재와 일관되는 가장 광범위한 해석으로 주어져야 함을 이해할 것이다.
<110> VALORISATION-HSJ, LIMITED PARTNERSHIP THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF MICHIGAN <120> ENCAPSULATED LIVER TISSUE <130> 2019-FPA-9372 <150> US 62/425,811 <151> 2016-11-23 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasmin sensitive cross-linker <400> 1 Gly Cys Tyr Lys Asn Ser Gly Cys Tyr Lys Asn Ser Cys Gly 1 5 10

Claims (46)

  1. 제1 생체적합성 가교 중합체로 적어도 부분적으로 커버링된 1 ㎤ 당 적어도 250개의 간 오르가노이드를 포함하는 캡슐화된 간 조직으로서,
    상기 1 ㎤ 당 적어도 250개의 간 오르가노이드는 (i) 간, 간엽 및 선택적으로 내피 세포를 포함하는 세포 코어를 포함하고, (ii) 실질적으로 구 형상을 갖고, 및 (iii) 약 50 내지 약 500 ㎛의 상대적 직경을 가지며, 상기 캡슐화된 간 조직은 적어도 5 mm의 폭을 갖는 캡슐화된 간 조직.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 1 ㎤ 당 적어도 250개의 간 오르가노이드는 상기 제1 생체적합성 가교 중합체로 실질적으로 커버링되는 캡슐화된 간 조직.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 세포 코어는 간세포 또는 담즙 상피 세포를 포함하는 캡슐화된 간 조직.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 제1 생체적합성 가교 중합체는 폴리(에틸렌) 글리콜(PEG)을 포함하는 캡슐화된 간 조직.
  5. 청구항 1에 있어서,
    제2 생체적합성 가교 중합체를 추가로 포함하며, 상기 제1 생체적합성 가교 중합체는 상기 제2 생체적합성 가교 중합체에 의해 적어도 부분적으로 커버링되는 캡슐화된 간 조직.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 제1 생체적합성 가교 중합체는 상기 제2 생체적합성 가교 중합체로 실질적으로 커버링되는 캡슐화된 간 조직.
  7. 청구항 1에 있어서,
    상기 제1 생체적합성 가교 중합체는 적어도 부분적으로 생분해성인 캡슐화된 간 조직.
  8. 청구항 5에 있어서,
    상기 제2 생체적합성 가교 중합체는 적어도 부분적으로 생분해에 대해 저항성인 캡슐화된 간 조직.
  9. 청구항 5에 있어서,
    상기 제2 생체적합성 가교 중합체는 폴리(에틸렌) 글리콜(PEG)을 포함하는 캡슐화된 간 조직.
  10. 삭제
  11. - 간, 간엽 및 선택적으로 내피 세포를 현탁액 중에서 조합하고 배양시켜, (i) 간, 간엽 및 선택적으로 내피 세포를 포함하는 세포 코어, (ii) 실질적으로 구 형상, 및 (iii) 약 50 내지 약 500 ㎛의 상대적 직경을 갖는 복수의 간 오르가노이드를 얻는 단계; 및
    - 상기 복수의 간 오르가노이드를 제1 생체적합성 가교 중합체로 적어도 부분적으로 커버링하여 1 ㎤ 당 적어도 250개의 간 오르가노이드 및 적어도 5 mm의 폭을 갖는 캡슐화된 간 조직을 얻는 단계;를 포함하는 캡슐화된 간 조직의 제조 방법.
  12. 청구항 11에 있어서,
    상기 간 및 간엽 세포는 배양 전에 1:0.2-7의 비율로 조합되는 방법.
  13. 청구항 11에 있어서,
    상기 간 및 내피 세포는 배양 전에 1:0.2-1의 비율로 조합되는 방법.
  14. 청구항 11에 있어서,
    상기 간, 간엽 및 내피 세포 중 적어도 하나는 줄기 세포 분화로부터 얻는 방법.
  15. 청구항 14에 있어서,
    상기 줄기 세포는 다분화능 줄기 세포인 방법.
  16. 청구항 11에 있어서,
    상기 간 세포는 하기 세포인 방법:
    - 완전 내배엽 또는 후부 전장으로부터 얻어진 세포;
    - 간모세포 또는 간 전구체 세포; 또는
    - 간세포.
  17. 청구항 11에 있어서,
    상기 간엽 세포는 간엽 줄기 세포 또는 간엽 전구체 세포인 방법.
  18. 청구항 11에 있어서,
    상기 내피 세포는 내피 전구체 세포인 방법.
  19. 청구항 11에 있어서,
    상기 적어도 250개의 간 오르가노이드를 상기 제1 생체적합성 가교 중합체로 실질적으로 커버링하는 단계를 포함하는 방법.
  20. 청구항 11에 있어서,
    상기 제1 생체적합성 가교 중합체는 폴리(에틸렌) 글리콜(PEG)을 포함하는 방법.
  21. 청구항 11에 있어서,
    상기 제1 생체적합성 가교 중합체를 제2 생체적합성 가교 중합체로 적어도 부분적으로 커버링하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  22. 청구항 21에 있어서,
    상기 제1 생체적합성 가교 중합체를 상기 제2 생체적합성 가교 중합체로 실질적으로 커버링하는 단계를 포함하는 방법.
  23. 청구항 11에 있어서,
    상기 제1 생체적합성 가교 중합체는 적어도 부분적으로 생분해성인 방법.
  24. 청구항 21에 있어서,
    상기 제2 생체적합성 가교 중합체는 적어도 부분적으로 생분해에 대해 저항성인 방법.
  25. 청구항 21에 있어서,
    상기 제2 생체적합성 가교 중합체는 폴리(에틸렌) 글리콜(PEG)을 포함하는 방법.
  26. 삭제
  27. 청구항 11 내지 청구항 25 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득가능한 캡슐화된 간 조직.
  28. 청구항 27에 있어서,
    의약 제조를 위한 캡슐화된 간 조직.
  29. 청구항 27에 있어서,
    이를 필요로 하는 대상체에서 간 기능을 회복 또는 개선시키기 위한 캡슐화된 간 조직.
  30. 청구항 29에 있어서,
    간 부전과 관련된 증상의 치료 또는 완화를 위한 캡슐화된 간 조직.
  31. 청구항 30에 있어서,
    상기 간 부전은 급성, 만성 또는 급만성 간 부전인 캡슐화된 간 조직.
  32. 청구항 29에 있어서,
    간 대사의 선천적 이상과 관련된 증상의 치료 또는 완화를 위한 캡슐화된 간 조직.
  33. 이를 필요로 하는 대상체에서 간 기능을 회복 또는 개선시키는 방법에 사용하기 위한 약학적 조성물로서,
    상기 방법은 대상체에서 간 기능을 개선시키기 위해 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항의 캡슐화된 간 조직의 간 오르가노이드 유효량을 대상체의 생물학적 유체와 접촉시키는 단계를 포함하는 약학적 조성물.
  34. 청구항 33에 있어서,
    상기 간 기능의 회복 또는 개선은 간 부전과 관련된 증상의 치료 또는 완화를 위한 것인 약학적 조성물.
  35. 청구항 34에 있어서,
    상기 간 부전은 급성, 만성 또는 급만성 간 부전인 약학적 조성물.
  36. 청구항 33에 있어서,
    상기 간 기능의 회복 또는 개선은 간 대사의 선천적 이상과 관련된 증상의 치료 또는 완화를 위한 것인 약학적 조성물.
  37. 청구항 29에 있어서,
    상기 캡슐화된 간 조직은 제1 생체적합성 가교 중합체 전반에 걸쳐 분산된 복수의 간 오르가노이드를 포함하는 캡슐화된 간 조직.
  38. a) 작용제를 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항의 캡슐화된 간 조직과 접촉시켜 시험 혼합물을 얻는 단계;
    b) 상기 시험 혼합물 중의 적어도 하나의 작용제-관련 간 대사물질 또는 간 파라미터를 결정하는 단계; 및
    c) 단계 b)의 상기 적어도 하나의 작용제-관련 간 대사물질 또는 간 파라미터를 대조군 작용제-관련 간 대사물질 또는 간 파라미터와 비교하여 상기 작용제의 간 대사 또는 간독성을 결정하는 단계;를 포함하는 작용제의 간 대사 또는 간독성의 결정 방법.
  39. 청구항 38에 있어서,
    상기 작용제가 상기 캡슐화된 조직의 적어도 250개의 간 오르가노이드의 적어도 하나의 세포 유형에서 간독성을 유도하는지 여부를 결정하기 위한 방법.
  40. 청구항 39에 있어서,
    상기 적어도 하나의 세포 유형은 간세포 또는 담즙 상피 세포인 방법.
  41. 청구항 38에 있어서,
    상기 작용제를 제1 간 오르가노이드를 포함하는 제1 캡슐화된 간 조직 및 제2 간 오르가노이드를 포함하는 제2 캡슐화된 간 조직과 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 제1 간 오르가노이드의 세포는 상기 제2 간 오르가노이드의 세포에 대해 동종이계인 방법.
  42. 청구항 38에 있어서,
    상기 캡슐화된 간 조직은 제1 생체적합성 가교 중합체 및 적어도 250개의 간 오르가노이드로 본질적으로 이루어지는 방법.
  43. 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항의 캡슐화된 간 조직 및 작용제의 간 대사를 결정하기 위한 지침서를 포함하는, 작용제의 간 대사를 결정하기 위한 키트.
  44. 청구항 43에 있어서,
    조직 배양 지지체를 추가로 포함하는 키트.
  45. 청구항 44에 있어서,
    상기 조직 배양 지지체는 적어도 하나의 웰을 포함하는 키트.
  46. 청구항 45에 있어서,
    상기 캡슐화된 간 조직은 상기 적어도 하나의 웰의 저부에 있는 키트.
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