KR101628821B1

KR101628821B1 - 탈세포화된 생체 조직 유래의 생체적합성 가용화 스캐폴드 추출물, 이의 제조방법 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101628821B1
Application number: KR1020150028889A
Authority: KR
Inventors: 우흥명; 쿠마르티오티아; 박경미
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2015-03-02
Filing date: 2015-03-02
Publication date: 2016-06-13

Abstract

본 발명은 탈세포화된 생체 조직 유래의 생체적합성 가용화 스캐폴드 추출물, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 탈세포화된 생체 조직 유래의 생체적합성 가용화 스캐폴드 추출물(Biocompatible Solubilized Scaffold Extract, SSE)의 제조 방법, 상기 방법에 따라 제조된 탈세포화된 생체 조직 유래의 생체적합성 가용화 스캐폴드 추출물, 및 상기 SSE를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 배양 또는 분화를 위한 배양 용기 코팅용 조성물을 제공한다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 탈세포화된 생체 조직 유래의 생체적합성 가용화 스캐폴드 추출물 및 이를 포함하는 배양 용기 코팅용 조성물은 탈세포화된 간 조각이 줄기세포의 생존을 위한 생체모방적인(biomimetic) 2D 및 3D 미세환경을 제공할 수 있음을 보여주며, 줄기세포의 분화 및 배양에 효과적으로 이용될 수 있다.

Description

탈세포화된 생체 조직 유래의 생체적합성 가용화 스캐폴드 추출물, 이의 제조방법 및 이의 용도{Biocompatible Solubilized Scaffold Extract Derived from Decellularized Organ Tissue, Method for Preparating the Biocompatible Scaffold Extract and Uses for Thereof}

본 발명은 탈세포화된 생체 조직 유래의 생체적합성 가용화 스캐폴드 추출물, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다.

동소 간(Orthotopic liver) 이식은 말기 간 질환 환자를 살리기 위한 유일한 표준 치료이다. 이러한 절차와 관련하여 기증 간에 대한 수요, 간 기증자의 부족뿐 만 아니라 이식 후 거부 반응과 같은 심각한 문제가 있다. 기증자 기관의 만성적 부족을 보완하기 위한 하나의 잠재적인 방법은 생체 인공(bioartificial) 간 및 보조(secondary livers) 간을 개발하는 것이다. 간은 구조가 매우 복잡하고, 해독, 단백질 합성 및 분해에 필요한 생화학 물질의 생산을 포함하여 신체 내에서 다양한 기능들을 갖는다. 따라서, 구성 요소, 구조 및 기능에 있어서, 간과 동일한 인공 지지체(scaffold)를 제조하는 것은 어렵다. 또한, 양호한 생체 적합성, 적합한 다공성을 가지며 조성, 형태, 구조 상 생체 간과 유사해야 한다. 따라서, 조직 공학, 장기 이식 및 약물 스크리닝을 위한 기능적인 생체 공학적 간의 제조는, 탈세포화 과정을 이용하여 구축될 수 있다. 계면활성제(detergent)를 이용하여 간 조직으로부터 세포 내 구성 요소를 완전히 제거하면, 온전한 간 특이 ECM 및 혈관 네트워크의 구조적 및 기능적 특징들은 잘 보존된다. 조직 공학에 있어 탈세포화된 매트릭스의 응용 잠재력은 방광, 동맥, 식도, 피부 및 기관을 포함한 다수의 조직에 대해 확인된 바 있다. 조직 또는 장기의 탈세포화는 세포 배양 및 이식을 위한 기능 적 스캐폴드를 제조하는 유망한 접근법으로 연구되어 왔다.

재생 의학 및 조직 공학용 인공 간을 개발하기 위해서는, 두 가지 기본적이고 상호보완적인 핵심 요소가 요구된다. 첫 번째는, 모든 세포외 기질(extracellular matrix) 단백질을 보존하고 천연 간 구조를 모방한 생물학적으로 호환가능한 스캐폴드이다. 합성 또는 천연 유래의 다수의 기질들이 간 조직 공학에 이용되어 왔다. 그러나, 대부분의 합성 기질들은 생체 적합성에 문제가 있었다. 탈세 포화 간 스캐폴드는 세포외 기질, 단백질 및 혈관을 유지하고 있어 가장 적합하고 신뢰할 수 있는 소스이다. 두 번째는, 정상적인 간 기능 수행하도록 지지할 수 있는 리시딩(reseeding)을 위한 적합한 세포 공급원이다. 성공적인 조직 재생을 위해서는 조직을 구성하는 세포가 필수적이다. 증식 활성 및 세포 분화 잠재력을 고려할 때, 줄기 세포가 실질적으로 유망한다. 자가재생(self-renewal)은 줄기세포에 멀티- 분화능(multi-potential differentiation ability)을 부여하는 줄기세포 고유의 특성이다. 간 세포로 분화 할 수 있는 성체 줄기 세포(adult stem cells), 태아 간 전구세포(fetal hepatic progenitor) 및 만능 줄기세포(pluripotent stem cells)와 같은 많은 세포 소스가 있다. 그러나, 간세포로의 성체 줄기세포의 분화 가능성은 여전히 논란이 있고, 다능성 줄기세포는 간세포 분화에 대해 유망한 것으로 나타났다. 한편, 간 조직으로부터 플라스틱 인 비트로 상 분리 및 배양된 간세포들은 연약하다. 이러한 세포들은 빠르게 간-특이 기능을 잃고, 인해 적절한 환경 기반의 부족으로 세포 사멸사하는 경향이 있다. 배아 줄기세포(ES, Embryonic stem cells) 및 유도만능줄기세포(iPS, Induced pluripotent stem cells)는 인 비트로 및 인 비보 상에서 간세포로 분화할 수 있는 잠재력을 유지하면서, 인 비트로 상에서 무제한적으로 증식하는 증식능을 가지고 있다. ES는 매우 원시적인 줄기 세포이며, 세 개의 모든 배엽으로 분화할 수 있고, 또한, 외인성 성장인자에 기반하여 최종적인 세포 유형으로 분화할 수 있는 잠재력을 가지고 있기 때문에, ES는 여전히 재생 치료를 위한 최선의 모델을 고려된다. 그러나, 대부분의 연구는 2D 세포 배양 시스템에서의 ES로부터 간세포 분화를 보고하고 있고, 3D 인공 스캐폴드에서의 분화는 많이 보고되지 않았으며, 여전히 보다 많은 조사가 필요하다. 적용가능한 세포 소스, 스캐폴드 생체 적합성 및 면역학적 장벽과 같은 아직 많은 어려움을 극복해야 한다.

최근의 연구들은 주로 탈세포화된 전체 간 구조의 응용에 초점을 맞추고 있다. 또한, 코팅 물질 또는 주사 가능한 하이드로 겔과 같은 다른 종류의 생체 물질을 제조하기 위한 탈세포화된 간 조직의 범용성도 연구되고 있다. 세포 특이적인 인 비보 미세 환경에 보다 가깝게 모방할 수 있으므로, 특정 조직으로부터 자연적인 ECM을 얻고 이용하는 것은 이상적인 성장 환경을 제공 할 수 있다. 탈세 포화 기술의 발달로, 완전한 신규한 생체 재료로서의 조직 특이적 세포외 기질(ECM)은 많은 연구자들의 관심을 끌고 있다. 단일 단백질의 다양한 연구 조합에서, 콜라겐, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 라미닌 또는 매트리겔은 코팅 물질로서 사용되었지만, 그들은 조직-특이적 결합 또는 다양한 단백질 및 다당류의 비율적인 면에서, 인 비보 ECM을 완벽하게 캡슐화시키지 않는다. ECM 스캐폴드 및 기질(substrate)은 조직 공학을 위한 이상적인 후보이다. ECM은 콜라겐, 엘라스틴, 피브로넥틴, 라미닌 및 글리코사미노글리칸(GAG)과 같은 섬유질 단백질의 교합하는 그물망을 구성하기 때문이다. 또한, ECM은 성장인자(GF)의 결합 및 세포-표면 수용체와의 상호작용하면서 중요한 형태학적 조직 및 생리학적 기능을 지시하여 시그널 전달을 유도하고, 유전자 전사를 조절한다.

본 연구에서 본 발명자들은, 간 세포외 매트릭스로부터 지략적인 플랫폼을 개발하여, 상술한 두 가지 기능을 제공하며 mES 세포 배양에 생체 적합한 2-차원 기질 코팅 물질인 ＇SSE(solubilized scaffold extract)＇ 및 3-차원 바이오 매트릭스를 제공하였다. 적합한 세포 소스로서 mES 세포를 이용하여 배양 접시의 코팅을 위한 SSE의 농도 및 mES 배양 배지에서 SSE의 농도를 최적화하였다. 또한, 3D 바이오 매트릭스에 세포들을 접종하여, 세포들의 생체 적합성 및 생존율을 확인하였다. 따라서, 탈세포화된 간 조각이 mES 생존을 위한 생체모방적인(biomimetic) 2D 및 3D 미세환경을 제공할 수 있음을 보여주며, 이는 간 조직 공학에서의 응용 가능성을 나타낸다.

본 발명자들은 줄기세포의 배양 또는 분화를 위한 생체 조직 유래의 신규한 생체적합성 물질을 개발하고자 예의 노력하였다. 그 결과, 간 세포외 매트릭스로부터 지략적인 플랫폼을 개발하여, mES 세포 배양에 생체 적합한 2-차원 기질 코팅 물질인 ＇SSE(solubilized scaffold extract)＇ 및 3-차원 바이오 매트릭스를 제공하였고, 이를 이용하여 mES 세포들의 생체 적합성 및 생존율을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 탈세포화된 생체 조직 유래의 생체적합성 가용화 스캐폴드 추출물(Biocompatible Solubilized Scaffold Extract)의 제조 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 탈세포화된 생체 조직 유래의 생체적합성 가용화 스캐폴드 추출물(Biocompatible Solubilized Scaffold Extract)을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 줄기세포 배양 또는 분화를 위한 배양 용기 코팅용 조성물을 제공하는 데 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 탈세포화된 생체 조직 유래의 생체적합성 가용화 스캐폴드 추출물(Biocompatible Solubilized Scaffold Extract)의 제조 방법을 제공한다:

(a) 생체 조직을 탈세포화(decellularization)하는 단계;

(b) 상기 탈세포화된 조직으로부터 세포외 기질(ECM, Extracellular Matrix)을 수득하는 단계;

(c) 상기 (b) 단계의 ECM을 동결건조 후 분쇄하여 분말을 형성하는 단계;

(d) 상기 (c) 단계의 분말에 산용액을 첨가하여 산추출한 산가용성 추출물을 수득하는 단계;

(e) 상기 (d) 단계의 산가용성 추출물에 펩신을 첨가하여 분해한 펩신 가용화 추출물을 수득하는 단계;

(f) 상기 (e) 단계의 펩신 가용화 추출물을 중화하여 가용성 추출물(SEx, solubilized extract)을 수득하는 단계;

(e) 상기 (f) 단계의 SEx를 원심분리하여 원심분리된 추출물(CEx, centrifuged extract)을 수득하는 단계; 및

(f) 상기 (e) 단계의 CEx를 여과하여 여과된 추출물(FEx, filtered extract)인 생체적합성 가용화 스캐폴드 추출물(SSE, solubilized scaffold extract)을 수득하는 단계.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 (a) 단계의 생체 조직은 포유류로부터 분리된 조직으로, 탈세포화시켜 세포외 기질(ECM, Extracellular Matrix)을 수득할 수 있는 한 어떠한 포유류의 조직도 포함할 수 있다.

바람직하게는, 돼지, 소, 말, 토끼, 개, 고양이, 양, 염소, 인간, 비인간 영장류, 기니 피크, 또는 설치류으로부터 분리된 조직이고, 보다 바람직하게는 돼지 또는 소이며, 가장 바람직하게는 돼지이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 (a) 단계의 생체 조직은 간, 심장, 신장, 위, 소장, 대장, 비장, 방광, 폐 또는 피부이고, 보다 바람직하게는 간, 심장 또는 신장이며, 가장 바람직하게는 간이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "스캐폴드(scaffold)"란, 조직공학(Tissue engineering)에 사용되는 용어로서, 생체 세포를 안착시켜 세포와 여러 가지 물질들의 조합을 이용하는 구조물을 말하며, 바이오 스캐폴드란 생체 구조물 즉, 생체 장기를 탈세포화(decellularization)시켜 세포를 제거한 후, 미세구조 및 장기의 윤곽만을 남긴 구조물(주형물)을 의미한다.

따라서, 본 명세서에서 사용되는 용어 "가용화 스캐폴드 추출물(SSE, solubilized scaffold extract)"는, 상술한 생체 구조물인 스캐폴드의 가용성 추출물을 의미한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 가용화 스캐폴드 추출물(SSE, solubilized scaffold extract)은 1) 탈세포화로 인하여 세포 구성물이 제거되어 이식시 면역 거부 반응이 최소화되고, 2) 세포 성장과 분화에 관여하는 세포외기질 및 단백질이 보존되고, 3) 간소엽 구조가 보존되어 세포 주입 후 산소 및 영양 공급이 가능하고, 원래 장기 그대로의 형태와 구조가 유지된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 (a) 단계의 탈세포화는 용해 용액(lysis solution), 저장성 용액(hypotonic solution), 계면활성제, RNase A 및 DNase I으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상을 이용하여 실시할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 계면활성제는 통상의 계면활성제가 이용될 수 있으며, 이의 농도는 0.1 내지 10%가 바람직하다.

바람직하게는, 상기 계면활성제는 SDS (sodium dodecyl sulfate), Triton-X, DNase 및 CHAPS (3-(3-cholamidopropyl)dimethylammonio)-1-propane sulfonate)로 이루어진 군 중에서 선택된 1 종 이상이고, 보다 바람직하게는 SDS (sodium dodecyl sulfate) 또는 Triton-X이고, 가장 바람직하게는 SDS (sodium dodecyl sulfate)이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 (d) 단계의 산용액은 염산, 황산 및 인산으로 이루어진 군 중에서 선택된 1 종 이상이다.

상기 단계에서 스캐폴드에 산용액을 1:1 내지 100의 중량비로 첨가하여 산 가용성 스캐폴드 추출물을 수득할 수 있다.

이어서 상기 산가용성 추출물에 펩신을 1:1 내지 100의 중량비로 첨가하여 분해한 펩신 가용화 추출물을 수득할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 방법에 따라 제조된 탈세포화된 생체 조직 유래의 생체적합성 가용화 스캐폴드 추출물(Biocompatible Solubilized Scaffold Extract)을 제공한다.

본 발명의 탈세포화된 생체 조직 유래의 생체적합성 가용화 스캐폴드 추출물(SSE, Solubilized Scaffold Extract)은 단독으로 또는 다른 물질들과 조합하여 세포의 배양을 위한 미세환경 조성에 이용될 수 있다.

예컨대, 본 발명의 SSE는 세포증식에 필요한 성장인자를 추가적으로 부착하여 생체에 이식하여 생장인자를 체내에서 방출 하도록 하는 약물전달체로도 활용할 수 있으며, 상기 세포외기질막에 부착되는 성장인자로는 인슐린유사 성장인자(IGF), 염기성 섬유아세포성장인자(bFGF), 산성 섬유아세포성장인자(aFGF), 형질전환성장인자-α(TGF-α), 형질전환성장인자(TGF-β), 골형성단백질(BMP), 혈소판유래 성장인자 (PDGF), 각질세포성장인자(KGF), 표피세포성장인자(EGF), 혈관내피세포성장인자(VEGF), 조혈촉진인자(EPO), 과립대식세포성장인자(GM-CSF), 과립세포성장인자(G-CSF), 신경세포성장인자(NGF), 헤파린결합 EGF(heparin binding EGF) 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 탈세포화된 생체 조직 유래의 생체적합성 가용화 스캐폴드 추출물(Biocompatible Solubilized Scaffold Extract)을 포함하는, 줄기세포 배양 또는 분화를 위한 배양 용기 코팅용 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 조성물은 가교제 및 천연 고분자를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 가교제는 글루타르알데히드(glutaraldehyde), 제니핀(Genipin) 및 카보디이미드(carbodiimide)로 이루어진 군 중에서 선택된 1 종 이상을 포함하고, 보다 바람직하게는 글루타르알데히드(glutaraldehyde) 또는 제니핀(Genipin)이며, 가장 바람직하게는 글루타르알데히드(glutaraldehyde)이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 천연 고분자는 콜라겐, 변성 콜라겐, 알기네이트, 변성 알기네이트, 히알루론산, 변성 히알루론산, 젤라틴, 변성 젤라틴, 키토산, 변성 키토산, 피브린 및 변성 피브린으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 따르면, 상기 가교제 및 천연 고분자는 1:1 내지 100의 중량비로 혼합 후 가교결합시켜 처리하거나 또는 상기 가교제 및 천연 고분자는 1:1 내지 100의 중량비로 개별 처리할 수 있으며, 바람직하게는 1:1 중량비로 개별처리하는 것이다.

즉, 본 발명의 조성물은 세포 배양 기판 위를 코팅하는 코팅용 조성물로서, 탈세포화된 생체 조직 유래의 생체적합성 가용화 스캐폴드 추출물(Biocompatible Solubilized Scaffold Extract)을 세포 배양 기판 표면을 코팅한 후, 추가적으로 1:1 비율의 가교제 및 천연 고분자를 첨가하여, 배양하고자 하는 세포의 접착성 및 생존율을 증가시킨다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 줄기세포는 배아줄기세포, 골수유래 줄기세포, 지방유래줄기세포, 태반유래 줄기세포 및 유도 만능 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 목적에 따라 적절히 선택될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 스캐폴드 추출물의 농도는 0.1 ㎎/㎖ 내지 10 ㎎/㎖이며, 보다 바람직하게는 1 ㎎/㎖ 내지 8 ㎎/㎖이고, 가장 바람직하게는 6 ㎎/㎖이다.

즉, 본 발명의 조성물은 줄기세포 배양 또는 분화를 위한 배양 용기 코팅용 조성물로서, 탈세포화된 생체 조직 유래의 생체적합성 가용화 스캐폴드 추출물(Biocompatible Solubilized Scaffold Extract)를 유효성분으로 포함하는 코팅을 통해 배양하고자 하는 세포의 접착성 및 생존율을 증가시킨다.

본 발명의 조성물은 상술한 SSE를 유효성분으로 포함하므로, 이와 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 줄기세포 배양 또는 분화 방법을 제공한다:

(a) 포유류로부터 분리된 간 조직을 탈세포화(decellularization)하여 스캐폴드 절편을 제작하는 단계; 및

(b) 상기 스캐폴드 절편의 표면에 줄기세포를 접종하여 공동-배양하거나 또는 상기 스캐폴드 절편 내부에 줄기세포를 주입하여 배양하는 단계.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 (a) 단계의 스캐폴드 절편은 세포외 기질(ECM, Extracellular Matrix)을 포함한다.

상기 스캐폴드 절편 내 또는 그 상에 도입("접종")되는 줄기세포의 수는 기관(예를 들어, 어떤 기관인지, 및 그 기관의 크기 및 중량) 또는 조직 및 줄기세포의 유형 및 단계 모두에 따라서 좌우된다.

바람직하게는, 상기 줄기세포는 하나 또는 그 이상의 위치에 주입함으로써 스캐폴드 절편 내로 도입될 수 있다.

또한, 한가지 유형 이상의 줄기세포(즉, 줄기세포의 칵테일)를 스캐폴드 절편 에 도입시킬 수도 있다. 예를 들어, 세포의 칵테일을 스캐폴드 절편 내의 다수의 위치에 주입할 수 있거나, 상이한 세포 유형을 스캐폴드 절편의 상이한 부분 내에 주입할 수 있다. 주입하는 대신에, 또는 주입하는 이외에도, 줄기세포 또는 세포의 칵테일은 카눌라 삽입된 스캐폴드 절편 내에 관류시킴으로써 도입될 수 있다. 예를 들어, 줄기세포는 관류매질을 사용하여 스캐폴드 절편 내로 관류시킬 수 있으며, 그 다음에 팽창 및/또는 분화매질로 교환하여 줄기세포의 성장 및/또는 분화를 유도할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 방법은 (b) 단계에서 추가적으로 생리활성물질을 첨가할 수 있다.

본 발명의 스캐폴드 절편에 줄기세포를 이식한 후 배양하는 단계에서 줄기세포를 증식시키거나 세포외 기질 분비를 촉진시키기 위하여 생리활성물질을 추가적으로 첨가할 수 있다.

상기 생리활성물질로는 전환 성장인자(transforming growth factor-beta, TGF-β), 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor, FGF), 골 형태발생 단백질(bone morphogenic protein, BMP), 혈관내피 성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 표피 성장인자(epidermal growth factor, EGF), 인슐린-유사 성장인자(insulin-like growth factor, IGF), 혈소판-유래 성장인자(platelet-derived growth factor, PDGF), 신경 성장인자(nerve growth factor, NGF), 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor, HGF), 태반 성장인자 (placental growth factor, PIGF), 과립구 콜로니 자극인자(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF), 및 아스코르베이트 2-포스페이트(ascorbate 2-phosphate)와 같은 배지 첨가물로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 탈세포화된 생체 조직 유래의 생체적합성 가용화 스캐폴드 추출물 및 이를 포함하는 배양 용기 코팅용 조성물은 탈세포화된 간 조각이 줄기세포의 생존을 위한 생체모방적인(biomimetic) 2D 및 3D 미세환경을 제공할 수 있음을 보여주며, 줄기세포의 분화 및 배양에 효과적으로 이용될 수 있다.

도 1은 정상 배양 배지 조건 하 멸균된 간 스캐폴드 절편의 세균 오염에 대해 배지 지시색 변화(A) 및 RNA 수준(B)에서 분석한 결과를 보여준다.
도 2는 탈세포화된 스캐폴드 절편의 코팅 물질로서의 제조 과정을 보여준다. 도 2 내 A는 1x1x0.5 크기의 돼지 천연 간 절편, B는 탈세포화된 돼지 간 절편, C는 천연 간의 H&E 염색 후 조직학적 모습, D는 탈세포화된 간엽의 H&E 염색 후
간소엽(hepatic lobular)의 형태, 문맥삼분기(흰색 화살표), 및 중심 정맥(검정 화살표)가 보존된 조직학적 모습, E는 동결건조된 돼지 간 절편, F는 펩신을 이용한 가용화된 돼지 간 절편, G는 SSE로 코팅되지 않은 배양 접시, H는 SSE로 균일하게 코팅된 배양 접시, I는 SSE로 코팅되지 않은 배양 접시의 위상차 광학 현미경 (Olympus-CX31) 관찰 결과, J는 SSE로 코팅한 배양 접시의 위상차 광학 현미경 관찰 결과를 보여준다. 200x 배율, * p <0.05 (스케일 바 = 10 ㎛)
도 3은 가용화 각 단계에서의 추출물(스캐폴드의 가용화(SEx), 가용성 스캐폴드추출물의 원심분리(CEx) 및 여과(FEx)) 내 ECM 성분인 GAG(A), 콜라겐(B), 엘라스틴(C), 단백질(D)의 수준을 확인한 결과를 보여준다. *p<0.05, n= 4.
도 4는 2D 기판 코팅 물질로서 배양 접시를 SSE로 코팅한 결과를 보여준다. A는 각 군의 세포 부착 및 세포 생존율을 보여준다. *p<0.05 및 **p<0.005. B는 각 군의 세포 부착 및 세포 생존을 보여주는 이미지이다. 100x 배율, n=5 (스케일 바 = 5mm).
도 5는 SSE로 코팅된 접시에 각 농도의 SSE를 배양 배지에 첨가하여 mES 세포를 배양한 결과를 보여준다. A는 각 농도에서의 세포 생존율을 보여준다. *p<0.05 및 **p<0.005. B는 각 농도에서의 생존한 세포의 이미지를 보여준다. 100x 배율, n=3 (스케일 바 = 5mm).
도 6은 mES의 생체 스캐폴드와의 적합성을 보여준다. A는 스캐폴드 절편 위에 공동-배양한 mES를 H&E 및 DAPI 염색한 결과를 보여준다. 2 주차의 흰색 화살표는 일부 세포가 안으로 침투된 것을 가리킨다. B는 스캐폴드 절편 내부에 주입한 세포들을 H&E 및 DAPI 염색한 결과를 보여준다. 100x 배율 (스케일 바 = 5mm).
도 7은 탈세포화된 스캐폴드 절편의 생체 적합성을 보여준다. A는 CM-DIL로 표지된 mES를 스캐폴드 절편 내부에 주입한 후 획득한 이미지를 보여준다. (스케일 바 = 10 ?). B는 H&E 염색 후 간엽 내 세포의 분포 및 위치를 보여준다. C는 스캐폴드 절편 내부에 주입한 CM-DIL-표지 mES 세포들의 생존 및 분포에 대한 면역형광 이미지를 보여준다. (스케일 바 = 5mm). D는 스캐폴드 절편 내부에 주입한 CM-DIL-표지 mES 세포들의 세포 생존율을 정량한 결과를 보여준다. (n=5).
도 8은 3D 탈세포화된 생체 매트릭스 내부에 주입된 mES 세포들을 TUNEL 염색한 결과를 보여준다. A는 면역형광 이미지를 보여준다. 흰색 화살표는 녹색 형광을 띄는 세포사멸사된 세포를 가리킨다. (스케일 바 = 10 ?). B는 3D 탈세포화된 생체 매트릭스 내부에 주입된 세포들의 세포 사멸을 나타내는 세포사멸사 핵을 정량한 결과를 보여준다. (n=3).

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실험 방법 및 재료

간 획득 및 간 절편의 탈세포화

모든 절차는 강원대학교의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 승인되었다. 40kg 내지 50kg 무게의 성돈을 직접 도축하고 내장을 제거한 후, 간을 획득하였다. 공지된 프로토콜에 따라 탈세포화를 실시하였다. 간략하게, 획득한 간엽들을 분리하고, 조각 당 0.8 gm의 평균 무게와 1x1x0.5 cm 크기로 여러 개의 얇은 절편으로 손질하였다. 상기 절편들을 500 IU/l 농도의 헤파린(Chungwae Pharma Co., Seoul, Korea) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(P/S)을 함유한 1x PBS(phosphate buffered solution)로 진탕기를 이용하여 1 시간 동안 120rpm의 속도로 4℃에서 두 번 세척하였다. 또한, 상기 절편들을 0.1 % SDS(sodium dodecyl sulfate, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로 진탕기를 이용하여 72 시간 동안 120rpm의 속도로 4℃에서 탈세포화시켰다. 탈세포화 용액은 매 8 시간 마다 바꿔주었다. 최종적으로, 모든 절편들은 각각 1 % P/S를 함유한 PBS로 2 시간 동안 세 번씩 린스하여 ECM 내 잔류 SDS를 세정하였다.

탈세포화된 간 절편의 멸균 및 효율성 분석

공지된 프로토콜에 따라 탈세포화된 절편의 멸균을 실시하였다. 간략하게, 스캐폴드 절편을 0.1% 과산화아세트산 용액(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) 으로 2 시간 동안 처리하였다. 멸균제를 매 15 분 마다 바꿔준 후, PBS로 15 분 동안 8번 세척하였다. 멸균의 효율성을 평가하기 위하여, 상기 절편들은 4 주 동안 10% FBS가 보충된 DMEM의 일반적인 배지 조건하에 두고, 상기 배지는 매 48시간 마다 바꿔주었다. 배지 색깔의 황색으로의 변화 및 불투명도의 증가로 인해 알 수 있는 감염 또는 오염 징후에 대하여 정기적으로 확인하였다. 매 주마다 e-마이코 플러스 마이코플라즈마 PCR 검출 키트(iNtron biotechnology)를 이용하여 세균 오염을 확인하였다.

마우스 배아 줄기 세포의 배양

유지를 위하여, mES 세포들을 MEF 피더 세포로 처리된 미토마이신 C(Sigma, St. Louis, MO)로 배양하고, 약 4일 후 70% 컨플루언시 일 때 계대하였다. mES 배지는 15% KSR (Knock our serum, Gibco, Carlsbad, CA), 2 mM L-글루타민(Invitrogen, Carlsbad, CA), 1x 비필수 아미노산(Invitrogen, Carlsbad, CA), 0.1 mM 2-머캅토에탄올(Sigma, St. Louis, MO), 1,000 U/ml LIF(leukemia inhibitory factor, Chemicon), 및 0.5% 페니실린-스트렙토마이신(Gibco, Carlsbad, CA)이 보충된 DMEM(dulbecco? modified eagle medium, Welgene, Daegu, Korea)이다. 또한, 상기 mES 세포들은 0.1% 젤라틴으로 미리 코팅한 배양 접시를 이용하여 피더-프리 조건에서 배양 할 수 있다.

가용성 ECM(Solubilized ECM)의 제작

공지된 프로토콜을 변경하여 가용성 ECM을 제작하였다. 멸균한 간 절편을 48시간 동안 동결건조시키고, 그라인딩 밀을 이용하여 조분말(coarse powder) 상태로 분쇄하였다. 가공된 샘플을 1 ㎖ 염산(HCl, Sigma, St. Louis, MO) 당 10 ㎎ ECM 농도의 0.1M HCl로 분해시킨 후, 펩신을 처리하였다. 펩신(Sigma, St. Louis, MO)을 1 ㎎/㎖의 농도로 사용하였다. ECM 분말은 72 시간 동안 분해시키고 1M NaOH(Sigma, St. Louis, MO)를 첨가하여 pH 8.5로 중화시켰다. 중화 단계는 펩신 활성을 중단시키고, 상기 효소는 pH 6.0 이상에서 비활성화되며, pH 8.0 이상에서는 불안정하다. 이러한 가용화 단계에서, ECM 성분들을 검사하기 위하여 소량을 남기고 이를 가용성 추출물(SEx, solubilized extract)로 지칭하였다. 중화 이후, 상기 추출물을 1500 rpm에서 원심 분리하였으며, ECM 성분들을 검사하기 위하여 상기 결과물의 디브리스(debris) 및 상층액 소량을 획득하고 이를 원심분리된 추출물(CEx, centrifuged extract)로 지칭하였다. 또한, 0.2 ㎛ 주사기 필터(코닝)를 통해 여과하였으며, ECM 성분들을 검사하기 위하여 소량을 남기고 이를 여과된 추출물(FEx, filtered extract)로 지칭하였다. 펩신 분해를 포함해 모든 단계들은 멸균 조건 하 실온에서 실시되었다. 여과 후 얻어진 점성 용액을 가용성 스캐폴드추출물 (SSE, solubilized scaffold extracts)로 지칭하고, 1x PBS로 적당한 농도로 희석 하였다.

가용성 스캐폴드 추출물의 특성

가용화 과정 동안 가용화된 ECM이 상이한 ECM 성분과 단백질을 유지하는 지 확인하였다. 탈세포화된 스캐폴드 ECM는 GAG, 콜라겐, 엘라스틴 및 단백질로 구성되어 있기 때문에, 각 단계에서 이러한 주요 성분들에 대해 샘플들을 계산하였다. 따라서, 스캐폴드의 가용화 후(SEx), 가용성 스캐폴드 추출물의 원심분리(CEx) 후 및 0.2 ㎛의 필터를 통해 여과한 후(FEx)의 이 세 단계에서 샘플을 100 ㎕씩 수집하였다(N = 4).

가용화된 ECM 추출물 내 GAG 함량을, 제조업체의 지시에 따른 디메틸 메틸렌 블루 염료-결합 분석 키트 (Blyscan, Biocolor, Carrickfergus County Antrim, UK)를 이용하여 측정하였다. 간략하게, 각각 가용화된 ECM 추출물 시료 용해물(10 ㎎/ ml)로부터 100 ㎕을 분취하고, 상기 분취액에 디메틸 메틸렌 블루 1 ㎖을 첨가하여 30 분 동안 25℃에서 진탕교반하였다. 용액들을 10 분 동안 10,000 x g에서 원심 분리한 후, GAG 염료 복합체를 획득하고 상층액은 폐기하였다. 잔류 펠렛을 제공된 해리 시약 1 ㎖에 현탁하고, 655 nm 파장에서 흡광도를 판독하였다.

가용화된 ECM 추출물의 콜라겐 총 농도를, 제조업체의 지침에 따른 시리콜 콜라겐 염료-결합 분석 키트 (Biocolor, Carrickfergus, County Antrim, UK)를 이용하여 측정하였다. 간략하게, 중화된 ECM 추출물의 100 ㎕ 분취액에 냉분리 및 농축 시약을 첨가하였다. 상기 튜브를 4℃에서 하룻밤 배양한 후 원심 분리하였다. 이어서, 1 ㎖ 시리콜 염료 시약을 상기 펠릿에 첨가하고, 30 분 동안 25℃에서 배양하였다. 원심분리 후, 상기 펠릿을 산-염 세척 시약으로 세척하고, 알칼리 시약 1 ㎖로 현탁한 후, 540 nm 파장에서 흡광도를 판독하였다.

가용화된 ECM 추출물 내 엘라스틴 함량을, 제조업체의 지시에 따른 시리콜 파스틴 염료-결합 분석 키트(Blyscan, Biocolor, Carrickfergus County Antrim, UK)를 이용하여 측정하였다. 간략하게, 중화된 ECM 추출물의 100 ㎕ 분취액에 동일 부피의 엘라스틴 침전 시약을 첨가하였다. 상기 튜브를 10 분 동안 원심 분리한 후, 엘라스틴 침전물만을 남기고 비커에 상층액을 버렸다. 이어서, 1 ㎖ 시리콜 염료 시약을 상기 펠릿에 첨가하고, 90 분 동안 25℃에서 진탕교반하였다. 용액들을 10 분 동안 10,000 x g에서 원심 분리한 후, 엘라스틴 염료 복합체를 획득하고 상층액은 폐기하였다. 원심 분리 후, 잔류 펠렛을 염색 분리 시약 100 ㎕로 현탁하고, 513 nm 파장에서 흡광도를 판독하였다.

가용화 각 단계에서 유지된 단백질을 정량화하기 위해, 제조사(Bio-Rad)의 프로토콜에 따라 브래드포드(Barford) 어세이를 실시하였다. 간략하게, BSA(2, 1, 0.5, 0.25, 0 ㎎/㎖)로 상이한 표준 농도를 제조하였다. 브래드포드 시약을 DW로 1:4 비율로 희석하여, 각 웰의 표준(N = 3) 및 샘플 (N = 8) 10 ㎕에 200 ㎕씩 추가하였다. 흡광도는 ELISA 판독기를 이용하여 595 nm에서 판독하고, 각 샘플의 정확한 단백질 농도를 공식화하여 표준 곡선을 만들었다.

가용성 스캐폴드 추출물로 배양 접시 코팅

배양 접시의 코팅에 SSE를 적용하기에, 가장 적합한 농도를 mES 세포 배양에 최적화하였다. 1 ㎎/㎖ 및 6 ㎎/㎖의 농도에서의 SSE 추출물 코팅시 세포 부착 및 생존율을 비교하였다. 공지된 프로토콜을 변경한 방법을 이용하여 배양 접시를 코팅하였다. 상세하게는, 멸균 1x PBS를 이용하여 1 ㎎/㎖, 6 ㎎/㎖의 ECM 용액을 희석시키고, 300 ㎕/웰을 각 24-웰 세포 배양 플레이트에 첨가 하였다. 상기 용액을 약 2 일 동안 클린 벤치에서 공기-건조시켰다. 공기 건조 후, 안정화를 위하여 3 시간 동안 1% 글루타르 알데히드(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로 코팅을 가교결합(cross-linked)시켰다. 0.1% 젤라틴을 1 시간 동안 가교결합된 코팅 위에 두어서 상기 배양 접시에 피더 프리 mES 세포가 접착되도록 지지한다. 잔여 글루타르알데히드를 PBS로 세척하여 린스하였다. 최종적으로, 상기 박막을 기본 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium: DMEM)로 세척하여 잔류 글루타르 알데히드를 불활성화시킨다. 배양 접시의 코팅에 가장 적합한 방법을 선택하기 위하여, 상기 단계에 기반하여 다른 그룹들을 형성하였다. 간략하게, control군은 세포 부착에 대한 양성 대조군으로서, 0.1% 젤라틴으로만 코팅하여 세포 생존율을 확인하였다. 일반적으로, 피더 프리 조건 하의 mES 세포 배양은 세포 부착을 지지하도록 젤라틴 코팅을 필요로 한다. 따라서, 최종적으로 모든 그룹을 0.1% 젤라틴으로 코팅하여, 대조군과 동일한 조건을 유지하였다. A 군은 어떠한 글루타 알데하이드(glutaraldehyde) 처리 없이 2 일 동안 SSE로만 코팅하였다. B 군은 SSE로 코팅한 후, 1% 글루타르알데히드와 0.1% 젤라틴을 혼합하여, 1:1 비율로 함께 이용하였고, 코팅 물질의 가교결합을 향상시키기 위한 임의의 조합에 의한 효과가 있는지 여부와 생존율을 확인하였다. C 군의 모든 단계는 B 군과 유사하고, 1% 글루타르알데히드와 0.1% 젤라틴 처리를 분리하였다.

다른 코팅 방법으로 웰을 코팅한 후, 피더 프리 mES 세포들을 배양 배지에 웰 당 5 x 10⁴ 세포로 접종하였다. 배양 72 시간 후, 표준 프로토콜에 따라 MTT(시그마) 분석법을 이용하여 세포 생존율을 분석 하였다. 세포를 1x PBS로 세척하고, MTT 용액 (2 ㎎/㎖) 10 ㎕를 1x PBS에 첨가하여, 각 웰에 100 ㎕ 세포 현탁액을 4 시간 동안 두었다. 배지를 흡인하고, 200 ㎕ DMSO를 각 웰에 첨가하여 포르마잔을 용해하였다. 이어서 분광 광도계의 570 nm의 테스트 파장 및 630 nm의 기준 파장에서 흡광도를 기록하였다.

세포 생존율 분석

배양 배지에 적용될 수 SSE의 적절한 농도를 분석하였다. 배지 내 상이한 농도의 SSE에 노출시키는 조건하에서, mES 세포의 세포 생존율을 평가하였다. 간략하게, 이전의 실험에서 확인된, 코팅에 대한 적절한 SSE의 농도인 6 ㎎/㎖로 모든 배양 접시를 코팅하였다. 양성 대조군 그룹은 어떠한 SSE 없이 mES 배지만 함유하였고, 음성 대조군 그룹은 라텍스 분말이 있는 mES 배지를 함유하였다. 라텍스는 광범위한 세포 사멸 및 용해를 초래하는 강한 세포 독성 효과를 갖는 것으로 알려져 있으며, 일반적으로 세포 사멸사에 대한 대조군으로서 사용되었다. 세포를 채집하여, 계수하고 mES 배지에 재현탁하였다. 총 2.5 x 10⁴ 세포를 300 ㎕ 배지에 넣고 48 웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 동시에 농축된 SSE 30 ㎎/㎖을 각각의 웰에 0.06 ㎎/㎖, 0.3 ㎎/㎖, 1.2 ㎎/㎖, 및 3 ㎎/㎖ 농도로 첨가 하였다. 72 시간 동안 플레이트를 배양한 후, SSE 대한 세포 반응을 평가하였다. 배양 배지는 각 농도의 SSE를 첨가한 후 24 시간마다 바꿔주었다. 배양 후, 표준 프로토콜에 따라 MTT 분석법을 이용하여 세포 생존율을 분석하였다. 세포를 1x PBS로 세척하고, MTT 용액(2 ㎎/㎖) 10 ㎕를 각 웰에 첨가하여, 4 시간 동안 인큐베이션시켰다. 배지를 흡인하고, 200 ㎕ DMSO를 각 웰에 첨가하여 포르마잔을 용해하였다. 이어서 분광 광도계의 570 nm의 테스트 파장 및 630 nm의 기준 파장에서 흡광도를 기록하였다.

탈세포화된 바이오매트릭스(Biomatix)의 생체적합성

탈세포화된 절편의 적합성을 확인하기 위해, mES 세포를 절편된 스캐폴드 위에 공동-배양(co-culture)하거나, mES 세포를 절편 내로 주입하였다.

세포를 접종하기 전에, 스캐폴드 절편들을 원심분리하여 거품을 제거하고, DMEM 배지에 두어 밤새 중화시켰다. 공동-배양하는 동안, 처음 12 시간 동안은 24 웰 플레이트 당 200 ㎕ 배양 배지 하에 5x10⁴ 세포들을 스캐폴드 절편 위에 두었다. 소량의 배지를 이용하여 세포들의 분산을 방지하였다.

주입군에서는, 50 ㎕ 배지에 넣은 5x10⁴ 세포들을 0.5 ml U-100 인슐린 주사기(Braun, omnican 50)를 이용하여 절편의 중앙에 위치하도록 서서히 주입하였다. 상기 세포들의 누출 없이 스캐폴드 절편 내부에 배치되도록 미세하게 조정하였다. 또한, 이러한 절편들을 mES 배양 배지에서 4 주 동안 시험관 내 배양하고, H&E 및 DAPI 염색을 이용하여 세포 부착을 분석하였다. 상기 절편들을 10% 중성 완충 포르말린에 고정시키고, 각 샘플의 횡단면을 얻기 위해 파라핀 블록을 제작하였다. 또한, 섹션들을 H&E와 DAPI로 염색하여, 각 시점에서의 세포의 분포를 가시화하였다. 상기 실험으로부터, mES 세포가 4 주 동안 스캐폴드 절편 내에서 배양 될 수 있는지 여부가 해석되었다. 또한, 스캐폴드 내로 세포를 배치하기 위한 적절한 경로가 확인되었다.

또한, 소엽 내부의 세포 생존, 분포 및 위치를 확인하기 위해, 스캐폴드 절편 내로 주입하기 전에 mES 세포들을 CM-DIL으로 표지하였다. 시험관 내 배양 4 주 동안, 상기 절편들을 10% 중성 완충 포르말린에 고정시키고, 각 샘플의 종단면을 얻기 위해 파라핀 블록을 제작하였다. 다수의 샘플을 4 μm 섹션으로 절단하고, H&E와 DAPI로 염색하여, 세포 위치 및 생존을 관찰하였다.

TUNEL 염색에 의한 세포 사멸사의 측정

제조사(Roche)의 프로토콜에 따라 TUNEL 염색을 실시하여, 탈세포화된 스캐폴드 절편 내부에 4 주 동안 배양된 mES의 사멸 세포사를 분석하였다. 접종된(seeding) 스캐폴드의 파라핀 섹션을 자일렌을 이용하여 파라핀을 제거하고, 표준 프로토콜에 따라 구배된 에탄올에 재수화하였다. 이어서, 37℃에서 15 분 동안 단백질 분해 효소 K 워킹 용액(10-20 ug/ml in 10mM Tris/HCl, pH 7.4-8)으로 상기 섹션을 투과가능하도록 하였다. 또한, 섹션들을 37℃에서 60 분 동안 섹션 당 TUNEL 반응 혼합물 50 ㎕에 노출시켰다. 사용 직전에 효소 용액 50 ㎕과 표지 용액 450 ㎕로 구성하여 제조하고, 완전히 반응시켰다. 세포사멸사된 세포를 염색한 후, 상기 섹션들을 DAPI로 대조염색하고, 형광 현미경으로 관찰하였다. 각 섹션에서 세포사멸사된 세포의 비율은 TUNEL 염색된 녹색 형광 세포를 통해 정량화하고, 총 세포 수는 DAPI 염색된 세포를 통해 정량화하였다. 각 시점에서 죽은 세포들의 백분율 정량화를 위해, 세 가지 다른 스캐폴드 샘플을 다른 섹션들(n = 3)로 사용 하였다. 염색된 세포 수는 이미지 J 소프트웨어(NIH)를 이용하여 계수하였다.

조직학적 염색

접종된 스캐폴드의 조직학적 형광 표지를 위해, 표준 프로토콜에 따라 절편들을 포르말린-고정시키고, 파라핀-포매한 후, 절편화하였다. 샘플을 4 μm의 섹션으로 절단하여 슬라이드에 고정시켰다. 이어서, 섹션을 50 분 동안 60℃에서 두어 파라핀을 제거하고, 각각 세 번씩 100 % 자일렌으로 20분 동안 처리하였다. 섹션들을 구배된 에탄올(100 %, 95 %, 95 %, 80 %, 70 % 및 50 %)로 재수화 하였다. 또한, 섹션을 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하여 세포 부착 위치를 평가하였다. 세포 생존율을 확인하기 위해, 섹션들을 Fluoroshield(Sigma), DAPI 염색 용액을 이용하여 염색하였다.

통계 분석

Two-tailed student's t-test를 이용하여, 평균값 ± 표준 편차로서 표현된 결과 간의 유의성 있는 차이를 평가하였다, * p 값 <0.05, ** p 값 <0.005은 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다. 세포 수는 이미지 J 소프트웨어(NIH)를 이용하여 계수하였다.

실시예 1. 멸균된 절편의 효율성

4 주간의 배양 기간 동안 감염에 대한 임의의 징후의 부재로써 정량적으로 멸균 효율을 측정하였다; 오염은 배양 배지의 지시색 변화 및 불투명도에 의해 표시되었다(도 1A). e-마이코 플러스 마이코플라즈마 PCR 검출 키트(iNtron biotechnology)를 이용하여 매 주마다 RNA 수준에서의 세균 오염에 대하여 스캐폴드 절편을 분석하였다. PCR과 전기 영동 후, 멸균된 스캐폴드 절편에서는 세균 오염에 대한 어떠한 타겟 밴드도 나타나지 않았다. 양성 대조군은 키트에서 제공되었고, 음성 대조군은 배지로 이용하였다(도 1B). 모든 처리된 스캐폴드 샘플은 세균 오염의 징후 및 배지 착색에 대한 어떠한 변화도 나타나지 않아 성공적으로 절편이 멸균되었음을 보여주었다. 이는 생체 적합성 평가를 위한 mES 세포와 탈세포화된 스캐폴드 절편의 추가적인 응용을 의미한다.

실시예 2. 탈세포화된 간 매트릭스-유래의 가용성 SSE

도 2A는 탈세포화를 실시하기 전의 돼지 간 절편의 모습을 보여준다. 도 2b는 72 시간 동안 0.1% SDS로 탈세포화를 실시한 후의 돼지 간 절편의 모습을 보여준다. 탈세포화된 돼지 간 절편의 조직학적 이미지(도 2D)는 천연 간(도 2C)과 비교하여 벌집 형상의 결합조직이 잘 보존되어 있을 뿐만 아니라 어떠한 세포질 또는 핵 염색이 되지 않았다. 탈세포화된 절편을 48 시간 동안 동결 건조하여 용이하게 분말로 만들었다(도 2E). 또한, 펩신을 이용하여 상기 분말을 균질 용액에 용해시켜서, 스캐폴드 추출물(SEx)(도 2F)로 만들었다. 이어서, 원심 분리 및 여과하여 최종적으로 가용성 스캐폴드추출물(SSE)을 획득하고, 균일하게 2D 기판의 배양 접시를 코팅하였다(도 2H). 도 2H는 표면을 코팅하지 않은 대조군을 나타낸다. 코팅시키지 않은 일반 접시와 비교하여, 추출물의 얇은 단층을 현미경으로 관찰하였다(도 2I, J). 또한, 이러한 SSE는 가용화의 다른 단계에서의 상이한 ECM 성분을 특성화하여 ECM 성분의 지속가능성을 확인하였다.

실시예 3. 가용성 스캐폴드 추출물의 생화학적 특성

스캐폴드 내부에 존재하는 ECM 성분은 세포의 생존과 증식에 중요하다. 따라서, 가용화 과정 동안 상이한 ECM 성분들의 유지에 대하여 SSE를 평가 하였다. 스캐폴드의 가용화 후(SEx), 스캐폴드 추출물의 원심분리후(CEx), 및 0.2 ㎛의 필터를 통해 여과한 후(FEx)의 세 가지 단계에서의 ECM 및 단백질들을 정량하였다. 모든 ECM 성분들을 천연 간을 기준으로 정규화하여 백분율로 나타내었다. 천연 간과 비교하여, 탈세포화된 간 스캐폴드는 탈세포화 프로토콜로 인하여 낮은 ECM 성분 및 단백질을 갖는다. 탈세포화된 스캐폴드 내 GAG, 엘라스틴 및 총 단백질의 양은 모든 SSE 진행 단계(SEx, CEx, FEx) 동안 유지되었다(도 3a, c, d). 반면, 콜라겐은 1.31 ± 9.16 %에서 0.56 ± 11.79 %로 여과 후 약간의 감소를 보였다. 이는 스캐폴드 내 존재하는 콜라겐과 공유 가교결합(cross-linked)하는 불용성 콜라겐의 여과로 인한 것일 수 있다. 이것은 SSE가 세포 부착과 생존에 중요한 역할을 하는 ECM 성분을 유지한다는 것을 나타낸다. 콜라겐을 세포 배양 및 분화를 위한 2D 코팅 및 3D 코팅 재료로서 적용하는 것은 잘 알려져 있다. 따라서, 상이한 ECM 성분을 포함하는 SSE는 mES 세포의 부착 및 생존을 지지할 수 있는 것으로 예측되었다. 또한, 스캐폴드 절편에 존재하는 ECM 성분은 세포의 부착, 생존, 및 증식을 인도하는 역할을 한다. 따라서, 스캐폴드 절편을 펩신 분해를 이용하여 가용화하고, 각 단계에서의 ECM 성분의 손실을 확인하였다. 본 탈세포화 프로토콜이 천연 조직에 대해 상대적으로 단백질 및 ECM 함량을 감소시킨 것으로 보이지만, 세포 내 DNA 성분이 제거된 반면, 여전히 많은 성분을 보유하고 있다. 가용화 처리는 0.2㎛의 필터를 통해 여과했음에도 불구하고, 여전히 최종 단계까지 엘라스틴, GAG, 콜라겐을 유지할 수 있었다. 모든 ECM 성분들 중, 엘라스틴은 최대로 유지되었고, 콜라겐은 소량이 여과 후(FEx) 소실되었다. 엘라스틴은 세포의 행동, 및 단독으로 또는 다른 분자와의 결합을 통해 세포외 기질 생산에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 또한, 이는 기준 콜라겐 코팅에 비해 인간-엘라스틴 유사 폴리펩타이드의 높은 접착성, 증식 및 분화를 보여주는 근아세포(myoblast)의 증거이다. 스캐폴드 내 존재하는 GAG는 성장 인자의 유지를 지지해준다. 따라서, 가용화 ECM 및 단백질의 존재는 2D 기판 코팅에 있어서 세포 내 부착에 대한 중요한 매개일 수 있다. 또한, SSE를 배양 접시의 코팅에 적용하여 mES의 세포 부착 및 생존을 분석 하였다.

실시예 4. 2D 기판 코팅 물질로서 가용성 스캐폴드 추출물

2D 기판 코팅 물질로서 SSE를 테스트하기 위해, 탈세포화된 스캐폴드 절편들을 펩신으로 효소적 분해를 이용하여 액상 형태로 가용화하였다. 적절한 코팅 농도를 얻기 위해, 1x PBS를 이용하여 1 ㎎/㎖과 6 ㎎/㎖로 희석하였다. 코팅 방법을 정립하기 위하여, 별개의 조성물을 적용하여 다른 그룹을 만들었다. C 군에서, 107.82 ± 12.12 %를 나타낸 1 ㎎/㎖ 농도일 때와 대조군에 비해, 6 ㎎/㎖ 농도일 때 168.45 ± 25.6 %의 가장 높은 세포 생존 비율을 보였다. 상기 결과는 6 ㎎/㎖ 농도가 접시 코팅시 가장 적합한 농도이고, SSE의 가교결합을 위해 별도로 1 % 글루타르알데히드를 처리한 C군은 1 ㎎/㎖ 농도 및 다른 군들에 비해 높은 세포 생존율을 나타냈다(도 4a). 1 % 글루타르알데히드와 0.1 % 젤라틴을 1:1 로 혼합한 SSE로 코팅한 B 군의 mES 세포들은 1 ㎎/㎖ (106.31 ± 9.41%) 및 6 ㎎/㎖(114.86 ±25.92%) 농도 모두에서 대조군과 비교하여 유사한 세포 생존율을 나타냈다. 이는 mES 세포 배양을 위한 높은 호환성을 보여준다. 일반적인 0.1 % 젤라틴 코팅 접시의 mES 세포를 함유하는 대조군은 100%로 나타내었다. A 군에서, mES 세포는 1 ㎎/㎖(26.14 ± 10.59%), 6 ㎎/㎖(27.15 ± 10.1%) 농도 모두에서 가장 낮은 세포 부착율을 나타냈다; 이는 mES 세포의 배양 기간 동안 배지 내 SSE 코팅의 느린 분리가 원인일 수 있다. 배양 접시에 SSE를 코팅하는 경우, 1% 글루타알데하이드 처리가 SSE만 코팅한 경우에 비해 SSE의 가교결합에 도움이 된다는 것을 알 수 있었다. SSE만 코팅한 경우, 배양 기간 동안 접시로부터 느리게 분리되는 동시에 낮은 세포 부착율을 나타냈다. 따라서, SSE로 코팅한 후 별도로 1% 글루타르알데히드를 0.1 % 젤라틴과 함께 적용하는 것이, 다른 코팅 방법과 비교하여 가장 높은 세포 생존율을 보여 주었다. 이는 글루타르알데히드 분자 당 탄화수소쇄(longer, flexible hydrocarbon chain)를 갖는 2 개의 알데히드기로 구성되어 있기 때문이다. 1 개의 글루타르알데히드 분자의 알데히드기 모두는 단백질과 반응하여 가교결합을 형성한다. 이러한 가교결합은 세포 배양 동안 SSE가 배양 접시에 접착된 상태를 유지하도록 지지해준다. 이미지들은 각 그룹의 세포의 포화 상태 및 생존 세포들을 보여준다(도 4b). 이러한 결과들은 SSE를 6 ㎎/㎖의 농도로 접시에 코팅하고, SSE에 존재하는 단백질의 가교결합을 위하여 별도로 1 % 글루타르알데히드를 이용하여 적용될 수 있다는 것을 가리킨다. 그러므로, 6 ㎎/㎖의 SSE는 피더 층이 없는 mES 세포 배양을 위한 2D 코팅 기판에 가장 적합하다는 것을 나타냈다.

실시예 5. 가용성 스캐폴드 추출물-조건 배지에서의 mES 세포 생존율

접시 코팅에 적합한 농도를 확인한 후, mES 배양 배지 내 SSE의 농도에 대해 분석하였다. 추출물의 농도를 증가시키기 위해, 6 ㎎/㎖의 SSE를 동결 건조하고, 배지 내 최종 농도 30 ㎎/㎖이 되도록 1x PBS로 용해시켰다. 72 시간 처리 후, MTT 분석을 실시하여 세포 생존율을 확인하였다. 배지에만 노출된 mES에 비해, 0.06 ㎎/㎖의 SSE-조건 배지에 노출된 세포는 유의하게 높은 세포 생존율을 나타냈다(115.2 ± 2.98%). 비록 0.3 ㎎/㎖(115.8 ± 10.55 %)에서 대조군에 비해 유의한 차이점이 관찰되지 않았지만, 유사한 세포 생존율을 나타내었다(도 5a).

배지 내 0.3 ㎎/㎖ 농도까지의 SSE는 mES 배양 배지에 적용할 수 있으나, 0.3 ㎎/㎖ 농도 이상의 SSE는 세포독성으로 인하여 낮은 세포 생존율을 나타내었다. 대조군은 SSE로만 코팅한 접시 상에 mES를 함유하고, 상기 대조군의 세포 생존율을 100 %으로 하였고, 음성 대조군은 세포 독성을 나타내는 라텍스 분말로 처리한 mES를 함유한다. 72 시간 후, 상이한 농도의 SSE-조건 배지를 함유한 그룹들의 부착 세포 및 생존 세포들의 이미지를 획득하였다(도 5b). 이는 0.3 ㎎/㎖ 농도 이하의 SSE는 mES 배양 배지에 적용할 수 있고, SSE 코팅된 기판에 접종된 mES 세포에 대해 높은 호환성을 나타낸다는 것을 의미한다.

실시예 6. 탈세포화된 스캐폴드 절편의 생체 적합성 평가

2D 코팅 기질으로서의 탈세포화된 절편을 확인한 후, 접종된 mES 세포와의 생체 적합성을 평가하였다. 스캐폴드 절편 상의 접착 및 생존에 대한 적합성에 있어 접종된 세포들의 효과를 연구하기 위해, mES 세포들을 스캐폴드 절편 위에 접종하거나, 절편 내로 주입하였다. 4 주 배양 기간 동안의 세포의 생존율을 조사하기 위해 횡단면을 제작하여 각각 다른 시점에서 염색하였다. 조직학적 염색은 공동-배양된 절편 세포들이 남아서 접착하고 스캐폴드의 표면 전체에 분포되어 있다는 것을 보여준다(도 6a). 2 주 차에, 접종된 세포가 표면에서 내부 소엽(interior lobules)으로의 이동하였다(도 6a-b, f). 이러한 내부 소엽으로의 이동에 대한 증거는 mES 세포가 스캐폴드 절편에 적합하다는 것을 나타냈다. 이전의 연구에서, 생체스캐폴드 상에서의 세포 이동 및 증식이 보고된 바 있으나, 본 발명자들은 탈세포화된 생체매트릭스(biomatix) 상의 만능 줄기 세포(mES)의 생체 적합성을 확인하였다. 이는 만능 줄기 세포 등 다양한 세포 소스에 대한 탈세포화 생체매트릭스를 넓게 적용시킨다. 또한, mES를 스캐폴드 절편 내로 주입했을 때, mES 세포는 생존하였다(도 6b). H&E 및 DAPI 이미지는, 스캐폴드 절편에 mES를 주입했을 때, 4 주 동안 세포의 상당수가 부착을 유지하고 생존한다는 것을 보여준다. 절편 내로 주입된 세포들은 4 주까지 부착을 유지하면서 생존하고, 공동-배양된 군의 일부 세포는 분리되어 접시의 바닥으로 이동한 것이 관찰되었다. 이는, 배치 및 최종적인 세포 수를 유지하는데 적합한 경로가 절편 내 주입이라는 것을 의미한다. 또한, 스캐폴드 절편은 3 차원의 천연적인 미세 환경을 구현한다. 본 연구에서, 본 발명자들은 mES 세포가 다능성 및 세 가지 생식 계통으로의 분화능을 갖기 때문에, mES 세포를 이용하였다.

현재 조직 공학 및 재생 의학의 연구는 천연 환경의 구조, 형태, 화학적 신호 및 생물학적 신호에 생체 적합적이고, 구현하는 스캐폴드 물질에 초점이 맞춰져 있다. 3D 생체적합성 탈세포화된 스캐폴드 절편의 장점 중 하나는 생체 고유의 미세 환경을 구현하고, 또한 세포 간 상호작용 및 기질 상호작용을 촉진하는 데 이용된다는 것이다. 또한, 스캐폴드 추출물은 세포 배양 및 기능을 유지하는 데 도움이 될 수 있는 성장 인자를 함유하고 있다. 따라서, 세포를 스캐폴드 절편에 주입할 때, 세포의 분포, 위치 및 생존율을 분석하였다. CM-DIL 표지된 mES 세포를 절편 내로 주입하고, 4 주 동안 mES 배지에서 배양하였다(도 7a). 상기 스캐폴드 절편을 종단면으로 절단한 완벽한 엽(lobes)을 H&E 및 DAPI 염색으로 염색하여 주사 부위에서부터의 세포 분포를 관찰하였다. mES 세포들은 혈관을 향해 위치하고, 밀집하는 것으로 나타났다(도 7b 패널 a-d). 이는, 혈관에 남아있는 세포 부착 및 위치를 지지하는 콜라겐의 높은 수준으로 인한 것일 수 있다. 또한, CM-DIL의 형광 이미지로 간 소엽 내 mES 세포의 분포와 위치를 확인하였다(도 7c). 병합된 이미지는 스캐폴드 절편 내부의 높은 세포 생존율(80-87%)을 보여 준다(도 7d). 또한, 절편을 TUNEL 염색으로 분석하여 세포 사멸사 핵(apoptotic nuclei)을 정량화하였다. 키트 내 표준 프로토콜에 따라, 세포 사멸사한 세포는 형광 현미경에서 녹색으로 나타났다(도 8a 패널 e-h). 정량화된 세포 사멸사 핵은 죽은 세포의 평균 11~15%로 나타났다(도 8b). 따라서, 적은 수의 세포가 세포 사멸하였고, 다수의 세포가 살아 남아 있음을 확인하였다. 그러므로, 스캐폴드 절편 내로 주입한 세포가 4 주 동안 생존을 유지하고, 스캐폴드 내부에서 배양될 수 있는 것으로 해석 할 수 있다. 요컨대, 이러한 증거는 탈세포화를 통해 획득된 3D 생체 매트릭스가 mES 세포 배양에 높은 생체 적합성을 갖는다는 것을 의미한다.

Claims

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탈세포화된 간(liver) 조직 유래의 생체적합성 가용화 스캐폴드 추출물(Biocompatible Solubilized Scaffold Extract), 글루타르알데히드(glutaraldehyde) 및 젤라틴을 포함하는, 줄기세포 배양 또는 분화를 위한 배양 용기 코팅용 조성물.
제 8 항에 있어서, 상기 탈세포화된 간 조직 유래의 생체적합성 가용화 스캐폴드 추출물(Biocompatible Solubilized Scaffold Extract)은 다음 단계에 따라 제조된 것을 특징으로 하는 조성물:
(a) 간 조직을 탈세포화(decellularization)하는 단계;
(b) 상기 탈세포화된 간 조직으로부터 세포외 기질(ECM, Extracellular Matrix)을 수득하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계의 ECM을 동결건조 후 분쇄하여 분말을 형성하는 단계;
(d) 상기 (c) 단계의 분말에 산용액을 첨가하여 산추출한 산가용성 추출물을 수득하는 단계;
(e) 상기 (d) 단계의 산가용성 추출물에 펩신을 첨가하여 분해한 펩신 가용화 추출물을 수득하는 단계;
(f) 상기 (e) 단계의 펩신 가용화 추출물을 중화하여 가용성 추출물(SEx, solubilized extract)을 수득하는 단계;
(g) 상기 (f) 단계의 가용성 추출물(SEx, solubilized extract)을 원심분리하여 원심분리된 추출물(CEx, centrifuged extract)을 수득하는 단계; 및
(h) 상기 (g) 단계의 원심분리된 추출물(CEx, centrifuged extract)을 여과하여 여과된 추출물(FEx, filtered extract)인 생체적합성 가용화 스캐폴드 추출물(SSE, solubilized scaffold extract)을 수득하는 단계.
제 9 항에 있어서, 상기 (a) 단계의 간 조직은 포유류로부터 분리된 조직인 것을 특징으로 하는 조성물.
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제 8 항에 있어서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포, 골수유래 줄기세포, 지방유래줄기세포, 태반유래 줄기세포 및 유도 만능 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 8 항에 있어서, 상기 가용화 스캐폴드 추출물의 농도는 0.1 ㎎/㎖ 내지 10 ㎎/㎖인 것을 특징으로 하는 조성물.