CN114340687A - 无洗涤剂去细胞化细胞外基质的制备方法和3d打印用生物墨水 - Google Patents

无洗涤剂去细胞化细胞外基质的制备方法和3d打印用生物墨水 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种无洗涤剂去细胞化ECM的制备方法、粉末形式和液体形式的无洗涤剂去细胞化ECM、初级生物墨水的制备方法、初级生物墨水、脉管生物墨水的制备方法、脉管生物墨水、包含初级生物墨水和/或脉管生物墨水的三维结构和该三维结构的制备方法。

Description

无洗涤剂去细胞化细胞外基质的制备方法和3D打印用生物 墨水
技术领域
本发明涉及一种无洗涤剂去细胞化ECM的制备方法、粉末形式和液体形式的无洗涤剂去细胞化ECM、初级(primary)生物墨水的制备方法、初级生物墨水、脉管(vascular)生物墨水的制备方法、脉管生物墨水、包含初级生物墨水和/或脉管生物墨水的三维结构和该三维结构的制备方法。
背景技术
生物打印能够自动沉积活细胞和其他成分，以形成三维(3D)组织结构体。生物墨水制剂由不同来源产生，包括合成聚合物和天然聚合物，如胶原、明胶、海藻酸盐、透明质酸、纤维蛋白和聚乙二醇。众所周知，用于生物打印的基质材料不能代表自然细胞外基质(ECM)的复杂性，ECM构成细胞的微环境，并且可以调节细胞过程，包括迁移、分化和其他功能。因此，生物墨水中ECM的存在被认为有利于重建具有细胞-细胞连接的微环境。
国际专利申请WO2017014582揭示了一种生物墨水组合物，其包含0.05至60×106/mL细胞、0.1至10w/v％细胞载体材料、0.01至1w/v％增粘剂、1至30v/v％润滑剂和0.1至10w/v％结构材料。生物墨水组合物可进一步包含组织源性成分材料。优选地，细胞载体材料为明胶或胶原，增粘剂为透明质酸或葡聚糖，润滑剂为甘油，结构材料为纤维蛋白原或甲基丙烯酸明胶(GelMa)。
文献包括许多关于选择具有最佳性质的适当生物墨水组合物用于组织工程应用的问题的出版物。Mohamed Ali等人开展了有关基于衍生自肾脏的去细胞化ECM(dECM)的生物墨水的生产的工作[1]。使用0.5M乙酸和0.1mg/mL胃蛋白酶，采用溶解法获得相对低浓度(1％至3％)的dECM水凝胶。另外，通过添加光引发剂(Irgacure)对dECM进行甲基丙烯酸化处理。
随后的研究小组试图使用添加甲基丙烯酸明胶(GelMa)和光引发剂(即LAP)(苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰亚膦酸锂)的ECM获得生物墨水[2]。另一些人使用以相对高浓度的胃蛋白酶获得的dECM水凝胶，添加聚己内酯(PCL)作为保存合成剂[3]。
专利说明KR20180125776描述了一种包含dECM粉末和水凝胶的生物墨水组合物。dECM粉末可选自肝组织、心脏组织、软骨组织、骨组织、脂肪组织、肌肉组织、皮肤组织、粘膜上皮组织、羊膜组织或角膜组织。优选地，dECM粉末的粒径为0.05μm至100μm。水凝胶可包含选自由明胶、透明质酸、葡聚糖和胶原组成的组的一种或多种。
Falguni等人(2014)开发了组织特异性dECM生物墨水，包含脂肪、软骨和心脏组织，能够为细胞植入、存活和长期功能提供关键线索。生物打印方法能够重建固有的细胞形态和功能。通过有组织的空间模式和组织特异性基因表达，观察到打印细胞结构体的高阶组装。方法论的关键优势是应用组织特异性ECM，为细胞植入、存活和长期功能提供关键线索[3]。
许多研究小组已经对涉及器官去细胞化以获得dECM作为生物墨水成分的实验进行了研究[4，5，7]。各种物质用于去细胞化，主要是Triton X-100和/或十二烷基硫酸酯(SDS)洗涤剂。KR1020180011607A中描述了一种肝脏去细胞化方法，其中肝组织用含有表面活性剂和超活性溶液的去饱和溶液处理。0.5％的Triton X-100(Triton X-100)可用作表面活性剂。
Mohamed Ali及其同事构建了包含ECM源性生物墨水的光交联肾脏[1]。猪的整个肾脏通过灌注法去细胞化，溶解在酸性溶液中，并通过甲基丙烯酸进行化学修饰。结果表明，生物打印的人肾细胞具有很高的存活率，并随着时间的推移而成熟。此外，生物打印的肾脏结构体显示了天然肾组织的结构和功能特征。组织特异性ECM源性生物墨水可增强细胞成熟并最终增强组织形成。
Mirmalek-Sani等人(2013年)介绍了猪胰腺的去细胞化过程，以创建人类干细胞和猪胰岛的支架。细胞材料被有效去除，同时保留ECM蛋白和天然脉管系统。此外，研究表明，去细胞化的胰腺可支持细胞粘附和细胞功能的维持[6]。
发明内容
本发明的目的是提供一种可用于生物打印的无洗涤剂dECM。文献数据未提供关于通过去细胞化获得的ECM中洗涤剂残留量或其含量测定方法的结果。在先前公布的各种组织去细胞化程序中，去除洗涤剂的阶段相对较短。据认为，dECM中不含洗涤剂会实质上影响所获得dECM的质量。申请人开发的流程允许去除几乎所有的洗涤剂，而无需添加其他化学品。本发明的第二个目的是获得具有适当稠度(consistency)和粘度的生物墨水，而无需添加粘度增强剂。
在第一方面中，提供一种无洗涤剂去细胞化细胞外基质(dECM)的制备方法，所述方法包括以下步骤：
-将选自胰腺、肝脏、肾脏、心脏、皮肤、肺、大肠、小肠、动脉和静脉、脂肪组织和胎盘中的动物源性器官通过机械破碎，优选通过机械挤压，其中器官与动物的身体是分开的；
-在优选包含1×磷酸盐缓冲盐水(PBS)的缓冲洗涤剂溶液中温育碎片(fragmented)器官，其中缓冲洗涤剂溶液包含0.5％至1.5％优选1％(v/v)的辛苯昔醇-9，其中洗涤剂溶液补充有抗微生物剂，优选链霉素，优选浓度为0.01％(w/v)，并且温育在搅拌的条件下在低于室温优选为4℃的温度进行至少72小时，其中每4至12小时将碎片器官转移到新鲜洗涤剂溶液中；
-在优选包含1×PBS的第一缓冲洗涤溶液中温育碎片器官，其中第一缓冲洗涤溶液包含抗微生物剂，优选链霉素，优选浓度为0.01％(w/v)，温育在搅拌的条件下在低于室温、优选为4℃的温度进行至少72小时，其中每4至12小时将碎片器官转移到新鲜洗涤溶液中；
-在包含DNA酶的脱氧核糖核酸酶溶液中温育碎片器官，优选浓度为0.0001％至0.0003％(w/v)，最优选浓度为0.0002％(w/v)，优选在适合DNA酶性能的温度温育至少8小时；
-在优选包含1×PBS的第二缓冲洗涤溶液中温育碎片器官，其中第二缓冲洗涤溶液包含抗微生物剂，优选链霉素，优选浓度为0.01％(w/v)，温育在搅拌的条件下在低于室温，优选为4℃的温度进行至少72小时，其中每4至12小时将碎片器官转移到新鲜洗涤溶液中；
-冷冻碎片器官并将冷冻的碎片器官压成碎片；
-将冷冻的碎片器官优选在-32℃，优选在0.31mbar(31Pa)的压力下冷冻干燥；
-在0.0010mbar(0.1Pa)且-76℃进行5至15分钟的可选的最终干燥；
-将经压碎并干燥的产品研磨成25μm至500μm的dECM粉末；
-可选灭菌产品，优选通过辐射和/或环氧乙烷进行。
器官的机械破碎增强了从器官中去除洗涤剂的能力，并产生了脂肪含量较低的产品，从而改善了最终产品的性能，即增加了粘度并改善了适印性。添加DNA酶对于去除动物来源器官的DNA至关重要。如果得到的打印三维结构包含具有DNA的dECM，则不能进一步用于移植实验。
优选地，研磨步骤之后是检查dECM粉末中辛苯昔醇-9的量的步骤，其中优选在检查dECM粉末中辛苯昔醇-9的存在之前，将粉末用胶原酶处理，优选浓度为至少43,953PZ/gdECM。
优选地，研磨步骤之后是以下步骤：
-将dECM粉末溶解在盐酸溶液中，溶液优选为0.01M，补充有0mg/ml至10mg/ml的胃蛋白酶；
-于室温混合48小时至72小时，优选72小时；
-在冰上中和，优选使用0.1M钠基和PBS溶液。
在第二方面中，提供一种粉末形式的无洗涤剂去细胞化ECM，其能够通过无洗涤剂去细胞化细胞外基质(dECM)的制备方法获得。优选地，dECM粉末是无菌的。如有必要，可通过辐射灭菌或环氧乙烷灭菌对粉末进行灭菌。
在第三方面中，提供一种溶液形式的无洗涤剂去细胞化ECM，其能够通过无洗涤剂去细胞化细胞外基质(dECM)的制备方法获得。
在第四方面中，提供一种初级生物墨水的制备方法，所述方法包括以下步骤：
-通过混合制备包含5％至50％(w/v)、优选15％至25％(w/v)的根据本发明第一方面的dECM粉末和1％至10％(w/v)、优选8％至10％(w/v)的根据本发明第三方面的dECM溶液的糊料；
-在7℃至10℃的温度温育糊料至少24小时；
-添加1.46％至7.32％(w/v)的甲基丙烯酸明胶、0.15％至1.10％(w/v)的甲基丙烯酸透明质酸、5％至10％(w/v)的甘油，和光引发剂，优选0.03％至0.17％(w/v)的苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰亚膦酸(phosphinate)锂，然后轻柔混合。
由于dECM粉末最初是通过冷冻干燥制备的，之后不会溶解，因此它保留了ECM的整个四级结构。因此，使用糊料形式的dECM(包括dECM粉末和dECM溶液二者)使初级生物墨水具有适当的稠度，并且由于dECM粉末未溶解在初级生物墨水中，因此保留ECM的整个四级结构。
在第五方面中，提供初级生物墨水，其包含dECM糊料和1.46％至7.32％(w/v)的甲基丙烯酸明胶，0.15％至1.10％(w/v)的甲基丙烯酸透明质酸，5％至10％(w/v)的甘油，和光引发剂，优选0.03％至0.17％(w/v)的苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰亚膦酸锂，其中dECM糊料包含5％至50％(w/v)、优选15％至25％(w/v)的根据本发明第二方面的dECM粉末，和1％至10％(w/v)、优选8％至10％(w/v)的根据本发明第三方面的dECM溶液，并且其中初级生物墨水的粘度在锥板系统中，以21/s的恒定剪切速率和37℃的温度测量为至少5Pa·s。
dECM的使用能够复制机体的细胞外条件，因此提供具有天然组织特征的生物打印，从而刺激细胞分化并提高其存活率。此外，细胞外基质对于通过在33℃至37℃温度范围内的热交联的额外可能性来获得适当的生物墨水粘度并维持打印结构体的稳定三维结构是必要的。
与使用对初级生物墨水中的细胞有毒的化学品的化学交联相比，使用光引发剂可以实现对细胞无毒的交联。和热交联相比，使用光引发剂和可见光进行交联可将细胞DNA损伤降至最低。温度和光线二者均对细胞都有负面影响，导致DNA损伤。然而，当采用可见光交联时，这些变化保持在最低限度。
甲基丙烯酸明胶(GelMa)用于打印结构体的成型。另外，它将微丝聚集在一起，以防止小叶分层，并提高细胞和胰岛的活力。与明胶相比，GelMa在更高的温度是稳定的，这在热交联期间是有益的。
甲基丙烯酸透明质酸(HAMA)通过交联有助于维持三维结构。另外，HAMA提供打印细丝的平滑度、丝滑度、均匀性，并支持细胞培养物。这些特征不能通过添加未甲基丙烯酸化的透明质酸获得。
甘油的使用改善了细胞和胰岛的功能。它还提高了生物墨水的润滑性，能够形成连续的细丝，改善了注射器或混合器中生物墨水成分的混合，并降低了打印过程中的压力消耗。
优选地，初级生物墨水包含至少一种选自以下的添加剂：浓度为0.001至0.100mg/mL生物墨水、优选0.007mg/mL生物墨水的透明质酸，浓度为0.005至0.100mg/mL生物墨水、优选0.084mg/mL生物墨水的层粘连蛋白，浓度为0.001至0.100mg/mL生物墨水、优选0.041mg/mL生物墨水的胶原I，浓度为0.005至0.175mg/mL生物墨水、优选0.122mg/mL生物墨水的胶原IV，浓度为3至300μg/mL、优选100μg/mL的纤维连接蛋白，浓度为10至100mg/mL生物墨水的人纤维蛋白酶原，浓度为1至2EPU/mL生物墨水的抑肽酶，浓度为0.05至2mg/mL生物墨水的聚山梨醇酯，浓度为5至55mg/mL生物墨水的人凝血酶，浓度为20至60mM/mL生物墨水的氯化钙；促血管生成的维生素：浓度为1nM至500μM、优选100μM的维生素A，浓度为50μM至100μM、优选100μM的维生素B1，浓度为1μM至10μM、优选10μM的维生素B3，浓度为10至100mg/mL生物墨水的维生素B12，浓度为0.1nM至10nM、优选10nM的维生素D3；支持血管生成的生长因子：浓度为10至30ng/mL生物墨水、优选30ng/mL生物墨水的VEGF，浓度为10至20ng/mL生物墨水、优选20ng/mL生物墨水的FGF，浓度为1至10ng/mL生物墨水、可选20ng/mL生物墨水的TGF-β，浓度为0至100ng/mL生物墨水、优选10ng/mL生物墨水的白细胞介素(IL)-8，浓度为20至50ng/mL生物墨水、优选20ng/mL生物墨水的IL-17A。
商用添加剂，如透明质酸、I型和IV型胶原以及层粘连蛋白，进一步改善打印三维结构的功能性。
维生素A-ATRA(全反式维甲酸)作为维生素A的代谢物之一，具有促血管生成作用—它可以改善血管生成背后因子(例如环氧合酶-2(COX-2)、缺氧诱导因子(HIF)-1、C-X-C、趋化因子受体(CXCR)-4、血管内皮生长因子(VEGF)、血管紧张素(Ang)-2、血管紧张素-4)的表达。此外，已经证明，ATRA降低pro-MMP2(前基质金属蛋白酶-2-Ⅳ型胶原酶)的活性。
维生素B1–苯磷硫胺(硫胺素衍生物)抑制蛋白依赖性B激酶途径(PKB/Akt)上的细胞凋亡，并负责诱导内皮祖细胞增殖。
维生素B3-烟酸，通过其受体，即羟基羧酸受体2(GPR109A)，增强和促进支持血管生成的内皮细胞功能。此外，维生素B3是NAD(+)的前体，其通过与sirtuin介体(SIRT)的反应，诱导并支持血管形成。
维生素B12(钴胺素)诱导前列腺素E1、前列环素和一氧化氮(NO)的产生。所有这些物质对血管生成的开始都具有有利的作用。
维生素D3旨在体外刺激血管生成。它诱导VEGF和pro-MMP2活性表达增加。它还影响ECFC(内皮集落形成细胞)的功能。
VEGF诱导内皮细胞之间的增殖、迁移、孢子形成和连接的形成，此外，通过诱导各种蛋白酶的产生，影响细胞外基质(ECM)的降解并激活内皮细胞的细胞表面整合素。
成纤维细胞生长因子(FGF)增加内皮细胞迁移并促进毛细血管形态发生。它还增加内源性VEGF的产生。
转化生长因子(TGF-β)促进ECM(蛋白多糖、纤维连接蛋白、胶原)的形成，调节内皮细胞的增殖、它们的迁移和血管的形成。TGF-β介导内皮细胞与周细胞的相互作用。
白细胞介素(IL)-8通过与CXCR1和CXCR2受体相互作用，对内皮细胞具有强大的促血管生成作用。它刺激微脉管网络的形成。
IL-17A-诱导血管生成、细胞迁移和细胞骨架重排。
优选地，初级生物墨水包含一种或多种选自以下的动物源性或人源性添加剂：内皮细胞，密度为0.1至10×105/mL生物墨水，原代微脉管内皮细胞，浓度为0.1至10×105/mL生物墨水，动物源性或人源性α细胞，浓度为3至9×106/mL生物墨水，动物源性或人源性β细胞，浓度为1.1至3.4×107/mL生物墨水，动物源性或人源性胰岛，优选量为20,000iEq/mL生物墨水。
胰岛负责产生胰岛素。添加内皮细胞以在打印的三维结构中更快地形成脉管网络。原代微脉管内皮细胞用于支持生物打印三维结构中微脉管的形成和生长。
在第六方面中，提供一种脉管生物墨水的制备方法，所述方法包括以下步骤：
a)可选地制备补充有CMC的微生物明胶溶液，包括在优选PBS的缓冲溶液中制备1％至2％(w/v)的微生物明胶溶液，这是通过在搅拌的条件下在50℃和65℃之间、优选60℃的温度将微生物明胶悬浮在缓冲溶液中，添加2％至5％(v/v)的羧甲基纤维素(CMC)水溶液以获得CMC在生物墨水中为0.2％至1％(v/v)的最终浓度，并将溶液冷却至等于或低于40℃的温度；
b)制备5％至10％(w/v)的dECM溶液，这是通过在轻柔搅拌的条件下将根据本发明第二方面的dECM粉末，优选通过辐射灭菌，添加到(i)在步骤a)中获得的补充有CMC的微生物明胶溶液或(ii)缓冲溶液或(iii)细胞培养基的溶液中；
c)将所得溶液在不超过37℃的温度超声处理0.5小时至2.0小时；
d)可选地添加至少一种选自以下的动物源性或人源性添加剂：浓度为3至300μg/mL、优选100μg/mL的纤维连接蛋白，浓度为10至30ng/mL、优选30ng/mL的VEGF，浓度为10至20ng/mL、优选20ng/mL的FGF，浓度在100和300nM之间、优选为100nM的PGE2，密度在0.1至10×107细胞/mL生物墨水之间的内皮细胞，密度在0.1至10×106细胞/mL生物墨水之间的成纤维细胞。
在第七方面中，提供一种脉管生物墨水的制备方法，所述方法包括以下步骤：
a)可选地制备补充有CMC的微生物明胶溶液，包括在优选PBS的缓冲溶液中制备1％至5％(w/v)的微生物明胶溶液，通过在搅拌的条件下在50℃和65℃之间、优选60℃的温度将微生物明胶悬浮在缓冲溶液中，添加2％至5％(v/v)的羧甲基纤维素(CMC)水溶液以在生物墨水中获得0.2％至2％(v/v)CMC的最终浓度，并将溶液冷却至等于或低于40℃的温度；
b)制备2％至10％(w/v)的dECM溶液，通过在轻柔搅拌的条件下将根据本发明第二方面的dECM粉末，优选通过辐射灭菌，添加到(i)在步骤a)中获得的补充有CMC的微生物明胶溶液或(ii)缓冲溶液或(iii)细胞培养基的溶液中；
c)将混合物在100℃煮15分钟至30分钟；
d)可选地添加至少一种选自以下的动物源性或人源性添加剂：浓度为3至300μg/mL、优选100μg/mL的纤维连接蛋白，浓度为10至30ng/mL、优选30ng/mL的VEGF，浓度为10至20ng/mL、优选20ng/mL的FGF，浓度在100和300nM之间、优选为100nM的PGE2，密度在0.1至10×107细胞/mL生物墨水之间的内皮细胞，密度在0.1至10×106细胞/mL生物墨水之间的成纤维细胞。
在第八方面中，提供脉管生物墨水，所述墨水包含上述经超声处理或经煮制处理的根据本发明第三方面的dECM溶液，其浓度为2％至10％(w/v)，优选补充有浓度为1％至5％(w/v)的微生物明胶和/或浓度为0.2％至2％(v/v)的CMC。
经超声处理或经煮制处理的dECM随温度变化而改变其物理和化学性质。该成分旨在确保在相对较低的温度(15℃至20℃)打印时，生物墨水的粘度适当，并在37℃的培养温度，保存打印导管直到细胞渗透以及缓慢液化。
微生物明胶提供了理想的稠度并提高了细胞存活率。CMC增加粘度并稳定生物墨水的稠度。纤维连接蛋白促进血管生成，并根据剂量刺激所形成的管的伸长，而不影响增殖率。
优选地，脉管生物墨水包含至少一种选自以下的动物源性或人源性添加剂：浓度为3至300μg/mL、优选100μg/mL的纤维连接蛋白，浓度为10至30ng/mL、优选30ng/mL的VEGF，浓度为10至20ng/mL、优选20ng/mL的FGF，浓度在100和300nM之间、优选为100nM的PGE2，密度在0.1至10×107细胞/mL生物墨水之间的内皮细胞，密度在0.1至10×106细胞/mL生物墨水之间的成纤维细胞。
内皮细胞产生血管。成纤维细胞产生血管生成诱导因子。VEGF诱导增殖、迁移、孢子形成和内皮细胞之间的连接形成。此外，通过诱导各种蛋白酶的产生，VEGF影响ECM的降解并激活内皮细胞的细胞表面整合素。FGF增加内皮细胞迁移并促进毛细血管形态发生。它还增加内源性VEGF的产生。PGE2–前列腺素E2，通过激活(R)-1受体的(磷酸化)FGF来诱导新的管的迁移、增殖和形成。
在第九方面中，提供一种三维结构，所述三维结构包括至少三个相邻的生物墨水层，其中根据本发明第八方面的脉管生物墨水的层布置在根据本发明第五方面的初级生物墨水的两层之间。
在第十方面中，提供一种三维结构的制备方法，其中根据本发明第五方面的初级生物墨水和根据本发明第八方面的脉管生物墨水在3D生物打印过程中以5mm/s至50mm/s的打印速度、4kPa至300kPa的压力和4℃至37℃的温度逐层沉积，并且其中在沉积期间或沉积之后，使初级生物墨水暴露于紫外光和/或可见光至少5秒，优选波长为365nm至405nm，更优选波长为405nm。优选在405nm处交联，因为其对三维结构中包含的细胞无毒。
本发明能够获得27×17×2.5mm大小的小叶的模型。在3至10分钟内打印出由5层组成的小叶。另外，获得了尺寸为30×40×20mm的功能器官原型的三维模型。模型由30层组成，在20至60分钟内打印。同样重要的是，这是第一次报道使用经煮制处理或超声波处理的dECM。由于打印速度与生物墨水的粘度(高达30mm/s)适当相关，本发明能够在短时间内获得结构体。可获得稳定的三维多孔结构(30层)，可在37℃的温度保存20天。在优选的实施方式中，初级生物墨水基于使用毒性较小的光引发剂，即LAP，而不是相对低浓度的Irgacure。此外，使用比文献中发现的更少量的胃蛋白酶以获得dECM溶液。
附图说明
图1.胃蛋白酶浓度对dECM水凝胶性质的影响。
图2A-2F.dECM溶液浓度与以下溶液粘度之间的关系：A)补充了15％(w/v)dECM粉末的5％(w/v)dECM溶液，B)补充了25％(w/v)dECM粉末的5％(w/v)dECM溶液，C)补充了15％(w/v)dECM粉末的8％(w/v)dECM溶液，D)补充了25％(w/v)dECM粉末的8％(w/v)dECM溶液，E)补充了15％(w/v)dECM粉末的10％(w/v)dECM溶液，F)补充了25％(w/v)dECM粉末的10％(w/v)dECM溶液。
图3A-3F.预定温度的5％(w/v)dECM溶液(A，B)、8％(w/v)dECM溶液(C，D)和10％(w/v)dECM溶液(E，F)的动力学分析。
图4.打印小叶：GelMa、HAMA、Mix的吸光度分析。
图5A-5B.A)经煮制处理的和B)经超声处理的dECM(r)的粘度。
图6A-6B.A)脉管化小叶的3D模型和B)打印结构体的照片。
图7A-7D.胰腺3D模型(A，B)和原型(C，D)的脉管系统可视化。
图8A-8B.A)实验开始时和B)温育24小时后甘油对胰岛功能的影响。
图9A-9C.A)实验开始时，B)温育24小时后，C)温育48小时后，商业添加剂对胰岛功能和活力的影响。
图10A-10D.A)实验开始时，B)温育24小时后，C)温育48小时后，D)温育72小时后，添加甲基丙烯酸明胶对胰岛活力的影响。
图11A-11C.A)实验开始时，B)温育24小时后，C)温育48小时后添加甲基丙烯酸透明质酸对胰岛活力的影响。
图12A-12D.A)实验开始时，B)温育24小时后，C)温育48小时后，D)温育72小时后添加不同比例的GelMa和HAMA的混合物对胰岛活力的影响。
图13A-13D.A)实验开始时，B)温育24小时后，C)温育48小时后，D)温育72小时后添加经切割或研磨的ECM粉末对胰岛活性的影响。
图14A-14B.A)实验开始时，B)温育24小时后，在初级生物墨水中添加GelMa和HAMA对打印后胰岛活力的影响。
图15A-15F.显示dECM制备各个阶段的蛋白质结构的电子显微镜下的可视化，以便将其用作生物打印的原料。
A)-C)为SEM(扫描电子显微镜)图像：A)去细胞化前的天然组织；B)去细胞化后的组织；C)从初级生物墨水打印的结构体。
D)-F)为TEM(透射电子显微镜)图像：D)去细胞化后的组织；E)、F)由具有保存的胶原四级结构(可见胶原纤维)的初级生物墨水打印的结构体。
具体实施方式
实施例1：制备无洗涤剂dECM
A.胰腺去细胞化流程
制备具有0.01％(w/v)链霉素的1×浓缩PBS溶液中的具有0.1％(v/v)氨水的1％(v/v)Triton X-100溶液，用于去除胰腺器官的细胞结构，同时保留细胞外基质(支架)。收集后，组织材料在-80℃冷冻。然后，解冻后，从器官中取出脂肪组织外层和周围的膜。制备的胰脏用两种方式处理：切成小块(约1cm至1.5cm)和机械研磨(使用挤压研磨法)。
将碎片组织置于瓶中，并悬浮在先前制备的Triton X-100溶液中。将试样置于4℃培养箱中，保持150rpm的恒定搅拌。每4小时至12小时更换一次洗涤剂，直到完全去除细胞部分(3至5天)。然后将洗涤剂从获得的支架中洗出。为此，使用含有0.01％(w/v)链霉素的1×PBS溶液。洗涤过程在4℃进行72小时，伴有以150rpm持续搅拌。
下一阶段-去细胞化-主要包括施用脱氧核糖核酸酶溶液(1×PBS中0.0002％(w/v)DNA酶，补充有0.12mM钙和镁离子)。支架在上述溶液中于37℃以150rpm搅拌温育8小时。最后一步涉及标准条件下(4℃；150rpm；72小时)用含有0.01％(w/v)链霉素的1×PBS溶液再次洗涤。另外，也测试了使用1×浓缩PBS溶液中浓度为0.1％(v/v)的氨水洗出洗涤剂。此外，研究了温度升高至20℃至24℃对洗涤步骤的影响。
去细胞化过程结束后，将获得的支架在液氮中冷冻，并压碎成约0.5cm大小的碎片。将材料在-32℃的温度和0.31mbar(31Pa)压力下冷冻干燥26小时。最终干燥过程在0.0010mbar(0.1Pa)压力和-76℃温度持续10分钟。使用低温磨机将经压碎并干燥的支架磨成粉末。研磨流程包括3个循环，各循环以每秒冲击15次持续1分钟。
为了表征获得的产品，即缩写为―dECM(p)”的dECM粉末，使用配备有用于研究吸入喷雾的辅助吸入室的激光衍射光谱仪Spraytec(Malvern，英国)测试流动梯度中的粉末粒度分布。在所有研究的情况中，描述雾化后分析粉末的参数值具有可比性，表明无需以增加气流的形式提供额外能量，以使粉末破裂为单个颗粒。表1给出了描述粉末颗粒直径的参数值，其中：
Dv(50)-体积粒径分布的中值：将累积体积分布一分为二的颗粒直径，换言之，所有小于或大于中值的颗粒都具有相同的体积(该直径以下的颗粒占样品体积的50％)。
Dv(10)-该直径以下的颗粒占样品体积的10％。
Dv(90)-该直径以下的颗粒占样品体积的90％。
D[3][2]-Sauter直径是颗粒的直径，其体积与表面的比率与所有分析颗粒的体积与所有此类颗粒的总表面的比率相同。
D[4][3]-被定义为颗粒直径的四次幂之和与颗粒直径的三次幂之和的比率的直径。
表1.描述粉末颗粒直径的参数值
Figure BDA0003485838470000131
dECM粉末雾化后的测量结果表明，粉末具有多分散性。在Cyclohaler型吸入器标称空气流的体积颗粒直径分布的中值-Dv(50)等于148.43±10.14μm。同时，总体积不超过样品总体积10％的最小颗粒的直径为小于28.23±1.48μm(Dv(10))，而区分总体积小于样品总体积90％的颗粒的直径为410.10±29.41μm。将送入吸入器的空气流率增加至200dm3/min和270dm3/min不会显著影响体积粒径分布中值或Dv(10)值。仅观察到最大颗粒的尺寸(Dv(90))从约410.1±29.41μm略微增大到498.3±62.7μm。这导致分布范围从2.57±0.04(对于100dm3/min的气流)增加到3.3±0.4(对于270dm3/min的气流)。
B.去细胞化方法的效力
-产品的蛋白质特性：
使用质谱技术，测定猪胰腺去细胞化后的ECM蛋白质组成。所获得的结果清楚地表明，受试样品中胶原蛋白的百分比最高，与其他检测到的胶原类型相比，α(A)-1链的1型胶原(COL1)，即所谓的COL1A1，显示出最高的值。
表2.测试样本中COL1A1的百分比。M18、M22、M23、M24s、M24、M25表示样本编号。
Figure BDA0003485838470000141
此外，还发现了大量的IV型和VI型胶原。这表明所使用的去细胞化方案允许保留与胰岛和β细胞整合程度最高的胶原类型。I型和IV型胶原在支持胰岛功能和活力方面最为有效，它们通常被用作基于胰岛细胞功能的生物医学应用中的补充剂。值得注意的是，VI和IV型胶原存在于胰岛分泌外表面和基底膜，它们调节纤维连接蛋白活性。分析的任何其他胶原蛋类型(COL1A2、COL3A1、COL4A2、COL6A1、COL6A2、COL6A3、COL14A1)的百分比含量在所有检查样本中均不超过3.5％。
-最终DNA浓度
为确定残余DNA浓度，进行三个分析：
(a)PicoGreen用于测定残余DNA浓度
(b)琼脂糖凝胶电泳用于测定剩余遗传物质的粒径
(c)显微镜成像-苏木精&伊红(H&E)染色。
当残余DNA的浓度不超过50ng双链DNA(dsDNA)/mg干重ECM，且剩余DNA的分子不超过200个碱基对(bp)时，去细胞化过程成功完成。此外，对获得的支架显微图像进行细胞核存在的评估(苏木精&伊红染色)。
干物质中残余DNA的浓度平均为0.077ng/mg。在所有检测样品中，残余DNA含量均低于0.15ng/mg。使用用于分离残余DNA的DNeasy Blood&Tissue Kit试剂盒，以及确定分离的遗传物质浓度的Quant iT PicoGreen dsDNA试剂和试剂盒来进行分析。
使用琼脂糖凝胶电泳未发现信号。所有样品均低于检测水平，这清楚地表明ECM中没有以大于200bp的颗粒形式存在的残余DNA。
显微镜检查显示，去细胞化过程后，未见遗传物质，未见细胞核。
-Triton X-100残余物及其检测和去除的有效方法
为了进行比较，使用0.5％(w/v)SDS进行去细胞化。然而，由于最终产品中残留大量洗涤剂，结果并不令人满意。ECM粉末在尝试使其溶解时显示出高发泡水平。使用TritonX-100时未观察到这一点。
为了验证去细胞化过程后剩余的Triton X-100浓度，测定其在最终产品中的残留量。
制备分析用样品：
鉴于溶解的dECM呈白色，样品用三种浓度的胶原酶处理：4.3953PZ活性单位/gdECM(p)、43.953PZ/g dECM(p)和87.906PZ/g dECM(p)。在含有150mL的pH为7.2至7.4的林格氏溶液、2.72mL的Hepes(1M)、1.125mL的碳酸氢钠(7.5％)和1.05mL的氯化钙(1M)的特殊溶液中制备胶原酶。
样品在1000rpm的恒定振动作用的条件下在37℃搅拌24小时。对获得的溶液进行非离子洗涤剂Triton X-100的残余浓度分析。样品A是用单一胶原酶浓度处理dECM的结果。样品B是用10倍胶原酶浓度处理的。样品C是用20倍胶原酶浓度处理的(A＝6.977μg TritonX-100/g dECM(p)，B＝40.475μg Triton X-100/g dECM(p)，C＝39.325μg Triton X-100/gdECM(p))。
重要的是，在经浓度为43953PZ/g dECM的胶原酶处理的dECM溶液中发现剩余Triton X-100的最高浓度。胶原酶浓度的增加并未导致获得更多量的Triton X-100，这表明dECM的43953PZ/g的浓度足以从样品中提取所有剩余的Triton X-100。
由于以下原因，先前发表的评估这种洗涤剂的尝试没有产生任何实际结果：
-Triton X-100粉末的评估是不可能的，因为这种形式的ECM吸收了染料，从而扭曲了结果。通过使用SDS洗涤剂去细胞化后分析ECM粉末证明了这种相关性，这指示TritonX-100的存在，由于使用的洗涤剂不是Triton X-100，所以这是不可能的。
-溶解在胃蛋白酶中并被中和的dECM由于呈白色所致而影响读取浓度。
因此，用胶原酶处理dECM是迄今为止评估去细胞化后生物材料中洗涤剂残留的唯一方法。这对于将此类材料(dECM)用于使用活细胞的生物打印过程具有重要意义。如果将这种材料用于植入人体，这一点至关重要。
C.结果
在第一步中，分析了去细胞化基质中脂肪组成在胰腺去细胞制备功能中的差异。下一步中，根据胰腺制备方法，分析残余DNA的含量、胶原含量和残余洗涤剂Triton X-100。
使用机械挤压研磨法允许显著降低获得的细胞外基质中的脂肪含量。在机械挤压研磨法中，脂肪含量为6.24+/-0.07％(w/w)，而在切割法中，脂肪含量为21.47+/-0.07％(w/w)。差异具有统计学显著性(p<0.001)。低脂肪含量的所得dECM显著提高了细胞和胰岛的活力。
当使用机械挤压研磨法时，使用Picogreen测试的残余DNA含量显著降低，即0.07+/-0.07ng/mg组织相比0.13+/-0.06ng/mg组织(p＝0.027)。两种情况下这都远低于允许的50ng/mg值。
使用机械挤压研磨法允许显著降低所获得的细胞外基质中的Triton X-100含量。在机械挤压研磨法中，洗涤剂含量为3.79+/-2.33μg/g，而在切割法中为6.53+/-2.34μg/g。差异具有统计学显著性(p＝0.008)。
根据切割法和机械挤压研磨法的使用，制备方法产生的受试材料中的胶原含量没有差异。
使用氨水使环境碱化以便更好地洗出Triton并未改善Triton的洗出。然而，它造成了所获得的胶原组成的改变。同样，在24℃洗涤也未改善Triton的洗出，同时增加了对胶原结构的损伤，导致DNA含量的结果更高，这可能表明材料存在感染风险。因此，最佳方法是在4℃的温度在PBS中洗涤去细胞化材料72小时。
实施例2：制备生物墨水
A.溶解dECM(p)
为了获得dECM溶液(dECM(r))，建立了使用胃蛋白酶和盐酸(HCl)的dECM粉末(dECM(p))溶解流程。获取dECM溶液的流程分为两部分：
(a)溶解dECM
将胃蛋白酶(浓度为0mg/mL至10mg/mL，优选1mg/mL)溶解在50mL的0.01M HCl中，然后添加dECM(p)(0.5g至5g)。该方法产生的dECM(r)浓度范围为1％至10％(w/v)。将制备的溶液置于磁力搅拌器上，使用以下搅拌条件：环境温度为约25℃，溶解时间为72小时，其中在搅拌的前8小时每隔一小时搅拌溶液。
(b)中和dECM(r)
使用以下物质在冰上(dECM溶液的理想温度为4℃至4.5℃)中和50mL dECM(r)，至pH为7.2至7.4：
-5ml的0.1M NaOH(用于中和的0.1M NaOH的体积等于dECM(r)体积的1/10)；
-5.56mL的10×PBS(用于中和的10×PBS的体积等于dECM(r)体积的1/9)；
-使用适当体积的1×PBS(1ml至10ml)稀释dECM溶液。
为了确定适用于制备dECM(r)的流程，对辐射灭菌后研磨的具有10％(w/v)的相对高浓度的dECM(p)的溶液进行了分析，胃蛋白酶含量不同。
制备了不同胃蛋白酶含量的dECM溶液。含有1mg/mL胃蛋白酶的溶液具有相对较高的均匀性：粘度值范围较小。随着温度的变化浊度略有变化。所有分析的具有不同胃蛋白酶含量的溶解方法均用于dECM(r)的制备，然而，已证明所使用的1mg/mL的量是最佳的。
B.制备生物墨水
(a)获得初级生物墨水的条件：
-中和的dECM溶液，dECM(p)经研磨、切割、有无辐射灭菌或环氧乙烷灭菌
-dECM(p)粉末，经研磨、切割、有无辐射灭菌或环氧乙烷灭菌
-无菌GelMa 10％至20％(w/v)，含0.2％至0.5％(w/v)LAP
-无菌HAMA 1％至3％(w/v)，含0.2％至0.5％(w/v)LAP
-无菌甘油
-培养基1：5-7v/v，胰岛20,000iEq/mL和细胞系：内皮细胞1×105/mL，原代微脉管内皮细胞1×105/mL，维生素：A为100μM，B1为100μM，B3为10μM，D3为10nM，生长因子：VEGF为30ng/mL，FGF为20ng/mL，肿瘤坏死因子(TNF)-α为10ng/mL，IL-8为10ng/mL，IL-17A为20ng/mL。
首先，通过使用无菌金属抹刀彻底混合，制备含有适量中和dECM(r)和dECM(p)的糊料。由于dECM(p)是通过冷冻干燥制备的，并且随后不溶解，因此它保留了ECM的四级结构。将获得的糊料在7℃至10℃的温度放置至少24小时。在将糊料直接用于生物墨水生产之前，将其放置在无菌注射器中，并在注射器之间混合。同时，根据常用流程，使用LAP制备GelMa(10％至20％(w/v))和HAMA(1％至3％(w/v))溶液。含有糊料的注射器通过连接器连接到另一个没有活塞的注射器上，该注射器倒置移动并稳定地垂直放置。依次添加甘油、培养基、生长因子、维生素、GelMa和HAMA溶液。然后轻轻插入活塞，使糊料与其他试剂混合。混合后，将制备好的生物墨水置于培养箱中5分钟，添加胰岛和细胞，然后再次混合，并将其引入墨盒中。在下一步中，填充的墨盒以1500rpm离心2分钟，然后重新引入培养箱中，之后打印约5分钟。
获得的初级生物墨水的组成如下：40％至50％(v/v)的dECM(r)、2.763％至27.692％(w/v)的dECM(p)、1.464％至7.320％(w/v)的GelMa、0.146％至1.098％(w/v)的HAMA、5.0％至10.0％(w/v)的甘油、0.03％至0.17％(w/v)的LAP、VEGF为30ng/mL、FGF为20ng/mL、TGF-β为10ng/mL、IL-8为10ng/mL、IL-17A为20ng/mL、维生素A为100μM、维生素B1为100μM、维生素B3为10μM、维生素D3为10nM、胰岛为20000iEq/mL、内皮细胞为1×105/mL、原代微脉管内皮细胞为1×105/mL。
(b)脉管生物墨水
使用超声波处理生产脉管生物墨水的过程分为两个步骤：
-初步溶解-将适量的微生物明胶悬浮在PBS(1％至2％(w/v))中，并在60℃用磁力搅拌器搅拌约10分钟。然后，在持续搅拌的条件下，降低温度，分批添加5％至10％(w/v)的dECM(p)(经研磨和切割，在辐射灭菌或环氧乙烷灭菌后或无辐射灭菌或环氧乙烷灭菌)，每2分钟额外搅拌一次溶液。根据变型，将先前制备的PBS基羧甲基纤维素(CMC)溶液(2％至5％(v/v))添加到混合物中。
-超声波处理：将装有制备好的ECM溶液的瓶子放在加冰的烧杯中，然后在烧杯中放置超声波探头和温度传感器，然后使用振幅为45％的3s脉冲按照开发的流程进行超声波处理，当温度超过30℃时发出警报停止工作。超声处理时间为0.5小时至2.0小时。
-作为选择，省略初步溶解步骤，通过将dECM粉末添加到缓冲溶液或细胞培养基溶液中并轻柔搅拌，制备5％至10％(w/v)的dECM溶液。接下来，如上所述执行超声处理步骤。
通过煮制处理生产脉管生物墨水的过程分为两个步骤：
-初步溶解-将适量的微生物明胶悬浮在PBS(1％至5％(w/v))中，并在60℃用磁力搅拌器搅拌约10分钟。然后，在持续搅拌的条件下，降低温度，分批添加2％至10％(w/v)的dECM(p)(经研磨和切割，在辐射灭菌或环氧乙烷灭菌后或无辐射灭菌或环氧乙烷灭菌)，每2分钟额外搅拌一次溶液。根据变型，将先前制备的PBS基CMC溶液(2％至5％(v/v))添加到混合物中。
-煮制处理：将装有制备的ECM溶液或溶于PBS溶液中的ECM粉末(5％至10％(w/v))的瓶子放在配有加热至100℃的加热板的磁力搅拌器上，在这里将混合物煮制处理15分钟至30分钟。
-作为选择，省略初步溶解步骤，通过将dECM粉末添加到缓冲溶液或细胞培养基溶液中并轻柔搅拌，制备5％至10％(w/v)dECM溶液。接下来，如上所述执行超声处理步骤。
向由此制备的脉管生物墨水基底补充纤维连接蛋白、生长因子和内皮细胞。
获得的经超声波处理的脉管生物墨水的组成如下：5％至10％(w/v)、优选7.5％(w/v)的dECM(p)、0.2％至1％(v/v)的CMC、1％至2％(w/v)、优选1％(w/v)的微生物明胶、100μg/mL的纤维连接蛋白、30ng/mL的VEGF、20ng/mL的FGF、100nM的PGE2、1.5×107/mL的内皮细胞和3×106/mL的成纤维细胞。
获得的经煮制处理的脉管生物墨水的组成如下：2％至10％(w/v)、优选5％(w/v)的dECM(p)、0.2％至2％(v/v)的CMC、1％至5％(w/v)、优选1％(w/v)的微生物明胶、100μg/mL的纤维连接蛋白、30ng/mL的VEGF、20ng/mL的FGF、100nM的PGE2、1.5×107/mL的内皮细胞和3×106/mL的成纤维细胞。
作为选择，脉管生物墨水由缓冲溶液或细胞培养基中的5％至10％(w/v)、优选5％(w/v)的dECM(p)组成。
实施例3：初级生物墨水的特征
A.流变学
进行的测试可作为确定特征参数值的基础，构成了限制使用特定系统打印胰腺小叶模型的可能性的因素-粘度值超过5Pa·s。胃蛋白酶浓度对dECM水凝胶性质的影响如下所述。
表3.温度(25℃至37℃)对dECM(r)浊度的影响
Figure BDA0003485838470000211
表4.在37℃温度的暴露时间对dECM(r)浊度的影响
Figure BDA0003485838470000212
表5.胃蛋白酶浓度对dECM(r)粘度的影响，在恒定剪切速率(21/s)下测量50分钟
胃蛋白酶浓度[mg/mL] η[mPa·s]
0 2109.7<η<5611.9
1 3026.9<η<4040.7
10 3287.6<η<4691.3
为了确定具有最佳性能的生物墨水的组成，遵循表示生物打印过程中存在的条件的专门开发的流程，使用MCR 72流变仪(Anton Paar)来测试dECM溶液和糊料的粘度：锥板系统，恒定剪切速率为21/s，试验温度为37℃。考虑到所用粉末类型(MS-研磨灭菌，CS-切割灭菌，MNS-研磨未灭菌，CNS-切割未灭菌)和所用成分浓度的样品差异，系统流变学测试结果如图2所示。
dECM溶液浓度的增加导致粘度的增加[图2]。获得的粘度值似乎太低，无法将dECM(r)用作赋予生物墨水适当稠度的试剂。在所考虑的每种情况下，dECM(p)经灭菌获得的溶液的粘度值低于非无菌粉末溶液。在较低dECM(r)浓度下使用经研磨的粉末和经切割的粉末时，观察到溶液稠度略有差异。对于10％(w/v)，经研磨的粉末dECM(r)的粘度略高于从经切割的dECM(p)制备的dECM(r)。
结果总结表明，使用dECM糊料对于获得具有适当稠度的生物墨水基底是必要的。总结的所有系统的粘度都在打印期间使用的可接受的范围内。此外，在灭菌后，使用无菌粉末对各成分与细胞和胰岛的混合物进行生物打印似乎是有利的。
向初级生物墨水(糊料)中添加甘油导致初级生物墨水的粘度略有下降，这与文献数据相反，其报告添加甘油后生物墨水的粘度增加。添加到糊料中的每一种试剂都会引起粘度的变化。添加支持维持细胞和胰岛结构体或活力的物质会导致糊料流动性的变化，这些变化微不足道，甚至可以忽略不计。来自dECM的糊料构成了生产初级生物墨水和确定特定生物墨水是否可用于打印的基础。
B.生物墨水的固化方法
-使用交联剂交联打印输出
下表显示了初级生物墨水中使用的交联剂组成的差异[表6]。
表6.初级生物墨水中使用的各种交联剂
Figure BDA0003485838470000221
已使用波长在365nm至405nm范围内的光对上述系统进行了交联性测试，结果积极[表7]。
表7.暴露于365nm和405nm波长的光的DNA的受损％
Figure BDA0003485838470000231
过程后或生物打印过程中的交联结果分析表明，使用365nm和405nm波长的光都达到了预期效果，即水凝胶形式从液体变为固体。然而，由于生物墨水含有细胞和微生物，因此只可使用可见光。因此，最优选的交联方法是使用波长为405nm的光。
向dECM糊料中添加补充化学物质可使细丝表面的形貌变得平滑。此外，当添加GelMa和HAMA时，确认生物墨水的通气增加，采用HAMA时这种作用最强。
-热胶凝
胶凝过程的强度通过使用专门设备在广泛的温度和其效果的暴露时间范围内识别溶液浊度来测试。图3显示了dECM溶液交联试验的结果示例。对于5％(w/v)，通过在25℃至37℃范围内的升温产生的所有测试系统均观察到吸光度略有增加。使用经研磨无菌粉末降低了dECM溶液的浊度。对于经切割的粉末溶液，在浓度较高(8％和10％(w/v))的dECM(r)情况下，获得相同的灭菌相关性，而对于经研磨的粉末则相反。随着温度的升高，8％和10％(w/v)dECM(r)的浊度都略有增加。10％的dECM(r)显示出相对较高的浊度，并且在测试温度范围内稳定。
根据37℃恒温的胶凝动力学，当增加37℃温度时的暴露时间时，未观察到浊度的显著变化。来自经研磨无菌粉末的dECM(r)具有最低的吸光度值，而对于所有dECM(r)浓度，经切割的非无菌粉末溶液具有最高的浊度。
C.以葡萄糖扩散为例的生物墨水成分渗透性
随着所谓驱动力(即葡萄糖浓度)的增加，延迟时间和达到平衡状态的时间减少，扩散率相应增加。表8中的数据表明，使用初级生物墨水获得的膜的扩散率与使用4％(w/v)海藻酸盐(Alg4)获得的膜相当。
表8.添加不同添加剂的初级生物墨水的膜的扩散率。添加4％海藻酸盐进行比较。
Figure BDA0003485838470000241
D.吸光度
为了评估所获得的生物墨水的可用性，使用模拟身体内部状况的特制缓冲液对打印小叶进行了吸光度分析。在最初的15分钟内，观察到打印结构体的重量略有增加，随后减少并稳定在特定水平上。在下一步中，观察打印小叶重量随时间的变化，以研究SBF缓冲环境中的降解现象[图4]。
实施例4：脉管生物墨水的特性
A.流变学
经煮制处理的dECM(r)比经超声处理的dECM(r)具有更高的粘度值。然而，由于超声处理后脉管生物墨水具有适当的稳定性，该方法被确定为对于管型导管的打印更优选。
B.胶凝
在25℃至37℃范围内的温度升高和37℃温度时的暴露时间变长会导致经煮制处理的和经超声处理的dECM浓度略微降低。
表9.温度对用于生产脉管生物墨水的dECM浓度的影响
Figure BDA0003485838470000251
表10.在温度37℃时的暴露时间对用于生产脉管生物墨水的dECM浓度的影响
Figure BDA0003485838470000252
实施例5：生物打印过程中使用的压力对细胞和微器官活力的影响
对成纤维细胞(细胞系3T3-L1和HFF-1)和胰岛进行活力测试。为此目的，使用直径为0.2mm和0.6mm的针头对胰腺细胞/胰岛施加15kPa至100kPa范围内的压力。所进行的测试结果表明，使用挤压法进行3D生物打印时诱发的剪切力会导致细胞和微器官活力发生显著变化。
表11.施加预定压力后存活和死亡的3T3-L1细胞的百分比
Figure BDA0003485838470000261
表12.施加预定压力后存活和死亡的HFF-1细胞的百分比
Figure BDA0003485838470000262
表13.使用0.6mm针头经受特定压力的胰岛的活力。对于胰岛，优选不使用较小的针头直径，因为胰岛的直径在50μm和500μm之间变化。
Figure BDA0003485838470000263
为了获得可行的功能性生物三维结构，针头的压力和直径需要与特定的细胞类型相匹配。然而，优选施加不超过30kPa的压力。
实施例5：适印性
使用初级生物墨水的打印输出通过使用以下参数进行：压力：4kPa至100kPa，打印速度：5mm/s至40mm/s，温度：打印头：10℃至37℃；打印床：4℃至37℃，针径：100nm至1mm。使用脉管生物墨水的打印输出通过使用以下参数进行：压力：5kPa至100kPa，打印速度：5mm/s至40mm/s，温度：打印头：10℃至37℃；打印床：4℃至37℃，针径：100nm至1mm。
-小叶
打印带有管的胰腺小叶需要约3分钟。图6显示了脉管化小叶的3D模型和打印结构体的图片。SEM用于确定打印小叶的侧面和横截面的形态。在小叶的实质性孔隙率后面观察到生物墨水细丝的松散排列。此外，基于横截面分析，确定了由模拟管的专利导管提供的三维多孔结构的分层。
-脉管化三维结构
打印带有专利导管网络的仿生胰腺原型需要约30分钟。与小叶的情况一样，在带有专利导管网络的打印结构体的高度多孔结构中观察到生物墨水细丝的松散排列。
使用核磁共振成像对打印的脉管系统进行评估。所制的三维重建显示专利导管没有塌陷或剥离的倾向。
实施例5：打印小叶的细胞毒性
对成纤维细胞系(3T3)进行MTT试验，以评估初级生物墨水的细胞毒性。结果以最大提取物浓度下对照％表示[表14]。提取物暴露时间为24小时，以细胞密度为1×105/mL铺于平板(plate)。两个试验均未显示对受试细胞系的细胞毒性。
表14.初级生物墨水细胞毒性的MTT分析结果。对成纤维细胞3T3系进行试验
Figure BDA0003485838470000271
实施例6：单个生物墨水成分对胰岛/细胞功能和活力的影响
为了评估初级生物墨水的单个成分对胰岛活力和功能的影响，进行了葡萄糖刺激试验。
-甘油
由于其性质，向生物墨水中添加5％(w/v)和10％(w/v)甘油可改善初级生物墨水的适印性。为了评估其对胰岛功能的影响，将甘油以5％或10％的浓度添加到培养基中，并将胰岛在其中温育24小时[图8]。在这两种情况下，胰岛的功能远远优于单独培养基中的胰岛。
-商用蛋白质补充剂
测试了添加细胞外基质蛋白对胰岛功能和活力的影响。为此目的，制备了由0.007mg/mL的透明质酸、0.041mg/mL的I型胶原、0.122mg/mL的IV型胶原和0.084mg/mL的层粘连蛋白组成的溶液，并将其添加到培养基中。将两种类型的透明质酸(高分子量或低分子量)加入培养基中进行实验，并将胰岛在其中温育48小时[图9]。在高(H)和低(L)分子量透明质酸变体中，胰岛的功能水平与未经任何补充剂治疗的胰岛相当。
-GelMA
测试了胰岛活力如何可能受到甲基丙烯酸明胶的影响，甲基丙烯酸明胶作为生物墨水的成分，用于确保打印物的适当交联。为此目的，将7.8％v/v的GelMa添加到培养基中，并将胰岛在其中温育72小时[图10]。在添加GelMa的培养基中生长的胰岛分泌相似或更多量的胰岛素，这取决于测量时间，这表明该化合物在给定浓度对胰岛的活力有有利的影响。
-HAMA
测试了胰岛活力如何可能受到甲基丙烯酸透明质酸的影响，甲基丙烯酸透明质酸作为生物墨水的成分，用于确保打印物的适当交联。为此目的，将0.78％v/v的HAMA添加到培养基中，并将胰岛在其中温育48小时[图11]。在含有HAMA的培养基中生长的胰岛分泌的胰岛素量低于对照胰岛，这可能表明被试浓度的化合物对胰岛活力有不利影响。
-GelMA和HAMA
测试了胰岛活力如何可能受到甲基丙烯酸明胶和甲基丙烯酸透明质酸的混合物的影响，作为生物墨水的成分，甲基丙烯酸明胶和甲基丙烯酸透明质酸可确保打印物的适当交联。为此目的，将4.68％v/v的GelMa和0.312％v/v的HAMA(G3:2H)或3.12％v/v的GelMa和0.468％v/v的HAMA(G2:3H)添加到培养基中，并将胰岛在其中温育72小时[图12]。与对照胰岛相比，在添加有G3:2H比率的混合物的培养基中生长的胰岛分泌更多或更少量的胰岛素，这取决于测量的时间点。这种混合物的变体似乎对胰岛的活力有有利的影响。在添加有G2:3H比率的混合物的培养基中生长的胰岛分泌的胰岛素明显少于对照胰岛，这表明在给定浓度的GelMa和HAMA混合物对胰岛活力有不利影响。
-ECM粉末
试验了通过去细胞化获得的ECM如何影响胰岛的活力。为此目的，将去细胞化过程中3.33％v/v的经切割或经研磨的ECM添加到培养基中，并将胰岛在其中温育72小时[图13]。在添加有经研磨的ECM的培养基中生长的胰岛对24小时内胰岛的胰岛素分泌有有利影响。添加有经切割的ECM的培养基显著减少胰岛素分泌，这可能表明对胰岛活力有不利影响。
实施例7：生物打印后胰岛的活力
选择三种生物墨水来评估3D生物打印后胰岛的活力：甲基丙烯酸明胶、甲基丙烯酸透明质酸、甲基丙烯酸明胶和甲基丙烯酸透明质酸的混合物。
为此目的，将7.8％v/v的GelMa或0.78％v/v的HAMA或4.68％v/v的GelMa和0.312％v/v的HAMA的混合物(MIX)添加到初级生物墨水中。打印后，将带有胰岛的小叶在培养基中温育24小时[图14]。
用包含GelMa添加的初级生物墨水打印的小叶中的胰岛在打印过程后显示出产生了最高水平的胰岛素，因此表明该成分对胰岛的活力和功能有有利的影响。与培养基中生长的对照胰岛(未经3D生物打印)相比，向生物墨水中添加HAMA以及GelMa和HAMA的混合物均会引起胰岛产生的胰岛素水平略微下降。虽然仅添加GelMa的生物墨水的结果显示，在给定的葡萄糖浓度，胰岛的活性最高，但打印的结构最不稳定，在培养基中分解最快。因此，最好的解决方案是使用甲基丙烯酸明胶和甲基丙烯酸透明质酸的混合物用于生物打印过程中。这种组合可以在保持适当的生物打印参数和打印模型稳定性的同时允许保存有活力的和有功能的胰岛。
实施例8：确认初级生物墨水中保存的dECM四级结构
为了可视化并确认ECM四级结构在包含初级生物墨水的打印结构体中的保存，使用电子显微镜对dECM制备各个阶段的蛋白质结构进行可视化(以便将其用于生物打印)(图15)。包含初级生物墨水的打印结构体(E和F)显示出具有可见胶原纤维的胶原四级结构。
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Claims (15)

1.一种无洗涤剂去细胞化细胞外基质dECM的制备方法，所述方法包括以下步骤：
-将选自胰腺、肝脏、肾脏、心脏、皮肤、肺、大肠、小肠、动脉和静脉、脂肪组织和胎盘中的动物源性器官通过机械破碎，优选通过机械挤压，其中所述器官与动物的身体是分开的；
-在优选包含1×PBS的缓冲洗涤剂溶液中温育碎片器官，其中所述缓冲洗涤剂溶液包含0.5％至1.5％、优选1％(v/v)的辛苯昔醇-9，其中所述洗涤剂溶液补充有抗微生物剂，优选链霉素，优选浓度为0.01％(w/v)，并且温育在搅拌的条件下在低于室温优选为4℃的温度进行至少72小时，其中每4至12小时将所述碎片器官转移到新鲜洗涤剂溶液中；
-在优选包含1×PBS的第一缓冲洗涤溶液中温育所述碎片器官，其中所述第一缓冲洗涤溶液包含抗微生物剂，优选链霉素，优选浓度为0.01％(w/v)，温育在搅拌的条件下在低于室温、优选为4℃的温度进行至少72小时，其中每4至12小时将所述碎片器官转移到新鲜洗涤溶液中；
-在包含DNA酶的脱氧核糖核酸酶溶液中温育所述碎片器官，优选浓度为0.0001至0.0003％(w/v)，最优选浓度为0.0002％(w/v)，优选在适合DNA酶性能的温度温育至少8小时；
-在优选包含1×PBS的第二缓冲洗涤溶液中温育所述碎片器官，其中所述第二缓冲洗涤溶液包含抗微生物剂，优选链霉素，优选浓度为0.01％(w/v)，温育在搅拌的条件下在低于室温、优选为4℃的温度进行至少72小时，其中每4至12小时将所述碎片器官转移到新鲜洗涤溶液中；
-冷冻所述碎片器官并将冷冻的碎片器官压成碎片；
-将冷冻的碎片器官优选在-32℃，优选在0.31mbar(31Pa)的压力下冷冻干燥；
-在0.0010mbar(0.1Pa)且-76℃进行5至15分钟的可选的最终干燥；
-将经压碎并干燥的产品研磨成25μm至500μm的dECM粉末；
-可选灭菌产品，优选通过辐射和/或环氧乙烷进行。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述研磨步骤之后是检查dECM粉末中辛苯昔醇-9的量的步骤，其中优选在检查dECM粉末中辛苯昔醇-9的存在之前，将粉末用胶原酶处理，优选浓度为43,953PZ/gdECM。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述研磨步骤之后是以下步骤：
-将dECM粉末溶解在盐酸溶液中，溶液优选为0.01M，补充有0mg/ml至10mg/ml的胃蛋白酶；
-于室温混合48小时至72小时，优选72小时；
-在冰上中和，优选使用0.1M钠基和PBS溶液。
4.一种粉末形式的无洗涤剂去细胞化ECM，其能够通过根据权利要求1或2所述的方法获得。
5.一种溶液形式的无洗涤剂去细胞化ECM，其能够通过根据权利要求3所述的方法获得。
6.一种初级生物墨水的制备方法，所述方法包括以下步骤：
-通过混合制备包含5％至50％(w/v)、优选15％至25％(w/v)的根据权利要求4的dECM粉末和1％至10％(w/v)、优选8％至10％(w/v)的根据权利要求5的dECM溶液的糊料；
-在7℃至10℃的温度温育糊料至少24小时；
-添加1.46％至7.32％(w/v)的甲基丙烯酸明胶、0.15％至1.10％(w/v)的甲基丙烯酸透明质酸和5％至10％(w/v)的甘油，以及光引发剂，优选0.03％至0.17％(w/v)的苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰亚膦酸锂，然后轻柔混合。
7.一种初级生物墨水，所述墨水包含dECM糊料和1.46％至7.32％(w/v)的甲基丙烯酸明胶、0.15％至1.10％(w/v)的甲基丙烯酸透明质酸和5％至10％(w/v)的甘油，以及光引发剂，优选0.03％至0.17％(w/v)的苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰亚膦酸锂，其中所述dECM糊料包含5％至50％(w/v)、优选15％至25％(w/v)的根据权利要求4的dECM粉末，和1％至10％(w/v)、优选8％至10％(w/v)的根据权利要求5的dECM溶液，并且其中所述初级生物墨水的粘度在锥板系统中，以21/s的恒定剪切速率和37℃的温度测量为至少5Pa·s。
8.根据权利要求7所述的初级生物墨水，所述墨水包含至少一种选自以下的添加剂：浓度为0.001至0.100mg/mL初级生物墨水、优选0.007mg/mL初级生物墨水的透明质酸，浓度为0.005至0.100mg/mL初级生物墨水、优选0.084mg/mL初级生物墨水的层粘连蛋白，浓度为0.001至0.100mg/mL初级生物墨水、优选0.041mg/mL初级生物墨水的胶原I，浓度为0.005至0.175mg/mL初级生物墨水、优选0.122mg/mL初级生物墨水的胶原IV，浓度为3至300μg/mL、优选100μg/mL的纤维连接蛋白，浓度为10至100mg/mL初级生物墨水的人纤维蛋白酶原，浓度为1至2EPU/mL初级生物墨水的抑肽酶，浓度为0.05至2mg/mL初级生物墨水的聚山梨醇酯，浓度为5至55mg/mL初级生物墨水的人凝血酶，浓度为20至60mM/mL初级生物墨水的氯化钙；促血管生成的维生素：浓度为1nM至500μM、优选100μM的维生素A，浓度为50μM至100μM、优选100μM的维生素B1，浓度为1μM至10μM、优选10μM的维生素B3，浓度为10至100mg/mL初级生物墨水的维生素B12，浓度为0.1nM至10nM、优选10nM的维生素D3；支持血管生成的生长因子：浓度为10至30ng/mL初级生物墨水、优选30ng/mL初级生物墨水的VEGF，浓度为10至20ng/mL初级生物墨水、优选20ng/mL初级生物墨水的FGF，浓度为1至10ng/mL初级生物墨水、优选20ng/mL初级生物墨水的TGF-β，浓度为0至100ng/mL初级生物墨水、优选10ng/mL初级生物墨水的白细胞介素(IL)-8，浓度为20至50ng/mL初级生物墨水、优选20ng/mL初级生物墨水的IL-17A。
9.根据权利要求7或8所述的初级生物墨水，所述墨水包含一种或多种选自以下的动物源性或人源性添加剂：密度为0.1至10×105/mL初级生物墨水的内皮细胞，浓度为0.1至10×105/mL初级生物墨水的原代微脉管内皮细胞，浓度为3至9×106/mL生物墨水的动物源性或人源性α细胞，浓度为1.1至3.4×107/mL生物墨水的动物源性或人源性β细胞，优选量为20,000iEq/mL初级生物墨水的动物源性或人源性胰岛。
10.一种脉管生物墨水的制备方法，所述方法包括以下步骤：
a)可选地制备补充有CMC的微生物明胶溶液，包括在优选PBS的缓冲溶液中制备1％至2％(w/v)的微生物明胶溶液，此制备是通过在搅拌的条件下在50℃和65℃之间、优选60℃的温度将微生物明胶悬浮在缓冲溶液中，添加2％至5％(v/v)的羧甲基纤维素CMC水溶液以获得在脉管生物墨水中0.2％至1％(v/v)的CMC的最终浓度，并将溶液冷却至等于或低于40℃的温度；
b)制备5％至10％(w/v)的dECM溶液，此制备是通过在轻柔搅拌的条件下将根据权利要求1或2获得的dECM粉末，优选通过辐射灭菌，添加到(i)在步骤a)中获得的补充有CMC的微生物明胶溶液或(ii)缓冲溶液或(iii)细胞培养基的溶液中；
c)将所得溶液在不超过37℃的温度超声处理0.5小时至2.0小时；
d)可选地添加至少一种选自以下的动物源性或人源性添加剂：浓度为3至300μg/mL、优选100μg/mL的纤维连接蛋白，浓度为10至30ng/mL、优选30ng/mL的VEGF，浓度为10至20ng/mL、优选20ng/mL的FGF，浓度在100和300nM之间、优选为100nM的PGE2，密度在0.1至10×107细胞/mL生物墨水之间的内皮细胞，密度在0.1至10×106细胞/mL生物墨水之间的成纤维细胞。
11.一种脉管生物墨水的制备方法，所述方法包括以下步骤：
a)可选地制备补充有CMC的微生物明胶溶液，包括在优选PBS的缓冲溶液中制备1％至2％(w/v)的微生物明胶溶液，此制备是通过在搅拌的条件下在50℃和65℃之间、优选60℃的温度将微生物明胶悬浮在缓冲溶液中，添加2％至5％(v/v)的羧甲基纤维素CMC水溶液以在脉管生物墨水中获得0.2％至1％(v/v)CMC的最终浓度，并将溶液冷却至等于或低于40℃的温度；
b)制备5％至10％(w/v)的dECM溶液，此制备是通过在轻柔搅拌的条件下将根据权利要求1或2获得的dECM粉末，优选通过辐射灭菌，添加到(i)在步骤a)中获得的补充有CMC的微生物明胶溶液或(ii)缓冲溶液或(iii)细胞培养基的溶液中；
c)将混合物在100℃煮15分钟至30分钟；
d)可选地添加至少一种选自以下的动物源性或人源性添加剂：浓度为3至300μg/mL、优选100μg/mL的纤维连接蛋白，浓度为10至30ng/mL、优选30ng/mL的VEGF，浓度为10至20ng/mL、优选20ng/mL的FGF，浓度在100和300nM之间、优选为100nM的PGE2，密度在0.1至10×107细胞/mL生物墨水之间的内皮细胞，密度在0.1至10×106细胞/mL生物墨水之间的成纤维细胞。
12.一种脉管生物墨水，所述墨水包含经超声处理或经煮制处理的根据权利要求5所述的dECM溶液，其浓度为2％至10％(w/v)，优选补充有浓度为1％至5％(w/v)的微生物明胶和/或浓度为0.2％至2％(v/v)的CMC。
13.根据权利要求12所述的脉管生物墨水，所述墨水包含至少一种选自以下的动物源性或人源性添加剂：浓度为3至300μg/mL、优选100μg/mL的纤维连接蛋白，浓度为10至30ng/mL、优选30ng/mL的VEGF，浓度为10至20ng/mL、优选20ng/mL的FGF，浓度在100和300nM之间、优选为100nM的PGE2，密度在0.1至10×107细胞/mL脉管生物墨水之间的内皮细胞，密度在0.1至10×106细胞/mL脉管生物墨水之间的成纤维细胞。
14.一种三维结构，所述三维结构包括至少三个相邻的生物墨水层，其中根据权利要求12或13所述的脉管生物墨水层布置在根据权利要求7至9中之一所述的初级生物墨水的两层之间。
15.一种三维结构的制备方法，其中根据权利要求7至9所述的初级生物墨水和根据权利要求12或13所述的脉管生物墨水在3D生物打印过程中以5mm/s至50mm/s的打印速度、4kPa至300kPa的压力和4℃至37℃的温度逐层沉积，并且其中在沉积期间或沉积之后，使初级生物墨水暴露于紫外光和/或可见光至少5秒，优选波长为365nm至405nm，更优选波长为405nm。
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