KR101848997B1 - 간 조직의 탈세포화 방법 - Google Patents

Abstract

탈세포의 대상이 되는 간 조직을 준비하는 단계, 계면활성제 및 고장용액이 포함되어 혼합된 탈세포화 용액을 이용하며, 간 조직의 세포를 파괴하여 탈세포화 물질로 변화시키는 세포제거단계, 세포제거단계 이후 탈세포화 물질을 살균 및 소독하는 살균소독단계를 포함하는 간 조직의 탈세포화 방법이 제공될 수 있다.
본 발명에 따른 간 조직의 탈세포화 방법, 탈세포화 물질 및 탈세포화 간 세포를 포함하는 바이오 잉크는 탈세포화 공정시 고장용액을 이용하여 신속하게 처리할 수 있으며, 잔여 DNA량 제거율을 높이고 세포외기질 성분의 잔존량은 증가시킨 3D 프린팅용 재료를 제공할 수 있다.

Description

간 조직의 탈세포화 방법{THE METHOD FOR DECELLULARIZATION OF LIVER}

본 발명은 간 조직의 탈세포화 방법, 탈세포화 물질 및 바이오 프린팅을 위한 바이오 잉크에 관한 것이며, 보다 상세하게는 탈세포화 용액을 이용하여 간조직을 신속하게 탈세포화 하는 방법, 이를 이용한 탈세포화 물질 및 이를 통하여 제작된 바이오 잉크에 관한 것이다.

최근들어 3차원 바이오 프린팅 기술을 응용하여 인체 이식이 가능한 인공 조직/장기의 개발 및 신약 개발을 위한 플랫폼 개발 등을 위한 용도로 3차원 바이오 프린팅 기술에 적용 가능한 바이오 잉크의 연구가 활발히 이루어지고 있다. 이는 세포에 직접적으로 영향을 주는 세포외기질의 성분을 모사해주기 위함이다. 현재까지 다양한 바이오 잉크의 연구들이 진행되어 왔었으나, 기존 조직의 모든 세포외기질 성분을 포함할 수 있는 조직별 세포외기질 기반 바이오 잉크는 다양한 바이오 잉크 종류를 중에서도 조직 재생에 있어서 가장 적합한 바이오 잉크로 여겨지고 있다.

조직별 세포외기질 기반 바이오 잉크는 탈세포화 과정을 필요로 한다. 탈세포화 과정을 통해 세포 성분만을 제거하고 세포외기질 성분만이 남게 된다. 따라서, 간 바이오잉크제작을 위해선 간 생체조직의 탈세포화 과정을 필수적으로 거쳐야 한다. 한편 이러한 탈세포화 생채조직에 대하여는 대한민국 등록특허 제1628821 호에 나타나 있다. 그러나 이러한 선행기술에서의 탈세포화 공정은 많은 시간이 소요되는 문제점이 있었다.

대한민국 등록특허 제1628821 호

본 발명은 종래의 탈세포화 시 시간이 많이 소요되는 문제점을 해결하며, 간 세포의 생존력을 향상시키는 물질을 생성하기 위한 간 조직의 탈세포화 방법 및 탈세포화 간 성분을 포함하는 3D 프린팅을 위한 바이오 잉크를 제공하는 것이다.

상기 과제의 해결 수단으로서, 탈세포의 대상이 되는 간 조직을 준비하는 단계, 계면활성제 및 고장용액이 포함되어 혼합된 탈세포화 용액을 이용하며, 간 조직의 세포를 파괴하여 탈세포화 물질로 변화시키는 세포제거단계, 세포제거단계 이후 탈세포화 물질을 살균 및 소독하는 살균소독단계를 포함하는 간 조직의 탈세포화 방법이 제공될 수 있다.

여기서 고장용액은 0.3M 내지 1.0M 의 NaCl 용액일 수 있다.

그리고 계면활성제는 3% 트리톤 X-100(Triton X-100)를 포함할 수 있다.

한편, 간 조직을 준비하는 단계, 세포제거단계 또는 살균소독단계 이후 수행되는 세정단계를 더 포함할 수 있다.

이때, 세포제거단계는 7시간 내지 10시간 수행될 수 있다.

그리고 세포제거단계의 수행시간은 전체 탈세포화 공정 대비 70%를 초과하지 않을 수 있다.

한편, 세포제거단계에서 간 조직의 부피는 탈세포화 용액 부피의 5% 이내로 하여 수행될 수 있다.

또한 간 조직을 준비하는 단계는, 간 조직을 1mm 이하의 두께의 절편조직을 이용하여 수행될 수 있다.

이때, 살균소독단계는 과초산이 0.1% 이내로 포함된 P.B.S. 용액으로 수행될 수 있다.

추가로, 간 조직을 계면활성제 및 고장용액이 포함되어 혼합된 탈세포화 용액을 이용하며, 간 조직의 세포를 파괴하여 탈세포화 조직으로 변화시키며,

탈세포화 조직을 살균 및 소독하여 생성되는 간 조직의 탈세포화 물질이 제공될 수 있다.

이때, 고장용액은 0.3M 내지 1.0M 의 NaCl 용액일 수 있다.

이에 더하여, 간 조직을 계면활성제 및 고장용액을 포함한 탈세포화 용액으로 처리하여 생성된 탈세포화 물질, 탈세포화 물질과 함께 3D 프린팅 될 수 있도록 구성된 하이드로젤을 포함하는 탈세포화 간 성분을 포함하는 바이오 잉크가 제공될 수 있다.

이때, 고장용액은 0.3M 내지 1.0M 의 NaCl 용액일 수 있다.

그리고 계면활성제는 3% 이내의 트리톤 X-100(Triton X-100)를 포함할 수 있다.

나아가 하이드로젤은 젤라틴 및 콜라겐 중 적어도 하나를 포함하며, 소정온도 이상에서 젤화될 수 있다.

한편, 탈세포화 물질은 7시간 내지 10시간 동안 탈세포화 용액을 이용하여 탈세포화시키는 과정을 포함하여 생성될 수 있다.

나아가 탈세포화시키는 과정은 전체 탈세포화 공정 대비 60%를 초과하지 않을 수 있다.

그리고 탈세포화 물질은 5% 이내의 함량으로 구성될 수 있다.

본 발명에 따른 간 조직의 탈세포화 방법, 탈세포화 물질 및 탈세포화 간 세포를 포함하는 바이오 잉크는 탈세포화 공정시 고장용액을 이용하여 신속하게 처리할 수 있으며, 잔여 DNA량 제거율을 높이고 세포외기질 성분의 잔존량은 증가시킨 3D 프린팅용 재료를 제공할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 제1 실시예인 간 조직의 탈세포화 방법의 순서도이다.
도 2는 제1 실시예에 따른 탈세포화 전후의 간 조직의 모습이다.
도 3는 고장용액의 농도에 따른 세포외기질 및 DNA잔존량이 나타난 그래프이다.
도 4는 제1 실시예에 따른 탈세포화 물질에서 배양된 간 세포의 기능 향상이 나타난 그래프이다.
도 5는 제1 실시예에 따른 탈세포화 물질에서 배양된 줄기세포의 분화 효능이 나타난 그래프 및 사진이다.
도 7은 제2 실시예에 따른 바이오 잉크의 개념도이다.
도 7은 제2 실시예에 따른 바이오 잉크의 특성이 나타난 그래프이다.
도 8은 제2 실시예에 따른 바이오 잉크의 특성이 나타난 그래프이다.
도 9은 제2 실시예의 노즐 및 압력에 따라 프린팅된 잉크의 특징을 도시한 그래프이다.

이하, 본 발명의 실시 예에 따른 간조직의 탈세포화 방법 및 탈세포화 간 세포를 포함하는 바이오 잉크에 대하여, 첨부된 도면을 참조하여 상세히 설명한다. 그리고 이하의 실시예의 설명에서 각각의 구성요소의 명칭은 당업계에서 다른 명칭으로 호칭될 수 있다. 그러나 이들의 기능적 유사성 및 동일성이 있다면 변형된 실시예를 채용하더라도 균등한 구성으로 볼 수 있다. 또한 각각의 구성요소에 부가된 부호는 설명의 편의를 위하여 기재된다. 그러나 이들 부호가 기재된 도면상의 도시 내용이 각각의 구성요소를 도면내의 범위로 한정하지 않는다. 마찬가지로 도면상의 구성을 일부 변형한 실시예가 채용되더라도 기능적 유사성 및 동일성이 있다면 균등한 구성으로 볼 수 있다. 또한 당해 기술분야의 일반적인 기술자 수준에 비추어 보아, 당연히 포함되어야 할 구성요소로 인정되는 경우, 이에 대하여는 설명을 생략한다.

이하에서의 간 조직은 생명체로부터 추출된 간 조직을 뜻하며, 생체 내에서 이루어지는 것을 뜻하는 것이 아니다.

도 1은 본 발명에 따른 제1 실시예인 간 조직의 탈세포화 방법의 순서도이다.

도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 간 조직의 탈세포화 방법은 간 조직 준비단계(S100), 세포제거단계(S200), 살균소독단계(S300), 세척단계(S400)를 포함하여 구성될 수 있다.

간 조직 준비단계(S100)는 탈세포화의 처리의 대상이 되는 간을 적절한 크기 및 상태로 준비하는 단계에 해당한다. 효율적인 탈세포화를 위하여 간조직을 2mm이하의 절편으로 잘라 준비할 수 있다. 한편 이는 일 예이며, 분쇄 등 다양한 방법을 이용하여 탈세포화 공정을 수행할 수 있도록 적절한 크기로 준비될 수 있다.

세척단계(S400)는 간 조직 준비단계(S100) 수행된 이후 잔존 용액 및 불순물을 세척할 수 있도록 구성된다. 세척단계(S400)는 세척액을 이용하여 수행될 수 있으며, 세척액은 증류수가 이용될 수 있다. 세척단계(S400)는 간 조직과 세척액을 함께 교반시켜 수행될 수 있다. 세척단계(S400)의 일 예로 상온에서 2시간 내외로 수행될 수 있다.

세포제거단계(S200)는 간 조직에 포함되어 있는 세포 및 세포외기질을 처리하여 탈세포화 물질로 변화시키는 과정이다. 세포제거단계(S200)는 계면활성제 및 고장용액이 포함된 탈세포화 용액을 이용하여 간 조직과 함께 교반하여 수행될 수 있다.

세포제거단계(S200)에서 계면활성제는 비이온 계면활성제를 이용한다. 이때 세포외기질의 다양한 단백질과 당단백질 및 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan, GAG) 등의 손상을 최소화시킬 수 있고, 간 세포에 포함되어 있는 DNA를 파괴시킬 수 있다. 본 실시예에서는 일 예로서, 3% 이내의 트리톤 X-100(Triton X-100)이 포함되어 계면활성제로 이용할 수 있다.

고장용액은 탈세포화 효율을 증가시킬 수 있도록 전술한 계면활성제와 함께 사용된다. 고장용액은 일반적인 식염수보다 높은 농도로 구성될 수 있다. 즉 기존 식염수 농도의 3배 이상의 고장용액을 이용하할 수 있으며, 본 실시예에서는 일 예로서, 0.3M 내지 1.0M의 NaCl 용액이 이용될 수 있다. 보다 구체적으로는 0.5M의 NaCl용액을 함께 사용할 때 세포외기질의 잔존량이 가장 많았으며, DNA의 잔존량이 가장 적음이 실험으로 밝혀졌다.

세포제거단계(S200)에서는 조직과 탈세포화 용액의 비율이 1/20 이하의 조건으로 수행될 수 있다. 즉 조직의 부피가 용액의 10% 이내로 하여 수행될 수 있다. 조직의 부피가 용액의 약 10%를 경계로 하여 10%이내인 경우 유사한 결과를 얻을 수 있음이 실험을 통하여 입증되었다.

한편, 세포제거단계는(S200) 지속적으로 탈세포화가 이루어 질 수 있도록 3시간마다 주기적으로 탈세포화 용액을 교체하여 수행될 수 있다. 지속적으로 적절한 농도로 간 조직을 처리할 수 있으며, 교체시 동일한 양의 탈세포화 용액으로 교체될 수 있다.

세포제거단계(S200)는 상온에서 수행될 수 있으며, 전체 탈세포화 공정 대비 70%를 초과하지 않는 시간동안 수행될 수 있다. 일 예로서, 후술할 단계를 모두 포함하여 전체 소요시간이 15시간인 경우 7시간 내지 10시간 동안 수행될 수 있다. 이 경우 7시간 및 10시간 인 경우 탈세포화 용액의 교체는 각각 2회 및 3회 이루어 질 수 있다.

세포제거단계(S200) 이후 전술한 세척단계(S400)가 수행될 수 있다. 이 경우에도 일 예로서 상온에서 2시간동안 세척이 이루어 질 수 있다.

살균소독단계(S300)는 탈세포화 물질 내에 존재하는 미생물 등을 사멸시키기 위하여 살균하는 단계에 해당한다. 살균소독단계(S300)는 살균 소독액을 이용하여 진행되며, 소독액은 미생물의 세포막을 파괴하는 효과가 있는 과초산(peracetic acid)을 포함한 용액일 수 있다. 구체적으로 P.B.S.(Phosphate buffer saline)에 1% 과초산(Peracetic acid)이 포함된 용액이 사용될 수 있다. 살균소독단계(S300)는 탈세포화 조직과 살균 소독액을 혼합하고 교반기를 이용하여 적절하게 교반시킴으로써 이루어질 수 있다. 살균소독단계(S300)는 상온에서 수행될 수 있으며, 1시간 이상의 시간동안 수행될 수 있다.

살균소독단계(S300) 이후 전술한 세척단계(S400)가 수행될 수 있다. 이 경우에도 일 예로서 상온에서 1시간동안 세척이 이루어 질 수 있다.

전술한 본 발명의 제1 실시예인 간 조직의 탈세포화 방법은 간 조직의 탈세포화 방법은 계면활성제와 고장용액을 함께 사용하여 세포파괴단계의 시간을 획기적으로 단축시킬 수 있어 전체 공정이 15시간 이하로 수행될 수 있다. 기존의 72시간 이상의 시간이 소요되었던 간 조직의 탈세포화 과정을 획기적으로 줄일 수 있게 된다.

이하에서는 본 발명에 따라 생성된 간 조직의 탈세포화 물질의 특성에 대하여 도 2 내지 도 5를 참조하여 상세히 설명하기로 한다.

도 2는 제1 실시예에 따른 탈세포화 전후의 간 조직의 모습이다.

도시된 바와 같이, 대표적인 세포외기질인 Histological(a), Glycosaminoglycans(b), Fibronectin(c) 및 Collagen(d)의 탈세포화 전 및 탈세포화 후의 모습이 촬영되어 있다. 상측의 사진은 간 조직의 탈세포화 전의 모습이며, 조직내에 보이는 점들은 간 세포에 해당한다. 탈세포화 방법을 수행한 이후에는 세포외 기질의 모습이 처리전과 유사하게 남아 있으며, 세포가 파괴되어 보이지 않은 모습이 도시되어 있다. 따라서 세포활동이 중단되며 세포의 성분 및 세포외기질의 성분만을 제공할 수 있는 환경을 만들 수 있게 된다.

도 3는 고장용액의 농도에 따른 세포외기질 및 DNA잔존량이 나타난 그래프이다.

도시된 바와 같이, 고장용액의 농도를 달리하여 수행한 시험하였으며, 세포외기질의 대표적 성분인 클리코사미노글리칸(Glycosaminoglycan, GAG)의 잔존량 비교를 수행한 결과 탈세포화 전 GAG의 잔존량 대비 고장용액의 농도가 0.3M 내지 1.0M을 이용한 경우 그 양이 잘 보존됨을 알 수 있었다.

탈세포화 과정을 통하여 세포외기질의 잔존량을 극대화시키는 것이 바람직하다. 이때 고장용액을 포함한 탈세포화 용액을 이용한 경우 세포외기질 성분이 파괴되어 손실되지 않고 보존되며, 세포가 파괴됨에 따라 추가되는 양이 포함되어 처리 전 세포외기질의 양보다 증가된 실험결과가 도시되어 있다. 한편 탈세포화 용액에 포함된 고장용액의 농도가 0.5M 인 경우 GAG의 잔존량이 가장 많아 가장 좋은 효과가 있음을 실험으로 얻을 수 있었다.

한편, 간 조직의 탈세포화 후 DNA함량을 살펴보면 처리 전 DNA량을 기준으로 할 때, 계면활성제만을 사용한 경우 약 60% 정도가 잔존하였으며, 고장용액을 함께 사용한 경우 30% 내외로 잔존하게 되는 결과를 실험적으로 얻을 수 있었다.

결국 계면활성제와 고장용액을 사용하여 세포외기질의 잔존량은 극대화하면서 DNA의 잔존량은 고장용액을 사용하지 않을 때보다 2배 이상으로 줄일 수 있음을 확인하였다.

도 4는 제1 실시예에 따른 탈세포화 물질에서 배양된 간 세포의 기능 향상이 나타난 그래프이다. 도시된 바와 같이, 간 조직의 탈세포화 된 물질을 이용하여 실제 간 세포를 배양할 수 있게 된다. 이때 중합효소 연쇄반응분석법(PCR)을 이용하여 각 성분의 잔존량을 분석하였다.

간 조직 내에 존재하는 세포들의 대사에 따라 발생하는 대표적인 단백질의 배수 변화량(Fold Change)을 살펴보면 콜라겐 내에서 배양할 때보다 간조직 탈세포화 물질 속에서 배양하는 경우 간 세포의 기능이 월등함을 알 수 있다.

구체적으로 Albumin(ALB), Alpa-feptoprotein(AFP), Cytokeratin18(CK18), Transthyretin(TTR)은 간 조직의 특정 마커(marker)로 간 세포의 대사에 따라 생성되는 대표적인 단백질이며, 콜라겐 내에서 배양시보다 2배 내지 6배 이상의 기능향상 효과를 확인할 수 있다. (도 4 (a))

또한 탈세포화 물질에서 배양된 간 세포에서 분비되는 Albumin(ALB)을 시간의 흐름에 따라 비교해보면 콜라겐에서 배양된 간세포보다 더 많은 Albumin이 분비되어 간 세포의 성장에 적합한 결과를 실험을 통하여 얻을 수 있었다(도 4 (b)). 이는 고장용액을 포함한 탈세포화 용액을 이용하여 탈세포화 과정에서 보다 많은 세포외기질이 잔존하게 되는 것으로부터 기인하며, 결국 간세포의 배양능력이 향상되어 결과적으로 간 세포의 대사가 상승하게 된다.

도 5 및 도 6은 제1 실시예에 따른 탈세포화 물질에서 배양된 줄기세포의 분화 효능이 나타난 그래프 및 사진이다.

도시된 바와 같이, 간 조직의 탈세포화 물질은 줄기세포의 분화에도 효능이 있음이 실험결과로부터 얻을 수 있었다. 간 조직 탈세포화 물질의 분화능 효과를 PCR로 분석한 결과 특정 유전자 표지(HNF1A, HNF3B, HNF4A)의 배수 변화량(Fold change)을 살펴보면, 콜라겐 내에서 배양한 경우에 비하여 2배 이상이 증가됨을 실험을 통하여 확인할 수 있었다.(도 5 (a))

한편, 간 조직 특정 마커(marker) 단백질을 살펴보면 콜라겐 내에서 줄기세포를 배양한 경우보다 Albumin의 양이 현저하게 증가하였으며, 기타 다른 단백질(AFP, CK18, TTR) 또한 그 발생량이 증가됨을 확인할 수 있었다.(도 5 (b))

또한 콜라겐 및 탈세포화 물질에서 줄기세포를 배양하고 다양한 물질의 발현 여부를 확인한 결과 특히 HNF4a(도 6 (b)), AFP(도 6 (c))의 발현량이 탈세포화 물질 내에서 현저하게 증가됨을 확인할 수 있었다.

이하에서는 본 발명의 제2 실시예인 탈세포화 물질을 포함하는 3D바이오 잉크에 대하여 상세히 설명하도록 한다.

도 7은 제2 실시예에 따른 바이오 잉크의 개념도이며, 도 8은 바이오 잉크의 특성이 나타난 그래프이다.

도시된 바와 같이, 탈세포화 물질을 포함하는 바이오 잉크는 간 조직(a)을 절편조직으로 자르고(b) 탈세포화 과정을 거친 탈세포화 물질(c)과 하이드로젤(d)을 포함하여 구성될 수 있다. 탈세포화 물질이 프린팅 될 수 있는 적절한 강도 및 점성을 가질 수 있도록 하이드로젤과 함께 프린트되며 3차원 적인 구조로 프린팅(e)이 가능하다.

3D바이오 잉크는 탈세포화 물질을 포함하여 구성될 수 있다. 3D바이오 잉크의 제작시 사용되는 탈세포화 물질은 잔여 DNA함량이 3% 이내로 구성될 수 있다. 이때 탈세토화 과정은 전술한 제1 실시예를 통하여 이루어 질 수 있다. 한편, 바이오 잉크 제작 시 탈세포화 물질이 너무 많은 함량을 갖는 경우 적절한 점성이 유지되지 않아 프린팅하는데 적합하지 않고 3D 프린팅 시 적절한 강성을 확보할 수 없어 원하는 구조의 프린팅이 어려워진다. 따라서 3D 프린팅용 바이오 잉크는 1% 내지 3% 의 탈세포화 물질을 포함할 수 있다. (도 8 (a))

이때 탈세포화 물질이 3% 및 1.5% 인 경우 각각의 손실 탄성률(Loss modulus)와 저장 탄성률(storage modulus)로 나타낸 그래프가 도시되어 있다. 이때 각각의 탄성률은 탈세포화 물질의 함유량에 따라 달라질 수 있으며, 일 예로 1.5% 및 3 % 포함시에는 프린팅하기에 적절한 수치의 탄성률을 갖게 된다. 한편 3D 프린팅의 구조 등에 따라서 적절한 탄성률을 가질 수 있도록 탈세포화 물질의 함유량을 변화시킬 수 있다.(도 8 (b))

하이드로젤은 젤라틴 및 콜라겐 중 적어도 하나를 포함하여 구성될 수 있다. 하이드로젤은 특정온도 또는 특정 pH에서 액체와 젤 상태로 변화될 수 있다(도 8 (c)). 하이드로젤은 프린팅하여 장기 칩 등을 제작하는 경우 제작 과정에서 탈세포화 물질이 프린팅 되기에 적절한 물성치를 갖도록 부가되며, 제작 이후에는 불필요한 성분이 된다. 따라서 제거되는 것이 바람직하므로 프린팅이 완료된 뒤 적절한 온도변화를 주어 액체로 상변화를 시킨 뒤 하이드로젤 만을 3D 구조물에서 제거할 수 있게 된다.

도 9은 제2 실시예의 노즐 및 압력에 따라 프린팅된 잉크의 특징을 도시한 그래프이다.

도시된 바와 같이, 200㎛ 의 직경을 가진 노즐을 통하여 3D 프린팅을 수행할 때 1.5%의 탈세포화 물질이 포함되는 경우 프린팅 속도에 따른 선폭 두께를 제어할 수 있게 된다. 정밀한 3D 프린팅을 위하여 프린팅 속도, 압력, 선폭 두께(strut width)의 조절이 용이해야 하며, 3%의 탈세포화 물질을 포함하는 경우 각 압력 차이에 따라 프린팅 속도, 선폭두께의 변화량이 유사한 경향성을 갖게 된다. (도 9 (a))

한편, 노즐의 직경이 보다 큰 경우 400㎛ 에도 Feeding rate 가 높아지면 선폭이 좁아지는 경향이 나타났으며, 압력에 따른 변화를 살펴볼 때 유사한 경향을 확인하였으며, 이를 이용하여 3D 프린팅 시 용이하게 제어할 수 있게 된다. (도 9 (b))

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 간 조직의 탈세포화 방법, 탈세포화 물질 및 이를 포함하는 바이오 잉크는 탈세포화시 계면활성제와 고장용액을 이용하여 탈세포화 전체 공정소요시간을 획기적으로 단축할 수 있으며, 세포외기질의 잔존량은 증가시키고, DNA의 잔존량은 줄일수 있는 효과를 발휘할 수 있다.

S100:간 조직 준비단계
S200: 세포제거단계
S300: 살균소독단계
S400:세척단계

Claims (18)

1. 삭제
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10. 탈세포의 대상이 되는 간 조직을 준비하는 단계;
    트리톤 X-100(Triton X-100)를 포함하는 계면활성제 및 NaCl 용액이 포함되어 혼합된 탈세포화 용액을 이용하며, 상기 간 조직의 세포를 파괴하여 탈세포화 물질로 변화시키는 세포제거단계; 및
    상기 세포제거단계 이후 상기 탈세포화 물질을 살균 및 소독하는 살균소독단계를 포함하는 간 조직의 탈세포화 방법.
11. 제10 항에 있어서,
    상기 NaCl 용액은 0.3M 내지 1.0M 인 것을 특징으로 하는 간 조직의 탈세포화 방법.
12. 제11 항에 있어서,
    상기 계면활성제는 3%의 트리톤 X-100(Triton X-100)를 포함하는 것을 특징으로 하는 간 조직의 탈세포화 방법.
13. 제11 항에 있어서,
    상기 간 조직을 준비하는 단계, 상기 세포제거단계 또는 상기 살균소독단계 이후 수행되는 세정단계를 더 포함하는 간 조직의 탈세포화 방법.
14. 제11 항에 있어서,
    상기 세포제거단계는 7시간 내지 10시간 수행되는 것을 특징으로 하는 간 조직의 탈세포화 방법.
15. 제11 항에 있어서,
    상기 세포제거단계의 수행시간은 전체 탈세포화 공정 대비 70%를 초과하지 않는 것을 특징으로 하는 간 조직의 탈세포화 방법.
16. 제11 항에 있어서,
    상기 세포제거단계에서 상기 간 조직의 부피는 상기 탈세포화 용액 부피의 10% 이내로 하여 수행되는 것을 특징으로 하는 간 조직의 탈세포화 방법.
17. 제11 항에 있어서,
    상기 간 조직을 준비하는 단계는,
    상기 간 조직을 2mm 이하의 두께의 절편조직을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 간 조직의 탈세포화 방법.
18. 제11 항에 있어서,
    상기 살균소독단계는 과초산이 1% 이내로 포함된 P.B.S. 용액으로 수행되는 것을 특징으로 하는 간 조직의 탈세포화 방법.

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