KR102450461B1

KR102450461B1 - 인체 유래 무세포 진피 기질의 제조방법

Info

Publication number: KR102450461B1
Application number: KR1020200080177A
Authority: KR
Inventors: 박희준; 윤홍선; 박초희; 문보미; 김귀재
Original assignee: (주)시지바이오
Priority date: 2020-06-30
Filing date: 2020-06-30
Publication date: 2022-10-05
Also published as: KR20220001799A

Abstract

본 발명은 탈표피, 탈지방 및 탈세포를 동시에 수행할 수 있는 인체 유래 무세포 진피 기질의 제조방법에 대한 것으로,
구체적으로
(i) 별도의 탈표피 및 탈지방 공정을 수행하지 않은 인체 유래 피부 조직을 준비하는 단계;
(ii) 상기 피부 조직을 계면활성제(surfactant)가 포함된 저장성(hypotonic) 용액으로 처리하는 단계; 및
(iii) 상기 (ii) 단계에서 수득된 피부 조직을 등장성(isotonic) 용액으로 세척하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 공정은, 인체 유래 피부 조직에 이온성 계면활성제가 포함된 저장성 용액을 처리할 시, 탈표피, 탈지방 및 탈세포를 one-step으로 수행함으로써 무세포 진피 가공 공정의 시간을 단축시킬 수 있으며 공정의 편의성이 크게 증대될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 공정은 조직의 손상(damage)을 최소화하고, 조직 내 세제(detergent) 잔류량이 감소하며, 세포 독성에 대한 안전성이 우수한 장점도 있다.

Description

인체 유래 무세포 진피 기질의 제조방법{Manufacturing method of acellular dermal matrix derived from human}

본 발명은 탈표피, 탈지방 및 탈세포를 동시에 수행할 수 있는 인체 유래 무세포 진피 기질의 제조방법에 대한 것으로,

구체적으로

(i) 별도의 탈표피 및 탈지방 공정을 수행하지 않은 인체 유래 피부 조직을 준비하는 단계;

(ii) 상기 피부 조직을 계면활성제(surfactant)가 포함된 저장성(hypotonic) 용액으로 처리하는 단계; 및

(iii) 상기 (ii) 단계에서 수득된 피부 조직을 등장성(isotonic) 용액으로 세척하는 단계;

를 포함하는 것을 특징으로 한다.

무세포 진피 기질(acellular dermal matrix)은 탈세포화(decellularization) 과정을 거치고 남은 세포 외 기질(extracellular matrix)로, 이식된 조직으로부터 새로운 세포와 혈관이 자라 들어오는 주형(scaffold) 역할을 한다(진웅식, 서울대학교 대학원 학위논문, 2016).

무세포 진피 기질(acellular dermal matrix)은 1970년대 응급의료가 발전하던 시기에, 화상 환자에게 적용됨으로써 처음 개발되었으며, 현재는 화상 이외에도 외상, 궤양, 복벽재건, 유방재건, 성대마비성형, 치간 유두이식 등 다양한 조직 재생 및 재건 목적으로 사용되고 있으며 특히, 창상피복재 및 인공피부에 널리 사용되고 있다.

무세포 진피 기질(acellular dermal matrix)의 재료는 크게 동종진피와 이종진피 재료로 나눌 수 있으며, 현재 임상에서 사용하는 것은 돼지의 건조진피, 키틴막, 우레탄막, 시체에서 채취한 피부 등이 있다.

상기 재료를 이용한 무세포 진피 기질을 제조하는 방법은 일반적으로 공여자로부터 적출된 피부조직에서 표피층을 분리하여 진피층을 수득하는 단계, 분리된 진피층으로부터 세포를 제거하여, 면역거부반응 유발물질을 제거하는 탈세포화 단계로 이루어진다.

한편, 무세포 진피 기질을 제품화한 LifeCell사는 조각낸 피부조직에 1 M NaCl을 처리하여 인간 피부의 경우 18~32시간, 돼지 피부의 경우 35~55시간 동안 37℃에서 배양(incubation)하여 표피조직을 제거한 후, 0.5% SDS HBSS와 1 mM EDTA를 포함하는 탈세포화 용액을 40±5 RPM조건에서 1시간동안 처리하여 탈세포화 시킨 후 동결보존액을 처리하는 공정을 개발한 바 있다(US5336616A).

하지만, NaCl로 표피를 제거하는 경우, 표피 분리만을 위한 공정이 별도로 필요하므로 공정시간이 길어진다. 또한, 경우에 따라서 표피와 진피가 잘 분리되지 않는다는 단점이 있다.

이에 따라, 표피조직을 제거하기 위한 수단으로, 여러 가지 단백질 분해효소를 사용하게 되었다. 엘앤씨바이오사는 중성 단백질 분해효소인 디스파아제, 터몰리신, 트립신 등을 1.0 units/ml의 농도로 37℃에서 60~120분간 처리하여 표피조직을 제거한 후, 1% Triton-X 용액으로 30℃에서 100분간 처리하여 진피층의 세포를 제거하는 공정을 2015년에 공지하였다(KR1523878B). 표피조직 제거에 단백질 분해 효소를 사용하는 경우, NaCl을 사용하는 공정보다 공정시간이 적게는 약 9배, 많게는 약 55배 단축이 되지만, 사용 농도가 낮거나 처리시간이 너무 짧으면 분리가 잘 이루어지지 않고, 농도가 높거나 처리시간이 너무 길면 세포나 조직에 손상을 일으키기 때문에, 샘플에 따라 적절한 농도와 반응시간을 조절해야 하는 것에 어려움이 있다.

이와 유사하게, 본 발명자들은 창상 피복재로 적합한 무세포 진피 기질을 포함하는 조성물에 대한 발명(KR2020-0008602A)에서 피부 조직을 탈세포화하기 위하여, 피부 조직을 1 M NaCl 용액으로 6시간 내지 24시간 동안 반응시킨 후 겸자(Forceps)를 이용하여 표피를 제거하고, 표피가 제거된 진피를 인산완충용액으로 세척한 후, 0.5% SDS(Sodium dodecyl sulfate)와 상온에서 1시간 동안 반응시켜 진피 내 세포를 제거하였다. 또한, 탈세포화 공정 전 지방을 제거하기 위하여, 지방제거 용액을 처리하는 공정을 수행하였다. 이와 같은 공정은 전체 공정시간이 약 120시간이 소요된다는 점에서 공정효율의 제고 필요성이 존재한다.

한편, Decell Technologies Inc사의 US9566369B에서는, 인체 유래 피부 조직을 저장성(hypotonic) 용액으로 처리하여 표피를 제거하고, Triton-X 100이 포함된 고장성 용액(solution comprise a high salt)으로 처리하여 탈세포화시킨 공정이 기재되어 있다. NaCl 및 단백질 분해효소를 사용하지 않고, 저장성(hypotonic) 용액으로 표피를 제거한다는 점에서, 앞선 선행문헌들의 단점을 극복하는 것으로 보인다.

하지만, 상기 공정은 탈표피 공정 후 Triton-X 100이 포함된 고장성 용액(solution comprise a high salt)을 처리하는 단계, 핵산분해효소를 처리하는 단계 및 카오트로픽제(chaotropic agent)를 처리하는 단계를 포함하는 탈세포 공정이 필수적으로 수반된다는 점에서 전체 공정시간이 오래 걸리고, 다양한 agent를 단계적으로(step by step) 처리해야 한다는 번거로움이 있다.

이렇게 기존에 다양한 기술 및 공정 들이 개발되어 있지만, 여전히 전체적인 공정 시간과 공정 단계를 줄임으로써 우수한 공정효율을 갖는 인체 유래 무세포 진피 기질의 제조방법에 대한 수요는 절실한 상황이다.

상기와 같은 피부 조직의 표피, 지방 및 세포를 제거하기 위한 공정을 각각 수행해야 하는 기존 기술의 문제점을 해결하고자, 본 발명은 별도의 탈표피 및 탈지방 공정 없이, 피부 조직의 표피, 지방 및 세포가 one step으로 제거되어, 탈표피, 탈지방 및 탈세포를 동시에 수행할 수 있는 것을 특징으로 하는 인체 유래 진피 기질의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 별도의 탈표피 및 탈지방 공정을 수행하지 않은 인체 유래 피부 조직을 계면활성제(surfactant)가 포함된 저장성(hypotonic) 용액으로 처리할 경우, 효율적으로 탈표피, 탈지방 및 탈세포 공정이 동시에 수행될 수 있을 뿐 아니라, 전체적인 공정 시간이 단축되어 공정의 효율성이 현저하게 제고될 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

구체적으로 본 발명은 탈표피, 탈지방 및 탈세포를 동시에 수행할 수 있는 인체 유래 무세포 진피 기질의 제조방법에 있어서,

를 포함하는 것을 특징으로 하는 인체 유래 무세포 진피 기질의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 공정은, 인체 유래 피부 조직에 이온성 계면활성제가 포함된 저장성 용액을 처리할 시, 탈표피, 탈지방 및 탈세포를 one-step으로 수행함으로써 무세포 진피 가공 공정의 시간을 단축시킬 수 있으며 공정의 편의성이 크게 증대될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 공정은 조직의 손상(damage)을 최소화하고, 조직 내 세제(detergent) 잔류량이 감소하며, 세포 독성에 대한 안전성이 우수한 장점도 있다.

도 1은 저농도 SDS 포함 저장성 용액을 처리한 피부 조직을 H&E 염색하여 현미경으로 촬영한 사진을 나타낸 것이다.
도 2는 신규공정의 용출물 내 잔류 detergent를 측정한 것이다.
도 3은 신규공정의 세척단계별 잔류 detergent를 측정한 것이다.
도 4는 신규공정 용출물의 세포 적합성(MTT assay)을 분석한 것이다.
도 5는 신규공정 용출물의 세포 독성(MEM Elution Test)을 분석한 것이다.
도 6은 신규공정으로 가공 후 무세포동종진피 내 Hydroxyproline assay를 통해 collagen 함량 평가 결과를 분석한 것이다.

본 발명에서는 종래 개발된 진피의 탈세포화 방법과 비교하여, 공정 효율이 개선되고, 표피, 지방 및 세포가 완벽하게 제거되며, 안전성이 우수한 인체 유래 무세포 진피 기질의 제조방법을 제공한다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 탈표피, 탈지방 및 탈세포를 동시에 수행할 수 있는 인체 유래 무세포 진피 기질의 제조방법에 있어서,

를 포함하는 것을 특징으로 하는 인체 유래 무세포 진피 기질의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에서, 상기 i) 단계에서의 진피 기질은 뼈, 인대, 건 또는 피부일 수 있으며, 이종 또는 동종 유래의 진피 조직일 수 있으나, 바람직하게는 인체 유래 진피 조직이다.

본 발명에서, 상기 ii) 단계에서의 계면활성제(ionic surfactant)는 이온성 계면활성제(ionic surfactant) 또는 비이온성 계면활성제(non-ionic surfactant)일 수 있으며, 바람직하게는 이온성 계면활성제(ionic surfactant)일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 이온성 계면활성제(ionic surfactant)는 알킬벤젠 설포네이트(alkylbenzene sulfonate), 알킬 설페이트(alkyl sulfate), 알킬 에테르 설페이트(alkyl ether sulfate), 알콕시 아마이드(alkoxylated amide), 올레핀 설포네이트 (olefin sulfonate), 알킬 자일린 설포네이트(alkyl xylene sulfonate), 디알킬 설포석시네이트(dialkyl sulfosuccinate), 지방산 에스터 설포네이트(fatty acid ester sulfonate), 알코올 설페이트(alcohol sulfate), 글리세롤 지방산에스터(glycerol fatty acid ester) 등의 글루타메이트(glutamate)계, 아이세티오네이트(isethionate)계, 라우릴 포스페이트(lauryl phosphate) 또는 라우레트 포스페이트(laureth-1-phosphate) 등의 포스페이트계, 타우레이트(taurate)계, 알콕시 알코올(alkoxylated alcohol)계, 알킬카복실(alkyl carboxylate)계, 하이드록시알킬(hydroxyalkyl), 4급 암모늄염(quaternary ammonium salt) 및 에톡시화 알킬(ethoxylated alkyl)으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

바람직하게는, 상기 이온성 계면활성제(ionic surfactant)는 SDS(sodium dodecyl sulfate), SLS(sodium laureth sulfate), SLES(sodium lauryl ether sulfate), SMES(sodium myreth sulfate), DSS(dioctyl sodium sulfosuccinate), PFOS(Perfluorooctanesulfonate), PFBS(Perfluorobutanesulfonate), PFNA(perfluorononanoate), PFOA(perfluorooctanoate), 소듐스테아레이트(sodium stearate), 소듐라우로일사코시네이트(sodium lauroyl sarcosinate), CTAB(cetrimonium bromide), CPC(cetylpyridinium chloride), BAC(benzalkonium chloride), BZT(benzethonium chloride), DDAC(dimethyldioctadecylammonium chloride) 및 DODAB(dioctadecyldimethylammonium bromide)에서 구성된 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 SDS(sodium dodecyl sulfate)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

종래 사용되는 일반적인 탈세포 지지체의 제조공정은 비이온성 계면활성제 또는 고농도의 이온성 계면활성제를 사용하는 것으로, 이는 상기 계면활성제로 세포막을 용해시키고 단백질 이외의 세포성분을 조직에서 제거하는 것이지만, 지지체 내의 잔존 단백질의 변성을 유발하고 세포외기질의 미세구조를 붕괴시키며 성장인자를 과도하게 제거한다는 단점이 있다.

따라서, 본 발명에서는 세포 제거 효율이 우수하고 조직에 손상(damage)을 덜 주는 저농도의 이온성 계면활성제, 바람직하게는 저농도의 알킬 설페이트(alkyl sulfate) 계면활성제, 더욱 바람직하게는 저농도의 SDS(sodium dodecylsulfate)를 사용하였다. 상기 SDS(sodium dodecylsulfate)의 농도는 저장성(hypotonic) 용액 내에서 0.1~0.5%(w/v), 바람직하게는 0.2~0.4%(w/v)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서, 상기 ii) 단계에서의 용어 “저장성(hypotonic)”은 반투과성 막을 사이에 둔 두 용액의 삼투압을 비교하였을 때 내부가 외부보다 더 높은 삼투압을 가지고 있는 상태 즉, 막 내부의 농도가 외부의 농도 보다 높은 상태이기 때문의 물의 순이동이 막 내부로 향해 있는 상태를 의미하며, 이러한 물의 수동적 확산 현상인 삼투 현상의 속도는 두 액간의 농도 구배와 비례하여 증가하거나 감소하고, 농도 차이가 없어질 경우 물의 순이동이 사라진다.

본 발명에서 ”저장성(hypotonic) 용액”은 삼투몰농도(osmolarity)가 약 270 mOsm/L 이하인 용액을 의미하며, 저장성 용액은 세포 용해(lysis)에 영향을 주기 위하한 처리에 이용되는데, 저장성) 용액은 삼투를 통해 세포막을 통해 세포로 유입되는 데, 이때 조직의 세포가 팽창하여 파열되어 잔존 세포들을 제거할 수 있다.

또한, 본 발명에서 용어 “삼투몰농도(osmolarity)”는 용액의 부피당 삼투 농도의 표현(mOsm/L)으로 체내 혈장 및 기타 체액 삼투농도는 270~300 mOsm/L이다.

따라서, 용액의 삼투몰농도(osmolarity)가 약 270 mOsm/L 이하이면 저장성(hypotonic) 용액, 약 270~300 mOsm/L이면 등장성(isotonic) 용액, 그리고 약 300 mOsm/L 이상이면 고장성(hypertonic) 용액으로 정의된다.

따라서, 본 발명의 저장성 용액은 270 mOsm/L 이하의 삼투몰농도(osmolarity)를 가지는 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 5~20 mM Tris-HCl, 0.1~1.5% EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid) 및 0.01~0.05 M NaOH(sodium hydroxide)를 포함하며 더욱 바람직하게는 8~12 mM Tris-HCl, 0.7~1.2%(w/v) EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid) 및 0.01~0.02 M NaOH(sodium hydroxide)를 포함한다.

또한, 본 발명에서는 상기 저장성(hypotonic) 용액을 피부 조직에 2시간 내지 10시간 동안 처리할 수 있으며, 바람직하게는 3시간 내지 9시간 동안, 더욱 바람직하게는 4시간 내지 8시간 동안 처리할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서, 상기 iii) 단계의 용어 “등장성(isotonic)”은 반투과성 막을 사이에 둔 용액의 삼투압이 같은 상태, 즉 농도가 동일하여 물의 순이동이 없는 상태를 말한다. 만일 막을 사이에 두고 용액 간의 농도가 다를 경우 물은 농도가 낮은 곳에서 높은 곳으로 이동하게 될 것이며 이러한 물의 수동적 확산 현상인 삼투 현상의 속도는 두 용액 간의 농도구배(concentration gradient)에 비례한다.

본 발명의 등장성 용액은 약 270~300 mOsm/L의 삼투몰농도(osmolarity)를 가지는 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 25~100 mM Tris-HCl, 0.1~1.5% EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid), 0.01~0.05 M NaOH(sodium hydroxide) 및 0.05~0.3 M NaCl(sodium chloride)를 포함하며 더욱 바람직하게는, 45~55 mM Tris-HCl, 0.8~1.2%(w/v) EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid), 0.01~0.02 M NaOH(sodium hydroxide) 및 0.05~0.3 M NaCl(sodium chloride)을 포함한다.

상기 등장성 용액 내 NaCl은 무세포 진피 제조 공정에서 종래 사용되는 성분으로 표피제거 목적으로 약 0.5 M 내지 2 M로 사용되었으나, 이는 피부의 원재료에 따라 표피가 잘 분리되지 않는 단점이 있다.

따라서, 본 발명에서는 세척 용액인 등장성 용액 내 NaCl을 0.05~0.5 M 농도로, 바람직하게는 0.1~0.3 M 농도로 사용하였으며, 이 조건이 무세포 진피 세척 단계에 적합한 것을 확인하였다.

상기 등장성(isotonic) 용액을 이용한 세척은 1시간 내지 10시간씩 1회 내지 10회, 바람직하게는 2시간 내지 7시간씩 1회 내지 5회 수행할 수 있다.

본 발명에 따른 인체 유래 무세포 진피 기질의 제조방법은, 상기 (ii) 단계 이후에 버퍼(buffer)를 사용하여 피부조직을 세척하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

또한, 상기 (iii) 단계 이후에 버퍼(buffer)를 사용하여 피부조직을 세척하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 버퍼(buffer)는 PBS(phosphate buffer saline), 증류수, 생리 식염수(normal saline), HBSS(Hank's balanced salt solution), TBS(Tris buffered saline), TAPS(N-Tris(hydroxy- methyl)methyl-3-aminopropanesulfonic acid) 완충용액, Bicine(N,N-Bis(2-hydroxyethyl) glycine) 완충용액, HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) 완충용액, TES(NTris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonicd acid) 완충용액, PIPES(piperazine- N,N'-bis(2-ethanesulfonic acid) 완충용액, 카코딜레이트(cacodylate) 완충용액, MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) 완충용액, MEM(Minimum Essential Media), DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Media), RPMI1640, IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Media), Defined Keratinocyte-SFM(without BPE(bovine pituitary extract)), Keratinocyte-SFM(with BPE), KnockOut D-MEM, AmnioMAX-II Complete Medium, AmnioMAX-C100 Complete Medium 및 이의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 버퍼(buffer)를 이용한 세척은 4~45℃의 온도 조건에서 overnight 및/또는 5~60분씩 1회 내지 10회 수행할 수 있으며, 바람직하게는 overnight 및/또는 5~30분씩 1회 내지 5회 수행할 수 있다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 인체 유래 무세포 진피 기질의 제조방법은, 별도의 탈표피 및 탈지방 공정을 수행하지 않은 인체 유래 피부 조직피부 조직을 이온성 계면활성제가 포함된 저장성(hypotonic) 용액으로 처리한 후, 버퍼(buffer), 바람직하게는 PBS(phosphate buffer saline)를 사용하여 피부조직을 세척하고, 등장성(isotonic) 용액으로 피부조직을 세척한 후, 다시 버퍼(buffer), 바람직하게는PBS(phosphate buffer saline)를 사용하여 피부조직을 세척할 수 있다.

구체적으로, 상기 (i) 단계의 피부 조직을 이온성 계면활성제가 포함된 저장성 용액으로 처리한 후, 버퍼(buffer), 바람직하게는 PBS(phosphate buffer saline)로 overnight 및/또는 5~60분씩 1회 내지 10회, 바람직하게는 overnight 및/또는 5분~30분씩 1회 내지 5회 세척할 수 있다. 이후, 등장성(isotonic) 용액으로 1시간 내지 10시간씩 1회 내지 10회, 바람직하게는 2시간 내지 7시간씩 1회 내지 5회 세척한 후, 다시 버퍼(buffer), 바람직하게는 PBS(phosphate buffer saline)로 overnight 및/또는 5~60분씩 1회 내지 10회, 바람직하게는 overnight 및/또는 5분~30분씩 1회 내지 5회 세척할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 인체 유래 진피 기질의 탈세포화 방법

사체에서 분리한 피부조직을 EURO skin bank, Allosource, CTS에서 구입한 후, 두께가 1 mm 이상인 조직을 선별하여 무세포 진피 기질 제조에 사용하였다.

상기 피부조직에 붙어 있는 지방조직을 겸자(Forceps)를 이용하여 제거한 후, 무균수로 3회 세척하였다. 그런 다음, 10 mM Tris-Hcl, 1g EDTA, 13.5mL 1M NaOH 및 0.25% SDS 포함 저장성 용액에 상기 피부조직을 침지시킨 후 6시간 반응시켰다.

상기 저장성 용액을 지방, 표피 및 세포를 제거한 후, 잔존하는 지방, 표피, 세포 및 SDS를 제거하기 위하여, 4℃에서 PBS 세척을 overnight한 후, 등장성 용액(50 mM Tris-HCl, 1g EDTA, 0.15 M NaCl, 13.4mL NaOH)으로 6시간 세척하였다.

실시예 2: 탈세포화 평가(H&E staining)

상기 실시예 1을 통해 획득한 인체 유래 진피 기질을 H&E 염색법을 이용한 조직학적 검사를 통해 탈세포화 평가를 수행하였다.

파라핀 블록을 4 ㎛ 두께로 박절한 후 건조시켜 파라핀 절편을 제작하였다. 이후, 탈파라핀 과정을 위해 자일렌에서 5분간 3번, 100% 에탄올에서 2분간 3번, 90% 에탄올에서 1분간 1번, 80% 에탄올에서 1분간 1번, 70% 에탄올에서 1분간 1번 반응시킨 후, 흐르는 물에 10분간 세척하였다. 헤마토자일린(Hematoxylin) 염색액에 10분간 반응시킨 후 흐르는 물에 3분간 세척하고, 에오신(Eosin) 염색액에 10분간 반응시킨 후 흐르는 물에 에오신 염색액이 나오지 않을 때까지 세척하였다. 70% 에탄올에 1초간 10번, 80% 에탄올에 1초간 10번, 90% 에탄올에 1초간 10번, 100% 에탄올에 1분간 2번, 자일렌에 3분간 3번 반응시킨 후, 마운팅 용액으로 마운팅하였고, 실시예의 피부를 광학 현미경(Olympus BX51, H&E staining) 및 주사 전자현미경(Hitachi S-4700, 일본)으로 촬영하여 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타난 바와 같이, 저농도 SDS 포함 저장성 용액을 처리한 피부 조직을 H&E 염색하여 현미경으로 촬영한 결과, 대조군(Fresh skin)과 비교하여 표피가 박리된 것을 확인할 수 있었다.

또한, 같은 시간 동안 처리되는 조건하에 1% Triton X-100, 1% Tween 80, 0.1% SDS 용액 및 0.25% SDS 포함 저장성 용액의 탈세포화 효과를 비교한 결과, 1% Triton X-100, 1% Tween 80 및 0.1% SDS용액을 처리한 피부 조직의 세포는 제거되지 않았고, 0.25% SDS 포함 저장성 용액을 처리한 경우, 조직 내 세포가 대부분 제거되었음을 관찰할 수 있었다(data not shown).

또한, Sonication을 1시간 동안 반응시킨 피부 조직과 Sonication을 1시간 반응 및 1% Triton X-100을 처리한 군에서는 세포가 제거되지 않고 조직이 손상되는 것을 관찰할 수 있었다(data not shown).

이에 따라, 표피제거(NaCl 또는 단백분해효소 이용) 및 지방제거(HIPS 이용) 공정을 거치지 않은 피부 조직에 1% Triton X-100, 1% Tween 80 및 0.1% SDS 용액과 같은 계면활성제 용액을 처리할 경우, 탈세포화가 되지 않음을 확인하였고, 이와 똑같은 조건에서 0.25% SDS 포함 저장성 용액을 처리할 경우, one step으로 표피, 지방 및 세포가 제거되는 것을 확인하였다.

또한, 표피, 지방 및 세포를 한번에 제거하기 위하여 sonication과 같은 물리적인 공정 및 계면활성제를 조합한 물리적인 공정을 수행하더라도, 세포가 제거되지 않는 것을 확인하였다.

실시예 3: Detergent 잔류량 평가

조직 내 detergent 잔류량을 평가하기 위해 methylnen blue dye binding assay를 수행하였다.

기존공정(NaCl을 이용한 표피 제거, 지방제거 및 SDS를 이용하여 세포를 제거한 시료) 및 신규공정(본 발명의 0.25% SDS 포함 저장성 용액을 이용하여 one-step으로 탈표피, 탈지방 및 탈세포한 시료)의 진피 조직을 건조 시킨 후, PBS로 용출된 용출액을 이용하여 Detergent(SDS) 잔류량을 평가하였다.

Detergent(SDS) 용액을 농도별 (1%, 0.5%, 0.25%, 0.125%, 0.0625%, 0%)로 methylene blue에 희석 후 chloroform으로 용출시킨 뒤 650nm에서 흡광도를 측정하여 검량선(standard curve)을 만든 후, 기존공정 및 신규공정에서 용출한 용출액의 650nm 흡광도를 측정하여 detergent 잔류량을 측정하였다.

상기 용출 과정 시, 두께는 약 3 mm이며 4 g 중량의 진피조직을 선택하였으며 37℃에서 72시간 동안 20 mL의 용출액을 수득하였다.

그 결과, 신규공정의 용출물 내 잔류 detergent는 약 32.87±6.42 mg/L로, 기존공정(data not shown) 대비 낮은 것을 확인하였다(도 2 및 표 1).

Detergent 잔류량 측정

	신규공정(72시간 용출)
잔류량(mg/L)	39.9566	27.4441	31.1979

또한, 신규공정의 진피 조직을 세척단계별로 세척액을 취하여 detergent의 잔류량을 측정한 결과, PBS로 세척할수록 세척액 내 detergent양이 감소하는 것을 확인하였다(도 3).

실시예 4: 안전성 평가(세포독성 분석)

세포 적합성 및 독성을 통한 안전성을 평가하기 위하여 MTT assay 및 ISO10993-5: Cytotoxicity Test 중 MEM Elution Test를 수행하였다.

4-1. MTT assay(세포 적합성)

L929세포를 96well plate에 각 well 당 1x10⁵cell/mL농도로 100 uL씩 분주한 후 24시간 배양 뒤에 기존공정 및 신규공정의 용출액을 처리하여 37℃에서 24시간 배양하였다. 상기 용출액은 기존공정 및 신규공정에서 두께는 약 3 mm이며 4 g 중량의 진피조직을 선택한 후 동물세포 배양용 배지로 37℃에서 24시간 동안 용출하여 20 mL의 용출액을 수득하였다.

용출액 처리 24시간 배양 후, 5 mg/mL의 MTT(3,(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2.5-diphenyl tetrazolium bromide) 시약을 배양액에 1:100으로 희석하고, 이를 각 웰에 0.1 mL씩 처리하여 5시간 동안 배양하였다. 5시간 후, 96웰 플레이트의 각 웰의 배양액을 제거하고, 각 웰에 DMSO(dimethylsulfoxide) 0.1 mL을 첨가하여 세포를 용해시켰다. 이후, 분광광도계(Spectrophotometer)에 상기 96웰 플레이트를 넣고 540 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.

MTT assay에서 Cell viability(세포 생존율)를 확인한 결과, 신규공정에서 96.26%, 101.49% 및 94.99%의 생존률 값을 나타내었다(도 4). 이는 기존공정 대비 높은 생존률 값으로, 신규공정이 기존공정보다 세포 적합성이 높은 것을 알 수가 있다.

4-2. MEM (Minimum Essential Medium) Elution Test (독성)

L929세포를 6 well plate에 각 well 당 1x10⁵cell/mL 농도로 4 mL씩 분주한 후 24시간 배양 뒤에 세포의 단층배양상태를 확인하였다. 그런 다음, 기존공정 및 신규공정의 용출액을 세포에 처리하여 48시간 배양하였다. 상기 용출액은 기존공정 및 신규공정의 진피 조직 중 두께는 약 3 mm이며 4 g 중량의 진피조직을 선택한 후 PBS로 37℃에서 24시간 동안 용출한 20 mL의 용출액을 사용하였다.

배양 24시간, 48시간 후 양성대조물질과 음성대조물질은 각각 DMSO와 MEM로 대체하였다.

배양 24시간, 48시간 후 현미경을 이용하여 세포의 성장 정도 및 용해 정도를 관찰하였다. 관찰 결과는 아래의 표 2에 따라 등급을 판정하였다. 시험물질을 적용한 세포를 관찰한 결과, 판정 등급이 2 이하일 경우, 시험물질 용출액에 세포독성이 없는 것으로 판단하였다.

세포독성 등급 채점표

등급	반응도	배양세포의 상태
0	없음	세포질내 과립 (intracytoplasmic granule)의 분리, 세포 용해 없음, 세포성장의 저해 없음
1	아주미약	세포의 모양이 둥글게 되고, 느슨하게 부착되어 있으며, 세포 질 내 과립이 소실되었거나, 형태에 변화를 보인 세포가 20 %를 넘지 않음. 때때로 용해된 세포가 존 재하고 약간의 성장 저해가 관 찰 됨
2	미약	세포의 모양이 둥글게 되고, 세포질 내 과립이 소실되 세포가 50%를 넘지 않고, 광범위한 세포 용해는 보이지 않음. 세포의 성장 저해가 50%를 넘지 않음.
3	중증도	세포의 모양이 둥글게 되었거나 용해된 세포가 70%를 넘지 않음. 세포층이 완전히 파괴되지는 않았으나 50% 이상의 성장 저해를 보임
4	심함	세포층이 거의 또는 완전히 파괴 됨

MEM Elution Test에서 세포독성을 평가한 결과, 신규공정군은 48시간 후에도 판정등급이 0등급인 것으로 확인되었으며, 기존공정에서는 48시간 후에 세포독성이 2등급인 것으로 확인하였다(도 5 및 표 3). 판정 등급이 2 이하일 경우, 시험물질 용출액에 세포독성이 없는 것으로 판단한다.

기존공정 및 신규공정의 세포독성 등급

	세포독성 등급
	초기	24hr	48hr
기존공정	0	0	2
신규공정	0	0	0
음성대조군	0	0	0
양성대조군	0	4	4

따라서, 상기 MTT assay와 MEM Elution test를 통해 기존공정도 세포적합성 및 독성 평가에 적합함을 알 수 있었으며, 신규공정이 기존공정보다 높은 적합성 즉, 높은 안전성을 나타내는 것을 확인하였다.

실시예 5: 콜라겐 측정

조직 및 대조군(collagen fiber) 10mg을 100μL 증류수에 균질화 한 후 100μL HCl (37% or ~12M)을 첨가하여 120℃에서 3시간 동안 가수분해하였다. 가수분해 완료 후 10,000 g 속도로 3분간 원심분리하여 상등액을 수득하였다. Hydroxyproline assay kit (MAK008-1KT, Sigma-Aldrich)를 이용하여 상기 상등액의 Hydroxyproline의 양을 560nm 흡광도에서 측정하여 콜라젠의 양을 확인하여 도 6에 나타내었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

탈표피, 탈지방 및 탈세포를 동시에 수행할 수 있는 인체 유래 무세포 진피 기질의 제조방법에 있어서,
(i) 별도의 탈표피 및 탈지방 공정을 수행하지 않은 인체 유래 피부 조직을 준비하는 단계;
(ii) 상기 피부 조직을 이온성 계면활성제(ionic surfactant)가 포함된 저장성(hypotonic) 용액으로 처리하는 단계; 및
(iii) 상기 (ii) 단계에서 수득된 피부 조직을 등장성(isotonic) 용액으로 세척하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 인체 유래 무세포 진피 기질의 제조방법.
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제1항에 있어서, 상기 이온성 계면활성제(ionic surfactant)는 알킬벤젠 설포네이트(alkylbenzene sulfonate), 알킬 설페이트(alkyl sulfate), 알킬 에테르 설페이트(alkyl ether sulfate), 알콕시 아마이드(alkoxylated amide), 올레핀 설포네이트(olefin sulfonate), 알킬 자일린 설포네이트(alkyl xylene sulfonate), 디알킬 설포석시네이트(dialkyl sulfosuccinate), 지방산 에스터 설포네이트(fatty acid ester sulfonate), 알코올 설페이트(alcohol sulfate), 글리세롤 지방산에스터(glycerol fatty acid ester) 등의 글루타메이트(glutamate)계, 아이세티오네이트(isethionate)계, 라우릴 포스페이트(lauryl phosphate) 또는 라우레트 포스페이트(laureth-1-phosphate) 등의 포스페이트계, 타우레이트(taurate)계, 알콕시 알코올(alkoxylated alcohol)계, 알킬카복실(alkyl carboxylate)계, 하이드록시알킬(hydroxyalkyl), 4급 암모늄염(quaternary ammonium salt) 및 에톡시화 알킬(ethoxylated alkyl)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 인체 유래 무세포 진피 기질의 제조방법.
제4항에 있어서, 상기 이온성 계면활성제(ionic surfactant)는 SDS(sodium dodecyl sulfate), SLS(sodium laureth sulfate), SLES(sodium lauryl ether sulfate), SMES(sodium myreth sulfate), DSS(dioctyl sodium sulfosuccinate), PFOS(Perfluorooctanesulfonate), PFBS(Perfluorobutanesulfonate), PFNA(perfluorononanoate), PFOA(perfluorooctanoate), 소듐스테아레이트(sodium stearate), 소듐라우로일사코시네이트(sodium lauroyl sarcosinate), CTAB(cetrimonium bromide), CPC(cetylpyridinium chloride), BAC(benzalkonium chloride), BZT(benzethonium chloride), DDAC(dimethyldioctadecylammonium chloride) 및 (dioctadecyldimethylammonium bromide)에서 구성된 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 인체 유래 무세포 진피 기질의 제조방법.
제5항에 있어서, 상기 이온성 계면활성제(ionic surfactant)는 SDS(sodium dodecyl sulfate)인 것을 특징으로 하는 인체 유래 무세포 진피 기질의 제조방법.
제6항에 있어서, 상기 SDS(sodium dodecyl sulfate)의 농도는 저장성(hypotonic) 용액 내에서 0.1~0.5%(w/v)인 것을 특징으로 하는 인체 유래 무세포 진피 기질의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 (ii) 단계의 저장성 용액은 270 mOsm/L 이하의 삼투몰농도(osmolality)를 가지는 것을 특징으로 하는 인체 유래 무세포 진피 기질의 제조방법.
제1항 또는 제8항에 있어서, 상기 저장성 용액은 5~20 mM Tris-HCl, 0.1~1.5%(w/v) EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid) 및 0.01~0.05 M NaOH(sodium hydroxide)를 포함하는 것을 특징으로 하는 인체 유래 무세포 진피 기질의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 (ii) 단계는, 상기 피부 조직을 저장성(hypotonic) 용액으로 3시간에서 9시간 동안 처리하는 것을 특징으로 하는 인체 유래 무세포 진피 기질의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 (iii) 단계의 등장성(isotonic) 용액은 270~300 mOsm/L의 삼투몰농도(osmolality)를 가지는 것을 특징으로 하는 인체 유래 무세포 진피 기질의 제조방법.
제1항 또는 제11항에 있어서, 상기 등장성(isotonic) 용액은 25~100 mM Tris-HCl, 0.1~1.5%(w/v) EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid), 0.01~0.05 M NaOH(sodium hydroxide) 및 0.05~0.3 M NaCl(sodium chloride)을 포함하는 것을 특징으로 하는 인체 유래 무세포 진피 기질의 제조방법.
제12항에 있어서, 상기 NaCl(sodium chloride)의 농도는 등장성(isotonic) 용액 내에서 0.1~0.2 M인 것을 특징으로 하는 인체 유래 무세포 진피 기질의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 (ii) 단계 후에 버퍼(buffer) 용액을 사용하여 피부조직을 세척하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 인체 유래 무세포 진피 기질의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 (iii) 단계 후에 버퍼(buffer) 용액을 사용하여 피부조직을 세척하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 인체 유래 무세포 진피 기질의 제조방법.
제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 버퍼(buffer)는 PBS(phosphate buffer saline), 증류수, 생리 식염수(normal saline), HBSS(Hank's balanced salt solution), TBS(Tris buffered saline), TAPS(N-Tris(hydroxy- methyl)methyl-3-aminopropanesulfonic acid) 완충용액, Bicine(N,N-Bis(2-hydroxyethyl) glycine) 완충용액, HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) 완충용액, TES(NTris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonicd acid) 완충용액, PIPES(piperazine- N,N'-bis(2-ethanesulfonic acid) 완충용액, 카코딜레이트(cacodylate) 완충용액, MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) 완충용액, MEM(Minimum Essential Media), DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Media), RPMI1640, IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Media), Defined Keratinocyte-SFM(without BPE(bovine pituitary extract)), Keratinocyte-SFM(with BPE), KnockOut D-MEM, AmnioMAX-II Complete Medium, AmnioMAX-C100 Complete Medium 및 이의 혼합물에서 구성된 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 인체 유래 무세포 진피 기질의 제조방법.
제16항에 있어서, 상기 버퍼(buffer)는 PBS(phosphate buffer saline)인 것을 특징으로 하는 인체 유래 무세포 진피 기질의 제조방법.