WO2014034759A1

WO2014034759A1 - 加圧処理を用いた組織の脱細胞化方法

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Publication number: WO2014034759A1
Application number: PCT/JP2013/073103
Authority: WO
Inventors: 尚樹森本; 鈴木　茂彦; 山岡　哲二; 馬原　淳; 藤里　俊哉
Original assignee: 国立大学法人京都大学; 独立行政法人国立循環器病研究センター; 学校法人常翔学園
Priority date: 2012-08-31
Filing date: 2013-08-29
Publication date: 2014-03-06

Abstract

本発明は、採取された組織を水溶液に浸した状態で200MPa程度の高静水圧を印加することで、脱細胞化させることを特徴とし、安価で小型の加圧装置を使用して組織を脱細胞化させる方法を提供するものである。また、本発明は、上記の方法で得られた脱細胞化組織を洗浄又は培養することにより移植用の組織片を調製する方法を提供する。

Description

加圧処理を用いた組織の脱細胞化方法

　本発明は、加圧処理を用いた脱細胞化方法に関する。より詳細には、200MPa程度の圧力を用いて脱細胞化する方法等に関する。

　皮膚は表皮と真皮の二層から構成されている。表皮は、外界からの病原体の侵入を防ぎ、体内の水分を保つ役割がある。表皮の構造は表皮細胞が重層化した、ほぼ細胞成分のみから成り立っており、現在の細胞培養技術を用いれば再生可能である。一方、真皮は主に膠原繊維などの強靱な結合組織と線維芽細胞などの細胞成分、皮膚付属器（毛など）からなり、皮膚に力学的強度を持たせる、体の中で最大の臓器である。表皮は、ほぼ再生可能なのに対し、真皮を再生することは現在の技術では極めて困難である。

　このため、皮膚欠損創に対する治療では、縫縮（縫い縮めること）できる程度の小さな創以外を治療するには、(1)自家皮膚移植（自分の皮膚を他の部位から採取し移植する）、(2)同種皮膚移植（死体から採取し凍結保存した皮膚を移植する）、(3)人工材料を用いた再建、の三つの治療法しかない。自家皮膚移植は、最も優れた再建材料であるが、採取部位の犠牲が問題となり、大きな皮膚欠損に対しては使用できないことも多い。同種皮膚は一時的に生着するが、数週間で拒絶され、脱落するため一時的にしか使用できない。同種皮膚に含まれる細胞を除去した、脱細胞化同種皮膚を移植しても、完全に生着することがない、一部しか生着しないことは、同種皮膚を用いた臨床一般治療で経験、確認されている。

　人工材料としては、1990年代に製品化された二層性人工真皮（シリコーンシートとコラーゲンスポンジの二層構造）が代表的なものであり、全層皮膚欠損層に貼付すると数週間で真皮様組織が形成される。しかしながら、真皮様組織の構築に要する期間の長さ、また再生される真皮様組織が本来の真皮と比べると強度、質感、共に劣っている等の問題がある。

　生体組織から脱細胞化する方法としては、高張液や低張液を用いる方法、酵素を用いる方法、凍結させる方法などが報告されている。中でも、界面活性剤（SDS;Sodium Dodecyl Sulfate）を用いる方法が最も脱細胞効果が高いとされている(非特許文献１)。
　しかしながら、脱細胞効果の高いSDSを用いた場合、SDS自体に細胞毒性がある、SDSが組織に結合し正常細胞の接着を妨げる、SDSを除去することが非常に難しい、など組織再生の足場として用いるには非常に問題が多い。

　一方、本発明者らは500MPa以上の超高圧法（冷間等方圧加圧処理）を利用して組織内の細胞を完全に破壊する脱細胞化技術を報告している（特許文献１）。そして、心臓弁や大動脈、神経、角膜など多種類の組織で、当該技術を用いた脱細胞化が行われており、動物実験での有効性も確認されている（非特許文献２、３）。当該技術は、自家移植ではなく、同種移植を目的として開発されてきたため、同種移植の際に問題となる拒絶反応および感染症の伝播を防ぐ、すなわち、細胞、細菌又はウィルスなども死滅させることが可能な500MPa以上の超高圧な、加圧条件が設定されている。この超高圧を用いた脱細胞化方法は、細胞外マトリックスを損傷することなく、細胞や病原体を死滅させることが可能である。そのため、薬剤などを用いる従来の方法と比較して安全性が高い方法ではある。ただし、500MPa以上の超高圧を発揮するためには高価で巨大な装置が必要であるため、加圧装置を医療機器として広く一般病院で使用されることは難しい、という問題があった。

Crapo PM, Gilbert TW, Badylak SF. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 2011;32(12):3233-3243 Hashimoto Y, Funamoto S, Sasaki S, Honda T, Hattori S, Nam K, Kimura T, Mochizuki M, Fujisato T, Kobayashi H, Kishida A. Preparation and characterization of decellularized cornea using high-hydrostatic pressurization for corneal tissue engineering. Biomaterials. 2010;31(14):3941-3948 Funamoto S, Nam K, Kimura T, Murakoshi A, Hashimoto Y, Niwaya K, Kitamura S, Fujisato T, Kishida A. The use of high-hydrostatic pressure treatment to decellularize blood vessels. Biomaterials. 2010;31(13):3590-3595

特開2004-97552号公報

　本発明は、安価で小型の加圧装置を使用して組織を脱細胞化させる方法を提供する。

　本発明者らは、同種移植ではなく、自家移植を行うことを目的とした脱細胞化であれば、感染症の伝播を考慮する必要性がないため、加圧条件を下げることで、上記問題が解決されると着想するに至った。そして、加圧条件を種々検討し、200MPa程度の加圧で細胞の形態が球状に変形してシャーレから剥がれ落ちること、及び、細胞の生存率が低下することを見出した。

　さらに、本発明者らは、ヒト正常皮膚への加圧条件を検討し、200MPa程度の加圧で細胞活性が低下すること、それが、最も脱細胞効果が高いとされているSDS処理と同程度の脱細胞効果であることも見出した。

　本発明者らは、これらの発見に基づいて鋭意検討し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は下記のとおりである：
［１］脱細胞化組織を調製する方法であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の工程を含む方法。
（ａ）採取された組織を水溶液に浸す工程、
（ｂ）前記組織に500MPa以下の高静水圧を印加する工程
［２］前記高静水圧が、200MPa以上である、［１］に記載の方法。
［３］前記水溶液が、緩衝液、培養液、及び蒸留水のいずれから選択される、［１］に記載の方法。
［４］前記組織が、皮膚、血管、神経、心臓弁、心膜、大動脈、硬膜、角膜、羊膜、靭帯、歯、肝臓、心臓、腎臓、及び膵臓からなる群から選択される、［１］に記載の方法。
［５］［１］に記載の方法で調製した脱細胞化組織に、以下の（ｃ）及び（ｄ）の少なくとも一方の工程を適用して移植用の組織片を調製する方法。
（ｃ）前記組織を洗浄する工程、
（ｄ）前記組織を培養する工程
［６］［５］に記載の方法で得られる移植用組織片。

　本発明によれば、従来の500MPa以上の非常な超高圧ではなく、200MPa程度の加圧でも組織を脱細胞化させることができる。この程度の圧力は、小型で安価な加圧装置でも印加することができるため、病院等で広く一般的に、組織の脱細胞化処理を実施できる。

図1は、NIH/3T3細胞をシャーレに入れ、冷間等方圧加圧装置を用いて、0、10、100、200、300、500、1000MPaで加圧し、3時間後の細胞形態の変化を観察した顕微鏡像を示す。(Scale bar: 200μm) 図2は、図1で観察される細胞の生存率を示す。図3は、ヒト正常皮膚を、冷間等方圧加圧装置を用いて0、10、100、200、300、1000MPaで加圧し、48時間後の細胞活性を示す。また、ヒト正常皮膚を0.1％SDSで48時間処理した後の細胞活性も示す。

　以下、本発明の詳細を説明する。

　本発明において「脱細胞化」とは、対象とする組織の構造及び機能を損傷することなく又は損傷は最小限に抑え、細胞成分を破壊することをいう。例えば、対象とする組織の細胞成分（細胞小器官、細胞質、及び細胞膜）を破壊し、組織の構造を保持しかつ細胞の足場となる細胞外マトリクス（以下、ECMともいう）（エラスチン、コラーゲン、ラミニン、フィブリリンなど）は、保持することをいう。

　脱細胞化の程度は、細胞生存率、細胞活性、形態変化の観察、核染色、残存DNA量等を指標に測定することができる。これらは、一般的な方法で測定することができ、例えば市販のキット等を使用することができる。一例として、後述の実施例のように、細胞の生存率をWST-8アッセイ(Cell Count Reagent SF)で測定し、形態変化を顕微鏡観察で行うことができる。また、ヘマトキシリン・エオシン染色の核染色により脱核の確認を行うことができる。

　本発明で脱細胞化の対象とする組織は、皮膚、血管、神経、心臓弁、心膜、大動脈、硬膜、角膜、羊膜、靭帯、歯、肝臓、心臓、腎臓及び膵臓等が挙げられるが、脱細胞化させて自家移植に使用する組織であれば、これらに限定されない。また、ヒト、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、サル、イヌ、ネコ、ヤギ等の哺乳動物を対象とすることができる。

　採取された組織とは、一般的な手法、例えば、生検、抜歯、インフォームドコンセントを得た患者から提供される組織等が挙げられるが、採取の手法はこれらに限定されない。

　組織を浸す水溶液としては、緩衝液、培養液、蒸留水等が含まれるがこれらに限定されない。緩衝液としては、例えば、生理食塩水、PBS緩衝液、HEPES緩衝液、MES緩衝液、Tris-HCl緩衝液等が挙げられるが、これらに限定されない。培養液としては、DMEM、MEM-α、RPMI1640、Eagle基礎培養液等が挙げられるが、これらに限定されない。

　脱細胞化後の組織を三次元培養等の培養を行う際に、その目的に応じて、当業者は適宜適した培養液を調製することができる。さらに、必要に応じて、血清、血清代替物、各種アミノ酸、各種ビタミン、浸透圧調整剤、pH緩衝液、又は抗生物質等を培養液等に添加して、使用することができる。

　本発明における高静水圧とは、上記脱細胞化の対象組織に対して印加された場合に、該組織中の細胞が脱細胞化されるのに十分で、かつ500MPa以下の静水圧をいう。好ましい静水圧は脱細胞化する組織によっても異なり、一概には言えないが、好ましくは、0.2 MPa－500MPa、より好ましくは、50 MPa－400 MPa、最も好ましくは200 MPa－300 MPaである。印加する静水圧が0.2 MPa より低い場合、脱細胞化が不十分となることがあり、一方、印加する静水圧が500 MPa より大きい場合、高価で巨大な加圧装置が必要となり、医療施設（病院）では実施が困難である。皮膚組織を脱細胞化する場合には、150 MPa－300 MPaであることが好ましく、この圧力範囲であれば、小型で安価な加圧装置を用いて処理できる。加圧する温度は、4℃－50℃、より好ましくは、15℃－35℃である。

　加圧する時間は、細胞を破壊することのできる時間であればよく、例えば、10分である。好ましくは、1分－60分、より好ましくは、10分－30分である。また、場合によっては、1時間－3時間も有り得る。

　高静水圧を印加する方法は、従来公知の高圧装置を用いて直接もしくは間接的に加圧することにより行われる。高圧装置は、上記の本発明における高静水圧を印加できる装置であればよい。例えば、市販の冷間等方圧加圧装置、それらを改良した装置等が挙げられる。一例として、後述の実施例で使用した冷間等方圧加圧装置（神戸製鋼所社製）等が挙げられる。

　本発明においては、上述の脱細胞化後の組織を、移植片として用いることができる。移植片として使用するには、上述の方法で得られる脱細胞化組織を緩衝液等で洗浄後、直接使用することができる。洗浄用の緩衝液としては、生理食塩水、PBS緩衝液等の他に、石灰化の発生を抑制する等の目的で、リン酸イオンの含有量が2.0 mmol/L以下であり、クエン酸、EDTA、及び許容される塩からなる群から選択される化合物を含有する緩衝液（特開2010-227246号公報）を使用することもできるが、これらに限定されない。

　あるいは、脱細胞化後の組織を三次元培養担体等として培養し、新たに得られる組織を移植片として使用することもできる。
　例えば、皮膚を採取し、上述の方法で脱細胞化して得られたECMに、同種の皮膚から調製した線維芽細胞を培養し、真皮組織を得ることができる。

　より具体的には、皮膚腫瘍、先天性巨大色素性母斑等の患者から、皮膚を採取し、上述の方法で脱細胞化することができる。さらに、脱細胞化後の組織から上述の方法で真皮組織を移植片として調製し、当該移植片を該患者に自家移植することができる。

　以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる例示を示すものにすぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではない。

　［分析例１］
　細胞が死滅する圧を確定するために、NIH/3T3細胞の懸濁液（10⁵cells/mL）に対して、冷間等方圧加圧装置（神戸製鋼所社製Dr.CHEF）を用いて、0、10、100、200、300、500、1000MPaで10分間加圧した。加圧処理後の懸濁液を96穴マルチウェルの各ウェルに100μl(10⁴cells)ずつ播種し3時間後の細胞形態の変化を観察し（図１）、さらに、細胞の生存率をWST-8アッセイ(Cell Count Reagent SF)により評価した。圧力０における細胞生存率を１としたときの細胞生存率を図２に黒四角（■）で示す。また、加圧処理における昇圧、施圧及び降圧の工程のうち、施圧工程と同じ時間（１０分間）圧力をかけずにサンプルを静置した対照実験の結果を図２に白四角（□）で示す。細胞観察の結果、10MPaおよび100MPaでは、細胞は接着性を保っていた。これに対し、200MPa以上の圧力をかけた場合、細胞は紡錘形から球状に変形し、シャーレから徐々に剥がれてくるのが確認された。また、WST-8アッセイの結果、200MPa以上で、細胞の生存率も急激に低下することが確認された。なお、図１中、スケールバーは200μｍを示す。

　［実施例１］
　手術で余剰となった患者（インフォームドコンセントを事前に得た）の正常皮膚（直径4mm）を生理食塩水に浸した状態で滅菌バックに入れ、これを冷間等方圧加圧装置（神戸製鋼社製Dr.CHEF）にセットし、10MPaで10分間加圧した。加圧から48時間後の細胞について、WST-8アッセイ(Cell Count Reagent SF)により450nmの吸光度に基づいて細胞活性を測定し、生存率を求めた（不図示）。

　［実施例２～４］
　印加圧力をそれぞれ100、200、300MPaとしたこと以外は実施例１と同様の手順にて正常皮膚組織を加圧し、細胞活性と細胞の生存率を測定した。細胞活性を図３に示す。

　［比較例１］
　印加圧力を1000MPaとしたこと以外は実施例１と同様の手順にて正常皮膚組織を加圧し、細胞活性と細胞の生存率を測定した。細胞活性を図３に示す。

　［比較例２］
　正常皮膚組織への加圧を行わなかったこと以外は実施例１と同様の手順にて実験を行い、細胞活性と細胞の生存率を測定した。細胞活性を図３に示す。

　［比較例３］
　高い脱細胞化効果が知られている公知の脱細胞化技術との比較のため、非特許文献３を参考にして0.1%SDS溶液中で皮膚（直径4mm）を48時間処理したのち、ヒト正常皮膚の細胞活性をWST-8アッセイにより測定した。結果を図３に示す。

　実施例２～４及び比較例１～３の結果から、200MPa以上の加圧で細胞活性が低下し、SDS処理と同程度の脱細胞効果があることが確認された。

　本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得ることは当業者にとって自明である。さらに、特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。

　本発明によれば、200MPa程度の加圧により、組織の脱細胞化を行うことができる。この程度の圧力は小型な加圧装置で印加することが可能である。そのため、病院の手術室等に当該装置を設置することで、広く一般的に組織の脱細胞化を行うことを可能とするため、特に臨床上有効である。

　本出願は米国で仮特許出願されたNo. 61/695,638（出願日：2012年8月31日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims

　脱細胞化組織を調製する方法であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の工程を含む方法。
（ａ）採取された組織を水溶液に浸す工程、
（ｂ）前記組織に500MPa以下の高静水圧を印加する工程
　前記高静水圧が、200MPa以上である、請求項１に記載の方法。
　前記水溶液が、緩衝液、培養液、及び蒸留水のいずれから選択される、請求項１に記載の方法。
　前記組織が、皮膚、血管、神経、心臓弁、心膜、大動脈、硬膜、角膜、羊膜、靭帯、歯、肝臓、心臓、腎臓、及び膵臓からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
　請求項１に記載の方法で調製した脱細胞化組織に、以下の工程（ｃ）及び（ｄ）の少なくとも一方を適用して移植用の組織片を調製する方法。
（ｃ）前記組織を洗浄する工程、
（ｄ）前記組織を培養する工程
　請求項５に記載の方法で得られる移植用組織片。