CN114286694A - 动物脂肪组织源性细胞外基质及动物脂肪组织源性细胞外基质保存液 - Google Patents

动物脂肪组织源性细胞外基质及动物脂肪组织源性细胞外基质保存液 Download PDF

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Abstract

本发明提供：一种细胞外基质，其通过脂肪去除和脱细胞化大大提高了其生物相容性，并含有生长因子以控制细胞的生理活动；及用于制备该细胞外基质的方法。此外，通过使用超临界流体的溶剂提取法可以有效地获得细胞外基质，并且包含该细胞外基质的保存液可以通过防止污染而长期保存，并且具有增加的可管理性，从而可以使细胞外基质的可用性大大提高。

Description

动物脂肪组织源性细胞外基质及动物脂肪组织源性细胞外基 质保存液
技术领域
本发明涉及一种动物脂肪源性细胞外基质及动物脂肪源性细胞外基质保存液，更具体地，涉及一种具有非常优异的生物相容性和生理功能的动物脂肪源性细胞外基质。
背景技术
细胞外基质是主要负责动物结构支撑的组织。作为一种简单的细胞间连接，它作为结构因子以及诸如细胞分裂、分化和死亡的细胞生理的调节剂可发挥非常重要的作用。
细胞外基质由结缔组织纤维、无定形成分和细胞外液组成。
结缔组织纤维以三螺旋结构形成，主要由胶原蛋白和弹性蛋白组成，为细胞外基质提供强度和弹性。
无定形成分主要由糖胺聚糖(Glycosaminoglycan，GAG)和蛋白聚糖与蛋白质(核心蛋白)结合而成。由于带负电荷，它与大量的水结合在细胞外基质中形成凝胶。
这些结缔组织纤维和无定形成分有助于细胞外基质的缓冲作用。
细胞外液中含有离子、脂肪、葡萄糖、氨基酸等，使细胞能够存活并执行特定的功能，而且存在诸如蛋白酶和生长因子等生理因子。
生长因子是促进各种细胞分裂或生长分化的多肽的总称。
已经发现了若干种类型的生长因子，生长因子具有各种功能并且已知参与细胞信号传导系统。
除了构成生物体的基本成分的营养物质外，它们是细胞增殖和生物体生长发育所必需的，也是细胞生长和分化所必需的。
如果我们能够储存和适当地供应它们，并提供一个细胞可识别它们的物理环境，那么就可以大大促进细胞的存活、生长、迁移、分化等等。
近年来，利用细胞外基质的特性，细胞外基质源性生物支持材料已广泛应用于组织工程和再生医学。
尤其是使用了细胞外基质的各种生物材料、例如组织修复材料、敷料带等已被推出，但目前的商品化产品仅使用了细胞外基质的部分成分。
尽管已经开发了各种化学和生物学方法来提取细胞外基质，但是在从动物脂肪组织中提取的过程中不丢失对细胞生理活性最重要的生长因子的细胞外基质尚未公开。
相关的现有文献包括韩国专利号10-1772316(2017年8月29日公开)，其公开了一种用于制备能够控制体内降解速率和物理性质的生物相容性猪软骨源性细胞外基质膜的方法，以及一种含有猪软骨源性细胞外基质作为活性成分的抗粘连组合物。
发明内容
技术问题
因此，本发明提供了：一种细胞外基质，在有效地从动物脂肪中提取细胞外基质的同时，该细胞外基质通过脱细胞化和脂肪去除提高了生物安全性和生物相容性，并且含有大量能够调节细胞生理活性的生长因子；及用于制备该细胞外基质的方法。
本发明要解决的问题不限于上述一个或多个问题，本领域普通技术人员通过以下描述将清楚地理解未提及的一个或多个其他问题。
解决方案
为了解决上述问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种动物脂肪源性细胞外基质，该细胞外基质经过脱细胞化和脂肪去除并含有一定的生长因子。
此外，脱细胞化和脂肪去除以及生长因子的包含可以是通过使用超临界流体的溶剂提取法进行的。
此外，使用超临界流体的溶剂提取法可以去除动物脂肪中残留的脂质并进行灭菌以提高生物相容性。
此外，动物脂肪可以是通过抽脂提取的废脂肪组织。
此外，生长因子可以由以下组成：AR、bFGF、b-NGF、EGF、EGFR、FGF-6、FGF-7、GCSF、GDNF、GM-CSF、HB-EGF、HGF、IGFB P-1、IGFB P-2、IGFB P-3、IGFB P-4、IGFB P-6、IGF-I、IGF-ISR、IGF-II、M-CSF、M-CSFR、NT-3、NT-4、PDGFRa、PDGFRb、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PIGF、SCF、SCFR、TGF-a、TGF-b、TGF-b2、TGF-b3、VEGF、VEGFR2、VEGFR3和VEGF-D。
此外，生长因子的含量可以为每1g细胞外基质中0.52ng至11.19ng。
根据本发明的另一方面，本发明提供一种动物脂肪源性细胞外基质保存液，其中包含：0.1重量份至5重量份的动物脂肪源性细胞外基质，该动物脂肪源性细胞外基质通过使用超临界流体的溶剂提取法经过脱细胞化和脂肪去除并含有一定的生长因子；和95重量份至99.9重量份的分散液，并且该动物脂肪源性细胞外基质保存液是经过滤的。
此外，生长因子可以由以下组成：AR、bFGF、b-NGF、EGF、EGFR、FGF-6、FGF-7、GCSF、GDNF、GM-CSF、HB-EGF、HGF、IGFB P-1、IGFB P-2、IGFB P-3、IGFB P-4、IGFB P-6、IGF-I、IGF-ISR、IGF-II、M-CSF、M-CSFR、NT-3、NT-4、PDGFRa、PDGFRb、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PIGF、SCF、SCFR、TGF-a、TGF-b、TGF-b2、TGF-b3、VEGF、VEGFR2、VEGFR3和VEGF-D，并且可以是经过滤的并且含量为每1g细胞外基质中0.21ng至6.86ng。
此外，生长因子可以通过过滤而使bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)含量降低至40％至50％。
发明效果
根据本发明，提供：一种细胞外基质，其通过脂肪去除和脱细胞化大大提高了其生物相容性，并含有生长因子以控制细胞的生理活动；及用于制备该细胞外基质的方法。
此外，细胞外基质可以通过使用超临界流体的溶剂提取法有效地获得。
此外，它可以在没有酸、酶处理和放射处理的情况下进行灭菌，以增加细胞外基质的生物安全性，并可以经过脱细胞化和脂肪去除以增加生物相容性。
此外，它提供了一种细胞外基质，其中细胞外基质的成分中保留了生长因子，通过控制生长因子的含量可以预期调节细胞的生理活动，并且可以快速诱导组织的再生。
此外，可以原样保持细胞外基质的结构特性，从而可以容易地制备可以根据移植部位的形状成型的组织结构模拟物。
此外，通过对人源性废脂肪进行有效处理，可以有效地提取和提供细胞外基质。
此外，含有该细胞外基质的保存液可以通过防止污染而长期保存，并且具有增加的可管理性，从而可以使细胞外基质的可用性大大提高。
本发明的效果不限于上述效果，并且应当理解为包括可以从本发明的详细说明或权利要求书中描述的本发明的构成推断的所有效果。
附图说明
图1是根据本发明实施方式的用于制备动物脂肪源性细胞外基质的方法的工艺流程图；
图2是根据本发明另一实施方式的动物脂肪源性细胞外基质保存液的工艺流程图；
图3是根据本发明实施方式的根据动物脂肪源性细胞外基质的蛋白质定量分析的电泳照片；
图4是根据本发明实施方式的示出了动物脂肪源性细胞外基质中DNA残留量的图；
图5是根据本发明实施方式的根据动物脂肪源性细胞外基质的苏木精和伊红染色的照片；
图6是根据本发明实施方式的根据动物脂肪源性细胞外基质的扫描电子显微照片；
图7是根据本发明实施方式的细胞外基质样品、1wt％分散液以及通过过滤制备的动物脂肪源性细胞外基质保存液的照片；
图8是示出了根据本发明实施方式的动物脂肪源性细胞外基质的基于VEGF的酶联免疫吸附试验结果的图；
图9是示出了分散有根据实施方式的动物脂肪源性细胞外基质的分散液中的VEGF含量的图；
图10是示出了分散有根据本发明实施方式的动物脂肪源性细胞外基质的分散液过滤前后的DNA含量的图；
图11是根据本发明实施方式的动物脂肪源性细胞外基质保存液过滤前后细胞因子抗体阵列的结果的图像；
图12示出了根据本发明实施方式的动物脂肪源性细胞外基质保存液过滤前后生长因子的类型和强度；
图13示出了根据本发明实施方式的动物脂肪源性细胞外基质保存液过滤前后生长因子的类型和含量(ng/g)。
具体实施方式
下面将结合附图，对根据本发明的优选实施方式进行详细描述。
参考以下结合附图而详细描述的实施方式，本发明的优点和特征及其实现方法将变得显而易见。
然而，本发明不限于以下公开的实施方式，而是将以各种不同的形式实施，这些实施方式仅用于使本发明的公开内容完整，并且提供这些实施方式以充分告知本发明所属技术领域的普通技术人员本发明的范围，并且本发明仅由权利要求书的范围所限定。
此外，在本发明的描述中，当确定相关的已知技术可能使本发明的主旨变得模糊时，将省略其详细描述。
本发明人发现，从动物脂肪中提取细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)的常规方法不适合有效获得细胞外基质。原因是常规方法主要是通过辐射照射以及化学处理和生物处理来提取和处理细胞外基质，以提高生物安全性、生物相容性、物理性能(例如机械性能)，但存在一个问题，即细胞外基质中所含的生长因子可能很容易被化学处理、生物处理和放射处理破坏，并且该过程使用大量的酸和酶并使用辐射，因此，控制该过程的风险很高，并且效率大大降低。
另一方面，使用超临界流体的溶剂提取法可以通过处于超临界状态的溶剂有效地提取提取物而不会使其物理变化，从而可以保持提取物的机械性能。特别是当在一定条件下对动物脂肪进行超临界流体溶剂提取时，可以有效地获得细胞外基质，通过脱细胞化和脂肪去除，其生物稳定性和生物相容性大大提高，并且其中生长因子(它们是细胞外基质的独特成分)的含量受到控制以调节细胞的生理活动。基于此，本发明人完成了本发明。
下面将详细描述本发明。
根据本发明的动物脂肪源性细胞外基质经过脱细胞化和脂肪去除并包含一定的生长因子。
动物脂肪可以是猪脂肪，并且优选是通过抽脂提取的废脂肪。
最近，为了整容手术进行了大量的抽脂术，因此可以获得大量的人源性脂肪。然而，在这样的抽脂术中提取干细胞和细胞外基质的有用物质时，由于含有诸如血液和脂质的不必要的成分，难以利用提取的人体脂肪。因此，当通过使用超临界流体的溶剂提取法通过脱细胞化和脂肪去除来增加生物稳定性和生物相容性时，它可以安全有效地移植到人体中。
动物脂肪不受限制，只要它在组织中含有细胞外基质即可。
可以通过使用超临界流体的溶剂提取法进行脱细胞化和脂肪去除。
在使用超临界流体的溶剂提取法中，对制备超临界流体溶剂时的压力、以及引入待提取动物脂肪组织的流速、反应过程温度和时间进行控制，从而使动物脂肪组织可以经历脱细胞化和脂肪去除。
使用超临界流体的溶剂提取法可以去除动物脂肪中残留的血液并对其进行灭菌以提高生物相容性。
使用超临界流体的溶剂提取法可以通过添加乙醇作为助溶剂来增加超临界流体在动物脂肪中的溶解度，并且可以有效去除动物脂肪中残留的血液和污染物以进行灭菌。
使用超临界流体的溶剂提取法从动物脂肪中提取细胞外基质，并且可以使细胞外基质含有一定的生长因子。
当细胞外基质含有生长因子时，可以控制细胞的生理活动，并且当其以组织修复材料的形式注入人体组织时，可以迅速诱导组织再生。
生长因子由以下组成：AR、bFGF、b-NGF、EGF、EGFR、FGF-6、FGF-7、GCSF、GDNF、GM-CSF、HB-EGF、HGF、IGFB P-1、IGFB P-2、IGFB P-3、IGFB P-4、IGFB P-6、IGF-I、IGF-ISR、IGF-II、M-CSF、M-CSFR、NT-3、NT-4、PDGFRa、PDGFRb、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PIGF、SCF、SCFR、TGF-a、TGF-b、TGF-b2、TGF-b3、VEGF、VEGFR2、VEGFR3和VEGF-D。
通过使用超临界流体的溶剂提取法，细胞外基质包含人类生长因子中除了成纤维细胞生长因子-4(Fibroblast growth factor-4，FGF-4)之外的40种生长因子。
FGF-4是在动物脂肪的脱细胞化和脂肪去除过程中通过使用超临界流体的溶剂提取法去除的，根据本发明实施方式的细胞外基质的特征在于排除FGF-4生长因子。
生长因子的含量可以为每1g细胞外基质中0.52ng至11.19ng。
通过使用超临界流体的溶剂提取法获得的细胞外基质，即使经过脱细胞化和脂肪去除，仍含有一定量或更多的生长因子，因此可以大大提高生物相容性，可以控制细胞的生理活性，并且可以迅速诱导组织再生。
当动物脂肪通过用酸和酶处理以及辐射处理而不是使用超临界流体的溶剂提取法收集时，很难收集全部40种生长因子。特别是酶处理法容易分解作为肽的生长因子，因此无法得到有效含量在上述范围内的细胞外基质。
根据本发明的另一方面，本发明提供一种动物脂肪源性细胞外基质保存液，其中包含：0.1重量份至5重量份的动物脂肪源性细胞外基质，该动物脂肪源性细胞外基质通过使用超临界流体的溶剂提取法经过脱细胞化和脂肪去除并含有一定的生长因子；和95重量份至99.9重量份的分散液，并且该动物脂肪源性细胞外基质保存液是经过滤的。
通过使用超临界流体的溶剂提取法收集的细胞外基质可以保持机械性能，但以固态制造各种应用(applications)并不容易。
当通过使用超临界流体的溶剂提取法获得的细胞外基质分散在分散液中并过滤时，通过去除高分子量蛋白质来提高生物安全性和生物相容性，并且使0.1wt％至5wt％或更少的细胞外基质分散在分散液中以增加可管理性并大大提高可用性。
如果包含的通过使用超临界流体的溶剂提取法收集的细胞外基质在上述范围内，则其可以长期保存而不改变细胞外基质中生长因子的含量。
生长因子由以下组成：AR、bFGF、b-NGF、EGF、EGFR、FGF-6、FGF-7、GCSF、GDNF、GM-CSF、HB-EGF、HGF、IGFB P-1、IGFB P-2、IGFB P-3、IGFB P-4、IGFB P-6、IGF-I、IGF-ISR、IGF-II、M-CSF、M-CSFR、NT-3、NT-4、PDGFRa、PDGFRb、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PIGF、SCF、SCFR、TGF-a、TGF-b、TGF-b2、TGF-b3、VEGF、VEGFR2、VEGFR3和VEGF-D。
动物脂肪源性细胞外基质保存液含有人类生长因子中除了成纤维细胞生长因子-4(FGF-4)之外的40种生长因子。
生长因子可以是经过滤的并且含量可以为每1g细胞外基质中0.52ng至6.86ng。
将动物脂肪源性细胞外基质保存液过滤，以控制生长因子的含量。
过滤可以通过去除细胞外基质中的蛋白质来防止保存液污染，并且可以允许在上述范围内包含生长因子。
相对于动物脂肪源性细胞外基质的含量，动物脂肪源性细胞外基质保存液可以在上述范围内降低生长因子的含量，但其可以有效地保存细胞外基质，并大大提高使用性。
分散液可以是去离子水。
当选择去离子水作为分散液时，可以在分散细胞外基质时防止污染，从而增加保存性。
可以使用孔径为0.2μm至0.45μm的过滤器进行过滤。
通过使用上述范围内的过滤器，可以通过去除残留在细胞外基质中的高分子量蛋白质来有效地降低污染风险，对保存液进行灭菌，并有效地去除残留的DNA。
如果超出上述范围，则担心保存液中的生长因子减少或者除蛋白质以外的细胞外基质一起被除去，并且有感染和DNA残留的风险，从而使生物相容性降低。
生长因子可以通过过滤而使bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)含量降低至40％至50％。
bFGF被包含在蛋白质中或与蛋白质结合，当通过过滤将保存液中的蛋白质过滤除去时，bFGF被一起过滤，因此bFGF含量减少。
根据本发明的另一方面，本发明提供一种用于制备动物脂肪源性细胞外基质的方法。
图1是根据本发明实施方式的用于制备动物脂肪源性细胞外基质的方法的工艺流程图。
参见图1，用于制备动物脂肪源性细胞外基质的方法包括以下步骤：
(1)洗涤并粉碎动物脂肪以便制备脂肪组织；
(2)通过将制备的脂肪组织离心并去除水和脂质来进行预处理；
(3)通过使用超临界流体的溶剂提取法对预处理的脂肪组织进行脱细胞化和脂肪去除，以便收集细胞外基质；以及
(4)确定细胞外基质中的生长因子。
首先，洗涤并粉碎动物脂肪以便制备脂肪组织(S100)。
动物脂肪可以是猪脂肪，并且优选是通过抽脂提取的废脂肪。
当动物脂肪是来自人体的废组织时，可以通过洗涤去除诸如残留血液的污染物，如果进行粉碎，则可以在后续步骤中提高离心效率。
通过将制备的脂肪组织离心并去除水和脂质来进行预处理(S110)。
通过离心，动物脂肪可以分离为在下层的水以及在上层的脂质。在对中间层中的固体成分进行溶剂提取的情况下，如果已去除在下层的水和在上层的脂质，则随后使用超临界流体的溶剂提取法的效率可以大大提高。
通过使用超临界流体的溶剂提取法对预处理的脂肪组织进行脱细胞化和脂肪去除，以便收集细胞外基质(S120)。
在使用超临界流体的溶剂提取法中，可以改变溶剂提取条件以用于脂肪组织的脱细胞化和脂肪去除。
在本发明的实施方式中，在使用超临界流体的溶剂提取法中，可以通过将二氧化碳加压至200巴至600巴来制备超临界流体，并且超临界流体可以在30℃至35℃下以18mL/min至70mL/min的流速渗透到动物脂肪中2小时至12小时，然后可以提取细胞外基质。
通过在上述范围内加压产生的超临界流体可以渗入脂肪组织的细胞膜并溶解细胞内脂质使其脱脂，当制备的超临界流体以上述范围内的流速渗入脂肪组织时，可以进行脱细胞化和脂肪去除，同时保持细胞外基质的机械性能。
在使用超临界流体的溶剂提取法中，脂肪组织中残留的污染物被再次去除，从而提高了防污染和灭菌效果。
在细胞外基质中确定生长因子(S130)。
脱细胞化且脱脂的细胞外基质可以通过使用超临界流体的溶剂提取法有效获得，并且细胞外基质中存在于细胞外液中的生长因子也可以大量保留。
通过对生长因子的确定过程，可以获得含有大量生长因子的细胞外基质，这些生长因子可以控制细胞的生理活动，并快速诱导组织再生。
为了确定生长因子，可以通过酶联免疫吸附测定来分析生长因子中选自由VEGF、bFGF、IGF-1和EGF组成的组中的任何一种生长因子的水平，以确定生长因子的含量。
酶联免疫吸附测定是非常优选的，因为可以基于选自由VEGF、bFGF、IGF-1和EGF组成的组中的任何一种生长因子来确定细胞外基质中所含的生长因子的含量。然而，对此没有特别限制，只要是能够确定生长因子的含量的方法即可。
另一方面，根据本发明的另一个方面，本发明提供一种用于制备动物脂肪源性细胞外基质保存液的方法。
图2是根据本发明另一实施方式的动物脂肪源性细胞外基质保存液的工艺流程图。
参见图2，用于制备动物脂肪源性细胞外基质保存液的方法包括以下步骤：
(a)洗涤并粉碎动物脂肪以便制备脂肪组织；
(b)通过将制备的脂肪组织离心来进行预处理以去除水和脂质；
(c)通过使用超临界流体的溶剂提取法对预处理的脂肪组织进行脱细胞化和脂肪去除，以便收集细胞外基质；
(d)将收集的细胞外基质分散在去离子水中以制备分散液；
(e)过滤分散液；以及
(f)确定过滤的分散液中生长因子的含量。
首先，洗涤并粉碎动物脂肪组织，以便制备脂肪组织(S200)。
通过将制备的脂肪组织离心并去除水和脂质来进行预处理(S210)。
通过使用超临界流体的溶剂提取法对预处理的脂肪组织进行脱细胞化和脂肪去除，以便收集细胞外基质(S220)。
由于步骤S200至S220与用于制备动物脂肪源性细胞外基质的方法中的过程相同，因此以下将省略重复描述。
将收集的细胞外基质分散在去离子水中以制备分散液(S230)。
通过将收集的细胞外基质分散在去离子水中制备分散液时，后续过滤容易，并且可以容易地确定生长因子的含量以制备细胞外基质保存液。
可以使用高压均化器在15℃下以15000psi至25000psi的压力下分散分散液。
当在上述范围内进行分散时，可以保持细胞外基质的机械性能，并且可以将残留在细胞外基质中的蛋白质洗脱并分散到分散液中。
此时，根据悬浮状态，可以重复分散1至5次。
过滤分散液(S240)。
由于分散液是保留有细胞外基质蛋白质的悬浮液，因此存在污染和感染的风险。
通过过滤去除残留的蛋白质，可以防止细胞外基质保存液的污染和感染，以提高生物安全性，还可以提高可管理性和可用性。
过滤可以通过使分散液通过孔径为0.2μm至0.45μm的注射器过滤器来进行。
通过使用孔径在上述范围内的过滤器，可以有效地除去与细胞外基质一起的残留的蛋白质，以将保存液维持在灭菌状态，并有效地去除残留的DNA。
如果超出上述范围，则细胞外基质的含量减少，因此生长因子减少或者可能因感染风险而无法灭菌，并且难以去除残留的DNA。
确定过滤的分散液中生长因子的含量(S250)。
生长因子可以通过过滤而使bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)含量降低至40％至50％。
bFGF被包含在蛋白质中或与蛋白质结合，当通过过滤将保存液中的蛋白质过滤除去时，bFGF被一起过滤，因此bFGF含量减少。因此，通过确定bFGF含量的降低，可以确定保存液中的蛋白质是否被去除，从而可以制备生物安全性提高的动物脂肪源性细胞外基质保存液。
在下文中，提供优选实施例以帮助理解本发明，但以下实施例仅用于说明本发明，本发明的范围不限于以下实施例。
实施例1.通过超临界流体提取的细胞外基质
为了通过使用超临界流体的溶剂提取法从动物脂肪中获得细胞外基质，对抽脂过程中获得的废脂肪进行处理以防止污染并进行转移，然后使用分液漏斗注入足够的去离子水，直到以肉眼可见的程度将脂肪中所含的血液完全洗掉，混合，然后放置20分钟，并洗涤。洗涤总共进行5次。
将1000mL洗涤后的脂肪放入烧瓶中，使用搅拌器以50rpm的速度分散，然后使用泵以恒定流速(以120rpm泵送)通过超声发生器，使超声波可以均匀传播通过整个脂肪。
将超声波的输出控制在400W的70％振幅，并将脂肪粉碎6分钟以获得脂肪组织。
在超声处理过程中，使用制冷剂将脂肪组织保持在3℃。
将超声处理的脂肪组织转移到离心机中，以4000rpm离心20分钟，分离除去下层的水和上层的脂质。
收集中间层中的固体内容物并放置在反应器中。
反应器的一侧装有二氧化碳钢瓶，沿着排放二氧化碳的管线设置有冷却器和泵，以对二氧化碳进行加压以制备作为超临界流体的溶剂。
在二氧化碳钢瓶的一侧设置了用于乙醇(一种助溶剂)的罐，并且在排出乙醇的管线上设置了泵。将乙醇作为超临界流体添加到溶剂中以增加溶剂的溶解度，并对残留在脂肪组织中的污染物进行灭菌以显示灭菌效果。
通过将加压至300巴的溶剂引入反应器并在32℃以20mL/min的流速与作为共溶剂的乙醇混合来进行溶剂提取。
提取时间为2小时至12小时，提取完成后，打开反应器中配备的捕集室的排气口，蒸发除去溶剂，得到白色固体状的细胞外基质。
实验例1.细胞外基质的物理性质
进行蛋白质定量分析(Bicinchonic Acid Assay；BCA)以确定通过使用超临界流体的溶剂提取法获得的细胞外基质中的蛋白质含量。
根据蛋白质定量分析方法，将注入的蛋白质总量调整为70μg，然后进行电泳。
图3是根据本发明实施方式的根据动物脂肪源性细胞外基质的蛋白质定量分析的电泳照片。
参考图3，从左边开始，为标记和两种样品，一种是提取前的脂肪样品，一种是提取后的样品。即使在提取之后，条带也保持不变。
由于注入等量蛋白质时条带保持，经确定，超临界提取后脱脂，并且蛋白质保持不变。
图4是根据本发明实施方式的示出了动物脂肪源性细胞外基质中DNA残留量的图。
[表1]
提取时间 DNA含量(ng/mg)
2小时 70.72211
6小时 31.07875
12小时 35.60731294
上表1示出了在使用动物脂肪的超临界溶剂进行溶剂提取时根据溶剂提取时间而残留在细胞外基质中的DNA含量。参照图4和表1可确定，超临界提取2小时后，DNA的含量约为70ng/mg，而超临界提取12小时后，DNA的残留量约为35ng/mg。因此，确定了可能引起免疫反应的DNA含量可以被有效减少，并且细胞中的细胞核被破坏和脱细胞化。
另一方面，进行苏木精和伊红染色以确定通过使用超临界流体的溶剂提取法获得的细胞外基质被脱细胞化。
图5是根据本发明实施方式的根据动物脂肪源性细胞外基质的苏木精和伊红染色的照片。
参考图5，为了比较使用超临界流体的溶剂提取法的效果，左侧示出了超临界提取前的脂肪组织染色照片，以及右侧示出了使用超临界流体的溶剂提取法后获得的细胞外基质的染色照片。
在使用超临界流体的溶剂提取法后，在细胞外基质中无法观察到细胞核，并且通过确定细胞没有保持其形状来确定细胞被脱细胞化。
图6是根据本发明实施方式的根据动物脂肪源性细胞外基质的扫描电子显微照片。
参考图6，为了确定使用超临界流体的溶剂提取法过程中细胞的变化，左侧示出了提取前脂肪组织的扫描电子显微照片，以及右侧示出了提取后组织的扫描电子显微照片。
在使用超临界流体进行溶剂提取法后，所有细胞被去除，并确定了纤维形状。因此，确定了细胞外基质是脱细胞化的。
实施例2.动物脂肪源性细胞外基质保存液的制备
将实施例1中获得的细胞外基质样品以1wt％添加到去离子水中，混合，并使用高压均质器在15℃、20000psi的压力下进行分散。
将分散重复5次以制备分散液。使用孔径为0.2μm的注射器过滤器来过滤制备的分散液，以制备透明状态的动物脂肪源性细胞外基质保存液。
图7是根据本发明实施方式的细胞外基质样品、1wt％分散液以及通过过滤制备的动物脂肪源性细胞外基质保存液的照片。
参考图7，可以确定，通过分散细胞外基质样品可以制备透明液体状态的动物脂肪源性细胞外基质保存液。
实验例2.生长因子的确定
进行酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immunosorbent assay，以下简称ELISA)以确定根据实施例1获得的细胞外基质是否含有生长因子。
制备根据实施例2生产的1wt％分散液，并通过将洗涤溶液添加到要使用的每个板孔中进行洗涤。将标准溶液(标样)和样品(试样)放入每个孔中并在室温下反应2小时。
用洗涤液洗涤未反应的标准溶液和样品。
每个孔中注入检测抗体，室温孵育2小时，洗涤。
注射链霉亲和素-HRP，在室温下孵育30分钟，然后再次洗涤。
注入TMB溶液后，孵育至显色，并在450nm波长处测定吸光度。
图8是示出了根据本发明实施方式的动物脂肪源性细胞外基质的基于VEGF的酶联免疫吸附试验结果的图。
图9是示出了分散有根据实施方式的动物脂肪源性细胞外基质的分散液中的VEGF含量的图。
参考图8和图9可确定，1wt％分散液中VEGF的浓度为40.34pg/ml，以及根据实施例1的细胞外基质样品中VEGF含量为4.03ng/g。因此，确定了生长因子存在于通过使用超临界流体的溶剂提取法从动物脂肪中获得的细胞外基质样品中。
实验例3.根据过滤的DNA含量的变化
对根据实施例2的保存液的过滤前后的DNA含量进行分析。
图10是示出了分散有根据本发明实施方式的动物脂肪源性细胞外基质的分散液过滤前后的DNA含量的图。
参考图10确定了，DNA含量从过滤前的5.57ng/μl降低到0.13ng/μl，当将通过使用超临界流体的溶剂提取法获得的细胞外基质分散并过滤后，可以进一步减少残留的DNA。
实验例4.确定生长因子的类型和含量
为了确定根据实施例1的细胞外基质含有大量的各种生长因子，使用人生长因子抗体阵列膜和Abcam试剂盒进行分析。
根据试剂盒的方案处理样品并以1/10稀释以控制样品中存在的蛋白质浓度。
另一方面，为了确定根据实施例2的动物脂肪源性细胞外基质保存液中所含的生长因子的类型和含量，使用细胞因子抗体阵列进行分析。
通过1/10稀释制备1wt％分散液(对照)和过滤溶液(滤过液)，用缓冲溶液(洗涤液)洗涤膜，然后在室温下放置30分钟(封闭)。
将稀释的分析物溶液涂在膜上并在4℃下孵育24小时，然后用抽吸器去除分析物溶液。
残留的分析物溶液用缓冲溶液洗涤，在室温下注入生物素缀合的抗细胞因子并孵育2小时，然后去除液体，并洗涤残留物。
室温下注入HRP-缀合的链霉亲和素，孵育2小时，然后去除液体，并洗涤残留物。
应用检测缓冲液后，在5分钟内用化学发光检测相机拍摄图像，并使用ImageJ程序进行分析。
图11是根据本发明实施方式的动物脂肪源性细胞外基质保存液过滤前后细胞因子抗体阵列的结果的图像。
图10中黑色斑点的强度是使用ImageJ程序测量的。
通过细胞因子阵列测量图像中相应抗体的信号强度，确定样品中相应物质含量的相对值。
它是通过基于为阳性对照的VEGF相对值，将检测到的残留的生长因子的相对值进行转换来计算的。
图12示出了根据本发明实施方式的动物脂肪源性细胞外基质保存液过滤前后生长因子的类型和强度。
参考图11和图12，通过使用超临界流体的溶剂提取法得到的细胞外基质中共确定出40种生长因子，可确定，在过滤含有细胞外基质的保存液后，生长因子的含量降低。
图13示出了根据本发明实施方式的动物脂肪源性细胞外基质保存液过滤前后生长因子的类型和含量(ng/g)。
参考图13，确定根据实施例1的细胞外基质总共包含41种人生长因子中的40种生长因子，在使用超临界流体的溶剂提取法中去除了FGF-4。
确定了使用超临界流体的溶剂提取法的脱细胞化和脂肪去除效果对生长因子的含量有影响，并确定了可以获得生长因子的含量和类型根据使用超临界流体的溶剂提取法的提取条件而受到控制的细胞外基质。
另一方面，确定了根据实施例2制备的动物脂肪源性细胞外基质保存液具有一定量的生长因子，根据过滤，每1g细胞外基质中的生长因子含量降低为0.21ng至6.86ng，并确定了保存液中生长因子的含量是可以控制的。
此外，确定了通过过滤过程，生长因子中的bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)的含量降低到40％至50％，并且在1wt％分散液中残留有蛋白质，但通过过滤去除了蛋白质中所含的bFGF。因此，确定了可以去除保存液中的蛋白质。
这表明细胞外基质保存液通过去除保存液中的蛋白质降低了感染和污染的风险，从而提高生物安全性，在过滤过程中进行灭菌，并去除了剩余的DNA。因此，确定了可以提高动物脂肪源性细胞外基质保存液的可管理性和保存性。
本发明人注意到，随着近来抽脂术的增加，大量人体脂肪被丢弃。在寻找利用它的方法时，本发明人确定了，当利用使用超临界流体的溶剂提取法控制脂肪组织中的提取条件时，可以通过脱细胞化和脂肪去除获得具有提高的生物安全性和生物相容性的细胞外基质，同时保持细胞外基质的机械性能。
特别是，确定了在使用超临界流体的溶剂提取法中，大量生长因子保留在细胞外基质中，从而控制细胞的生理活动并迅速诱导组织再生。通过确定确定在使用超临界流体的溶剂提取法中排除某些生长因子的特点，确定了通过常规的化学和生物学处理，可以有效地从细胞外基质中提取具有不同生长因子组成的细胞外基质。
至此，对根据本发明的动物脂肪源性细胞外基质和动物脂肪源性细胞外基质保存液的具体示例进行了描述，但显然在本发明的范围内可以进行各种实施修改。
因此，本发明的范围不应限于所描述的实施方式，而应由所附权利要求及其等同物来定义。
即，上述实施方式在所有方面都应理解为说明性而非限制性，并且本发明的范围由以下要描述的权利要求而不是详细说明来指示，并且权利要求的含义和范围，以及所有源自其等同概念的变化或修改，均应理解为包含在本发明的范围内。
工业应用性
根据本发明，提供：一种细胞外基质，其通过脂肪去除和脱细胞化大大提高了其生物相容性，并含有生长因子以控制细胞的生理活动；及用于制备该细胞外基质的方法。
此外，细胞外基质可以通过使用超临界流体的溶剂提取法有效地获得。
此外，它可以在没有酸、酶处理和放射处理的情况下进行灭菌，以增加细胞外基质的生物安全性，并可以经过脱细胞化和脂肪去除以增加生物相容性。
此外，它提供了一种细胞外基质，其中细胞外基质的成分中保留了生长因子，通过控制生长因子的含量可以预期调节细胞的生理活动，并且可以快速诱导组织的再生。
此外，可以原样保持细胞外基质的结构特性，从而可以容易地制备可以根据移植部位的形状成型的组织结构模拟物。
此外，通过对人源性废脂肪进行有效处理，可以有效地提取和提供细胞外基质。
此外，包含该细胞外基质的保存液可以通过防止污染而长期保存，并且具有增加的可管理性，从而可以使细胞外基质的可用性大大提高。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种具有增加的生物安全性和生物相容性的动物脂肪源性细胞外基质，所述动物脂肪源性细胞外基质经过脱细胞化和脂肪去除并包含一定的生长因子。
2.根据权利要求1所述的动物脂肪源性细胞外基质，其中，所述脱细胞化和脂肪去除以及生长因子的包含是通过使用超临界流体的溶剂提取法进行的。
3.根据权利要求1所述的动物脂肪源性细胞外基质，其中，所述动物脂肪是通过抽脂提取的废脂肪。
4.根据权利要求2所述的动物脂肪源性细胞外基质，其中，所述生长因子由以下组成：AR、bFGF、b-NGF、EGF、EGFR、FGF-6、FGF-7、GCSF、GDNF、GM-CSF、HB-EGF、HGF、IGFB P-1、IGFBP-2、IGFB P-3、IGFB P-4、IGFB P-6、IGF-I、IGF-ISR、IGF-II、M-CSF、M-CSFR、NT-3、NT-4、PDGFRa、PDGFRb、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PIGF、SCF、SCFR、TGF-a、TGF-b、TGF-b2、TGF-b3、VEGF、VEGFR2、VEGFR3和VEGF-D。
5.根据权利要求4所述的动物脂肪源性细胞外基质，其中，所述生长因子的含量为每1g所述细胞外基质中0.52ng至11.19ng。
6.一种动物脂肪源性细胞外基质保存液，其中包含：0.1重量份至5重量份的动物脂肪源性细胞外基质，所述动物脂肪源性细胞外基质通过使用超临界流体的溶剂提取法经过脱细胞化和脂肪去除并含有一定的生长因子；和95重量份至99.9重量份的分散液，并且所述动物脂肪源性细胞外基质保存液是经过滤的。
7.根据权利要求6所述的动物脂肪源性细胞外基质保存液，其中，所述生长因子由以下组成：AR、bFGF、b-NGF、EGF、EGFR、FGF-6、FGF-7、GCSF、GDNF、GM-CSF、HB-EGF、HGF、IGFB P-1、IGFB P-2、IGFB P-3、IGFB P-4、IGFB P-6、IGF-I、IGF-ISR、IGF-II、M-CSF、M-CSFR、NT-3、NT-4、PDGFRa、PDGFRb、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PIGF、SCF、SCFR、TGF-a、TGF-b、TGF-b2、TGF-b3、VEGF、VEGFR2、VEGFR3和VEGF-D，并且是经过滤的并且含量为每1g所述细胞外基质中0.21ng至6.86ng。
8.根据权利要求6所述的动物脂肪源性细胞外基质保存液，其中，所述生长因子通过过滤而使bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)含量降低至40％～50％。

Claims (8)

1.一种动物脂肪源性细胞外基质，所述动物脂肪源性细胞外基质经过脱细胞化和脂肪去除并包含一定的生长因子。
2.根据权利要求1所述的动物脂肪源性细胞外基质，其中，所述脱细胞化和脂肪去除以及生长因子的包含是通过使用超临界流体的溶剂提取法进行的。
3.根据权利要求1所述的动物脂肪源性细胞外基质，其中，所述动物脂肪是通过抽脂提取的废脂肪。
4.根据权利要求2所述的动物脂肪源性细胞外基质，其中，所述生长因子由以下组成：AR、bFGF、b-NGF、EGF、EGFR、FGF-6、FGF-7、GCSF、GDNF、GM-CSF、HB-EGF、HGF、IGFB P-1、IGFBP-2、IGFB P-3、IGFB P-4、IGFB P-6、IGF-I、IGF-ISR、IGF-II、M-CSF、M-CSFR、NT-3、NT-4、PDGFRa、PDGFRb、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PIGF、SCF、SCFR、TGF-a、TGF-b、TGF-b2、TGF-b3、VEGF、VEGFR2、VEGFR3和VEGF-D。
5.根据权利要求4所述的动物脂肪源性细胞外基质，其中，所述生长因子的含量为每1g所述细胞外基质中0.52ng至11.19ng。
6.一种动物脂肪源性细胞外基质保存液，其中包含：0.1重量份至5重量份的动物脂肪源性细胞外基质，所述动物脂肪源性细胞外基质通过使用超临界流体的溶剂提取法经过脱细胞化和脂肪去除并含有一定的生长因子；和95重量份至99.9重量份的分散液，并且所述动物脂肪源性细胞外基质保存液是经过滤的。
7.根据权利要求6所述的动物脂肪源性细胞外基质保存液，其中，所述生长因子由以下组成：AR、bFGF、b-NGF、EGF、EGFR、FGF-6、FGF-7、GCSF、GDNF、GM-CSF、HB-EGF、HGF、IGFB P-1、IGFB P-2、IGFB P-3、IGFB P-4、IGFB P-6、IGF-I、IGF-ISR、IGF-II、M-CSF、M-CSFR、NT-3、NT-4、PDGFRa、PDGFRb、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PIGF、SCF、SCFR、TGF-a、TGF-b、TGF-b2、TGF-b3、VEGF、VEGFR2、VEGFR3和VEGF-D，并且是经过滤的并且含量为每1g所述细胞外基质中0.21ng至6.86ng。
8.根据权利要求6所述的动物脂肪源性细胞外基质保存液，其中，所述生长因子通过过滤而使bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)含量降低至40％～50％。
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