CN111760072B - 脂肪来源的真皮内填充物及其制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种脂肪来源的真皮内填充物及其制备和应用。该脂肪来源的真皮内填充物的制备方法包括：取脂肪组织颗粒，去除油脂和肿胀液，对所得剩余部分进行匀浆处理；所述匀浆处理采用的转速为20000rpm/min‑40000rpm/min，所述匀浆处理的时长为0.5min‑2min。本发明去除脂肪组织中的油脂及肿胀液之后，于合适的条件下对剩余脂肪成分进行匀浆处理，通过该匀浆处理对脂肪组织进行适度破坏，使所得产物含有脂肪细胞外基质胶原片段，实现脂肪组织中的活性胶原的保留，支撑效果好。该匀浆处理使脂肪组织中的活性物质释放出来，能够激活周围的机体细胞，促进胶原和血管新生，改善皮肤状态，达到年轻化的目的。

Description

脂肪来源的真皮内填充物及其制备和应用
技术领域
本发明属于医学美容技术领域，主要涉及一种脂肪来源的真皮内填充物及其制备和应用。
背景技术
面部衰老主要表现在骨性结构的改变，面部软组织容量减少，在皮肤层面表现为皮肤真皮层内含有更低的胶原密度并且分布分散，真皮成纤维细胞也由于胶原的碎片化而失去了正常的细胞形态，从而导致真性皱纹形成。尤其是眶周区域，由于缺乏骨性和软组织支撑，加之眶周的皮肤菲薄、运动多，使得眶周在面部衰老过程中最早出现真性皱纹。
针对眶周细小真性皱纹这一皮肤问题，临床上传统的治疗方法包括激光和填充剂填充等方法。但激光治疗很难针对皱纹本身精确处理，并且会产生色沉。传统的填充剂包括小分子透明质酸和异种胶原蛋白。透明质酸虽然注射方便，但是维持时间短，不能刺激周围组织再生；并且注射层次太浅时会出现丁达尔现象，皮肤呈现蓝色外观。异种胶原蛋白能直接用于补充真皮流失的胶原成分，但同时存在着过敏的风险，常需要在术前4周进行过敏测试。另外，异种胶原蛋白价格昂贵。
在临床自体脂肪移植的应用中发现，采用自体脂肪移植的区域的皮肤状况得到了改善。并且脂肪相关产物，如纳米脂肪和无细胞脂肪提取物，能够达到改善肤质的作用都已在实验和临床中得以证明。但纳米脂肪和无细胞脂肪提取物中含有大量的油或水，真正起作用的部分含量极低，尽管将这些传统产品会对肤质起到一定的作用，但支撑效果有待提升。
发明内容
基于此，本发明的目的是提供一种脂肪来源的真皮内填充物的制备方法，该方法制备的脂肪来源填充物中含有细小的胶原片段，能够真皮内注射，有一定填充和支撑效果，同时，还能够刺激局部真皮内胶原新生。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种脂肪来源的真皮内填充物的制备方法，所述的制备方法包括：
取脂肪组织颗粒，去除油脂和肿胀液，对所得剩余部分进行匀浆处理；
所述匀浆处理采用的转速为20000rpm/min-40000rpm/min，所述匀浆处理的时长为0.5min-2min。
在其中一个实施例中，所述匀浆处理采用的转速为25000rpm/min-35000rpm/min，所述匀浆处理的时长为0.8min-1.5min。
在其中一个实施例中，所述制备方法还包括对所述匀浆处理所得产物进行纯化的步骤。
在其中一个实施例中，所述纯化包括对所述匀浆处理所得产物进行过滤并对所得过滤产物进行离心的步骤。
在其中一个实施例中，所述过滤是将所述匀浆处理所得产物依次通过0.2mm-0.3mm孔径滤网和0.1mm-0.15mm孔径滤网。
在其中一个实施例中，对所述过滤产物进行离心所采用的转速为2500g/min-3500g/min，离心时长为2.5min-3.5min。
在其中一个实施例中，去除所述油脂和所述肿胀液采用离心的方式。
在其中一个实施例中，所述离心采用的转速1000g/min-1500g/min，离心时长为2.5min-3.5min。
本发明的还一目的是提供如上所述制备方法获得的脂肪来源的真皮内填充物。
本发明的又一目的是提供如上所述的真皮内填充物在制备皮肤修复产品中的应用。
在其中一个实施例中，所述皮肤修复产品为面部皮肤修复产品。
在其中一个实施例中，所述皮肤修复产品为颈部皮肤修复产品。
在其中一个实施例中，所述皮肤修复产品为注射型皮肤修复产品。
本发明的又一目的在于提供一种皮肤修复产品，包含如上所述的脂肪来源的真皮内填充物。
本发明的有益效果如下：
传统上，主要是向凹陷的皮肤部分注射透明质酸、脂肪干细胞悬浮液、脂肪组织乳糜液或者胶原蛋白。人们一直认为：透明质酸能给增加皮肤含水量，改善肤质。脂肪干细胞和脂肪组织乳糜液含有活性细胞，能够分泌生长因子，刺激移植区域的皮肤进行胶原新生，进而起到改善肤质的作用。胶原蛋白能够直接填充凹陷区域，但是来源为动物使得使用提取的胶原蛋白有过敏风险，需要提前4周做过敏反应的测试。然而，发明人经过长期研究和实践中发现，注射透明质酸，胶原蛋白、脂肪干细胞、脂肪组织乳糜液均不能同时达到支撑和刺激胶原新生的效果。
基于此，本发明去除脂肪组织中的油脂及肿胀液之后，于合适的条件下对剩余脂肪成分进行匀浆处理，通过该匀浆处理对脂肪组织进行适度破坏，使所得产物含有脂肪细胞外基质胶原片段(含0.15mm以下的片段)，实现脂肪组织中的活性胶原的保留，支撑效果好。
并且，该匀浆处理使脂肪组织中的活性物质释放出来，能够激活周围的机体细胞，促进胶原和血管新生，改善皮肤状态，达到年轻化的目的。
综上，本发明所得产物无活细胞，浓缩脂肪细胞外基质，成匀质状态，可注射性好。整体上，通过该工艺通过物理手段获得的真皮内填充物，尽可能保留了脂肪组织中的活性胶原和细胞因子成分，注射入皮肤之后，能够兼顾填充和焕肤的双重效果。
附图说明
图1为实施例1的ACF制备流程图；
图2为实施例1制备的ACF和Coleman脂肪物理性质以及可注射性的对比图；
图3为实施例1制备的ACF的Masson、扫描电镜结构显示显微结构；
图4为实施例1制备的ACF以及与Coleman脂肪对比关键胶原蛋白保留检测结果图；
图5为实施例1制备的ACF中细胞培养和活死染色检测结果图；
图6为实施例1制备的ACF皮肤内移植后真皮层厚度改变；
图7为实施例1制备的ACF皮肤内移植后真皮层中成纤维细胞数目改变。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明实施例主要提供一种真皮内填充物的制备方法，所述的制备方法包括：
取脂肪组织颗粒，去除油脂和肿胀液，对所得剩余部分进行匀浆处理；
所述匀浆处理采用的转速为20000rpm/min-40000rpm/min，所述匀浆处理的时长为0.5min-2min。
基于此，本发明去除脂肪组织中的油脂及肿胀液之后，于合适的条件下对剩余脂肪成分进行匀浆处理，通过该匀浆处理对脂肪组织进行适度破坏，使所得产物含有脂肪细胞外基质胶原片段(含有0.15mm以下的片段)，实现脂肪组织中的活性胶原的保留。并且，该匀浆处理使脂肪组织中的活性物质得以释放，能够激活周围的机体细胞，促进胶原和血管新生，改善皮肤状态，达到年轻化的目的。
综上，本发明所得产物无活细胞，浓缩脂肪细胞外基质，成匀质状态，可注射性好。整体上，通过该工艺通过物理手段获得的真皮内填充物，尽可能保留了脂肪组织中的活性胶原和细胞因子成分，注射入皮肤之后，能够兼顾填充和焕肤的双重效果。
可以理解的是，在该匀浆处理的条件范围内均可实现本发明，例如匀浆处理采用的转速为20000rpm/min、匀浆处理的时长为2min，匀浆处理采用的转速为40000rpm/min、匀浆处理的时长为0.5min，匀浆处理采用的转速为35000rpm/min、匀浆处理的时长为1.5min，等。
可以理解的是，本发明实施例所涉的脂肪组织，来源广泛，例如：可以是购买的，也可以是手术获得的。
优选地，所述匀浆处理采用的转速为25000rpm/min-35000rpm/min，所述匀浆处理的时长为0.8min-1.5min。
进一步优选地，所述匀浆处理采用的转速为30000rpm/min，所述匀浆处理的时长为1min。
优选地，所述制备方法还包括对所述匀浆处理所得产物进行纯化的步骤。可以理解的是，为了获得质量较好的真皮内填充物，例如，获得浓度较高的胶原片段等活性成分，降低细胞碎片等杂质，可以对匀浆处理所得产物进行纯化，纯化的方式不受限制。经过纯化步骤，本申请所得产物中，关键胶原蛋白成分的保留率高，细胞因子活性成分高。
优选地，所述纯化包括对所述匀浆处理所得产物进行过滤并对所得过滤产物进行离心的步骤。
优选地，所述过滤是将所述匀浆处理所得产物依次通过0.2mm-0.3mm孔径滤网和0.1mm-0.15mm孔径滤网。例如依次通过0.25mm孔径滤网和0.15mm孔径滤网、依次通过0.2mm孔径滤网和0.15mm孔径滤网、依次通过0.3mm孔径滤网和0.1mm孔径滤网等等。可以理解的是，为了达到纯化的目的，通过0.2mm-0.3mm孔径滤网的次数不受限制和通过0.1mm-0.15mm孔径滤网的此处不受限制，可以是1次、2次、3次等。
进一步优选地，所述过滤是将所述匀浆处理所得产物依次通过0.25mm孔径滤网和0.15mm孔径滤网。
可以理解的是，过滤的方式不受限制，可以压滤，也可以抽滤，采用的装置设备也不受局限。
优选地，对所述过滤产物进行离心所采用的转速为2500g/min-3500g/min，时长为2.5min-3.5min。进一步优选地，对所述过滤产物进行离心所采用的转速为3000g/min，时长为3min。
优选地，所述获得颗粒脂肪组织的步骤中，所述离心采用的转速1000g/min-1500g/min，时长为2.5min-3.5min。进一步优选地，所述获得颗粒脂肪组织的步骤中，所述离心采用的转速1200g/min，时长为3min。
优选地，去除所述油脂和所述肿胀液采用离心的方式。可以理解的是，离心的脂肪组织颗粒可以是对块状脂肪组织进行粉碎得到的，亦或者是从脂肪组织抽取得到的。
优选地，所述离心采用的转速1000g/min-1500g/min，离心时长为2.5min-3.5min。
本发明实施例还提供如上所述制备方法获得的真皮内填充物。
本发明实施例还提供如上所述的真皮内填充物在制备皮肤修复产品中的应用。
优选地，所述皮肤修复产品为面部皮肤修复产品或者颈部皮肤修复产品。
优选地，所述皮肤修复产品为注射型皮肤修复产品。
本发明实施例还提供一种皮肤修复产品，包含如上所述的脂肪来源的真皮内填充物。
以下通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明，下述实施例以Coleman脂肪作为对照。Coleman脂肪将是抽吸脂肪物用1200g×3min离心，上层为油脂，最下层是肿胀液，中间层即为Coleman脂肪。
实施例1、脂肪来源的真皮内填充物及其制备方法
本实施例提供一种脂肪来源的真皮填充物及其制备方法，该制备方法包括如下步骤(参照图1)：
(1)将脂肪组织，粉碎成颗粒，置于1200g/min条件下离心3min，将离心所得上层油脂及底层肿胀液弃去，收集中层颗粒脂肪组织；
(2)将步骤(1)所得的体积适量的颗粒脂肪组织，转移至组织匀浆机中；
(3)将组织匀浆机的转速设置为30000rpm/min，匀浆时间为1min；
(4)将步骤(3)所得的匀浆后的均质脂肪产物收集至50ml螺口注射器中；
(5)将步骤(4)的螺口注射器与含有0.25mm孔径的不锈钢网的滤器以鲁尔接头密封对接，同时滤器另一端与一枚新的50ml螺口注射器密封连接；
(6)推动含有均质脂肪产物的注射器活塞，将脂肪单向推注至对侧注射器中；
(7)调转螺口注射器相对于滤器的位置，重复步骤(6)；
(8)将滤器更换为含有0.15mm孔径的不锈钢网的滤器，与注射器以鲁尔接头密封对接；
(9)重复步骤(6)以及步骤(7)；
(10)收集步骤(9)过滤后的均质脂肪产物，以3000g/min离心3min，将上层油脂弃去，最底层为真皮内填充物，含有脂肪胶原片段，简称为“ACF”。
本实施例制备的ACF为白色或者粉色，匀质。可以转移至1ml螺口注射器，连接30G注射器锐针针头，即可进行面部及颈部皱纹精细填充或少量容量填充。
以下对本实施例制备的ACF作进一步的生物学特性进行检测：
1、ACF物理性质检测
实验方法：对ACF进行大体观察以及可注射性的检测。为了更直观的比较ACF的各类性质，在下述检测中，将Coleman脂肪设置为对照组。结果参见图2。
如图2所示，与Coleman脂肪相比，ACF具有一定的内聚性。并且ACF更加的均质细腻，而且延展性更强。ACF可以顺利的通过31G的针头进行注射，进一步说明了精细填充的可能性。
2、ACF显微结构及关键胶原蛋白保留检测
取本实施例制备的ACF样本，用福尔马林固定后分别进行HE染色及Masson染色及I型胶原蛋白(COL I)和IV型胶原蛋白(COL IV)和层粘连蛋白(Laminin)的免疫组化染色。
用扫描电镜(SEM)观察ACF的超微结构。用扫描电镜(S-3000N；Hitachi Ltd.,Tokyo,Japan)观察，图像用数码相机(Canon Inc.,Tokyo,Japan)拍摄。
用免疫组化染色的方法直观比较ACF和Coleman脂肪中COL I；COL IV和Laminin的含量。对上述经福尔马林处理的ACF和Coleman脂肪样本用常规方法进行石蜡包埋，切成5μm厚切片，覆盖于载玻片，进行脱蜡和水合。随后，将载玻片放入3％过氧化氢5分钟使过氧化物酶失活，再用PBS洗三遍，持续5分钟。随后，对载玻片进行抗原修复，并在4℃下用一级抗体孵育过夜，PBS清洗三遍后，显色剂显色，自来水充分冲洗，使用封片剂封片。
用western blotting技术半定量分别测量ACF和Coleman脂肪中的几种关键胶原蛋白成分的保留率：包括I型胶原(COLⅠ)、III型胶原(COL III)、IV型胶原(COLⅣ)、层粘连蛋白(laminin)，β肌动蛋白(β-actin)作为内源参照蛋白。
检测结果如图3所示：
图3中，Masson染色显示ACF由胶原组成；SEM电镜分析证实ACF主要由碎片状的胶原结构构成，其中还有少量残留细胞，而且没有观察到油滴。
图4A中可以看出ACF与Coleman脂肪相比含有更高的COL I和COL IV比例。
图4B所示结果，进一步证实了免疫组化染色的结果，据此可以看出细胞外基质胶原蛋白COL I，COL IV，Laminin在ACF组明显高于Coleman脂肪对照组。
3、ACF中细胞培养和活死染色检测
检测方法包括：
分别将1ml Coleman脂肪和ACF平铺在10cm细胞培养皿中，加入9mL完全培养基(DMEM中加入10％牛胎儿血清、100U/mL青霉素和100μg/ml链霉素)进行培养。一周后直接在光镜下观察是否在组织周围有细胞迁出。
采用DAPI+Calcein-AM/PI双染细胞的方法标记活细胞和死细胞。取少量Coleman脂肪和ACF置于2mLEP管中，用PBS稀释至总体积1ml。加入10L染色液A和2μL染色液B，以及10μLDAPI染色液。震荡均匀后置于37℃恒温箱中避光孵育30min。离心后，用荧光倒置显微镜(IX71；Olympus,Tokyo,Japan)观察。
检测结果：如图5所示，从中可以看出，ACF在体外培养1周后没有活细胞从组织内迁出，而Coleman脂肪组可以看到多个贴壁梭形细胞。活/死细胞染色结果可以看出Coleman脂肪组存在完整的团簇状脂肪细胞结构。而ACF组则表现为均质一片，没有完整细胞结构。
4、ACF体内真皮层内移植补充真皮层胶原能力、诱导真皮层内新生胶原以及真皮成纤维细胞数量的检测
将4-6周大的裸鼠随机分成两组，分别为ACF组和PBS组。在ACF处理组中，把单点0.01mLACF皮内注射到裸鼠背部左侧，右侧相应位置单点注射0.01mL PBS缓释液。每组各注射9个点(如图6所示)。分别在1周、4周、8周三个时间点进行取材，一半样本用福尔马林固定，进行免疫组织化学染色。
(1)对上述经福尔马林处理的鼠全层皮肤样本用常规方法进行masson染色。
石蜡包埋，切成4μm厚切片，覆盖于载玻片，进行脱蜡和水合。依次自来水和蒸馏水洗。用Regaud苏木精染液或Weigert苏木精液染核5-10min。充分水洗,如过染可盐酸酒精分化。蒸馏水洗。用Masson丽春红酸性复红液5-10min。以2％冰醋酸水溶液浸洗片刻。1％磷钼酸水溶液分化3-5min。不经水洗,直接用苯胺蓝或光绿液染5min。以0.2％冰醋酸水溶液浸洗片刻。95％酒精、无水酒精、二甲苯透明、中性树胶封固。用荧光显微镜(BX51；Olympus,Tokyo,Japan)对切片进行观察和拍摄。每张切片观察10个视野，对样品的真皮厚度进行测量，评估ACF在鼠真皮内的结合以及降解情况。
实验结果如图6所示，ACF皮内注射组在三个时间点均可在鼠真皮层增厚，胶原蛋白含量增加，并且结构逐渐趋于整齐，真皮内的总胶原蛋白含量增加，密度增到。定量结果显示，ACF处理组相较于PBS对照组能够增加真皮层的厚度以及胶原蛋白含量。
(2)对上述经福尔马林处理的鼠全层皮肤样本用常规方法进行，用真皮成纤维细胞特征性标记vimentin抗体进行免疫组化染色。
石蜡切片脱蜡至水，3％H2O2室温孵育5-10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟。随后对载玻片进行抗原修复。并在4℃下用一级抗体孵育过夜。PBS冲洗，5分钟×3次。在26℃下用二级抗体孵育30分钟。滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素(PBS稀释)，37℃孵育10-30分钟。PBS冲洗，5分钟×3次。显色剂显色(DAB或AEC)。自来水充分冲洗，复染，封片。用荧光显微镜(BX51；Olympus,Tokyo,Japan)对切片进行观察和拍摄。每张切片观察10个视野，对样品中vimentin阳性的真皮成纤维细胞进行计数。
实验结果如图7示，ACF处理组相较于PBS对照组能够显著增加真皮内的成纤维细胞的数量。
实施例2、真皮内填充物及其制备方法
本实施例提供一种真皮填充物及其制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(1)将脂肪组织击碎，置于1000g/min条件下离心3.5min，将离心所得上层油脂及底层肿胀液弃去，收集中层颗粒脂肪组织；
(2)将步骤(1)所得的体积适量的颗粒脂肪组织，转移至组织匀浆机中；
(3)将组织匀浆机的转速设置为20000rpm/min，匀浆时间为2min；
(4)将步骤(3)所得的匀浆后的均质脂肪产物收集至50ml螺口注射器中；
(5)将步骤(4)的螺口注射器与含有0.2mm孔径的不锈钢网的滤器以鲁尔接头密封对接，同时滤器另一端与一枚新的50ml螺口注射器密封连接；
(6)推动含有均质脂肪产物的注射器活塞，将脂肪单向推注至对侧注射器中；
(7)调转螺口注射器相对于滤器的位置，重复步骤(6)；
(8)将滤器更换为含有0.1mm孔径的不锈钢网的滤器，与注射器以鲁尔接头密封对接；
(9)重复步骤(6)以及步骤(7)；
(10)收集步骤(9)过滤后的均质脂肪产物，以2500g/min离心3.5min，将上层油脂弃去，最底层为真皮内填充物，含有脂肪胶原片段，简称为“ACF”。
经检测(检测方法参照实施例1)，本实施例所得ACF与实施例1制备法获得的ACF具有相近的性质和功能。
实施例3、真皮内填充物及其制备方法
本实施例提供一种真皮填充物及其制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(1)将脂肪组织击碎，置于1500g/min条件下离心2.5min，将离心所得上层油脂及底层肿胀液弃去，收集中层颗粒脂肪组织；
(2)将步骤(1)所得的体积适量的颗粒脂肪组织，转移至组织匀浆机中；
(3)将组织匀浆机的转速设置为40000rpm/min，匀浆时间为0.5min；
(4)将步骤(3)所得的匀浆后的均质脂肪产物收集至50ml螺口注射器中；
(5)将步骤(4)的螺口注射器与含有0.3mm孔径的不锈钢网的滤器以鲁尔接头密封对接，同时滤器另一端与一枚新的50ml螺口注射器密封连接；
(6)推动含有均质脂肪产物的注射器活塞，将脂肪单向推注至对侧注射器中；
(7)调转螺口注射器相对于滤器的位置，重复步骤(6)；
(8)将滤器更换为含有0.15mm孔径的不锈钢网的滤器，与注射器以鲁尔接头密封对接；
(9)重复步骤(6)以及步骤(7)；
(10)收集步骤(9)过滤后的均质脂肪产物，以3500g/min离心2.5min，将上层油脂弃去，最底层为真皮内填充物，含有脂肪胶原片段，简称为“ACF”。
经检测(检测方法参照实施例1)，本实施例所得ACF与实施例1制备法获得的ACF具有相近的性质和功能。
对比例1、真皮内填充物及其制备方法
本实施例是实施例1的比较例，也提供一种真皮填充物及其制备方法，该制备方法相对于实施例1的主要变化之处包括匀浆处理的参数设置不同，具体地，本实施例的真皮填充物的制备方法包括如下步骤：
(1)将脂肪组织击碎，置于1200g/min条件下离心3min，将离心所得上层油脂及底层肿胀液弃去，收集中层颗粒脂肪组织；
(2)将步骤(1)所得的体积适量的颗粒脂肪组织，转移至组织匀浆机中；
(3)将组织匀浆机的转速设置为45000rpm/min，匀浆时间为0.5min；
(4)将步骤(3)所得的匀浆后的均质脂肪产物收集至50ml螺口注射器中；
(5)将步骤(4)的螺口注射器与含有0.25mm孔径的不锈钢网的滤器以鲁尔接头密封对接，同时滤器另一端与一枚新的50ml螺口注射器密封连接；
(6)推动含有均质脂肪产物的注射器活塞，将脂肪单向推注至对侧注射器中；
(7)调转螺口注射器相对于滤器的位置，重复步骤(6)；
(8)将滤器更换为含有0.15mm孔径的不锈钢网的滤器，与注射器以鲁尔接头密封对接；
(9)重复步骤(6)以及步骤(7)；
(10)收集步骤(9)过滤后的均质脂肪产物，以3000g/min离心3min，将上层油脂弃去，最底层为真皮内填充物。
经检测，本对比例所得ACF由于匀浆转速过快，结构坍塌，片段过于细碎。不能通过离心处理和脂肪组织其他成分相分离。
对比例2、真皮内填充物及其制备方法
本实施例是实施例1的比较例，也提供一种真皮填充物及其制备方法，该制备方法相对于实施例1的主要变化之处包括匀浆处理的参数设置不同，具体地，本实施例的真皮填充物的制备方法包括如下步骤：
(1)将脂肪组织击碎，置于1200g/min条件下离心3min，将离心所得上层油脂及底层肿胀液弃去，收集中层颗粒脂肪组织；
(2)将步骤(1)所得的体积适量的颗粒脂肪组织，转移至组织匀浆机中；
(3)将组织匀浆机的转速设置为18000rpm/min，匀浆时间为2.5min；
(4)将步骤(3)所得的匀浆后的均质脂肪产物收集至50ml螺口注射器中；
(5)将步骤(4)的螺口注射器与含有0.25mm孔径的不锈钢网的滤器以鲁尔接头密封对接，同时滤器另一端与一枚新的50ml螺口注射器密封连接；
(6)推动含有均质脂肪产物的注射器活塞，将脂肪单向推注至对侧注射器中；
(7)调转螺口注射器相对于滤器的位置，重复步骤(6)；
(8)将滤器更换为含有0.15mm孔径的不锈钢网的滤器，与注射器以鲁尔接头密封对接；
(9)重复步骤(6)以及步骤(7)；
(10)收集步骤(9)过滤后的均质脂肪产物，以3000g/min离心3min，将上层油脂弃去，最底层为真皮内填充物。
经检测，本对比例所得ACF由于匀浆时间过长，匀浆机内温度过高，破坏了微观结构。不能通过离心处理和脂肪组织其他成分相分离，并认为不能再体内发挥应有的作用。
本发明主要是对脂肪组织进行纯物理的机械化处理，预先破坏细胞，去除脂肪组织中脂质成分，获得浓缩的细胞外基质和可溶性细胞因子，尽可能保留脂肪组织中的活性胶原和细胞因子成分。本发明的优点表现在：(1)本发明使用简单的物理处理方法，将脂肪组织中脂肪细胞破坏；获得脂肪组织细胞外基质的胶原片段。(2)本发明应用简易的离心方法，高度浓缩脂肪组织中脂肪细胞破坏后释放出大量生物活性物质。(3)本发明的方法，可以用于获取自身脂肪组织来源胶原成分，作为衰老导致的真皮内胶原成分流失的补充剂，提供皱纹的容量填充，达到面部和颈部年轻化的目的。如果将本发明的方法用于从自体脂肪组织中获得胶原，自体脂肪组织可以从抽脂手术后自身废弃脂肪抽取物中获得，制备方法简便，消除了其他真皮填充物可能污染和过敏的风险，可成为面颈部皱纹填充及肤质改善等年轻化目的的新策略。(4)通过纯物理方法高度浓缩的脂肪组织细胞因子，不携带外源性污染物以及过敏原，通过注射到真皮层，能够激活周围细胞，促进胶原和血管新生，进一步起到改善面部及颈部皮肤状态，达到年轻化的目的。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (4)

1.一种脂肪来源的真皮内填充物的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括：
取脂肪组织颗粒，去除油脂和肿胀液，对所得剩余部分进行匀浆处理；去除所述油脂和所述肿胀液采用离心的方式；所述离心采用的转速1200g/min，离心时长为3min；离心的所述脂肪组织颗粒是通过对块状脂肪组织进行粉碎得到的，或者是从脂肪组织抽取得到的；
所述匀浆处理采用的转速为30000rpm，所述匀浆处理的时长为1min；
所述制备方法还包括对所述匀浆处理所得产物进行纯化的步骤；
所述纯化包括对所述匀浆处理所得产物进行过滤并对所得过滤产物进行离心的步骤；
所述过滤是将所述匀浆处理所得产物依次通过0.25mm孔径滤网和0.15mm孔径滤网；
对所述过滤产物进行离心所采用的转速为3000g/min，离心时长为3min。
2.权利要求1所述制备方法获得的脂肪来源的真皮内填充物。
3.权利要求2所述的脂肪来源的真皮内填充物在制备皮肤修复产品中的应用。
4.一种皮肤修复产品，其特征在于，包含有权利要求2所述的脂肪来源的真皮内填充物。
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