KR20210063324A - 지방 유래 줄기 세포 및 젤라틴을 포함하는 생체물질 및 이의 제조방법 - Google Patents

지방 유래 줄기 세포 및 젤라틴을 포함하는 생체물질 및 이의 제조방법 Download PDF

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KR20210063324A
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Abstract

본 발명은 지방 유래 줄기 세포 (ASC), 세포외 기질 및 젤라틴을 포함하는 생체물질에 관한 것이다. 본 발명은 또한 생체물질을 제조하는 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

지방 유래 줄기 세포 및 젤라틴을 포함하는 생체물질 및 이의 제조방법
본 발명의 분야
본 발명은 줄기 세포 및 다차원 생체물질(biomaterial) 제조를 위한 이의 용도 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 지방 유래 줄기 세포 (adipose-derived stem cell; ASC)를 포함하는 생체물질, 상기 생체물질을 제조하는 방법 및 치료를 위해 상기 생체물질을 사용하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 배경
조직 공학은 살아있는 세포의 사용을 통한 조직 구조 또는 기능의 복원을 포함한다. 일반적인 프로세스는 세포 단리 및 증식, 이어서, 스캐폴드(scaffold) 물질이 사용되는 재이식 절차로 구성된다. 중간엽 줄기 세포는 성숙한 조직으로부터의 세포에 대한 우수한 대안을 제공하고, 예를 들어, 골 및 연골 조직 재생을 위한 세포 공급원으로서 다수의 장점을 갖는다.
정의에 따르면, 줄기 세포는 자가 재생을 진행시킬 수 있는 능력 및 다계통 분화를 진행시키고, 최종 분화 세포를 형성할 수 있는 능력을 특징으로 한다. 이상적으로, 재생 의약 적용을 위한 줄기 세포는 하기 기준 세트를 충족하여야 한다: (i) 풍부한 양 (수백만 내지 수십억 개의 세포)으로 존재하여야 하고; (ii) 최소 침습 절차에 의해 수집 및 수확될 수 있고; (iii) 재현가능한 방식으로 다중 세포 계통 경로를 따라 분화될 수 있고; (iv) 자가 또는 동종이계 숙주에 안전하고 효과적으로 이식될 수 있다.
연구에 의해, 줄기 세포가 중배엽, 내배엽 및 외배엽 기원의 세포로 분화하는 능력을 갖는 것으로 입증되었다. MSC의 소성은 대부분 종종 계통 장벽을 통과하고, 다른 조직에 고유한 세포의 표현형, 생화학적 및 기능적 특성을 채택하기 위해 줄기 세포 내에 보유된 고유 능력을 지칭한다. 성체 중간엽 줄기 세포는 예를 들어, 골수 및 지방 조직으로부터 단리될 수 있다.
지방 유래 줄기 세포는 다능성이며, 완전한 재생 능력을 갖는다. 동일한 지방 조직 세포 집합을 확인하기 위해 하기 용어가 사용되었다: 지방 유래 줄기/기질 세포 (ASC); 지방 유래 성체 줄기 (ADAS) 세포, 지방 유래 성체 기질 세포, 지방 유래 기질 세포 (ADSC), 지방 기질 세포 (ASC), 지방 중간엽 줄기 세포 (AdMSC), 지방아세포, 혈관주위세포, 지방전구세포, 프로세싱된 지방흡인물 (PLA) 세포. 이러한 다양한 명칭의 사용은 문헌에서 상당한 혼란을 초래하였다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 국제 지방 관련 연구회(International Fat Applied Technology Society)는 "지방 유래 줄기 세포" (ASC)라는 용어를 채택하여, 단리된 소성-부착성 다능성 세포 집합을 확인하는 합의에 도달하였다.
조직 재건(reconstruction)은 골 및 연골 재건 뿐만 아니라, 진피(dermis), 표피(epidermis) 및 근육 재건을 포함한다. 현재, 각각의 조직 결손은 각각에 대하여 상이한 발생을 요하면서, 특이적인 처치로 치료되어야 한다.
따라서, 당업계에서는 완전 생체적합성이고, 비록 매우 다양하게 광범위한 조직에 사용할 수는 있지만, 지정된 적용에 적절한 기계적 특징을 제공하는 골 조직 재건 및/또는 재생을 위한 조직 조작된 물질이 여전히 요구되고 있다. 그러므로, 본 발명은 젤라틴과 함께, 다차원 구조로 분화되는 ASC로 제조된 이식편에 관한 것이다.
요약
본 발명은 분화된 지방 유래 줄기 세포 (ASC), 세포외 기질(extracellular matrix) 및 젤라틴을 포함하는 다차원 구조를 갖는 생체물질에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 젤라틴은 돼지(porcine) 젤라틴이다. 한 실시양태에서, 젤라틴은 입자 형태이다. 한 실시양태에서, 젤라틴의 평균 직경은 약 50 ㎛ 내지 약 1,000 ㎛, 바람직하게는, 약 75 ㎛ 내지 약 750 ㎛, 더욱 바람직하게는, 약 100 ㎛ 내지 약 500 ㎛ 범위이다.
한 실시양태에서, 생체물질은 3차원이다.
특정 실시양태에서, 생체물질은 성형가능 또는 형성가능한 것이다.
한 실시양태에서, ASC는 골아세포, 연골세포, 각질형성세포(keratinocyte), 근섬유아세포, 내피 세포 및 지방세포를 포함하거나, 또는 이로 구성된 군으로부터 선택되는 세포로 분화된다.
본 발명은 또한 본원 상기에 기술된 바와 같은 다차원 생체물질을 포함하는 의료 장치(medical device) 또는 제약 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은
- 지방 유래 줄기 세포 (ASC) 증식 단계,
- 제4 계대(the fourth passage)에서의 ASC 분화 단계, 및
- 다차원 유도, 바람직하게는, 3D 유도 단계를 포함하는, 본원 상기에 기술된 바와 같은 다차원 생체물질을 제조하는 방법이다.
본 발명은 추가로 본원 상기에 기술된 바와 같은 방법에 의해 수득가능한 다차원 생체물질에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 또 다른 목적은 조직 결손(tissue defect)의 치료용으로 사용하기 위한 본원 상기에 기술된 바와 같은 생체물질이다. 한 실시양태에서, 조직은 골, 연골, 진피, 표피, 근육, 내피 및 지방 조직을 포함하거나, 또는 이로 구성된 군으로부터 선택된다.
정의
본 발명에서, 하기 용어는 하기 의미를 갖는다:
- 값에 선행하는 용어 "약"은 상기 값의 + 또는 - 10%를 의미한다.
- 용어 "지방 조직"은 임의의 지방 조직을 지칭한다. 지방 조직은 피하, 대망/내장, 유방, 생식선 또는 다른 지방 조직 부위로부터 유래된 갈색 또는 백색 지방 조직일 수 있다. 바람직하게는, 지방 조직은 피하 백색 지방 조직이다. 상기 세포는 1차 세포 배양물 또는 불멸화 세포주를 포함할 수 있다. 지방 조직은 지방 조직을 갖는 살아있거나, 사멸된 임의의 유기체로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, 지방 조직은 동물, 더욱 바람직하게는, 포유동물이고, 가장 바람직하게는, 지방 조직은 인간이다. 지방 조직의 편리한 공급원은 지방흡입 수술에 의한 것이지만, 지방 조직의 공급원 또는 지방 조직의 단리 방법은 본 발명에 중요하지 않다.
- 본원에서 사용되는 바, "지방 유래 줄기 세포"는 지방 조직의 "비-지방세포" 분획을 지칭한다. 세포는 신선한 것이거나, 배양물 중의 것일 수 있다. "지방 유래 줄기 세포" (ASC)는 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 지방세포, 골세포, 연골세포와 같은 다양한 상이한 세포 유형에 대한 전구체로서 작용할 수 있는 지방 조직으로부터 유래된 기질세포를 지칭한다.
- 용어 "재생" 또는 "조직 재생"은 본 개시내용의 ASC로부터의 새로운 세포 유형 또는 조직의 성장, 생성 또는 재건을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 한 실시양태에서, 이들 세포 유형 또는 조직으로는 골형성 세포 (예컨대, 골아세포), 연골세포, 내피 세포, 심근세포, 조혈 세포, 간 세포, 지방세포, 신경 세포 및 근관을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 용어 "재생" 또는 "조직 재생"은 본 개시내용의 ASC로부터의 골형성 세포 (예컨대, 골아세포)의 생성 또는 재건을 지칭한다.
- 본원에서 사용되는 바, 용어 "성장 인자"는 조직 성장, 세포 증식, 혈관화 등을 촉진하는 분자이다. 특정 실시양태에서, 용어 "성장 인자"는 골 조직을 촉진하는 분자를 포함한다.
- 본원에서 사용되는 바, 용어 "배양된"은 시험관내, 생체내 또는 생체외 환경에서 세포 분열이 진행되거나, 세포 분열이 진행되지 않는 하나 이상의 세포를 지칭한다. 시험관내 환경은 예를 들어, 적합한 액체 배지 또는 아가와 같은 시험관내에서 세포를 유지하는 데 적합한 당업계에 공지된 임의의 배지일 수 있다. 세포 배양에 적합한 시험관내 환경의 구체적인 예는 문헌 [Culture of Animal Cells: a manual of basic techniques (3rd edition), 1994, R. I. Freshney (ed.), Wiley-Liss, Inc.; Cells: a laboratory manual (vol. 1), 1998, D. L. Spector, R. D. Goldman, L. A. Leinwand (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press; and Animal Cells: culture and media, 1994, D. C. Darling, S. J. Morgan John Wiley and Sons, Ltd.]에 기술되어 있다.
- 용어 "전면생장률(confluency)"은 세포 배양 표면 (예컨대, 배양 디쉬 또는 플라스크) 중의 부착성 세포의 개수, 즉, 세포로 커버된 표면의 비율을 지칭한다. 전면생장률이 100%라는 것은 표면이 세포로 완전히 커버되어 있음을 의미한다. 한 실시양태에서, "세포가 전면생장에 도달하다" 또는 "세포가 전면생장 상태이다"라는 표현은 세포가 표면의 80 내지 100%를 커버한 것을 의미한다. 한 실시양태에서, "세포는 준-전면생장 상태이다"라는 표현은 세포가 표면의 60 내지 80%를 커버한 것을 의미한다. 한 실시양태에서, "세포가 과다전면생장 상태이다"이라는 표현은 세포가 수 시간 또는 수 일 이후 표면의 적어도 100%를 커버하고/거나, 100% 전면생장 상태임을 의미한다.
- 용어 "냉장 상태" 또는 "냉장"은 예를 들어, 연장된 기간, 예컨대, 적어도 약 1시간, 적어도 약 1일, 적어도 약 1주, 적어도 약 4주, 적어도 약 6개월 등의 기간 동안 대상체의 정상적인 생리학적 온도보다 낮은 온도, 예를 들어, 약 -196℃ 내지 약 +32℃의 범위에서 선택되는 하나 이상의 온도에 도달되도록 하는 처리를 지칭한다. 한 실시양태에서, "냉장 상태" 또는 "냉장"은 0℃ 미만의 온도에 도달되도록 하는 처리를 지칭한다. 냉장 상태는 수동으로 수행될 수 있거나, 또는 바람직하게는, 냉장 프로그램을 실행할 수 있는 특수 장치를 사용하여 수행될 수 있다. 한 실시양태에서, 용어 "냉장"은 당업계에 "동결" 및 "저온보존"으로 공지된 방법을 포함한다. 당업자는 냉장 방법이 그 목적을 위한 시약의 첨가를 포함하는 다른 단계를 포함할 수 있음을 이해할 것이다.
- 본원에서 사용되는 바, 용어 "비-배아 세포"는 배아로부터 단리되지 않은 세포를 지칭한다. 비-배아 세포는 분화되거나, 분화되지 않은 것일 수 있다. 비-배아 세포는 자궁외 동물로부터 단리된 세포와 같은 거의 모든 체세포를 지칭할 수 있다. 이러한 예는 제한하는 것을 의미하지 않는다.
- 본원에서 사용되는 바, 용어 "분화된 세포"는 특수화되지 않은 표현형으로부터 특수한 표현형으로 발생한 전구체 세포를 지칭한다. 예를 들어, 지방 유래 줄기 세포는 골형성 세포로 분화될 수 있다.
- 본원에서 사용되는 바, 용어 "분화 배지"는 분화된 세포를 생성하기 위해 본 발명의 배양 시스템에 사용되는 화합물의 집합 중 하나를 지칭한다. 화합물의 작용 모드는 제한되지 않는 것으로 의도된다. 예를 들어, 작용제는 표현형의 변화를 유도 또는 지원하거나, 특정 표현형을 갖는 세포의 성장을 촉진시키거나, 다른 것의 성장을 지연시킴으로써 분화 프로세스를 지원할 수 있다. 이는 또한 그렇지 않으면 경로를 통해 원치않는 세포 유형으로의 분화를 유도할 수 있고, 세포 집합에 의해 합성되거나, 배지에 존재할 수 있는 다른 인자에 대한 억제제로서 작용할 수 있다.
- 용어 "치료," "치료하는" 또는 "완화"는 골 결손을 예방하거나, 지연 (감소)시킬 목적의 치료학적 처치를 지칭한다. 치료를 필요로 하는 대상으로는 이미 장애가 있는 대상 뿐만 아니라, 장애의 소인이 있는 대상 또는 골 결손을 예방하고자 하는 대상을 포함한다. 본 발명의 방법에 따라 치료량의 생체물질을 받은 후, 환자가 하기 중 하나 이상의 것에서 관찰가능하고/거나, 측정가능한 감소 또는 이의 부재를 나타낸다면, 대상체의 골 결손은 성공적으로 "치료된" 것이고: 골 결손의 감소 및/또는 골 결손과 연관된 증상들 중 하나 이상의 것이 어느 정도 경감; 이환율 및 치사율 감소, 및 삶의 질 문제의 개선. 질환의 성공적인 치료 및 개선을 평가하기 위한 상기 파라미터는 의사에게 공지된 통상적인 절차에 의해 용이하게 측정될 수 있다.
개시된 생체물질의 치료적 용도와 관련하여, '동종이계' 요법에서 공여자 및 수용자는 동일한 종의 상이한 개체인 반면, '자가' 요법에서 공여자 및 수용자는 동일한 개체이고, '이종' 요법에서 공여자 및 수용자는 수용자와 다른 종의 동물로부터 유래된 것이다.
- 용어 "유효량"은 임상 결과를 포함하여 유익하거나, 바람직한 결과를 초래하기에 충분한 양을 지칭한다. 유효량은 1회 이상의 투여량으로 투여될 수 있다.
- 용어 "대상체"는 포유동물, 바람직하게는, 인간을 지칭한다. 대상체의 예로는 인간, 비-인간 영장류, 개, 고양이, 마우스, 래트, 말, 소 및 이의 트랜스제닉 종을 포함한다. 한 실시양태에서, 대상체는 의료 관리를 받기 위해 대기 중이거나, 받는 중이거나, 의료 절차의 대상이었거나, 대상이거나, 대상이 될 예정이거나, 질환의 발생에 대해 모니터링되고 있는 "환자," 즉, 온혈 동물, 더욱 바람직하게는, 인간일 수 있다. 한 실시양태에서, 대상체는 성인 (예를 들어, 18세 초과의 인간 대상체)이다. 다른 실시양태에서, 대상체는 소아 (예를 들어, 18세 미만의 인간 대상체)이다. 한 실시양태에서, 대상체는 남성이다. 또 다른 실시양태에서, 대상체는 여성이다.
- 용어 "생체적합성"은 세포, 세포 배양물, 조직 또는 유기체와 같은 생물학적 시스템과 적합성을 갖는 비-독성 물질을 지칭한다.
상세한 설명
본 발명은 지방 조직 유래 줄기 세포 (ASC), 세포외 기질, 및 젤라틴을 포함하는 다차원 구조를 갖는 생체물질에 관한 것이다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "다차원 구조를 갖는 생체물질"은 본 발명 전역에 걸쳐 용어 "다차원 생체물질"로 대체될 수 있다.
한 실시양태에서, 세포는 지방 조직으로부터 단리되고, 이하 본원에서 지방 유래 줄기 세포 (ASC)로 지칭된다.
한 실시양태에서, ASC 조직은 동물 기원의 것, 바람직하게는, 포유동물 기원의 것, 더욱 바람직하게는, 인간 기원의 것이다. 따라서, 한 실시양태에서, ASC는 동물 ASC, 바람직하게는, 포유동물 ASC, 더욱 바람직하게는, 인간 ASC이다. 바람직한 실시양태에서, ASC는 인간 ASC이다.
지방 조직으로부터 줄기 세포를 단리하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌 [Zuk et al. (Tissue Engineering. 2001, 7:211-228)]에 개시되어 있다. 한 실시양태에서, ASC는 지방흡입에 의해 지방 조직으로부터 단리된다.
예로서, 지방 조직을 바늘 생검 또는 지방흡입 흡인에 의해 수집할 수 있다. 먼저, 임의적으로, 항생제, 예를 들어, 1% 페니실린/스트렙토마이신 (P/S)을 함유하는 포스페이트 완충처리된 염수 (PBS)로 조직 샘플을 철저히 세척함으로써 ASC를 지방 조직으로부터 단리시킬 수 있다. 이어서, 조직 분해를 위해 콜라게나제 (예를 들어, 2% P/S를 함유하는 PBS 중에 제조된 콜라게나제 타입 I)와 함께 샘플을 멸균 조직 배양 플레이트에 배치하고, 37℃, 5% CO2에서 30 min 동안 인큐베이션시킬 수 있다. 배양 배지 (예를 들어, 10% 혈청을 함유하는 DMEM)를 첨가함으로써 콜라게나제 활성을 중화시킬 수 있다. 분해시, 샘플을 튜브로 옮길 수 있다. 샘플을 (예를 들어, 2000 rpm에서 5 min 동안) 원심분리함으로써 ASC를 함유하는 기질 혈관 분획 (SVF)을 수득한다. 1차 지방세포로부터 기질 세포의 분리를 완료하기 위해, 샘플을 왕성하게 진탕시켜 펠릿을 완전히 파괴시키고, 세포를 혼합할 수 있다. 원심분리 단계를 반복할 수 있다. 스피닝 및 콜라게나제 용액 흡인 후, 펠릿을 용해 완충액에 재현탁시키고, 얼음상에서 (예를 들어, 10 min 동안) 인큐베이션시키고, (예를 들어, PBS/2% P/S로) 세척하고, (예를 들어, 2,000 rpm에서 5 min 동안) 원심분리할 수 있다. 이어서, 상청액을 흡인하고, 세포 펠릿을 배지 (예를 들어, 기질 배지, 즉, 20% FBS, 1% L-글루타민, 및 1% P/S로 보충된 α-MEM)에 재현탁시키고, 세포 현탁액을 (예를 들어, 70 ㎛ 세포 여과기를 통해) 여과할 수 있다. 세포를 함유하는 샘플을 마지막으로 배양 플레이트에 플레이팅하고, 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션시킬 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 ASC는 지방 조직의 기질 혈관 분획으로부터 단리된다. 한 실시양태에서, 지방흡인물은 실온에서 수 시간 동안 또는 사용 전에 +4℃에서 24시간 동안 또는 장기간 보존을 위해 0℃ 미만, 예를 들어, -18℃에서 보관될 수 있다.
한 실시양태에서, ASC는 신선한 ASC 또는 냉장된 ASC일 수 있다. 신선한 ASC는 냉장 처리를 거치지 않은 단리된 ASC이다. 냉장된 ASC는 냉장 처리를 거친 단리된 ASC이다. 한 실시양태에서, 냉장 처리는 0℃ 미만의 임의의 처리를 의미한다. 한 실시양태에서, 냉장 처리는 약 -18℃, -80℃ 또는 -180℃에서 수행될 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 냉장 처리는 저온보존일 수 있다.
냉장 처리의 예로서, ASC는 전면생장률이 약 80-90%일 때 수확될 수 있다. 디쉬로부터의 세척 및 분리 단계 후, 세포를 냉장 보존 배지로 실온에서 펠릿화하고, 바이알에 배치할 수 있다. 한 실시양태에서, 냉장 보존 배지는 80% 우태아 혈청 또는 인간 혈청, 10% 디메틸술폭시드 (DMSO) 및 10% DMEM/Ham F-12를 포함한다. 이어서, 바이알을 -80℃에서 밤새도록 보관할 수 있다. 예를 들어, 바이알을 알콜 동결 용기에 배치하여, -80℃에 도달할 때까지 1분마다 대략 1℃씩 바이알을 천천히 냉각시킬 수 있다. 마지막으로, 동결 바이알을 장기간 저장을 위해 액체 질소 용기로 옮길 수 있다.
한 실시양태에서, ASC는 분화된 ASC이다. 한 실시양태에서, ASC는 골아세포, 연골세포, 각질형성세포, 내피 세포, 근섬유아세포 및 지방세포를 포함하거나, 또는 이로 구성된 군으로부터 선택되는 세포로 분화된다. 또 다른 실시양태에서, ASC는 골아세포, 연골세포, 각질형성세포, 내피 세포, 및 근섬유아세포를 포함하거나, 또는 이로 구성된 군으로부터 선택되는 세포로 분화된다. 또 다른 실시양태에서, ASC는 골아세포, 연골세포, 각질형성세포, 및 근섬유아세포를 포함하거나, 또는 이로 구성된 군으로부터 선택되는 세포로 분화된다. 또 다른 실시양태에서, ASC는 골아세포, 연골세포, 각질형성세포, 및 내피 세포를 포함하거나, 또는 이로 구성된 군으로부터 선택되는 세포로 분화된다. 또 다른 실시양태에서, ASC는 골아세포, 연골세포 및 각질형성세포를 포함하거나, 또는 이로 구성된 군으로부터 선택되는 세포로 분화된다. 또 다른 실시양태에서, ASC는 골아세포 및 연골세포를 포함하거나, 또는 이로 구성된 군으로부터 선택되는 세포로 분화된다.
한 실시양태에서, ASC는 골형성 분화된 ACS이다. 다시 말해, 바람직한 실시양태에서, ASC는 골형성 세포로 분화된다. 추가로 다시 말해, 바람직한 실시양태에서, ASC는 골형성 배지 중에서 분화된다. 특정 실시양태에서, ASC는 골아세포로 분화된다.
골형성 분화를 제어하고, 평가하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 본 발명의 세포 또는 조직의 골-분화는 (예컨대, 폰 코사(von Kossa)에 의한) 오스테오칼신 및/또는 포스페이트의 염색에 의해; (예컨대, 알리자린 레드(Alizarin red)에 의한) 인산칼슘 염색에 의해; 자기 공명 영상 (MRI)에 의해; 무기질화된 기질 형성 측정에 의해; 또는 알칼리성 포스파타제 활성 측정에 의해 평가될 수 있다.
한 실시양태에서, ASC의 골형성 분화는 골형성 분화 배지 (MD) 중 ASC의 배양에 의해 수행된다.
한 실시양태에서, 골형성 분화 배지는 인간 혈청을 포함한다. 특정 실시양태에서, 골형성 분화 배지는 인간 혈소판 용해물 (hPL)을 포함한다. 한 실시양태에서, 골형성 분화 배지는 임의의 다른 동물 혈청을 포함하지 않으며, 바람직하게는, 이는 인간 혈청 이외에 다른 혈청은 포함하지 않는다.
한 실시양태에서, 골형성 분화 배지는 덱사메타손, 아스코르브산 및 인산나트륨으로 보충된 증식 배지를 포함하거나, 또는 이로 구성된다. 한 실시양태에서, 골형성 분화 배지는 항생제, 예컨대, 페니실린, 스트렙토마이신, 젠타마이신 및/또는 암포테리신 B를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 모든 배지는 동물 단백질을 함유하지 않는다.
한 실시양태에서, 증식 배지는 당업계의 숙련가에게 공지된 세포의 성장을 지원하도록 디자인된 임의의 배양 배지일 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 증식 배지는 또한 "성장 배지"로도 명명된다. 성장 배지의 예는 제한 없이, MEM, DMEM, IMDM, RPMI 1640, FGM 또는 FGM-2, 199/109 배지, HamF10/HamF12 또는 McCoy 5A를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 증식 배지는 DMEM이다.
한 실시양태에서, 골형성 분화 배지는 L-알라닐-L-글루타민 (Ala-Gln, 또한 '글루타맥스(Glutamax)®' 또는 '울트라글루타민(Ultraglutamine)®'로도 명명), hPL, 덱사메타손, 아스코르브산 및 인산나트륨으로 보충된 DMEM을 포함하거나, 또는 이로 구성된다. 한 실시양태에서, 골형성 분화 배지는 L-알라닐-L-글루타민, hPL, 덱사메타손, 아스코르브산 및 인산나트륨, 페니실린, 스트렙토마이신 및 암포테리신 B로 보충된 DMEM을 포함하거나, 또는 이로 구성된다.
한 실시양태에서, 골형성 분화 배지는 L-알라닐-L-글루타민, hPL (약 5%, v/v), 덱사메타손 (약 1 μM), 아스코르브산 (약 0.25 mM) 및 인산나트륨 (약 2.93 mM)으로 보충된 DMEM을 포함하거나, 또는 이로 구성된다. 한 실시양태에서, 골형성 분화 배지는 L-알라닐-L-글루타민, hPL (약 5%, v/v), 덱사메타손 (약 1 μM), 아스코르브산 (약 0.25 mM) 및 인산나트륨 (약 2.93 mM), 페니실린 (약 100 U/mL) 및 스트렙토마이신 (약 100 ㎍/mL)으로 보충된 DMEM을 포함하거나, 또는 이로 구성된다. 한 실시양태에서, 골형성 분화 배지는 암포테리신 B (약 0.1%)를 추가로 포함한다.
또 다른 실시양태에서, ASC는 연골형성 분화된 ASC이다. 다시 말해, 바람직한 실시양태에서, ASC는 연골형성 세포로 분화된다. 추가로 다시 말해, 바람직한 실시양태에서, ASC는 연골형성 배지 중에서 분화된다. 특정 실시양태에서, ASC는 연골세포로 분화된다.
연골형성 분화를 제어하고, 평가하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 본 발명의 세포 또는 조직의 연골형성 분화는 알시안 블루(Alcian Blue)의 염색에 의해 평가될 수 있다.
한 실시양태에서, 연골형성 분화는 연골형성 분화 배지 중 ASC의 배양에 의해 수행된다.
한 실시양태에서, 연골형성 분화 배지는 DMEM, hPL, 피루브산 나트륨, ITS, 프롤린, TGF-β1 및 덱사메타손을 포함하거나, 또는 이로 구성된다. 한 실시양태에서, 연골형성 분화 배지는 항생제, 예컨대, 페니실린, 스트렙토마이신, 젠타마이신 및/또는 암포테리신 B를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 연골형성 분화 배지는 DMEM, hPL (약 5%, v/v), 덱사메타손 (약 1 μM), 피루브산 나트륨 (약 100 ㎍/mL), ITS (약 1X), 프롤린 (약 40 ㎍/mL) 및 TGF-β1 (약 10 ng/mL)을 포함하거나, 또는 이로 구성된다.
또 다른 실시양태에서, ASC는 각질형성(keratinogenic) 분화된 ASC이다. 다시 말해, 바람직한 실시양태에서, ASC는 각질형성 세포(keratinogenic cell)로 분화된다. 추가로 다시 말해, 바람직한 실시양태에서, ASC는 각질형성 배지 중에서 분화된다. 특정 실시양태에서, ASC는 각질형성세포(keratinocyte)로 분화된다.
각질형성 분화를 제어하고, 평가하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 본 발명의 세포 또는 조직의 각질형성 분화는 판케라틴(Pankeratin) 또는 CD34의 염색에 의해 평가될 수 있다.
한 실시양태에서, 각질형성세포로의 분화는 각질형성 분화 배지 중 ASC의 배양에 의해 수행된다.
한 실시양태에서, 각질형성 분화 배지는 DMEM, hPL, 인슐린, KGF, hEGF, 히드로코르티손 및 CaCl2를 포함하거나, 또는 이로 구성된다. 한 실시양태에서, 각질형성 분화 배지는 항생제, 예컨대, 페니실린, 스트렙토마이신, 젠타마이신 및/또는 암포테리신 B를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 각질형성 분화 배지는 DMEM, hPL (약 5%, v/v), 인슐린 (약 5 ㎍/mL), KGF (약 10 ng/mL), hEGF (약 10 ng/mL), 히드로코르티손 (약 0.5 ㎍/mL) 및 CaCl2 (약 1.5 mM)를 포함하거나, 또는 이로 구성된다.
또 다른 실시양태에서, ASC는 내피형성 분화된 ASC이다. 추가로 다시 말해, 바람직한 실시양태에서, ASC는 내피형성 배지 중에서 분화된다. 특정 실시양태에서, ASC는 내피 세포로 분화된다.
내피형성 분화를 제어하고, 평가하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 본 발명의 세포 또는 조직의 내피형성 분화는 CD34의 염색에 의해 평가될 수 있다.
한 실시양태에서, 내피 세포로의 분화는 내피형성 분화 배지 중 ASC의 배양에 의해 수행된다.
한 실시양태에서, 내피형성 분화 배지는 EBMTM-2 배지, hPL, hEGF, VEGF, R3-IGF-1, 아스코르브산, 히드로코르티손 및 hFGFb를 포함하거나, 또는 이로 구성된다. 한 실시양태에서, 내피형성 분화 배지는 항생제, 예컨대, 페니실린, 스트렙토마이신, 젠타마이신 및/또는 암포테리신 B를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 내피형성 분화 배지는 EBMTM-2 배지, hPL (약 5%, v/v), hEGF (약 0.5 mL), VEGF (약 0.5 mL), R3-IGF-1 (약 0.5 mL), 아스코르브산 (약 0.5 mL), 히드로코르티손 (약 0.2 mL) 및 hFGFb (약 2 mL), 키트 클론틱스(Clonetics)™ EGM™-2MV 불렛키트(BulletKit)™ CC-3202 (론자(Lonza))의 시약을 포함하거나, 또는 이로 구성된다.
또 다른 실시양태에서, ASC는 근섬유형성 분화된 ASC이다. 다시 말해, 바람직한 실시양태에서, ASC는 근섬유형성 세포로 분화된다. 추가로 다시 말해, 바람직한 실시양태에서, ASC는 근섬유형성 배지 중에서 분화된다. 특정 실시양태에서, ASC는 근섬유아세포로 분화된다.
근섬유형성 분화를 제어하고, 평가하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 본 발명의 세포 또는 조직의 근섬유형성 분화는 α-SMA의 염색에 의해 평가될 수 있다.
한 실시양태에서, 근섬유형성 세포로의 분화는 근섬유형성 분화 배지 중 ASC의 배양에 의해 수행된다.
한 실시양태에서, 근섬유형성 분화 배지는 DMEM:F12, 피루브산 나트륨, ITS, RPMI 1640 비타민, TGF-β1, 글루타티온, MEM을 포함하거나, 또는 이로 구성된다. 한 실시양태에서, 근섬유형성 분화 배지는 항생제, 예컨대, 페니실린, 스트렙토마이신, 젠타마이신 및/또는 암포테리신 B를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 근섬유형성 분화 배지는 DMEM:F12, 피루브산 나트륨 (약 100 ㎍/mL), ITS (약 1X), RPMI 1640 비타민 (약 1X), TGF-β1 (약 1 ng/mL), 글루타티온 (약 1 ㎍/mL), MEM (약 0.1 mM)을 포함하거나, 또는 이로 구성된다.
또 다른 실시양태에서, ASC는 지방형성 분화된 ASC이다. 다시 말해, 바람직한 실시양태에서, ASC는 지방형성 세포로 분화된다. 추가로 다시 말해, 바람직한 실시양태에서, ASC는 지방형성 배지 중에서 분화된다. 특정 실시양태에서, ASC는 지방세포로 분화된다.
지방형성 분화를 제어하고, 평가하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 본 발명의 세포 또는 조직의 지방형성 분화는 오일-레드(Oil-Red)의 염색에 의해 평가될 수 있다.
한 실시양태에서, 지방세포로의 분화는 지방형성 분화 배지 중 ASC의 배양에 의해 수행된다.
한 실시양태에서, 지방형성 분화 배지는 DMEM, hPL, 덱사메타손, 인슐린, 인도메타신 및 IBMX를 포함하거나, 또는 이로 구성된다. 한 실시양태에서, 지방형성 분화 배지는 항생제, 예컨대, 페니실린, 스트렙토마이신, 젠타마이신 및/또는 암포테리신 B를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 지방형성 분화 배지는 DMEM, hPL (약 5%), 덱사메타손 (약 1 μM), 인슐린 (약 5 ㎍/mL), 인도메타신 (약 50 μM) 및 IBMX (약 0.5 mM)를 포함하거나, 또는 이로 구성된다.
한 실시양태에서, ASC는 후기 계대의 지방 유래 줄기 세포이다. 본원에서 사용되는 바, "후기 계대의"라는 용어는 적어도 계대 4 이후 분화된 지방 유래 줄기 세포를 의미한다. 본원에서 사용되는 바, 계대 4는 세포를 배양 베쓸(culture vessel)의 표면으로부터 탈착시킨 후, 신선한 배지에 이를 재현탁시킴으로써 세포를 분할하는 제4 수행 단계를 지칭한다. 한 실시양태에서, 후기 계대의 지방 유래 줄기 세포는 계대 4, 계대 5, 계대 6 또는 그 초과의 계대 이후에 분화되는 것이다. 바람직한 실시양태에서, ASC는 계대 4 후에 분화된 것이다.
1차 세포의 초기 계대는 계대 0 (P0)으로 지칭되었다. 본 발명에 따르면, 계대 P0은 배양 베쓸 상에 펠릿화된 기질 혈관 분획 (SVF)으로부터 세포 현탁액의 시딩을 지칭한다. 따라서, 계대 P4는 세포를 배양 베쓸의 표면으로부터 (예를 들어, 트립신으로의 분해에 의해) 4회 (P1, P2, P3 및 P4에서) 탈착시키고, 새로운 배지에 재현탁시켰다는 것을 의미한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 ASC는 증식 배지에서 최대 제4 계대까지 배양된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 ASC는 분화 배지에서 제4 계대 후에 배양된다. 따라서, 한 실시양태에서, 계대 P1, P2 및 P3에서, ASC를 배양 베쓸의 표면으로부터 탈착시킨 후, 증식 배지에서 적절한 세포 밀도로 희석시킨다. 추가로 본 실시양태에 따르면, 계대 P4에서, ASC를 배양 베쓸의 표면으로부터 탈착시킨 후, 분화 배지에서 적절한 세포 밀도로 희석시킨다. 따라서, 본 실시양태에 따르면, P4에서, 본 발명의 ASC를 분화되기 전에 (즉, 분화 배지에서 배양되기 전에) 전면생장에 도달할 때까지 증식 배지에 재현탁 및 배양하지 않고, 분화 배지에 직접 재현탁 및 배양한다.
한 실시양태에서, 세포는 적어도 전면생장, 바람직하게는, 70% 내지 100% 전면생장, 더욱 바람직하게는, 80% 내지 95% 전면생장에 도달할 때까지 분화 배지 중에 유지된다. 한 실시양태에서, 세포는 분화 배지에서 적어도 5일, 바람직하게는, 적어도 10일, 더욱 바람직하게는, 적어도 15일 동안 유지된다. 한 실시양태에서, 세포는 분화 배지에서 5 내지 30일, 바람직하게는, 10 내지 25일, 더욱 바람직하게는, 15 내지 20일 동안 유지된다. 한 실시양태에서, 분화 배지는 2일마다 교체된다. 그러나, 당업계에 공지된 바와 같이, 한 공여자와 또 다른 공여자 간의 세포 성장 속도는 약간 상이할 수 있다. 따라서, 분화 지속기간 및 배지 교체 횟수는 공여자마다 상이할 수 있다.
한 실시양태에서, 적어도 분화 배지에 의존하여 독특한 조직 형성이 사용될 때까지 세포를 분화 배지에서 유지시킨다.
예를 들어, 적어도 골 조직의 성숙 전에 형성되는 골상, 즉, 골 기질의 비-무기질화된 유기 부분이 형성될 때까지 세포를 골형성 분화 배지에서 유지시킨다.
배양 파라미터, 예컨대, 예를 들자면, 온도, pH, O2 함량, CO2 함량 및 염분이 최신 기술 수준에서 이용가능한 표준 프로토콜에 따라서 조정될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 젤라틴은 돼지 젤라틴이다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "돼지(porcine) 젤라틴"은 "돼지(pork) 젤라틴" 또는 "돼지(pig) 젤라틴"으로 교체될 수 있다. 한 실시양태에서, 젤라틴은 돈피 젤라틴이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 젤라틴은 입자, 비드, 구체, 미소구체 형태 등이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 젤라틴의 구조는 소정의 3D 형상 또는 스캐폴드, 예컨대, 예를 들어, 입방체를 형성하지 않는다. 한 실시양태에서, 본 발명의 젤라틴은 소정의 형상 또는 스캐폴드를 갖지 않는다. 한 실시양태에서, 본 발명의 젤라틴은 입방체의 형태를 갖지 않는다. 한 실시양태에서, 젤라틴, 바람직하게는, 돼지 젤라틴은 3D 스캐폴드가 아니다. 한 실시양태에서, 본 발명의 생체물질은 스캐폴드-무함유이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 젤라틴은 거대다공성 미세담체이다.
돼지 젤라틴 입자의 예로는 컬티스퍼(Cultispher)® G, 컬티스퍼® S, 스폰고스탄(Spongostan) 및 큐탄플라스트(Cutanplast)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 한 실시양태에서, 본 발명의 젤라틴은 컬티스퍼® G 또는 컬티스퍼® S이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 젤라틴, 바람직하게는, 돼지 젤라틴의 평균 직경은 적어도 약 50 ㎛, 바람직하게는, 적어도 약 75 ㎛, 더욱 바람직하게는, 적어도 약 100 ㎛, 더욱 바람직하게는, 적어도 약 130 ㎛이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 젤라틴, 바람직하게는, 돼지 젤라틴의 평균 직경은 최대 약 1,000 ㎛, 바람직하게는, 최대 약 750 ㎛, 더욱 바람직하게는, 최대 약 500 ㎛이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 젤라틴, 바람직하게는, 돼지 젤라틴의 평균 직경은 최대 약 450 ㎛, 바람직하게는, 최대 약 400 ㎛, 더욱 바람직하게는, 적어도 최대 약 380 ㎛이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 젤라틴, 바람직하게는, 돼지 젤라틴의 평균 직경은 약 50 ㎛ 내지 약 1,000 ㎛, 바람직하게는, 약 75 ㎛ 내지 약 750 ㎛, 더욱 바람직하게는, 약 100 ㎛ 내지 약 500 ㎛ 범위이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 젤라틴, 바람직하게는, 돼지 젤라틴의 평균 직경은 약 50 ㎛ 내지 약 500 ㎛, 바람직하게는, 약 75 ㎛ 내지 약 450 ㎛, 더욱 바람직하게는, 약 100 ㎛ 내지 약 400 ㎛ 범위이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 젤라틴, 바람직하게는, 돼지 젤라틴의 평균 직경은 약 130 ㎛ 내지 약 380 ㎛ 범위이다.
본 발명에 따른 젤라틴 입자의 평균 직경을 평가하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 상기 방법의 예로는 특히 적합한 시브를 이용하는 미립자측정법; 침전부피법; 원심분리 기술; 레이저 회절; 및 특히 텔리센트릭 렌즈가 장착된 고성능 카메라에 의한 영상 분석 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 한 실시양태에서, 젤라틴은 150 ㎠ 베쓸(vessel)당, 약 0.1 ㎤ 내지 약 5 ㎤, 바람직하게는, 약 0.5 ㎤ 내지 약 4 ㎤, 더욱 바람직하게는, 약 0.75 ㎤ 내지 약 3 ㎤ 범위의 농도로 첨가된다. 한 실시양태에서, 젤라틴은 150 ㎠ 베쓸당, 약 1 ㎤ 내지 약 2 ㎤ 범위의 농도로 첨가된다. 한 실시양태에서, 젤라틴은 50 ㎠ 베쓸당, 약 1 ㎤, 1.5 ㎤ 또는 2 ㎤의 농도로 첨가된다.
한 실시양태에서, 젤라틴은 150 ㎠ 베쓸당, 약 0.1 g 내지 약 5 g, 바람직하게는, 약 0.5 g 내지 약 4 g, 더욱 바람직하게는, 약 0.75 g 내지 약 3 g 범위의 농도로 첨가된다. 한 실시양태에서, 젤라틴은 150 ㎠ 베쓸당, 약 1 g 내지 약 2 g 범위의 농도로 첨가된다. 한 실시양태에서, 젤라틴은 150 ㎠ 베쓸당, 약 1 g, 1.5 g 또는 2 g의 농도로 첨가된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 젤라틴은 세포가 분화 후, 배양 배지에 첨가된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 젤라틴은 세포가 준-전면생장일 때, 배양 배지에 첨가된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 젤라틴은 세포가 과다전면생장일 때, 배양 배지에 첨가된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 젤라틴은 세포가 분화 후, 전면생장에 도달했을 때, 배양 배지에 첨가된다. 다시 말해, 한 실시양태에서, 본 발명의 젤라틴은 세포가 분화 배지 중 전면생장에 도달했을 때, 배양 배지에 첨가된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 젤라틴은 P4 후, 적어도 5일, 바람직하게는, 10일, 더욱 바람직하게는, 15일째에 배양 배지에 첨가된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 젤라틴은 P4 후, 5 내지 30일, 바람직하게는, 10 내지 25일, 더욱 바람직하게는, 15 내지 20일째에 배양 배지에 첨가된다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 생체물질은 2차원이다. 본 실시양태에서, 본 발명의 생체물질은 1 mm 미만의 얇은 필름을 형성할 수 있다.
본 발명의 범주 내에서, "1 mm 미만"이라는 표현은 0.99 mm, 0.95 mm, 0.9 mm, 0.8 mm, 0.75 mm, 0.7 mm, 0.6 mm, 0.5 mm, 0.4 mm, 0.3 mm, 0.2 mm, 0.1 mm 및 그 미만을 포함한다. 일부 실시양태에서, "미만"이라는 표현은 "더 낮은"이라는 표현으로 치환될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 생체물질은 3차원이다. 본 실시양태에서, 본 발명의 생체물질은 두께가 적어도 1 mm인 두꺼운 필름을 형성할 수 있다. 생체물질의 크기는 용도에 따라 조정될 수 있다.
본 발명의 범주 내에서, "적어도 1 mm"이라는 표현은 1 mm, 1.2 mm, 1.3 mm, 1.5 mm, 1.6 mm, 1.75 mm, 1.8 mm, 1.9 mm, 2 mm, 2.25 mm, 2.5 mm, 2.75 mm, 3 mm, 3.5 mm, 4 mm, 4.5 mm, 5 mm 및 그 초과를 포함한다. 일부 실시양태에서, "적어도 1 mm"이라는 표현은 "1 mm 이상"이라는 표현으로 치환될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 생체물질은 스캐폴드를 포함하지 않는다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "스캐폴드"는 인간 및 동물 조직, 예컨대, 천연 포유동물 골을 비롯한, 천연 포유동물 조직의 다공성, 기공 크기 및/또는 기능을 모방하는 구조, 또는 천연 세포외 기질 구조를 모방하는 스캐폴드를 의미한다. 상기 스캐폴드의 예로는 인공 골, 콜라겐 스폰지, 히드로겔, 예컨대, 단백질 히드로겔, 펩티드 히드로겔, 중합체 히드로겔 및 목질 나노셀룰로스 히드로겔 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 한 실시양태에서, 본 발명의 생체물질은 인공 골을 포함하지 않는다. 한 실시양태에서, 본 발명의 생체적합성 물질은 인공 골이 아니다. 한 실시양태에서, 본 발명의 생체물질은 인공 진피 및/또는 표피를 포함하지 않는다. 한 실시양태에서, 본 발명의 생체적합성 물질은 인공 진피 및/또는 표피가 아니다.
한 실시양태에서, 본 발명의 생체물질의 다차원은 천연 세포외 기질 구조를 모방하는 스캐폴드에 기인하는 것이 아니다. 한 실시양태에서, 본 발명의 생체물질은 천연 세포외 기질 구조를 모방하는 스캐폴드를 포함하지 않는다.
한 실시양태에서, 본 발명의 생체물질의 다차원은 본 발명의 지방 조직 유래 줄기 세포에 의한 세포외 기질의 합성에 기인하는 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 생체물질은 세포외 기질을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 생체물질의 세포외 기질은 ASC로부터 유래된 것이다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "세포외 기질"은 비세포성 3차원 거대분자 망을 의미한다. ECM의 기질 성분은 세포 부착 수용체 뿐만 아니라, 서로 결합함으로써, 본 발명의 생체물질 또는 조직 내에 세포가 유지되는 복합 망을 형성한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 세포외 기질은 콜라겐, 프로테오글리칸/글리코사미노글리칸, 엘라스틴, 피브로넥틴, 라미닌, 및/또는 다른 당단백질을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 세포외 기질은 콜라겐을 포함한다. 또 다른 특정 실시양태에서, 본 발명의 세포외 기질은 프로테오글리칸을 포함한다. 또 다른 특정 실시양태에서, 본 발명의 세포외 기질은 콜라겐 및 프로테오글리칸을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 세포외 기질은 성장 인자, 프로테오글리칸, 분비 인자, 세포외 기질 조절인자, 및 당단백질을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 생체물질 내의 ASC는 본원에서 ASC 조직으로 지칭되는 조직을 형성한다.
한 실시양태에서, ASC 조직은 세포화된 상호연결 조직이다. 한 실시양태에서, 생체적합성 물질, 바람직하게는, 생체적합성 입자는 세포화된 상호연결 조직에 통합된다. 한 실시양태에서, 생체적합성 물질, 바람직하게는, 생체적합성 입자는 ASC 조직 내에 분산된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 생체물질은 젤라틴을 통해 형성된 상호연결 조직을 특징으로 한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 생체물질은 젤라틴 주변의 무기질화를 특징으로 한다.
한 실시양태에서, 골형성 분화 배지가 사용될 때, 본 발명의 생체물질은 오스테오칼신 발현 및 무기질화 특성을 갖는 실제 골과 유사한 특성을 갖는다. 본 실시양태에 따라, 본 발명의 생체물질은 골 세포를 포함한다. 추가로 본 실시양태에 따라, 본 발명의 생체물질은 골 세포 및 세포외 기질을 포함한다. 추가로 본 실시양태에 따라, 본 발명의 생체물질은 골 세포 및 콜라겐을 포함한다. 추가로 본 실시양태에 따라, 본 발명의 생체물질은 골 기질을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 생체물질은 생체물질의 세포의 분화가 최종점에 도달하고, 이식되는 경우, 생체물질의 표현형이 변하지 않은 상태로 유지되도록 하는 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 생체물질은 성장 인자를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 생체물질은 VEGF 및/또는 SDF-1α를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 생체물질은 무기질화된다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "무기질화" 또는 "골 조직 무기질 밀도"는 생체물질에 의해 형성된 골 또는 "골-유사" 조직의 제곱 센티미터당 무기질 물질의 양으로서, 또한 백분율로 표시되는 양을 지칭한다. 따라서, 본원에서 사용되는 바, 용어 "무기질화" 또는 "골 조직 무기질 밀도"는 생체물질의 제곱 센티미터당 무기질 물질의 양으로서, 또한 백분율로 표시되는 양을 지칭한다.
생체물질의 무기질화 정도를 평가하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 상기 방법의 예로는 마이크로 컴퓨터 단층촬영 (마이크로-CT) 분석, 영상화 질량 분석법, 칼세인 블루 염색, 골 무기질 밀도 분포 (BMDD) 분석 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
한 실시양태에서, 본 발명의 생체물질의 무기질화는 생체물질이 성숙화됨에 따라 증가한다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "생체물질의 성숙화"는 젤라틴과 함께 계속해서 배양을 지속하는 것을 의미한다. 다시 말해, 생체물질의 성숙화는 다차원 유도 횟수에 상응한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 생체물질의 무기질화 정도는 약 1% 미만이다. 한 실시양태에서, 약 1% 미만의 무기질화 정도는 12주 미만 동안의 골형성 분화 배지로의 성숙화로 수득된다. 약 1% 미만의 무기질화 정도는 8주 이하 동안의 골형성 분화 배지로의 성숙화로 수득된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 생체물질의 무기질화 정도는 약 1% 내지 약 20%, 바람직하게는, 약 1% 내지 약 15%, 더욱 바람직하게는, 약 1% 내지 약 10%, 더욱더 바람직하게는, 약 1% 내지 약 5% 범위이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 생체물질의 무기질화 정도는 약 1% 내지 약 4% 또는 3% 범위이다. 본 발명의 범주 내에서, "약 1% 내지 약 20%"라는 표현은 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% 및 약 20%를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 생체물질의 무기질화 정도는 적어도 1% 또는 1.24%이다. 한 실시양태에서, 적어도 1% 또는 1.24%의 무기질화 정도는 12주 이상 동안의 골형성 분화 배지로의 성숙화로 수득된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 생체물질의 무기질화 정도는 적어도 2%, 2.5% 또는 2.77%이다. 한 실시양태에서, 적어도 2%, 2.5% 또는 2.77%의 무기질화 정도는 25주 이상 동안의 골형성 분화 배지로의 성숙화로 수득된다.
한 특정 실시양태에서, 본 발명의 생체물질의 무기질화 정도는 약 0.07%이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 본 발명의 생체물질의 무기질화 정도는 약 0.28%이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 본 발명의 생체물질의 무기질화 정도는 약 0.33%이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 본 발명의 생체물질의 무기질화 정도는 약 1.24%이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 본 발명의 생체물질의 무기질화 정도는 약 2.77%이다.
본 발명은 또한 분화된 지방 유래 줄기 세포 (ASC), 세포외 기질 및 젤라틴을 포함하는 다차원 구조를 제조하는 생산하는 방법에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 생체물질을 제조하는 방법은
- 세포 증식 단계,
- 세포 분화 단계, 및
- 다차원 유도 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 생체물질을 제조하는 방법은
- ASC 증식 단계,
- ASC 분화 단계, 및
- 3차원 유도 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 생체물질을 제조하는 방법은
- 대상체로부터 세포, 바람직하게는, ASC를 단리시키는 단계;
- 세포, 바람직하게는, ASC를 증식시키는 단계,
- 증식된 세포, 바람직하게는, ASC를 분화시키는 단계, 및
- 젤라틴의 존재하에 분화된 세포, 바람직하게는, ASC를 배양하는 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 생체물질을 제조하는 방법은 세포 증식 단계 전에 수행되는 세포, 바람직하게는, ASC의 단리 단계를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 생체물질을 제조하는 방법은 세포 증식 단계 전에 수행되는 세포, 바람직하게는, ASC의 단리 단계를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 증식 단계는 증식 배지 중에서 수행된다. 특정 실시양태에서, 증식 배지는 DMEM이다. 한 실시양태에서, 증식 배지는 Ala-Gln 및/또는 인간 혈소판 용해물 (hPL)로 보충된다. 한 실시양태에서, 증식 배지는 항생제, 예컨대 페니실린 및/또는 스트렙토마이신을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 증식 배지는 Ala-Gln 및 hPL (5%)로 보충된 DMEM을 포함하거나, 또는 이로 구성된다. 한 실시양태에서, 증식 배지는 Ala-Gln, hPL (5%, v/v), 페니실린 (100 U/mL) 및 스트렙토마이신 (100 ㎍/mL)으로 보충된 DMEM을 포함하거나, 또는 이로 구성된다.
한 실시양태에서, 증식 단계는 최대 P8까지 수행된다. 한 실시양태에서, 증식 단계는 최대 P4, P5, P6, P7 또는 P8까지 지속된다. 따라서, 한 실시양태에서, 세포 증식 단계는 적어도 3 계대를 포함한다. 한 실시양태에서, 세포 증식 단계는 최대 7 계대를 포함한다. 한 실시양태에서, 세포 증식 단계는 3 내지 7 계대를 포함한다. 특정의 한 실시양태에서, 증식 단계는 최대 P4까지 수행된다. 따라서, 한 실시양태에서, 세포 증식 단계는 배양 베쓸의 표면으로부터 세포를 탈착시킨 후, 이어서, 계대 P1, P2 및 P3에 증식 배지 중에 이를 희석시키는 단계를 포함한다. 최대 P6까지의 증식의 실시양태에서, 세포 증식 단계는 배양 베쓸의 표면으로부터 세포를 탈착시킨 후, 이어서, 계대 P1, P2, P3, P4 및 P5에 증식 배지 중에 이를 희석시키는 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, 증식 단계는 세포가 3, 4, 5, 6 또는 7회 계대하는 데 필요한 기간 동안 지속된다. 특정 실시양태에서, 증식 단계는 세포가 3회 계대하는 데 필요한 기간 동안 지속된다. 한 실시양태에서, 증식 단계는 세포가 최종 계대 후, 전면생장, 바람직하게는, 70% 내지 100% 전면생장, 더욱 바람직하게는, 80% 내지 95% 전면생장에 도달할 때까지 지속된다. 한 실시양태에서, 증식 단계는 세포가 제3, 제4, 제5, 제6 또는 제7 계대 후, 전면생장에 도달할 때까지 지속된다.
유리한 실시양태에서, 젤라틴을 첨가하기 전에 분화 배지에서 세포, 바람직하게는, ASC를 배양하는 단계가 본 발명의 방법의 주요 단계이다. 상기 단계는 ASC를 골형성 세포로 분화시키기 위해 필요하다. 추가로, 이 단계는 다차원 구조를 수득하기 위해 필요하다.
한 실시양태에서, 분화 단계는 P4, P5, P6, P7 또는 P8 후에 수행된다. 한 실시양태에서, 분화 단계는 세포가 전면생장에 도달하지 않았을 때, 수행된다. 특정 실시양태에서, 분화 단계는 세포의 배양물이 전면생장에 도달하지 않았을 때, P4, P5, P6, P7 또는 P8 후에 수행된다.
한 실시양태에서, 분화 단계는 P4, P5, P6, P7 또는 P8에 수행된다. 한 실시양태에서, 분화 단계는 세포가 전면생장에 도달하지 않았을 때, 수행된다. 특정 실시양태에서, 분화 단계는 세포를 전면생장까지 배양하지 않고, P4, P5, P6, P7 또는 P8에 수행된다.
한 실시양태에서, 분화 단계는 세포를 분화 배지에서 인큐베이션함으로써 수행된다. 한 실시양태에서, 분화 단계는 세포를 골형성, 연골형성, 근섬유형성 또는 각질형성 분화 배지에서, 바람직하게는, 골형성, 연골형성 또는 근섬유형성 분화 배지에서, 더욱 바람직하게는, 골형성 또는 연골형성 분화 배지, 더욱 바람직하게는, 골형성 배지에서 인큐베이션함으로써 수행된다. 한 실시양태에서, 분화 단계는 배양 베쓸의 표면으로부터 탈착된 세포를 분화 배지에 재현탁시킴으로써 수행된다.
한 실시양태에서, 분화 배지 중 ASC의 인큐베이션은 적어도 3일, 바람직하게는, 적어도 5일, 더욱 바람직하게는, 적어도 10일, 더욱 바람직하게는, 적어도 15일 동안 수행된다. 한 실시양태에서, 분화 배지 중 ASC의 인큐베이션은 5 내지 30일, 바람직하게는, 10 내지 25일, 더욱 바람직하게는, 15 내지 20일 동안 수행된다. 한 실시양태에서, 분화 배지는 2일마다 교체된다. 본 발명의 범주 내에서, "적어도 3일"이라는 표현은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35일 및 그 초과를 포함한다.
한 실시양태에서, 다차원 유도, 바람직하게는, 3D 유도 단계는 본원 상기에 정의된 바와 같은 젤라틴을 분화 배지에 첨가함으로써 수행된다. 한 실시양태에서, 세포는 다차원 유도, 바람직하게는, 3D 유도 단계 동안 분화 배지에 유지된다.
한 실시양태에서, 다차원 유도, 바람직하게는, 3D 유도 단계는 세포가 분화 배지에서 전면생장, 바람직하게는, 70% 내지 100% 전면생장, 더욱 바람직하게는, 80% 내지 95% 전면생장에 도달하였을 때, 수행된다.
또 다른 실시양태에서, 다차원 유도, 바람직하게는, 3D 유도 단계는 형태학적 변화가 나타날 때 수행된다. 한 실시양태에서, 다차원 유도, 바람직하게는, 3D 유도 단계는 사용되는 분화 배지에 의존하여 적어도 하나의 독특한 조직이 존재할 때 수행된다. 예를 들어, 골형성 분화 배지가 사용될 때, 다차원 유도, 바람직하게는, 3D 유도 단계는 적어도 하나의 골상 결절이 형성되는 경우에 수행된다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "골상"은 골 조직의 성숙 전에 형성되는 골 기질의 비-무기질화된 유기 분획을 의미한다.
또 다른 실시양태에서, 다른 실시양태에서, 다차원 유도, 바람직하게는, 3D 유도 단계는 세포가 전면생장에 도달하는 경우에 수행된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 세포 및 젤라틴은 적어도 5일, 바람직하게는, 적어도 10일, 더욱 바람직하게는, 적어도 15일 동안 인큐베이션된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 세포 및 젤라틴은 10일 내지 30일 동안 인큐베이션된다. 본 발명의 범주 내에서, "적어도 5일"이라는 표현은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35일 및 그 초과를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 세포 및 젤라틴은 적어도 1주, 2주, 3주, 4주, 8주, 12주, 25주 또는 34주 동안 인큐베이션된다.
한 실시양태에서, 배지는 다차원 유도, 바람직하게는, 3D 유도 단계 동안 2일마다 교체된다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능한 다차원 생체물질에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 다차원 생체물질은 본 발명에 따른 방법에 의해 수득된다. 한 실시양태에서, 다차원 생체물질은 본 발명에 따른 방법에 의해 제조된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 방법에 의해 수득가능하거나, 수득된 생체물질은 인간 또는 동물 신체에 이식하기 위한 것으로 의도된다. 한 실시양태에서, 이식되는 생체물질은 자가 기원, 또는 동종이계일 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 생체물질은 골, 연골, 진피, 근육, 내피 또는 지방 조직 부위에 이식될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 생체물질은 인간 또는 동물 신체의 비정상적인 부위에 이식될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 생체물질은 균일하며, 이는 생체물질의 구조 및/또는 구성이 전체 조직에 걸쳐 유사하다는 것을 의미한다. 한 실시양태에서, 생체물질은 자연 질환 영역에서 이식에 필요한 바람직한 취급 및 기계적 특성을 갖는다. 한 실시양태에서, 본 발명의 방법에 의해 수득가능하거나, 수득되는 생체물질은 파단되지 않고 수술 기구로 유지될 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 생체물질을 포함하는 의료 장치이다.
본 발명의 추가의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 생체물질 및 적어도 하나의 제약상 허용 가능한 담체를 포함하는 제약 조성물이다.
본 발명은 또한 의약으로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 생체물질 또는 제약 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 의료 장치로서 또는 의료 장치에 포함되는 또는 제약 조성물에서 본 발명의 생체물질의 임의의 용도에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 생체물질, 의료 장치 또는 제약 조성물은 사용 전에 조작 및 성형될 수 있는 퍼티-유사(putty-like) 물질이다.
본 발명은 추가로 조직 결손의 치료를 필요로 하는 대상체에서 조직 결손의 치료용으로 사용하기 위한, 또는 상기 치료에서 사용하기 위한, 분화된 지방 유래 줄기 세포 (ASC), 세포외 기질 및 젤라틴을 포함하는 다차원 구조를 갖는 생체물질, 상기를 포함하는 의료 장치 또는 제약 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 또한 조직 결손을 치료하기 위한, 분화된 지방 유래 줄기 세포 (ASC), 세포외 기질 및 젤라틴을 포함하는 다차원 구조를 갖는 생체물질, 상기를 포함하는 의료 장치 또는 제약 조성물의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 추가의 다른 측면은 조직 결손 치료용 의약의 제조 또는 생산을 위한, 분화된 지방 유래 줄기 세포 (ASC), 세포외 기질 및 젤라틴을 포함하는 다차원 구조를 갖는 생체물질, 상기를 포함하는 의료 장치 또는 제약 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 조직 결손의 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 본 발명에 따른 생체물질, 의료 장치 또는 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 조직 결손의 치료를 필요로 하는 대상체에서 조직 결손을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 한 측면은 조직 재건을 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 본 발명에 따른 생체물질, 의료 장치 또는 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 조직 재건을 필요로 하는 대상체에서의 조직 재건 방법이다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "조직 재건"은 "조직 수복" 또는 "조직 재생"에 의해 대체될 수 있다.
한 실시양태에서, 용어 "조직"은 골, 연골, 진피, 표피, 근육, 내피, 및 지방 조직을 포함하거나, 또는 이로 구성된다. 따라서, 한 실시양태에서, 조직 결손은 골, 연골, 진피, 표피, 근육, 내피 및 지방 조직 결손을 포함하거나, 또는 이로 구성된다.
한 실시양태에서, 조직 재건은 골 재건, 연골 재건, 진피 재건, 표피 재건, 근육 또는 근원성 재건, 내피 재건 및 지방형성 재건을 포함하거나, 또는 이로 구성된 군으로부터 선택된다.
골 및 진피 및/또는 표피 재건의 예로는 진피 재건, 상처 치유, 당뇨성 궤양 치료, 예컨대, 당뇨성 족부 궤양, 화상 후 병변 재건, 방사선 속발 병변(post-radiation lesion) 재건, 유방암 또는 유방 기형(breast deformity) 후 재건을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
진피 및/또는 표피 재건의 예로는 진피 재건, 상처 치유, 당뇨성 궤양 치료, 예컨대, 당뇨성 족부 궤양, 화상 후 병변 재건, 방사선 속발 병변 재건, 유방암 또는 유방 기형 후 재건을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
연골 재건의 예로는 무릎 연골성형술, 코 또는 귀 재건, 늑골 또는 흉골 재건을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
근원성 재건의 예로는 골격 근육 재건, 복벽 파괴 후 재건, 하지의 허혈성 근육 손상 후 재건, 구획 증후군(compartment syndrome: CS) 연관 재건을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
내피 재건의 예로는 예컨대, 정맥 동맥경화증 션트와 같은 혈관 문합(vascular anastomosis)용 혈관 패치의 재세포화를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
지방형성 재건의 예로는 미용 수술, 회춘법, 지방충전술 재건을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원인은 본 발명의 생체물질이 이식재 부위에서 무기질화된 조직의 존재하에 골형성 특성을 갖는다는 것을 입증하였다.
한 특정 측면에서, 본 발명은 골 결손 치료에서 사용하기 위한 본 발명의 생체물질, 의료 장치 또는 제약 조성물에 관한 것이다. 한 특정 측면에서, 본 발명은 골 재건용으로 사용하기 위한 생체물질, 의료 장치 또는 제약 조성물에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 생체물질은 골 공동을 인간 또는 동물 신체로 충전시키기 위해 사용하기 위한 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 생체물질, 의료 장치 또는 제약 조성물은 연골 결손을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 생체물질, 의료 장치 또는 제약 조성물은 연골 재건용으로 사용하기 위한 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 생체물질, 의료 장치 또는 제약 조성물은 무릎 연골성형술, 코 또는 귀 재건, 늑골 또는 흉골 재건용으로 사용하기 위한 것이다.
본 출원인은 본 발명의 생체물질이 더욱 빠른 표피 및 진피 재건, 면역 반응 유도 및 엘라스틴 섬유 개수 증가라는 장점을 갖는다는 것을 입증하였다. 또한, 본 발명의 생체물질의 이식 후에 형성된 상처는 비대성이 아니다.
한 실시양태에서, 본 발명의 생체물질, 의료 장치 또는 제약 조성물은 진피 및/또는 표피 결손을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 생체물질, 의료 장치 또는 제약 조성물은 진피 재건용으로 사용하기 위한 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 생체물질, 의료 장치 또는 제약 조성물은 진피 재건, 상처 치유, 당뇨성 궤양 치료, 예컨대, 당뇨성 족부 궤양, 화상 후 병변 재건, 방사선 속발 병변 재건, 유방암 또는 유방 기형 후 재건용으로 사용하기 위한 것이다. 한 특정 측면에서, 본 발명의 생체물질, 의료 장치 또는 제약 조성물은 진피 상처, 바람직하게는, 당뇨성 진피 상처의 치료용으로 사용하기 위한, 또는 상기 치료에서 사용하기 위한 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 생체물질, 의료 장치 또는 제약 조성물은 상처 봉합을 촉진시키기 위한 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 생체물질, 의료 장치 또는 제약 조성물은 특히, 상처 치유 동안 상처 두께를 감소시키기 위한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 생체물질, 의료 장치 또는 제약 조성물은 수포성 표피박리증(epidermolysis bullosa), 거대 선천적 모반(giant congenital nevus), 및/또는 선천성 피부 무형성(aplasia cutis congenita)의 치료용으로 사용하기 위한, 또는 상기 치료에서 사용하기 위한 것이다.
추가의 또 다른 측면에서, 본 발명은 재건 또는 미용 수술용으로 사용하기 위한 본 발명의 생체물질, 의료 장치 또는 제약 조성물에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 생체물질은 동종이계 이식재 또는 자가 이식재로 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 생체물질은 조직 이식에 사용될 수 있다.
대상체는 조직 결손에 대해 이미 치료받고 있는 대상체이다. 또 다른 실시양태에서, 대상체는 조직 결손에 대해 아직 치료받지 않은 대상체이다.
한 실시양태에서, 대상체는 조직 결손에 대한 적어도 하나의 다른 치료에 비-반응성이었다.
한 실시양태에서, 대상체는 당뇨를 앓고 있는 대상체이다. 한 실시양태에서, 대상체는 당뇨성 상처를 앓고 있는 대상체이다.
한 실시양태에서, 대상체는 성인, 즉, 18세 이상이다. 또 다른 실시양태에서, 대상체는 아동, 즉, 18세 미만이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 생체물질, 의료 장치 또는 제약 조성물은 조직 재건 수술 동안 그를 필요로 하는 대상체에게 투여된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 생체물질, 의료 장치 또는 제약 조성물은 외과적 이식에 의해, 예를 들어, 클립 또는 투관침(trocar)을 통해; 또는 복강경 경로에 의해 그를 필요로 하는 대상체에게 투여된다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 생체물질, 제약 조성물 또는 의료 장치를 포함하는 키트에 관한 것이다. 적합한 고정 수단의 예로는 생체적합성이고, 비-독성이며, 임의적으로, 생체흡수성인 수술용 접착제, 조직-접착제 또는 외과용의 임의의 접착제 조성물을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
도 1A-1B는 생체물질의 육안적 소견을 보여주는 사진이다. 도 1A: 골분화 배지 중 배양 2.5주째에 돼지 젤라틴 (컬티스퍼 G) 및 ASC로 형성된 생체물질. 도 B: 골분화 배지 중 배양 7.5주째에 돼지 젤라틴 (컬티스퍼 G) 및 ASC로 형성된 생체물질.
도 2A-2B는 골분화 배지 중 배양 7.5주째에 돼지 젤라틴 (컬티스퍼 G) 및 ASC로 형성된 생체물질의 헤마톡실린-에오신 염색을 보여주는 사진이다. 도 2A: 원 배율 x5. 도 2B: 확대 x10.
도 3A-3B는 골분화 배지 중 배양 7.5주째에 돼지 젤라틴 (컬티스퍼 G) 및 ASC로 형성된 생체물질의 폰 코사 염색을 보여주는 사진이다. 도 3A: 원 배율. 도 3B: 확대 x10.
도 4A-4B는 골분화 배지 중 배양 7.5주째에 돼지 젤라틴 (컬티스퍼 G) 및 ASC로 형성된 생체물질의 오스테오칼신 발현을 보여주는 사진이다. 도 4A: 원 배율. 도 4B: 확대 x10.
도 5A-5l은 MP (MP)에서의 ASC와 비교하여 골분화 배지 중 ASC 및 컬티스퍼 G (생체물질)로 형성된 본 발명의 생체물질에서의 유전자 발현을 보여주는 그래프이다. 도 5A: ANG; 도 5B: ANGPT1; 도 5C: EPHB4; 도 5C: EDN1; 도 5E: THBS1; 도 5F: PTGS1; 도 5G: LEP; 도 5H: VEGFA; 도 5I: VEGFB; 도 5J: VEGFC; 도 5K: ID1; 및 도 5L: TIMP1. *: p<0.05.
도 6A-6D는 골분화 배지에서 상이한 성숙화 수준의 ASC 및 컬티스퍼 G로 형성된 본 발명의 생체물질을 보여주는 그래프이다. 도 6A: 4주; 도 6B: 8주; 도 6C: 12주; 및 도 6D: 25주. 무기질화는 투명하게 표시된 3D 기질에 황색으로 표시된다.
도 7은 이식 후 29일째에 누드(Nude) 래트에서 골분화 배지 중 배양 7.5주째에 돼지 젤라틴 (컬티스퍼 G 또는 S) 및 ASC로 형성된 생체물질의 "이식재 부위"의 방사선 사진이다.
도 8은 이식 후 29일째에 위스타르(Wistar) 래트에서 골분화 배지 중 배양 7.5주째에 돼지 젤라틴 (컬티스퍼 G 또는 S) 및 ASC로 형성된 생체물질의 "이식재 부위"의 방사선 사진이다.
도 9는 골분화 배지 중 배양 7.5주째에 돼지 젤라틴 (컬티스퍼 G 또는 S) 및 ASC로 형성된 생체물질의 폰 코사 염색을 보여주는 사진이다.
도 10은 골분화 배지 중 배양 7.5주째에 돼지 젤라틴 (컬티스퍼 G 또는 S) 및 ASC로 형성된 생체물질의 헤마톡실린-에오신 염색을 보여주는 사진이다.
도 11은 이식 후 29일째에 누드 래트에서 골분화 배지 중 배양 7.5주째에 돼지 젤라틴 (컬티스퍼 G 또는 S) 및 ASC로 형성된 생체물질의 폰 코사 염색을 보여주는 사진이다.
도 12A-12B는 누드 래트에서의 "이식재 부위"의 방사선 사진이다. 도 12A: 이식 후 29일째 골분화 배지 중 배양 7.5주째에 돼지 젤라틴 (컬티스퍼 G 또는 S) 및 ASC로 형성된 생체물질의 상기 방사선 사진이다. 도 12B: 이식 후 29일째 돼지 젤라틴 (컬티스퍼 G 또는 S) 단독의 것으로 형성된 생체물질의 상기 방사선 사진이다.
도 13A-13C는 0일째 (D0), 15일째 (D15), 23일째 (D23) 및 34일째 (D34) 래트 다리의 상처 치유를 보여주는 사진이다. 도 13A: 이식 부재하의 사진; 도 13B: 컬티스퍼 S 입자를 단독으로 이식한 후의 사진; 및 도 13C: 골분화 배지 (C) 중 배양 8주째에 돼지 젤라틴 (컬티스퍼 S) 및 ASC로 형성된 생체물질을 이식한 후의 사진. 좌측 다리: 허혈성 다리; 우측 다리: 비-허혈성 다리.
도 14는 100%로 고정된 모의 실험과 비교하여 평가된 것으로, 처리되지 않거나 (모의), 컬티스퍼 S 입자 단독 (컬티스퍼) 또는 골분화 배지 중 배양 8주째에 돼지 젤라틴 (컬티스퍼 S) 및 ASC로 형성된 생체물질 (생체물질)로 처리된, 비-허혈성 다리 (검은색 막대) 및 허혈성 다리 (흰색 막대)의 상처 크기에 대한 곡선하면적 (AUC)을 보여주는 히스토그램이다.
도 15A-15B는 컬티스퍼 S 입자 단독 (사각형 표시) 또는 골분화 배지 중 배양 8주째에 돼지 젤라틴 (컬티스퍼 S) 및 ASC로 형성된 생체물질 (동그라미 표시)로의 처리 후, 또는 비처리 후 (모의, 삼각형 표시)의 0 내지 34일째의 상처 면적 (백분율)을 보여주는 그래프이다. 도 15A: 비-허혈성 다리; 도 15B: 허혈성 다리.
도 16A-16B는 비처리 (모의, 좌측), 컬티스퍼 S 입자 단독 (가운데), 본 본 발명의 생체물질 (우측)로의 치료 후 완전한 상처 봉합일을 보여주는 그래프이다. 도 16A: 비-허혈성 다리; 도 16B: 허혈성 다리.
도 17A-17C는 허혈성 다리 치료 후 0 내지 34일째의 림프구 CD3 (검은색 선) 및 대식세포 CD68 (회색 선) 개수를 보여주는 그래프이다. 도 17A: 비처리 (모의 대조군). 도 17B: 컬티스퍼 S 입자 단독. 도 17C: 골분화 배지 중 배양 8주째에 돼지 젤라틴 (컬티스퍼 S) 및 ASC로 형성된 생체물질.
도 18A-18B는 비처리 후 (모의 대조군), 컬티스퍼 S 입자 단독 이식 후 (컬티스퍼) 및 골분화 배지 중 배양 8주째에 돼지 젤라틴 (컬티스퍼 S) 및 ASC로 형성된 생체물질 이식 후 15일 내지 34일째의 상처 두께를 보여주는 그래프이다. 도 18A: 허혈성 모델에서. 도 18B: 비-허혈성 모델에서.
도 19A-19D는 컬티스퍼 S 입자 단독 처리 후 (도트 표시된 히스토그램) , 또는 골분화 배지 중 배양 8주째에 돼지 젤라틴 (컬티스퍼 S) 및 ASC로 형성된 생체물질 처리 후 (검은색 히스토그램), 또는 비처리 후 (모의, 스트라이프 표시된 히스토그램) 1, 5, 15 및 34일째 비-허혈성 다리의 표피 및 진피 점수를 보여주는 히스토그램이다. 도 19A: 비-허혈성 다리의 코어의 표피 점수. 도 19B: 비-허혈성 다리 주변의 표피 점수. 도 19C: 비-허혈성 다리의 코어의 진피 점수. 도 19D: 비-허혈성 다리 주변의 진피 점수.
도 20A-20d는 상이한 배지 중에서 ASC 및 입자로 수득된 구조를 보여주는 사진이다. 도 20A: 골형성 배지; 도 20B: 연골형성 배지; 도 20C: 근섬유형성 배지; 및 도 20D: 각질형성 배지. 구조 형태 (1.), 그립가능성(grippability) (2.), 헤마톡실린-에오신 염색 (3.) 및 조직-특이적 염색 (4.), 즉, 골형성 배지의 경우, 오스테오칼신 (OC), 연골형성 배지의 경우, 알시안 블루 (AB), 근섬유형성 배지의 경우, α-SMA, 및 각질형성 배지의 경우, CD34에 대해 평가하였다.
실시예
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 설명된다.
실시예 1: 본 발명의 생체물질의 제조
1.1. hASC의 단리
정보에 입각한 동의 및 혈청학적 스크리닝 후에 복부 영역에서 콜맨(Coleman) 기술에 따라 지방 흡인함으로써, 인간 피하 지방 조직을 수확하였다.
인간 지방 유래 줄기 세포 (hASC)를 유입 지방 조직으로부터 신속하게 단리시켰다. 지방흡인물은 +4℃에서 24시간 동안 또는 -80℃에서 더 장기간 동안 보관할 수 있다.
먼저, 품질 관리를 위해 한 분획량의 지방흡인물을 단리시키고, 지방흡입물의 잔여 부피를 측정하였다. 이어서, 지방흡입물을 HBSS 중 제조된 콜라게나제 용액 (NB 1, 세르바 일렉트로포레시스 게엠베하(Serva Electrophoresis GmbH: 독일 하이델베르크)) (최종 농도 ~8 U/mL)에 의해 분해시켰다. 분해에 사용된 효소 용액의 부피는 지방 조직 부피의 2배였다. 37℃ ± 1℃에서 50-70 min 동안 분해를 수행하였다. 15-25 min 후에 1차 간헐적 진탕을 수행하였고, 35-45 min 후에 2차 간헐적 진탕을 수행하였다. MP 배지 (증식 배지 또는 성장 배지)를 첨가하여 분해를 중지시켰다. MP 배지는 5% 인간 혈소판 용해물 (hPL) (v/v)로 보충된 DMEM 배지 (4.5 g/L 글루코스 및 4 mM Ala-Gln; 사토리우스 스테딤 바이오테크(Sartorius Stedim Biotech: 독일 괴팅겐))를 포함하였다. DMEM은 카르보네이트 완충제로 완충처리된, 염, 아미노산, 비타민, 피루베이트 및 글루코스를 함유하는 표준 배양 배지이고, 생리학적 pH (7.2-7.4)를 갖는다. 사용된 DMEM은 Ala-Gln을 함유하였다. 인간 혈소판 용해물 (hPL)은 중간엽 줄기 세포 (예컨대, hASC)의 시험관내 성장을 자극하는 데 사용되는 풍부한 성장 인자 공급원이다.
분해된 지방 조직을 원심분리하고 (500 g, 10 min, 실온), 상청액을 제거하였다. 펠릿화된 기질 혈관 분획 (SVF)을 MP 배지에 재현탁시키고, 200-500 ㎛ 메쉬 필터를 통과시켰다. 여과된 세포 현탁액을 다시 원심분리하였다 (500 g, 10 min, 20℃). hASC를 함유하는 펠릿을 MP 배지에 재현탁시켰다. 세포 계수를 위해 소량의 세포 현탁액을 유지시킬 수 있고, 나머지 모든 세포 현탁액을 사용하여 하나의 75 ㎠ T-플라스크에 시딩하였다 (계대 P0으로 지칭). 시딩된 세포의 개수를 추정하기 위해 세포 계수를 수행하였다 (단지 정보용).
단리 단계 다음 날 (1일), 성장 배지를 75 ㎠ T-플라스크로부터 제거하였다. 세포를 인산염 완충액으로 3회 세정한 후, 이어서, 새로 제조된 MP 배지를 플라스크에 첨가하였다.
1.2. 인간 지방 유래 줄기 세포의 성장 및 확장
증식 단계 동안, 프로세스 중 후속 단계를 위해 충분한 양의 세포를 수득하기 위해 hASC를 4회 계대시켰다 (P1, P2, P3 및 P4).
P0와 제4 계대 (P4) 사이에, 세포를 T-플라스크에서 배양하고, 새로운 MP 배지를 공급하였다. ≥ 70% 이상 내지 ≤100%의 전면생장에 도달했을 때 (표적 전면생장률: 80-90%), 세포를 계대시켰다. 1 배치로부터의 모든 세포 배양 수용자를 동시에 계대시켰다. 각 계대에서, 재조합 동물-무함유 세포 해리 효소인 TrypLE (셀렉트(Select) 1X; 75 ㎠ 플라스크의 경우, 9 mL 또는 150㎠ 플라스크의 경우, 12 mL)를 사용하여 세포를 이의 배양 베쓸로부터 탈착시켰다. TrypLe 분해를 37℃ ± 2℃에서 5-15 min 동안 수행하고, MP 배지의 첨가에 의해 중지시켰다.
이어서, 세포를 원심분리하고 (500 g, 5 min, 실온), MP 배지에 재현탁시켰다. 균일한 세포 현탁액이 되도록 하기 위해 수확된 세포를 풀링하였다. 재현탁 후, 세포를 계수하였다.
이어서, 계대 P1, P2 및 P3에서, 남아있는 세포 현탁액을 MP 배지에서 적절한 세포 밀도로 희석하고, 더 큰 조직 배양 표면에 시딩하였다. 이 단계에서, 75 ㎠ 플라스크에 15 mL의 세포 현탁액 부피를 시딩하고, 150 ㎠ 플라스크에 30 mL의 세포 현탁액 부피를 시딩하였다. 각 계대에서, 세포를 0.5x104 내지 0.8x104 세포/㎠로 시딩하였다. 상이한 계대 사이에, 배양 배지를 3-4일마다 교체하였다. 한 공여자와 또 다른 공여자 사이에 세포 거동 및 성장 속도는 약간 상이할 수 있다. 따라서, 두 계대 사이의 지속기간 및 계대 사이의 배지 교체 횟수는 공여자마다 상이할 수 있다.
1.3. 골형성 분화
계대 P4 (즉, 제4 계대)에서, 세포를 다시 원심분리하고, MD 배지 (분화 배지)에 재현탁시켰다. 재현탁 후, 세포를 다시 계수한 후, MD 배지에서 적절한 세포 밀도로 희석하고, 70 mL의 세포 현탁액 부피를 150 ㎠ 플라스크에 시딩하고, 골형성 MD 배지를 공급하였다. 이 방법에 따라, 제4 계대 후, 세포를 골형성 MD 배지에서 직접 배양하였다. 따라서, 세포가 전면생장에 도달하지 않은 동안에 골형성 MD 배지를 첨가하였다.
골형성 MD 배지는 덱사메타손 (1 μM), 아스코르브산 (0.25 mM) 및 인산나트륨 (2.93 mM)으로 보충된 증식 배지 (DMEM, Ala-Gln, hPL 5%)로 구성되었다.
한 공여자와 또 다른 공여자 사이에 세포 거동 및 성장 속도는 약간 상이할 수 있다. 따라서, 골형성 분화 단계의 지속기간 및 계대 사이의 배지 교체 횟수는 공여자마다 상이할 수 있다.
1.4. 세포의 다차원 유도
3D 유도는 세포가 전면생장에 도달한 때, 및 형태학적 변화가 나타난 경우, 및 플라스크 내에 적어도 하나의 골상 결절 (골 조직의 성숙화 이전에 형성되는 골 기질의 비무기질화된 유기 부분)이 관찰된 경우에 3D 유도를 개시하였다.
골형성 MD 배지에 노출시킨 후, 부착성 골형성 세포의 전면생장 단층을 함유하는 배양 베쓸에 150 ㎠ 베쓸에 대해 1, 1.5 및 2 ㎤ 농도로 젤라틴 입자 (컬티스퍼-G 및 컬티스퍼-S, 퍼셀 바이올리티카(Percell Biolytica: 스웨덴 아스토프))를 서서히 균일하게 분무하였다:
세포를 MD 배지에서 유지시켰다. 다차원 유도 동안 3-4일마다 주기적인 배지 교체를 수행하였다. 젤라틴 입자의 제거 및 구조(들) 생성을 주의 깊게 방지하여 상기 배지 교체를 수행하였다.
실시예 2: 생체물질의 특징화
2.1. 물질 및 방법
2.1.1. 구조/조직학
ASC 및 컬티스퍼 G 및 S 입자로부터 수득된 3D 구조의 형성을 시험하였다. 계대 4에 6개의 상이한 공여자로부터의 전면생장 ASC 상에 컬티스퍼의 입자를 첨가하였다. 상이한 부피를 시험하였다: 150 ㎠ 베쓸당 1, 1.5, 2 ㎤ 입자. 세포를 분화 배지 (울트라글루타민 + 1% 페니실린/스트렙토마이신 + 0.5% 암포테리신 AB + 덱사메타손 (1μM), 아스코르브산 (0.25 mM) 및 인산나트륨 (2.93mM)을 포함하는 DMEM 4.5 g/L 글루코스)에 유지시키고, 3-4일마다 배지를 교체하였다.
MP 및 MD에서의 배양의 비교를 위해, MD 중 3D 구조의 생검을 입자 첨가 후, 5일, 14일 및 8주째에 수행하였다.
세포충실성(cellularity)의 평가를 위해, 컬티스퍼 입자의 첨가 후, 4주, 8주 및 12주째에 3D 구조의 생검을 수행하였다.
이를 포르몰(formol)에 고정시키고, 헤마톡실린-에오신, 메이슨 트리크롬(Masson’s Trichrome), 오스테오칼신 및 폰 카사 염색을 위해 제조하였다.
조직의 골분화 및 무기질화를 각각 오스테오칼신 및 폰 코사-염색 슬라이드에서 평가하였다. 헤마톡실린-에오신 및 메이슨 트리크롬 염색 후, 조직의 구조, 세포충실성 및 세포외 기질의 존재를 평가하였다.
2.1.2. 생물학적 활성
생체활성의 시험관내 연구를 (i) 최종 생성물 중 성장 인자 VEGF, IGF1, SDF-1α의 추출 및 정량화 및 (ii) 저산소 및 고혈당 (예를 들어, 당뇨병성 상처 치유의 병태)에서의 본 발명의 생체물질의 성장 인자 분비/함량의 용량에 의해 평가하였다. 추가로, (iii) 본 발명의 생체물질의 생체활성 특성을 qRT-PCR에 의해 분자 수준에서 시험관내에서 특징화하였다.
성장 인자 함량
형성된 조직의 생체활성을 평가하기 위해, 단백질 추출 및 정량화를 위해 젤라틴 (1.5 ㎤) 첨가 후 4 및 8주째에 생검을 수행하였다. 총 단백질 및 성장 인자 함량을 공급자의 지침에 따라 비색계 (BCA 프로테인 어세이 키트(BCA Protein Assay Kit), 써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific)) 및 VEGF, SDF1α, IGF1에 대한 ELISA (휴먼 콴티카인(Human Quantikine) ELISA 키트, RD 시스템즈(RD Systems))에 의해 정량화하였다.
저산소 및 고혈당에서의 배양
본 발명의 생체물질의 생체활성 및 이 3D 구조의 생체활성에 대한 산소 상태(oxemia) 및 혈당의 영향을 평가하기 위해, 8주째에 3 공여자로부터의 ASC 및 컬티스퍼 G (1.5 ㎤)로 형성된 조직의 생검을 PBS로 2회 세정하고, 6 웰 플레이트에 HPL의 부재하에 4.5 g/L (고혈당 상태) 또는 1 g/L (정상 혈당 상태) 글루코스의 10 mL의 MD에 이중으로 배치하였다. 플레이트를 72시간 동안 저산소 (1% O2) 또는 정상 산소 (21% O2), 5% CO2, 37℃에 배치하였다. 이어서, 각각 비색계 (BCA 프로테인 어세이 키트, 써모피셔 사이언티픽) 및 ELISA (BMP2, BMP7, VEGF, SDF-1α, IGF1, FGFb (휴먼 콴티카인 ELISA 키트, RD 시스템즈))에 의한 총 단백질 및 성장 인자 정량화를 위해 상청액을 수확하였다. 단백질 추출, 정제 및 총 단백질 및 성장 인자 함량 정량화를 위해 조직을 처리하였다.
qRT-PCR
본 발명의 생체물질의 혈관신생 유발(pro-angiogenic) 가능성을 혈관형성 및 혈관신생에 관여하는 유전자의 발현의 분석에 의해 조사하였다. 상이한 상태의 지방 줄기 세포에 의한 유전자 발현을 분석하였다: 증식 배지 (표현형 방향(phenotype orientation) 없음, MP) 중 지방 줄기세포, 무입자의 통상의 골형성 배지 (MD) 중 지방 줄기세포 및 마지막으로 본 발명의 생체물질 (세포외 기질에 의한 3차원 스캐폴드-무함유 구조의 형성을 유도하기 위한 것으로, 1.5 ㎤의 입자를 갖는 지방 줄기 세포).
퀴아졸(Qiazol) 용해 시약 (퀴아젠(Qiagen: 독일 힐덴)) 및 프리셀리스(Precellys) 균일화기 (베르틴 인스트루먼트(Bertin instrument: 프랑스 몽티니 르 브르토뇌))를 사용하여 증식 배지 (MP) 중 배양된 ≥2,000개의 ASC (n=4 인간 지방 조직의 독립적 공급원)에서 및 ~1 ㎠의 본 발명의 생체물질의 생검 (n=5)으로부터 총 RNA를 추출하였다. 제조사의 지침에 따라 Rneasy 미니 키트 (퀴아젠: 독일 힐덴) 및 칼럼 상의 DNase 분해를 추가로 사용하여 RNA를 정제하였다. RNA의 품질 및 양을 분광광도계 (스펙트라맥스(Spectramax) 190, 몰레큘라 디바이시스(Molecular Devices: 미국 캘리포니아주))를 사용하여 측정하였다. 상업적으로 이용가능한 PCR 어레이 (휴먼 RT2 프로파일러 어세이 - 안지오제네시스(Human RT2 Profiler Assay - Angiogenesis))를 통해 골형성 및 혈관신생 유전자 발현 프로파일에 대해 RT2 RNA 제1 가닥 키트 (퀴아젠: 독일 힐덴)를 사용하여 0.5 ㎍의 총 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 증폭 생성의 검출에는 ABI 콴트스튜디오(Quantstudio) 5 시스템 (어플라이드 시스템즈(Applied Biosystems)) 및 SYBR 그린 ROX 마스터믹스(SYBR Green ROX Mastermix) (퀴아젠: 독일 힐덴)를 사용하였다. △△CT 방법에 따라 정량을 수득하였다. 각 샘플의 최종 결과를 3개의 하우스키핑 유전자 (ACTB, B2M 및 GAPDH)의 발현 수준의 평균으로 정규화하였다.
2.1.3. 생체물질의 성숙화가 이의 특성에 미치는 영향
생체물질 (또한 "조직"으로도 지칭)의 성숙화가 이의 특성에 미치는 영향은 무기질화 수준 평가, 조직학적 평가 (세포충실성 측정) 및 생체활성 평가 (성장 인자 VEGF, IGF1, SDF-1α의 추출 및 정량화)에 의해 평가하였다. 생체물질의 성숙화는 본원에서 분화 배지에서 컬티스퍼 입자와 ASC의 배양 지속기간을 의미한다.
컬티스퍼 입자의 첨가 후, 4주 (1 공여자), 8주 (6 공여자), 12주 (3 공여자) 및 25주 (1 공여자)째에 3D 구조의 생검을 채취하여, 마이크로-CT 스캐너 분석을 위해 포르몰에 고정시켰다. 3D 구조 무기질화를 말초 정량적 CT 기계 (스카이스캔(Skyscan) 1172G, 브루커(Bruker) 마이크로-CT NV: 벨기에 콘티치)를 사용하여 평가하였다.
추가로, 조직 생검 (4주 (n=3), 8주 (n=8), 12주 (n=3) 및 25주 (n=1))을 포르몰에 고정시키고, 헤마톡실린-에오신, 메이슨 트리크롬 및 폰 코사 염색을 위해 제조하였다.
2.2. 결과
2.2.1. 구조/조직학
컬티스퍼 입자를 증식 배지에서 hASC와 함께 배양하였을 때, 3D 구조는 수득되지 않았다. 육안적 3D 구조가 발견되지 않았는 바, 미세 구조는 형성되지 않았다.
증식 배지와 달리, 골형성 분화 배지에서 ASC와 함께 배양된 컬티스퍼는 시트형 3D 구조의 형성을 나타내었다 (도 1A). 또한, 이 구조는 겸자로 잡을 수 있었다 (도 1B).
골형성 분화 배지에서 ASC와 함께 배양된 컬티스퍼의 조직학적 연구 결과, 입자들 사이의 상호연결된 세포화된 조직이 존재하는 것으로 나타났다. 또한, 세포외 기질 및 세포가 입자의 기공에서 발견되었다 (도 2A 및 B). 폰 코사 염색은 단리된 무기질화 입자의 존재를 보여주었다. 그에 반해, 세포외 기질은 폰 코사에 의해 염색되지 않았다 (도 3A 및 B). 마지막으로, 오스테오칼신 발현이 상호연결 조직에서 관찰되었다 (도 4A 및 B).
2.2.2. 생물학적 활성
성장 인자 함량 및 분비
컬티스퍼 G 및 S 단독의 경우에는 단백질 함량이 관찰되지 않았다. 단지 미량의 IGF-1만이 검출되었지만, ELISA 방법의 정량의 하한 미만이었다.
골형성 분화 배지에서 ASC와 함께 배양된 컬티스퍼의 생검 상청액에서 검출된 IGF-1 및 BMP7 수준은 ELISA 방법의 정량 하한 미만이었고, 미량의 BMP2 및 FGFb가 측정되었다. 그에 반해, 상당량의 VEGF 및 SDF-1α가 분비된 것으로 관찰되었다.
배양 조건이 성장 인자 분비에 미치는 유의적인 영향은 없는 것으로 나타났다 (표 1).
Figure pct00001
골형성 분화 배지에서 ASC와 함께 배양된 컬티스퍼의 생검으로부터의 단백질 추출물에서 검출된 BMP2, BMP7 및 FGFb의 수준은 ELISA 방법의 정량의 하한 미만이었다. 그에 반해, 유의적인 함량의 IGF-1, VEGF 및 SDF-1α가 발견되었다.
배양 조건이 VEGF 함량에 미치는 유의적인 영향은 없는 것으로 나타났다. 그러나, 다른 군과 비교하여, 4.5 g/L 글루코스에서 정상 산소 (21% O2)에서 더 낮은 IGF-1 함량이 발견되었다 (p<0.05). 저산소 대비 정상 산소 및 정상 혈당에서 더 높은 SDF-1α 함량이 발견되었다 (1 및 4.5 g/L 글루코스) (p<0.05) (표 2).
Figure pct00002
qRT-PCR 분석
qRT-PCR 분석에 의해 분석된 84개의 혈관신생 유발 유전자에 걸쳐, 상이한 배양 조건 간에 13개의 mRNA가 조정되었다. 증식 배지 중 ASC와 비교하여 본 발명의 생체물질에서 10개의 유전자가 상향조절되었고 (ANG, ANGPT1, EPHB4, EDN1, LEP, THBS1, PTGS1, VEGFA, VEGFB 및 VEGFC), MP 중 ASC와 비교하여 본 발명의 생체물질에서 2개의 유전자가 하향조절된 것으로 발견되었다(ID1, TIMP1) (도 5).
MP 중 ASC와 비교하여 본 발명의 생체물질에서 안지오포이에틴 (ANG 및 ANGPT1) mRNA의 유의적으로 더 높은 발현이 발견되었다 (도 5A 및 B). 안지오포이에틴 신호전달은 기존 혈관으로부터 신생 동맥 및 정맥이 형성되는 과정인 혈관신생을 촉진한다 (문헌 [Fagiani E et al, Cancer Lett, 2013]).
혈관신생에 필수적인 역할을 하는 막관통 단백질인 EPHB4 (에프린 수용체 B4), 강력한 혈관수축신경인 엔도텔린 (EDN1) (문헌 [Wu MH, Nature, 2013]), 내피 세포를 조절하는 혈관확장신경 및 시클로옥시게나제 1 (PTGS1/COX-1)인 트롬보스폰딘 1 (THBS1)은 MP 중 ASC와 비교하여 본 발명의 생체물질에서 유의적으로 상향조절되었다 (각각 도 5C, D, E 및 F).
렙틴 (LEP) mRNA의 발현 (혈관신생의 중요한 증강제 및 VEGF의 발현의 유도제; 문헌 [Bouloumie A et al, Circ. Res. 1998]; [Sierra-Honigmann MR et al, Science (New York, N.Y.) 1998])은 또한 MP 중 ASC와 비교하여 본 발명의 생체물질에서 과다발현되었다 (도 5G).
마지막으로, 혈관 내피 성장 인자 A, B 및 C mRNA (VEGFA/B/C)의 발현 또한 MP 중 ASC와 비교하여 본 발명의 생체물질 중 ASC에 대해 유의적으로 개선되었다 (각각 도 5H, I 및 J). VEGF는 혈관 발달 및 혈관신생의 조절에 가장 중요한 성장 인자 중 하나이다. 골은 고도로 혈관화된 기관이기 때문에 (골형성에서의 중요한 조절인자로서의 혈관신생), VEGF는 또한 골격 발생 및 출생 후 골 수복에 긍정적인 영향을 미친다 (문헌 [Hu K et al, Bone 2016]).
그에 반해, 생체내 혈관신생 감소와 연관된 DNA-결합 단백질 억제제 (ID1) 및 메탈로펩티다제 억제제 1 (TIMP1) (문헌 [Reed MJ et al, Microvasc Res 2003])은 MP 중 ASC와 비교하여 본 발명의 생체물질에서 하향조절되었다 (각각 도 5K 및 l).
종합하면, 상기 분자 분석은 세포가 본 발명의 생체물질에서 이의 3D 기질에 포매되는 경우, ASC의 혈관신생 유발 가능성이 상향조절된다는 것을 보여준다.
2.2.3. 생체물질의 성숙화가 이의 특성에 미치는 영향
무기질화 수준 평가
4주, 8주, 12주 및 25주째에서의 3D 이식편의 매크로사진(photomacrograph)은 동일한 육안적 구조를 나타내었고 (도 6A 및 B), 이를 마이크로 CT에서 분석하였다. 무기질화 부피의 백분율을 측정하였다: 4주째에 0.07%, 8주째에 0.28% +/- 0.33%, 12주째에 1.24% +/- 0.35% 및 25주째에 2.77% (도 6C 및 D).
따라서, 성숙화 수준이 높을수록, 무기질화는 더 높아진다.
조직학적 평가
분석된 상이한 조직에서 유사한 세포충실성이 정량화되었으므로, 조직의 성숙화가 세포 함량에 미치는 영향은 없는 것으로 나타났다 (데이터는 제시되지 않음).
그에 반해, 조직에서의 ECM의 비율은 성숙화 수준에 따라 증가하였고, 여기서, 4주째에 ECM 비율은 유의적으로 더 낮았고, 25주째에 ECM의 비율은 더 높았다 (각각 4, 8/12 및 25주째에 28 ± 7 대 33 ± 11/34 ± 11 대 56 ± 8%의 ECM (p<0.05)) (표 3).
Figure pct00003
더욱 뚜렷한 폰 코사 염색에 의해 나타난 바와 같이 (데이터는 제시되지 않음), 성숙화 12 및 25주째에 더 높은 무기질화 정도가 관찰되었다
생체활성 평가
단백질 추출, 정제 및 ELISA에 의한 성장 인자 (VEGF, IGF1, SDF-1α) 정량화 후, 성숙화 4, 8, 12 및 25주째에서의 생체물질의 생체활성을 연구하였다 (표 4).
Figure pct00004
실시예 3: 혈관신생 및 골형성 특성의 생체내 연구
3.1. 물질 및 방법
3.1.1. 누드 래트를 사용한 생체내 실험
본 발명의 생체물질의 10개의 복제물 (실시예 1에 기술된 바와 같이 7.5주 성숙화 동안 1.5 ㎤의 컬티스퍼 G 또는 S와 함께 배양된 ASC)을 0일째에 누드 래트의 소작된(cauterized) 요추 근육에서 봉합하였다. 이식 후 29일째, 생체물질을 수확하여 이미지 및 조직학으로 분석하였다.
3.1.2. 위스타르 래트를 사용한 생체내 실험
본 발명의 생체물질의 10개의 복제물 (실시예 1에 기술된 바와 같이 7.5주 성숙화 동안 1.5 ㎤의 컬티스퍼 G 또는 S와 함께 배양된 ASC)을 0일째에 위스타르 래트의 소작된 요추 근육에서 봉합하였다. 이식 후 29일째, 생체물질을 수확하여 이미지 및 조직학으로 분석하였다.
동물의 일반적인 임상 상태를 실험 기간 동안 매일 체크하였다.
소형 동물 영상화 스카이스캔1076을 위한 고해상도 X선 마이크로-CT 시스템을 사용하여 30개 표본의 무기질화 분석을 수행하였다. CTvol 및 CTan 소프트웨어 (스카이스캔)를 사용하여 스캔의 3차원 재구성 및 무기질화된 조직의 분석을 수행하였다.
생성물의 생체내 혈관신생 및 골유도 특성을 평가하기 위해 근육 샘플의 조직학적 분석을 수행하였다 (헤마톡실린-에오신, 메이슨 트리크롬, 폰 코사 (조직의 무기질화의 위치를 정밀 측정하기 위함), 인간 조직 마커 Ku80 (동물 조직 내의 세포의 인간 유래를 확인하기 위함) 및 CD3 (조직 내의 CD3+ 면역 세포의 재분리를 기술하기 위함) 염색).
3.2. 결과
3.2.1. 누드 래트를 사용한 생체내 실험
생체내 실험 동안, 병태 또는 유의한 병변의 징후는 관찰되지 않았으며, 이는 생성물이 동물에 부작용을 유발하지 않았음을 나타낸다.
누드 래트에서, 29일째에 수행된 방사선 사진에서 무기질화를 시사하는 방사선 불투과성 구조의 존재가 관찰되었다 (도 7).
누드 래트로부터의 샘플에서 인간 세포의 존재가 표시되었다. 존재하는 경우, 인간 세포는 2개의 군에서 경계부를 제외하고 이식재 부위의 세포의 평균 절반을 나타냈다. 래트 및 인간 기원의 세포는 오직 래트 세포만 존재하는 경계부를 제외하고는 이식재 부위에 균일하게 분포하였다.
3.2.2. 위스타르 래트를 사용한 생체내 실험
위스타르 래트에서, 29일째에 수행된 방사선 사진에서 무기질화를 시사하는 방사선 불투과성 구조의 존재가 관찰되었다 (도 8).
무기질화의 분석은 각각의 이식재 부위에서 무기질화된 조직의 존재를 시사한다.
폰 코사 염색은 무기질화가 입자 상에 국재화되어 있음을 나타낸다 (도 9).
실시예 4: 생체내 생체활성 연구
4.1. 물질 및 방법
4.1.1. 샘플 제조
10마리의 누드 래트의 척추 주위 근조직에서의 이식을 위해 ~0.5 g의 생체물질 (실시예 1에 기술된 바와 같이 8주의 성숙화 동안 1.5 ㎤의 컬티스퍼 S와 함께 배양된 ASC)의 샘플 10개를 제조하였다. 추가로, ~0.5 g의 컬티스퍼 S 입자의 2개의 샘플을 대조군으로 사용하였다.
샘플의 성장 인자 함량을 평가하기 위해, 단백질 추출 및 정량화 (VEGF, IGF1, SDF-1α)를 위해 생체물질 샘플을 제조하였다.
생체물질의 품질을 평가하기 위해, 헤마톡실린-에오신 (HE) 및 폰 코사 (VK) 염색을 위해 하나의 샘플을 포르몰에 고정시켰다. HE 염색 후, 조직내 세포수를 계수하여 탈세포화 처리 효능의 평가를 확인하였다.
4.1.2. 동물 시설에서의 하우징
수의학 서비스에 의해 승인받은 동물 시설 "상트르 프리클리니크 애틀란쎄라(Centre Preclinique Atlanthera)"에 동물을 하우징하고, 현재 현행법 (2013년 2월 1일자의 실험 목적으로 사용되는 동물에 대한 법령 N 2013-118)에 의거하여 모든 실험 절차에 사용하였다. 연구 개시 전 최소 7일 동안 동물을 적응시키고, 연구 동안 일반적인 동물 상태를 매일 추적 조사하였다. 표준 치수의 플라스틱 상자 내 냉난방 시설이 탑재된 동물 사육장에 동물을 하우징하였다. 인위적 명/암 광주기를 12시간의 명 및 12시간의 암으로 설정하였다. 모든 동물은 물에 자유롭게 접근할 수 있었고, 시판 사료를 임의 제공하였다. 각 동물을 귀 태그 (링)로 식별 표시하였다.
4.1.3. 실험 프로토콜
0일째에, 10마리의 누드 래트의 소작된 요추 근육에서 생체물질의 복제물을 봉합하고, 1개의 누드 래트의 요추 근육에 실행된 근육 소작 스톨 (stall)에 입자 단독을 이식하였다. 이식 후 29일째에, 생체물질을 포함하는 근육을 수확하여, 이미지와 조직학에 의해 분석한다.
요추 근육으로의 이식
최상의 조건하에서 수술을 수행하기 위해 동물을 완전히 마취시켰다. 진통제 절차를 수술하기 대략 30분 전에 부프레노르핀을 주사하고, 다음날에 또 다시 주사하도록 설정하였다.
수술: 각 동물에, 요추 수준에서 척추를 따라 세로로 피부를 절개하였다. 1마리의 래트에, 피부 절개의 양쪽에서 근육 스톨을 수득하였다 (즉, 스톨을 요추 근육 내에 수행). 스톨을 소작하였다. 이 스톨 내에 입자 단독을 이식하였다. 10마리의 래트에, 생체물질을 소작된 요추 근육에서 봉합하였다. 수술 절차 후, 피부 상처를 수술용 스테이플 을 사용하여 봉합하였다.
임상 추적 조사
동물의 일반적인 임상 상태를 실험 기간 동안 매일 체크하였다. 호흡기, 눈, 심혈관, 위장관 징후; 운동 활동 및 거동; 발작 징후; 피부 평가; 이식 부위에서의 염증에 중점을 둔 상세한 임상 추적 조사를 일주일에 2회 수행하였다.
추가로, 상세한 임상 추적 조사와 동시에 체중을 주 2회 측정하였다.
최종 절차 및 사후 분석
29일째에, 동물을 방혈에 의해 희생시키고, 육안적 평가를 수행하였다. 부검 동안, 사체의 외부 양상을 관찰하고, 가능한 내부 병변 이상을 나타내는 병리학적 유체 손실이 기록하였다.
심장, 신장, 비장, 간 및 폐에 중점을 두고, 인턴 기관의 임의의 병변 변형을 평가하기 위해 흉부 및 복강을 넓게 개방하였다.
이식재 부위에서의 육안적 평가
근육 이식재 부위를 노출시키고, 국소 조직 반응 및 이식재의 존재 및 국재화에 중점을 둔 상세한 육안적 평가를 수행하였다 (방사선 분석).
근육 이식재 부위를 함께 제거하였다. 외식편을 실온에서 48시간 동안 중성 완충처리된 포르말린 용액에 고정시켰다.
3D 조직 외형 측정 분석
소형 동물 영상화 스카인스캔1076을 위한 고해상도 X선 마이크로-CT 시스템을 사용하여 표본의 무기질화 분석을 수행하였다.
근육 샘플을 하기 파라미터를 사용하여 실온에서 스캐닝하였다: 공급 전압: 50 kV; 회전 단계: 0.5°; 픽셀 크기: 18 ㎛; 위치당 1 프레임.
CTvol 및 CTan 소프트웨어 (Skyscan)를 사용하여 스캔의 3차원 재구성 및 무기질화된 조직의 분석을 수행하였다.
각 샘플에서, 골 무기질화된 조직과 유사한 신호의 양 (임계값 40/255)을 결정하였다 (골 부피: BV로 확인). 사용된 "조직 부피" 값은 제형화된 이식재의 부피이다.
조직병리학 및 2D 조직 외형 측정 분석
생성물의 생체내 혈관신생 및 골유도 특성을 평가하기 위해 근육 샘플에 대해 조직학적 분석을 수행하였다.
포르말린 고정 외식편을 EDTA 15%에서 13일 동안 탈석회화시켰다. 이어서, 샘플을 탈수시키고, 파라핀에 포매시켰다. 4-5 ㎛의 절편을 마이크로톰을 사용하여 절단하고, 슬라이드에 펼쳤다. 150 ㎛만큼 떨어진 2개의 상이한 수준에서 절편화를 수행하였다.
이들 2개의 절편 영역에서, 헤마톡실린-에오신 (HE), 메이슨 트리크롬 (MT) 및 CD146의 면역조직화학을 수행하였다 (파라핀에 포매되거나 동결된 표본의 절편 사용).
완전히 염색된 절편의 이미지를 디지털 슬라이드 스캐너 (나노주머(Nanozoomer), 하마마츠(Hamamatsu))를 사용하여 수득하였다. 혈관이 차지하는 영역의 정량화 (트리크롬 메이슨, CD146)를 NDPview2 소프트웨어를 사용하여 수행하였다: 관심 영역을 조직 특징을 기반으로 수동으로 확인하여, 절편의 "이식재 부위" 영역을 규정하였다. 관심 영역에서 혈관이 차지하는 영역을 정량화하기 위해 각 혈관을 수동으로 확인하였다. 혈관에 해당하는 표면 및 혈관의 수를 "이식재 부위"의 총 영역에 대해 기록하였다.
4.2. 결과
4.2.1. 조직학적 분석
HE 염색 후 조직내 세포수를 측정하였다 (도 10): 146.5 ± 50.4 세포/㎟.
조직의 폰 코사 염색 결과, 입자에 국재화된 약한 무기질화가 나타났다 (도 11).
4.2.2. 생체물질의 생체활성에 대한 생체내 연구
병태 또는 유의적인 병변의 징후는 관찰되지 않았으며, 이는 생성물이 동물에 부작용을 유발하지 않았음을 나타낸다. 실험 과정 동안 기록된 동물의 체중에 의하면, 모든 동물이 2일째에 체중 증가를 보이지 않았고, 그 후 2일째 내지 28일째에 규칙적인 체중 증가를 보인 것으로 나타났다. 종종 수술 직후에는 체중 증가가 관찰되지 않으며, 이는 시험된 생성물의 임의의 독성 징후로 간주되지 않는다. 2일째 내지 28일째에 관찰된 규칙적인 체중 증가를 통해 입자가 동물 대사에 영향을 주지 않는다는 것이 확인된다. 생체내 실험 종료시, 부검에 의하면 육안적 기관 병변이 나타나지 않았다.
이식재 부위의 무기질 함량
29일째에 수행된 방사선 사진에서 생체물질이 이식된 모든 부위에서 무기질화를 시사하는 방사선 불투과성 구조의 존재가 관찰되었다 (도 12)
근육 내에 무기질화된 조직의 형성 백분율을 정량화하기 위해, "이식재 부위"의 무기질화 분석을 소형 동물 영상화 스카이스캔1076의 고해상도 X선 마이크로-CT 시스템을 사용하여 수행하였다. 결과는 하기 표 5에 제시되어 있다.
Figure pct00005
분석에 의하면, 생체물질이 이식된 각각의 부위에서 현저한 함량의 무기질화 조직이 존재하고, 평균 BV/TV는 0.118인 것으로 나타났다.
이식재의 신생혈관화
신생혈관화를 기록하기 위해 섬유질 결합 조직에서 모세관의 존재를 조사하였다.
메이슨 트리크롬 염색 후, 이식재 및 근육과 이식재 부위 사이의 접합부에서 혈관의 수/영역 및 혈관 밀도를 정량화하였다.
생체물질에 의한 이식재는 메이슨 트리크롬 염색에 의해 혈관화된 것으로 나타났으며, 그 개수는 40.8 ± 18.5 혈관/㎟였다.
실시예 5: 고혈당/허혈성 이종 래트 모델에서의 생체내 효능 연구
5.1. 물질 및 방법
5.1.1 동물
250-300 g의 56마리의 암컷 위스타르 래트는 스트렙토조토신 (50 mg/kg)을 복강내로 받았다. 스트렙토조토신 투여 후 7일 내지 10일째, 혈당 테스트 스트립에 의해 꼬리 정맥혈로부터 혈당 수준을 측정하였다. 글루코스 수준이 >11.1 mM인 래트는 고혈당으로 간주하였고, 이를 연구에 포함시켰다 (n-42마리의 래트).
문헌 [Levigne et al (Biomed Res Int 2013)]에 기술된 바와 같이 각 래트의 좌측 다리에서 허혈을 유도하였다. 털을 제거한 서혜 부위의 세로 절개를 통해 외부 장골 및 대퇴 동맥을 총 장골로부터 복재 동맥까지 해부하였다. 허혈 조건을 유발하기 위해, 해부된 동맥을 좌측 다리의 총 장골로부터 절개하고, 우측 다리 동맥을 보존하고, 다리를 비-허혈성인 것으로 간주하였다. 모든 수술 절차는 수술 현미경 (독일 칼 자이스(Carl Zeiss, Germany: 독일 예나)) 하에서 수행하였고, 마취 유도를 위해 5%, 마취 유지를 위해, 3%의 이소플루란을 흡인시켜 동물을 마취시켰다.
동물을 무작위로 3개 군으로 나누었다:
- 모의 군 (n=10 암컷 위스타르 래트);
- 컬티스퍼 군 (n=10 암컷 위스타르 래트), 즉, 입자 단독;
- 생체물질 군 (n=14 암컷 위스타르 래트), 즉, 조직을 형성하는 젤라틴 입자와 ASC.
5.1.2 시험 품목
~0.5 g의 컬티스퍼 입자로 이루어진 14개의 샘플을 제조하고, 감마선을 조사하였다.
~2 ㎠의 생체물질 (실시예 1에 기술된 바와 같이 8주의 성숙화 동안 1.5 ㎤의 컬티스퍼 S와 함께 배양된 ASC)로 이루어진 14개의 샘플을 이식을 위해 제조하였다.
샘플의 성장 인자 함량을 평가하기 위해, 단백질 추출 및 정량화 (VEGF, IGF1, SDF-1α)를 위해 하나의 생체물질 샘플을 제조하였다.
생체물질의 품질을 평가하기 위해, 헤마톡실린-에오신 (HE) 착색을 위해 샘플을 포르몰에 고정시켰다. HE 염색 후, 조직내 세포수를 계수하여 탈세포화 처리 효능의 평가를 확인하였다.
5.1.3 상처 치유의 육안적 평가
이식 후, 0, 15, 24 및 34일째에 다리 사진을 촬영하였다.
상처 봉합을 정량화하기 위해, 상처 면적을 두 독립적인 조작자에 의해 이미지 J(Image J) 소프트웨어를 사용하여 이미지 분석에 의해 측정하였다. 곡선하 면적을 D0과 D34 사이의 각 시점에서 측정된 상처 면적에 대해 계산하고, 100%로 고정된 모의 군과 비교하여 표시하였다.
5.1.4 상처 치유의 현미경 평가
다리를 절개하여 상처 조직을 제거하고, 이러한 가장 최근의 것을 횡단으로 배향시키고, 조직의 전체 두께의 조직학적 슬라이드를 제조하였다. 표피 (문헌 [op't Veld RC et al, Biomaterials 2018]) 및 진피 점수화 (문헌 [Yates C et al, Biomaterials 2007])를 위해 5 ㎛의 조직학적 슬라이드를 제조하고, HE로 염색하였다:
3개의 대표적인 상처 절편 (코어 및 주변)에서의 표피 치유 점수:
- 0: 상피 세포의 이동 없음,
- 1: 부분적 이동,
- 2: 각질화 부재/부분적 각질화 하의 완전 이동
- 3: 완전한 각질화 하의 완전한 이동,
- 4: 진행성 비대.
3개의 대표적인 상처 절편 (코어 및 주변)에서의 진피 치유 점수:
- 0: 치유되지 않음,
- 1: 염증성 침윤,
- 2: 과립화 조직 존재-섬유 증식 및 혈관신생,
- 3: 과립화 조직을 대체하는 콜라겐 침착이 >50%,
- 4: 비대성 섬유증 반응.
추가로, 면역 및 염증 반응의 평가를 위해 조직 외형 측정 및 CD3, CD68 면역염색에 의한 혈관 영역의 평가를 위해 메이슨 트리크롬 착색을 수행하였다. 추가로, 이식 후, 인간 세포의 존재를 확인하기 위해 KU80 염색을 수행하였다.
5.2. 결과
스트렙토조토신 주사를 맞은 56마리의 래트 중 42마리에서는 고혈당이 발생하였고, 이를 연구를 위해 선택하였고, 14마리에서는 저혈당이 나타났고, 외과적 합병증이 발생하였으며, 따라서 이를 연구에서 배제시켰다.
5.2.1. 상처 치유의 육안적 평가
상처의 육안적 사진이 도 13에 제시되어 있다. 다른 군 (모의 대조군 (도 13A) 및 입자 단독, 도 13B)과 비교하여 생체물질 군 (도 13C)에서 수술 후, 15일 (D15)째부터 더 우수한 상처 치유를 관찰할 수 있다. 이 차이는 허혈성 (좌측 다리) 및 비-허혈성 상처 (우측 다리), 둘 모두에서 볼 수 있다.
비-허혈성 상처에 대한 곡선하 면적의 결과는 도 14에 제시되어 있다. 컬티스퍼 단독의 경우의 이식은 비처리 동물과 비교하여, 상처 치유가 각각 23%만큼 감소한 것으로 나타났다. 그에 반해, 본 발명의 생체물질로 처리된 군에서 더 우수한 상처 치유 (25%)가 나타났다.
D0과 D34 사이의 비-허혈성 상처 및 허혈성 상처에 대한 상처 면적의 전개는 도 15 (각각 A 및 B)에 제시되어 있다. 본 발명의 생체물질로 처리된 상처는 다른 군과 비교하여 D21에서 D34까지 더 낮은 비-치유된 조직을 나타낸다는 점에 주목한다. 상처의 완전한 봉합은 비-허혈성 및 허혈성 조건하에서 본 발명의 생체물질로 처리되었을 때, 유의적으로 더 빠르다(각각 도 16A 및 B).
염증 반응을 평가하기 위한 조직 외형 측정 결고는 도 17에 제시되어 있다. 본 결과에서는 모의 대조군 (도 17A) 및 컬티스퍼 S 단독 (도 17B)인 것과 비교하여 본 발명의 생체물질 (도 17C)로 처리된 경계부, 코어 및 전체 허혈성 상처에서 림프구 CD3 (검은색 선)이 더 높게 나타난다. CD3은 정상적으로 감염 및 기능 장애 세포를 파괴시키는 작용을 한다.
추가로, 대식세포 CD68 (회색 선)은 모의 대조군 (도 17A) 및 컬티스퍼 S 단독 (도 17B)인 것과 같이, 대략 D10에서 피크에 도달하였다 (도 17C). CD68은 조직 부위를 감염시키고, 세포 잔해물 및 감염을 제거하는 것으로 보이는 대식세포의 특징이다.
상기 두 관찰결과에 따르면, 본 발명의 생체물질의 이식을 통해 면역 유도에 의해서 상처 봉합의 동적 성질이 증가됨을 확인할 수 있다.
상처 두께 또한 평가하였다 (도 18). 허혈성 모델에서 (도 18A), 상처 두께는 이식 후 D15 내지 D34에서 감소하였으며, 이는 위축을 나타내는 것이다. 비-허혈성 모델에서 (도 18B), 상처 두께는 이식 후 D15 내지 D34에서 약간 감소하였지만, 더 중요한 것은 모의 대조군 및 컬티스퍼 단독인 경우에서와 같이 증가하지 않았다는 점이다. 본 결과는 본 발명의 생체물질이 이식되었을 때 비대는 없다는 것을 강조한다.
5.2.2. 상처 치유의 현미경 평가
각각의 시점에서 비-허혈성 상처에 대해 평가된 표피 및 진피 점수는 19a, b, c 및 d에 제시되어 있다. 다른 군과 비교하여 본 발명의 생체물질에 대해 더 빨리 진피 및 표피가 나타났다.
실시예 6: 상이한 분화 배지 시험
6.1. 물질 및 방법
분화 배지가 형성되는 3D 구조에 미치는 영향을 연구하였다. ASC를 1.5 ㎤의 컬티스퍼 S와 함께 4주 동안 상이한 분화 배지: 골형성 (실시예 1의 것과 동일), 연골형성 (DMEM, 5% HPL, 100 ㎍/mL 피루브산 나트륨, ITS 1X, 40 ㎍/mL 프롤린, 10 ng/mL TGF-β1, 1 μM 덱사메타손), 각질형성 (DMEM, 5% HPL, 5 ㎍/mL 인슐린, 10 ng/mL KGF, 10 ng/mL hEGF, 0.5 ㎍/mL 히드로코르티손, 1.5 mM CaCl2), 및 근섬유형성 (DMEM:F12, 100 ㎍/mL 피루브산 나트륨, 1X ITS, 1X RPMI 1640 비타민, 1 ng/mL TGF-β1, 1 ㎍/mL 글루타티온, 0.1 mM MEM)에서 배양하였다. 배양을 4주 동안 유지시켰고, 분화 배지를 3-4일마다 교체하였다.
4주째 조직 생검을 헤마톡실린-에오신, 메이슨 트리크롬, 및 폰 코사 염색을 위해 포르몰에 고정시켰다. 추가로, 조직-특이적 염색을 수행하였다 (오스테오칼신, 알시안 블루, 판케라틴, CD34, α-SMA).
형성된 조직의 생체활성을 평가하기 위하여, 단백질 추출 및 정량화를 위해 컬티스퍼 첨가 후 4주째에 생검을 채취하였다. 비색계 (BCA 프로테인 어세이 키트, 써모피셔 사이언티픽)에 의해 총 단백질 및 성장 인자 함량(VEGF 및 SDF-1α)을 정량화하였다.
6.2. 결과
골형성 배지 중 ASC 및 컬티스퍼 S는 골형성 분화를 위한 양성 대조군으로서 역할을 한다. 그립가능한 큰 3D 구조 형성이 관찰되었다. 조직학적 분석 결과, 세포화된 상호연결 조직 중 입자 통합 및 기질의 오스테오칼신 양성 염색이 나타났다 (도 20A).
연골형성 배지 중의 배양물은 빠르게 (단지 수일 경과 후에) 용이한 그립가능성을 보이고, 기계력에 대해 저항성을 띠는, 강건하고, 두꺼운 3D 구조 형성을 보였다. 조직학적 분석 결과, 세포화된 상호연결 조직 중 입자 통합 및 알시안 블루 착색에 양성을 띠는 기질이 나타났다 (도 20B).
근섬유형성 분화 배지를 통해 3D 구조가 형성될 수 있었다. 형성된 구조는 그립가능성을 보였지만, 취약하였다. 또한, 조직학적 분석 결과, 세포화된 상호연결 조직 중 입자 통합 및 α-SMA 염색에 양성을 띠는 기질이 나타났다 (도 20C).
각질형성 배지 중 ASC 및 입자는 크고, 평평하고, 얇은 3D 구조를 형성하였다. 이러한 가장 최근의 것은 매우 취약하고, 취급이 어려웠다 (도 20D).
Figure pct00006
그러므로, 시험된 모든 분화 배지에서 ASC 및 젤라틴으로 형성된 생체물질로 이루어진 모든 샘플에서 3D 구조가 관찰되었다.

Claims (15)

  1. 분화된 지방 유래 줄기 세포 (adipose-derived stem cell; ASC), 세포외 기질(extracellular matrix) 및 젤라틴을 포함하는 다차원 구조를 갖는 생체물질(biomaterial).
  2. 제1항에 있어서, 상기 젤라틴이 돼지(porcine) 젤라틴인 것인 생체물질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 젤라틴이 입자 형태인 것인 생체물질.
  4. 제3항에 있어서, 상기 입자의 평균 직경이 약 50 ㎛ 내지 약 1,000 ㎛, 바람직하게는 약 75 ㎛ 내지 약 750 ㎛, 더욱 바람직하게는 약 100 ㎛ 내지 약 500 ㎛ 범위인 것인 생체물질.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체물질이 3차원인 것인 생체물질.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ASC가 골아세포, 연골세포, 각질형성세포, 근섬유아세포, 내피 세포 및 지방세포를 포함하거나, 또는 이로 구성된 군으로부터 선택되는 세포로 분화되는 것인 생체물질.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 다차원 생체물질을 포함하는 의료 장치(medical device).
  8. - 지방 유래 줄기 세포 (ASC) 증식 단계,
    - 제4 계대(the fourth passage)에서의 ASC 분화 단계, 및
    - 다차원 유도, 바람직하게는 3D 유도 단계를 포함하는, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 다차원 생체물질을 제조하는 방법.
  9. 제8항에 따른 방법에 의해 수득가능한 다차원 생체물질.
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 조직 결손(tissue defect)의 치료용으로 사용하기 위한 생체물질.
  11. 제10항에 있어서, 상기 조직이 골, 연골, 진피(dermis), 표피(epidermis), 근육, 내피 및 지방 조직을 포함하거나, 또는 이로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 사용하기 위한 생체물질.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 조직 결손이 진피 및/또는 표피 결손인 것인, 사용하기 위한 생체물질.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체물질이 진피 재건(dermis reconstruction)용으로 사용하기 위한 것인, 사용하기 위한 생체물질.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체물질이 진피 상처, 바람직하게는 당뇨성 진피 상처의 치료용으로 사용하기 위한 것인, 사용하기 위한 생체물질.
  15. 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체물질이 수포성 표피박리증(epidermolysis bullosa), 거대 선천적 모반(giant congenital nevus), 및/또는 선천성 피부 결손(aplasia cutis congenita)의 치료용으로 사용하기 위한 것인, 사용하기 위한 생체물질.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Family Cites Families (10)

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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AUPR289601A0 (en) 2001-02-05 2001-03-01 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Method of tissue repair
CN1827766B (zh) * 2001-06-28 2010-08-25 徐荣祥 体外细胞的培养方法
AU2006307897A1 (en) * 2005-10-27 2007-05-03 Coloplast A/S Biodegradable scaffold with ECM material
US20150081033A1 (en) * 2011-12-28 2015-03-19 Hideki Yoshikawa Scaffold-free self-organizing 3d synthetic tissue and artificial bone complex for bone/cartilage regeneration
US10030228B2 (en) * 2012-04-13 2018-07-24 Case Western Reserve University Scaffold-free tissue constructs
EP3046628B1 (en) * 2013-09-19 2019-11-06 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Methods and compositions for producing hepatocyte-like cells
EP3090764A1 (en) * 2015-05-08 2016-11-09 Université Catholique De Louvain Compositions comprising mesenchymal stem cells and uses thereof
CN105779383A (zh) * 2016-03-12 2016-07-20 上海盛缘生物技术有限公司 一种脂肪干细胞-水凝胶三维培养体系的制备方法及应用
CN106727706A (zh) * 2016-12-26 2017-05-31 湖南新起源医疗技术有限公司 一种用于皮肤损伤修复的细胞制剂的制备方法
CN108187142A (zh) * 2018-01-31 2018-06-22 广州沙艾生物科技有限公司 一种干细胞在生物组织修复中的应用

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